ES2813123A1 - Método para la obtención de un extracto con propiedades anti-hipertensivas, antihiperlipidémicas y antioxidantes - Google Patents

Abstract

Método para la obtención de un extracto con propiedades anti-hipertensivas, anti-hiperlipidémicas y antioxidantes. La presente invención se refiere a un método para obtener un extracto de Arthrospira sp. que comprende incubar Arthrospira sp. en una disolución acuosa a un pH de entre 3 y 14 en presencia de la enzima Alcalase{reg}; y separar la biomasa de la solución obtenida en la etapa a) para obtener el extracto. El extracto acuoso así obtenido es un concentrado de aminoácidos y péptidos de bajo peso molecular de fácil asimilación por el organismo, y en polifenoles entre otros antioxidantes. El extracto tiene múltiples aplicaciones terapéuticas, pudiendo usarse en la prevención y tratamiento de, por ejemplo, la hipertensión, anemia, desnutrición, hiperlipidemia, obesidad y diabetes.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la obtención de un extracto con propiedades anti-hipertensivas, antihiperlipidémicas y antioxidantes.

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuadra dentro del ámbito de la biotecnología y se refiere a un extracto de Artrospira sp. con una base peptídica, así como a su procedimiento de obtención. El extracto es útil para elaborar composiciones con actividad antihipertensiva, antioxidante, y/o anti-hiperlipidémica de aplicación en la industria alimentaria, cosmética o farmacéutica.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las microalgas son organismos vivos eucariotas que presentan una considerable fuente de biocomponentes de alto valor para diversos campos industriales. Las cianobacterias, por otro lado, son organismos procariotas y, aunque no presentan la misma estructura celular, comparten ciertas características funcionales y por ello también son conocidas como algas verdeazuladas. La espirulina como ingrediente o suplemento dietético es elaborado a base de cianobacterias del género Arthrospira, sobre todo las especies Arthrospira platensis y Arthrospira máxima (antes conocidas como Spirulina platensis y Spirulina máxima). Estas cianobacterias filamentosas se consideran los mayores componentes del fitoplancton presente en océanos y aguas marinas (Setchell & N.L.Gardner. Spirulina máxima, pp 923, Published in: Geitler, L., Cyanophyceae. In: Kryptogamen-Flora von Deutschland, Osterreich und der Schweiz. Ed. 2. Rabenhorst, L. Eds. 1932, 14:673-1196, i-[vi]. Leipzig: Akademische Verlagsgesellschaft).

La espirulina es un organismo de alto contenido proteico, en torno al 60%, que cultivada en condiciones de stress puede alcanzar hasta el 77% de su peso seco (Biotechnology, Agronomy, Society and Environment, 2017, 20(3): 1-9; J. of Aquatic Research, 2012, 40(3): 763-771), y que además presenta componentes de interés diverso como aminoácidos esenciales, minerales, antioxidantes, vitaminas (en mayor proporción vitamina B), ácidos grasos esenciales, carbohidratos y esteroles, entre otros. También se ha demostrado que contiene pigmentos azules en su estructura, como la ficocianina, que contribuyen al aumento del contenido proteico y férrico en su composición. El consumo de espirulina tiene propiedades beneficiosas para la salud (antiviral, antiinflamatoria, antimicrobiana), además del efecto positivo en el sistema inmune tanto animal como humano. Diversos estudios han demostrado su inocuidad y seguridad en el consumo y su mínima citotoxicidad, además de no producir toxinas como microcistinas. Por ello, y debido a su seguridad, este microorganismo se clasifica como ingrediente de complementos dietéticos de Clase A por la Farmacopea norteamericana (United States Pharmacopeia and National Formulary (USP-NF)). No obstante, cada productor debe determinar la posible contaminación de espirulina con ciertas cantidades de otras algas productoras de microcistinas. Por ello, se ha visto la necesidad de establecer estándares que identifiquen las cantidades máximas permisibles de microcistinas en los productos comerciales a base de espirulina. (Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2011, 51:593-604).

La estructura de la envoltura de las bacterias Gram (-), como el caso de espirulina, está formada por dos polímeros complejos: peptidoglicanos y lipopolisacáridos. Los peptidoglicanos están formados por disacáridos y tetrapéptidos. Estos últimos se unen entre ellos y da lugar a una estructura rígida y covalente que rodea toda la célula. Por su parte, los lipopolisacáridos se componen de lípido A y de una cadena de polisacárido compleja. La envoltura celular dificulta la extracción de los lípidos intracelulares, almacenados en forma de compartimentos subcelulares denominados cuerpos lipídicos, gotas lipídicas u oleosomas (Appl. Biochem. Biotechnol. 2011, 164 (7): 1215-1224). Estos están formados por un núcleo de lípidos neutros rodeado de una monocapa lípidica o membrana envuelta por proteínas (Proteomics 2011, 11(21): 4266-4273). Una efectiva extracción de lípidos requiere la destrucción de las estructuras celular y subcelular (J. Agric. Food Chem. 2012, 60(47):11771-11776).

Existen diferentes métodos de extraer los biocomponentes de biomasas vegetales. Los más eficaces incluyen una etapa de disgregación de la biomasa previa a la etapa de recuperación de los biocomponentes. La disgregación de la biomasa aumenta notablemente los rendimientos extractivos, y cuando esta produce la ruptura de la membrana celular permite la recuperación de biocompuestos intracelulares. El tratamiento de la biomasa previo a la extracción de los péptidos de interés tiene gran influencia en el producto obtenido, distintos tratamientos generan distintos extractos con propiedades diferentes. Diferentes extracciones con asistencia enzimática rinden distintos extractos con diferente composición, que es función del tipo de biocatalizador y condiciones del bioproceso.

Así, en un estudio realizado por Zhang y Zhang (Biotechnol Prog., 2013, 29(5): 1230-8) se obtienen extractos de péptidos con actividad antitumoral mediante el tratamiento de una biomasa de espirulina en dos etapas. En una primera etapa se extraen proteínas de la biomasa de espirulina mediante ciclos de congelación/descongelación y aplicación de ultrasonidos, y en una segunda etapa estas se hidrolizan enzimáticamente mediante un tratamiento enzimático múltiple con las enzimas tripsina, alcalasa, papaína, y pepsina.

Por otro lado, se describe el péptido Ile-Gln-Pro con actividad antihipertensiva (J. Agric. Food Chem. 2010; 58: 7166-7171), obtenido por un método que comprende una primera etapa en la que la espirulina se somete a ciclos de congelación/descongelación junto con ultrasonidos para romper las células, y una posterior etapa de hidrólisis enzimática llevada a cabo con la enzima alcalasa.

También se encuentra descrita la obtención de péptidos con actividad antioxidante a partir de espirulina (J. Microbiol Biotechnol. 2016; 26(7):1216-23). En este estudio se lleva a cabo la hidrólisis de la cianobacteria con la enzima proteasa K y la posterior extracción de los péptidos mediante ultracentrifugación y cromatografía en gel.

Además, es conocido el efecto anticolesterolémico de la espirulina (J. Nutr. Sci. Vitaminol 2010; 56(1): 34-40) y más concretamente de la molécula entera de C-ficocianina obtenida a partir de dicha cianobacteria (J. Nutr. 2005 Oct;135(10): 2425-30).

Si bien la espirulina es muy rica en proteínas, su asimilación no es siempre buena. La asimilación de algunos péptidos y biocomponentes de la espirulina, se ve afectada por su mayor o menor capacidad de degradación en el organismo. Así, la obtención de extractos a base de péptidos y aminoácidos resultantes de la degradación de la biomasa, particularmente mediante un tratamiento enzimático previo a su recuperación por extracción con disolventes, ha de suponer un gran avance en el diseño de procesos de obtención de extractos ricos en metabolitos altamente asimilables y de alta funcionalidad biológica.

Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de seguir desarrollando extractos con nuevos componentes bioactivos generados a partir de degradaciones específicas y selectivas de la biomasa de espirulina, así como métodos de extracción de estos, analizando la posibilidad de obtención de rendimientos extractivos mayores que los métodos actualmente disponibles.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método para extraer biocomponentes de una biomasa vegetal, donde dicha biomasa es de espirulina, mediante una etapa de tratamiento enzimático de la biomasa con la enzima Alcalase® para degradar selectivamente componentes específicos de su membrana celular. Posteriormente, puede completarse con una segunda etapa de extracción y recuperación de sus biocomponentes y, opcionalmente, una etapa de concentración/purificación y secado del extracto. Dicho método da lugar a la obtención de un extracto con unas propiedades particulares, entre las que destaca una actividad antihipertensiva mucho más elevada que la obtenida en otros tratamientos enzimáticos de espirulina. Además, el extracto de la invención presenta también un amplio abanico de actividades: antioxidante, antihiperlipidémica (anti-hipertriglicerolémica e hipocolesterolémica).

El extracto es muy heterogéneo, conteniendo elevadas cantidades de aminoácidos y péptidos de bajo peso molecular junto con compuestos fenólicos, polifenoles e hidratos de carbono, y se diferencia de otros extractos por su mayor actividad antihipertensiva, además de mayor actividad/propiedad antioxidante y anti-hiperlipidémica (antihipertrigliceridémica y anti-hipercolesterolémica). La obtención de un extracto con una mayor efectividad proporciona diversas ventajas como la necesidad de una dosis menor para la obtención del mismo efecto y la consecuente disminución de posibles efectos secundarios. Por tanto, el extracto es útil para elaborar composiciones con actividad antihipertensiva, antioxidante, y/o anti-hiperlipidémica de aplicación en la industria alimentaria, cosmética o farmacéutica.

En un primer aspecto, la presente invención describe un método para la obtención de un extracto de Arthrospira sp., de aquí en adelante denominado "método de la invención”, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) incubar la biomasa de Arthrospira sp. en una disolución acuosa a un pH de entre 3 y 14 en presencia de la enzima Alcalase® y

b) separar la biomasa de la solución obtenida en la etapa (a) para obtener el extracto.

El término "extracto” hace referencia a la sustancia muy concentrada que se obtiene de una biomasa bacteriana, alga, planta, semilla u otro objeto por diversos procedimientos, del cual conserva sus propiedades. Dicho extracto está constituido por componentes de distinta naturaleza, característica que permite su separación en distintas fases, por ejemplo: oleosa u orgánica, acuosa y biomasa residual.

El género Arthrospira comprende varias especies, entre las que se encuentran, sin limitar a, A. platensis y A. maxima, antes conocidas como Spirulina platensis y Spirulina maxima. En una realización particular, la biomasa de espirulina está compuesta de la especie A. platensis y A. máxima; más preferentemente de la especie A. platensis. A. platensis es una cianobacteria filamentosa pluricelular enrollada en hélice levógira, que crece de forma natural en lagos tropicales y subtropicales de África, Asia y Sudamérica con pH elevado y altas concentraciones de carbonato y bicarbonato; es cultivada en EEUU, Asia, Europa y Sudamérica. En el contexto de la presente invención, se ha utilizado una variedad lineal (no helicoidal) de A. platensis. Se puede partir tanto de biomasa seca como de un concentrado de biomasa húmeda (por ejemplo, según se obtiene por decantación, centrifugación o floculación de los tanques de cultivo) para la obtención del extracto acuoso. Además, el origen de la biomasa de Arthrospira sp. puede ser tanto el cultivo de las cianobacterias como su extracción o recolección del medio natural.

El cultivo de la cioanobacteria Arthrospira sp. puede llevarse a cabo en condiciones de agitación suave del medio del cultivo, favoreciendo el contacto con la luz solar y las reacciones de fotosíntesis. La iluminación es un factor importante para el crecimiento de la espirulina, pero no debe ser mantenida de forma continua durante las 24 horas del día; un filamento individual de espirulina no puede soportar una exposición prolongada al sol ya que es destruido por fotolisis y de ahí la necesidad de agitar el cultivo.

El agua utilizada para hacer el medio de cultivo debe estar limpia, o filtrada, para eliminar los contaminantes. El agua empleada puede ser agua dulce o agua de mar. También puede emplearse agua potable pero sin que contenga demasiada cantidad de cloro. En caso de emplearse agua de mar, muy rica en magnesio, deben tomarse muchas precauciones y ser analizada previamente. El medio de cultivo puede obtenerse disolviendo productos químicos en agua; productos químicos que incluyen, sin limitarse a, bicarbonato de sodio, sal, nitrato potásico, sulfato dipotásico, fosfato monoamónico, solución de hierro y cal. El medio de cultivo también tiene que contender nutrientes para la cianobacteria, el mayor elemento nutritivo es el carbono, que el medio de cultivo absorbe espontáneamente del aire bajo la forma de anhídrido carbónico (CO2) cuando su pH es mayor de 10. Como el aire contiene muy poco CO2, la absorción de éste corresponde a una productividad máxima (cuando el pH llega a 11) de 4 g de espirulina por día y por m3 de estanque. No obstante, es posible inyectar CO2 suplementario para aumentar la productividad. En caso necesario, el azúcar puede reemplazar al CO2 como fuente de carbono (0.5 kg de azúcar = 1 kg de CO2). La preparación del medio de cultivo para el cultivo de espirulina es ampliamente conocido en el estado de la técnica y práctica de rutina para el experto en la materia.

En una realización particular, la biomasa utilizada en esta invención es una variedad lineal de la cianobacteria A. platensis, cultivada por ASN Leader S.L. con agua de la montaña en el sureste español (Murcia), donde se realizan controles diarios analíticos. Esta biomasa es esencialmente pura y libre de otras microalgas o cianobacterias contaminantes. En otra realización particular, la biomasa de Arthrospira es A. maxima.

