ES2783898T3 - Live attenuated parvovirus - Google Patents

Abstract

Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo recombinante, caracterizado por que el genoma de dicho parvovirus comprende un gen de la cápside que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y un aminoácido distinto de Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2, y en donde dicho genoma lleva una mutación atenuante en la región no estructural desde la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO: 1 y en donde dicha proteína de la cápside VP2 es distinta de la del serotipo 2 de CPV.Recombinant live attenuated canine parvovirus (CPV), characterized in that the genome of said parvovirus comprises a capsid gene that encodes an amino acid other than Isoleucine at amino acid position 219 of the capsid protein VP2 and an amino acid other than Glutamine in amino acid position 386 of the VP2 capsid protein, and wherein said genome carries an attenuating mutation in the non-structural region from position 2061 to 2070 of SEQ ID NO: 1 and wherein said VP2 capsid protein it is different from CPV serotype 2.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Parvovirus atenuado vivoLive attenuated parvovirus

La invención se refiere a parvovirus atenuados vivos, sus usos, vacunas que comprende tales parvovirus atenuados vivos, así como métodos para su producción.The invention relates to live attenuated parvoviruses, their uses, vaccines comprising such live attenuated parvoviruses, as well as methods for their production.

El Parvovirus pertenece a la familia de los virus de ADN de cadena sencilla. Los parvovirus pueden causar enfermedad en diversos animales tales como gatos, perros y cerdos. Debido a que los virus requieren células que se dividan activamente para replicarse, el tipo de tejido infectado varía con la edad del animal. El tracto gastrointestinal y el sistema linfático pueden estar afectados a cualquier edad, conduciendo a vómitos, diarrea e inmunosupresión, pero la hipoplasia cerebelar solamente se observa en gatos que se infectan en el útero o al menos con dos semanas de vida, y la enfermedad del miocardio se observa en cachorros infectados entre las tres y ochos semanas de vida. El parvovirus canino (CPV) es una enfermedad particularmente mortal en cachorros, mortal aproximadamente en el 80 %, que causa daño en el tracto gastrointestinal y deshidratación, así como un síndrome cardiaco en muchos cachorros jóvenes. Se propaga por contacto con heces de perros infectados. Los síntomas incluyen letargo, diarrea grave, fiebre, vómitos, pérdida de apetito y deshidratación. El parvovirus porcino causa una enfermedad reproductora en cerdo conocida como SMEDI, lo cual significa nacido muerto, momificación, muerte embrionaria e infertilidad. La panleucopenia felina, comúnmente conocida como moquillo felino, es una infección vírica que afecta a los gatos, causada por el parvovirus felino (FPV), un pariente cercano del parvovirus canino. La panleucopenia felina es común en gatitos y causa fiebre, bajo recuento de glóbulos blancos, diarrea, y muerte. La infección del feto de gato y gatitos de menos de dos semanas de vida causa hipoplasia cerebelar. El virus de la enteritis de visón es similar en efecto a la panleucopenia felina, excepto que no causa hipoplasia cerebelar. Un parvovirus diferente causa Enfermedad de Aleutian en visones y otros mustélidos, caracterizada por linfadenopatía, esplenomegalia, glomerulonefritis, anemia y muerte. El diagnóstico más grave de parvovirus es por ELISA. Perros, gatos y cerdos frecuentemente son vacunados frente a parvovirus.Parvovirus belongs to the family of single-stranded DNA viruses. Parvoviruses can cause disease in various animals such as cats, dogs, and pigs. Because viruses require actively dividing cells to replicate, the type of infected tissue varies with the age of the animal. The gastrointestinal tract and lymphatic system can be affected at any age, leading to vomiting, diarrhea and immunosuppression, but cerebellar hypoplasia is only seen in cats that are infected in utero or at least two weeks old, and the disease of the myocardium is seen in infected puppies between three and eight weeks of age. Canine parvovirus (CPV) is a particularly deadly disease in puppies, fatal in approximately 80%, that causes gastrointestinal tract damage and dehydration, as well as a heart syndrome in many young puppies. It is spread by contact with infected dog feces. Symptoms include lethargy, severe diarrhea, fever, vomiting, loss of appetite, and dehydration. Porcine parvovirus causes a reproductive disease in pig known as SMEDI, which means stillborn, mummification, embryonic death, and infertility. Feline panleukopenia, commonly known as feline distemper, is a viral infection that affects cats, caused by feline parvovirus (FPV), a close relative of canine parvovirus. Feline panleukopenia is common in kittens and causes fever, low white blood cell counts, diarrhea, and death. Infection of the fetus of cats and kittens less than two weeks old causes cerebellar hypoplasia. The mink enteritis virus is similar in effect to feline panleukopenia, except that it does not cause cerebellar hypoplasia. A different parvovirus causes Aleutian disease in mink and other mustelids, characterized by lymphadenopathy, splenomegaly, glomerulonephritis, anemia, and death. The most serious diagnosis of parvovirus is by ELISA. Dogs, cats, and pigs are frequently vaccinated against parvovirus.

A nivel de ADN, se sabe que los parvovirus caninos, felinos y porcinos tienen un genoma altamente homólogo. El parvovirus canino CPV2 es un virus que es responsable de una enteritis aguda y a veces mortal en perros (Kelly, Aust. Vet. J. 54; 593, 1978; Appel y col., Vet. Rec. 105; 156-159, 1979). El virus, el cual apareció primero alrededor de 1977, probablemente surgió de un virus muy estrechamente relacionado en gatos, el virus de la panleucopaenia felina (FPLV) por un número pequeño de mutaciones en la proteína única de la cápside; un salto de especie que puede haber implicado paso intermedio en otros carnívoros tales como visones o mapaches (Truyen y col., Virology 215, 186-189, 1996).At the DNA level, canine, feline, and porcine parvoviruses are known to have highly homologous genomes. Canine parvovirus CPV2 is a virus that is responsible for acute and sometimes fatal enteritis in dogs (Kelly, Aust. Vet. J. 54; 593, 1978; Appel et al., Vet. Rec. 105; 156-159, 1979 ). The virus, which first appeared around 1977, probably arose from a very closely related virus in cats, feline panleukopaenia virus (FPLV) by a small number of mutations in the unique capsid protein; a species jump that may have involved intermediate passage in other carnivores such as mink or raccoons (Truyen et al., Virology 215, 186-189, 1996).

Ya en 1979 aparecieron las primeras variantes de CPV2, llamadas CPV2a, y rápidamente fueron seguidas por la aparición de CPV2b en 1984. (Parrish y col., Science 230, 1.046-1.048, 1985, y J. Virol. 65; 6.544-6.552, 1991). El virus tipo 2 original ya ha desparecido del campo habiéndose reemplazado por los tipos 2a y 2b, aunque las proporciones relativas de estos dos tipos varía de país en país (Truyen y col., supra; Chinchkar y col., Arch. Virol.As early as 1979, the first variants of CPV2, called CPV2a, appeared and were quickly followed by the appearance of CPV2b in 1984. (Parrish et al., Science 230, 1046-1048, 1985, and J. Virol. 65; 6,544-6,552 , 1991). The original type 2 virus has already disappeared from the field, having been replaced by types 2a and 2b, although the relative proportions of these two types vary from country to country (Truyen et al., Supra; Chinchkar et al., Arch. Virol.

151, 1.881-1.887, 2006; Pereira y col., Infect. Genet. Evol. 3, 399-409, 2007). Los cambios de aminoácidos en la proteína de la cápside (VP2), los cuales caracterizan el cambio desde 2 a 2a y a 2b, están muy limitados. Substituciones en las posiciones 87 (Met a Leu), 300 (Ala a Gly), 305 (Asp a Tyr) y 555 (Val a Ile) se dieron en la evolución de 2 a 2a y 426 (Asn a Asp) y 555 (Ile a Val) en el surgimiento de 2b a partir de 2a (Parrish y col., supra; Truyen y col., J. Virol. 69, 4.702-4.710, 1995). Recientemente, se ha informado que las cepas 2a carecen de la sustitución de Val a Ile en la posición 555 (Wang y col., Virus Genes 31, 171-174, 2005; Martella y col., Virus Genes 33, 11-13, 2006). Tal parece que un cambio único de aminoácido puede diferenciar las secuencias de VP2 de CPV2a y CPV2b.151, 1,881-1,887, 2006; Pereira et al., Infect. Genet. Evol. 3, 399-409, 2007). The amino acid changes in the capsid protein (VP2), which characterize the change from 2 to 2a and to 2b, are very limited. Substitutions in positions 87 (Met to Leu), 300 (Ala to Gly), 305 (Asp to Tyr) and 555 (Val to Ile) occurred in the evolution from 2 to 2a and 426 (Asn to Asp) and 555 ( Ile to Val) in the emergence of 2b from 2a (Parrish et al., Supra; Truyen et al., J. Virol. 69, 4,702-4,710, 1995). Recently, strains 2a have been reported to lack the Val to Ile substitution at position 555 (Wang et al., Virus Genes 31, 171-174, 2005; Martella et al., Virus Genes 33, 11-13, 2006). It appears that a single amino acid change can differentiate the VP2 sequences from CPV2a and CPV2b.

