ES2817903T3

ES2817903T3 - Proteínas de consenso del virus de la Fiebre Aftosa (VFA), secuencias codificantes y vacunas preparadas a partir de las mismas

Info

Publication number: ES2817903T3
Application number: ES14765406T
Authority: ES
Inventors: David B Weiner; Karuppiah Muthumani; Jian Yan; Niranjan Y Sardesai
Original assignee: University of Pennsylvania Penn; Inovio Pharmaceuticals Inc
Current assignee: University of Pennsylvania Penn; Inovio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2021-04-08
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: EP2968519A4; MX2015011487A; AU2014232363B2; KR102276405B1; CN114045295A; EP2968519A2; WO2014145951A2; AU2014232363A8; CA2895806A1; BR112015022582A2; KR20160002757A; CN105338998A; AU2014232363A1; WO2014145951A3; JP2016515820A; JP6947773B2; EP3756683A1; JP7245282B2; US20160045589A1; CN105338998B

Abstract

Molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 y SEC ID nº 11.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de consenso del virus de la Fiebre Aftosa (VFA), secuencias codificantes y vacunas preparadas a partir de las mismas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos codificantes de proteínas inmunogénicas de consenso sintéticas del virus de la fiebre aftosa (VFA), a vacunas contra el VFA, a vacunas para la utilización en métodos de inducción de respuestas inmunitarias contra el VFA, a vacunas para la utilización en métodos para distinguir entre individuos infectados por VFA frente a los vacunados contra el VFA y vacunas para la utilización en métodos de inmunización profiláctica y/o terapéutica de individuos frente al VFA.

Antecedentes de la invención

La fiebre aftosa (FA) es una enfermedad altamente contagiosa de animales domésticos y biungulados salvajes, incluyendo vacas, cerdos, cabras y ciervos, que se replica rápidamente en el huésped y se extiende a animales susceptibles en contacto. La enfermedad se caracteriza por fiebre, cojera y lesiones vesiculares en lengua, patas, hocico y pezones que resultan en una elevada morbilidad, aunque baja mortalidad, en animales adultos. La infección del VFA induce una enfermedad vesicular aguda en vacas, búfalos, ovejas, cabras y cerdos, que puede desarrollarse en infección persistente (a excepción de los cerdos). El VFA puede infectar muchas otras especies de mamífero, incluyendo antílopes, elefantes y erizos, entre otros. Se cree que el huésped natural original del VFA podría ser el búfalo africano, ya que: i) resulta infectado persistentemente, y ii) la enfermedad se observa raramente.

El agente causante de la FA es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un virus ARNcs de grupo IV (+) del género Aphthovirus, de la familia Picornaviridae. El VFA presenta siete serotipos principales: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 y Asia-1. Estos serotipos están regionalmente restringidos, siendo el serotipo O el más común globalmente. El genoma de ARN de sentido positivo de cadena sencilla del VFA es de aproximadamente 8500 bases, circundado por una cápside icosaédrica con 60 copias de cada una de las cuatro proteínas estructurales, VP1-VP4. Las proteínas víricas son antigénicamente muy variables dentro de los varios subtipos, incluyendo A, Asia 1, O, C, SAT1, SAT2 y SAT3. La FA resulta económicamente devastadora y la infección del ganado biungulado puede resultar en pérdidas significativas. Los brotes recientes han resultado en pérdidas de miles de millones de dólares. Se han producido brotes recientemente en varios países anteriormente libres de la enfermedad, incluyendo Taiwan en 1997, el Reino Unido y los Países Bajos en 2001 y el surgimiento en varios países sudamericanos ha despertado la conciencia de la importancia de este virus económicamente destructivo. Además, hay una preocupación global de un posible ataque terrorista económico que utilice el VFA con diana en países con grandes industrias ganaderas, tal como la industria ganadera de los Estados Unidos, con 100.000 millones de dólares/año.

Entre las medidas anteriores para controlar el VFA se incluyen el sacrificio de los animales infectados o en contacto y la descontaminación. Los países que han sacrificado su ganado debido a un brote de VFA sólo pueden reiniciar las actividades ganaderas si presentan un estado libre de VFA durante 3 meses desde el último brote. Los países habitualmente la vacunación de los animales para tratar un brote de VFA como último recurso, debido a que los países que han vacunado y no han sacrificado los animales, deben esperar un año entero para obtener nuevamente el estado de libre de VFA. Sin embargo, los países están buscando de vacunar sus animales antes de ningún brote de VFA para poder conservar su estado de libre de VFA.

En el pasado, las vacunas de VFA incluían antígeno de virus completo inactivado químicamente junto con un adyuvante; sin embargo, existen desventajas a ello, ya que requiere caras instalaciones de fabricación de alta contención para producir la vacuna. Durante los últimos 25 a 30 años, los investigadores han estado intentando desarrollar una vacuna que proporcione protección tras una única inoculación. Entre estos esfuerzos se incluyen la utilización de VP1 purificado a partir de partículas víricas, VP1 de bioingeniería, péptidos VP1, péptidos VP1 de síntesis química, vectores vivos que expresan epítopos de VP1, la inoculación con ADN codificante de epítopos de VP1 y la utilización de proteína VP1-VP4 de cápside completa producida a partir de cultivos infectados por VFA o la administración de la cápside VP1-VP4 mediante un vector adenovirus tipo 5 (Ad5) humano de replicación defectuosa. La totalidad de dichos enfoques presentan sólo un número limitado de epítopos de todos los subtipos de virus VFA en el animal inoculado.

De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad en la técnica de una vacuna y métodos de diagnóstico de mamíferos infectados por el VFA que resulten adecuados para proporcionar protección frente a una pluralidad de epítopos del VFA de los diversos subtipos de VFA.

Nagarajan, et al. Indian J. Virol. 22: 50, 2011, dan a conocer una vacuna génica autorreplicante portadora del gen PI-2A del VFA de serotipo O y sus efectos sobre las respuestas inmunitarias de bovinos.

Fowler et al., Antiviral Research, volumen 94, número 1, abril 2012, páginas 25 a 34 dan a conocer un régimen de vacunación de ADN que incluye refuerzo proteico y electroporación que protege a los bovinos frente a la enfermedad de la fiebre aftosa.

Li et al., Vaccine, volumen 26, número 21, 19 de mayo de 2008, páginas 2647 a 2656 dan a conocer una mejora en la eficacia de la vacuna de ADN del VFA e inducción de anticuerpos de diferentes serotipos en cerdos tras un refuerzo proteico

Robertson et al., Journal of Virology 54.3: 651-660, 1985, dan a conocer secuencias de nucleótidos y aminoácidos para polipéptidos del virus de la fiebre aftosa de tipo A12. Subramanian et al., Antiviral Research 96.3: 288-295, 2012, da a conocer el desarrollo de partículas de tipo vírico (PTV) de virus de la fiebre aftosa (VFA) de serotipo O. Ramanathan et al., Vaccine 27.32:4370-4380, 2009 dan a conocer que la coinmunización con un adyuvante de plásmido de IL15 optimizado potencia la inmunidad humoral mediante la estimulación de células B inducidas por vacunas de ADN genéticamente manipulado que expresa JEV de consenso y WNV E DIII.

Los documentos n° US 2012/282217 y n° w O 2011/054011 dan a conocer un ácido nucleico que comprende una secuencia de aminoácidos de consenso de proteínas de cubierta VP1-4 del VFA de la enfermedad de la fiebre aftosa; el documento n° WO 2013/019603 da a conocer casetes de expresión de ácidos nucleicos lineales y métodos de utilización de los mismos en un método de vacunación no invasivo.

Descripción resumida de la invención

La invención proporciona una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 1, SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7, SEC ID n° 9 y SEC ID n° 11.

La invención proporciona además un plásmido que comprende una molécula de ácidos nucleicos de la invención. La invención proporciona además una vacuna que comprende uno o más plásmidos de la invención.

La invención proporciona además vacunas de la invención para la utilización en un método de generación de una respuesta inmunitaria contra el VFA en un individuo.

La invención proporciona además vacunas de la invención para la utilización en un método de prevención de la infección por el VFA en un individuo.

La invención proporciona además vacunas de la invención para la utilización en un método de tratamiento de un individuo que ha sido infectado por el VFA.

Se da a conocer una molécula de ácidos nucleicos que comprende secuencias codificantes de la proteína vírica VP4 unida en su extremo C-terminal a un sitio de corte de proteasa unido en su extremo C-terminal a la proteína vírica VP2 unida en su extremo C-terminal a un sitio de corte de proteasa unido en su extremo C-terminal a la proteína vírica VP3 unida en su extremo C-terminal a un sitio de corte de proteasa unido a la proteína vírica VP1 en su extremo C-terminal a un sitio de corte de proteasa unido a la proteína vírica 2A. La molécula de ácidos nucleicos puede comprender además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia líder en el extremo 5' de la secuencia codificante de la proteína vírica VP4. En algunas realizaciones, la secuencia codificante de la proteína vírica VP4 se omite. En algunas realizaciones, la secuencia codificante de la proteína vírica 2A se omite. En algunas realizaciones, la secuencia codificante que codifica la secuencia líder N-terminal se omite. En algunas realizaciones, la secuencia codificante que codifica la secuencia líder N-terminal es una secuencia líder de Ig, tal como una secuencia líder de IgG o IgE. En algunas realizaciones, el sitio de corte es reconocido por la furina.

Se proporcionan plásmidos que comprenden moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo plásmidos en los que las proteínas víricas proceden de un subtipo de VFA seleccionado del grupo que consiste en A, Asia1, C, O, SAT1, SAT2 y SAT3. Se proporciona la vacuna que comprende cuatro plásmidos, en la que las proteínas víricas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos son de cada subtipo de VFA del grupo que consiste en A, Asia1, C y O. En algunas realizaciones, se proporcionan además vacunas que comprenden siete plásmidos, en las que las proteínas víricas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos de cada subtipo de VFA del grupo que consiste en A, Asia1, C, O, SAT1, SAT2 y SAT3. En algunas realizaciones, se proporcionan vacunas que comprenden menos de siete, es decir, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis plásmidos, en las que las proteínas víricas están codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos de los subtipos de VFA seleccionados del grupo que consiste en A, Asia1, C, O, SAT1, SAT2 y SAT3. Se da a conocer en la presente memoria una molécula de ácidos nucleicos que comprende secuencias codificantes de la proteína vírica Vp4 unida en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de un sitio de corte de proteasa unido en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de la proteína vírica VP2 unidas en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de un sitio de corte de proteasa unido en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de la proteína vírica VP3 unidas en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de un sitio de corte de proteasa unido en su extremo a secuencias codificantes de la proteína vírica VP1 unida en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de la proteína vírica 2A, denominada versiones largas o “ larga”. En la presente memoria se da a conocer una molécula de ácidos nucleicos que comprende secuencias codificantes de la proteína vírica VP2 unida en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de un sitio de corte de proteasa unido en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de la proteína vírica VP3 unido en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de un sitio de corte de proteasa unido a secuencias codificantes de la proteína vírica VP1 unida en su extremo C-terminal a secuencias codificantes de la proteína vírica 2A, denominada versiones cortas o “corta”. En las versiones tanto larga como corta, las secuencias codificantes del sitio de corte de proteasa que está unido al extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína vírica VP1 y la secuencia codificante de la proteína vírica 2A pueden omitirse. En las versiones tanto larga como corta, la secuencia codificante de una secuencia líder N-terminal está unida al extremo N-terminal de la secuencia codificante de la proteína vírica VP4 en el caso de la versión larga y la secuencia codificante de la proteína vírica VP2 en el caso de la secuencia larga. El líder N-terminal es preferentemente un líder de Ig, tal como una secuencia de señal de IgG o de IgE. En algunas realizaciones, el sitio de corte es reconocido por la furina.

En algunas realizaciones, se proporcionan plásmidos que comprende las moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo plásmidos en los que las proteínas víricas son de un subtipo de VFA seleccionado del grupo que consiste en A, Asia1, C, O, SAT1, SAT2 y SAT3. En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna que comprende cuatro plásmidos, en la que las proteínas víricas codificadas por la secuencia de ácidos nucleicos son de cada subtipo de VFA del grupo que consiste en A, Asia1, C y O. En algunas realizaciones, se proporcionan además vacunas que comprenden siete plásmidos, en las que las proteínas víricas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos de cada subtipo de VFA del grupo que consiste en A, Asia1, C, O, SAT1, SAT2 y SAT3.

Se dan a conocer métodos para generar una respuesta inmunitaria contra el VFA en un individuo mediante la administración en el mismo de las vacunas dadas a conocer.

Se dan a conocer métodos de prevención de la infección por el VFA en un individuo, mediante la administración en el individuo de una de las vacunas dadas a conocer.

En la presente memoria se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos de consenso de por lo menos VP1-VP3, y preferentemente, VP1-VP4 del virus de la fiebre aftosa, que induce una respuesta inmunitaria de reactividad cruzada en un sujeto vacunado contra múltiples subtipos de VFA, incluyendo A, Asia1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 y SAT4. El ácido nucleico puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) un constructo derivado de VFA-A24cruzeiro que comprende una secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 1 codificante de VP4-VP2-VP3-VP1 (larga) tal como se indica en SEC ID n° 2; (b) un constructo derivado de VFA-A24cruzeiro que comprende una secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 3 codificante de VP2-VP3-VP1 (corta) tal como se indica en SEC ID n° 4; (c) un constructo derivado de VFA-As1-Shamir89 que comprende una secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 5 codificante de VP4-VP2-VP3-VP1 (larga) tal como se indica en SEC ID n° 6; (d) un constructo derivado de VFA-As1-Shamir89 que comprende una secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 7 codificante de VP2-VP3-VP1 (corta) tal como se indica en SEC id n° 8; (e) un constructo derivado de VFA-SAT2 que comprende una secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 9 codificante de VP4-VP2-VP3-VP1 (larga) tal como se indica en SEC ID n° 10; (f) un constructo derivado de VFA-STA2 que comprende una secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 11 codificante de VP2-VP3-VP1 (corta) tal como se indica en SEC ID n° 12.

