JP2021506746A - Multivalent cat vaccine - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規なネコ用多価ワクチンを提供する。本発明はまた、多価ワクチンを単独でまたは他の防御剤と組み合わせて作製および使用する方法も提供する。The present invention provides a novel multivalent vaccine for cats. The present invention also provides methods of making and using a multivalent vaccine alone or in combination with other protective agents.
Description
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９４０１号、２０１７年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５９６５０８号、２０１７年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８２０５０号および２０１７年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８１９５５号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での優先権を主張する。
Mutual Reference of Related Applications This application is filed on December 15, 2017, US Provisional Patent Application No. 62/599401, filed on December 8, 2017, the entire contents of which are incorporated herein by reference. US Provisional Patent Application No. 62/596508 filed, US Provisional Patent Application No. 62/582050 filed on November 6, 2017, and US Provisional Patent Application No. 62/581955 filed on November 6, 2017. Claims priority under Article 119 (e) of the US Patent Act.
本発明は、新規なネコ用多価ワクチンに関する。多価ワクチンを単独でまたは他の防御剤と組み合わせて作製および使用する方法も提供される。 The present invention relates to a novel multivalent vaccine for cats. Methods of making and using multivalent vaccines alone or in combination with other protective agents are also provided.
ネコ呼吸器疾患には、副鼻腔炎、結膜炎、流涙、唾液分泌および口腔潰瘍に代表される病気が含まれる。ネコの上気道疾患に関連する２つの最も一般的な病原体は、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）とネコヘルペスウイルス１型ウイルス（ＦＨＶ−１）としても知られているネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）である。これら２つのネコウイルスは、世界中の全てのネコ呼吸器疾患のおよそ８０％の原因であると考えられている。細菌であるクラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）は、ネコ呼吸器疾患でも役割を果たし得る第３の病原体である。したがって、これらの３つの病原体に対するワクチンが現在市販されている。 Cat respiratory diseases include diseases such as sinusitis, conjunctivitis, lacrimation, salivation and oral ulcer. The two most common pathogens associated with upper respiratory tract disease in cats are feline calicivirus (FCV) and feline viral rhinotracheitis virus (FVR), also known as feline herpesvirus type 1 virus (FHV-1). ). These two cat viruses are believed to be responsible for approximately 80% of all cat respiratory diseases worldwide. The bacterium Chlamydophila felis is a third pathogen that can also play a role in cat respiratory disease. Therefore, vaccines against these three pathogens are currently on the market.
ＦＶＲは、イヌヘルペスウイルス１に関連するアルファヘルペスウイルスであり、おそらくネコ呼吸器病原体の中で最も重要である。ＦＶＲは、極めて伝染性で、子ネコならびにネコで重篤な疾患を引き起こし得る大きなエンベロープＤＮＡウイルスである。したがって、ほとんどのネコは生涯を通じてＦＶＲに曝露される。市販のＮｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ−１ワクチンは、改変された生ネコウイルス性鼻気管炎ウイルスを含有している。 FVR is an alphaherpesvirus associated with canine herpesvirus 1 and is probably the most important of the feline respiratory pathogens. FVR is a large enveloped DNA virus that is highly contagious and can cause serious disease in kittens and cats. Therefore, most cats are exposed to FVR throughout their lives. The commercially available Novivac® Feline-1 vaccine contains a modified live feline viral rhinotracheitis virus.
ＦＣＶ感染の最も一般的な特徴および臨床徴候は、舌および口腔粘膜上の小胞（潰瘍）の発生であり、これは小さな個別の潰瘍として始まるが、舌の大部分に広がり、影響を及ぼし得る。感染したネコでは発熱もしばしば見られる。ＦＣＶの一定の株は、リンピング症候群（ｌｉｍｐｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）として知られているネコの疾患も引き起こし、これは発熱、関節と筋肉の痛み（リンピング）、および時折の舌／口腔潰瘍を特徴とする。さらに、ＦＣＶのいくつかの株は、感染したネコの慢性口内炎と関連付けられている。ＦＣＶに感染したネコは持続感染する可能性があり、長期間にわたって感染性ウイルスを排出し得る。 The most common feature and clinical sign of FCV infection is the development of vesicles (ulcers) on the tongue and oral mucosa, which begin as small individual ulcers but can spread and affect most of the tongue. .. Fever is often seen in infected cats. Certain strains of FCV also cause a cat disease known as the limping syndrome, which is characterized by fever, joint and muscle pain (limping), and occasional tongue / oral ulcers. In addition, some strains of FCV have been associated with chronic stomatitis in infected cats. Cats infected with FCV can be persistently infected and can shed infectious virus over a long period of time.
ＦＣＶ分離株は抗原的に極めて可変性で、ＦＣＶ Ｆ９などのＦＣＶの古いワクチン株でワクチン接種されたネコの抗体は、現在の野外分離株全てを有効に中和するわけではない。さらに、全身性疾患および高い死亡率に関連する新たなＦＣＶ株が同定されている［米国特許第７４４９３２３号明細書参照］。これらの「強毒全身性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｉｃ）」（ＶＳ−ＦＣＶ）分離株は、局所的発生の原因であり、現在のワクチンも、これらの株によって引き起こされる疾患からネコを防御するようには思われない。 FCV isolates are highly antigenically variable, and feline antibodies vaccinated with older FCV vaccine strains such as FCV F9 do not effectively neutralize all current field isolates. In addition, new FCV strains associated with systemic disease and high mortality have been identified [see US Pat. No. 7,449,323]. These "virulent systemic" (VS-FCV) isolates are responsible for local outbreaks, and current vaccines also appear to protect cats from the diseases caused by these strains. I can't.
ＦＣＶは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを含む。ゲノムは３’末端がポリアデニル化され、５’末端がウイルスコードタンパク質によって結合されている。第１のオープンリーディングフレームは、単一ポリペプチドで発現されるウイルスプロテアーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。次いで、このポリペプチドはウイルスプロテアーゼによって翻訳後に切断される。第２のオープンリーディングフレームは、主カプシドタンパク質（すなわち、ＦＣＶカプシドタンパク質）をコードし、これはＡ−Ｆとして示される６つの領域を有する［Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，６０ Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．：６５２−６５８（１９９９）］。領域Ａが切断されて、成熟カプシドタンパク質が産生される。ＯＲＦ２の領域Ｂ、ＤおよびＦはＦＣＶ分離株間で比較的保存されているが、領域ＣおよびＥは可変性であり、ＯＲＦ２の領域Ｅは主要なＢ細胞エピトープを含んでいる［Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，３８（２）Ｖｅｔ Ｒｅｓ．：３１９−３３５（２００７）参照］。ＯＲＦ３は、マイナーな構造タンパク質をコードする［Ｓｏｓｎｏｖｔｓｅｖ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２７７ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１９３−２０３（２０００）］。 The FCV contains a single-stranded positive-strand RNA genome consisting of three open reading frames (ORFs). The genome is polyadenylated at the 3'end and bound by a virus-encoding protein at the 5'end. The first open reading frame encodes a viral protease and RNA-dependent RNA polymerase expressed in a single polypeptide. The polypeptide is then cleaved after translation by a viral protease. The second open reading frame encodes the main capsid protein (ie, the FCV capsid protein), which has six regions designated as AF [Scott et al. , 60 Am. J. Vet. Res. : 652-658 (1999)]. Region A is cleaved to produce a mature capsid protein. Regions B, D and F of ORF2 are relatively conserved among FCV isolates, while regions C and E are variable and region E of ORF2 contains the major B cell epitopes [Radford et al. , 38 (2) Vet Res. : See 319-335 (2007)]. ORF3 encodes a minor structural protein [Sosnovtsev and Green, 277 Virology: 193-203 (2000)].
クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）は、世界中のイエネコに特有の細菌である。クラミドフィラ・フェリス（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）は、感染したネコの結膜炎症、鼻炎および呼吸器系の問題を引き起こし得る。クラミドフィラ・フェリス（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）は、わずか約１０００個のタンパク質をコードする比較的小さなゲノムを有する。この細菌は、７５０００塩基対を含むプラスミドも含む。市販のＮｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ−１ワクチンは、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）を含有している。 Chlamydophila felis is a bacterium unique to domestic cats around the world. Cramidophila ferris can cause conjunctivitis, rhinitis and respiratory problems in infected cats. Cramidophila ferris has a relatively small genome encoding only about 1000 proteins. The bacterium also contains a plasmid containing 75,000 base pairs. The commercially available Novivac® Feline-1 vaccine contains a modified raw Chlamydophila felis.
上記のネコ呼吸器疾患に関連する３つの病原体に加えて、ネコは通常、他の３つのウイルス：ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症（ＦＰＶまたはＦＰＬＶ）、および狂犬病ウイルスに対してもワクチン接種される。ネコ白血病ウイルスは、イエネコに感染するレトロウイルスであり、世界中で重大な罹患率および死亡率をもたらしている。ＦｅＬＶは主に唾液を介して伝染するが、体液との接触を通して広がることも報告されている［Ｐａｃｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ Ｒｅｃ １１８：３８１−３８４（１９８６）ｄｏｉ：１０．１１３６／ｖｒ．１１８．１４．３８１；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｆｅｌｉｎｅ Ｍｅｄ Ｓｕｒｇ １０：３００−３１６（２００８）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｆｍｓ．２００８．０３．００２］。ＦｅＬＶ感染中に観察されるネコの臨床徴候には、細胞増殖性障害（リンパ系または骨髄性腫瘍）、細胞抑制性障害（免疫抑制、貧血、骨髄抑制に関連する感染性疾患）、炎症性障害、神経障害、流産、および腸炎が含まれる［Ｈｏｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ １９９：１２８７−１２９７（１９９１）；Ｌｅｖｙ ａｎｄ Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６ｔｈ ｅｄ （Ｅｔｔｉｎｇｅｒ ＳＪ， Ｆｅｌｄｍａｎ ＥＣ．， ｅｄｓ．）ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ．（２００５）］。抗原血症の有病率は、健康なネコの１〜５％から罹患したネコの１５〜３０％までさまざまである［Ｈｏｓｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄｓ，１２８：２９３−２９７（１９８９）；Ｂｒａｌｅｙ， Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２２：２５−２９ （１９９４）；Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ７５：３２３−３２７（１９９７）；Ａｒｊｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３８：３４４８−３４４９（２０００）］。ＦｅＬＶはしばしば、付随する持続性ウイルス血症を伴う持続的な感染を確立し、しばしば宿主ネコの死につながる。 In addition to the three pathogens associated with feline respiratory disease described above, cats are usually against three other viruses: feline leukemia virus (FeLV), feline panleukopenopathy (FPV or FPLV), and rabies virus. Is also vaccinated. Feline leukemia virus is a retrovirus that infects domestic cats and causes significant morbidity and mortality worldwide. FeLV is transmitted primarily through saliva, but has also been reported to spread through contact with body fluids [Pactiti et al. , Vet Rec 118: 381-384 (1986) doi: 10.1136 / vr. 118.14.381; Levy et al. , J Feline Med Surg 10: 300-316 (2008) doi: 10.016 / j. jfms. 2008.03.002]. Clinical signs of cats observed during FeLV infection include cell proliferative disorders (lymphatic system or myelogenous tumors), cell suppressive disorders (immunosuppression, anemia, infectious diseases associated with myelosuppression), inflammatory disorders. , Neuropathy, abortion, and enteritis [Hover et al. , J Am Vet Med Assoc 199: 1287-1297 (1991); Levy and Crawford, Textbook of Veterinary Internal Medicine, 6th ed (Ettinger SJ, Felder Peld). (2005)]. The prevalence of antigenemia varies from 1-5% of healthy cats to 15-30% of affected cats [Hosie et al. Veterinary Records, 128: 293-297 (1989); Braley, Feline Practice 22: 25-29 (1994); Malik et al. , Australian Veterinary Journal 75: 323-327 (1997); Arjona et al. , Journal of Clinical Microbiology 38: 3448-3449 (2000)]. FeLV often establishes a persistent infection with concomitant persistent viremia, often leading to the death of the host cat.