Más recientemente han surgido cepas en Italia en las que el aminoácido en la posición 426 (Asn en 2a y Asp en 2b) ha llegado a ser un residuo de ácido glutámico (Glu) (Buonavoglia y col., J. Gen. Virol. 82, 3.021-3.025, 2001; Martella y col., J. Clin. Microbiol. 42, 1.333-1.336, 2004). El hecho de que estas variantes Glu 426, llamadas virus CPV2c, estén circulando y coexistiendo con otros tipos de CPV en Italia y otros países europeos (Decaro y col., J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472, 2006) y que también se hayan aislado en países tan geográficamente diversos como Vietnam y Escocia (Nakamura y col., Arch Virol. 149, 2.261-2.269, 2004, Spibey y col., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008) sugiere que tienen una ventaja en al menos una proporción de la población canina.More recently strains have emerged in Italy in which the amino acid at position 426 (Asn in 2a and Asp in 2b) has become a glutamic acid residue (Glu) (Buonavoglia et al., J. Gen. Virol. 82 , 3,021-3,025, 2001; Martella et al., J. Clin. Microbiol. 42, 1,333-1,336, 2004). The fact that these Glu 426 variants, called CPV2c viruses, are circulating and coexisting with other types of CPV in Italy and other European countries (Decaro et al., J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472, 2006) and have also been isolated in countries as geographically diverse as Vietnam and Scotland (Nakamura et al., Arch Virol. 149, 2,261-2,269, 2004, Spibey et al., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008) suggests that they have an advantage in at least a proportion of the canine population.

La evolución relativamente rápida del parvovirus canino ha dado como resultado la pérdida y, a continuación, la recuperación del rango de hospedador felino (Truyen y col., 1996 supra), y esta capacidad recuperada de replicarse en gatos puede explicar bien el reemplazamiento del virus tipo 2 original con las variantes 2a, 2b y 2c. A finales de los años 70 y comienzos de los años 80 vacunas de FPL tanto vivas como inactivadas se usaron para proteger a los perros frente a la enfermedad de CPV debido a los antígenos compartidos que estimulaban la protección cruzada, sin embargo, el nivel de protección que proporcionaban era malo y la duración de la inmunidad era corta. Estas vacunas se reemplazaron por vacunas de CPV atenuadas vivas, las cuales proporcionaron buena protección y mayor duración de la inmunidad. Actualmente las vacunas atenuadas vivas se derivan de o bien aislados de CPV2b 0 el virus tipo 2 original. Puesto que el virus tipo 2 se ha reemplazado completamente en el campo por los virus 2a, 2b y ahora 2c ha habido una preocupación sobre el nivel de protección proporcionado por las vacunas tipo 2 atenuadas (Pratelli y col., Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615, 2001; Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50, 1999). Sin embargo, basándose en estudios con anticuerpos monoclonales disponibles cada nueva variante antígena ha perdido al menos un epítopo neutralizante en comparación con la variante antigua (Strassheim y col., Virology 198, 175-184, 1994; Pereira y col., supra). Previamente se ha demostrado que la vacuna con CPV2 atenuado vivo es capaz de proteger a los perros frente a las exposiciones en campo a 2a y 2b (Greenwood y col., Vet. Record. 136, 63-67, 1995) aunque estudios de neutralización cruzada conducidos in vitro que usan suero cultivado frente a diversos tipos antígenos muestran diferencias marcadas (Pratelli y col., supra).The relatively rapid evolution of canine parvovirus has resulted in the loss and subsequent recovery of feline host range (Truyen et al., 1996 supra), and this recovered ability to replicate in cats may well explain virus replacement. original type 2 with variants 2a, 2b and 2c. In the late 1970s and early 1980s both live and inactivated FPL vaccines were used to protect dogs against CPV disease due to shared antigens that stimulated cross protection, however the level of protection they provided was bad and the duration of immunity was short. These vaccines were replaced by live attenuated CPV vaccines, which provided good protection and longer duration of immunity. Currently live attenuated vaccines are derived from either CPV2b isolates or parent type 2 virus. Since virus type 2 has been completely replaced in the field by viruses 2a, 2b and now 2c there has been concern about the level of protection provided by attenuated type 2 vaccines (Pratelli et al., Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615, 2001; Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50, 1999). However, based on studies with available monoclonal antibodies each new antigenic variant has lost at least one neutralizing epitope compared to the old variant (Strassheim et al., Virology 198, 175-184, 1994; Pereira et al., Supra). Live attenuated CPV2 vaccine has previously been shown to be capable of protecting dogs against field exposures to 2a and 2b (Greenwood et al., Vet. Record. 136, 63-67, 1995) although neutralization studies In vitro conducted cross-examinations using serum cultured against various types of antigens show marked differences (Pratelli et al., supra).

Recientemente, se demostró que la vacuna tipo 2 atenuada viva (Nobivac-Intervet) era capaz de proteger a los perros de la exposición a la variante de CPV más reciente, CPV2c (Spibey y col., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008). No obstante, existe una necesidad en el campo de las vacunas que combinen la inducción de un nivel suficiente de inmunidad en animales, en particular gatos, perros y cerdos frente a infección con parvovirus con un comportamiento altamente atenuado. Un alto nivel de atenuación en sinónimo de seguridad, especialmente en animales jóvenes y viejos.Recently, the live attenuated type 2 vaccine (Nobivac-Intervet) was shown to be capable of protecting dogs from exposure to the newer CPV variant, CPV2c (Spibey et al., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008). However, there is a need in the field for vaccines that combine the induction of a sufficient level of immunity in animals, in particular cats, dogs and pigs against infection with parvovirus with highly attenuated behavior. A high level of attenuation synonymous with safety, especially in young and old animals.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevos parvovirus vivos que están atenuados, aunque son aún inmunógenos. Tales virus proporcionan una base para vacunas seguras.It is an object of the present invention to provide new live parvoviruses that are attenuated, yet still immunogenic. Such viruses provide a basis for safe vaccines.

La invención es como se define en las reivindicaciones.The invention is as defined in the claims.

A este respecto, una realización de la presente invención se refiere a parvovirus caninos atenuados vivos (CPV) que comprenden un aminoácido distinto de Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y un aminoácido distinto de una Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2 y en el que el virus lleva una mutación atenuante en la región no estructural de la posición 2061 a 2060 de la SEQ ID NO: 1 y en el que dicha proteína de la cápside VP2 es distinta de la del serotipo de CPV 2. El CPV no es el CPV que está presente en la vacuna con parvovirus canino Nobivac Parvo C. Una secuencia comprendida en este CPV (el CPV de la vacuna con parvovirus canino Nobivac Parvo C) está dada en SEQ ID NO: 1.In this regard, one embodiment of the present invention relates to live attenuated canine parvovirus (CPV) comprising an amino acid other than Isoleucine at amino acid position 219 of the VP2 capsid protein and an amino acid other than a Glutamine at position amino acid 386 of the VP2 capsid protein and in which the virus carries an attenuating mutation in the non-structural region of position 2061 to 2060 of SEQ ID NO: 1 and in which said VP2 capsid protein is different from that of CPV serotype 2. CPV is not the CPV that is present in Nobivac Parvo C canine parvovirus vaccine. A sequence comprised in this CPV (the CPV of Nobivac Parvo C canine parvovirus vaccine) is given in SEQ ID NO: 1.

Sorprendentemente se encontró, que estos dos sitios, en la posición de aminoácido 219 y 386 del gen de la cápside, juegan un papel importante en la atenuación del virus. Hasta ahora se asumía que principalmente los aminoácidos fuera de la región de la cápside están implicados en la virulencia/atenuación del virus.Surprisingly, it was found that these two sites, at amino acid positions 219 and 386 of the capsid gene, play an important role in attenuation of the virus. Until now it was assumed that mainly amino acids outside the capsid region are involved in virulence / attenuation of the virus.

La localización de la Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y una Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2 es idéntica en tanto parvovirus caninos como felinos, sin reparar en el serotipo.The location of Isoleucine at amino acid position 219 of the VP2 capsid protein and a Glutamine at amino acid position 386 of the VP2 capsid protein is identical in both canine and feline parvoviruses, regardless of serotype.

