ES2773504T3

ES2773504T3 - Nuevo polipéptido que tiene afinidad por PD-L1

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Publication number: ES2773504T3
Application number: ES16790321T
Authority: ES
Inventors: Elisabet Wahlberg; Elin Gunneriusson
Original assignee: Affibody AB
Current assignee: Affibody AB
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2020-07-13
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: KR20180072797A; NZ741586A; US11155596B2; JP2018537965A; EP3368545A1; MY187827A; RU2018117862A; EP3693378A1; IL258419A; AU2016347495A1; JP6810143B2; RU2018117862A3; US20180312565A1; WO2017072280A1; RU2749110C2; MX2018005399A; CA3001264A1; BR112018007154A2; EP3368545B1; ZA201802542B

Abstract

Polipéptido de unión a PD-L1, que comprende un motivo de unión a PD-L1 BM, motivo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de: i) ERNX4AAX7EIL X11LPNLX16X17X18QX20 WAFIWX26LX28D en la que, independientemente uno del otro, X4 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y; X7 se selecciona de A, E, F, H, N, Q, S, T, V, W y Y; X11 se selecciona de A, D, E, F, H, K, L, N, Q, R, S, T, V, W y Y; X16 se selecciona de N y T; X17 se selecciona de A, H, K, N, Q, R y S; X18 se selecciona de A, D, E, G, H, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y; X20 se selecciona de H, I, K, L, N, Q, R, T, V y Y; X26 se selecciona de K y S; y X28 se selecciona de A, D y E; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96 % de identidad con la secuencia definida en i).

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo polipéptido que tiene afinidad por PD-L1

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a una clase de polipéptidos modificados genéticamente que tienen una afinidad de unión por el ligando de muerte programada 1 (en lo sucesivo denominado PD-L1). La presente divulgación se refiere, además, al uso de tal un polipéptido de unión a PD-L1 como agente terapéutico, de pronóstico y/o diagnóstico.

Antecedentes

Bajo condiciones fisiológicas normales, los puntos de control del sistema inmune son cruciales para mantener la autotolerancia (es decir, prevenir la autoinmunidad) y para modular la respuesta inmune para proteger contra el daño tisular cuando el sistema inmune responde a infecciones patógenas. En ocasiones, las células tumorales pueden cooptar ciertas rutas de puntos de control del sistema inmune para escapar de los mecanismos de vigilancia inmunológica. Por lo tanto, la inhibición de los puntos de control del sistema inmune se convirtió en un enfoque prometedor en la inmunoterapia contra el cáncer. Los dos receptores de punto de control del sistema inmune que se estudiaron más activamente en este contexto son el antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4; conocido, además, como CD152) y la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1; conocida, además, como CD279), que regulan la respuesta inmune a diferentes niveles. CTLA-4 regula principalmente las respuestas inmunes al inicio de la activación de las células T, mientras que PD-1 limita principalmente la actividad de las células T en la fase efectora dentro de los tejidos y tumores (Pardoll, 2012, Nat. Rev. Cancer, 12: 252-64).

PD-1 tiene dos ligandos conocidos: el ligando de muerte programada 1 (PD-L1; conocido, además, como homólogo de B7 humano 1, B7-H1, o grupo de diferenciación 274, CD274) y el ligando de muerte programada 2 (PD-L2; conocido, además, como B7-DC y CD273). Ambos ligandos pertenecen a la superfamilia de inmunoglobulinas B7 y son glicoproteínas de transmembrana de tipo I compuestas de dominios extracelulares de tipo IgC e IgV. Sin embargo, recientemente se informó que PD-L1 y PD-L2, así como también PD-1, existen, además, en formas solubles en adición a estar unidas a la membrana. PD-L1 y PD-L2 comparten aproximadamente un 40 % de identidad de residuos aminoacídicos. Mientras que la expresión de PD-L2 se limita principalmente a las células presentadoras de antígeno, PD-L1 se expresa tanto en células hematopoyéticas como no hematopoyéticas. La alta expresión tumoral de PD-L1 se asocia con una mayor agresividad y un peor pronóstico (Dai y otros, 2014, Cellular Immunology, 290:72-79).

La importancia clínica de dirigirse a las rutas de punto de control del sistema inmune se demostró con varios anticuerpos monoclonales que inhiben CTLA-4, PD-1 y PD-L1, que funcionan mediante la restauración de las respuestas inmunes protectoras a las células tumorales. El anticuerpo anti-CTLA-4 ipilimumab (Yervoy®, Bristol Myers Squibb) se aprobó por la FDA en 2011 para el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico donde se observó una respuesta duradera en el 10-15 % de los pacientes. Sin embargo, el ipilimumab se asocia con toxicidades relacionadas con el sistema inmune, potencialmente debido a su función en la fase de cebado de la respuesta inmune, lo que afecta, además, a los tejidos normales. Un enfoque más seguro puede ser dirigirse a la ruta PD-1/PD-L1 para restaurar la inmunidad antitumoral selectivamente dentro del microambiente tumoral. La inhibición de la ruta PD-1/PD-L1 demostró una respuesta duradera en 30-35 % de los pacientes con melanoma avanzado, lo que en 2014 resultó en la aprobación de la FDA de los anticuerpos anti-PD-1 pembrolizumab (anteriormente lambrolizumab; Keytruda®, Merck) y nivolumab (Bristol Myers Squibb and Ono Pharmaceutical) (Shin y Ribas, 2015, Curr. Opin. Immunol., 33:23-35; Philips y Atkins, 2015, International Immunology, 27:39-46). El primer anticuerpo dirigido a PD-L1 investigado en ensayos clínicos fue MDX-1105 que se evaluó en un estudio de fase I en pacientes con tumores sólidos avanzados que incluyen melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer gástrico y cáncer de mama (Momtaz y Postow, 2014, Pharmgenomics Pers Med. 7:357-65). Los resultados demostraron beneficios potenciales del bloqueo de PD-L1. Otros anticuerpos contra PD-L1 que se encuentran actualmente en ensayos clínicos de fase III incluyen atezolizumab (MDPL3280A, Genentech), durvalumab (MEDI4736, Medlmmune/Astra Zeneca, Celgene) y avelumab (MSB0010718C, EMD Serono, Pfizer).

Para mejorar la eficacia y aumentar el número de pacientes que responden a la inmunoterapia, puede ser beneficioso enfocarse en la respuesta inmune antitumoral a múltiples niveles. Esto puede lograrse mediante combinaciones sinérgicas. Por ejemplo, los estudios preclínicos que combinan los anticuerpos bloqueadores CTLA-4 y PD-1 (ipilimumab y nivolumab) demostraron una actividad antitumoral superior, pero con una toxicidad similar a la monoterapia anti-CTLA-4 (Shin y Ribas, 2015, supra). Además, se especula que PD-L1 es un biomarcador potencial, debido a su abundancia en el microambiente tumoral y porque la expresión tumoral de PD-L1 tiene una fuerte asociación con la respuesta a la terapia anti-PD-1/PD-L1.

La alta prevalencia de cáncer y enfermedades infecciosas, junto con una gran necesidad médica no satisfecha, justifica el desarrollo de nuevos modos de tratamiento. Dado que la tasa de penetración al tejido se asocia negativamente con el tamaño de la molécula, una molécula de anticuerpo relativamente grande tiene inherentemente una distribución en tejido y una capacidad de penetración pobres.

Así, el uso de anticuerpos monoclonales no siempre es óptimo para la terapia y existe la necesidad continua de proporcionar agentes con una alta afinidad por PD-L1. De gran interés es, además, la provisión de usos de tales moléculas en el tratamiento, diagnóstico y pronóstico de trastornos relacionados con PD-L1.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar nuevos agentes de unión a PD-L1, que podrían usarse, por ejemplo, para aplicaciones terapéuticas, de pronóstico y de diagnóstico.

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar un nuevo agente multiespecífico, tal como un agente biespecífico, que tenga afinidad por PD-L1 y al menos un antígeno adicional.

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una molécula que permita una terapia eficaz para, por ejemplo, diversas formas de cáncer y enfermedades infecciosas, mientras alivie los inconvenientes mencionados anteriormente y otros inconvenientes de las terapias actuales.

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una molécula adecuada para aplicaciones de pronóstico y diagnóstico, por ejemplo, aplicación de pronóstico y diagnóstico en relación con diversas formas de cáncer y enfermedades infecciosas.

Estos y otros objetos, que son evidentes para la persona experta a partir de la presente divulgación, se cumplen con los diferentes aspectos de la invención como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas y como se divulga generalmente en la presente memoria.

Así, en el primer aspecto de la divulgación, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, que comprende un motivo de unión a PD-L1 BM, cuyo motivo consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

i) ERNX4AAX7EIL X11LPNLX16X17X18QX20 WAFIWX26LX28D

en la que, independientemente uno del otro,

X4 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X7 se selecciona de A, E, F, H, N, Q, S, T, V, W y Y;

X11 se selecciona de A, D, E, F, H, K, L, N, Q, R, S, T, V, W y Y;

X16 se selecciona de N y T;

X17 se selecciona de A, H, K, N, Q, R y S;

X18 se selecciona de A, D, E, G, H, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X20 se selecciona de H, I, K, L, N, Q, R, T, V y Y;

X26 se selecciona de K y S; y

X28 se selecciona de A, D y E;

y

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96 % de identidad con la secuencia definida en i).

La definición anterior de una clase de polipéptidos de unión a PD-L1 relacionados por la secuencia se basa en un análisis estadístico de varias variantes de polipéptidos aleatorios de un andamio principal, que se seleccionaron por su interacción con PD-L1 en experimentos de selección. El motivo de unión a PD-L1 identificado, o "BM", corresponde a la región de unión diana del andamio principal, región que constituye dos hélices alfa dentro de un dominio proteico de haz de tres hélices. En el andamio principal, los residuos aminoacídicos variados de las dos hélices de BM constituyen una superficie de unión para la interacción con la parte Fc constante de los anticuerpos. En la presente divulgación, la variación aleatoria de los residuos de la superficie de unión y la posterior selección de variantes reemplazaron la capacidad de interacción con la Fc con una capacidad de interacción con PD-L1.

Como se dará cuenta el experto, la función de cualquier polipéptido, tal como la capacidad de unión a PD-L1 del polipéptido de la presente divulgación, es dependiente de la estructura terciaria del polipéptido. Por lo tanto, es posible realizar cambios menores en la secuencia de aminoácidos en un polipéptido sin afectar la función del mismo. Así, la divulgación abarca variantes modificadas del polipéptido de unión a PD-L1, que conservan las características de unión a PD-L1.

De esta manera, la presente divulgación abarca un polipéptido de unión a PD-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad del 96 % o mayor a un polipéptido como se define en i). Por ejemplo, es posible que un residuo aminoacídico que pertenece a un determinado grupo funcional de residuos aminoacídicos (por ejemplo, hidrófobo, hidrófilo, polar, etc.) pueda cambiarse por otro residuo aminoacídico del mismo grupo funcional.

En algunas realizaciones, tales cambios pueden realizarse en cualquier posición de la secuencia del polipéptido de unión a PD-L1 como se divulga en la presente memoria. En otras realizaciones, tales cambios pueden realizarse solo en las posiciones no variables, indicadas, además, como residuos aminoacídicos del andamio. En tales casos, no se permiten cambios en las posiciones variables. En otras realizaciones, tales cambios pueden ser solo en las posiciones variables. De acuerdo con una definición de tales "posiciones variables", estas son posiciones indicadas con una "X" en la secuencia i) como se definió anteriormente. De acuerdo con otra definición, "posiciones variables" son aquellas posiciones que se asignan aleatoriamente en una biblioteca de selección de variantes Z antes de la selección, y pueden así, por ejemplo, ser las posiciones 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 17, 18, 20, 21, 25 y 28 en la secuencia i), como se ilustra en el Ejemplo 1.

El término "% de identidad", como se usa a través de toda la especificación, puede calcularse, por ejemplo, como sigue. La secuencia de consulta se alinea con la secuencia diana mediante el uso del algoritmo ^cL^uSTAL W (Thompson y otros, (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680). Se hace una comparación sobre la ventana correspondiente a la más corta de las secuencias alineadas. La más corta de las secuencias alineadas puede ser en algunos casos la secuencia diana. En otros casos, la secuencia de consulta puede constituir la más corta de las secuencias alineadas. Los residuos aminoacídicos en cada posición se comparan y el porcentaje de posiciones en la secuencia de consulta que tienen correspondencias idénticas en la secuencia diana se informa como % de identidad.

En otra realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 en el que en la secuencia i)

X4 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X7 se selecciona de E, F, H, N, Q, S, T, V, W y Y;

X11 se selecciona de A, D, H, L, Q, R, T, V, W y Y;

X16 se selecciona de N y T;

X17 se selecciona de A, H, K, N, Q, R y S;

X18 se selecciona de A, D, E, G, H, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X20 se selecciona de H, I, K, L, Q, R, T, V y Y;

X26 se selecciona de K y S; y

X28 se selecciona de A, D y E.

En otra realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, en el que en la secuencia i)

X4 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X7 se selecciona de A, E, F, H, N, Q, S, T, V, W y Y;

X11 se selecciona de A, D, E, F, H, K, L, N, Q, R, S, T, V, W y Y;

X16 se selecciona de N y T;

X17 se selecciona de A, H, K, N, Q, R y S;

X18 se selecciona de A, D, E, G, H, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X20 se selecciona de H, I, K, L, N, Q, R, T, V y Y;

X26 se selecciona de K y S; y

X28 se selecciona de A, D y E.

Aun en otra realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, en el que en la secuencia i)

X4 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T y V;

X7 se selecciona de F, H, Q y Y;

X11 se selecciona de H, Q, W y Y;

X16 se selecciona de N y T;

X17 se selecciona de A, H, K, N, Q y S;

X18 se selecciona de A, E, G, H, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X20 se selecciona de H, I, K, Q, R y V;

X26 se selecciona de K y S; y

X28 se selecciona de A y D.

Como se usa en la presente memoria, "Xn" y "Xm" se usan para indicar aminoácidos en las posiciones n y m en la secuencia i) como se definió anteriormente, en la que n y m son números enteros que indican la posición de un aminoácido dentro de dicha secuencia contada desde el extremo N-terminal de dicha secuencia. Por ejemplo, X3 y X7 indican el aminoácido en la posición tres y siete, respectivamente, desde el extremo N-terminal de la secuencia i).

En realizaciones de acuerdo con el primer aspecto, se proporcionan polipéptidos en los que Xn en la secuencia i) se selecciona independientemente de un grupo de posibles residuos de acuerdo con la Tabla 1. El experto apreciará que Xn puede seleccionarse de uno cualquiera de los grupos enumerados de posibles residuos y que esta selección es independiente de la selección de aminoácidos en Xm, en la que n t m. Así, cualquiera de los posibles residuos enumerados en la posición Xn en la Tabla 1 puede combinarse independientemente con cualquiera de los posibles residuos enumerados en cualquier otra posición variable en la Tabla 1.

El experto apreciará que la Tabla 1 debe leerse como sigue: En una realización de acuerdo con el primer aspecto, se proporciona un polipéptido en el que el residuo aminoacídico "Xn" en la secuencia i) se selecciona de "residuos posibles". Así, la Tabla 1 divulga varias realizaciones específicas e individualizadas del primer aspecto de la presente divulgación. Por ejemplo, en una realización de acuerdo con el primer aspecto, se proporciona un polipéptido en el que X4 en la secuencia i) se selecciona de A, D, E, I, K, L, N, Q, S y T, y en otra realización de acuerdo con el primer aspecto, se proporciona un polipéptido en el que X4 en la secuencia i) se selecciona de A, D, E, I, K, Q, S y T. Para evitar dudas, las realizaciones enumeradas pueden combinarse libremente aun en otras realizaciones. Por ejemplo, una de tales realizaciones combinadas es un polipéptido en el que X4 se selecciona de A, D, E, I, K, Q, S y T, mientras que X7 se selecciona de F, H, Q y Y, y X18 se selecciona de A, L, K y S.

Toblo 1

En una realización particular de acuerdo con el primer aspecto, se proporciona un polipéptido en el que la secuencia i) cumple al menos cuatro de las siete condiciones I-VII:

I. X7 se selecciona de F, H, Q y Y;

II. X11 se selecciona de H y Y;

III. X16 es T;

IV. X17 se selecciona de N, Q y S;

V. X20 se selecciona de H, I, K y R;

VI. X26 es K; y

VII. X28 es A o D.

En una realización, la secuencia i) cumple al menos cinco de las siete condiciones I-VII, tal como al menos seis de las siete condiciones I-VII. En una realización particular, la secuencia i) cumple las siete condiciones I-VII.

En algunas realizaciones de un polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con el primer aspecto, X7X11X20 se selecciona de FYK y YYK. En algunas realizaciones, X11X17X20 se selecciona de YNK y YQK. En algunas realizaciones, X11X18X20 es YAK.

Como se describe en detalle en la sección experimental que sigue, la selección de variantes de polipéptidos de unión a PD-L1 llevó a la identificación de varias secuencias de motivos de unión a PD-L1 individuales (BM). Estas secuencias constituyen realizaciones individuales de la secuencia i) de acuerdo con este aspecto. Las secuencias de los motivos de unión a PD-L1 individuales corresponden a las posiciones de aminoácidos 8-36 en las SEQ ID NO:1-808 presentada en la Figura 1. Por lo tanto, en una realización del polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con este aspecto, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-808. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 774-796, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 774-787. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 775, 776, 779-781 y 784-786, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776, 780, 781, 784 y 786, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776, 781 y 784, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776 y 784 o el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776 y 781, por ejemplo, el grupo que consiste en las SEQ ID nO:1-93 y 776 o el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 781 o el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 784. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 774, 775 y 780-786, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 775, 780, 781, 784 y 786. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 17, 776 y 781, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2 y 776. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:776. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 3-8, 11, 13, 16, 18, 20, 22, 23, 43 y 73. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-24. Por ejemplo, en una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-16, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 7, 9 y 10. En otra realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 3-6, 9-10, 12-21, 23 y 24, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 4-6, 9, 14 y 18-21. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-12, 14 y 17-21. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-12 y 17, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-5 y 17, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2 y 17. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 4, 5, 6, 9, 14 y 18-21, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:4, 5, 18 y 21, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:4, 5 y 21. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 4, 5 y 21, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1 y 2. En una realización, la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:21.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el BM como se definió anteriormente "forma parte de un dominio proteico de haz de tres hélices. Se entiende que esto significa que la secuencia del BM se "inserta" o se "injerta" en la secuencia del dominio de haz de tres hélices original, tal que el BM reemplaza un motivo estructural similar en el dominio original. Por ejemplo, sin querer limitarse por la teoría, el BM se cree que constituye dos de las tres hélices de un haz de tres hélices y, por lo tanto, puede reemplazar tal motivo de dos hélices dentro de cualquier haz de tres hélices. Como se dará cuenta el experto, el reemplazo de dos hélices del dominio de haz de tres hélices por las dos hélices del BM debe realizarse para no afectar la estructura básica del polipéptido. Es decir, el plegamiento general de la cadena principal del Ca del polipéptido de acuerdo con esta realización de la invención es sustancialmente el mismo que el del dominio proteico del haz de tres hélices del que forma parte, por ejemplo, que tiene los mismos elementos de estructura secundaria en el mismo orden etc. Así, un BM de acuerdo con la presente divulgación "forma parte" de un dominio de haz de tres hélices si el polipéptido de acuerdo con esta realización tiene el mismo plegamiento que el dominio original, lo que implica que las propiedades estructurales básicas son compartidas, esas propiedades, por ejemplo, dan como resultado espectros de CD similares. El experto es consciente de otros parámetros que son relevantes.

Así en realizaciones particulares, el motivo de unión a PD-L1 (BM) forma parte de un dominio proteico de haz de tres hélices. Por ejemplo, el BM esencialmente puede constituir dos hélices alfa con un lazo de interconexión, dentro de dicho dominio proteico de haz de tres hélices. En realizaciones particulares, dicho dominio proteico de haz de tres hélices se selecciona de dominios de proteínas receptoras bacterianas. Ejemplos no limitantes de tales dominios son los cinco dominios de tres hélices diferentes de la proteína A de Staphylococcus aureus, tales como el dominio B, y derivados del mismo. En algunas realizaciones, el dominio proteico de haz de tres hélices es una variante de la proteína Z, que se deriva del dominio B de la proteína A estafilocócica (Wahlberg E y otros, 2003, PNAS 100(6):3185-3190). En algunas realizaciones donde el polipéptido de unión a PD-L1 como se divulga en la presente memoria forma parte de un dominio proteico de haz de tres hélices, el polipéptido de unión a PD-L1 puede comprender un módulo de unión (BMod), cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de:

iii) K-[BM]-DPSQSXaXbLLXc EAKKLXdXeXfQ;

en la que

[BM] es un motivo de unión a PD-L1 como se define en la presente memoria;

Xa se selecciona de A y S;

Xb se selecciona de N y E;

Xc se selecciona de A, S y C;

Xd se selecciona de E, N y S;

Xe se selecciona de D, E y S; y

Xf se selecciona de A y S; y

iv) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 93 % de identidad con una secuencia definida en iii).

En algunas realizaciones, dicho polipéptido puede exhibir beneficiosamente una alta estabilidad estructural, tal como resistencia a modificaciones químicas, a cambios en las condiciones físicas y a la proteólisis, durante la producción y el almacenamiento, así como también in vivo.

Como se discutió anteriormente, los polipéptidos que comprenden cambios menores en comparación con las secuencias de aminoácidos anteriores, que no afectan en gran medida la estructura terciaria y la función del polipéptido, también están dentro del ámbito de la presente divulgación. Así, en algunas realizaciones, la secuencia iv) tiene al menos un 93 %, tal como al menos un 95 %, tal como al menos un 97 % de identidad con una secuencia definida por iii).

En una realización, Xa en la secuencia ii i) es A.

En una realización, Xa en la secuencia ii i) es S.

En una realización, Xb en la secuencia ii i) es N.

En una realización, Xb en la secuencia ii i) es E.

En una realización, Xc en la secuencia ii i) es A.

En una realización, Xc en la secuencia ii i) es S.

En una realización, Xc en la secuencia ii i) es C.

En una realización, Xd en la secuencia ii i) es E.

En una realización, Xd en la secuencia ii i) es N.

En una realización, Xd en la secuencia ii i) es S.

En una realización, Xe en la secuencia ii i) es D.

En una realización, Xe en la secuencia ii i) es E.

En una realización, Xe en la secuencia ii i) es S.

En una realización, XdXe en la secuencia Ni) se selecciona de EE, ES, SD, SE y SS.

En una realización, XdXe en la secuencia iii) es ES.

En una realización, XdXe en la secuencia iii) es SE.

En una realización, XdXe en la secuencia iii) es SD.

En una realización, Xf en la secuencia iii) es A.

En una realización, Xf en la secuencia iii) es S.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es A; Xb es N; Xc es A y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es A y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es A; Xb es N; Xc es C y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es S y Xf es S.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es C y Xf es S.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es A; Xb es N; Xc es A; XdXe es ND y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es A; XdXe es ND y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es A; Xb es N; Xc es C; XdXe es ND y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es S; XdXe es ND y Xf es S.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es C; XdXe es ND y Xf es S.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es A; Xb es N; Xc es A; XdXe es SE y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es A; XdXe es SE y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es A; Xb es N; Xc es C; XdXe es SE y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es S; XdXe es SE y Xf es S.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es C; XdXe es SE y Xf es S.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es A; Xb es N; Xc es A; XdXe es SD y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es A; XdXe es SD y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es A; Xb es N; Xc es C; XdXe es SD y Xf es A.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es S; XdXe es SD y Xf es S.

En una realización, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es C; XdXe es SD y Xf es S.