ＦｅＬＶの一本鎖ＲＮＡゲノムは、３つの遺伝子のみ：（ｉ）エンベロープ糖タンパク質をコードするＥＮＶ遺伝子、（ｉｉ）ウイルスの主要な構造要素をコードするＧＡＧ遺伝子、および（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＯＬ遺伝子をコードする［Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１８１９−１８２４（１９９２）］。ＦｅＬＶエンベロープ（ＥＮＶ）遺伝子は、１つまたは複数の細胞酵素によってタンパク質分解処理されて主要なエンベロープ糖タンパク質ｇｐ７０および関連する膜貫通タンパク質ｐ１５Ｅを産生するｇｐ８５前駆体タンパク質をコードする［ＤｅＮｏｒｏｎｈａ， ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５：６１７−６２１（１９７８）；Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８１：３６７５−３６７９ （１９８３）］。膜貫通タンパク質ｐ１５Ｅは、免疫抑制特性を有するガンマレトロウイルス間で保存されている配列を含む［Ｍａｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７４：６８７−６８９（１９７８）］。近年、欧州医薬品庁の動物用医薬品委員会（ＣＶＭＰ）は、活性物質として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で発現されるＦｅＬＶサブグループＡのｇｐ７０表面糖タンパク質に由来する組換えｐ４５ ＦｅＬＶエンベロープ抗原を含むワクチンについて肯定的な意見を採用した。ＦｅＬＶエンベロープ糖タンパク質はＦｅＬＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答の標的であると同時に、中和抗体であり、したがってＦｅＬＶの主要な免疫原の１つである［Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（５）：２３０６−２３１５（２００２）］。 The FeLV single-stranded RNA genome encodes only three genes: (i) the ENV gene encoding the envelope glycoprotein, (ii) the GAG gene encoding the major structural elements of the virus, and (iii) the RNA polymerase. It encodes the POL gene [Genome et al. , Journal of General Virology 73: 1819-1824 (1992)]. The FeLV envelope (ENV) gene encodes a gp85 precursor protein that is proteolytically treated by one or more cellular enzymes to produce the major envelope glycoprotein gp70 and the associated transmembrane protein p15E [DeNoronha, et al. , Virology 85: 617-621 (1978); Numberg et al. , PNAS 81: 3675-3679 (1983)]. The transmembrane protein p15E contains sequences conserved among gammaretroviruses with immunosuppressive properties [Mathes et al. , Nature 274: 687-689 (1978)]. In recent years, the Veterinary Drug Commission (CVMP) of the European Pharmaceutical Agency has announced a vaccine containing a recombinant p45 FeLV envelope antigen derived from the gp70 surface glycoprotein of FeLV subgroup A expressed in Escherichia coli as an active substance. Adopted a positive opinion. FeLV enveloped glycoproteins are targets of FeLV-specific cytotoxic T cell responses as well as neutralizing antibodies and are therefore one of the major immunogens of FeLV [Flynn et al. , J. Virol. 76 (5): 2306-2315 (2002)].
ネコ汎白血球減少症（ＦＰＶまたはＦＰＬＶ）は、しばしば致命的なネコの極めて伝染性のウイルス疾患である。汎白血球減少症という名称は、罹患した動物が示す白血球数（白血球）が少ないことに由来している。ＦＰＬＶは、リンパ組織、骨髄、腸上皮、および非常に幼い子ネコでは、網膜および小脳の活発に***している細胞に感染し、これらを破壊する。ウイルスは妊娠中のネコでも経胎盤的に広がり、胚吸収、胎子ミイラ化、死産または流産を引き起こし得る。感染したネコは、尿、便および鼻分泌物にウイルスを排出し、感受性ネコがこれらの分泌物または感染したネコのノミと接触すると、感受性ネコが感染する。ＦＰＬＶ感染による臨床徴候はまた、ネコジステンパーまたはネコパルボとして分類されている。 Feline panleukopenopathy (FPV or FPLV) is a highly contagious viral disease in cats that is often fatal. The name panleukopenia is derived from the low white blood cell count (white blood cells) exhibited by affected animals. FPLV infects and destroys actively dividing cells in the retina and cerebellum in lymphoid tissues, bone marrow, intestinal epithelium, and in very young kittens. The virus also spreads transplacentally in pregnant cats and can cause embryonic resorption, fetal mummification, stillbirth or miscarriage. Infected cats shed viruses into urine, stool and nasal secretions, and when susceptible cats come into contact with these secretions or flea of infected cats, the susceptible cats become infected. Clinical signs of FPLV infection are also classified as cat distemper or cat parvo.
ネコ汎白血球減少症ウイルスは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のパルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のメンバーである。したがって、ＦＰＬＶはミンク腸炎ウイルスおよびイヌ２型パルボウイルス（ＣＰＶ−２）と密接に関連している。ＦＰＬＶは、配列決定された一本鎖ＤＮＡゲノムを有する［Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ．Ｍａｒ−Ａｐｒ；３（２）（２０１５）：ｅ０１５５６−１４参照］。市販のＮｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ−１ワクチンは、改変された生ネコ汎白血球減少症ウイルスを含有している。 The feline panleukopenopathy virus is a member of the Parvoviridae family of Parvoviridae. Therefore, FPLV is closely associated with mink enteritis virus and canine parvovirus (CPV-2). FPLV has a sequenced single-stranded DNA genome [Liu et al. , Genome Announc. Mar-Apr; 3 (2) (2015): see e01556-14]. The commercially available Novivac® Feline-1 vaccine contains a modified live feline panleukopenopathy virus.
狂犬病は、ヒトおよび他の哺乳動物の脳の炎症をもたらす予防可能な人畜共通感染症である。臨床狂犬病は、典型的には***性狂犬病または麻痺性狂犬病に分類される急性進行性脳炎である。***性狂犬病は、不穏状態、被刺激性および攻撃性を特徴とする。麻痺性狂犬病は、過度の唾液分泌、深い努力性呼吸、麻痺、および最終的には昏睡を特徴とする。狂犬病の原因因子は狂犬病ウイルスであり、これはネコを含むほとんどの哺乳動物に感染することができ、野生動物および感受性飼育動物の貯蔵所を維持している。 Rabies is a preventable zoonotic disease that causes inflammation of the brains of humans and other mammals. Clinical rabies is an acute progressive encephalitis that is typically classified as violent rabies or paralytic rabies. Rogue rabies is characterized by restlessness, irritation and aggression. Paralytic rabies is characterized by excessive salivation, deep strenuous breathing, paralysis, and ultimately coma. The causative factor for rabies is the rabies virus, which can infect most mammals, including cats, and maintains reserves for wildlife and susceptible domestic animals.
狂犬病ウイルスは、５つの構造タンパク質：核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするエンベロープＲＮＡウイルスである［Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：４２７−４３９（１９９１）］。糖タンパク質（Ｇ）は、ウイルス中和抗体を誘導する防御抗原と考えられている［Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １６：７５４−７５９ （１９７７）］。この疾患に対抗するために、数種類の狂犬病ワクチンが製造されている。不活化細胞培養物由来全ウイルス死滅狂犬病ウイルスワクチンが、米国で最も一般的に使用されているワクチンである。これらの全ウイルス死滅狂犬病ウイルスワクチンは高レベルの抗原を必要とするため、アジュバントが必要である。残念ながら、このアジュバントの使用は、注射部位の反応性、過敏症、さらにはネコの注射部位肉腫の知覚されたリスクと関連している。近年、改変された生ワクチンが、野生動物の免疫化のための経口ワクチンベイトでうまく使用されている［Ｍａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ Ｒｅｓ ４５（１）：７７（２０１４）］。さらに、糖タンパク質（Ｇ）を発現する組換えワクチンが、現在、ネコで使用するために米国で販売されている。核酸ワクチンも実験室研究で使用されているが、現在米国では認可されているものはない。 Rabies virus is an enveloped RNA virus that encodes five structural proteins: nucleoprotein (N), phosphoprotein (P), matrix protein (M), glycoprotein (G) and RNA-dependent RNA polymerase [Dietzschold et al]. .. , Crit Rev Immunol 10: 427-439 (1991)]. Glycoprotein (G) is considered to be a protective antigen that induces virus neutralizing antibodies [Cox et al. , Infect Immuno 16: 754-759 (1977)]. Several rabies vaccines have been produced to combat the disease. All-virus killing rabies virus vaccines derived from inactivated cell cultures are the most commonly used vaccines in the United States. All of these virus-killing rabies virus vaccines require high levels of antigens and therefore require adjuvants. Unfortunately, the use of this adjuvant is associated with injection site reactivity, hypersensitivity, and even the perceived risk of injection site sarcoma in cats. In recent years, modified live vaccines have been successfully used in oral vaccine baits for immunization of wild animals [Mahl et al. , Vet Res 45 (1): 77 (2014)]. In addition, recombinant vaccines expressing glycoprotein (G) are currently marketed in the United States for use in cats. Nucleic acid vaccines have also been used in laboratory studies, but none are currently approved in the United States.
いくつかのベクター戦略は、一定の病原体から防御する努力においてワクチンで長年にわたって使用されてきた。このようなベクター戦略の１つには、アルファウイルス由来のレプリコンＲＮＡ粒子（ＲＰ）の使用が含まれ［Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１−９．（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１；Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３−１７２７（２０１０）］、これらはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９−６４４６（１９９３）］およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６−１３６１（１９９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発された。ＲＰワクチンは、増殖不全アルファウイルスＲＮＡレプリコンを宿主細胞に送達し、インビボで（１または複数の）所望の抗原性導入遺伝子の発現をもたらす［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９（２）：３８９−４０１（１９９７）］。ＲＰは、いくつかの従来のワクチン製剤と比較した場合、魅力的な安全性および有効性プロファイルを有する［Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１−９．（２０１２）］。ＲＰプラットフォームは、病原性抗原をコードするために使用されており、ブタおよび家禽用のいくつかのＵＳＤＡ認可ワクチンの基礎となっている。 Several vector strategies have been used in vaccines for many years in an effort to protect against certain pathogens. One such vector strategy involves the use of replicon RNA particles (RP) derived from alphavirus [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13 (1): 1-9. (2012) doi: 10.107 / S1466252312001; Kamrud et al. , J Gen Virol. 91 (Pt 7): 1723-1727 (2010)], these are Venezuelan equima encephalitis virus (VEE) [Pushko et al. , Virology 239: 389-401 (1997)], Sindvis (SIN) [Bredenbeek et al. , Journal of Virology 67: 6439-6446 (1993)] and Semliki Forest Virus (SFV) [Lilgestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9: 1356-1361 (1991)] developed from several different alpha viruses. .. The RP vaccine delivers the proliferative alphavirus RNA replicon to the host cell, resulting in the expression of the desired antigenic transgene (s) in vivo [Pushko et al. , Virology 239 (2): 389-401 (1997)]. RP has an attractive safety and efficacy profile when compared to some conventional vaccine formulations [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13 (1): 1-9. (2012)]. The RP platform has been used to encode pathogenic antigens and is the basis for several USDA-approved vaccines for pigs and poultry.
特に、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、特にベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、全身の抗ウイルス状態を触媒し、致命的なウイルス攻撃から防御する［Ｋｏｎｏｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８３ （２９）：１２４３２−１２４４２（２００９）］、特に***ウイルスに対する迅速な防御を誘導する［Ｓｅｇｕｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１０）：５４４７−５４６０（２０１３）］ことが報告されている。したがって、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は生ウイルスに対する自然免疫応答を増強するため、免疫応答に有害であると予想されるため、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をワクチン中で改変生ウイルスと組み合わせるべきではないように思われる。 In particular, alphavirus RNA replicon particles, especially Venezuelan encephalitis (VEE) alphavirus RNA replicon particles, catalyze systemic antiviral conditions and protect against lethal viral attacks [Konopka et al. , J. Virol. , 83 (29): 12432-12442 (2009)], in particular inducing rapid defense against foot-and-mouth disease virus [Segundo et al. , J. Virol. , 87 (10): 5447-5460 (2013)] has been reported. Therefore, alphavirus RNA replicon particles should not be combined with modified live virus in vaccines, as alphavirus RNA replicon particles are expected to be detrimental to the immune response as they enhance the innate immune response to live virus. Seem.
本明細書中の任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。 Citations of any references herein should not be construed as an endorsement that such references are available as "prior art" to the present application.
したがって、本発明は、１つまたは複数のネコ病原体からの１つまたは複数の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、１つまたは複数の改変された生ネコ病原体と共に含む免疫原性組成物を含む。本発明の免疫原性組成物の全てが、多価ワクチンにも使用され得る。このタイプの特定の実施形態では、ワクチン接種される対象がネコである。さらに特定の実施形態では、ワクチン接種される対象がイエネコである。本発明の免疫原性組成物およびワクチンを作製および使用する方法も提供される。 Accordingly, the present invention comprises an immunogenic composition comprising alphavirus RNA replicon particles encoding one or more antigens from one or more feline pathogens, along with one or more modified live cat pathogens. Including. All of the immunogenic compositions of the present invention can also be used in multivalent vaccines. In certain embodiments of this type, the subject to be vaccinated is a cat. In a further specific embodiment, the subject to be vaccinated is a domestic cat. Also provided are methods of making and using the immunogenic compositions and vaccines of the invention.