En la presente memoria se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos tales como las seleccionadas del grupo que consiste en: a) un VFA-A24cruzeiro derivado de una secuencia de nucleótidos modificada, tal como la indicada en SEC ID n° 1 (FVA-A24cruzeiro-larga) insertada en un plásmido, tal como pVAX que presenta la secuencia indicada en SEC ID n° 13, b) una secuencia de nucleótidos modificada derivada de VFA-A24cruzeiro tal como la indicada en SEC ID n° 3 (FMDV-A24cruzeiro-corta) insertada en un plásmido, tal como pVAX que presenta la secuencia indicada en SEC ID n° 14; c) una secuencia de nucleótidos modificada derivada de VFA-As1-Shamir89, tal como la indicada en SEC ID n° 5 (FMDV-As1-Shamir89-larga) insertada en un plásmido, tal como pVAX que presenta la secuencia indicada en SEC ID n° 15, y d) una secuencia de nucleótidos modificada derivada de VFA-As1-Shamir89, tal como la indicada en SEC ID n° 7 (FMDV-As1-Shamir89-larga) insertada en un plásmido, tal como pVAX que presenta la secuencia indicada en SEC ID n° 16.

Las moléculas de ácidos nucleicos en las composiciones pueden comprender las secuencias de ácidos nucleicos siguientes, y/o fragmentos de los mismos, y/o secuencias homólogas de las secuencias, y/o fragmentos de dichas secuencias homólogas, siendo las secuencias de ácidos nucleicos: a) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA-As1-Shamir89 que codifica VP4, tal como la indicada en la SEC ID n° 17; b) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA-A24cruzeiro que codifica VP4, tal como la indicada en SEC ID n° 18; c) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA- As1-Shamir89 que codifica VP2, tal como la indicada en SEC ID n° 19; d) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA-A24cruzeiro que codifica VP2, tal como la indicada en SEC ID n° 20; e) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA- As1-Shamir89 que codifica 2A, tal como la indicada en SEC ID n° 21; f) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA-A24cruzeiro que codifica 2A, tal como la indicada en SEC ID n° 22; g) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA-As1-Shamir89 que codifica VP3, tal como la indicada en SEC ID n° 23; h) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA-A24cruzeiro que codifica VP3, tal como la indicada en SEC ID n° 24; i) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA-As1-Shamir89 que codifica VP1, tal como la indicada en SEC ID n° 25; j) una secuencia de ácidos nucleicos derivada de VFA-A24cruzeiro que codifica VP1, tal como la indicada en SEC ID n° 26.

La secuencia de aminoácidos del sitio de corte reconocido por la proteasa furina es la secuencia indicada en SEC ID En algunas realizaciones, los constructos pueden incluir una secuencia codificante de consenso C3 (SEC ID n° 28) que codifica una proteína de consenso de proteasa C3 (SEC ID n° 29).

Se proporciona además en la presente memoria una vacuna capaz de generar en un mamífero una respuesta inmunitaria contra una pluralidad de subtipos de virus de la fiebre aftosa (VFA), en los que la vacuna comprende un plásmido de ADN que comprende un promotor operablemente ligado a una secuencia codificante que codifica un antígeno del VFA de consenso que comprende las proteínas de cápside VP1-VP4 de uno o más subtipos de VFA y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el plásmido de ADN es capaz de expresar el antígeno de VFA de consenso en una célula del mamífero en una cantidad eficaz para inducir una amplia respuesta inmunitaria de reactividad cruzada en el mamífero. La vacuna puede generar una respuesta inmunitaria contra el VFA de subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o combinaciones de los mismos.

En la presente memoria se proporciona además una vacuna capaz de generar en un mamífero una respuesta inmunitaria contra una pluralidad de subtipos del virus de la fiebre aftosa (VFA), en el que la vacuna comprende uno o más plásmidos de ADN que comprenden un promotor operablemente ligado a una secuencia codificante que codifican un antígeno de VFA de consenso que comprende las proteínas de cápside VP1-VP4 de uno o más subtipos de VFA seleccionados del grupo que consiste en los subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o una combinación de los mismos y un excipiente farmacéuticamente aceptable de los mismos, en el que los plásmidos de ADN son capaces de expresar un antígeno de VFA de consenso en una célula del mamífero en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria en el mamífero. La vacuna puede administrarse en un mamífero, tal como un cerdo, rumiante, ser humano o primate. La vacuna puede inducir una respuesta inmunitaria en el mamífero, tal como una respuesta humoral, celular o ambas: una respuesta humoral y una respuesta celular.

En la presente memoria se proporciona además una vacuna capaz de generar en un mamífero una respuesta inmunitaria contra una pluralidad de subtipos de VFA, en la que la vacuna comprende un antígeno que comprende una o más secuencias de aminoácidos de consenso codificantes de las proteínas de cápside VP1-VP4 del virus de la fiebre aftosa (VFA) subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 o SAT3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable de los mismos. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en IL-2 e IL-15. El excipiente farmacéuticamente aceptable de la vacuna puede ser un agente facilitador de la transfección. El agente facilitador de la transfección puede ser un polianión, policatión o un lípido, tal como poli-L-glutamato, a una concentración inferior a 6 mg/ml. La vacuna puede administrarse en un mamífero, tal como un cerdo, rumiante, ser humano o primate. La vacuna puede inducir una respuesta inmunitaria en el mamífero, tal como una respuesta humoral, celular o ambas: una respuesta humoral y una respuesta celular.

En la presente memoria se proporciona además un método para inducir una respuesta inmunitaria contra una pluralidad de subtipos de virus VFA en un mamífero, que comprende administrar la vacuna de plásmido de ADN indicada en la presente memoria en el tejido del mamífero y electroporar células del tejido con un pulso de energía a una corriente constante eficaz para permitir la entrada del plásmido de ADN en las células. La administración de las vacunas de plásmido de ADN indicadas en la presente memoria puede llevarse a cabo mediante un método que puede comprender inyectar la vacuna de plásmido de ADN en el tejido intradérmico, subcutáneo o muscular. El plásmido de ADN del método puede administrarse prefijando la corriente y el pulso de energía a una corriente constante que equivalente a la presente corriente. La etapa de electroporación del método puede comprender además medir la impedancia en las células electroporadas, ajustando el nivel de energía del pulso de energía respecto a la impedancia medida para mantener una corriente constante en las células electroporadas, en el que la etapa de medición y ajuste se produce dentro del tiempo de vida del pulso energético. La etapa de electroporación puede comprender además la administración del pulso energético en una pluralidad de electrodos según un patrón de secuencia de los pulsos que administra el pulso energético en un patrón descentralizado.

Se da a conocer además un método e diagnóstico de mamíferos infectados por el VFA, en el que el método comprende aislar una muestra de líquido a partir del mamífero, aislar anticuerpos a partir de la muestra de líquido del mamífero y comparar los anticuerpos aislados con un mamífero de control en el que se ha inoculado la vacuna indicada en la presente memoria, en el que el mamífero de control sólo presenta anticuerpos contra las proteínas VP1-VP4 del VFA y el mamífero infectado por VFA presenta anticuerpos contra las proteínas VP1-VP4 del FVA y proteínas no estructurales del VFA. Las proteínas no estructurales pueden ser las polimerasas 2C, 3A y 3D del VFA.

Se dan a conocer métodos de inducir una respuesta inmunitaria contra uno o más subtipos del virus VFA en un mamífero. Los métodos comprenden utilizar una vacuna dada a conocer en la presente memoria y, en algunas realizaciones, incluyen las etapas de administración de una molécula de ácidos nucleicos codificantes de una proteína con secuencia inmunogénica del VFA en el tejido del mamífero, y electroporar las células del tejido con un pulso energético a una corriente constante eficaz para permitir la entrada del plásmido de ADN en las células.

Se da a conocer además un método de diagnóstico de un mamífero infectado por el VFA en un mamífero infectado según los procedimientos dados a conocer en la presente memoria. Los métodos comprenden aislar una muestra de líquido a partir del mamífero vacunado y detectar la presencia de proteínas del VFA no incluidas en dicha vacuna y/o anticuerpos contra proteínas del VFA no incluidas en dicha vacuna. La presencia de dichas proteínas y/o anticuerpos del VFA contra dichas proteínas del VFA indica que el mamífero vacunado ha sido infectado por el VFA.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una representación esquemática de un constructo de vacuna de ADN VFA-As1-Shamir-89 para el serotipo Asia 1 que indica que un inserto de As1 Shamir89 ha sido clonado en los sitios BamHI y Xho-1. El mapa plasmídico se basa en el plásmido pVAX. Pueden ser ejemplos del inserto de VFA-As1-Shamir, la forma larga, que se muestra en la figura 1, como pVFA-As1 Shamir-89-L, o la forma corta, que se muestra en la figura 1, como pVFA-As1 Shamir-89-S.

La figura 2 muestra un par de geles teñidos que muestran la clonación de As1-Shamir89-S (izquierda - SEC ID n° 7) y As1l-Shamir89-L (derecha- SEC ID n° 5) y la secuencia de aminoácidos para FMDV-As1-Shamir89-L forma larga (SEC ID n° 6 es una secuencia de VFA-As1-Shamir89-L forma larga). La secuencia incluía la secuencia líder de IgE en el extremo N-terminal sombreada, los sitios de corte proteolítico en minúscula y las secuencias de VP4 en negrita entre el líder de IgE y el primer sitio de corte proteolítico. La secuencia de VP1 se muestra en negrita entre el tercer y cuarto sitios de corte proteolítico y la secuencia de 2a entre el cuarto (último) sitio de corte proteolítico y la parada.

La figura 3 muestra una representación esquemática de un constructo de vacuna de ADN VFA-A24cruzeiro que indica que un inserto de A24cruzeiro ha sido clonado en los sitios BamHI y Xho-1. El mapa plasmídico se basa en el plásmido pVAX. Pueden ser ejemplos del inserto de VFA-A24cruzeiro, la forma larga, que se muestra en la figura 3, como pVFA-A24cruzeiro-L, o la forma corta, que se muestra en la figura 3, como pVFA-A24cruzeiro-S. La figura 4 muestra un par de geles teñidos que muestran la clonación de A24cruzeiro-S (izquierda - SEC ID n° 3) y A24cruzeiro-L (derecha- SEC ID n° 1) y la secuencia de aminoácidos para FMDV-A24cruzeiro-L forma larga (SEC ID n° 2 es una secuencia de VFA-A24cruzeiro-L forma larga). La secuencia incluía la secuencia líder de IgE en el extremo N-terminal sombreada, los sitios de corte proteolítico en minúscula y las secuencias de VP4 se muestra entre el líder de IgE y el primer sitio de corte proteolítico. La secuencia de VP1 muestra entre el tercer y cuarto sitios de corte proteolítico y la secuencia de 2a entre el último (cuarto) sitio de corte proteolítico y la parada. La figura 5 muestra una representación esquemática de un constructo de vacuna de ADN VFA-Sat2, que indica que un inserto de Sat2 se clona en los sitios BamHI1 y Xho-1. El mapa plasmídico se basa en el plásmido pVAX. Pueden ser ejemplos del inserto de VFA-Sat la forma larga, que se muestra en la figura 4 como pVFA-As1-Sat2-L o la forma corta, que se muestra en la figura 5 como pVFA-Sat2-S.

La figura 6 muestra un par de geles teñidos que muestran la clonación de Sat2-S (izquierda - SEC ID n° 11) y Sat2-L (derecha- SEC ID n° 9) y la secuencia de aminoácidos para FMDV-Sat2-L forma larga (SEC ID n° 10 es una secuencia de VFA-Sat2-L forma larga). La secuencia incluía la secuencia líder de IgE en el extremo N-terminal sombreada, los sitios de corte proteolítico en minúscula y las secuencias de VP4 se muestra entre el líder de IgE y el primer sitio de corte proteolítico. La secuencia de VP1 muestra entre el tercer y cuarto sitios de corte proteolítico y la secuencia de 2a entre el último (cuarto) sitio de corte proteolítico y la parada.

La figura 7 muestra los resultados experimentales de expresión de proteínas.

La figura 8 muestra un protocolo experimental de experimentos de inmunización utilizando la electroporación para evaluar las respuestas inmunitarias tras la administración de: 1) pVAX, 2) FMDV-A24cruzeiro-L, 3) FMDV-A24cruzeiro-S, 4) FMDV-Shamir89-L, 5) FMDV-Shamir89-S, FMDV-Sat2-L, FMDV-Sat2-S frente a la no exposición.

La figura 9 muestra datos de las respuestas inmunitarias celulares inducidas por las vacunas de VFA-A24cruzeiro-L y VFA-A24cruzeiro-S.

La figura 10 muestra datos de las respuestas inmunitarias celulares inducidas por las vacunas de VFA-AsI-Sharma89-L y VFA- As1-Sharma89-S.

La figura 11 muestra datos de las respuestas inmunitarias celulares inducidas por las vacunas de VFA-Sat2-L y VFA-Sat2-S.

La figura 12 muestra un protocolo experimental de transfección de ADN y preparación de lisados celulares para el análisis de ELISA.