En otra realización más, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-808 presentadas en la Figura 1. Por lo tanto, en una realización del polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con este aspecto, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-808. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 774-796, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 774-787. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 775, 776, 779-781 y 784-786, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776, 780, 781, 784 y 786, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776, 781 y 784, tal como el grupo que consiste en las S^eQ ID NO:1-93, 776 y 784 o el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776 y 781, por ejemplo, el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 776 o el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 781 o el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 784. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 774, 775 y 780-786, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 775, 780, 781, 784 y 786. En una realización, la secuencia Ni) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 17, 776 y 781, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2 y 776. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:776. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 3-8, 11, 13, 16, 18, 20, 22, 23, 43 y 73. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-24. Por ejemplo, en una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-16, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 7, 9 y 10. En otra realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 3-6, 9-10, 12-21, 23 y 24, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 4-6, 9, 14 y 18-21. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-12, 14 y 17-21. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-12 y 17, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-5 y 17, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2 y 17. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 4, 5, 6, 9, 14 y 18-21, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:4, 5, 18 y 21, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:4, 5 y 21. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 4, 5 y 21, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1 y 2. En una realización, la secuencia iii) corresponde a la secuencia desde la posición 7 hasta la posición 55 en las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:21.

Además, en una realización adicional, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

v) YA-[BMod]-AP;

en la que [BMod] es un módulo de unión a PD-L1 como se define en la presente memoria; y

vi) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia definida en v).

Alternativamente, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

vii) FN-[BMod]-AP;

viii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia definida en vii).

Por ejemplo, en una realización se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 seleccionado del grupo que consiste en ix) FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P; en el que [BM] es un motivo de unión a PD-L1 como se definió anteriormente y Xc se selecciona de A y C; y

x) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia definida en ix).

En otra realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 seleccionado del grupo que consiste en

xi) FAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL SESQA P;

en el que [BM] es un motivo de unión a PD-L1 como se definió anteriormente y Xc se selecciona de A, S y C; y xii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia definida en xi).

xiii) FAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;

en el que [BM] es un motivo de unión a PD-L1 como se definió anteriormente y Xc se selecciona de A, S y C;

xiv) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia definida en xiii).

En otra realización más, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 seleccionado del grupo que consiste en xv) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;

xvi) y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia definida en xv).

Como se discutió anteriormente, los polipéptidos que comprenden cambios menores en comparación con las secuencias de aminoácidos anteriores, que no afectan en gran medida la estructura terciaria y la función del polipéptido, también caen dentro del ámbito de la presente divulgación. Así, en algunas realizaciones, la secuencia vi), viii), x), xii), xiv) o xvi) puede ser, por ejemplo, al menos 90 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 94 %, tal como al al menos 96 %, tal como al menos 98 % idéntica a una secuencia definida por v, vii), ix), xi), xiii) y xv), respectivamente.

En algunas realizaciones, el motivo de unión a PD-L1 puede formar parte de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de

ADNNFNK-/BM/-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;

ADNKFNK-/BM/-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;

ADNKFNK-/BM/-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;

ADAQQNNFNK-/BM/-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;

AQHDE-/BM/-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK; VD N K ^FN K-[BM]~ D PSQS AN L LAEAKKL N DAQAP K; AEAKYAK-/BM/- DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK; VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK; VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK; AEAKYAK-/BM/- DPSQSSE LLS EAKKLN DSQAP K; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP; AEAKFAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; AEAKFAK-/6M/-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP; AEAKFAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK; AEAKFAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK; AEAKYAK-/BM/-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLESSQAP; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK; AEAKYAK-/BM/-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAP; AEAKYAK-/BM/- DPSQSSE LLAEAKKLS DSQAP K; AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK; AEAKYAK-/BM/-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK; VDAKYAK-[BM]- DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK; VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK; VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK; VDAKYAK-/BM/-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK; VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK; VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK; VDAKYAK-/BM/-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK; VDAKYAK7eM>DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK; VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK; VDAKYAK-ffíMj-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK; VDAKYAK7SM/-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK; VDAKYAK-/e/U/-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK¡ AEAKYAK-^/WfDPSQSSELLAEAKKLNKAQAPKiY ADAKYAK-fBMj-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; en las que [BM] es un motivo de unión a PD-L1 como se define en la presente memoria.

En una realización, el polipéptido de unión a PD-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: xvii) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

en el que [BM] es un motivo de unión a PD-L1 como se define en la presente memoria; y

xviii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 89 % de identidad con la secuencia definida en xvii). En una realización, el polipéptido de unión a PD-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: xix) AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;

xx) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 89 % de identidad con la secuencia definida en xix).

En una realización, el polipéptido de unión a PD-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: xxi) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

xxii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 89 % de identidad con la secuencia definida en xxi).

En una realización, el polipéptido de unión a PD-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: xxiii) AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

xxiv) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 89 % de identidad con la secuencia definida en xxiii).

Nuevamente, los polipéptidos que comprenden cambios menores en comparación con las secuencias de aminoácidos anteriores, que no afectan en gran medida la estructura terciaria y la función del polipéptido, también caen dentro del ámbito de la presente divulgación. Así, en algunas realizaciones, la secuencia xviii), xx), xxii) o xxiv) puede ser, por ejemplo, al menos 89 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 98 % idéntica a una secuencia definida por xvii), xix), xxi) y xxiii), respectivamente.

La secuencia xvii) o xxi) en tal polipéptido puede seleccionarse del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-814 presentadas en la Figura 1. En una realización del polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con este aspecto, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-808. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 774-796 y 809-814, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 774-787 y 809-814. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 775, 776, 779-781, 784-786 y 809-814, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776, 780, 781, 784, 786 y 809-814, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID No :1-93, 776, 781, 784 y 809-814, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776, 784, 809 y 811-814 o el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776, 781, 809 y 811-814. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776, 809 y 811-814 o el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 781, 809 y 811-814 o el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 784 y 811-814. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 774, 775, 780-786 y 810-814, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID nO:1-93, 775, 780, 781, 784, 786 y 810-814. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776, 781 y 809-813, tal como el grupo que consiste de las SEQ ID NO:1-93, 781 y 810-813. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 17, 776, 781, 809-812, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 776, 809, 811 y 812. En una realización, la secuencia xvii) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, 776 y 781, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 781. En una realización, la secuencia xvii) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 17, 776 y 781, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2 y 776. En una realización, la secuencia xvii) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 o SEQ ID No :776. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 811-813. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 3-8, 11, 13, 16, 18, 22, 23, 43, 73 y 811-813. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-24 y 811-813. Por ejemplo, en una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-16 y 811-813, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 811 y 812. En otra realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 3-6, 9-10, 12-21, 23, 24, 811 y 812, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 4-6, 9, 14, 18-21, 811 y 812. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-12, 14, 17-21 y 811-812. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-12, 17, 811 y 812, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-5, 17, 811 y 812, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 17, 811 y 812. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 4, 5, 6, 9, 14, 18, 19, 20, 21 y 811, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:4, 5, 18 y 21, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:4, 5 y 21. En una realización, la secuencia xvii)) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 4, 5 y 21, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1 y 2. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en las SEQ ID NO:1 u 811. En una realización, la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en las SEQ ID NO:2 u 812. En una realización, la secuencia xvii) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en las SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:21.

Las expresiones "unión a PD-L1" y "afinidad de unión a PD-L1" tal como se usan en esta especificación se refieren a una propiedad de un polipéptido que puede ensayarse, por ejemplo, mediante ELISA o mediante el uso de tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR).

Por ejemplo, como se describe en los ejemplos a continuación, la afinidad de unión a PD-L1 puede ensayarse en un experimento en el que se capturan muestras del polipéptido en placas de ELISA revestidas con anticuerpos y se adiciona PD-L1 biotinilado seguido de HRP conjugada con estreptavidina. Se adiciona sustrato TMB y se mide la absorbancia a 450 nm mediante el uso de un lector de placas de pocillos múltiples, tal como Victor3 (Perkin Elmer). El experto puede interpretar los resultados obtenidos por tales experimentos para establecer al menos una medida cualitativa de la afinidad de unión del polipéptido por PD-L1. Si se desea una medida cuantitativa, por ejemplo, para determinar el valor de EC50 (la concentración efectiva máxima media) para la interacción, también puede usarse ELISA. La respuesta del polipéptido contra una serie de diluciones de PD-L1 biotinilado se mide mediante el uso de ELISA como se describe anteriormente. El experto puede interpretar los resultados obtenidos por tales experimentos, y los valores de EC50 pueden calcularse a partir de los resultados mediante el uso de, por ejemplo, GraphPad Prism 5 y regresión no lineal.

La afinidad de unión a PD-L1 puede ensayarse, además, en un experimento en el que PD-L1, o un fragmento del mismo, se inmoviliza en un chip sensor de un instrumento de resonancia de plasmón superficial (SPR), y se pasa la muestra que contiene el polipéptido a analizar sobre el chip. Alternativamente, el polipéptido a ensayar se inmoviliza en un chip sensor del instrumento, y una muestra que contiene PD-L1, o un fragmento del mismo, se pasa sobre el chip. El experto puede interpretar los resultados obtenidos por tales experimentos para establecer al menos una medida cualitativa de la afinidad de unión del polipéptido por PD-L1. Si se desea una medida cuantitativa, por ejemplo, para determinar un valor de K^dpara la interacción, pueden usarse, además, procedimientos de resonancia de plasmón superficial. Los valores de unión pueden definirse, por ejemplo, en un instrumento Biacore (GE Healthcare) o ProteOn XPR 36 (Bio-Rad). PD-L1 se inmoviliza adecuadamente en un chip sensor del instrumento, y las muestras del polipéptido cuya afinidad se determinará se preparan mediante dilución en serie y se inyectan en orden aleatorio. Los valores de Kd pueden calcularse a partir de los resultados mediante el uso de, por ejemplo, el modelo de unión de Langmuir 1:1 del software BIAevaluation 4.1 u otro software adecuado, proporcionado por el fabricante del instrumento. Las expresiones "unión de albúmina" y "afinidad de unión por albúmina" tal como se usan en esta divulgación se refieren a una propiedad de un polipéptido que puede ensayarse, por ejemplo, mediante el uso de tecnología de SPR en un instrumento Biacore o un instrumento ProteOn XPR36, de manera análoga al ejemplo descrito anteriormente para PD-L1.

En una realización, el polipéptido de unión a PD-L1 es capaz de unirse a PD-L1 de manera tal que el valor de K^dde la interacción con PD-L1 es como máximo 2 x 10'8 M, tal como máximo 1 x 10'8 M, tal como máximo 1 x 10'9 M, tal como máximo 5 x 10'1° M, tal como máximo 3 x 10'1° M.

En una realización, el polipéptido de unión a PD-L1 es capaz de unirse a PD-L1 de manera tal que el valor de kd de la interacción con PD-L1 es como máximo 1 x 10'3 s-1, tal como máximo 6 x 10'4 s-1.

En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquier ítem anterior que es capaz de unirse a PD-L1 de manera tal que el valor de EC50 de la interacción sea como máximo 1 x 10'9 M, tal como máximo 1 x 10'10 M, tal como máximo 7 x 10'11 M.

La unión de un polipéptido como se define en la presente memoria a PD-L1 puede interferir con la señalización mediante PD-L1 in vivo o in vitro. Cuando PD-L1 se une a PD-1, la interacción ligando/receptor amortigua la respuesta de los linfocitos T, por ejemplo, mediante la inhibición de las quinasas que participan en la activación de los linfocitos T. Así, el bloqueo de la unión de PD-L1 a PD-1 restaura la respuesta de los linfocitos T. La actividad de bloqueo puede, por ejemplo, cuantificarse por la concentración inhibitoria máxima media (IC50), que es una medida de la efectividad de una sustancia para inhibir una función biológica o bioquímica específica. Esta medida cuantitativa indica qué cantidad de una sustancia particular se necesita para inhibir a la mitad un proceso biológico dado, y se usa comúnmente en la técnica. Así, en una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 como se define en la presente memoria que es capaz de bloquear la señalización dependiente de PD-L1. En una realización, la concentración inhibitoria máxima media (IC50) del bloqueo es como máximo 5 x 10-8 M, tal como máximo 1 x 10-8 M, tal como máximo 5 x 10-9 M, tal como máximo 3,5 x Í0 -9 M, tal como máximo 1 x 10-9 M, tal como máximo 5 x 10-10 M, tal como máximo 1 x 10-10 M. En una realización, el polipéptido de unión a PD-L1 es capaz de bloquear la interacción de PD-L1 con PD-1.

En una realización, dicho PD-L1 es PD-L1 humano. En otra realización, dicho PD-L1 es PD-L1 de mono rhesus.

El experto comprenderá que pueden hacerse varias modificaciones y/o adiciones a un polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquier aspecto divulgado en la presente memoria para adaptar el polipéptido a una aplicación específica sin apartarse del ámbito de la presente divulgación.

Por ejemplo, en una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 como se describe en la presente memoria, dicho polipéptido se extendió por y/o comprende aminoácidos adicionales en el C terminal y/o N terminal. Tal un polipéptido debe entenderse como un polipéptido que tiene uno o más residuos aminoacídicos adicionales en la primera y/o última posición en la cadena de polipéptidos. Así, un polipéptido de unión a PD-L1 puede comprender cualquier número adecuado de residuos aminoacídicos adicionales, por ejemplo, al menos un residuo aminoacídico adicional. Cada residuo aminoacídico adicional puede adicionarse individual o colectivamente para, por ejemplo, mejorar y/o simplificar la producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, acoplamiento o detección del polipéptido. Tales residuos aminoacídicos adicionales pueden comprender uno o más residuos aminoacídicos adicionados con el propósito de acoplamiento químico. Un ejemplo de esto es la adición de un residuo de cisteína. Los residuos aminoacídicos adicionales pueden proporcionar, además, una "etiqueta" para la purificación o detección del polipéptido, tal como una etiqueta de His6, una etiqueta (HisGlu)3 (etiqueta "HEHEHE") o una etiqueta (c-myc) "myc" o una etiqueta "FLAG" para la interacción con anticuerpos específicos de la etiqueta o de la cromatografía de afinidad por metal inmovilizado (IMAC) en el caso de la etiqueta de His6.

En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 como se describe en la presente memoria que comprende aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal y/o N-terminal. Por ejemplo, en una realización del polipéptido de unión a PD-L1 como se divulga en la presente memoria, consiste en una cualquiera de las secuencias divulgadas en la presente memoria, que tiene de 0 a 15 residuos C-terminales y/o N-terminales adicionales, tales como de 0 a 7 residuos C-terminales y/o N-terminales adicionales. En una realización, el polipéptido de unión a PD-L1 consiste en una cualquiera de las secuencias divulgadas en la presente memoria, que tiene de 0 a 15, tal como de 0 a 4, tal como 3 residuos C-terminales adicionales. En una realización particular, el polipéptido de unión a PD-L1 como se describe en la presente memoria comprende los residuos C-terminales adicionales ^vD^co VEC.

Los aminoácidos adicionales como se discutió anteriormente pueden acoplarse al polipéptido de unión a PD-L1 por medio de conjugación química (mediante el uso de procedimientos de química orgánica conocidos) o por cualquier otro medio, tal como la expresión del polipéptido de unión a PD-L1 como proteína de fusión o unidos de cualquier otra forma, ya sea directamente o mediante un enlazador, por ejemplo, un enlazador de aminoácidos.

Un dominio polipeptídico adicional puede proporcionar, además, otro resto de unión a PD-L1. Así, en una realización adicional, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 en una forma multimérica. Se entiende que dicho multímero comprende al menos dos polipéptidos de unión a PD-L1 como se divulga en la presente memoria como unidades monoméricas, cuyas secuencias de aminoácidos pueden ser iguales o diferentes. Las formas multiméricas de los polipéptidos pueden comprender un número adecuado de dominios, cada uno con un motivo de unión a PD-L1, y cada uno forma un monómero dentro del multímero. Estos dominios pueden tener la misma secuencia de aminoácidos, pero alternativamente, pueden tener diferentes secuencias de aminoácidos. En otras palabras, el polipéptido de unión a PD-L1 de la invención puede formar homo o heteromultímeros, por ejemplo, homo o heterodímeros. En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, en el que dichas unidades de monómero se acoplan covalentemente entre sí. En otra realización, dichas unidades de monómero del polipéptido de unión a PD-L1 se expresan como una proteína de fusión. En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 en forma dimérica. En una realización particular, dicha forma dimérica es una forma homodimérica. En otra realización, dicha forma dimérica es una forma heterodimérica. En aras de la claridad, a lo largo de esta divulgación, el término "polipéptido de unión a PD-L1" se usa para abarcar polipéptidos de unión a PD-L1 en todas sus formas, es decir, formas monoméricas y multiméricas.

Los aminoácidos adicionales como se discutió anteriormente pueden comprender, por ejemplo, uno o más dominios polipeptídicos adicionales. Un dominio polipeptídico adicional puede proporcionar al dímero de unión a PD-L1 otra función, tal como, por ejemplo, otra función de unión, o una función enzimática, o una función tóxica o una función de señalización fluorescente, o combinaciones de las mismas.

Además, puede ser beneficioso que el polipéptido de unión a PD-L1 como se define en la presente memoria sea parte de una proteína de fusión o un conjugado que comprende un segundo o más restos. El segundo y más restos del polipéptido o conjugado de fusión en tal proteína pueden tener adecuadamente una actividad biológica deseada.

Así, en un segundo aspecto de la presente divulgación, se proporciona una proteína de fusión o un conjugado, que comprende un primer resto que consiste en un polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con el primer aspecto, y un segundo resto que consiste en un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada. En otra realización, dicha proteína de fusión o conjugado puede comprender adicionalmente restos adicionales, que comprenden actividades biológicas deseadas que pueden ser iguales o diferentes de la actividad biológica del segundo resto.

Los ejemplos no limitantes de una actividad biológica deseada comprenden una actividad terapéutica, una actividad de unión y una actividad enzimática. En una realización, el segundo resto que tiene una actividad biológica deseada es un polipéptido terapéuticamente activo. En una realización, dicho segundo resto es un agente modificador de la respuesta inmune. En otra realización, dicho segundo resto es un agente anticancerígeno.

En una realización del primer o segundo aspecto de la presente divulgación, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión o conjugado que comprende un agente modificador de la respuesta inmune. Los ejemplos no limitantes de agentes modificadores de la respuesta inmune adicionales incluyen agentes inmunomoduladores u otros agentes antiinflamatorios

En una realización del primer o segundo aspecto de la presente divulgación, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión o conjugado que comprende un agente anticancerígeno. Los ejemplos no limitantes de agentes anticancerígenos incluyen agentes seleccionados del grupo que consiste en auristatina, antraciclina, calicheamicina, combretastatina, doxorrubicina, duocarmicina, el antibiótico antitumoral CC-1065, ecteinsascidina, geldanamicina, maitansinoide, metotrexato, micotoxina, taxol, ricina, bouganina, gelonina, exotoxina 38 de pseudomonas (PE38), toxina diftérica (DT) y sus análogos, y derivados de los mismos y combinaciones de los mismos. Un experto apreciaría que los ejemplos no limitantes de agentes anticancerígenos incluyen todas las variantes posibles de dichos agentes, por ejemplo, el agente auristatina se pretende que incluya, por ejemplo, auristatina E, auristatina F, auristatina PE, y derivados de los mismos.

Ejemplos no limitantes de polipéptidos terapéuticamente activos son biomoléculas, tales como moléculas seleccionadas del grupo que consiste en hormonas, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas, linfocinas y enzimas endógenas humanas.

Ejemplos no limitantes de actividades de unión son actividades de unión que aumentan la semivida in vivo de la proteína de fusión o conjugado, y actividades de unión que actúan para bloquear una actividad biológica. Un ejemplo de tal actividad de unión es una actividad de unión, que aumenta la semivida in vivo de una proteína de fusión o conjugado. En una realización de dicha proteína de fusión o conjugado, la semivida in vivo de dicha proteína de fusión o conjugado es más larga que la semivida in vivo del polipéptido que tiene la actividad biológica deseada per se. En una realización, dicha semivida in vivo se incrementa al menos 10 veces, tal como al menos 25 veces, tal como al menos 50 veces, tal como al menos 75 veces, tal como al menos 100 veces en comparación con la semivida in vivo de la proteína de fusión o conjugado per se.

La proteína de fusión o conjugado puede comprender al menos un resto adicional. En una realización particular, dicha diana es albúmina, la unión a la cual aumenta la semivida in vivo de dicha proteína de fusión o conjugado. En una realización, dicha actividad de unión a la albúmina se proporciona por un dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína estreptocócica G o un derivado de la misma. Así, dicha proteína de fusión puede comprender, por ejemplo, un polipéptido de unión a PD-L1 en forma monomérica o multimérica (tal como una forma homodimérica o heterodimérica) como se define en la presente memoria y un dominio de unión a albúmina de proteína G estreptocócica o un derivado del mismo.

En otra realización, se proporciona una proteína de fusión o un conjugado en el que dicho segundo resto que tiene una actividad de unión deseada es una proteína basada en la proteína Z, derivada del dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus, que tiene una afinidad de unión por una diana distinta de PD-L1.

Por ejemplo, dicha proteína de fusión o conjugado, que comprende al menos un resto adicional, puede comprender [polipéptido de unión a PD-L1] -[resto de unión a albúmina] -[resto con afinidad por la diana seleccionada]. Debe entenderse que los tres restos en este ejemplo pueden estar dispuestos en cualquier orden del N al C terminal del polipéptido.

El experto es consciente de que la construcción de una proteína de fusión a menudo implica el uso de enlazadores entre los restos funcionales a fusionar, y existen diferentes tipos de enlazadores con diferentes propiedades, tales como enlazadores de aminoácidos flexibles, enlazadores de aminoácidos rígidos y enlazadores de aminoácidos escindibles. Los enlazadores se usan, por ejemplo, para aumentar la estabilidad o mejorar el plegamiento de las proteínas de fusión, para aumentar la expresión, mejorar la actividad biológica, permitir el direccionamiento y alterar la farmacocinética de las proteínas de fusión. Así, en una realización, el polipéptido de acuerdo con cualquier aspecto divulgado en la presente memoria comprende, además, al menos un enlazador, tal como al menos un enlazador seleccionado de enlazadores de aminoácidos flexibles, enlazadores de aminoácidos rígidos y enlazadores de aminoácidos escindibles. En una realización, dicho enlazador se dispone entre dicho polipéptido de unión a PD-L1 y un dominio polipeptídico adicional, tal como entre un dominio de unión a PD-L1 como se divulga en la presente memoria y un fragmento de unión al anticuerpo o antígeno del mismo (como se describe con más detalle a continuación). Los enlazadores flexibles se usan a menudo en la técnica cuando los dominios unidos requieren un cierto grado de movimiento o interacción, y pueden ser particularmente útiles en algunas realizaciones del complejo. Tales enlazadores generalmente se componen de aminoácidos pequeños, no polares (por ejemplo, G) o polares (por ejemplo, S o T). Algunos enlazadores flexibles consisten principalmente en tramos de residuos G y S, por ejemplo, (GGGGS)p. El ajuste del número de copias "p" permite la optimización del enlazador para lograr una separación apropiada entre los restos funcionales o para mantener la interacción necesaria entre los restos. Además de los enlazadores G y S, se conocen otros enlazadores flexibles en la técnica, tales como enlazadores de G y S que contienen residuos aminoacídicos adicionales, tales como T y A, para mantener la flexibilidad, así como residuos de aminoácidos polares para mejorar la solubilidad. Ejemplos adicionales no limitantes de enlazadores incluyen GGGGSLVPRGSGGGGS, (GS)3, (GS)4, (GS)s, GGSGGHMGSGG, GGSGGSGGSGG, GGSGG, GGSGGGGG, GGGSEGGGSEGGGSEGGG, AAGAATAA, GGGGG, GGSSG, GSGGGTGGGSG, GSGGGTGGGSG, GSGSGSGSGGSG, GSGGSGGSGGSGGS y GSGGSGSGGSGGSG, correspondientes a las SEQ ID NO:820-836, respectivamente, y GT. El experto es consciente de otros enlazadores adecuados.

En una realización, dicho enlazador es un enlazador flexible que comprende residuos de glicina (G), serina (S) y/o treonina (T). En una realización, dicho enlazador tiene una fórmula general seleccionada de (GnSm)p y (SnGm)p, en la que, independientemente, n = 1-7, m = 0-7, n m < 8 y p = 1-7. En una realización, n = 1-5. En una realización, m = 0-5. En una realización, p = 1-5. En una realización más específica, n = 4, m = 1 y p = 1-4. En una realización, dicho enlazador se selecciona del grupo que consiste en S4G, (S4G)3 y (S4G)4 En una realización, dicho enlazador se selecciona del grupo que consiste en G4S y (G4S)3. En una realización particular, dicho enlazador es G4S y en otra realización dicho enlazador es (G4S)3.