特定の実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された生ネコ病原体とを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数のネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された生ネコ病原体とを含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数の狂犬病ウイルス抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された生ネコ病原体とを含む。一定の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）である。他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生Ｆ９様ネコカリシウイルス（ＦＣＶ Ｆ９様）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）である。本発明はさらに、これらのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と改変された生ネコ病原体の任意の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、ＦＣＶ抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、ＦｅＬＶ抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、改変された生ＦＶＲ、改変された生ＦＰＬＶ、および改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）を含む。 In certain embodiments, the immunogenic composition comprises alphavirus RNA replicon particles encoding one or more feline calicivirus (FCV) antigens and a modified live cat pathogen. In other embodiments, the immunogenic composition comprises an alphavirus RNA replicon particle encoding one or more feline leukemia virus (FeLV) antigens and a modified live feline pathogen. In yet another embodiment, the immunogenic composition comprises alphavirus RNA replicon particles encoding one or more rabies virus antigens, and a modified live cat pathogen. In certain embodiments, the modified live cat pathogen is feline viral rhinotracheitis virus (FVR). In another embodiment, the modified live cat pathogen is the feline panleukopenopathy virus (FPLV). In yet another embodiment, the modified live cat pathogen is a modified raw Chlamydophila felis. In yet another embodiment, the modified live cat pathogen is a modified live F9-like feline calicivirus (FCV F9-like). In yet another embodiment, the modified live cat pathogen is the modified live Bordetella bronchiseptica. The present invention further provides an immunogenic composition comprising any combination of these alphavirus RNA replicon particles and a modified live cat pathogen. In a specific embodiment of this type, the immunogenic composition is an alphaviral RNA replicon particle encoding an FCV antigen, an alphaviral RNA replicon particle encoding a FeLV antigen, a modified raw FVR, a modified raw FPLV. , And modified raw Chlamydofila virus.
このタイプの一定の実施形態では、免疫原性組成物が、ＦＣＶカプシドタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに特定の実施形態では、ＦＣＶカプシドタンパク質がＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質の抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、ＦＣＶカプシドタンパク質が、強毒全身性ＦＣＶ（ＶＳ−ＦＣＶ）カプシドタンパク質である。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質の抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片とＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。 In certain embodiments of this type, the immunogenic composition comprises alphavirus RNA replicon particles encoding the FCV capsid protein. In a more specific embodiment, the FCV capsid protein is an FCV F9-like capsid protein. In other embodiments, alphavirus RNA replicon particles encode an antigenic fragment of an FCV F9-like capsid protein. In yet another embodiment, the FCV capsid protein is a virulent systemic FCV (VS-FCV) capsid protein. In yet another embodiment, the alphavirus RNA replicon particles encode an antigenic fragment of the VS-FCV capsid protein. In yet another embodiment, the alphavirus RNA replicon particles encode both the FCV F9-like capsid protein or an antigenic fragment thereof and the VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof.
他の実施形態では、免疫原性組成物が、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。より具体的な実施形態では、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む。さらにより具体的な実施形態では、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質が、配列番号１または配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされる。関連する実施形態では、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。このタイプの具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。より具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質が、配列番号３または配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされる。 In another embodiment, the immunogenic composition comprises alphavirus RNA replicon particles encoding the VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof, and the VS-FCV capsid protein is 95 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Includes an amino acid sequence containing% or more identity. In a more specific embodiment, the VS-FCV capsid protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In a more specific embodiment, the VS-FCV capsid protein is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 12. In a related embodiment, the alphavirus RNA replicon particles of the invention encode an FCV F9-like capsid protein or an antigenic fragment thereof. In a specific embodiment of this type, the FCV F9-like capsid protein comprises an amino acid sequence that comprises 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In a more specific embodiment, the FCV F9-like capsid protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In a more specific embodiment of this type, the FCV F9-like capsid protein is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 13.
関連する実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数のネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。一定の実施形態では、ＦｅＬＶ抗原がＦｅＬＶ糖タンパク質（例えば、ｇｐ８５）である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦｅＬＶ ｇｐ８５の抗原性断片をコードする。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質の抗原性断片がＦｅＬＶ ｇｐ７０である。関連する実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質の抗原性断片がＦｅＬＶ ｇｐ４５である。このタイプのより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ８５が、配列番号６のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ８５が、配列番号６のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ８５が、配列番号５または配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされる。関連する実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ７０が、配列番号８のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ７０が、配列番号８のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ７０が、配列番号７または配列番号１５のヌクレオチド配列によってコードされる。 In a related embodiment, the immunogenic composition comprises alphavirus RNA replicon particles encoding one or more feline leukemia virus (FeLV) antigens. In certain embodiments, the FeLV antigen is a FeLV glycoprotein (eg, gp85). In other embodiments, alphavirus RNA replicon particles encode an antigenic fragment of FeLV gp85. In a more specific embodiment of this type, the antigenic fragment of the FeLV glycoprotein is FeLV gp70. In a related embodiment, the antigenic fragment of the FeLV glycoprotein is FeLV gp45. In a more specific embodiment of this type, FeLV gp85 comprises an amino acid sequence comprising 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In a more specific embodiment of this type, FeLV gp85 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In a more specific embodiment of this type, FeLV gp85 is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 14. In a related embodiment, FeLV gp70 comprises an amino acid sequence that comprises 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In a more specific embodiment of this type, FeLV gp70 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In a more specific embodiment of this type, FeLV gp70 is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 15.
さらに他の実施形態では、免疫原性組成物が、狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、狂犬病ウイルスＧの抗原性断片をコードする。このタイプのより具体的な実施形態では、狂犬病ウイルスＧが、配列番号１０のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのなおさらに具体的な実施形態では、狂犬病ウイルスＧが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、狂犬病ウイルスＧが、配列番号９または配列番号１６のヌクレオチド配列によってコードされる。 In yet another embodiment, the immunogenic composition comprises alphavirus RNA replicon particles encoding rabies virus glycoprotein (G). In yet another embodiment, alphavirus RNA replicon particles encode an antigenic fragment of rabies virus G. In a more specific embodiment of this type, the rabies virus G comprises an amino acid sequence that comprises 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In a more specific embodiment of this type, rabies virus G comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In a more specific embodiment of this type, rabies virus G is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 16.
特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。このタイプのより具体的な実施形態では、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＴＣ−８３ ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、シンドビス（ＳＩＮ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。代替実施形態では、裸のＤＮＡベクターが、１つまたは複数のネコ病原体に由来する１つまたは複数の抗原をコードする。このタイプの特定の実施形態では、裸のＤＮＡベクターが、ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。このタイプの具体的な実施形態では、裸のＤＮＡベクターが、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。このタイプの他の実施形態では、裸のＤＮＡベクターがＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードする。 In certain embodiments, the alphavirus RNA replicon particles are Venezuelan encephalitis (VEE) alphavirus RNA replicon particles. In a more specific embodiment of this type, the VEE alphavirus RNA replicon particle is a TC-83 VEE alphavirus RNA replicon particle. In another embodiment, the alphavirus RNA replicon particles are Sindvis (SIN) alphavirus RNA replicon particles. In yet another embodiment, the alphavirus RNA replicon particles are Semliki Forest Virus (SFV) alphavirus RNA replicon particles. In an alternative embodiment, the naked DNA vector encodes one or more antigens from one or more feline pathogens. In certain embodiments of this type, the naked DNA vector encodes the FCV capsid protein or antigenic fragment thereof. In a specific embodiment of this type, a naked DNA vector encodes a VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof. In other embodiments of this type, the naked DNA vector encodes FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof.
一定の実施形態では、免疫原性組成物が、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、１つまたは複数のＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、１つまたは複数のＦｅＬＶ糖タンパク質またはその抗原性断片、ならびに／あるいは１つまたは複数の狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含むことができる。このタイプの特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片とＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。関連する実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片とＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片の両方をコードする。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片とＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片の両方をコードする。別の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片と狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片と狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片、および狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードする。別の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片、およびＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片、狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片、およびＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片、および狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片、および狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードする。 In certain embodiments, the immunogenic composition comprises at least one modified live cat pathogen and one or more FCV capsid proteins or antigenic fragments thereof, or one or more FeLV glycoproteins or antigenicity thereof. Fragments and / or alphavirus RNA replicon particles encoding one or more mad dog disease virus G proteins or antigenic fragments thereof can be included. In certain embodiments of this type, alphavirus RNA replicon particles encode both the VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof and the FCV F9-like capsid protein or an antigenic fragment thereof. In a related embodiment, the alphavirus RNA replicon particle encodes both the VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof and FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof. In other embodiments, alphavirus RNA replicon particles encode both FCV F9-like capsid protein or an antigenic fragment thereof and FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof. In another embodiment, the alphavirus RNA replicon particles encode both the VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof and the rabies virus G protein or an antigenic fragment thereof. In yet another embodiment, the alphavirus RNA replicon particles encode both the FCV F9-like capsid protein or an antigenic fragment thereof and the rabies virus G protein or an antigenic fragment thereof. In yet another embodiment, the alphavirus RNA replicon particles encode the VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof, FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof, and the rabies virus G protein or an antigenic fragment thereof. In another embodiment, alphavirus RNA replicon particles encode a VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof, an FCV F9-like capsid protein or an antigenic fragment thereof, and FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof. In yet another embodiment, the alphavirus RNA replicon particles are VS-FCV capsid protein or antigenic fragment thereof, FeLV gp85 or antigenic fragment thereof, mad dog disease virus G protein or antigenic fragment thereof, and FCV F9-like capsid protein or Encodes the antigenic fragment. In yet another embodiment, the alphavirus RNA replicon particles encode FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof, and a rabies virus G protein or an antigenic fragment thereof. In yet another embodiment, alphavirus RNA replicon particles encode FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof, FCV F9-like capsid protein or an antigenic fragment thereof, and rabies virus G protein or an antigenic fragment thereof.
したがって、本発明は、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、複数のネコ病原体抗原をコードする本発明のいずれか１つまたは複数のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または単一ネコ病原体抗原をコードする本発明のいずれか１つまたは複数のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ＦＶＲである。他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ＦＰＬＶである。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ＦＣＶ Ｆ９様である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）である。特定の実施形態では、２つ以上の改変された生ネコ病原体が免疫原性組成物に含まれる。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、改変された生ＦＶＲおよび改変された生クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）を含む。他の実施形態では、３つ以上の改変された生ネコ病原体が免疫原性組成物に含まれる。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、改変された生ＦＶＲ、改変された生クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）を含み、改変された生ネコ病原体がＦＰＬＶである。さらに他の実施形態では、４つ以上の改変された生ネコ病原体が免疫原性組成物に含まれる。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、改変された生ＦＶＲ、改変された生クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、改変された生ＦＰＬＶ、および改変された生Ｆ９様ＦＣＶを含む。特定の実施形態では、免疫原性組成物中のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の全てが、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。さらにより具体的な実施形態では、免疫原性組成物中のＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の全てが、ＴＣ−８３ ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。 Accordingly, the invention encodes at least one modified live cat pathogen and any one or more alphavirus RNA replicon particles and / or single cat pathogen antigens of the invention encoding multiple cat pathogen antigens. Provided is an immunogenic composition comprising any one or more of the alphavirus RNA replicon particles of the present invention. In certain embodiments, the modified live cat pathogen is a modified live FVR. In another embodiment, the modified live feline pathogen is a modified live FPLV. In yet another embodiment, the modified live cat pathogen is a modified raw Chlamydophila felis. In yet another embodiment, the modified live cat pathogen is modified raw FCV F9-like. In yet another embodiment, the modified live cat pathogen is the modified live Bordetella bronchiseptica. In certain embodiments, the immunogenic composition comprises two or more modified live cat pathogens. In a specific embodiment of this type, the immunogenic composition comprises a modified raw FVR and a modified raw Chlamydophila. In other embodiments, the immunogenic composition comprises three or more modified live cat pathogens. In a specific embodiment of this type, the immunogenic composition comprises a modified raw FVR, a modified raw Chlamydophila, and the modified live feline pathogen is FPLV. In yet another embodiment, the immunogenic composition comprises four or more modified live cat pathogens. In a specific embodiment of this type, the immunogenic composition comprises a modified raw FVR, a modified raw Chlamydophila, a modified raw FPLV, and a modified raw F9-like FCV. In certain embodiments, all of the alphavirus RNA replicon particles in the immunogenic composition are Venezuelan encephalitis (VEE) alphavirus RNA replicon particles. In a more specific embodiment, all of the VEE alphavirus RNA replicon particles in the immunogenic composition are TC-83 VEE alphavirus RNA replicon particles.
