ES2770424T3

ES2770424T3 - Ratones ADAM6

Info

Publication number: ES2770424T3
Application number: ES14154967T
Authority: ES
Inventors: Lynn Macdonald; Sean Stevens; Andrew J Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2020-07-01
Anticipated expiration: 2032-02-24
Also published as: US20180346599A1; PL2738258T5; SI2550363T1; CN103429746B; HUE046746T2; DK2578688T1; EP2550363A1; PT2738258T; IN2013CN07629A; SI2738258T2; US20180362663A1; EP2738258B2; HUE062552T2; JP2022071051A; US20150210776A1; SI2578688T1; DK2738258T4; CN103429746A; RU2016109443A3; ME03732B

Abstract

Un ratón que expresa anticuerpos, en el que cada cadena pesada en los anticuerpos expresados comprende una región variable humana y una región constante de ratón, en donde el ratón expresa también: (i) una proteína ADAM6a de ratón o un ortólogo o unhomólogo de la misma que es funcional en un ratón macho; y (ii) una proteína ADAM6b de ratón o un ortólogo o un homólogo de la misma que es funcional en un ratón macho, en donde las proteínas ADAM6a y ADAM6b o los ortólogos o los homólogos de las mismas se expresan a partir de una secuencia de ácido nucleico integrada que está presente dentro del locus endógeno de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón que comprende al menos un segmento VH humano, al menos un segmento DH humano y al menos un segmento JH humano, en donde el ratón carece de un gen Adam6 endógeno funcional.

Description

DESCRIPCIÓN

Ratones ADAM6

Campo de la invención

Se describen ratones, células, embriones, y tejidos genéticamente modificados que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un locus de ADAM6 funcional. Las modificaciones incluyen loci de inmunoglobulina humanos y/o humanizados. Se describen ratones que carecen de un gen ADAM6 endógeno funcional pero que comprenden una función de ADAM6, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica una proteína ADAM6. Se describen ratones macho genéticamente modificados que comprenden una modificación de un locus VH de inmunoglobulina endógeno que vuelve a los ratones incapaces de fabricar una proteína ADAM6 funcional y da como resultado una pérdida de fertilidad, y que comprende además la función de ADAM6 en los ratones macho, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópica que restaura la fertilidad en los ratones macho.

Antecedentes de la invención

Se conocen en la técnica ratones que contienen genes de anticuerpos humanos. Las aplicaciones farmacéuticas para anticuerpos en las dos últimas décadas han impulsado fuertemente la investigación acerca de la preparación de anticuerpos que son adecuados para su uso como agentes terapéuticos humanos. Los primeros agentes terapéuticos basados en anticuerpos, que se basaban en anticuerpos de ratón, no eran ideales como agentes terapéuticos humanos debido a que la administración repetida de anticuerpos de ratón a seres humanos da como resultado una inmunogenicidad puede confundir los regímenes de tratamiento a largo plazo. Se han desarrollado soluciones basadas en anticuerpos de ratón humanizantes que los hacen parecer más humanos y menos similares a los de ratón. Siguieron métodos para expresar secuencias de inmunoglobulina humana para uso en anticuerpos, la mayoría basados en la expresión in vitro de bibliotecas de inmunoglobulina humana en fagos, bacterias, o levaduras. Finalmente, se han hecho intentos de preparar anticuerpos humanos útiles a partir de linfocitos humanos in vitro, en ratones a los que se habían injertado células hematopoyéticas humanas, y en ratones transcromosómicos o transgénicos con loci de inmunoglobulina endógena desactivados. En los ratones transgénicos ha sido necesario desactivar los genes de inmunoglobulina de ratón endógenos para que los transgenes completamente humanos integrados aleatoriamente funcionen como el origen de las secuencias de inmunoglobulina expresadas en el ratón. Dichos ratones pueden fabricar anticuerpos humanos adecuados para el uso como agentes terapéuticos humanos, pero estos ratones presentan problemas sustanciales en sus sistemas inmunes. Estos problemas (1) hacen que los ratones sean poco prácticos para generar un repertorio de anticuerpos suficientemente diverso, (2) requieren el uso de extensas fijaciones de rediseño genético, (3) proporcionan un proceso de selección clonal subóptimo debido probablemente a la incompatibilidad entre elementos humanos y de ratón, y (4) convierten a estos ratones en una fuente no fiable de poblaciones grandes y diversas de secuencias variables humanas necesarias para ser verdaderamente útiles para preparar agentes terapéuticos humanos.

Sigue existiendo una necesidad en la técnica para crear ratones genéticamente modificados que sean útiles en la generación de secuencias de inmunoglobulina, incluyendo secuencias de anticuerpos humanos. Sigue existiendo también una necesidad de ratones que puedan reordenar segmentos génicos de la inmunoglobulina para formar genes de la inmunoglobulina reordenados útiles, o que puedan fabricar proteínas a partir de loci de inmunoglobulina alterados, reduciendo o eliminando al mismo tiempo cambios perjudiciales que puedan ser el resultado de las modificaciones genéticas.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, se proporcionan células y ratones para crear ratones que comprenden una modificación que da como resultado una proteína ADAM 6 o un gen ADAM 6 de ratón endógeno no funcional (por ejemplo, una inactivación génica o una deleción en un gen ADAM6 endógeno), en el que los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que sea funcional en un ratón macho.

Se describen construcciones de ácidos nucleicos, células, embriones, ratones, y métodos para crear ratones que comprenden una modificación de un locus endógeno de inmunoglobulina de ratón, en el que los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que sea funcional en un ratón macho. El locus endógeno de la inmunoglobulina de ratón puede ser un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina, y la modificación puede reducir o eliminar la actividad de ADAM6 de una célula o tejido de un ratón macho.

Se describen ratones que comprenden una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma; se proporcionan ratones que comprenden una secuencia de nucleótidos endógena que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma, y al menos una modificación genética de un locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina.

Se describen métodos para crear ratones que comprenden una modificación de un locus endógeno de inmunoglobulina de ratón, en el que los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que sea funcional en un ratón macho. Se pueden obtener ratones de acuerdo con la invención, por ejemplo, mediante los métodos descritos en el presente documento.

Se describen métodos para crear ratones que comprenden una modificación genética de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en el que la aplicación de los métodos da como resultado ratones macho que comprenden un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina (o una de sus deleciones), y los ratones macho pueden generar progenie mediante apareamiento. Los ratones macho pueden producir esperma que puede atravesar un útero de ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón.

Se describen métodos para crear ratones que comprenden una modificación genética de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en el que la aplicación de los métodos da como resultado ratones macho que comprenden un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina (o una de sus deleciones), y los ratones macho presentan una reducción de la fertilidad, y los ratones comprenden una modificación genética que restaura en todo o en parte la reducción de la fertilidad. La reducción de la fertilidad puede caracterizarse por una incapacidad del esperma de los ratones macho para migrar desde un útero de ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón. La reducción de la fertilidad puede caracterizarse por un esperma que presenta un defecto de migración in vivo. La modificación genética que restaura en todo o en parte la reducción de la fertilidad puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón o el ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho.

La modificación genética puede comprender sustituir los loci variables de la cadena pesada de inmunoglobulina endógena por los loci variables de la cadena pesada de inmunoglobulina de otras especies (por ejemplo, una especie no humana). La modificación genética puede comprender la inserción de los loci de la cadena pesada de inmunoglobulina ortóloga en los loci variables de la cadena pesada de inmunoglobulina endógena. La especie puede ser un ser humano. La modificación genética puede comprender la deleción de un locus variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina endógena en todo o en parte, en el que la deleción da como resultado una pérdida de la función endógena de ADAM6. La pérdida de la función de ADAM6 endógena puede asociarse con una reducción de la fertilidad en ratones macho.

Se describen ratones que comprenden una modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 de ratón de un alelo endógeno de ADAM6 de tal manera que un ratón macho que tiene la modificación presenta una fertilidad reducida (por ejemplo, una capacidad muy reducida para generar progenie mediante apareamiento), o no es esencialmente fértil, debido a la reducción o eliminación de la función de ADAM6 endógena, en el que los ratones comprenden además una secuencia ectópica de ADAM6 o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma. La modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 de ratón puede ser una modificación (por ejemplo, una inserción, una deleción, una sustitución, etc.) en un locus de inmunoglobulina de ratón.

La reducción o pérdida de la función de ADAM6 puede comprender una incapacidad o incapacidad sustancial del ratón para producir esperma que pueda viajar desde un útero de ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un ovario de ratón. Al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de los espermatozoides producidos en un volumen eyaculado del ratón puede ser incapaz de viajar a través de un oviducto in vivo tras la cópula y fertilizar un óvulo de ratón.

La reducción o pérdida de la función de ADAM6 puede comprender una incapacidad para formar o una incapacidad sustancial para formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 sobre la superficie de un espermatozoide del ratón. La pérdida de la función de ADAM6 puede comprender una incapacidad sustancial para fertilizar un ovario de ratón mediante cópula con un ratón hembra.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional, y comprende una proteína (o una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica una proteína) que confiere funcionalidad ADAM6 en el ratón. En una realización, el ratón es un ratón macho y la funcionalidad comprende una fertilidad aumentada en comparación con un ratón que carece de un gen ADAM 6 endógeno funcional.

La proteína está codificada por una secuencia genómica localizada en un locus de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. El locus de inmunoglobulina es un locus de la cadena pesada. En una realización específica, el locus de la cadena pesada comprende al menos una V^hhumana, al menos una D^hhumana y al menos un segmento del gen J^h.

En una realización, el ratón comprende una cadena ligera humana o una quimera de ser humano/ratón o una quimera de ser humano/rata (por ejemplo, variable humana, constante de ratón o rata) y una quimera variable humana/de ratón o una cadena pesada constante de rata. En una realización específica, el ratón comprende un transgén que comprende una quimera variable humana/de rata o un gen de la cadena ligera constante de ratón unido de manera operativa a un promotor transcripcionalmente activo, por ejemplo, un promotor ROSA26. En una realización específica adicional, la quimera humana/de ratón o el transgén de la cadena ligera de rata comprende una secuencia de la región variable de la cadena humana reordenada en la línea germinal del ratón.

La secuencia ectópica de nucleótidos está localizada en un locus de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. El locus de inmunoglobulina es un locus de la cadena pesada. El locus de la cadena pesada comprende al menos una V^hhumana, al menos una D^hhumana y al menos un segmento del gen J^hhumano.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional, en el que el ratón comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que complementa la pérdida de la función de ADAM6 de ratón. En una realización, la secuencia ectópica de nucleótidos confiere al ratón la capacidad de producir progenie que es comparable con la correspondiente a un ratón silvestre que incluye un gen ADAM6 endógeno funcional. En una realización, la secuencia confiere al ratón capacidad para formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 sobre la superficie de un espermatozoide del ratón. En una realización, la secuencia confiere al ratón capacidad de viajar desde un útero de ratón a través del oviducto de ratón a un óvulo de ratón para fertilizar el óvulo.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos produce al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 % del número de crías que un ratón de tipo silvestre de la misma edad y raza produce en un periodo de tiempo de seis meses.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos produce al menos aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, o aproximadamente 10 veces o más progenie cuando se reproduce durante un periodo de tiempo de seis meses que un ratón de la misma edad y misma raza o similar que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia ectópica de nucleótidos, que se reproduce durante sustancialmente el mismo periodo de tiempo y esencialmente en las mismas condiciones.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos produce un promedio de al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, o un número mayor de 4 veces de crías por camada en un periodo de cría de 4 o 6 meses que un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia ectópica de nucleótidos, y que se reproduce durante el mismo periodo de tiempo.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos es un ratón macho, y el ratón macho produce esperma que, cuando se recupera de los oviductos aproximadamente 5-6 horas después de la cópula, refleja una migración desde el oviducto que es al menos de 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, 100 veces, 110 veces, o 120 veces o más que un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia ectópica de nucleótidos.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos, cuando copula con un ratón hembra, genera un esperma que puede atravesar el útero y penetrar y atravesar el oviducto en aproximadamente 6 horas con una eficacia que es aproximadamente igual a la del esperma de un ratón de tipo silvestre.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos produce al menos aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, o aproximadamente 4 veces o más crías en un periodo comparable de tiempo que un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia ectópica de nucleótidos.

Se describe un ratón que comprende en su línea germinal una secuencia de ácido nucleico no de ratón que codifica una proteína inmunoglobulina, en el que la secuencia de inmunoglobulina no de ratón comprende una inserción de un gen ADAM6 de ratón o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma. La secuencia de inmunoglobulina no de ratón puede comprender una secuencia de inmunoglobulina humana. La secuencia puede comprender una secuencia de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana. La secuencia puede comprender una secuencia de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana. La secuencia puede comprender uno o más segmentos génicos V, uno o más segmentos génicos D, y uno o más segmentos génicos J; en una realización, la secuencia comprende uno o más segmentos génicos V y uno o más segmentos génicos J. Los uno o más segmentos génicos V, D, y J, o uno o más segmentos génicos V y J, pueden no estar reordenados. Los uno o más segmentos génicos V, D, y J, o uno o más segmentos génicos V y J, pueden estar reordenados. Tras la reordenación de los uno o más segmentos génicos V, D, y J, o uno o más segmentos génicos V y J, el ratón puede comprender en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón o el homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. Tras la reordenación, el ratón puede comprender en su genoma al menos dos secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen ADAM6 de ratón o el homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. Tras la reordenación, el ratón puede comprender en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón o el homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. El ratón puede comprender el gen ADAM6 o el homólogo u ortólogo o el fragmento funcional del mismo en un linfocito B. El ratón puede comprender el gen ADAM6 o el homólogo u ortólogo o el fragmento funcional del mismo en un linfocito que no sea un linfocito B.

En un aspecto, se proporcionan ratones que expresan una región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana o fragmento funcional de la misma procedente de un locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en el que los ratones comprenden una actividad de ADAM6 que es funcional en un ratón macho.

En una realización, los ratones macho comprenden un alelo ADAM6 endógeno no modificado individualmente u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo en un locus de ADAM6 endógeno.

En una realización, el ratón macho comprende una secuencia ectópica de ADAM6 de ratón o el homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma que codifica una proteína que confiere la función de ADAM6.

En una realización, los ratones macho comprenden una secuencia de ADAM6 o el homólogo u ortólogo o el fragmento funcional de la misma en una localización del genoma de ratón que se parece a la localización del alelo endógeno de ADAM6, por ejemplo, en 3' de la secuencia final del segmento del gen V y en 5' del segmento inicial del gen D.

En una realización, los ratones macho comprenden una secuencia ectópica de ADAM6 o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma flanqueado en la dirección 5', la dirección 3', o la dirección 5' y la dirección 3' (con respecto a la dirección de transcripción de la secuencia de ADAM6) de una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento génico variable de la inmunoglobulina. El segmento génico variable de inmunoglobulina es un segmento de gen humano. En una realización, la secuencia que codifica la ADAM6 de ratón o el ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma está entre los segmentos génicos V humanos; en una realización, el ratón comprende dos o más segmentos génicos V humanos, y la secuencia está situada entre el segmento final del gen V y el penúltimo segmento del gen V; en una realización, la secuencia está situada tras el segmento final del gen V y el primer segmento del gen D.

En un aspecto, se proporciona un ratón macho que carece de un gen ADAM6 endógeno no funcional, o una deleción en un gen ADAM6 endógeno, en su línea germinal; en el que los espermatozoides del ratón pueden transitar a través del oviducto de un ratón hembra y fertilizar un óvulo. En una realización, los ratones comprenden un gen ADAM6 de ratón ectópico o el ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una modificación genética que reduce la función endógena de ADAM6 de ratón, en el que el ratón comprende al menos alguna funcionalidad de ADAM6 proporcionada mediante la expresión de una secuencia ectópica que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma que es funcional en un ratón macho.

En una realización, los ratones comprenden una función de ADAM6 suficiente para conferir a los ratones macho la capacidad de generar progenie mediante apareamiento, en comparación con ratones macho que carecen de ADAM6 funcional. En una realización, la función de ADAM6 se transmite mediante la presencia de una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica una ADAM6 de ratón o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma. Los homólogos u ortólogos de ADAM6 o sus fragmentos que son funcionales en un macho de ratón incluyen aquellos que restauran, en todo o en parte, la pérdida de capacidad para generar progenie observada en un ratón macho que carece de actividad endógena de ADAM6 de ratón suficiente, por ejemplo, la pérdida de capacidad observada en un ratón ADAM6 inactivado genéticamente. En este sentido, los ratones ADAM6 inactivados genéticamente incluyen ratones que comprenden un locus endógeno o un fragmento del mismo, pero que no es funcional, es decir, que no expresa ADAM6 (ADAM6a y/o ADAM6b) en ningún caso, o que expresa ADAM6 (ADAM6a y/o ADAM6b) a un nivel que es insuficiente para soportar una capacidad esencialmente normal para generar la progenie de un ratón macho de tipo silvestre. La pérdida de la función puede deberse, por ejemplo, a una modificación en un gen estructural del locus (es decir, en una región de codificación de ADAM6a o ADAM6b) o en una región reguladora del locus (por ejemplo, en una secuencia en 5' del gen ADAM6a, o en 3' de la región de codificación de ADAM6a o ADAm6b, en el que la secuencia controla, en todo o en parte, la transcripción de un gen ADAM6, la expresión de un ARN de ADAM6, o la expresión de una proteína ADAM6). En varias realizaciones, los ortólogos u homólogos o sus fragmentos que son funcionales en un macho de ratón son aquellos que permiten que el esperma de un macho de ratón (o una mayoría de espermatozoides en el eyaculado de un ratón macho) transite por el oviducto de un ratón y fertilice un óvulo de ratón.

En una realización, los ratones macho que expresan la región variable de la inmunoglobulina humana o sus fragmentos funcionales comprenden una actividad de ADAM6 suficiente para conferir a los ratones macho la capacidad de generar progenie mediante apareamiento con un ratón hembra y, en una realización, los ratones macho presentan una capacidad de generar progenie mediante apareamiento que en una realización es al menos del 25 %, en una realización, al menos del 30 %, en una realización al menos del 40 %, en una realización al menos del 50 %, en una realización al menos del 60 %, en una realización al menos del 70 %, en una realización al menos del 80 %, en una realización al menos del 90 %, y en una realización aproximadamente la misma que la de los ratones con uno o dos alelos endógenos de ADAM6 no modificados.

En una realización, los ratones macho expresan suficiente ADAM6 (o un ortólogo u homólogo o sus fragmentos funcionales) para permitir que un espermatozoide de ratón macho atraviese el oviducto de un ratón hembra.

En un aspecto, se proporcionan ratones genéticamente modificados y células que comprenden una modificación de un locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina, en el que los ratones expresan al menos una parte de una secuencia de la cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, al menos una parte de una secuencia humana, en el que los ratones comprenden una actividad de ^aD^aM6 que es funcional en un ratón macho. La modificación erradica la actividad de ADAM6 del ratón. El ratón puede estar modificado de tal manera que ambos alelos que codifican la actividad de ADAM6 bien están ausentes o bien expresan una ADAM6 que no funciona sustancialmente para soportar el apareamiento normal en un macho de ratón. El ratón comprende además una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma.

Se describen ratones genéticamente modificados y células que comprenden una modificación de un locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la modificación reduce o elimina la actividad de ADAM6 expresada a partir de una secuencia de ADAM6 del locus, y en el que los ratones comprenden una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma. La proteína ADAM6 o el fragmento funcional de la misma pueden estar codificados por una secuencia ectópica de ADAM6. La proteína ADAM6 o el fragmento de la misma pueden expresarse a partir de un alelo endógeno de ADAM6. El ratón puede comprender un primer alelo de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende una primera modificación que reduce o elimina la expresión de una ADAM6 funcional procedente del primer alelo de la cadena pesada de inmunoglobulina, y el ratón comprende un segundo alelo de la cadena pesada de la inmunoglobulina que comprende una primera modificación que no reduce o elimina sustancialmente la expresión de una ADAM6 funcional procedente del segundo alelo de la cadena pesada de inmunoglobulina.

La segunda modificación puede localizarse en 3' (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento del gen V) de un segmento final del gen V de ratón y localizarse en 5' (con respecto a la dirección de la transcripción de la secuencia constante) del gen de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina de un ratón (o quimera de ser humano/ratón) o de su fragmento (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica: C^h1 y/o la región bisagra y/o Ch2 y/o Ch3 de un ser humano y/o ratón).

La modificación puede ser en un primer alelo de la cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus que codifica un primer alelo de ADAM6, y la función de ADAM6 es resultado de la expresión de una ADAM6 endógena en un segundo alelo de la cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus funcional que codifica una ADAM6 funcional, en el que el segundo alelo de la cadena pesada de inmunoglobulina comprende al menos una modificación de un segmento del gen V, D, y/o J. La al menos una modificación del segmento del gen V, D, y/o J puede ser una deleción, una sustitución con un segmento del gen V, D, y/o J humano, una sustitución con un segmento del gen V, D, y/o J de camélido, una sustitución con un segmento del gen V, D, y/o J de camélido, una sustitución de una secuencia de la cadena pesada por una secuencia de la cadena ligera, y una de sus combinaciones. La al menos una modificación puede ser la deleción de uno o más segmentos génicos V, D, y/o J de la cadena pesada y la sustitución con uno o más segmentos génicos V y/o J de la cadena ligera (por ejemplo, un segmento del gen V y/o J de la cadena ligera humana) en los locus de la cadena pesada.

La modificación puede ser en un primer alelo de la cadena pesada de la inmunoglobulina en un primer locus y en un segundo alelo de la cadena pesada de la inmunoglobulina en un segundo locus, y la función de ADAM6 puede ser resultado de la expresión de una ADAM6 ectópica en un locus no de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. El locus no de inmunoglobulina puede ser el locus ROSA26. El locus no de inmunoglobulina puede ser transcripcionalmente activo en un tejido reproductor.

Se describe un ratón que comprende un ADAM6 heterocigótico u homocigótico inactivado genéticamente. El ratón puede comprender además una secuencia de inmunoglobulina modificada que es una secuencia de inmunoglobulina humana o humanizada, o una secuencia de inmunoglobulina de camélido o camelizada, de ser humano o de ratón. La secuencia de inmunoglobulina modificada puede estar presente en el locus endógeno de la inmunoglobulina de la cadena pesada de ratón. La secuencia de inmunoglobulina modificada puede comprender una secuencia génica de la región variable de la cadena pesada humana en un locus endógeno de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. La secuencia génica de la región variable de la cadena pesada humana puede sustituir una secuencia endógena de la región variable de la cadena pesada de ratón en el locus endógeno de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón.

Se describe un ratón incapaz de expresar una ADAM6 endógena funcional de ratón procedente de un locus de ADAM6 endógeno de ratón. El ratón puede comprender una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica una ADAM6, o un fragmento funcional de la misma, que es funcional en el ratón. La secuencia de ácido nucleico ectópica puede codificar una proteína que rescata una pérdida en la capacidad de generar la progenie que tiene un macho de ratón que homocigótico con respecto a un ratón ADAM6 inactivado genéticamente. La secuencia de ácido nucleico ectópica puede codificar una proteína ADAM6 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un locus de ADAM6 endógeno funcional, y que comprende una secuencia de ácido nucleico ectópica que confiere la función ADAM6 al ratón. En una realización, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia endógena de ADAM6 de ratón o un fragmento funcional de la misma. En una realización, la secuencia endógena de ADAM6 de ratón comprende una secuencia que codifica ADAM6a y ADAM6b localizada en un ratón de silvestre entre el segmento 3' del gen V de la cadena pesada de inmunoglobulina (V^h) de la mayoría de ratones y el segmento 5' del gen D de la cadena pesada de la inmunoglobulina de la mayoría de ratones (DH).

La secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica ADAM6a o uno de sus fragmentos funcionales y/o una secuencia que codifica ADAM6b o uno de sus fragmentos funcionales. ADAM6a y/o ADAM6b o uno de sus fragmento(s) funcionales puede estar unido de manera operativa a un promotor. En una realización, el promotor es un promotor humano. En una realización, el promotor es el promotor de ADAM6 de ratón. En una realización específica, el promotor de ADAM6 comprende una secuencia localizada entre el primer codón del primer gen ADAM6 más cercano al segmento 5' de los D^hde la mayoría de los ratones y la secuencia de señalización de la recombinación del segmento 5' de los genes D^hde la mayoría de los ratones, en el que 5' está indicado con respecto a la dirección de la transcripción de los genes de la inmunoglobulina de ratón. En una realización, el promotor es un promotor vírico. En una realización específica, el promotor vírico es un promotor de citomegalovirus (CMV). En una realización, el promotor es un promotor de la ubiquitina.

