ES2791360T3

ES2791360T3 - Composiciones oftálmicas que comprenden iota-carragenina

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Publication number: ES2791360T3
Application number: ES15702404T
Authority: ES
Inventors: Eva Prieschl-Grassauer; Martina Morokutti-Kurz; Andreas Grassauer; Sabine Nakowitsch; Angelika Bodenteich; Marielle König-Schuster; Christiane Koller; Frédéric Pilotaz
Original assignee: Visufarma BV
Current assignee: Visufarma BV
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2015-01-20
Publication date: 2020-11-04
Anticipated expiration: 2035-01-20
Also published as: JP2017503841A; CN105939720A; EP2898888A1; HRP20191050T1; CN105939720B; US20160331776A1; PL2898888T3; EP3096766B1; EP2898888B1; CA2937402A1; SI2898888T1; EP3096766A1; MX2016009475A; JP6635343B2; PT2898888T; WO2015110429A1; ES2734269T3; CA2937402C; WO2015110430A1; RS58731B1

Abstract

Una composición farmacéutica oftálmica para administración tópica que comprende iota-carragenina a una concentración de 0.05% a 1% en peso de la preparación lista para su uso, agua, un agente de ajuste de la osmolalidad seleccionado de manitol o sorbitol, al menos un aditivo compatible oftalmológicamente que sea un agente de ajuste del pH o un sistema tampón, que comprende además dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) con la condición de que la composición en su formulación lista para su uso no contenga más del 0,5% p/v de una sal de haluro metálico.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones oftálmicas que comprenden iota-carragenina

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende iota-carragenina que es útil en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la conjuntivitis inducida por virus.

Antecedentes de la invención

La queratoconjuntivitis epidémica (EKC) es una infección ocular grave y contagiosa que afecta tanto a la conjuntiva como a la córnea y está causada por adenovirus de tipo D, predominantemente de los serotipos 8, 19, 37. Se han aislado más de 50 serotipos de adenovirus, y al menos 19 serotipos documentados causan infección ocular. Los serotipos más comúnmente asociados que causan EKC incluyen el adenovirus 8, 19 y 37, y con menor frecuencia y en formas menos severas, los serotipos 2-5, 7, 9, 10, 11, 14, 16, 21 y 29. Debido a los bajos niveles de inmunidad natural contra el adenovirus en la población general, es decir, los anticuerpos del adenovirus tipo 8 se encuentran en menos del 5% de la población general en los EE.UU., cada individuo se considera susceptible a la infección.

La EKC se caracteriza por los típicos síntomas de la conjuntivitis, como la aparición de enrojecimiento del lagrimal, sensación de cuerpo extraño y dolor intenso. Los síntomas incluyen además la inflamación de la conjuntiva (conjuntivitis) y de la córnea (queratitis), dolor asociado, edema, disminución de la vista, lagrimeo, sensibilidad a la luz, sentimiento o sensación como si un cuerpo extraño estuviera presente en el ojo, y el desarrollo de pseudo-membranas. Durante la fase aguda, que persiste durante aproximadamente dos o tres semanas, los virus están presentes y se están replicando. En el caso típico, primero se infecta un ojo y luego la infección se propaga al otro ojo en un plazo de dos a tres días. Ambos ojos se ven afectados en el 60% de los casos. La infección en el primer ojo es típicamente más seria. En aproximadamente el 20 - 50% de los pacientes, se desarrollan opacidades corneales que resultan en el deterioro de la visión que permanece durante semanas y meses, y en raros casos incluso años. Como la enfermedad es a menudo de naturaleza epidémica, se llama queratoconjuntivitis epidémica (EKC). La conjuntivitis por adenovirus es una infección de declaración obligatoria en Alemania (véase, por ejemplo, Meyer-Rüsenberg y otros, Dtsch Arztebl Int 2011; 108(27): 475-80) y está incluida en la lista de enfermedades infecciosas de categoría IV de la Vigilancia Epidemiológica Nacional de Enfermedades Infecciosas del Japón (NESID), con el mandato de recopilar, analizar y publicar informes sobre su incidencia.

La EKC aún carece de un tratamiento efectivo, por lo que hay una gran necesidad médica insatisfecha. Las gotas oftálmicas de povidona yodada parecen tener sólo una eficacia limitada y al mismo tiempo causan una sensación adicional de picor en los ojos inflamados y a veces incluso la decoloración de la conjuntiva. Una composición farmacéutica más compatible que pudiera utilizarse para el tratamiento de la EKC y para la prevención de su propagación sería, pues, muy deseable para los pacientes que sufren la enfermedad, así como para las personas que entran en contacto con esos pacientes, como familiares, amigos, colegas, médicos.

A diferencia de otros subtipos de virus de la gripe que causan enfermedades respiratorias predominantes en los seres humanos, las infecciones por el virus de la gripe H7 suelen provocar síntomas oculares más que respiratorios (Belser y otros, Emerg Infect Dis. 2009; 15:859-865) Por lo tanto, es muy conveniente que una formulación antiviral diseñada para el tratamiento de infecciones oculares virales sea eficaz durante los brotes de gripe que provocan enfermedades oculares.

El uso de carrageninas como excipientes y viscosificadores en oftalmología está bien establecido. La patente de los Estados Unidos no. 5,403,841 describe soluciones a base de carragenina que son útiles para preparar formulaciones de gotas para los ojos de ingredientes farmacéuticamente activos. Al entrar en contacto con la película lacrimal, las soluciones forman un gel que mantiene un contacto prolongado con la conjuntiva, impidiendo la rápida eliminación del principio activo de la superficie ocular y facilitando su aplicación tópica. Para un examen exhaustivo de los sistemas oftálmicos de gelificación in situ basados en carrageninas u otros polímeros cargados, véase, por ejemplo, Rupenthal y otros, Int J Pharm. 2011; 411(1-2): 69-77 y 78-85. Los sistemas poliméricos que contienen carragenina también son útiles para el suministro trans-cleral de agentes macromoleculares (Thrimawithana et al., Eur J Pharm Sci. 2011; 44(3):399-409). En ninguno de los documentos mencionados se menciona ni se insinúa ninguna actividad farmacéutica intrínseca de las carrageninas.