Con respecto a la descripción anterior de proteínas de fusión o conjugados que incorporan un polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con la divulgación, debe observarse que la designación de los restos primero, segundo y adicionales se realiza por razones de claridad para distinguir entre polipéptidos o polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con la invención, por un lado, y restos que exhiben otras funciones por otro lado. Estas designaciones no pretenden referirse al orden real de los diferentes dominios en la cadena polipeptídica de la proteína de fusión o conjugado. Similarmente, las designaciones de las unidades de monómero primera y segunda se realizan por razones de claridad para distinguir entre dichas unidades. Así, por ejemplo, dicho primer resto (o unidad de monómero) puede aparecer sin restricción en el extremo N-terminal, en el medio, o en el extremo C-terminal de la proteína de fusión o conjugado.

Recientemente, se avanzó considerablemente en el desarrollo de agentes multiespecíficos, tales como los anticuerpos con la capacidad de unirse a más de un antígeno, por ejemplo mediante la ingeniería de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) para abordar dos antígenos en un solo sitio de combinación de anticuerpos (Bostrom y otros, 2009, Science 323(5921):1610-1614; Schaefer y otros, 2011, Cancer Cell 20(4):472-486), mediante la construcción de anticuerpos heterodiméricos mediante el uso de unidades de Fc modificadas genéticamente (Carter, 2001, J Immunol Methods 248(1-2):7-15; Schaefer y otros, 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108(27):11187-11192) y mediante la fusión genética de unidades de reconocimiento auxiliares al extremo N o C de las cadenas ligeras o pesadas de anticuerpos de longitud completa (Kanakaraj y otros, 2012, MAbs 4(5):600-613; LaFleur y otros, 2013, MAbs 5(2):208-218). Así, puede ser beneficioso que una molécula que incorpora una afinidad por PD-L1 como se divulga en la presente memoria muestre, además, afinidad por otro factor, tal como un factor asociado con cáncer o un factor asociado con la respuesta inmune.

Así, en el tercer aspecto de la presente divulgación, se proporciona un complejo que comprende al menos un polipéptido de unión a PD-L1 y al menos un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el polipéptido de unión a PD-L1 es como se describe en la presente memoria.

Cuando se usa en la presente memoria, el término "complejo" pretende referirse a dos o más cadenas de polipéptidos asociadas, al menos una que tiene afinidad por PD-L1 y al menos una es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Estas cadenas polipeptídicas pueden contener dominios proteicos diferentes, y el complejo multiproteína resultante puede tener múltiples funciones. "Complejo" pretende referirse a dos o más polipéptidos como se definen en la presente memoria, conectados por enlaces covalentes, por ejemplo, dos o más cadenas polipeptídicas conectadas por enlaces covalentes a través de la expresión de las mismas como una proteína de fusión recombinante, o asociadas por conjugación química.

Como se conoce bien, los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina capaces de unirse específicamente a una diana (un antígeno), tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido u otro, a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en la presente memoria, la expresión "anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo" abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales completos o intactos, sino también fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fab3, Fv y variantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una o más porciones de anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, lo que incluye variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. Otros ejemplos de anticuerpos modificados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen nanocuerpos, AlbudAbs, DART (redireccionamiento de doble afinidad), BiTE (acoplador biespecífico de células T), TandAbs (diacuerpos en tándem), DAF (Fab de doble acción), anticuerpos dos en uno, SMIP (inmunofarmacéuticos modulares pequeños), FynomAbs (finómeros fusionados a anticuerpos), DVD-Igs (inmunoglobulina de dominio variable doble), cuerpos CovX (anticuerpos modificados con péptidos), duocuerpos y triomAbs. Esta lista de variantes de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos no debe considerarse como limitante, y el experto es consciente de otras variantes adecuadas.

Un anticuerpo de longitud completa comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada contiene una región variable de cadena pesada (Vh) y regiones constantes primera, segunda y tercera (Ch1, Ch2 y Ch3). Cada cadena ligera contiene una región variable de cadena ligera (Vl) y una región constante de cadena ligera (Cl). En dependencia de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan a diferentes clases. Existen seis clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM e IgY, y varios de estos pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. El término "anticuerpo de longitud completa" como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgD, IgE, IgG, IgA, IgM o IgY (o cualquier subclase de los mismos). Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de anticuerpos se conocen bien.

Un "fragmento de unión a antígeno" es una porción o región de una molécula de anticuerpo, o un derivado de la misma, que retiene toda o una parte significativa de la unión a antígeno del anticuerpo de longitud completa correspondiente. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender la región variable de la cadena pesada (Vh), la región variable de la cadena ligera (Vl), o ambas. Cada una de las Vh y Vl contiene típicamente tres regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3. Las tres CDR en V^ho V^lse flanquean por regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4). Como se enumeró brevemente anteriormente, los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen, pero no están limitados a: (1) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que tiene una cadena V^l-C^ly una cadena Vh-Ch1; (2) un fragmento Fab', que es un fragmento Fab con la región de la bisagra de la cadena pesada, (3) un fragmento F(ab')2, que es un dímero de fragmentos Fab' unidos por la región de la bisagra de la cadena pesada, por ejemplo, unida por un puente disulfuro en la región bisagra; (4) un fragmento Fc; (5) un fragmento Fv, que es el fragmento de anticuerpo mínimo que tiene los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo; (6) un fragmento de cadena sencilla Fv (scFv), que es una cadena polipeptídica sencilla en la que los dominios V^hy V^lde un scFv se unen por un enlazador peptídico; (7) un (scFv)2, que comprende dos dominios Vh y dos dominios Vl, que se asocian a través de los dos dominios V^hmediante puentes disulfuro y (8) anticuerpos de dominio, que pueden ser polipéptidos de dominio variable único de anticuerpos (V^ho V^l) que se unen específicamente a antígenos.

Los fragmentos de unión a antígeno pueden prepararse mediante procedimientos de rutina. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2 pueden producirse por hidrólisis con pepsina de una molécula de anticuerpo de longitud completa, y pueden generarse fragmentos Fab mediante la reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, los fragmentos pueden prepararse mediante tecnología recombinante mediante la expresión de los fragmentos de cadena pesada y ligera en células huésped adecuadas (por ejemplo, E. coli, células de levadura, mamífero, vegetal o insecto) y ensamblarlas para formar los fragmentos de unión a antígeno deseados in vivo o in vitro. Puede prepararse un anticuerpo de cadena sencilla mediante tecnología recombinante mediante la unión de una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera. Por ejemplo, puede incorporarse un enlazador flexible entre las dos regiones variables. El experto es consciente de los procedimientos para la preparación de anticuerpos de longitud completa y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Así, en una realización, este aspecto de la divulgación proporciona un complejo como se define en la presente memoria, en el que dicho al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos de longitud completa, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F( ab')2, fragmentos Fc, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla, (scFv)2 y anticuerpos de dominio. En una realización, dicho al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de anticuerpos de longitud completa, fragmentos Fab y fragmentos scFv. En una realización particular, dicho al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de longitud completa.

En una realización de dicho complejo como se define en la presente memoria, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

El término "anticuerpos monoclonales" como se usa en la presente memoria se refiere a anticuerpos que tienen afinidad monovalente, lo que significa que cada molécula de anticuerpo en una muestra del anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo en el antígeno, mientras que el término "anticuerpos policlonales" como se usa en la presente memoria se refiere a un colección de anticuerpos que reaccionan contra un antígeno específico, pero en la colección puede haber diferentes moléculas de anticuerpos, por ejemplo, que identifican diferentes epítopos en el antígeno. Los anticuerpos policlonales se producen típicamente por inoculación de un mamífero adecuado y se purifican del suero del mamífero. Los anticuerpos monoclonales se producen por células inmunes idénticas que son clones de una célula madre única (por ejemplo, una línea celular de hibridoma). El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria se refiere a anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden sustancialmente a, o se derivan de, anticuerpos obtenidos de sujetos humanos. El término "anticuerpos quiméricos" como se usa en la presente memoria, se refiere a anticuerpos recombinantes o modificados genéticamente, tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón, que contienen polipéptidos o dominios de una especie diferente, por ejemplo humana, introducidos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos. El término "anticuerpos humanizados" se refiere a anticuerpos de especies no humanas cuyas secuencias de proteínas se modificaron para aumentar su similitud con las variantes de anticuerpos producidas naturalmente en seres humanos, con el fin de reducir la inmunogenicidad.

El complejo como se describe en la presente memoria puede estar presente, por ejemplo, en forma de una proteína de fusión o un conjugado. Así, dicho al menos un polipéptido de unión a PD-L1 y dicho al menos un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, pueden acoplarse por medio de conjugación química (mediante el uso de procedimientos conocidos de química orgánica) o por cualquier otro medio, tal como la expresión del complejo como una proteína de fusión o unido de cualquier otra manera, ya sea directamente o mediante un enlazador, por ejemplo, un enlazador de aminoácidos. El experto apreciará que la descripción anterior de secuencias enlazadoras en relación con los polipéptidos de fusión es igualmente relevante para el complejo como se divulga en la presente memoria.

Así en una realización, se proporciona un complejo como se define en la presente memoria, en el que dicho complejo es una proteína de fusión o un conjugado. En una realización, dicho complejo es una proteína de fusión. En otra realización, dicho complejo es un conjugado. En una realización de dicho complejo, dicho polipéptido de unión a PD-L1 se une al N terminal o al C terminal de la cadena pesada de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra realización, dicho polipéptido de unión a PD-L1 se une al N terminal o al C terminal de la cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, dicho polipéptido de unión a PD-L1 se une al N terminal y/o al C terminal de la cadena ligera y de la cadena pesada de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, el polipéptido de unión a PD-L1 puede unirse solo al N terminal de la(s) cadena(s) pesada(s), solo al N terminal de la(s) cadena(s) ligera(s), solo al C terminal de la(s) cadena(s) pesada(s), solo el C terminal de la(s) cadena(s) ligera(s), tanto al N terminal como al C terminal de la(s) cadena(s) pesada(s), tanto el N terminal como al C terminal de la(s) cadena(s) ligera(s), solo el C terminal de la(s) cadena(s) ligera(s) y al N terminal de la(s) cadena(s) pesada(s), solo al C terminal de la(s) cadena(s) pesada(s) y al N terminal de la cadena(s) ligera(s), de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En una realización, se proporciona un complejo, en el que dicho polipéptido de unión a PD-L1 se une al C terminal o al N terminal de la cadena pesada o de la cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización particular, se proporciona un complejo de acuerdo con cualquier ítem anterior, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene afinidad por un antígeno, por ejemplo, un antígeno asociado con una enfermedad infecciosa, o un antígeno asociado con cáncer. Por ejemplo, dicho antígeno puede ser PD-1 o CTLA-4.

En una realización se proporciona una proteína de fusión, conjugado o complejo como se describe en la presente memoria, en el que dicho segundo o más resto/restos o anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un inhibidor seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de: PD-1, CTLA-4, inmunoglobulina de células T y mucina que contiene proteína-3 (TIM-3), galectina-9 (GAL-9), gen-3 de activación de linfocitos (LAG-3), PD-L2, homólogo 3 de B7 (B7-H3), homólogo 4 de B7 (B7-H4), supresor de Ig del dominio V de la activación de células T (VISTA), molécula 1 de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM1), atenuador de linfocitos B y T (BTLA), receptor 1 del factor estimulante de colonias (CSF1R), mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), receptor tipo inmunoglobulina de célula asesina (KIR), adenosina, receptor de adenosina A2a (A2aR), CD200-CD200R y dominio ITIM e Ig de células T.

En una realización, dicho segundo resto o anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un inhibidor de PD-1, tal como un inhibidor seleccionado del grupo que consiste en nivolumab, pidilizumab, BMS 936559, MPDL328OA (Roche) y pembrolizumab. En una realización específica, el inhibidor es pembrolizumab.

En una realización, dicho segundo resto o anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un inhibidor de CTLA-4, tal como un inhibidor seleccionado del grupo que consiste en belatacept, abatacept, tremelimumab e ipilimumab. En una realización específica, el inhibidor es ipilimumab.

En una realización se proporciona una proteína de fusión, conjugado o complejo como se describe en la presente memoria, en el que dicho segundo resto o anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un agonista seleccionado del grupo que consiste en agonistas de CD134, CD40, 4-1BB y proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR).

Los aspectos anteriores abarcan, además, polipéptidos en los que el polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con el primer aspecto, el polipéptido de unión a PD-L1 como se comprende en una proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el segundo aspecto o en un complejo de acuerdo con el tercer aspecto, comprende, además, una etiqueta, tal como una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en metales y tintes fluorescentes, tintes cromóforos, compuestos quimioluminiscentes, proteínas bioluminiscentes, enzimas, radionucleidos, partículas radiactivas y etiquetas de reconocimiento de predireccionamiento. Tales etiquetas pueden usarse, por ejemplo, para la detección del polipéptido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, tal polipéptido etiquetado puede usarse, por ejemplo, para etiquetar o dirigirse a tumores que tienen una alta expresión de PD-L1.

El etiquetado indirecto de un polipéptido de variante Z se mostró recientemente mediante el uso de etiquetas de reconocimiento de predireccionamiento (Westerlund y otros (2015), Bioconjugate Chem 26:1724-1736). Similarmente, la divulgación proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 como se describe en la presente memoria etiquetado con un resto de predireccionamiento, que puede usarse entonces para el etiquetado indirecto con un resto complementario al resto de predireccionamiento. Cuando comprende un resto de predireccionamiento, un agente de unión a PD-L1 de la presente divulgación puede asociarse con un resto de predireccionamiento complementario, y dicho resto de predireccionamiento complementario puede entonces comprender o unirse a un radionucleido adecuado. El experto es consciente de los radionucleidos adecuados para fines terapéuticos, diagnósticos y/o pronósticos. Tal radionucleido puede quelarse a dicho resto de predireccionamiento complementario mediante un entorno quelante como se describe en general para el agente de unión a PD-L1 a continuación.

En una realización, el par complementario de restos de predireccionamiento comprende stept(avidina)/biotina, oligonucleótido/oligonucleótido complementario tal como ADN/ADN complementario, ARN/ARN complementario, ácido nucleico fosforotioato/ácido nucleico fosforotioato complementario y ácido nucleico de péptido (PNA)/ácido nucleico de péptido complementario (cPNA) y morfolinos/morfolinos complementarios. En una realización particular, dicho resto de predireccionamiento es un oligonucleótido de PNA, tal como una secuencia de PNA de 10-20 mer, tal como una secuencia de PNA de 15 mer.

En realizaciones en las que el polipéptido, proteína de fusión, conjugado o complejo se etiqueta, directa o indirectamente (por ejemplo, mediante predireccionamiento como se describe anteriormente), con un agente de obtención de imágenes (por ejemplo, agente radiactivo), puede medirse la cantidad de polipéptido etiquetado presente en un tumor mediante el uso de equipos de obtención de imágenes, tal como a través de la adquisición de recuentos de radiactividad o imágenes de densidad de radiación, o derivados de los mismos tal como la concentración de radiación. Los ejemplos no limitantes de radionucleidos, adecuados para el etiquetado directo del agente de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquier aspecto divulgado en la presente memoria, o para el etiquetado indirecto mediante el etiquetado de un resto de predireccionamiento complementario, incluyen 68Ga, 110mIn, 18F, 45Ti, 44Sc, 61Cu, 66Ga, 64Cu, 55Co, 72As, 86y 89Zr 124i 76Br 111|n 99mTc 123| 131|y67Ga

En una realización, el equipo de obtención de imágenes usado en tales mediciones es un equipo de tomografía por emisión de positrones (PET), en cuyo caso el radionucleido se selecciona de manera que sea adecuado para PET. El experto es consciente de los radionucleidos adecuados para su uso con PET. Por ejemplo, un radionucleido para PET se selecciona del grupo que consiste en 68Ga, 110mIn, 18F, 45Ti, 44Sc, 61Cu, 66Ga, 64Cu, 55Co, 72As, 86Y, 89Zr, 124I y 76Br. En otra realización, el equipo de obtención de imágenes usado es un equipo de tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), en cuyo caso el radionucleido se selecciona de manera que sea adecuado para SPECT. El experto es consciente de los radionucleidos adecuados para su uso con SPECT. Por ejemplo, un radionucleido SPECT se selecciona del grupo que consiste en 111In, 99mTc, 123I, 131I y 67Ga.

Así, en una realización, se proporciona un polipéptido, proteína de fusión o complejo de unión a PD-L1 como se describe en la presente memoria, que comprende una etiqueta de radionucleidos directa o indirecta, tal como un radionucleido seleccionado del grupo que consiste en 68Ga, 110mIn, 18F, 45Ti, 44Sc, 61Cu, 66Ga, 64Cu, 55Co, 72As, 86Y, 89Zr, 124I, 76Br, 111In, 99mTc, 123I, 131I, y 67Ga, tal como el grupo que consiste en 68Ga, 110mIn, 18F, 45Ti, 44Sc, 61Cu, 66Ga, 64Cu, 55Co, 72As, 86Y, 89Zr, 124I y 76Br, tal como 18F.

En algunas realizaciones, el polipéptido de unión a PD-L1 etiquetado está presente como un resto en una proteína de fusión, conjugado o complejo que comprende, además, un segundo resto que tiene una actividad biológica deseada. En algunos casos la etiqueta puede acoplarse solo al polipéptido de unión a PD-L1 y, en algunos casos tanto al polipéptido de unión a PD-L1 como al segundo resto de la proteína de fusión o conjugado y/o al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Además, también es posible que el marcador pueda acoplarse a un segundo resto, o anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y no al resto de unión a PD-L1. Por lo tanto, aun en otra realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1 que comprende un segundo resto, en el que dicha etiqueta se acopla solo al segundo resto. En otra realización, se proporciona un complejo como se define en la presente memoria, en el que dicha etiqueta se acopla solo al anticuerpo o al fragmento de unión a antígeno del mismo.

Cuando se hace referencia a un polipéptido etiquetado, esto debe entenderse como una referencia a todos los aspectos de los polipéptidos como se describe en la presente memoria, que incluyen los polipéptidos de unión a PD-L1, proteínas de fusión, conjugados y complejos que comprenden un polipéptido de unión a PD-L1. Así, un polipéptido etiquetado puede contener solo el polipéptido de unión a PD-L1 y, por ejemplo, un radionucleido terapéutico, que puede quelarse o acoplarse covalentemente al polipéptido de unión a PD-L1, o contener el polipéptido de unión a PD-L1, un radionucleido terapéutico y un segundo resto tal como una molécula pequeña que tiene una actividad biológica deseada, por ejemplo, una eficacia terapéutica. Un polipéptido etiquetado puede contener un polipéptido de unión a PD-L1 en forma heterodimérica y, por ejemplo, un radionucleido terapéutico, que puede quelarse o acoplarse covalentemente al polipéptido de unión a PD-L1, o contener el polipéptido de unión a PD-L1 en forma heterodimérica, un radionucleido terapéutico y un segundo resto tal como una molécula pequeña que tiene una actividad biológica deseada, por ejemplo, una eficacia terapéutica. Se prevé, además, un complejo que contiene un polipéptido de unión a PD-L1 como se define en la presente memoria, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y, por ejemplo, un radionucleido terapéutico, que puede quelarse o acoplarse covalentemente al polipéptido de unión a PD-L1 o al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. El experto es consciente de otras posibles variantes.

En realizaciones en las que el polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo se radioetiqueta, dicho polipéptido radioetiquetado puede comprender un radionucleido. La mayoría de los radionucleidos tienen una naturaleza metálica y los metales son típicamente incapaces de formar enlaces covalentes estables con elementos presentados en proteínas y péptidos. Por esta razón, el etiquetado de proteínas y péptidos con metales radiactivos se realiza con el uso de quelantes, es decir, ligandos multidentados, que forman compuestos no covalentes, llamados quelatos, con los iones metálicos. En una realización del polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo, la incorporación de un radionucleido se habilita mediante la provisión de un entorno quelante, a través del cual el radionucleido puede coordinarse, quelarse o formar un complejo con el polipéptido. Un ejemplo de un quelante es el tipo de quelante poliaminopolicarboxilato. Pueden distinguirse dos clases de tales quelantes de poliaminopolicarboxilato: quelantes macrocíclicos y acíclicos.

En una realización, el polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo comprende un entorno quelante proporcionado por un quelante de poliaminopolicarboxilato conjugado con el polipéptido de unión a PD-L1 mediante un grupo tiol de un residuo de cisteína o un grupo amina épsilon de un residuo de lisina.

Los quelantes macrocíclicos más comúnmente usados para radioisótopos de indio, galio, itrio, bismuto, radioactínidos y radiolantánidos son diferentes derivados de DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético). En una realización, DOTA o un derivado del mismo proporciona un entorno quelante del polipéptido de unión a PD-L1, polipéptido de unión a PD-L1 en forma heterodimérica, proteína de fusión, conjugado o complejo. Más específicamente, en una realización, se obtiene un polipéptido quelante abarcado en la presente divulgación mediante la reacción del derivado de DOTA 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-tris-ácido acético-10-maleimidoetilacetamida (maleimidomonoamida-DOTA) con dicho polipéptido. En una realización, se obtiene un polipéptido quelante abarcado en la presente divulgación mediante la reacción del derivado de DOTA DOTAGA (ácido 2,2',2"-(10-(2,6-dioxotetrahidro-2H-piran-3-il)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético) con dicho polipéptido. Adicionalmente, el ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) y derivados del mismo pueden usarse como quelantes. Por lo tanto, en una realización, NOTA o un derivado del mismo proporciona un entorno quelante del polipéptido de unión a PD-L1, polipéptido de unión a PD-L1 en forma heterodimérica, proteína de fusión, conjugado o complejo. En una realización, se obtiene un polipéptido quelante abarcado en la presente divulgación mediante la reacción del derivado NOTA NODAGA (ácido 2,2'-(7-(1-carboxi-4-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)4-oxobutil)-1,4,7-triazonano-1,4-diil)diacético) con dicho polipéptido. Los quelantes de poliaminopolicarboxilato acíclico más comúnmente usados son diferentes derivados de DTPA (ácido dietilentriamino-pentaacético). Por lo tanto, los polipéptidos que tienen un entorno quelante proporcionado por ácido dietilentriaminopentaacético o derivados del mismo se abarcan, además, por la presente divulgación.

En otros aspectos de la presente divulgación, se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión o complejo como se describe en la presente memoria; un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido; y una célula huésped que comprende dicho vector de expresión.

Esta divulgación abarca, además, un procedimiento para producir polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión o complejo como se describe anteriormente, que comprende cultivar dicha célula huésped en condiciones permisivas de expresión de dicho polipéptido a partir de su vector de expresión y aislar el polipéptido.

El polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión o complejo de la presente divulgación puede producirse alternativamente mediante síntesis de péptidos no biológica mediante el uso de aminoácidos y/o derivados de aminoácidos que tienen cadenas laterales reactivas protegidas, la síntesis de péptidos no biológicos comprende - acoplar por etapas los aminoácidos y/o derivados de aminoácidos para formar un polipéptido, proteína de fusión o complejo como se describe en la presente memoria que tiene cadenas laterales reactivas protegidas,

- eliminar los grupos protectores de las cadenas laterales reactivas del polipéptido, proteína de fusión o complejo, y - plegar el polipéptido en solución acuosa.

Un complejo como se divulga en la presente memoria puede producirse, además, mediante la conjugación de al menos un polipéptido de unión a PD-L1 o proteína de fusión como se describe en la presente memoria a al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. El experto es consciente de los procedimientos de conjugación, tales como los procedimientos de conjugación química convencionales, por ejemplo, el uso de ésteres de succinimidilo o carbodiimidas cargados.

Debe entenderse que el polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con la presente divulgación puede ser útil como agente terapéutico, de diagnóstico y/o pronóstico por derecho propio o como un medio para dirigirse a otros agentes terapéuticos o de diagnóstico con, por ejemplo, efectos directos o indirectos sobre PD-L1. Un efecto terapéutico directo puede lograrse, por ejemplo, mediante la inhibición de la señalización de PD-L1. Un efecto terapéutico indirecto puede lograrse, por ejemplo, mediante un predireccionamiento mediante el uso de polipéptidos de unión a PD-L1 como se describe anteriormente.

