ES2785045T3 - Vectores HVT recombinantes que expresan antígenos de patógenos aviares y usos de los mismos - Google Patents

Vectores HVT recombinantes que expresan antígenos de patógenos aviares y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Composición o vacuna que comprende un primer vector de virus del herpes de pavo (HVT) recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno del virus de la enfermedad de Newcastle F (NDV-F) unido operativamente a un promotor de SV40 y una señal de poliA de SV40, además en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido NDV-F, el promotor de SV40 unido operativamente y la señal de poliA de SV40 se insertan en el locus del sitio intergénico 1 (IG1) del genoma de HVT, además en el que el polinucleótido que codifica y expresa NDV-F tiene la secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 1; y un segundo vector de HVT recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno del virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (IBDV) VP2, en el que el segundo vector de HVT recombinante es vHVT13.

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores HVT recombinantes que expresan antígenos de patógenos aviares y usos de los mismos
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos 61/564.877 presentada el 30 de noviembre de 2011 y la solicitud provisional de Estados Unidos 61/694.957 presentada el 30 de agosto de 2012.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0002] La invención se refiere a vectores virales recombinantes para la inserción y expresión de genes extraños para su uso como vehículos de inmunización seguros para la protección contra una diversidad de patógenos. También se refiere a una composición o vacuna multivalente que comprende uno o más vectores virales recombinantes para la protección contra una diversidad de patógenos. En el presente documento también se describen procedimientos para producir y utilizar vectores virales recombinantes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] La vacunación de aves de corral se usa ampliamente para proteger las manadas de aves de corral contra enfermedades devastadoras incluyendo la enfermedad de Newcastle (ND), la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBD), la enfermedad de Marek (MD), la bronquitis infecciosa (IB), la laringotraqueítis infecciosa (ILT) y la gripe aviar (AI). La ND es causada por el paramixovirus 1 aviar (APMV-1), también denominado virus ND (NDV) que pertenece a la familia Paramyxoviridae. La MD es causada por el herpesvirus gallináceo 2 (familia Herpesviridae), también denominado como virus de MD de serotipo 1 (MDV1). La IB es causada por el virus IB (IBV) que pertenece a la familia Coronaviridae, la ILT es causada por el herpesvirus gallináceo 1 (familia Herpesviridae), también denominado virus ILT (ILTV) y la IA es causada por el virus AI (AIV) que pertenece a la familia Orthomyxoviridae.
[0004] Se han propuesto varios vectores virales recombinantes aviares con el fin de vacunar a las aves contra estos patógenos aviares. Los vectores virales utilizados comprenden virus avipox, especialmente la viruela aviar (documento EP-A-0.517.292), virus de Marek, tal como los serotipos 2 y 3 (HVT) (documento WO-A-87/04463), o como alternativa, ITLV, NDV y adenovirus aviares. Cuando algunos de estos vectores virales recombinantes aviares se utilizaron para la vacunación, mostraron niveles variables de protección.
[0005] Se han desarrollado y autorizado varios vectores de herpesvirus recombinantes de pavos (HVT, también denominados Meleagrid herpesvirus 1 o MDV serotipo 3) que expresan antígenos de diversos patógenos (patentes de Estados Unidos N.° 5.980.906, 5.853.733, 6.183.753, 5.187.087) incluyendo IBDV, NDV, ILTV y AIV. De particular interés es un gen protector de VP2 de IBDV que expresa el vector HVT que ha mostrado claras ventajas sobre las vacunas contra la IBD clásicas (Bublot et al J.Comp. Path.2007, Vol.137, S81-S84; US 5.980.906). Otros vectores de HVT de interés son aquellos que expresan el gen o los genes protectores contra NDV (Morgan et al 1992, Avian dis. 36, 858-70; US 6.866.852; US 5.650.153) o ILTV (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259; US 6.299882; Us 5.853.733), o Heckert et al. Avian disease, 1996, 40(4): 770-777, que describe vectores para la expresión de NDV-F por vectores HVT que comprenden un NDV-F de tipo salvaje bajo el control de un promotor CMV IE humano. Uno de los problemas prácticos de usar varias vacunas recombinantes basadas en HVT juntas es su interferencia. La protección más baja se induce al menos contra una de las enfermedades cuando se mezclan dos recombinantes HVT que expresan diferentes antígenos (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines; artículo presentado en la XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress en Cancún, México, 14-18 de agosto de 2011; Slacum G, Hein R. y Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, EE.UU., 23-25 de marzo, pág. 84).
[0006] La combinación de HVT y SB-1, una cepa de vacuna contra el herpesvirus gallináceo 3 (MDV serotipo 2 o MDV-2), ha mostrado un efecto sinérgico en la protección contra la MD (Witter y Lee, 1984, Avian Pathology 13, 75-92). Para abordar el problema de la interferencia, es de interés evaluar el virus HVT como un vector de vacuna para expresar no o más antígenos protectores contra una variedad de patógenos aviares.
[0007] El genoma de SB-1 se clonó y se caracterizó en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) (Petherbridge, et al., J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009; Singh et al., Research in Veterinary Science 89, 140-145, 2010). La secuencia de SB-1 de MDV2 se obtuvo y analizó recientemente (Spatz y Schat, Virus Gene 42, 331-338, 2011). Se describió una deleción de la glucoproteína E del virus SB-1 por Petherbridge et al. (J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009). Sin embargo, no se ha indicado ninguna investigación que use SB-1 como un vector viral que exprese genes protectores extraños.
[0008] Teniendo en cuenta el efecto potencial de los patógenos animales, tales como NDV e IBDV en la salud pública veterinaria y la economía, se necesitan procedimientos eficientes para prevenir la infección y proteger a los animales. Existe la necesidad de una solución de vacunas vectoriales eficaces combinadas y un procedimiento adecuado para fabricar la vacuna que pueda aliviar el problema de la interferencia observada entre 2 vacunas vectoriales basadas en HVT.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0009] En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición o vacuna que comprende:
un primer vector de virus del herpes de pavo (HVT) recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno del virus de la enfermedad de Newcastle F (NDV-F) unido operativamente a un promotor de SV40 y una señal de poliA de SV40, además en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido NDV-F, el promotor de SV40 unido operativamente y la señal de poliA de SV40 se insertan en el locus del sitio intergénico 1 (IG1) del genoma de HVT, además en el que el polinucleótido que codifica y expresa NDV-F tiene la secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 1; y
un segundo vector de HVT recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno del virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (IBDV) VP2, en el que el segundo vector de HVT recombinante es vHVT 13.
[0010] En un segundo aspecto, la presente invención proporciona la composición o vacuna de la presente invención para uso en un procedimiento de vacunación de un animal, comprendiendo dicho procedimiento al menos una administración de la composición o vacuna.
[0011] En un tercer aspecto, la presente invención proporciona la composición o vacuna de la presente invención para usar en un procedimiento para inducir una respuesta protectora en un animal contra el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (es decir, IBDV o Virus de la enfermedad de Gumboro) y el virus de la enfermedad de Marek (MDV), comprendiendo dicho procedimiento al menos una administración de la composición o vacuna.
[0012] Se describen en el presente documento resultados sorprendentes cuando composiciones o vacunas polivalentes que comprenden un vector simple o doble de HVT eran eficaces para proteger animales contra una variedad de patógenos aviares sin interferencias. También se observaron resultados sorprendentes cuando varias combinaciones de promotores, genes optimizados con codones, colas de poliA y sitios de inserción conferían diferentes niveles de eficacia y estabilidad a la expresión de uno o más genes heterólogos in vivo.
[0013] Se describe en el presente documento es un vector de HVT recombinante que comprende uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar.
[0014] En el presente documento se describe una composición o vacuna que comprende uno o más vectores de HVT recombinantes que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar.
[0015] En el presente documento se describe una composición o vacuna polivalente que comprende uno o más vectores de HVT recombinantes que comprenden polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar y uno o más vectores SB1 recombinantes que comprenden polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno de un patógeno aviar.
[0016] Se describe en el presente documento un procedimiento de vacunación de un animal, o la inducción de una respuesta inmunogénica o protectora en un animal, que comprende al menos una administración de la composición o vector de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0017] La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, y que no pretende limitar la invención a realizaciones específicas descritas, puede entenderse conjuntamente con las figuras que se acompañan, incorporadas en el presente documento por referencia, en las que:
La Figura 1 es una tabla que muestra la SEQ ID NO asignada a cada secuencia de ADN y proteína.
La Figura 2 representa la estructura del genoma de HVT y sus sitios de inserción.
La Figura 3 representa el mapa del plásmido de pHM103.
La Figura 4 representa los resultados del análisis por PCR de vHVT 114.
La Figura 5 muestra los resultados del ensayo de doble inmunofluorescencia.
La Figura 6 representa los resultados de transferencia Southern de vHVT114.
La Figura 7 representa los resultados de los análisis por inmunoprecipitación y transferencia Western de vHVT114. La Figura 8 representa el análisis por transferencia Western de la muestra inmunoprecipitada células infectadas con vHVT306.
La Figura 9 representa el análisis por transferencia Western de la muestra inmunoprecipitada de células infectadas con vSB 1-009.
La Figura 10 representa el resultado del estudio de desafío de vHVT304 y vHVT114 contra NDV ZJ1 y CA02.
La Figura 11 representa el resultado de diseminación viral después del desafío con NDV CA02 y ZJ1.
La Figura 12 representa el resultado de diseminación viral después del desafío con NDV Chimalhuacan.
La Figura 13 muestra la alineación de secuencia y el porcentaje de identidad.
La Figura 14 muestra las secuencias de ADN y proteínas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0018] Se observa que en esta descripción, y particularmente en las reivindicaciones, términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares, pueden tener el significado que se le atribuye en la Ley de Patentes de EE.UU.; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "incluyendo" y similares; y que términos tales como "que consisten esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de EE.UU., por ejemplo, permiten elementos no mencionados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.
[0019] A menos que se indique otra cosa, los términos técnicos se usan según el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0020] Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La palabra "o" significa cualquier miembro de una lista en particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista.
[0021] El término "animal" se usa en el presente documento para incluir a todos los mamíferos, aves y peces. El animal, como se usa en el presente documento, puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballo), canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos, incluyendo guepardos y linces), bovinos (por ejemplo, ganado), porcinos (por ejemplo, cerdos), ovinos (por ejemplo, ovejas, cabras, llamas, bisontes), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emú y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, simio), seres humanos y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluidas las etapas embrionarias y fetales.
[0022] Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos consecutivos.
[0023] El término "ácido nucleico", "nucleótido" y "polinucleótido" se usan de manera intercambiable y se refiere a ARN, ADN, ADNc o ARNc, y derivados de los mismos, tales como que contienen esqueletos modificados. Debe apreciarse que la invención proporciona polinucleótidos que comprenden secuencias complementarias a las descritas en el presente documento. El "polinucleótido" descrito en el presente documento incluye tanto la cadena directa (5' a 3') como la cadena complementaria inversa (3' a 5'). Los polinucleótidos según la invención pueden prepararse de diferentes maneras (por ejemplo, por síntesis química, por clonación génica, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, lineal o ramificada, monocatenaria o bicatenaria, o un híbrido de las mismas, cebadores, sondas, etc.).
[0024] El término "ADN genómico", o "genoma" se usan indistintamente y se refieren a la información genética hereditaria de un organismo huésped. El ADN genómico comprende el ADN del núcleo (también denominado ADN cromosómico) pero también el ADN de los plástidos (por ejemplo, cloroplastos) y otros orgánulos celulares (por ejemplo, mitocondrias). El ADN genómico o genoma contemplado en la presente invención también se refiere al ARN de un virus. El ARN puede ser una cadena positiva o un ARN de cadena negativa. El término "ADN genómico" contemplado en la presente invención incluye las secuencias que contienen ADN genómico complementarias a las descritas en el presente documento. El término "ADN genómico" también se refiere a ARN mensajero (ARNm), ADN complementario (ADNc) y ARN complementario (ARNc).
[0025] El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes o polinucleótidos incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o solo las secuencias de codificación como en los ADNc, tal como un marco de lectura abierto (ORF), partiendo del codón de inicio (codón de metionina) y terminando con una señal de terminación (codón de parada). Los genes y los polinucleótidos también pueden incluir regiones que regulan su expresión, tal como el inicio de la transcripción, la traducción y la terminación de la transcripción. Por lo tanto, también se incluyen los promotores y las regiones de unión al ribosoma (en general, estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos aguas arriba del codón de inicio de la secuencia de codificación o gen; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), terminadores de la transcripción (en general, el terminador se encuentra en aproximadamente 50 nucleótidos aguas abajo del codón de parada de la secuencia de codificación o gen; Ward C K et al.). Gen o polinucleótido también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.
[0026] El término "ADN heterólogo", como se usa en el presente documento, se refiere al ADN derivado de un organismo diferente, tal como un tipo de célula diferente o una especie diferente del receptor. El término también se refiere a un ADN o fragmento del mismo en el mismo genoma del ADN huésped en el que el ADN heterólogo se inserta en una región del genoma que es diferente de su ubicación original.
[0027] Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" o "inmunógeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunógenas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la presentación en un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Como alternativa, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.
[0028] El término "proteína o péptido inmunógeno", como se usa en el presente documento, incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que, una vez administrado al huésped, es capaz de provocar una respuesta inmunitaria de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína descrita en el presente documento comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína "inmunógena" o polipéptido, como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunógenos de la misma. Por "fragmento inmunógeno" se refiere a un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y, por lo tanto, provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Dichos fragmentos pueden identificarse utilizando cualquier número de técnicas de cartografía de epítopos, bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos todavía están unidos a los soportes. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de los aminoácidos, tal como, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional.
[0029] El término "proteína o péptido inmunogénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica como se define en el presente documento. El término "variación conservadora" representa el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o el reemplazo de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal forma que el residuo de aminoácido codificado no cambie o sea otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina para la asparagina, y similares; o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente que no tendrá un efecto importante en la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservadora" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido principal no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también reaccionen de forma inmunitaria con el polipéptido no sustituido.
[0030] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al que responden los linfocitos B y/o linfocitos T específicos. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.
[0031] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Normalmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero sin limitación, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfomas B, linfomas T auxiliares y/o linfomas T citotóxicos, dirigida específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de tal manera que la resistencia a una nueva infección aumentará y/o la gravedad clínica de la enfermedad se reducirá. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o falta de síntomas que se muestra normalmente por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral reducido en el huésped infectado.
[0032] Los términos "recombinante" y "modificado genéticamente" se usan de manera intercambiable y se refieren a cualquier modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o proteína en su forma o estructura nativa, o cualquier modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o proteína en su entorno nativo o alrededores. La modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o proteína puede incluir, pero sin limitación, la deleción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, la deleción de un gen completo, la optimización por codones de un gen, la sustitución conservadora de aminoácidos, la inserción de uno o más polinucleótidos heterólogos.
[0033] El término "construcción doble de HVT" o "vector doble de HVT" se refiere a un vector viral de HVT que comprende dos polinucleótidos heterólogos.
[0034] Los términos "vacuna o composición polivalente", "combinación o combinación de vacuna o composición" y "vacuna o composición multivalente" se usan indistintamente para referirse a una composición o vacuna que contiene más de una composición o vacunas. La vacuna o composición polivalente puede contener dos, tres, cuatro o más composiciones o vacunas. La vacuna o composición polivalente puede comprender vectores virales recombinantes, virus de tipo silvestre activos o atenuados o muertas, o una mezcla de vectores virales recombinantes y virus de tipo silvestre en formas activas o atenuadas o muertas.
[0035] Una realización descrita en este documento proporciona un vector viral de HVT recombinante que comprende uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno o polipéptido de un patógeno aviar. Las cepas de HVT utilizadas para el vector viral recombinante pueden ser cualquier cepa de HVT, incluyendo, pero no limitado a, la cepa FC126 de HVT (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989).
[0036] Otra realización descrita en este documento proporciona un vector viral de SB-1 recombinante que comprende uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan al menos un antígeno o polipéptido de un patógeno aviar. Las cepas de SB-1 pueden ser cualquier cepa de SB-1, incluyendo, pero no limitado a, la vacuna comercial de la enfermedad de Marek (vacuna de SB-1) (Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, EE.UU.), la cepa de SB-1 que tiene la secuencia del genoma tal como se define por el número de acceso GenBank HQ840738.1.
[0037] Los genes que codifican el antígeno o polipéptido descrito en el presente documento pueden ser los que codifican la proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F), la neuraminidasa de hemaglutinina del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-HN), la glucoproteína C del virus de la enfermedad de Marek (gC), la glucoproteína B del virus de la enfermedad de Marek (gB), la glucoproteína E del virus de la enfermedad de Marek (gE), la glucoproteína I del virus de la enfermedad de Marek (gI), la glucoproteína H del virus de la enfermedad de Marek (gH) o la glucoproteína del virus de la enfermedad de Marek (gL), VP2 del virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (IBDV), VPX de IBDV, VP3 de IBDV, VP4 de IBDV, la glucoproteína B de ILTV, la glucoproteína I de ILTV, ILTV UL32, la glucoproteína D de ILTV, la glucoproteína E de ILTV, la glucoproteína C de ILTV, hemaglutinina de influenza (HA), neuraminidasa de influenza (NA), genes protectores derivados de Mycoplasma gallisepticum (MG), o Mycoplasma synoviae (MS), o combinaciones de los mismos. El antígeno o polipéptido puede ser cualquier antígeno del patógeno de las aves de corral seleccionado del grupo que consiste en virus de la encefalomielitis aviar, reovirus aviar, paramixovirus aviar, metaneumovirus aviar, virus de la influenza aviar, adenovirus aviar, virus de la viruela aviar, coronavirus aviar, rotavirus aviar, virus de la anemia del pollo, astrovirus aviar, parvovirus aviar, coccidiosis (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Pasteurella sp., Avibacterium sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium sp., y E. coli.
[0038] Además, los homólogos de antígeno o polinucleótidos mencionados anteriormente se describen en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas funciones o funciones similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Los análogos, ortólogos y parálogos de un polipéptido de tipo silvestre pueden diferir del polipéptido de tipo silvestre por modificaciones postraduccionales, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambas. En particular, los homólogos descritos en el presente documento generalmente presentarán al menos un 80-85 %, 85-90 %, 90-95 %, o un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia, con toda o parte de las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos de antígenos descritos anteriormente, y presentarán una función similar.
[0039] En una realización descrita en el presente documento, se proporciona un vector viral HVT o SB-1 recombinante que comprende uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan el antígeno o polipéptido NDV-F. En un aspecto de la realización, el antígeno o polipéptido NDV-F tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 33, 35 o 37, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. En otro aspecto de la realización, el polinucleótido heterólogo que codifica un antígeno o polipéptido NDV-F tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 33, 35 o 37. En aún otro aspecto de la realización, el polinucleótido heterólogo tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 32, 34, o 36.
[0040] Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o diversidad de virus). Dichas variaciones alélicas naturales pueden dar como resultado típicamente una variación del 1 al 5 % en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas se pueden identificar mediante la secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en varias especies diferentes, que se pueden realizar fácilmente mediante el uso de sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético del gen en estas especies. Todas y cada una de dichas variaciones de ácidos nucleicos y los polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes de la variación alélica natural y que no alteren la actividad funcional del gen de interés, se describen en el presente documento.
[0041] El término "identidad" con respecto a las secuencias puede referirse, por ejemplo, al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en la que el alineamiento de las dos secuencias se puede determinar según el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman). La identidad de secuencia o la similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se pueden determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Cuando se dice que las secuencias de Ar N son similares, o tienen un grado de identidad de secuencia u homología con las secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN pueden derivarse de secuencias de ADN, considerándose la timidina (T) en la secuencia de ADN igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN.
[0042] Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que se degeneran como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizado para un huésped específico. Como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que está diseñado genéticamente para aumentar su expresión en una especie dada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican polipéptidos NDV-F, la secuencia de ADN del gen de la proteína NDV-F se puede modificar para 1) comprender los codones preferidos por los genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A+T o G+C en la composición de bases de nucleótidos con respecto al que se encuentra sustancialmente en dicha especie; 3) formar una secuencia de inicio de dicha especie; o 4) eliminar las secuencias que causan desestabilización, poliadenilación inadecuada, degradación y terminación del ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de corte y empalme de ARN. El aumento de la expresión de la proteína NDV F en dichas especies puede lograrse utilizando la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso de codones preferido" se refiere a la preferencia mostrada por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales se especifican por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas se incluyen en la descripción, siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido NDV-F codificada por la secuencia de nucleótidos no se modifique funcionalmente.