Algunos preparados farmacéuticos oculares que emplean carrageninas como excipientes y/o mucomiméticos contienen agentes antivirales. Por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 2007/039201 se reivindican formulaciones fotoestables de brivudina para tratar la queratitis herpética. También se sabe que las carrageninas y los mucomiméticos poliméricos aniónicos relacionados pueden utilizarse en soluciones destinadas a la limpieza y el almacenamiento de lentes de contacto, donde mejoran las propiedades astringentes de dichas soluciones que contienen agentes de bajo peso molecular con amplia actividad antimicrobiana, como el peróxido de hidrógeno, el borato o el cloruro de cetilpiridinio (véase WO 2009/152028 y WO 2010/038129). No se atribuye ninguna acción antiviral o antiinflamatoria al componente de carragenina de estas soluciones.

Se sabe que los preparados oftálmicos basados en polímeros orgánicos naturales han sido diseñados explícitamente para tratar la inflamación de la conjuntiva. Por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 2005/046562 se reivindican los ácidos hialurónicos sulfatados para tal fin terapéutico. Las carrageninas no se mencionan en la presente divulgación.

Stiles y otros (Invest Ophthalmol Vis Sci 2008; 49(4): 1496-1501) informan de que el tratamiento de los gatos que padecen conjuntivitis herpética inducida experimentalmente con una preparación ocular de lambda-carragenina redujo la duración de la capacidad infectiva del animal, aunque el curso clínico de la conjuntivitis no se acortó. En el presente documento sólo se aborda la inflamación de la conjuntiva causada por el virus del herpes felino; no se mencionan los adenovirus ni las carrageninas que no sean de la clase lambda.

En el documento WO 2009/027057 se reveló un efecto antiviral de la iota-carragenina contra adenovirus de tipo B (respiratorios). Sin embargo, en la misma solicitud se menciona que no se pudo determinar ningún efecto significativo contra los subtipos A, C y D.

El documento EP 0424043 revela formulaciones que incluyen iota-carragenina (polisacárido de sulfato) como agente gelificante y un compuesto antiviral como principio activo seleccionado de una lista de medicamentos. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir ingredientes adicionales que son: reguladores de tonicidad, conservantes y sistemas tampón.

El documento US 2012/237572 revela la composición farmacéutica antiviral de iota- y/o kappa- carragenina para la profilaxis o el tratamiento de la infección de virus respiratorios causados por el paramixovirus, la gripe humana A y el adenovirus subtipo B. Las composiciones antivirales de la carragenina pueden comprender además al menos un vehículo y/o aditivo farmacéuticamente aceptable adecuado y permitido para aplicación médica. Se sugiere el uso de cloruro de sodio como aditivo.

Breve descripción de la invención

Ahora se ha comprobado sorprendentemente que la carragenina, y en particular la iota-carragenina, puede ser formulada en una nueva composición farmacéutica para producir efectividad antiviral contra adenovirus de tipo D e infecciones causadas por dichos adenovirus de tipo D, contrariamente al estado del conocimiento de la técnica discutido anteriormente. En consecuencia, la presente invención, tal como se reivindica en las reivindicaciones independientes, se refiere, entre otras cosas, a esas composiciones novedosas que se consideran útiles para la prevención o el tratamiento de la queratoconjuntivitis epidémica.

Como ya se informó en el documento WO 2009/027057, la iota-carragenina no es eficaz contra los adenovirus de tipo D en condiciones fisiológicas, es decir, cuando el polímero se disuelve en una solución acuosa de NaCl al 0,9%. Sin embargo, incidentalmente se reveló que cuando la iota-carragenina se disuelve en agua sin NaCl el polímero exhibe una eficacia sorprendente contra los adenovirus de tipo D.

Investigaciones posteriores sobre estos inesperados hallazgos dieron como resultado la percepción de que una reducción del contenido de cloruro de sodio, en comparación con una solución fisiológica (0,9%) de NaCl, en una solución ocular tópica lista para su uso puede reducir drásticamente los valores IC50 de iota-carragenina necesarios para la actividad contra el subtipo H7N7 del virus de la gripe A. Estas características permiten y recomiendan el uso del polímero para la prevención y el tratamiento de las infecciones oculares causadas por los virus de la gripe A H7.

La presente divulgación se refiere a un preparado farmacéutico que contiene carragenina, preferiblemente iotacarragenina, para su uso como medicamento en la prevención o el tratamiento tópico de la conjuntivitis infecciosa causada por adenovirus de tipo D o virus de la gripe A de tipo H7, más concretamente para su uso como medicamento en la prevención o el tratamiento tópico de la queratoconjuntivitis epidémica causada por adenovirus y de la conjuntivitis que se produce en el curso de infecciones con la cepa de gripe H7N7.

También se ha comprobado sorprendentemente que las formulaciones farmacéuticas oftálmicas que tienen una alta concentración de iota-carragenina y un aumento de la actividad antiviral se puede lograr mediante la adición de dihidrato de sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Descripción detallada de la invención

El objeto de la presente invención es una composición farmacéutica oftálmica para administración tópica que contiene iota-carragenina en una concentración de 0.05% a 1% en peso del preparado listo para su uso, agua, un agente de ajuste de la osmolalidad seleccionado de manitol o de sorbitol, al menos un aditivo compatible oftalmológicamente que es un agente de ajuste del pH o un sistema tampón, que además comprende el dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) con la condición de que la composición en su formulación lista para su uso no contenga más del 0,5% p/v de una sal de haluro metálico.