Una vez que se tiene la cantidad deseada de biomasa de Arthrospira sp., se procede a añadir la enzima Alcalase®. Así, en una primera etapa [etapa (a)], el método de la invención comprende incubar la biomasa de Arthrospira sp. en una disolución acuosa a un pH entre 3 y 14 en presencia de la enzima Alcalase®, preferiblemente a un pH de entre 4,5 y 8,5. En otra realización más preferida tanto para la extracción óptima de biocomponentes hidrofílicos como para la de los hidrofóbicos, la suspensión enzimabiomasa se encuentra a un pH de 6,5.

La incubación de la biomasa junto con la enzima puede realizarse en un amplio rango de temperaturas. No obstante, en una realización preferida del método de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 5-80°C, preferiblemente de entre 25-50°C. En una realización más preferida la temperatura es de 30°C.

En el contexto de la presente invención, el término "enzima” se refiere a una proteína encargada de catalizar las reacciones bioquímicas del metabolismo, las cuales en función de su acción catalítica se clasifican en: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. En la presente invención la enzima utilizada es una proteasa, que es un tipo de hidrolasa, más concretamente una alcalasa (Serina endo-peptidasa (mayormente subtilisina A), EC 3.4.21.62).

Para expresar la cantidad de enzima que se puede usar en el método de la invención, se emplea el término "carga enzimática” que hace referencia al porcentaje de la enzima en la solución. Así, la carga enzimática en la disolución de la etapa (a) puede ser 0,3-10% v/p (volumen de solución de Alcalase® comercial referido al peso total de suspensión de biomasa de espirulina en la solución enzimática), preferentemente de 0,5-2%, y más preferentemente de 1% v/p. Alcalase® 2.4 L FG es una preparación comercial de la empresa Novozymes, a base de una serina endoproteasa que hidroliza enlaces peptídicos internos. Siendo una proteasa (Subtilisina A) la enzima declarada con una actividad de 2,4 AU-A/g, no siendo este producto OMG.

Una vez que ha pasado el tiempo suficiente de incubación de la biomasa junto con la enzima (para extraer el mayor número y cantidad de biocomponentes hidrofílicos e hidrofóbicos a sus respectivas fases, tal y como se identifica por ejemplo mediante análisis de cromatografía de líquidos (HPLC)), se procede a separar la biomasa residual de la solución obtenida en la etapa (a) obteniendo el extracto de Arthrospira sp. [etapa b) del método de la invención]. En una realización particular, el extracto obtenido comprende la fase acuosa o la fase oleosa de la solución obtenida en la etapa (a). Para retirar los compuestos menos polares presentes en las partes de la biomasa, principalmente lípidos, fosfolípidos, esteroides, vitaminas y pigmentos liposolubles o productos de degradación de éstos, y otros biocomponentes liposolubles, se procede a separarlos mediante adición de diferentes disolventes orgánicos, realizándose el correspondiente reparto de los biocomponentes hidrosolubles de los liposolubles en las diferentes fases formadas en el procedimiento de extracción. Así, en una realización particular del método de la invención, el método comprende una etapa adicional que comprende la adición de un disolvente orgánico de extracción entre las etapas (a) y (b). En otra realización más particular, en disolvente orgánico es hexano, isopropanol o una mezcla de ambos.

En el caso de no interesar el extracto oleoso correspondiente, es posible obviar la adición de los disolventes orgánicos tras el tratamiento enzimático, en cuyo caso únicamente se utiliza una solución acuosa para extraer biocomponentes polares a la fase acuosa, separándolos de una pequeña fase oleosa y de la biomasa residual. Para ello, puede usarse cualquiera de los métodos empleados en el estado de la técnica (separación de las fases acuosa, orgánica y biomasa residual por una primera etapa de centrifugación o decantación o floculación, y/o una etapa de filtrado que puede ser a vacío u otros métodos conocidos para separar/retirar la fracción de biomasa residual que quede en suspensión de las fases líquidas, y seguida de otra etapa de separación propia de las fases en distintos recipientes (Maniglia et al. Food Sci & Technol. 2014, 56:269-277)).

A continuación, cada uno de los extractos (acuoso y oleoso) pueden opcionalmente concentrarse o purificarse mediante técnicas convencionales (cromatográficas, etc), y llevarse a sequedad por cualquiera de las técnicas disponibles y conocidas (liofilización, en rotavapor, bajo corriente de aire o nitrógeno, etc). Tras el tratamiento enzimático de la biomasa, los extractos pueden obtenerse usando el método Shoxlet o mediante una extracción acelerada de disolventes (Food Chemistry, 2005, 93: 417-423). Anterior o posteriormente a la etapa enzimática, podría aplicarse también una etapa adicional de tratamiento de la biomasa por técnicas disrupción mecánica, ultrasonidos, microondas, cavitación por presión negativa, pulsos eléctricos, etc., cuyo efecto es de disgregración/separación de los componentes celulares más que de su ruptura a nivel molecular. Esta última disgregación, por tanto, facilita la recuperación/extracción de biocomponentes intracelulares, pero no su transformación en productos de degradación molecular (ej., péptidos de bajo peso molecular). Una vez degradada la biomasa, para la recuperación de biocomponentes puede usarse destilación Soxhlet, autoclavado, shock osmótico, etc, y pueden usarse solventes tradicionales o solventes "verdes” como fuídos supercríticos, agua subcrítica, líquidos iónicos, etc). (Food Sci. and Technol. 2014, 56: 269-277). En una realización particular, el método comprende añadir a la disolución obtenida en la etapa (a) al menos un disolvente orgánico.

Se entiende por "disolvente orgánico" al agente químico ajeno a formulación, es decir, al compuesto químico que no es necesario en la formulación final pero que se introduce durante el proceso de obtención con el fin de favorecer la extracción. Entre los disolventes orgánicos se encuentran los alcanos como el hexano o el tolueno, cetonas como la acetona, alcoholes como el isopropanol, el metanol, o el etanol, esteres como el acetato de etilo, y otros hidrocarburos lineales, cíclicos o ramificados sustituidos o no, como el cloroformo, y el xileno, éteres como el dimetil éter o el éter de petróleo, líquidos iónicos, ácidos y bases orgánicas y amidas como la N,N-dimetil formamida. En otra realización preferida el disolvente orgánico es hexano, isopropanol o cualquiera de sus combinaciones. En particular, una mezcla 3:2 (v/v) de n-hexano/iso-propanol. Otros métodos pueden diferir en el tipo, número y proporciones relativas de disolventes utilizados, sean o no miscibles entre sí, y pudiendo ser solo agua pura o con diversos solutos: sales, buffer, etc, si solo interesa extraer componentes hidrofílicos.

En otra realización particular del método de la invención, tras la etapa (b) del método se lleva a cabo procesos sucesivos de centrifugación, filtrado, y/o decantación. Opcionalmente puede añadirse una etapa c) para el secado del extracto por cualquier método conocido, como los basados en evaporación o liofilización.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un extracto de Arthrospira sp., de aquí en adelante denominado "extracto de la invención”, obtenido mediante el método descrito anteriormente, es decir, el método de la invención. El término extracto ha sido definido y explicado en párrafos anteriores de la presente descripción.

En otra realización preferida, dicho extracto comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho péptidos seleccionados de la lista que consiste en MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1), LPPL (SEQ ID NO: 2), ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3), TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) y/o CHLLLSM(+15.99) (SEQ ID 8). En una realización todavía más particular, el extracto de la invención comprende los péptidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

Por otro lado, la presente invención también se refiere a una composición, de aquí en adelante "composición de la invención”, que comprende los péptidos MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1), LPPL (SEQ ID NO: 2), ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3), TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) y/o CHLLLSM (+15.99) (SEQ ID 8). En una realización particular, dicha composición comprende un excipiente y/o un vehículo. Los términos excipiente y vehículo están definidos en los párrafos siguientes.

Se trata de un extracto de base peptídica procedente de espirulina, que presenta capacidad/actividad antihipertensiva, antioxidante y anti-hiperlipidémica (antihipertrigliceridémica y anti-hipercolesterolémica) que, en una realización particular, además de los péptidos descritos anteriormente, comprende:

a) un contenido mínimo en polifenoles totales de 12 mg/g de extracto,

b) un contenido mínimo de carbohidratos totales de 226 mg /g de extracto, y/o

c) cantidades significativas de todos los aminoácidos incluidos los esenciales, con un contenido mínimo del 45% p/p de aminoácidos totales

En la presente invención se entiende por “composición” a la sustancia constituida por una combinación de moléculas entre las que se encuentran los péptidos bioactivos de interés. El término “péptidos” hace referencia a moléculas naturales formadas por cadenas lineales de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Los aminoácidos se representan a lo largo de la descripción y las reivindicaciones a través del código de una letra conocido en el estado del arte. El término “antioxidante” hace referencia a compuestos que mitigan la oxidación y que, al ser ingeridos, pueden ser beneficiosos para la salud humana. Los antioxidantes que más abundan en la dieta son el ácido ascórbico o vitamina C, los polifenoles, la vitamina E, y los carotenoides, siendo los dos primeros hidrosolubles y los dos últimos liposolubles. El término “polifenol(es)” hace referencia a moléculas naturales que son compuestos fenólicos con un anillo aromático y uno o varios grupos hidroxilo, y se clasifican en “flavonoides” y “no flavonoides”. Los flavonoides son polifenoles con 15 átomos de carbono y dos anillos aromáticos conectados por un puente de tres carbonos; pueden tener numerosos sustituyentes en su estructura, y en la naturaleza están mayormente en forma de glicósidos y en menor proporción en forma de agliconas. Las estructuras más comunes de no flavonoides son C6-C1 ácidos fenólicos, que en la naturaleza se presentan en forma de complejos esteres de azúcares. Los polifenoles son metabolitos secundarios, que tanto en forma de agliconas (poly)fenólicas como sus azúcares conjugados, existen en las plantas en concentraciones de pM hasta mM. Ambos tienen funciones protectoras, y se les atribuyen importantes efectos positivos en enfermedades crónicas. Modulan la actividad de enzimas digestivas, o actúan como antioxidantes en forma directa sobre ROS (reactive oxigen species) presentes en el lumen, o bien en forma sistémica (en órganos, tejidos o células a través de su previa absorción gastrointestinal y distribución desde la sangre a tales tejidos). Tras su ingesta, se transforman en los correspondientes metabolitos (fase II), y pasan al sistema circulatorio, donde su concentración en plasma es del orden nM. En el colon son degradados por la microbiota local, dando pequeños ácidos fenólicos y catabolitos aromáticos que se absorben en el sistema circulatorio. La forma conjugada de los polifenoles es más polar (hidrosoluble) y menos absorbible (y biodisponible). En el intestino grueso, las bacterias del colon metabolizan los flavonoides, hidrolizando sus enlaces glucosídicos y favoreciendo así su absorción. Dietas ricas en polifenoles favorecen la proliferación de microbios beneficiosos e inhiben la de organismos patógenos.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica, alimentaria o cosmética que comprende el extracto de la invención o la composición de la invención, y opcionalmente, comprende además al menos un excipiente o vehículo farmacéutica, alimentaria o cosméticamente aceptable, respectivamente.

El término “composición farmacéutica” se refiere a una composición, como se ha descrito previamente, administrada en forma de sólida o líquida en cualquier formato farmacéutico, tales como, sin limitar a, comprimidos, cápsulas, bolsitas, jarabes, sprays, inyectables, pomadas, cremas, lociones, supositorios, viales y ungüentos.

Por otro lado "composición alimentaria" se refiere a una composición, como se ha descrito previamente, administrada como alimento o suplemento alimentario formulado como, por ejemplo, cápsulas, pastillas, jarabes o bebidas, etc. que aporta nutrientes al sujeto que lo toma, y puede afectar beneficiosamente a una o varias funciones del organismo. Puede ser administrada en forma de bebida o comida, con o sin elaboración previa, y puede ser destinada para alimentación humana o animal. Entre los animales se incluyen, sin limitar a, mascotas, animales de granja (ganado bobino, ovino, porcino, caprino) y animales de cultivos piscícolas, etc.

El término "composición cosmética” se refiere a una composición, como se ha descrito previamente, administrada como cremas, pomadas, lociones, emulsiones, microemulsiones, liposomas, sprays, líquidos, polvos compactos o sueltos, barras anhidras, geles y aceites, mascarillas, jabones, champús, u otros productos de higiene personal y cosméticos solares.

El término "excipiente" se refiere a una sustancia que ayuda a la absorción de la composición farmacéutica, alimentaria o cosmética de la invención, estabiliza dichas composiciones o ayuda a su preparación, en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento, como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Para que la composición de la invención tenga un sabor agradable se puede añadir una esencia, como por ejemplo esencia de canela, limón, naranja, mandarina o vainilla.

El “vehículo farmacéutica, alimentaria o cosméticamente aceptable” se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico y/o cosmético, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas y/o cosméticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte. El vehículo se encuentra, preferiblemente, a una concentración del 2,5 al 7% v/p con respecto a la composición final. La función del vehículo es facilitar la incorporación del producto de la invención, así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. Estos vehículos pueden ser conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, pero sin limitar a, lisosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, miliesferas, microesferas, nanoesferas, milipartículas, micropartículas y nanopartículas. El término "farmacéutica, alimentaria o cosméticamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o de la composición de la invención para su uso como medicamento. El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. La administración debe ajustarse a una dosis deseable de la composición de la invención y varía dependiendo de la condición y del peso del sujeto, de la gravedad de la enfermedad, de la forma del fármaco, de la ruta y del periodo de administración, y puede ser elegida por el especialista en la técnica.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o la composición de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de cualquiera de las enfermedades seleccionadas de la lista que consiste en hipertensión, anemia, desnutrición, hiperlipidemia (tales como hipertriglicerolemia, hipercolesterolemia, e hiperlipidemia mixta), obesidad y diabetes.