En una realización, el promotor es un promotor inducible. En una realización, el promotor inducible regula la expresión en tejidos no reproductivos. En una realización, el promotor inducible regula la expresión en tejidos reproductivos. En una realización específica, la expresión de las secuencias de ADAM6a y/o ADAM6b o sus fragmento(s) funcionales se regula desde el punto de vista del desarrollo por el promotor inducible en tejidos reproductivos.

En una realización, los ratones ADAM6a y/o ADAM6b se seleccionan entre ADAM6a de SEC ID N°: 1 y /o ADAM6b de la secuencia SEC ID N°: 2. En una realización, el promotor ADAM6 de ratón es un promotor de la SEC ID N°: 3. En una realización específica, el promotor de ADAM6 de ratón comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID N°: 3 directamente en la dirección 5' (con respecto a la dirección de la transcripción de ADAM6a) del primer codón de ADAM6a y se extiende hasta el extremo de la SEC ID N°: 3 en la dirección 5' de la región de codificación de ADAM6. En otra realización específica, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende a partir de entre aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos en la dirección 5' del codón de inicio de ADAM6a hasta aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 2 kb, o 3 kb o más en la dirección 5' del codón de inicio de ADAM6a.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEC ID N°: 3 o uno de sus fragmentos, que cuando se coloca en un ratón que no es fértil o que tiene una fertilidad baja debido a la carencia de ADAM6, aumenta la fertilidad o restaura la fertilidad hasta aproximadamente la fertilidad de un ratón silvestre. En una realización, la SEC ID N°: 3 o uno de sus fragmentos confiere a un ratón macho la capacidad de producir un espermatozoide que puede atravesar el oviducto de un ratón hembra a fin de fertilizar un óvulo de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una deleción de una secuencia endógena de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6, una sustitución de un segmento endógeno del gen V^hde ratón con un segmento del gen V^hhumano, y una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En una realización, el ratón comprende un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una deleción de una secuencia endógena de nucleótidos del locus de la inmunoglobulina que comprende un gen de ADAM6 endógeno, comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más segmentos génicos de la inmunoglobulina humana, y donde la secuencia ectópica de nucleótidos que codifica la proteína ADAM6 humana está comprendida o es directamente adyacente a la secuencia de nucleótidos que codifica el uno o más segmentos génicos de la inmunoglobulina humana.

En una realización, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^H, y la secuencia ectópica de nucleótidos que codifica la proteína ADAM6 de ratón está comprendida, o es directamente adyacente a, la secuencia de nucleótidos que codifica el uno o más segmentos génicos V^Hhumanos. En una realización, el ratón comprende además una sustitución de uno o más segmentos endógenos del gen D^Hcon uno o más segmentos de los genes D^hen el locus endógeno del gen D^h.En una realización, el ratón comprende además una sustitución de uno o más segmentos endógenos del gen J^hcon uno o más segmento del gen J^hen el locus endógeno del gen J^h.En una realización, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^h, D^h, y J^hy una sustitución en los loci endógenos del gen V^h, D^h, y J^hcon segmentos génicos V^h, D^h, y J^h,en el que el ratón comprende una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En una realización específica, la secuencia ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón se coloca entre el penúltimo segmento 3' de la mayoría de genes V^hpresentes en los segmentos génicos V^hhumanos, y el último segmento 3' del gen V^hpresente en los segmentos génicos VH humanos. En una realización específica, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^h, y una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^h, y la secuencia ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón se coloca en la dirección 3' del segmento 1-2 del gen V^hhumano y en la dirección 5' del segmento 6-1 del gen V^hhumano.

En una realización específica, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^h, y la secuencia ectópica de nucleótidos que codifica la proteína ADAM6 de ratón está comprendida, o es directamente adyacente a, la secuencia de nucleótidos que codifica el uno o más segmentos génicos V^hhumanos. Se describe un ratón que comprende una modificación de un locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina, en el que el ratón expresa un linfocito B que comprende una secuencia reordenada de inmunoglobulina unida de manera operativa a una secuencia génica de la región constante de la cadena pesada, y el linfocito B comprende en su genoma (por ejemplo, en un cromosoma del linfocito B) un gen que codifica una ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. La secuencia de inmunoglobulina reordenada unida de manera operativa a la secuencia génica de la región constante de la cadena pesada puede comprender una secuencia V, D, y/o J de la cadena pesada humana; una secuencia V, D, y/o J de la cadena pesada de ratón; una secuencia V y/o J de la cadena ligera humana o de ratón. La secuencia génica de la región constante de la cadena pesada puede comprender una secuencia de la cadena pesada humana o de ratón seleccionada entre el grupo que consiste en C^h1, una bisagra, C^h2, C^h3, y una de sus combinaciones.

Se describe un ratón genéticamente modificado, en el que el ratón comprende un gen de la cadena ligera de la inmunoglobulina silenciado funcionalmente, y comprende además una sustitución de uno o más segmentos génicos endógenos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina, en el que el ratón carece de un locus de ADAM6 endógeno funcional, y en el que el ratón comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que expresa una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

Se describe un ratón que carece de un locus o secuencia de ADAM6 de ratón endógeno funcional y que comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica un locus de ADAM6 de ratón o un fragmento funcional de un locus o secuencia de ADAM6 de ratón, en el que el ratón puede aparearse con un ratón del sexo opuesto para producir una progenie que comprende el locus o secuencia ectópica de ADAM6. El ratón puede ser macho. El ratón puede ser hembra.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en el que el ratón comprende un segmento génico de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana en un locus génico endógeno de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, careciendo el ratón de una secuencia endógena de ADAM6 funcional en el locus génico endógeno de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, y en el que el ratón comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que expresa una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. La secuencia ectópica de nucleótidos que expresa la proteína ADAM6 de ratón está integrada en un locus de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa una secuencia de la cadena pesada de la inmunoglobulina procedente de un locus endógeno modificado de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, en el que la cadena pesada se deriva de un fragmento del gen V humano, un segmento del gen D, y un segmento del gen J, en el que el ratón comprende una actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una realización, el ratón comprende una pluralidad de segmentos génicos V humanos, una pluralidad de segmentos génicos D, y una pluralidad de segmentos J, En una realización, los segmentos génicos D son segmentos de los genes D humanos. En una realización, los segmentos de los genes J son segmentos de los genes J humanos. En una realización, el ratón comprende además una secuencia humanizada de la región constante de la cadena pesada, donde la inmunización comprende la sustitución de una secuencia seleccionada entre C^h1, bisagra, C^h2, C^h3, y una de sus combinaciones. En una realización específica, la cadena pesada se deriva de un fragmento del gen V humano, un segmento del gen D humano, un segmento del gen J humano, una secuencia CH1 humana, una secuencia bisagra humana o de ratón, una secuencia C^h2 de ratón, y una secuencia C^h3 de ratón. En otra realización específica, el ratón comprende además una secuencia de la región constante de la cadena ligera humana.

En una realización, el segmento del gen D está flanqueado en 5' (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento del gen D) por una secuencia que codifica una actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una realización, la actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón es el resultado de la expresión de una secuencia de nucleótidos localizada en 5' de los segmentos de los genes D situados más en dirección 5' y en 3' de los segmentos génicos V situados más en la dirección 3' (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento del gen V) del locus endógeno modificado de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón.

En una realización, la actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón es el resultado de la expresión de una secuencia de nucleótidos localizada entre los segmentos génicos V humanos en el locus endógeno modificado de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. En una realización, los dos segmentos génicos V humanos son el segmento 1-2 del gen Vh y el segmento 6-1 del gen Vh humano.

La secuencia de nucleótidos comprende una secuencia seleccionada procedente de una secuencia de ADAM6b de ratón o uno de sus fragmentos funcionales, y una secuencia de ADAM6a de ratón o uno de sus fragmentos funcionales.

En una realización, la secuencia de nucleótidos entre los dos segmentos génicos V humanos se coloca en una orientación opuesta a la transcripción con respecto a los segmentos génicos V humanos. En una realización específica, la secuencia de nucleótidos codifica, de 5' a 3' con respecto a la dirección de la transcripción de los genes ADAM6, y una secuencia de ADAM6a seguida por una secuencia de ADAM6b.

En una realización, el ratón comprende una sustitución de una secuencia del pseudogen ADAM6 humano entre los segmentos 1-2 de Vh y 6-1 de Vh del gen V humano con una secuencia de ADAM6 de ratón o uno de sus fragmentos funcionales.

En una realización, la secuencia que codifica la actividad de ADAM6 que es funcional en el ratón es una secuencia de ADAM6 de ratón o uno de sus fragmentos funcionales.

Se describe un ratón que comprende un segmento endógeno del gen DFL16.1 de ratón (por ejemplo, en un ratón heterocigótico para el locus endógeno modificado de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón), o un segmento 1-1 del gen D^hhumano. El segmento del gen D de la cadena pesada de la inmunoglobulina expresada por el ratón puede derivarse de un segmento endógeno del gen DFL16.1 de ratón o un segmento 1-1 del gen D^hhumano.

Se describe un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (o un homólogo u ortólogo o su fragmento funcional) en una célula que contiene ADN de un linaje no reordenado de linfocitos B, pero no comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica ADAM6 de ratón (o un homólogo u ortólogo o su fragmento funcional) en un linfocito B que comprende los loci reordenados de la inmunoglobulina, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica la ADAM6 de ratón (o un homólogo u ortólogo o su fragmento funcional) se produce en el genoma en una posición que es diferente de una posición en la que la ADAM6 de ratón aparece en un ratón silvestre. La secuencia de ácido nucleico que codifica la ADAM6 de ratón (o el homólogo u ortólogo o su fragmento funcional) puede estar presente en todas o sustancialmente todas las células que contienen el ADN que no son del linaje reordenado de linfocitos B; la secuencia del ácido nucleico puede estar presente en las células de la línea germinal del ratón, pero no en un cromosoma de un linfocito B reordenado.

Se describe un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una ADAM6 de ratón (o un homólogo u ortólogo o su fragmento funcional) en todas o sustancialmente todas las células que contienen el ADN, incluyendo los linfocitos B que comprenden los loci reordenados de la inmunoglobulina, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica la ADAM6 de ratón (o un homólogo u ortólogo o su fragmento funcional) se produce en el genoma en una posición que es diferente de una posición en la que la ADAM6 de ratón aparece en un ratón silvestre. La secuencia del ácido nucleico que codifica la ADAM6 de ratón (o el homólogo u ortólogo o su fragmento funcional) puede estar en un ácido nucleico que es contiguo al locus reordenado de la inmunoglobulina. El ácido nucleico que es contiguo al locus reordenado de la inmunoglobulina puede ser un cromosoma. El cromosoma puede ser un cromosoma que se encuentra en un ratón silvestre y el cromosoma comprende una modificación de un locus de la inmunoglobulina de ratón.

Se describe un ratón genéticamente modificado, en el que el ratón comprende un linfocito B que comprende en su genoma una secuencia de ADAM6 o un ortólogo o un homólogo de la misma. La secuencia de ADAM6 o un ortólogo u homólogo de la misma puede estar en un locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina. La secuencia de ADAM6 o un ortólogo u homólogo de la misma puede estar en un locus que no es un locus de la inmunoglobulina. La secuencia de ADAM6 puede estar en un transgén impulsado por un promotor heterólogo. El promotor heterólogo puede ser un promotor no de inmunoglobulina. Los linfocitos B pueden expresar una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo de la misma.

El 90 % o más de los linfocitos B del ratón pueden comprender un gen que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo de la misma o un homólogo de la misma o un fragmento de la misma que es funcional en el ratón. El ratón puede ser un ratón macho.

El genoma del linfocito B puede comprender un primer alelo y un segundo alelo que comprende la secuencia de ADAM6 o un ortólogo u homólogo de la misma. El genoma del linfocito B puede comprender un primer alelo pero no un segundo alelo que comprende la secuencia de ADAM6 o un ortólogo u homólogo de la misma.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una modificación en uno o más alelos endógenos de ADAM6.

Los ratones no pueden expresar una proteína ADAM6 funcional procedente de cada alelo endógeno de ADAM6, y los ratones comprenden una secuencia ectópica de ADAM6.

En una realización, los ratones no pueden expresar una proteína ADAM6 funcional procedente de cada alelo endógeno de ADAM6, y los ratones comprenden una secuencia ectópica de ADAM6 localizada en 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, o 120 o más kb en la dirección 5' (con respecto a la dirección de la transcripción del locus de la cadena pesada de ratón) de una secuencia de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. En una realización específica, la secuencia ectópica de ADAM6 está en el locus endógeno de la cadena pesada de la inmunoglobulina (por ejemplo, en una región V-D intergénica, entre dos segmentos génicos V, entre un segmento del gen V y el gen D, entre un segmento del gen D y el gen J, etc.). En una realización específica, la secuencia ectópica de ADAM6 está localizada en una secuencia intergénica de 90 a 100 kb entre el segmento final del gen V de ratón y el primer segmento del gen D de ratón. En otra realización específica, se elimina la secuencia endógena V-D intergénica de 90 a 100 kb, y la secuencia ectópica de ADAM6 se coloca entre el segmento final del gen V y el primer gen D.

Se describe un ratón macho estéril, en el que el ratón comprende una deleción de dos o más alelos endógenos de ADAM6. Se describe un ratón hembra que es portador de un rasgo de esterilidad del macho, en el que el ratón hembra comprende en su línea germinal un alelo no funcional de ADAM6 o un alelo endógeno de ADAM6 inactivado genéticamente.

Se describe un ratón que carece de un segmento endógeno del gen V, D, y J de la cadena pesada de la inmunoglobulina, donde una mayoría de los linfocitos B del ratón comprenden una secuencia de ADAM6 o un ortólogo u homólogo de la misma.

El ratón puede carecer de los segmentos génicos endógenos de la cadena pesad de la inmunoglobulina seleccionados entre dos o más segmentos génicos V, dos o más segmentos de los genes D, dos o más segmentos de los genes J, y una de sus combinaciones. El ratón puede carecer de los segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina seleccionados entre al menos uno y hasta al menos 89 segmentos génicos de V, al menos uno y hasta 13 segmentos génicos de D, al menos uno y hasta cuatro segmentos génicos de J, y una de sus combinaciones. El ratón puede carecer de un fragmento de ADN genómico del cromosoma 12 que comprende aproximadamente tres megabases del locus endógeno de la cadena pesada de la inmunoglobulina. El ratón puede carecer de todos los segmentos endógenos del gen V, D, y J de la cadena pesada. El ratón puede carecer de 89 segmentos del gen V^h, 13 segmentos de los genes D^hy cuatro segmentos de los genes J^h.

En un aspecto, se proporciona un ratón, en el que el ratón tiene un genoma en la línea germinal que comprende una modificación de un locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina, donde la modificación en el locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende la sustitución de una o más secuencias de la región variable de la inmunoglobulina de ratón con una o más secuencias de la región variable de la inmunoglobulina no de ratón, y en el que el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En una realización preferida, las secuencias D^hy J^hy al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 secuencias de VH del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina están sustituidas por secuencias de la región variable de la inmunoglobulina no de ratón. En una realización preferida adicional, las secuencias D^h, J^h, y todas las V^hdel locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina están sustituidas por secuencias de la región variable de la inmunoglobulina no de ratón. Las secuencias de la región variable de la inmunoglobulina no de ratón pueden no estar reordenadas. En una realización preferida, las secuencias de la región variable de la inmunoglobulina no de ratón comprenden las regiones D^hy J^hno reordenadas y al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 secuencias de V^hno reordenadas de especies no de ratón. En una realización preferida adicional, las secuencias de la región variable de la inmunoglobulina no de ratón comprenden la región variable completa, incluyendo todas las regiones V^h, D^h, y J^h, de las especies no de ratón. Las especies no de ratón pueden ser Homo sapiens y las secuencias de la región variable de la inmunoglobulina no de ratón pueden ser secuencias humanas.

Se describe un ratón que expresa un anticuerpo que comprende al menos un dominio variable humano/dominio constante no humano del polipéptido de la inmunoglobulina, en el que el ratón expresa una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo de la misma procedente de un locus diferente que el de un locus de la inmunoglobulina.

La proteína ADAM6 o el ortólogo u el homólogo de la misma se puede expresar en un linfocito B del ratón, en el que el linfocito B comprende una secuencia reordenada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de la región variable humana y una secuencia de la región constante no humana.

La secuencia de la región constante no humana puede ser una secuencia de roedor. El roedor se puede seleccionar entre un ratón, una rata, y un hámster.

Se describe un método para crear un ratón macho estéril, que comprende convertir en no funcional un alelo ADAM6 endógeno de una célula ES donante (o inactivar genéticamente dicho alelo), introducir la célula ES donante en un embrión hospedador, introducir el embrión hospedador en una madre sustituta, y dejar que la madre sustituta críe a la progenie derivada en todo o en parte de la célula ES donante. El método puede comprender además criar la progenie para obtener un ratón macho estéril.

Se describe un método para crear un ratón con una modificación genética de interés, en el que el ratón es estéril, comprendiendo el método las etapas de (a) crear una modificación genética de interés en un genoma; (b) modificar el genoma para inactivar genéticamente un alelo endógeno de ADAM6, o convertir en no funcional un alelo endógeno de ADAM6; y, (c) emplear el genoma en la creación de un ratón. El genoma puede proceder de una célula ES o se usa en un experimento de transferencia nuclear.

Se describe un ratón creado utilizando un vector director, una construcción de nucleótidos, o una célula tal como se describe en el presente documento.

Se describe una progenie procedente del apareamiento de un ratón tal como se describe en el presente documento con un segundo ratón que es un ratón silvestre o genéticamente modificado.

Se describe un método para mantener una raza de ratones, donde la raza de ratón comprende una sustitución de una secuencia de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón con una o más secuencias heterólogas de la cadena pesada de la inmunoglobulina. La una o más secuencias heterólogas de la cadena pesada de la inmunoglobulina pueden ser secuencias de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana.

La raza de ratón puede comprender una deleción de uno o más segmentos génicos V^h, D^h, y/o J^h. El ratón puede comprender además uno o más segmentos génicos V^hhumanos, uno o más segmentos de los genes D^hhumanos, y/o uno o más segmentos de los genes J^hhumanos. El ratón puede comprender al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 segmentos V^hhumanos, al menos 27 segmentos de los genes D^hhumanos, y al menos seis segmentos de los genes J^h. El ratón puede comprender al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 segmentos V^Hhumanos, los al menos 27 segmentos de los genes D^Hhumanos, y los al menos seis segmentos de los genes J^Hse unen de manera operativa a un gen de la región constante. El gen de la región constante puede ser un gen de la región constante de ratón. El gen de la región constante puede comprender una secuencia génica de la región constante de ratón seleccionado entre C^h1, una bisagra, C^H2, C^H3, y/o C^H4 o una de sus combinaciones.

Se describe un método que comprende generar un ratón macho heterocigótico para la sustitución de la secuencia pesada de la inmunoglobulina de ratón, y la reproducción del ratón macho heterocigótico con un ratón hembra silvestre o un ratón hembra que es homocigótico o heterocigótico para la secuencia de la cadena pesada humana. El método puede comprender mantener la raza criando repetidamente machos heterocigóticos con hembras que son silvestres u homocigóticas o heterocigóticas para la secuencia de la cadena pesada humana.

El método puede comprender obtener células de los ratones machos o hembras homocigóticos o heterocigóticos para la secuencia de la cadena pesada humana, y emplear dichas células como células donantes o los núcleos de las anteriores como núcleos donantes, y utilizar las células o los núcleos para criar animales genéticamente modificados utilizando células hospedadoras y/o gestando las células y/o los núcleos en madres sustitutas.

Solo los ratones macho que son heterocigóticos para la sustitución en el locus de la cadena pesada pueden reproducirse con ratones hembra. Los ratones hembra pueden ser homocigóticos, heterocigóticos, o silvestres con respecto al locus sustituido de la cadena pesada.

El ratón puede comprender además una sustitución de las secuencias de la región variable de la cadena ligera A y/o ^ken un locus endógeno de la cadena ligera de la inmunoglobulina con secuencias heterólogas de la cadena ligera de la inmunoglobulina. Las secuencias heterólogas de la cadena ligera de la inmunoglobulina pueden ser secuencias de la región variable de la cadena ligera A y/o k.

El ratón puede comprender además un transgén en un locus diferente al locus endógeno de la inmunoglobulina, en la que el transgén comprende una secuencia que codifica una secuencia heteróloga reordenada o no reordenada de la cadena ligera de A o k (por ejemplo, V^lno reordenada y J^lno reordenada, o VJ) reordenada unida de manera operativa (para la no reordenada) o fusionada (para la reordenada) a una secuencia de la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina. La secuencia heteróloga de la cadena ligera A o k puede ser humana. La secuencia de la región constante se puede seleccionar entre roedor, ser humano, y primate no humano. La secuencia de la región constante se puede seleccionar entre ratón, rata, y hámster. El transgén puede comprender un promotor no de inmunoglobulina que impulsa la expresión de las secuencias de la cadena ligera. El promotor es un promotor transcripcionalmente activo. El promotor es un promotor ROSA26.

Se describe una construcción de ácido nucleico, que comprende un brazo de homología en la dirección 5' y un brazo de homología en la dirección 3', en el que el brazo de homología en la dirección 5' comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina, el brazo de homología en la dirección 5' comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de la región variable de la inmunoglobulina humana o de ratón, y dispuesta entre los brazos de homología en la dirección 5' y en la dirección 3' hay una secuencia que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6 de ratón. La secuencia que codifica el gen ADAM6 de ratón puede estar unida operativamente a un promotor de ratón con el que se une la a Da M 6 de ratón en un ratón silvestre.

Se describe un vector director, que comprende (a) una secuencia de nucleótidos que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos del segmento génico de la región variable humana; y, (b) una secuencia de nucleótidos que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón.

El vector director puede comprender además un promotor unido operativamente a la secuencia que codifica ADAM6 de ratón. El promotor puede ser el promotor ADAM6 de ratón.

Se describe una construcción de nucleótidos para modificar un locus de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, en el que la construcción comprende al menos un sitio de reconocimiento de la recombinasa específico del emplazamiento y una secuencia que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón.

En un aspecto, se proporcionan células de ratón, incluyendo pero sin limitarse a células ES, células pluripotentes, y células pluripotentes inducidas, que comprenden modificaciones genéticas tal como se describe en el presente documento. Se proporcionan células que son XX y células que son XY. Se proporcionan también células que comprenden un núcleo que contiene una modificación tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, una modificación introducida en una célula mediante una inyección pronuclear.

En un aspecto, se proporciona una célula de un ratón genéticamente modificado, en el que la célula carece de un locus de ADAM6 de ratón endógeno funcional, y la célula comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6 de ratón o uno de sus fragmentos funcionales. La célula comprende además una modificación de una secuencia génica endógena de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina. El ratón comprende una sustitución de una o más secuencias de V^h, D^h, y/o J^hcon una secuencia de la inmunoglobulina humana. La secuencia de inmunoglobulina humana se puede seleccionar entre una V^Hhumana, una V^lhumana, una D^hhumana, una J^hhumana, una J^lhumana, y una de sus combinaciones.

En una realización, la célula es una célula totipotente, una célula pluripotente, o célula pluripotente inducida. En una realización específica, La célula es una célula ES de ratón.

Se describe un linfocito B de ratón, en el que el linfocito B comprende un gen reordenado de la cadena pesada de la inmunoglobulina, en el que el linfocito B comprende, en un cromosoma del linfocito B, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. El linfocito B de ratón puede comprender dos alelos de la secuencia de ácido nucleico.

La secuencia de ácido nucleico puede estar en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma del linfocito B) que es contiguo al locus reordenado de la cadena pesada de inmunoglobulina.

La secuencia de ácido nucleico puede estar en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de linfocito B) que es distinto de la molécula de ácido nucleico que comprende el locus reordenado de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón.