La composición farmacéutica revelada es adecuada para la prevención o el tratamiento terapéutico de la conjuntivitis vírica mediante la administración a un ojo afectado por dicha conjuntivitis vírica o en riesgo de desarrollarla. "Conjuntivitis vírica" significa una infección de la conjuntiva causada por un virus, tal y como se define en el grupo de códigos B30 de la Clasificación Internacional de Enfermedades, versión 10 (ICD-10). En algunas realizaciones, la conjuntivitis viral es la conjuntivitis o queratoconjuntivitis debida a la infección por adenovirus (códigos B30.1 y B30.0 de la ICD-10, respectivamente). En otras realizaciones, la conjuntivitis viral puede ser causada por otros virus o por virus no especificados (códigos B30.8 y B30.9 de la ICD-10), y puede ser causada, por ejemplo, por la cepa H7N7 del virus de la gripe A.

En el contexto de la presente invención, los términos "tratar" o "tratamiento" significarán las intervenciones terapéuticas destinadas a modificar el curso clínico de la conjuntivitis vírica de tal manera que o bien los síntomas clínicos como el enrojecimiento y el dolor ocular, las perturbaciones de la visión y el flujo lagrimal, etc., sean menos severos que sin intervenciones con los preparados según la invención; o que dichos síntomas clínicos persistan durante períodos más cortos; o que se acorte el período de tiempo durante el cual un individuo infectado que tenga dichos síntomas siga siendo capaz de transmitir los agentes infecciosos causantes de la conjuntivitis viral a otro individuo; o cualquier combinación de dichos efectos.

Asimismo, en el contexto de la presente invención, los términos "prevenir" o "prevención" significarán que no se produce ninguna infección viral o que no se producen síntomas clínicamente relevantes de una infección viral en un ojo sano que haya estado expuesto primero a un preparado según la presente invención y que posteriormente haya estado expuesto a una cantidad de agente viral infeccioso que de otro modo, es decir, en ausencia de dicho tratamiento previo, sería suficiente para causar conjuntivitis viral. Por "prevenir parcialmente" se entenderá que la conjuntivitis vírica, si es desencadenada por el agente vírico infeccioso a pesar del pretratamiento del ojo con una preparación de la presente invención, se manifiesta con síntomas menos graves que sin pretratamiento, o que muestran una aparición retardada, o que se resuelven antes.

La composición farmacéutica de la invención es útil para prevenir o mejorar las complicaciones tardías de la conjuntivitis viral. Tales complicaciones son conocidas en la literatura científica y clínica, e incluyen - pero no se limitan a - opacidades corneales, infiltraciones subepiteliales y formación de pseudomembranas oculares.

Las preparaciones según la presente invención contienen iota-carragenina, como ingrediente antiviral activo o como único ingrediente antiviral activo en una concentración de 0,05% a 1% en peso, preferentemente de 0,1 a 0,5%, y más preferentemente de 0,1 a 0,3% en peso de la preparación lista para su uso. Además, están o bien esencialmente libres de sales de haluro metálico como el cloruro de sodio o de potasio, o bien no contienen más de 0,5% (p/v), preferentemente no más de 0,1% (p/v) de una o más sales de haluro metálico. Las sales de haluro metálico se utilizan frecuentemente en las formulaciones galénicas como agentes de ajuste de la tonicidad iónica. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas líquidas basadas en una solución "fisiológica" de cloruro de sodio suelen comprender un 0,9% p/v de cloruro de sodio. "Esencialmente libre" en este contexto significa que las composiciones de la presente invención no contienen más que trazas de sales de haluro de metal posiblemente originadas de impurezas de otros ingredientes presentes en la composición.

Las composiciones oftálmicas administrables tópicamente de acuerdo con la presente invención pueden tener un valor de pH dentro de un intervalo de 3,5 a 8,0, generalmente un valor de pH en el intervalo de alrededor de 4,0 a alrededor de 8,0, y una osmolalidad de alrededor de 220 a 320 mOsm/kg. Sin embargo, para diversas aplicaciones puede ser preferible ajustar la osmolalidad a valores ligeramente hipotónicos, estando dichos valores típicamente dentro de un intervalo de 170 a 250 mOsm/kg, y más específicamente dentro de un intervalo de 190 a 220 mOsm/kg, a fin de compensar la hipertonicidad de la película lagrimal debido a la enfermedad o a la evaporación excesiva con pacientes que sufren de conjuntivitis. Según la presente invención, el ajuste de la osmolalidad se realiza sin el uso de agentes de tonicidad iónica y, en particular, sin el uso de sales de haluro metálico como NaCl o KCl. En cambio, la osmolalidad deseada se ajusta añadiendo al menos uno de sorbitol o manitol.

La formulación oftálmica tópica según la presente invención comprende uno o más agentes de ajuste del pH o sistemas tampón oftalmológicos compatibles que impiden la desviación del pH durante el almacenamiento. Esos agentes incluyen, entre otros, ácido bórico, borato de sodio, citrato de potasio, ácido cítrico, bicarbonato de sodio y varios tampones de fosfato inorgánico como Na2HPO4, NaH2PO4, KH2PO4 y sus mezclas. Las fuerzas iónicas mínimas introducidas por cualquiera de estos agentes de ajuste del pH no interfieren con la esencia de la invención.

Además, la formulación oftálmica tópica de la presente invención puede comprender uno o más tensioactivos oftalmológicamente compatibles. El surfactante facilita la difusión de la formulación en la superficie del ojo y puede ser no iónico o aniónico. Entre los tensioactivos no iónicos ejemplares figuran el tyloxapol, los ésteres de sorbitán de polioxietileno, los aceites de ricino polietoxilados, los poloxámeros, los tensioactivos de polioxietileno/polioxipropileno, el estearato de polioxietileno, el estearato de polioxietileno propileno glicol, el hidroxialquilfosfonato, los ésteres y éteres del ácido láurico o palmítico, el oleato de trietanolamina o una combinación de los agentes anteriores, u otros agentes conocidos por los expertos en la materia. El agente tensioactivo, cuando se incluye, suele estar presente en una concentración de entre el 0,02 % (p/v) y el 0,1 % (p/v) de la composición.