[0043] La expresión satisfactoria de los polinucleótidos heterólogos por el virus infeccioso recombinante/modificado requiere dos condiciones. En primer lugar, los polinucleótidos heterólogos se deben insertar o introducir en una región del genoma del virus con el fin de que el virus modificado permanezca viable. La segunda condición para la expresión de polinucleótidos heterólogos insertados es la presencia de secuencias reguladoras que permiten la expresión del gen en la base viral (por ejemplo: promotor, potenciador, sitios de corte y empalme donantes y aceptores e intrón, secuencia consenso de iniciación de traducción de Kozak, señales de poliadenilación, elementos de secuencia no traducidos).
[0044] El sitio de inserción puede ser cualquier región no esencial del genoma de1HVT, incluyendo, pero no limitado a, la región entre el ATG del ORF UL55 y la unión de UL con la región de repetición adyacente (US 5,980,906), el locus IG1, el locus IG2, el locus IG3, el locus UL43, el locus US10, el locus SORF3/US2 (ver Fig. 2).
[0045] En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en células eucariotas. Los promotores incluyen, pero no se limitan a, un promotor de citomegalovirus temprano inmediato (CMV), promotor de CMV de cobaya, un promotor de SV40, promotores de virus de pseudorrabia, tales como el del promotor de glicoproteína X, virus de Herpes Simplex 1, tal como el promotor alfa 4, promotores del virus de la enfermedad de Marek (incluyendo MDV-1, MDV-2 y HVT), tales como aquellos que impulsan la expresión de glicoproteínas gC, gB, gE o gI,promotores del virus de laringotraqueitis infecciosa, tales como los de los genes de glicoproteínas gB, gE, gI, gD, u otros promotores del virus del herpes.
[0046] Una realización de la invención proporciona un vector de HVT recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica y expresa el antígeno o polipéptido de NDV-F. En un aspecto de la realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido NDV-F está unido operativamente al promotor de SV40 que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 9 y por lo tanto la expresión del antígeno o polipéptido de NDV-F está regulada por el promotor de SV40. En otro aspecto de la realización, la expresión del antígeno o polipéptido de NDV-F está regulada por la señal de poliA de SV40 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 11. En un aspecto descrito en el presente documento, el polinucleótido que codifica el polipéptido de NDV-F está unido operativamente al promotor gB de MDV que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 38 y por lo tanto la expresión del antígeno o polipéptido de NDV-F está regulada por el promotor gB de MDV.
[0047] Otra realización descrita en este documento proporciona un vector doble de HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa el antígeno o polipéptido de NDV-F y un segundo polinucleótido que codifica y expresa el antígeno o polipéptido VP2 de IBDV. En un aspecto de la realización, el antígeno o polipéptido de NDV-F tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 33, 35, o 37. En otro aspecto de la realización, el antígeno o polipéptido VP2 de IBDV tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 8 o 42. En otro aspecto, el polinucleótido que codifica el polipéptido de NVD-F está unido operativamente al promotor de SV40 que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 9 y la expresión de antígeno o polipéptido de NDV-F está regulada por el promotor de SV40. En aún otro aspecto, la expresión del antígeno o polipéptido de NDV-F está regulada por la señal de poliA de SV40 que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 11, o la señal de poliA sintético que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 12. En otro aspecto, la expresión de antígeno o polipéptido VP2 de IBDV está regulada por el promotor CMV-IE que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 10 y la señal de poliA de SV40 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 11.
[0048] Aún otra realización descrita en el presente documento proporciona un vector soble de HVT recombinante que comprende dos polinucleótidos que codifican y expresan los antígenos o polipéptidos VP2 de IBDV. En un aspecto de la realización, el antígeno o polipéptido VP2 de IBdV tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 8 o 42. En un aspecto, el polinucleótido que codifica un primer antígeno o polipéptido VP2 de IBDV está unido operativamente al promotor CMV-IE que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 10 y el polinucleótido que codifica un segundo antígeno o polipéptido VP2 de IBDV está unido operativamente al promotor de CMV de cobaya que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 43. En otro aspecto, la expresión de un primer antígeno o polipéptido VP2 de IBDV está regulada por el promotor CMV-IE que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 10 y la señal de poliA de SV40 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 11, y la expresión de un segundo antígeno o polipéptido VP2 de IBDV está regulada por el promotor CMV de cobaya que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 43 y la señal de poliA sintética que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 12. En aún otro aspecto de la realización, los polinucleótidos que codifican el antígeno o polipéptido VP2 de IBDV pueden ser insertados en una o más regiones del locus seleccionadas del grupo que consiste de IG1, IG2, US10, SORF3-US2 y gD del genoma de HVT. En una realización, en el presente documento se describe una composición farmacéutica o de vacuna que comprende uno o más vectores virales de HVT o SB-1 recombinantes de la presente invención y un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.
[0049] En otra realización, la presente invención proporciona una composición o vacuna que comprende un vector viral de HVT que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de NDV-F, un promotor de SV40, y opcionalmente un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización descrita en el presente documento, se proporciona una composición farmacéutica o de vacuna que comprende un primer vector de HVT que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de NDV-F, un segundo vector de HVT que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno VP2 de IBDV y opcionalmente un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente. En otra realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica o de vacuna que comprende un vector de HVT que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de NDV-F, un vector de SB-1 que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de NDV-F, opcionalmente, un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. Una composición farmacéutica o de vacuna descrita en el presente documento puede comprender un primer vector de HVT que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de NDV-F, un segundo vector de HVT que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno VP2 de IBDV, un vector de SB-1 que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de NDV-F, opcionalmente un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.
[0050] En aún otra realización descrita en el presente documento, se proporciona una composición o vacuna que comprende un vector viral doble de HVT que comprende: i) un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno o polipéptido de NDV-F; ii) un segundo polinucleótido que codifica y expresa un antígeno o polipéptido VP2 de IBDV; y iii) opcionalmente un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización descrita en el presente documento, se proporciona una composición o vacuna que comprende un vector viral doble de HVT que comprende dos polinucleótidos que codifican y expresan los antígenos o polipéptidos de VP2 de IBDV, y opcionalmente un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable. En aún otra realización, la composición que comprende el vector viral doble de HVT comprende además un vector de HVT que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno VP2 de IBDV, o un vector SB-1 que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de NDV-F, o una combinación de los mismos. Los portadores o adyuvantes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables se conocen bien por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un portador o adyuvante o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser el diluyente de la vacuna contra la enfermedad de Marek utilizado para las vacunas contra MD. Otro portador o adyuvante o vehículo o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden usar para los procedimientos de esta invención incluyen, pero sin limitación, una solución al 0,9 % de NaCI (por ejemplo, una solución salina) o un tampón fosfato, poli(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro), o que faciliten la transfección o infección y/o mejoren la conservación del vector (o proteína). Las dosis y los volúmenes de dosis se analizan en el presente documento en la descripción general y también pueden determinarse por el experto en la técnica a partir de esta descripción, junto con el conocimiento de la técnica, sin una experimentación excesiva.
[0051] Opcionalmente, pueden añadirse otros compuestos como portadores o adyuvantes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables, incluyendo, pero sin limitación, alumbre; oligonucleótidos CpG (ODN), en particular ODN 2006, 2007, 2059, o 2135 (Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89­ 103); poliA-poliU, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", editado por Michael F. Powell y Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p.03, pág. 157); N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propanodiamina (tal como AVRIDINE®) (Ibid, pág. 148); carbómero, quitosano (véase, la Patente de Estados Unidos N.° de Serie 5.980.912, por ejemplo).
[0052] Las composiciones farmacéuticas y vacunas según la invención pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para su uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la pág. 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la pág. 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA, (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) otros adyuvantes analizados en cualquier documento citado en la presente solicitud, o (9) cualquier combinación o mezcla de los mismos.
[0053] Otro aspecto descrito en el presente documento es un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal contra uno o más antígenos o una respuesta protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares, cuyo procedimiento que comprende inocular al animal al menos una vez con la vacuna o la composición farmacéutica de la presente invención. Aún otro aspecto descrito en el presente documento es un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal a uno o más antígenos o una respuesta protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares en un régimen de administración de sensibilización y refuerzo, que comprende al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo usando al menos una administración de refuerzo que utiliza al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición inmunológica o la vacuna utilizada en la administración primaria pueden ser iguales, pueden ser de naturaleza diferente de las utilizadas como refuerzo.
[0054] Los patógenos aviares pueden ser el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), el virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa (es decir, IBDV o el virus de la enfermedad de Gumboro), el virus de la enfermedad de Marek (MDV), el virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), el virus de la encefalomielitis aviar, reovirus aviar, paramixovirus aviar, metaneumovirus aviar, virus de la influenza aviar, adenovirus aviar, virus de la viruela aviar, coronavirus aviar, rotavirus aviar, parvovirus aviar, astrovirus aviar y virus de la anemia del pollo, coccidiosis (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella sp., Avibacterium sp., E. coli o Clostridium sp.
[0055] Usualmente, una administración de la vacuna se realiza a un día de edad por vía subcutánea o intramuscular o in ovo en embriones de 17-19 días. Se puede hacer una segunda administración en los primeros 10 días de edad. Los animales tienen preferiblemente al menos 17 días de embrión o un día de edad en el momento de la primera administración.
[0056] Se puede usar una diversidad de vías de administración en pollos de un día, tales como por vía subcutánea o intramuscular, intradérmica, transdérmica. La vacunación in ovo se puede realizar en el saco amniótico y/o en el embrión. Se pueden utilizar dispositivos de administración in ovo y SC comercialmente disponibles para la vacunación.
[0057] La invención y aspectos descritos en el preente docmento se describirán ahora más detalladamente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
[0058] La construcción de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales recombinantes se realizó utilizando las técnicas estándar de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).
Ejemplo 1 Construcción de vHVT114 recombinante que expresa NDV-F
Preparación de plásmido pHM103 Fopt donante
[0059] El plásmido pHM103 (Merial Limited) que contiene los brazos intergénicos I de HVT FC126 (ver la figura 2), el promotor de SV40 y poli A de SV40 se digirió con NotI, se desfosforiló y el fragmento de 5,6 kb se extrajo en gel. Un fragmento de 1,7 kb flanqueado por NotI de un gen de NDV-F de genotipo optimizado por codones sintetizado químicamente VIId (SEQ ID NO: 1, que codifica la SEQ ID NO: 2) también fue digerido con NotI y el fragmento de 1,7 kb se extrajo en gel. Los fragmentos de 5,6 y 1,7 kb se ligaron para crear pHM103 Fopt (Fig. 3).
Generación de vector viral de HVT recombinante
[0060] Se realizó una recombinación in vitro (IVR) mediante coelectroporación de células de fibroblastos de embriones de pollo secundarias (2a células CEF) usando pHM103 Fopt como el plásmido donante y el ADN viral se aisló de la cepa FC126 de HVT. La coelectroporación se realizó usando 1x107 de 2a CEF en 300 ul Opti-MEM y se aplicaron 150 voltios con capacitancia 950 en una cubeta de electroporación de 2 mm. Las células transfectadas se sembraron en placa de 96 pocillos y se incubaron durante 5 días. Las células cultivadas en la placa de 96 pocillos fueron entonces duplicadas en dos placas de 96 pocillos. Se utilizó un conjunto de placas de 96 pocillos para IFA usando sueros policlonales de pollo contra NDV-F para identificar los pocillos positivos que contenían las recombinantas y se usó otro conjunto de placas de 96 pocillos para la recuperación de las células infectadas de los pocillos positivos.
[0061] La purificación viral recombinante se realizó primero mediate duplicación de la placa de 96 y selección IFA para los pocillos que contenía la mayoría de las placas IFA positivas con la menor cantidad de placas IFA negativas. Lo pocillos que cumplen estos criterios se recogieron a continuación y se ajustaron a 1 ml en DMEM FBS al 2%. De la solución madre de 1 ml, se extrajeron 5-20 ul y se mezclaron con 1x107 CEF en 10 ml de DMEM FBS al 2% y se dividieron en alícuotas en una nueva placa de 96 pocillos para tener placas de HVT individuales por pocillo. El sobrenadante de los pocillos que contenía placas individuales se ensayaron para determinar la ausencia de virus parental mediante PCR. Después de cinco rondas de purificación de placas, se aisló un virus recombinante designado como vHVT114 y la pureza se probó mediante IFA y PCR para confirmar la expresión de NDV-F y la ausencia de virus parental.
Análisis por PCR de vHVT114 recombinante
[0062] Se extrajo ADN de vHVT114 mediante extracción con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en HEPES 20 mM. Los cebadores de PCR (mostrados en la tabla 1) se diseñaron para identificar específicamente la presencia de la NDV-F optimizado en codones, el promotor de SV40, así como la pureza del virus recombinante del virus parental FC126 CL2. La PCR se realizó usando 200 ng de plantilla de ADN junto con los pares de cebadores especificados indicados en la Tabla 1. Las condiciones de ciclación de PCR son las siguientes: 94 °C durante 2 minutos; 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 3 minutos; 68 °C durante 5 minutos. Los productos de PCR esperados se muestran en la Tabla 2. Los resultados de la PCR se muestran en la Figura 4. Tal como se muestra en la Figura 4, los tamaños de los productos de PCR después de la electroforesis en gel se corresponden bien con los tamaños esperados y los patrones de bandas.
Tabla 1
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Tabla 2
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Análisis de la expresión de vHVT114 recombinante
[0063] Se realizaron pruebas de inmunofluorescencia usando el vHVT114 que se pasó sobre diez veces más allá de una semilla pre-master experimental (pre-MSV). Los materiales pre-MSV y pre-MSV 12 se diluyeron 1:100 en medio. Cincuenta microlitros de virus diluido se añadieron a 10 ml de DMEM FBS al 2% con 1x107 CEF y, a continuación, se tomaron alícuotas en una placa de 96 pocilios (100 ul/pocillo). Las placas se incubaron durante 3 días a 37 °C 5% de CO2 hasta que las placas virales eran visibles. Las placas se fijaron con acetona enfriada con hielo al 95% durante tres minutos y se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron anti-sueros de pollo contra virus de la enfermedad de Newcastle (lot # C0139, Charles Laboratory Ríos) a 1:1.000 junto con anticuerpo monoclonal L-78 (Merial Limited) a 1:3000 y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de la incubación de 1 hora, las placas se lavaron tres veces con PBS y se añadió anti-pollo FITC (cat # F8888, Sigma) junto con anti-ratón (Ig) de burro Alexz Fluor 568 (cat # A 10037, Molecular Probe) a 1:500. De nuevo, las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de la incubación de 1 hora, se enjuagaron las células tres veces con PBS. Se añadió una pequeña cantidad de PBS para evitar que la monocapa se seque y que cause autofluorescencia. A continuación, las células se visualizaron con un microscopio de fluorescencia utilizando los filtros de isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) en combinación.
[0064] Las placas virales con vHVT114 se visualizaron utilizando tanto los filtros TRITC como FITC para la doble tinción. La prueba FITC mostró la expresión de NDV-F y la prueba de TRITC mostró la expresión de HVT. Debido a los pequeños pocillos de las placas de 96 pocillos, cada pocillo se registró con las placas contadas primero con el filtro TRITC y a continuación recontadas con el filtro FITC. Más de 500 placas se contaron para el pase pre-MSV y pre-MSV 12. Todas las placas fueron positivas tanto para FITC como TRITC en ambas placas. (Fig. 5)
Análisis por transferencia Southern de vHVT114 recombinante
[0065] Se extrajo ADN genómico total de HVT FC126 y vHVT114 de acuerdo con el protocolo de extracción de ADN genómico estándar. Para cada digesto de restricción, se usaron 3 mg de ADN genómico (1 ng para el plásmido donante) con un volumen de digestión total de 20 ml para cada muestra. El ADN genómico de HVT FC126 (control negativo), plásmido donante pHM103 Fopt y vHVT114 se digirieron cada uno por la noche a 37 °C con endonucleasas de restricción BamHI, PstI, SphI y NcoI. Los fragmentos de restricción del ADN genómico de HVT FC126 (control negativo), plásmido donante pHM103 Fopt y vHVT114 se separaron mediante un gel de agarosa al 1% y se transfirieron a una membrana de nylon cargada positivamente. Siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de hibridación y detección quimioluminiscente North2South (Thermo Scientific), la membrana se pre-hibridó durante 1 hora y después se hibridó con una sonda de NDV-F biotinilado durante una noche a 55 °C. Después de la hibridación durante una noche, se realizaron varios lavados de rigurosidad hasta que la membrana se colocó en tampón de bloqueo con la adición de estreptavidina-HRP. Después de enjuagar la membrana de cualquier estreptavidina-HRP no unido, se añadieron la solución de sustrato de Luminal y peróxido. A continuación, la membrana se expuso a una película de rayos X y se reveló. Las áreas donde la sonda biotinilada unida al ADN eran quimioluminiscentes se capturaron mediante la película de rayos X. La Tabla 3 muestra las bandas de transferencia Southern esperadas utilizando la sonda de NDV-F. Los resultados de transferencia Southern mostraron los patrones de digestión, tal como se esperaba (Fig. 6).
Tabla 3
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Análisis de secuencia de la región insertada en vHVT114 recombinante
[0066] El análisis de la región del ADN genómico de vHVT114 se realizó mediante amplificación por PCR. Se utilizaron un total de 10 cebadores para amplificar todo el casete, así como, más allá de los brazos de BamHI-I flanqueantes utilizados en el plásmido donante. El producto de PCR de 4,727 kb se purificó en gel y el fragmento completo se secuenció usando los cebadores de secuenciación. El resultado de la secuencia confirmó que el vHVT114 contiene el promotor de SV40 correcto, el NDV-F optimizado en codones y las secuencias de poliA de SV40 que coinciden exactamente con la secuencia descrita para el plásmido donante pHM103 Fopt en la SEQ ID NO: 38 (véase la Figura 20).
Análisis de transferencia Western de vHVT114 recombinante
[0067] Se infectaron aproximadamente 2 x 106 células de fibroblastos de pollo a MOI ~0,1 con Pre-MSV de vHVT114. Después de dos días de incubación a 37 °C, las células infectadas, así como las no infectadas, se recogieron utilizando un raspador de células después de eliminar el medio y aclarar con PBS. Las células se recogieron con 1 ml de PBS y se centrifugaron. Los sedimentos celulares se lisaron siguiendo el kit Pierce Classic IP (Thermo Scientific). Se usaron 100 pl del anticuerpo monoclonal anti-NDV-F 001C3 (Merial Limited) para formar el complejo inmune. La muestra de anticuerpo/lisado se añadió a la proteína A/G más agarosa para capturar el complejo inmune. El complejo inmune se lavó tres veces para eliminar el material no unido y después se eluyó en un volumen de 50 pl utilizando una elución de tampón de muestra en condiciones no reductoras. Después de ebullición durante 5 minutos, se cargaron 10 pl de las muestras en un gel de acrilamida al 10 % (Invitrogen). El gel PAGE se ejecutó en tampón MOPS (Invitrogen) a 200 voltios durante 1 hora. A continuación, el gel se transfirió a una membrana de PVDF.
[0068] Se usó el sistema TMB del kit de transferencia Western detector de proteínas (KPL, cat. N.° 54-11-50) para transferir la membrana de PVDF utilizando los reactivos y siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de bloquear la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente, la membrana se aclaró entonces tres veces en un tampón de lavado IX, cinco minutos cada vez y después se empapó en un tampón de bloqueo que contenía una dilución 1:1000 de suero de pollo producido contra el virus NDV (Lote N.° C0139, Charles River Laboratories). Después de lavar tres veces en un tampón de lavado, la membrana se incubó con una IgG anti-pollo de cabra marcada con peroxidasa (KPL, cat. N.° 14-24-06) a una dilución de 1:2000 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, la membrana se aclaró tres veces en tampón de lavado 1x, cinco minutos cada vez. Se añadieron 5 ml de sustrato de peroxidasa de membrana TMB a la membrana y se meció suavemente durante aproximadamente 1 minuto. La reacción de revelado se detuvo colocando la membrana en agua.
[0069] La técnica de inmunoprecipitación y transferencia Western detectó una proteína de aproximadamente 55 kD en la muestra de vHVT114 que corresponde al tamaño esperado del componente F1 de la proteína NDV-F (Figura 16).
Ejemplo 2 Construcción de vHVT110, vHVT111, vHVT112, vHVT113 y vHVT116 recombinantes que expresa NDV-F
[0070] La generación y caracterización de recombinantes de HVT vHVT110, vHVT111, vHVT112, vHVT113 y vHVT116 se realizaron esencialmente de la misma manera que para vHVT114 descrito en el ejemplo 1. La Tabla 4 muestra las características únicas para cada construcción alrededor de los casetes de expresión, incluyendo las secuencias respectivas.