さらなる実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、他のネコ病原体に由来するタンパク質抗原（またはその抗原性断片）をコードし得る。このタイプの特定の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコニューモウイルス（ＦＰＮ）に由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコ免疫不全ウイルスに由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコインフルエンザウイルスに由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）に由来する。 In a further embodiment, alphavirus RNA replicon particles can encode protein antigens (or antigenic fragments thereof) derived from other feline pathogens. In certain embodiments of this type, the protein antigen is derived from the human metapneumovirus (FPN). In yet another embodiment, the protein antigen is derived from cat parvovirus (FPV). In yet another embodiment, the protein antigen is derived from the feline infectious peritonitis virus (FIPV). In yet another embodiment, the protein antigen is derived from the feline immunodeficiency virus. In yet another embodiment, the protein antigen is derived from the Borna disease virus (BDV). In yet another embodiment, the protein antigen is derived from the feline influenza virus. In yet another embodiment, the protein antigen is derived from feline coronavirus (FCOV).
本発明はさらに、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、本発明の１つまたは複数の改変された生（例えば、弱毒化）ネコ病原体と共に、死滅ネコ病原体と共に含む免疫原性組成物および／またはワクチン（多価ワクチン）を提供する。特定の実施形態では、免疫原性組成物が、死滅クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、および／または死滅ＦＶＲ、および／または死滅Ｆ９様ＦＣＶ、および／または死滅ＶＳ−ＦＣＶ、および／または死滅ＦｅＬＶ、および／または死滅ＦＰＬＶをさらに含み得る。一定の実施形態では、ワクチンが、免疫学的有効量の１つまたは複数のこれらの免疫原性組成物を含む。 The present invention further comprises an immunogenic composition and / or an immunogenic composition comprising the alphavirus RNA replicon particles of the present invention together with one or more modified live (eg, attenuated) cat pathogens of the invention, along with a dead cat pathogen. Provide a vaccine (multivalent vaccine). In certain embodiments, the immunogenic composition is Chlamydia felis, and / or FVR, and / or F9-like FCV, and / or VS-FCV, and / or FeLV, which is dead. And / or dead FPLV may be further included. In certain embodiments, the vaccine comprises an immunologically effective amount of one or more of these immunogenic compositions.
本発明は、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンおよび多価ワクチンをさらに含む。特定の実施形態では、多価ワクチンが非アジュバントワクチンである。一定の実施形態では、ワクチンが、ＦＣＶ、および／またはＦｅＬＶ、および／またはＦＶＲ、および／またはＦＰＬＶ、および／または狂犬病ウイルス、および／またはクラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）による疾患の予防を助ける。関連する実施形態では、ネコがワクチンで免疫されると、ネコ対象で抗体が誘導される。本発明はさらに、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および裸のＤＮＡベクターの全てを含む。 The present invention further includes vaccines and multivalent vaccines comprising the immunogenic compositions of the present invention. In certain embodiments, the multivalent vaccine is a non-adjuvant vaccine. In certain embodiments, the vaccine helps prevent disease by FCV and / or FeLV, and / or FVR, and / or FPLV, and / or rabies virus, and / or Chlamydophila felis. In a related embodiment, when a cat is immunized with a vaccine, antibodies are induced in the cat subject. The present invention further includes all of the alphavirus RNA replicon particles and naked DNA vectors of the present invention.
本発明はまた、ネコ病原体、例えばＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、免疫学的有効量の本発明のワクチンまたは多価ワクチンをネコに投与するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンが筋肉内注射を介して投与される。代替実施形態では、ワクチンが皮下注射を介して投与される。他の実施形態では、ワクチンが静脈内注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンが皮内注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンが経皮注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンが経口投与を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンが鼻腔内投与を介して投与される。具体的な実施形態では、ネコがイエネコである。 The present invention also provides a method of immunizing a cat against a cat pathogen, such as FCV, which comprises the step of administering to the cat an immunologically effective amount of the vaccine or polyvalent vaccine of the invention. In certain embodiments, the vaccine is administered via intramuscular injection. In an alternative embodiment, the vaccine is administered via subcutaneous injection. In other embodiments, the vaccine is administered via intravenous injection. In yet another embodiment, the vaccine is administered via intradermal injection. In yet another embodiment, the vaccine is administered via transdermal injection. In yet another embodiment, the vaccine is administered via oral administration. In yet another embodiment, the vaccine is administered via intranasal administration. In a specific embodiment, the cat is a domestic cat.
本発明のワクチンおよび多価ワクチンは、プライマーワクチンおよび／またはブースターワクチンとして投与され得る。具体的な実施形態では、本発明のワクチンが、その後の投与を必要とせずに、単発ワクチン（１回用量）として投与される。一定の実施形態では、プライマーワクチンとブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンおよびブースターワクチンが、同一経路によって投与され得る。このタイプの一定の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンが共に皮下注射によって投与される。代替実施形態では、プライマーワクチンとブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンの投与がある経路によって実施され、ブースターワクチンが別の経路によって実施され得る。このタイプの一定の実施形態では、プライマーワクチンが皮下注射によって投与され、ブースターワクチンが経口投与され得る。 The vaccines and multivalent vaccines of the present invention can be administered as primer vaccines and / or booster vaccines. In a specific embodiment, the vaccine of the invention is administered as a single dose vaccine without the need for subsequent administration. In certain embodiments, in the case of administration of both the primer vaccine and the booster vaccine, the primer vaccine and the booster vaccine can be administered by the same route. In certain embodiments of this type, both primer and booster vaccines are administered by subcutaneous injection. In an alternative embodiment, in the case of administration of both the primer vaccine and the booster vaccine, the primer vaccine may be administered by one route and the booster vaccine may be administered by another route. In certain embodiments of this type, the primer vaccine can be administered by subcutaneous injection and the booster vaccine can be administered orally.
本発明はさらに、ＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、免疫学的有効量の上記の本発明のワクチンをネコに注射するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンが、例えば、約１×１０４〜約１×１０１０個のＲＰまたはそれ以上を含み得る。さらに特定の実施形態では、ワクチンが、約１×１０５〜約１×１０９個のＲＰを含み得る。さらにより特定の実施形態では、ワクチンが、約１×１０６〜約１×１０８個のＲＰを含み得る。特定の実施形態では、ネコがイエネコである。 The present invention further provides a method of immunizing a cat against FCV, comprising injecting an immunologically effective amount of the vaccine of the invention described above into the cat. In certain embodiments, the vaccine may comprise, for example, about 1 × 10 4 to about 1 × 10 10 RPs or more. In a more specific embodiment, the vaccine may comprise from about 1 × 10 5 ~ about 1 × 10 9 RP. In an even more specific embodiment, the vaccine may contain from about 1 × 10 6 to about 1 × 10 8 RPs. In certain embodiments, the cat is a domestic cat.
特定の実施形態では、本発明のワクチンが、０．０５ｍＬ〜３ｍＬ用量で投与される。さらに特定の実施形態では、投与される用量が０．１ｍＬ〜２ｍＬである。なおさらに特定の実施形態では、投与される用量が０．２ｍＬ〜１．５ｍＬである。さらにより特定の実施形態では、投与される用量が０．３〜１．０ｍＬである。なおさらに特定の実施形態では、投与される用量が０．４ｍＬ〜０．８ｍＬである。 In certain embodiments, the vaccine of the invention is administered at a dose of 0.05 mL to 3 mL. In a more specific embodiment, the dose administered is 0.1 mL-2 mL. In yet even more specific embodiments, the dose administered is 0.2 mL to 1.5 mL. In an even more specific embodiment, the dose administered is 0.3-1.0 mL. In yet even more specific embodiments, the dose administered is 0.4 mL to 0.8 mL.
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解されよう。 These and other aspects of the invention will be better understood by reference to the detailed description below.
本発明は、安全で有効な多価ワクチンを提供する。特定の実施形態では、ワクチンが非アジュバントである。本発明のこの態様では、ワクチンがネコ注射部位肉腫を誘発しないが、それでもネコカリシウイルス（ＦＣＶ）および／またはネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）による感染、ならびにネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、および／またはネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）、および／または生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）による感染によって引き起こされる疾患からのワクチン接種ネコ（ｖａｃｃｉｎａｔｅｓ）の防御を助ける。 The present invention provides a safe and effective multivalent vaccine. In certain embodiments, the vaccine is non-adjuvant. In this aspect of the invention, the vaccine does not induce feline injection site sarcoma, but is still infected with feline calicivirus (FCV) and / or feline leukopen virus (FeLV), and feline viral rhinotracheitis virus (FVR), and / Or help protect vaccinated cats from diseases caused by infection with the feline panleukopenopathy virus (FPLV) and / or raw Chlamydofila felis.
アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子による自然免疫系の既知の増強にもかかわらず、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と改変された生ウイルスの両方を含む本発明の多価ワクチンは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が改変された生ウイルスの免疫学的効果を有意に妨害することなく、予想外に安全で有効である。 Despite the known enhancement of the natural immune system by alphavirus RNA replicon particles, the multivalent vaccine of the invention containing both alphavirus RNA replicon particles and modified live virus modified alphavirus RNA replicon particles. It is unexpectedly safe and effective without significantly interfering with the immunological effects of the live virus.
実際、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、特にベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、全身の抗ウイルス状態を触媒し、致命的なウイルス攻撃から防御することが以前示された［Ｋｏｎｏｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８３（２９）：１２４３２−１２４４２（２００９）］。さらに、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、***ウイルスに対する迅速な防御を誘導することが報告されている［Ｓｅｇｕｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１０）：５４４７−５４６０（２０１３）］。したがって、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と改変された生ウイルスの両方を含むワクチンは、改変された生ウイルスの免疫学的効果の実質的な阻害をもたらすと予測されただろう。しかしながら、驚くべきことに、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の存在による自然免疫応答の増強は、付随する改変された生ウイルスによって誘導される免疫応答に有害ではないことが判明した。 In fact, alphavirus RNA replicon particles, especially Venezuelan encephalitis (VEE) alphavirus RNA replicon particles, have previously been shown to catalyze systemic antiviral conditions and protect against deadly viral attacks [Konopka et al. , J. Virol. , 83 (29): 12432-12442 (2009)]. In addition, VEE alpha virus RNA replicon particles have been reported to induce rapid defense against foot-and-mouth disease virus [Segundo et al. , J. Virol. , 87 (10): 5447-5460 (2013)]. Therefore, a vaccine containing both alphavirus RNA replicon particles and the modified live virus would have been predicted to result in a substantial inhibition of the immunological effects of the modified live virus. Surprisingly, however, it was found that the enhancement of the innate immune response by the presence of alphavirus RNA replicon particles was not detrimental to the immune response induced by the accompanying modified live virus.
したがって、特定の態様では、本発明は、ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片および／またはＦｅＬＶ ｇｐ８５もしくはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、改変された生ネコＦＶＲ、および／または改変された生ＦＰＬＶ、および／または改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）と共に含むワクチンを提供する。本発明のさらに別の態様では、ワクチンが、ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片および／またはＦｅＬＶ ｇｐ８５もしくはその抗原性断片をコードする裸のＤＮＡベクターを、改変された生ネコＦＶＲ、および／または改変された生ネコＦＰＬＶ、および／または改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）と共に含む。 Thus, in certain embodiments, the present invention presents modified live feline FVR and / or modifications of alphavirus RNA replicon particles encoding the FCV capsid protein or antigenic fragment thereof and / or FeLV gp85 or antigenic fragment thereof. Provided are vaccines containing live FPLV and / or modified live Chlamydofila virus. In yet another aspect of the invention, the vaccine is a modified live feline FVR and / or a modification of a bare DNA vector encoding the FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof and / or FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof. Included with raw feline FPLV and / or modified raw Chlamydia felis.
本発明のワクチンは、アジュバントの非存在下でネコに投与することができ、依然としてＦＣＶに対するワクチン接種されたネコの防御を有効に助けることができる。 The vaccine of the present invention can be administered to cats in the absence of adjuvants and can still effectively assist the protection of vaccinated cats against FCV.
本発明をより完全に理解するために、以下の定義が提供される。 To better understand the invention, the following definitions are provided.
説明における便宜上の単数の用語の使用は、決してそのように限定することを意図するものではない。よって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含む組成物への言及は、１つまたは複数のこのようなポリペプチドへの言及を含む。さらに、「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」への言及は、特に指示されない限り、複数のこのようなアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への言及を含む。 The use of the singular term for convenience in the description is by no means intended to be so limiting. Thus, for example, a reference to a composition comprising "a polypeptide" includes a reference to one or more such polypeptides. Furthermore, references to "alphavirus RNA replicon particles" include a plurality of such references to alphavirus RNA replicon particles, unless otherwise indicated.