En algunas realizaciones, la presente formulación oftálmica tópica puede contener uno o más conservantes para inhibir el crecimiento microbiano y prolongar la vida útil. Algunos conservantes ejemplares son, entre otros, el cloruro de benzalconio, el edetato disódico (EDTA), el poliquaternio-1, la biguanida de polihexametileno y el perborato. La cantidad de conservantes es típicamente menor que alrededor del 0,01% (p/v) de la composición total.

Además de los ingredientes mencionados, se prevé que en las composiciones farmacéuticas de la presente invención puede haber una variedad de ingredientes adicionales o alternativos, entre los que se incluyen, entre otros, antioxidantes como la vitamina E o sus derivados disponibles en el mercado, como el succinato de polietilenglicol de tocoferol 1000 (TPGS), el ácido ascórbico o el metabisulfito de sodio.

Otra realización de la presente invención se refiere a las composiciones farmacéuticas oftálmicas para administración tópica que comprenden la iota-carragenina como ingrediente antivírico activo en una cantidad antiviral efectiva, el dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), un agente de ajuste de la osmolalidad seleccionado del manitol o del sorbitol, un agente de ajuste del pH o un sistema tampón y agua, con la condición de que la composición en su formulación lista para el uso no contenga más del 0,5% p/v de una sal de haluro metálico.

La composición de la mencionada realización contiene iota-carragenina en una concentración de 0,05% a 1% en peso de la preparación lista para su uso, preferentemente de 0,1 a 0,5%, preferentemente de 0,1 a 0,4% en peso, muy preferentemente de 0,2 a 0,4% en peso de la preparación lista para su uso.

El dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) está presente en concentraciones de 0,05% a 0,2% (p/v), y preferiblemente en una concentración de 0,1% (p/v).

Los agentes de ajuste del pH o sistemas tampón incluyen, entre otros, ácido bórico, borato de sodio, citrato de potasio, ácido cítrico, bicarbonato de sodio y diversos tampones de fosfato inorgánico como Na2HPO4, NaH2PO4, KH2PO4 y sus mezclas, preferentemente una mezcla de Na2HPO4/ácido cítrico.

Las composiciones farmacéuticas oftálmicas según esta realización tienen una viscosidad en el intervalo de 10 a 50 mPa.s, un valor de pH dentro de un intervalo de 6 a 8,0, y una osmolalidad en el intervalo de 280 a 320 mOsm/kg.

Otra realizaciónde la presente invención se refiere a las composiciones farmacéuticas oftálmicas que comprenden la iota-carragenina como ingrediente antivírico activo en una concentración del 0,2% al 0,4% en peso del preparado listo para su uso, el dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en una concentración de 0.1 % (p/v), manitol o sorbitol en una concentración en el intervalo del 3 al 4 % en peso y una mezcla de Na2HPO4/ácido cítrico, con la condición de que la composición en su formulación lista para el uso no contenga más del 0,5 % p/v de una sal de haluro metálico.

Inesperadamente, la presencia de EDTA modula la viscosidad de la composición oftálmica tópica que comprende la iota-carragenina; en particular, el EDTA reduce la viscosidad de la composición que aumenta a medida que aumenta la cantidad de iota-carragenina.

Este efecto del EDTA permite preparar composiciones oftálmicas tópicas que tienen una alta concentración de iotacarragenina y una viscosidad apropiada para asegurar que las composiciones sean cómodas para los pacientes y que no produzcan visión borrosa.

Otro efecto de la presencia del EDTA es que las formulaciones que contienen EDTA tienen mayor actividad antiviral que las formulaciones correspondientes sin EDTA.

Una ventaja de las composiciones oftálmicas mencionadas anteriormente es que el ojo humano infectado tiene una alta tasa de lagrimeo y, en general, las terapias aplicadas tópicamente se eliminan muy rápido, por lo que las formulaciones que tienen una alta concentración de iota-carragenina permiten transmitir una dosis efectiva de iotacarragenina al ojo infectado.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención se proporcionan típicamente en forma estéril para su administración tópica en la parte frontal del ojo, y se ajustan preferentemente para su auto-administración por el individuo que lo necesite. En una realización, la formulación es un colirio sin partículas. Se conocen en la técnica varios recipientes adecuados para dispensar gota a gota líquidos a la superficie ocular a través de una tobera en una manera que puede ser fácilmente controlada por un individuo durante la auto-administración de dichas gotas. Preferentemente, un típico sistema de contenedor tobera está diseñado para mantener la esterilidad de las gotas para los ojos durante el uso repetido.

Otras formulaciones galénicas dentro del ámbito de la invención incluyen hisopos, pomadas o geles oftalmológicamente aceptables que pueden aplicarse al ojo como aerosoles o pulverizadores, o geles que pueden administrarse en el saco conjuntival. Para cada una de estas formulaciones se conocen en la técnica varios productos o sistemas de aplicación que están diseñados para dispensar tales formulaciones al frente del ojo sin arriesgar daños mecánicos a la superficie ocular.

Para aplicaciones especiales, las presentes composiciones farmacéuticas también pueden formularse en dispositivos de liberación controlada que se colocan transitoriamente en el saco conjuntival o se disuelven in situ mientras liberan la preparación de carragenina según la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig.1 es una representación gráfica de los resultados de la prueba del ejemplo 6, en el que se probó el efecto antivírico de la iota-carragenina en la supervivencia de ratones infectados intraocularmente con el virus de la gripe aviar A/H7N7; se infectaron 10 ratones por grupo con la gripe A/turca/Alemania/R11/01 H7N7 y se trataron durante un período de diez días, dos veces al día con la composición farmacéutica descrita en el ejemplo 4 o con un placebo, respectivamente. El tratamiento se inició inmediatamente después de la infección.

En el eje x se indica el tiempo de supervivencia (días) y en el eje y el porcentaje de ratones supervivientes; I = preparación de iota-carragenina (línea continua); P = placebo (línea discontinua).