La figura 13 muestra datos de inducción de anticuerpos en ratones inducidos por vacunas de VFA-A24cruzeiro-L y VFA-A24cruzeiro-S y por las vacunas VFA-As1-Sharma89-L y VFA-AsI-Sharma89-S.

La figura 14 muestra datos del análisis de ELISA de la unión de proteínas utilizando lisados de proteínas preparados a partir de células transfectadas por VFA-A24cruzeiro-L y células transfectadas por VFA-As1-Sharma89-L.

La figura 15 muestra comparaciones de secuencias de aminoácidos entre las secuencias Shamir y Cruzeiro. Las secuencias de VP4 Shamir (SEC ID n° 17) se muestran en comparación con las secuencias de VP4 Cruzeiro (SEC ID n° 18); se muestran las secuencias de VP2 Shamir (SEC ID n° 19) en comparación con secuencias de VP2 Cruzeiro (SEC iD n° 20) y secuencias 2A Shamir (SEC iD n° 21) en comparación con 2A Cruzeiro (SEC ID n° 22). La figura 16 muestra comparaciones de secuencias de aminoácidos entre las secuencias Shamir y Cruzeiro. Se muestras las secuencias de VP3 Shamir (Sec ID n° 23) en comparación con secuencias de VP3 Cruzeiro (SEC ID n° 24) y se muestran secuencias de VP1 Shamir (SEC ID n° 25) en comparación con secuencias de VP1 Cruzeiro (SEC ID n° 26).

La figura 17 muestra una representación esquemática de un constructo genérico de vacuna de ADN de VFA, que indica que un inserto de Sat2 se clona en los sitios BamHI1 y Xho-1. Un mapa plasmídico de la vacuna genérica de VFA se basa en el plásmido pVAX. Pueden ser ejemplos de los insertos de VFA la forma larga, que se muestra en la figura 17 como inserto de forma larga, o la forma corta, que se muestra en la figura 7 como inserto de forma corta. El líder de IgE mostrado en cada forma se indica que es opcional o puede sustituirse con un líder diferente. La secuencia de 2A se indica como opcional y el sitio de corte de furina (rgrkrrs - SEC ID n° 27) se indica como sustituible.

Descripción detallada

Se han generado secuencias de aminoácidos de consenso para proteínas de fusión que comprende múltiples proteínas del VFA y proteínas del VFA individuales de diversos serotipos. También se han generado moléculas de ácidos nucleicos codificantes de las proteínas.

En un aspecto de la presente exposición, hay proteínas de fusión que comprenden las proteínas del VFA, VP1, VP2, VP3, VP4 y/o 2A y/o 3C y secuencias de ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas, que pueden generarse y utilizarse en una vacuna para proporcionar protección de los mamíferos frente a la enfermedad de la fiebre aftosa en uno o más subtipos del VFA, incluyendo A, Asia 1, O, C, SAT1, SAT2 y SAT3. Preferentemente, el gen de VP1 es un consenso para un subtipo seleccionado del VFA, p.ej., tal como se indica en la presente memoria es VFA-Sat2, en el que VP1 es una VP1 de consenso Sat2.

Aunque sin respaldo de ninguna teoría científica, una vacuna dirigida contra las secuencias de aminoácidos de consenso de VP1, VP2, VP3 y/o VP4 para uno o más subtipos del VFA presentará un gran repertorio de epítopos que resultarán eficaces para la inducción de una respuesta inmunitaria eficaz (humoral, celular o ambos) contra una mayoría de las especies de cada subtipo de VFA. Aunque sin respaldo de ninguna teoría científica, VP1 es una excelente diana inmunogénica para una vacuna dirigida contra las secuencias de aminoácidos de consenso de VP1. VP1 es un inmunógeno predominante.

Entre los constructos de algunas realizaciones se incluyen una forma larga y una forma corta. Los constructos de algunas realizaciones proporcionan las proteínas víricas VP1, VP2, VP3 y VP4 en un orden específico. VP4 - VP2 -VP3 - VP1. Se proporciona además una cola opcional, 2A. Los constructos presentan una secuencia líder de IgE opcional. Al expresarse, se proporciona un sitio de corte proteolítico “SC” entre cada una de VP4, VP2, VP3 y VP1 y en caso de presencia de 2A. La proteasa que puede procesar el sitio puede ser furina en algunas realizaciones, o una proteasa del VFA en algunas realizaciones. Pueden utilizarse otros sitios de proteasa. El sitio debe ser reconocido por una proteasa observada comúnmente en células en la que se expresa la vacuna.

En un aspecto de la presente exposición, hay proteínas de fusión que comprenden las proteínas del VFA de consenso VP1, VP2, VP3, VP4 y/o 2A y/o 3C, y en un aspecto de la presente invención, se proporcionan secuencias de los ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas, que pueden generarse y utilizarse en una vacuna para proporcionar protección a mamíferos frente a la enfermedad de la fiebre aftosa en uno o más subtipos del VFA, incluyendo A, Asia 1, O, C, SAT1, SAT2 y SAT3.

En otro aspecto de la presente exposición, hay proteínas de fusión que comprenden la proteína del VFA de consenso VP1, y en un aspecto de la presente invención, se proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de dicha proteína, de dos subtipos diferentes que pueden generarse y utilizarse en una vacuna para proporcionar protección a mamíferos frente a la enfermedad de la fiebre aftosa en uno o más subtipos del VFA, incluyendo A, Asia 1, O, C, SAT1, SAT2 y SAT3.

En otro aspecto de la presente exposición, hay proteínas del VFA de consenso VP1 y, en un aspecto de la presente invención, se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos codificantes de ellas que pueden generarse y utilizarse en una vacuna para proporcionar protección a mamíferos frente a la enfermedad de la fiebre aftosa en uno o más subtipos del VFA, incluyendo A, Asia 1, O, C, SAT1, SAT2 y SAT3.

1. Definiciones.

La terminología utilizada en la presente memoria presenta el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitativa. Tal como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas individuales “un”, “una” y “el” o “ la”, incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Para la recitación de intervalos numéricos en la presente memoria, se encuentra explícitamente contemplado cada número comprendido entre los extremos de los intervalos con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6 a 9, los números 7 y 8 se encuentran contemplados además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se encuentran explícitamente contemplados los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

a. Adyuvante

“Adyuvante” tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a cualquier molécula añadida a las vacunas de plásmido de ADN indicadas en la presente memoria para potenciar la antigenicidad del antígeno del virus de la fiebre aftosa (VFA) codificado por los plásmidos de ADN y secuencias de ácidos nucleicos codificantes indicadas posteriormente en la presente memoria.

b. Anticuerpo

“Anticuerpo” puede significar un anticuerpo de las clases IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, o fragmentos, fragmentos o derivados de los mismos, incluyendo Fab, F(ab')², Fd y anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos bifuncionales y derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo aislado a partir de la muestra de suero del mamífero, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo purificado por afinidad o mezclas de los mismos, que muestran suficiente especificidad de unión para un epítopo deseado o una secuencia derivada del mismo.

c. Secuencia codificante

“Secuencia codificante” o “ácido nucleico codificante” tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse al ácido nucleico (molécula de ARN o ADN) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. La secuencia codificante puede incluir además señales de inicio y terminación operablemente ligadas a elementos reguladores, incluyendo un promotor y señal de poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células de un individuo o mamífero en el que se administra el ácido nucleico.

d. Complemento

“Complemento” o “complementario” tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a un ácido nucleico, puede referirse a apareamiento de bases de Watson-Crick (p.ej., A-T/U y C-G) o de Hoogsteen entre nucleótidos o análogos de nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos.

e. Consenso o secuencia de consenso

“Consenso” o “secuencia de consenso” tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a una secuencia de ácidos nucleicos sintético o secuencia polipeptídica correspondiente, construida basándose en el análisis de una alineación de múltiples subtipos de un antígeno de influenza particular, que puede utilizarse para inducir una inmunidad amplia contra múltiples subtipos o serotipos de un antígeno de influenza particular. Entre los antígenos del VFA de consenso pueden incluirse secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de VP1, VP2, VP3, VP4 y proteasa C2. Además, pueden manipularse antígenos sintéticos, tales como proteínas de fusión, formando secuencias de consenso (o antígenos de consenso).

f. Corriente constante

“Corriente constante” tal como se utiliza en la presente memoria define una corriente que resulta recibida o experimentada por un tejido, o células que definen dicho tejido, a lo largo de la duración de un pulso eléctrico suministrado a dicho tejido. El pulso eléctrico se administra a partir del dispositivo de electroporación indicado en la presente memoria. Dicha corriente mantiene un amperaje constante en dicho tejido durante la vida del pulso eléctrico debido a que el dispositivo de electroporación dado a conocer en la presente memoria presenta un elemento de retroalimentación, preferentemente presenta una retroalimentación instantánea. El elemento de retroalimentación puede medir la resistencia del tejido (o células) durante toda la duración del pulso y causar que el dispositivo de electroporación altere su producción de energía eléctrica (p.ej., un voltaje incrementado), de manera que la corriente en el mismo tejido se mantiene constante durante todo el pulso eléctrico (del orden de microsegundos), y de pulso a pulso. En algunas realizaciones, el elemento de retroalimentación comprende un controlador.

g. Retroalimentación de corriente o retroalimentación

“Retroalimentación de corriente” o “retroalimentación” tal como se utiliza en la presente memoria puede utilizarse intercambiablemente y puede significar la respuesta activa de los dispositivos de electroporación dados a conocer, que comprende medir la corriente en el tejido entre los electrodos y alterar la salida de energía administrada por el dispositivo de EP correspondientemente a fin de mantener la corriente en un nivel constante. Dicho nivel constante es prefijado por el usuario antes de iniciar una secuencia de pulsos o tratamiento eléctrico. La retroalimentación puede conseguirse con el componente de electroporación, p.ej., el controlador, del dispositivo de electroporación, ya que el circuito eléctrico en el mismo es capaz de monitorizar continuamente la corriente en el tejido entre los electrodos y comparar la corriente monitorizada (o corriente dentro del tejido) con una corriente prefijada y realizar continuamente ajustes de la salida energética a fin de mantener la corriente monitorizada en los niveles prefijados. El bucle de retroalimentación puede ser instantáneo, ya que es una retroalimentación de bucle cerrado analógica.

h. Corriente descentralizada

“Corriente descentralizada” tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse al patrón de corrientes eléctricas administradas a partir de las diversas matrices de electrodos de aguja de los dispositivos de electroporación indicados en la presente memoria, en los que los patrones minimizan, o preferentemente eliminan, la incidencia de estrés térmico relacionado con la electroporación en cualquier zona de tejido sometido a electroporación.

i Electroporación

“Electroporación”, “electro-permeabilización” o “potenciación electrocinética” (“PE”) tal como se utilizan intercambiablemente en la presente memoria pueden referirse a la utilización de un pulso de campo eléctrico transmembranal para inducir rutas microscópicas (poros) en una membrana biológica; su presencia permite que moléculas biológicas tales como plásmidos, oligonucleótidos, ARNip, fármacos, iones y agua pasen de una cara de la membrana celular a la otra.

j. Mecanismo de retroalimentación

“Mecanismo de retroalimentación” tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a un procedimiento llevado a cabo mediante software o hardware (o firmware), en el que se recibe y compara la impedancia del tejido deseado (antes, durante y/o después de la administración de un pulso de energía) con un valor actual, preferentemente de corriente, y ajusta el pulso de energía administrado para conseguir el valor prefijado. Puede utilizarse un mecanismo de retroalimentación mediante un circuito de bucle cerrado analógico.

k. Fragmento

“Fragmento” tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a una parte o a un ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero sustancialmente similar al del no fragmento para por lo menos un subtipo de VFA, tal como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 o SAT3. Los fragmentos pueden comprender por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de una proteína del VFA codificada por una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID n° 1, 3, 5, 7, 9 o 11. Los fragmentos de ADN pueden presentar una longitud de 30 o más nucleótidos, de 45 o más, de 60 o más, de 75 o más, de 90 o más, de 120 o más, de 150 o más, de 180 o más, de 210 o más, de 240 o más, de 270 o más, de 300 o más, de 360 o más, de 420 o más, de 480 o más, de 540 o más, de 600 o más, de 660 o más, de 720 o más, de 780 o más, de 840 o más, de 900 o más, de 960 o más, de 1020 o más, de 1080 o más, de 1140 o más, de 1200 o más, de 1260 o más, de 1320 o más, de 1380 o más, de 1440 o más, de 1500 o más, de 1560 o más, de 1620 o más, de 1680 o más, de 1740 o más, de 1800 o más, de 1860 o más, de 1820 o más, 1880 o más, 1940 o más, 2000 o más, 2600 o más, de 2700 o más, 2800 o más, 2900 o más, 2910 o más, de 2920 o más, de 2930 o más, de 2931 o más, de 2932 o más, de 2933 o más, de 2934 o más, de 2935 o más, de 2936 o más, de 2937 o más, o de 2938 o más.

Los fragmentos de ADN pueden comprender secuencias codificantes del líder de inmunoglobulina, tal como secuencias de igE o IgG.

Los fragmentos de ADN pueden presentar menos de 10 nucleótidos, menos de 20, menos de 30, menos de 40, menos de 50, menos de 60, menos de 75, menos de 90, menos de 120, menos de 150, menos de 180, menos de 210, menos de 240, menos de 270, menos de 300, menos de 360, menos de 420, menos de 480, menos de 540, menos de 600, menos de 660, menos de 720, menos de 780, menos de 840, menos de 900, menos de 960, menos de 1020, menos de 1080, menos de 1140, menos de 1200, menos de 1260, menos de 1320, menos de 1380, menos de 1440, menos de 1500, menos de 1560, menos de 1620, menos de 1680, o menos de 1740 nucleótidos, menos de 1800, menos de 1860, menos de 1820, menos de 1880, menos de 1940, menos de 2000, menos de 2600, menos de 2700, menos de 2800, menos de 2900, menos de 2910, menos de 2920, menos de 2930, menos de 2931, menos de 2932, menos de 2933, menos de 2934, menos de 2935, menos de 2936, menos de 2937, o menos de 2938.