Tabla 4 Características de los casetes de expresión de solo recombinantes de HVT individuales
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vHVT110
[0071] El plásmido pCD046 (material patentado por Merial) que contiene los brazos intergénicos I de HVT FC126, el promotor de CMV de ratón y poli A de SV40 se digirió con NotI, se desfosforiló y se extrajo un fragmento de 6,6 kb en gel. Un fragmento de 1,7 kb flanqueado con NotI de un gen de NDV-F sintetizado químicamente que contiene la secuencia F de tipo salvaje (SEQ ID NO: 3, que codifica SEQ ID NO: 4) también fue digerido con NotI y se extrajo el fragmento de 1,7 kb en gel. Los fragmentos de 6,6 y 1,7 kb se ligaron para crear un plásmido donante pCD046 n DV-F wt (SEQ ID NO: 21 para vHVT110) utilizado en la transfección para generar vHVT110 recombinante. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT110 contiene las secuencias correctas del promotor de mCMV, el gen de NDV-F de tipo salvaje y el poliA de SV40. La secuencia también coincide exactamente con la secuencia descrita para el plásmido donante pCD046 NDV-F wt en la SEQ ID NO: 21.
vHVT111
[0072] El plásmido pHM103 (material patentado por Merial) que contiene los brazos intergénicos I de HVT FC126, el promotor de SV40 y poli A de SV40 se digirió con NotI, se desfosforiló y se extrajo un fragmento de 5,6 kb en gel. Un fragmento de 1,7 kb flanqueado con NotI de un gen de NDV-F sintetizado químicamente que contiene la secuencia F de tipo salvaje (SEQ ID NO: 3, que codifica SEQ ID NO: 4) también fue digerido con NotI y se extrajo el fragmento de 1,7 kb en gel. Los fragmentos de 5,6 y 1,7 kb se ligaron para crear un plásmido donante (SEQ ID NO: 22 para vHVT1110) utilizado en la transfección para generar vHVT111 recombinante. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT11 contiene las secuencias correctas del promotor de SV40, el gen de NDV-F de tipo salvaje y el poliA de SV40, tal como se muestra en la secuencia del plásmido donante pHM103 NDV-F WT (SEQ iD NO: 22).
vHVT112
[0073] Se escindió un fragmento que abarca el gen de tipo salvaje sintético NDV-F YZCQ (SEQ ID NO: 34 que codifica SEQ ID NO: 35) del plásmido pUC57 NDV-F YZCQ (sintetizado por GeneScript) usando Notl y se insertó en el mismo sitio del plásmido pCD046 que contiene el promotor de mCMV y la cola poliA de SV40. El material ligado se transformó utilizando kit Top10 Oneshot (cat # C404002, Invitrogen). Las colonias bacterianas se cultivaron en caldo LBamp, el plásmido se extrajo utilizando el kit Qiagens MiniSpin Prep, y se cribaron para la orientación del inserto. El plásmido donante correcto se denominó pCD046 NDV-F VII YZCQ. Se desarrollaron cultivos a gran escala y se realizó la extracción del plásmido mediante el uso del kit Qiagens Maxi Prep. La expresión transitoria de las preps maxi se verificó utilizando reactivo de transfección Fugene en células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y suero policlonal de pollo contra NDV.
[0074] El plásmido pCD046 NDV-F VII YZCQ (SEQ ID NO: 29) se utilizó en la transfección para generar vHVT112 recombinante. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT112 contiene las secuencias correctas de promotor de mCMV, gen de NDV-F YZCQ de tipo salvaje y el poliA de SV40. La secuencia también coincide exactamente con la secuencia descrita para el plásmido donante pCD046 NDV-F VII YZCQ en la SEQ ID NO: 29.
vHVT113
[0075] Se escindió un fragmento que abarca el gen de NDV Texas F sintético (SEQ ID NO: 36 que codifica SEQ ID NO: 37) de plásmido pUC57 NDV Texas F (sintetizado por GeneScript) usando Notl y se insertó en el mismo sitio del plásmido pCD046 que contiene promotor de mCMV y la cola de poliA de SV40. El material ligado se transformó utilizando el kit Top10 Oneshot (cat # C404002, Invitrogen). Las colonias bacterianas se cultivaron en caldo LBamp, el plásmido se extrajo utilizando el kit Qiagens MiniSpin Prep, y se seleccionaron para la orientación del inserto. El plásmido donante correcto se denominó pCD046 Texas NDV-F. Se desarrollaron cultivos a gran escala y la extracción del plásmido se realizó mediante el uso del kit Qiagens Maxi Prep. La expresión transitoria de las preps maxi se verificó utilizando reactivo de transfección Fugene en células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y suero policlonal de pollo contra NDV.
[0076] El plásmido pCD046 Texas NDV-F (SEQ ID NO: 30) se utilizó en la transfección para generar vHVT113 recombinante. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT113 contiene las secuencias correctas del promotor de mCMV, el gen de NDV-F Texas F de tipo salvaje y el poliA de SV40. La secuencia también coincide exactamente con la secuencia descrita para el plásmido donante pCD046 Texas NDV-F en la SEQ ID NO: 30.
vHVT039
[0077] El promotor de MDV gB (SEQ ID NO: 38) se amplificó a partir de ADN extraído de la cepa MDV1 RB1B mediante PCR usando los cebadores HM101 (5'-CCG-GAA-TTC-CGA-TGT-TTA-GTC-ACG-ATA- GAC-3') (SEQ ID NO: 44) y HM102 (5'-ATA-AGA-GCG-GCC-GCA-GTG-AGA-TGA-TCT-TAA-TGA-TG-3') (SEQ ID NO: 45). El primero contiene un sitio EcoRI y el último contiene un sitio Notl para la ligación del producto de PCR de 630 pb digerido con EcoRI/Notl en el plásmido pCD046 digerido con EcoRI/Notl. El producto de ligación se utilizó para transformar células competentes DH5a. Las colonias se recogieron y se cribaron para la presencia del fragmento de PCR insertado mediante análisis de restricción con EcoRI y Notl. El plásmido resultante se designó pHM102.
[0078] La cepa velogénica de NDV Texas (genotipo IV) se cultivó en huevos embrionados de SPF de 11 días de edad y se semipurificó. El ARN total se extrajo y se realizó una RT PCR utilizando dos cebadores F-ATG (5'-TAT-AGC-GGC-CGC-AAG-ATG-GGC-TCC-AGA-TCT-TCT-ACC-AG-3') (SEQ ID NO: 46) y F-STOP (5'-CGA-GGC-GGC-CGC-TCA-TAT-TTT-TGT-AGT-GGC-TCT-C-3') (SEQ ID NO: 47). Permiten la amplificación completa del gen de NDV F con la adición del sitio Notl en dirección 5' de ATG y en dirección 3' de los codones de parada. El fragmento de PCR de 1,7 kb se digirió con Notl y se ligó en pHM102 digerido con Notl. El plásmido resultante se designó pHM119 y se utilizó como plásmido donante en un estudio de recombinación in vitro mediante co-transfección de células CEF con ADN parental de HVT para generar vHVT039, tal como se describe anteriormente. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT039 contiene las secuencias correctas del promotor de MDV gB, el gen de NDV-F de la cepa Texas no modificado de tipo salvaje (SEQ ID NO: 32 que codifica SEQ ID NO: 33) y el poliA de SV40, tal como se muestra en la secuencia parcial del plásmido donante pHM119 (SEQ ID NO: 31).
vHVT116
[0079] El plásmido pHM103 (material patentado de Merial) que contiene los brazos intergénicos I de HVT FC126, el promotor de SV40 y poliA de SV40 se digirió con Notl, se desfosforiló y el fragmento de 5,6 kb se extrajo en gel. Un fragmento de 1,7 kb flanqueado con Notl de un gen de NDV-F CA02 de genotipo V optimizado en codones sintetizado químicamente (SEQ ID NO: 5, que codifica SEQ ID NO: 6) también fue digerido con Notl y se extrajo el fragmento de 1,7 kb en gel. Los fragmentos de 5,6 y 1,7 kb se ligaron para crear pHM103 NDV-F Ca 02 (SEQ ID NO: 23 para vHVT116) utilizado en la transfección para generar vHVT116 recombinante. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT116 contiene las secuencias correctas del promotor de SV40, el gen de NDV-F CA02 optimizado en codones y el poliA de SV40, tal como se muestra en la secuencia del plásmido donante pHM103 NDV-F wt (SEQ ID NO: 23).
Discusión
[0080] Varios cassettes bajo los promotores de mCMV o no CMV se insertaron en diferentes loci del genoma de HVT (Tabla 4). A pesar de los repetidos intentos, la generación de una construcción con una combinación de mCMV y la secuencia de F optimizada en codones no fue exitosa más allá del paso 2. Sin embargo, cuando la secuencia de tipo salvaje fue impulsada por mCMV se pudo generar una construcción estable, vHVT110. Además, vHVT111 recombinante con secuencia de F de tipo salvaje bajo el promotor de SV40 fue también estable durante más de 10 pases in vitro. Sorprendentemente, una secuencia de F optimizada en codones bajo el promotor de SV40 se encontró de manera similar que era estable durante más de 10 pases in vitro (por ejemplo vHVT114 y vHVT116). Estos resultados indican el delicado equilibrio entre la fuerza del promotor y la naturaleza del gen que controlan (optimizado o no en codones) en la generación de una construcción de HVT genéticamente estable.
Ejemplo 3 Construcción de vHVT306, un vector doble de HVT que expresa NDV-F y VP2 de IBDV
[0081] El plásmido donante pHVT US2 SV- Fopt-synPA fue construido conteniendo el promotor de SV40, el gen de NDV F VII optimizado en codones sintético, cola de poliA sintética flanqueada por las secuencias de brazo SORF3 y US2 del HVT FC126.
Generación de virus recombinante
[0082] Se siguió un procedimiento de recombinación homóloga estándar mediante coelectroporación de células CEF secundarias utilizando plásmido donante pHVT US2 SV-Fopt-synPA y el ADN viral aislado de vHVT13 (un vector de HVT que expresa el gen VP2 de IBDV, Merial Limited). Esencialmente el procedimiento descrito en el ejemplo 1 para vHVT114 fue seguido para generar, purificar por placa y caracterizar recombinantes mediante inmunofluorescencia.
[0083] Después de cinco rondas de purificación de placas, se aisló el virus recombinante puro (vHVT306) y se analizó la pureza de vHVT306 y se confirmó mediante IFA y PCR.
Análisis de PCR
[0084] Se extrajo ADN viral de solución madre de virus de semilla pre-master vHVT306 (pre-MSV) mediante el kit QIA DNeasy Blood & Tissue (Qiagen cat # 69506). Se diseñaron cebadores de PCR para identificar la presencia del NDV F optimizado, el NDV F de tipo salvaje, el promotor de SV40, el promotor de mCMV, los brazos flanqueantes de virus US2 del HVT y el virus de SB-1.
[0085] La amplificación por PCR con diversos cebadores confirmó que el vHVT306 tiene los patrones de amplificación esperados y amplicones.
Análisis de expresión
[0086] El ensayo inmunofluorescente indirecto (IFA) se realizó en la solución madre pre-MSV vHVT306. Los CEF que se inocularon con vHVT306 se fijaron con acetona al 95 % enfriada con hielo durante tres minutos a temperatura ambiente y se secaron al aire durante 10 minutos. Después de tres lavados con PBS, se añadieron dos anticuerpos primarios, sueros contra el virus de la enfermedad de Newcastle de pollo (Charles Rivers Laboratories cat. N.° 10100641, lote N.° C0117A) a una dilución de 1:500 y anticuerpo monoclonal L78 contra HVT (Merial Select, Gainesville, GA) a una dilución de 1:3000 y se incubaron durante 45 minutos a 37 °C. Después de tres lavados con PBS, se añadieron dos anticuerpos secundarios, IgG-fluoresceína anti-pollo de cabra (KPL cat#. 02-04-06, lot#110020) a una dilución de 1:500 e IgG-Alexa Fluor 568 anti-ratón de burro (Molecular Probe#A10037, lot#989784) a una dilución de 1:300. Las placas se incubaron a 37 °C durante 45 min y seguido de tres lavados con PBS. Los pocillos se observaron para identificar placas positivas para IFA con un microscopio fluorescente usando filtros de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y de isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC) del microscopio invertido Nikon Eclipse Ti.
[0087] De manera similar, la expresión de la proteína VP2 del IBDV (SEQ ID NO: 8 codificada por SEQ ID NO: 7) de vHVT306 se examinó mediante IFA utilizando suero anti-MDV de pollo (Charles River Laboratories cat # 10100610 lot # G0117) (dilución 1:500) y anticuerpo monoclonal anti-NDV F 001C3 (fluido ascítico, lote 10/09/044, 02/11/2010) (dilución 1:300) como anticuerpo primario; seguido de IgG-fluoresceína anti-pollo de cabra (KPL cat#02-24-06, lot#110020) (dilución 1:500) e IgG-Alexa Fluor 568 anti-ratón de burro (Molecular Probe #A10037, lot#989784) (dilución 1:300) como anticuerpos secundarios.
[0088] Los resultados de IFA indican que vHVT306 expresa los genes F de NDV en las CEF infectadas por el virus.
[0089] Se contaron más de 400 placas de vHVT306 usando el filtro de FITC y el filtro de TRITC del microscopio. La expresión general del gen F de NDV y VP2 de IBDV coinciden con las placas de HVT (Tabla 5).
Tabla 5 IFA dual de vHVT306
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Análisis de transferencia Southern
[0090] El ADN genómico total se extrajo de CEF infectadas con solución madre de vHVT306 pre-MSV. El análisis de transferencia Southern se realizó de acuerdo con el protocolo estándar.
[0091] Se utilizó un total de 3 sondas para confirmar el casete NDV F (promotor de SV40, gen optimiado con codones de NDV F, cola de poli A sintético) entre SORF3 y US2 de vHVT306, así como la retención del casete IBDV VP2 (promotor de mCMV, gen de VP2 IBDV, cola de poli A de SV40).
[0092] Los resultados de transferencia Southern mostraron los patrones de digestión como se esperaba en base al análisis de mapas Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). El casete de NDV F (promotor de SV40, gen optimizado por codones NDV F, cola de poli A sintético) está situado entre SORF3 y US2, y el casete IBDV VP2 (promotor de mCMV, gen VP2 de IBDV, cola de poli A SV40) está intacto como el virus parental (vHVT13).
Análisis genómico
[0093] El ADN genómico de stock de pre-MSV de vHVT306 se secuenció para verificar la secuencia de la región del brazo de recombinación, así como casete del gen insertado.
[0094] Los cebadores se diseñaron para amplificar el casete del gen insertado completo, que incluye el brazo de recombinación utilizado en el plásmido donante. El análisis de ADN genómico de vHVT306 se realizó mediante amplificación por PCR y seguido por determinación de la secuencia de nucleótidos.
[0095] El vHVT306 (plásmido donante pHVT US2 SV- Fopt-synPA) que contiene los brazos recombinantes, el promotor de SV40 y el gen optimizado en codones de NDV-F se confirmó que era correcta, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 20.
Análisis pos transferencia Western
[0096] La monocapa de CEF se infectó con vHVT306 pre-MSV a MOI ~ 0,1. Después de una incubación de 4 días, las CEF se sedimentaron y se lavaron con PBS, seguido por lisis con tampón de lisis IP/lavado del kit Pierce Classic IP (Thermo Scientific cat # 26146) de acuerdo con los protocolos del fabricante. El lisado se preaclaró y se incubó con 100 ul de anticuerpo monoclonal anti-NDV F 001C3 para fabricar el complejo inmune. El complejo inmune fue capturado por la proteína A/G Plus Agarosa y después de la eliminación del complejo inmune no unido mediante etapas de lavado, se utilizaron los 50 ul de tampón de muestra para eluir en condiciones no reductoras. Los CEF no infectados se incluyeron como controles.
[0097] Los 20 ul de las muestras eluidas se separaron en geles al 10% de Bis-Tris por electroforesis. Después de la electroforesis, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de PVDF. El kit de transferencia Western TMB de detección de proteínas (KPL Cat # 54-11-50) se utilizó para detectar los antígenos de NDV en la membrana de PVDF con suero anti-NDV de pollo (Charles River Laboratories cat# 10100641, lote # C0117A), y conjugado de IgG anti-pollo de cabra-peroxidasa (KPL cat # 14-24-06) siguiendo los protocolos de los fabricantes.
[0098] La expresión de la proteína NDV F de vHVT306 se confirmó mediante inmunodetección de dos etapas. Primero, las proteínas NDV F expresadas de CEF infectados con vHVT306 se capturaron mediante la inmunoprecipitación utilizando el anticuerpo monoclonal anti-NDV F 001C3. Posteriormente, se aplicó un análisis de transferencia Western utilizando suero policlonal anti-NDV (Charles River Laboratories cat#10100641, lote#C0117A) para detectar la proteína NDV F en las muestras capturadas (complejo de proteína NDV F-anticuerpo monoclonal) (figura 8). Se detectó una proteína de 55 kDa en lisados pre-MSV de vHVT306 mediante suero anti-NDV que corresponde al tamaño esperado de la proteína de fusión NDV F1 (figura 8).
Ejemplo 4 Construcción de vectores dobles de HVT vHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304 y vHVT307 que expresan NDV-F y IBDV VP2, y vector doble de HVT vHVT202 que expresa las variantes IBDV VP2
Ejemplo 4.1 Construcción de vHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304 y vHVT307
[0099] La generación y caracterización de recombinantes dobles de HVT vHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304 y vHVT307 se realizaron esencialmente de la misma manera que para el vHVT306 descrito en el ejemplo 3. La Tabla 6.1 muestra las características únicas de cada construcción alrededor de los casetes de expresión, incluidas las secuencias respectivas.
Tabla 6.1 Características de los casetes de ex resión de recombinantes dobles de HVT
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vHVT301
[0100] El plásmido pHVT IG2 SbfI (material patentado de Merial) que contiene las secuencias del brazo intergénico 2 de vHVT13 se digirió con SmaI, se desfosforiló y el fragmento de 4,3 kb se extrajo en gel. El plásmido donante pHM103 NDV-F wt que contiene un promotor de SV40, NDV-F de tipo salvaje genotipo VIId, cola de poliA de SV40 fue digerido por EcoRI y SalI, se trató con Klenow, y el fragmento de 2,3 kb se extrajo en gel. Los dos fragmentos se ligaron para crear un plásmido donante pHVT IG2 SV Fwt SbfI (SEQ ID NO: 24) utilizado en la transfección para generar vHVT301 recombinante.
vHVT302
[0101] Un plásmido sintéticamente sintetizada, pHVT US10 cds, que contiene las secuencias de brazo US10 de vHVT13 fue digerido con NotI, se desfosforiló y el fragmento de 4,7 kb se extrajo en gel. Un fragmento de 1,7kb flanqueado por NotI de un genotipo de NDV-F VIId, optimizado en codones, sintetizado químicamente fue digerido por NotI y se extrajo en gel. Los dos fragmentos se ligaron para crear un plásmido donante pHVT US10 cds F opt utilizado en la transfección para generar vHVT302 recombinante. La transcripción del gen de F insertado debe ser impulsada por el promotor US10 nativo y debe detenerse por la señal de poliA de US10 nativa. No se añade promotor exógeno o polyA para expresar este inserto. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT302 contiene la secuencia correcta del gen de NDV-F VIId optimizado en codones, tal como se muestra en la secuencia del plásmido donante pHVT US 10 cds F opt (SEQ ID NO: 25).
vHVT303
[0102] El plásmido sintéticamente sintetizado, pHVT US10 cds, que contiene las secuencias de brazo US10 de vHVT13 fue digerido con NotI, se desfosforiló y el fragmento de 4,7 kb se extrajo en gel. Un fragmento de 1,7kb flanqueado por NotI de un genotipo de NDV-F V, optimizado en codones, sintetizado químicamente fue digerido por NotI y se extrajo en gel. Los dos fragmentos se ligaron para crear un plásmido donante pHVT US10 cds F CAO2 utilizado en la transfección para generar vHVT302 recombinante. Como con vHVT302, la transcripción del gen de F insertado debe ser impulsada por el promotor US10 nativo y debe detenerse por la señal de poliA de US10 nativa. No se añade promotor exógeno o polyA para expresar este inserto. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT303 contiene la secuencia correcta del gen de NDV-F V optimizado en codones, tal como se muestra en la secuencia del plásmido donante pHVT US 10 cds F CA02 (SEQ ID No : 26).
vHVT304
[0103] El plásmido donante pHVT IG2 Sbfl que contiene las secuencias de 2 brazos intergénicas de vHVT13 se digirió con SbfI, se desfosforiló y el fragmento de 4,3 kb se extrajo en gel. Un plásmido sintéticamente sintetizado que contiene un promotor de SV40 genotipo de NDV-F VIId optimizado en codones cola de poli A flanqueado por Sbf se digirió con SbfI y el fragmento de 2,3 kb se extrajo en gel. Los dos fragmentos se ligaron para crear un plásmido donante pHVT IG2 SV Fopt syn tail utilizado en la transfección para generar vHVT304 recombinante. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT304 contiene las secuencias correctas de promotor de SV40, el gen de NDV-F VIId optimizado en codones y la cola de poli A sintética, tal como se muestra en la secuencia del plásmido donante pHVT IG2 SV Fopt syn tail (SEQ ID NO: 27).
vHVT307
[0104] El plásmido donante pHVT US2-SORF3 que contiene las secuencias de brazos US2 y SORF3 de vHVT13 se digirió con SbfI, se desfosforiló y el fragmento de 5,1 kb se extrajo en gel. El plásmido SB1-1 u L55 SV CaF syn tail SbfI que contiene un promotor de SV40 genotipo de NDV-F V optimizado en codones cola de poli A flanqueado por SbfI se digirió con SbfI y el fragmento de 2,3 kb se extrajo en gel. Los dos fragmentos se ligaron para crear un plásmido donante pHVT US2 SV-FCA02 opt-syn PA utilizado en la transfección para generar vHVT307 recombinante. La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT307 contiene las secuencias correctas de promotor de SV40, el gen de NDV-F V optimizado en codones y la cola de poli A sintética, tal como se muestra en la secuencia del plásmido donante pHVT US2 SV-FCA02 opt-synPA (SEQ ID NO: 28).