Ejemplo 1

Procedimiento de determinación de los valores de IC50 para los adenovirus

Las células A549 fueron sembradas en 96 placas con pocillos con una densidad celular de 1,7*104 células por pocillo y cultivadas durante 24 horas en un medio de cultivo de tejido DMEM estándar que contiene 4,5 g/l de glucosa. Se preparó una suspensión de virus que contenía cantidades variables de polímero de carragenina y NaCl y se incubó durante un período mínimo de 20 minutos. Las células se infectaron con la suspensión de virus que contenía la sustancia de prueba (= polímero de carragenina) a una concentración dada y a un título de virus de 1,3 * 103 unidades infecciosas por pocillo. Una hora después de la infección se retiró el inóculo del virus y se añadió una capa semilíquida que contenía un 2,5% p/v de carboximetilcelulosa (CMC), el polímero de carragenina y la concentración de sal de NaCl en la cantidad que se iba a analizar. Las células se incubaron durante 5 días a 37°C. Posteriormente, se retiró el sobrenadante, se lavaron las células 3 veces con PBS y se fijaron para la inmunotinción con una mezcla helada de metanol/acetona (1:1). Las células se siguieron incubando durante 45 minutos con tampón de bloqueo (Biolegend) y se incubaron con un anticuerpo antiadenovirus de ratón en una dilución de 1:1000. Después de la incubación durante 1 hora, las células se lavaron de nuevo 3 veces con un tampón de lavado que contenía un 0,1% de Tween 20 y luego se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con HRP en una dilución de 1:1000. Posteriormente las células fueron lavadas 3 veces con PBS, después de lo cual se añadió el sustrato TMB (Biolegend). Después de un tiempo de reacción de 10 minutos, la reacción se detuvo añadiendo ácido sulfúrico IN.

La absorbancia se midió a 450nm. La absorbencia de las células infectadas no tratadas se fijó en 100% mientras que la absorbencia de las células tratadas no infectadas se fijó en 0%. El cálculo de los valores de IC50 se realizó con el software de ajuste estándar ExcelFit. Paralelamente, se determinó el efecto del procedimiento en las células no infectadas tiñéndolas y fijándolas con una solución de cristal violeta que contenía un 4% de formaldehído. No se detectó ningún efecto negativo significativo del polímero y de las diferentes concentraciones de sal probadas en las células no infectadas.

Tabla 1: Los valores IC50 de iota-carragenina en tres tipos de adenovirus dependen de la concentración de NaCl.

Todos los valores en pg/ml. [MA = manitol]

Como se muestra en la tabla 1, la iota-carragenina no es efectiva contra los adenovirus 8, 19 y 37 cuando el cloruro de sodio está presente en concentraciones fisiológicas. A una concentración del 0,5% de NaCl la eficacia antiviral es detectable. En ausencia de NaCl, el IC50 de iota-carragenina se encuentra entre 29 y 38 pg de iota-carragenina por 1 ml de la solución de recubrimiento experimental.

La eficacia antiviral se mantiene cuando se añade manitol hasta que se alcanza una osmolaridad de 200 mOsmol/l (0% NaCl 200 mOsm/l MA). Para lograr los resultados que se muestran en la Tabla 1 se añadió manitol a una concentración de 36,4mg/ml a una solución que contenía 1,2mg/ml de iota-carragenina, lo que corresponde a una osmolalidad de 193 mOsm/kg.

Ejemplo 2:

Procedimiento de determinación de los valores IC50 del virus de la gripe A H7N7

El ensayo se realizó en células MDCK en una configuración con preincubación profiláctica del virus y muestra de prueba experimental, infección de las células y tratamiento posterior a la infección utilizando un medio de recubrimiento semilíquido con un 2,25% de carboximetilcelulosa (CMC). La matriz del ensayo estaba compuesta por el medio y la matriz de la muestra en una proporción de 2:1, resultante de la dilución inicial 1:3 de las soluciones madre.

El ensayo se configuró en 6 réplicas para cada concentración de muestra de prueba, y para el control de infectados y no infectados. El simulacro de infección (control de toxicidad) se hizo por triplicado. Las concentraciones finales de iota-carragenina fueron 400, 120, 36, 10.8, 3.2, 0.97, 0.3, 0.09 pg/ml (1:3.33 diluciones en serie). Se sembraron 1,7x104 células en 96 pocillos de placas de cultivo de tejido para que alcanzaran aproximadamente el 90% de confluencia 24 a 28 horas después. Se mezclaron volúmenes iguales de dilución de virus de doble concentración y series de dilución de muestras de prueba de doble concentración y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. El virus sin muestra de prueba y el medio sólo se añadió al control infectado y no infectado, respectivamente. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos. Luego se diluyó el inóculo y se dispensó en alícuotas de 1 ml a tubos de fondo redondo de 5 ml, preparando un tubo para cada concentración de muestra de prueba. Se transfirieron 4 ml de medio de CMC por placa de ensayo a un tubo cónico de 50 ml para preparar el medio de recubrimiento para los controles infectados y no infectados.

Las soluciones madre se diluyeron a 800 pg/ml de iota-carragenina con el medio de ensayo complementado con tripsina, obteniéndose una mezcla de medio y matriz de muestra en una proporción de 1:2 con tripsina 1:500. Se realizaron diluciones seriadas posteriores manteniendo fijas las condiciones de la matriz. Se añadió 1 ml de dilución de la muestra de ensayo a 1 ml de medio de CMC y se agitó enérgicamente. El medio de CMC para los controles infectados/no infectados se combinó con un volumen igual de una mezcla de medio de ensayo y matriz 1:2 que contenía tripsina 1:500 y se mezcló vigorosamente. El medio de superposición se mantuvo a 37°C en un baño de agua. Poco antes de su uso, las soluciones se agitaron brevemente y se vertieron en los pocillos de una placa de pocillos profundos. El medio de recubrimiento final: Opti-Pro con L-glutamina 4 mM, ABAM, tripsina 1:1000 y 2,25% de CMC. El mismo procedimiento se realizó en ausencia del virus como control de toxicidad.