Se descarta específicamente de la presente invención el CPV que está presente en la vacuna con parvovirus canino Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health) que comprende la secuencia dada en ^s E^q ID NO: 1. Por tanto, la presente invención se refiere a un parvovirus canino atenuado (CPV) como se define en las reivindicaciones, que comprende un gen de la cápside que codifica un aminoácido distinto de isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y/o un aminoácido distinto de glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2, a condición de que ese PV no comprenda la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 1.Specifically discarded from the present invention is the CPV that is present in the Nobivac Parvo C canine parvovirus vaccine (Intervet Schering-Plow Animal Health) comprising the sequence given in ^s E ^q ID NO: 1. Therefore, the present invention is refers to an attenuated canine parvovirus (CPV) as defined in the claims, comprising a capsid gene encoding an amino acid other than isoleucine at amino acid position 219 of the VP2 capsid protein and / or an amino acid other than glutamine at amino acid position 386 of the VP2 capsid protein, provided that that PV does not comprise the sequence presented in SEQ ID NO: 1.

Simplemente para indicar la localización de la Isoleucina en la posición de aminoácido 219 y la Glutamina en la posición de aminoácido 386, a continuación, se muestran los dos aminoácidos (en caracteres en negrita) en un ejemplo del contexto secuencial encontrado en la mayoría de las cepas CPV y FPV.Simply to indicate the location of Isoleucine at amino acid position 219 and Glutamine at amino acid position 386, the two amino acids are shown below (in bold characters) in an example of the sequential context found in most of the CPV and FPV strains.

yfqwdrtlipshtgtsg (Isoleucina 219 = en negrita)yfqwdrtlipshtgtsg (Isoleucine 219 = in bold)

yafgrqhgqkttttget (Glutamina 386 = en negrita)yafgrqhgqkttttget (Glutamine 386 = in bold)

Dependiendo de la cepa que se use como material de partida para la sustitución de uno o ambos aminoácidos según la invención, puede ser que una sustitución sencilla del aminoácido en la posición 219 o 386 no sea suficiente para, por ejemplo, hacer al virus seguro en animales muy jóvenes. Si se requiere una atenuación adicional, se prefiere la sustitución de tanto el aminoácido en la posición 219 como 386.Depending on the strain used as the starting material for the substitution of one or both amino acids according to the invention, it may be that a simple substitution of the amino acid at position 219 or 386 is not enough to, for example, make the virus safe in very young animals. If additional attenuation is required, substitution of both the amino acid at position 219 and 386 is preferred.

Por lo tanto, la invención se refiere a un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo como se define en las reivindicaciones que comprende un gen de la cápside que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y un aminoácido distinto de Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2. Therefore, the invention relates to a live attenuated canine parvovirus (CPV) as defined in the claims comprising a capsid gene encoding an amino acid other than Isoleucine at amino acid position 219 of the VP2 capsid protein. and an amino acid other than Glutamine at amino acid position 386 of the VP2 capsid protein.

Una forma más preferida de esta realización se refiere a un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo, que comprende un gen de la cápside que codifica una Valina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside y/o una Lisina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside.A more preferred form of this embodiment refers to a live attenuated canine parvovirus (CPV), comprising a capsid gene encoding a Valine at amino acid position 219 of the capsid protein and / or a Lysine at position amino acid 386 of capsid protein.

Una forma incluso más preferida de esta realización se refiere a un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo, que comprende un gen de la cápside que codifica una Valina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside y una Lisina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside.An even more preferred form of this embodiment refers to a live attenuated canine parvovirus (CPV), comprising a capsid gene encoding a Valine at amino acid position 219 of the capsid protein and a Lysine at position of amino acid 386 of the capsid protein.

Si se prefiere una atenuación adicional más, puede ser interesante usar un parvovirus que ya tiene otra mutación atenuante como el material de partida para la introducción de una sustitución de aminoácido según la invención. Preferentemente, dicha mutación atenuante se localiza fuera de la región de la cápside. Esto permitiría el reemplazamiento de un fragmento de ADN de una parte de la región de no cápside de un virus según la invención con una región de no cápside homóloga de una cepa de parvovirus que lleva una atenuación es esa región. Los parvovirus que llevan una atenuación en una parte de la región de no cápside son, por ejemplo, la vacuna con parvovirus canino comercialmente disponible Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Anima1Health).If a still further attenuation is preferred, it may be interesting to use a parvovirus already having another attenuating mutation as the starting material for the introduction of an amino acid substitution according to the invention. Preferably, said attenuating mutation is located outside the capsid region. This would allow the replacement of a DNA fragment of a part of the non-capsid region of a virus according to the invention with a homologous non-capsid region of a parvovirus strain carrying an attenuation in that region. Parvoviruses that carry an attenuation in a part of the noncapsid region are, for example, the commercially available canine parvovirus vaccine Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plow Anima1Health).

La ventaja de tal planteamiento es, que tales virus tendrían un nivel de atenuación incluso mayor. Por tanto, una forma aún más preferida de esta realización se refiere a un parvovirus atenuado vivo según la invención, en el que el parvovirus es un parvovirus recombinante en el que un fragmento de ADN de una parte de la región de no cápside de dicho parvovirus se reemplaza por un fragmento de ADN homólogo de una parte de la región no de cápside provedente de un segundo parvovirus, en el que el fragmento de ADN homólogo de dicho segundo parvovirus lleva una mutación atenuante.The advantage of such an approach is that such viruses would have an even higher level of attenuation. Therefore, an even more preferred form of this embodiment refers to a live attenuated parvovirus according to the invention, in which the parvovirus is a recombinant parvovirus in which a DNA fragment of a part of the non-capsid region of said parvovirus it is replaced by a homologous DNA fragment from a part of the non-capsid region from a second parvovirus, wherein the homologous DNA fragment from said second parvovirus carries an attenuating mutation.

Un fragmento de ADN homólogo de un segundo parvovirus es un fragmento de ADN que tiene la misma función que el fragmento de ADN del parvovirus según la invención, pero difiere de ese fragmento de ADN en que lleva una mutación que conduce a un comportamiento atenuado del virus. Simplemente como ejemplo, si un fragmento de ADN comprende una mutación atenuante en un fragmento de ADN entre dos sitios de restricción específicos, y estos dos sitios de restricción también están presentes en la misma localización en un virus que no tiene esa mutación, el fragmento de restricción que lleva la mutación se considerará homólogo al mismo fragmento del virus que no tiene esa mutación.A homologous DNA fragment of a second parvovirus is a DNA fragment that has the same function as the DNA fragment of the parvovirus according to the invention, but differs from that DNA fragment in that it carries a mutation that leads to an attenuated behavior of the virus . Merely as an example, if a DNA fragment comprises an attenuating mutation in a DNA fragment between two specific restriction sites, and these two restriction sites are also present in the same location in a virus that does not have that mutation, the fragment of restriction carrying the mutation will be considered homologous to the same fragment of the virus that does not have that mutation.

La invención se refiere a un parvovirus atenuado vivo como se define en las reivindicaciones en el que el parvovirus canino lleva una mutación atenuante en la región no estructural, en la región desde la posición 2.061 a 2.070.The invention relates to a live attenuated parvovirus as defined in the claims wherein the canine parvovirus carries an attenuating mutation in the non-structural region, in the region from position 2,061 to 2,070.

Se entenderá que el parvovirus canino atenuado vivo según la invención, independientemente de la presencia adicional de cualquier atenuación adicional, tal como, por ejemplo, una región no de cápside atenuada, puede obtenerse de todos los parvovirus en los que la puede realizarse la transición de isoleucina/X1 y/o glutamina/X2 según la invención en la proteína de la cápside, y, por tanto, al menos a partir de todos los miembros secuenciados ahora de CPV y FPV. (X1 y X2 son aminoácidos distintos de isoleucina y glutamina, respectivamente).It will be understood that the live attenuated canine parvovirus according to the invention, regardless of the additional presence of any additional attenuation, such as, for example, an attenuated non-capsid region, can be obtained from all the parvoviruses in which the transition of isoleucine / X1 and / or glutamine / X2 according to the invention in the capsid protein, and therefore at least from all the now sequenced members of CPV and FPV. (X1 and X2 are amino acids other than isoleucine and glutamine, respectively).

También se entenderá que se incluyen en la invención virus híbridos que comprenden una cápside de CPV y una cadena principal no capsídica de FPV.It will also be understood that hybrid viruses comprising a CPV capsid and a non-capsid FPV backbone are included in the invention.

Cuando se va a desarrollar una vacuna para la protección de un canino contra infección por parvovirus, el parvovirus preferido para su uso en dicha vacuna sería un parvovirus canino.When a vaccine is to be developed for the protection of a canine against parvovirus infection, the preferred parvovirus for use in such a vaccine would be a canine parvovirus.

Especialmente, cuando una vacuna se dirige específicamente a la protección de los perros contra CPV, el gen de la cápside del virus según la invención codificaría preferentemente una proteína de la cápside del serotipo de CPV 2a, 2b o 2c.In particular, when a vaccine is specifically directed to the protection of dogs against CPV, the capsid gene of the virus according to the invention would preferably encode a capsid protein of the CPV serotype 2a, 2b or 2c.