“Fragmento” también puede referirse a un fragmento polipeptídico que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero sustancialmente similar a la del no fragmento para como mínimo un subtipo de VFA, tal como A, Asia l. C, O, SAT1, SAT2 o SAT3. El fragmento puede ser un fragmento polipeptídico seleccionado de por lo menos una de las diversas secuencias polipeptídicas de la presente exposición, incluyendo las SEC ID n° 2, 4, 6, 8, 10 o 12. El fragmento polipeptídico puede analizarse para entrar en contacto con por lo menos un epítopo antigénico tal como proporciona una base de datos disponible públicamente, tal como la base de datos de secuencias de VFA del Los Alamos National Laboratory. Los fragmentos de proteínas pueden comprender por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de una proteína del VFA indicada en las poliproteínas mostradas en SEC ID n° 2, 4, 6, 8, 10 o 12. Los polipéptidos pueden comprender secuencias de aminoácidos del líder de inmunoglobulina, tal como IgE o IgG. Los fragmentos polipeptídicos pueden presentar una longitud de 30 o más aminoácidos, de 45 o más, de 60 o más, de 75 o más, de 90 o más, de 120 o más, de 150 o más, de 180 o más, de 210 o más, de 240 o más, de 270 o más, de 300 o más, de 360 o más, de 420 o más, de 480 o más, de 540 o más, de 600 o más, de 660 o más, o de 710 aminoácidos o más. Los fragmentos de polipéptido pueden presentar una longitud de menos de 10 aminoácidos, de menos de 20, de menos de 30, de menos de 40, de menos de 50, de menos de 60, de menos de 75, de menos de 90, de menos de 120, de menos de 150, de menos de 180, de menos de 210, de menos de 240, de menos de 270, de menos de 300, de menos de 360, de menos de 420, de menos de 480, de menos de 540, de menos de 600, de menos de 660, de menos de 700, de menos de 701, de menos de 702, de menos de 703, de menos de 704, de menos de 705, de menos de 706, de menos de 707, de menos de 708, de menos de 709, o de menos de 710 aminoácidos.

l. Homología

Puede generarse homología de múltiples alineaciones de secuencias utilizando ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

m. Idéntico

“ Idéntico” o “ identidad” tal como se utiliza en la presente memoria en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, puede referirse a que las secuencias presentan un porcentaje especificado de residuos que son iguales a lo largo de una región especificada. El porcentaje puede calcularse mediante alineación óptima de las dos secuencias, comparando las dos secuencias a lo largo de la región especificada, determinando el número de posiciones en las que se encuentra un residuo idéntico en ambas secuencias, rindiendo el número de posiciones correspondientes, dividiendo el número de posiciones correspondientes por el número total de posiciones en la región específica y multiplicando el resultado por 100, que rinde el porcentaje de identidad de secuencias. En los casos en que dos secuencias son de longitud diferente o la alineación produce uno o más extremos escalonados y la región especificada de comparación incluye únicamente una sola secuencia, los residuos de la secuencia única se incluyen en el denominador, aunque no en el denominador del cálculo. Al comparar ADN y ARN, la timina (T) y el uracilo (U) pueden considerarse equivalentes. La identidad puede calcularse manualmente o mediante la utilización de un algoritmo de secuenciación informático, tal como BLAST o BLAST 2.0.

n. Impedancia

“ Impedancia” tal como se utiliza en la presente memoria puede utilizarse al comentar el mecanismo de retroalimentación y puede convertirse en el valor actual según la ley de Ohm, permitiendo de esta manera comparaciones con la corriente prefijada.

o. Respuesta inmunitaria

“Respuesta inmunitaria” tal como se utiliza en la presente memoria puede significar la activación del sistema inmunitario del huésped, p.ej., de un mamífero, en respuesta a la introducción de un antígeno de consenso del VFA mediante las vacunas de plásmido de ADN proporcionadas. La respuesta inmunitaria puede ser en forma de una respuesta celular o humoral, o ambas.

p. Ácido nucleico

“Ácido nucleico” u “oligonucleótido” o “polinucleótido” tal como se utiliza en la presente memoria puede significar por lo menos dos nucleótidos unidos covalentemente entre sí. La ilustración de una sola cadena también define la secuencia de la cadena complementaria. De esta manera, un ácido nucleico también comprende la cadena complementaria de una cadena sencilla ilustrada. Pueden utilizarse muchas variantes de un ácido nucleico con el mismo fin como ácido nucleico dado. De esta manera, un ácido nucleico comprende además ácidos nucleicos sustancialmente idénticos y complementos de los mismos. Una cadena sencilla proporciona una sonda que puede hibridarse con una secuencia diana bajo condiciones de hibridación restrictivas. De esta manera, un ácido nucleico comprende además una sonda que se hibrida bajo condiciones de hibridación restrictivas.

Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla o de doble cadena, o pueden contener partes de secuencia de doble cadena y de cadena sencilla. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, en el que el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, y combinaciones de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Pueden obtenerse ácidos nucleicos mediante métodos de síntesis química o mediante métodos recombinantes.

Un ácido nucleico generalmente contiene enlaces fosfodiéster, aunque pueden incluirse análogos de ácidos nucleicos que pueden presentar por lo menos un enlace diferente, p.ej., enlaces fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato o O-metilfosforamidita y esqueletos y enlaces de ácido péptido-nucleico. Entre otros ácidos nucleicos análogos se incluyen aquellos con esqueletos positivos, esqueletos no iónicos y esqueletos no de ribosa, incluyendo los indicados en la patente US n° 5.235.033 y n° 5.034.506. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más nucleótidos no naturales o modificados también se encuentran incluidos en la definición de ácidos nucleicos. El análogo de nucleótido modificado puede estar situado, por ejemplo, en el extremo 5' y/o en el extremo 3' de la molécula de ácidos nucleicos. Pueden seleccionarse ejemplos representativos de análogos de nucleótidos a partir de ribonucleótidos de sacárido o esqueleto modificado. Sin embargo, debe indicarse que también resultan adecuados ribonucleótidos de nucleobase modificada, es decir, ribonucleótidos, que contienen una nucleobase no natural en lugar de una nucleobase natural, tal como uridinas o citidinas modificadas en la posición 5, p.ej., 5-(2-amino)propil-uridina, 5-bromo-uridina; adenosinas y guanosinas modificadas en la posición 8, p.ej., 8-bromo-guanosina; nucleótidos deaza, p ej., 7-deaza-adenosina, nucleótidos O- y N-alquilados, p.ej., N-6-metil-adenosina. El grupo 2'-OH puede sustituirse por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, s H, SR, NH², NHR, NR²o CN, en el que R es alquilo C¹-C⁶, alquenilo o alquinilo, y halo es F, Cl, Br o I. Entre los nucleótidos modificados se incluyen además nucleótidos conjugados con colesterol mediante, p.ej., un enlace hidroxiprolinol, tal como se indica en Krutzfeldt et al., Nature (oct. 30, 2005), Soutschek et al., Nature 432:173-178, 2004 y la publicación de patente US n° 20050107325. Los nucleótidos y ácidos nucleicos modificados también pueden incluir ácidos nucleicos bloqueados (ANB), tal como se indica en la patente US n° 2002/0115080. Se describen nucleótidos y ácidos nucleicos modificados adicionales en la publicación de patente US n° 2005/0182005. Pueden llevarse a cabo modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato por una diversidad de motivos, p.ej., para incrementar la estabilidad y semivida de dichas moléculas en medios fisiológicos, para potenciar la difusión a través de las membranas celulares o como sondas en un biochip. Pueden prepararse mezclas de ácidos nucleicos naturales y análogos; alternativamente, pueden prepararse mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos y mezclas de ácidos nucleicos naturales y análogos.

q. Operablemente ligado

“Operablemente ligado” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que la expresión de un gen se encuentra bajo el control de un promotor con el que se encuentra conectado espacialmente. Un promotor puede estar situado 5' (cadena arriba) o 3' (cadena abajo) de un gen bajo su control. La distancia entre el promotor y un gen puede ser aproximadamente igual a la distancia entre dicho promotor y el gen que controla en el gen a partir del cual se deriva el promotor. Tal como es conocido de la técnica, la variación en dicha distancia puede incluirse sin pérdida de función del promotor.

r. Promotor

“Promotor” tal como se utiliza en la presente memoria puede significar una molécula sintética o de origen natural que es capaz de conferir, activar o potenciar la expresión de un ácido nucleico en una célula. Un promotor puede comprender una o más secuencias reguladoras de la transcripción específicas para potenciar adicionalmente la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal del mismo. Un promotor puede comprender además elementos potenciadores o represores distales, que pueden estar situados hasta a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor puede derivarse de fuentes víricas, bacterianas, fúngicas, vegetales, de insecto y de animales. Un promotor puede regular la expresión de un componente génico constitutivamente, o diferencialmente con respecto a la célula, el tejido u órgano en el que se produce la expresión o con respecto a la etapa de desarrollo en la que se produce la expresión, o en respuesta a estímulos externos, tales como tensiones fisiológicas, patógenos, iones metálicos o agentes inductores. Entre los ejemplos representativos de promotores se incluyen el promotor del bacteriófago T7, el promotor del bacteriófago T3, el promotor SP6, el promotor del operador lac, el promotor tac, el promotor tardío de SV40, el promotor temprano de SV40, el promotor RSV-LTR, el promotor IE del CMV, el promotor temprano de SV40 o el promotor tardío de SV40 y el promotor IE del CMV.

s. Condiciones de hibridación restrictiva

“Condiciones de hibridación restrictivas” tal como se utiliza en la presente memoria puede significar condiciones bajo las que una primera secuencia de ácidos nucleicos (p.ej., una sonda) se hibridará con una segunda secuencia de ácidos nucleicos (p.ej., una diana), tal como en una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las condiciones restrictivas son dependientes de la secuencia y serán diferentes bajo diferentes circunstancias. Las condiciones restrictivas pueden seleccionarse de manera que sean aproximadamente 5°C a 10°C más bajas que el punto de fusión térmica (Tf) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definida. La Tf puede ser la temperatura (bajo fuerza iónica, pH y concentración de ácidos nucleicos definidos) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (debido a que las secuencias diana se encuentran presentes en exceso, a Tf, el 50% de las sondas se encuentran ocupadas en el equilibrio). Las condiciones restrictivas pueden ser aquellas en las que la concentración salina es inferior a aproximadamente 1,0 M de ion sodio, tal como entre aproximadamente 0,01 y 1,0 M de concentración de ion sodio (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (p.ej., aproximadamente 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (p.ej., de más de aproximadamente 50 nucleótidos). También pueden conseguirse condiciones restrictivas con la adición de agentes desestabilizadores, tales como la formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser por lo menos 2 a 10 veces la hibridación de fondo. Entre las condiciones ejemplares de hibridación restrictiva se incluyen las siguientes: Formamida al 50%, 5x SSC y SDS al 1%, incubando a 42°C, o 5x SSC, SDS al 1%, incubando a 65°C con un lavado en 0,2x SSC y SDS al 0,1% a 65°C.

t. Sustancialmente complementario

“Sustancialmente complementario” tal como se utiliza en la presente memoria puede significar que una primera secuencia es por lo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica al complemento de una segunda secuencia en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos o aminoácidos, o que las dos secuencias se hibridan bajo condiciones de hibridación restrictiva.

u. Sustancialmente idéntico

“Sustancialmente idéntico” tal como se utiliza en la presente memoria puede significar que una primera y una segunda secuencias son por lo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticas en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos o aminoácidos, o con respecto a ácidos nucleicos, en el caso de que la primera secuencia sea sustancialmente complementaria al complemento de la segunda secuencia.

v. Subtipo o serotipo

“Subtipo” o “serotipo” tal como se utiliza en la presente memoria intercambiablemente y en referencia a los virus VFA, y se refiere a variantes genéticas de un antígeno del virus VFA en las que un subtipo es reconocido por el sistema inmunitario como diferente de otro subtipo.

w. Variante

“Variante” utilizada en la presente memoria con respecto a un ácido nucleico puede significar: (i) una parte o fragmento de una secuencia de nucleótidos mencionada, (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos mencionada o parte de la misma, (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico mencionado o el complemento del mismo, o (iv) un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones restrictivas con el ácido nucleico mencionado, complemento del mismo, o una secuencia sustancialmente idéntica al mismo.