本明細書で使用される場合、「およそ」という用語は、「約」という用語と互換的に使用され、値が、指示される値の５０パーセント以内であることを示す、すなわち、１ミリリットル当たり「およそ」１×１０８個のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する組成物は、１ミリリットル当たり０．５×１０８〜１．５×１０８個のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する。 As used herein, the term "approximately" is used interchangeably with the term "about" to indicate that the value is within 50% of the indicated value, i.e., per milliliter. "approximately" 1 × 10 composition containing eight alphavirus RNA replicon particles contain 0.5 × 10 8 ~1.5 × 10 8 per milliliter or alphavirus RNA replicon particles.
本明細書で使用される場合、「ネコ」という用語は、ネコ科（Ｆｅｌｉｄａｅ）の任意のメンバーを指す。イエネコ、純血種および／または雑種の伴侶ネコ、ならびに野生または野生化したネコが全てネコである。 As used herein, the term "cat" refers to any member of the feline family (Felidae). Domestic cats, purebred and / or hybrid companion cats, and wild or wild cats are all cats.
本明細書で使用される場合、「レプリコン」という用語は、存在する場合に、細胞培養物または動物宿主で親ウイルスの増殖を成功させることができる１つまたは複数の要素（例えば、構造タンパク質のコード配列）を欠く改変されたＲＮＡウイルスゲノムを指す。適切な細胞状況では、レプリコンは自身を増幅し、１つまたは複数のサブゲノムＲＮＡ種を産生し得る。 As used herein, the term "replicon", when present, can be used to successfully propagate the parent virus in a cell culture or animal host, such as for structural proteins. Refers to a modified RNA viral genome lacking a coding sequence). Under appropriate cellular conditions, the replicon can amplify itself and produce one or more subgenome RNA species.
本明細書で使用される場合、「ＲＰ」と略される「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」という用語は、構造タンパク質、例えば、Ｐｕｓｈｋｏら［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９（２）：３８９−４０１（１９９７）］によって記載されるように、同様にアルファウイルスに由来するカプシドおよび糖タンパク質にパッケージングされたアルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである。レプリコンはアルファウイルスの構造成分（例えば、カプシドおよび糖タンパク質）をコードしないため、ＲＰは（ヘルパープラスミドまたは類似の成分なしで）細胞培養物または動物宿主で増殖できない。 As used herein, the term "alphavirus RNA replicon particles", abbreviated as "RP", is described by structural proteins such as Pushko et al. [Virology 239 (2): 389-401 (1997)]. As is, it is an alphavirus-derived RNA replicon also packaged in alphavirus-derived capsids and glycoproteins. Replicon does not encode structural components of alphavirus (eg, capsids and glycoproteins), so RP cannot grow in cell cultures or animal hosts (without helper plasmids or similar components).
「ＦＣＶ Ｆ９様」および「Ｆ９様ＦＣＶ」という用語は、相互におよび「古典的ＦＣＶ」という用語と互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ＦＣＶ Ｆ９株が典型的代表と考えられるＦＣＶの古い、以前のユニバーサルワクチン株として特徴付けられ得るＦＣＶである。直接対照的に、強毒全身性「ＶＳ−ＦＣＶ」または本明細書で互換的に使用される「（ＶＳ）ＦＣＶ」と呼ばれるＦＣＶは、異常に毒性であり、ＦＣＶ Ｆ９様株の抗体によって中和できない新たなクラスのＦＣＶである［米国特許第７４４９３２３号明細書；Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，３８（２）Ｖｅｔ ｒｅｓ．３１９−３３５ （２００７）参照］。 The terms "FCV F9-like" and "F9-like FCV" are used interchangeably and interchangeably with the term "classical FCV" and, as used herein, the FCV F9 strain is considered to be a typical representative. FCVs that can be characterized as older, earlier universal vaccine strains of FCVs. In direct contrast, FCVs called virulent systemic "VS-FCVs" or "(VS) FCVs" used interchangeably herein are abnormally toxic and are moderated by antibodies to FCV F9-like strains. A new class of FCV that cannot be harmonized [US Pat. No. 7,449,323; Radford et al. , 38 (2) Vet res. See 319-335 (2007)].
「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅ ｆｒｏｍ）」、「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ）」および「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ ｆｒｏｍ）」という用語は、所与のタンパク質抗原およびそれを天然でコードする病原体またはその病原体の株に関して互換的に使用され、本明細書で使用される場合、その所与のタンパク質抗原の非改変および／または切断アミノ酸配列が、その病原体またはその病原体の株によってコードされていることを意味する。病原体に由来するタンパク質抗原についての本発明の核酸構築物内のコード配列は、病原体または病原体の株（自然弱毒化株を含む）におけるそのタンパク質抗原の対応する配列に対して発現されたタンパク質抗原のアミノ酸配列の改変および／または切断をもたらすように遺伝子操作されたかもしれない。 The terms "originate from", "originates from" and "originating from" are compatible with respect to a given protein antigen and a pathogen that naturally encodes it or a strain of that pathogen. As used herein, it means that the unmodified and / or cleaved amino acid sequence of a given protein antigen is encoded by the pathogen or strain of the pathogen. The coding sequence within the nucleic acid construct of the invention for a protein antigen derived from a pathogen is the amino acid of the protein antigen expressed for the corresponding sequence of the protein antigen in the pathogen or strain of the pathogen (including naturally attenuated strains). It may have been genetically engineered to result in sequence modification and / or cleavage.
本明細書で使用される場合、「防御する」、または「防御を提供する」、または「防御免疫を誘発する」、「疾患の予防を助ける」、および「防御を助ける」という用語は、感染の兆候からの完全な防御を要しない。例えば、「防御を助ける」は、防御が、攻撃後、基礎となる感染の症状が少なくとも減少する、ならびに／あるいは根底にある細胞、生理学的もしくは生化学的原因または症状を引き起こす機序の１つまたは複数が減少するおよび／または排除されるように十分であることを意味することができる。この文脈で使用される「減少する」は、感染の生理学的状態だけでなく、感染の分子状態を含む、感染の状態に関連することを意味する。 As used herein, the terms "protect" or "provide protection", or "induce protective immunity", "help prevent disease", and "help defense" are infections. Does not require complete protection from the signs of. For example, "helping defense" is one of the mechanisms by which defense causes at least a reduction in the symptoms of the underlying infection and / or the underlying cell, physiological or biochemical cause or symptom after the attack. Or it can mean that more than one is sufficient to be reduced and / or eliminated. As used in this context, "decreasing" means being associated with an infectious state, including the molecular state of the infectious as well as the physiological state of the infectious.
本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、動物に投与すると、野生型微生物による感染から生じる疾患からの防御を最小限助けるのに十分強力な、すなわち、疾患の予防を助ける、および／または疾患を予防、改善もしくは治癒するのに十分強力な免疫応答を誘導する、典型的には水を含有する液体などの薬学的に許容される担体と組み合わせた１つまたは複数の抗原を含む、動物、例えばネコ（一定の実施形態では、ヒトを含むが、他の実施形態では、具体的にヒトではない）に施用するのに適した組成物である。 As used herein, a "vaccine", when administered to an animal, is strong enough to minimize protection from disease resulting from infection by wild-type microorganisms, i.e., to help prevent disease, and /. Alternatively, it comprises one or more antigens in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, such as a liquid containing water, which induces a strong enough immune response to prevent, ameliorate or cure the disease. The composition is suitable for application to animals, such as cats (in certain embodiments, it comprises humans, but in other embodiments, it is not specifically human).
本明細書中で使用される場合、多価ワクチンは、２つ以上の異なる抗原を含むワクチンである。このタイプの特定の実施形態では、多価ワクチンが、２つ以上の異なる病原体に対するレシピエントの免疫系を刺激する。 As used herein, a multivalent vaccine is a vaccine that contains two or more different antigens. In certain embodiments of this type, the multivalent vaccine stimulates the recipient's immune system against two or more different pathogens.
「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書で互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。これに関連して、アジュバントは、１つまたは複数のワクチン抗原／分離株に対する免疫応答を増強するために使用される。したがって、「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を非特異的に増加させ、したがって、任意の所与のワクチンに必要な抗原の量、および／またはの目的の抗原に対する十分な免疫応答を生成するために必要な注射の頻度を減少させる薬剤である。これに関連して、アジュバントは、１つまたは複数のワクチン抗原／分離株に対する免疫応答を増強するために使用される。例えば、アメリカ猫獣医師協会のネコワクチン接種ガイドラインは、非アジュバントＦｅＬＶワクチンの使用を提案している［ＡＡＦＰ Ｆｅｌｉｎｅ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｐａｎｅｌ， １５：７８５−８０８ （２０１３）］。 The terms "adjuvant" and "immune stimulant" are used interchangeably herein and are defined as one or more substances that cause stimulation of the immune system. In this regard, adjuvants are used to enhance the immune response to one or more vaccine antigens / isolates. Thus, an "adjuvant" non-specifically increases the immune response to a particular antigen, thus producing a sufficient amount of antigen required for any given vaccine and / or a sufficient immune response to the antigen of interest. It is a drug that reduces the frequency of injections required to do this. In this regard, adjuvants are used to enhance the immune response to one or more vaccine antigens / isolates. For example, the Cat Veterinary Association's Cat Vaccination Guidelines suggest the use of non-adjuvant FeLV vaccines [AAFP Feline Adjuvant Panel, 15: 785-808 (2013)].
本明細書中で使用される場合、「非アジュバントワクチン」は、アジュバントを含有しないワクチンまたは多価ワクチンである。 As used herein, a "non-adjuvant vaccine" is an adjuvant-free or multivalent vaccine.
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、修飾された名詞が医薬品での使用に適切であることを意味するために形容詞的に使用される。これが、例えば、医薬品ワクチンの賦形剤を説明するために使用される場合、これは、その賦形剤が組成物の他の成分と適合性であり、意図したレシピエント動物、例えばネコに不利に有害ではないとして特徴付ける。 As used herein, the term "pharmaceutically acceptable" is used adjectively to mean that a modified noun is suitable for use in a pharmaceutical product. When this is used, for example, to describe an excipient for a pharmaceutical vaccine, it is disadvantageous to the intended recipient animal, eg cat, because the excipient is compatible with the other components of the composition. Characterized as not harmful to.
「非経口投与」は、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および注入を含む。 "Parental administration" includes subcutaneous injection, submucosal injection, intravenous injection, intramuscular injection, intradermal injection and infusion.
本明細書で使用される場合、特定のタンパク質（例えば、タンパク質抗原）に関する「抗原性断片」という用語は、抗原性である、すなわち、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができるそのタンパク質の断片である。例えば、ＦＣＶカプシドタンパク質の抗原性断片は、抗原性であるカプシドタンパク質の断片である。好ましくは、本発明の抗原性断片は、抗体および／またはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である。特定の実施形態では、所与のタンパク質抗原に関する抗原性断片が、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも２５％を保持するそのタンパク質の断片である。好ましい実施形態では、抗原性断片が、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも５０％を保持する。より好ましい実施形態では、抗原性断片が、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも７５％を保持する。抗原性断片は、２０個のアミノ酸程度の小さなものである場合もあれば、その一方で、完全長タンパク質から１個のアミノ酸だけが失われている大きな断片である場合もある。特定の実施形態では、抗原性断片が、２５〜１５０個のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、抗原性断片が、５０〜２５０個のアミノ酸残基を含む。例えば、ＦｅＬＶの場合、ＦｅＬＶ ｇｐ４５糖タンパク質およびＦｅＬＶ ｇｐ７０糖タンパク質はＦｅＬＶ ｇｐ８５糖タンパク質の抗原性断片であるが、ＦＣＶの場合、ＦＣＶカプシドタンパク質の１つの抗原性断片がＯＲＦ２の領域Ｅを含む。 As used herein, the term "antigenic fragment" for a particular protein (eg, a protein antigen) is antigenic, i.e. an immune system such as an immunoglobulin (antibody) or T-cell antigen receptor. A fragment of the protein capable of specifically interacting with the antigen-recognizing molecule of. For example, an antigenic fragment of an FCV capsid protein is a fragment of an antigenic capsid protein. Preferably, the antigenic fragments of the invention are immunodominant for antibody and / or T cell receptor recognition. In certain embodiments, the antigenic fragment for a given protein antigen is the fragment of that protein that retains at least 25% of the antigenicity of the full-length protein. In a preferred embodiment, the antigenic fragment retains at least 50% of the antigenicity of the full-length protein. In a more preferred embodiment, the antigenic fragment retains at least 75% of the antigenicity of the full-length protein. The antigenic fragment may be as small as 20 amino acids, while it may be a large fragment in which only one amino acid is lost from a full-length protein. In certain embodiments, the antigenic fragment comprises 25-150 amino acid residues. In other embodiments, the antigenic fragment comprises 50-250 amino acid residues. For example, in the case of FeLV, the FeLV gp45 glycoprotein and the FeLV gp70 glycoprotein are antigenic fragments of the FeLV gp85 glycoprotein, whereas in the case of FCV, one antigenic fragment of the FCV capsid protein comprises region E of ORF2.