El linfocito B de ratón puede comprender una secuencia génica reordenada de la región variable de la inmunoglobulina no de ratón unida de manera operativa a un gen de la región constante de la inmunoglobulina de ratón o humana, en la que el linfocito B comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

Se describe una célula somática de ratón que comprende un cromosoma que comprende un locus modificado de la cadena pesada de inmunoglobulina, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. La secuencia de ácido nucleico puede estar en el mismo cromosoma que el locus modificado de la cadena pesada. El ácido nucleico puede estar en un cromosoma diferente que el del locus modificado de la cadena pesada. La célula somática puede comprender una única copia de la secuencia del ácido nucleico. La célula somática puede comprender al menos dos copias de la secuencia del ácido nucleico. La célula somática puede ser un linfocito B. La célula puede ser una célula germinal. La célula puede ser un citoblasto.

En un aspecto, se proporciona una célula germinal de ratón, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una ADAM6 de ratón (o un homólogo u ortólogo o su fragmento funcional) en un cromosoma de la célula germinal, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica la ADAM6 de ratón (o un homólogo u ortólogo o su fragmento funcional) está en una posición que es diferente de la posición en un cromosoma de una célula germinal de ratón silvestre. La secuencia de ácido nucleico está en un locus de la inmunoglobulina de ratón. El locus de la inmunoglobulina de ratón comprende una sustitución de al menos una secuencia de la inmunoglobulina de ratón con al menos una secuencia de inmunoglobulina humana.

En un aspecto, se proporciona una célula pluripotente, pluripotente inducida, o totipotente derivada de un ratón que se describe en el presente documento. En una realización específica, la célula es un embriocitoblasto (ES) de ratón. En un aspecto, se proporciona un tejido derivado de un ratón que se describe en el presente documento. En una realización, el tejido se deriva del bazo, los ganglios linfáticos o la médula ósea de un ratón tal como se describe en el presente documento.

Se describe un núcleo derivado de un ratón tal como se describe en el presente documento. El núcleo puede proceder de una célula diploide que no es un linfocito B.

Se describe una secuencia de nucleótido que codifica una región variable de inmunoglobulina procedente de un ratón tal como se describe en el presente documento.

Se describe una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina o la cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo procedente de un ratón tal como se describe en el presente documento.

Se describe una secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina o la cadena ligera de inmunoglobulina que codifican una región variable de un anticuerpo procedente de un ratón tal como se describe en el presente documento.

Se describe un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, Fab, F(ab')2, scFv) procedente de un ratón que se describe en el presente documento. Se describe un método para crear un ratón modificado genéticamente, que comprende sustituir uno o más segmentos génicos de la cadena pesada de inmunoglobulina en la dirección 5' (con respecto a la transcripción de los segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina) de un locus endógeno de ADAM6 con uno o más segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, y sustituir uno o más segmentos génicos de la inmunoglobulina en la dirección 3' (con respecto a la transcripción de los segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina) del locus de ADAM6 con uno o más segmentos génicos de la cadena pesada o de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana. Los uno o más segmentos génicos de la inmunoglobulina humana sustituyen uno o más segmentos génicos endógenos de la inmunoglobulina en la dirección 5' de un locus endógeno de ADAM6 del ratón pueden incluir segmentos génicos V. Los segmentos génicos de la inmunoglobulina humana sustituyen uno o más segmentos génicos endógenos de la inmunoglobulina en la dirección 5' de un locus endógeno de ADAM6 del ratón pueden incluir segmentos génicos V y del gen D. Los uno o más segmentos génicos de la inmunoglobulina humana sustituyen uno o más segmentos génicos endógenos de la inmunoglobulina en la dirección 3' de un locus endógeno de ADAM6 del ratón pueden incluir segmentos de los genes J. Los uno o más segmentos génicos de la inmunoglobulina humana sustituyen uno o más segmentos génicos endógenos de la inmunoglobulina en la dirección 3' de un locus endógeno de ADAM6 del ratón pueden incluir segmentos de los genes D y del gen J. Los uno o más segmentos génicos de la inmunoglobulina humana sustituyen uno o más segmentos génicos endógenos de la inmunoglobulina en la dirección 3' de un locus endógeno de ADAM6 del ratón pueden incluir segmentos génicos V, D y J.

Los uno o más segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina en la dirección 5' y/o 3' del gen ADAM6 se pueden sustituir en una célula pluripotente, pluripotente inducida, o totipotente para formar una célula progenitora modificada genéticamente; la célula progenitora modificada genéticamente se introduce en un hospedador; y, el hospedador comprende la célula progenitora modificada genéticamente se puede gestar para formar un ratón que comprende un genoma derivado de la célula progenitora modificada genéticamente. El hospedador puede ser un embrión. El hospedador se puede seleccionar entre un ratón premórula (por ejemplo, en un estadío de 8 o 4 células), un embrión tetraploide, un agregado de células embriónicas, o un blastocito.

Se describe un método para crear un ratón modificado genéticamente, que comprende sustituir una secuencia de nucleótidos que comprende un segmento génico de la inmunoglobulina de ratón y una secuencia de nucleótidos ADAM6 de ratón (o un ortólogo u homólogo o su fragmento funcional en un ratón macho) con una secuencia que comprende un segmento génico de la inmunoglobulina humana para formar un primer locus quimérico, insertando a continuación una secuencia que comprende una secuencia que codifica ADAM6 de ratón (o una secuencia que codifica un ortólogo u homólogo o su fragmento funcional) en la secuencia que comprende el segmento génico de la inmunoglobulina humana para formar un segundo locus quimérico.

El segundo locus quimérico puede comprender un segmento génico variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (V^h). El segundo locus quimérico puede comprender un segmento génico variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana (V^l). En una realización específica, el segundo locus quimérico comprende un segmento del gen V^hhumano o un segmento del gen V^lhumano unido operativamente a un segmento del gen D^hhumano y un segmento del gen J^hhumano. El segundo locus quimérico se puede unir operativamente a un tercer locus quimérico que comprende una secuencia C^h1 humana, o una C^h1 humana y una secuencia bisagra, fusionada con una secuencia C^h2 C^h3 de ratón.

Se describe el uso de un ratón que comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que comprende un locus o secuencia ADAM6 de ratón para crear un ratón macho fértil, donde el uso comprende aparear el ratón que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos que comprende el locus o la secuencia ADAM6 de ratón a un ratón que carece de un locus o secuencia endógena funcional de ADAM6 de ratón, y obtener una progenie, esto es, una hembra capaz de producir progenie que tenga el locus o la secuencia ectópica de ADAM6 o que es un macho que comprende el locus o la secuencia ectópica de ADAM6, y el macho presenta una fertilidad que es aproximadamente la misma que la fertilidad presentada por un ratón macho silvestre.

Se describe el uso de un ratón tal como se describe en el presente documento para preparar una secuencia de nucleótidos de la región variable de la inmunoglobulina.

Se describe el uso de un ratón que se describe en el presente documento para preparar un Fab completamente humano o un F(ab)2 completamente humano.

Se describe el uso de un ratón que se describe en el presente documento para preparar una línea celular inmortalizada.

Se describe el uso de un ratón que se describe en el presente documento para preparar un hibridoma o cuadroma. Se describe el uso de un ratón que se describe en el presente documento para preparar una biblioteca de fagos que contenga regiones variables de la cadena pesada humana y regiones variables de la cadena ligera humana.

Se describe el uso de un ratón tal como se describe en el presente documento para generar una secuencia de la región variable para preparar un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón que se describe en el presente documento con un antígeno de interés, (b) aislar un linfocito del ratón inmunizado de (a), (c) exponer el linfocito a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una o más secuencias de ácido nucleico de la región variable procedentes del linfocito generando por tanto una secuencia de la región variable.

El linfocito se puede derivar del bazo del ratón. El linfocito se puede derivar de un ganglio linfático del ratón. El linfocito se puede derivar de la médula ósea del ratón.

El anticuerpo marcado puede ser un anticuerpo conjugado con fluoróforo. El uno o más anticuerpos conjugados con fluoróforos se pueden seleccionar a partir de una IgM, una IgG, y/o una de sus combinaciones.

El linfocito puede ser un linfocito B.

La una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable puede comprender una secuencia de la región variable de la cadena pesada. La una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable puede comprender una secuencia de la región variable de la cadena ligera. La secuencia de la región variable de la cadena ligera puede ser una secuencia de la región variable de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina. La una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable puede comprender una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera k.

Se describe el uso de un ratón que se describe en el presente documento para generar una secuencia de la región variable de la cadena pesad y de la región variable de la cadena ligera ^k, que comprende (a) inmunizar un ratón que se describe en el presente documento con un antígeno de interés, (b) aislar el bazo del ratón inmunizado de (a), (c) exponer los linfocitos B del bazo a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B de (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera k procedentes del linfocito B generando por tanto las secuencias de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera ^k.

Se describe el uso de un ratón que se describe en el presente documento para generar una secuencia de la región variable de la cadena pesad y de la región variable de la cadena ligera ^k, que comprende (a) inmunizar un ratón que se describe en el presente documento con un antígeno de interés, (b) aislar uno o más ganglios linfáticos del ratón inmunizado de (a), (c) exponer los linfocitos B procedentes del uno o más ganglios linfáticos al uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B de (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera k procedentes del linfocito B generando por tanto las secuencias de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera k.

Se describe el uso de un ratón que se describe en el presente documento para generar una secuencia de la región variable de la cadena pesad y de la región variable de la cadena ligera k, que comprende (a) inmunizar un ratón que se describe en el presente documento con un antígeno de interés, (b) aislar la médula ósea del ratón inmunizado de (a), (c) exponer los linfocitos B de la médula ósea a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B de (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera k procedentes del linfocito B generando por tanto las secuencias de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera ^k. El uno o más anticuerpos marcados se pueden seleccionar a partir de una IgM, una IgG, y/o una de sus combinaciones.

Se describe el uso de un ratón que se describe en el presente documento para generar una secuencia de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera k. para preparar un anticuerpo humano, que comprende además fusionar las secuencias amplificadas de la región variable de la cadena pesada y ligera, expresar las secuencias fusionadas de la cadena pesada y ligera en una célula, y recuperar las secuencias expresadas de la cadena pesada y ligera generando por tanto un anticuerpo humano.

Las regiones constantes de la cadena pesada humana se pueden seleccionar entre IgM, IgD, IgA, IgE e IgG. La IgG se puede seleccionar entre una IgG1, una IgG2, una IgG3 y una IgG4. La región constante de la cadena pesada humana puede comprender C^h1, una bisagra, C^h2, C^h3, C^h4, o una combinación de las mismas. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante de la inmunoglobulina k. La célula se puede seleccionar entre una célula Hela, una célula DU145, una célula Lncap, una célula MCF-7, una célula MDA-MB-438, una célula PC3, una célula T47D, una célula THP-1, una célula U87, una célula SHSY5Y (neuroblastoma humano), una célula Saos-2, una célula Vero, una célula CHO, una célula GH3, una célula PC12, una célula retinal humana (por ejemplo, una célula PER.C6™), y una célula MC3T3. La célula puede ser una célula CHO.

Se describe un método para generar un anticuerpo quimérico inverso de roedor-ser humano específico frente a un antígeno de interés, que comprende las etapas de inmunizar un ratón que se describe en el presente documento con el antígeno, aislar al menos una célula del ratón produciendo un anticuerpo quimérico inverso de ratón-ser humano específico contra el antígeno, cultivar al menos una célula produciendo el anticuerpo quimérico inverso de ratón-ser humano específico contra el antígeno, y obtener dicho anticuerpo.

El anticuerpo quimérico inverso de ratón-ser humano puede comprender un dominio variable de la cadena pesada humana fusionado con un gen de la región constante de la cadena pesada de ratón o rata, y un dominio de la región variable de la cadena ligera humana fusionado con un gen de la región constante de la cadena ligera de rata o ser humano.

Cultivar al menos una célula produciendo el anticuerpo quimérico inverso de roedor-ser humano específico contra el antígeno se puede realizar en al menos una célula de hibridoma generada a partir de al menos una célula aislada procedente de ratón.

Se describe un método para generar un anticuerpo completamente humano frente a un antígeno de interés, que comprende las etapas de inmunizar un ratón que se describe en el presente documento con el antígeno, aislar al menos una célula del ratón produciendo un anticuerpo quimérico inverso de roedor-ser humano específico contra el antígeno, generar al menos una célula productora de un anticuerpo completamente humano derivada de un anticuerpo quimérico inverso de roedor-ser humano específico contra el antígeno, y cultivar al menos una célula productora del anticuerpo completamente, y obtener el mencionado anticuerpo completamente humano.

La al menos una célula aislada procedente del ratón que produce un anticuerpo quimérico inverso de roedor-ser humano específico contra el antígeno puede ser un esplenocito o un linfocito B.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.

La inmunización con un antígeno de interés se puede realizar con una proteína, ADN, una combinación de ADN y proteína, o células que expresan el antígeno.

Se describe el uso de un ratón que se describe en el presente documento para preparar una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la inmunoglobulina o uno de sus fragmentos. La secuencia de ácido nucleico se puede usar para preparar un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El ratón se puede usar para preparar una proteína de unión a antígeno seleccionada entre un anticuerpo, un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), un scFv, un scFv biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, una V-NAR, una V^hh, una V^l, un F(ab), un F(ab)2, un DVD (es decir, un dominio variable doble de antígeno-proteína de unión), un SVD (es decir, un dominio variable simple de antígeno-proteína de unión), o emplear un linfocito T biespecífico (BiTE).

Se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para introducir una secuencia ectópica de ADAM6 en un ratón que carece de una secuencia endógena funcional de ADAM6 de ratón, donde el uso comprende aparear un ratón como se describe en el presente documento con el ratón que carece de la secuencia endógena funcional de ADAM6 de ratón.

Se describe el uso de material genético procedente de un ratón como se describe en el presente documento para crear un ratón que tiene una secuencia ectópica de ADAM6. El uso puede comprender la transferencia nuclear utilizando un núcleo de una célula de un ratón como se describe en el presente documento. El uso puede comprender clonar una célula de un ratón como se describe en el presente documento para producir un animal derivado de la célula. En una realización, el uso puede comprender emplear un esperma o un óvulo de un ratón tal como se describe en el presente documento en un proceso para crear un ratón que comprende la secuencia ectópica de ADAM6.

Se describe un método para crear un ratón macho estéril que comprende un locus modificado de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende fertilizar una primera célula germinal de ratón que comprende una modificación de un locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina con una segunda célula germinal de ratón que comprende un gen ADAM6 o un ortólogo u homólogo o su fragmento que es funcional en un ratón macho; formar una célula fertilizada; dejar que la célula fertilizada se desarrolle en un embrión; y, gestar el embrión en una madre sustituta para obtener un ratón.

La fertilización se puede conseguir apareando un ratón macho y un ratón hembra. El ratón hembra puede comprender el gen ADAM6 o el homólogo u ortólogo o el fragmento funcional del mismo. El ratón macho puede comprender el gen ADAM6 o el ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo.

Se describe el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo de la misma o un fragmento funcional de la proteína ADAM6 correspondiente para restaurar o aumentar la fertilidad de un ratón que tiene un genoma que comprende una modificación de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina, donde la modificación reduce o elimina la función endógena de ADAM6.

La secuencia de ácido nucleico se puede integrar en el genoma del ratón en una posición ectópica. La secuencia de ácido nucleico se puede integrar en el genoma del ratón en un locus endógeno de la inmunoglobulina. El locus endógeno de la inmunoglobulina puede ser un locus de la cadena pesada. La secuencia de ácido nucleico se puede integrar en el genoma del ratón en una posición diferente de la del locus endógeno de la inmunoglobulina.

Se describe el uso del ratón que se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamente (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno), o para la fabricación de una secuencia que codifica una secuencia de la región variable de un medicamente (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno), para el tratamiento de una enfermedad o trastorno humano.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1A muestra una ilustración general, no hecha a escala, de la sustitución genómica directa de aproximadamente tres megabases (Mb) de un locus génico de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón (símbolos cerrados) con aproximadamente una megabase (Mb) del locus génico de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (símbolos abiertos).

La FIG. 1 B muestra una ilustración general, no hecha a escala, de la sustitución genómica directa de aproximadamente tres megabases (Mb) de un locus génico de la región variable de la cadena ligera k de la inmunoglobulina de ratón (símbolos cerrados) con aproximadamente 0,5 megabases (Mb) de la primera, o proximal, de dos repeticiones prácticamente idénticas de un locus génico de la región variable de la cadena ligera k de la inmunoglobulina (símbolos abiertos).

La FIG. 2A muestra una ilustración detallada, no hecha a escala, de tres etapas iniciales (A-C) para la sustitución genómica directa de un locus génico de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón que da como resultado la deleción de todos los segmentos génicos V^h, D^hy J^hy la sustitución con tres segmentos génicos V^h, D^hy J^h.Se muestra un vector director (3hVH BACvec) para una primera inserción de segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana con un brazo 5' de 67 kb de homología de ratón, un casete de selección (rectángulo abierto), un sitio de recombinación específico de emplazamiento (triángulo abierto), un fragmento genómico humano de 145 kb y un brazo 3' de 8 kb de homología de ratón. Se muestran segmentos génicos de la inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados), casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación específicos de emplazamiento (triángulos abiertos) insertados en los vectores de dirección posteriores.

La FIG. 2B muestra una ilustración detallada, no hecha a escala, de seis etapas adicionales (D-I) para la sustitución genómica directa de un locus génico de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón que da como resultado la inserción de 77 segmentos adicionales del gen V^hhumano y la eliminación de un casete final de selección. Se muestra un vector director para la inserción de segmentos adicionales del gen VH humano (18hV^HBACvec) para la inserción inicial de segmentos génicos de la cadena pesada humana (Alelo híbrido 3hV^H-CRE) con un brazo 5' de 20 kb de homología de ratón, un casete de selección (rectángulo abierto), un fragmento genómico humano de 196 kb y un brazo de 62 kb de homología humano que se solapa con el extremo 5' de la inserción inicial de segmentos génicos de la cadena pesada humana que se muestra con un sitio de recombinación específico de emplazamiento (triángulo abierto) localizado 5' en los segmentos génicos humanos. Se muestran segmentos génicos de la inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados) y casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) insertados en vectores directores posteriores.

La FIG. 2C muestra una ilustración detallada, no hecha a escala, de tres etapas iniciales (A-C) para la sustitución genómica directa de un locus génico de la región variable de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina de ratón que da como resultado la deleción de todos los segmentos génicos V^H, y de los segmentos de los genes Jk (Alelo híbrido IgK-CRE). Se muestran casetes de selección (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación específicos de emplazamiento (triángulos abiertos) insertados en los vectores directores.

La FIG. 2D muestra una ilustración detallada, no hecha a escala, de cinco etapas adicionales (D-H) para la sustitución genómica directa de un locus génico variable de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina de ratón que da como resultado la inserción de todos los segmentos génicos V^ky J^khumanos de la repetición y deleción proximales de un casete de selección final (Alelo híbrido 40hVKdHyg). Se muestran segmentos génicos de la inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados) y casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) insertados en vectores directores posteriores.

La FIG. 3A muestra una ilustración general, no hecha a escala, de una estrategia de cribado que incluye las localizaciones de los conjuntos de cebadores/sondas de la PCR cuantitativa (qPCR) para detectar la inserción de las secuencias génicas de la cadena pesada humana y la pérdida de secuencias génicas de la cadena pesada de ratón en embriocitoblastos dirigidos (ES). Se muestra la estrategia de cribado en células y ratones ES para una primera inserción génica de la cadena pesada con conjuntos de cebadores/sondas de la qPCR de la región borrada ("pérdida" de las sondas C y D), la región insertada (sondas G y H "alto") y regiones flanqueantes (sondas de "retención" A, B, E y F) en un cromosoma de ratón no modificado (parte superior) y un cromosoma correctamente dirigido (parte inferior).

La FIG. 3B muestra un cálculo representativo del número de copias de sondas observado en células ES progenitoras y modificada durante una primera inserción de segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana. Se ha calculado el número de copias de sondas observado para las sondas A a B como 2/2AACt. AACT se ha calculado como pro[ACt(muestra) - medACt(control)] en el que ACt es la diferencia en Ct entre las sondas de ensayo y de referencia (entre las sondas de referencia 4 y 6 dependiendo del ensayo). El término medACt(control) es el promedio ACt de múltiples muestras de ADN (>60) no dirigido procedente de células ES progenitoras. Se evaluó cada clon de células ES por sextuplicado. Para calcular el número de copias de las sondas G y H de IgH en células ES progenitoras, se supuso que estas sondas tenían un número de copias de 1 en células ES modificadas y una Ct máxima de 35 y se usaron incluso sin que se observara amplificación.

La FIG. 3C muestra un cálculo representativo del número de copias para cuatro ratones de cada genotipo calculado utilizando solo las sondas D y H. Ratones silvestres: Ratones WT; ratones heterocigóticos para una primera inserción de segmentos génicos de la inmunoglobulina humana: Ratones HET; Ratones heterocigóticos para una primera inserción de segmentos génicos de la inmunoglobulina humana: Ratones Homo.

La FIG. 4A muestra una ilustración detallada, no hecha a escala, de las tres etapas empleadas para la construcción de 3hV^HBACvec mediante recombinación bacteriana homóloga (BHR). Se muestran segmentos génicos de la inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados), casetes de selección (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación específicos de emplazamiento (triángulos abiertos) insertados en los vectores directores.

La FIG. 4B muestra la electroforesis en gel en un campo de pulsos (PFGE) de tres BAC los clones (B1, B2 y B3) tras la digestión de Notl. Los marcadores M1, M2 y M3 son de gama baja, marcadores lambda y PFG en escalera de gama media, respectivamente (New England BioLabs, Ipswich, M^a).

La FIG. 5A muestra una ilustración esquemática, no hecha a escala, de las modificaciones secuenciales de un locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón con cantidades crecientes de segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. Se crearon ratones homocigóticos de cada una de las tres etapas diferentes de humanización de la cadena pesada. Los símbolos abiertos indican una secuencia humana; los símbolos cerrados indican una secuencia de ratón.

La FIG. 5B muestra una ilustración esquemática, no hecha a escala, de las modificaciones secuenciales de un locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina k de ratón con cantidades crecientes de segmentos génicos de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana. Se crearon ratones homocigóticos de cada una de las tres etapas diferentes de humanización de la cadena ligera k. los símbolos abiertos indican una secuencia humana; los símbolos cerrados indican una secuencia de ratón.

La FIG. 6 muestra las gráficas de puntos FACS de poblaciones de linfocitos B en ratones silvestres y VELOCIMMUNE® humanizados. Células de bazo (hilera superior, tercera hilera de la parte superior e hilera de la parte inferior) o ganglio linfático inguinal (segunda hilera de la parte superior) de ratones silvestres (wt), VELOCIMMUNE® 1 (V1), VELOCIMMUNE® 2 (V2) o VELOCIMMUNE® 3 (V3) se tiñeron para la IgM superficial que expresaba linfocitos B (hilera superior, y una segunda hilera en la parte superior), inmunoglobulina superficial que contiene tanto cadenas ligeras ^kcomo cadenas ligeras A (tercera hilera de la parte superior) o IgM superficial de haplotipos específicos (hilera inferior), y poblaciones separadas mediante FACS.