Discusión
[0105] Uno de los principales objetivos de este trabajo fue desarrollar un vector basado en virus herpes aviar multivalente mediante la incorporación de múltiples genes protectores de interés a un esqueleto del virus de1Herpes aviar (por ejemplo, HVT). Un requisito previo para este enfoque es definir casetes de expresión que contengan las combinaciones adecuadas de promotor-gen-plya y evaluar su estabilidad genética y la capacidad para proteger contra la enfermedad específica.
[0106] Para el propósito de crear una vacuna de vector trivalente vector MD-IBD-ND eficaz, se clonaron secuencias del gen (NDV)-F del virus de la enfermedad de Newcastle optimizado en codones o no optimizado en codones en un esqueleto de vHVT13 (HVT-IBD, una vacuna con licencia para proteger simultáneame los pollos contra MD y IBD) bajo CMV humano (ratón CMV ya se utiliza en vHVT13). Todas las construcciones vHVT-IBD-F bajo el promotor de CMV humano perdieron la expresión de la proteína F dentro de los seis pases tanto si la secuencia de NDV-F está optmizada en codones como sinó y con independencia del lugar de inserción. La pérdida de expresión de la proteína F fue rápida (en dos pases) cuando hCMV se combinó con la proteína F optimizada en codones en comparación con una combinación de hCMV con la secuencia de F de tipo salvaje (pérdida de expresión de la proteína F en 6 pases). Tomados en conjunto, los datos muestran que CMV humano no es un promotor ideal para la generación de recombinantes de HVT estables que expresan la proteína NDV-F. Sorprendentemente, este ejemplo muestra que el promotor de SV40 y promotor endógeno HVT (promotor US10) generó recombinantes de HVT estables que expresan la proteína NDV-F.
Ejemplo 4.2 Construcción de vHVT202
Construcción del plásmido donante HVT SORF3-US2 gpVar-Ewtsyn
[0107] Un fragmento que comprendía el gen de VP2 de IBDV de tipo salvaje varient E sintético (SEQ ID NO: 41 que codifica la SEQ Id NO: 42) se escindió del plásmido pUC57 Varient E wt (sintetizado por GeneScript) usando NotI y se insertó en el mismo sitio del plásmido SORF3 y US2 que contenía el promotor gpCMV y la cola de poli A sintética. El material ligado se transformó utilizando el kit Top10 Oneshot (Invitrogen, CA, Ee .UU.). Las colonias bacterianas se hicieron crecer en caldo LBamp, el plásmido se extrajo usando el kit Qiagens MiniSpin Prep, y se cribaron para determinar la orientación del inserto utilizando la digestión con SacI HindIII. El plásmido donante correcto se designó pHVT SORF3-US2 gpVar-Ewt Syn. La tabla 6.2 muestra las características únicas para la construcción alrededor de los casetes de expresión, incluyendo las secuencias respectivas. Los cultivos a gran escala se hicieron crecer y la extracción del plásmido se realizó con el kit Qiagens Maxi Prep. La expresión transitoria de las preparaciones máximas se verificó utilizando reactivo de transfección Fugene en células de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) y sueros policlonales de pollo contra NDV.
Tabla 6.2 Características de los casetes de expresión de recombinantes de doble HVT
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Generación de recombinantes
[0108] Se siguió un procedimiento de recombinación homóloga estándar mediante la coelectroporación de células CEF secundarias utilizando el plásmido donante pHVTSORF3-US2 gpVar-Ewt Syn y se aisló el ADN viral de vHVT306 y se digirió con SbfI. vHVT306, que expresa VP2 clásica del IBDV y NDV-F, fue elegido como un original para simplificar el proceso de la sección, tal como se describe a continuación. El plásmido donante VP2 variante E fue diseñado para reemplazar el gen F y los recombinantes se seleccionaron inicialmente por la ausencia de la expresión del gen F y después mediante PCR para la presencia de VP2 variante E. La coelectroporación se realizó utilizando 1 x 107 de CEF 2° en 300 pl de Opti-MEM y se aplicó a 150 voltios con capacitancia 950 en una cubeta de electroporación de 2 mm. Las células transfectadas se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 5-7 días. Las células que crecieron en la placa de 96 pocillos se duplicaron en dos placas de 96 pocillos y se incubaron durante 5 días más. Se utilizó un conjunto de placas de 96 pocillos para IFA utilizando sueros policlonales de pollo contra NDV-F para identificar los pocillos positivos que contenían los originales de vHVT306 y se usó otro conjunto de placas de 96 pocillos para recuperar las células infectadas de los pocillos negativos en IFA.
[0109] Los procedimientos de purificación viral recombinante se realizaron primero mediante duplicación de placas de 96 pocillos y selección por IFA de los pocillos que contenían la mayor parte de las placas negativas para IFA (contra NDV-F) con la menor cantidad de placas positivas por IFA. Los pocillos que coincidían con esos criterios se recogieron a continuación y se ajustaron a 1 ml en DMEM FBS al 2 %. De la solución madre de 1 ml, se recogieron 5-20 |jl (dependiendo del número de placas visibles) y se mezclaron con 1 x 107 de CEF en 10 ml de DMEM FBS al 2 % y se dividieron en alícuotas en una nueva placa de 96 pocillos para tener placas de HVT individual por pocillo. Las placas de 96 pocillos se duplicaron después de 4 días de incubación y los pocillos que contenían placas se ensayaron para determinar la presencia de HVT recombinante y ausencia de virus parental mediante IFA y PCR. De nuevo, los pocillos que parecían tener más virus recombinantes y menos virus parental, al comparar los resultados de la banda de PCR, se recolectaron y ajustaron a 1 ml y se dividieron en alícuotas en nuevas placas de 96 pocillos. Después de cinco rondas de purificación de las células infectadas con virus, se aisló HVT recombinante que portaba dos proteínas VP2 de IBDV y se analizó la pureza del virus recombinante mediante PCR para confirmar la ausencia del virus parental.
[0110] La secuenciación de la región de inserción confirmó que vHVT202 contiene las secuencias correctas del promotor de CMV, el gen de VP2 de tipo salvaje Varient E de IBDV, y la cola de poli A sintética de cobaya, tal como se muestra en la secuencia del plásmido donante HVT SORF3-US2 gpVar- Ewtsyn (SEQ ID NO: 39).
Análisis de recombinante mediante PCR
[0111] Se extrajo el ADN de un virus madre mediante extracción con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en 20 mM de HEPES. Se diseñaron cebadores de PCR para identificar específicamente el gen wt Varient E, el promotor, el poliA, así como, la pureza del virus recombinante a partir de virus parenta1HVT. La PCR se realizó usando 200 ug de plantilla de ADN junto con los pares de cebadores especificados indicados en la Tabla 1. Las condiciones de ciclado de PCR son las siguientes (a menos que se indique lo contrario): 94 °C - 2 min; 30 ciclos de 94 °C - 30 s, 55 °C - 30 s, 68 °C - 3 min; 68 °C - 5 min.
[0112] La pureza de virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando pares de cebadores que son específicos para los brazos flanqueantes de HVT, el promotor gpCMV, el gen de Varient E y la cola syn. Los cebadores, específicos para SB1, MDV serotipo 2 (SB1US1.FP SB1Sorf4.RP) también se incluyeron en el análisis. Los resultados de la PCR demuestran que el virus recombinante vHVT202 lleva el casete de expresión previsto y el stock de virus está libre de cantidades detectables de virus HVT parental.
Tinción inmunofluorescente de virus vHVT202 recombinante que expresa dos proteínas VP2 de IBDV
[0113] Para el ensayo de inmunofluorescencia, el material P3 se diluyó 1:100 en medio. Se añadieron aproximadamente 50 pl de virus diluido a 10 ml de DMEM FBS al 2% con 1x107 CEF y, a continuación se dividió en alícuotas en una placa de 96 pocillos (100 pl/pocillo). Las placas se incubaron durante 4 días a 37 °C 5% de CO2 hasta que las placas virales eran visibles. Las placas se fijaron con acetona a 95% enfriada con hielo durante tres minutos y se lavaron tres veces con PBS. Se utilizó un pocillo para anti-suero de pollo contra virus de la enfermedad de Newcastle (lote # C0139, Charles Laboratory Ríos) a 1:1000 y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. El otro pocillo se utilizó para anti-sueros de pollo contra IBDV (lote # G0117). Después de una hora de incubación, las placas se lavaron tres veces con PBS y se añadió anti-pollo con FITC (cat # F8888, Sigma) a 1:500. De nuevo, las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de una hora de incubación, se lavaron las células tres veces con PBS y se visualizaron con un microscopio de fluorescencia usando un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC).
[0114] Los resultados de tinción inmunofluorescente indican que vHVT202 exhibió una muy fuerte expresión de la proteína VP2 cuando se utilizaron sueros policlonales contra ambas proteínas VP2 clásica y la variante E.
Conclusión
[0115] Basado en PCR y análisis de inmunofluorescencia, vHVT202 es un HVT recombinante en el que un gen de VP2 de la variante E del IBDV bajo el control de promotor gpCMV se insertó con éxito en una base de HVT recombinante que ya expresa el gen de VP2 del IBDV clásico. En consecuencia vHVT202 lleva ambos genes VP2 de la variante E y IBDV clásico y está libre de cualquier virus vHVT306 parental detectable.
Ejemplo 5 Construcción de vSB1-009, vSB1-004, vSB1-006, vSB1-007, vSB1-008, y vSB1-010 recombinantes que expresan NDV-F
Ejemplo 5.1 Construcción de vSB1-009, vSB1-004, vSB1-006, vSB1-007, y vSB1-008
[0116] El objetivo del estudio es construir un vector viral recombinante de SB-1 VSB 1-009 en la que se inserta un casete de expresión que contiene el promotor de SV40 y la proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) para reemplazar la secuencia de codificación UL44 (gC) de SB-1.
[0117] Se construyó un plásmido donante pSB1 44 cds SV FCAopt que contenía brazos flanqueantes UL44 de virus SB1, el promotor de SV40 y la secuencia de genes optimizada en codones de NDV F (SEQ ID NO: 5, que codifica la SEQ ID NO: 6).
Generación de virus recombinante
[0118] Un procedimiento de recombinación homologa estándar se siguió de la coelectroporación de células CEF secundarias usando el plásmido donante pSB144 cds SV FCAopt y el ADN viral se aisló de CEF infectados con el virus SB-1. Esencialmente, se siguió el procedimiento descrito en el ejemplo 1 para vHVT114 para generar, purificar en placa y caracterizar los recombinantes mediante inmunofluorescencia.
[0119] Después de cinco rondas de purificación en placa, se aisló el virus recombinante puro (vSB1-009) y la pureza de vSB 1-009 se probó mediante IFA y PCR para validar la inserción apropiada, así como el virus parental no remanente.
Análisis por PCR
[0120] Se extrajo ADN viral del stock de virus de siembra pre-master (pre-MSV) vSB 1-009 mediante el kit QIA DNeasy Blood & Tissue (Qiagen). Los cebadores de PCR se diseñaron específicamente para identificar la presencia del NDV F optimizado, NDV F de tipo salvaje, el promotor de SV40, el promotor mCMV, los brazos flanqueantes de UL44 del virus SB-1 y el virus HVT. Las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando aproximadamente 200 ng de plantilla de ADN junto con los pares de cebadores.
[0121] La amplificación por PCR con diversos cebadores confirmó que el vSB1-009 tiene los patrones de amplificación y amplicones esperados.
Análisis de expresión
[0122] El ensayo inmunofluorescente indirecto (IFA) se realizó en el stock de vSB 1-009 pre-MSV para examinar la expresión del gen NDV F y el antígeno del virus SB-1. Los CEF que se inocularon con vSB1-009 se fijaron con acetona al 95 % enfriada con hielo durante tres minutos a temperatura ambiente y se secaron al aire durante 10 minutos. Las placas se lavaron con PBS, después se añadieron dos anticuerpos primarios, sueros contra el virus de la enfermedad de Newcastle de pollo (Charles Rivers Laboratories cat. N.° 10100641, lote N.° C0117A) a una dilución de 1:500 y anticuerpo monoclonal Y5.9 contra el virus SB-1 (Merial Select, Gainesville, GA) a una dilución de 1:3000 y las placas se incubaron durante 45 minutos a 37 °C. Después de tres lavados con PBS, se añadieron dos anticuerpos secundarios, IgG anti-pollo de cabra-fluoresceína (KPL cat#02-24-06, lote#110020) a una dilución de 1:500 e IgG anti-ratón de burro-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe, cat#10037, lote#989784) a una dilución de 1:250. Las placas se incubaron a 37 °C durante 45 min y seguidas de tres lavados con PBS. Los pocillos se cribaron para determinar placas positivas por IFA con un microscopio fluorescente usando filtros de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y de isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC) del microscopio invertido Nikon Eclipse Ti. De manera similar, la reactividad de vSB1-009 con Mab contra NDV F se examinó mediante IFA dual utilizando suero anti-MDV (Charles River Laboratories, cat#10100628, lote#D0111 (dilución 1/300) y anticuerpo monoclonal anti-NDV F (dilución 1/300) como anticuerpo primario. Se utilizaron IgG anti-pollo de cabra-fluoresceína (KPL cat#02-24-06, lote#110020) (dilución 1:500) e IgG anti­ ratón de burro-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe, cat#10037, lote#989784) (dilución 1:250) como anticuerpos secundarios. Se observaron los pocillos para identificar las placas positivas por IFA con un microscopio de fluorescencia utilizando filtros FITC y TRITC del microscopio invertido Nikon Eclipse Ti.
[0123] Los resultados del IFA indican que vSB1-009 expresa la proteína NDV F en CEF infectados con virus. Se contaron más de 500 placas de vSB1-009 para la expresión de la proteína NDV F, así como la expresión de la proteína específica del virus SB-1 con IFA dual. La expresión de la proteína NDV F coincidió completamente con la expresión del antígeno del virus SB-1 en cada placa de virus (Tabla 7).
Tabla 7 IFA dual de vSB1-009
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[0124] La reactividad de MAb contra NDV F se confirmó mediante IFA dual. Se examinaron más de 200 placas de vSB 1-009 para determinar la reactividad del MAb contra NDV F Mab, así como la reactividad del suero anti-MDV. La reactividad con MAb contra NDV F coincidió completamente con la reactividad del suero anti-MDV en cada placa de virus (Tabla 8).
Tabla 8 Reactividad de vSB1-009 con Mab anti-NDV F
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Análisis de transferencia Southern
[0125] Se extrajo ADN genómico total de CEF infectados con stock pre-MSV de vSB1-009. El ADN genómico de vSB 1­ 009, el virus SB-1 (control negativo), el plásmido donante pSB1 44 cds SV FCA opt se digirieron a 37 °C con las endonucleasas de restricción EcoRI, NcoI y KpnI por separado. Los fragmentos de restricción se separaron mediante una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y se transfirieron a una membrana de Nylon cargada positivamente. Después de la transferencia, la membrana se trató con NaOH 0,4 M y después se neutralizó con tampón 2XSSC-HCl. A continuación, la membrana se secó al aire y se reticuló con UV.
[0126] Siguiendo las instrucciones de los fabricantes del kit de hibridación quimioluminiscente y detección North2South (Thermo Scientific cat. N.° 89880), la membrana se hibridó previamente durante 1 h y después se hibridó con la sonda a 55 °C durante una noche. Para la hibridación, se utilizaron dos sondas; 1) el fragmento Sbfl de pSB144 cds SV FCA opt como sonda del casete de NDV F, 2) el fragmento Smal-EcoRI del brazo pUC57 SB1 44 (GenScript) como sonda del brazo de recombinación. Después de la hibridación durante una noche, se realizaron varios lavados rigurosos hasta que la membrana se colocó en un tampón de bloqueo con la adición de estreptavidina-HRP. Después de aclarar la membrana de cualquier estreptavidina-HRP no unida, se añadieron la solución de sustrato de Luminal y peróxido. A continuación, la membrana se expuso a una película de rayos X y la película se reveló.
[0127] Los resultados de transferencia Southern fueron los esperados según el análisis de mapa Vector NTI. El casete de NDV F (promotor de SV40, gen de NDV-F CA02 optimizado en codones) reemplazó las secuencias codificantes de UL44 del virus SB-1.
Análisis genómico
[0128] El ADN genómico del stock de pre-MSV de vSB1-009 se realizó mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos de la región del brazo de recombinación, así como el casete génico insertado. Los cebadores se diseñaron y se utilizaron para amplificar el casete del gen de NDV-F completo, incluidos los brazos de recombinación.
[0129] Se confirmó que la secuencia de vSB1-009 (plásmido donante pSB1 44 cds SV FCAopt) que contenía los brazos recombinantes, el promotor de SV40 y el gen de n Dv F optimizado en codones era correcta, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 19.
Análisis de transferencia Western
[0130] La monocapa de CEF se infectó con pre-MSV de vSB1-009 a MOI ~0,1. Después de una incubación de 5 días, los c Ef se sedimentaron y se lavaron con PBS, seguido de lisis con tampón de lisis IP/lavado del kit Pierce Classic IP (Thermo Scientific cat. N.° 26146) según los protocolos de los fabricantes. El lisado se aclaró previamente y se incubó con 100 ml de anticuerpo monoclonal anti-NDV F para formar el complejo inmune. El complejo inmune se capturó mediante proteína A/G Plus Agarosa y después de extraer el complejo inmune no unido mediante etapas de lavado, se utilizaron 50 ml de tampón de muestra para eluir en condiciones no reductoras. Los CEF no infectados se incluyeron como control. Los 20 ml de muestras eluidas se separaron en geles de Bis-Tris al 10 % mediante electroforesis. Después de la electroforesis, las proteínas separadas en un gel se transfirieron a la membrana de PVDF. El kit transferencia Western para detección de proteínas TMB (KPL cat. N.° 54-11-50) se utilizó para detectar los antígenos de NDV en la membrana de PVDF con suero de pollo anti-NDV (Charles River Laboratories cat. N.° 10100641, lote N.° C0117A) y el conjugado de IgG anti-pollo de cabra-peroxidasa (KPL cat. N.° 14-24-06) siguiendo los protocolos de los fabricantes.
[0131] La expresión de la proteína NDV F de vSB1-009 se confirmó mediante inmunodetección de dos etapas. Primero, las proteínas NDV F expresadas del lisado de CEF infectados con vSB1-009 se capturaron mediante la inmunoprecipitación utilizando el anticuerpo monoclonal anti-NDV F 001C3. Posteriormente, se aplicó un análisis de transferencia Western utilizando suero policlonal anti-NDV (Charles River Laboratories, cat. N.° 10100641, lote N.° C0117A) para detectar la proteína NDV F en las muestras capturadas (complejo de proteína NDV F-anticuerpo monoclonal) (Figura 9). Se detectó una proteína de aproximadamente 55 kDa en lisados de pre-MSV de vSB 1-007 mediante suero anti-NDV que correspondía al tamaño esperado de la proteína de fusión NDV F1 (Figura 9).