Como se ha mencionado anteriormente, la parte no de cápside del parvovirus puede ser de origen CPV o FPV. Por lo tanto, una forma aún más preferida de esta realización se refiere a CPV atenuado vivo según la invención, en el que el parvovirus codifica una proteína de la cápside del serotipo de CPV 2a, 2b o 2c.As mentioned above, the noncapsid part of the parvovirus can be of CPV or FPV origin. Therefore, an even more preferred form of this embodiment relates to live attenuated CPV according to the invention, wherein the parvovirus encodes a capsid protein of the CPV serotype 2a, 2b or 2c.

Otra realización de la presente invención se refiere a vacunas para la protección de animales frente a infección con parvovirus, en la que tales vacunas comprenden un parvovirus canino atenuado vivo según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.Another embodiment of the present invention relates to vaccines for the protection of animals against infection with parvovirus, wherein such vaccines comprise a live attenuated canine parvovirus according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

Una cantidad adecuada de parvovirus según la invención, para su uso en una vacuna estará en muchos casos dentro del intervalo de 10³ a 10⁹ TCID⁵⁰, dependiendo del nivel de atenuación y las características de replicación del virus. Una dosis infecciosa del virus que está por debajo de 10³ TCID⁵⁰ se considerará en muchos casos que es demasiado baja, puesto que el virus tardará mucho tiempo en replicarse a un nivel suficientemente alto para desencadenar el sistema inmune. Cantidades que superasen el 10⁹ TCID⁵⁰ no serían atractivas, únicamente por razones comerciales. A suitable amount of parvovirus according to the invention, for use in a vaccine will in many cases be within the range of 10 ³ to 10 ⁹ TCID ⁵⁰ , depending on the level of attenuation and the replication characteristics of the virus. An infectious dose of the virus that is below 10 ³ TCID ⁵⁰ will in many cases be considered too low, since it will take a long time for the virus to replicate at a level high enough to trigger the immune system. Amounts exceeding 10 ⁹ TCID ⁵⁰ would not be attractive, solely for commercial reasons.

Una dosis muy adecuada estaría en el intervalo de 10⁵ a 10⁸ TCID⁵⁰, incluso mejor entre 10⁶ a 10⁸ TCID^50. A very suitable dose would be in the range of 10 ⁵ to 10 ⁸ TCID ⁵⁰ , even better between 10 ⁶ to 10 ⁸ TCID ^50.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Simplemente como ejemplo; tal vehículo puede ser tan simple como agua estéril o una solución tampón tal como PBS.Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art. Just as an example; Such a vehicle can be as simple as sterile water or a buffer solution such as PBS.

Las vacunas según la invención se pueden administrar de diversas maneras. Puesto que la vacuna comprende un virus atenuado vivo, muchas maneras de administración, tal como administración oral, intranasal, intramuscular y subcutánea son viables. Una vía de administración preferida es la administración subcutánea.The vaccines according to the invention can be administered in various ways. Since the vaccine comprises a live attenuated virus, many modes of administration, such as oral, intranasal, intramuscular, and subcutaneous administration are viable. A preferred route of administration is subcutaneous administration.

Animales susceptibles a la infección por parvovirus tales como perros son frecuentemente vacunados frente a varias otras enfermedades a la vez. Por lo tanto, sería practico combinar una vacuna según la invención con un antígeno adicional de un virus o microorganismo patógeno a perros y gatos o información genética codificadora de dicho antígeno.Animals susceptible to parvovirus infection such as dogs are frequently vaccinated against several other diseases at the same time. Therefore, it would be practical to combine a vaccine according to the invention with an additional antigen of a virus or microorganism pathogenic to dogs and cats or genetic information encoding said antigen.

Por tanto, otra realización de la invención se refiere a una vacuna de combinación que comprende una vacuna según la invención y un antígeno adicional de un virus o microorganismo patógeno a animales o información genética codificadora de un polipéptido inmunogénico de dicho virus o microorganismo.Therefore, another embodiment of the invention relates to a combination vaccine comprising a vaccine according to the invention and an additional antigen of a virus or microorganism pathogenic to animals or genetic information encoding an immunogenic polypeptide of said virus or microorganism.

El antígeno adicional de un virus o un microorganismo puede ser el virus o microorganismo completo (en una forma atenuada viva o en una forma inactivada) o un polipéptido inmunogénico u otra parte inmunogénica de ese virus o microorganismo tal como, por ejemplo, un (lipo-)polisacárido, capaz de inducir una respuesta inmune protectora. Preferiblemente, el virus o microorganismo patógeno a animales se selecciona entre el grupo de Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, Babesia vogeli, Babesia rossi, Leishmania donovani-complex, adenovirus canino, coronavirus canino, virus del moquillo canino, Leptospira interrogans serovar canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira bratislava, virus de la hepatitis canina, virus paragripal canino, virus de la rabia, Hepatozoon canis, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, virus de1Herpes felino, calicivirus felino, panleucopenia felina y Chlamydophila felis.The additional antigen of a virus or a microorganism can be the whole virus or microorganism (in a live attenuated form or in an inactivated form) or an immunogenic polypeptide or other immunogenic part of that virus or microorganism such as, for example, a (lipo -) polysaccharide, capable of inducing a protective immune response. Preferably, the virus or microorganism pathogenic to animals is selected from the group of Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, Babesia vogeli, Babesia rossi, Leishmania donovani-complex, canine adenovirus, canine coronavirus, canine distemper virus, Leptospira interrogans serovar canicola, Leptospira icterogiaehae , Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira bratislava, canine hepatitis virus, canine parainfluenza virus, rabies virus, Hepatozoon canis, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, feline herpes virus, feline calicivirus, feline panleukopenia and feline panleukopenia.

Las vacunas que comprende virus atenuados vivos deben ser almacenadas a baja temperatura, o tienen que estar en una forma liofilizada. Las vacunas liofilizadas se pueden mantener bajo condiciones de enfriamiento moderado o incluso a temperatura ambiente. Con frecuencia, la vacuna se mezcla con establizadores, por ejemplo, para proteger a las proteínas propensas a degradación de ser degradadas, para aumentar la semivida de la vacuna, o para mejorar la eficacia de la liofilización. Estabilizadores útiles son entre otros SPGA, carbohidratos, por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación de los mismos, y tampones, tales como fosfatos de metales alcalinos.Vaccines comprising live attenuated viruses must be stored at low temperatures, or they must be in a lyophilized form. Freeze-dried vaccines can be kept under moderately cooled conditions or even at room temperature. Often times, the vaccine is mixed with stabilizers, for example, to protect degradation-prone proteins from being degraded, to increase the half-life of the vaccine, or to improve the efficiency of lyophilization. Useful stabilizers are among others SPGA, carbohydrates, for example sorbitol, mannitol, trehalose, starch, sucrose, dextran or glucose, proteins such as albumin or casein or degradation products thereof, and buffers, such as alkali metal phosphates.

Por lo tanto, preferiblemente, la vacuna (de combinación) según la invención está en una forma liofilizada. Además, la vacuna se puede suspender en un diluyente fisiológicamente aceptable. Tales tampones pueden ser, por ejemplo, agua estéril, un tampón y similares.Therefore, preferably, the (combination) vaccine according to the invention is in a lyophilized form. Furthermore, the vaccine can be suspended in a physiologically acceptable diluent. Such buffers can be, for example, sterile water, a buffer, and the like.

No hace falta decir, que los diluyentes y compuestos para la emulsión o estabilización de virus también están incorporados en la presente invención.Needless to say, diluents and compounds for emulsifying or stabilizing viruses are also incorporated in the present invention.

Además, otra realización de la invención se refiere a métodos para la fabricación de una vacuna (de combinación) según la invención en la que estos métodos comprenden la mezcla de un parvovirus canino atenuado vivo según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.Furthermore, another embodiment of the invention relates to methods for the manufacture of a (combination) vaccine according to the invention wherein these methods comprise the mixture of a live attenuated canine parvovirus according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

Otra realización más de la invención se refiere a parvovirus canino atenuado vivo según la invención para su uso como un medicamento. Más específicamente, esta realización se refiere a parvovirus canino atenuado vivo según la invención para su uso en el tratamiento de la infección por parvovirus.Yet another embodiment of the invention relates to live attenuated canine parvovirus according to the invention for use as a medicament. More specifically, this embodiment relates to live attenuated canine parvovirus according to the invention for use in treating parvovirus infection.

De nuevo, otra realización de la presente invención se refiere al uso de un parvovirus canino atenuado vivo según la invención para el tratamiento de infección por parvovirus.Again, another embodiment of the present invention relates to the use of a live attenuated canine parvovirus according to the invention for the treatment of parvovirus infection.