La FIG. 7A muestra las secuencias CDR3 representativas de la cadena pesada de anticuerpos VELOCIMMUNE® seleccionados aleatoriamente alrededor de la unión V^h-0^h-J^h(CDR3), demostrando la diversidad de la unión y las adiciones de nucleótidos. Las secuencias CDR3 de la cadena pesada se agrupan de acuerdo a la utilización del segmento de gen 0^h, la línea germinal del cual se proporciona encima de cada grupo en negrita. Se señalan segmentos génicos V^hde cada secuencia CDR3 de la cadena pesada en paréntesis en el extremo 5' de cada secuencia (por ejemplo, 3-72 es 3-72 de V^hhumana). Se señalan segmentos de gen J^hde cada CDR3 de la cadena pesada en paréntesis en el extremo 3' de cada secuencia (por ejemplo, 3 es 3 de J^hhumana). se muestran las SEC ID Nos de cada secuencia como sigue procediendo desde la parte superior a la parte inferior: SEC ID N°: 21; SEC ID N°: 22; SEC ID N°: 23; SEC ID N°: 24; SEC

ID N°: 25; SEC ID N°: 26; SEC ID N°: 27; SEC ID N°: 28; SEC ID N°: 29; SEC ID N°: 30; SEC ID N°: 31; SEC ID N°: 32; SEC ID N°: 33; SEC ID N°: 34; SEC ID N°: 35; SEC ID N°: 36; SEC ID N°: 37; SEC ID N°: 38; SEC ID N°: 39. La FIG. 7B muestra las secuencias CDR3 representativas de la cadena ligera de anticuerpos VELOCIMMUNE® seleccionados aleatoriamente alrededor de la unión Vk-Jk (CDR3), demostrando la diversidad de la unión y las adiciones de nucleótidos. Se señalan segmentos génicos Vk de cada secuencia CDR3 de la cadena ligera en paréntesis en el extremo 5' de cada secuencia 5' (por ejemplo, 1-6 es 1-6 de V^khumana). Se señalan segmentos de gen Jk de cada CDR3 de la cadena ligera en paréntesis en el extremo 3' de cada secuencia (por ejemplo, 1 es 1 de Jk humana). se muestran las SEC ID Nos de cada secuencia como sigue procediendo desde la parte superior a la parte inferior: SEC ID N°: 40; SEC ID N°: 41; SEC ID N°: 42;

SEC ID N°: 43; SEC ID N°: 44; SEC ID N°: 45; SEC ID N°: 46; SEC ID N°: 47; SEC ID N°: 48; SEC ID N°: 49; SEC ID N°: 50; SEC ID N°: 51; SEC ID N°: 52;

: 53; SEC ID N°: 54; SEC ID N°: 55; SEC ID N°: 56; SEC ID N°: 57; SEC ID N°: 58.

La FIG. 8 muestra frecuencias somáticas de hipermutación de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos VELOCIMMUNE® puntuadas (tras alineación para emparejar secuencias de líneas germinales) como porcentaje de secuencias cambiadas en cada nucleótido (NT; columna izquierda) o posición de aminoácido

(AA; columna derecha) entre conjuntos de 38 (IgM no inmunizada), 28 (IgG inmunizada), 32 (IgK no inmunizada procedente de IgG), 36 (IgG inmunizada) o 36 secuencias (Igk inmunizada procedente de IgG).

Las barras sombreadas indican las localizaciones de C0Rs.

La FIG. 9A muestra los niveles de inmunoglobulina sérica de los isotipos en ratones silvestres (barras abiertas) o VELOCIMMUNE® (barras cerradas).

La FIG. 9B muestra los niveles de inmunoglobulina sérica del isotipo IgA en ratones silvestres (barras abiertas) o VELOCIMMUNE® (barras cerradas).

La FIG. 9C muestra los niveles de inmunoglobulina sérica del isotipo IgE en ratones silvestres (barras abiertas) o VELOCIMMUNE® (barras cerradas).

La FIG. 10A muestra los títulos de IgG específicos de antígeno frente al receptor de la interleuquina 6 (IL-6R) del suero de siete ratones VELOCIMMUNE® (VI) y cinco ratones silvestres (WT) tras dos (exudado 1) o tres (exudado 2) ciclos de inmunización con el ectodominio de IL-6R.

La FIG. 10B muestra los títulos de IgG específica de isotipo dirigida contra IL-6R-específica de siete ratones VELOCIMMUNE® (VI) y cinco ratones silvestres (WT).

La FIG. 11A muestra la distribución de afinidad de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de la interleuquina 6 generados en ratones VELOCIMMUNE®.

La FIG. 11B muestra el bloqueo específico de antígeno de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de la interleuquina 6 generados en ratones VELOCIMMUNE® (VI) y silvestres (WT).

La FIG. 12 muestra una ilustración esquemática, no hecha a escala, de los genes ADAM6a y ADAM6b en un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. Se muestra un vector directo (mADAM6) utilizado para la inserción de ADAM6a y ADAM6b de ratón en un locus endógeno de la cadena pesada humanizada con un casete de selección (HYG: higromicina) flanqueado por sitios de recombinación específicos de emplazamiento (Frt) que incluyen sitios de restricción diseñados mediante ingeniería genética en los extremos 5' y 3'.

La FIG. 13 muestra una ilustración esquemática, no hecha a escala, de un pseudogen A0AM6 humano (hADAM6^) localizado entre los segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada humana 1-2

(V^h1-2) y 6-1 (V^h6-1). Se muestra un vector director para la recombinación homóloga bacteriana (Vector director hADAM6^) para borrar un pseudogen ADAM6 humano e insertar sitios de restricción únicos en un locus de la cadena pesada humana con un casete de selección (NEO: neomicina) flanqueado por sitios de recombinación específicos de emplazamiento (loxP) que incluyen sitios de restricción generados en los extremos 5' y 3'. Se muestra una ilustración, no hecha a escala, del locus dirigido de la cadena pesada humanizada resultante que contiene un fragmento genómico que codifica los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón que incluyen un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación específicos del emplazamiento.

La FIG. 14A muestra las gráficas de contorno de FACS de los linfocitos clasificados en singletes para establecer la expresión superficial de lgM y B220 en la médula ósea de ratones homocigóticos para investigar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana (H+/+k+/+) y ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana que tienen un fragmento ectópico genómico de ratón que codifica los genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). Se señala el porcentaje de linfocitos B inmaduros (B220intlgM+) y maduros (B220highlgM+) en cada gráfica de contorno.

La FIG. 14B muestra el número total de linfocitos B inmaduros (B220intlgM+) y maduros (B220altolgM+) en la médula ósea aislada de fémures de ratones homocigóticos para investigar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera ^khumana (H+/+^k+/+) y de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+).

La FIG. 15A muestra las gráficas de contorno de FACS de los linfocitos B clasificados CD19+para establecer la expresión superficial del kit c y de CD43 en la médula ósea de ratones homocigóticos para investigar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y de la cadena ligera ^khumana (H+/+^k+/+) y de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera ^khumana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). Se señala el porcentaje de células pro-B (CD19+CD43+ckit+) y pre-B (CD19+CD43"ckit") en los cuadrantes de la parte superior derecha y de la parte inferior izquierda, respectivamente, de cada gráfica de contorno.

La FIG. 15B muestra el número total de prolinfocitos B (CD19+CD43+ckit+) y prelinfocitos B (CD19+CD43'ckit‘) en la médula ósea aislada de fémures de ratones homocigóticos para investigar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana (H+/+k+/+) y de ratones homocigóticos para establecer los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana que tienen que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+).

La FIG. 16A muestra las gráficas de contorno de FACS de los linfocitos clasificados en singletes para establecer la expresión superficial de CD19 y CD43 en la médula ósea de ratones homocigóticos para investigar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana (H+/+k+'+) y ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera ^khumana que tienen un fragmento ectópico genómico de ratón que codifica los genes a Da M6 de ratón (H+/+A6resK+/+). Se señala el porcentaje de linfocitos B inmaduros (CD19+CD43-), prelinfocitos B (CD19+CD43int) y prolinfocitos B (CD19+Cd43+) en cada gráfica de contorno.

La FIG. 16B muestra histogramas de linfocitos B inmaduros (CD19+CD43-) y de prelinfocitos B (CD19+CD43int) en la médula ósea de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana (H+/+k+/+) y de ratones homocigóticos para establecer los loci génicos de la región variaba de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+).

La FIG. 17A muestra las gráficas de contorno de FACS de los linfocitos clasificados en singletes para la expresión superficial de CD19 y CD3 para investigar ratones homocigóticos para establecer los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana (H+/+k+/+) y ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). Se señala el porcentaje de linfocitos B (CD19+CD3-) y linfocitos T (CD19-CD3+) en cada gráfica de contorno.

La FIG. 17B muestra las gráficas de contorno de FACS de los linfocitos B clasificados CD19+para investigar la expresión superficial de la cadena ligera de IgA e IgK en el bazo de ratones homocigóticos para establecer los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y de la cadena ligera K humana (H+/+k+/+) y de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera K humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+). Se señala el porcentaje de linfocitos B en lgX+ (cuadrante superior izquierdo) e lgK (cuadrante inferior derecho) en cada gráfica de contorno.

La FIG. 17C muestra el número total de linfocitos B CD19+ en el bazo de ratones homocigóticos para investigar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera K humana (H+/+k+/+) y de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera K humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+).

La FIG. 18A muestra las gráficas de contorno de FACS de los linfocitos B clasificados CD19+ para establecer la expresión superficial de IgD y de IgM en el bazo de ratones homocigóticos para investigar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y de la cadena ligera K (H+/+k+/+) y de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera K humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6 (H+/+A6resK+/+). Se señala el porcentaje de linfocitos B maduros (CD19+lgDhighlgMint) para cada gráfica de contorno. La flecha de la gráfica de contorno de la derecha ilustra el proceso de maduración de los linfocitos B en relación a la expresión superficial de IgM e IgD.

La FIG. 18B muestra el número total de linfocitos B en el bazo de ratones homocigóticos para establecer los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera k humana (H+/+k+/+) y de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y la cadena ligera ^khumana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+) durante la maduración de CD19+lgMaltolgDint a CD19+lgMintlgDalto

La FIG. 19 muestra el título del anticuerpo para la primera y segunda exudaciones procedentes de ratones homocigóticos para establecer los loci génicos de la cadena pesada humana y de la cadena ligera k humana (H+/+k+/+; n=5) y de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y de la cadena ligera k humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+; n=5) que se han inmunizado con un receptor superficial celular humano (Antígeno A).

La FIG. 20 muestra el título del anticuerpo para la primera y segunda exudaciones procedentes de ratones homocigóticos para establecer los loci génicos de la cadena pesada humana y de la cadena ligera k humana (H+/+^k+/+; n=5) y de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y de la cadena ligera k humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+; n=10) que se han inmunizado con un anticuerpo humano específico del receptor de la proteína tirosina quinasa humano (Antígeno B).

La FIG. 21 muestra el título del anticuerpo para la primera y segunda exudaciones procedentes de ratones homocigóticos para establecer los loci génicos de la cadena pesada humana y de la cadena ligera k humana (H+/+k+/+; n=12) y de ratones homocigóticos para determinar los loci génicos de la región variable de la cadena pesada humana y de la cadena ligera k humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+; n=12) que se han inmunizado con una proteína humana secretada que funciona en la regulación de la ruta de señalización de TGF-p (Antígeno C).

La FIG. 22 muestra el título del anticuerpo para la primera y segunda exudaciones procedentes de ratones homocigóticos para establecer los loci génicos de la cadena pesada humana y de la cadena ligera k humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+; n=12) que se han inmunizado con un receptor de la tirosina quinasa humano (Antígeno D).

Descripción detallada de la invención

Esta invención no está limitada a los métodos concretos, y a las condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. Debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene solamente el fin de describir solamente realizaciones concretas, y no se pretende que sea limitante, debido a que el alcance de la presente invención se define mediante las reivindicaciones.

Salvo que se indique de otra manera, todos los términos y frases utilizados en el presente documento incluyen los significados que los términos y frases han alcanzado en la técnica, a no ser que se indique claramente lo contrario o que se evidencie claramente a partir del contexto en el que se usa el término o frase. Aunque se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para llevar a la práctica o en el ensayo de la presente invención, se describen ahora los métodos y materiales concretos.

La frase "sustancial" o "sustancialmente", cuando se usa para referirse a una cantidad de segmentos génicos (por ejemplo, "sustancialmente todos" los segmentos génicos V) incluye segmentos génicos funcionales y no funcionales e incluye, en algunas realizaciones, por ejemplo, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de todos los segmentos génicos; en algunas realizaciones, "sustancialmente todos" los segmentos génicos incluye, por ejemplo, al menos del 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de los segmentos génicos funcionales (es decir, sin pseudogenes).

El término "sustitución" incluye dónde se coloca una secuencia de ADN en un genoma de una célula de tal manera que sustituye una secuencia en el genoma con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia humana en un ratón), en el locus de la secuencia genómica. La secuencia de ADN colocada de esta manera puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte de la fuente de ADN utilizada para obtener la secuencia colocada de esta manera (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones 5' o 3' no traducidas, secuencias de señalización de la recombinación adecuadas, etc.). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la sustitución es una sustitución de una secuencia endógena por una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto génico procedente de la secuencia de ADN colocada de esta manera (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; la sustitución es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ^aDⁿque codifica una proteína que tiene una función similar que una proteína codificada por la secuencia genómica endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un gen o dominio de la inmunoglobulina, y el fragmento de ADN codifica uno o más genes o dominios de la inmunoglobulina humana). En varias realizaciones, un gen endógeno o un fragmento del mismo se sustituyen con un gen humano o un fragmento del mismo correspondiente. Un gen humano o fragmento del mismo correspondiente es un gen o fragmento humano que es un ortólogo de, un homólogo de, o es sustancialmente idéntico o igual en estructura y/o función, que el gen endógeno o fragmento del mismo que se sustituye.

El ratón como modelo genético se ha potenciado mucho mediante tecnologías transgénicas y de inactivación genética, que han permitido el estudio de los efectos de la expresión en exceso o deleción dirigidas de los genes específicos. A pesar de todas sus desventajas, el ratón presenta todavía obstáculos genéticos que los vuelven un modelo imperfecto para las enfermedades humanas y una plataforma imperfecta para ensayar agentes de tratamiento para seres humanos o fabricarlos. En primer lugar, aunque aproximadamente el 99 % de los genes humanos tienen un homólogo en ratón (Waterston et al. 2002, Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature 420:520-562), los agentes de tratamiento fracasan a menudo porque reaccionan en cruzado, o reaccionan en cruzado de forma inadecuada, con ortólogos de ratón de las dianas humanas previstas. Para obviar este problema, los genes diana usados puede ser "humanizados", esto es, el gen de ratón se puede eliminar y sustituir por la correspondiente secuencia génica ortóloga humana (por ejemplo, documentos US 6.586.251, US 6.596.541 y US 7.105.348). Inicialmente, se han llevado a cabo esfuerzos para humanizar genes mediante una estrategia de "desactivación génica más humanización transgénica" que conlleva cruzar un ratón que transporta una deleción (es decir, una inactivación genética) del gen endógeno con un ratón que transporta un transgén humano integrado aleatoriamente (véase, por ejemplo, Bril et al., 2006, Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al., 2006, Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al., 2006, A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88(3):309-15; Pan et al., 2006, Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mice, Mol Immunol 43:1741-1750). Pero aquellos esfuerzos estuvieron obstaculizados debido a limitaciones de tamaño; las tecnologías de inactivación genética convencionales no han sido suficientes para sustituir directamente genes de ratón grandes con sus homólogos genómicos humanos grandes. Se ha intentado raramente una solución sencilla de sustitución homóloga directa en la que el gen endógeno de ratón se sustituye directamente por el gen homólogo humano en la misma localización precisa del gen de ratón (es decir, en el locus endógeno de ratón) debido a las dificultades técnicas. Hasta ahora, los esfuerzos en la sustitución directa han implicado procesos elaborados y laboriosos, limitando de esta manera la longitud del material genético que podría manipularse y la precisión con la cual se podría manipular.

Los transgenes de la inmunoglobulina humana introducidos exógenamente se reordenan en linfocitos B precursores en ratones (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). Este hallazgo se ha explicado mediante ratones diseñados con ingeniería genética usando la solución transgénica más la inactivación genética para expresar anticuerpos humanos (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg y col., 1994, Antigenspecific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). Se han inactivado en estos ratones los loci de la cadena pesada y de la cadena ligera k mediante deleción dirigida de porciones críticas pero pequeñas de cada locus endógeno, seguido por la introducción de loci de genes de la inmunoglobulina humana que integran aleatoriamente transgenes grandes, como se ha descrito anteriormente, o minicromosomas (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromo some fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727). Dichos ratones han representado un importante avance en la ingeniería genética; se han aislado anticuerpos monoclonales completamente humanos a partir de ellos dando como resultado potenciales y prometedores agentes de tratamiento para tratar varias enfermedades humanas (Gibson et al., 2006, Resultados del ensayo en fase III aleatorizado de panitumumab, un anticuerpo monoclonal completamente humano dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico, cáncer colorrectal metastásico, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim et al., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005, Human antibodies from transgenic animals, Nat Biotechnol 23:1117-1125; Maker et al., 2005, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al., 2006, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, New Engl J Med 354:821-831). Pero, tal como se ha descrito anteriormente, estos ratones presentan desarrollo de linfocitos B comprometidos y deficiencias inmunes cuando se comparan con ratones silvestres. Dichos problemas limitan potencialmente la capacidad de los ratones de soportar una intensa respuesta humoral y, en consecuencia, generar anticuerpos completamente humanos contra algunos antígenos. Las deficiencias pueden ser debidas a: (1) una funcionalidad ineficaz debida a la introducción aleatoria de los transgenes de la inmunoglobulina humana y la expresión incorrecta resultante debido a la carencia de elementos de control anteriores y posteriores (Garrett et al., 2005, Chromatin architecture near a potential 3' end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:1511-1525; Manis et al., 2003, Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al., 2006, Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of the mouse IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, y E2A, J Immunol 176:6839-6851); (2) inefficient interspecies interactions between human constant domains and mouse components of the B-cell receptor signaling complex on the cell surface, which may impair signaling processes required for normal maturation, proliferation, and survival of B cells (Hombach et al., 1990, Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762); and (3) inefficient interspecies interactions between soluble human immunoglobulins and mouse Fc receptors that might reduce affinity selection (Rao et al., 2002, Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high affinity B cells, J Immunol 169:1859-1868) and immunoglobulin serum concentrations (Brambell et al., 1964, A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans y Anderson, 1996, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA 93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al., 2006, Antibodymediated regulation of the immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn y Ravetch, 2007, Fcreceptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204). Estas deficiencias se pueden corregir mediante humanización in situ solo de las regiones variables de los loci de la inmunoglobulina de ratón en sus localizaciones naturales en los loci endógenos de la cadena pesada y la cadena ligera. Esto daría un resultado eficaz en ratones que producen "quimeras inversas (es decir, V humano:C ratón) que serían capaces de interacciones y selección normales con el entorno del ratón basadas en la retención de las regiones constantes de ratón. Además, dichos anticuerpos quiméricos inversos pueden reformarse fácilmente en anticuerpos completamente humanos a fines terapéuticos.

Pueden crearse animales genéticamente modificados que comprenden una sustitución en el locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina con secuencias heterólogas de inmunoglobulina (por ejemplo, de otras especies) junto con sustituciones en los loci endógenos de la cadena ligera de inmunoglobulina o junto con transgenes de la cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, transgenes quiméricos de la cadena ligera de inmunoglobulina o completamente humanos o completamente de ratón, etc.). Las especies a partir de las cuales se derivan secuencias heterólogas de la cadena pesada de la inmunoglobulina pueden variar ampliamente; como con las secuencias de la cadena ligera de la inmunoglobulina empleadas en las sustituciones de secuencias de la cadena ligera de la inmunoglobulina o los transgenes de la cadena ligera de la inmunoglobulina.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la región variable de inmunoglobulina, por ejemplo, los segmentos V, D y/o J se obtienen de un ser humano.

Se describe un ratón que comprende una sustitución de segmentos de V^h, D^h, y J^hen un locus endógeno de la cadena pesada de la inmunoglobulina con uno o más segmentos de V^h, D^h, y J^h, donde el uno o más segmentos de V^h, D^h, y J^hse unen operativamente a un gen endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina; en el que el ratón comprende un transgén en un locus diferente que un locus endógeno de la inmunoglobulina, donde el transgén comprende un segmento de V^lhumano y de J^lhumano no reordenado o reordenado unido operativamente a una región constante de ratón o rata o ser humano.

Se describe un método para una sustitución genética grande in situ de los loci génicos de la región variable de la inmunoglobulina de la línea germinal de ratón manteniendo a la vez la capacidad de los ratones de generar progenie. Específicamente, se describe la sustitución exacta de seis megabases de los loci génicos de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera k de inmunoglobulina con sus homólogos humanos dejando intactas las regiones constantes de ratón. Como resultado, se han creado ratones que tienen una sustitución precisa del repertorio de la región variable de la inmunoglobulina de su línea germinal con secuencias equivalentes de la región variable de la inmunoglobulina de la línea germinal humana, manteniendo a la vez las regiones constantes de ratón. Las regiones variables humanas se unen a regiones constantes de ratón para formar loci quiméricos de inmunoglobulina humana-de ratón que se reordenan y expresan a niveles fisiológicamente adecuados. Los anticuerpos expresados son "quimeras inversas", es decir, comprenden secuencias de la región variable humana y secuencias de la región constante de ratón. Estos ratones que tienen regiones variables de la inmunoglobulina inmunizada que expresan anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes de ratón se denominan ratones VELOCIMMUNE®.

Los ratones VELOCIMMUNE® humanizados presentan un sistema inmune humoral completamente funcional que es esencialmente indistinguible del de los ratones silvestres. Presentan poblaciones de células normales en todas las etapas de desarrollo de los linfocitos B. Presentan una morfología normal de los órganos linfáticos. Las secuencias de anticuerpos de los ratones VELOCIMMUNE® presentan una reordenación V(D)J normal y frecuencias somáticas de hipermutación normales. Las poblaciones de anticuerpos en estos ratones reflejan distribuciones isotípicas que son el resultado de cambios de clase normales (por ejemplo, cambios cis isotípicos normales). Los ratones VELOCIMMUNE® inmunizantes dan como resultados sólidas inmunorespuestas humorales que generan grandes repertorios de anticuerpos diversos que tienen dominios variables de la inmunoglobulina humana adecuados para el uso como candidatos terapéuticos. Esta plataforma proporciona una abundante fuente de secuencias de la región variable de la inmunoglobulina humana maduradas por afinidad naturalmente para preparar anticuerpos farmacéuticamente aceptables y otras proteínas de unión a antígeno.

Es la sustitución precisa de secuencias de la región variable de la inmunoglobulina de ratón con secuencias de la región variable de la inmunoglobulina humana lo que permite crear ratones VELOCIMMUNE®. Además, incluso una sustitución precisa de secuencias endógenas de la inmunoglobulina humana en los loci de la cadena pesada y la cadena ligera con las secuencias equivalentes de la inmunoglobulina humana mediante ingeniería recombinógena secuencial de tramos muy grandes de secuencias de la inmunoglobulina humana, puede presentar determinados estímulos debido a la evolución divergente de los loci de la inmunoglobulina entre el ratón y el hombre. Por ejemplo, las secuencias intergénicas intercaladas en los loci de la inmunoglobulina no son idénticas entre ratones y seres humanos y, en algunas circunstancias, pueden no ser funcionalmente equivalentes. Las diferencias entre ratones y seres humanos en sus loci de inmunoglobulina pueden dar como resultado además anomalía en ratones humanizados, particularmente cuando se humanizan o manipulan determinadas porciones de loci endógenos de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. Algunas modificaciones en los loci de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón son perjudiciales. Las modificaciones perjudiciales pueden incluir, por ejemplo, la pérdida de la capacidad de los ratones modificados de aparearse y dar lugar a progenie.

Se ha llevado a cabo una sustitución precisa, a gran escala, in situ de seis megabases de las regiones variables de los loci de inmunoglobulina de la cadena pesada y la cadena ligera del ratón (V^h-D^h-J^hand Vk-Jk) con las megabases 1,4 correspondientes de las secuencias genómicas humanas, manteniendo a la vez las secuencias flanqueantes de ratón intactas y funcionales en los loci híbridos, incluyendo todos los genes de la cadena constante de ratón y las regiones locus de control de la transcripción (FIG. 1A y FIG. 1 B). Específicamente, se han introducido las secuencias de genes V^h, D^h, J^h, Vk y Jk mediante una inserción por etapas de 13 vectores directores BAC quiméricos que contienen fragmentos solapantes de los loci de la región variable de la línea germinal humana en las células ES de ratón utilizando la tecnología de genomanipulación VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos. N° 6.586.251 y Valenzuela et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659).