[0132] La generación y caracterización de HVT recombinantes vSB1-004, vSB 1-006, vSB1-007 y vSB1-008 se realizaron esencialmente de la misma manera que para vSB 1-009 descrito en este ejemplo. La Tabla 9.1 muestra las características únicas para cada construcción alrededor de los casetes de expresión, incluyendo las respectivas secuencias. La generación y caracterización de vectores virales SB1 recombinantes también se describieron en la solicitud de patente de Estados Unidos No. de serie USSN 13/689,572 presentada el 29 de noviembre de 2012 (Merial Limited).
Tabla 9.1 Características de los casetes de expresión de recombinantes de SB1
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Ejemplo 5.2 Construcción de doble construcción de vSB1-010
Plásmido donante de laconstrucción SB1US2 gpVIIdwtsyn
[0133] Utilizando el plásmido HVT SOrf3-US2 gpVar-Ewt Syn, el gpCMV, Variante E, cola Syn se extrajo mediante digestión con SbfI. Este fragmento se ligó en el plásmido donante s B1 US2. El gen variante E se cortó por NotI y se reemplazó por NDV-F VI I d wt. El gen sintético de tipo salvaje NDV-F VIId (SEQ ID NO:3 que codifica la SEQ ID nO: 4) se escindió del plásmido pUC57 NDV-F VIId wt (sintetizado por GeneScript) usando digestión con NotI. El material ligado se transformó utilizando el kit Top10 Oneshot (cat. N.° C404002, Invitrogen). Las colonias bacterianas se hicieron crecer en caldo LBamp, el plásmido se extrajo usando el kit Qiagens MiniSpin Prep, y se cribaron para determinar la orientación del inserto utilizando la digestión con NcoI+SalI. El plásmido donante correcto se designó pSB1 US2 gpVIIdwt Syn. La Tabla 9.2 muestra las características únicas para la construcción alrededor de los casetes de expresión, incluyendo las secuencias respectivas. Los cultivos a gran escala se hicieron crecer y la extracción del plásmido se realizó con el kit Qiagens Maxi Prep. La expresión transitoria de las preparaciones máximas se verificó utilizando reactivo de transfección Fugene en células de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) y sueros policlonales de pollo contra NDV-F.
Generación de recombinantes
[0134] Un procedimiento de recombinación homóloga estándar se siguió de coelectroporación de células CEF secundarias usando el plásmido donante pSB1 US2 gpVIIdWt Syn y el ADN viral se aisló de vSB1-009 (vSB1-009 ya es un virus recombinante que expresa el gen de CA02 F de NDV). Esencialmente, se siguió el procedimiento descrito en el ejemplo 1 para vHVT114 para generar, purificar en placa y caracterizar los recombinantes mediante inmunofluorescencia.
[0135] Después de cinco rondas de purificación en placa, se aisló el virus recombinante puro (vSB1-010) y la pureza de vSB1-010 se probó mediante IFA y PCR para validar la inserción apropiada, así como el virus parental no remanente.
Tabla 9.2 Características de vSB1-010
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[0136] La secuenciación de la región del inserto confirmó que vSB1-010 contiene las secuencias correctas de promotor CMV de cobaya y el gen NDV-F VIId wt, tal como se muestra en la secuencia del plásmido donante SB1US2 gpVIIdwtsyn (SEQ ID NO: 40).
Análisis de recombinantes por PCR
[0137] Se extrajo ADN de un stock de virus mediante extracción con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en HEPES 20 mM. Los cebadores de PCR se diseñaron para identificar específicamente el gen NDV-F VIId wt, el promotor, la poli A, así como la pureza del virus recombinante a partir del virus parental SB1. El análisis por PCR se realizó utilizando 200 pg de plantilla de ADN junto con los pares de cebadores especificados indicados en la Tabla 1. Las condiciones de ciclado de la PCR son las siguientes (a menos que se indique de otro modo): 94 °C - 2 min; 30 ciclos de 94 °C - 30 s, 55 °C - 30 s, 68 °C - 3 min; 68 °C - 5 min.
[0138] La pureza del virus recombinante se verificó por PCR usando pares de cebadores que son específicos para los brazos que flanquean SB1, el promotor de gpCMV, el gen NDV-F VIId wt y la cola syn. Los cebadores, específicos para HVT, MDV serotipo 3 (MB080 MB081) también se incluyeron en el análisis. Los resultados de la PCR demuestran que el virus recombinante vSB1-010 transporta el casete de expresión deseado y que el stock de virus está libre de cantidades detectables del virus SB1-009 parental.
Tinción inmunofluorescente del virus vSB1-010 recombinante que expresa dos proteínas NDV-F
[0139] Para las pruebas de inmunofluorescencia, el material P3 se diluyó 1:100 en medio. Se añadieron aproximadamente 50 pl del virus diluido a 10 ml de DMEM FBS al 2 % con 1 x 107 de CEF y después se dividió en alícuotas en una placa de 96 pocillos (100 pl/pocillo). Las placas se incubaron durante 5 días a 37 °C CO2 al 5 % hasta que las placas virales fueron visibles. Las placas se fijaron con acetona enfriada con hielo al 95 % durante tres minutos y se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron antisueros de pollo contra el virus de la enfermedad de Newcastle (lote N.° C0139, Charles Rivers Laboratory) a 1:1000 y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de una hora de incubación, las placas se lavaron tres veces con PBS y se añadió anti-pollo FITC (cat. N.° F8888, Sigma) a 1:500. De nuevo, las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de una hora de incubación, las células se aclararon tres veces con PBS y se visualizaron con un microscopio fluorescente usando un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC).
[0140] Los resultados de la tinción inmunofluorescente indican que vSB1-010 mostró una expresión muy fuerte de la proteína NDV-F cuando se usaron los sueros policlonales contra ambas proteínas CA02 y VI I d F de NDV.
Conclusión
[0141] En base a las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vSB1-010 es un SB-1 recombinante en que el gen VIId-F de NDV bajo el control del promotor de gpCMV se insertó con éxito en un vSB 1-009, que ya expresa el gen de CA02-F de NDV. En consecuencia, vSB1-010 transporta ambos genes VIId y CA02 F de los genotipos de NDV y está libre de cualquier vSB 1-009 parental detectable.
Ejemplo 6 Eficacia de vHVT110, vHVT111, vHVT114 y vSB1-004 que expresan el gen de NDV F contra exposiciones con cepas de NDV de Chimalhuacan y de Malasia (MAL04-01) a los 14 días de edad en pollos SPF
[0142] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones de HVT recombinantes (vHVT110, vHVT111 y vHVT114) y una construcción recombinante de SB1 (VSB 1-004) que expresan el gen de NDV F contra las exposiciones a la enfermedad de Newcastle (cepas del virus de Chimalhuacan y Malasia) llevada a cabo a los 14 días de edad en pollos SPF.
[0143] Las características de estos 5 candidatos de vacunas se describen en la Tabla 10 a continuación.
Tabla 10 Características de los vectores utilizados en el estudio de exposición
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[0144] En D0, 100 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar en 10 grupos de 10 aves. Las aves se inyectaron por vía subcutánea en el cuello en D0 con 0,2 ml de vacunas recombinantes que contienen una dosis objetivo de 2000 ufp, tal como se describe en la Tabla 11 a continuación. Cabe mencionar que el título de vSB 1-004 (31.600 pfu) que se administra a las aves de los grupos 6 era muy superior al objetivo. Las aves fueron expuestas por la vía intramuscular en D14 con cepa velogénica de ND de Malasia (genotipo VIId) (sub-grupos "A") o con cepa virulenta de ND de Chimalhuacan (genotipo V) (subgrupos "b").
Tabla 11 Estudio de la exposición con vHVT110, vHVT 111, vHVT114 y vSB1-004
% de protección contra mortalidad/morbilidad después de la Grupo Vacuna en el día Serología de NDV exposición a Newcastle a los 14 días de (D0) en el D14* edad(D14)
cepa de Malasia cepa de Chimalhuacan
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* Número de aves positivas mediante la prueba de HI de NDV/total probadas
[0145] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos después de la exposición fueron anotados todos los días de la siguiente manera: saludable/con síntomas específicos (plumas erizadas, postración, tortícolis, temblor)/muerto. En D14, se tomaron muestras de suero de cada grupo para serología (prueba de inhibición de hemaglutinación (HI) del virus de la Enfermedad de Newcastle).
[0146] Como se esperaba, los animales no vacunados (G1A y G1b) no mostraron anticuerpos contra NDV en D14. Se obtuvo una seroconversión baja de título (título medio en HI <0,6 log10) en cada grupo vacunado (subgrupos "a" y "b" de G2 a G5), que confirma las tomas de vacuna. El número de aves positivas/total probadas era dependiente del grupo y fue el más alto (90%) en aves vacunadas con vHVT114 (ver tabla anterior).
[0147] Se describen porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad en la tabla anterior. Se observó susceptibilidad completa en los grupos de control y G1a G1b, validando así la alta gravedad de ambas exposiciones. Se observaron niveles de protección más bajos en los grupos vacunados con vHVT111 o VSB 1-004. Se obtuvieron tasas de protección más alta contra la morbilidad y la mortalidad en los grupos vacunados con vHVT110 o vHVT114 cualquiera que sea la cepa de exposición utilizada (cepa homóloga es decir, el genotipo de Malasia VIId o cepa heteróloga, es decir, Chimalhuacan genotipo V). Hubo una correlación entre el % de aves positivas mediante la prueba de HI antes de la exposición y el % de protección.
[0148] La diferencia de la protección obtenida entre vHVT110 y vHVT111 ilustra claramente la importancia del promotor, siendo el promotor de mCMV IE más potente que el promotor de SV40 para la transcripción del gen F de genotipo VIId de tipo salvaje (wt). La diferencia de la protección obtenida entre vHVT111 y vHVT114 ilustra la importancia de la secuencia de nucleótidos del gen F, siendo la secuencia optimizada más potente que la de tipo salvaje (o nativa).
[0149] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron la importancia del promotor y la secuencia de nucleótidos del gen F en la protección contra ND inducida por vacunas de vectores de la enfermedad de Marek. Una combinación óptima de estos factores debe encontrarse para llegar a los mejores rendimientos de eficacia que para vHVT114.
Ejemplo 7 Eficacia de vHVT114, vHVT116, vHVT301, vHVT302 y vHVT303 que expresan el gen F de NDV contra las exposiciones con la cepa de NDV Texas GB a los 14 días de edad en pollos s Pf
[0150] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de 2 construcciones recombinantes de HVT individuales (vHVT114 y vHVT116) que expresan el gen F de NDV y 3 construcciones recombinantes dobles de HVT (vHVT301, vHVT302 y vHVT303) que expresan el gen F de NDV F y el gen de VP2 de IBDV contra la exposición a la enfermedad de Newcastle (cepa Texas GB, genotipo II) realizada a los 14 días de edad en pollos SPF.
[0151] Las características de estas 4 vacunas candidatas se describen en la Tabla 12 a continuación.
Tabla 12 Características de los vectores usados en el estudio de ex osición
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[0152] En D0, 120 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 6 grupos de 20. A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 1000 ufp, tal como se describe en la Tabla 13 a continuación. Las aves se expusieron por ruta intramuscular en D14 con 4,5 log 10 EID50 de cepa velogénica de ND Texas GB (genotipo II).
Tabla 13 Resultados de eficacia
Grupo Vacuna a un día de % de protección clínica (número infectados/total) después de la exposición a edad(D0) Newcastle a los 14 días de edad (D14)
G1 - 0% (20/20)
G2 vHVT114 80% (4/20)
G3 vHVT116 70% (6/20)
G4 vHVT301 15% (17/20)
G5 vHVT302 52,6% (9/19)*
G6 vHVT303 15% (17/20)
*1 ave murió antes de la exposición
[0153] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV y la mortalidad se registraron después de la exposición.
[0154] Los porcentajes de protección se indican en la tabla anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de ambas exposiciones. Se observó una protección parcial de los 5 candidatos a vacunas, obteniéndose los mejores rendimientos con vHVT114 y vHVT116. Entre los recombinantes dobles HVT, el vHVT302 fue el más protector. Actuó mejor que vHVT303 lo que sugiere que el gen F de NDV de genotipo VIId optimizado puede ser mejor protector cruzado contra la exposición al genotipo II que el gen F de NDV de genotipo V optimizado. Una tendencia similar se observó con HVT individual, el vHVT114 (gen VIId) que actúa un poco mejor que vHVT116 (gen V), pero la diferencia era menos pronunciada. Estos resultados indicaron que ambos genes F de NDV de genotipos VIId y V insertados en el vector HVT proporcionan una protección cruzada frente a al exposición al genotipo IINDV heterólogo; el gen VIId puede ser potencialmente más protector cruzado. El vHVT302 indujo una mejor protección de ND que vHVT301 confirmando la importancia del promotor, poli-A y el locus de inserción. En conclusión, los resultados de este estudio mostraron una protección temprana muy buena de ND inducida por vacunas de vectores de la enfermedad de Marek probadas, especialmente para HVT-ND individual probada.
Ejemplo 8 Eficacia de vHVT114, vHVT116, vSB1-007, vSB1-008 (en solitario o con vHVT13) y vHVT 304 frente a exposiciones a NDV ZJ1 (genotipo VIId) y California/02 (genotipo V) a los 21 días de edad en pollos SPF
[0155] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de 2 construcciones recombinantes de HVT individuales (vHVT114 y vHVT116), 2 construcciones recombinantes de SB1 (vSB1-007 y vSB1-008) que expresan el gen de NDV F y un recombinante de doble HVT (vHVT304) contra la exposición a la enfermedad de Newcastle con NDV ZJ1 (genotipo VIId) y California/02 (genotipo V) realizada a los 21 días de edad en pollos SPF.
[0156] Las características de estas 5 vacunas candidatas se describen en la Tabla 14 a continuación.
Tabla 14 Características de los vectores usados en el estudio de ex osición
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[0157] En D0, 158 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 6 grupos de 24 aves (vacunadas) y 1 grupo de 12 aves (controles no vacunados). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 1000 ufp como se describe en la Tabla 15 a continuación. Las aves se separaron después en dos subgrupos, estando cada uno de los subgrupos expuesto por vía intramuscular en D21 con 5 log10 EID50 de la cepa velogénica de NDV ZJ1 (genotipo VIId) o California/02 (genotipo V).
Tabla 15 Resultados de eficacia
Grupo Vacuna a un día de edad (D0) % de protección clínica
CA/02 (genotipo V) ZJ1 (genotipo VIId)
G1 - 0 % 0 %
G2 vHVT114 100 % 100 %
G3 vHVT116 100 % 90 %
G4 vSB1-007 92 % 100 %
G5 vSB1-008 100 % 100 %
G6 vSB1-008+vHVT13 100 % 83 %
G7 vHVT304 92 % 75 %
[0158] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los problemas técnicos observados con los aisladores redujeron el número de aves en el grupo 2 (vHVT1 14: de 24 a 14) y en el grupo 3 (vHVT1 16: de 24 a 20). Los signos clínicos del NDV se registraron después de la exposición. El suero se recolectó de muestras de sangre tomadas de aves de los grupos 2 y 7 antes de la exposición (D21) para la serología de NDV mediante la prueba HI usando cada cepa de exposición como antígeno.
[0159] La media de los títulos serológicos HI de G2 y G7 antes de la exposición se muestran en la Figura 10. Los títulos de HI fueron mayores con el antígeno ZJ1 en ambos grupos. Los títulos de HI inducidos por vHVT114 fueron más altos que los inducidos por vHVT304.
[0160] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de ambas exposiciones. Todas las vacunas indujeron altos niveles (<75 %) de protección contra ambas exposiciones. La protección clínica completa contra ambas exposiciones se indujo por vHVT114 y vSB 1-008. Siguiendo una tendencia similar a los títulos de Hi, la protección de ND inducida por vHVT304 fue ligeramente inferior a la inducida por vHVT114.
[0161] La propagación se evaluó después de la exposición mediante RT-PCR en tiempo real en frotis orales y cloacales tomados 2 y 4 días después de la exposición. El porcentaje de aves positivas (Ct < 40) se muestra para ambas exposiciones en las Figuras 11A y 11B. Cabe indicar que las 6 aves murieron a los 4 días después de la exposición en el grupo de control expuesto al aislado CA/02 y solo un ave (de 6) seguía con vida a los 4 días después de la exposición en el grupo de control expuesto a ZJ1. Se detectó propagación en todas las aves control. Se observó una reducción del porcentaje de aves positivas para la propagación en todos los grupos vacunados.
[0162] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron una muy buena protección contra la ND a las 3 semanas de edad inducida por las vacunas vectoriales de la enfermedad de Marek probadas.
Ejemplo 9 Eficacia de las vacunas de vHVT114, vSB1-007, vSB1-009, vHVT306 y vHVT307 contra las exposiciones con la cepa NDV Texas GB a los 28 días de edad en pollos SPF
[0163] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de combinaciones de diferentes vacunas vectoriales de la enfermedad de Marek que expresan el NDV F y/o el gen de VP2 de IBDV contra la exposición a la enfermedad de Newcastle (cepa Texas Gb , genotipo II) realizada a los 28 días de edad en pollos SPF.
[0164] Las características de las 5 vacunas recombinantes candidatas probadas en este estudio se describen en la Tabla 16 a continuación.
Tabla 16 Características de los vectores usados en el estudio de ex osición
Figure imgf000025_0001
[0165] Las vacunas contra el virus de la enfermedad de Marek serotipo 1 (cepa CVI988 (o Rispens); virus del herpes gallináceo 2) y serotipo 2 (cepa SB-1; virus del herpes gallináceo 3) también se usaron en combinación con virus recombinantes en algunos de los grupos.
[0166] En D0, 135 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 9 grupos de 15 aves. A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D0 0,2 ml que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp para vacunas recombinantes (vSB 1-007, vSB 1-009, vHVT13, vHVT306, vHVT307, vHVT114), y 1000 ufp para cepas parentales de vacuna contra la enfermedad de Marek (SB-1 y CVI988). El diseño de los 9 grupos se muestra en la Tabla 17 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D28 con 4,0 log10 EID50 de la cepa velogénica ND Texas GB (genotipo II).
Tabla 17 Resultados de eficacia
Grupo Vacuna a un día de edad (D0) % de protección contra ND después de la exposición a la enfermedad de Newcastle a los 28 días de edad
G1 - 0 %
G2 vSB1-007+vHVT13 80 %
G3 vSB1-009 100 %
G4 vSB1-009+vHVT13 86 %
G5 vSB1-009+vHVT 13+CVI988 93 %
G6 vHVT306+SB-1 100 %
G7 vHVT307 100 %
G8 vHVT307+SB-1 93 %
G9 vHVT114+vHVT13+SB-1 100 %
[0167] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Se registraron los signos clínicos del NDV después de la exposición.
[0168] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observaron excelentes niveles de protección en todos los grupos vacunados. Las aves de G3, G6, G7 y G9 estaban completamente protegidas. Este estudio muestra que los candidatos de vSB1-ND pueden administrarse conjuntamente con vHVT13 y CVI988 y aun así proporcionar una muy buena protección contra ND. De manera similar, HVT-IBD ND doble es compatible con SB-1, y vHVT-ND (vHVT114) es compatible con vHVT13 y SB-1.
[0169] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron la falta de interferencia en la protección contra la ND inducida por las vacunas parentales y vectoriales de la enfermedad de Marek probadas.
Ejemplo 15 Eficacia de vHVT114, vHVT307, vSB1-007 y vSB1-009 en combinación con vHVT13 contra exposiciones con la cepa de NDV Chimalhuacan (genotipo V) en D28 en pollos SPF
[0170] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de una construcción recombinante de HVT (vHVT114) y dos construcciones recombinantes de SB1 (vSB1-007 y vSB 1-009) que expresan el gen de NDV F en combinación con vHVT-IBD (vHVT13), así como un doble HVT vHVT307 que expresaba tanto NDV F como VP2 de IBDV frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle (Chimalhuacan, genotipo V) realizada a los 28 días de edad en pollos SPF.
[0171] Las características de estas 4 vacunas candidatas se describen en la Tabla 18 a continuación.
Tabla 18 Características de los vectores usados en el estudio de ex osición
Figure imgf000026_0003
[0172] En D0, 45 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 4 grupos de 10 aves y 1 grupo de 5 aves (grupos de control sin vacunar). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp, tal como se describe en la Tabla 19 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D28 con 5,0 log10 EID50 de la cepa velogénica Chimalhuacan (genotipo V).