“Variante” con respecto a un péptido o polipéptido que difiere en su secuencia de aminoácidos por inserción, deleción o sustitución conservadora de aminoácidos, aunque conserva por lo menos una actividad biológica. Variante puede significar también una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína mencionada con una secuencia de aminoácidos que conserva por lo menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, sustituir un aminoácido por un aminoácido diferente de propiedades similares (p.ej., hidrofilicidad, grado y distribución de zonas con carga) se reconoce en la técnica que típicamente implica un cambio menor. Dichos cambios menores pueden identificarse, en parte, mediante la consideración del índice hidropático de aminoácidos, tal como se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982. El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Es conocido de la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden sustituirse y todavía conservan la función de la proteína. En un aspecto, se sustituyen los aminoácidos con índices hidropáticos de ±2. El hidrofilicidad de aminoácidos también puede utilizarse para revelar sustituciones que resultarían en proteínas que conservan la función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la hidrofilicidad media local máxima de ese péptido, una medida útil que se ha informado que se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. Se hace referencia a la patente US n° 4.554.101 en la presente memoria. La sustitución de aminoácidos con valores de hidrofilicidad similares puede resultar en péptidos que conservan la actividad biológica, por ejemplo la inmunogenicidad, tal como se entiende en la técnica. Pueden llevarse a cabo sustituciones con aminoácidos que presentan valores de hidrofilicidad a ±2 unos de otros. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influidos por la cadena lateral particular de ese aminoácido. En concordancia con dichas observaciones, las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica se entiende que dependen de la similitud relativa de los aminoácidos y particularmente de las cadenas laterales de dichos aminoácidos, tal como revela la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y otras propiedades.

x. Vector

“Vector”, utilizado en la presente memoria, puede referirse a una secuencia de ácidos nucleicos que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un plásmido, bacteriófago, cromosoma bacteriano artificial o cromosoma artificial de levadura. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. Un vector puede ser un vector extracromosómico autorreplicante o un vector que se integra en el genoma del huésped.

2. Proteínas y secuencias codificantes del VFA

Los genomas de cada uno de los subtipos A, C, O, Asia, SAT1, SAT2 y SAT3 se encuentran en GenBank en los números de acceso siguientes:

A: JF749843

C: NC_002554

O: JF749851

Asia: DQ533483

SAT-1: JF749860

SAT-2: JF749862

SAT-3: NC_011452

Estos pueden utilizarse para localizar secuencias codificantes para cada uno de VP1, VP2, VP3 y VP4 para cada uno de los subtipos A, C, O, Asia, SAT1, SAT2 y SAT3. De manera similar, tal como se ha indicado anteriormente, el documento n° WO 2011/054011, da a conocer vacunas del VFA con VP1, VP2, VP3, VP4 de subtipos de VFA, A, C, O, Asia, SAT1, SAT2 y SAT3, aunque utilizando un diseño diferente. El experto en la materia podría identificar secuencias codificantes de cada de una de las proteínas de VFA, VP1, VP2, VP3 y VP4 de subtipos A, C, O, Asia, SAT1, SAT2 y SAT3, utilizando la información en el documento n° WO 2011/054011 y GenBank.

En algunos constructos pueden utilizarse proteínas homólogas que son 95% o más, 96%o más, 97% o más, 98% o más, o 99% o más homólogas respecto a las proteínas de VFA, VP1, VP2, VP3 o VP4 de los subtipos A, C, O, Asia, SAT1, SAT2 o SAT3.

En algunos constructos pueden utilizarse fragmentos de proteínas de VFA VP1, VP2, VP3 o VP4 de los subtipos A, C, O, Asia, SAT1, SAT2 o SAT3 con 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más, o 99% o más de la secuencia de longitud completa.

En algunos constructos pueden utilizarse fragmentos de proteínas que son 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más, o 99% o más homólogas respecto a las proteínas de VFA Vp1, VP2, VP3 o VP4 de los subtipos A, C, O, Asia, SAT1, SAT2 o SAT3, y que presentan 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más, o 99% o más de la secuencia de longitud completa.

En constructos pueden utilizarse secuencias codificantes de dichas proteínas de VFA, proteínas homólogas, fragmentos de proteínas de VFA y fragmentos de proteínas homólogas.

Puede encontrarse presente un sitio de corte proteolítico nativo entre cada una de las secuencias de antígeno de consenso, tal como la secuencia de aminoácidos: RGRKRRS.

En la presente memoria se proporciona un antígeno capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más e los subtipos de virus de la enfermedad de la fiebre aftosa (VFA). El antígeno puede ser un antígeno de VFA que comprende las proteínas de cápside VP1, VP2, VP3, VP4, un consenso de las mismas, una variante de las mismas, un fragmento de las mismas o una combinación de las mismas. El antígeno de VFA puede ser VFA de subtipo A, Asia 1, C, O, SAT, SAT2 o SAT3. El antígeno de VFA puede contener por lo menos un epítopo antigénico que puede resultar eficaz contra inmunógenos particulares del VFA contra los que puede inducirse una respuesta inmunitaria. Las proteínas de cápside vírica vacía VP1-VP4 del antígeno de VFA proporcionan un repertorio completo de sitios inmunogénicos y epítopos presentes en un virus VFA intacto. La secuencia de VFA de consenso puede derivarse de las secuencias de antígeno del VFA de una pluralidad de virus VFA de un subtipo de VFA. El antígeno de VFA de consenso puede comprender secuencias de proteína de consenso de VP1, VP2, VP3 y VP4 de subtipo de VFA, que puede ser una proteína de consenso VP1-VP4. La proteína VP1-VP4 de consenso puede comprender por lo menos un sitio de corte de proteasa 3C del VFA. El sitio de corte de proteasa 3C puede encontrarse presente entre cada una de las secuencias de VP1, VP2, VP3 y VP4 de consenso de la proteína VP1-4 de consenso. El corte de la proteína VP1-VP4 de consenso por la proteasa 3C puede cortar la proteína VP1-VP4 de consenso para producir una proteína VP1- de consenso, una proteína VP2- de consenso, una proteína VP3- de consenso y una proteína VP4 de consenso. Puede encontrarse presente un sitio de corte proteolítico nativo entre cada una de las secuencias de antígeno de consenso, tal como la secuencia de aminoácidos: RGRKRRS.

En algunas realizaciones, las proteínas son 80% homólogas. En algunas realizaciones, las proteínas son 90% homólogas. En algunas realizaciones, las proteínas son 95% homólogas. En algunas realizaciones, las proteínas son 96% homólogas. En algunas realizaciones, las proteínas son 97% homólogas. En algunas realizaciones, las proteínas son 98% homólogas. En algunas realizaciones, las proteínas son 99% homólogas.

En la presente memoria se proporcionan secuencias codificantes de antígenos capaces de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más subtipos del virus de la fiebre aftosa (VFA). El antígeno puede ser un antígeno de VFA que comprende las proteínas de cápside VP1, VP2, VP3, VP4, un consenso de las mismas, una variante de las mismas, un fragmento de las mismas o una combinación de las mismas. El antígeno de VFA puede ser VFA de subtipo A, Asia 1, C, O, SAT, SAT2 o SAT3. El antígeno de VFA puede contener por lo menos un epítopo antigénico que puede resultar eficaz contra inmunógenos particulares del VFA contra los que puede inducirse una respuesta inmunitaria. Las proteínas de cápside vírica vacía VP1-4 del antígeno de VFA proporcionan un repertorio completo de sitios inmunogénicos y epítopos presentes en un virus VFA intacto. La secuencia de VFA de consenso puede derivarse de las secuencias de antígeno del VFA de una pluralidad de virus VFA de un subtipo de VFA. El antígeno de VFA de consenso puede comprender secuencias de proteína de consenso de VP1, VP2, VP3 y VP4 de subtipo de VFA, que puede ser una proteína de consenso VP1-4. La proteína VP1-4 de consenso puede comprender por lo menos un sitio de corte 3C de proteína del VFA. El sitio de corte de proteasa 3C puede encontrarse presente entre cada una de las secuencias de VP1, VP2, VP3 y VP4 de consenso de la proteína VP1-4 de consenso. El corte de la proteína VP1-4 de consenso por la proteasa 3C puede cortar la proteína VP1-4 de consenso para producir una proteína VP1- de consenso, una proteína VP2- de consenso, una proteína VP3- de consenso y una proteína VP4 de consenso. Puede encontrarse presente un sitio de corte proteolítico nativo entre cada una de las secuencias de antígeno de consenso, tal como la secuencia de aminoácidos: RGRKRRS. Se proporcionan secuencias codificantes de proteínas de fusión que comprenden el consenso de la proteasa 3C.

Adicionalmente, las secuencias codificantes pueden codificar proteínas o pueden ser fragmentos de las proteínas indicadas en la presente memoria. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 20% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 30% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 40% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 50% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 60% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 70% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 85% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 90% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 95% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 96% de la proteína de consenso. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 97% de la proteína de consenso. I

Adicionalmente, las secuencias codificantes pueden codificar proteínas que son homólogas respecto a las proteínas dadas a conocer en la presente memoria. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 80% homólogas. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 90% homólogas. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 95% homólogas. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 96% homólogas. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 97% homólogas. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 98% homólogas. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 99% homólogas.

Adicionalmente, las secuencias codificantes codifican proteínas que son fragmentos de proteínas homólogas de las proteínas indicadas en la presente memoria. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 20% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 30% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 40% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 50% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 60% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 70% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 80% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 90% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 95% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 96% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 97% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 98% de la proteína homóloga. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 99% de la proteína homóloga.

3. Plásmido

En la presente memoria se proporciona un vector que es capaz de expresar uno o más antígenos del VFA en la célula de un mamífero en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria en el mamífero. El vector puede comprender ácido nucleico heterólogo codificante del antígeno del VFA. El vector puede ser un plásmido. El plásmido puede resultar útil para transfectar células con ácidos nucleicos codificantes de un antígeno del VFA, en el que la célula huésped transformada se cultiva y se mantiene bajo condiciones en las que tiene lugar la expresión del antígeno de VFA.

El plásmido puede comprender un ácido nucleico codificante de un antígeno de VFA seleccionado de las proteínas dadas a conocer en la presente memoria, fragmentos de las mismas, secuencias homólogas de las mismas y fragmentos de homólogas. El plásmido puede comprender además un codón de inicio o secuencia líder, que puede encontrarse cadena arriba de la secuencia codificante y un codón de parada, que puede encontrarse cadena abajo de la secuencia codificante. El codón de inicio y terminación puede encontrarse en el mismo marco que la secuencia codificante.

El plásmido puede comprender además un promotor que se encuentra operablemente ligado a la secuencia codificante. El promotor operablemente ligado a la secuencia codificante puede ser un promotor del virus 40 del simio (SV40), un promotor del virus del tumor mamario de ratón (VTMR), un promotor del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tal como el promotor de la repetición terminal larga (RTL) del virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), un promotor del virus de Moloney, un promotor del virus la leucosis aviar (VLA), un promotor de citomegalovirus (CMV), tal como el promotor temprano inmediato del CMV, un promotor del virus de Epstein-Barr (VEB) o un promotor de virus del sarcoma de Rous (VSR). El promotor puede ser además un promotor de un gen humano, tal como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana o metalotioneína humana. El promotor puede ser además un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico muscular o cutáneo, natural o sintético. Se indican ejemplos de dichos promotores en la solicitud publicada de patente US n° US2004/0175727.

El plásmido puede comprender además una señal de poliadenilación, que puede encontrarse cadena abajo de la secuencia codificante. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación de SV40, una señal de poliadenilación de RTL, una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina (HCb), una señal de poliadenilación de hormona del crecimiento humana (HCh) o una señal de poliadenilación de p-globina humana. La señal de poliadenilación de SV40 puede ser una señal de poliadenilación de un plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego, c A).

El plásmido puede comprender además un intensificador situado cadena arriba de la secuencia codificante. El intensificador puede ser actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana o un intensificador vírico, tal como uno de CMV, VFA, VSR o VEB. Los potenciadores de la función de polinucleótidos se describen en las patentes US n° 5.593.972 y n° 5.962.428 y en el documento n° WO94/016737.

El plásmido puede comprender además un origen de replicación de mamífero a fin de mantener el plásmido extracromosómicamente y producir múltiples copias del plásmido en una célula. El plásmido puede ser pVAXI, pCEP4 o pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA), que pueden comprender el origen de replicación del virus de Epstein-Barr y la región codificante del antígeno nuclear EBNA-1, que puede producir una replicación episómica de alto número de copia sin integración. El esqueleto del plásmido puede ser pAV0242. El plásmido puede ser un plásmido de adenovirus de tipo 5 (Ad5) de replicación defectuosa.

El plásmido puede comprender además una secuencia reguladora, que puede ser idónea para la expresión génica en una célula en la que se administre el plásmido. La secuencia codificante puede comprender un codón, que puede permitir una transcripción más eficiente de la secuencia codificante en la célula huésped.

La secuencia codificante puede comprender una secuencia líder de Ig. La secuencia líder puede encontrarse en el lado 5' de la secuencia codificante. La proteína de consenso codificada por dicha secuencia puede comprender un líder de Ig N-terminal seguido de una proteína de consenso. El líder de Ig N-terminal puede ser IgE o IgG.

El plásmido puede ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que puede utilizarse para la producción de proteínas en Escherichia coli (E. coli). El plásmido también puede ser pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que puede utilizarse para la producción de proteínas en cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae. El plásmido también puede ser del sistema de expresión baculovírica completa MAXBAC™ (Invitrogen, San Diego, Calif.), que puede utilizarse para la producción de proteínas en células de insecto. El plásmido también puede ser pcADN I o pcADN3 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que puede utilizarse para la producción de proteínas en células de mamífero, tal como células de ovario de hámster chino (CHO).

Los plásmidos pueden comprender una o más secuencias codificantes que codifican una o más de VP1, VP2, VP3, VP4 y 3C de uno o más subtipos, tales como Asia, A, O, C, SAT1, SAT2 y SAT3.

En algunas realizaciones, un plásmido comprende secuencias codificantes de múltiples antígenos de VFA de consenso diferentes, VP1, VP2, VP3, VP4 y 3C del subtipo Asia, A, O, C, SAT1, SAT2 o SAT3.

En algunas realizaciones, un plásmido comprende secuencias de múltiples antígenos de VFA de consenso diferentes, VP1, VP2, VP3 y VP4 del subtipo Asia, A, O, C, SAT1, SAT2 o SAT3.