El término "tratamiento” se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto que incluye inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo; aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología y estabilizar la enfermedad o la condición patológica.

El término "prevención" se refiere a evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto, en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.

En la presente invención, la enfermedad que se trata y/o previene con una mayor eficacia respecto a otros extractos o composiciones derivados de espirulina es la hipertensión. El término “hipertensión” también conocida como tensión arterial alta, es un trastorno en el que los vasos sanguíneos tienen una tensión persistentemente alta, lo que puede dañarlos. La tensión arterial normal en adultos es de 120 mm Hg (tensión sistólica) y de 80 mm Hg (tensión diastólica). Cuando la tensión sistólica es igual o superior a 140 mm Hg y/o la tensión diastólica es igual o superior a 90 mm Hg, la tensión arterial se considera alta.

Además de la hipertensión, otras enfermedades que pueden ser prevenidas y/o tratadas por el extracto acuoso o la composición de la invención:

- La hiperlipidemia, que incluye diferentes desórdenes metabólicos que conducen a niveles elevados de triglicéridos y/o colesterol en el torrente sanguíneo. Se clasifican en hipertrigliceridemias, hipercolesterolemias, e hiperlipemias mixtas.

• la hiperlipidemia tipo I, desarrollada por la deficiencia de lipoproteína lipasa, provoca una acumulación de quilomicrones (QM) el consiguiente aumento de los triglicéridos plasmáticos.

• La hipercolesterolemia, que consiste en la presencia de niveles elevados de colesterol en la sangre o, más concretamente, una elevada concentración de colesterol de baja densidad (LDL), que es un factor que aumenta el riesgo de desarrollo de enfermedades cardiacas. En una realización preferida, la enfermedad es hipercolesterolemia.

• Las hiperlipemias mixtas en las que aumentan tanto el colesterol como los triglicéridos.

- La anemia es una enfermedad que se caracteriza por la disminución anormal del número o tamaño de los glóbulos rojos que contiene la sangre o de su nivel de hemoglobina.

- La desnutrición, que es ese estado patológico de distintos grados de seriedad y de distintas manifestaciones clínicas causado por la asimilación deficiente de alimentos por el organismo.

- El sobrepeso, que se refiere a una patología caracterizada porque el sujeto tiene un índice de masa corporal (IMC) igual o superior a 25. El IMC es una medida de asociación entre el peso y la talla de un individuo. El IMC tiene la siguiente fórmula para su cálculo: Masa (Kg) / estatura2 (m). El sobrepeso se caracteriza por un IMC de entre > 25 a < 30.

- La obesidad, que se refiere a una patología caracterizada porque el sujeto tiene un IMC es igual o mayor de 30. La obesidad se clasifica en diferentes niveles, considerando que sujetos con IMC > 40 padecen de obesidad mórbida. Otros parámetros utilizados para determinar si un individuo padece obesidad central son la circunferencia de cintura absoluta (el sujeto padece obesidad cuando es >102 cm en hombres [obesidad central] y >88 cm en mujeres) o el índice cintura-cadera (el sujeto padece obesidad cuando es >0,9 para hombres y >0,85 para mujeres). Una vía alternativa para determinar la obesidad es medir el porcentaje de grasa corporal (el sujeto padece obesidad cuando tiene aproximadamente >25% de grasa corporal en un hombre y aproximadamente >30% de grasa corporal en la mujer).

- Diabetes, preferentemente diabetes gestacional o diabetes Mellitus tipo 2. La diabetes Mellitus tipo 2 se caracteriza por el déficit relativo de la producción y sensibilidad a la insulina en los tejidos y, por tanto, una deficiente utilización periférica de glucosa.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o la composición de la invención para su uso como un agente antioxidante.

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o a la composición de la invención para su uso como un agente anti-hipertensivo o antihiperlipidemico.

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o a la composición de la invención para preparar un concentrado proteico de fácil asimilación.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Cromatograma del análisis en gradiente por HPLC-ELSD del extracto oleoso de biomasa de A. platensis obtenido con asistencia del biocatalizador Alcalase®. Condiciones de extracción: 1% v/p de enzima Alcalase® a pH 6,5 y 30°C durante 24h. Se computaron los picos eluídos a partir de 3 min., a tiempos inferiores se eluye el disolvente. El estándar interno (hexadecano) eluye a 9 min.

Figura 2. Influencia del pH de la etapa de degradación de la biomasa con Alcalase® en el extracto oleoso obtenido utilizando 1% v/p de enzima, a 40°C durante 4h. U. A., unidades arbitrarias: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD.

Figura 3. Influencia de la temperatura de la etapa de degradación de la biomasa con Alcalase® en el extracto oleoso obtenido: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD. Condiciones: pH 6,5 y 1% (v/p) de carga enzimática durante el tratamiento enzimático de 4 ó 24h.

Figura 4. Influencia de la carga enzimática (v/p) de la etapa de degradación de la biomasa con Alcalase® en el extracto oleoso obtenido: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD, a pH 6,5 y 30°C, y a diferentes tiempos de tratamiento enzimático (0-24h). El ensayo control (0% carga enzimática) se realizó con idéntico protocolo, pero usando agua milli-Q en lugar de la solución enzimática tamponada a 30°C.

Figura 5. Cromatograma del análisis en gradiente por HPLC-ELSD del extracto acuoso de biomasa de A.platensis, obtenido con asistencia del biocatalizador Alcalase®.

Condiciones de extracción: 1% v/p de enzima Alcalase® a pH 6,5 y 30°C durante 24h. El límite de identificación de picos fue de 7500 u.a. de área. Se computaron los picos eluídos a partir de 2,39 min, a tiempos inferiores se eluye el disolvente.

Figura 6. Cromatograma del análisis en gradiente por HPLC-ELSD del extracto acuoso de biomasa de A. platensis, obtenido con asistencia del biocatalizador Control (sin enzima). Condiciones de extracción: agua mili-Q en lugar de solución enzimática tamponada, 30°C y 24h. El límite de identificación de picos fue de 7500 u.a. de área. Se computaron los picos eluídos a partir de 2,39 min. , a tiempos inferiores se eluye el disolvente.

Figura 7. Influencia del pH del proceso de degradación de la biomasa con Alcalase® en la recuperación de componentes polares de espirulina (variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD del extracto acuoso). A) Efecto del pH a las 4 h del tratamiento enzimático. B) Cinética de la extracción al valor óptimo de pH 6,5. Otras condiciones: 1% (v/p) carga enzimática y 40°C. u. a. Unidades arbitrarias de área.

Figura 8. Influencia de la temperatura de la etapa de degradación enzimática de la biomasa con Alcalase® en el extracto acuoso obtenido: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD. Condiciones: 1% v/p de Alcalase® a pH 6,5 durante 24h (variación del área total de picos).

Figura 9. Influencia de la carga enzimática de la etapa de degradación de la biomasa con Alcalase® en el extracto acuoso obtenido: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD. Condiciones: pH 6,5 y 30°C durante 24h. La extracción control (0% carga enzimática) se realizó con el mismo protocolo extractivo, pero usando agua milli-Q en lugar de la disolución enzimática tamponada a 30°C.

Figura 10. Evolución del área de los diferentes picos cromatográficos del extracto acuoso obtenido con Alcalase® en condiciones óptimas de extracción. Condiciones: pH= 6.5, 30°C y 1% (v/p) biocatalizador. A) tiempo de retención (Tr) = 3-5min.; B) Tr = 5,5min.; C) Tr = 11-14min.; D) Tr = 20-22min.; E) Tr = 28min.: F) Tr = 68min. El límite de identificación de picos fue de 7500 u.a. de área. La identificación y seguimiento en el tiempo de los dos primeros picos (Tr= 3-5,5 min) se realizó con un volumen de inyección de 5 pl de muestra, mientras que el resto de picos se identificaron con inyecciones de 20 pl de muestra.

Figura 11. Estudio comparativo de los extractos oleosos (enzimáticos y control) obtenidos en sus respectivas condiciones óptimas. Variación del área total de picos en los análisis de HPLC-ELSD ponderado por su correspondiente rendimiento, es decir área equivalente extraída por cada gramo de biomasa inicial de espirulina. Condiciones: 24h de tratamiento enzimático en sus respectivas condiciones óptimas (pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Alcalase®; pH 6,0, 1% v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1% v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®). La extracción control (0% carga enzimática) se realizó con el mismo protocolo, pero usando agua milli-Q en lugar de la solución enzimática tamponada a 30°C.

Figura 12. Estudio comparativo de los extractos acuosos (enzimáticos y control) obtenidos en sus respectivas condiciones óptimas. Variación del área total de picos en los análisis de HPLC-ELSD ponderado por su correspondiente rendimiento, es decir área equivalente extraída por cada por gramo de biomasa inicial de espirulina. Condiciones: 24h de tratamiento enzimático en sus respectivas condiciones óptimas (pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Alcalase®; pH 6,0, 1% v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1% v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®; pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Lipozyme®; pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Celluclast®). La extracción control (0% carga enzimática) se realizó con el mismo protocolo, pero usando agua mili-Q en lugar de la solución enzimática tamponada a 30°C.

Figura 13. Micrografías realizadas a 15.000 aumentos. A) Biomasa de A. platensis comercial seca no tratada con enzima ni extraída; B) biomasa extraída con Alcalase® en las condiciones óptimas determinadas para este proceso extractivo (pH 6,5, 1% v/p Alcalase® y 30°C durante 24h).

Figura 14. Micrografías realizadas a 200.000 aumentos. A) Biomasa comercial seca no tratada con enzima ni extraída; B) extraída con Alcalase® en las condiciones óptimas determinadas para este proceso extractivo (pH 6,5, 1% v/p Alcalase® y 30°C durante 24h).

Figura 15. Concentración total de aminoácidos extraídos en diferentes métodos extractivos en sus respectivas condiciones óptimas. Las condiciones óptimas fueron: pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Alcalase®; pH 6,0, 1% v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1% v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®, pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Lipozyme®; pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Celluclast®. Al extracto control se le añadió agua mili-Q en lugar de solución enzimática tamponada, 30°C y 24h. El método control es igual que los enzimáticos, pero usando agua milli-Q en vez de solución enzimática tamponada.

Figura 16. Cromatogramas de los extractos acuosos de biomasa de A. platensis obtenidos con diferentes procesos enzimáticos en sus respectivas condiciones óptimas y sin enzima (control), analizados por LC ESI-MS MS en modo de ionización positiva. Las condiciones óptimas fueron: pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Alcalase®; pH 6,0, 1% v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1% v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®. Al extracto control se le añadió agua mili-Q en lugar de solución enzimática tamponada, 30°C y 24h.

EJEMPLOS

La invención se basa en una etapa enzimática específica, en la que el biocatalizador actúa para degradar específica- y selectivamente la biomasa. La degradación enzimática de la biomasa permite recuperar y extraer mayor cantidad de biocomponentes intracelulares y diferentes productos de degradación según el biocatalizador/bioproceso empleado. Los componentes extraídos son tanto acuosos como oleosos (o hidrofílicos e hidrofóbicos). La cantidad y composición de ambos extractos son consecuencia tanto de la elección del biocatalizador como del efecto de las variaciones de los valores de los parámetros que influyen en la etapa de degradación de la biomasa. Esta etapa enzimática previa a la recuperación de biocomponentes acuosos y oleosos de espirulina, facilita su extracción maximizándose los rendimientos extractivos para valores óptimos de dichos parámetros. Por otra parte, independientemente de los rendimientos de material extraído, los biocompuestos específicos obtenidos como productos de la degradación enzimática son específicos del tipo de enzima utilizado, y de sus condiciones de operación durante el tratamiento de la biomasa con el biocatalizador, dado que son el resultado de una acción enzimática específica y selectiva sobre componentes celulares de la biomasa, y de la extensión de dicha acción según sean las condiciones de operación del proceso enzimático degradador.

Ejemplo 1

Descripción metodológica

Tratamiento enzimático de la biomasa de espirulina

Se llevó a cabo por duplicado o triplicado la disrupción celular de la biomasa (4 g) en un reactor de 25 mL donde la espirulina se encontraba en una concentración de 0,2 g/ml en un tampón 0,1 M. Según fue el valor de pH estudiado se utilizó tampón acetato sódico o fosfato sódico. Si bien la degradación enzimática de la biomasa puede realizarse utilizando diferentes concentraciones de biomasa en el reactor, la usada corresponde a la concentración de compromiso para tener la mayor productividad volumétrica. El valor de concentración de biomasa utilizada corresponde al rango de concentración para tener la mayor cantidad posible de biomasa por ml de solución acuosa, que permite formar una suspensión completamente dispersa y de forma que se tengan mínimas limitaciones de transferencia de materia y para posibilitar el contacto entre los intervinientes en el proceso degradador enzimático y extractivo. El proceso degradador enzimático de la biomasa se llevó a cabo en un incubador (Stuart SI50) a temperatura y agitación magnética (500 rpm) controladas. Durante la reacción se recogieron por duplicado alícuotas de 0,5 mL para hacer el seguimiento de la reacción enzimática hasta 24-48 h.

Extracción de los Biocomponentes mediante Disolventes

A cada alícuota (0,5 ml) recogida del medio de reacción enzimático se le adicionó 1 ml de una mezcla de disolventes compuesta por hexano e isopropanol en una proporción 3:2 (v/v). Se agitó la mezcla en un vórtex durante 1 minuto y a continuación se centrifugó durante 15 minutos a 10.000 rpm. La fase orgánica o fase superior se extrajo cuidadosamente a un eppendorf. Las operaciones de adición de la mezcla de hexano e isopropanol, y posterior extracción de la fase oleosa, se llevaron a cabo dos veces más utilizando 0,25 ml de la mezcla de disolventes. Los tres volúmenes de las fases orgánicas recuperadas tras cada una de las tres adiciones de disolventes se juntaron y homogeneizaron en el vórtex. La fase acuosa recuperada tras las tres extracciones de disolventes fue filtrada. Ambos extractos (acuoso y oleoso) se guardaron a 4°C hasta su análisis por HPLC-ELSD.