Para la inmunotinción, el medio de recubrimiento se diluyó con 100 pl de PBS y se aspiró. Se añadieron 100 pl de PBS a cada pocillo. Las placas fueron sometidas a una corta y vigorosa agitación en un agitador de microplacas a máxima velocidad antes de que la PBS fuera aspirada. El lavado se repetía dos veces o más a menudo si los cristales de CMC todavía estaban en la capa celular. Se añadieron 100pl de fijador frío de metanol/acetona, las placas se incubaron durante 20 a 30 minutos a -20°C, y se dejaron secar después de retirar el fijador.

Después de 1 hora de incubación con 100pl de tampón de bloqueo, las placas se lavaron una vez con PBS y se incubaron con 50pl de dilución de anticuerpos (anti-NP 1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo de detección se añadió después del lavado (dilución 1:1000), y se mantuvo en contacto durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual las placas se vaciaron y se volvieron a lavar tres veces con tampón de lavado y una vez con PBS. Se añadieron 100 pl de sustrato. 6 pocillos sin (=sin) células se llenaron con el sustrato y sirvieron como blanco. Después de 10 a 15 minutos se detuvo la reacción con 100 pl de ácido sulfúrico 1N. Se transfirieron 100 pl a placas de 96 pocillos de fondo plano y la absorbancia se midió a 450nm.

Evaluación: La media de las muestras en blanco se restó de todos los valores medidos y las medias de 6 réplicas calculadas (datos brutos). La media de las muestras no infectadas se restó de todos los valores medidos. Los valores se normalizaron a la media de las muestras infectadas, y los valores resultantes se restaron de 100 para obtener la inhibición como porcentaje de las muestras no infectadas. En un diagrama, se trazaron los datos brutos de inhibición y los datos brutos corregidos en blanco frente a la concentración de la dilución de iota-carragenina. Los valores IC50 se calcularon como se ha descrito anteriormente para los adenovirus.

Tabla 2: Los valores de IC50 de iota-carragenina en el virus de la gripe H7N7 dependen de la concentración de NaCl. Todos los valores en pg/ml [MA=200 mOsm/l manitol]

Ejemplo 3: Preparación de co lirios antivirales para el tratam iento de infecciones oculares.

Iota-carragenina: 2,4mg/ml

Mannitol: 36,4mg/ml

Osmolaridad: 200 mOsm/l (osmolalidad: 192 mOsm/kg)

Viscosidad: 76 mPa.s

Anuncio de agua al 100%

Ejemplo 4: Formulación antiviral de gotas para los ojos para el tratam iento de infecciones oculares.

lota-carragenina: 1.2 mg/ml

Mannitol: 36.4mg ml

Osmolaridad: 200 mOsm/l (osmolaridad: 193 mOsm/kg)

Viscosidad: 8-15 mPa.s

Agua hasta 100%

Ejemplo 5:

Un voluntario varón sufrió queratoconjuntivitis durante aproximadamente 10 días consecutivos. El paciente informó de enrojecimiento de los ojos, aumento del flujo de lágrimas, picor y ardor en ambos ojos, muy probablemente causado por una infección viral. El voluntario fue tratado con la solución de colirio del Ejemplo 3 con un régimen de dosis de 5 gotas por ojo 3 veces al día durante 5 días. Ya después del primer día, el voluntario informó de una reducción de los síntomas como el picor y el enrojecimiento. La afección patológica mejoró continuamente durante la terapia y el día 5 se suspendió la terapia debido a la ausencia total de síntomas clínicamente relevantes. No se produjo ninguna recaída en un período de observación de 14 días.

Ejemplo 6: Efecto antiviral de la iota-carragenina en ratones infectados por vía intracorneal con el virus de la gripe aviar A/H7N7

El tipo de virus de la gripe H7N7 entra predominantemente en el cuerpo a través de la infección de los ojos. El tipo H7N7 ha demostrado ser altamente patógeno para los seres humanos y los ratones. En el peor de los casos, las consecuencias podrían ser letales si el virus se extiende desde el lugar primario de la infección al pulmón. En los ratones C57BL6 la infección intraocular con el virus de la gripe H7N7 A/turca/Alemania/R11/01 resulta en un resultado letal. Este modelo se utilizó para probar la composición farmacéutica descrita en el ejemplo 4.

Ratones C57BL6 de tres semanas de edad (10 por grupo) fueron infectados intraocularmente con una suspensión de 5|jl que contenía 1,5 x105 unidades formadoras de placa (pfU) del virus de la gripe H7N7 A/turca/Alemania/R11/01. El tratamiento se inició inmediatamente después de la infección, ya sea con un preparado placebo que contenía 36,4 mg/ml de manitol o con el preparado descrito en el ejemplo 4. Los ratones fueron tratados durante un período de diez días, dos veces al día con el preparado de iota-carragenina o con un placebo, respectivamente. Después de 14 días, el 80% de los ratones tratados con placebo habían muerto. En cambio, el 50% de los ratones tratados con iotacarragenina habían sobrevivido y se habían recuperado de la infección (véase la figura 1). Una evaluación estadística con una prueba de Log-rank (Prisma 5 versión 5.02) reveló una diferencia significativa entre los dos grupos con un valor p de 0,0492. Por lo tanto, se puede concluir que el tratamiento intraocular de ratones con una preparación de iota-carragenina, como se describe en el ejemplo 4, tiene un efecto significativo en la supervivencia de los ratones infectados intraocularmente con una dosis letal del virus de la gripe H7N7.