En algunas realizaciones, un plásmido comprende secuencias codificantes de dos antígenos VP1 de VFA de consenso diferentes de dos de los subtipos Asia, A, O y C, tal como VP1 del subtipo Asia, VP1 del subtipo O, o VP1 del subtipo A y VP1 del subtipo C.

En algunas realizaciones, un plásmido comprende secuencias codificantes de un antígeno de VFA de consenso VP1, tal como VP1 de subtipo Asia, VP1 de subtipo A, VP1 de subtipo O o VP1 de subtipo C.

La secuencia codificante puede estar codificada por un plásmido de ADN diferente, todos regulados por un promotor operablemente ligado, p.ej., un plásmido de ADN que presenta una secuencia codificante regulada por uno o más promotores, comprendiendo la secuencia codificante múltiples antígenos de VFA de consenso.

El vector puede ser pVAXI o una variante de pVaxI con cambios, tal como el plásmido variante indicado en la presente memoria. El plásmido pVaxI variante es una variante de 2998 pares de bases del plásmido vector de esqueleto pVAXI (Invitrogen, Carlsbad, CA). El promotor del CMV está situado en las bases 137 a 724. El promotor/sitio de cebado de T7 se encuentra en las bases 664 a 683. Se encuentran sitios de clonación múltiple en las bases 696 a 811. La señal de poliadenilación de GH bovina se encuentra en las bases 829 a 1053. El gen de resistencia a la canamicina se encuentra en las bases 1226 a 2020. El origen de pUC se encuentra en las bases 2320 a 2993.

Basándose en la secuencia de pVAXI disponible de Invitrogen, se encontraron las mutaciones siguientes en la secuencia de pVAX1 que se utilizaron como el esqueleto para los plásmidos 1 a 6 indicados en la presente memoria:

C>G241 en el promotor de CMV

C>T 1942 esqueleto, cadena abajo de la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (HCbpoliA) A> - 2876 esqueleto, cadena abajo del gen de canamicina

C>T 3277 en el origen de replicación de pUC (Ori) mutación de alto número de copia (ver Nucleic Acid Research 1985)

G>C 3753 en el mismo extremo de Ori de pUC cadena arriba del sitio de ARNasaH

Los pares de bases 2, 3 y 4 se cambiaron de ACT a CTG en el esqueleto, cadena arriba del promotor de CMV.

El esqueleto del vector puede ser pAV0242. El vector puede ser un vector adenovirus de tipo 5 (Ad5) de replicación defectuosa.

El plásmido puede comprender además una secuencia reguladora, que puede resultar idónea para la expresión génica en una célula en la que se administre el plásmido. La secuencia codificante puede comprender un codón, que puede permitir una transcripción más eficiente de la secuencia codificante en la célula huésped.

La secuencia codificante puede comprender, además, una secuencia líder de Ig. La secuencia líder puede encontrarse en el lado 5' de la secuencia codificante. Los antígenos de consenso codificados por dicha secuencia pueden comprender un líder de Ig N-terminal seguido de una proteína de antígeno de consenso. El líder de Ig N-terminal puede ser IgE o IgG.

El plásmido puede ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que puede utilizarse para la producción de proteínas en Escherichia coli (E. coli). El plásmido también puede ser pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que puede utilizarse para la producción de proteínas en cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae. El plásmido también puede ser del sistema de expresión baculovírica completa MAXBAC™ (Invitrogen, San Diego, Calif.), que puede utilizarse para la producción de proteínas en células de insecto. El plásmido puede ser además pcADN I o pcADN3 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que puede utilizarse para la producción de proteínas en células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO).

4. Vacuna

Aunque sin restringirse a ninguna teoría científica, una vacuna que puede utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria (humoral, celular, o ambas) ampliamente contra el VFA puede comprender una o más secuencias codificantes indicadas anteriormente, es decir, secuencias de ácidos nucleicos que codifican una o más proteínas VP1, VP2, VP3, CVP4 y 2A de los subtipos seleccionados del grupo que consiste en: subtipos de VFA, tales como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la vacuna puede comprender además un ácido nucleico codificante de una proteasa C3 de VFA, que puede ser un ácido nucleico de proteasa C3 de consenso.

Lo anterior incluye:

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos de consenso de por lo menos VP1-VP3, y preferentemente VP1-4 del virus de la fiebre aftosa que induce una respuesta inmunitaria de reactividad cruzada en un sujeto vacunado contra múltiples subtipos de VFA, incluyendo A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT, SAT3 y SAT4. El ácido nucleico puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEC ID n° 1; una secuencia de nucleótidos codificante SEC ID n° 2; (b) SEC ID n° 3; una secuencia de nucleótidos codificante SEC ID n° 4; (c) SEC ID n° 5; una secuencia de nucleótidos codificante SEC ID n° 6; d) SEC ID n° 7; una secuencia de nucleótidos codificante SEC ID n° 8; e) SEC ID n° 9; una secuencia de nucleótidos codificante SEC ID n° 1 y f) SEC ID n° 11; una secuencia de nucleótidos codificante SEC ID n° 12.

En la presente memoria se proporciona una vacuna capaz de generar en un mamífero una respuesta inmunitaria contra uno o más subtipos de VFA. La vacuna puede comprender el plásmido comentado anteriormente. La vacuna puede comprender una pluralidad de plásmidos, cada uno de ellos dirigidos a uno o más subtipos del VFA, tales como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o combinaciones de los mismos. La vacuna puede comprender además los antígenos de VFA mismos dirigidos contra uno o más subtipos de VFA, tales como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o combinaciones de los mismos. La vacuna puede comprender además plásmidos dirigidos a subtipos de VFA de zonas particulares del mundo, por ejemplo, Asia, Europa y sub-África. Alternativa o adicionalmente, la vacuna puede comprender proteínas de uno o más subtipos de VFA, tales como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o combinaciones de los mismos. La vacuna puede comprender además los antígenos de VFA mismos dirigidos contra uno o más subtipos de VFA, tales como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o combinaciones de los mismos. La vacuna puede comprender además plásmidos y/o proteínas dirigidos a subtipos de VFA de zonas particulares del mundo, por ejemplo, Asia, Europa y sub-África. La vacuna puede proporcionarse para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica o profiláctica.

En la presente memoria se dan a conocer composiciones farmacéuticas según la presente invención que comprenden aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 10 mg de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas según la presente exposición comprenden: 1) por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 nanogramos, o por lo menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895.900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 o 1000 microgramos, o por lo menos 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 mg o más, y 2) hasta e incluyendo 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 nanogramos, o hasta e incluyendo 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, o 1000 microgramos, o hasta, e incluyendo, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 mg. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas según la presente exposición comprenden entre aproximadamente 5 nanogramos y aproximadamente 10 mg de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas según la presente exposición comprenden entre aproximadamente 25 nanogramos y aproximadamente 5 mg de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 50 nanogramos y aproximadamente 1 mg de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 1 y aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 5 y aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 10 y aproximadamente 200 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 15 y aproximadamente 150 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 25 y aproximadamente 75 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 30 y aproximadamente 50 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 35 y aproximadamente 40 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden entre aproximadamente 10 microgramos y aproximadamente 100 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden entre aproximadamente 20 microgramos y aproximadamente 80 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden entre aproximadamente 25 microgramos y aproximadamente 60 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden entre aproximadamente 30 nanogramos y aproximadamente 50 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden entre aproximadamente 35 nanogramos y aproximadamente 45 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferentes, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferentes, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 1 y aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferentes, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 25 y aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferentes, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 microgramos de ADN.

Las composiciones farmacéuticas según la presente exposición se formulan según el modo de administración que debe utilizarse. En los casos en que las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, son estériles, libres de pirógenos y libres de partículas. Preferentemente se utiliza una formulación isotónica. Generalmente, entre los aditivos para la isotonicidad pueden incluirse cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, resultan preferentes soluciones isotónicas, tales como solución salina tamponada con fosfato. Entre los estabilizadores se incluyen gelatina y albúmina. En algunas realizaciones, se añade un agente de vasoconstricción a la formulación.

Preferentemente, la composición farmacéutica es una vacuna, y más preferentemente una vacuna de ADN.

La vacuna puede ser una vacuna de ADN. La vacuna de ADN puede comprender una pluralidad de los mismos plásmidos o plásmidos diferentes que comprenden secuencias codificantes de ácidos nucleicos de uno o más antígenos prostáticos de consenso. La vacuna de ADN puede comprender una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican uno o más antígenos prostáticos de consenso. En el caso de que la vacuna de ADN comprenda secuencias codificantes de más de un antígeno prostático de consenso, la totalidad de dichas secuencias puede encontrarse presente en un único plásmido, o cada una de dichas secuencias puede encontrarse presente en plásmidos diferentes.

En algunas realizaciones, las vacunas pueden comprender secuencia de ácidos nucleicos que codifican uno o más antígenos prostáticos de consenso en combinación con uno o más antígenos prostáticos de consenso.

Se dan a conocer vacunas de ADN en las patentes US n° 5.593.972, n° 5.739.118, n° 5.817.637, n° 5.830.876, n° 5.962.428, n° 5.981.505, n° 5.580.859, n° 5.703.055 y n° 5.676.594. La vacuna de ADN puede comprender además elementos o reactivos que inhiben la integración de la misma en el cromosoma. La vacuna puede ser un ARN del antígeno prostático. La vacuna de ARN puede introducirse en la célula.

La vacuna puede ser una vacuna recombinante que comprende el constructo genético o antígeno indicado anteriormente. La vacuna puede comprender además uno o más antígenos prostáticos de consenso en forma de una o más subunidades de proteína, o una o más partículas víricas atenuadas que comprenden uno o más antígenos de consenso. La vacuna atenuada puede ser una vacuna viva atenuada, vacunas muertas y vacunas que utilizan vectores recombinantes para administrar genes foráneos que codifican uno o más antígenos prostáticos de consenso, y también vacunas de subunidades y proteínas. Los ejemplos de vacunas vivas atenuadas, las que utilizan vectores recombinantes para administrar antígenos prostáticos, vacunas de subunidad y vacunas de glucoproteína se describen en las patentes US n°

, n° n° 5.2 n° 5.4

n° 6.0

Las vacunas pueden comprender plásmidos en combinación con otros componentes de vacuna, tales como proteínas de VFA o vectores de expresión codificantes de proteínas.

La vacuna proporcionada puede utilizarse para inducir respuestas inmunitarias, incluyendo respuestas inmunitarias terapéuticas o profilácticas. Pueden generarse anticuerpos y/o células T asesinas que estén dirigidas contra el antígeno prostático de consenso. Pueden aislarse dichos anticuerpos y células.

La vacuna puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente farmacéuticamente aceptable pueden ser moléculas funcionales, tales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un agente facilitador de la transfección, que puede incluir agentes activos en superficie, tales como complejos inmunoestimulantes (ISCom), adyuvante incompleto de Freund, análogo de LPS, incluyendo monofosforil-lípido A, péptidos muramilo, análogos de quinona, vesículas tales como escualeno y escualano, ácido hialurónico, lípidos, liposomas, iones de calcio, proteínas víricas, polianiones, policationes o nanopartículas, u otros agentes facilitadores de la transfección conocidos.

El agente facilitador de la transfección es un polianión, policatión, incluyendo poli-L-glutamato (LGS) o lípido. El agente facilitador de la transfección es poli-L-glutamato, y más preferentemente, el poli-L-glutamato se encuentra presente en la vacuna a una concentración inferior a 6 mg/ml. El agente facilitador de la transfección puede incluir además agentes activos en superficie, tales como complejos inmunoestimulantes (ISCOM) adyuvante incompleto de Freund, análogo de LPS, incluyendo monofosforil-lípido A, péptidos muramilo, análogos de quinona y vesículas, tales como escualeno y escualano, y ácido hialurónico, que también pueden utilizarse administrados junto con el constructo genético. En algunas realizaciones, las vacunas de plásmido de ADN pueden incluir además un agente facilitador de la transfección, tal como lípidos, liposomas, incluyendo liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos de la técnica, tales como una mezcla de ADN-liposomas (ver, por ejemplo, el documento n° WO93/24640), iones de calcio, proteínas víricas, polianiones, policationes o nanopartículas, u otros agentes facilitadores de la transfección conocidos.

Preferentemente, el agente facilitador de la transfección es un polianión, policatión, incluyendo poli-L-glutamato (LGS), o lípido. La concentración del agente de transfección en la vacuna es inferior a 4 mg/ml, inferior a 2 mg/ml, inferior a 2 mg/ml, inferior a 0,750 mg/ml, inferior a 0,500 mg/ml, inferior a 0,250 mg/ml, inferior a 0,100 mg/ml, inferior a 0,050 mg/ml o inferior a 0,010 mg/ml.

El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un adyuvante. El adyuvante puede ser otros genes que se expresan en un plásmido alternativo o que se administren en forma de proteínas en combinación con el plásmido anteriormente indicado en la vacuna. El adyuvante puede seleccionarse del grupo que consiste en: interferón a (IFN-a), interferón p (IFN-p), interferón y, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (eGf ), quimioquina atractora de células T (CTACK), quimioquina epitelial expresada por el timo (TECK), quimioquina epitelial asociada a mucosas (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80,CD86 incluyendo IL-15, que presenta deleción de secuencia de señal e incluyendo opcionalmente el péptido de señal de IgE. El adyuvante puede ser IL-12, IL-15, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF,

factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, o una combinación de los mismos.