Análisis de los extractos

El estudio de la influencia de los parámetros de pH, temperatura, tiempo y carga enzimática en los extractos oleosos, se realizó mediante análisis de las soluciones en cloroformo de alícuotas de las diferentes fases oleosas por HPLC-ELSD (High pressure liquid chromatography with an evaporative light scattering detector), siguiendo la variación del área total de los picos cromatográficos significativos. Un ejemplo de cromatograma se muestra en la Figura 1. El pico eluído a 9 min. corresponde al hexadecano usado como estándar interno. El detector utilizado de ELSD es universal, si bien no visualiza compuestos de alta volatilidad como el isopropanol o difíciles de nebulizar (alto peso molecular, etc).

Los análisis de los extractos oleosos se realizaron por cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC, High-Performance Liquid Chromatography), en un equipo marca Merck-Hitachi Ltd. (Germany and Japan) acoplado a una columna Kromasil de sílice 5pm, 250x4.6 mm. y con un detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD, Evaporative Light Scattering Detector) de SEDERE modelo SEDEX 55. Las muestras, fueron filtradas a través filtro de nylon (15mm x 0,45pm, de Análisis Vinicos S.A., España) Se inyectaron 10 pl de muestra disuelta en cloroformo (calidad HPLC 99% puro), analizándose a un flujo de 1,5 ml/min. durante 30min. Se usó una fase móvil en gradiente donde la fase móvil A era n-Hexano (calidad HPLC 96%) y la fase móvil B contenía Hexano/Isopropanol/Acetato de etilo (80:10:10). Desde una proporción de fases A:B de 1:99, se aumentó de manera lineal la relación de fases hasta 98:2 durante 20 minutos. Estas condiciones se mantuvieron durante 3 minutos, a partir de los cuales se volvió a las condiciones iniciales (1:99) en 1 min, que se mantuvieron isocraticamente durante 9 minutos.

El estudio de la influencia de los mismos parámetros de la etapa enzimática en los extractos acuosos, se realizó mediante análisis por HPLC-ELSD, evaluando variaciones en el área total de todos los picos significativos. Ejemplos de cromatogramas se muestran en las Figuras 5-6.

Los análisis de los extractos acuosos se realizaron en el mismo equipo de HPLC, acoplado a una columna Kromasil C18 5u, 250x4.6 mm. Se inyectaron 10 pl de una disolución del extracto en agua (50 mg/ml) y se analizó a un flujo de 1,5 ml/min durante 83 minutos en gradiente utilizando como fase A 100% Agua MiliQ y como fase B una mezcla de Acetonitrilo:Agua MiliQ a 80:20. Se mantuvieron condiciones isocráticas del 96% A y 4% de B durante cinco minutos, seguido de un aumento lineal hasta el 40% de B en 60 min y un aumento lineal hasta 95% de B en un minuto. Se mantuvieron las proporciones durante siete minutos y se volvió a las condiciones iniciales en 10 minutos. Todos los análisis se replicaron 2-3 veces.

Los extractos acuosos obtenidos tras 24h de tratamiento enzimático de la biomasa se estudiaron a partir de extractos liofilizados obtenidos a mayor escala.

Proceso extractivo a mayor escala

El proceso extractivo a mayor escala se preparó realizando la disrupción celular de la biomasa (10 g) en un reactor de 250 ml donde la espirulina se encontraba en una concentración de 0,2 g/ml en un tampón 0,1 M. Según fue el valor de pH estudiado se utilizó tampón acetato sódico o fosfato sódico. El proceso degradador enzimático de la biomasa se llevó a cabo durante 24h. en un incubador (Stuart SI50) a temperatura y agitación magnética (500 rpm) controlada. Estas muestras se extrajeron mediante una mezcla hexano/isopropanol 3:2 (v/v). Para ello, tras añadir la mezcla de disolventes en igual proporción biomasa/disolvente que para el proceso a pequeña escala, la mezcla resultante se mantuvo bajo agitación magnética a 500 rpm a temperatura ambiente durante 10 min, tras los cuales se centrifugó en una centrifuga refrigerada a 10°C a 14.000 rpm durante 30 min. Tras la separación de fases ocurrida en este proceso, se separó cuidadosamente la fase superior (oleosa). Seguidamente, se repitió esta etapa extractiva añadiendo al material remanente en el tubo de centrífuga (fase acuosa biomasa residual) 90 mL de la mezcla de disolventes hexano/isopropanol 3/2 (v/v), repitiéndose a continuación las etapas de agitación, centrifugación y retirada de la fase oleosa. Tras las sucesivas etapas de extracción con disolventes, la fase acuosa líquida remanente en el tubo de centrífuga se filtró en papel de filtro y se trasvasó a un embudo de decantación, quedando la biomasa residual en el fondo del tubo de centrífuga. La fase acuosa fue liofilizada durante 4 días. Los dos volúmenes obtenidos de fase oleosa se juntaron y filtraron, llevándose a sequedad en rotavapor y finalmente bajo corriente de nitrógeno. Los dos extractos (acuoso y oleoso) secos se almacenaron hasta su uso a -70°C. El extracto control se obtuvo con idéntico protocolo salvo que se usó agua mili-Q en lugar de la solución del enzima en buffer.

Determinación del rendimiento extractivo

El rendimiento en peso de los extractos acuosos fue determinado a partir de los valores de peso seco liofilizado de cada extracto acuoso en balanza de precisión de 4 dígitos. Para ello, las fases acuosas fueron liofilizadas durante 4 días y las fases oleosas fueron rotavaporeadas a 30°C para eliminar el disolvente, y posteriormente tratadas durante 4h bajo corriente de nitrógeno hasta la completa eliminación de las trazas de disolvente. A los valores de peso seco de los extractos acuosos obtenidos se les sustrajo el valor del peso correspondiente a su contenido en sales del tampón y al de la enzima añadida en la solución de Alcalase®, siendo la cantidad total sustraída inferior al 1% p/p. La biomasa residual fue igualmente secada bajo corriente de nitrógeno.

Análisis de la biomasa residual

Los cambios morfológicos producidos en la biomasa por los diferentes métodos extractivos, se estudiaron con un microscopio electrónico de transmisión Jeol Jem 1010 (100Kv) Yokyo Japan. Cámara digital acoplada al equipo modelo Orius SC200 de Gatan Inc. Pleasanton, California. Software para adquisición de imágenes Digital Micrograph v 3.4. Todas las muestras fueron previamente tratadas para su fijación con aldehídos, lavado, osmificación, deshidratación, inclusión en resina durcupan con una polimerización final en estufa a 60°C durante 48h.

Análisis de composición en aminoácidos de los extractos acuosos

El análisis cuantitativo de las mezclas de aminoácidos se realizó conforme al procedimiento cromatográfico desarrollado.por Spackman, Moore y Stein en 1958 (Fed Proc. 1958, 17(4):1107-1115) y basado en el principio básico de operación en modo flujo continuo, en un aparato Biochrom 30 Series amino Acid Analyser, con una reproducibilidad > 0,5 CV a 10 nmoles. Biochrom 30 usó la metodología clásica de análisis de aminoácidos basada en cromatografía líquida de intercambio iónico y una reacción post-columna en continuo con ninhidrina para obtener una análisis cualitativo y cuantitativo, con una sensitividad de ~10 pmol,

Se prepararon por triplicado las correspondientes soluciones de los diferentes extractos acuosos secos (1-2,6 mg/mL) en tubos de hidrólisis, y se les añadió un volumen determinado de una solución de concentración conocida de norleucina (utilizada como estándar interno). Se analizaron cantidades conocidas de estándar y estándar interno para calibrar el analizador.

Identificación de biocomponentes de los extractos acuosos por LC ESI-MS MS Los diferentes extractos acuosos (enzimáticos y control) fueron analizados mediante LC ESI-MS MS en modo de ionización positiva, a fin de identificar sus respectivos biocomponentes.

Previo a su análisis, todas las muestras se limpiaron utilizando las puntas con fase estacionaria C18 de Millipore. Los análisis LC ESI-MS MS se realizaron en un Ultimate 3000 nanoHPLC (Dionex, Sunnyvale, California) acoplado a un espectrómetro de masas trampa de iones AmaZon Speed (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). La columna analítica usada de era de base sílice de fase reversa C18 PepMap 75 pm * 15 cm, 3 pm de tamaño de partícula y 100 Á tamaño de poro (Dionex, Sunnyvale, California). La columna de la trampa era una C18 PepMap (Dionex, Sunnyvale, California), 5 pm diametro de partícula, 100 Á tamaño de poro, conectada en línea con la columna analítica. La carga de la bomba eluía una solución de 0,1% ácido trifluoroacetico en 98% agua/2% acetonitrilo (ScharLab, Barcelona, Spain) a 30 ^l/minutos. La nanobomba proporcionaba una velocidad de flujo de 300 nl/minutos y operó en condiciones de elución con gradiente, usando 0,1% ácido fórmico (Fluka, Buchs, Suiza) en agua como fase móvil A, y 0,1% ácido fórmico en 80% acetonitrilo / 20% agua como fase móvil B. El gradiente de elución se realizó conforme al siguiente esquema: en modo isocrático con 96% A: 4% B durante cinco minutos, un incremento lineal a 40% B en 60 minutos, un incremento lineal hasta 95% B en un minuto, condiciones isocráticas de 95% B durante siete minutos y retorno a las condiciones iniciales en 10 minutos. Se inyectaron 5 ^l de las disoluciones de extractos (4 ^g/^l), siendo las longitudes de onda registradas 214 y 280 nm. En un segundo análisis se inyectaron 5 ^l de disoluciones de extractos de 10 ^g/^l. El sistema LC estaba conectado mediante una fuente CaptiveSpray (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) al espectrómetro de masas con trampa de iones operando en modo positivo con un set de voltaje capilar a 1400 V. La adquisición automática de datos permitió obtener secuencialmente, el scan completo de espectros de MS (m/z 350-1500), y los espectros MS CID de los ocho iones más abundantes. En el análisis de las muestras de 10 ^g/^l, el scan completo de espectros de MS fue 100-1000 m/z. La dinámica de exclusión fue aplicada para prevenir la misma m/z desde su aislamiento durante 1 minuto después de su fragmentación.

Para la identificación de péptidos, los datos de MS y MS/MS obtenidos para fracciones individuales de HPLC fueron procesados con DataAnalysis 4.1 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). Para la identificación de péptidos, los espectros MS/MS (en forma de ficheros genéricos Mascot) fueron analizados frente a una base de datos compuesta obtenida del NCBInr (National Center for Biotechnology Information, as a protein database for searches. It contains non-identical sequences from GenBank CDS translations, PDB, Swiss-Prot, PIR, and PRF) y que contenía 68623 entradas de proteínas de ambas, Spirulina y Arthrospira. Las búsquedas en la base de datos se hicieron usando una versión licenciada de Mascot v.2.6.0 (Matrix Science, London, UK) (Electrophoresis, 1999, 20(18): 3551-67). Los parámetros de búsqueda fueron fijados como sigue: metionina oxidada como modificación de variable, sin restricción de enzima. La tolerancia de masa peptídica se fijó a 0,3 Da en modo MS y 0,4 Da en modo MS/MS, no se permitieron pérdidas por rupturas. En la mayor parte de los casos, se obtuvo una precisión de ± 0,1-0,2 Da tanto en espectros de MS como de MS/MS.

Además, en el caso de la muestra de Alcalase® se tomaron todos los espectros MS y MS/MS obtenidos en el análisis de la muestra y se analizaron utilizando la herramienta "de novo" del programa Peaks (Bioinformatics Solutions, Inc). Este programa permite, al igual que Mascot, enfrentar los espectros MS/MS obtenidos en el análisis de las muestras frente a una base de datos de entradas de secuencias, en este caso de Artrhospira-Spirulina. Este análisis “de novo” analiza matemáticamente los datos espectrales buscando la mejor solución de secuencia que explique el espectro. Se trata de un análisis no condicionado. La tabla incluye sólo aquellos espectros MS y MS/MS y sus correspondientes interpretaciones de novo. La columna confianza tiene los valores solo iguales o superiores a 80 para evitar que entren secuencias muy dudosas. La interpretación tiene una serie de condicionantes que hacen indistinguibles las identidades: I y L; K y Q; F y M(ox).

Determinación del contenido total de carbohidratos

El contenido en carbohidratos totales de los extractos acuosos liofilizados se determinó el método fenol-sulfúrico (Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356). Los extractos se resuspendieron en agua miliQ a una concentración de 0,2 g/l y analizaron por duplicado, expresándose los resultados como el valor medio calculado con su desviación estándar.

Análisis de la actividad antihipertensiva

Evaluación in vitro de la actividad inhibidora de ACE (enzima convertidora de angiotensina I), según el protocolo descrito por Sentandreu y Toldrá (Nat. Protoc. 2006, 1: 2423-2427). El sistema renina-angiotensina constituye el mayor sistema regulador de la presión sanguínea en el cuerpo humano. En dicho sistema, ACE transforma el decapéptido angiotensina I en el péptido vasoconstrictor angiotensina II y, a su vez, desactiva el vasodilatador bradiquinina. Además, esta enzima juega un importante papel en el control de la presión sanguínea. El valor de IC50 (concentración de extracto de espirulina necesario para inhibir el 50 % de la actividad de ACE) se utiliza para expresar la capacidad inhibidora de ACE in vitro del extracto.