La humanización de los genes de la inmunoglobulina de ratón representa la mayor modificación genética hasta la fecha en el genoma de ratón. Aunque los esfuerzos anteriores con transgenes de la inmunoglobulina humana integrados aleatoriamente han tenido cierto éxito (se ha discutido anteriormente), la sustitución directa de los genes de la inmunoglobulina de ratón con sus homólogos humanos aumenta drásticamente la eficacia con la cual se pueden generar eficazmente anticuerpos completamente humanos generados en ratones por otra parte normales. Además, dichos ratones presentan una diversidad drásticamente aumentada de anticuerpos completamente humanos que se pueden obtener tras inmunización con virtualmente cualquier antígeno, en comparación con ratones que contienen loci endógenos deshabilitados y transgenes de anticuerpos completamente humanos. Múltiples versiones de loci humanizados sustituidos presentan niveles completamente normales de linfocitos B maduros e inmaduros, en contraste con ratones que tienen transgenes humanos integrados aleatoriamente, que presentan poblaciones de linfocitos B significativamente reducidas es diversas etapas de la diferenciación. Aunque los esfuerzos para aumentar el número de segmentos génicos humanos en ratones transgénicos humanos han reducido dichos defectos, los repertorios ampliados de la inmunoglobulina no han corregido en conjunto las reducciones en las poblaciones de linfocitos B en comparación con ratones silvestres.

A pesar de la proximidad de la función inmune humoral silvestre observada en ratones con loci de inmunoglobulina sustituidos (es decir, ratones VELOCIMMUNE®), se han encontrado otros estímulos cuando se emplea una sustitución directa de la inmunoglobulina que no se han encontrado en algunas soluciones que emplean transgenes aleatoriamente integrados. Las diferencias en la composición genética de los loci de inmunoglobulina entre ratones y seres humanos han conducido al descubrimiento de secuencias beneficiosas para la propagación de ratones con segmentos génicos de inmunoglobulina sustituidos. Específicamente, los genes ADAM de ratón localizados en los locus endógenos de la inmunoglobulina están óptimamente presentes en ratones con los loci de inmunoglobulina sustituidos, debido a su papel en la fertilidad.

Localización y función genómica de ADAM6 de ratón

Ratones macho que carecen de la capacidad de expresar cualquier proteína ADAM6 funcional presentan sorprendentemente un defecto en la capacidad de los ratones de aparearse y generar progenie. Los ratones carecen de la capacidad de expresar una proteína ADAM6 funcional en virtud de una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos de la región variable de la inmunoglobulina de ratón con los segmentos génicos de la región variable humana. La pérdida de la función de ADAM6 tiene lugar debido a que el locus de ADAM6 está localizado en una región del locus endógeno génico de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, próximo al extremo 3' del locus del segmento del gen V^hque se encuentra en la dirección 5' de los segmentos del gen DH. Para criar ratones que sean homocigóticos para una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada de ratón con segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada humana, es generalmente una solución laboriosa desarrollar machos y hembras que sean cada uno homocigóticos para la sustitución y esperar un apareamiento productivo. Las camadas satisfactorias tienen una frecuencia y tamaño bajos. En su lugar, se han empleado machos heterocigóticos para aparear con hembras homocigóticas para la sustitución para generar progenie que sea heterocigótica para la sustitución, criando a un ratón homocigótico a partir de la anterior. Los inventores han determinado que la causa probable de la pérdida de fertilidad en los ratones macho es la ausencia en ratones macho homocigóticos de una proteína ADAM6 funcional.

En diversos aspectos, los ratones macho que comprenden un gen ADAM6 dañado (es decir, no funcional o marginalmente funcional) presentan una reducción o eliminación de la fertilidad. Debido a que en ratones (y en otros roedores) el gen ADAM6 está localizado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina, los inventores han determinado que a fin de propagar ratones, o crear y mantener una raza de ratones que comprenda un locus sustituido de la cadena de la inmunoglobulina, se empleen algunos esquemas de reproducción o propagación modificados. La fertilidad baja, o infertilidad, de ratones macho homocigóticos para una sustitución del locus génico endógeno de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina convierte el mantenimiento de dicha modificación en un ratón en algo difícil. Mantener la raza puede comprender evitar los problemas de infertilidad presentados por ratones macho homocigóticos para la sustitución.

Se describe un método para mantener una raza de ratón que se describe en el presente documento. La raza de ratón no necesita comprender una secuencia de ADAM6 ectópica, y en algunas realizaciones, la raza de ratón es homocigótica o heterocigótica para una inactivación genética (por ejemplo, una inactivación genética funcional) de ADAM6.

La raza de ratón puede comprender una modificación de un locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina que da como resultado una reducción o pérdida de fertilidad en un macho de ratón. La modificación puede comprender una deleción de una región reguladora y/o una región de codificación de un gen ADAM6. La modificación puede comprender una modificación de un gen ADAM6 endógeno (región reguladora y/o de codificación) que reduce o elimina la fertilidad de un macho de ratón que comprende la modificación; la modificación puede reducir o eliminar la fertilidad de un macho de ratón que es homocigótico para la modificación.

La raza de ratón puede ser homocigótica o heterocigótica para una inactivación genética (por ejemplo, una inactivación genética funcional) o una deleción de un gen ADAM6.

La raza de ratón puede mantenerse aislándola de un ratón que es homocigótico o heterocigótico para la modificación de una célula, y empleando la célula donante en el embrión hospedador, y gestando el embrión hospedador y la célula donante en una madre sustituta, y obtener a partir de la madre sustituta una progenie que comprenda la modificación genética. En una realización, la célula es una célula ES. La célula donante puede ser una célula pluripotente, por ejemplo, una célula pluripotente inducida.

La raza de ratón puede mantenerse aislándola de un ratón que es homocigótico o heterocigótico para la modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende la modificación, e introduciendo la secuencia de ácido nucleico en un núcleo hospedador, y gestando una célula que comprende la secuencia de ácido nucleico y el núcleo hospedador en un animal adecuado. La secuencia de ácido nucleico puede introducirse en un embrión de oocito hospedador.

La raza de ratón puede mantenerse aislándola de un ratón que es homocigótico o heterocigótico para la modificación de un núcleo, e introduciendo el núcleo en una célula hospedadora, y gestando el núcleo y la célula hospedadora en un animal adecuado para obtener una progenie que es homocigótica o heterocigótica para la modificación.

La raza de ratón puede mantenerse empleando la fertilización in vitro (IVF) de un ratón hembra (silvestre, homocigótico para la modificación, o heterocigótico para la modificación) empleando el esperma de un macho de ratón que comprende la modificación genética. El macho de ratón puede ser heterocigótico para la modificación genética. El macho de ratón puede ser homocigótico para la modificación genética.

La raza de ratón puede mantenerse criando un macho de ratón que es heterocigótico para la modificación genética con un ratón hembra para obtener una progenie que comprende la modificación genética, identificar una progenie de machos y hembras que comprenda la modificación genética, y emplear un macho que es heterocigótico para la modificación genética en la reproducción con una hembra silvestre, homocigótica, o heterocigótica para la modificación genética para obtener una progenie que comprenda la modificación genética. Se puede repetir la etapa de cría de un macho heterocigótico para la modificación genética con una hembra silvestre, una hembra heterocigótica para la modificación genética, o una hembra homocigótica para la modificación genética a fin de mantener la modificación genética en la raza de ratón.

Se describe un método que se proporciona para mantener una raza de ratón que comprende una sustitución de un locus génico endógeno de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina con una o más secuencias de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, que comprende criar la raza de ratones a fin de generar ratones macho heterocigóticos, donde los ratones macho heterocigóticos se crían para mantener la modificación genética en la raza. La raza no necesita mantenerse mediante cualquier cría de un macho homocigótico con una hembra silvestre, o una hembra homocigótica o heterocigótica para la modificación genética.

La proteína ADAM6 es un miembro de la familia ADAM de proteínas, en el que ADAM es un acrónimo de una de una desintegrina A y metaloproteasa. La familia ADAM de proteínas es grande y diversa, con funciones diversas que incluyen la adhesión celular. Algunos miembros de la familia ADAM están implicados en la espermatogénesis y la fertilización. Por ejemplo, ADAM2 codifica una subunidad de la proteína fertilina, que está implicada en las interacciones esperma-huevo. ADAM3, o ciristetina, parece ser necesaria para la unión del esperma a la zona pelúcida. La ausencia tanto de ADAM2 como de ADAM3 da como resultado infertilidad. Se ha postulado que ADAM2, ADAM3, y ADAM6 forman un complejo sobre la superficie de los espermatozoides de ratón. El gen ADAM6 humano, que se encuentra normalmente entre los segmentos génicos V^hhumano V^h1-2 y V^h6-1, parece ser un pseudogen (Figura 12). En ratones, existen dos genes ADAM6, ADAM6a y ADAM6b que se encuentran en una región intergénica entre los segmentos génicos VH y D^h, y en el ratón, los genes ADAM6a y ADAM6b se orientan en una orientación transcripcional opuesta a la de los segmentos génicos de la inmunoglobulina que los rodean (FIG.

12). En ratones, se requiere aparentemente un locus de ADAM6 funcional para una fertilización normal. Un locus o secuencia de ADAM6 funcional, entonces, se refiere a un locus o secuencia de ADAM6 que puede complementar, o rescatar, la fertilización drásticamente reducida presentada en ratones macho con loci endógenos de ADAM6 desaparecidos o no funcionales.

La posición de la secuencia intergénica en ratones que codifica ADAM6a y ADAM6b vuelve la secuencia intergénica susceptible a modificación cuando se modifica una cadena pesada endógena de ratón. Cuando los segmentos génicos V^hse eliminan o sustituyen, o cuando los segmentos de los genes D^hse eliminan o sustituyen, existe una elevada probabilidad de que un ratón resultante presente un grave déficit de fertilidad. A fin de compensar el déficit, el ratón está modificado para incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que complementará la pérdida de la actividad de ADAM6 debida a la modificación del locus endógeno de ADAM6 de ratón. En varias realizaciones, la secuencia de nucleótidos complementaria es una que codifica ADAM6a de ratón, ADAM6b de ratón, o un homólogo u ortólogo o su fragmento funcional que rescata el déficit de fertilidad.

La secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se puede colocar en cualquier posición adecuada. Se puede colocar en la región intergénica, o en cualquier posición adecuada en el genoma (es decir, ectópicamente). En una realización, la secuencia de nucleótidos se puede introducir en un transgén que se integra aleatoriamente en el genoma de ratón. En una realización, la secuencia puede mantenerse episómicamente, es decir, en un ácido nucleico separado más bien que en un cromosoma de ratón. Las posiciones adecuadas incluyen posiciones que son transcripcionalmente permisivas o activas, por ejemplo, un locus ROSA26 (Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), un locus BT-5 (Michael et al., 1999, Mech. Dev. 85:35-47), o un locus Oct4 (Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464). Se describen secuencias de nucleótidos dirigidas a loci transcripcionalmente activos, por ejemplo, en el documento US 7.473.557.

Como alternativa, la secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad puede acoplarse con un promotor inducible con el fin de facilitar la expresión en las células y/o tejidos adecuados, por ejemplo, tejidos reproductores. Los promotores inducibles ilustrativos incluyen promotores activados mediante medios físicos (por ejemplo, promotor del choque térmico) y/o químicos (por ejemplo, IPTG o Tetraciclina).

Además, la expresión de la secuencia de nucleótidos puede unirse a otros genes a fin de conseguir la expresión en los estadíos específicos de desarrollo o en tejidos específicos. Se puede conseguir dicha expresión colocando la secuencia de nucleótidos en unión operativa con el promotor de un gen expresado en un estadío específico de desarrollo. Por ejemplo, secuencias de inmunoglobulina de una especie genomanipulada en el genoma de una especie hospedadora se colocan unidas operativamente a una secuencia promotora de un gen CD19 (un gen específico de linfocitos B) de la especie hospedadora. Se consigue la expresión específica de los linfocitos B en los estadíos precisos del desarrollo cuando se expresan las inmunoglobulinas.

Otro método adicional para conseguir una sólida expresión de una secuencia de nucleótidos insertada es emplear un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK y CAGG. De una manera similar, la secuencia de nucleótidos deseada se coloca en unión operativa con un promotor constitutivo seleccionado, que proporciona un elevado nivel de expresión de la(s) proteína(s) codificada(s) por la secuencia de nucleótidos.

Se pretende que el término "ectópico" incluya un desplazamiento, o una colocación en una posición que no se encuentra normalmente en la naturaleza (por ejemplo, la colocación de una secuencia de ácido nucleico en una posición que no es la misma posición que la secuencia de ácido nucleico que se encuentra en un ratón silvestre). El término, en algunas realizaciones, se usa en el sentido de un objeto que se encuentra fuera de su posición normal o correcta. Por ejemplo, la frase "una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica..." se refiere a una secuencia de nucleótidos que aparece en una posición en la cual no se encuentra normalmente en el ratón. Por ejemplo, en el caso de una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6 de ratón (o un ortólogo u homólogo o uno de sus fragmentos que proporciona el mismo o similar beneficio de fertilidad en ratones macho), la secuencia se puede colocar en una posición diferente en el genoma del ratón que la que se encuentra en un ratón silvestre. En esos casos, se crearan secuencias novedosas de la secuencia de ratón colocando la secuencia en una posición diferente en el genoma del ratón que en un ratón silvestre. Un homólogo u ortólogo funcional de ADAM6 de ratón es una secuencia que confiere un rescate de pérdida de fertilidad (porejemplo, la pérdida de la capacidad de un ratón macho para generar progenie mediante apareamiento) que se observa en un ratón ADAM6'/'. Los homólogos u ortólogos funcionales incluyen proteínas que tienen al menos aproximadamente un 89 % de identidad o más, por ejemplo, hasta un 99 % de identidad, con la secuencia de aminoácidos de ADAM6a y/o con la secuencia de aminoácidos de ADAM6b, y que pueden complementar, o rescatar la capacidad de aparearse satisfactoriamente, de un ratón que tiene un genotipo que incluye una deleción o inactivación genética de ADAM6a y/o ADAM6b.

La posición ectópica puede ser en cualquier parte (por ejemplo, como con la inserción aleatoria de un transgén que contiene una secuencia de ADAM6 de ratón), o puede ser, por ejemplo, en una posición que se aproxima (pero no es precisamente la misma que) su localización en un ratón silvestre (por ejemplo, en un locus endógeno modificado de inmunoglobulina de ratón, pero tanto anterior o posterior a su posición natural, por ejemplo, en un locus modificado de inmunoglobulina pero entre diferentes segmentos génicos, o en una posición diferente en una secuencia V-D intergénica de ratón). Un ejemplo de una colocación ectópica es una colocación es locus humanizado de una cadena pesada de inmunoglobulina. Por ejemplo, un ratón que comprende una sustitución de uno o más segmentos endógenos del gen Vh con segmentos humanos del gen VH, donde la sustitución elimina una secuencia endógena de ADAM6, se puede genomanipular para tener una secuencia de ADAM6 de ratón localizada en una secuencia que contienen segmentos génicos V^hhumano. La modificación resultante generaría una secuencia (ectópica) de ADAM6 de ratón en una secuencia génica humana, y la colocación (ectópica) de la secuencia de ADAM6 de ratón en la secuencia génica humana puede aproximarse a la posición del pseudogen ADAM6 humano (es decir, entre dos segmentos V) o puede aproximarse a la posición de la secuencia de ADAM6 de ratón (es decir, en la región intergénica de V-D). Las uniones resultantes de la secuencia creadas mediante la unión de una secuencia (ectópica) de ADAM6 de ratón en o adyacente a una secuencia génica humana (por ejemplo, una secuencia génica de inmunoglobulina) en la línea germinal del ratón sería novedosa en comparación con la misma o similar posición en el genoma de un ratón silvestre.

Se describen animales no humanos que carecen de ADAM6 o un homólogo o su ortólogo, donde la carencia vuelve infértil al animal no humano, o reduce sustancialmente la fertilidad del animal no humano. La carencia de ADAM6 o del ortólogo o su homólogo puede ser debida a una modificación de un locus endógeno de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Una reducción sustancial de la fertilidad es, por ejemplo, una reducción en la fertilidad (por ejemplo, en la frecuencia reproductiva, en las crías por camada, en las crías por año, etc.) de aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % o más. En varias realizaciones, los animales no humanos se suplementas con un gen ADAM6 de ratón o el ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un macho del animal no humano, en las que el gen ADAM6 suplementado o el ortólogo o el homólogo o su fragmento funcional rescata la reducción de la fertilidad completamente o en una parte sustancial. Un rescate de fertilidad en una parte sustancial es, por ejemplo, una restauración de la fertilidad de tal manera que el animal no humano presenta una fertilidad que es al menos del 70 %, 80 %, o 90 % o más en comparación con un locus no modificado (es decir, un animal sin una modificación en el gen ADAM6 o en el ortólogo o su homólogo) de la cadena pesada.

La secuencia que se confiere en el animal genéticamente modificado (es decir, el animal que carece de ADAM6 funcional o el ortólogo o su homólogo, debido a, por ejemplo, una modificación de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina) es, en algunas realizaciones, seleccionada a partir de un gen ADAM6 o un ortólogo u homólogo del mismo. Por ejemplo, en un ratón, la pérdida de la función de ADAM6 se rescata añadiendo, en una realización, un gen ADAM6 de ratón. En una realización, la pérdida de la función de ADAM6 en el ratón se rescata añadiendo un ortólogo u homólogo de una especie estrechamente relacionada con respecto al ratón, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o una raza o especie diferente, una rata de cualquier especie, un roedor; donde la adición del ortólogo u homólogo al ratón rescata la pérdida de fertilidad debida a la pérdida de la función de ADAM6 o la pérdida de un gen ADAM6. Los ortólogos y homólogos de otras especies, en algunas realizaciones, se seleccionan de especies filogenéticamente relacionadas y, en algunas realizaciones, presentan un porcentaje de identidad con el ADAM6 endógeno (u ortólogo) que es aproximadamente el 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 96 % o más, o 97 % o más; y esta pérdida de fertilidad relacionada con el rescate de ADAM6 o (en un animal no ratón) o relacionada con el ortólogo de ADAM6. Por ejemplo, en una rata macho genéticamente modificada que carece de la función de ADAM6 (porejemplo, una rata con una región variable endógena de la cadena pesada de la inmunoglobulina sustituida con una región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, o una inactivación genética en la región de la cadena pesada de la inmunoglobulina), la pérdida de fertilidad en la rata es rescatada mediante la adición de una rata ADAM6 o, en algunas realizaciones, un ortólogo de una rata ADAM6 (por ejemplo, un ortólogo de ADAM6 de otra raza o especie de rata, o, en una realización, de un ratón).

De esta manera, en algunas realizaciones, los animales genéticamente modificados que no presentan fertilidad o que presentan una reducción de la fertilidad debida a la modificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 (o un ortólogo o su homólogo) o una región reguladora unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico, comprende una secuencia de ácido nucleico que complementa, o restaura, la pérdida de fertilidad en el que la secuencia de ácido nucleico que complementa o restaura la pérdida de fertilidad es de una raza diferente de la misma especie o de especies filogenéticamente relacionadas. La secuencia de ácido nucleico complementario es un ortólogo u homólogo de ADAM6 o su fragmento funcional. El ortólogo u homólogo de ADAM6 complementario o su fragmento funcional es de un animal no humano que está estrechamente relacionado con el animal genéticamente modificado que tiene el defecto de fertilidad. Por ejemplo, en el que el animal genéticamente modificado es un ratón de una raza concreta, se puede obtener un ortólogo u homólogo de ADAM6 o su fragmento funcional de un ratón de otra raza, o de un ratón de una especie relacionada. El ortólogo o el homólogo de ADAM6 o su fragmento funcional se selecciona de un animal del orden Rodentia, o del suborden Myomorpha.

En varias realizaciones, uno o más ortólogos u homólogos de ADAM6 de roedor o sus fragmentos funcionales de un roedor en una familia restauran la fertilidad en un roedor genéticamente modificado de la misma familia que carece de un ortólogo u homólogo de ADAM6 (por ejemplo, Cricetidae (por ejemplo, hámsteres, ratas y ratones del nuevo mundo, topillos); Muridae (por ejemplo, ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas de crin)).

En varias realizaciones, los ortólogos, homólogos, y sus fragmentos se evalúan para la funcionalidad discerniendo si el ortólogo, homólogo, o fragmento restaura la fertilidad en un animal no humano macho genéticamente modificado que carece de la actividad de ADAM6 (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o rata, que comprende una inactivación genética de ADAM6 o su ortólogo). En varias realizaciones, la funcionalidad se define como la capacidad de un esperma de un animal genéticamente modificado que carece de ADAM endógeno o del ortólogo o su fragmento de migar por un oviducto y fertilizar un óvulo de la misma especie de un animal genéticamente modificado.

En diversos aspectos, se pueden crear ratones que comprendan deleciones o sustituciones del locus endógeno de la región variable de la cadena pesada o de sus porciones que contengan una secuencia ectópica de nucleótidos que codifique una proteína que confiera similares beneficios de fertilidad a un ratón ADAM6 (por ejemplo, un ortólogo o un homólogo o su fragmento que es funcional en un ratón macho). la secuencia ectópica de nucleótidos puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína que sea un homólogo u ortólogo de ADAM6 (o su fragmento) de una raza de ratones diferentes o de una especie diferente, por ejemplo, una especie diferente de roedor, y que confiere un beneficio en la fertilidad, por ejemplo, un número aumentado de camadas en un periodo de tiempo especificado, y/o un número aumentado de crías por camada, y/o la capacidad de un espermatozoide de un ratón macho de atravesar un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón.

En una realización, ADAM6 es un homólogo u ortólogo que es al menos un 89 % a 99 % idéntica a una proteína ADAM6 de ratón (por ejemplo, al menos un 89 % a 99 % idéntica a ADAM6a de ratón o ADAM6b de ratón). En una realización, la secuencia ectópica de nucleótidos codifica una o más proteínas seleccionadas independientemente de una proteína al menos un 89 % idéntica a ADAM6a de ratón, una proteína al menos 89 % idéntica a ADAM6b de ratón, y una de sus combinaciones. En una realización, el homólogo u ortólogo es una proteína de rata, hámster, ratón, que se modifica de esta manera para ser aproximadamente un 89 % o más idéntica a ADAM6a y/o ADAM6b de ratón. En una realización, el homólogo u ortólogo es o es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a ADAM6a y/o ADAM6b de ratón.

ADAM6 ectópico en ratones de cadena pesada humanizada

Desarrollos en el direccionamiento génico, por ejemplo, el desarrollo de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) permite ahora la recombinación de fragmentos genómicos relativamente grandes. La genomanipulación de BAC ha permitido la capacidad de realizar deleciones grandes, e inserciones grandes, en las células ES de ratón.

Los ratones que fabrican anticuerpos humanos han estados disponibles desde algún tiempo. Aunque representan un importante avance en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos humanos, estos ratones presentan numerosas anomalías significativas que limitan su utilidad. Por ejemplo, presentan un desarrollo de linfocitos B comprometido. El desarrollo comprometido puede ser debido a varias diferencias entre ratones transgénicos y ratones silvestres. Los anticuerpos humanos pueden no interactuar óptimamente con prelinfocitos B o receptores de los linfocitos B en la superficie de las células de ratón que señalizan la maduración, proliferación, o supervivencia durante la selección clonal. Los anticuerpos completamente humanos pueden no interactuar óptimamente con un sistema del receptor de Fc de ratón; los ratones expresan los receptores de Fc que no presentan una correspondencia uno a uno con los receptores de Fc humano. Finalmente, algunos ratones que fabrican anticuerpos completamente humanos no incluyen todas las secuencias genuinas de ratón, por ejemplo, elementos potenciadores en la dirección 3' y otros elementos de control del locus, que pueden requerirse para el desarrollo de linfocitos B silvestres.

Los ratones que fabrican anticuerpos completamente humanos comprenden loci endógenos de inmunoglobulina que están de alguna manera inhabilitados, y se introducen transgenes humanos que comprenden segmentos génicos variables y constantes de la inmunoglobulina en una localización aleatoria en el genoma de ratón. Siempre que el locus endógeno esté suficientemente inhabilitado a fin de no reordenar segmentos génicos para formar un gen de inmunoglobulina funcional, la meta de fabricar anticuerpos completamente humanos puede casi conseguirse en el mencionado ratón con el desarrollo de linfocitos B comprometidos.