Entre otros genes que pueden ser adyuvantes útiles se incluyen los codificantes de: MCP-1, MlP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, selectina l, selectina P, selectina E, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento fibroblástico, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, caspasa ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inactivo, SAP K, SAP-1, j Nk , genes de respuesta a interferón, NFkB, Bax, TRAiL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, ligando RANK, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y fragmentos funcionales de los mismos.

La vacuna puede comprender además un agente facilitador de vacuna genético tal como se indica en la patente US n° de serie 021.579, presentada el 1 de abril de 1994.

La vacuna puede formularse según el modo de administración que deba utilizarse. Una composición farmacéutica de vacuna inyectable puede ser estéril, libre de pirógenos y libre de partículas. Puede utilizarse una formulación o solución isotónica. Entre los aditivos para la isotonicidad pueden incluirse cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. La vacuna puede comprender un agente de vasoconstricción. Entre las soluciones isotónicas pueden incluir solución salina tamponada con fosfato. La vacuna puede comprender además estabilizadores, incluyendo gelatina y albúmina. La estabilización puede permitir que la formulación sea estable a temperatura de laboratorio o ambiente durante periodos de tiempo prolongados, tal como LGS o policationes o polianiones añadidos a la formulación de vacuna.

5. Métodos de administración de la vacuna

En la presente memoria se da a conocer un método de administración de la vacuna para proporcionar constructos genéticos y proteínas del antígeno del VFA que comprenden epítopos que los convierte en particularmente eficaces contra inmunógenos del VFA contra el que puede inducirse una respuesta inmunitaria. El método de administración de la vacunas o vacunación puede proporcionarse para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica y profiláctica. El procedimiento de vacunación puede generar en el mamífero una respuesta inmunitaria contra una pluralidad de subtipos de VFA. La vacuna puede administrarse en el individuo para modular la actividad del sistema inmunitario del mamífero y potenciar la respuesta inmunitaria. La administración de la vacuna puede ser la transfección del antígeno de VFA en forma de molécula de ácidos nucleicos que se expresa en la célula y se administra en la superficie de la célula, de manera que el sistema inmunitario la reconoce e induce una respuesta celular, humoral o celular y humoral. La administración de la vacuna puede utilizarse para inducir o estimular una respuesta inmunitaria en mamíferos contra una pluralidad de virus de VFA mediante la administración de la vacuna en el mamífero tal como se ha comentado anteriormente.

Tras la administración de la vacuna y el plásmido en las células del mamífero, las células transfectadas expresan y secretan cápsides de consenso para cada uno de los plásmidos inyectados con la vacuna. Dichas proteínas de cápside secretadas resultan reconocidas como foráneas por el sistema inmunitario y se producen anticuerpos contra ellas. Dichos anticuerpos son mantenidos por el sistema inmunitario y permiten una rápida eliminación de posteriores retos de VFA.

La vacuna puede administrarse en el mamífero para inducir una respuesta inmunitaria en el mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, primate, primate no humano, vaca, res, oveja, cabra, antílope, bisonte, búfalo acuático, bisonte, bóvidos, ciervo, erizos, elefantes, llama, alpaca, ratones, ratas y pollos.

a. Tratamientos de combinación

La vacuna puede administrarse en combinación con otras proteínas o genes codificantes de interferón a, interferón y, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), quimioquina atractora de células T cutánea (CTACK), quimioquina epitelial expresada en el timo (TECK), quimioquina epitelial asociada mucosas (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86, incluyendo IL-15 en la que se ha delecionado la secuencia de señal y que incluye opcionalmente el péptido de señal de IgE, IL-12, IL-15, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, selectina L, selectina P, selectina E, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento fibroblástico, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, caspasa ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respuesta a interferón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, ligando de Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y fragmentos funcionales de los mismos o combinaciones de los mismos. La vacuna puede administrarse además en combinación con proteína CTACK, proteína TECK, proteína MEC o fragmentos funcionales de las mismas.

La vacuna puede administrarse por diferentes vías, incluyendo oral, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosal, tópica, mediante inhalación, mediante administración bucal, intrapleural, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intranasal, intratecal e intraarticular, o combinaciones de las mismas. Para la utilización veterinaria, la composición puede administrarse en forma de una formulación convenientemente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal. El veterinario podrá determinar fácilmente el régimen de administración y la vía de administración que resulte más apropiada para el animal particular. La vacuna puede administrar mediante jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin aguja, “pistolas génicas de bombardeo de microproyectiles” u otros métodos físicos, tales como la electroporación (“EP”), el “método hidrodinámico”, o los ultrasonidos.

El plásmido de la vacuna puede administrarse en el mamífero mediante varias tecnologías bien conocidas, incluyendo la inyección de ADN (también denominada vacunación de ADN) con y sin electroporación in vivo, mediada por liposomas, facilitada por nanopartículas, vectores recombinantes, tales como adenovirus recombinantes, virus asociados a adenovirus recombinante y Vaccinia recombinante. El antígeno del VFA puede administrarse mediante inyección de DAN y junto con la electroporación in vivo.

b. Electroporación

La administración de la vacuna mediante electroporación de los plásmidos de la vacuna puede llevarse a cabo utilizando dispositivos de electroporación que pueden configurarse para la administración en un tejido deseado de un mamífero de un pulso de energía productor de una corriente constante similar a una entrada de corriente prefijada por un usuario. El dispositivo de electroporación puede comprender un componente de electroporación y un conjunto de electrodos o conjunto de mandos. El componente de electroporación puede incluir e incorporar uno o más de los diversos elementos de los dispositivos de electroporación, incluyendo: controlador, generador de forma de onda de corriente, probador de impedancia, registrador de forma de onda, elemento de entada, elemento notificador de estado, puerto de comunicación, componente de memoria, fuente de alimentación y conmutador de alimentación. La electroporación puede llevarse a cabo utilizando el sistema VGXP Cellectra™ para facilitar la transfección de células con el plásmido.

El componente de electroporación puede funcionar como un elemento de los dispositivos de electroporación y los demás elementos son elementos (o componentes) separados en comunicación con el componente de electroporación. El componente de electroporación puede funcionar como más de un elemento de los dispositivos de electroporación, que pueden encontrarse en comunicación con todavía otros elementos de los dispositivos de electroporación separados del componente de electroporación. Los elementos de los dispositivos de electroporación existentes como partes de un dispositivo electromecánico o mecánico pueden no encontrarse limitados, ya que los elementos pueden funcionar como un dispositivo o como elementos separados en comunicación mutua. El componente de electroporación puede ser capaz de administrar el pulso energético que produce la corriente constante en el tejido deseado, e incluye un mecanismo de retroalimentación. El conjunto de electrodos puede incluir una matriz de electrodos con una pluralidad de electrodos en una disposición espacial, en el que el conjunto de electrodos recibe el pulso energético procedente del componente de electroporación y lo administra en el tejido deseado mediante los electrodos. Por lo menos uno de la pluralidad de electrodos es neutro durante la administración del pulso energético y mide la impedancia en el tejido deseado y comunica la impedancia al componente de electroporación. El mecanismo de retroalimentación puede recibir la impedancia mediad y puede ajustar el pulso energético administrado por el componente de electroporación para mantener la corriente constante.

Una pluralidad de electrodos puede administrar el pulso energético en un patrón descentralizado. La pluralidad de electrodos puede administrar el pulso energético en el patrón descentralizado mediante el control de los electrodos bajo una secuencia programada, y la secuencia programada puede ser introducida por un usuario en el componente de electroporación. La secuencia programada puede comprender una pluralidad de pulsos administrada en secuencia, en la que cada pulso de la pluralidad de pulsos es administra mediante por lo menos dos electrodos activos con un electrodo neutro que mide la impedancia, y en el que un pulso posterior de la pluralidad de pulsos es administrado por un electrodo diferente de entre por lo menos dos electrodos activos, con un electrodo neutro que mide la impedancia.

El mecanismo de retroalimentación puede llevarse a cabo con hardware o software. El mecanismo de retroalimentación puede llevarse a cabo mediante un circuito de bucle cerrado analógico. La retroalimentación se produce cada 50 js , 20 js , 10 js o 1 js , aunque es preferentemente una retroalimentación en tiempo real o instantánea (es decir, sustancialmente instantánea según se determina mediante las técnicas disponibles para determinar el tiempo de respuesta). El electrodo neutro puede medir la impedancia en el tejido deseado y comunicarla al mecanismo de retroalimentación, y el mecanismo de retroalimentación responde a la impedancia y ajusta el pulso energético para mantener la corriente constante en un valor similar a la corriente prefijada. El mecanismo de retroalimentación puede mantener la corriente constante continua e instantáneamente durante la administración del pulso energético.

Entre los ejemplos de dispositivos de electroporación y métodos de electroporación que pueden facilitar la administración de las vacunas de ADN de la presente invención se incluyen los indicados en la patente US n° 7.245.963, de Draghia-Akli et al., publicación de patente US n° 2005/0052630, presentada por Smith, et al. Otros dispositivos de electroporación y métodos de electroporación que pueden utilizarse para facilitar la administración de las vacunas de ADN se incluyen los proporcionados en las publicaciones copendientes y copropietarias de las publicaciones de patente US n° US 2008-0091135, presentada el 17 de octubre de 2007, que reivindica el beneficio bajo 35 USC 119(e) a solicitudes provisionales de patente US n° de serie 60/852,149, presentada el 17 de octubre de 2006 y n° 60/978,982, presentada el 10 de octubre de 2007.

La patente US n° 7.245.963, de Draghia-Akli et al., describe sistemas modulares de electrodos y su utilización para facilitar la introducción de una molécula biológica en células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Los sistemas modulares de electrodos pueden comprender una pluralidad de electrodos de agua: una aguja hipodérmica, un conector eléctrico que proporciona un enlace conductor de un controlador programable de pulso de corriente constante con la pluralidad de electrodos de aguja y una fuente de alimentación. Un operador puede coger la pluralidad de electrodos de aguja que están montados en una estructura de soporte e insertarlos firmemente en el tejido seleccionado en un cuerpo o planta. A continuación, las biomoléculas se administran mediante la aguja hipodérmica en el tejido seleccionado. El controlador programable de pulso de corriente constante se activa y el pulso eléctrico de corriente constante se aplica en la pluralidad de electrodos de aguja. El pulso eléctrico de corriente constante aplicado facilita la introducción de la molécula biológica en la célula entre la pluralidad de electrodos.

La publicación de patente US n° 2005/0052630, presentada por Smith, et al. describe un dispositivo de electroporación que puede utilizarse para facilitar eficazmente la introducción de una molécula biológica en células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. El dispositivo de electroporación comprende un dispositivo electrocinético (“dispositivo EKD”) cuyo funcionamiento es especificado por el software o firmware. El dispositivo EKD produce una serie de patrones programables de pulsos de corriente constante entre electrodos en una matriz basada en el control y entrada por el usuario de los parámetros del pulso, y permite el almacenamiento y adquisición de datos de forma de onda de corriente. El dispositivo de electroporación comprende además un disco de electrodos sustituible con una matriz de electrodos de aguja, un canal de inyección central para una aguja de inyección y un disco guía extraíble.

Las matrices de electrodos y métodos indicados en la patente US n° 7.245.963 y en la publicación de patente US n° 2005/0052630 pueden adaptarse para la penetración profunda en no sólo tejidos tales como el músculo, sino también otros tejidos u órganos. Debido a la configuración de la matriz de electrodos, la aguja de inyección (para administrar la molécula biológica seleccionada) también se inserta por completo en el órgano diana, y la inyección se administra perpendicularmente al tejido diana, en la zona que se predelimita con los electrodos. Los electrodos indicados en la patente US n° 7.245.963 y en la publicación de patente Us n° 2005/005263 preferentemente son de 20 mm de longitud y de calibre 21.

Adicionalmente, se encuentra contemplado en algunas realizaciones que incorporan dispositivos de electroporación y usos de los mismos, dispositivos de electroporación que son los indicados en las patentes a continuación: patente US n° 5.273.525, publicada el 28 de diciembre de 1993, las patentes US n° 6.110.161, publicada el 29 de agosto de 2000, n° 6.261.281, publicada el 17 de julio de 2001, y n° 6.958.060, publicada el 25 de octubre de 2005 y la patente US n° 6.939.862, publicada el 6 de septiembre de 2005. Además, las patentes que cubren la materia proporcionadas en la patente US n° 6.697.669, publicada el 24 de febrero de 2004, que se refiere a la administración de ADN utilizando cualquiera de entre una diversidad de dispositivos y la patente US n° 7.328.064, publicada el 5 de febrero de 2008, referida a un método de inyección de ADN, se encuentran contempladas en la presente memoria.

c. Método de preparación de vacuna

En la presente memoria se proporcionan métodos para preparar la vacuna. En algunas realizaciones, los métodos son métodos de preparación de las vacunas que comprenden plásmidos de ADN. Los plásmidos de ADN, tras la etapa final de subclonación en el plásmido de expresión de mamífero, pueden utilizarse para inocular un cultivo celular en un tanque de fermentación a gran escala utilizando métodos conocidos de la técnica. El plásmido se transforma en una célula huésped compatible y se cultiva y se mantiene bajo condiciones en las que tiene lugar la expresión del antígeno del VFA. El antígeno del VFA puede recuperarse a partir del cultivo mediante lisado de las células o a partir del medio de cultivo y aislarse. Las proteínas de consenso VP1-4 aisladas pueden utilizarse en la vacuna como una fuente natural de anticuerpos. El antígeno de VFA puede producirse mediante técnicas recombinantes utilizando sintetizadores automáticos, que también pueden utilizarse para producir antígeno de VFA esencialmente puro aislado. Dichas técnicas pueden resultar útiles para introducir variantes del antígeno de VFA para subtipos particulares de VFA.