Así, en otro aspecto, se proporciona una composición que comprende un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo como se describe en la presente memoria y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, dicha composición comprende, además, al menos un agente activo adicional, tal como al menos dos agentes activos adicionales, tal como al menos tres agentes activos adicionales. Ejemplos no limitantes de agentes activos adicionales que pueden resultar útiles en tal combinación son los agentes modificadores de la respuesta inmune y los agentes anticancerígenos como se describe en la presente memoria.

El tamaño pequeño y la robustez de los polipéptidos de unión a PD-L1 de la presente divulgación confieren varias ventajas sobre las terapias convencionales basadas en anticuerpos monoclonales. Tales ventajas incluyen ventajas en la formulación, modos de administración, tales como rutas alternativas de administración, administración a dosis más altas que los anticuerpos y ausencia de efectos secundarios mediados por Fc. Los agentes de la presente divulgación se contemplan para administración oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o por supositorios, tal como para administración tópica. Además, muchas enfermedades y trastornos, tales como el cáncer y las enfermedades infecciosas, se asocian con más de un factor. Así, un complejo como se define en la presente memoria confiere la ventaja de dirigirse a un antígeno adicional junto con PD-L1.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición como se describe en la presente memoria para su uso como un medicamento, un agente de pronóstico y/o un agente de diagnóstico. En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar en el tratamiento, diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con PD-L1.

En una realización, dicho polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición se proporciona para su uso como un medicamento. En una realización más específica, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición como se describe en la presente memoria, para usar como un medicamento para modular la función PD-L1 in vivo. Como se usa en la presente memoria, el término "modular" se refiere a cambiar la actividad, tal como hacer que la función de PD-L1 sea hipomorfa, inhibir parcialmente o inhibir completamente la función de PD-L1.

En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar en el tratamiento de un trastorno relacionado con PD-L1.

En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar en el diagnóstico de un trastorno relacionado con PD-L1.

En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar en el pronóstico de un trastorno relacionado con PD-L1.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "trastorno relacionado con PD-L1" se refiere a cualquier trastorno, enfermedad o afección en la que la señalización de PD-L1 desempeña una función reguladora. Ejemplos de tales trastornos relacionados con PD-L1 incluyen enfermedades infecciosas y cánceres.

Debe entenderse que dicho polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición puede usarse como el único agente de diagnóstico o pronóstico o como un agente de diagnóstico y/o pronóstico complementario.

En una realización, dicho trastorno relacionado con PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en enfermedades infecciosas y cánceres. Los ejemplos no limitantes de enfermedades infecciosas incluyen infección viral crónica, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en virus de inmunodeficiencia humana (HIV), virus de hepatitis B (HBV) y virus de hepatitis C (HCV). El experto apreciará que un cáncer adecuado para el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico mediante el uso de un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición puede ser un cáncer de tumor sólido o un cáncer de tumor no sólido caracterizado por la sobreexpresión de PD-L1. Ejemplos no limitantes de tales cánceres incluyen cáncer de piel; tales como melanoma y cáncer de piel no melanoma (NMSC); cánceres de pulmón tales como cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC); cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de células renales (RCC), cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, glioma, glioblastoma, carcinoma de hígado, cáncer de vesícula biliar, cáncer de tiroides, cáncer de hueso, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer de vulva, cáncer de endometrio, cáncer testicular, cáncer de riñón, carcinoma esofágico, cáncer de cerebro/CNS, cáncer neuronal, mesotelioma, sarcomas, adenocarcinoma de intestino delgado y tumores malignos pediátricos; leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda y mieloma múltiple.

En una realización particular, dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, RCC, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer pancreático y cáncer de próstata, tal como un cáncer seleccionado del grupo que consiste en melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, RCC y cáncer de vejiga.

En una realización, puede ser beneficioso administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición como se describe en la presente memoria junto con al menos una segunda sustancia farmacológica, tal como un agente anticancerígeno o un agente modificador de la respuesta inmune.

En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar en el pronóstico y/o diagnóstico junto con al menos un marcador de proliferación celular. Ejemplos no limitantes de marcadores de proliferación celular contemplados son aquellos seleccionados del grupo que consiste en Ki-67, AgNOR, colina, claspina, ciclina A, CYR61, Cdk1, histona H3, HsMCM2, IL-2, Ki-S1, Ki-S2, Ligl, MCM2, MCM6, MCM7, mitosina, p120, PCNA, PDPK, PLK, STK1, TK-1, topoisomerasa II alfayTPS.

En un aspecto relacionado, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un trastorno relacionado con PD-L1, que comprende administrar a un sujeto que necesite del mismo una cantidad eficaz de un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición como se describe en la presente memoria. En una realización más específica de dicho procedimiento, el polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición tal como se describe en la presente memoria modula la función PD-L1 in vivo. El experto apreciará que cualquier descripción en relación con el uso del polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición como se describe en la presente memoria para el tratamiento de una enfermedad o trastorno es igualmente relevante para el procedimiento terapéutico relacionado. En aras de la brevedad, dicha descripción no se repetirá aquí.

En una realización particular, dicho procedimiento de tratamiento, particularmente relevante para el tratamiento de cánceres relacionados con PD-L1, comprende las etapas de

- poner en contacto al sujeto con un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo que comprende un resto de predireccionamiento como se describe en la presente memoria, o con una composición que comprende dicho polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo que comprende un resto de predireccionamiento, y

- poner en contacto al sujeto con un resto de predireccionamiento complementario que comprende un radionucleido. En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento para detectar PD-L1, que comprende proporcionar una muestra sospechosa de contener PD-L1, poner en contacto dicha muestra con un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición como se describe en la presente memoria, y detectar la unión del polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para indicar la presencia de PD-L1 en la muestra.

En una realización, dicho procedimiento comprende, además, una etapa de lavado intermedia para eliminar el polipéptido, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición no unidos, después de poner en contacto la muestra.

En otra realización, dicho procedimiento es un procedimiento de diagnóstico o pronóstico para determinar la presencia de PD-L1 en un sujeto, el procedimiento comprende las etapas:

a) poner en contacto al sujeto, o una muestra aislada del sujeto, con un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición como se describe en la presente memoria, y

b) obtener un valor correspondiente a la cantidad de polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición que se unió a dicho sujeto o a dicha muestra.

En una realización, dicho procedimiento comprende, además, una etapa de lavado intermedia para eliminar el polipéptido, proteína de fusión, conjugado o composición no unidos, después de contactar con el sujeto o la muestra y antes de obtener un valor.

En una realización de este procedimiento de diagnóstico o pronóstico, dicho polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo comprende un resto de predireccionamiento como se describe en la presente memoria, y la etapa de contacto a) del procedimiento comprende, además, poner en contacto al sujeto con un resto de predireccionamiento complementario etiquetado con una etiqueta detectable, tal como una etiqueta de radionucleido.

En una realización, dicho procedimiento comprende, además, una etapa de comparar dicho valor con una referencia. Dicha referencia puede ser por un valor numérico, un umbral o un indicador visual, por ejemplo, basado en una reacción de color. El experto apreciará que se conocen diferentes formas de comparación con una referencia en la técnica y que pueden ser adecuadas para su uso.

En una realización de tal procedimiento, dicho sujeto es un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano. En una realización, dicho procedimiento se realiza in vivo. En otra realización, dicho procedimiento se realiza in vitro.

En una realización, el procedimiento de diagnóstico o pronóstico es un procedimiento para la obtención de imágenes médicas in vivo como se discutió anteriormente. Tal procedimiento comprende la administración sistémica de una entidad de unión a PD-L1 como se divulga en la presente memoria (es decir, el polipéptido per se, o la proteína de fusión, conjugado, complejo o composición que lo contiene) a un sujeto mamífero. La entidad de unión a PD-L1 se etiqueta directa o indirectamente, con una etiqueta que comprende un radionucleido adecuado para la obtención de imágenes médicas (véase más arriba para obtener una lista de los radionucleidos contemplados). Además, el procedimiento para la obtención de imágenes médicas comprende obtener una o más imágenes de al menos una parte del cuerpo del sujeto mediante el uso de un instrumento de obtención de imágenes médicas, dicha imagen o imágenes indican la presencia del radionucleido dentro del cuerpo.

Si bien la invención se describió con referencia a varios aspectos y realizaciones ejemplares, los expertos en la técnica entenderán que pueden hacerse varios cambios y pueden sustituirse equivalentes por elementos de la misma sin apartarse del ámbito de la invención. En adición, pueden hacerse muchas modificaciones para adaptar una situación o molécula particular a las enseñanzas de la invención sin apartarse del ámbito esencial de la misma. Por lo tanto, se pretende que la invención no esté limitada a ninguna realización particular contemplada, sino que la invención incluirá todas las realizaciones que caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una lista de las secuencias de aminoácidos de ejemplos de polipéptidos de unión a PD-L1 de la presente divulgación (SEQ ID NO:1-814), así como de la cadena pesada (HCLam; SEQ ID NO:815) y la cadena ligera (LC[_am¡ SEQ ID NO:816) del anticuerpo monoclonal de unión a PD-1 Lam y la cadena pesada (HClpi; SEQ ID NO:817) y la cadena ligera (LClpi; ^sE^qID NO:818) del anticuerpo monoclonal de unión a CT^lA-4 lpi. En los polipéptidos de unión a PD-L1 de la presente divulgación, los motivos de unión a PD-L1 deducidos (BM) se extienden desde el residuo 8 hasta el residuo 36 en cada secuencia. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos largos de 49 residuos aminoacídicos (BMod) previstos para constituir el haz completo de tres hélices dentro de cada una de estas variantes Z se extienden desde el residuo 7 hasta el residuo 55.

La Figura 2 muestra la unión de dos polipéptidos de primera generación a PD-L1 humano analizados por Biacore como se describe en el Ejemplo 3. Las variantes Z (A) Z13091 (SEQ ID NO:776) y (B) Z13156 (SEQ ID NO:781 se inyectaron a concentraciones de 50 nM (negro), 5 nM (gris oscuro) y 0,5 nM (gris claro) sobre un Chip CM5 con hPD-L1 inmovilizado.

La Figura 3 muestra la ausencia de respuesta SPR contra (A) hPD-L2, (B) hB7-H3 y (C) hB7-H4, ilustrada aquí con los polipéptidos de unión a PD-L1 Z13091 (SEQ ID NO:776) y Z13156 (SEQ ID NO:781) inyectados a concentraciones de 50 nM, 5 nM y 0,5 nM.

La Figura 4 muestra espectros de dicroísmo circular (CD) de dos polipéptidos de unión a PD-L1 de primera generación. Los espectros de CD en longitudes de onda que van desde 250 hasta 195 nm recolectados a 20 °C antes (línea discontinua) y después (línea continua) de la medición de temperatura variable (VTM) se muestran para (A) Z15168-Cys (SEQ ID NO:809) y (B) Z15169-Cys (SEQ ID NO:810).

La Figura 5 muestra la unión de dos polipéptidos de segunda generación a PD-L1 humano analizados por Biacore como se describe en el Ejemplo 7. Las variantes Z (A) Z17964 (SEQ ID NO:2) y (B) Z18064 (SEQ ID NO:1) se inyectaron a concentraciones de 135 nM (negro), 45 nM (gris oscuro) y 15 nM (gris claro) sobre un chip CM5 con hPD-L1 inmovilizado.

La Figura 6 muestra espectros de dicroísmo circular (CD) de dos polipéptidos de unión a PD-L1 de segunda generación. Los espectros de CD a longitudes de onda que varían desde 250 hasta 195 nm recolectados a 20 °C antes (línea discontinua) y después (línea continua) de la medición de temperatura variable (VTM) se muestran para (A) Z18064 (SEQ ID NO:1) y ( B) Z18090 (SEQ ID NO:17).

La Figura 7 es una representación esquemática del diseño de complejos de acuerdo con la divulgación, producidos como se describe en el Ejemplo 8. "Z" denota la variante Z Z15170 dirigida a PD-L1 (SEQ ID NO:814), que se fusionó genéticamente al extremo N (7A y 7B) o al extremo C (7C y 7D) de las cadenas pesadas (7A y 7D) o las ligeras (7B y 7C) del anticuerpo monoclonal anti-PD-1 Lam o el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 Ipi mediante un enlazador (GGGGS)3 de 15 residuos.

La Figura 8 muestra la especificidad de doble unión de los complejos analizados en un ensayo de captura por Biacore como se describe en el Ejemplo 8. (A) Z15170-HC_am y (B) Z15170-LC_am se inyectaron durante 5 minutos sobre superficies de chips inmovilizadas con PD-1, seguido por la inyección de PD-L1 a una concentración de 100 y/o 500 nM, respectivamente. (C) Z15170-HClpi y (D) Z15170-LClpi se inyectaron durante 5 minutos sobre superficies de chips inmovilizadas con CTLA-4, seguido por la inyección de PD-L1 a una concentración de 100 y 500 nM, respectivamente.

La Figura 9 muestra el resultado de la inhibición de PD-L1 y CTLA-4 por complejos basados en lpi, analizados en un ensayo de linfocitos mixtos como se describe en el Ejemplo 8. (A) Reducción en el número de células MDA-MB231 y (B) número creciente de células T CD3 con concentraciones crecientes de los complejos basados en lpi HClpi-Z15170, LClpi-Z15170, Z15170-HClpi y Z15170-LClpi.

La Figura 10 muestra imágenes de proyección de máxima intensidad (MIP) de PET de ratones con xenoinjerto. (A) MIP de ratones con xenoinjertos de tumor LOX (izquierda) y tumor SUDHL6 (derecha), 30-90 min después de la administración de [18F]AIF-NOTA-Z15168. (B) MIP de ratones con xenoinjertos de tumor LOX, 30-90 min después de la administración de [18F]AIF-NOTA-Z15168 (izquierda) al inicio y (derecha) después del prebloqueo con 400 |jg de NOTA-Z15168.

La Figura 11 muestra los resultados de biodistribución ex vivo para modelos de xenoinjerto de ratón LOX y SUDHL6, como se analizó directamente después de la adquisición de datos por PET. Los resultados se muestran en unidades de (A) valor de absorción estándar (SUV) y (B) relación tumor:sangre. Las barras de error representan la desviación estándar.

La Figura 12 muestra el resultado del escaneo de todo el cuerpo de monos rhesus. MIP (sumados durante 90-180 min; imágenes invertidas a color) de monos rhesus administrados con (A) [18F]AIF-NOTA-Z15168 y (B) [18F]AIF-NOTA-Z18609. (C) Absorción promedio del marcador durante “ 120-180 min en diferentes órganos mostrados en las unidades de SUV. Las barras de error representan la desviación estándar.

Ejemplos

Sumario

Los siguientes ejemplos divulgan el desarrollo de nuevas moléculas de variantes Z dirigidas al ligando de muerte programada 1 humano (PD-L1), conocido, además, como homólogo de B7 humano 1 (B7-H1) y grupo de diferenciación 274 (CD274), basado en la tecnología de presentación de fagos. Los polipéptidos de unión a PD-L1 descritos en la presente memoria se secuenciaron, y sus secuencias de aminoácidos se enumeran en la Figura 1 con los identificadores de secuencia SEQ ID NO:1-808. Los ejemplos describen adicionalmente la caracterización de los polipéptidos de unión a PD-L1 y demuestran la funcionalidad in vitro de dichos polipéptidos.

Ejemplo 1

Selección y cribado de variantes Z de unión a PD-L1

En este ejemplo, se usó PD-L1 humano (hPD-L1) como diana en las selecciones por presentación de fagos mediante el uso de una biblioteca de fagos de variantes Z. Se secuenció el ADN de los clones seleccionados, producidos en fracciones periplásmicas de E. coli y ensayadas contra PD-L1 en ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). Materiales y procedimientos

Biotinilación de proteína diana: hPD-L1 (quimera Fc PD-L1 humano, R&D Systems, núm. de cat. 156-B7-100) se biotiniló mediante el uso de No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo Scentific, núm. de cat. 21327) a un exceso molar de 10 x, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La reacción se realizó a temperatura ambiente (RT) por 40 min. El posterior intercambio de tampón a PBS (fosfato 10 mM, NaCl 137 mM, KCI 2,68 mM, pH 7,4) se realizó mediante el uso de un casete de diálisis Slide-a-lyzer (10000 MWCO, Thermo Scientific, núm. de cat. 66383) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Selección por presentación en fagos de variantes Z de unión a PD-L1: Una biblioteca de variantes aleatorias de proteína Z presentada en bacteriófago, construida en fagémido pAY02592 esencialmente como se describe en Gronwall y otros. (2007) J Biotechnol, 128:162-183, se usó para seleccionar variantes Z de unión a PD-L1. En esta biblioteca, un dominio de unión a albúmina (ABD, GA3 de la proteína G de Streptococcus cepa G148) se usa como pareja de fusión para las variantes Z. La biblioteca se denomina Zlib006Naive.II y tiene un tamaño de 1.5 x 1010 miembros de la biblioteca (variantes Z). Se inocularon células de E. coli RRIAM15 (Rüther y otros, (1982) Nucleic Acids Res 10:5765-5772) de un stock de glicerol que contiene la biblioteca de fagémidos Zlib006Naive.II en 20 l de un medio definido libre de prolina [KH2PO43 g/l, K2HPO42 g/l, uracilo 0,02 g/l, YNB (Base nitrogenada de levaduras sin aminoácidos Difco™, Becton Dickinson) 6,7 g/l, monohidrato de glucosa 5,5 g/l, L-alanina 0,3 g/l, L-arginina monoclorhidrato 0,24 g/l, L-asparagina monohidrato 0,11 g/l, L-cisteína 0,1 g/l, ácido L-glutámico 0,3 g/l, L-glutamina 0,1 g/l, glicina 0,2 g/l, L-histidina 0,05 g/l, L-isoleucina 0,1 g/l, L-leucina 0,1 g/l, L-lisina monoclorhidrato 0,25 g/l, L-metionina 0,1 g/l, L-fenilalanina 0,2 g/l, L-serina 0,3 g/l, L-treonina 0,2 g/l, L-triptófano 0,1 g/l, L-tirosina 0,05 g/l, L-valina 0,1 g/l], suplementado con ampicilina 100 jg/ml. Los cultivos se crecieron a 37 °C en un fermentador (Belach Bioteknik, BR20). Cuando las células alcanzaron una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,75, aproximadamente 2,6 l del cultivo se infectaron mediante el uso de un exceso molar de 10 x de fago auxiliar M13K07 (New England Biolabs, núm. de cat. N0315S). Las células se incubaron durante 30 min, después de lo cual se llenó el fermentador hasta 20 l con medio de cultivo ((NH4)2SO42,5 g/l; extracto de levadura (Merck 1.03753.0500) 5,0 g/l; peptona (Scharlau 07-119) 25 g/l; K2HPO42 g/l; KH2PO43 g/l; NaaC6H5Oy. 2 H2O 1,25 g/l; agente antiespumante Breox FMT30 0,1 ml/l) suplementado con isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 100 |jM para la inducción de la expresión y con ampicilina 50 |jg/ml, carbenicilina 12,5 |jg/ml, kanamicina 25 |jg/ml, 35 ml/l de MgSO41,217 M y 10 ml de una solución de elementos traza [FeCh 129 mM; ZnSO436,7 mM; CuSO4 10,6 mM; MnSO478,1 mM; CaCh 94,1 mM, disuelto en HCl 1,2 M]. Se inició un cultivo de lote alimentado con glucosa limitada donde se introdujo una solución de glucosa de 600 g/l al reactor (15 g/h en el inicio, 40 g/h al final de la fermentación después de 17 h). El pH se controló a 7 a través de la adición automática de NH4OH 25 %, se suplementó con aire (10 l/min), y el agitador se ajustó para mantener el nivel de oxígeno disuelto por encima del 30 %. Las células en el cultivo se eliminaron por filtración de flujo tangencial.

Las partículas de fago se precipitaron del sobrenadante dos veces en PEG/NaCl (polietilenglicol/cloruro de sodio), se filtraron y disolvieron en PBS y glicerol como se describe en Gronwall y otros, supra. Los stocks de fagos se almacenaron a -80 °C antes de su uso.

Las selecciones contra hPD-L1 biotinilado se realizaron en cuatro ciclos inicialmente divididos en dos pistas diferentes (1 y 2). A medida que avanzaba la selección, las pistas se dividieron de acuerdo con la concentración de la diana y el número y/o el tiempo de lavados para finalmente terminar en nueve pistas en el ciclo 4. Más precisamente, la primera pista (1) se dividió del segundo al cuarto ciclos, lo que resultó en un total de dos pistas (1-1 a 1-2) en el ciclo 2, cuatro pistas (1-1-1 a 1-2-2) en el ciclo 3 y seis pistas (1-1-1-1 a 1-2-2-1) en el ciclo 4. La segunda pista (2) se dividió del tercero al cuarto ciclo, lo que resultó en un total de dos pistas (2-1-1 a 2-1-2) en el ciclo 3, tres pistas (2-1-1-1 a 2-1-2-1) en el ciclo 4. En la pista 1 con descendientes, se usaron Dynabeads® M-280 Streptavidin (cuentas SA, Invitrogen, núm. de cat. 11206D) para atrapar los complejos variantes Z:hPD-L1. En la pista 2, en su lugar se usaron Dynabeads® Protein A (cuentas SPA, Invitrogen, núm. de cat. 10002D) para atrapar los complejos variantes Z:hPD-L1 mediante la unión a la parte Fc de la proteína quimérica Fc hPD-L1.

La preparación del stock de fagos, el procedimiento de selección y la amplificación del fago entre ciclos de selección se realizaron esencialmente como se describe para la selección frente a otra diana biotinilada en el documento núm. WO2009/077175 con la siguiente excepción: el tampón de selección consistió en PBS suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Gibco, núm. de cat. 10108-165) y Tween20 al 0,1 % (Acros Organics, núm. de cat. 233362500). Para reducir la cantidad de unidores de fondo, se realizó una preselección en cada ciclo. En la preselección, se usaron los mismos tipos de cuentas que durante la selección, es decir, cuentas SA en la pista 1 y cuentas SPA en la pista 2. En todas las pistas de los ciclos 1-4, las preselecciones se realizaron mediante el uso de cuentas SA o SPA revestidas con IgG-Fc humano biotinilado (Jackson ImmunoResearch Lab, núm. de cat. 009-060-008). Además, en el ciclo 1, pista 1, la preselección se realizó mediante el uso de cuentas SA revestidas con una mezcla de hPD-L2 (quimera PD-L2 Fc humana; R&D Systems, núm. de cat. 1224-PL-100), hB7-H3 (quimera B7-H3 Fc humana; R&D Systems, núm. de cat.

1027-B3-100), hB7-H4 (B7-H4 humana; R&D Systems, núm. de cat. 6576-B7-50), biotiniladas previamente como se describe para hPD-L1. En el ciclo 1, pista 2, la preselección se realizó mediante el uso de cuentas SPA revestidas con una mezcla de PD-L2 biotinilada y B7-H3 biotinilada. Durante la preselección, el stock de fagos se incubó con cuentas revestidas de extremo a extremo durante 30-90 min a RT. Todos los tubos y cuentas usados en las preselecciones o selección se bloquearon previamente con PBS suplementado con albúmina de suero bovino al 3 % (BSA, Sigma A3059-100G) y Tween20 al 0,1 %. La selección se realizó en solución a RT y el tiempo de selección fue de aproximadamente 120 min seguido de lavado con PBS Tween20 al 0,1 % y de la captura de los complejos fagos diana en cuentas SA o cuentas SPA mediante el uso de 1 mg de cuentas por 1,6 u 8,5 jig de hPD-L1 biotinilado, respectivamente.

Para la amplificación de las partículas de fago entre el ciclo de selección 1 y 2, se usaron células de E. coli cepa ER2738 (Lucigen, Middleton, WI, EE. UU.) para la infección y se crecieron en medio suplementado con tetraciclina 20 jig/ml. Se permitió un exceso de 5 x del fago auxiliar M13K07 en comparación con las bacterias para infectar las bacterias en la fase logarítmica.