Ejemplo 7 (f2)

Preparación de co lirios antivirales para el tratam iento de infecciones oculares

lota-carragenina: 2,4 mg/ml

Manitol: 23,50 mg/ml

Na2HPO4: 3,67 mg/ml

Ácido cítrico: 0,46 mg/ml

Dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA): 1 mg/ml

Agua hasta 100%

Osmolaridad: 195 mOsm/kg

Viscosidad: 7,9 mPa.s

pH = 6,8

Ejemplo 8 (f4)

Iota-carragenina: 2.4 mg/ml

Mannitol: 38,4 mg/ml

Na2HPO4: 3,67 mg/ml

Ácido cítrico: 0,46mg/ml

Agua hasta 100%

Osmolaridad: 291 mOsm/kg

Viscosidad: 12,4 mPa.s

pH = 6,70

Ejemplo 9 (f4S)

Iota-carragenina: 2,4 mg/ml

Sorbitol: 40,0 mg/ml

Na2HPO4: 3,67 mg/ml

Ácido cítrico: 0,46 mg/ml

Dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA): 1 mg/ml de agua al 100%. Osmolaridad: 291 mOsm/kg

Viscosidad: 15,7 mPa.s

pH = 6,79

Ejemplo 10 (f5d)

Iota-carragenina: 3,20 mg/ml

Mannitol: 38,4 mg/ml

Na2HPO4: 3,67 mg/ml

Ácido cítrico: 0,46 mg/ml

Agua hasta 100%

Osmolaridad: 290 mOsm/kg

Viscosidad: 44,8 mPa.s

pH = 6,77

Ejemplo 11 (f5S)

Iota-carragenina: 3,2 mg/ml

Sorbitol: 40,0mg/ml

Na2HPO4: 3,67 mg/ml

Ácido cítrico: 0,46 mg/ml

Dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético , (EDTA): 1 mg/ml

Agua hasta 100%

Osmolaridad: 289 mOsm/kg

Viscosidad: 43,6 mPa.s

Ejemplo 12

Procedimiento general para la preparación de las formulaciones

La iota-carragenina se disolvió en agua bajo agitación constante para obtener soluciones de 2,4 mg/ml. Luego se añadieron todos los demás compuestos y se disolvieron bajo agitación constante. Las soluciones finales se calentaron a unos 80°C y filtrado estéril a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 pm con un prefiltro de fibra de vidrio.

Medición de la viscosidad de las formulaciones

La viscosidad se determinó con un viscosímetro Rheoplus/32 V3.40 21004590-33024. Los análisis se realizaron mediante dos mediciones diferentes por muestra, cada una de las cuales incluyó tres puntos de tiempo de registro (20, 40 y 60 segundos).

Ejemplo 13

Evaluación de la actividad antiviral contra los adenovirus 8 y 19 (AdV8 y AdV19) de las formulaciones de los Ejemplos 7-11.

La actividad antiviral de las formulaciones 7-11 fue probada mediante inhibición de la replicación in vitro de AdV8 y AdV19.

Las células A549 se infectaron con AdV en presencia de las formulaciones (f2), (f4), (f4S), (f5) y (f5S) y se incubaron durante 5 días, con una capa semifluida que contenía la formulación probada. La infección se realizó en presencia del 50% y la incubación en presencia del 17% de la matriz de la formulación respectiva. La inhibición de la replicación del virus se evaluó por la cantidad relativa de proteína AdV detectada mediante la inmunotinción.

El ensayo se realizó en placas de 96 pocillos con 5 réplicas para cada dilución de muestra de prueba y control infectado y no infectado. El virus y las diluciones de muestras se incubaron en el 100% del placebo respectivo y se diluyeron con el medio antes de que la mezcla se añadiera a las células para la infección. El medio de cultivo posterior a la infección consistió en un 17% de placebo respectivo en DMEM con ABAM y un 2% de FBS y se complementó con un 2,5% de CMC (glucosa alta con L-glutamina (DMEM) con un 10% de suero bovino fetal (FBS)). Las concentraciones de iota-carragenina variaron entre 400 y 2,3 pg/ml (dilución 1:1,77).

5 días después de la infección, la inhibición de la replicación del virus fue evaluada por la cantidad relativa de proteína AdV generada detectada por inmunotinción.

Se hizo un control de toxicidad con células no infectadas en paralelo.

Células:

1,7x104 células fueron sembradas en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos 24 horas antes del ensayo.

Dilución de la muestra de prueba:

Se preparó una serie de muestras de prueba con una dilución de 1:1,77 cuatro veces concentrada del respectivo placebo.

Tratamiento profiláctico e infección:

Una alícuota de la reserva de virus fue descongelada en agua fría del grifo y agitada brevemente en un vórtice. Se preparó un virus concentrado cuatro veces en el respectivo placebo.

Se mezclaron volúmenes iguales de una muestra de prueba diluida en serie cuatro veces concentrada o el respectivo placebo (para control positivo = infectado, control negativo = no infectado) y una dilución de virus cuatro veces concentrada y se incubaron a TA durante 30 minutos. El virus y la mezcla de la muestra o el placebo (controles infectados, no infectados) se diluyeron con un volumen igual de DMEM ABAM 2% FBS. Se mezclaron volúmenes iguales de la dilución de la muestra y de la matriz particular para el control de la toxicidad.

Las células fueron lavadas con medio ABAM sin FCS antes de que se añadieran a las células 30pl de virus (1500(AdV8) o 1300 (AdV19) TCID50)/mezcla de muestras, sólo virus (infectado, inf) o matriz sin virus (no infectado, ni), o muestra sin virus (tox). La matriz del ensayo era 50% placebo en DMEM con ABAM y 2% FBS. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C. Luego el inóculo se diluyó con 100pl de medio ABAM 2% FBS y se aspiró. Tratamiento post-infección:

El medio de recubrimiento se preparó combinando volúmenes iguales de muestra de prueba diluida en serie de doble concentración o medio de dilución (control infectado, no infectado). Las células se incubaron con 100jl de medio de recubrimiento a 37°C durante 5 días.