本明細書で使用する場合、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合、１つのアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列と１００％「同一」であるまたは１００％の「同一性」を有する。したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合、あるアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列と５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えば比較されるタンパク質、またはポリペプチドの一部に含まれるアミノ酸残基の連続ブロックにわたって行われる。特定の実施形態では、２つのアミノ酸配列間の対応を変える可能性がある選択された欠失または挿入が考慮される。 As used herein, one amino acid sequence is 100% "identical" or 100% "identity" with the second amino acid sequence if the amino acid residues of both sequences are identical. Thus, if 50% of the amino acid residues of the two amino acid sequences are identical, then one amino acid sequence is 50% "identical" to the second amino acid sequence. Sequence comparison is performed over a continuous block of amino acid residues contained in a given protein, eg, the protein being compared, or part of a polypeptide. In certain embodiments, selected deletions or insertions that may change the correspondence between the two amino acid sequences are considered.
本明細書で使用する場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列同一性％は、アラインメント・デフォルト・パラメータおよび同一性についてのデフォルトパラメータと共にＣ， ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ， Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ、ＮＣ ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ， Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ ＰＬＣ（１９９６）およびＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを用いて決定することができる。これらの市販のプログラムを使用して、同一または類似のデフォルトパラメータを用いて配列類似性を決定することもできる。あるいは、例えば、デフォルトパラメータを使用するＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージ用プログラムマニュアル、バージョン７、マディソン、ウィスコンシン州）パイルアッププログラムを使用して、デフォルトフィルター条件下でのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ検索を使用することができる。 As used herein,% sequence identity of nucleotides and amino acids, along with alignment default parameters and default parameters for identity, are C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Infomax, It can be determined using Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) and the Bluestal W algorithm. These off-the-shelf programs can also be used to determine sequence similarity with the same or similar default parameters. Alternatively, use an Advanced Blast search under default filter conditions, for example, using a GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for GCG Packages, Version 7, Madison, Wisconsin) pile-up program that uses default parameters. Can be done.
本明細書で使用される場合、「不活性化」微生物という用語は、「死滅」微生物という用語と互換的に使用される。本発明の目的のために、「不活性化」微生物は、動物で免疫応答を誘発することができるが、動物に感染することができない生物である。本発明の抗原（例えば、不活化ネコカリシウイルス）は、バイナリーエチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ホルマリン、β−プロピオラクトン、チメロサール、または熱からなる群から選択される因子によって不活化され得る。特定の実施形態では、本発明のＲＰと組み合わされた不活性化ネコカリシウイルス分離株が、バイナリーエチレンイミンによって不活性化される。 As used herein, the term "inactivated" microorganism is used interchangeably with the term "killed" microorganism. For the purposes of the present invention, an "inactivated" microorganism is an organism that can elicit an immune response in an animal but cannot infect an animal. The antigen of the invention (eg, inactivated feline calicivirus) can be inactivated by a factor selected from the group consisting of binary ethyleneimine, formalin, β-propiolactone, thimerosal, or heat. In certain embodiments, the inactivated feline calicivirus isolate combined with the RP of the invention is inactivated by binary ethyleneimine.
本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、凍結乾燥され、滅菌水希釈剤で再水和され得る。他方、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が個別に保存されているが、投与前に他のワクチン成分と混合することを意図している場合、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をそれらの成分の安定化溶液、例えば高スクロース溶液中に保存することができる。 The alphavirus RNA replicon particles of the present invention can be lyophilized and rehydrated with a sterile water diluent. On the other hand, if the alphavirus RNA replicon particles are stored separately but are intended to be mixed with other vaccine components prior to administration, the alphavirus RNA replicon particles may be added to a stabilizing solution of those components, eg, high. It can be stored in a sucrose solution.
本発明のワクチンは、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、皮内および／または腹腔内ワクチン接種を含む任意の標準的な経路によって容易に投与することができる。当業者であれば、ワクチン組成物が、好ましくは各タイプのレシピエント動物および投与経路に対して適切に製剤化されることを理解するだろう。 The vaccines of the invention can be readily administered by any standard route, including intravenous, intramuscular, subcutaneous, oral, intranasal, intradermal and / or intraperitoneal vaccination. Those skilled in the art will appreciate that the vaccine composition is preferably formulated appropriately for each type of recipient animal and route of administration.
よって、本発明はまた、ネコ病原体に対してネコを免疫する方法を提供する。このような方法の１つは、ネコが適切な抗病原体抗体を産生するように、免疫学的有効量の本発明のワクチンをネコに注射するステップを含む。 Thus, the present invention also provides a method of immunizing a cat against a cat pathogen. One such method involves injecting an immunologically effective amount of the vaccine of the invention into the cat so that the cat produces the appropriate anti-pathogen antibody.
多価ワクチン
したがって、本発明は、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、１つまたは複数のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む多価ワクチンを提供する。例えば、タンパク質抗原またはその抗原性断片のコード配列、またはネコワクチンで有用なタンパク質抗原のこのようなコード配列の組み合わせを、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）に添加する、あるいは例えば、多価ワクチン中のＦＣＶカプシドタンパク質および／またはＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）をコードするものと同じＲＰに組み合わせることができる。
Multivalent Vaccine Therefore, the present invention provides a multivalent vaccine comprising at least one modified live cat pathogen and one or more alphavirus RNA replicon particles. For example, a coding sequence of a protein antigen or an antigenic fragment thereof, or a combination of such coding sequences of a protein antigen useful in a cat vaccine, is added to alphavirus RNA replicon particles (RP), or, for example, in a multivalent vaccine. Can be combined with the same RP that encodes the FCV capsid protein and / or FeLV glycoprotein (gp85).
具体的な実施形態では、ワクチンが、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質もしくはその抗原性断片、および／またはＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードする別のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と共に含む。他の実施形態では、ワクチンが、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする１つのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードする別のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、さらにＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする第３のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む。さらに他の実施形態では、ワクチンが、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、およびＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む。 In a specific embodiment, the vaccine is an alpha virus encoding at least one modified live cat pathogen and an FCV F9-like capsid protein or antigenic fragment thereof, and / or a VS-FCV capsid protein or antigenic fragment thereof. RNA replicon particles are included with another alphavirus RNA replicon particle encoding FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof. In other embodiments, the vaccine comprises at least one modified live cat pathogen, one alphaviral RNA replicon particle encoding the VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof, and FeLV gp85 or an antigenic fragment thereof. It comprises another alphavirus RNA replicon particle encoding and a third alphavirus RNA replicon particle encoding an FCV F9-like capsid protein or an antigenic fragment thereof. In yet another embodiment, the vaccine comprises at least one modified live cat pathogen and FCV F9-like capsid protein or antigenic fragment thereof, VS-FCV capsid protein or antigenic fragment thereof, and FeLV gp85 or antigenicity thereof. Includes alphavirus RNA replicon particles encoding fragments.
１つまたは複数のこのようなタンパク質抗原が由来し得る病原体の例としては、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬ）、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、他のＦＣＶ株、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）、狂犬病ウイルス、ネコインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザ、イヌニューモウイルス、ネコニューモウイルス、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）（ＦＫＡ クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ））、 ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、およびバルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種（例えば、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））が挙げられる。特定の実施形態では、これらのネコまたはイヌ病原体の１つまたは複数からのカプシドタンパク質または類似タンパク質のコード配列を、ＦＣＶ抗原と同じＲＰに挿入することができる。あるいは、またはそれと組み合わせて、これらのネコまたはイヌ病原体の１つまたは複数からのカプシドタンパク質または類似タンパク質のコード配列を、１つまたは複数の他のＲＰに挿入することができ、これをワクチンで、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質もしくはその抗原性断片および／またはＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片をコードするＲＰと組み合わせることができる。 Examples of pathogens from which one or more such protein antigens can be derived include cat viral rhinotracheitis virus (FVR), cat leukemia virus (FeLV), cat panleukopenia virus (FPL), cat herpes. Virus (FHV), other FCV strains, cat parvovirus (FPV), cat infectious peritonitis virus (FIPV), cat immunodeficiency virus, Borna disease virus (BDV), mad dog disease virus, cat influenza virus, dog influenza virus, birds Influenza, canine pneumovirus, cat pneumovirus, Chlamydofila ferlis (FKA Chlamydophila pisttaci), Bordetella bronchiceptica (Boldetella bronte) B. virus))) can be mentioned. In certain embodiments, the coding sequences for capsid or similar proteins from one or more of these feline or canine pathogens can be inserted into the same RP as the FCV antigen. Alternatively, or in combination with it, the coding sequence of a capsid protein or similar protein from one or more of these feline or canine pathogens can be inserted into one or more other RPs, which are vaccines. It can be combined with an RP encoding an FCV F9-like capsid protein or an antigenic fragment thereof and / or a VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof.
したがって、本発明は、１つまたは複数の本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）［例えば、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片］を１つまたは複数の改変された生（弱毒化）ウイルス分離株、例えば、ＦＣＶの生弱毒化古ワクチン株、例えば生弱毒化ＦＣＶ Ｆ９、および／または生弱毒化ネコヘルペスウイルス、および／または生弱毒化ネコパルボウイルス、および／または生弱毒化ネコ白血病ウイルス、および／または生弱毒化ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、および／または生弱毒化ネコ免疫不全ウイルス、および／または生弱毒化ボルナ病ウイルス、および／または生弱毒化狂犬病ウイルス、および／または生弱毒化ネコインフルエンザウイルス、および／または生弱毒化イヌインフルエンザウイルス、および／または生弱毒化鳥インフルエンザ、および／または生弱毒化イヌニューモウイルス、および／または生弱毒化ネコニューモウイルスと共に含むワクチンを提供する。さらに、生弱毒化クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、および／または生弱毒化ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、および／または生弱毒化バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種（例えば、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））もこのような多価ワクチンに含めることができる。 Accordingly, the present invention presents one or more modified raw (attenuated) alphavirus RNA replicon particles (RP) of the invention [eg, VS-FCV capsid protein or antigenic fragment thereof]. Viral isolates, such as FCV bioattenuated paleoventilation strains, such as live attenuated FCV F9, and / or live attenuated cat herpesvirus, and / or live attenuated cat parvovirus, and / or live attenuated cat leukemia. Virus and / or live attenuated feline infectious peritonitis virus and / or live attenuated feline immunodeficiency virus and / or live attenuated Borna disease virus and / or live attenuated mad canine virus and / or live attenuated Provided are vaccines comprising with cat influenza virus and / or live attenuated canine influenza virus and / or live attenuated bird influenza and / or live attenuated canine pneumovirus and / or live attenuated cat pneumovirus. In addition, live-attenuated Chlamydia felis and / or live-attenuated Bordetella bronchiseptica, and / or live-attenuated Bartonella species (eg, Bartonella hensela hen). ) Can also be included in such multivalent vaccines.
さらに、１つまたは複数の本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子［例えば、ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする］を含む本発明のワクチンは、１つまたは複数の改変された生ウイルス分離株と共に、１つまたは複数の死滅ウイルス分離株、例えば死滅ＦＣＶ株、および／または死滅ネコヘルペスウイルス、および／または死滅ネコパルボウイルス、および／または死滅ネコ白血病ウイルス、および／または死滅ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、および／または死滅ネコ免疫不全ウイルス、および／または死滅ボルナ病ウイルス、および／または死滅狂犬病ウイルス、および／または死滅ネコインフルエンザウイルス、および／または死滅イヌインフルエンザウイルス、および／または死滅鳥インフルエンザウイルス、および／または死滅イヌニューモウイルス、および／または死滅ネコニューモウイルスをさらに含むことができる。さらに、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、および／またはボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、および／または生弱毒化バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種（例えば、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））のバクテリンもこのような多価ワクチンに含めることができる。 In addition, the vaccine of the invention comprising one or more alphavirus RNA replicon particles of the invention [eg, encoding a VS-FCV capsid protein or an antigenic fragment thereof] is one or more modified live viruses of the invention. Along with the isolate, one or more dead virus isolates such as dead FCV strain and / or dead cat herpesvirus and / or dead cat parvovirus and / or dead cat leukemia virus and / or dead cat infectious Peritonitis virus and / or dead cat immunodeficiency virus and / or dead Borna disease virus and / or dead mad dog disease virus and / or dead cat influenza virus and / or dead canine influenza virus and / or dead bird influenza virus , And / or dead canine pneumovirus, and / or dead cat pneumovirus can be further included. In addition, Chlamydia felis, and / or Bordetella bronchiseptica, and / or a live-attenuated Bartonella species (eg, Bartonella hensela) (eg, Bartonella hensela). Can be included in various multivalent vaccines.