Los plásmidos de ADN para la utilización con los dispositivos de EP de la presente invención pueden formularse o prepararse utilizando una combinación de dispositivos y técnicas conocidos, aunque preferentemente se preparan utilizando una técnica de preparación de plásmidos optimizada que está descrita en una solicitud provisional de patente US copendiente objeto de licencia n° de serie 60/939.792, que fue presentada el 23 de mayo de 2007. En algunos ejemplos, los plásmidos de ADN utilizados en dichos estudios pueden formularse a concentraciones superiores o iguales a 10 mg/ml. Entre las técnicas de preparación se incluyen o se incorporan además diversos dispositivos y protocolos que son comúnmente conocidos por el experto ordinario en la materia, además de los indicados en el documento de patente US n° de serie 60/939792, incluyendo los indicados en una patente objeto de licencia; patente US n° 7.238.522, publicada el 3 de julio de 2007. La solicitud y patente anteriormente indicadas, n° de serie US 60/939.792 y patente US n° 7.238.522, respectivamente, se indican en la presente memoria.

Ejemplos

Ejemplo 1

Tal como se indica en las figuras 1 a 17, se prepararon y sometieron a ensayo constructos de algunas realizaciones. Dichas figuras muestran que las vacunas se prepararon y se generaron datos a partir de su utilización.

La figura 17 muestra una representación esquemática de un constructo genérico de vacuna de ADN del VFA, indicando que el inserto se clona en los sitios BamHI y Xho-1. Un mapa plasmídico de la vacuna genérica de VFA se basa en el plásmido pVAX. Pueden ser ejemplos de los insertos de VFA la forma larga, que se muestra en la figura 17 como inserto de forma larga, o la forma corta, que se muestra en la figura 7 como inserto de forma corta. El líder de IgE mostrado en cada forma se indica que es opcional o puede sustituirse con un líder diferente. La secuencia de 2A se indica como opcional y el sitio de corte de furina (rgrkrrs - SEC ID n° 27) se indica como sustituible.

La figura 1 es una versión VFA-As1-Shamir-89 de la vacuna de ADN genérica de VFA mostrada en la figura 17. La figura 3 es una versión de ADN de VFA-A24cruzeiro de la vacuna genérica de ADN de VFA mostrada en la figura 17. La figura 5 es una versión de ADN de VFA-SAT2 de la vacuna genérica de ADN de VFA mostrada en la figura 17. La figura 1 muestra una representación esquemática de los constructos de vacuna de VFA-As1-Shamir-89 para el serotipo Asia 1, que indican que se clona un inserto de As1 Shamir89 en los sitios BamH1 y Xho-1. El constructo de vacuna de ADN de VFA-A24cruzeiro mostrado en la figura 3 se clonó en los sitios BamH1 y Xho-1. El constructo de vacuna de ADN de VFA-SAT mostrado en la figura 5 se clonó en los sitios BamH1 y Xho-1. En cada una de las figuras 1, 3 y 5, el mapa plasmídico se basa en el plásmido pVAX. Pueden ser ejemplos del inserto de VFA-Asl-Shamir, la forma larga, que se muestra en la figura 1, como pVFA-As1 Shamir-89-L, o la forma corta, que se muestra en la figura 1, como pVFA-As1 Shamir-89-S. Pueden ser ejemplos del inserto de VFA-A24cruzeiro, la forma larga, que se muestra en la figura 3 como pVFA-A24cruzeiro-L o la forma corta, que se muestra en la figura 3 como pVFA-A24cruzeiro-S. Pueden ser ejemplos del inserto de VFA-SAT2, la forma larga, que se muestra en la figura 5 como pVFA-As1 SAT2 forma larga, o la forma corta, que se muestra en la figura 5 como pVFA-SAT2 forma corta.

La figura 2 muestra una pareja de geles teñidos que muestra la clonación de As1-Shamir89-S (izquierda, SEC ID n° 7) y As1-Shamir89-L (derecha, SEC ID n° 5); la figura 4 muestra una pareja de geles teñidos que muestra la clonación de A24-cruzeiro-S (izquierda, SEC ID n° 3) y A24cruzeiro-L (derecha, SEC ID n° 1). La figura 6 muestra una pareja de geles teñidos que muestra la clonación de SAT2-S (izquierda, SEC ID n° 11) y SAT2-L (derecha, SEC ID n° 9). Estos datos muestran que los insertos se han incorporado correctamente en los plásmidos respectivos. La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos para VFA-As1-Shamir89-L forma larga. La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos para VFA-A24cruzeiro-L forma larga. La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos para VFA-SAT2 forma larga. En cada forma larga, la secuencia incluía la secuencia líder de IgE en el extremo N-terminal sombreada, los sitios de corte proteolítico en minúscula y las secuencias de VP4 en negrita entre el líder de IgE y el primer sitio de corte proteolítico. Entre el primer sitio de corte proteolítico y el segundo sitio de corte proteolítico se encuentra la secuencia codificante de VP2. Entre el segundo sitio de corte proteolítico y el tercer sitio de corte proteolítico se encuentra la secuencia codificante de VP3. Entre el tercer sitio de corte proteolítico y el cuarto sitio de corte proteolítico se encuentra la secuencia codificante de VP1. La secuencia de 2A entre el último (cuarto) sitio de corte proteolítico y la parada.

La figura 7 muestra los resultados experimentales de expresión de proteínas. Transferencias Western de proteínas en geles de SDS de comparación de la expresión de proteínas procedentes de muestras producidas por VFA-A24cruzeiro-S forma corta, VFA-A24cruzeiro-L forma larga, pVAX, VFA-As1-Shamir89-S forma corta y VFA-As1-Shamir89-L forma larga. La transferencia se sondeó con antisueros anti-A24.

La figura 8 muestra un protocolo experimental de experimentos de inmunización utilizando la electroporación para evaluar las respuestas inmunitarias tras la administración de: 1) pVAX, 2) VFA-A24cruzeiro-L, 3) VFA-A24cruzeiro-S, 4) VFAShamir89-L, 5) VFA-Shamir89-S, VFA-Sat2-L, VFA-Sat2-S frente a la no exposición.

La figura 9 muestra datos de las respuestas inmunitarias celulares inducidas por las vacunas de VFA-A24cruzeiro-L y VFA-A24cruzeiro-S. La figura 10 muestra datos de respuestas inmunitarias celulares inducidas por vacunas de VFA-As1-Shama89-L y VFA-As1-Sharma89-S. La figura 11 muestra datos de las respuestas inmunitarias celulares inducidas por las vacunas de VFA-Sat2-L y VFA-Sat2-S. La figura 12 muestra un protocolo experimental de transfección de ADN y preparación de lisados celulares para el análisis de ELISA. La figura 13 muestra datos de la inducción de anticuerpos en ratones inducidos con vacunas de VFA-A24cruzeiro-L y VFA-A24cruzeiro-S y con vacunas de VFA-As1-Sharma89-L y VFA-As1-Sharma89-S. La figura 14 muestra datos del análisis de ELISA de la unión de proteínas utilizando lisados de proteínas preparados a partir de células transfectadas por VFA-A24cruzeiro-L y células transfectadas por VFA-As1-Sharma89-L. La vacuna de VFA era inmunogénica en los ratones. Se observó seroconversión en todos los animales inmunizados. Las formas largas de las vacunas eran más potentes que las formas cortas. Las respuestas humorales aparentemente son más potentes contra la vacuna Shamir que contra la vacuna Cruzeiro; sin embargo, ambas vacunas eran potentes. Las respuestas celulares presentaban mayor reactividad cruzada con la vacuna Shamir que con la vacuna Cruzeiro. La comparación con los sueros seropositivos bovinos muestra que las vacunas indujeron niveles razonables de reactividad inmunitaria.

La figura 15 muestra comparaciones de secuencias de aminoácidos entre las secuencias Shamir y Cruzeiro. Las secuencias de VP4 Shamir (SEC ID n° 17) se muestran en comparación con las secuencias de VP4 Cruzeiro (SEC ID n° 18); se muestran las secuencias de VP2 Shamir (SEC ID n° 19) en comparación con secuencias de VP2 Cruzeiro (SEC ID n° 20) y secuencias 2A Shamir (SEC ID n° 21) en comparación con 2A Cruzeiro (SEC ID n° 22).

La figura 16 muestra comparaciones de secuencias de aminoácidos entre las secuencias Shamir y Cruzeiro. Se muestras las secuencias de VP3 Shamir (Sec ID n° 23) en comparación con secuencias de VP3 Cruzeiro (SEC ID n° 24) y se muestran secuencias de VP1 Shamir (SEC ID n° 25) en comparación con secuencias de VP1 Cruzeiro (SEC ID n° 26).

Ejemplo 2

Se diseñaron catorce constructos para la preparación de una vacuna de VFA. Se utilizaron secuencias de siete virus de la fiebre aftosa, subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 y SAT4. Pueden utilizarse dos diseños de constructo: una versión larga y una versión corta. De acuerdo con lo anterior, hay formas largas y cortas de constructos para cada uno de los subtipos, A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 y SAT4, rindiendo 14 constructos. Las vacunas pueden producirse utilizando tan solo 4 constructos, y típicamente 7.

Se muestra una forma larga genérica en la figura 17. Las secuencias codificantes de inmunógeno están dispuestas en el orden VP4, VP2, VP3 y VP1. Secuencias codificantes de sitios de corte de proteasa separan cada una de las cuatro proteínas víricas. Puede proporcionarse la secuencia codificante para cualesquiera secuencias de líder de IgE opcionales. De manera similar, se proporciona una cola de péptido 2A de VFA en el extremo incluyendo un sitio de corte de proteasa.

En la figura 17 también se muestra una forma corta genérica. Las secuencias codificantes de inmunógeno están dispuestas en el orden VP2, VP3 y VP1. Secuencias codificantes de sitios de corte de proteasa separan cada una de las cuatro proteínas víricas. Puede proporcionarse la secuencia codificante para cualesquiera secuencias de líder de IgE opcionales. De manera similar, se proporciona una cola 2A de 16 aminoácidos en el extremo incluyendo un sitio de corte de proteasa.

Se insertan constructos en los vectores de expresión plasmídicos, resultando en 14 plásmidos.

En algunas realizaciones, las vacunas comprenden A - forma larga, Asia 1-laga, C-forma larga, O-forma larga, SAT1-forma larga, SAT2-forma larga, SAT3-forma larga y SAT4-forma larga.

En algunas realizaciones, las vacunas comprenden A-forma corta, Asia 1-corta, C-forma corta, O-forma corta, SAT1-forma corta, SAT2-forma corta, SAT3-forma corta y SAT4-forma corta.

En algunas realizaciones, las vacunas comprenden A-forma larga, Asia1-larga, C-forma larga y O-forma larga. En algunas realizaciones, las vacunas comprenden A-forma corta, Asia 1-corta, C-forma corta y O-forma corta. El extremo N-terminal puede ser una secuencia líder, tal como IgE o IgE, o no presentar líder.

Las proteínas víricas individuales deben encontrarse separadas entre sí por una proteasa, que se encuentra comúnmente presente en las células en las que se desea la expresión.

El documento n° WO 2011/054011 da a conocer vacunas de VFA. En la exposición se incluyen secuencias de aminoácidos y secuencias codificantes para las 28 secuencias que pueden incluirse en diversas realizaciones. Las catorce secuencias víricas son: VP1, VP2, VP3 Y vP4, para cada uno de los subtipos de VFA: A, Asia 1, O, C, SAT, SAT2 y SAT3. Las secuencias dadas a conocer pueden utilizarse para generar constructos que pueden incluirse en vacunas.

Los constructos incluyen una forma larga y una forma corta. La figura 1 muestra una forma parcialmente genérica de cada uno. Tal como se muestra en la figura 17, en la presente invención, los constructos proporcionan las proteínas víricas VP1, VP2, VP3 y VP4 en un orden específico. VP4 - VP2 - VP3 - VP1. Se proporciona además una cola opcional, 2A. Los constructos presentan una secuencia líder de IgE opcional. Al expresarse, se proporciona un sitio de corte proteolítico “SC” entre cada una de VP4, VP2, VP3 y VP1 y en caso de presencia de 2A. La proteasa que puede procesar el sitio puede ser la furina en algunas realizaciones. Pueden utilizarse otros sitios de proteasa. El sitio debe ser reconocido por una proteasa observada comúnmente en células en la que se expresa la vacuna.

En un aspecto de la presente exposición, hay proteínas de fusión que comprenden las proteínas de VFA de consenso VP1, VP2, VP3, VP4 y/o 3C y, en un aspecto de la presente invención, según las reivindicaciones adjuntas, se

Claims

REIVINDICACIONES

1. Molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 1, SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 7, SEC ID n° 9 y SEC ID n° 11.

2. Plásmido que comprende una molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 1.

3. Vacuna que comprende uno o más plásmidos según la reivindicación 2.

4. Vacuna según la reivindicación 3 para la utilización en un método de generación de una respuesta inmunitaria contra el VFA en un individuo.

5. Vacuna según la reivindicación 3 para la utilización en un método de prevención de la infección por VFA en un individuo.

6. Vacuna según la reivindicación 3 para la utilización en un método de tratamiento de un individuo que ha sido infectado por el VFA.

7. Vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que la vacuna induce una respuesta inmunitaria de reactividad cruzada en un sujeto vacunado contra múltiples subtipos de VFA.

8. Vacuna para la utilización según la reivindicación 7, en la que se seleccionan múltiples subtipos de VFA del grupo que consiste en A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 y SAT4.