Finalmente, otra realización de la presente invención se refiere a métodos como se definen en las reivindicaciones para la preparación de un mutante de parvovirus canino (CPV) según la invención, en la que dichos métodos comprenden el intercambio de un fragmento de ADN codificador de al menos parte de la proteína de la cápside de parvovirus que tiene en la posición de aminoácido 219 un codón que codifica Isoleucina y/o que tiene en la posición de aminoácido 386 un codón que codifica Glutamina, por un fragmento de ADN codificador de al menos parte de la proteína de la cápside del parvovirus que tiene en la posición de aminoácido 219 un codón que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina y/o que tiene en la posición de aminoácido 386 un codón que codifica un aminoácido distinto de Glutamina y el reemplazo de un fragmento de ADN de una parte de la región no de cápside de dicho parvovirus por un fragmento de a Dn homólogo de una parte de la región no de cápside procedente de un segundo parvovirus, en el que dicho fragmento de ADN homólogo de dicho segundo parvovirus lleva una mutación atenuante en la región no estructural de la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO: 1.Finally, another embodiment of the present invention refers to methods as defined in the claims for the preparation of a canine parvovirus (CPV) mutant according to the invention, in which said methods comprise the exchange of a DNA fragment encoding al less part of the parvovirus capsid protein that has at amino acid position 219 a codon encoding Isoleucine and / or that has a codon encoding Glutamine at amino acid position 386, by a DNA fragment encoding at least part of the parvovirus capsid protein that has at amino acid position 219 a codon that encodes an amino acid other than Isoleucine and / or that has at amino acid position 386 a codon that encodes an amino acid other than Glutamine and the replacement of a DNA fragment of a part of the non-capsid region of said parvovirus by a homologous a Dn fragment of a part of the non-capsid region from a second parvovirus, wherein said homologous DNA fragment of said second parvovirus carries a mutation attenuating in the non-structural region from position 2061 to 2070 of SEQ ID NO: 1.

Tal intercambio de ADN se puede hacer usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida, intercambio de fragmentos de restricción y similares. Hay varias maneras de realizar la sustitución de isoleucina 219 una X1 o glutamina 386 una X2. Tales cambios se podrán introducir por síntesis química o PCR seguida de recombinación del fragmento nuevamente sintetizado con ADN vírico.Such DNA exchange can be done using recombinant DNA techniques well known in the art, such as site-directed mutagenesis, restriction fragment exchange, and the like. There are several ways to make the substitution of isoleucine 219 an X1 or glutamine 386 an X2. Such changes can be introduced by chemical synthesis or PCR followed by recombination of the newly synthesized fragment with viral DNA.

EjemplosExamples

Ejemplo 1:Producción del Clonde parvoviruscanino 630attExample 1: Production of Clonde parvovirus canine 630att

Materialesde partidaStarting materials

VirusVirus

Cepas de E. coli E. coli strains

Las cepas de E. coli JC811 obtenidas a partir del centro de reserva genético de E. coli (EEUU) y cepa DL795 (Kramel Biotech UK) se seleccionaron para la propagación de plásmido de clones infecciosos completos.The E. coli JC811 strains obtained from the E. coli Genetic Reserve Center (USA) and DL795 strain (Kramel Biotech UK) were selected for plasmid propagation of whole infectious clones.

Síntesis de ADNDNA synthesis

La síntesis de ADN a medida se realizó por Eurofins MWG GmbH. El fragmento de ADN sintetizado se suministró en el plásmido de clonación pBluescript.Custom DNA synthesis was performed by Eurofins MWG GmbH. The synthesized DNA fragment was supplied in the cloning plasmid pBluescript.

La construcción del clon 630att de parvovirus canino fue un proceso multietapas y está descrito en el presente documento en sus etapas separadas.The construction of the canine parvovirus clone 630att was a multistage process and is described herein in its separate steps.

1) Construcción de un clon molecular infeccioso de NobivacParvo C (p154att)1) Construction of an infectious molecular clone of NobivacParvo C (p154att)

El ADN vírico de forma replicativa (RF) se obtuvo a partir de células A72 infectadas con células infectadas por Nobivac Parvo C usando un método de preparación “Hirt” modificado (Parrish y col 1988, Virology 166, 293-307). El ADN vírico se digirió con un número de enzimas de restricción y el genoma se ensambló en pBluescript usando metodología de clonación rutinaria. El esquema de clonación está representado en la figura 1 a 4. El ADN de RF de CPV 154att primero se sometió a “relleno de extremo” usando la ADN polimerasa de T4. A continuación, se digirió el ADN con EcoRI y Spel. Estas enzimas cortaron una vez en las posiciones 1.099 y 3.459 respectivamente. La digestión dio como resultado tres fragmentos marcados A, B y C en orden de su tamaño. Los fragmentos se separaron por electroforesis en gel y, a continuación, el fragmento EcoRI/Spel (fragmento A) se clonó en el plásmido pBluescript que se había preparado por digestión con las mismas enzimas (véase la figura 1). El fragmento terminal EcoRI (fragmento C) del producto de digestión de ADN de RF, a continuación, se clonó en pBluescript digerido con EcoRI y EcoRV para producir pCPV C (véase la figura 2).Replicative form (RF) viral DNA was obtained from A72 cells infected with Nobivac Parvo C infected cells using a modified "Hirt" preparation method (Parrish et al 1988, Virology 166, 293-307). The viral DNA was digested with a number of restriction enzymes and the genome was assembled into pBluescript using routine cloning methodology. The cloning scheme is depicted in Figures 1-4. CPV 154att RF DNA was first end-filled using T4 DNA polymerase. The DNA was then digested with EcoRI and Spel. These enzymes cut once at positions 1,099 and 3,459 respectively. Digestion resulted in three fragments labeled A, B, and C in order of their size. The fragments were separated by gel electrophoresis, and then the EcoRI / Spel fragment (fragment A) was cloned into the plasmid pBluescript which had been prepared by digestion with the same enzymes (see Figure 1). The terminal EcoRI fragment (fragment C) of the RF DNA digest was then cloned into EcoRI and EcoRV digested pBluescript to produce pCPV C (see Figure 2).

Los fragmentos de parvovirus canino A y C se subclonaron juntos dentro del mismo plásmido. Los plásmidos pCPV A y pCPV C se digirieron con Spel y EcoRI. El inserto de CPV se purificó del pCPV A y la porción de vector se tomó del pCPV C. A continuación, la ligación dio como resultado un plásmido en el que se “reunieron” los fragmentos A y C (véase la figura 3).Canine parvovirus fragments A and C were subcloned together into the same plasmid. The plasmids pCPV A and pCPV C were digested with Spel and EcoRI. The CPV insert was purified from pCPV A and the vector portion was taken from pCPV C. The ligation then resulted in a plasmid in which fragments A and C were "pooled" (see Figure 3).

A continuación, se clonó el fragmento terminal Spel (fragmento B) del producto de digestión de ADN de RF de CPV dentro del pCPV AC. El plásmido pCPV AC se digirió con SpeI y una enzima Hincll que corta dejando un extremo romo. Los fragmentos se ligaron y clonaron. (véase la figura 4).The Spel terminal fragment (fragment B) of the CPV RF DNA digest was then cloned into the pCPV AC. The plasmid pCPV AC was digested with SpeI and a Hincll enzyme which cuts leaving a blunt end. The fragments were ligated and cloned. (see figure 4).

El plásmido resultante se llamó p154att.The resulting plasmid was named p154att.

La confirmación de que se había ensamblado un clone completo se consiguió mediante la transfección del ADN del plásmido a las células A72 dando como resultado la producción de virus infecciosos.Confirmation that a complete clone had been assembled was achieved by transfection of plasmid DNA into A72 cells resulting in the production of infectious virus.

Se realizó el análisis de secuencia de ADN del clon del plásmido; se mostró que esta secuencia era idéntica a la determinada a partir del ADN vírico extraído de células infectadas, como se muestra más a continuación.DNA sequence analysis of the plasmid clone was performed; This sequence was shown to be identical to that determined from viral DNA extracted from infected cells, as shown further below.

2) Construcción de 2/2cHíbridoD92) 2 / 2c Hybrid D9 construction

El ADN vírico se obtuvo a partir de tanto células infectadas por Nobivac parvo C como por separado de células infectadas por CPV2c “Jes”. Las preparaciones de ADN vírico se digirieron cada una con una única enzima de restricción para producir 2 fragmentos de ADN de cada una. Las digestiones enzimáticas se hicieron de tal manera que el fragmento a la izquierda del genoma de Nobivac y el fragmento a la derecha del genoma de “Jes” compartían >200 pb de secuencia solapante. Los fragmentos del extremo izquierdo de Nobivac y del extremo derecho de “Jes” se separaron, purificaron y mezclaron (Figura 7).Viral DNA was obtained from both Nobivac parvo C infected cells and separate cells infected by CPV2c "Jes". The viral DNA preparations were each digested with a single restriction enzyme to produce 2 DNA fragments of each. Enzyme digestions were done in such a way that the fragment to the left of the Nobivac genome and the fragment to the right of the "Jes" genome shared> 200 bp of overlapping sequence. The fragments from the left end of Nobivac and the right end of "Jes" were separated, purified, and mixed (Figure 7).