また、本明細書に開示される特定の構成、プロセスステップ、および材料は、いくぶん変化し得るので、本発明はこのような構成、プロセスステップ、および材料に限定されないことも理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されたい。
配列
Array
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を提供するのに役立つが、本発明の有効な範囲を制限することを決して意味するものではない。
The following examples serve to provide a further understanding of the invention, but by no means limit the effective scope of the invention.
［実施例］
［実施例１］
ＦＣＶカプシドタンパク質のコード配列のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への組み込み
導入
ＲＮＡウイルスは、遺伝子操作されたワクチン抗原をゲノムに導入するためのベクター媒体として使用されている。しかしながら、現在までのそれらの使用は、主にウイルス抗原をＲＮＡウイルスに組み込み、次いで、ウイルスをレシピエント宿主に導入することに限定されてきた。その結果、組み込まれたウイルス抗原に対する防御抗体が誘導される。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、病原性抗原をコードするために使用されている。このようなアルファウイルスレプリコンプラットフォームは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）［その内容全体がこれにより本明細書に組み込まれる、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９−６４４６（１９９３）］およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）［その内容全体がこれにより本明細書に組み込まれる、Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）９：１３５６−１３６１（１９９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発された。さらに、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ブタおよび家禽用のいくつかのＵＳＤＡ認可ワクチンの基礎となっている。これらには、ブタ流行性下痢ワクチン、ＲＮＡ粒子（製品コード１９Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、鳥インフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）、および処方製品、ＲＮＡ粒子（製品コード９ＰＰ０．００）が含まれる。
[Example]
[Example 1]
Incorporation of FCV capsid protein coding sequence into alphavirus RNA replicon particles RNA viruses have been used as vector media for the introduction of genetically engineered vaccine antigens into the genome. However, their use to date has been limited primarily to incorporating viral antigens into RNA viruses and then introducing the virus into recipient hosts. As a result, a protective antibody against the incorporated viral antigen is induced. Alphavirus RNA replicon particles have been used to encode pathogenic antigens. Such an alphavirus replicon platform is described by Venezuelan Encephalitis Virus (VEE) [Pushko et al. , Virology 239: 389-401 (1997)], Sindvis (SIN) [the entire content of which is incorporated herein by this, Bredenbeek et al. , Journal of Virology 67: 6439-6446 (1993)] and Semliki Forest Virus (SFV) [Lilgestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9: 1356-1361 (1991), the entire contents of which are incorporated herein by this. ] Developed from several different alpha viruses. In addition, alphavirus RNA replicon particles are the basis of several USDA-approved vaccines for pigs and poultry. These include swine flu vaccine, RNA particles (product code 19U5.5P1), swine flu vaccine, RNA (product code 19A5.D0), bird flu vaccine, RNA (product code 19O5.D0), and prescription products. RNA particles (product code 9PP0.00) are included.
アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子構築
ＲＰ−ＦＣＶ：
ＦＣＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ネココドン使用）ヌクレオチド配列を作製した。最適化配列は、商用ベンダー（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、合成遺伝子を、それぞれＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質およびＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づいて設計した。ＶＳ−ＦＣＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列［配列番号２］、またはＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質の［配列番号４］をコードする構築物を、ネコについてコドン最適化し、隣接配列はアルファウイルスレプリコンプラスミドへのクローニングに適していた。
Alphavirus RNA Replicon Particle Construction RP-FCV:
The amino acid sequence of the FCV capsid protein was used to generate codon-optimized (using cat codon) nucleotide sequences in silico. Optimized sequences were prepared as synthetic DNA by commercial vendors (ATUM, Newark, CA). Therefore, synthetic genes were designed based on the amino acid sequences of VS-FCV capsid protein and FCV F9-like capsid protein, respectively. The construct encoding the amino acid sequence of the VS-FCV capsid protein [SEQ ID NO: 2] or the FCV F9-like capsid protein [SEQ ID NO: 4] is codon-optimized for cats, and the flanking sequence is suitable for cloning into the alphavirus replicon plasmid. Was there.
ＦＣＶカプシドタンパク質を発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以下の修正をして、以前記載されたように［その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書参照］構築した。ＴＣ−８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９４４１２４７号明細書に開示および記載されている］を、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。ＦＣＶカプシド遺伝子のコドン最適化オープンリーディングフレームヌクレオチド配列を含み、５’隣接配列（５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ−３’）［配列番号１１］および３’隣接配列（５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’）を有するＤＮＡプラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで同様に消化した。次いで、合成遺伝子カセットを消化したｐＶＥＫベクターにライゲートした。 A VEE replicon vector designed to express the FCV capsid protein has the following modifications, as previously described [see US Pat. No. 9,441,247, the contents of which are incorporated herein by reference]. It was constructed. The TC-83-derived replicon vector "pVEK" [disclosed and described in US Pat. No. 9,441,247] was digested with restriction enzymes AscI and PacI. DNA containing a codon-optimized open reading frame nucleotide sequence of the FCV capsid gene and having a 5'adjacent sequence (5'-GGCGCGCCGCACCC-3') [SEQ ID NO: 11] and a 3'adjacent sequence (5'-TTAATTAA-3'). The plasmid was similarly digested with restriction enzymes AscI and PacI. The synthetic gene cassette was then ligated into the digested pVEK vector.
ＴＣ−８３ ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前記載された方法［その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書および米国特許第８４６０９１３号明細書］に従って行った。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用してインビトロ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化した。重要なことに、作製で使用されるヘルパーＲＮＡは、以前記載されたように［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３−１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登録商標）ＳＦＭ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）に戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁液をＺｅｔａＰｌｕｓ ＢｉｏＣａｐデプスフィルター（３Ｍ、Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）に通過させ、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に４００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で保持ＲＰを溶出することによって、細胞および培地から精製した。溶出したＲＰを最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に製剤化し、０．２２ミクロン膜フィルターに通過させ、保存用に一定分量に分注した。機能的ＲＰの力価を、感染したＶｅｒｏ細胞単層の免疫蛍光アッセイによって決定した。 Preparation of TC-83 RNA replicon particles (RP) was performed according to a previously described method [US Pat. No. 9,441,247 and US Pat. No. 8,460,913, the contents of which are incorporated herein by reference]. .. Briefly, pVHV replicon vector DNA and helper DNA plasmids were linearized with NotI restriction enzymes prior to in vitro transcription using MegaScript T7 RNA polymerase and cap analogs (Promega, Madison, WI). Importantly, the helper RNA used in the production is as previously described [Kamrud et al. , J Gen Virol. 91 (Pt 7): 1723-1727 (2010)], lacking the VEE subgenome promoter sequence. Replicon and purified RNA of helper components were combined, mixed with a suspension of Vero cells, electroporated with a 4 mm cuvette and returned to OptiPro® SFM cell culture medium (Thermo Fisher, Waltham MA). After overnight incubation, alphavirus RNA replicon particles are passed through a ZetaPlus BioCap depth filter (3M, Maplewood, MN) and in phosphate buffered saline containing 5% sucrose (w / v). It was washed and finally purified from cells and medium by eluting retained RP with 400 mM NaCl buffer. The eluted RP was formulated into the final 5% sucrose (w / v), passed through a 0.22 micron membrane filter and dispensed into a fixed amount for storage. Titers of functional RP were determined by immunofluorescence assay of infected Vero cell monolayers.
ＲＰ−ＦｅＬＶ：
ＦｅＬＶ ｇｐ８５のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ネココドン使用）ヌクレオチド配列を作製した。最適化配列は、商用ベンダー（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、ｇｐ８５のアミノ酸配列に基づいて合成遺伝子を設計した。構築物（ｇｐ８５＿ｗｔ）は野生型アミノ酸配列［配列番号２］であり、ネコについてコドン最適化し、隣接配列はアルファウイルスレプリコンプラスミドへのクローニングに適切であった。
RP-FeLV:
The amino acid sequence of FeLV gp85 was used to generate codon-optimized (using feline codon) nucleotide sequences in silico. Optimized sequences were prepared as synthetic DNA by commercial vendors (ATUM, Newark, CA). Therefore, synthetic genes were designed based on the amino acid sequence of gp85. The construct (gp85_wt) was a wild-type amino acid sequence [SEQ ID NO: 2], codon-optimized for cats, and the flanking sequence was suitable for cloning into the alphavirus replicon plasmid.
ＦｅＬＶ ｇｐ８５を発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以下の修正をして、以前記載されたように［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書参照］構築した。ＴＣ−８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９４４１２４７号明細書に開示および記載されている］を、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。ＦｅＬＶ ｇｐ８５遺伝子のコドン最適化オープンリーディングフレームヌクレオチド配列を含み、５’隣接配列（５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ−３’）［配列番号１１］および３’隣接配列（５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’）を有するＤＮＡプラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで同様に消化した。次いで、合成遺伝子カセットを消化したｐＶＥＫベクターにライゲートし、得られたクローンの名前を「ｐＶＨＶ−ＦｅＬＶ ｇｐ８５」に変更した。「ｐＶＨＶ」ベクター命名法は、ｐＶＥＫのマルチクローニングサイトのＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を介してクローニングされた導入遺伝子カセットを含むｐＶＥＫ由来レプリコンベクターを指すように選択した。 A VEE replicon vector designed to express FeLV gp85 has the following modifications, as previously described [see US Pat. No. 9,441,247, the entire contents of which are incorporated herein by reference]. It was constructed. The TC-83-derived replicon vector "pVEK" [disclosed and described in US Pat. No. 9,441,247] was digested with restriction enzymes AscI and PacI. DNA containing a codon-optimized open reading frame nucleotide sequence of the FeLV gp85 gene and having a 5'adjacent sequence (5'-GGCGCGCCGCACCCCC-3') [SEQ ID NO: 11] and a 3'adjacent sequence (5'-TTAATTAA-3'). The plasmid was similarly digested with restriction enzymes AscI and PacI. The synthetic gene cassette was then ligated into the digested pVEK vector and the name of the resulting clone was changed to "pVHV-FeLV gp85". The "pVHV" vector nomenclature was chosen to refer to a pVEK-derived replicon vector containing a transgene cassette cloned via the AscI and PacI sites of the pVEK multicloning site.
ＴＣ−８３ ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前記載された方法［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書および米国特許第８４６０９１３号明細書］に従って行った。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用してインビトロ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化した。重要なことに、作製で使用されるヘルパーＲＮＡは、以前記載されたように［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３−１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登録商標）ＳＦＭ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）に戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁液をＺｅｔａＰｌｕｓ ＢｉｏＣａｐデプスフィルター（３Ｍ、Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）に通過させ、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に４００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で保持ＲＰを溶出することによって、細胞および培地から精製した。溶出したＲＰを最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に製剤化し、０．２２ミクロン膜フィルターに通過させ、保存用に一定分量に分注した。機能的ＲＰの力価を、感染したＶｅｒｏ細胞単層の免疫蛍光アッセイによって決定した。 Preparation of TC-83 RNA replicon particles (RP) is performed according to the methods previously described [US Pat. No. 9,441,247 and US Pat. No. 8,460,913, the entire contents of which are incorporated herein by reference]. It was. Briefly, pVHV replicon vector DNA and helper DNA plasmids were linearized with NotI restriction enzymes prior to in vitro transcription using MegaScript T7 RNA polymerase and cap analogs (Promega, Madison, WI). Importantly, the helper RNA used in the production is as previously described [Kamrud et al. , J Gen Virol. 91 (Pt 7): 1723-1727 (2010)], lacking the VEE subgenome promoter sequence. Replicon and purified RNA of helper components were combined, mixed with a suspension of Vero cells, electroporated with a 4 mm cuvette and returned to OptiPro® SFM cell culture medium (Thermo Fisher, Waltham MA). After overnight incubation, alphavirus RNA replicon particles are passed through a ZetaPlus BioCap depth filter (3M, Maplewood, MN) and in phosphate buffered saline containing 5% sucrose (w / v). It was washed and finally purified from cells and medium by eluting retained RP with 400 mM NaCl buffer. The eluted RP was formulated into the final 5% sucrose (w / v), passed through a 0.22 micron membrane filter and dispensed into a fixed amount for storage. Titers of functional RP were determined by immunofluorescence assay of infected Vero cell monolayers.