Tabla 2: Selección frente a quimera hPD-L1 Fc biotinilada

La amplificación de las partículas de fago entre los ciclos de selección 2 y 4 se realizó mediante la infección de bacterias en solución como sigue. Después de la infección de E. coli ER2738 en la fase logarítmica con partículas de fago, se adicionó TSB suplementado con glucosa al 2 %, tetraciclina 10 pg/ml y ampicilina 100 pg/ml, seguido de incubación con rotación por 30 minutos a 37 °C. Posteriormente, las bacterias se infectaron con fago auxiliar M13K07 en exceso de 5 x. Las bacterias infectadas se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en medio TSB-YE suplementado con IPTG 100 pM, kanamicina 25 pg/ml y ampicilina 100 pg/ml, y se crecieron durante la noche a 30 °C. Los cultivos crecidos durante la noche se centrifugaron, y las partículas de fago en el sobrenadante se precipitaron dos veces con tampón PEG/NaCl. Finalmente, las partículas de fago se resuspendieron en el tampón de selección antes de ingresar al siguiente ciclo de selección.

En el ciclo de selección final, las bacterias en fase logarítmica se infectaron con eluato y se diluyeron antes de extenderse sobre placas TBAB (30 g/l de base de agar sangre con triptosa, Oxoid, núm. de cat. CMO233B) suplementado con ampicilina 0,2 g/l para formar una sola colonia para usarse en el cribado por ELISA.

En la Tabla 2 se muestra una descripción general de la estrategia de selección, que describe una mayor rigurosidad en los ciclos posteriores, mediante el uso de una concentración de la diana reducida y un mayor número de lavados. Los lavados se realizaron por 1 minuto, si no se indica nada más en la Tabla 2, mediante el uso de PBST al 0,1 % (PBS suplementado con Tween-20 al 0,1 %) y la elución se realizó como se describe en el documento núm. WO2009/077175. Producción de variantes Z para ELISA: Las variantes Z se produjeron mediante la inoculación de colonias individuales de las selecciones en 1 ml de medio TSB-YE suplementado con ampicilina 100 pg/ml e IPTG 1 mM en placas de pocillos profundos (Nunc, núm. de cat. 278752). Las placas se incubaron con rotación por 24 ha 37 °C. Las células se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en 200 pl de PBST al 0,05 % y se congelaron a -80 °C para liberar la fracción periplásmica de las células. Las muestras congeladas se descongelaron en un baño de agua y el procedimiento de congelación-descongelación se repitió ocho veces. Se adicionaron 600 pl de PBST al 0,05 % a las muestras descongeladas y las células se sedimentaron por centrifugación.

El sobrenadante final del extracto periplásmico contenía las variantes Z como fusiones a ABD, expresadas como AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG (Gronwall y otros, supra). Z##### se refiere a variantes Z de 58 residuos aminoacídicos, individuales.

Cribado por ELISA de variantes Z: La unión de las variantes Z a hPD-L1 se analizó en ensayos ELISA. Se revistieron placas ELISA de 96 pocillos de área media (Costar, núm. de cat. 3690) a 4 °C durante la noche con 2 pg/ml de un anticuerpo de cabra anti-ABD (producido internamente) diluido en tampón de revestimiento (sodio carbonato 50 mM, pH 9,6; Sigma, núm. de cat. C3041). La solución de anticuerpo se vertió y los pocillos se lavaron en agua y se bloquearon con 100 pl de PBSC (PBS suplementado con caseína al 0,5 %; Sigma, núm. de cat. C8654) durante 1 a 3 h a RT. La solución de bloqueo se desechó y se adicionaron a los pocillos 50 pl de soluciones periplásmicas diluidas 1:1 con PBST al 0,05 %, y se incubaron durante 1,5 a 2,5 h a RT bajo agitación lenta. Como control en blanco, se adicionó PBST al 0,05 % en lugar de una muestra periplásmica. Los sobrenadantes se eliminaron y los pocillos se lavaron 4 veces con PBST al 0,05 %. Después, se adicionaron a cada pocilio 50 |jl de hPD-L1 biotinilado a una concentración de 0,32 nM en PBSC. Las placas se incubaron por 1 hora a RT seguido de lavados como se describió anteriormente. Se adicionó HRP conjugado con estreptavidina (Thermo Scientific, núm. de cat. N100) diluido 1:30.000 en PBSC, a los pocillos y las placas se incubaron durante aproximadamente 1 h. Después de lavar como se describió anteriormente, se adicionaron a los pocillos 50 j l de sustrato ImmunoPure TMB (Thermo Scientific, núm. de cat. 34021) y las placas se trataron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La absorbancia a 450 nm se midió mediante el uso de un lector de placas multipocillos, Victor3 (Perkin Elmer).

Secuenciación: En paralelo con el cribado por ELISA, se secuenciaron todos los clones. Los fragmentos de PCR se amplificaron a partir de colonias individuales, se secuenciaron y analizaron esencialmente como se describe en el documento núm. WO2009/077175.

Análisis de EC50 de variantes Z: Una selección de variantes Z de unión a PD-L1 se sometió a un análisis de la respuesta frente a una serie de diluciones de hPD-L1 biotinilado de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente. Las variantes Z se diluyeron 1:1 en PBST al 0,05 %. Se adicionó hPD-L1 biotinilado a una concentración de 40 nM y se diluyó paso a paso 1:4 hasta 32 pM. Como control de fondo, todas las variantes Z se analizaron, además, sin adicionar proteína diana. Se incluyeron muestras de periplasma que contenían la variante Z de unión a PD-L1 Z13112 (SEQ ID.NO:777) en cada placa y se analizaron como control positivo. El periplasma que contiene el resto ABD solo se usó como control negativo. En el mismo ensayo, la especificidad de las variantes Z se ensayó mediante la incubación de muestras de periplasma con las cuatro proteínas de control biotiniladas diferentes hPD-L2, hB7-H3, hB7-H4 e IgGFc, respectivamente, adicionadas a una concentración de 8 nM. Los datos se analizaron mediante el uso de GraphPad Prism 5 y regresión no lineal, y se calcularon los valores de EC50 (la concentración efectiva máxima media).

Resultados

Selección por presentación en fagos de variantes Z de unión a PD-L1: Se obtuvieron clones individuales después de cuatro ciclos de selecciones por presentación en fagos contra hPD-L1 biotinilado.

Cribado por ELISA de variantes Z: Los clones obtenidos después de cuatro ciclos de selección se produjeron en placas de 96 pocillos y se cribaron para determinar la actividad de unión a hPD-L1 en ELISA. Se encontró que varias variantes Z únicas daban una respuesta de 0,3 AU o más (correspondiente a al menos 3 x el control en blanco) contra hPD-L1 a una concentración de 0,32 nM. La respuesta promedio de los controles en blanco fue de 0,067 AU.

Secuenciación: La secuenciación se realizó para los clones obtenidos después de cuatro ciclos de selección. Cada variante recibió un número de identificación único //////////, y las variantes individuales se denominan Z#####. Las secuencias de aminoácidos de las variantes Z de 58 residuos aminoacídicos de longitud se enumeran en la Figura 1 y en el listado de secuencias como SEQ ID NO:774-808. Los motivos de unión a PD-L1 deducidos se extienden desde el residuo 8 hasta el residuo 36 en cada secuencia. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de 49 residuos aminoacídicos de largo predichos para constituir el haz completo de tres hélices dentro de cada una de estas variantes Z se extienden desde el residuo 7 hasta el residuo 55.

Análisis de EC50 de variantes Z: Se seleccionó un subconjunto de variantes Z que tenían los valores de ELISA más altos en el experimento de cribado por ELISA descrito anteriormente y se sometió a una titulación de la diana en formato ELISA. Las muestras de periplasma se incubaron con una dilución en serie de hPD-L1 biotinilado. Una muestra de periplasma que contenía Z13112 (SEQ ID NO:777), confirmada para unirse a PD-L1 en el cribado por ELISA, se seleccionó como control positivo y se usó para normalizar diferentes placas entre sí. Se analizaron los valores obtenidos y se calcularon sus respectivos valores de EC50 (Tabla 3).

No se detectó una unión significativa a ninguna de las proteínas de control incluidas de la familia B7 (hPD-L2, hB7-H3 y hB7-H4), ni a la proteína de control IgGFc (incluida aquí porque se usaron proteínas quiméricas Fc en la selección y cribado). Estos resultados indican que las variantes Z seleccionadas son específicas de PD-L1.

Tabla 3: Valores de EC50 calculados a partir del análisis de titulación por ELISA

Ejemplo 2

Subclonación y producción de un subconjunto de variantes Z de unión a PD-L1 primarias

Materiales y procedimientos

Subclonación de variantes Z con una etiqueta Hísr: El ADN de 14 variantes Z de unión a PD-L1, Z13080 (SEQ ID NO:774), Z13088 (SEQ ID NO:775), Z13091 (SEQ ID NO:776), Z13112 (SEQ ID NO:777), Z13120 (SEQ ID NO:778), Z13147 (SEQ ID NO:779), Z13154 (SEQ ID NO:780), Z13156 (SEQ ID NO:781), Z13158 (SEQ ID NO:782), Z13164 (SEQ ID NO:783), Z13165 (SEQ ID NO:784), Z13169 (SEQ ID NO:785), Z13198 (SEQ ID NO:786) y Z13304 (SEQ ID NO:787) se amplificaron del vector de biblioteca pAY02592. Una estrategia de subclonación para la construcción de moléculas de variantes Z monoméricas con etiqueta His6 N-terminal se aplicó mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular (esencialmente como se describe en detalle en el documento núm. WO2009/077175 para variantes Z que se unen a otra diana). Los fragmentos del gen Z se subclonaron en el vector de expresión pAY01448 lo que resultó en la secuencia codificada MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD.

Subclonación de variantes Z con una Cys en el C terminal: Se mutaron dos variantes Z, Z13091 (SEQ ID NO:776) y Z13156 (SEQ ID NO:781) para comenzar con los aminoácidos N terminales AE en lugar de VD y se subclonaron adicionalmente con la adición en el C terminal de los aminoácidos VDC (que incorporan una cisteína única en el polipéptido) mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular. Las secuencias de codificación resultantes se denominan Z15168-Cys (SEQ ID NO:809) y Z15169-Cys (SEQ ID NO:810), respectivamente.

Cultivo: Las células de E. coli T7E2 (GeneBridges) se transformaron con plásmidos que contenían los fragmentos de genes de cada variante Z de unión a PD-L1 respectiva y se cultivaron a 37 °C en 940 ml de medio TSB-YE suplementado con 50 pg/ml de kanamicina. Para inducir la expresión de proteínas, se adicionó IPTG a una concentración final de 0,2 mM a OD600 = 2 y el cultivo se incubó a 37 °C por otras 5 h. Las células se cosecharon por centrifugación.

Purificación de variantes Z de unión de PD-L1 con una etiqueta H^ísr: Se resuspendieron aproximadamente 1-2 g de cada sedimento celular en 30 ml de tampón de unión (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM, pH 7,4) suplementado con Benzonase® (Merck, núm. de cat. 1.01654.0001) a una concentración de 15 U/ml. Después de la disrupción celular por sonicación, los depósitos celulares se eliminaron por centrifugación y cada sobrenadante se aplicó en una columna His GraviTrap IMAC de 1 ml (GE Healthcare, núm. de cat. 11-0033-99). Los contaminantes se eliminaron mediante el lavado con tampón de lavado (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 60 mM, pH 7,4) y las variantes Z de unión a PD-L1 se eluyeron posteriormente con tampón de elución (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 500 mM, pH 7,4). Después de la purificación por IMAC, el tampón de la proteína se intercambió a PBS mediante el uso de columnas PD-10 (GE Healthcare, núm. de cat. 17-0851-01).

Purificación de las variantes Z de unión a PD-L1 con una Cys en el C terminal: El sedimento celular respectivo se resuspendió en Tris-HCl 20 mM, pH 8 (10 ml de tampón/g de sedimento celular) y se lisó por tratamiento térmico en un baño de agua a 90 °C por 10 minutos, seguido de enfriamiento en hielo hasta aproximadamente 20 °C. Se adicionó Benzonase® (1 pl/g de sedimento celular) y cada lisado celular se incubó a RT por 30 minutos, antes de eliminar los depósitos celulares por centrifugación. Para la reducción de disulfuros, se adicionó ditiotreitol (DTT; Acros organics, núm. de cat. 165680250) a una concentración final de 20 mM seguido de incubación a RT por 1 h. La purificación se realizó mediante intercambio aniónico seguido de cromatografía de fase inversa (RPC). El intercambio de tampón a HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2 se llevó a cabo mediante el uso de columnas HiPrep 26/10 (GE Healthcare, núm. de cat. 17-5087-01). Finalmente, cada variante Z se purificó en columnas rojas EndoTrap® (Hyglos, núm. de cat.

321063) para asegurar un bajo contenido de endotoxina.

Para cada proteína purificada por cualquier procedimiento descrito anteriormente, la concentración se determinó mediante la medición de la absorbancia a 280 nm, mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 y el coeficiente de extinción de la proteína. La pureza se analizó mediante SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie y se confirmó la identidad de cada variante Z purificada mediante el uso de análisis por HPLC-MS (HPLC-MS 1100; Agilent Technologies).

Resultados

Cultivo y purificación: Las variantes Z de unión a PD-L1 con una etiqueta His6 o Cys C-terminal se expresaron como productos génicos solubles en E. coli. El análisis por SDS-PAGE de cada preparación final de proteínas mostró que éstas contenían predominantemente la variante Z de unión a PD-L1. La identidad correcta y el peso molecular de cada variante Z se confirmaron mediante análisis por HPLC-MS.

Ejemplo 3

Caracterización de variantes Z de unión a PD-L1 primarias

En este ejemplo, un subconjunto de variantes Z se caracterizó en términos de estabilidad y propiedades de unión in vitro. La especificidad y afinidad por el PD-L1 humano de las variantes Z se analizaron mediante SPR y la unión a las células que expresan PD-L1 se analizó mediante el uso de Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Además, se investigó la capacidad de las variantes Z para bloquear la unión de PD-L1 a su receptor PD1 mediante el uso de AlphaLISA.

Materiales y procedimientos

Análisis de especificidad y cinética por Biacore: Se determinaron las constantes cinéticas (ka y kd) y las afinidades (Kd) para hPD-L1 para 14 variantes Z etiquetadas con His6 con un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). Algunas de las variantes Z se analizaron, además, para determinar la unión contra las proteínas relacionadas con la secuencia hPD-L2, hB7-H3, hB7-H4 y mPD-L1 (Quimera PD-L1 Fc de ratón, R&D Systems, núm. de cat. 1019-B7).

hPD-L1, hPD-L2, hB7-H3, hB7-H4 y mPD-L1 se inmovilizaron en celdas de flujo separadas en la capa de dextrano carboxilado de diferentes superficies de chips CM5 (GE Healthcare, núm. de cat. BR100012). La inmovilización se realizó mediante el uso de química de acoplamiento de amina de acuerdo con el protocolo del fabricante y mediante el uso de HBS-EP como tampón en corrida (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, E^dTA 3 mM, 0,005 % v/v tensioactivo P20, GE Healthcare, núm. de cat. BR100188). Los niveles de inmovilización del ligando en las superficies fueron 468 894 RU para hPD-L1, 537-742 RU para hPD-L2, 383 RU para hB7-H3, 538-659 RU para hB7-H4 y 482 RU para mPD-L1. Se activó y desactivó una superficie de celda de flujo en cada chip para usar como blanco durante las inyecciones de analito. En el experimento cinético, se usó HBS-EP como tampón de corrida y el caudal fue de 50 pl/min. Los analitos, es decir, las variantes Z, se diluyeron cada uno en tampón HBS-EP dentro de un intervalo de concentración de 1.000 a 0,01 nM y se inyectaron por 5 min, seguido de la disociación en tampón de corrida por 15-25 min. Después de la disociación, las superficies se regeneraron con una o dos inyecciones de SDS al 0,1 %. Las constantes cinéticas se calcularon a partir de los sensorgramas mediante el uso del modelo Langmuir 1:1 del software BiaEvaluation 4.1 (GE Healthcare).

Ensayo de bloqueo por AlphaLISA: Se analizó el potencial de las variantes Z para inhibir la unión de PD-L1 a PD-1 mediante AlphaLISA y se registró en un lector multiplaca EnSpire 2300 (Perkin Elmer). La hPD-1 (quimera PD-1 Fc humana; R&D Systems, núm. de cat. 1086-PD-050) se inmovilizó sobre cuentas aceptoras de AlphaLISA (Perkin Elmer, núm. de cat. 6772002) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se prepararon diluciones en serie paso a paso 1:3 de variantes Z etiquetadas con His6 a concentraciones finales de 250 nM a 12 pM en una placa 384 (Perkin Elmer, núm. de cat. 6005350) y se incubaron durante 1 h con hPD-L1 biotinilado 10 nM en tampón de AlphaLISA (Perkin Elmer, núm. de cat. AL000F). Se adicionaron cuentas aceptoras revestidas con hPD-1 a una concentración final de 10 pg/ml y se incubaron por 1 h. Finalmente, se adicionaron cuentas donantes revestidas con estreptavidina (Perkin Elmer, núm. de cat. 6772002) a una concentración final de 40 pg/ml y se incubaron por 30 minutos. Todas las incubaciones se realizaron a RT en la oscuridad. La placa se analizó en el instrumento EnSpire y los valores de IC50 se calcularon mediante el uso de GraphPad Prism 5.

Análisis de unión a células por FACS: El potencial de las variantes Z para unirse a las células que expresan PD-L1 se investigó mediante el uso de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Las células THP-1, cultivadas en RPMI (Lonza, núm. de cat. BE12-702F) que contenía FBS al 10 %, se estimularon con IFNg 10 ng/ml (R&D Systems, núm. de cat. 285-IF-100) durante la noche lo que resultó en una regulación positiva de PD-L1. Se pipetearon 150.000 células estimuladas y no estimuladas por pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en v (Nunc, núm. de cat. 277143) y las células en la placa se sedimentaron posteriormente a 400g por 3 min a RT. Los sobrenadantes se eliminaron y las células se resuspendieron en 100 |jl de PBS más FBS al 2,5 % (tampón de tinción) que contenía 10 jl/m l de las diferentes variantes Z etiquetadas con His. Se usó un anticuerpo anti-PD-L1 de ratón (R&D Systems, núm. de cat. MAB1561) a 1 jg/ml como control positivo. Las células incubadas con tampón solo se usaron como controles negativos. Las células se incubaron por 1 hora a 8 °C en la oscuridad, se lavaron dos veces con 100 j l de tampón de tinción y se resuspendieron en 100 j l de tampón de tinción que contenía un anticuerpo anti-Z de cabra (producido en casa) a una concentración de 5 jg/ml. Las células teñidas con el control positivo se trataron solo con tampón. Las células se incubaron por 1 hora a 8 °C en la oscuridad, se lavaron dos veces con 100 j l de tampón de tinción y se resuspendieron en 100 j l de tampón de tinción que contenía un anticuerpo anti IgG de cabra de pollo Alexa Fluor 647 (Life technologies, núm. de cat. A21469 ) o un anticuerpo anti IgG de ratón de cabra Alexa Fluor 647 (Life technologies núm. de cat. A21236). Las células se incubaron nuevamente por 1 hora a 8 °C en la oscuridad, se lavaron dos veces con 100 j l de tampón de tinción y se resuspendieron en 200 j l de tampón de tinción. Los datos de 10.000 células se obtuvieron mediante el uso de un FACS Calibur (Beckman Coulter) y los datos se analizaron mediante el uso del software Flowing 2.5.0 (Universidad de Turku). La intensidad de fluorescencia media (MFI) se usó como lectura de la capacidad de unión.

Análisis de espectroscopia de dicroísmo circular (CD): Dos variantes Z purificadas con una cisteína C terminal, Z15168-Cys (SEQ ID NO:809) y Z15169-Cys (SEQ ID NO:810), se diluyeron a 0,5 mg/ml en HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2. Para cada variante Z diluida, se obtuvo un espectro de Cd a 250-195 nm a 20 °C. En adición, se realizó una medición a temperatura variable (VTM) para determinar la temperatura de fusión (Tm). En la VTM, la absorbancia se midió a 221 nm mientras que la temperatura se elevó de 20 a 90 °C, con una pendiente de temperatura de 5 °C/min. Se obtuvo un nuevo espectro de CD a 20 °C después del procedimiento de calentamiento para estudiar la capacidad de replegamiento de las variantes Z. Las mediciones de CD se realizaron en un espectropolarímetro Jasco J-810 (Jasco Scandinavia AB) mediante el uso de una celda con una longitud de trayectoria óptica de 1 mm.

Resultados

Análisis de especificidad y cinética por Biacore: Las interacciones de 14 variantes Z de unión a PD-L1 etiquetadas con His6 con hPD-L1 se analizaron en un instrumento Biacore mediante la inyección de diversas concentraciones de las variantes Z sobre una superficie que contenía hPD-L1 inmovilizada. Todas las variantes Z ensayadas mostraron unión a hPD-L1. Un sumario de los parámetros cinéticos (Kd, ka y kd) para la unión de las variantes Z a hPD-L1 obtenidos mediante el uso de un modelo de interacción 1:1 se proporciona en la Tabla 4. Las curvas resultantes típicas, donde se restaron las respuestas de una superficie en blanco, se muestran en la Figura 2 para dos variantes Z seleccionadas, Z13091 (SEQ ID NO:776) y Z13156 (SEQ ID NO:781).

Tabla 4: Parámetros cinéticos para la unión de variantes Z a hPD-L1

Se ensayó, además, la unión de un subconjunto de las variantes Z contra cuatro proteínas inmovilizadas, relacionadas con la secuencia: hPD-L2, hB7-H3, hB7-H4 y mPD-L1. No se detectó unión contra hPD-L2, hB7-H3, hB7-H4 o mPD-L1 a concentraciones de las variantes Z de hasta 50 nM. Cuando se inyectó 1.000 nM de algunas variantes Z seleccionadas (Z13088, Z13091, Z13112, Z13147, Z13154, Z13156, Z13165, Z13169, Z13198) se observó alguna respuesta contra B7-H4 para Z13156 y Z13165. El resultado del análisis de especificidad de unión se resume en la Tabla 5. Las trazas típicas que no interactúan del análisis por SPR contra hPD-L2, hB7-H3 y hB7-H4 se muestran en la Figura 3.

Tabla 5: Especificidad de unión contra mPD-L1, hPD-L2, hB7-H3 y hB7-H4

Ensayo de bloqueo por AlphaLISA: La capacidad de 14 variantes Z etiquetadas con His6 para inhibir la unión de hPD-L1 a hPD-1 se ensayó en un ensayo de bloqueo por AlphaLISA. Las diluciones en serie de las variantes Z se incubaron con hPD-L1 biotinilado y la capacidad de bloqueo de cada variante respectiva se midió después de la adición de cuentas aceptoras revestidas con hPD-1 y posteriormente cuentas donantes revestidas con estreptavidina. La inhibición podría medirse como una disminución en los recuentos de AlphaLISA para variantes Z positivas. Los valores calculados de IC50 para las 14 variantes que se demostraron que bloquean la unión de PD-L1 a PD-1 en este ensayo se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6: Valores de IC50 para variantes Z que inhiben la unión de PD-L1 a PD-1

Tabla 7: MFI normalizada para la unión de variantes Z a células THP-1

Análisis de unión a células por FACS: Este experimento confirmó la unión de las variantes Z específicas de PD-L1 a las células que expresan PD-L1. Las células THP-1 estimuladas con IFN^ydurante la noche, lo que aumenta la expresión de PD-L1, se tiñeron con 10 pg/ml de cada una de las variantes Z etiquetadas con His6. Los análisis se realizaron en dos ocasiones diferentes y los valores de MFI, normalizados frente a Z13091 incluidos en ambos ensayos, se presentan en la Tabla 7.