La transfección de las células A72 y CrFK con estos fragmentos solapantes permitió que el virus infeccioso se produjera por recombinación natural. Los virus resultantes se clonaron por dilución limitante y se llamaron 2/2c híbrido D9.Transfection of A72 and CrFK cells with these overlapping fragments allowed the infectious virus to be produced by natural recombination. The resulting viruses were cloned by limiting dilution and named 2 / 2c hybrid D9.

3) Construcción del Clon630.3) Construction of Clone630.

El clon 630 se desarrolló a partir del clon de plásmido infeccioso p154att y ADN preparado a partir del 2/2c híbrido D9.Clone 630 was developed from infectious plasmid clone p154att and DNA prepared from 2 / 2c hybrid D9.

La enzima de restricción PacI corta el genoma de CPV en dos lugares alrededor de las posiciones 561 y 4.651; los extremos alejados derecho e izquierdo del genoma. Por lo tanto, el plásmido p154att se digirió con Pacl y el fragmento Pacl de alrededor 4 kpb que contenía más del 80 % del genoma se separó del vector y las secuencias terminales y se reemplazó con el obtenido a partir del ADN del 2/2c híbrido D9. El plásmido resultante se llamó p630. Esto está ilustrado en la Figura 5.The restriction enzyme PacI cuts the CPV genome in two places around positions 561 and 4651; the far left and right ends of the genome. Therefore, the plasmid p154att was digested with Pacl and the Pacl fragment of about 4 kbp containing more than 80% of the genome was separated from the vector and the terminal sequences and was replaced with that obtained from the DNA of the 2 / 2c hybrid D9. The resulting plasmid was named p630. This is illustrated in Figure 5.

Como se predijo, la transfección de las células A72 o CrFK con p630 da como resultado la generación de virus infeccioso, este virus se llama 630.As predicted, transfection of A72 or CrFK cells with p630 results in the generation of infectious virus, this virus is called 630.

El virus 2/2c híbrido D9 tipo 630 mantenía un bajo nivel de patogenicidad.The 2 / 2c hybrid virus D9 type 630 maintained a low level of pathogenicity.

4) Construcción del Clon630att4) Construction of the Clone630att

El virus 630 mostró algunas señales clínicas de bajo nivel cuando se inyectó en perros.Virus 630 showed some low-level clinical signs when injected into dogs.

Una parte del gen de la cápside se sintetizó químicamente incorporando cambios de aminoácidos observados en Nobivac parvo C pero no se encontró que se diera en cepas de campo. A continuación, este fragmento se sustituyó por la misma región en el plásmido p630 para crear el plásmido p630att; esto está ilustrado en la Figura 6.A part of the capsid gene was chemically synthesized incorporating amino acid changes observed in Nobivac parvo C but was not found to occur in field strains. This fragment was then substituted for the same region in plasmid p630 to create plasmid p630att; this is illustrated in Figure 6.

Se sintetizó la secuencia de ADN correspondiente a la de entre las posiciones 3.356 y 4.029 en el genoma de CPV. La secuencia de ADN exacta, proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 2, se muestra a continuaciónThe DNA sequence corresponding to that between positions 3,356 and 4,029 in the CPV genome was synthesized. The exact DNA sequence, provided herein as SEQ ID NO: 2, is shown below

1 agatctqaqa cattqqqttt ttatccatgq aaaccaacca taccaactcc 1 agatctqaqa cattqqqttt ttatccatgq aaaccaacca taccaactcc

atqqaqatat tattttcaat qqqataqaac attaqtacca tctcatactqatqqaqatat tattttcaat qqqataqaac attaqtacca tctcatactq

101 qaactaqtqq cacaccaaca aatatatacc atqqtacaqa tccaqatqat101 qaactaqtqq cacaccaaca aatatatacc atqqtacaqa tccaqatqat

qttcaatttt atactattqa aaattctqtq ccaqtacact tactaaqaacqttcaatttt atactattqa aaattctqtq ccaqtacact tactaaqaac

201 aqqtqatqaa tttqctacaq qaacattttt ttttqattqt aaaccatqta201 aqqtqatqaa tttqctacaq qaacattttt ttttqattqt aaaccatqta

qactaacaca tacatqqcaa acaaataqaq cattqqqctt accaccatttqactaacaca tacatqqcaa acaaataqaq cattqqqctt accaccattt

301 ctaaattctt tqcctcaaqc tqaaqqaqgt actaactttg gttatatagg301 ctaaattctt tqcctcaaqc tqaaqqaqgt actaactttg gttatatagg

agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga aatacaaactagttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga aatacaaact

401 atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca401 atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca

ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctatccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat

501 tgcagcagga cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg501 tgcagcagga cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg

gtgatccaag atatgcattt ggtagacaac atggtaaaaa aactaccacagtgatccaag atatgcattt ggtagacaac atggtaaaaa aactaccaca

601 acaggagaaa cacctgagag atttacatat atagcacatc aagatacagg601 acaggagaaa cacctgagag atttacatat atagcacatc aagatacagg

aagatatcca gaaggagatt gg aagatatcca gaaggagatt gg

Los sitios de la enzima de restricción BgI II y Xcml están mostrados en negrita y subrayados.The restriction enzyme sites Bgl II and Xcml are shown in bold and underlined.

La secuencia se liberó del plásmido en el que se proporcionó por digestión con BgI II y Xcml. Los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de 672 pb se aisló y se purificó.The sequence was released from the plasmid into which it was provided by digestion with Bgl II and Xcml. The DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis and the 672 bp fragment was isolated and purified.

La transfección de las células A72 o CrFK con p630att dio como resultado la generación de virus infeccioso (630att) que cuando se administra a cachorros no da señales clínicas.Transfection of A72 or CrFK cells with p630att resulted in the generation of infectious virus (630att) that when administered to puppies does not give clinical signs.

En un estudio comparativo, se compararon una vacuna que comprendía el clon 630 y una vacuna que comprendía el clon 630att.In a comparative study, a vaccine comprising clone 630 and a vaccine comprising clone 630att were compared.

Se vacunaron subcutáneamente cinco perros MDA negativos 10⁸⁰ a 10⁸³ TCID⁵⁰ del clon 630 por 1 ml. Esto condujo a señales leves a moderadas en todos los perros. El cambio de peso durante el periodo de 5 días fue de -6 % en promedio en los 5 perros, de la siguiente manera a partir de la tabla de a continuación.Five MDA negative dogs 10 ⁸⁰ to 10 ⁸³ TCID ⁵⁰ of clone 630 per 1 ml were vaccinated subcutaneously. This led to mild to moderate signs in all dogs. The weight change over the 5 day period was -6% on average in the 5 dogs, as follows from the table below.

Se vacunaron subcutáneamente perros MDA negativos 10⁸⁰ a 10⁸³ TCID⁵⁰ del Clon 630att por 1 ml.MDA negative dogs 10 ⁸⁰ to 10 ⁸³ TCID ⁵⁰ of Clone 630att were vaccinated subcutaneously per 1 ml.

En este grupo, no se observaron síntomas clínicos, aumentos de temperatura, leucopaenia, diarrea o vómitos. Además, hubo una ganancia sustancial de peso en este grupo, de la siguiente manera a partir de la tabla de a continuación.In this group, no clinical symptoms, temperature increases, leukopaenia, diarrhea or vomiting were observed. Additionally, there was substantial weight gain in this group, as follows from the table below.

Por lo tanto, se concluyó que las vacunas basadas en el clon 630att verdaderamente se comportan atenuadas cuando se comparan con el clon 630, y tienen un excelente perfil de seguridad.Therefore, it was concluded that vaccines based on clone 630att truly behave attenuated when compared to clone 630, and have an excellent safety profile.

Ejemplo 2: generación de un virus recombinante que tiene una mutación atenuante fuera del gen de la cápsideExample 2: generation of a recombinant virus that has an attenuating mutation outside the capsid gene

La cepa 154att se obtuvo a partir de un Nobivac Parvo C comercialmente disponible (Intervet Schering-Plough Animal Health) y la cepa Jess era un aislado de campo de un virus tipo 2c.The 154att strain was obtained from a commercially available Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plow Animal Health) and the Jess strain was a field isolate of a type 2c virus.

Los virus se cultivaron en células de riñón caninas o felinas adherentes (por ejemplo, A72 y CrFK) usando medio M6B8 que contenía suero fetal bovino al 5 %. El ADN de forma replicativa (RF) se preparó a partir de cultivos de célula infectada usando una modificación del método “Hirt” estándar (McMaster y col. 1891).Viruses were cultured in adherent canine or feline kidney cells (eg, A72 and CrFK) using M6B8 medium containing 5% fetal calf serum. Replicative form (RF) DNA was prepared from infected cell cultures using a modification of the standard "Hirt" method (McMaster et al. 1891).