La actividad ACE se determinó siguiendo la generación de fluorescencia debido a la liberación del producto fluorescente o-aminobenzoylglicina (Abz-Gly) del sustrato no fluorescente Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro. La actividad inhibidora de ACE de las muestras se midió por triplicado. La fluorescencia emitida se determinó a cada minuto durante 30 minutos a longitudes de onda de emisión y excitación de 355 y 405 nm, respectivamente, en un microplato de fluorimétrico Synergy HT (Biotek, Winooski, VT, USA). El valor de IC50 se determina mediante curvas de dosis-respuesta en las que el rango de concentración de proteína (0-0,8 mg/ml) se distribuyó a lo largo de una escala logarítmica y usando la función de ajuste a una curva de regresión no-lineal sigmoidal en GraphPad Prism 4.00 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Análisis de la actividad anti-hiperlipidémica: inhibición de la lipasa pancreática La actividad de los extractos en la inhibición de la actividad de la lipasa pancreática de cerdo se realizó en base al método descrito anteriormente por Lee et al., ligeramente modificado (Biochim Biophys Acta. 1993; 1169: 156-164). Brevemente, p- nitrofenil butirato (PNPB, de Sigma) fue disuelto en acetonitrilo dando una disolución stock de concentración 13,33 mM, que se almacenó a -20 °C. La lipasa pancreática de cerdo se disolvió en agua Mili-Q a una concentración Anal de 15 mg/ml.

Todas las reacciones se llevaron a cabo con una concentración de sustrato 0,4 mM de PNPB en tampón 0,061 M Tris-HCl, pH 8,5 a 37 °C durante 5 minutos. El incremento de absorbancia del p-nitrofenol liberado en presencia de 1,5 mg/ml de lipasa pancreática porcina se midió a 400 nm en un espectrofotómetro UV-vis (Jasco V-630 Spectrophotometer) durante 3 minutos. Seguidamente, se determinó la velocidad de reacción en idénticas condiciones en presencia de una concentración de 0,75 mg/ml del extracto de espirulina correspondiente La diferencia entre la actividad enzimática del ensayo sin extracto y con extracto se definió como la actividad inhibidora del extracto. El ensayo de actividad se realizó por triplicado para cada extracto, los resultados fueron promediados y expresados con sus deviaciones estándar.

Análisis de actividad anti-hiperlipidémica: inhibición de la enzima colesterol esterasa pancreática

Se determinó la capacidad de los extractos para la inhibición de la colesterol esterasa pancreática, utilizando el método descrito por Pietsch y Gütschow (J. Med. Chem. 2005; 48: 8270-8288) La enzima desempeña un papel esencial hidrolizando los ésteres de colesterol de la dieta. Generalmente, la hidrólisis de los colesterol ésteres tiene lugar en el lumen del intestino delgado mediada por la colesterol esterasa pancreática (CEase), produciéndose colesterol. La capacidad inhibidora de algunos compuestos permite controlar la biodisponibilidad del colesterol procedente de los ésteres de colesterol, y así limitar la absorción de colesterol libre en el torrente sanguíneo.

La disolución buffer contenía 100 mM fosfato sódico y 100 mM NaCl, pH 7.0. Se preparó una disolución stock fresca de CEase (0,075 mg/ml) en el buffer y conservó a 0 °C hasta su uso. Una disolución stock de ácido taurocólico (TC, 8,6 mM) fue preparada en la disolución buffer y mantuvo a 4°C hasta su empleo. La disolución stock de PNPB (13,33 mM) se preparó en acetonitrilo. En la cubeta, los extractos enzimáticos (75 pg/ml) se incubaron a 25°C con una mezcla que contenía ácido taurocólico 5,16 mM, PNPB 0,2 mM en un tampón fosfato sódico 0,1 M, 100 mM NaCl a pH 7,0. La reacción se inició mediante la adición de colesterol esterasa pancreática porcina (2,5 pg/ml). La variación de absorbancia de las mezclas se midió en un espectrofotómetro UV-vis a 405 nm.

Análisis de actividad antioxidante

Los métodos de análisis de antioxidantes se clasifican en dos tipos: i) los basados en una reacción de transferencia de un átomo de hidrógeno (HAT) y ii) los basados en una reacción con transferencia electrónica (ET). Generalmente, en los HAT el antioxidante y el sustrato compiten por radicales peróxido generados térmicamente en la descomposición de azocompuestos (ej., método ORAC). Los métodos ET miden la capacidad del antioxidante para reducir a un oxidante, que cambia de color al reducirse. El cambio de color se correlaciona con la concentración de antioxidante de la muestra. Entre los ensayos ET están los de determinación de fenoles totales por Folin-Ciocalteu reagent (FCR) y algunos de determinación de Trolox equivalence antioxidant capacity (TEAC). FCR se usa para cuantificar la capacidad reductora de antioxidantes y el método ORAC para cuantificar la capacidad de secuestrar radicales peróxido.

Es habitual encontrar valores diferentes para diferentes técnicas de capacidad antioxidante. Este es uno de los motivos por lo que se recomienda realizar la medición de la capacidad antioxidante por más de un método y por eso se expresan en TEAC. Para un estudio integral de antioxidantes en una muestra, además de estos ensayos comúnmente aceptados (ABTS, ORAC y FCR), se recomienda realizar ensayos específicamente validados para la misma (J Agric Food Chem. 2005, 53(6):1841-56).

Todos los extractos acuosos se analizaron por ABTS, ORAC y FCT.

• Ensayo ABTS.

Se utilizó el método descrito por Re et al. (Biol. Med. 1999; 26, 1231-1237), que mide la capacidad de los compuestos antioxidantes para secuestrar un catión radical estable (ABTS'+). El radical monocatión preformado de 2,29-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS^1) se genera por oxidación de ABTS con persulfato potásico y es reducido en presencia de antioxidantes donadores de hidrógeno. Las influencias tanto de la concentración de antioxidante y de la duración de la reacción de inhibición de la absorción del radical catiónico son consideradas para determinar la actividad antioxidante. Los resultados se expresan mediante el valor TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity), que es la concentración (mM) de la solución una referencia estándar (Trolox) con capacidad antioxidante equivalente a la de una disolución 1 mM de analito investigado. Los resultados se expresan como los valores TEAC (mmol trolox/ g extracto). La actividad antiradicalaria con el ABTS fue determinado por cuadruplicado, siendo la reproducibilidad del método ABTS del 5%.

• Análisis de actividad antioxidante mediante determinación del secuestro de radicales hidroxilo (Hydroxyl radicalscavenging assay, (ORAC-Fluorescein) Assay).

Se utilizó el método descrito por Dávalos et al. (J. Agric. Food Chem. 2004; 52, 48-54). El radical hidroxilo (OH*) es un radical generado en el cuerpo humano, que desempeña un importante papel en el daño de los tejidos con procesos inflamatorios de enfermedades causadas por stress oxidativo.

En ambos análisis (ABTS y ORAC) se utilizó un lector multimodal de microplacas SynergyTM HT con dispensador automático de muestra, y control de temperatura de Biotek Instruments (VT, USA).

Biotek Gen5TM fue el software usado para el análisis de datos. Cada placa de 96 pocillos fue analizada cuatro veces, con cuatro niveles de estándares para calibración y ocho repeticiones por blanco o control. La reacción fue iniciada mediante la adición automática de 60 ql del radical ABTS en la disolución o del AAPH para los ensayos ABTS y ORAC, respectivamente. La actividad antiradicalaria con el ABTS fue determinada de manera estándar tras 10 minutos de reacción. Para el método ORAC los valores se tomaron tras 180 minutos de reacción.

La actividad antiradicalaria con el ABTS fue determinado por cuadruplicado y el ensayo de ORAC por triplicado. La reproducibilidad de algunas de las muestras en ORAC, en concreto la muestra control, es superior a lo normal (aprox. 10%). La reproducibilidad del método ABTS suele ser del 5%.

• Determinación del contenido total de polifenoles por FCT

Se utilizó el método de Folin-Ciocalteu (Nature Protocols, 2007; 2(4): 875-877), que determina contenido en polifenoles y otros antioxidantes. Aunque aminas aromáticas, fenoles, altos niveles de azúcares y ácido ascórbico interfieren en la determinación, este método reduce en un 15% la interferencia del ácido ascórbico.

Los extractos acuosos liofilizados se resuspendieron (10g/l) en 95% (v/v) metanol/agua, y se sometieron a un baño de ultrasonidos (20 kHz) durante 10 minutos para su mejor dilución en la solución. Los resultados se expresan como el valor medio de valores obtenidos en dos réplicas con su desviación estándar.

Ejemplo 2.

Optimización de los parámetros del tratamiento enzimático para el extracto oleoso

Se llevó a cabo la optimización del tratamiento enzimático de la biomasa de espirulina estudiando el efecto de diferentes parámetros de la reacción en la recuperación de biocomponentes oleosos de espirulina. El estudio permitió determinar los valores óptimos del pH del medio, temperatura y carga de biocatalizador en la reacción enzimática para la recuperación de biocomponentes hidrofóbicos de espirulina.

La biomasa de espirulina utilizada en el estudio fue un preparado comercial liofilizado en polvo de uso alimentario suministrado por la empresa ASN Espirulina Leader SL. Todos los disolventes utilizados tanto en la extracción y en los análisis fueron de calidad HPLC suministrados por Scharlau. Tanto el hexadecano como las sales para la preparación de las disoluciones con pureza de más del 99% fueron suministrados por Sigma-Aldrich (Madrid, Spain).

Las enzimas utilizadas en el estudio fueron: Alcalasa, denominada comercialmente Alcalase® 2.4 L FG (EC 3.4.21.62), la proteasa Flavourzyme®; la endoglucosidasa Ultraflo® Max, y la exoglucanasa Vinoflow® Max, la lipasa Lipozyme® 100L y la Celulasa Celluclast®. Todas ellas fueron suministradas por Novozymes.

El estudio de todos los parámetros se realizó mediante análisis de las diferentes fases oleosas por HPLC-ELSD, siguiendo las variaciones en el área total de los picos mayoritarios. Un ejemplo de cromatograma se muestra en la Figura 1. El pico eluído a 9 min. corresponde a hexadecano usado como estándar interno. Todos los experimentos se realizaron por duplicado o triplicado, dándose el valor medio de los valores obtenidos y su error calculado como la desviación estándar.

- Efecto del pH en la extracción asistida por enzimas

El efecto del pH del tratamiento enzimático en la recuperación de biocomponentes oleosos con seis diferentes enzimas comerciales se realizó con una carga enzimática de 1% (v/p) (volumen de solución enzimática por peso total de mezcla de reacción: biomasa y buffer) a 40°C. El estudio se realizó por duplicado, tomando alícuotas de cada mezcla biomasa-enzima tras 4 h. Los valores óptimos de pH se determinaron considerando los valores de área total de picos cromatográficos obtenidos en el análisis del extracto oleoso (Figura 2).

Para la obtención óptima del extracto oleoso con las dos proteasas estudiadas (Alcalase® y Flavourzyme®), los valores óptimos de pH fueron 6,5 y 6,0, respectivamente (Figura 2). Estos valores de pH permitieron obtener los valores máximos de área total de picos con tratamientos enzimáticos de 4 h. En el caso de Ultraflo®, se encontró un valor óptimo de pH de 7,0. En el caso de Vinoflow®, solo el valor óptimo de pH 6,5 rinde la máxima cantidad de biocomponentes extraídos con 4h de tratamiento enzimático, sugiriendo que a este valor de pH la degradación de la biomasa es más rápida. Para las enzimas Lipozyme® y Celluclast®, la extracción óptima se obtiene a pH 6,5.

En resumen, los valores óptimos de pH determinados fueron pH 6 para obtener el extracto oleoso con Flavouzyme®, pH 6,5 para la extracción con Alcalase®, Vinoflow®, Lipozyme® y Celluclast®, y pH 7,0 para la de Ultraflo®. Estos valores están dentro del rango de condiciones de operación declaradas por el fabricante Novozymes Ltd (Denmark) para estas preparaciones enzimáticas.

Los valores óptimos de temperatura y carga de biocatalizador fueron determinados seguidamente a los respectivos valores óptimos de pH de los diferentes procesos enzimáticos extractivos.

- Estudio de la temperatura

Este estudio se realizó a los respectivos valores óptimos de pH de cada enzima en el intervalo 25-50°C (Figura 3).

El efecto de la temperatura de la etapa degradadora de la biomasa (etapa a) en el proceso extractivo se estudió tomando alícuotas de la mezcla biomasa-enzima tras 4 h y 24 h de tratamiento. En la Figura 3 se muestran los valores de área total de picos de los cromatogramas de HPLC-ELSD de la fase oleosa obtenida con Alcalase®.