Análisis de CD: Los espectros de CD determinados para dos variantes Z de unión de PD-L1 seleccionadas con una cisteína C terminal, Zl5l68-Cys (SEQ ID NO:809) y Z15169-Cys (SEQ ID NO:810) mostraron que ambas variantes tenían una estructura a-helicoidal a 20 °C basada en los mínimos típicos a 208 y 222 nm. Se observó plegamiento reversible para ambas variantes Z cuando se superpusieron espectros medidos antes y después de calentar a 90 °C (Figura 4). Se espera que la señal ruidosa observada en la región UV lejana resulte de los efectos del tampón (HEPES, que se usó como tampón de análisis, absorbe fuertemente a 200 nM y menos). Las temperaturas de fusión (Tm) se determinaron a 50 °C y 58 °C para Z15168-Cys y Z15169-Cys, respectivamente (Tabla 8).

Tabla 8: Temperaturas de fusión (Tm)

Ejemplo 4

Diseño y construcción de una biblioteca madurada de variantes Z de unión a PD-L1

En este ejemplo, se construyó una biblioteca madurada. La biblioteca se usó para selecciones de variantes Z de unión a PD-L1. Las selecciones de bibliotecas maduradas pueden dar lugar a unidores con mayor afinidad (Orlova y otros, (2006) Cancer Res 66(8):4339-48). En este estudio, se generan oligonucleótidos monocatenarios aleatorios, mediante el uso de síntesis de ADN por división y mezcla que permite la incorporación de codones definidos en las posiciones deseadas en la síntesis.

Materiales y procedimientos

Diseño de la biblioteca: La biblioteca se basó en las secuencias de las variantes Z de unión a PD-L1 identificadas y caracterizadas como se describe en el Ejemplo 1 y Ejemplo 3. En la nueva biblioteca, 13 posiciones variables en el andamio de la molécula Z estaban sesgadas hacia ciertos residuos aminoacídicos, de acuerdo con una estrategia basada en las secuencias de las variantes Z definidas en las SEQ ID NO:774-808. Se generaron dos oligonucleótidos, uno complementario directo y uno inverso, con extremos 3' complementarios mediante el uso de síntesis por división y mezcla. Los dos oligonucleótidos se hibridaron y extendieron por PCR, mediante el uso de cebadores externos, para producir un fragmento de gen que cubre 147 pb correspondientes a las hélices 1 y 2 parcialmente aleatorizadas de la secuencia de aminoácidos: 5'- AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA CGT AAC NNN GCG GCT NNN GAG ATC CTG NNN CTG CCT AAC CTC ACC NNN NNN CAA NNN TGG GCC TTC ATC TGG AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A -3' (SEQ ID NO:819; los codones aleatorios se ilustran como NNN) flanqueados por sitios de restricción XhoI y SacI. Los oligonucleótidos se ordenaron a Ella Biotech GmbH (Martinsried Alemania).

Tabla 9: Diseño de biblioteca madurada

Las distribuciones teóricas de los residuos aminoacídicos en la nueva biblioteca que incluyen 7 posiciones variables (11, 14, 18, 24, 25, 27 y 35) en el andamio de la molécula Z se dan en la Tabla 9. El tamaño de la biblioteca teórica resultante es 5,3 x 107 variantes.

Construcción de la biblioteca: La biblioteca se amplificó mediante el uso de la polimerasa AmpliTaq Gold (Life Technologies, núm. de cat. 4311816) durante 12 ciclos de PCR y los productos mezclados se purificaron con el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, núm. de cat. 28106) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. La mezcla purificada de fragmentos de biblioteca aleatorizados se hidrolizó con enzimas de restricción XhoI y SacI-HF (New England Biolabs, núm. de cat. R0146L, y núm. de cat. R3156M, respectivamente) y se concentró mediante el uso de un kit de purificación de PCR. Posteriormente, el producto se corrió en una electroforesis preparativa en gel de agarosa al 2,5 % (NuSieve GTG ® Agarose, Lonza, núm. de cat. 50080) y se purificó mediante el uso del kit de extracción de gel QIAGEN (QIAGEN, núm. de cat. 28706) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.

El vector fagémido pAY02592 (esencialmente como pAffi1 descrito en Gronwall y otros, supra) se restringió con las mismas enzimas y se purificó mediante el uso de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Los fragmentos restringidos y el vector restringido se ligaron en una relación molar de 5:1 con ligasa de ADN T4 (Thermo Scientific, núm. de cat. EL0011) durante 2 h a RT, seguido de incubación durante la noche a 4 °C. El ADN ligado se recuperó mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, seguido de disolución en Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. Así, la biblioteca resultante en el vector pAY02592 codificó variantes Z cada una fusionada a un dominio de unión a albúmina (ABD) derivado de la proteína G estreptocócica.

Las reacciones de ligamiento (aproximadamente 160 ng de ADN/transformación) se electroporaron en células electrocompetentes de E. coli ER2738 (Lucigen, Middleton, WI, EE. UU., 50 pl). Inmediatamente después de la electroporación, se adicionó aproximadamente 1 ml de medio de recuperación (suministrado con células de E. coli ER2738). Las células transformadas se incubaron a 37 °C por 60 min. Se tomaron muestras para la titulación y para la determinación del número de transformantes. Posteriormente las células se mezclaron y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 1 l de medio TSB-YE, suplementado con glucosa al 2 %, tetraciclina 10 pg/ml y ampicilina 100 pg/ml. Las células se sedimentaron por 15 minutos a 4.000 g y se resuspendieron en una solución de PBS/glicerol (aproximadamente 40 % de glicerol). Las células se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C. Los clones de la biblioteca de variantes Z se secuenciaron para verificar el contenido y evaluar el resultado de la biblioteca construida frente al diseño de la biblioteca. La secuenciación se realizó como se describe en el Ejemplo 1 y se verificó la distribución de aminoácidos.

Preparación del stock de fagos: Las células de un stock de glicerol que contenía la biblioteca de fagémidos se inocularon en 3,5 l de TSB-YE suplementado con glucosa 1 g/l, ampicilina 100 mg/l y tetraciclina 10 mg/l. Las células se cultivaron a 37 °C con agitación orbital (100 RPM). Cuando las células alcanzaron una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,59, se infectaron aproximadamente 620 ml de cultivo mediante el uso de un exceso molar de 5 x de fago auxiliar M13K07. Las células se incubaron por 30 minutos, después de lo cual las células se sedimentaron por centrifugación a 3.000 g y se resuspendieron en 3 l de TSB-YE fresco suplementado con ampicilina 100 mg/l, kanamicina 25 mg/l e IPTG 0,1 mM. El cultivo se dividió en matraces agitadores 6 x 5 l y se incubó a 30 °C con agitación orbital y después de ~18 h las células se sedimentaron por centrifugación a 4.700 g. Las partículas de fago se precipitaron del sobrenadante dos veces en PEG/NaCl, se filtraron y disolvieron en PBS y glicerol como se describe en el Ejemplo 1. Las reservas de fagos se almacenaron a -80 °C hasta su uso en la selección.

Resultados

Construcción de la biblioteca: La nueva biblioteca se diseñó en base a un conjunto de variantes Z de unión de PD-L1 con propiedades de unión verificadas (Ejemplos 1 y 3). El tamaño teórico de la biblioteca diseñada fue de 5,3 x 107 variantes Z. El tamaño real de la biblioteca, determinado por la titulación después de la transformación de células de E. coli. ER2738, fue de 2,8 x 109 transformantes.

La calidad de la biblioteca se ensayó mediante la secuenciación de 116 transformantes y la comparación de sus secuencias reales con el diseño teórico. Se demostró que los contenidos de la biblioteca real en comparación con la biblioteca diseñada eran satisfactorios. Así se construyó con éxito una biblioteca madurada de posibles unidores a PD-L1.

Ejemplo 5

Selección, cribado y caracterización de variantes Z de una biblioteca madurada

Materiales y procedimientos

Selección por presentación en fagos de variantes Z de unión a PD-L1: La proteína diana PD-L1 se biotiniló como se describe en el Ejemplo 1. Las selecciones por presentación en fagos, mediante el uso de la nueva biblioteca de moléculas de variantes Z construidas como se describe en el Ejemplo 4, se realizaron en cuatro ciclos contra hPD-L1 esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, con las siguientes excepciones: Excepción 1: Se usaron cuentas SA para atrapar los complejos PD-L1:variante Z en todas las pistas de selección. Excepción 2: la preselección se realizó contra cuentas SA revestidas con IgG-Fc humano biotinilado solo antes del ciclo 1 y 2. Además, en el ciclo 1, se realizó otra preselección contra cuentas SA revestidas con una mezcla de PD-L2, B7-H3, y B7-H4 como se describió previamente en el Ejemplo 1. Excepción 3: las selecciones contra PD-L1 humano biotinilado se realizaron en cuatro ciclos inicialmente divididos en dos pistas diferentes (1 y 2). A medida que avanzaba la selección, las pistas se dividieron de acuerdo con la concentración de la diana y el número y/o el tiempo de los lavados para finalmente terminar en 11 pistas en el ciclo cuatro. Más precisamente, la primera pista (1) se dividió del segundo al cuarto ciclos, lo que resultó en un total de 2 pistas (1-1 a 1-2) en el ciclo 2, cuatro pistas (1-1-1 a 1-2-2) en el ciclo 3 y siete pistas (1-1-1-1 a 1-2-2-2) en el ciclo 4. La segunda pista (2) se dividió del segundo al cuarto ciclo, lo que resultó en un total de 2 pistas (2 1 a 2-2) en el ciclo 2, cuatro pistas (2-1-1 a 2-2-2 ) en el ciclo 3 y cuatro pistas (2-1-1-1 a 2-2-2-1) en el ciclo cuatro. Excepción 4: durante la etapa de lavado de 19 h en el ciclo de selección 1-1-2-3 se adicionó un exceso molecular de 20 veces de hPD-L1 no biotinilado al tampón de lavado. En la Tabla 10 se muestra una descripción general de la estrategia de selección, que describe un mayor rigor en los ciclos posteriores obtenido mediante el uso de una concentración de la diana reducida y un mayor número de lavados.

Tabla 10. Selección contra Fc hPD-L1 biotinilado mediante el uso de una biblioteca madurada

Producción de variantes Z para ELISA: Las variantes Z se produjeron mediante la inoculación de colonias individuales de las selecciones en 1,2 ml de medio TSB-YE suplementado con ampicilina 100 pg/ml e IPTG 1 mM en placas de pocillos profundos (Nunc, núm. de cat. 278752). Las placas se incubaron con rotación durante 24 h a 37 °C. Las células se sedimentaron por centrifugación a 3.300 g y se resuspendieron en 150 pl de PBST al 0,05 % y se congelaron a -80 °C para liberar la fracción periplásmica de las células. Las muestras congeladas se descongelaron en un baño de agua y el procedimiento de congelación-descongelación se repitió ocho veces antes de aislar la fracción periplásmica en placas de pocillos profundos (Axygen, núm. de cat. 391-01-101) por filtración mediante el uso de placas de filtro (EMD Millipore, núm. de cat. MSNANLY50). El sobrenadante final del extracto periplásmico contenía las variantes Z como fusiones a ABD, expresadas como AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG (Gronwall y otros, supra). Z##### se refiere a variantes Z de 58 residuos aminoacídicos, individuales.

Cribado por ELISA de variantes Z: La unión de las variantes Z a PD-L1 humano se analizó en ensayos ELISA como se describe previamente en el Ejemplo 1 con las siguientes excepciones. Excepción 1: La fracción periplásmica se diluyó 1:8 con PBST al 0,05 % antes de adicionarse a los pocillos y se incubó por 1,7 h. Excepción 2: en lugar de un control en blanco, se usó un control negativo de una fracción periplásmica que contiene la proteína de fusión ABD sin pareja de fusión Z. Excepción 3: las muestras de periplasma que contienen la variante Z de unión a PD-L1 primaria Z13091 (SEQ ID.NO:776) se incluyeron por duplicado en cada placa y se analizaron como controles positivos. Excepción 4: Se adicionaron 50 pl de hPD-L1 biotinilado a una concentración de 40 pM en PBSC a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1,8 h a RT.

Secuenciación: En paralelo con el cribado por ELISA, todos los clones se secuenciaron como se describe en el Ejemplo 1.

Análisis de EC50 por ELISA: Una selección de variantes Z de unión a PD-L1 se sometió a un análisis de la respuesta frente a una serie de diluciones de PD-L1 humano biotinilado como se describe en el Ejemplo 1 con las siguientes excepciones. Excepción 1: las variantes Z se diluyeron 1:8 en PBST al 0,05 % antes de adicionarlas a los pocillos. Excepción 2: se adicionó PD-L1 humano biotinilado a una concentración de 15 nM y se diluyó paso a paso 1:3 hasta 0,25 pM. Excepción 3: se incluyó una muestra de periplasma que contenía la variante Z de unión a PD-L1 primaria Z13091 (SEQ ID.NO:776) para comparación y se analizó junto con las variantes Z maduradas.

Resultados

Selección por presentación en fagos de variantes Z de unión a PD-L1: Se obtuvieron clones individuales después de cuatro ciclos de selección de presentación en fagos contra hPD-L1 biotinilado.

Cribado por ELISA de variantes Z: Los clones obtenidos después de cuatro ciclos de selección se produjeron en placas de 96 pocillos y se cribaron para determinar la actividad de unión a hPD-L1 en ELISA. Se encontró que la mayoría de las variantes Z únicas dan una respuesta más alta que la respuesta promedio del control positivo Z13091 (promedio 0,264 AU) contra hPD-L1 a una concentración de 40 pM. La respuesta promedio de los controles negativos fue de 0,051 AU.

Secuenciación: La secuenciación se realizó para los clones obtenidos después de cuatro ciclos de selección. Cada variante recibió un número de identificación único, Z#####, como se describe en el Ejemplo 1. Las secuencias de aminoácidos de las variantes Z de 58 residuos aminoacídicos de longitud se enumeran en la Figura 1 y en el listado de secuencias como SEQ ID NO:1-773. Los motivos de unión a PD-L1 deducidos se extienden desde la posición 8 hasta la posición 36 en cada secuencia. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de 49 residuos aminoacídicos de largo predichos para constituir el haz completo de tres hélices dentro de cada una de estas variantes Z se extienden desde el residuo 7 hasta el residuo 55.

Análisis de EC50 de variantes Z: Se seleccionó un subconjunto de variantes Z que tenían los valores de ELISA más altos en el experimento de cribado por ELISA descrito anteriormente y se sometió a una titulación de la diana en formato ELISA. Las muestras de periplasma se incubaron con una dilución en serie de hPD-L1 biotinilado. Una muestra de periplasma que contiene Z13091 (SEQ ID NO:776), la variante Z primaria aislada que mostró la mayor afinidad de unión a hPD-L1, se incluyó como control positivo. Los valores obtenidos se analizaron y sus respectivos valores de EC50 se calcularon mediante el uso de GraphPad Prism 5 (Tabla 11). Todas las variantes Z maduradas mostraron valores de EC50 más bajos que la variante Z Z13091 primaria superior.

Tabla 11: Valores de EC50 calculados de variantes Z-ABD a partir de la maduración

Ejemplo 6

Subclonación y producción de un subconjunto de variantes Z de unión a PD-L1 maduradas

Materiales y procedimientos

Subclonación de variantes Z con una etiqueta H^ísr: El ADN de 24 variantes Z de unión a PD-L1 maduradas, (Z17746 (SEQ ID NO:8), Z17748 (SEQ ID NO:11), Z17756 (SEQ ID NO:7), Z17825 (SEQ ID NO:5), Z17911 (SEQ ID NO:3), Z17964 (SEQ ID NO:2), Z17972 (SEQ ID NO:19), Z17978 (SEQ ID NO:13), Z18022 (SEQ ID NO:9), Z18039 (SEQ ID NO:20), Z18048 (SEQ ID NO:4), Z18052 (SEQ ID NO:14), Z18054 (SEQ ID NO:22), Z18064 (SEQ ID NO:1), Z18066 (SEQ ID NO:12), Z18070 (SEQ ID NO:10), Z18074 (SEQ ID NO:6), Z18090 (SEQ ID NO:17), Z18101 (SEQ ID NO:23), Z18129 (SEQ ID NO:16), Z18149 (SEQ ID NO:18), Z18233 (SEQ ID NO:21), Z18353 (SEQ ID NO:15) y Z18418 (SEQ ID NO:24)) se amplificó del vector de la biblioteca pAY02592 y se subclonó con la etiqueta His6 como se describe en el Ejemplo 2 anterior.

Subclonación de variantes Z con una Cys en el C terminal: Se mutaron tres variantes Z, Z18064 (SEQ ID NO:1), Z17964 (SEQ ID NO:2) y Z18090 (SEQ ID NO:17) para que comenzaran con los aminoácidos AE en el N-terminal en lugar de VD y se subclonaron adicionalmente con el adición en el C-terminal de los aminoácidos VDC (que incorporan una cisteína única en el polipéptido) mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular. Las secuencias resultantes se denominan Z18608-Cys (SEQ ID NO:811), Z18609-Cys (SEQ ID NO:812) y Z18610-Cys (SEQ ID NO:813), respectivamente.

Cultivo: En general, se transformaron células de E. coli T7E2 (GeneBridges) con plásmidos que contenían los fragmentos génicos de cada variante Z de unión a PD-L1 respectiva y se cultivaron a 37 °C en aproximadamente 940 ml de medio TSB-YE suplementado con kanamicina 50 pg/ml. Para inducir la expresión de proteínas, se adicionó IPTG a una concentración final de 0,2 mM a OD600 = 2 y el cultivo se incubó a 37 °C por otras 5 h. Las células se cosecharon por centrifugación. Específicamente, Z18608-Cys y Z18609-Cys se cultivaron por lote alimentado a 37 °C en aproximadamente 700 ml de medio mineral definido suplementado con 50 pg/ml de kanamicina. Para inducir la expresión de proteínas, se adicionó IPTG a una concentración final de 0,5 mM a OD600 = 75 y el cultivo se incubó por otras 7 h. Las células se cosecharon por centrifugación.

Purificación de variantes Z de unión a PD-L1 con una etiqueta H^ísr: Las purificaciones por IMAC, el intercambio de tampón a PBS y las determinaciones de concentración se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 2. Purificación de las variantes Z de unión a PD-L1 con una Cys en el C terminal: El sedimento celular respectivo se resuspendió en Tris-HCl 20 mM, EDTA 0,5 mM, Tween 80 al 0,1 %, pH 7,5 (10 ml de tampón/g de sedimento celular) y se lisó por tratamiento térmico en un baño de agua a 80 °C por 10 min, seguido de enfriamiento en hielo hasta aproximadamente 20 °C. Se adicionó Benzonase® (1 pl/g de sedimento celular) y cada lisado celular se incubó a RT por 30 minutos, antes de eliminar los depósitos celulares por centrifugación. Para la reducción de disulfuros, se adicionó ditiotreitol (DTT; Acros Organics, núm. de cat. 165680250) a una concentración final de 10 mM seguido de incubación a RT por 20 min. Posteriormente, el lisado se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 pm (Millipore). La purificación se realizó mediante intercambio aniónico seguido de cromatografía de fase inversa (RPC). El intercambio de tampón a HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2 se llevó a cabo mediante el uso de medio Sephadex G-25 (GE Healthcare) empaquetado en una columna XK-50.

Para cualquier proteína purificada por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, la concentración se determinó mediante la medición de la absorbancia a 280 nm, mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 y el coeficiente de extinción de la proteína. La pureza se analizó mediante SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie, y la identidad de cada variante Z purificada se confirmó mediante el uso de análisis HPLC-MS (HPLC-MS 1100; Agilent Technologies).

Resultados

Cultivo y purificación: Las variantes Z de unión a PD-L1 se expresaron como productos génicos solubles en E. coli. La cantidad de proteína purificada de aproximadamente 2,0-2,4 g de sedimento bacteriano se determinó espectrofotométricamente mediante la medición de la absorbancia a 280 nm y varió de aproximadamente 18 mg a 29 mg para las diferentes variantes Z de unión a PD-L1 con etiqueta His6. El análisis por SDS-PAGE de cada preparación final de proteínas mostró que éstas contenían predominantemente la variante Z de unión a PD-L1. La identidad correcta y el peso molecular de cada variante Z se confirmaron mediante análisis por HPLC-MS.

Ejemplo 7

Caracterización adicional de un subconjunto de variantes Z de unión a PD-L1 primarias

En este ejemplo, un subconjunto de variantes Z se caracterizó en términos de estabilidad y diversas propiedades de unión. La especificidad y afinidad por PD-L1 de las variantes Z se analizó por Biacore y se investigó la capacidad de las variantes Z para bloquear la unión de PD-L1 a su receptor PD-1 mediante el uso de AlphaLISA.

Materiales y procedimientos

Análisis de especificidad y cinética por Biacore: Se determinaron las constantes cinéticas (ka y kd) y las afinidades (K^d) para el PD-L1 humano y PD-L1 de mono rhesus (RhPD-L1; quimera PD-L1/Fc de rhesus, Sino Biological Inc., núm. de cat. 90251-C02H) para 24 variantes Z maduradas etiquetadas con His6 (especificadas en el Ejemplo 6). Las variantes Z se ensayaron, además, para la unión contra las proteínas relacionadas por secuencia hPD-L2, hB7-H3 y hB7-H4. Los análisis por Biacore se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 3, sin embargo, se usó un caudal de 30 pl/min. Los niveles de inmovilización del ligando en las superficies fueron 1.030 RU para hPD-L1, 1.060 RU para RhPD-L1, 1.070 RU para hPD-L2, 1.090 RU para hB7-H3, y 770 RU para hB7-H4. En un primer análisis cinético de la unión, las 24 variantes Z se inyectaron a concentraciones de 5 y 50 nM sobre chips inmovilizados con hPD-L1 y RhPDL1, respectivamente. Las 12 variantes Z de unión a PD-L1 maduradas que mostraron la mayor afinidad por hPD-L1 en el primer experimento se analizaron con más detalle y se inyectaron a concentraciones de 135, 45, 15, 5 y 1,67 nM sobre hPD-L1 y RhPD-L1 inmovilizados. En el ensayo de especificidad, es decir, el análisis de unión contra hPD-L2, hB7-H3 y hB7-H4, las 24 variantes Z se inyectaron a una concentración de 500 nM.

Ensayo de bloqueo por AlphaLlSA: El potencial de las variantes Z para inhibir la unión de PD-L1 a su ligando natural PD-1 se analizó en un ensayo AlphaLISA como se describe en el Ejemplo 3 con las siguientes excepciones: Excepción 1: se prepararon diluciones en serie paso a paso 1:3 de variantes Z etiquetadas con His6 a concentraciones finales de 250 nM a 4 pM en una placa 384SW (Perkin Elmer, núm. de cat. 6008350) y se incubaron por 45 minutos con hPD-L1 biotinilado 8 nM (R&D Systems) en tampón de AlphaLISA (Perkin Elmer, núm. de cat. AL000F). Excepción 2: se adicionaron cuentas aceptoras revestidas con hPD-1 a una concentración final de 10 pg/ml y se incubaron por 50 minutos.

Análisis de espectroscopia de dicroísmo circular (CD): Un subconjunto de las variantes Z etiquetadas con His6 purificadas se analizaron mediante espectroscopia de CD como se describe en el Ejemplo 3, pero con las excepciones de que el tampón de análisis era PBS y que la temperatura se elevó a 80 °C en el VTM.

Resultados

Análisis de especificidad y cinética por Biacore: Las interacciones de 24 variantes Z etiquetadas con His6 maduradas con PD-L1 humano y de mono rhesus, se analizaron en un instrumento Biacore mediante la inyección de diversas concentraciones de las variantes Z sobre superficies que contenían hPD-L1 y RhPD-L1 inmovilizados, respectivamente. Se realizó un primer análisis cinético para clasificar las variantes Z en términos de su afinidad por hPD-L1 y RhPD-L1, asi como para comparar su cinética de unión con la variante Z de unión de PD-L1 primaria Z13091. En la Tabla 12 se proporciona un sumario de las constantes de afinidad aproximadas del experimento de clasificación, que se obtuvieron mediante el uso de un modelo de interacción 1:1.

Las 12 variantes Z maduradas que mostraron la mayor afinidad de unión a hPD-L1 se analizaron adicionalmente y los parámetros cinéticos determinados con mayor precisión para estas 12 variantes Z se dan en la Tabla 13. Las curvas resultantes tipicas, donde se restaron las respuestas de una superficie en blanco, se muestran para dos variantes seleccionadas en la Figura 5.