Aunque obligados a fabricar anticuerpos completamente humanos a partir de un locus de transgenes humanos, generar anticuerpos humanos en un ratón es aparentemente un proceso desfavorecido. En algunos ratones, el proceso está desfavorecido de esta manera para dar como resultado la formación de cadenas pesadas de la región variable humana/constante de ratón (pero no cadenas ligeras) a través del mecanismo de cambio en trans. Mediante este mecanismo, los transcritos que codifican anticuerpos completamente humanos que experimentan el cambio de isotipo en trans desde el isotipo humano a un isotipo de ratón. El proceso es en trans, debido a que el transgén completamente humano se localiza lejos del locus endógeno que retiene una copia no dañada de un gen de la región constante de la cadena pesada de ratón. Aunque en dichos ratones, el cambio en trans es muy evidente, el fenómeno sigue siendo insuficiente para rescatar el desarrollo de linfocitos B, que sigue estando francamente deteriorado. En cualquier caso, los anticuerpos con cambios en trans fabricados en dichos ratones retienen cadenas ligeras completamente humanas, debido a que el fenómeno de cambio en trans no se produce aparentemente con respecto a las cadenas ligeras; el cambio en trans se basa presumiblemente en secuencias de cambio en los loci endógenos utilizados (casi diferentes) en cambios de isotipo normales en cis. De esta manera, incluso cuando los ratones genomanipulados fabrican anticuerpos completamente humanos seleccionan un mecanismo de cambio en trans para fabricar anticuerpos con regiones constantes de ratón, la estrategia es todavía insuficiente para rescatar un desarrollo normal de linfocitos B.

Un riesgo principal en la fabricación de agentes de tratamiento humano basados en anticuerpos es preparar una diversidad suficientemente grande de secuencias de la región variable de la inmunoglobulina humana para identificar dominios variables útiles que reconocen específicamente epítopos concretos y se unen a ellos con una afinidad deseable, usualmente, pero no siempre con una elevada afinidad. Antes del desarrollo de ratones VELOCIMMUNE® (descrito en el presente documento), no había indicaciones de que los ratones que expresaban regiones variables humanas con regiones constantes de ratón exhibirían diferencias significativas procedentes de ratones que fabrican anticuerpos humanos a partir de un transgén. Esta suposición, sin embargo, era incorrecta.

ratones VELOCIMMUNE®, que contienen una sustitución precisa de regiones variables de la inmunoglobulina de ratón con regiones variables de la inmunoglobulina humana en loci endógenos de ratón, presentan una sorprendente y remarcable similitud con ratones silvestres con respecto al desarrollo de linfocitos B. En un desarrollo sorprendente y llamativo, los ratones VELOCIMMUNE® presentaron una respuesta a la inmunización normal esencialmente natural que difirió solo en un aspecto significativo de las regiones variables de los ratones silvestres - las regiones variables generadas en respuesta a la inmunización son completamente humanas.

Los ratones VELOCIMMUNE® contienen una sustitución a gran escala precisa de regiones variables de la línea germinal de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana de ratón (IgH) y de la cadena ligera de la inmunoglobulina (por ejemplo, una cadena ligera ^k, IgK) con las regiones variables correspondientes de la inmunoglobulina humana, en los loci endógenos. En total, aproximadamente seis megabases de los loci de ratón se sustituyen con aproximadamente 1,5 megabases de la secuencia genómica humana. Esta sustitución precisa da como resultado un ratón con loci híbridos de inmunoglobulina que fabrican las cadenas pesada y ligera que tienen regiones variables humanas y una región constante de ratón. La sustitución precisa de los segmentos V^h-D^h-J^hand V^k-J^kdeja intactas y funcionales las secuencias flanqueantes de ratón en los loci híbridos de la inmunoglobulina. El sistema inmune humoral de las funciones del ratón es similar al de un ratón silvestre. El desarrollo de linfocitos B no está impedido en ningún aspecto significativo y se genera una rica diversidad de regiones variables humanas en el ratón tras el estímulo del antígeno.

Los ratones VELOCIMMUNE® son posibles debido a que los segmentos génicos de la inmunoglobulina de las cadenas pesada y ligera k se reordenan de forma similar en seres humanos y ratones, lo que no significa que sus loci sean iguales o incluso casi tan claramente que no lo son. Sin embargo, los loci son lo suficientemente similares para poder realizar la inmunización del locus génico de la región variable de la cadena pesada sustituyendo aproximadamente tres millones de pares de bases de la secuencia contigua de ratón que contienen todos los segmentos génicos V^h, D^h, y J^hcon aproximadamente un millón de bases de la secuencia genómica contigua humana que cubren básicamente la secuencia equivalente de un locus de la inmunoglobulina humana.

En algunas realizaciones, la sustitución adicional de determinadas secuencias génicas de la región constante de ratón con secuencias génicas humanas (por ejemplo, la sustitución se la secuencia C^h1 de ratón con la secuencia C^h1 humana, y la sustitución de la secuencia C^lde ratón con la secuencia C^lhumana) da como resultado ratones con loci híbridos de inmunoglobulina que fabrican anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes parcialmente humanas, adecuadas para, por ejemplo, preparar fragmentos de anticuerpos completamente humanos, por ejemplo, Fab completamente humanos. Ratones con loci híbridos de inmunoglobulina presentan una reordenación normal del segmento génico de la región variable, frecuencias normales de hipermutación somática, y cambios de clase normales. Estos ratones presentan un sistema inmune humoral que es indistinguible del que tiene el ratón silvestre, y presentan poblaciones normales de células en todas las etapas de desarrollo de los linfocitos B y estructuras normales de órganos linfáticos - incluso cuando el ratón carece de un repertorio completo de segmentos génicos de la región variable humana. Inmunizar estos ratones da como resultado respuestas humorales sólidas que presentan una amplia diversidad de utilización de segmentos génicos variables. La sustitución precisa de segmentos génicos de la región variable de la línea germinal de ratón permite crear ratones que tienen loci de inmunoglobulina parcialmente humanos. Debido a que los loci de inmunoglobulina parcialmente humanos se reordenan, se hipermutan, y cambian de clase normalmente, los loci de inmunoglobulina parcialmente humanos generan anticuerpo en un ratón que comprenden regiones variables humanas. Se pueden identificar y clonar secuencias de nucleótidos que codifican regiones variables, a continuación, fusionarse (por ejemplo, en un sistema in vitro) con cualquier secuencia de elección, por ejemplo, cualquier isotipo de inmunoglobulina adecuado para un uso concreto, dando como resultado un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno derivada completamente de secuencias humanas.

La humanización a gran escala mediante métodos de ingeniería recombinógena se utilizaron para modificar embriocitoblastos (ES) de ratón para sustituir con precisión hasta tres megabases del locus de inmunoglobulina de la cadena pesada de ratón que incluían esencialmente todos los segmentos génicos V^h, D^h, y J^hcon segmentos génicos humanos equivalentes con hasta una secuencia genómica humana de una megabase que contiene algunos o esencialmente todos los segmentos génicos V^h, D^h, y J^hhumanos. Se ha usado hasta la mitad del segmento de megabase del genoma humano que comprende una de dos repeticiones que codifican esencialmente todos los segmentos génicos Vk y Jk para sustituir un segmento de tres megabases del locus de la cadena ligera de la inmunoglobulina ^kque contiene esencialmente todos los segmentos génicos V^ky J^k.

Los ratones con dichos loci de inmunoglobulina sustituidos pueden comprender una perturbación o deleción del locus endógeno de ADAM6 de ratón, que se encuentra normalmente entre los segmentos 3' de la mayoría de genes V^Hy los segmentos 5' de la mayoría de genes D^hen el locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. La perturbación en esta región puede conducir a la reducción o eliminación de la funcionalidad del locus endógeno de ADAM6 de ratón. si los segmentos 3' de la mayoría de genes V^hdel repertorio de la cadena pesada humana se convierten en una sustitución, una región intergénica que contiene un pseudogen que parece ser un pseudogen ADAM6 humano está presente entre estos segmentos génicos V^h, es decir, entre V^h1-2 y V^h1-6 humanos. Sin embargo, los ratones macho que comprenden esta secuencia intergénica humana presentan una reducción en la fertilidad.

Se describe que los ratones comprenden los loci sustituidos como se ha descrito anteriormente, y comprenden también una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica ADAM6 de ratón, en el que el ratón presenta esencialmente fertilidad normal. La secuencia de ácido nucleico ectópica comprende una secuencia ADAM6a de ratón y una secuencia ADAM6b de ratón o sus fragmentos funcionales que pueden estar colocados entre V^h1-2 humano y V^h6-1 humano en un locus endógeno modificado de la cadena pesada. En una realización, la secuencia de ácido nucleico ectópica es la SEC ID N°: 3, colocada entre V^h1-2 humano y V^h6-1 humano en un locus endógeno modificado de la cadena pesada. La dirección de la transcripción de los genes ADAM6 de la SEC ID N°: 3 son opuestos con respecto a la dirección de la transcripción de los segmentos génicos V^hhumanos que lo rodean.

El fenómeno de complementar un ratón que carece de un locus de ADAM6 funcional con una secuencia ectópica que comprende un gen ADAM6 de ratón o el ortólogo u homólogo o su fragmento funcional es un método que es aplicable para rescatar cualesquiera ratones con loci de ADAM6 endógenos no funcionales o mínimamente funcionales. De esta manera, muchísimos ratones que comprenden una modificación perturbadora de ADAM6 del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina pueden ser rescatados con las composiciones y métodos de la invención. Por consiguiente, la invención comprende ratones con una amplia variedad de modificaciones en los loci de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprenden la función endógena de ADAM6. Se proporcionan en esta descripción algunos ejemplos (no limitantes). Además de los ratones VELOCIMMUNE® descritos, las composiciones y métodos relacionados con ADAM6 se pueden usar en muchísimas aplicaciones, por ejemplo, cuando se modifica un locus de la cadena pesada en una amplia variedad de maneras.

En un aspecto, se proporcionaron ratones que comprendían una secuencia ectópica de nucleótidos que codificaba una proteína ADAM6 funcional (o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón con uno o más segmentos génicos V^hhumanos, una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos de los genes D^hy los segmentos de los genes J^hde ratón con los segmentos de los genes D^hy los segmentos de los genes J^hhumanos; en el que el ratón carece de C^h1 y/o la región bisagra. En una realización, el ratón fabrica una única proteína de unión al dominio variable que es un dímero de las cadenas de inmunoglobulina seleccionadas entre: (a) V^hhumano - C^h1 ratón - C^h2 ratón - C^h3 ratón; (b) V^hhumano - bisagra de ratón - C^h2 de ratón - C^h3 ratón; y, (c) V^hhumano - C^h2 ratón - C^h3 ratón.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se coloca en una secuencia de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (por ejemplo, entre los segmentos 1-2 del gen V^hy 1-6 del gen V^h) en un ratón que tiene una sustitución de uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón (de mVH, mD^H, y/o ^itiJ^h) con uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón (de hV^H, hD^H, y/o hJ^H), y el ratón comprende además una sustitución de uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena ligera k de la inmunoglobulina (de mVK y mJK) con uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina (de hVK y/o hJK).

En una realización, el uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón comprenden aproximadamente tres megabases del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. En una realización, el uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón comprende al menos 89 segmentos génicos V^h, al menos 13 segmentos de los genes D^H, al menos cuatro segmentos de los genes JH o una de sus combinaciones del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. En una realización, el uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana comprenden aproximadamente una megabase del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana. En una realización, el uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana comprende al menos 80 segmentos génicos V^h, al menos 27 segmentos de los genes D^h, al menos seis segmentos de los genes J^ho una de sus combinaciones de un locus variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana.

En una realización, el uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina de ratón comprende aproximadamente tres megabases del locus de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina de ratón. En una realización, el uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena ligera k de la inmunoglobulina de ratón comprende al menos 137 segmentos génicos Vk, al menos cinco segmentos de los genes J^ko una de sus combinaciones del locus de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina de ratón. En una realización, el uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina comprende aproximadamente la mitad de la megabase de un locus de la cadena ligera k de la inmunoglobulina. En una realización específica, el uno o más de uno segmentos génicos de la región variable de la cadena ligera k de la inmunoglobulina comprende la repetición proximal con respecto a la región constante k de la inmunoglobulina) de un locus de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina humana. En una realización, el uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena ligera ^kde la inmunoglobulina humana comprende al menos 40 segmentos génicos Vk, al menos cinco segmentos de los genes Jk o una de sus combinaciones del locus de la cadena ligera k de la inmunoglobulina humana.

En una realización, la secuencia de nucleótidos se coloca entre dos segmentos génicos de la inmunoglobulina humana. En una realización específica, los dos segmentos génicos de la inmunoglobulina humana son segmentos génicos de la cadena pesada. En una realización, la secuencia de nucleótidos se coloca entre un segmento 1-2 del gen V^hy un segmento 1-6 del gen V^hen un ratón VELOCIMMUNE® (documento US 6.596.541 y US 7.105.348). En una realización, el ratón VELOCIMMUNE® modificado de esta manera comprende una sustitución de segmentos génicos de la región variable de la inmunoglobulina de ratón con al menos 80 segmentos génicos V^hhumanos, 27 segmentos de los genes D^hhumanos y seis segmentos de los genes J^hhumanos, y una sustitución de segmentos génicos de la región variable de la cadena ligera k de la inmunoglobulina con al menos 40 segmentos génicos Vk y cinco segmentos de los genes Jk.

En un aspecto, un locus funcional de ADAM6 de ratón (o un ortólogo u homólogo o sus fragmentos funcionales) está presente en los segmentos medios del gen V^hhumano que sustituye el gen V^hhumano. En una realización, al menos 89 segmentos génicos V^hde ratón se eliminan y sustituyen con uno o más segmentos génicos V^hhumanos, y el locus de ADAM6 de ratón está presente inmediatamente adyacente al extremo 3' de los segmentos génicos V^hhumanos, o entre dos segmentos génicos V^hhumanos, En una realización específica, el locus de ADAM6 de ratón está presente entre dos segmentos génicos V^hen aproximadamente 20 kilo bases (kb) a aproximadamente 40 kilo bases (kb) del extremo 3' de los segmentos insertados en los genes V^hhumanos. En una realización específica, el locus de ADAM6 de ratón está presente entre dos segmentos génicos V^hen aproximadamente 29 kb a aproximadamente 31 kb del extremo 3' de los segmentos insertados en los genes V^Hhumanos. En una realización específica, y el locus de ADAM6 de ratón está presente inmediatamente adyacente al extremo 3' de los segmentos génicos V^hhumanos, En una realización específica, el locus de ADAM6 de ratón está presente en aproximadamente 30.184 pb del extremo 3' de los segmentos insertados del gen VH humano. En una realización específica, la sustitución incluye los segmentos V^h1-2 y V^h6-1 humanos, y el locus de ADAM6 de ratón está presente en la dirección 3' del segmento génico V^h1-2 y en la dirección 5' del segmento génico V^h6-1. En una realización específica, el locus de ADAM6 de ratón está presente entre un segmento génico V^h1-2 humano y un segmento génico V^h6-1 humano, donde el extremo 5' del locus de ADAM6 de ratón tiene aproximadamente 13.848 pb desde el extremo 3' del segmento génico V^h1-2 humano y el extremo 3' del locus de ADAM6 tiene aproximadamente 29.737 pb desde el extremo 5' del segmento génico V^H6-1 humano. En una realización específica, el locus de ADAM6 de ratón comprende la SEC ID N°: 3 o uno de sus fragmentos que confieren la función de ADAM6 en las células de ratón. En una realización específica, la disposición de los segmentos génicos V^hhumanos es entonces la siguiente (de la dirección 5' a la dirección 3' con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos V^hhumanos): V^h1-2 humano - locus de ADAM6 de ratón - V^h6-1 humano. En una realización específica, El pseudogen ADAM6 entre V^h1-2 humano y V^h6-1 humano está sustituido con el locus de ADAM6 de ratón. En una realización, la orientación de uno o más de uno ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón del locus de ADAM6 locus es opuesta con respecto a la dirección de la transcripción comparada con la orientación de los segmentos génicos V^hhumanos. Como alternativa, el locus de ADAM6 de ratón está presente en la región intergénica entre el segmento 3' de la mayoría de genes V^hhumanos y el segmento 5' de la mayoría de genes D^h. Este puede ser el caso cuando el segmento 5' de la mayoría de genes D^hes de ratón o ser humano.

De manera similar, un ratón modificado con uno o más segmentos génicos V^l(por ejemplo, los segmentos V^ko VA) que sustituyen todos o sustancialmente todos los segmentos endógenos del gen V^hde ratón pueden modificarse con el fin de mantener cualquier locus endógeno de ADAM6 de ratón, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, empleando un vector director que tenga un brazo de homología en la dirección 3' que incluya un locus ADAM6 de ratón o uno de sus fragmentos funcionales, o sustituir un locus dañado de ADAM6 de ratón con una secuencia ectópica situada entre dos segmentos génicos V^lhumanos o entre los segmentos génicos V^lhumanos y un segmento del gen DH (tanto humano como de ratón, por ejemplo, VA m/hDH), o un segmento J (tanto humano como de ratón, por ejemplo, V^k+ J^h). En una realización, la sustitución incluye dos o más segmentos génicos V^lhumanos, y el locus ADAM6 de ratón o su fragmento funcional está presente entre los dos segmentos 3' de la mayoría de genes V^l. En una realización específica, la disposición de los segmentos génicos V^lhumano es entonces la siguiente (desde la dirección 5' a la dirección 3' con respecto a la dirección de la transcripción de los segmentos génicos humanos): V^l3'-1 humano - locus de ADAM6 - V^l3' humano. En una realización, la orientación de uno o más ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón y del locus de ADAM6 es opuesta con respecto a la dirección de la transcripción en comparación con la orientación de los segmentos génicos Vl humanos. Como alternativa, el locus de ADAM6 de ratón está presente en la región intergénica entre el segmento 3' de la mayoría de genes V^lhumanos y el segmento 5' de la mayoría de genes Dh. Este puede ser el caso cuando el segmento 5' de la mayoría de genes D^Hes de ratón o ser humano.

Se describe un ratón con una sustitución de uno o más segmentos endógenos del gen V^hde ratón, y que comprenden al menos un segmento endógeno del gen Dh de ratón. En dicho ratón, la modificación de los segmentos endógenos del gen Vh de ratón comprende una modificación de uno o más segmentos 3' de la mayoría de genes Vh, pero no de los segmentos 5' de la mayoría de genes D^h, cuando se tiene cuidado con el fin de que la modificación de los uno o más segmentos 3' de la mayoría de genes V^hno perturbe o vuelva el locus endógeno de ADAM6 funcional. Por ejemplo, en una realización, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos endógenos del gen Vh de ratón con uno o más segmentos génicos Vh humanos, y el ratón comprende uno o más segmentos endógenos del gen D^hy un locus endógeno de ADAM6 de ratón.

El ratón puede comprender la modificación de los segmentos 3' endógenos de la mayoría de genes Vh, y una modificación de uno o más segmentos endógenos del gen Dh de ratón, y la modificación se lleva a cabo de tal manera que mantiene la integridad del locus endógeno de ADAM6 de ratón en la extensión en la que el locus endógeno de ADAM6 sigue siendo funcional. En un ejemplo, Dicha modificación se realiza en dos etapas: (1) sustituir los segmentos 3' de la mayoría de genes V^Hendógenos de ratón con uno o más segmentos génicos V^Hhumanos que emplean un vector director con un brazo de homología en la dirección 5' y un brazo de homología en la dirección 3' donde el brazo de homología en la dirección 3' incluye todo o una porción de un locus funcional de ADAM6 de ratón; (2) sustituyendo a continuación un segmento endógeno del gen Dh de ratón con un vector director que tiene un brazo de homología en la dirección 5' que incluye todo o una porción funcional de un locus de ADAM6 de ratón.

En diversos aspectos, emplear ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o su homólogo funcional es útil cuando las modificaciones perturban la función de ADAM6 endógeno de ratón. La probabilidad de perturbar la función endógena de ADAM6 de ratón es alta cuando se preparan modificaciones de los loci de inmunoglobulina de ratón, en particular cuando se modifican regiones variables de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón y las secuencias de la rodean. Por tanto, dichos ratones proporcionan un beneficio concreto cuando se crean ratones con loci de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se eliminan en todo o en parte, se humanizan en todo o en parte, o se sustituyen (por ejemplo, con secuencias V^ko VA) en todo o en parte. Los expertos en la materia conocen los métodos para crear las modificaciones genéticas descritas para los ratones descritos a continuación.

Los ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón o una proteína sustancialmente idéntica o similar que confiere los beneficios de fertilidad de una proteína ADAM6 de ratón, son particularmente útiles junto con las modificaciones en un locus génico de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón que perturba o elimina la secuencia endógena de ADAM6 de ratón. Aunque se describe principalmente vinculada a ratones que expresan anticuerpos con regiones variables humanas y regiones constantes de ratón, dichos ratones son útiles vinculadas a cualquier modificación genética que perturbe los genes endógenos de ADAM6 de ratón. Las personas expertas reconocerán que esto abarca una amplia variedad de ratones genéticamente modificado que contienen modificaciones de los loci génicos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. Estos incluyen, por ejemplo, ratones con una deleción o una sustitución de todos o una porción de los segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, con respecto a otras modificaciones. Se describen a continuación ejemplos no limitantes.

En algunos aspectos, se proporcionan ratones genéticamente modificados que comprenden un ratón, roedor ectópico, u otro gen ADAM6 (o el ortólogo o el homólogo o un fragmento) funcional en un ratón, y uno o más segmentos génicos de la región variable y/o la región constante de la inmunoglobulina humana. En varias realizaciones, otros ortólogos de ADAM6 o los homólogos o fragmentos funcionales en un ratón pueden incluir secuencias de bóvido, cánido, primate, conejo u otras secuencias no humanas.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ectópica de ADAM6 que codifica una proteína ADAM6 funcional, una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^Hcon uno o más segmentos génicos V^Hhumanos; una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos de los genes D^Hhumano con uno o más segmentos de los genes D^Hhumanos; y una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos de los genes Jh de ratón con uno o más segmentos de los genes Jh humanos.

En una realización, el ratón comprende además una sustitución de una secuencia de nucleótidos C^h1 de ratón con una secuencia de nucleótidos Ch1 humana. En una realización, el ratón comprende además una sustitución de una secuencia de nucleótidos bisagra de ratón con una secuencia de nucleótidos bisagra humana. En una realización, el ratón comprende además una sustitución de un locus de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (V^ly J^l) con un locus de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina. En una realización, el ratón comprende además una sustitución de una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina de ratón con una región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana. En una realización específica, la V^l, J^l, y C^lson secuencias de la cadena ligera k de la inmunoglobulina. En una realización específica, el ratón comprende una secuencia de la región constante C^h2 and C^h3 de la inmunoglobulina de ratón fusionada con una bisagra humana y una secuencia C^h1 humana, de tal manera que los loci de la inmunoglobulina de ratón se reordenan para formar un gen que codifica una proteína de unión que comprende (a) una cadena pesada que tiene una región variable humana, una región C^h1 humana, una región bisagra humana, y una región C^h2 de ratón y una región C^h3 de ratón; y (b) un gen que codifica una cadena ligera de la inmunoglobulina que comprende un dominio de la región variable humana y una región constante humana.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ectópica de ADAM6 que codifica una proteína ADAM6 funcional, una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón con uno o más segmentos génicos V^lhumanos, y opcionalmente una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos de los genes D^hy/o los segmentos de los genes J^hcon uno o más segmentos de los genes D^hhumanos y/o los segmentos de los genes J^hhumanos, u opcionalmente una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos de los genes D^hy los segmentos de los genes J^hcon uno o más segmentos de los genes J^lhumanos. En una realización, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón, D^h, y J^hcon uno o más segmentos génicos V^l, uno o más segmentos de los genes D^h, y uno o más segmentos de los genes J, (por ejemplo, Jk o JA), en el que los segmentos génicos se unen operativamente a una región bisagra endógena de ratón, en el que el ratón forma un gen reordenado de la cadena de inmunoglobulina que contiene, desde 5' a 3' en la dirección de la transcripción, V^lhumano - D^hhumano o de ratón - J humano o de ratón -bisagra de ratón - C^h2 de ratón - C^h3 de ratón. En una realización, la región J es una región Jk humana. En una realización, la región J es una región J^hhumana. En una realización, la región J es una región JA humana. En una realización, la región V^lhumana se selecciona entre una región VA humana y una región V^khumana.