Considerando el error experimental del conjunto de valores tomados a 4h y a 24h, se determinó un valor óptimo de temperatura de 30°C para las extracciones con las dos proteasas (Alcalase® and Flavourzyme®), para Ultraflo® (con actividades p-glucanasa y xylanasa, junto a otras secundarias como celulasa, hemicelulasa, y pentosanasa), para la celulasa Celluclast® y la lipasa Lipozyme®. Este valor corresponde a la menor temperatura a la cual puede obtenerse el máximo valor de área total de picos de biocomponentes oleosos extraídos con estos cinco distintos tratamientos enzimáticos de 24 h. Aunque para algunas enzimas los valores a tiempos cortos (4h) son mayores a otra temperatura, a tiempos largos los valores a esas temperaturas resultan inferiores a los de 30°C, indicando una degradación de los productos a dichas temperaturas a tiempos largos. Sin embargo, a una temperatura suave de 30°C los productos susceptibles de oxidación (ácidos grasos poliinsaturados, vitaminas, antioxidantes, etc) se preservan mejor. En el caso de Vinoflow®, la máxima concentración de biocomponentes extraídos en la fase oleosa puede alcanzarse a 40°C o mayor temperatura (considerando el error experimental). El empleo de mayor temperatura favorece la cinética del proceso enzimático degradador de la biomasa, reduciendo el tiempo necesario para obtener la extracción máxima de biocomponentes, pero ello conlleva el aumento del gasto energético y reduce tanto la estabilidad de productos lábiles, como la estabilidad operacional del biocatalizador. Por tal razón, se observa un descenso en el área total observada cuando el tratamiento enzimático de la biomasa se prolonga de 4h a 24h al aumentar la temperatura del proceso con algunas de estas enzimas (Alcalase® a 50°C, Flavourzyme® a 40-50°C, Ultraflo® y Vinoflow® a 50°C). Teniendo en cuenta la disminución de la estabilidad enzimática al aumentar la temperatura, y la termolabilidad de los compuestos a extraer, resulta más favorable la temperatura de 40°C respecto a otras superiores para Vinoflow®.

Por tanto, los valores a 4h y 24h indicaron que la temperatura óptima podría ser 30-40°C para algunos enzimas. En base a la termolabilidad de los biocomponentes (antioxidantes, etc) y a consideraciones para minimizar el consumo energético del proceso, se seleccionó la temperatura de 30°C como óptima para los procesos enzimático con Alcalase®, Ultraflo®, Flavourzyme®, Lipozyme® y Celluclast®, y de 40°C para el de Vinoflow®.

- Estudio de la carga enzimática

La carga de biocatalizador empleada en la etapa degradadora es un importante parámetro del proceso extractivo, ya que afecta a la velocidad de biodegradación de la biomasa previa a la extracción de biocomponentes con disolventes, y ésta determina el valor del rendimiento extractivo. El valor óptimo de la carga enzimática debe determinarse cuidadosamente. Aunque el empleo de una alta carga enzimática reduce el tiempo necesario para lograr la deseada degradación de la biomasa, ello también supone incrementar el coste de la partida del biocatalizador, y en el caso de proteasas puede favorecer la autodestrucción vía autolisis del biocatalizador.

Los resultados obtenidos para la extracción con Alcalase® a diferentes cargas del biocatalizador se muestran en la Figura 4. Este estudio se realizó en el intervalo 0-2% v/p de carga para todas las enzimas estudiadas, excepto para Vinoflow® (0-4% v/p). Los resultados obtenidos en las diferentes extracciones enzimáticas se compararon con los obtenidos en el experimento control sin enzima, donde en lugar de la solución enzimática se empleó una cantidad equivalente de solución acuosa (Figura 4).

Se determinó un valor óptimo de carga enzimática de 1% v/p para todos los casos, excepto para Vinoflow®, que fue 2% v/p, habida cuenta que o bien el empleo de cargas enzimáticas superiores rendían inferiores valores de área o el aumento de ésta no justificaba el empleo de mayor cantidad de biocatalizador.

En general, el área total de picos incrementa cuando la duración del tratamiento enzimático se prolonga en el intervalo 0-24h con todas las cargas enzimáticas estudiadas (Figura 4). Solo en el caso de Vinoflow® con 1% (v/p) de enzima la reacción se ralentiza después de 4h, de forma que la cantidad de biocomponentes recuperada resulta prácticamente invariable. También, el área total de productos extraídos no aumenta al aumentar el tiempo de tratamiento con Vinoflow® de 4h a 24h usando la mayor carga enzimática estudiada (4% v/p Ultraflow®). Ello sugiere que una excesiva concentración enzimática puede favorecer la posterior degradación de los productos extraídos. Además, la recuperación de los productos oleosos incrementa al aumentarse la carga enzimática de 0,5% a 1% (v/p) cuando se usan las dos proteasas y Ultraflo®, pero disminuye dramáticamente cuando se usan mayores cargas de ellas (ej., 2% v/p). Este efecto puede deberse a una excesiva biodegradación de la biomasa en presencia de una excesiva concentración de enzima. Como resultado de ello, puede tenerse una ulterior biodegradación de los productos extraídos, disminuyéndose su concentración en el extracto oleoso. En el caso de proteasas, los menores rendimientos extractivos de biocomponentes oleosos pueden ser debidos a una rápida inactivación enzimática vía autolisis favorecida a altas concentraciones de enzima.

Cabe notar que las extracciones con una etapa degradadora previa por Alcalase®, Flavourzyme®, Ultraflo® y Vinoflow® (24h de tratamiento enzimático en sus respectivas condiciones óptimas de operación) proporcionan significativos aumentos en las cantidades recuperadas de biocomponentes oleosos, comparado con las del proceso extractivo sin tratamiento enzimático de la biomasa (Figura 4). Este resultado prueba la favorable contribución de la etapa de degradación de la biomasa de espirulina por las enzimas estudiadas, para la extracción de los componentes oleosos.

Los valores óptimos de carga enzimática determinados son 1% v/p para todos los biocatalizadores estudiados, excepto para Vinoflow® (2% v/p).

En conclusión, para cada extracción enzimática, se determinaron sus condiciones óptimas de proceso, en función del pH, temperatura y tiempo de exposición a la enzima (pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Alcalase®, Lipozyme® y Celluclast®; pH 6,0, 1% v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1% v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®; la duración en todos los casos es de 24h). Los extractos del experimento control sin enzima se obtuvieron añadiendo agua mili-Q en lugar de la solución enzimática tamponada, a 30°C y 24h.

Ejemplo 3

Optimización del tratamiento enzimático para el extracto acuoso de Alcalase®. Su comparación con otras extracciones enzimáticas y control sin enzima.

Se llevó a cabo la optimización del tratamiento enzimático de la biomasa de espirulina, previo a la extracción por la mezcla de disolventes hexano/isopropanol 3:2 (v/v) para la recuperación de biocomponentes hidrofílicos de espirulina, estudiando el efecto de diferentes parámetros de la reacción enzimática en el extracto acuoso. Este estudio permitió determinar los valores óptimos del pH del medio, temperatura, carga de biocatalizador y duración de la reacción enzimática para la obtención del extracto acuoso de espirulina.

El estudio de todos los parámetros se realizó tomando alícuotas de la mezcla enzimabiomasa al tiempo indicado, y analizando las diferentes fases acuosas extraídas por HPLC-ELSD, y mediante comparación del área total de los picos significativos de cada cromatograma. Un ejemplo de cromatograma obtenido con Alcalase® se muestra en la Figura 5 (en la Figura 6, control sin enzima). El primer pico eluído hasta 2,39 min. corresponde al disolvente y no fue computado. En el estudio inicial de optimización de las variables de los procesos enzimáticos, los valores de área total de picos en sus respectivos cromatogramas de análisis por HPLC-ELSD fueron comparados, para determinar las condiciones de operación óptimas que permiten obtener la mayor tasa de recuperación de biocomponentes hidrofílicos.

Los extractos acuosos obtenidos con las dos proteasas las dos (endo- y exo-) glucanasas, la celulasa y las lipasas usadas en este estudio, deben contener diferentes biocomponentes, como resultado de los diferentes tipos de reacciones catalizadas por los diferentes biocatalizadores. En todos los casos, las sumas totales de valores de área de los picos significativos fueron también comparativamente analizados.

Seguidamente se muestra la determinación de las condiciones óptimas del proceso extractivo con Alcalase® en función del pH, temperatura, carga enzimática y tiempo de exposición a la enzima sobre el extracto acuoso tras la extracción con disolventes.

- Efecto del pH en la extracción asistida por Alcalase®

El efecto del pH del tratamiento enzimático de la biomasa en la recuperación de biocomponentes acuosos se realizó a 40°C con una carga enzimática de 1% (v/p) (unidades en volumen de solución enzimática por peso total de mezcla de reacción: biomasa y buffer). Los extractos acuosos post-extracción con disolventes obtenidos a diferentes valores de pH de la etapa enzimática (etapa (a)) se estudiaron para diferentes tiempos de tratamiento enzimático.

En la Figura 7 se representa la variación del área total de picos cromatográficos con el pH para la extracción con Alcalase®. Los resultados obtenidos de efecto del pH en el área total de los picos cromatográficos significativos obtenidos tras 4h de acción enzimática, se representan en las Figura 7A. La mayor velocidad inicial (4h) de extracción de biocomponentes con Alcalase® se obtiene a pH 6,5 (Figura 7A). A pH 6,5 el proceso de degradación enzimática resulta el más rápido, y en consecuencia se obtiene el máximo valor de área total de picos cromatográficos a este pH para extracciones con tratamiento enzimático corto (4h, Figure 7A).

También, la evolución de la extracción enzimática con la duración de la etapa a) (disgregación enzimática de la biomasa) para el valor óptimo de pH fue determinada durante las primeras 48h. Los resultados obtenidos con Alcalase® se representan en la Figura 7B. Similarmente al caso de Alcalase®, el resto de extracciones enzimáticas estudiadas requieren 24h de tratamiento enzimático de la biomasa de espirulina para obtenerse la máxima cantidad de biocomponentes en el extracto acuoso extraído con disolventes. Un mayor duración de la etapa a) (enzimática), por ej de 48h rinde menor cantidad de biocomponentes posiblemente debido a una degradación enzimática de parte de éstos (péptidos por la proteasa Alcalase®),

- Estudio de la temperatura

El efecto de la temperatura de la etapa a) en la extracción de componentes polares se estudió para 24 h de tratamiento enzimático de la biomasa. El estudio se realizó al correspondiente valor óptimo de pH de la enzima Alcalase®, y una carga enzimática de 1% (v/p) en el intervalo 30-50°C.

La Figura 8 muestra los valores de área total de picos cromatográficos de los correspondientes extractos acuosos obtenidos con Alcalase®. A fin de identificar la temperatura que permite extraer mayor cantidad de componentes hidrofílicos a partir de cada gramo de espirulina, en la Figura 8 se representa el valor de área total referida a la cantidad total de extracto acuoso obtenido a partir de 1 g de espirulina, calculada considerando el área total obtenida con la cantidad inyectada de extracto (ver adelante la determinación de rendimientos extractivos).

Considerando el error experimental, 30°C o una temperatura inferior resulta ser la temperatura óptima para la extracción con Alcalase®. La temperatura para obtener la máxima recuperación de biocomponentes en el extracto acuoso es relativamente baja. Vitaminas, antioxidantes y otros componentes termolábiles de los extractos pueden preservarse relativamente bien a estas temperaturas (30-40°C). Comparado con temperaturas mayores, a estas suaves temperaturas el coste energético y la desnaturalización de los extractos es reducida, mientras que la estabilidad operacional de los biocatalizadores empleados aumenta. De hecho, la disminución observada en la extracción de biocomponentes a mayores temperaturas (Figura 8) puede ser debida a una indeseable degradación enzimática de los biocomponentes al acelerarse térmicamente el proceso y/o a la disminución de la estabilidad operacional del enzima.

- Estudio de la carga enzimática

El valor de carga enzimática utilizado debe ser cuidadosamente seleccionado. Entre otras razones, una carga óptima de biocatalizador debe ser identificada, de forma que permita reducir el tiempo para completar la degradación deseada de la biomasa para extraer sus biocomponentes, sin aumentar excesivamente el gasto en el biocatalizador (J Am Oil Chem Soc, 2009, 86(12): 1235-1240). La carga de catalizador empleada afecta a la velocidad de biodegradación de la biomasa, previa a la etapa de extracción por disolventes, y determina el rendimiento extractivo a un tiempo dado.

Los resultados obtenidos con diferentes cargas de Alcalase® (0-2% v/p enzima) están representados en la Figura 9. Los resultados fueron comparados con los obtenidos en la extracción control, en la que se utilizó un volumen equivalente de agua milli-Q en lugar de la solución enzimática (0% carga de enzima en la Figura 9).

La extracción de biocomponentes polares aumenta al aumentar la carga enzimática empleada de 0,0% a 1% (v/p) de Alcalase®, pero disminuye dramáticamente al utilizar cargas superiores (por ej., 2% v/p; Figura 9).

La disminución de la recuperación de productos al emplear cargas superiores a cierto valor, sugiere que con elevadas concentraciones de enzima se favorece una excesiva biodegradación de la biomasa. Como resultado de ello, los componentes extraídos son el resultado de un mayor grado de biodegradación de los productos extraídos a cargas menores. En el caso de proteasas, el descenso de los rendimientos extractivos de biocomponentes puede también deberse a cierto grado de autolisis enzimática, favorecida a altas concentraciones de enzimas proteolíticas.

Un análisis individual de la evolución del área de los diferentes picos cromatográficos (Figura 10), indica que algún(os) producto(s) es(son) extraído(s) casi completamente con solo 4h de tratamiento enzimático (tiempo de retención (Tr) = 68min, Figura 10E), mientras que otros productos requieren tiempos mayores (24h) para la etapa a) (los eluídos a Tr = 3-5min.; 5,5 min; 11-14min.; 20-22min.; 28min., Figuras 10 A-E). Estos resultados sugieren que algunos de los biocomponentes extraídos son, bien intracelulares o pueden formarse por la acción degradadora enzimática sobre los componentes celulares (ej., péptidos y/o azúcares, etc).

La inspección individual de la evolución temporal del área de los diferentes picos de productos extraídos en el extracto acuoso, revela la existencia de dos tipos de cinéticas extractivas para los diferentes productos. Estos resultados sugieren que los productos localizados en lugar más accesible de la célula (ej, región extracelular) necesitan un tiempo corto para la etapa a) de degradación enzimática de la biomasa. Pero, la extracción completa de los dos tipos de biocomponentes requiere una duración de la etapa enzimática de 24h. La duración de la etapa de tratamiento enzimático es un importante parámetro. En este proceso, 24h son necesarias para obtener la máxima extracción de componentes intra- y extracelulares de la biomasa de espirulina.