Además, las 24 variantes Z etiquetadas con His6 maduradas se ensayaron, además, para la unión contra las tres proteínas relacionadas por la secuencia, hPD-L2, hB7-H3, y hB7-H4. En línea con los resultados del Ejemplo 3, no se detectó unión a ninguna de las proteínas de control a una concentración de variante Z de 500 nM.

Tabla 13: Parámetros cinéticos para la unión de variantes Z a hPD-L1 y RhPD-L1

Ensayo de bloqueo por AlphaLISA: La capacidad de 24 variantes Z monoméricas etiquetadas con His6 maduradas para inhibir la unión de hPD-L1 a hPD-1 se ensayaron en un ensayo de bloqueo por AlphaLISA. La variante Z primaria Z13091 se incluyó como referencia. Las diluciones en serie de las variantes Z se incubaron con hPD-L1 biotinilado y la capacidad de bloqueo de cada variante respectiva se midió después de la adición de cuentas aceptoras revestidas con hPD-1 y posteriormente cuentas donantes revestidas con estreptavidina. La inhibición podría medirse como una disminución en los recuentos de AlphaLISA para variantes Z positivas. Los valores calculados de IC50 para las 25 variantes que mostraron que bloquean la unión de PD-L1 a PD-1 en este ensayo se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14: Valores de IC50 para variantes Z que bloquean la interacción PD-1/PD-L1

Análisis de CD: El espectro de CD determinado para 24 variantes Z de unión de PD-L1 maduradas con una etiqueta His6 mostró que cada una tenía una estructura a helicoidal a 20 °C. Las temperaturas de fusión (Tm) se determinaron mediante el uso de mediciones de temperatura variable (Tabla 15). Se observó plegamiento reversible para todas las variantes Z de unión a PD-L1 cuando se superpusieron espectros medidos a 20 °C antes y después de calentar a 80 °C, como se muestra para dos variantes Z seleccionadas en la Figura 6.

Tabla 15: Temperaturas de fusión de las variantes Z de unión a PD-L1 maduradas

Ejemplo 8

Caracterización de los complejos anti-PD-L1/PD-1 y anti-PD-L1/CTLA-4

Materiales y procedimientos

Producción de complejos y anticuerpos de control: Se construyeron cuatro complejos diferentes dirigidos a PD-L1 y PD-1, y cuatro complejos diferentes dirigidos a PD-L1 y CTLA-4, así como un anticuerpo de control dirigido a PD-1. Se construyó un anticuerpo denominado "Lam", que tiene las mismas secuencias de CDR y especificidad que el anticuerpo monoclonal dirigido a PD-1 pembrolizumab (anteriormente lambrolizumab), mediante el uso de las secuencias de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) HCLam (SEQ ID NO:815) y LCLam (SEQ ID NO:816). Se construyó un anticuerpo denominado "Ipi", que tiene las mismas secuencias de CDR y especificidad que el comercialmente disponible, anticuerpo monoclonal dirigido a CTLA-4 ipilimumab, mediante el uso de las secuencias de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) HQpi (SEQ ID NO:817) y LQpi (SEQ ID NO:818). La variante Z dirigida a PD-L1 Z15170 (SEQ ID n O:814; idéntica a Z13165 (SEQ ID NO:784) pero que comienza con los residuos aminoacídicos AE en lugar de VD) con una secuencia VD en el C terminal se fusionó genéticamente, mediante un enlazador de 15 residuos (GGGGS)3 flexible, al extremo N de HCLam, LCLam, HCIpi y LCIpi, respectivamente, lo que resultó en los complejos Z15170-HCLam, Z15170-LCLam, Z15170-HCIpi y Z15170-LCIpi respectivamente; o al extremo C de las mismas cadenas, lo que resultó en los complejos HCLam-Z15170, LCLam-Z15170, HCIpi-Z15170 y LCIpi-Z15170, respectivamente. Se realizó la síntesis génica, clonación, producción por expresión génica transitoria en células CHO así como la purificación por cromatografía de proteína A y verificación de construcciones por electroforesis en gel por Evitria AG (Suiza).

Análisis cinéticos por Biacore: Se determinaron las constantes cinéticas (ka y kd) y las afinidades (Kd) para hPD-L1, PD-1 humano (hPD-1; R&D Systems núm. de cat. 1086-PD-050) y CTLA-4 humano (hCTLA-4; R&D Systems núm. de cat.

325-CT-200) para los ocho complejos producidos y mediante el uso de un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). El anticuerpo de control Lam también se analizó para la unión contra PD-1. Se prepararon soluciones de 5 pg/ml de cada una de las proteínas hPD-L1, hPD-1 y hCTLA-4 en tampón NaAc 10 mM (pH 5,0 para PD-L1 y pH 4,5 para PD-1 y CTLA-4) y se usaron para la inmovilización en celdas de flujo separadas en la capa de dextrano carboxilado de diferentes superficies de chips CM5 (GE Healthcare, núm. de cat. BR100012). La inmovilización se realizó mediante el uso de química de acoplamiento de amina de acuerdo con el protocolo del fabricante y mediante el uso de HBS-EP con NaCl 500 mM como tampón de corrida. Los niveles de inmovilización obtenidos fueron de ~ 110-140 RU. Se inyectó una serie de concentraciones de 3,33, 10, 30, 90, 270 nM del complejo respectivo y Lam y se registraron las respuestas, excepto para el análisis de unión a PD-L1 para construcciones con Z15170 colocado en el extremo C del anticuerpo respectivo, para lo cual se usó una serie de concentraciones de 30, 90, 270 y 900 nM.

En un experimento separado, la especificidad de unión doble se evaluó mediante un ensayo de captura mediante el uso del instrumento Biacore 2000. Los complejos Z15170-HCLam, Z15170-LCLam, Z15170-HCIpi y Z15170-LCIpi, Lam e ipilimumab (Yervoy®, Bristol-Myers Squibb/Astra Zeneca a través de Apoteket AB, núm. de cat. 065544, lote núm.

4A85968), a una concentración de 300 nM, se inyectaron sobre superficies de chips inmovilizados con PD-1 o CTLA-4 como se describe anteriormente. En todos los casos, la duración de la inyección fue de 5 min a un caudal de 30 pl/min con una etapa de espera/disociación de 5 min antes de una segunda inyección (5 min) de PD-L1 100 o 500 nM. Se usó HBS-EP con NaCl 500 mM como tampón de corrida y para las diluciones de proteínas.

Análisis de unión a células por FACS: El potencial de los complejos para unirse a las células que expresan PD-L1 se investigó mediante el uso de FACS. Se pipetearon 150.000 células de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231, cultivadas en DMEM (ATCC núm. de cat. 30-2002) que contenía 10 % de FBS, por pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V (Nunc, núm. de cat. 277143) y las células en la placa se sedimentaron posteriormente a 400 g por 3 minutos a RT. Los sobrenadantes se eliminaron y las células se resuspendieron en 100 pl de PBS más FBS al 2,5 % (tampón de tinción) que contenía 0,625 pg/ml de los complejos Z15170-HCLam, Z15170-LCLam, HCLam-Z15170, LCLam Z15170, Z15170-HCipi, Z15170-LCipi, HCipi-Z15170 y LCipi-Z15170, respectivamente, o 0,625 pg/ml de los anticuerpos Lam o ipilimumab. Se usó un anticuerpo anti-PD-L1 de ratón (RnD Systems, núm. de cat. MAB1561) a una concentración de 1 pg/ml como control positivo. Las células incubadas con tampón solo se usaron como controles negativos. Las células se incubaron durante 1 h a 8 °C en la oscuridad, se lavaron dos veces con 100 pl de tampón de tinción y se resuspendieron en 100 pl de tampón de tinción que contenía 2,5 pg/ml del anticuerpo de cabra anti IgG humana-Alexa488 (Molecular Probes, núm. de cat. A11013) o, para células teñidas con el anticuerpo de control positivo, anticuerpo de cabra anti IgG de ratón-Alexa647 (Life Technologies, núm. de cat. A21236). Las células se incubaron por 1 hora a 8 °C en la oscuridad, se lavaron dos veces con 100 pl de tampón de tinción y se resuspendieron en 300 pl de tampón de tinción. Los datos de 10.000 células se obtuvieron mediante el uso de un FACS Calibur (Beckman Coulter) y los datos se analizaron mediante el uso del software Flowing 2.5.0 (Universidad de Turku). La intensidad de fluorescencia media (MFI) se usó como lectura de la capacidad de unión.

Cocultivo de MDA-MB-231 y PBMC: Se usó un ensayo mixto de linfocitos para analizar si los complejos basados en Ipi podrían afectar la proliferación o el efecto citotóxico de las células T y por lo tanto aumentar la eliminación de las células cancerosas. En la presente memoria, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células MDA-MB-231 se cultivaron conjuntamente durante seis días y se evaluó el número de células T y células cancerosas. Se pipetearon 20.000 células MDA-MB-231, cultivadas en DMEM que contenía FBS al 10 %, por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano y se dejaron adherirse al fondo del pocillo por incubación a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 humidificada. El día 2 del experimento, las diluciones en serie (200-0,064 nM) de los complejos basados en Ipi se prepararon en una placa separada mediante el uso de RPMI1640 con L-glut (Lonza) suplementado con 10 % de FCS y 1 % de Pen-Strep (Lonza, núm. de cat. DE17-603E). El medio DMEM se descartó de las células MDA-MB-231 y se adicionaron 100 pl de los complejos diluidos. Los PBMC se prepararon a partir de una capa leucocitaria mediante el uso de Ficoll Paque PLUS (GE Healthcare, núm. de cat. 17-1440-02). En resumen, la capa leucocitaria se diluyó 2 X en PBS. Se colocaron capas de 10 ml de la capa leucocitaria diluida en la parte superior de 5 ml de Ficoll en tubos falcon de 15 ml y se centrifugaron a RT por 30 minutos a 400 g. La capa de linfocitos se recolectó y las células se lavaron dos veces en el medio RPMI1640 suplementado descrito anteriormente. Las células se contaron y se ajustaron a 1 millón de células por ml en medio RPMI suplementado. Se adicionaron 100 pl de la suspensión celular a la placa con las células MDA-MB-231. Las placas se incubaron por 6 días a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 humidificada. En el día 7 del experimento, se contó por FACS el número de células MDA-MD-231 y células T CD3+. Las PBMC se transfirieron a una placa de fondo en V, se lavaron dos veces con PBS que contenía FBS al 2 % (usado, además, como tampón de tinción) y se tiñeron con un anticuerpo anti-CD3 de ratón (EXBIO Praha, núm. de cat. 12-631-M001) a una concentración de 2 pg/ml durante 1 h a 4 °C. Las células MDA-MB231 se tripsinizaron (20 pl/pocillo) y se transfirieron a otra placa en forma de fondo en V, se lavaron dos veces con PBS que contenía FBS al 2 % y se tiñeron con un anticuerpo anti-EGFR de conejo (Abcam, núm. de cat. Ab2430-1) a una concentración de 2 pg/ml durante 1 h a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con PBS que contenía FBS al 2 % y un anticuerpo de cabra anticonejo-Alexa-fluor 488 (Invitrogen, núm. de cat. A11008) y el anticuerpo de cabra antiratón-Alexa-fluor 647 (Life technologies, núm. de cat. A21236) se usaron como anticuerpos de detección a una concentración de 1 pg/ml y se incubaron durante 1 h a 4 °C.

Resultados

Producción de construcciones de complejos: En la Figura 7 se muestra una representación esquemática del diseño de cada uno de los cuatro tipos de complejos producidos.

Análisis cinéticos por Biacore: Se determinó la afinidad con las proteínas diana PD-L1, PD-1 y CTLA-4, respectivamente, para cada complejo relevante. El anticuerpo de control Lam también se analizó contra su diana PD-1. Los parámetros cinéticos para las interacciones con PD-L1 se resumen en la Tabla 16. Se mantuvo la capacidad del resto Z del complejo para interactuar con PD-L1, aunque la afinidad se redujo, así como se afectó por la colocación del resto Z en el anticuerpo. A modo de comparación, la K^dde la interacción de Z13165-His6 con PD-L1 fue de 0,64 nM (como se presenta en el Ejemplo 3), mientras que la K^dpara complejos con restos Z colocados en el extremo N fue de 1,5-2,6 nM y la Kd para los restos Z colocados en el extremo C fue de 12-41 nM. Así, la colocación N terminal del resto Z fue superior a la colocación C terminal, con una afinidad aproximadamente 10 veces mayor. Este efecto fue evidente con las construcciones basadas en Lam e Ipi. Si las fusiones se hicieron a las cadenas pesadas o ligeras de los anticuerpos era de menor importancia para el resto Z colocado en el extremo N, pero tuvo un impacto importante en el resto Z colocado en el extremo C, donde las fusiones de cadena ligera tenían una K^dde 12-18 nM en comparación con una K^dde 29-41 nM para las fusiones de cadena pesada.

Tabla 16: Parámetros cinéticos para la unión de los complejos indicados a hPD-L1

Las interacciones de los complejos con PD-1 y CTLA-4, respectivamente, siguieron un modelo bivalente. La Kdi, Kd2, kai, ka2, kd1 y kd2 se resumen en la Tabla 17 y la Tabla 18 para PD-1 y CTLA-4, respectivamente. La constante de afinidad Kd1 para la interacción de PD-1 con el anticuerpo de control Lam producido se determinó a 18,6 nM. La afinidad fue más fuerte para todos los complejos basados en Lam, con un intervalo de Kdi de 0,8-2,7 nM. Una asociación y tasa algo más lenta, kai, se observó que para Z15170-HCLam, pero en general las diferencias entre los complejos fueron pequeñas, es decir, la colocación del resto Z en el anticuerpo parece tener un impacto menor en la interacción entre el anticuerpo y PD-i.

Tabla 17: Parámetros para la unión de los complejos indicados y Lam a hPD-1

La constante de afinidad K^dipara la interacción de complejos con CTLA-4 estaba en el intervalo de 8-10 nM y esto está en línea con la K^dinformada para ipilimumab (5,25 ± 3,62 nM; European Medicines Agency's assessment report 2011: EMA/CHMP/557664/2011). Los perfiles cinéticos fueron similares para todas las construcciones basadas en Ipi, pero con tasas de asociación y disociación algo más lentas para Z15170-HC^{ip i}.

El ensayo de captura por Biacore confirmó la especificidad de unión doble de todos los complejos incluidos en el ensayo, es decir, Z15170-HC^{L a m}, Z15170-LC^{L a m}, Z15170-HC^{ip i}y Z15170-LC^{ip i}. La Figura 8 muestra que los complejos se unen primero a PD-i o CTLA-4 inmovilizados y que PD-L1 se une posteriormente al complejo capturado respectivo. En experimentos de control separados, se demostró que PD-L1 no se une a CTLA-4 o Ipi y que no se observó unión adicional por PD-Li después de la inyección de PD-Li a Lam capturado en PD-i.

Análisis de unión a células por FACS: Este experimento se realizó para analizar si los complejos podían unirse a células que expresan PD-L1. Células MDA-MB-231 que expresan naturalmente PD-L1 se tiñeron con 0,625 |jg/ml del complejo respectivo. Los valores de MFI se presentan en la Tabla 19 y muestran que los complejos tenían la capacidad de unirse a células que expresan PD-L1. Para los complejos basados tanto en Ipi como en Lam, se obtuvieron los valores más altos de m Fi para la colocación N terminal del resto Z en la cadena ligera del anticuerpo.

Tabla 19: MFI para la unión de complejos a células que expresan PD-L1

Cocultivo de MDA-MB-231 y PBMC: Para evaluar si los complejos basados en Ipi podrían afectar los mecanismos inhibitorios causados por CTLA-4 y PD-L1, se usó un ensayo de linfocitos mixtos. Se cultivaron células de cáncer de mama MDA-MB-231 conjuntamente con PBMC durante seis días y se evaluó el número de células cancerosas y células T. El análisis reveló un efecto dependiente de la concentración de los complejos, con una mayor cantidad de células T y un número reducido de células cancerosas. La Figura 9A muestra la reducción en el número de células MDA-MB231 con el aumento de la concentración de los complejos. Esta reducción fue evidente para todos los complejos con el mejor efecto logrado con la construcción en la que el resto Z se sitúa en el extremo N de la cadena ligera del anticuerpo. En contraste, el anticuerpo de control ipilimumab no indujo una disminución dependiente de la concentración de las células cancerosas. Así, el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 parece esencial para reducir la cantidad de células cancerosas. La Figura 9B muestra el aumento en el número de células T con una concentración en aumento de los complejos. Nuevamente, el efecto es más prominente con la construcción en la que el resto Z se sitúa en el extremo N de la cadena ligera del anticuerpo.

Ejemplo 9

Conjugación y radioetiquetaje de variantes Z de unión a PD-L1

Este ejemplo describe la conjugación y el radioetiquetaje de Z15168-Cys (SEQ ID NO:809), Z18608-Cys (SEQ ID NO:811), Z18609-Cys (SEQ ID NO:812) y Z18610-Cys (s Eq ID NO:813), clonadas y producidas como se describe en el Ejemplo 2 y el Ejemplo 6, y usadas adicionalmente para los estudios de obtención de imágenes in vivo descritos en los Ejemplos 10 y 11.

Materiales y procedimientos

Reducción y conjugación con NOTA: A 5 mg de la variante Z en [HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2] se adicionaron tres equivalentes molares de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en 0,5 ml de tampón acetato de amonio 0,2 M desgasificado (pH 7,0). La reacción se mantuvo a RT por 60 minutos antes de transferirse a un filtro centrífugo Ultracel 3K y se centrifugó a 4.000 rpm por 90 minutos. Se descartó el flujo que pasó y se adicionó 1 ml adicional de tampón acetato de amonio 0,2 M, y se repitió el proceso. La variante Z reducida se transfirió después a un segundo recipiente de reacción en 2 ml de tampón acetato de amonio 0,2 M sin oxígeno (pH 7,0). Después se adicionaron 4 mg de NOTA-maleimida (Macrocyclics) en 0,5 ml de tampón acetato de amonio 0,2 M (pH 7,0), y el recipiente de reacción se purgó con argón antes de calentar a 40 °C por 3 h, momento en el que la mezcla de reacción se transfiere a un filtro centrífugo Ultracel 3K y se centrifuga por 90 minutos a 4.000 rpm. Se descartó el flujo que pasó y se adicionaron 2 ml de agua miliQ. La centrifugación se realizó por 90 minutos adicionales y se descartó el flujo que pasó. La variante Z conjugada con NOTA purificada se recolectó en 1 ml de agua miliQ, se liofilizó y se almacenó a -70 °C antes de su uso. La pureza del producto final se determinó por LC/MS.

^{R a d i o e t i q u e t a j e : U n c a r t u c h o q u e c o n t i e n e [}18^{F ] - f l u o r u r o s e l a v ó p r i m e r o c o n 1 , 5 m l d e a g u a u l t r a p u r a , d e s p u é s e l [}18^{F ] -f l u o r u r o s e e l u y ó c o n 1 , 0 m l d e K H C O 3 0 , 4 M . S e a d i c i o n a r o n 1 0 0 j l d e l a s o l u c i ó n d e [}18^{F ] - f l u o r u r o e l u i d a a u n v i a l d e}t a l l o c a r g a d o c o n 1 0 j l d e á c i d o a c é t i c o , 5 0 j l d e A l C l 3 ( 2 m M e n t a m p ó n d e N a O A c 0 , 1 M , p H 4 ) y 1 2 5 j l d e N a O A c 0 , 1 M , p H 4 . L a s o l u c i ó n s e i n c u b ó p o r 2 m i n u t o s a R T a n t e s d e q u e s e a d i c i o n a r a n 1 m g d e v a r i a n t e Z c o n j u g a d a c o n N O T A e n 4 0 0 j l d e u n a s o l u c i ó n 1 : 1 d e a c e t o n i t r i l o y N a O A c 0 , 1 M a p H 4 , d e s p u é s s e c a l e n t ó a 1 0 0 ° C p o r 1 5 m i n u t o s . U n a v e z c o m p l e t a d o e l c a l e n t a m i e n t o , l a m u e s t r a s e t r a n s f i r i ó a u n v i a l q u e c o n t e n í a 0 , 7 m l d e á c i d o f ó r m i c o a l 0 , 1 % , s e m e z c l ó y p u r i f i c ó p o r H P L C [ c o l u m n a W a t e r s X s e l e c t C S H C 1 8 ( 2 5 0 * 1 0 m m , 1 3 0 j m ) ] m e d i a n t e e l u s o d e u n g r a d i e n t e d e 1 0 - 3 0 % d e M e C N d u r a n t e 1 5 m i n a u n c a u d a l d e 5 m l / m i n , e l r e s t o e s á c i d o f ó r m i c o a l 0 , 1 % . S e r e c o l e c t ó e l p i c o ^{c o r r e s p o n d i e n t e a [}18^{F ] A I F - N O T A - Z # # # # # , s e e l i m i n ó e l M e C N a l v a c í o y s e t r a n s f i r i ó a u n v i a l e s t é r i l m e d i a n t e e l u s o d e s o l u c i ó n s a l i n a f i s i o l ó g i c a c o m o e n j u a g u e p a r a d a r [}18^{F ] A I F - N O T A - Z # # # # # . L a a c t i v i d a d e s p e c í f i c a y l a p u r e z a}r a d i o q u í m i c a s e d e t e r m i n a r o n m e d i a n t e u n s i s t e m a W a t e r s A c q u i t y L C / M S ( M i l f o r d , M A , E E . U U . ) y u n d e t e c t o r d e r a d i o -H P L C m o d e l o 4 d e p - R A M ( I N / U S S y s t e m s , B r a n d o n , F L , E E . U U . ) .

R e su lta d o s

Ejemplo 10

Biodistribución y obtención de imágenes in vivo en ratones con tumores

M a t e r i a l e s y p r o c e d i m i e n t o s

R e su lta d o s

^{I m á g e n e s r e p r e s e n t a t i v a s d e P E T d e s p u é s d e l a i n y e c c i ó n d e v a r i a n t e s Z e t i q u e t a d a s c o n [}18^{F ] e n r a t o n e s p o r t a d o r e s}d e t u m o r m o s t r a r o n l a m a y o r a b s o r c i ó n e n r i ñ ó n y v e j i g a . L o s t u m o r e s L O X P D - L 1 p o s i t i v o s p o d í a n v e r s e c l a r a m e n t e e n ^{l a s i m á g e n e s , m i e n t r a s q u e l o s t u m o r e s S U D H L}6 ^{P D - L 1 n e g a t i v o s n o e r a n v i s i b l e s . L a s i m á g e n e s d e P E T r e p r e s e n t a t i v a s s e m u e s t r a n e n l a F i g u r a 1 0 A p a r a [ 18 F ] A I F - N O T A - Z 1 5 1 6 8 . L a s m e d i c i o n e s d e b i o d i s t r i b u c i ó n} e x v ivo ^al o s 9 0 m i n u t o s d e s p u é s d e l a i n y e c c i ó n e s t u v i e r o n d e a c u e r d o c o n l a s i m á g e n e s d e P E T . L a c a p t a c i ó n d e v a r i a n t e s Z ^{e t i q u e t a d a s c o n [}18^{F ] Z 1 5 1 6 8 - C y s ( S E Q I D N O : 8 0 9 ) , Z 1 8 6 0 8 - C y s ( S E Q I D N O : 8 1 1 ) , Z 1 8 6 0 9 - C y s ( S E Q I D N O : 8 1 2 ) y Z 1 8 6 1 0 - C y s ( S E Q i D N O : 8 1 3 ) f u e s i g n i f i c a t i v a m e n t e m a y o r e n l o s t u m o r e s L O X q u e e n l o s t u m o r e s S U D H L}6 ^{y l a}c a p t a c i ó n t u m o r a l a u m e n t ó c o n l a a f i n i d a d d e u n i ó n a P D - L 1 d e l a s v a r i a n t e s Z ( F i g u r a 1 1 A - B ) . L a e s p e c i f i c i d a d p o r l a d i a n a s e c o n f i r m ó e n u n e x p e r i m e n t o d e p r e b l o q u e o e n e l q u e l a p r e a d m i n i s t r a c i ó n d e 4 0 0 j g d e N O T A - Z 1 5 1 6 8 c a u s ó u n a r e d u c c i ó n e n l a c a p t a c i ó n d e [ 18 F ] A l F - N O T A - Z 1 5 1 6 8 e n t u m o r e s L O X ( F i g u r a 1 0 B ) . S e o b s e r v a r o n , a d e m á s , c a m b i o s e n l a d i s t r i b u c i ó n , i n c l u i d o u n a c l a r a m i e n t o m á s r á p i d o s e g ú n l o i n d i c a d o p o r u n a m e n o r a b s o r c i ó n e n s a n g r e a l o s 9 0 m i n u t o s . L a r e t e n c i ó n d e l m a r c a d o r r e n a l ( S U V p r o m e d i o v a r i ó e n t r e 5 7 y 8 4 e n l a s x e n o g r a f í a s d e t u m o r e s L O X ) probablemente se deba a la recaptación tubular de proteínas, donde la etiqueta [18F]AIF queda atrapada después de la escisión de las variantes Z. Para resumir, los resultados muestran que los ligandos de las variantes Z son efectivos para direccionarse a tumores PD-L1 positivos in vivo, y exhiben una unión específica y un aclaramiento rápido.