Tabla 19 Resultados de la eficacia
Grupo Vacuna a un día de edad (D0) % de protección contra mortalidad % de protección contra morbilidad
G1 - 0 % 0 %
G2
Figure imgf000026_0001
100 % 100 %
Figure imgf000026_0002
[0173] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV se registraron después de la exposición. Se tomaron frotis orofaríngeos en los grupos vacunados a los 5 y 7 días después de la exposición para evaluar la carga viral mediante RT-PCR en tiempo real.
[0174] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observó una muy buena protección en los 4 grupos vacunados, induciéndose una protección clínica completa por vHVT114+vHVT13.
[0175] Se muestra el porcentaje de aves positivas y el título medio de propagación (expresado como log 10 EID50 equivalente por ml) en las Figuras 12A y 12B. Sorprendentemente, no se detectó propagación en G2, lo que indica una protección contra ND completa (contra tanto los signos clínicos como la propagación) inducida por vHVT114, incluso si se administra conjuntamente con vHVT13, en las condiciones probadas. Los niveles de propagación detectados en los otros grupos vacunados fueron bajos, con un nivel ligeramente superior detectado en G3 (vHVT307) solo 5 días después de la infección (pi).
[0176] En conclusión, este ejemplo ilustra adicionalmente la excelente protección contra ND inducida por el recombinante HVT-IBD ND doble o una combinación de los virus recombinantes SB1-ND o HVT-ND y HVT-IBD (vHVT13). Contrariamente a la creencia general en el campo de que una segunda vacuna de HVT (vacunas contra HVT regulares o vacunas contra HVT recombinantes) interfiere con la inmunidad a los genes extraños insertados en la primera vacuna contra HVT recombinante, la presente invención mostró el resultado sorprendente de que vHVT114 en combinación con vHVT13 ofreció una excelente protección contra el NDV y no se observó efecto de interferencia.
Ejemplo 11 Eficacia de vHVT306, vSB1-008 en combinación con vHVT13 administrado mediante SC o in ovo contra la exposición a la cepa Chimalhuacan de NDV (genotipo V) en D28 en pollos SPF
[0177] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia del HVT doble VHVT306 que expresa ambos genes de NDV F y Vp2 de IBDV, y el vSB1-008 SB1 recombinante que expresa el gen de NDV F en combinación con vHVT-IBD (vHVT13), administrados in ovo o por vía subcutánea contra la exposición a la enfermedad de Newcastle (Chimalhuacan, genotipo V) realizada a los 28 días de edad en pollos SPF.
[0178] Las características de estas dos vacunas candidas contra ND se describen en la tabla 14 (vSB1-008) y en la tabl 16 (vHVT306)
[0179] El diseño de los grupos se muestra en la Tabla 20. Se usaron sesenta huevos embrionarios SPF (después de aproximadamente 18 días y 18 horas de incubación; D-3) para la administración in ovo (20 por grupo para G1, G2 y G3). Se administraron cincuenta microlitros de vacuna que contenía 2000 UFP por vía in ovo utilizando el dispositivo IntelliLab System de AviTech LLC (Salisbury, MD, EE.UU.). La incubabilidad y la supervivencia se registraron después de la administración in ovo. En D0, 20 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 2 grupos de 10 aves (G4 y G5). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea (SC) en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp como se describe en la Tabla 20 a continuación. Diez aves por grupo se expusieron por vía intramuscular en D28 con 5,0 log 10 EID50 de cepa velogénica Chimalhuacan (genotipo V).
Tabla 20 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra ND
Grupo Vacuna a un día de de protección contra edad D0 Vía de admin. % de protección contra %
mortalidad morbilidad
G2 vHVT306 In ovo 100 % 100 %
G3 vSB1-008+vHVT 13 In ovo 78 % 68 %
G4 vHVT306 SC 100 % 100 %
G5 vSB1-008+vHVT 13 SC 100 % 70 %
[0180] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV se registraron después de la exposición. Se tomaron frotis orofaríngeos en los grupos vacunados a los 5 y 7 días después de la exposición para evaluar la carga viral mediante RT-PCR en tiempo real.
[0181] Se registró la incubabilidad completa y viabilidad hasta D28 (día de exposición) para las aves de los grupos G1 y G2. La incubabilidad en G3 fue del 85 % y un ave adicional murió después de la eclosión en este grupo. La menor incubabilidad de ese grupo puede deberse a problemas con la incubadora de huevos. Los pesos corporales de machos y hembras en G1, G2 y G3 fueron similares en D1 y en D28.
[0182] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla 20. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observó una muy buena protección en los 4 grupos vacunados, induciéndose una protección clínica completa por vHVT306 administrado por ambas vías.
[0183] Se muestra el porcentaje de aves positivas y el título promedio de propagación (expresado como log 10 EID50 equivalente por ml) en la Tabla 21. Se observó la ausencia de propagación detectable o muy baja en G2 y G4 vacunados con vHVT306. Los niveles de propagación detectados en los grupos vacunados con vSB1-008 vHVT13 fueron mayores, especialmente a los 5 días posteriores a la infección (pi).
Tabla 21 Resultados de la protección contra la propagación (porcentaje de aves con propagación detectable y carga ______________ viral media en log10) evaluados en D5 y D7 después de la exposición a NDV______________ Grupo Vacuna a un día de edad (D0) Vía de admin. Porcentaje de aves Carga viral media* positivas (D5/D7 pi) (D5/D7 pi) G2 vHVT306 In ovo 0/0 % 2,7/2,7
G3 vSB1-008+vHVT 13 In ovo 100/38 % 5,2/3,2
G4 vHVT306 SC 20/10 % 3,2/2,9
G5 vSB1-008+vHVT 13 SC 80/50 % 4,6/3,4
* Valor de PCR en tiempo real cuantitativo medio expresado en log10 EID50 equivalente; el umbral se establece en 2,7 log10.
[0184] En conclusión, este ejemplo muestra una excelente protección contra la ND inducida por el recombinante de doble HVT VHVT306 administrado in ovo o por SC. El rendimiento de vSB1-008 vHVT13 fue ligeramente inferior, especialmente después de la administración in ovo, pero puede deberse, al menos parcialmente, a problemas con la incubadora de huevos. De hecho, la prueba de seguridad in ovo de otro recombinante de SB1-ND (vSB1-009) a 1000 o 4000 UFP asociado con 6000 UFP de vHVT13 no mostró ninguna diferencia en la incubabilidad y la supervivencia temprana con un grupo que recibió 6000 UFP de vHVT13 solamente.
Ejemplo 12 Eficacia de vHVT304, vHVT306, vSB1-007 y vSB1-008 en combinación con vHVT13 frente a la exposición a la cepa de NDV Chimalhuacan (genotipo V) en D42 en pollos de engorde comerciales
[0185] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de dos HVT dobles (vHVT304 y vHVT306) que expresan ambos genes de NDV F y VP2 de IBDV, y dos recombinantes de SB1 (vSB1-007 y vSB 1-008) que expresan el gen de NDV F en combinación con vHVT-IBD (vHVT13) frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle (Chimalhuacan, genotipo V) realizada a los 42 días de edad en pollos de engorde comerciales.
[0186] Las características de estos 4 candidados de vacuna contra ND se indican en las tablas 14 y 16. El diseño de los grupos se muestra en la Tabla 22. En D0, 55 pollos de engorde comerciales de un día de edad se asignaron al azar a 5 grupos de 11 aves. A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea (SC) en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp como se describe en la Tabla 22 a continuación. Diez aves por grupo se expusieron por vía intramuscular en D42 con 5,0 log10 EID50 de la cepa velogénica Chimalhuacan (genotipo V).
Tabla 22 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra ND
Grupo Vacuna a un día de edad % de protección contra % de protección contra
(D0) mortalidad morbilidad
G1 vHVT13 0 % 0 %
G2 vHVT304 82 % 82 %
G4 vSB1-007+vHVT13 100 % 100 %
G5 vSB1-008+vHVT13 91 % 91 %
[0187] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV se registraron durante 14 días después de la exposición. Se tomaron frotis orofaríngeos en los grupos vacunados a los 5 y 7 días después de la exposición para evaluar la carga viral mediante RT-PCR en tiempo real.
[0188] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la tabla 22. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observó una muy buena protección en los 4 grupos vacunados, induciéndose una protección clínica completa inducida por vHVT306 y por vSB1-007+vHVT13.
[0189] Se muestra el porcentaje de aves positivas y el título promedio de propagación (expresado como log10 EID50 equivalente por ml) en la Tabla 23. La mejor reducción de propagación se indujo por vHVT306 y vSB1-007 vHVT13, que también fueron los mejores candidatos para la protección clínica.
Tabla 23 Resultados de la protección contra la propagación (porcentaje de aves con propagación detectable y carga _________ viral media en log10) evaluados en D5 y D7 después de la exposición a NDV (pi)_________ Grupo Vacuna a un día de edad (D0) Porcentaje de aves positivas Carga viral media*
(D5/D7 pi) (D5/D7 pi)
G2 vHVT304 100/100 % 5,4/4,6
G3 vHVT306 40/50 % 3,5/3,7
G4 vSB1-007+vHVT13 80/70 % 3,8/4,8
G5 vSB1-008+vHVT 13 100/100 % 4,8/4,3
* Valor de PCR en tiempo real cuantitativo medio expresado en log10 EID50 equivalente; el umbral se establece en 2,7 log10.
[0190] Se encontró que la protección de ND por vHVT306 era mejor que la de vHVT304. Estos dos dobles HVT contienen el mismo casete de expresión de NDV F pero insertado en dos loci diferentes, estando VP2 de IBDV insertado en la misma posición. Este ejemplo por tanto ilustra la importancia del locus de inserción en el diseño de recombinantes de HVT. El vSB1-007+vHVT13 fue mejor que vSB1-008+vHVT13. La estructura genómica de vSB1-007 difiere de la de vSB1-008 en diferentes aspectos: locus de inserción, promotor, señal de poliadenilación y origen del gen F. La combinación de estas secuencias exógenas y el locus de inserción en vSB 1-007 probablemente fueron responsables de su mejor rendimiento de protección contra ND.
[0191] En resumen, este ejemplo ilustra la importancia del locus de inserción y otras secuencias reguladoras del casete de expresión de NDV en la protección contra ND inducida por los vectores de HVT y MDV serotipo 2.
Ejemplo 13 Eficacia de HVT-ND+IBD doble (vHVT304 y vHVT306) o SB1-ND (vSB1-008) en combinación con vacunas recombinantes de vHVT13, frente a la exposición a un aislado de IBDV clásico en D14 en pollos SPF
[0192] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia temprana de IBD de los recombinantes dobles de HVT vHVT304 y vHVT306, así como de vHVT13 administrado conjuntamente con una construcción recombinante de SB1-ND (vSB1-008) frente a una exposición a virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa virulenta (vIBDV) (cepa Faragher 52/70) realizada a los 14 días de edad en pollos SPF.
[0193] Las características de los recombinantes dobles de HVT y SB1 utilizados en este estudio se muestran en las tablas 14 y 15.
[0194] En D0, 95 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 9 grupos de 10 aves y 1 grupo de 5 aves (grupo de control no expuesto sin vacunar). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 300 o 1000 ufp como se describe en la Tabla 24 a continuación. En D14, se extrajo una muestra de sangre de 5 aves por grupo para las pruebas serológicas con el Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). Las aves (10 aves por grupo, excepto para el grupo 7 en el que 1 ave murió antes de la exposición) se expusieron por gota ocular (0,05 ml por ave) a 2,5 log10 EID50.
Tabla 24 Diseño de estudio resultados de la eficacia contra IBD
Figure imgf000029_0002
[0195] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos de IBDV se registraron durante 11 días después de la exposición (de D15 a D25). Al final del periodo de observación posterior a la exposición (D33), todas las aves supervivientes se sacrificaron y se les realizó la autopsia. Se registró el peso corporal y de la bolsa. Cada bolsa de Fabricio (BF) se pesó y después se almacenó en recipientes individuales que contenían formaldehído al 4 % para histología. Las lesiones histológicas de la bolsa se puntuaron según la escala presentada en la Tabla 25.
Tabla 25 Escala de puntuación de las lesiones histológicas de la bolsa de Fabricio* Puntuación Observación histológica/lesiones
0 Sin lesión, bolsa normal
1 Del 1 % al 25 % de los folículos muestran agotamiento linfoide (es decir, menos del 50
% de agotamiento en 1 folículo afectado), afluencia de heterófilos en las lesiones
Del 26 % al 50 % de los folículos muestran un agotamiento linfoide casi completo (es
2 decir, más del 75 % de agotamiento en 1 folículo afectado), los folículos afectados muestran necrosis y se puede detectar una afluencia grave de heterófilos
3 Del 51 % al 75 % de los folículos muestran agotamiento linfoide; los folículos afectados
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muestran lesiones de necrosis y se detecta una afluencia grave de heterófilos
Del 76 % al 100 % de los folículos muestran un agotamiento linfoide casi completo; se
4 detectan hiperplasia y estructuras quísticas; los folículos afectados muestran necrosis y
se detecta una afluencia grave de heterófilos
El 100 % de los folículos muestran un agotamiento linfoide casi completo; pérdida
5 completa de la estructura folicular; epitelio engrosado y plegado; fibrosis del tejido de la bolsa
* Fuente: Monografía N.° 01/2008: 0587 de la Farmacopea de la UE "Avian Infectious Bursal Disease vaccine (live)
[0196] Se consideró que un ave estaba afectada si moría y/o mostraba signos notables de enfermedad y/o lesiones graves de la bolsa de Fabricio (es decir, puntuación histológica <3).
[0197] El título de anticuerpos contra IBD+ por ELISA medio expresado en log10 antes de la exposición se muestra en la Tabla 24. Se detectaron títulos significativos en todos los grupos vacunados que fueron significativamente más altos que los del grupo de control G1. El título de serología no fue dependiente de la dosis.
[0198] Se observaron signos clínicos graves después de la exposición en todas las aves del grupo de control G1. Siete de 10 aves de ese grupo murieron dentro del periodo de observación de 11 días, lo que indica la gran gravedad de la exposición. Ninguna de las aves vacunadas mostró signos clínicos graves después de la exposición, excepto un ave de G4 que murió. Los porcentajes de protección contra lesiones graves de la bolsa se muestran en la tabla anterior. Se observó una protección significativa contra la IBD en todos los grupos, observándose la mejor protección en G2 y G3 (vHVT13 en solitario). La administración conjunta de vSB1-008 vHVT13 y las construcciones dobles de vHVT304 y vHVT306 indujeron niveles similares de protección contra IBD. La protección no fue dependiente de la dosis en las dosis probadas. Las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo también se muestran en la Tabla 24. Las relaciones en todos los grupos vacunados fueron más altas que las del grupo de control expuesto.
[0199] En conclusión, estos datos indican que la combinación de un vector SB1-ND con un HVT-IBD individual o HVT doble que expresa tanto NDV-F como IBDV-VP2 inducen anticuerpos contra IBD y una protección temprana contra IBD en un modelo de exposición a IBDV grave.
Ejemplo 14 Eficacia de HVT-ND individual (vHVT114) o SB1-ND (vSB1-007 y vSB1-009) en combinación con vacunas recombinantes de vHVT13, frente a la exposición a un aislado de IBDv muy virulento en D23 en pollos de engorde comerciales
[0200] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia contra IBD de vHVT13 administrado conjuntamente con una construcción recombinante de HVT-ND (vHVT114) o de SB1-ND (vSB1-007 y vSB 1-009) frente a una exposición al virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa muy virulento (wIBDV) (91-168/980702) realizada a los 23 días de edad en pollos de engorde comerciales.
[0201] Las características de estos 4 candidatos de vacuna se describen en las tablas 14 y 16. En D0, 90 pollos de engorde de un día de edad se asignaron al azar a 7 grupos de 12 aves y 1 grupo de 6 aves (grupo de control no expuesto sin vacunar). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D0 0,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 3000 ufp como se describe en la Tabla 26. En D14, se extrajo una muestra de sangre de 5 aves por grupo para las pruebas serológicas con el Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). El suero de 10 pollos de engorde de un día adicionales se ensayó en D0 con el mismo kit para evaluar el nivel de anticuerpos maternos contra IBDV. Las aves (10 aves por grupo) se expusieron por gota ocular (0,05 ml por ave) en D23 con 4,3 log10 EID50 del aislado vvIBDV 91-168.
[0202] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos de IBDV se registraron durante 11 días después de la exposición (de D23 a D33). Al final del periodo de observación posterior a la exposición (D33), todas las aves supervivientes se sacrificaron y se les realizó la autopsia. Se registró el peso corporal y de la bolsa. Cada bolsa de Fabricio (BF) se pesó y después se almacenó en recipientes individuales que contenían formaldehído al 4 % para histología. Las lesiones histológicas de la bolsa se puntuaron según la escala presentada en la Tabla 25.
[0203] Se consideró que un ave estaba afectada si moría y/o mostraba signos notables de enfermedad y/o lesiones graves de la bolsa de Fabricio (es decir, puntuación histológica <3).
Tabla 26 Diseño del estudio y resultados serológicos
Grupo Vacuna a un día de edad (D0) Título de IBD+ ELISA en D23, Relación so media de la bo e
l n
sa p
/ e
cuerpo2
G1 - 3,9 0,0007
G2 vHVT13 4,0 0,0015
G3 vHVT114+vHVT13 4,1 0,0015
G4 vSBI-007+vHVT13 3,8 0,0018
G5 vSBI-009+vHVT13 4,0 0,0019
1 Títulos de IBD+ ELISA medios expresados en log10 en el suero de 5 aves por grupo muestreadas en D23 antes de la exposición;
2 La relación en peso de la bolsa/cuerpo del grupo no vacunado/no expuesto fue de 0,0047
[0204] El título serológico medio de IBD+ por ELISA en D0 fue de 4,36 ± 0,01 log10, lo que indica un nivel muy alto de anticuerpos maternos contra IBD en la eclosión. En D23, el título medio de IBD+ por ELISA todavía era alto (3,9) en el control G1. Los títulos medios por ELISA en los grupos vacunados no fueron significativamente diferentes de los del grupo control.
[0205] No se observó morbilidad ni mortalidad en ninguno de los grupos después de la exposición. Los porcentajes de protección contra lesiones graves de la bolsa se muestran en la Tabla 26 anterior. El resultado mostró que la administración conjunta de vHVT114, vSB 1-007 o vSB1-009 no interfirió con la protección contra IBD inducida por vHVT13, lo que indica una falta de interferencia. De manera similar, las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo de los grupos vacunados fueron similares y claramente más altas que las del grupo de control, lo que indica protección contra IBD y ninguna diferencia entre los regímenes de vacunación.
[0206] En conclusión, los datos indican la compatibilidad entre vHVT114, vSB1-007 o vSB 1-009 y vHVT13 para la protección contra IBD. La falta de interferencia entre los dos vectores HVT para la protección contra IBD fue de nuevo sorprendente y confirmó los resultados observados para la protección contra ND (véase el ejemplo 10),
Ejemplo 15 Eficacia de HVT-ND+IBD doble (vHVT304 y vHVT306) asociado o no con SB-1 y de SB1-ND (vSB1-007 y vSB1-008) en combinación con vacunas recombinantes de vHVT13, frente a la exposición a un aislado de IBDV de variante E en D28 en pollos SPF
[0207] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de dos HVT dobles (HVT-ND+IBD: vHVT304 y vHVT306) o dos vSB-1-NDV en combinación con las vacunas vectorizadas vHVT13 (vSB1-007+vHVT13, vSB1-008+vHVT13) administradas por vía subcutánea (SC) a pollos SPF de un día de edad y expuestos a la variante de IBDV (VAR-E) 28 días después de la vacunación.
[0208] En D0, 105 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 7 grupos de 15 aves, incluido un grupo de controles expuestos (G6) y controles no expuestos (G7). A las aves de los grupos G1 a G5 se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D0 0,2 ml de vacunas recombinantes y/o SB-1, conteniendo cada una dosis objetivo de 2000 ufp. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 27 a continuación. En D28, todas las aves de los grupos G1 a G6 se expusieron por gota ocular (0,03 ml que contenía 3 log10 EID50 por ave) del aislado de variante E del IBDV de la Universidad de Delaware (EE.UU.). Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Once días después de la exposición, las aves se pesaron y se les realizó la autopsia. Las bolsas se recogieron y se pesaron. Se calculó la relación en peso de la bolsa/cuerpo (relación en peso de la bolsa/cuerpo x 100).