Finalmente, se determinó que las condiciones óptimas del tratmiento enzimático para Alcalase® son: temperatura de 30°C, pH 6,5, 24h y carga enzimática 1% v/p.

Los estudios de los ejemplos 2 y 3 revelaron que tanto las cantidades de biocomponentes recuperados en la fase acuosa (determinados en base a áreas cromatográficas), como la composición de los diferentes extractos, varían según estos parámetros (tipo y carga de enzima, extensión temporal de su acción, temperatura y pH de trabajo). También, se determinó que las condiciones de operación óptimas para la etapa de degradación enzimática de la biomasa, son idénticas para la recuperación tanto de los biocomponentes hidrofílicos como hidrofóbicos (extractos acuosos y oleosos, respectivamente).

Ejemplo 4

Rendimientos en peso de los extractos en condiciones óptimas

Los procesos extractivos fueron realizados a mayor escala (10 g de biomasa de A. platensis) y los correspondientes extractos oleosos y acuosos obtenidos en sus respectivas condiciones llevados a sequedad para determinar su peso. Los diferentes extractos enzimáticos y el control (sin enzima) fueron preparados (por duplicado) en sus respectivas condiciones óptimas: pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Alcalase®, Lipozyme® y Celluclast®; pH 6,0, 1% v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1% v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®. Los extractos del control sin enzima se obtuvieron añadiendo agua mili-Q en lugar de la solución enzimática tamponada, a 30°C y 24h.

Todos los extractos fueron secados (en rotavapor+corriente de nitrógeno) o liofilizados, determinando su peso seco en una balanza de precisión (4 dígitos). En la Tabla 1 se recoge los valores de rendimiento en peso seco de las diferentes fases (oleosa, acuosa y residual) Los rendimientos se calcularon como el porcentaje de peso del extracto seco (o biomasa residual seca) respecto al peso utilizado de la biomasa seca de espirulina.

Todos los sistemas de recuperación de biocomponentes con asistencia enzimática proporcionaron mayores rendimientos extractivos de las fases acuosas y oleosas que el sistema control sin enzima. El mayor rendimiento en peso de extracto oleoso se obtuvo con Vinoflow®, mientras que, para el extracto acuoso los sistemas extractivos que utilizan biocatalizadores proteolíticos (Alcalase® y Flavourzyme®) dieron el mayor rendimiento en peso seco; si bien, el mayor rendimiento en el extracto acuoso fue el de Alcalase®. El proceso de extracción enzimática con Alcalase® permitió aumentar 1,5 y 1,9 veces el peso de los extractos oleoso y acuoso, respectivamente, con respecto a los obtenidos en el control sin enzima (Tabla 1).

Tabla 1 . - Rendimientos en peso de la Extracción en condiciones óptimas_____

RENDIMIENTOS DE EXTRACCIÓN (%)

Enzima FASE

Orgánica Acuosa Biomasa Residual Alcalase® 6,7±0,1 36,5±0,1 47,7±0,4 Flavourzyme® 6,4±0,1 31,8±0,1 47,8±1,0

Ultraflo® 5,9±0,1 19,7±0,1 61,4±1,2

Vinoflow® 8,1±0,2 26,3±0,1 57,1±0,3

Lipozyme® 5,0 27,0 66,6

Celluclast® 4,9 26,1 69,3

Control 4,7±0,2 19,2±0,2 70,1±0,4 Alcalase®* n.d. 42,9 56,1 Flavourzyme®* n.d. 41,8 56,8

Control* n.d. 49,0 50,2

* Rendimientos de la extracción de biocomponentes de la etapa a), sin emplear disolventes post-tratamiento enzimático. n.d.: no determinado.

Cuando la recuperación del extracto acuoso se realiza sin adición de la mezcla de disolventes hexano/isopropanol, los rendimientos en peso de las fases acuosas y biomasa residual varían respecto a la extracción usando estos disolventes (Tabla 1 , indicado como *), de forma que se obtiene mayor peso de fase acuosa sin el uso de estos disolventes. Hecho que es particularmente notable en el caso de la extracción control sin enzima. Ello es probablemente debido a la dificultad de separar bien el material oleoso, que, al no retirarse a la fase de hexano, queda firmemente adherido a la biomasa residual y parcialmente emulsionado en la fase acuosa. A diferencia de lo que ocurre usando la mezcla de hexano/isopropanol para extraer los biocomponentes, las fases acuosas de las extracciones con Alcalase® y Flavouzyme® recuperadas sin empleo de estos disolventes tienen menor peso que su respectiva extracción control sin enzima. Esto es debido al extraordinario aumento del peso recuperado de la fase acuosa de la extracción control sin disolventes con respecto a la misma extracción control usando disolventes para la recuperación de biocomponentes. Estas extracciones sin adición de disolventes orgánicos tienen igualmente pérdidas de rendimiento en peso debido a las mismas razones que los otros extractos (operaciones de filtración, etc).

Para los extractos recuperados con la mezcla de disolventes a partir de los rendimientos en peso de los extractos oleoso y acuoso (Tabla 1) se calcularon las unidades de área total de picos de los análisis de HPLC-ELSD de los diferentes extractos óptimos (enzimáticos y control sin enzima) referidas a 1 gramo de biomasa de A. platensis inicial. El valor calculado es indicativo de la cantidad total de biocomponentes extraídos a partir de 1 g de biomasa seca de espirulina en los diferentes procesos extractivos. El estudio comparativo de los valores obtenidos para los diferentes procesos extractivos se representa en las Figuras 11 y 12 para los extractos acuoso y oleoso, respectivamente.

En la Figura 11 se representan los diferentes valores de área total de picos de biocomponentes oleosos correspondientes a un gramo de biomasa extraída con los diferentes tratamientos enzimáticos en sus respectivas condiciones óptimas de operación. Todos los procesos extractivos tras una etapa a) de digestión enzimática de la biomasa permiten obtener la mayor cantidad de biocomponentes oleosos detectados por HPLC-ELSD, indicando que la acción de todas las enzimas facilita la recuperación de los biocomponentes oleosos intracelulares. Vinoflow® proporciona la mayor recuperación de biocomponentes detectados por HPLC-ELSD.

La comparación de los valores obtenidos para los diferentes extractos acuosos (Figura 12) indica, que el mejor método enzimático (1% v/p Alcalase®, pH=6,5, 30°C y 24h) permite aumentar la recuperación de biocomponentes polares por gramo de espirulina 2,5 veces con respecto al obtenido con la simple extracción por disolventes (control), lo cual es consecuencia de que el método de Alcalase® aumenta el peso del extracto acuoso un 90% (1,90 veces mayor % p/p) y de la diferente composición de los extractos obtenidos con las distintas enzimas (ver Ejemplos 6 y 7). La cantidad de biocomponentes hidrofílicos detectados por HPLC-ELSD, extraída de cada gramo de espirulina con Alcalase® resulta 3 veces mayor que el obtenido con la otra proteasa (Flavourzyme®). Para el extracto acuoso, no todos los sistemas enzimáticos aumentan la cantidad de biocomponentes extraídos, siendo las cantidades obtenidas con Vinoflow®, Lipozyme® y Celluclast® similares a la obtenida en el control sin enzima.

Estos resultados demuestran la superioridad del proceso extractivo de Alcalase® para la recuperación de biocomponentes hidrofílicos de espirulina.

Ejemplo 5

Análisis morfológico de la biomasa.

La mayor extracción neta de biocomponentes y menor cantidad de biomasa residual) obtenida mediante tratamiento con Alcalase®, se visualizó también mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la biomasa residual, siendo la de Alcalase® la que se visualizó más desintegrada y traslúcida, indicando mayor desaparición de sus biocomponentes, con respecto a los otros casos (Figuras 13-14).

La visualización de las biomasas residuales al microscopio electrónico corrobora la superioridad extractiva de componentes del proceso con Alcalase® con respecto a otros procesos enzimáticos estudiados y al control sin enzima.

Ejemplo 6

Análisis de composición en aminoácidos de los extractos acuosos obtenidos en condiciones óptimas de los procesos extractivos

El análisis cuantitativo de las mezclas de aminoácidos se realizó conforme al procedimiento descrito en el ejemplo 1. En la Figura 15 se representa el contenido total de moles de aminoácidos extraídos por g de biomasa con cada sistema extractivo.

El extracto acuoso obtenido con Alcalase® tiene mayor contenido en amino ácidos totales (45% p/p extracto liofilizado) que el extracto control sin enzima (34% p/p) y que los de las otras enzimas (13-17%).

El extracto obtenido con el método de Alcalase® es particularmente rico en Glu, Asp y Leu; destaca el aumento en la recuperación de moles de Tyr (3,7-10,8 veces mayor cantidad que con los demás métodos). El método de Alcalase® permite recuperar hasta 7,2 y 10,8 veces mayor cantidad de moles de Arg y Tyr, respectivamente, y para los demás elementos el de Alcalase® es 2,6-3,3 veces superior que el método de la proteasa (Flavourzyme®).

Ejemplo 7

Identificación de biocomponentes de los extractos acuosos por LC ESI-MS MS Los biocomponentes de los diferentes extractos acuosos separados con disolventes (enzimáticos y control) fueron analizados e identificados mediante LC ESI-MS MS en modo de ionización positiva, mediante la metodología descrita en el ejemplo 1. Las condiciones de obtención de los extractos fueron las determinadas como óptimas: pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Alcalase®, Lipozyme® y Celluclast®; pH 6,0, 1% v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1% v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®; el extracto del control sin enzima se obtuvo añadiendo agua mili-Q a 30°C en lugar de la solución enzimática tamponada y 24h.

Los perfiles cromatográficos obtenidos con trampa Bruker AmaZon del equipo empleado, están representados en la Figura 16, donde se representa la variación de intensidad de señal recibida por el detector (un sistema basado en conversión dinodal (Daly detector)). Los diferentes cromatogramas indicaron que todos los extractos estaban integrados por un importante número de biocomponentes. También se observó que, todos los sistemas enzimáticos extractivos dieron mayor número y cantidad de biocomponentes en el extracto acuoso que el control no enzimático (Figura 16).

La columna cromatográfica utilizada resuelve por interacción hidrofóbica con los productos, eluyendo a tiempos mayores los de menor polaridad. En el extracto control se observan tres picos que no aparecen en el resto de los extractos: dos bandas estrechas a 46 y 63 min. de intensidad media, y una banda ancha y alta a tiempos de retención altos (66-94 min.; Figura 16). La mayor degradación del material celular observada por TEM en el caso de los extractos enzimáticos comparado con el extracto control (no enzimático) se correspondió con el hecho de que los extractos enzimáticos presentaron mayor número de biocomponentes en el análisis por LC ESI-MS MS, existiendo varias zonas del cromatograma con biocomponentes, que no aparecen en los del extracto control (especialmente la zona de tiempo de elución de 50-70 min., Figura 16). Los distintos extractos enzimáticos presentaron diferentes biocomponentes (Figura 16). La mayor desaparición del material celular observada por TEM en el caso del extracto de Alcalase®, se correspondió con el hecho de que este extracto de Alcalase® presentó mayor número de biocomponentes en el análisis por HPLC-MS-MS, existiendo varias zonas del cromatograma con biocomponentes, que no aparecen en los otros extractos. (picos mayoritarios a 53 min., 60 min. y 80 min., Figura 16). El cromatograma de Flavourzyme® presenta picos a tiempos de retención entre 35 y 45 min. inexistentes en los comatogramas del resto de extractos (Figura 16).

Según la Tabla 2, en el extracto de Alcalase® se han detectado 8 péptidos diferentes de los detectados en el resto de extractos (enzimáticos o control). Concretamente tiene al menos 11 familias de péptidos exclusivos, correspondientes a diferentes proteínas de Arthrospira sp. con su correspondiente actividad biológica: MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1) , (nitrogen regulatory protein P-II [Arthrospira platensis NIES-39]); LPPL (SEQ ID NO: 2) , sin asignación; ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3),(AtpH [Arthrospira platensis HN01]); TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), (ATP synthase c chain [Arthrospira platensis NIES-39]); DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), (Full=Elongation factor Tu; Short=EF-Tu), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) y CHLLLSM(+15.99) (SEQ ID NO: 8); las tres últimas sin asignación. En una realización todavía más particular, el extracto de la invención comprende los péptidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8

Tabla 2 . -Secuencia peptídica, tiempo de retención (Rt, minutos), masa molecular calculada y experimental (Da), y marca o score de los péptidos identificados en los extractos acuosos de A. platensis utilizando LC ESI-MS MS.

Extracto ^RT Secuencia Peptídica Mr. M. Exp

_min. Se . ID: Da Calc. _Da Marca

Ejemplo 8

Determinación de las propiedades bioactivas de los extractos acuosos

Se realizó un estudio comparativo de las propiedades antihipertensiva, antihiperlipidémica (anti-hipertriglicerolémica y anti-colesterolémica), y antioxidante de los extractos acuosos enzimáticos y control.

Análisis de la actividad anti-hipertensiva

Los valores de actividad anti-hipertensiva de todos los extractos se resumen en la Tabla 3. El tratamiento con Alcalase® presenta la mayor actividad inhibidora de ACE, siendo 3,7 veces superior a la del extracto control. La posterior extracción con disolventes permite incrementar esta actividad frente al control aún más, hasta 7,3 veces.