Ejemplo 11

Obtención de imágenes in vivo en mono Rhesus

Materiales y procedimientos

Los monos rhesus en ayunas se sedaron con ketamina (10 mg/kg, intramuscular). Se insertó un catéter intravenoso en las venas safenas derecha e izquierda y los animales se mantuvieron con anestesia con propofol (5 mg/kg para inducción y 0,45 mg/kg/min durante todo el procedimiento de escaneo). Después de la inducción inicial con propofol, el animal se intubó y se mantuvo en una mezcla de oxígeno/aire ventilado a aproximadamente 10 cm3/kg/aliento, y 23 respiraciones por minuto. Los animales se instrumentaron con una sonda de temperatura, un oxímetro de pulso y un monitor de CO2 espiratorio final. La temperatura corporal se mantuvo mediante el uso de almohadillas calefactoras del módulo K. La terapia de fluido general se mantuvo con solución de Ringer lactato (10 ml/kg/h i.v.) durante todo el procedimiento de escaneo. Se administraron 84-138 MBq de [18F]AIF-NOTA-Z15168 y 147-227 MBq de [18F]AIF-NOTA-Z18609, respectivamente, como una infusión de 2 minutos. El escaneo dinámico de todo el cuerpo se inició al comienzo de la inyección del marcador y se adquirió por 180 min mediante el uso de un escáner de PET/CT TPTV 64 de Siemens Biograph. La reconstrucción de todo el cuerpo se realizó mediante el uso del software suministrado por el proveedor del escáner de PET/CT. El análisis de imagen de PET se realizó mediante el uso de un software personalizado basado en Matlab.

Resultados

Las imágenes de proyección de intensidad máxima representativas de monos rhesus administrados con [18F]AIF-NOTA-Z15168 y [18F]AIF-NOTA-Z18609, respectivamente, se muestran en la Figura 12A-B y los gráficos de la absorción media del marcador (~ 120-180 min) se muestran en la Figura 12C. Al igual que en los ratones, la mayor absorción se observó en el riñón (SUV = 100-112) y la vejiga, pero se observó, además, un direccionamiento a ganglios linfáticos y bazo, lo que es consistente con la expresión de PD-L1.

Lista por ítems de las realizaciones

1. Polipéptido de unión a PD-L1, que comprende un motivo de unión a PD-L1 BM, cuyo motivo consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

i) ERNX4AAX7EIL X11LPNLX16X17X18QX20 WAFIWX26LX28D

en la que, independientemente uno del otro,

X4 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X7 se selecciona de A, E, F, H, N, Q, S, T, V, W y Y;

X11 se selecciona de A, D, E, F, H, K, L, N, Q, R, S, T, V, W y Y;

X16 se selecciona de N y T;

X17 se selecciona de A, H, K, N, Q, R y S;

X18 se selecciona de A, D, E, G, H, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X20 se selecciona de H, I, K, L, N, Q, R, T, V y Y;

X26 se selecciona de K y S; y

X28 se selecciona de A, D y E;

y

2. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con el ítem 1, en el que en la secuencia i)

X4 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X7 se selecciona de E, F, H, N, Q, S, T, V, W y Y;

X11 se selecciona de A, D, H, L, Q, R, T, V, W y Y;

X16 se selecciona de N y T;

X17 se selecciona de A, H, K, N, Q, R y S;

X18 se selecciona de A, D, E, G, H, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X20 se selecciona de H, I, K, L, Q, R, T, V y Y;

X26 se selecciona de K y S; y

X28 se selecciona de A, D y E.

3. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con el ítem 1, en el que en la secuencia i)

^X4 ^{s e s e l e c c i o n a d e A , D , E , F , H , I, K , L , N , Q , R , S , T , V y Y ;}

^X7 ^{s e s e l e c c i o n a d e A , E , F , H , N , Q , S , T , V , W y Y ;}

^X11 ^{s e s e l e c c i o n a d e A , D , E , F , H , K , L , N , Q , R , S , T , V , W y Y ;}

^X16 ^{s e s e l e c c i o n a d e N y T ;}

^X17 ^{s e s e l e c c i o n a d e A , H , K , N , Q , R y S ;}

^X18 ^{s e s e l e c c i o n a d e A , D , E , G , H , K , L , N , Q , R , S , T , V y Y ;}

^X20 ^{s e s e l e c c i o n a d e H , I, K , L , N , Q , R , T , V y Y ;}

^X26 ^{s e s e l e c c i o n a d e K y S ; y}

^X28 ^{s e s e l e c c i o n a d e A , D y E .}

5 v ) Y A -[ B M o d ] - A P ;

^{e n l a q u e} [B M od ] ^{e s u n m ó d u l o d e u n i ó n a P D - L 1 c o m o s e d e f i n e e n u n o c u a l q u i e r a d e l o s í t e m s 3 0 - 4 4 ; y}v i ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s u n 9 0 % d e i d e n t i d a d c o n u n a s e c u e n c i a d e f i n i d a e n v ) .

4 6 . P o l i p é p t i d o d e u n i ó n a P D - L 1 d e a c u e r d o c o n u n o c u a l q u i e r a d e l o s í t e m s 1 - 4 4 , q u e c o m p r e n d e u n a s e c u e n c i a d e 0 a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :

v i i ) F N -[ B M o d ] - A P ;

^{e n l a q u e} [B M od ] ^{e s u n m ó d u l o d e u n i ó n a P D - L 1 c o m o s e d e f i n e e n u n o c u a l q u i e r a d e l o s í t e m s 3 0 - 4 4 ; y}v i i i ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s u n 9 0 % d e i d e n t i d a d c o n u n a s e c u e n c i a d e f i n i d a e n v i i ) . 5

4 7 . P o l i p é p t i d o d e u n i ó n a P D - L 1 d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r í t e m a n t e r i o r , q u e c o m p r e n d e u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :

ADNNFNK-/BM/-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;

ADNKFNK-/BM7-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;

ADNKFNK-/BM/-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;

ADAQQNNFNK-/BM7-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK; AQHDE-/B/W/-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;

VDNKFNK-/B/W/-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;

AEAKYAK-7BM/-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;

VDAKYAK-/B/W/-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;

VDAKYAK-/B/W/-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;

AEAKYAK-7BM/-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

AEAKYAK-7BM/-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;

AEAKFAK-/B/W/-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

AEAKFAK-/B/W/-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;

AEAKYAK-7BM/-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;

AEAKYAK-7BM/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;

AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;

AEAKFAK-/B/W/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;

AEAKFAK-/B/W/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;

AEAKYAK-7BM/-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;

AEAKYAK-/BM/-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;

AEAKYAK-7BM/-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;

AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLESSQAP;

AEAKYAK-7BM/-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;

AEAKYAK-7BM/-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;

AEAKVAK-/B/W/-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;

AEAKYAK-/BA/Í/-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAP;

AEAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK;

AEAKYAK-/BM7-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;

AEAKYAK-/B/W/-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;

VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;

VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;

VDAKYAK-/DM/-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;

VDAKYAK-7SM7-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;

VDAKYAK-7BM7-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;

VDAKYAK-7BM7-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;

VDAKYAK-7BM7-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;

VDAKYAK-7BM7-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;

VDAKYAK-7BM7-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK;

VDAKYAK-/BM/-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;

VDAKYAK-78/W7-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;

VDAKYAK-/BM7-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;

AEAKYAK-/B/W/-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; y

AD AK YAK-7BM7-DPSQSSE LLS EAKKL N DSQAPK;

^{e n l a s q u e} [B M ] es ^{u n m o t i v o d e u n i ó n a P D - L 1 c o m o s e d e f i n e e n u n o c u a l q u i e r a d e l o s í t e m s 1 - 2 5 .}

4 8 . P o l i p é p t i d o d e u n i ó n a P D - L 1 d e a c u e r d o c o n u n o c u a l q u i e r a d e l o s í t e m s 1 - 4 7 , q u e c o m p r e n d e u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :

x v i i ) V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;

e n l a q u e [ B M ] e s u n m o t i v o d e u n i ó n a P D - L 1 c o m o s e d e f i n e e n u n o c u a l q u i e r a d e l o s í t e m s 1 - 2 5 ; y

x v i i i ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s u n 8 9 % d e i d e n t i d a d c o n l a s e c u e n c i a d e f i n i d a e n x v i i ) .

4 9 . P o l i p é p t i d o d e u n i ó n a P D - L 1 d e a c u e r d o c o n u n o c u a l q u i e r a d e l o s í t e m s 1 - 4 7 , q u e c o m p r e n d e u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :

x i x ) A E A K F A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;

x x ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s 8 9 % d e i d e n t i d a d c o n l a s e c u e n c i a d e f i n i d a e n x i x ) .

5 0 . P o l i p é p t i d o d e u n i ó n a P D - L 1 d e a c u e r d o c o n u n o c u a l q u i e r a d e l o s í t e m s 1 - 4 7 , q u e c o m p r e n d e u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :

^{x x i ) A E A K Y A K - [} B M ^{] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;}

x x i i ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s 8 9 % d e i d e n t i d a d c o n l a s e c u e n c i a d e f i n i d a e n x x i ) .

72. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquier ítem anterior, que es capaz de unirse a PD-L1 de manera tal que el valor de EC50 de la interacción sea como máximo 1 x 10-9 M, tal como máximo 1 x 10-10 M, tal como máximo 7 x 10-11 M.

73. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquier ítem anterior, en el que dicho PD-L1 es PD-L1 humano. 74. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquier ítem anterior que comprende aminoácidos adicionales en el extremo C terminal y/o N terminal.

75. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con el ítem 74, en el que dicho aminoácido adicional mejora la producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, acoplamiento o detección del polipéptido.

76. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquier ítem anterior en forma multimérica, que comprende al menos dos unidades de monómero del polipéptido de unión a PD-L1, cuyas secuencias de aminoácidos pueden ser iguales o diferentes.

77. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con el ítem 76, en el que dichas unidades de monómero del polipéptido de unión a PD-L1 se acoplan covalentemente entre sí.

78. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con el ítem 77, en el que las unidades de monómero del polipéptido de unión a PD-L1 se expresan como una proteína de fusión.

79. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 76-78, en forma dimérica.

80. Proteína de fusión o conjugado que comprende

- un primer resto que consiste en un polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquier ítem precedente; y - un segundo resto que consiste en un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada.

81. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el ítem 80, en el que dicha actividad biológica deseada es una actividad terapéutica.

82. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el ítem 80, en el que dicha actividad biológica deseada es una actividad de unión.

83. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el ítem 80, en el que dicha actividad biológica deseada es una actividad enzimática.

84. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el ítem 82, en el que dicha actividad de unión es la actividad de unión a albúmina que aumenta la semivida in vivo de la proteína de fusión o conjugado.

85. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el ítem 84, en el que dicho segundo resto comprende el dominio de unión a albúmina de la proteína estreptocócica G o un derivado del mismo.

86. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el ítem 82, en donde dicha actividad de unión actúa para bloquear una actividad biológica.

87. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el ítem 81, en donde el segundo resto es un polipéptido terapéuticamente activo.

88. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el ítem 87, en el que el segundo resto es un agente modificador de la respuesta inmune.

89. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con el ítem 87, en el que el segundo resto es un agente anticancerígeno.

90. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 80-83 y 86-89, en el que el segundo resto se selecciona del grupo que consiste en enzimas endógenas humanas, hormonas, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas y linfocinas.

91. Proteína de fusión de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 80-91, en los que el segundo resto comprende, además, un enlazador.

92. Complejo, que comprende al menos un polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con uno cualquiera de los ítems anteriores y al menos un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

93. Complejo de acuerdo con el ítem 92, en el que dicho al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos de longitud completa, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fc, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), (scFv)2 y anticuerpos de dominio.

94. Complejo de acuerdo con el ítem 93, en el que dicho al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos de longitud completa, fragmentos Fab y fragmentos scFv.

95. Complejo de acuerdo con el ítem 94, en el que dicho al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de longitud completa.

96. Complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 92-95, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

97. Complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 92-96, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

98. Complejo de acuerdo con el ítem 97, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

99. Complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 92-98, en el que dicho polipéptido de unión a PD-L1 se une al extremo C o al extremo N de la cadena pesada o la cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

100. Complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 92-99, que comprende, además, un enlazador.

101. Complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 92-100, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene afinidad por un antígeno, por ejemplo, un antígeno asociado con una enfermedad infecciosa, o un antígeno asociado con cáncer.

102. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 79-90 o complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 92-101, en el que dicho segundo resto o dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un inhibidor seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de:

PD-1, CTLA-4, inmunoglobulina de células T y mucina que contiene proteína-3 (TIM-3), galectina-9 (GAL-9), gen-3 de activación de linfocitos (LAG-3), PD-L2, homólogo 3 de B7 (B7-H3), homólogo 4 de B7 (B7-H4), supresor de Ig del dominio V de la activación de células T (VISTA), molécula 1 de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM1), atenuador de linfocitos B y T (BTLA), receptor 1 del factor estimulante de colonias (CSF1R), mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), receptor tipo inmunoglobulina de célula asesina (KIR), adenosina, receptor de adenosina A2a (A2aR), CD200-CD200R y dominio ITIM e Ig de células T.

103. Proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con el ítem 102, en el que dicho segundo resto, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un inhibidor de PD-1, tal como un inhibidor seleccionado del grupo que consiste en nivolumab, pidilizumab, BMS 936559, MPDL328OA y pembrolizumab, tal como pembrolizumab.

104. Proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con el ítem 102, en el que dicho segundo resto, fragmento de unión a anticuerpo o antígeno del mismo es un inhibidor de CTLA-4, tal como un inhibidor seleccionado del grupo que consiste en belatacept, abatacept e ipilimumab, tal como ipilimumab.

105. Proteína de fusión o conjugado de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 80-91 o complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 92-101, en el que dicho segundo resto o fragmento de unión a anticuerpo o antígeno del mismo es un agonista seleccionado del grupo que consiste en agonistas de CD134, CD40, 4-1BB y proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR).

106. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 1-105, que comprende, además, una etiqueta.

107. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con el ítem 106, en el que dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en metales y tintes fluorescentes, tintes cromóforos, compuestos quimioluminiscentes y proteínas bioluminiscentes, enzimas, radionucleidos, partículas radiactivas y etiquetas de reconocimiento de predireccionamiento.

108. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con el ítem 107, que comprende un entorno quelante proporcionado por un quelante de poliaminopolicarboxilato conjugado con el polipéptido de unión a PD-L1 mediante un grupo tiol de un residuo de cisteína o un grupo amina de un residuo de lisina.

109. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con el ítem 106, que comprende una etiqueta de reconocimiento de predireccionamiento que forma parte de un par complementario de restos de predireccionamiento, por ejemplo seleccionados de stept(avidina)/biotina, oligonucleótido/oligonucleótido complementario tales como ADN/ADN complementario, a Rn/ARN complementario, ácido nucleico de fosforotioato/ácido nucleico de fosforotioato complementario y ácido nucleico de péptido/ácido nucleico de péptido complementario y morfolinos/morfolinos complementarios.

110. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con el ítem 109, en el que dicha etiqueta de reconocimiento de predireccionamiento es una etiqueta de ácido nucleico de péptido.

111. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 110, en el que dicha etiqueta de reconocimiento de predireccionamiento es una secuencia de ácido nucleico de péptido de 10-20 mer, tal como una secuencia de ácido nucleico peptídico de 15 mer.

112. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 1-105.

113. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con el ítem 112.

114. Célula huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con el ítem 113.

115. Procedimiento para producir un polipéptido de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 1-105, que comprende

- cultivar una célula huésped de acuerdo con el ítem 114 bajo condiciones permisivas de expresión de dicho polipéptido a partir de dicho vector de expresión, y

- aislar dicho polipéptido.

116. Composición que comprende un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 1-111 y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. 117. Composición de acuerdo con el ítem 116, que comprende, además, al menos un agente activo adicional, tal como un agente seleccionado de un agente modificador de la respuesta inmune y un agente anticancerígeno.

118. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 1-111 o una composición de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 116-117 para administración oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o por supositorios, tal como para administración tópica.

119. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 1-111 o una composición de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 116-117 para uso como un medicamento, un agente de diagnóstico y/o un agente de pronóstico.

120. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar de acuerdo con el ítem 119 como un medicamento.

121. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar de acuerdo con el ítem 119 como un agente de diagnóstico y/o un agente de pronóstico.

122. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar como un medicamento de acuerdo con el ítem 120, en el que dicho polipéptido, proteína de fusión, conjugado o composición modula la función PD-L1 ^{in vivo.}

123. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 119-121 en el tratamiento, pronóstico o diagnóstico de un trastorno relacionado con PD-L1.

124. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar de acuerdo con el ítem 122, en el que dicho trastorno relacionado con PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en enfermedades infecciosas y cánceres.

125. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar de acuerdo con el ítem 124, en el que dicho trastorno relacionado con PD-L1 es una enfermedad infecciosa, tal como una infección viral crónica, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (^vH^b) y virus de la hepatitis C (V^hC).

126. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar de acuerdo con el ítem 124, en el que dicho trastorno relacionado con PD-L1 es cáncer, tal como un cáncer seleccionado del grupo que consiste en:

- cánceres que manifiestan tumores sólidos, por ejemplo seleccionados del grupo que consiste en cáncer de piel, tal como melanoma y cáncer de piel no melanoma (NMSC); cánceres de pulmón, tales como cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC); cáncer de cabeza y cuello; carcinoma de células renales (RCC); cáncer de vejiga; cáncer de mama; cáncer colorrectal; cáncer gástrico; cáncer de ovarios; cáncer pancreático; cáncer de próstata; glioma glioblastoma; carcinoma de hígado; cáncer de vesícula biliar; cáncer de tiroides; cáncer de hueso; cáncer cervical; cáncer uterino; cáncer de vulva; cáncer endometrial; cáncer testicular; cáncer de riñón; carcinoma esofágico; cánceres de cerebro/CNS; cánceres neuronales; mesotelioma; sarcomas; adenocarcinoma de intestino delgado; y tumores malignos pediátricos; y

- cánceres que manifiestan tumores no sólidos, por ejemplo, leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda y mieloma múltiple.

127. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para usar de acuerdo con el ítem 126, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, RCC, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer pancreático y cáncer de próstata, tal como seleccionado del grupo que consiste en melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, RCC y cáncer de vejiga.

128. Procedimiento de tratamiento de un trastorno relacionado con PD-L1, que comprende administrar a un sujeto que necesite del mismo una cantidad eficaz de un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 1-111 o una composición de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 116 117.

129. Procedimiento de acuerdo con el ítem 128, en el que dicho trastorno relacionado con PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en enfermedad infecciosa y cáncer.

130. Procedimiento de acuerdo con el ítem 129, en el que dicho trastorno relacionado con PD-L1 es una enfermedad infecciosa, tal como una infección viral crónica, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), virus de la hepatitis B (HBV) y virus de la hepatitis C (HCV).

131. Procedimiento de acuerdo con el ítem 129, en el que dicho trastorno relacionado con PD-L1 es cáncer, tal como un cáncer seleccionado del grupo que consiste en:

132. Procedimiento de acuerdo con el ítem 131, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, RCC, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer pancreático y cáncer de próstata, tal como seleccionado del grupo que consiste en melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, RCC y cáncer de vejiga.

133. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 131-132, que comprende las etapas de:

- poner en contacto al sujeto con un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 109-111 que comprende una etiqueta de reconocimiento de predireccionamiento, o con una composición que comprende dicho polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo, y

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido de unión a PD-L1, que comprende un motivo de unión a PD-L1 BM, motivo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

i) ERNX₄AAX₇EIL XiILPNLX16X17X18QX20 WAFIWX26LX28D

en la que, independientemente uno del otro,

X4 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X7 se selecciona de A, E, F, H, N, Q, S, T, V, W y Y;

se selecciona de A, D, E, F, H, K, L, N, Q, R, S, T, V, W y Y;

X16 se selecciona de N y T;

X17 se selecciona de A, H, K, N, Q, R y S;

X18 se selecciona de A, D, E, G, H, K, L, N, Q, R, S, T, V y Y;

X20 se selecciona de H, 1, K, L, N, Q, R, T, V y Y;

X26 se selecciona de K y S; y

X28 se selecciona de A, D y E;

Y

2. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia i) corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-808, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-24, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 4, 5 y 21, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1 y 2.

3. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho motivo de unión a PD-L1 forma parte de un dominio proteico de haz de tres hélices.

4. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un módulo de unión BMod, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de:

iii) K-[BM]-DPSQSX_aXbLLX_cEAKKLX_dX_eX_fQ;

en la que

[BM] es un motivo de unión a PD-L1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-2;

X_ase selecciona de A y S;

Xb se selecciona de N y E;

X_cse selecciona de A, S y C;

Xd se selecciona de E, N y S;

X_ese selecciona de D, E y S; y

X_fse selecciona de A y S; y

5. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

xvii) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

en la que [BM] es un motivo de unión a PD-L1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-2; y xviii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 89 % de identidad con la secuencia definida en xvii).

6. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

xxi) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

en la que [BM] es un motivo de unión a PD-L1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-2; y xxii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 89 % de identidad con la secuencia definida en xxi).

7. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en el que la secuencia xvii) o xxi) corresponde a la secuencia desde la posición 1 hasta la posición 58 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1-814, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-93 y 811-813, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-24 y 811-813, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 21, 811 y 812, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO:1 y 2 o SEQ ID NO:811 y 812.

8. Polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es

- capaz de bloquear la señalización dependiente de PD-L1, por ejemplo, de manera tal que la concentración inhibitoria media máxima (1050) del bloqueo sea como máximo 5 x 10^-8M, tal como máximo 1 x 10^-8M, tal como máximo 5 x 10^-9M, tal como máximo 3,5 x 10^-9M, tal como máximo 1 x 10^-9M, tal como máximo 5 x 10^-1° M, tal como máximo 1 x 10^-1° M; y/o

- capaz de bloquear la interacción de PD-L1 con PD-1; y/o

- capaz de unirse a PD-L1 de modo que el valor de K_Dde la interacción es como máximo 2 x 10^-8M, tal como máximo 1 x 10^-8M, tal como máximo 1 x 10^-9M, tal como máximo 5 x 10^-1° M, tal como máximo 3 x 10^-1° M.

9. Proteína de fusión o conjugado que comprende

 un primer resto que consiste en un polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores; y

 un segundo resto que consiste en un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada.

10. Complejo, que comprende al menos un polipéptido de unión a PD-L1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y al menos un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

11. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10. 0. Composición que comprende un polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

1. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado o complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o una composición de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso como un medicamento, un agente de diagnóstico y/o un agente de pronóstico.

2. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho polipéptido, proteína de fusión, conjugado o composición modula la función de PD-L1 in vivo.

3. Polipéptido de unión a PD-L1, proteína de fusión, conjugado, complejo o composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-14 en el tratamiento, pronóstico o diagnóstico de un trastorno relacionado con PD-L1, tal como un trastorno relacionado con PD-L1 seleccionado del grupo que consiste en enfermedades

infecciosas y cánceres.