ＲＰ−ＲＶ
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非毒性ＴＣ−８３株のカプシドタンパク質および糖タンパク質とパッケージングされた狂犬病ウイルス（ＲＶ）からの狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンを調製した。狂犬病ウイルスＧタンパク質のヌクレオチド配列を、ヒトについてコドン最適化した。得られた配列は、１００％のアミノ酸同一性を有しているにもかかわらず、生狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）配列に対してわずか約８５％のヌクレオチド同一性しか有さない。ワクチンを、哺乳動物対象に投与される単一用量として、例えば、１２週以上のネコおよびイヌに皮下的に、あるいは初回投与とそれに続く１回または複数回のブースター投与を含む複数回用量で使用することができる。
RP-RV
A vaccine containing alphavirus RNA replicon particles encoding rabies virus glycoprotein (G) from rabies virus (RV) packaged with capsid protein and glycoprotein of non-toxic TC-83 strain of Venezuelan equine encephalitis virus was prepared. .. The nucleotide sequence of the rabies virus G protein was codon-optimized for humans. The resulting sequence has only about 85% nucleotide identity to the live rabies virus glycoprotein (G) sequence, despite having 100% amino acid identity. The vaccine is used as a single dose given to mammalian subjects, eg, subcutaneously in cats and dogs for 12 weeks or longer, or in multiple doses, including an initial dose followed by one or more booster doses. can do.
狂犬病糖タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ヒトコドン使用）ヌクレオチド配列を作製した。最適化配列は、商用ベンダー（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、狂犬病糖タンパク質のアミノ酸配列に基づいて合成遺伝子［配列番号９］を設計した。構築物（ＲＡＢＶ−Ｇ）は野生型アミノ酸配列［配列番号１０］であり、ヒトについてコドン最適化し、隣接配列はアルファウイルスレプリコンプラスミドへのクローニングに適切であった。 The amino acid sequence of rabies glycoprotein (G) was used to generate codon-optimized (using human codon) nucleotide sequences in silico. Optimized sequences were prepared as synthetic DNA by commercial vendors (ATUM, Newark, CA). Therefore, a synthetic gene [SEQ ID NO: 9] was designed based on the amino acid sequence of rabies glycoprotein. The construct (RABV-G) was a wild-type amino acid sequence [SEQ ID NO: 10], codon-optimized for humans, and the flanking sequence was suitable for cloning into the alphavirus replicon plasmid.
狂犬病Ｇを発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以下の修正をして、以前記載されたように［その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書参照］構築した。ＴＣ−８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９４４１２４７号明細書に開示および記載されている］を、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。狂犬病Ｇ遺伝子のコドン最適化オープンリーディングフレームヌクレオチド配列を含み、５’隣接配列（５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ−３’）［配列番号１１］および３’隣接配列（５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’）を有するＤＮＡプラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで同様に消化した。次いで、合成遺伝子カセットを消化したｐＶＥＫベクターにライゲートし、得られたクローンの名前を「ｐＶＨＶ−ＲＡＢＶ−Ｇ」に変更した。「ｐＶＨＶ」ベクター命名法は、ｐＶＥＫのマルチクローニングサイトのＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を介してクローニングされた導入遺伝子カセットを含むｐＶＥＫ由来レプリコンベクターを指すように選択した。 A VEE replicon vector designed to express rabies G is constructed with the following modifications as previously described [see US Pat. No. 9,441,247, the contents of which are incorporated herein by reference]. did. The TC-83-derived replicon vector "pVEK" [disclosed and described in US Pat. No. 9,441,247] was digested with restriction enzymes AscI and PacI. DNA containing a codon-optimized open reading frame nucleotide sequence of the mad dog disease G gene and having a 5'adjacent sequence (5'-GGCGCGCCGCACCC-3') [SEQ ID NO: 11] and a 3'adjacent sequence (5'-TTAATTAA-3'). The plasmid was similarly digested with restriction enzymes AscI and PacI. The synthetic gene cassette was then ligated into the digested pVEK vector and the resulting clone was renamed to "pVHV-RABV-G". The "pVHV" vector nomenclature was chosen to refer to a pVEK-derived replicon vector containing a transgene cassette cloned via the AscI and PacI sites of the pVEK multicloning site.
ＴＣ−８３ ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前記載された方法［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書および米国特許第８４６０９１３号明細書］に従って行った。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用してインビトロ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化した。重要なことに、作製で使用されるヘルパーＲＮＡは、以前記載されたように［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３−１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登録商標）ＳＦＭ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁液をＺｅｔａＰｌｕｓ ＢｉｏＣａｐ（登録商標）デプスフィルター（３Ｍ、Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）に通過させ、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に４００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で保持ＲＰを溶出することによって、細胞および培地から精製した。溶出したＲＰを最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に製剤化し、０．２２ミクロン膜フィルターに通過させ、保存用に一定分量に分注した。機能的ＲＰの力価を、感染したＶｅｒｏ細胞単層の免疫蛍光アッセイによって決定した。 Preparation of TC-83 RNA replicon particles (RP) is performed according to the methods previously described [US Pat. No. 9,441,247 and US Pat. No. 8,460,913, the entire contents of which are incorporated herein by reference]. It was. Briefly, pVHV replicon vector DNA and helper DNA plasmids were linearized with NotI restriction enzymes prior to in vitro transcription using MegaScript T7 RNA polymerase and cap analogs (Promega, Madison, WI). Importantly, the helper RNA used in the production is as previously described [Kamrud et al. , J Gen Virol. 91 (Pt 7): 1723-1727 (2010)], lacking the VEE subgenome promoter sequence. Replicon and purified RNA of helper components were combined, mixed with a suspension of Vero cells, electroporated with a 4 mm cuvette and returned to OptiPro® SFM cell culture medium (Thermo Fisher, Waltham, MA). After overnight incubation, alphavirus RNA replicon particles are passed through a ZetaPlus BioCap® depth filter (3M, Maplewood, MN) and phosphate buffered with 5% sucrose (w / v). Purified from cells and medium by washing with saline and finally eluting retained RP with 400 mM NaCl buffer. The eluted RP was formulated into the final 5% sucrose (w / v), passed through a 0.22 micron membrane filter and dispensed into a fixed amount for storage. Titers of functional RP were determined by immunofluorescence assay of infected Vero cell monolayers.
［実施例２］
ネコにおける２つのＲＰ構築物と３つの改変された生画分とを含む混合ワクチンの安全性の評価
凍結乾燥された五価ネコ混合ワクチンの種々の製剤および再構成方法を、ネコにおけるそれらの安全性に関して評価した。五価ワクチンの望ましい提示は０．５ｍＬ用量であり、最適な製剤および充填方法は０．５ｍＬ充填である。安定剤は、１．１％ＮＺ−アミン（カゼイン酵素加水分解物）、１．１％ゼラチンおよび７．５％スクロースを含有し、提供される割合は最終濃度を表す。５つの画分を添加するための体積および最終的な効力の制約により、０．５ｍＬを超える体積が必要な場合は、製品を製剤化して１．０ｍＬまで充填し、０．５ｍＬの希釈剤で再構成することができる。これにより、投与用量の安定剤成分の濃度が２倍になる。これらの抗原を含むこのような濃縮用量の安定剤の安全性は、以前はネコで試験されていなかった。
[Example 2]
Assessment of the safety of DPT vaccines containing 2 RP constructs and 3 modified live fractions in cats Various formulations and reconstitution methods of cryodried pentavalent cat vaccines, their safety in cats Evaluated with respect to. The preferred presentation of the pentavalent vaccine is a 0.5 mL dose, and the optimal formulation and filling method is 0.5 mL filling. Stabilizers contain 1.1% NZ-amine (casein enzyme hydrolase), 1.1% gelatin and 7.5% sucrose, the proportions provided represent the final concentration. If volume greater than 0.5 mL is required due to volume and final potency constraints for adding the 5 fractions, formulate the product, fill to 1.0 mL, and with 0.5 mL diluent. Can be reconfigured. This doubles the concentration of the stabilizer component in the dose. The safety of such concentrated dose stabilizers containing these antigens has not previously been tested in cats.
１．０ｍＬ充填／０．５ｍＬ再水和フォーマットがネコで安全でない場合、１．０ｍＬの希釈剤で再水和した１．０ｍＬ充填体積の第３の選択肢も試験した。ワクチンをブレンドし、次いで、凍結乾燥した。ワクチンは、１．１％ゼラチン、１．１％ＮＺアミンおよび７．５％スクロースを含有する安定剤中、ネコ白血病ウイルス糖タンパク質（ＲＰ−ＦｅＬＶ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子およびネコカリシウイルスカプシドタンパク質（ＲＰ−ＦＣＶ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、市販のワクチン、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ−１の成分、すなわち、改変された生（ＭＬＶ）ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬ）、改変された生ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）および改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）と共に含有していた。以下の表１に記載されるように、五価ネコ混合ワクチンの種々の製剤を調製し、再構成した。
ワクチンを同用量の各抗原を含有するよう製剤化し（０．５ｍＬケークワクチンは２倍の各抗原の濃度で製剤化した）、安定剤を全ての製剤に一定の濃度で使用した（０．５ｍＬ希釈剤で再水和される１．０ｍＬケークワクチンは、再水和時に２倍の濃度の安定剤を含有していた）。
The vaccine was formulated to contain the same dose of each antigen (0.5 mL cake vaccine was formulated at twice the concentration of each antigen) and stabilizers were used in all formulations at a constant concentration (0.5 mL). The 1.0 mL cake vaccine rehydrated with the diluent contained a double concentration of stabilizer upon rehydration).
実験ネコ対象を、７〜８週齢（典型的には、ネココアワクチンの最小ワクチン接種年齢を有する）と、２１日後に再度、指示された体積のそれぞれの試験ワクチンでワクチン接種した。ネコを、啼鳴、刺痛、掻痒、噛みつき、ワクチンの注射時の突然の動き、または異常な反応（以下の表２および表３を参照）などの疼痛または不快感を示し得る試験ワクチンに対する反応について各ワクチン接種の直後に１５分間観察した。臨床評価は、ワクチン接種の４〜６時間後、およびワクチン接種後３日間、毎日獣医師によって実施した。 Experimental cat subjects were vaccinated again at 7-8 weeks of age (typically with the minimum vaccination age of the cat core vaccine) and 21 days later with the indicated volume of each test vaccine. Responses to test vaccines that may cause pain or discomfort in cats such as snarling, stinging, pruritus, biting, sudden movements during vaccination, or abnormal reactions (see Tables 2 and 3 below) Was observed for 15 minutes immediately after each vaccination. Clinical evaluations were performed daily by a veterinarian 4-6 hours after vaccination and 3 days after vaccination.
臨床評価は、注射部位の触診、触れると痛い、腫脹、発赤または膿瘍を含む任意の局所反応についての観察を含んでいた。ネコを、抑うつ、嗜眠、跛行、嘔吐、振戦、激越および下痢などの任意の全身反応についても観察した。体温も測定し、ワクチン接種の４〜６時間後、および各ワクチン接種後２日間、毎日記録した。局所反応についての注射部位の触診をさらに各ワクチン接種の７日後〜２１日後に週３回実施した。 Clinical evaluation included palpation of the injection site and observation of any local reactions, including pain to the touch, swelling, flare or abscess. Cats were also observed for any systemic reactions such as depression, lethargy, lameness, vomiting, tremor, agitation and diarrhea. Body temperature was also measured and recorded daily 4-6 hours after vaccination and 2 days after each vaccination. Palpation of the injection site for local reactions was further performed 3 times a week 7 to 21 days after each vaccination.
全てのワクチン製剤および再水和プロトコルが安全であることが分かった。ネコのいずれにも局所反応も全身反応も観察されなかった。２回目のワクチン接種の５時間後に体温１０３．６℃を示した処置群３（０．５ｍＬケーク／０．５ｍＬ希釈剤）の１匹のネコを除いて、全てのネコの各測定期間での体温は正常であった。したがって、五価ワクチンの３つの調製物全てが許容されることが分かった。
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の修正が、前記説明から当業者には明らかになるだろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。
The present invention should not be limited in scope by the specific embodiments described herein. In fact, various modifications of the invention, in addition to those described herein, will be apparent to those skilled in the art from the above description. Such amendments are intended to be within the appended claims.
さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることを理解されたい。 Further, it should be understood that all base or amino acid sizes given for nucleic acids or polypeptides, and all molecular weight or molecular weight values are approximations and are provided for illustration purposes.
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