Tabla 27 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra IBD
Grupo Vacuna a un día de edad Relación media en peso de la bolsa/cuerpo (*100) G1 vHVT304 0,33
G2 vHVT304+SB-1 0,33
G3 vHVT306 0,29
G4 vHVT 13+vSB1-007 0,49
G5 vHVT13+vSB1-008 0,47
G6 -(con exposición) 0,13
G7 -(sin exposición) 0,46
[0209] Las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo se muestran en la Tabla 27. Las aves de control expuestas tuvieron una atrofia de la bolsa grave en comparación con las no expuestas. Las vacunas de vSB1-007 y vSB 1-008 no interfirieron en la protección inducida por vHVT13 (G4 y G5). Las relaciones en peso de la bolsa/cuerpo de las aves vacunadas con hVt doble (HVT-ND IBD) fueron ligeramente más bajas que el grupo de control no expuesto, pero fueron claramente más altas que los grupos de control expuestos. Además, la vacuna contra la enfermedad de Marek SB-1 serotipo 2 no interfirió con la protección contra IBD inducida por vHVT304.
[0210] En conclusión, estos datos indican que la combinación de un vector SB1-ND con HVT-IBD individual o HVT doble que expresa tanto NDV-F como IBDV-VP2 inducen protección contra IBD en un modelo de exposición a IBDV de variante E.
Ejemplo 16 Falta de interferencia de vHVT114, vSB1-009 y/o SB-1 en la protección contra IBD de variante E inducida por vHVT13 en pollos SPF
[0211] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia contra IBD de vHVT13 cuando se administró por SC o in ovo de forma concomitante con vHVT114, vSB 1-009 y/o SB-1 en pollos SPF en una variante de IBDV (VAR-E) en el modelo de exposición de D28.
[0212] 75 pollos SPF de un día de edad y 75 embriones de pollo SPF de 18 a 19 días de edad se asignaron al azar a 5 grupos (G1 a G5 y G6 a G10, respectivamente) incluyendo un grupo de controles expuestos (G4 y G9, respectivamente) y controles no expuestos (G5 y G10, respectivamente). A las aves de los grupos G1 a G3 se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas cada una conteniendo una dosis objetivo de 3000 ufp, excepto para SB-1 que tenía una dosis objetivo de 1000 UFP. Las aves de G6 a G8 recibieron las mismas dosis de vacuna pero en un volumen de 0,05 ml mediante la vía in ovo 2-3 días antes de la eclosión. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 28 a continuación. A los 28 días de edad, todas las aves de los grupos G1 a G4 y G6 a G9 se expusieron por gota ocular (0,03 ml que contenía 3 log10 EID50 por ave) del aislado de variante E del IBDV de la Universidad de Delaware (EE.UU.). Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Once días después de la exposición, las aves se pesaron y se les realizó la autopsia. Las bolsas se recogieron y se pesaron. Se calculó la relación en peso de la bolsa/cuerpo (relación en peso de la bolsa/cuerpo x 100).
Tabla 28 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra IBD
Grupo Vacuna a un día de edad Vía de administración Relación media en peso de la bolsa/cuerpo (*100)
G1 vHVT13+vHVT114+SB-1 SC 0,56
G2 vHVT13+vHVT114+vSB1-009 SC 0,58
G3 vHVT13+vSB1-009 SC 0,52
G4 -(con exposición) SC 0,13
G5 -(sin exposición) SC 0,51
G6 vHVT13+vHVT114+SB-1 In ovo 0,54
G7 vHVT13+vHVT114+vSB1-009 In ovo 0,47
G8 vHVT13+vSB1-009 In ovo 0,53
G9 -(con exposición) In ovo 0,14
G10 -(sin exposición) In ovo 0,58
[0213] Las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo se muestran en la Tabla 28. Las aves de control expuestas (G4 y G9) tuvieron una atrofia de la bolsa grave en comparación con las no expuestas. Las relaciones en peso de la bolsa/cuerpo de los grupos vacunados (G1 a G3 y G6 a G8) fueron similares a las de los grupos de control no expuestos (G5 y G10) y muy por encima de las de los grupos de control expuestos (G4 y G9). La falta de interferencia de vHVT114 en la protección contra IBD inducida por vHVT 13 después de las vías s C o in ovo fue sorprendente y confirmó los datos obtenidos en los ejemplos 10 y 14.
[0214] En conclusión, estos datos indican claramente la compatibilidad de vHVT114 vSB1-009 o SB-1 y vSB 1­ 009 con vHVT13 cuando se administran por vía SC o in ovo en un modelo de exposición a IBDV de variante E.
Ejemplo 17 Eficacia de vectores vHVT114 y vHVT13 y SB1 o vSB1-009 frente a una exposición a la enfermedad de Marek mucho más virulenta
[0215] El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia de la enfermedad de Marek inducida por diferentes combinaciones de vacunas, incluidas vHVT114, vHVT13, SB-1 y/o vSB1-009 administradas por vía SC a pollos SPF de un día de edad y expuestos 4 días después al aislado de T-King del virus de la enfermedad de Marek mucho más virulento (vv MDV).
[0216] En D0, 100 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 5 grupos de 20 aves. A las aves de los grupos 1 a 3 se les inyectaron mediante inyección subcutánea en el cuello en DO 0,2 ml de vacunas que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp para cada vacuna, excepto para SB-1 para el cual la dosis objetivo era de 1000 ufp. Las aves de los grupos 4 y 5 no fueron vacunadas y se usaron como controles simulados expuestos (grupo 4) o no expuestos (grupo 5). El diseño del estudio se muestra en la Tabla 29. En D4, todas las aves de los grupos 1 a 4 se expusieron a 0,2 ml del aislado de Vv MDV T-King utilizando la vía de administración intraperitoneal.
Tabla 29 Diseño del estudio y resultados de la protección contra MD
Grupo Vacuna a un día de edad (D0) Número de positivos a MD/total Porcentaje de protección G1 vHVT13+SB-1 7/20 65 %
G2 vHVT114+SB-1 7/20 65 %
G3 vHVT13+vHVT114+vSB1-009 7/20 65 %
G4 -(con exposición) 20/20 0 %
G5 -(sin exposición) 0/20 100 %
[0217] Cada grupo se controló diariamente para detectar cualquier reacción desfavorable antes y después de la exposición. El día 49, todas las aves vivas se sacrificaron y se sometieron a una autopsia para examinar lesiones macroscópicas asociadas con la enfermedad de Marek. Los pollos se clasificaron como positivos para la infección con la enfermedad de Marek si se observaron signos nerviosos, tales como parálisis, signos del sistema locomotor atribuibles a la enfermedad, y emaciación grave o depresión, si se produce una mortalidad directamente atribuible a la enfermedad de Marek, o si se observan lesiones macroscópicas en la autopsia. Las lesiones pueden incluir, pero sin limitación, las siguientes: lesiones en el hígado, corazón, bazo, gónadas, riñones y lesiones musculares
[0218] Los resultados de protección se muestran en la Tabla 29 anterior. Todos los grupos vacunados (G1 a G3) actuaron por igual, lo que indujo una protección parcial (65 %) contra MD como se esperaba en este modelo de exposición muy grave y temprana. Estos resultados indicaron que las vacunas vectoriales candidatas conservan su capacidad de protección contra la enfermedad de Marek.
Ejemplo 18 Eficacia de los vectores HVT y SB1 recombinantes contra la enfermedad de Marek
[0219] La eficacia contra la enfermedad de Marek se demuestra también para los recombinantes vectorizados de HVT y los recombinantes vectorizados de SB-1, ya sean solos o en combinación. Las cepas de exposición incluyen una exposición a enfermedad de Marek (vMD) virulenta, tales como GA22, una exposición a enfermedad de Marek muy virulenta (vvMD), tal como R1B y/o exposición a enfermedad de Marek mucho más virulenta (vv+MD), tal como el virus T. King. Pollos de un día de edad se inoculan por vía subcutánea o huevos embrionados de 18-19 días de edad se inoculan con una dosis de 0,2 ml o 0,05 ml de dosis, respectivamente, de los virus de prueba. A los cinco días de edad los pollos vacunados y los controles no tratados previamente son expuestos con el virus de la exposición de Marek relevante (v, vv, o vv+MDV). Las aves expuestas se observan hasta siete semanas de edad. Todas las aves se terminan y se practica la necropsia para observar las lesiones macroscópicas asociadas con la enfermedad de Marek, tal como se describe en el Ejemplo 17.
Ejemplo 19 La interferencia de HVT en anticuerpos de IBDV inducida por vHVT13 en gallinas comerciales
[0220] El objetivo de este estudio fue determinar si la coadministración de HVT con vHVT13 tuvo un impacto en la respuesta de anticuerpos contra IBDV inducida por vHVT13 en gallinas comerciales.
[0221] Se utilizaron gallinas marrones de ochenta días de edad comerciales en tres unidades de aislamiento. A quince se tomaron sangre en el día D para probar anticuerpos derivados de la madre con IBD (MDA). Las aves restantes se dividieron en tres grupos, tal como se muestra en la Tabla 30. Las aves del grupo 2 y 3 fueron vacunadas por vía SC en la nuca del cuello con dosis comerciales de vHVT13 (VAXXITEK HVT IBD; Merial SAS, Lyon, Francia) y/o Bio HVT asociados a células HVT (Merial SpA, Noventa, Italia). El muestreo de sangre se realizó a la edad de 25, 35 y 45 días de edad. El kit de ELISA usado para evaluar la respuesta serológica a IBDV fue el kit de ELISA PROFLOK PLUS IBD (IBD+) Ab de Synbiotics (Synbiotics Corp., Kansas City, MO, EE.UU.).
Tabla 30 Estudio de diseño y resultados de serología
Grupo Vacuna en el día Título de ELISA Título de ELISA Título de ELISA Título de ELISA _____________________ (D0)_____________ D1______________D25_____________ D35_____________ D45 G1_____________ -_________________10.502_________ 7.814____________6.237____________3.664_________ G2_____________ vHVT13___________10.502_________ 8.023____________9.360____________9.486_________ G3 vHVT13 HVT 10.502 6.896 4.763 3.795
[0222] Los títulos promedio de ELISA se muestran en la Tabla 30. Los títulos en el grupo no vacunado G1 disminuyeron de D1 a D45, que correspondía a la disminución de los anticuerpos maternos contra IBDV. Como se esperaba; los títulos de ELISA en el grupo con vHVT13 G2 siguen siendo alta hasta D45, lo que indica que los anticuerpos maternos se sustituyeron progresivamente por anticuerpos inducidos por vHVT13. La adición de HVT a vHVT13 tuvo un impacto negativo claro, ya que los títulos de anticuerpos observados en G3 fueron similares a G1. Estos resultados contrastan con los obtenidos con vHVT114 vHVT13, ya que vHVT114 no disminuyó los títulos de IBD ELISA inducidas por vHVT13 (véase el ejemplo 14, Tabla 26). Confirman la propiedad inesperada de vHVT114 en que no interfiere con la inmunogenicidad de vHVT13.
[0223] En conclusión, a diferencia de lo observado con vHVT114, la adición de HVT a vHVT13 tuvo un impacto negativo evidente en inmunidad humoral IBDV inducida por vHVT13.
Ejemplo 20 La interferencia de HVT-ND comrcial en la protección de IBD inducida por vHVT13
[0224] El objetivo de este estudio fue determinar si la administración conjunta de vacunas de vector HVT-ND comerciales con vHVT13 tuvo un impacto en la protección de IBD inducida por vHVT13 en pollos SPF.
[0225] Se vacunaron setenta y cinco pollos SPF (3 grupos (G2, G3 y G4) de 25) en un día de edad por la vía SC con una dosis comercial de vHVT13 (VAXXITEK HVT IBD) con o sin una dosis comercial de la vacuna contra ND vectorizada con HVT con licencia (vHVT-ND1 y vHVT-ND2), tal como se muestra en la Tabla 31. Quince aves se mantuvieron como controles no vacunados (G1). Tres semanas después de la vacunación, las aves (20 pollos en G2, G3 y G4 y 10 pollos en G1) fueron expuestos con al menos 2,0 log10 EID50 en 0,05 ml de cepa Ph/B1 de virus IBD (aislado en Filipinas) administrado por vía ocular. Se observaron todos los pollos durante 5 días en busca de signos clínicos o muerte por causas atribuibles a la exposición al virus de IBD y se sacrificaron humanitariamente al final de la observación post-exposición para examen de la necropsia de lesión por IBD, especialmente de la bolsa de Fabricio. Se consideraron las aves como protegidas si su bolsa no mostraba lesiones de la bolsa típicas de IBD: atrofia bursal, edema peri-bursa y/o hemorragias en tejidos de la bolsa.
Tabla 31 Diseño del estudio y datos de protección frente a IBD
Grupo Vacuna en el día (D0) Número de Número de bolsas Porcentaje de enfermas positivas/total protección (muertas)/total
G1 - 10(8)/10 10/10 0% G2 vHVT 13+vHVT-ND1 3(3)/20 9/20 55% G3 vHVT 13+vHVT-ND2 3(1)/20 7/20 65% G4 vHVT13 0(0)/20 0/20 100%
[0226] Los resultados se muestran en la Tabla 31. Todas las 10 aves de control expuestas mostraron signos clínicos y 8 de 10 murieron 4 o 5 dpi, lo que indica que la exposición a IBDV fue muy severa. Todas ellas tenían lesiones graves de la bursa incluyendo atrofia severa y manchas hemorrágicas. El vHVT13 solo indujo una protección completa, mientras que ambas combinaciones con vHVT-ND indujeron protección parcial clínica y bursal.
[0227] En conclusión, estos resultados indican claramente que los 2 vacunas contra ND vectorizadas con HVT comerciales interfieren con la protección frente a IBD inducida por vHVT13.
Ejemplo 21 Eficacia de la vacuna de ND vectorizada con vSB1-004, vSB1-006, vSB1-007, vSB1-008, SB1 en solitario o en asociación con la vacuna contra IBD vectorizada con HVT vHVT13, y las vacunas vHVT302 y vHVT304 frente a exposición a la cepa de NDV Texas GB a los 14 y/o 28 días de edad en pollos SPF
[0228] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de combinaciones de diferentes vacunas vectoriales de la enfermedad de Marek que expresan el gen de NDV F y/o el gen VP2 de IBDV contra la exposición a la enfermedad de Newcastle (cepa Texas GB, genotipo II) realizada a los 14 y/o 28 días de edad en pollos SPF.
[0229] Las características de las 6 vacunas recombinantes candidatas contra NDV probadas en este estudio se describen en la Tabla 32 a continuación.
Tabl a 2 r rí i l v n r m in n n i nr NDV r n i
Figure imgf000034_0002
[0230] En D0, 225 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 9 grupos de 15 aves (G1a a G9a expuestos en D14) y 6 grupos de 15 aves (G1b, G3b, G4b, G5b, G8b, G9b expuestos en D28). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D0 0,2 ml que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp para vacunas recombinantes. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 33 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D14 o D28 a 4,3 y 4,2 log10 EID50 (0,1 ml) de la cepa velogénica ND Texas GB (genotipo II), respectivamente.
Tabla 33 Resultados de eficacia contra ND
protección contra ND después % de protección contra ND Grupo Vacuna a un e
d a de % d
edad (D0 í de la exposición a ND a los 14 días después de la exposición a ND a)
de edad los 28 días de edad
G1a y 1b - 0 % 0 %
G2a vSB1-004 20 % ND*
G3a y 3b vSB1-006 26,6 % 73,3 %
G4a y 4b vSB1-007 33,3 % 93,3 %
G5a y 5b vSB1-008 46,6 %
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86,6 %
G6a vSB1-006+vHVT 13 14 % ND
G7a vSB1-008+vHVT 13 21,4 % ND
G8a y 8b vHVT302 13,3 % 80 %
G9a y 9b vHVT304 33,3 % 93,3 %
*ND = no realizado
[0231] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Se registraron los signos clínicos del NDV después de la exposición. Un ave murió en G6 y G7 antes de la exposición, lo que redujo el número de aves de 15 a 14 en estos grupos.
[0232] Los porcentajes de protección clínica (incluida la protección contra la mortalidad y la morbilidad) se indican en la Tabla 33 anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1a y G1b, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Se observaron protecciones parciales que variaban del 13,3 al 46,6 % después de la exposición en D14, induciéndose los niveles más altos de protección por vSB1-008, vSB1-007 y vHVT304. Los niveles de protección después de la exposición a ND en D28 fueron mucho más altos para todos los grupos vacunados y fueron de nuevo ligeramente más altos en los grupos vacunados con vSB1-008, vSB1-007 o vHVT304. Estos resultados indicaron que los niveles de protección contra ND dependían de la fecha de la exposición y de la construcción. Las construcciones vSB 1-008 y vSB1-007 actuaron ligeramente mejor que vSB 1-004 y vSB 1-006, y vHVT304 actuó ligeramente mejor que vHVT302, lo que indica que las diferentes características de las construcciones desempeñan un papel en la acción de las vacunas vectoriales basadas en MDV.
[0233] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron que los niveles de protección contra ND inducidos por los vectores de la enfermedad de Marek que expresan el gen NDV F pueden depender de diferentes parámetros incluyendo el vector, el locus de inserción, el gen F, el promotor, el sitio de poliadenilación y las condiciones de exposición.
Ejemplo 22 Eficacia de las vacunas dobles HVT-ND+IBD vHVT304 y vHVT306 frente a exposición a la cepa de NDV Texas GB a los 14 y/o 28 días de edad en pollos SPF
[0234] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de la vacuna vectorizada con HVT que expresa ambos genes NDV F y VP2 de IBDV frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle (cepa Texas GB, genotipo II) realizada a los 14 y/o 28 días de edad en pollos SPF.
[0235] Las características de las 2 vacunas recombinantes candidatas probadas en este estudio se describen en la Tabla 34 a continuación.
Tabla 34 Características de las vacunas recombinantes candidatas utilizadas en este estudio
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[0236] En D0, 90 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 3 grupos de 15 aves (G1a a G3a expuestos en D14) y 3 grupos de 15 aves (G1b a G3b expuestos en D28). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp para vacunas recombinantes. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 35 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D14 o D28 a una dosis objetivo de 4,0 log10 EID50 (0,1 ml) de la cepa velogénica ND Texas GB (genotipo II).
Tabla 35 Resultados de eficacia contra ND
% de protección contra ND Grupo Vacuna a un día de edad (D0) ND después de la % de protección contra exposición a ND a los 14 después de la exposición a ND a días de edad los 28 días de edad
G1a y 1b - 0 % 0 %
G2a y 2b vHVT304 26,7 % 92,9 %
G3a y 3b vHVT306 33,3 % 86,7 %
[0237] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Se registraron los signos clínicos del NDV después de la exposición. Un ave murió en G2b antes de la exposición, lo que redujo el número de aves de 15 a 14 en este grupo.
[0238] Los porcentajes de protección clínica (incluida la protección contra la mortalidad y la morbilidad) se indican en la Tabla 35 anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1a y G1b, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Los niveles de protección después de la exposición en D14 fueron mucho más bajos que los obtenidos después de la exposición en D28. Estas vacunas candidatas tenían el mismo casete de expresión de NDV F insertado en 2 loci diferentes del genoma de vHVT13. Actuaron de igual manera en términos de protección contra ND en las condiciones ensayadas, lo que indica que ambos loci de inserción (IG2 y SORF3-US2) son igualmente adecuados para la inserción del casete de NDV F.
[0239] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron que los niveles de protección contra ND inducidos por los vectores de la enfermedad de Marek que expresan el gen de NDV F dependen de diferentes parámetros incluyendo el vector, el locus de inserción, el gen F, el promotor, el sitio de poliadenilación y las condiciones de exposición.
Ejemplo 23 Eficacia temprana contra ND inducida por HVT-ND+IBD doble (vHVT302, vHVT303, y vHVT304) o vectores SB1 (vSB1-006 y vSB1-007) en pollos SPF de un día de edad frente a una exposición a n Dv velogénico del genotipo V
[0240] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres vectores HVT-ND+IBD dobles (vHVT302, vHVT303, y vHVT304) y dos vectores SB1-ND (vSB1-006 y vSB1-007) en pollos SPF de un día de edad frente a una exposición velogénica a NDV del genotipo V (Chimalhuacan) realizada en D14.
[0241] Las características de las 5 vacunas recombinantes candidatas probadas en este estudio se describen en la Tabla 36 a continuación.