El ADN de RF preparado a partir de la cepa 154att se digirió con la enzima de restricción Pstl y los fragmentos se separaron por electroforesis en gel de agarosa. La banda de 3.055 pares de bases (pb) (correspondiente al extremo a la izquierda del CPV) se escindió del gel y se purificó usando columnas de extracción en gel Qiagen Qiaquick. El ADN de RF aislado de las células infectadas por CPV Jess se digirió con la enzima de restricción Xmnl. De nuevo se separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa seguido de una purificación de una banda de aproximadamente 2.750 pb (correspondiente al extremo a la derecha del CPV que incluye la secuencia de la cápside) usando columnas de extracción en gel Qiagen Qiaquick.RF DNA prepared from strain 154att was digested with restriction enzyme Pstl and fragments were separated by agarose gel electrophoresis. The 3,055 base pair (bp) band (corresponding to the extreme left of CPV) was excised from the gel and purified using Qiagen Qiaquick gel extraction columns. RF DNA isolated from CPV Jess infected cells was digested with restriction enzyme Xmnl. Again the DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis followed by a purification of a band of approximately 2,750 bp (corresponding to the extreme right of the CPV that includes the capsid sequence) using Qiagen Qiaquick gel extraction columns .

Los fragmentos de 3.055 pb y 2.750 pb purificados de 154att y Jess se combinaron y se sometieron a transfección dentro de células A72 y CrFK en cultivo. Las transfecciones se realizaron usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) con aproximadamente 3 |jg de cada fragmento, siguiendo las instrucciones del fabricante.The purified 3,055 bp and 2,750 bp fragments from 154att and Jess were combined and transfected into cultured A72 and CrFK cells. Transfections were performed using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) with approximately 3 µg of each fragment, following the manufacturer's instructions.

Después de la transfección, las células se sometieron a subcultivo y a seguimiento mediante el ensayo de hemaglutinación (HA). El virus se detectó por HA en el subcultivo 4. La determinación de la secuencia de ADN de los virus híbridos se realizó usando los protocolos de secuenciación de ADN estándares que usan o bien modelos de fragmento de PCR o ADN de RF. El virus se purificó mediante dilución limitante en células caninas o felinas susceptibles adherentes.After transfection, cells were subcultured and monitored by haemagglutination (HA) assay. The virus was detected by HA in subculture 4. Determination of the DNA sequence of the hybrid viruses was performed using standard DNA sequencing protocols using either PCR or RF DNA fragment models. The virus was purified by limiting dilution in adherent susceptible canine or feline cells.

Ejemplo3: Virus recombinante construido a partir delADNvíricoclonadoExample 3: Recombinant virus constructed from cloned viral DNA

El virus recombinante se generó a partir de fragmentos clonados. El genoma de la cepa 154att de virus se clonó dentro del vector de clonación estándar pBluescript (Stratagene inc.). Para mantener las secuencias terminales palindrómicas intactas el plásmido se propagó en el hospedador bacteriano DL795 que es defectuoso en un número de sistemas de recombinación. La clonación de genomas de parvovirus se ha descrito en la bibliografía y las técnicas requeridas son conocidas por algunos expertos en la técnica. El clon de 154att obtenido (p154att) se digirió con la enzima de restricción Pac I de manera que no se permitió que la digestión llegara a finalización, es decir, la digestión de la enzima de restricción era solamente parcial. A continuación, los fragmentos digeridos se sometieron a digestión con la enzima de restricción Xmn I. A continuación, los fragmentos de ADN digeridos se separaron por electroforesis en gel de agarosa y el fragmento indicado en el diagrama de más adelante se escindió del gel y se purificó usando columnas de extracción en gel Qiagen Qiaquick. Los sitios Pac a la derecha y Xmn I flanquean la región de la cápside en el genoma de parvovirus.The recombinant virus was generated from cloned fragments. The genome of virus strain 154att was cloned into the standard cloning vector pBluescript (Stratagene inc.). To keep the palindromic terminal sequences intact the plasmid was propagated in the bacterial host DL795 which is defective in a number of recombination systems. Cloning of parvovirus genomes has been described in the literature and the required techniques are known to some of skill in the art. The 154att clone obtained (p154att) was digested with the restriction enzyme Pac I such that the digestion was not allowed to go to completion, that is, the digestion of the restriction enzyme was only partial. The digested fragments were then digested with the restriction enzyme Xmn I. The digested DNA fragments were then separated by agarose gel electrophoresis and the fragment indicated in the diagram below was excised from the gel and purified using Qiagen Qiaquick gel extraction columns. Sites Pac on the right and Xmn I flank the capsid region in the parvovirus genome.

El gen de la cápside de 154att se reemplazó por el gen de la cápside de una cepa virulenta de CPV como sigue. El sitio Xmn I y el Pac I a la derecha indicados en la figura 8 caen fuera de las fronteras del gen de la cápside. La secuencia de aproximadamente 110 pb entre el sitio Pac I y el extremo del gen de la cápside difiere significativamente entre la cepa 154att y los aislados virulentos. Hasta ahora no hay cambios de secuencia registrados en la secuencia corta (-55 pb) entre el sitio Xmn I y el comienzo del gen de la cápside. Por lo tanto, para limitar el intercambio de material justo a la secuencia de la cápside; se sintetizó químicamente la secuencia de la cápside de CPV virulenta y se mantuvo la secuencia específica a vacuna entre el sitio PacI y la señal de parada de la cápside.The 154att capsid gene was replaced by the capsid gene from a virulent strain of CPV as follows. The Xmn I site and Pac I on the right indicated in Figure 8 fall outside the boundaries of the capsid gene. The sequence of approximately 110 bp between the Pac I site and the end of the capsid gene differs significantly between strain 154att and virulent isolates. So far there are no sequence changes recorded in the short sequence (-55 bp) between the Xmn I site and the beginning of the capsid gene. Therefore, to limit the exchange of material right to the sequence of the capsid; The virulent CPV capsid sequence was chemically synthesized and the vaccine-specific sequence was maintained between the PacI site and the capsid stop signal.

A continuación, se muestra la secuencia químicamente sintetizada que contiene el gen de la cápside de CPV. La secuencia como se muestra a continuación se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 3. The chemically synthesized sequence containing the CPV capsid gene is shown below. The sequence as shown below is provided herein as SEQ ID NO: 3.

AGAGGCAGAC CTGAGAGC CATCTTTACTTCT GAACAAT TGGAAGAAGATTT TCGAGAAGAGGCAGAC CTGAGAGC CATCTTTACTTCT GAACAAT TGGAAGAAGATTT TCGAGA

Xmn I CGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGTAAGGGTGT GTTAGTAAAGTGGGGGGAGAGGAAAGATTTAATAACTTAACTAAGTATGTGTTTTTTTAT AGGACTTGTGCCTCCAGGTTATAAATATCTTGGGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGA ACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCT TCGCTCTGGTAAAAACCCATACTTATATTTCTCGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCA AACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGAGCTAAAAA GGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACACCAGATCATCCATCAACATCAAGACCAACAAA ACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTTCATTAATCTTGCAAAAAAAAAAAA AGCCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGCAGTTCA ACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCAACAGGATCTGGGAACGGGTC TGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAA TCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAG ACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTT GGATAAAAC TGCAGT TAACGGAAACAT GGC TT TAGAT GATAC T CATGCACAAAT TGTAAC ACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCA ACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAA TGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAA TGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCC AGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCC ATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGG CACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGA AAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTT TTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTT ACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGG AGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAAACTATATTACTGA AGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGC GTCTACACAAGGGCCAT TTAAAACACCTAT TGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGA TGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAA AACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGG Xmn I CGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGTAAGGGTGT GTTAGTAAAGTGGGGGGAGAGGAAAGATTTAATAACTTAACTAAGTATGTGTTTTTTTAT AGGACTTGTGCCTCCAGGTTATAAATATCTTGGGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGA ACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCT TCGCTCTGGTAAAAACCCATACTTATATTTCTCGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCA AACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGAGCTAAAAA GGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACACCAGATCATCCATCAACATCAAGACCAACAAA ACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTTCATTAATCTTGCAAAAAAAAAAAA AGCCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGCAGTTCA ACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCAACAGGATCTGGGAACGGGTC TGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAA TCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAG ACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTT GGATAAAAC TGCAGT TAACGGAAACAT GGC TT TAGAT GATAC T CATGCACAAAT TGTAAC ACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCA ACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAA TGTTGTTTT AAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAA TGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCC AGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCC ATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGG CACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGA AAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTT TTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTT ACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGG AGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAAACTATATTACTGA AGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGC GTCTACACAAGGGCCAT TTAAAACACCTAT TGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGA TGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAA AACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGG

Claims (13)