Inmunotinción:

El medio de recubrimiento fue diluido con 100jl de PBS (PBS de Dulbecco sin Ca, Mg) y aspirado. Las placas fueron lavadas dos veces con 100jl de PBS por una agitación corta con 900rpm en un agitador de microplacas. El líquido residual se eliminó golpeando las placas sobre una toalla de papel, antes de que se añadieran 100jl de mezcla fría de metanol y acetona a las células. Las placas se incubaron durante 20 a 30 minutos a -20°C. Luego se aspiró el fijador y se dejaron secar las placas.

Después de 45 minutos de incubación con 100jl de tampón de bloqueo, las placas se lavaron una vez con tampón de lavado y posteriormente se incubaron con 50 jl de dilución de anticuerpos (1:1000 en tampón de lavado) durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego las placas se vaciaron y se lavaron tres veces con tampón de lavado antes de añadir el anticuerpo de detección (dilución 1:1000 en tampón de lavado). Después de 1 hora a TA las placas se vaciaron y se lavaron dos veces con tampón de lavado y dos veces con PBS. Se añadieron 100jl de sustrato. Se llenaron 6 pocillos sin células con el sustrato y sirvieron como blanco. Después de 10 minutos se detuvo la reacción con 100jl de ácido sulfúrico 1N. Se transfirieron 100jl a placas de 96 pocillos de fondo plano y la absorbancia se midió a 450nm.

La absorbencia de las células infectadas no tratadas se fijó en un 100% mientras que la absorbencia de las células tratadas no infectadas se fijó en un 0%. El cálculo de los valores de IC50 se realizó con el software de ajuste estándar ExcelFit.

Sobre la base de las curvas de inhibición se calculó la concentración de iota-carragenina necesaria para alcanzar el 50% de inhibición del virus (IC50) para las formulaciones probadas, los resultados se resumen en la Tabla 3.

Ejemplo 14: Influencia del EDTA en la actividad antiviral contra el ADV8

La actividad antiviral de una formulación que contiene EDTA (f2/EDTA) contra una formulación correspondiente sin EDTA (f2 sin EDTA) se comparó con un ensayo in vitro que investigaba la inhibición del AdV8.

Formulaciones probadas:

(f2/EDTA):

Iota-carragenina: 2,4 mg/ml

Manitol: 23,50 mg/ml

Na2HPO4: 3,67 mg/ml

Ácido cítrico: 0,46 mg/ml

Agua hasta 100%

(f2 sin EDTA):

Iota-carragenina: 2,4 mg/ml

Manitol: 23,50 mg/ml

Na2HPO4: 3,67 mg/ml

Ácido cítrico: 0,46 mg/ml

Agua hasta 100%

El ensayo se realizó según el procedimiento descrito en el ejemplo 14 con un protocolo ligeramente adaptado.

En esta configuración de ensayo el virus se incubó durante 10 min en presencia de formulaciones diluidas en el correspondiente placebo con una concentración final de 33% de matriz de formualción en el medio. En consecuencia, las células A549 se infectaron con adenovirus (AdV8) en presencia del 17% de la matriz de formulación en el medio y se incubaron durante 5 días con una capa semilíquida que contenía la formulación probada (de nuevo el 17% de la matriz de formulación en el medio). La inhibición de la replicación del virus se evaluó por la cantidad relativa de proteína AdV generada detectada por inmunotinción.

Sobre la base de las curvas de inhibición se calculó la concentración de iota-carragenina necesaria para alcanzar el 50% de inhibición del virus (IC50) para las formulaciones probadas, los resultados se resumen en la Tabla 4. Los resultados muestran que la adición de EDTA en la formulación del colirio resultó en una mayor actividad antiviral que la formulación correspondiente sin EDTA.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica oftálmica para administración tópica que comprende iota-carragenina a una concentración de 0.05% a 1% en peso de la preparación lista para su uso, agua, un agente de ajuste de la osmolalidad seleccionado de manitol o sorbitol, al menos un aditivo compatible oftalmológicamente que sea un agente de ajuste del pH o un sistema tampón, que comprende además

dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) con la condición de que la composición en su formulación lista para su uso no contenga más del 0,5% p/v de una sal de haluro metálico.

2. La composición según la reivindicación 1 en la que la iota-carragenina está presente en una concentración en el intervalo de 0,2 a 0,4 % en peso.

3. La composición según las reivindicaciones 1 o 2, en la que la composición no contiene más del 0,1% p/v de dicha sal de haluro metálico o está esencialmente libre de una sal de haluro metálico.

4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la sal de haluro metálico se selecciona del grupo que consiste en cloruro de sodio y cloruro de potasio.

5. La composición según las reivindicaciones 1 a 4 en la que el dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetracético (EDTA) está presente en concentraciones de 0,05% a 0,2% (p/v).

6. La composición según la reivindicación 5 en la que el dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) está presente en una concentración del 0,1% (p/v).

7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la que el sistema tampón es una mezcla de Na2HPO4/ácido cítrico.

8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que tiene una viscosidad en el intervalo de 10 a 50 mPa.s, un valor de pH en el intervalo de 6,0 a 8,0, y una osmolalidad en el intervalo de 280 a 320 mOsm/kg.

9. La composición según la reivindicación 2 y 5 a 8, en la que la iota-carragenina tiene una concentración del 0,2% al 0,4% en peso, el dihidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) tiene una concentración del 0,1% (p/v), el manitol o el sorbitol tienen una concentración en el intervalo del 3% al 4% en peso y el sistema tampón es una mezcla de Na2HPO4/ácido cítrico.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición comprende además un aditivo oftalmológicamente compatible seleccionado del grupo que consiste en un tensioactivo, un conservante antimicrobiano y un antioxidante.

11. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en forma de colirio con la siguiente composición:

Iota-carragenina: 3,2 mg/ml

Sorbitol: 40,0mg/ml

Na2HPO4: 3,67 mg/ml

Ácido cítrico: 0,46 mg/ml

Agua hasta 100%.

12. Una formulación oftálmica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso como medicamento.

13. Una formulación oftálmica, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en el tratamiento de infecciones oculares virales causadas por el adenovirus del subtipo D o el virus de la gripe A del subtipo H7.