Tabla 36 Características de las vacunas recombinantes candidatas utilizadas en este estudio
Figure imgf000035_0001
_____ _____
[0242] Se constituyeron aleatoriamente seis grupos (1 y 2) de diez pollos Leghorn blancos libres de patógenos específicos (SPF) de un día de edad. Las aves de los grupos 2 a 6 se vacunaron por vía subcutánea (nuca) con una dosis objetivo de 2000 UFP como se muestra en la Tabla 37 a continuación. Los pollos del grupo 1 no fueron vacunados y se mantuvieron como aves de control. A las 2 semanas de edad, todas las aves se expusieron a la cepa velogénica de NDV Mexican Chimalhuacan del genotipo V (Mex V). La exposición se realizó por vía intramuscular (IM) utilizando 105 dosis 50 infecciosas de embrión (EID50) diluidas en 0,2 ml de agua fisiológica estéril. Todas las aves se controlaron hasta 14 días después de la exposición. Después de la exposición, el estado de salud de cada ave se calificó diariamente de la siguiente manera: sana/con síntomas específicos (plumas erizadas, postración, tortícolis, temblor)/muerta. Para el cálculo de la morbilidad se tuvo en cuenta cualquier ave que presentara síntomas específicos durante más de 2 días o que se notara enferma en D28.
Tabla 37 Resultados de la protección temprana contra la ND inducida por diferentes candidatos vectorizados con MDV f
Figure imgf000036_0001
[0243] Los resultados de la protección se resumen en la Tabla 37. Todas las aves de control murieron después de la exposición a ND. Los niveles variables de protección contra ND se indujeron por las diferentes vacunas ensayadas que variaron del 10 % al 80 % y del 0 % al 60 % en términos de protección contra la mortalidad y la morbilidad, respectivamente. El candidato vHVT304 indujo una mejor protección que los candidatos vHVT303 y vHVT302; esto puede deberse a que el promotor de SV40 exógeno se coloca frente al gen de NDV F. El vSB1-007 actuó ligeramente mejor que el vSB1-006. Además, los rendimientos obtenidos con vHVT304 fueron comparables a los obtenidos con vSB1-007, lo que indica que diferentes vectores de la enfermedad de Marek pueden alcanzar el mismo nivel de protección contra ND.
[0244] En conclusión, este estudio demuestra que ambas vacunas vectorizadas dobles HVT-ND IBD y SB1-ND pueden alcanzar niveles significativos de protección contra ND en un modelo muy grave y temprano de exposición a NDV.
Ejemplo 24 Eficacia contra ND inducida por vHVT306 doble HVT-ND IBD administrado mediante vía in ovo o SC a pollos SPF de un día de edad frente a una exposición velogénica a NDV del genotipo V realizada en D28
[0245] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de un HVT-ND+IBD doble (vHVT306) administrado mediante la vía in ovo o SC a pollos SPF frente a una exposición velogénica a NDV del genotipo V (Chimalhuacan) realizada a los 28 días de edad.
[0246] Las características de la vacuna recombinante vHVT306 candidata ensayada en este estudio se describen en la Tabla 38 a continuación. La vacuna del vector HVT-IBD indivdual vHVT13 se usó como control.
Tabla 38 Características de la vacuna recombinante candidata utilizada en este estudio
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[0247] El día -3, se asignaron al azar 40 huevos embrionarios SPF de aproximadamente 18 días y 18 horas de incubación a 2 grupos de 20 huevos cada uno. En D0, se añadió un grupo de pollos SPF de 12 días de edad. La definición de grupos se proporciona en la Tabla 39 a continuación. La vacunación se realizó en D-3 (in ovo) o en D0 (vía SC, en la nuca) y la dosis objectivo de vHVT306 y vHVT13 fue de 2000 UFP/ave. Para la vía in ovo, se controlaron la incubabilidad, la viabilidad (hasta D28) y el crecimiento de las aves (entre la incubación y D28).
[0248] En D28, 10 aves por grupo se expusieron a la cepa virulenta de ND Chimalhuacan. La exposición se realizó por vía intramuscular (IM) utilizando 105 dosis 50 infecciosas de embrión (EID50) diluidas en 0,2 ml de agua fisiológica estéril. Las aves se controlaron hasta 14 días después de la exposición. Se registraron signos clínicos específicos y la mortalidad. Para el cálculo de la morbilidad se tuvo en cuenta cualquier ave que presentara síntomas específicos durante más de 2 días o que se notara enferma en D42. Cinco y siete días después de la exposición (es decir, en D33 y D35), se tomó un frotis orofaríngeo de cada ave superviviente. Todos los frotis se analizaron mediante qVR-PCR de NDV específica.
Tabla 39 Resultados de la protección contra ND inducida por el candidato vectorizado vHVT306 MDV que expresa los n NDV F VP2 IBDV mini r r l ví in v n ll PF
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000037_0004
[0249] Se registró la incubabilidad total después de la vacunación in ovo en los grupos 1 y 2 y todas las aves incubadas sobrevivieron hasta D28. No se detectaron diferencias en el peso corporal entre los dos grupos, tanto en D0 como en D28, lo que confirma la seguridad perfecta de vHVT306 cuando se administra in ovo. Los resultados de la protección se resumen en la Tabla 39. Todas las aves de control vacunadas con vHVT13 murieron 4 días después de la exposición a ND. La protección clínica completa contra ND se indujo por vHVT306 administrado por ambas vías. Además, no se detectó propagación después de la administración in ovo, mientras que solo algunas aves propagaron una cantidad detectable de virus de exposición después de la administración de SC.
[0250] En conclusión, este estudio demuestra que el vHVT306 doble HVT-ND IBD induce un excelente nivel de protección contra ND por las vías de administración SC o in ovo en un modelo de exposición a NDV heterólogo muy grave.
Ejemplo 25 Eficacia de vacunas recombinantes dobles de HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303 y vHVT304), frente a la exposición a un aislado de IBDV clásico en D15 en pollos SPF
[0251] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia temprana contra IBD de construcciones de recombinantes dobles de HVT vHVT302, vHVT303 y vHVT304 frente a una exposición al virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa virulenta (vIBDV) (cepa Faragher 52/70) realizada a los 15 días de edad en pollos SPF.
[0252] Las características de las 3 vacunas recombinantes candidatas dobles de HVT-ND+IBD en este estudio se describen en la Tabla 40 a continuación.
Tabl HVT
Figure imgf000037_0005
[0253] En D0, 40 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar en 4 grupos de 10 aves, incluido un grupo de control (G1) que se vacunó con vSB 1-004, un vector SB-1 que expresa el gen de NDV F. Otras cinco aves SPF se mantuvieron sin vacunar y no se expusieron para determinar la evaluación del peso de la bolsa/cuerpo. A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 2000 ufp como se describe en la Tabla 41 a continuación. En D15, se extrajo una muestra de sangre de todas las aves por grupo (10 aves por grupo, excepto para los grupos 1 y 3 en los que 1 ave murió antes de la muestra de sangre) para las pruebas serológicas con el Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). En D15, las aves de los 4 grupos se expusieron por gota ocular (0,05 ml por ave) con 2,5 log10 EID50.
Tabla 41 Diseño de estudio y resultados de la eficacia contra IBD
Número de % d Relación en peso Grupo Vacu
d n
e a
e a
da u
d n día Título por
ELISA de IBD+ m uertes/enfermas eió ,n22 media de la (log10) (total)1 pro %tecc bolsa/cuerpo 44 G1 vSB 1-004 0,25 1/9 9 0 % 0,0014
G2 vHVT302 2,6 0,0043
Figure imgf000037_0001
G3 vHVT303
Figure imgf000037_0003
3,0
Figure imgf000037_0002
0,0053
G4 vHVT304 2,4 0/0 (10) 80 % 0,0034
1 Las aves enfermas durante más de 2 días o todavía enfermas en D25 se consideraron enfermas. El número entre paréntesis es el número total de aves en el grupo que se expusieron.
2 Protección contra signos clínicos y lesión grave de la bolsa (puntuación de la bolsa <3)
4 La relación en peso de la bolsa/cuerpo del grupo no vacunado/no expuesto fue de 0,0043.
[0254] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos de IBDV se registraron durante 11 días después de la exposición (de D15 a D25). Al final del periodo de observación posterior a la exposición (D25), todas las aves supervivientes se sacrificaron y se les realizó la autopsia. Se registró el peso corporal y de la bolsa. Cada bolsa de Fabricio (BF) se pesó y después se almacenó en recipientes individuales que contenían formaldehído al 4 % para histología. Las lesiones histológicas de la bolsa se puntuaron según la escala presentada en la Tabla 42.
Tabla 42 Escala de puntuación de las lesiones histológicas de la bolsa de Fabricio* Puntuación Observación histológica/lesiones
0 Sin lesión, bolsa normal
Del 1 % al 25 % de los folículos muestran agotamiento linfoide (es decir, menos del 50 % de agotamiento en 1 folículo afectado), afluencia de heterófilos en las lesiones________________ Del 26 % al 50 % de los folículos muestran un agotamiento linfoide casi completo (es decir, más del 75 % de agotamiento en 1 folículo afectado), los folículos afectados muestran necrosis y se puede detectar una afluencia grave de heterófilos_________________________________ Del 51 % al 75 % de los folículos muestran agotamiento linfoide; los folículos afectados muestran lesiones de necrosis y se detecta una afluencia grave de heterófilos______________
Figure imgf000038_0001
Del 76 % al 100 % de los folículos muestran un agotamiento linfoide casi completo; se detectan
hiperplasia y estructuras quísticas; los folículos afectados muestran necrosis y se detecta una afluencia grave de heterófilos_____________________________________________________
5 El 100 % de los folículos muestran un agotamiento linfoide casi completo; pérdida completa de la estructura folicular; epitelio engrosado y plegado; fibrosis del tejido de la bolsa____________ * Fuente: Monografía N.° 01/2008: 0587 de la Farmacopea de la UE "Avian Infectious Bursal Disease vaccine (live)________________________________________ |____________________________________________
[0255] Se consideró que un ave estaba afectada si moría y/o mostraba signos notables de enfermedad y/o lesiones graves de la bolsa de Fabricio (es decir, puntuación histológica <3).
[0256] El título de anticuerpos contra IBD+ por ELISA medio expresado en log10 antes de la exposición se muestra en la Tabla 41. Se detectaron títulos significativos en todos los grupos vacunados que fueron significativamente más altos que los del grupo de control G1. El título de serología fue ligeramente mayor en G3 (vHVT303).
[0257] Se observaron signos clínicos graves después de la exposición en las 9 aves del grupo de control G1, que llevaron a la muerte de 1 ave. Solo un ave vacunada en G2 (vHVT302) mostró signos clínicos después de la exposición. Los porcentajes de protección contra lesiones graves de la bolsa se muestran en la Tabla 41 anterior. Se observó una protección significativa contra IBD en todos los grupos vacunados, y se observó una protección completa en G3 (vHVT303). Las relaciones medias en peso de la bolsa/cuerpo también se muestran en la Tabla 41. Las relaciones en todos los grupos vacunados fueron más altas que las del grupo de control expuesto G1 y no fueron significativamente diferentes del grupo de control no vacunado y sin exposición.
[0258] En conclusión, estos datos indican que los tres HVT-IBD ND dobles ensayados en este estudio indujeron anticuerpos contra IBD y una protección temprana contra IBD en un modelo de exposición a IBDV grave.
Ejemplo 26 Eficacia de cinco vacunas candidatas HVT-ND diferentes frente a exposición a un aislado velogénico de n Dv ZJ1 (genotipo VIId) a los 14 días de edad en pollos SPF
[0259] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de 5 construcciones recombinantes de HVT individual (vHVT39, vHVT110, vHVT111, vHVT112 y vHVT113) que expresan el gen de NDV F frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle con el aislado velogénico de NDV ZJ1 (genotipo VIId) realizada a los 14 días de edad en pollos SPF.
[0260] Las características de estas 5 vacunas candidatas se describen en la Tabla 43 a continuación.
Tabla 43 Características de los virus recombinantes de HVT-ND utilizados en el estudio de ex osición
Figure imgf000038_0002
[0261] En D0, 72 pollos SPF de un día de edad se asignaron al azar a 5 grupos de 12 aves (vacunadas) y 1 grupo de 12 aves (controles no vacunados). A las aves se les inyectaron por inyección subcutánea en el cuello en D0 0,2 ml de vacunas recombinantes que contenían una dosis objetivo de 6000 ufp como se describe en la Tabla 44 a continuación. Las aves se expusieron por vía intramuscular en D14 con 5 log 10 EID50 de la cepa velogénica de NDV ZJ1/2000 (genotipo VIId).
Tabla 44 Resultados de eficacia contra ND
Grupo Vacuna a un día de edad % de protección clínica
(D0) Protección contra Título de propagación media (log10) mortalidad/morbilidad a 2/4 dpi
G1 - 0 %/0 % 3,5/-(todas muertas)
G2 vHVT039 25 %/8 % 2,5/4,8
G3 vHVT110________________ 100 %/83 % 1,8/2,0
Figure imgf000039_0001
G4 vHVT 111________________ 100 %/67 % 1,8/2,8
G5 vHVT 112_______________ 75 %/42 % 1,7/3,4
G6 vHVT113 83 %/25 % 1,4/3,3
[0262] Cada grupo se controló antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV y la mortalidad se registraron después de la exposición. Se tomaron frotis orofaríngeos 2 y 4 días después de la infección (dpi) para evaluar la carga viral mediante RT-PCR en tiempo real utilizando el procedimiento descrito por Wise et al. (2004; Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of Newcastle Disease Virus RNA in Clinical Samples. J Clin Microbiol 42, 329-338).
[0263] Los porcentajes de protección contra la mortalidad y la morbilidad se indican en la Tabla 44 anterior. Se observó una susceptibilidad total en el grupo de control expuesto no vacunado G1, validando de este modo la alta gravedad de la exposición. Las vacunas indujeron niveles variables de protección contra la mortalidad (25-100 %) o contra la morbilidad (8 %-83 %). El mejor nivel de protección se indujo por vHVT110 mientras que el más bajo se indujo por vHVT039, mientras que los otros candidatos dieron resultados intermedios. Los resultados de la propagación orofaríngea en 2 y 4 dpi también se muestran en la Tabla 44 anterior y están en línea con los de la protección clínica. Estas vacunas candidatas difieren en su promotor y en la secuencia del gen F. Estos resultados muestran que ambos parámetros son importantes para el diseño de la vacuna candidata óptima contra HVT-ND.
[0264] En conclusión, los resultados de este estudio mostraron la importancia del promotor y la secuencia del gen F en la eficacia contra ND inducida por los candidatos de vcauna contra ND vectorizada con HVT.
Ejemplo 27 Evaluación de la eficacia contra la enfermedad de Newcastle inducida por construcciones de SB1 dobles que expresan VP2 de IBDV y NDV F
[0265] El objetivo del estudio es evaluar la eficacia de construcciones dobles de SB1 que expresan VP2 de IBDV y NDV F frente a la exposición a la enfermedad de Newcastle.
[0266] En D0, los pollos SPF de un día de edad se asignan al azar en varios grupos de 10-20 aves, incluidos los grupos vacunados y no vacunados. A las aves de los grupos vacunados se les inyectan por inyección subcutánea en el cuello en D0 0,2 ml que contienen una dosis objetivo de 1000 a 5000 ufp de vacunas recombinantes. Como alternativa, la misma dosis en 0,05 ml puede administrarse in ovo 2 o 3 días antes de la eclosión. Las aves (al menos un grupo vacunado y un grupo no vacunado) se exponen por vía intramuscular en un momento diferente después de la vacunación: por ejemplo, D14, D28 o D42 con aproximadamente 4,0 log10 EID50 (0,1 ml) de una cepa de NDV velogénica, tal como las cepas Texas GB (genotipo II), ZJ1 (genotipo VI I d), Chimalhuacan (genotipo V).
[0267] Cada grupo se controla clínicamente antes y después de la exposición. Los signos clínicos del NDV (morbilidad) y la mortalidad se registran después de la exposición. Se calculan los porcentajes de protección clínica en todos los grupos. Al menos el 90 % de las aves SPF expuestas no vacunadas deberían morir o estar gravemente enfermas después de la exposición para validar la gravedad de la exposición. Los frotis orofaríngeos y cloacales pueden ser muestras en diferentes momentos después de la exposición, tal como 3, 5, 7 y 9 días después de la exposición y la carga viral se puede estimar mediante RT-PCR en tiempo real. Los mejores candidatos serán aquellos que induzcan el nivel más alto de protección clínica y el nivel más bajo de carga viral en los frotis. Se puede realizar un estudio similar en pollos de engorde que contienen anticuerpos maternos contra NDV; sin embargo, estos anticuerpos maternos pueden proteger potencialmente a las aves no vacunadas si la exposición se realiza temprano. La construcción doble de SB1 también se puede ensayar en combinación con otra vacuna o vacunas vectoriales contra la enfermedad de Marek.
Ejemplo 28 Evaluación de la eficacia contra la enfermedad de la bursitis infecciosa por construcciones de SB1 dobles que expresan VP2 de IBDV y NDV F
[0268] El objetivo del estudio es evaluar la eficacia contra IBD de SB1 doble que expresa tanto el VP2 del IBDV como el NDV F.
[0269] Los pollos SPF de un día de edad se asignan al azar en varios grupos de 10 a 20 aves, incluidos los controles vacunados y no vacunados. Los controles no vacunados se separarán en 2 subgrupos, incluidas las aves expuestas y no expuestas. A las aves de los grupos vacunados se les inyectan por inyección subcutánea en el cuello en D00,2 ml de vacunas, cada una conteniendo una dosis objetivo de 1000 a 5000 ufp. Como alternativa, la misma dosis en 0,05 ml puede administrarse in ovo 2 o 3 días antes de la eclosión. En diferentes momentos después de la vacunación, tal como 14, 21, 28 o 42 días después de la vacunación, todas las aves de los grupos vacunados y los controles expuestos se exponen por gota ocular (0,03 ml que contienen de 2 a 4 log 10 EID50 por ave) de un IBDV virulento (tal como la cepa Faragher o la cepa estándar de Ee .UU.), un IBDV muy virulento tal como el aislado 91-168 o un aislado de IBDv variante tal como el aislado de la variante E US Delaware. Cada grupo se controló clínicamente antes y después de la exposición. Se realizó la autopsia a las aves 4 o 5 días después de la exposición para la evaluación de las lesiones macroscópicas de las bolsas. También se pueden realizar las autopsias de 10 a 11 días después de la exposición. Se

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Composición o vacuna que comprende
un primer vector de virus del herpes de pavo (HVT) recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno del virus de la enfermedad de Newcastle F (NDV-F) unido operativamente a un promotor de SV40 y una señal de poliA de SV40, además en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido NDV-F, el promotor de SV40 unido operativamente y la señal de poliA de SV40 se insertan en el locus del sitio intergénico 1 (IG1) del genoma de HVT, además en el que el polinucleótido que codifica y expresa NDV-F tiene la secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 1; y
un segundo vector de HVT recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno del virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (IBDV) VP2, en el que el segundo vector de HVT recombinante es vHVT 13.
2. Composición o vacuna, según la reivindicación 1, en la que la composición comprende además uno o más vectores SB1 recombinantes, en la que el vector SB1 se selecciona del grupo que consiste en vSB1-009 que comprende un promotor de SV40 y un polinucleótido optimizado en codones que codifica un antígeno de NDV-F del genotipo CA02 insertado en el locus UL44 del genoma de SB1; vSB1-010 que comprende un promotor de CMV de cobaya y un polinucleótido que codifica un antígeno de NDV-F del genotipo VI I d insertado en el locus SORF4-US2 del genoma de SB1; vSB1-004 que comprende un promotor IE mCMV y un polinucleótido que codifica un antígeno de NDV-F del genotipo VIId insertado en el locus US 10 del genoma de SB1; vSB1-006 que comprende un promotor de SV40 y un polinucleótido optimizado en codones que codifica un antígeno de NDV-F del genotipo VIId insertado en el locus UL55/LORF5 del genoma de SB1; vSB1-007 que comprende un promotor de SV40 y un polinucleótido optimizado en codones que codifica un antígeno de NDV-F del genotipo VIId insertado en el locus UL44 del genoma de SB1, y vSB1-008 que comprende un promotor de SV40 y un polinucleótido optimizado en codones que codifica un antígeno de NDV-F del genotipo CA02 insertado en el locus UL55/LORF5 del genoma de SB1.
3. Composición o vacuna, según la reivindicación 1 o 2, para usar en un procedimiento de vacunación de un animal, comprendiendo dicho procedimiento al menos una administración de la composición o vacuna.
4. Composición o vacuna, según la reivindicación 1 o 2, para usar en un procedimiento para inducir una respuesta protectora en un animal contra el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), el virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (es decir, el virus de IBDV o de la enfermedad de Gumboro) y el virus de la enfermedad de Marek (MDV), comprendiendo dicho procedimiento al menos una administración de la composición o vacuna.
5. Composición o vacuna para usar, según la reivindicación 3 o 4, en la que el animal es un ave.
Figura 1 (1/2)
Figure imgf000109_0001
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