En realizaciones específicas, el ratón expresa un único anticuerpo de dominio variable que tiene una región constate de ratón o humana y una región variable de V^khumana, D^hhumana y J^khumana; V^khumana, una D^hhumana, y una J^hhumana; VA humana, D^hhumana, y JA humana; VA humana, D^hhumana, y una J^hhumana; V^khumana, D^hhumana, y JA humana; VA humana, D^hhumana, y J^khumana. En una realización específica, las secuencias de reconocimiento de la recombinación están modificadas de tal manera que permiten que se produzcan redisposiciones productivas entre los segmentos génicos V, D, y J o entre los segmentos génicos V y J enumerados. En un aspecto, se proporcionaron ratones que comprendían una secuencia ectópica de nucleótidos que codificaba una proteína ADAM6 funcional (o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón con uno o más segmentos génicos V^lhumanos, una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos de los genes D^hy los segmentos de los genes JH con los segmentos de los genes JL humanos; en el que el ratón carece de CH1 y/o la región bisagra.

En una realización, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio C^h1. En una realización, el ratón carece de una secuencia que codifica una región bisagra. En una realización, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio C^h1 y una región bisagra.

En una realización específica, el ratón expresa una proteína de unión que comprende un dominio variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana (A o ^k) fusionado a un dominio C^h2 de ratón que se une a un dominio C^h3 de ratón.

En un aspecto, se proporcionaron ratones que comprendían una secuencia ectópica de nucleótidos que codificaba una proteína ADAM6 funcional (o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hde ratón con uno o más segmentos génicos V^lhumanos, una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos de los genes D^hy los segmentos de los genes J^hcon los segmentos de los genes J^lhumanos.

En una realización, el ratón comprende una deleción de una secuencia génica de la región constante de la cadena pesada que codifica una región C^h1, una región bisagra, una región C^h1 y una región bisagra, o una región C^h1 y una región bisagra y una región C^H2.

En una realización, el ratón fabrica una única proteína de unión a un dominio variable que comprende un homodímero seleccionado a partir de los siguientes: (a) V^hhumano - C^h1 ratón - C^h2 ratón - C^h3 ratón; (b) V^hhumano - bisagra de ratón - C^h2 de ratón - C^h3 ratón; (c) V^hhumano - C^h2 ratón - C^h3 ratón.

Se describe un ratón con un locus endógeno de la cadena pesada de la inmunoglobulina inactivado, que comprende un locus endógeno de ADAM6 de ratón inhabilitado o eliminado, en el que el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa un anticuerpo humano o de ratón o humano/de ratón u otro anticuerpo quimérico. En una realización, la secuencia de ácido nucleico está presente en un transgén integrado que se integra aleatoriamente en el genoma de ratón. La secuencia de ácido nucleico puede estar en un episoma (por ejemplo, un cromosoma) que no se encuentra en un ratón silvestre.

El ra tón puede co m p re n d e r a d e m á s un locus e n d óg e n o in a c tiva d o de la ca d e na lige ra de la in m un o g lo b u lin a . En una rea lizac ión e spec ífica , el locus en d óg e n o de la ca d e na lige ra de la in m un o g lo b u lin a se puede se le c c io n a r en tre un ^{locus de la ca d e n a lige ra Kappa}(k) ^{y la m bd a (A). El ra tón puede c o m p re n d e r un locus e n d ó g e n o de la ca d e na lige ra}k y un locus in a c tiva d o de la ca d e na lige ra A, en el que el ra tón exp resa un a n ticu e rp o que co m p re n d e un do m in io v a ria b le de la ca d e na pe sa da de la in m u n o g lo b u lin a h u m a n a y un d o m in io de la ca d e na lige ra de la in m u n o g lo b u lin a hum ana . El d o m in io de la ca d e n a lige ra de la in m u n o g lo b u lin a h u m a n a se puede s e le c c io n a r e n tre un d o m in io de la ca d e na lige ra k y un d o m in io de la ca d e na lige ra A hum ana .

En un aspe c to , se p ro p o rc io n a un ra tón g e n é tica m e n te m o d ifica d o que exp re sa un a n ticu e rp o q u im é rico y e xp resa una p ro te ín a A D A N 6 o un o rtó lo g o o su h o m ó lo g o que es fu n c io n a l en el ra tón g e n é tica m e n te m od ificado .

El a n ticu e rp o q u im é rico co m p re n d e un do m in io v a ria b le hu m a n o y una se cu e nc ia de la reg ión co n s tan te de un ratón. El a n ticu e rp o q u im é rico se e xp re sa a p a rtir de un locus de in m un o g lo b u lin a . El do m in io v a ria b le de la ca d e na pesada de l a n ticu e rp o q u im é rico se exp re sa a p a rtir de un locus e n d óg e n o de la ca d e na pe sa da de la inm un o g lo b u lin a . El d o m in io v a ria b le de la ca d e na lige ra de l a n ticu e rp o q u im é rico p uede e x p re sa rse a p a rtir de un locus e n d ó g e n o de la ca d e na lige ra de in m u n o g lo b u lin a reo rdenada . En una rea lizac ión , el d o m in io v a ria b le de la ca d e na lige ra del a n ticu e rp o q u im é rico se e xp resa a p a rtir de un tra n sg é n re o rd e n ad o (p o r e jem p lo , una se cu e nc ia de ác ido nuc le ico re o rd e n ad a d e riva d a de una se cu e nc ia de á c ido nuc le ico no re o rd e n ad a in te g ra d a en el ge n om a del a n im a l en un locus d ife re n te que un locus e n d óg e n o de inm un o g lo b u lin a ).

En una re a lizac ión esp e c ífica , e l tra n sg é n se e xp re sa a tra v é s de un locus tra n s c r ip c io n a lm e n te activo , p o r e jem p lo , un locus R O S A 26 , p o r e jem p lo , un m urino (p o r e jem p lo , ra tón ) un locus R O S A 26.

En un aspe c to , se p ro p o rc io n a un ratón, que co m p re n d e un locus h u m a n iza d o de la ca d e na pesada de in m un o g lo b u lin a , d o n de el locus h u m a n iza d o de la ca d e na pesada de in m un o g lo b u lin a co m p re n d e una se cu e nc ia de A D A M 6 no h u m a n a o un o rtó lo g o o su hom ó logo .

El o rtó lo g o de A D A M 6 u h o m ó lo g o no h u m a n o es una se cu e n c ia que es o rtó lo g a y /u h o m ó lo g a a una se cu e n c ia de A D A M 6 de ratón, d o n de el o rtó lo g o u ho m ó lo g o es fu n c io na l en el ratón.

En una re a liza c ió n e sp e c ífica , el a n im a l no h u m a n o es un ra tón y el o rtó lo g o u h o m ó lo g o de A D A M 6 p ro ce d e de un a n im a l que se s e le c c io n a de e s p e c ie s de ra tón d ife re n te s , una rata, y un h ám ste r. En una re a liza c ió n e sp e c ífica , El a n im a l no h u m a n o es una rata, y e l o rtó lo g o u h o m ó lo g o de A D A M 6 p ro ce d e de un ro e d o r que se se le cc io n a de una e sp e c ie de ra ta d ife ren te , un ratón, y un hám ster.

En una rea lizac ión e spec ífica , la se cu e nc ia de A D A M 6 p rocede de un a n im a l se le cc io n a d o en tre un roe d o r de la s u p e rfa m ilia D ip o d o id ea y un roe d o r de la su p e rfa m ilia M uro idea . En una rea lizac ión e sp ec ífica , el ro e d o r es un ra tón de la s u p e rfa m ilia M uro idea , y el o rtó lo g o o el h o m ó logo de A D A M 6 p roce d e de un ra tón o una rata o un h á m s te r de la su p e rfa m ilia M uro idea .

En una rea lizac ión , la se cu e nc ia de A D A M 6 no hu m a n a se s itúa en tre dos se g m e n to s g é n ico s V. En una rea lizac ión , la se cu e nc ia de A D A M 6 no hum ana se yu x ta p o n e en tre un se g m e n to de l gen V y D. En una rea lizac ión , la se cu e n c ia de A D A M 6 de ra tón se s itúa en tre un s e g m e n to de l gen V y del gen J. En una rea lizac ión , la se cu e n c ia de A D A M 6 de ra tón se yu x ta p o n e en tre un se g m e n to del gen D y un se g m e n to de l gen J.

^{Se d e s c rib e un ra tón g e n é tica m e n te m od ifica d o , que co m p re n d e un lin fo c ito B que exp resa un d o m in io}V^{h aná logo hu m a n o con un d o m in io}V^{l hu m a n o p roceden te de un lo cu s de in m un o g lo b u lin a , d onde el ra tón exp re sa una}p ro te ín a no h u m a n a no de in m u n o g lo b u lin a p ro ce d e n te de l locus de in m u n o g lo b u lin a . La p ro te ín a no h u m a n a no de in m u n o g lo b u lin a es una p ro te ín a A D A M 6 o un h o m ó lo g o u o rtó lo g o o fra g m e n to fu n c io n a l de la m ism a.

La p ro te ín a no hu m a n a no de in m u n o g lo b u lin a puede se r una p ro te ín a de roedor. El ro e d o r puede se r de la fam ilia M uridae . El ro e d o r puede se r de la fa m ilia M urinae . El ro e d o r puede se r se le c c io n a d o e n tre un ra tón , una rata, y un hám ste r.

^{Los d o m in io s}V^{h y}V^{l se pueden u n ir d irec ta m e n te o a tra v é s de un e n la z a d o r a una se cu e nc ia de un dom in io}co n s tan te de la in m un o g lo b u lin a . La se cu e nc ia de l d o m in io co n s tan te puede c o m p re n d e r una se cu e nc ia ^{s e le cc io n a d a en tre una b isag ra , una}C^h2 ^unaC^h3, ^{y una de sus c o m b in a c io n e s . El d o m in io}V^{l hu m a n o se puede s e le c c io n a r en tre un d o m in io}Vk ^{o un d o m in io VA.}

En un aspe c to , se p ro p o rc io n a un ratón, que c o m p re n d e una se cu e n c ia de in m u n o g lo b u lin a h u m a n a co n tig u a a una se cu e nc ia no hu m a n a que co d ifica una p ro te ína A D A M 6 o un o rtó lo g o u ho m ó lo g o o su fra g m e n to func iona l.

La se cu e nc ia de la in m u n o g lo b u lin a hum a n a es una se cu e n c ia de la ca d e na pesada de in m un o g lo b u lin a . En una ^{rea lizac ión , la se cu e nc ia de in m u n o g lo b u lin a com p re n d e uno o m ás se g m e n to s gén ico s}V^h. ^{En una rea lizac ión , la} secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos de los genes D^h. En una realización, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos de los genes J^h. En una realización, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos V^h, uno o más segmentos de los genes D^hy uno o más segmentos de los genes J^h.

En una realización, la secuencia de la inmunoglobulina comprende uno o más segmentos génicos V^hque tienen una elevada frecuencia en los repertorios humanos naturales. En una realización específica, el uno o más segmentos génicos V^hcomprende no más de dos segmentos génicos V^h, no más de tres segmentos génicos V^h, no más de cuatro segmentos génicos V^h, no más de cinco segmentos génicos V^h, no más de seis segmentos génicos V^h, no más de siete segmentos génicos VH, no más de ocho segmentos génicos V^h, no más de nueve segmentos génicos V^h, no más de 10 segmentos génicos V^h, no más de 11 segmentos génicos V^h, no más de 12 segmentos génicos V^h, no más de 13 segmentos del gen V^h, no más de 14 segmentos génicos V^h, no más de 15 segmentos génicos V^h, no más de 16

segmentos génicos V^h, no más de 17 segmentos génicos V^h, no más de 18 segmentos génicos V^h, no más de 19 segmentos génicos V^h, no más de 20 segmentos génicos V^h, no más de 21 segmentos génicos V^H, no más de 22 segmentos génicos V^Ho no más de 23 segmentos génicos V^H.

En una realización específica, el uno o más segmentos génicos V^hcomprende cinco segmentos génicos V^h. En una realización específica, el uno o más segmentos génicos V^hcomprende 10 segmentos génicos V^h. En una realización específica, el uno o más segmentos génicos V^Hcomprende 15 segmentos génicos V^H. En una realización específica, el uno o más segmentos génicos V^hcomprende 20 segmentos génicos V^h.

En varias realizaciones, los segmentos génicos V^hse seleccionan entre V^h6-1, V^h1-2, V^h1-3, V^h2-5, V^h3-7, V^h1-8, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-16, V^h1-18, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h1-24, V^h2-26, V^h4-28, V^h3-30, V^h4-31, V^h3-33, V^h4-34, V^h3-35, V^h3-38, V^h4-39, V^h3-43, V^h1-45, V^h1-46, V^h3-48, V^h3-49, V^h5-51, V^h3-53, V^h1-58, V^h4-59, V^h4-61, V^h3-64, V^h3-66, V^h1-69, V^h2-70, V^h3-72, V^h3-73 y V^h3-74.

En varias realizaciones, los segmentos génicos V^hse seleccionan entre V^h1-2, V^h1-8, V^h1-18, V^h1-46, V^h1-69, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-33, V^h3-43, V^h3-48, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h5-51 y V^h6-1.

En varias realizaciones, los segmentos génicos V^hse seleccionan entre V^h1-18, V^h1-46, V^h1-69, V^h3-7, V^h3-11, V^h3-15, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-33, V^h3-48, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59 y V^h5-51.

En varias realizaciones, los segmentos génicos V^hse seleccionan entre V^h1-18, V^h1-69, V^h3-7, V^h3-11, V^h3-15, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-43, V^h3-48, V^h4-39, V^h4-59 y V^h5-51.

En varias realizaciones, los segmentos génicos V^hse seleccionan entre V^h1-18, V^h3-11, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h4-39 y V^h4-59.

En varias realizaciones, los segmentos génicos V^hse seleccionan entre V^h1-18, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30 y V^h4-39.

En varias realizaciones, los segmentos génicos V^hse seleccionan entre V^h1-18, V^h3-23 y V^h4-39.

En varias realizaciones, los segmentos génicos V^hse seleccionan entre V^h3-21, V^h3-23 y V^h3-30.

En varias realizaciones, los segmentos génicos V^hse seleccionan entre V^h3-23, V^h3-30 y V^h4-39.

En una realización específica, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende segmentos de los genes18 V^h, segmentos de los genes 27 D^hy seis segmentos de los genes J^h. En una realización específica, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende segmentos de los genes 39 V^h, segmentos de los genes 27 D^hy seis segmentos de los genes J^h. En una realización específica, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende segmentos de los genes 80 V^h, segmentos de los genes 27 D^hy seis segmentos de los genes J^h.

En una realización, el animal no humano es un ratón, y el ratón comprende una sustitución de segmentos endógenos de genes V^Hde ratón con uno o más segmentos génicos V^Hhumanos, en el que los segmentos génicos V^hhumanos se unen operativamente a un gen de la región C^hde ratón, de tal manera que el ratón reordena los segmentos génicos V^hhumanos y expresa una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica inversa que comprende un dominio de V^hhumano y un dominio de C^hde ratón. En una realización, un 90-100 % de segmentos no reordenados del gen V^hde ratón se sustituyen con al menos un segmento no reordenado de un segmento del gen V^hhumano. En una realización específica, todos o sustancialmente todos los segmentos endógenos del gen V^hde ratón están sustituidos con al menos un segmento no reordenado del gen V^hhumano. En una realización, la sustitución es con al menos 19, al menos 39, o al menos 80 u 81 segmentos no reordenados del gen V^hhumano. En una realización, la sustitución es con al menos 12 segmentos funcionales no reordenados de segmentos génicos V^hhumanos, al menos 25 segmentos funcionales no reordenados de segmentos génicos V^hhumanos, o al menos 43 segmentos funcionales no reordenados de segmentos génicos V^hhumanos. En una realización, el ratón comprende una sustitución de todos los segmentos D^hy J^hde ratón con al menos un segmento no reordenado de D^hhumano y al m e n o s un se g m e n to no reo rd e n a d o de J ^hhum ano . En una rea lizac ión , el al m e n o s un se g m e n to no re o rd e n ad o de un se g m e n to D ^hh u m a n o se se le c c io n a de 1-1, 1-7, 1-26, 2 -8 , 2 -15 , 3-3, 3 -10 , 3 -16 , 3 -22 , 5-5, 5 -12 , 6 -6 , 6 -13 , 7 27, y una de sus co m b in a c io n e s . En una rea lizac ión , el al m enos un se g m e n to no re o rd e n ad o de un se g m e n to J ^hh u m a n o se se le c c io n a de 1, 2, 3, 4, 5, 6, y una de su s c o m b in a c io n e s . En una re a liz a c ió n e sp e c ífica , el uno o m ás s e g m e n to s g é n ico s V ^hh u m a n o s se se le cc io n a de un s e g m e n to 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2 -5 ,3 -7 ; 3-9, 3 -11 , 3 -13 , 3-15, 3 20, 3 -23 , 3 -30 , 3-33, 3-48, 3-53, 4 -31 , 4 -39 , 4 -59 , 5 -51 ,6 -1 de l gen V ^hhum ano , y una de sus com b in a c io n e s .

En va ria s rea lizac ion e s , la se cu e nc ia de la in m un o g lo b u lin a hum a n a está un ida o p e ra tiva m en te con una reg ión co n s tan te en la línea g e rm in a l de l ra tón. En una rea lizac ión , la reg ión co n s tan te es una reg ión co n s tan te hum ana, q u im é rica hum a n a /d e ra tón o q u im é rica hu m a n a /d e ra ta o q u im é rica hum a n a /d e hám ste r, de ra tón , de rata, o de h ám ste r. En una rea lizac ión , la reg ión c o n s ta n te es una reg ión co n s tan te de ro e d o r (p o r e jem p lo , de ra tón o ra ta o hám ste r). En una rea lizac ión e spec ífica , el roe d o r es un ratón o una rata. En va ria s rea lizac ion e s , la reg ión co n s tan te co m p re n d e al m enos un d o m in io C ^h2 y un d o m in io C ^h3.

La se cu e n c ia de la ca d e na pe sa da de la in m u n o g lo b u lin a h u m a n a se lo ca liza en un locus de la ca d e na pe sa da de la in m u n o g lo b u lin a en la línea g e rm in a l de l an im a l no hum ano (p o r e jem p lo , el roedor, p o r e jem p lo , el ra tón o ra ta o hám ste r).

En d ive rso s aspec to s , el an im a l no hum ano co m p re n d e a d e m á s una se cu e nc ia de la cadena lige ra de la in m u n o g lo b u lin a h u m a n a (p o r e jem p lo , una o m ás se c u e n c ia s no reo rd e n a d a s de V y J de la ca d e n a lige ra , o una o m ás se cu e n c ia s reo rd e n ad a s de V J ) en la línea g e rm in a l del a n im a l no hum ano . En una rea lizac ión esp e c ífica , la se cu e n c ia de la ca d e na lige ra de in m u n o g lo b u lin a es una se cu e n c ia de la ca d e na lige ra ^kde la in m u n o g lo b u lin a . En una rea lizac ión , la s e c u e n c ia de la ca d e na lige ra de la in m u n o g lo b u lin a hum ana co m p re n d e uno o m ás se g m e n to s g é n ico s V ^l. En una rea lizac ión , la se cu e nc ia de la ca d e na lige ra de la in m un o g lo b u lin a hu m a n a co m p re n d e uno o m ás se g m e n to s de los g e n es J ^l. En una rea lizac ión , la se cu e n c ia de la ca d e na lige ra de la in m u n o g lo b u lin a hum ana co m p re n d e uno o m ás se g m e n to s g é n ico s V l y uno m ás se g m e n to s de los g e n e s J l. En una rea liza c ió n esp e c ífica , la se cu e nc ia de la ca d e na lige ra de la in m u n o g lo b u lin a hu m a n a c o m p re n d e al m enos se g m e n to s de los g e n es 16 V ^ky c inco se g m e n to s de los genes J ^k. En una rea lizac ión esp e c ífica , la se cu e nc ia de la ca d e na lige ra de la in m u n o g lo b u lin a hu m a n a co m p re n d e al m e n o s se g m e n to s de los genes 30 V ^ky c in co s e g m e n to s de los g e n es J ^k. En una re a lizac ión e sp e c ífica , la se cu e n c ia de la c a d e n a lige ra de la in m u n o g lo b u lin a h u m a n a co m p re n d e al m enos se g m e n to s de los genes 40 V k y c inco se g m e n to s de los genes J k . En va ria s rea lizac ion e s , la se cu e nc ia de la ca d e na lige ra de la in m u n o g lo b u lin a hu m a n a está un ida o p e ra tiva m e n te con una reg ión co n s tan te en la línea g e rm in a l de l a n im a l no hu m a n o (p o r e jem p lo , roedor, po r e jem p lo , ra tón o rata o hám ste r). En una rea lizac ión , la reg ión co n s tan te es una reg ión co n s tan te hum ana , q u im é rica hu m a n a /d e ro e d o r ratón, rata, o de h ám ste r. En una re a lizac ión e sp e c ífica , la reg ión c o n s ta n te es una reg ión co n s ta n te de ra tón o de rata . En una re a lizac ión esp e c ífica , ^{la reg ión co n s tan te es una reg ión co n s tan te k de ra tón (m C}K^{) o una reg ión co n s tan te k de rata ( rC}K^).

En una rea lizac ión , el ra tón co m p re n d e una s u s titu c ió n de to d o s o s u s ta n c ia lm e n te to d o s los s e g m e n to s g é n ico s V k y de l gen J ^kcon al m enos se is s e g m e n to s g é n ico s V ^ky al m en o s un s e g m e n to de l gen J ^k. En una rea lizac ión , to d os o su s ta n c ia lm e n te to d o s los se g m e n to s g é n ico s V ^ky J ^kse su s titu yen con al m en o s 16 se g m e n to s g é n ico s V ^kh u m a n o s (V k h u m a n o ) y al m e n o s un se g m e n to de l gen Jk. En una rea lizac ión , to d o s o su s ta n c ia lm e n te to d o s los se g m e n to s g é n ico s V k y Jk se su s titu yen con al m enos 30 se g m e n to s gén ico s V k hum anos, y al m enos un se g m e n to de l gen Jk. En una rea lizac ión , to d o s o su s ta n c ia lm e n te to d o s los se g m e n to s gén ico s V k y Jk se su s titu yen con al m enos 40 se g m e n to s gén ico s V k y al m enos un se g m e n to de l gen Jk. En una rea lizac ión , el al m en o s un se g m e n to de l gen Jk c o m p re n d e dos, tres, cua tro , o c inco se g m e n to s de los g enes Jk.

En una rea lizac ión , los se g m e n to s gén ico s V ^kco m p re n d en V ^k4 -1 , V ^k5-2, V ^k7-3, V ^k2-4 , V ^k1-5, y V ^k1-6. En una rea lizac ión , los s e g m e n to s g é n ico s V k co m p re n d e n V k 3-7, V k 1-8, V k1-9, V k2-10 , V k3-11, V k 1-12, V k 1-13, V k2-14, V k3 -15 y V k 1-16. En una rea lizac ión , los s e g m e n to s g é n ico s V k c o m p re n d e n V k 1-17, V k2-18 , V k2-19 , V k3-20, V k6-21, V ^k1-22, V ^k1-23, V ^k2 -24 , V ^k3-25, V ^k2-26 , V ^k1-27, V ^k2-28 , V ^k2 -29 , y V ^k2-30. En una rea lizac ión , los se g m e n to s g é n ico s V k co m p re n d en V k 3 -31, V k 1-32, V k 1-33, V k3-34, V k 1-35, V k2-36 , V k 1-37, V k2-38 , V k 1-39, y V k2-40. En una rea lizac ión e spec ífica , los se g m e n to s gén ico s V k co m p re n d en se g m e n to s co n tig uo s de l gen k de la in m u n o g lo b u lin a que a b a rca n el lo cus de la ca d e na lige ra k de la in m u n o g lo b u lin a desde Vk4-1 a V k2 -40 , y los s e g m e n to s de los g e n es Jk c o m p re n d e n se g m e n to s co n tig uo s de l gen que a b a rca n el lo cus de la ca d e na lige ra k de la in m u n o g lo b u lin a desde Jk1 a Jk5.