Tabla 3. - Actividad anti-hipertensiva. Evaluación in vitro de la capacidad inhibidora de ACE (enzima convertidora de angiotensina

Enzima ^IC50 A extraída* control_(mg/ A/A_{ml) (ml)}

Alcalase® (proteasa) 0,050±0,006 7,3±0,9 7,3 Flavourzyme® (proteasa) 0,236±0,012 1,3±0,1 1,3

Ultraflo® (endoglucanasa) 0,178±0,029 1,1 ±0,2 1,1 Vinoflow® (exoglucanasa) 0,404±0,029 0,7±0,0 0,6 Celluclast® (celulasa) 0,216±0,019 1,2±0,1 1,2 Lipozyme® (lipasa) 0,255±0,054 1,1 ±0,2 1,0

Control (Sin enzima) 0,189±0,028 1,0±0,2 1,0

Alcalase® (proteasa)*** 0,105±0,004 4,1±0,2 3,7

Flavourzyme® (proteasa)*** 0,397±0,063 1,1±0,2 1,0

Control (Sin enzima)*** 0,446±0,052 1,1±0,1 1,0

*La actividad anti-hipertensiva extraída de 1 gr biomasa, calculada como el producto de la inversa del valor de IC50 por el peso obtenido del correspondiente extracto a partir de 1 gr de espirulina (rendimiento (%)/10 g biomasa extraída).

**Relación de unidades de actividad extraídas con cada método enzimático y con el control

*** Valores de la extracción acuosa de la etapa a), sin emplear disolventes post­ tratamiento enzimático.

Análisis de la actividad anti-hiperlipidémica: inhibición de la lipasa pancreática

La hiperlipidemia incluye diferentes desórdenes metabólicos que conducen a

hipertrigliceridemia y/o hipercolesterolemia en el torrente sanguíneo. A largo plazo, todo

esto conduce a complicaciones vasculares (microangiopatía, enfermedades

cardiovasculares, cerebrovasculares y/o síndrome metabólico).

Todos los extractos enzimáticos presentan una mayor capacidad inhibidora que el

extracto control, siendo 35-62 veces superior la de aquellos (Tabla 4). Los dos extractos

obtenidos con proteasas (Alcalase® y Flavourzyme®) resultaron tener la mayor actividad

inhibidora, que fue similar para ambos extractos.

Respecto a los procesos extractivos, los dos procesos de proteasas (Alcalase® y

Flavourzyme®) resultaron extraer la mayor actividad inhibidora, siendo 106 y 94 veces

superior que la obtenida con el extracto control.

Tabla 4. - Actividad inhibidora in vitro de la lipasa pancreática de cerdo.

Enzima _(Aab ^A Inhibición A^{e x tra c to} A^{e x tra íd a}

_s/s)* (AAbs x L/s. g (AAbs x L/s. g A/Acontrol (%) extracto) biomasa)

Sin Inhibidor 0,368±0,008 - - - -

Alcalase®

(proteasa) 0,256±0,007 30,3±1,9 0,149±0,019 54,5±6,8 106 Flavourzyme®

(proteasa) 0,254±0,008 31,1 ±2,1 0,152±0,020 48,3±6,4 94 Ultraflo®

(endoglucanasa) 0,282±0,003 20,7±0,7 0,115±0,013 22,6±2,6 44 Vinoflow®

(exoglucanasa) 0,304±0,009 17,5±2,2 0,085±0,021 22,4±5,6 44 Celluclast®

(celulasa) 0,366±0,008 0,5±2 0,002±0,020 0,6±5,2 1 Lypozime®

(lipasa) 0,368±0,008 0,0±4,6 0,000±0,020 0,0±5,4 0 Control

(Sin enzima) 0,366±0,012 0,5±3,0 0,003±0,011 0,5±2,1 1 * unidades de actividad como incremento de absorbancia por segundo, para 750 mg/l extracto en la cubeta

** Relación de unidades de actividad extraídas con cada método enzimático y con el control

Análisis de actividad anti-hiperlipidémica: inhibición de la enzima colesterol esterasa pancreática

Los resultados se presentan como inhibición (%) de la colesterol esterasa pancreática (Tabla 5).

Todos los extractos enzimáticos presentaron mayor actividad inhibidora que el control, siendo la del obtenido con Alcalase 16 veces mayor que la del control y 1,1-3,5 veces superior a la del resto de extractos enzimáticos. Por cada gramo de biomasa, el método de Alcalase® permite extraer 26 veces más productos hipocolesterolémicos que el control sin enzima.

Tabla 5 . - Actividad hipocolesterolémica determinada por inhibición de la colesterol esterasa pancreática.

Aextracto A extraida

A Inhibición (AAbs x (AAbs x L/seg A/Acontrol Enzima

(Aabs/seg)* (%) L/seg. g x g biomasa) **

extracto)

Sin Inhibidor 0,515±0,007 - - - -Alcalase®

0,432±0,006 16,0±1,2 1,11 ±0,17 0,404±0,063 26 (proteasa)

Flavourzyme® 0,439±0,008 14,7±1,6 1,01 ±0,20 0,322±0,064 21 (proteasa)

Ultraflo®

0,491 ±0,006 4,5±1,2 0,32±0,17 0,063±0,034 4

(endoglucanasa)

Vinoflow®

0,452±0,011 12,2±2,1 0,84±0,24 0,221 ±0,063 14

(exoglucanasa)

Control

0,509±0,006 1,0±1,2 0,08±0,17 0,015±0,033 1

(Sin enzima)

*Actividad (A) en unidades de actividad como incremento de absorbancia por segundo para 75 mg/l extracto.

** Relación de unidades de actividad extraídas con cada método enzimático y con el control

Análisis de actividad antioxidante

La actividad antioxidante de los extractos liofilizados se determinó mediante tres métodos distintos: mediante el ensayo ABTS, que mide la capacidad de los compuestos antioxidantes para secuestrar un catión radical estable (ABTS'+), mediante el ensayo ORAC, en el que se determina el secuestro de radicales hidroxilo (ORAC-Fluorescein) Assay), mediante análisis de polifenoles totales por FCR.

A) Métodos ABST Y ORAC

Los resultados de los métodos ABTS y ORAC se expresan mediante el valor TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), que es la concentración de la solución la referencia estándar (Trolox, mM) con capacidad antioxidante equivalente a la de una disolución 1 mM de analito investigado. Los resultados se expresan como mmol Trolox por g extracto.

Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 6, donde puede observarse que todos los extractos tienen actividad antioxidante. Es habitual encontrar valores diferentes para diferentes técnicas de capacidad antioxidante y por eso se expresan en TEAC, como ocurre en este caso. Es uno de los motivos por lo que se recomienda realizar la medición de la capacidad antioxidante por más de un método. Por los dos métodos utilizados, los extractos tienen actividad antioxidante, y el proceso de Alcalase® permite extraer más actividad antioxidante que el control. Por el método ORAC, los extractos de Alcalase® y Ultraflo® presentan superiores valores de actividad antioxidante que el resto. En el proceso de Alcalase®, por cada gramo de espirulina se extrae superior valor de actividad de antioxidante que con los demás procesos por el método ORAC, siendo éste 4,4 veces mayor que la cantidad obtenida con el proceso control, y 1,6 veces mayor que con la otra proteasa. La capacidad antioxidante extraída con Alcalase®, determinada por el método ABTS, resultó ser 1,5 veces mayor que la obtenida con la extracción control, y 1,4 veces mayor a la de Flavourzyme®.

Tabla 6. - Actividad Antioxidante determinada por los métodos ABTS and ORAC.

ABTS ORAC*

TOTAL TOTAL EXTRACTO R** EXTRACTO R** EXTRAIDA EXTRAIDA

Enzima

TEAC TEAC TEAC TEAC

(pmol/g (pmol/g (pmol/g (pmol/g

extracto Biomasa) extracto Biomasa) liofilizado) liofilizado)

Alcalase®

19,7±0,5 7,19±0,18

(proteasa) 1,5 462±19 169±7 4,4

Flavourzyme®

15,5±0,5 4,93±0,16

(proteasa) 1,0 325±14 107±4 2,8

Ultraflo®

24,1±0,6 4,75±0,12

(endoglucanasa) 1,0 269±12 53±2 1,4

Vinoflow®

16,4±0,6 4,31 ±0,16 0,9 260±5 68±1

(exoglucanasa) 1,8

Celluclast® 31,5±0,8 8,22±0,22 1,7 - - -Lipozyme® 28,7±0,4 7,75±0,10 1,6 - - -Control (Sin

23,4±0,9 4,78±0,12

enzima) 1,0 199±16 38±3 1,0

*Valores de la cinética obtenidos a los 180 min.

** Ratio de unidades de actividad extraídas con cada método enzimático y con el control sin enzima

B) Determinación del contenido total de polifenoles.

Se utilizó el método de Folin-Ciocalteu (FCT) descrito en el ejemplo 1, que determina contenido en polifenoles y otros antioxidantes. Los resultados mostrados en la Tabla 7 indican que todos los métodos enzimáticos aumentan la capacidad de recuperación de polifenoles. A partir de cada gramo de espirulina, con Alcalase® se obtiene 2,3 veces más peso de polifenoles que el del control y 1,4-2,1 veces más que con las demás enzimas (1,12 veces más que con Flavourzyme).

Tabla 7 . - Polifenoles recuperados en los distintos procesos extractivos

Enzima ^Polifenoles Polifenoles R*

_{(mg /g extracto)} (mg /g biomasa)

Alcalase® (proteasa) 12,1 ±0,1 4,16±0,23 2,3 Flavourzyme® (proteasa) 9,3±0,0 2,95±0,01 1,6 Celluclast® (celulasa) 8,2±0,1 2,15±0,02 1,2 Ultraflo® (endoglucanasa) 11,0±0,1 2,16±0,02 1,2 Vinoflow® (exoglucanasa) 8,0±0,1 2,11±0,04 1,1 Lipozyme® (lipasa) 7,3±0,1 1,98±0,03 1,1 Control 9,6±0,0 1,84±0,01 1,0 * Ratio del peso de polifenoles extraído por gramo de espirulina con cada método enzimático y con el método control sin enzima

Determinación del contenido total de carbohidratos

El contenido en carbohidratos totales de los extractos acuosos liofilizados se determinó el método fenol-sulfúrico descrito en el ejemplo 1. Los resultados mostrados en la Tabla 8 indican que Flavourzyme® es la enzima que permite extraer mayor cantidad de carbohidratos. A partir de cada gramo de biomasa con esta enzima se extraen 2,1 y 1,6 veces más carbohidratos que con el proceso control y con Alcalase®, respectivamente. El de Alcalase® extrae 1,3 veces más carbohidratos que el control.

Tabla 8 . - Carbohidratos recuperados en los distintos procesos extractivos.

Enzima ^{Carbohidratos} Carbohidratos

_{(mg / g extracto)} (mg / g biomasa) ^R*

Alcalase® (proteasa) 226,3±13,0 82,6±4,7 1,3 Flavourzyme® (proteasa) 425,5±25,7 135,3±8,2 2,1 Celluclast® (celulasa) 308,2±13,9 80,4±3,6 1,2 Ultraflo® (endoglucanasa) 122,0±17,7 24,0±3,5 0,4 Vinoflow® (exoglucanasa) 337,0±4,2 88,6±1,1 1,4 Lipozyme® (lipasa) 327,6±7,8 88,4±2,1 1,4 Control 337,0±43,8 64,6±8,4 1,0 * Ratio del peso de carbohidratos extraídos por gramo de espirulina con cada método enzimático y con el método control sin enzima

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Método para la obtención de un extracto de Arthrospira sp. caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) incubar la biomasa de Arthrospira sp. en agua o en una solución acuosa tamponada a un pH de entre 3 y 14 en presencia de la enzima Alcalase®; y

b) separar la biomasa de la solución obtenida en la etapa a) para obtener el extracto.

2. Método según la reivindicación 1, en donde el método comprende una etapa adicional que comprende la adición de un disolvente orgánico de extracción entre las etapas a) y b).

3. Método según la reivindicación 2, donde el disolvente orgánico es hexano, isopropanol o una mezcla de ambos.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el extracto obtenido en la etapa b) comprende la fase acuosa o la fase oleosa de la solución obtenida en a).

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde Arthrospira sp.

es A. platensis o A. máxima.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de 30°C.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la solución acuosa de la etapa (a) se encuentra a un pH de 6,5.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la carga enzimática en la disolución de la etapa (a) es 1% v/p.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde tras la etapa (b) se lleva a cabo la separación de las fases acuosa, oleosa y biomasa residual, mediante centrifugación o decantación.

10. Extracto de Arthrospira sp. obtenido mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Extracto según la reivindicación 10, donde dicho extracto comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 péptidos seleccionados de la lista que consiste en MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1), LPPL (SEQ ID NO: 2), ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3), TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) y CHLLLSM(+15.99) (SEQ ID NO: 8).

12. Composición farmacéutica, alimentaria o cosmética que comprende un extracto según la reivindicación 10 u 11 y, opcionalmente, comprende además al menos un excipiente o vehículo farmacéutica, alimentaria o cosméticamente aceptable, respectivamente.

13. Un extracto según cualquiera de la reivindicación 10 u 11 para su uso como medicamento.

14. Extracto según la reivindicación 10 u 11 para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad seleccionada de la lista que consiste en hipertensión, anemia, desnutrición, hiperlipidemia, obesidad y diabetes.

15. Extracto según la reivindicación 10 u 11, o la composición según la reivindicación 12, para su uso como un agente anti-hipertensivo o anti-hiperlipidemico.

16. Extracto según la reivindicación10 u 11, o la composición según la reivindicación 12, para su uso como un agente antioxidante.

17. Uso del extracto según la reivindicación 10 u 11, o la composición según la reivindicación 12, para preparar un concentrado proteico de fácil asimilación.