REIVINDICACIONES 1. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo recombinante, caracterizadoporque el genoma de dicho parvovirus comprende un gen de la cápside que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y un aminoácido distinto de Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2, y en donde dicho genoma lleva una mutación atenuante en la región no estructural desde la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO: 1 y en donde dicha proteína de la cápside VP2 es distinta de la del serotipo 2 de CPV.1. Recombinant live attenuated canine parvovirus (CPV), characterized in that the genome of said parvovirus comprises a capsid gene that encodes an amino acid other than Isoleucine at amino acid position 219 of the VP2 capsid protein and an amino acid other than Glutamine in amino acid position 386 of the VP2 capsid protein, and where said genome carries an attenuating mutation in the non-structural region from position 2061 to 2070 of SEQ ID NO: 1 and where said VP2 capsid protein it is different from CPV serotype 2. 2. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según la reivindicación 1, caracterizadoporque comprende un gen de la cápside que codifica una Valina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside y/o una Lisina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside.2. Live attenuated canine parvovirus (CPV) according to claim 1, characterized in that it comprises a capsid gene that encodes a Valine at amino acid position 219 of the capsid protein and / or a Lysine at amino acid position 386 of the capsid protein. 3. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizadoporque dicho parvovirus codifica una proteína de la cápside de los serotipos 2a, 2b o 2c de CPV.Live attenuated canine parvovirus (CPV) according to any of claims 1 to 2, characterized in that said parvovirus encodes a capsid protein of CPV serotypes 2a, 2b or 2c. 4. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadoporque dicho parvovirus codifica una proteína de la cápside que tiene una Metionina o una Leucina en la posición de aminoácido 87, una Alanina o una Glicina en la posición de aminoácido 300, un Ácido aspártico o una Tirosina en la posición de aminoácido 305, un Ácido aspártico o un Ácido glutámico en la posición de aminoácido 426 y/o una Isoleucina o una Valina en la posición de aminoácido 555.4. Live attenuated canine parvovirus (CPV) according to any of claims 1 to 3, characterized in that said parvovirus encodes a capsid protein that has a Methionine or a Leucine at amino acid position 87, an Alanine or a Glycine at the position of amino acid 300, an Aspartic Acid or a Tyrosine at amino acid position 305, an Aspartic Acid or a Glutamic Acid at amino acid position 426 and / or an Isoleucine or a Valine at amino acid position 555. 5. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadoporque dicho parvovirus codifica una proteína de la cápside que tiene al menos uno de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en una Leucina en la posición 87, una Glicina en la posición 300, una Tirosina en la posición 305, un Ácido glutámico en la posición 426 y una Isoleucina en la posición 555.5. Live attenuated canine parvovirus (CPV) according to any of claims 1 to 4, characterized in that said parvovirus encodes a capsid protein that has at least one of the amino acids selected from the group consisting of a Leucine at position 87, a Glycine at position 300, a Tyrosine at position 305, a Glutamic Acid at position 426 and an Isoleucine at position 555. 6. Vacuna para la protección de animales frente a infección con parvovirus, caracterizadaporque dicha vacuna comprende un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.6. Vaccine for the protection of animals against infection with parvovirus, characterized in that said vaccine comprises a live attenuated canine parvovirus (CPV) according to any of claims 1 to 5 and a pharmaceutically acceptable vehicle. 7. Vacuna de combinación para la protección de animales frente a patógenos, caracterizadaporque dicha vacuna de combinación comprende una vacuna según la reivindicación 6 y un antígeno adicional de un virus o de un microorganismo patógeno a animales o información genética codificadora de una proteína inmunogénica de dichos virus o microorganismo.7. Combination vaccine for the protection of animals against pathogens, characterized in that said combination vaccine comprises a vaccine according to claim 6 and an additional antigen of a virus or of a microorganism that is pathogenic to animals or genetic information encoding an immunogenic protein of said virus or microorganism. 8. Vacuna de combinación según la reivindicación 7, caracterizada porque dichos virus o microorganismo patógeno a animales se seleccionan entre el grupo que consiste en Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, Babesia vogeli, Babesia rossi, complejo Leishmania donovani, adenovirus canino, coronavirus canino, virus del moquillo canino, Leptospira interrogans serovar canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira bratislava, virus de la hepatitis canina, virus paragripal canino, virus de la rabia, Hepatozoon canis, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, virus del herpes felino, calicivirus felino, panleucopenia felina y Chlamydophila felis.Combination vaccine according to claim 7, characterized in that said virus or microorganism pathogenic to animals are selected from the group consisting of Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, Babesia vogeli, Babesia rossi, Leishmania donovani complex, canine adenovirus, canine coronavirus, virus canine distemper, Leptospira interrogans serovar canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira bratislava, canine hepatitis virus, canine parainfluenza virus, rabies virus, Hepatozoon canis, Borrelia feltellaferi virus, Herpes bronchisepes feline calicivirus, feline panleukopenia, and Chlamydophila felis. 9. Método para la fabricación de una vacuna según la reivindicación 6 o una vacuna de combinación según las reivindicaciones 7 u 8, caracterizadoporque dicho método comprende la mezcla de un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.9. Method for the manufacture of a vaccine according to claim 6 or a combination vaccine according to claims 7 or 8, characterized in that said method comprises the mixture of a live attenuated canine parvovirus (CPV) according to any of claims 1 to 5 and a pharmaceutically acceptable carrier. 10. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso como medicamento.10. Live attenuated canine parvovirus (CPV) according to any one of claims 1 to 5 for use as a medicine. 11. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento de infección por parvovirus.11. Live attenuated canine parvovirus (CPV) according to any one of claims 1 to 5 for use in treating parvovirus infection. 12. Método para la preparación de un mutante del parvovirus canino (CPV) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadopor que el método comprende la etapa de alteración mediante técnicas de ADN recombinante de un codón en la posición de aminoácido 219 que codifica Isoleucina y un codón en la posición de aminoácido 386 que codifica Glutamina, en un codón en la posición de aminoácido 219 que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina y/o un codón que codifica un aminoácido distinto de Glutamina en la posición de aminoácido 386 y reemplazo de un fragmento de ADN de una parte de la región no de la cápside de dicho parvovirus por un fragmento de a Dn homólogo de una parte de la región no de la cápside procedente de un segundo parvovirus, en donde dicho fragmento de ADN homólogo de dicho segundo parvovirus lleva una mutación atenuante en la región no estructural de la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO:1.12. Method for the preparation of a mutant of the canine parvovirus (CPV) according to any of claims 1 to 5, characterized in that the method comprises the step of alteration by means of recombinant DNA techniques of a codon at amino acid position 219 that encodes Isoleucine and a codon at amino acid position 386 encoding Glutamine, at a codon at amino acid position 219 encoding an amino acid other than Isoleucine and / or a codon encoding an amino acid other than Glutamine at amino acid position 386 and replacement of a DNA fragment of a part of the non-capsid region of said parvovirus by a homologous a Dn fragment of a part of the non-capsid region from a second parvovirus, wherein said homologous DNA fragment of said second parvovirus carries an attenuating mutation in the nonstructural region from position 2061 to 2070 of SEQ ID NO: 1. 13. Método para la preparación de un mutante del parvovirus canino (CPV) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadoporque el método comprende el intercambio de un fragmento de ADN codificador de al menos parte de la proteína de la cápside del parvovirus que tiene en la posición de aminoácido 219 un codón que codifica Isoleucina y que tiene en la posición de aminoácido 386 un codón que codifica Glutamina, por un fragmento de ADN codificador de la misma parte de la proteína de la cápside del parvovirus que tiene ahora en la posición de aminoácido 219 un codón que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina y/o que tiene en la posición de aminoácido 386 un codón que codifica un aminoácido distinto de Glutamina y reemplazo de un fragmento de ADN de una parte de la región no de la cápside de dicho parvovirus por un fragmento de ADN homólogo de una parte de la región no de la cápside procedente de un segundo parvovirus, en el que dicho fragmento de ADN homólogo de dicho segundo parvovirus lleva una mutación atenuante en la región no estructural de la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO:1. 13. Method for the preparation of a mutant of the canine parvovirus (CPV) according to any of claims 1 to 5, characterized in that the method comprises the exchange of a DNA fragment encoding at least part of the parvovirus capsid protein that has at amino acid position 219 a codon that codes for Isoleucine and that has a codon that codes for Glutamine at amino acid position 386, by a DNA fragment coding for the same part of the protein of the parvovirus capsid which now has at amino acid position 219 a codon encoding an amino acid other than Isoleucine and / or which has at amino acid position 386 a codon encoding an amino acid other than Glutamine and replacement of a DNA fragment of a part of the non-capsid region of said parvovirus by a homologous DNA fragment of a part of the non-capsid region of a second parvovirus, wherein said homologous DNA fragment of said second parvovirus carries a mutation attenuating in the non-structural region from position 2061 to 2070 of SEQ ID NO: 1.