En una rea lizac ión , la se cu e nc ia de la ca d e na lige ra de la in m u n o g lo b u lin a hum ana se loca liza en un locus de la ca d e na lige ra de la in m u n o g lo b u lin a en la línea g e rm in a l del a n im a l no hum ano . En una rea lizac ión e spec ífica , el lo cus de la ca d e na lige ra de la in m u n o g lo b u lin a en la línea g e rm in a l de l a n im a l no h u m a n o es un locus de la ca d e na lige ra k de la in m un o g lo b u lin a . En una re a lizac ión , la se cu e nc ia de la cadena lige ra de la in m u n o g lo b u lin a hum ana se lo ca liza en un locus de la ca d e na lige ra no de in m u n o g lo b u lin a en la línea g e rm in a l de l a n im a l no h u m a n o qu e es tra n s c r ip c io n a lm e n te activo . En una rea lizac ión e spec ífica , el locus no de in m u n o g lo b u lin a es un locus R O S A 26. Se d e sc rib e un m é to d o para c re a r un a n ticu e rp o hum ano , donde el a n ticu e rp o hu m a n o co m p re n d e dom in io s v a r ia b le s d e riva d o s de una o m ás se c u e n c ia s de á c id o s n u c le ico s de la reg ión v a ria b le co d ifica d a s en una cé lu la de un ratón que se describe en el presente documento.

Se describe una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se deriva de una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable aisladas de un ratón que se describe en el presente documento. El polipéptido puede ser un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo con una única cadena pesada. El polipéptido puede ser un fragmento de la región variable monocatenario (por ejemplo, un scFv).

Se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para preparar un anticuerpo. El anticuerpo puede comprender uno o más dominios variables que se derivan de secuencias de ácidos nucleicos de una o más regiones variables aisladas del ratón. Las secuencias de ácidos nucleicos de la región variable pueden comprender segmentos génicos de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Las secuencias de ácidos nucleicos de la región variable pueden comprender segmentos génicos de la cadena ligera de la inmunoglobulina.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención, que está definida por las reivindicaciones adjuntas. Salvo que se indique otra cosa, se indica la temperatura en grados Celsius, y la presión es o está próxima a la atmosférica.

Ejemplo 1

Humanización de genes de la inmunoglobulina de ratón

Se han usado cromosomas artificiales bacterianos humanos y de ratón (BAC) para diseñar mediante ingeniería genética 13 vectores directores BAC (BACvec) diferentes para la humanización de los loci de la cadena pesada y de la cadena ligera k de la inmunoglobulina de ratón. Las tablas 1 y 2 definen las descripciones de las etapas realizadas para la construcción de todos los BACvec empleados para la humanización de los loci de la cadena pesada y de la cadena ligera k de la inmunoglobulina, respectivamente.

Identificación de BAC humanos y de ratón. BAC de ratones que abarcan los extremos 5' y 3' de los loci de la cadena pesada y de la cadena ligera k de la inmunoglobulina se identificaron mediante la hibridación de los filtros manchados con una biblioteca de BAC o mediante combinados de ADN de una biblioteca de BAC de ratones seleccionados mediante PCR. Se hibridaron los filtros en condiciones normalizadas utilizando sondas que se correspondían con las regiones de interés. Se cribaron las bibliotecas mediante la PCR utilizando parejas de cebadores únicos que flanquean la región diana de interés. Se realizó una PCR adicional utilizando los mismos cebadores para deconvolucionar un pocillo dado y aislar los BAC de interés correspondientes. Se generaron filtros y bibliotecas combinadas de BAC a partir de células ES de ratones 129 Svj (Incyte Genomics/Invitrogen). Los BAC humanos que cubren la totalidad de los loci de la cadena pesada y de la cadena ligera k de la inmunoglobulina se identificaron tanto mediante hibridación de los filtros manchados con la biblioteca de BAC (Caltech B, C, como las bibliotecas D y la biblioteca RPCl-11, Research Genetics/Invitrogen) mediante el cribado de combinados de bibliotecas de BAC humanos (biblioteca Caltech, Invitrogen) mediante un método basado en la PCR o utilizando una base de datos de secuencias terminales de BAC (biblioteca Caltech D, TIGR).

Construcción de BACvec mediante recombinación homóloga bacteriana y ligadura. Se realizó la recombinación homóloga bacteriana (BHR) como se ha descrito (Valenzuela et al., 2003; Zhang et al., 1998, A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli, Nat Genet 20:123-128). En la mayor parte de casos, se generaron fragmentos lineales mediante secuencias de homología generadas mediante PCR de ligadura para casetes clonados mediante aislamiento en gel de productos de ligadura y electroporación en bacterias competentes para BHR que hospedaban los BAC diana. Tras la selección en placas petri con antibióticos adecuados, se identificaron los BAC recombinados correctamente mediante PCR a través de ambas uniones novedosas seguido por un análisis de restricción en geles de campo pulsado (Schwartz y Cantor, 1984, Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis, Cell 37:67-75) y se comprobaron las manchas mediante la PCR usando cebadores distribuidos a través de las secuencias humanas.

Se construyó BACvec 3hVH utilizando tres etapas secuenciales de BHR para la etapa inicial de humanización del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina (FIG. 4A y Tabla 1). En la primera etapa (Etapa 1) se introdujo un casete en un BAC humano progenitor en la dirección 5' a partir del segmento del gen V^h1-3 humano que contiene una región de homología con el locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón (HB1), un gen que confiere resistencia a la kanamicina en bacterias y resistencia a G418 en células animales (kanR) y un sitio de recombinación específico de emplazamiento (por ejemplo, lOxP). En la segunda etapa (Etapa 2) se introdujo un segundo casete exactamente en la dirección 3' desde el último segmento de J^hque contiene una segunda región de homología con el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (HB2) y un gen que confiere resistencia en bacterias a la espectinomicina (specR). Esta segunda etapa incluyó eliminar las secuencias del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina en la dirección 3' entre J^h6 y el gen de resistencia al cloranfenicol del vector BAC (cmR).

En la tercera etapa (Etapa 3) el BAC humano modificado por duplicado (B1) se linealizó a continuación utilizando los sitios I-CeuI que se habían añadido en las primeras dos etapas y se integró en un BAC de ratón (B2) mediante BHR a través de las dos regiones de homología (HB1 y HB2). Se diseñaron las selecciones de fármacos para que la primera (cm/kan), segunda (spec/kan) y tercera (cm/kan) etapas fueran específicas de los productos deseados. Los clones de BAC modificados se analizaron mediante electroforesis en gel en campo pulsado (PGFE) tras digestión con enzimas de restricción para determinar la construcción adecuada (FIG. 4B).

De una manera similar, se diseñaron mediante ingeniería genética 12 BACvec adicionales para la humanización de los loci de la cadena pesada y los loci de la cadena ligera ^k. En algunos casos, se realizó la ligadura de BAC en lugar de BHR para unir dos BAC grandes mediante la introducción de sitios de restricción raros en ambos BACvec progenitores mediante BHR junto con una cuidadosa colocación de los marcadores seleccionables. Esto permitió la supervivencia del producto de ligadura deseado tras la selección con combinaciones específicas de fármacos marcadores. Se identificaron los BAC recombinantes mediante ligadura tras la digestión con enzimas de digestión raros y se cribaron de una manera similar a los obtenidos mediante BHR (como se ha descrito anteriormente).

Tabla 1

continuación

Tabla 2

continuación

Modificación de embriocitoblastos (ES) y generación de ratones. Se realizó el direccionamiento de células ES (F1 H4) utilizando el método de ingeniería genética VELOCIGENE® como se describe (Valenzuela et al., 2003). Derivation of mice from modified ES cells by either blastocyst (Valenzuela et al., 2003) o mediante inyección de células 8 (Poueymirou et al., 2007, F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol 25:91-99) como se ha descrito. Se confirmaron las células y los ratones ES dirigidos cribando el ADN de células o ratones ES con conjuntos únicos de sondas y cebadores en un ensayo basado en la PCR (por ejemplo, FIG. 3A, 3B y 3C). Todos los estudios en ratones fueron supervisados y homologados por el Regeneron's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Análisis del cariotipo e hibridación fluorescente ^{in s itu} (FISH). El análisis del cariotipo fue realizado por el Coriell Cell Repositories (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ). Se realizó FISH en células ES dirigidas tal como se ha descrito (Valenzuela et al., 2003). Las sondas que correspondían tanto a ADN de BAC de ratón o ADN de BAC humano se marcaron mediante traducción de mellas (Invitrogen) con los nucleótidos dUTP marcados fluorescentemente en el espectro del naranja o en el espectro del verde (Vysis).

Locus génico de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina. Se consiguió la humanización de la región variable del locus de la cadena pesada en nueve etapas secuenciales mediante la sustitución directa de aproximadamente tres millones de pares de bases (Mb) de una secuencia genómica contigua de ratón que contenía todos los segmentos génicos V^h, D^hy J^hcon aproximadamente un Mb de secuencia genómica contigua humana que contenía los segmentos génicos equivalentes humanos (FIG. 1A y Tabla 1) utilizando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos. N° 6.586.251 y Valenzuela et al., 2003).

El intrón entre los segmentos génicos J^hy los genes de la región constante (el intrón J-C) Contiene un potenciador de la transcripción (Neuberger, 1983, Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoidcells, EMBO J 2:1373-1378) seguido de repeticiones simples requeridas para la recombinación durante el cambio de isotipo (Kataoka et al., 1980, Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavy-chain class switch, PNAS USA 77:919-923). Se seleccionó la unión entre la región V^h-D^h-J^hhumana y la región C^hde ratón (la unión proximal) para mantener el potenciador intrónico de la cadena pesada de ratón y el dominio de cambio a fin de preservar la expresión eficaz y el cambio de clase del locus humanizado de la cadena pesad en el ratón. La posición exacta de los nucleótidos de estas y posteriores uniones en todas las sustituciones fue posible mediante el uso del método de ingeniería genética VELOCIGENE® (más arriba), que empleó la recombinación homóloga bacteriana impulsada por los oligonucleótidos sintetizados. De esta manera, la unión proximal se colocó aproximadamente 200 pb en la dirección 3' del último segmento del gen J^hy la unión distal se colocó algunos cientos en la dirección 5' del segmento 5' de la mayoría de genes VH del locus humano y aproximadamente 9 kb en la dirección 3' del segmento génico V^h1-86 de ratón, conocido también como J558.55. El segmento génico V^h1-86 (J558.55) es el segmento génico de la región variable más distal, notificado por ser un pseudogen en ratones C57BL/6, pero potencialmente activo, pero con una secuencia RSS mal caracterizada, en el alelo 129 diana. El extremo distal del locus de la cadena pesada de ratón puede contener tal como se informa elementos de control que regulan la expresión y/o la reordenación del locus (Pawlizky et al., 2006).

Se consiguió una primera inserción de la secuencia de ADN de la inmunoglobulina humana en el ratón utilizando 144 kb del extremo proximal del locus de la cadena pesada humana que contenía los segmentos de los genes 3 V^h, 27 D^hy 9 J^hhumano insertados en el extremo proximal del locus IgH de ratón, con una deleción de 16,6 kb simultánea de la secuencia genómica de ratón, utilizando 75 kb de los brazos de homología del ratón (Etapa A, FIG.

2A; Tablas 1 y 3, 3hVH). Esta inserción grande de 144 kb y la deleción de 16,6 kb acompañante se realizó en una única etapa (Etapa A) que se produjo con una frecuencia de 0,2 % (Tabla 3). Las células Es correctamente dirigidas se puntuaron mediante un ensayo de pérdida de alelos no naturales (LONA) (Valenzuela et al., 2003) utilizando sondas en y que flanqueaban la secuencia eliminada de ratón y en la secuencia humana insertada, y se verificó la integridad de la inserción grande en ser humano utilizando sondas múltiples que abarcaban la inserción completa (FIG. 3A, 3B y 3C). Debido a que se anticiparon muchos ciclos de direccionamiento secuencial de células ES, los clones de células ES diana en esta, y todas las etapas posteriores, se sometieron a análisis cariotípico (más arriba) y solo aquellos clones que mostraban cariotipos normales en al menos 17 de 20 propagaciones para las etapas posteriores.

Las células ES dirigidas de la Etapa A se redirigieron con el BACvec que produjeron una deleción de 19 kb en el e x tre m o d is ta l de l locus de la ca d e na pesada (E ta p a B, La F IG . 2A ). El B A C ve c de la E tapa B co n ten ía un gen de res is te n c ia a la h ig ro m ic in a (hyg ) en co n tra s te con el gen de re s is te n c ia a la ne o m ic in a (neo ) co n ten id o en el B A C ve c de la E tapa A. Los genes de re s is te n c ia p roceden tes de los dos B A C ve c se d ise ñ a ro n de ta l m a n e ra que, tra s el d ire cc io n a m ie n to sa tis fa c to r io en el m ism o c rom o so m a , a p ro x im a d a m e n te tres M b de l locus gén ico de la reg ión v a ria b le de la ca d e na p esada de ra tón que co n te n ía to d o s los se g m e n to s g é n ico s V ^hde ra tón d ife re n te s de V ^h1-86 y to d o s los s e g m e n to s de los g e n es D ^hd ife re n te s de D Q 52, a s í com o los dos g e n es de res is te n c ia , es ta ba n fla n q u e a d o s p o r s itios loxP; D Q 52 y to d o s los s e g m e n to s g é n ico s de la ca d e na J ^hde ra tón se e lim in a ro n en la E tapa A. se id e n tifica ro n c lo n e s de cé lu la s ES d o b le m e n te d ir ig id os en el m ism o c ro m o so m a im p u lsa n d o el ca se te p rox im a l 3hVH para la h o m o c ig o s id a d en G 418 de e xp res ión e leva d a (M o rten se n e t al., 1992, P roduc tion o f hom o zyg o u s m u ta n t ES ce lls w ith a s ing le ta rg e tin g co ns truc t, M ol C e ll B io l 12 :2391 -2395 ) y s ig u ie n d o el co m p o rta m ie n to del case te hyg d is ta l. Los se g m e n to s de ra tón de hasta cua tro M b de ta m a ñ o , que se han m od ifica d o de fo rm a que estén fla n q u e a d o s p o r s itio s loxP , se han e lim in a d o sa tis fa c to r ia m e n te en cé lu la s ES m ed ia n te la exp res ión tra n s ito r ia de la re co m b in a sa C R E con e fica c ia s e le va d as (h a s ta ~11 % ) inc luso en a u se nc ia de se le cc ió n de fá rm a co s (Z heng e t al., 2000 , E ng in e e ring m ouse ch ro m o so m e s w ith C re -lo xP : range, e ffic ie n cy , and so m a tic a p p lica tio n s , M ol C e ll B io l 20 :648 -655 ). D e una m an e ra s im ila r, los in ve n to re s co n s ig u ie ro n una d e le c ió n de tre s M b en un 8 % de los c lones de c é lu la s ES tra s la e xp res ión tra n s ito r ia de C R E (E ta p a C, La F IG . 2A; T ab la 3). La d e lec ión se pu n tu ó m ed ia n te el en sa yo L O N A u tiliza n d o so n d as en c u a lq u ie r e x tre m o de la se cu e nc ia de ratón e lim inada , a s í com o la pé rd ida de neo y hyg y la a p a ric ió n de un p ro d u c to de la P C R a lo la rgo de l p u n to de de le c ió n que co n ten ía el ún ico s itio loxP restan te . A d e m á s , Se co n firm ó la de le c ió n m ed ia n te h ib ridac ión in s itu (no se m ue s tra n los da tos).

Se a ñ a d ió el resto de la reg ión va riab le de la cadena p esada hum ana al a le lo 3hVH en una se rie de 5 e tapas u tiliza n d o el m é to d o de in g e n ie ría g e n é tica V E L O C IG E N ^e® (E ta p as E-H, La FIG . 2B ), im p lica n do cada e tapa la in se rc ión p re c isa de hasta 210 kb de se c u e n c ia s g é n ica s h u m anas. P a ra cada e tapa , se d ise ñ ó el e x tre m o p ro x im a l de cada nuevo B A C ve c pa ra s o la p a r las se c u e n c ia s h u m a n a s m ás d is ta le s de la e ta pa p re v ia y el e x tre m o d is ta l de cada n u e vo B A C v e c co n te n ía la m ism a reg ión d is ta l de h o m o lo g ía de l ra tón que se usó en la E ta p a A. Los B A C ve c de las e ta p a s D, F y H co n ten ía n los ca se tes de se le cc ió n neo, m ie n tra s que a q u e llo s de las e ta p a s E y G co n ten ía n los c a se te s de s e le cc ió n hyg, de e s ta m ane ra , las s e le cc io n e s se a lte rn a ro n en tre G 418 e h ig ro m ic in a . Se e va lu ó el d ire cc io n a m ie n to en la E tapa D m ed ia n te la pé rd ida de l ún ico p ro duc to de la P C R a lo la rgo de l s itio loxP de l a le lo h íb rid o 3hVH. S e e va lu ó e l d ire c c io n a m ie n to de las E ta p a s E a I m ed ia n te la p é rd id a de l ca se te de se le cc ió n previo . En la e tapa fina l (E ta p a I, La FIG . 2B ), el case te de se le cc ió n neo, f la n q u e a d o po r s itio s F rt (M cL e o d e t al., 1986, Iden tifica tio n o f th e c ro s s o v e r s ite d u ring F LP -m e d ia ted re co m b in a tio n in the S a cch a ro m yce s ce re v is iae p lasm id 2 m ic ro n s c irc le , M ol C e ll B io l 6 :3357 -3367 ), se e lim in ó m ed ia n te la e xp res ión tra n s ito r ia de FLP e (B u ch h o lz e t al., 1998, Im proved p ro p e rtie s o f FLP reco m b in a se evo lved by cyc ling m u ta g e n e s is , N a t B io te ch n o l 16 :657 -662). Se d e riva ro n las se cu e n c ia s h u m a n a s de los B A C ve c para las E tapas D, E y G de cada uno de los dos BA C p ro g e n ito re s hum anos, m ie n tra s que los de las E tapas F y H fu e ro n de B A C ind iv idua les . S e co n firm ó la re te n c ió n de las se cu e nc ias h u m a n a s en cada e tapa u tiliza n d o so n d as m ú ltip les que a b a rca b a n las se cu e n c ia s hum anas in se rta d a s (com o se ha d e sc rito a n te rio rm e n te , p o r e jem p lo , F IG . 3A, 3 b y 3C). S o lo se h ic ie ron a v a n z a r a la s ig u ie n te e tapa los c lones con ca rio tip o no rm a l y una línea g e rm in a l po tenc ia l. Las cé lu la s ES de la e tapa fina l fu e ro n aún cap a ces de c o n trib u ir a la línea g e rm in a l d e sp ué s de nueve m a n ip u la c io n e s se cu e n c ia le s (T a b la 3). F ue ron v ia b le s los ra tones h o m o c ig ó tico s para cada uno de los a le los de la ca d e na pesada , a p a re c ie ro n sanos y d e m o s tra ro n un s is te m a inm une hu m o ra l e se n c ia lm e n te na tu ra l (véa se el E jem p lo 3).

Tabla 3

Locus génico variable de la cadena ligera ^k. ^{La reg ión v a ria b le de la ca d e na lige ra}k ^{se h u m a n izó en o cho e tapas}se cu e n c ia le s m ed ia n te la sus titu c ió n d irec ta de a p ro x im a d a m e n te tre s M b de la se cu e nc ia de ra tones que con ten ía ^{to d o s los se g m e n to s gén ico s}Vk ^yJk ^{con a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 M b de la se cu e nc ia hum ana que co n ten ía los se g m e n to s p ro x im a le s h u m a n o s de g e n es}Vk ^yJk ^{de una m an e ra s im ila r a la de la ca d e na pesada (F IG . 1 B; T ab la s} 2 y 4).

La reg ión v a ria b le de l locus de la ca d e na lige ra k hum a n a con tie ne dos re p e tic io n e s de 400 kb cas i idén ticas s e p a ra d a s po r un s e p a ra d o r de 800 kb (W e ich h o ld e t al., 1993, T he h um an im m u n o g lo b u lin kappa locus co n s is ts o f tw o cop ies th a t are o rg an ized in o p p os ite po la rity , G e n o m ics 16 :503 -511). C o m o las rep e tic io n e s son tan s im ila res, se puede re p ro d u c ir cas i to d a la d ive rs ida d de locus en ra tones u tiliza n d o la repe tic ión p rox im a l. A d e m á s , se ha n o tifica d o la d e sa p a ric ió n de la rep e tic ió n d is ta l de l locus de la ca d e na lige ra k de un a le lo h u m a n o na tu ra l (S ch a ib le e t al., 1993, T he im m u n o g lo b u lin kappa locus: p o lym o rp h ism and hap lo typ e s o f C au ca so id and non -C a u ca so id ind iv idua ls , H um G e n e t 91 :261 -267 ). Los in ve n to re s su s titu ye ro n a p ro x im a d a m e n te tre s M b de la se cu e nc ia gén ica ^{de la reg ión va riab le de la cadena lige ra}k ^{de ra tón pa ra su s titu ir e fica zm e n te to d o s los se g m e n to s gén ico s}Vk ^yJk ^{de ra tón con los}Vk ^{p ro x im a le s h u m a n o s y los s e g m e n to s de los g e n es}Jk ^{h u m a n o s (F IG . 2C y 2D ; T a b la s 2 y 4). En co n tra s te con el m é to d o d e sc rito en el E jem p lo 1 pa ra el locus de la ca d e na pesada , la reg ión co m p le ta de g e n es}Vk ^{de ra tón , qu e co n tie n e to d o s los se g m e n to s g é n ico s}Vk ^yJk, ^{se e lim in ó en un p ro ce so en tre s e ta p a s a n tes de que}se a ñ a d ie ra c u a lq u ie r se cu e nc ia hum ana . En p rim e r lugar, se in tro d u jo un case te neo en el e x tre m o p ro x im a l de la reg ión va riab le (E ta p a A, FIG . 2C ). A co n tin ua c ió n , se inse rtó un case te hyg en el ex tre m o d is ta l de l lo cus k (E tapa B, F IG . 2C ). S itio s de re c o n o c im ie n to de la re co m b in a sa (p o re je m p lo , lo xP ) se s itu a ro n de n u e vo en cada ca se te de ^{se le cc ió n de ta l m an e ra que el tra ta m ie n to de C R E indu jo la d e le c ió n de los 3 M b re s ta n te s de la reg ión}Vk ^{de ra tón}ju n to con a m b o s g e nes de res is te n c ia (E ta p a C, La F IG . 2C ).

Se in se rtó un fra g m e n to g e n ó m ic o h u m a n o de a p ro x im a d a m e n te 480 kb de ta m a ñ o que co n te n ía la reg ión v a ria b le co m p le ta de la ca d e na lige ra k de la in m u n o g lo b u lin a en cu a tro e ta pa s se cu e n c ia le s (F IG . 2D ; T a b la s 2 y 4), con hasta 150 kb de la se cu e nc ia de la cadena lige ra k de la in m u n o g lo b u lin a hum a n a in se rta d a en una ún ica e tapa, usa n do m é to d o s s im ila re s a los e m p le a d o s pa ra la cadena p esada (véa se el E jem p lo 1). Se e lim in ó el gen fina l de res is te n c ia a la h ig ro m ic in a m ed ia n te la e xp res ión tra n s ito r ia de FLP e. C o m o con la ca d e na pesada , se e va lua ron los c lones de cé lu la s d ir ig id as para la in te g rid a d de la inse rc ión hum a n a com p le ta , el ca rio tip o no rm a l y la línea g e rm in a l po ten c ia l tra s cada e tapa . Se g e n e ra ron ra tones h o m o c ig ó tico s para cad a uno de los a le lo s de la cadena lige ra k y se e n co n tró que te n ía n una a p a rie n c ia san a y norm a l.

Tabla 4

Ejemplo 2

Generación de ratones completamente inmunizados mediante combinación de múltiples alelos de inmunoglobulina humanizada

En v a rio s m om en tos , se m ic ro in ye c ta ro n las cé lu la s ES que co n tie ne n una po rc ión de rep e rto rio s de la cadena p esada de la in m u n o g lo b u lin a hum ana o de re p e rto rio s de la reg ión v a ria b le de la ca d e na lige ra k ta l co m o se d e sc rib e n en el E je m p lo 1, y se c ria ro n los ra tones resu lta n te s pa ra c re a r m ú ltip les v e rs io n e s de ra tones V E L O C IM M U N E ® con fra cc io n e s p ro g re s iva m e n te m ás g randes de rep e rto rio s de in m u n o g lo b u lin a de la línea g e rm in a l hum a n a (T a b la 5; La FIG . 5 A y 5B). Los ra tones V E L O C IM M U N E ® 1 (V 1 ) poseen d ie c io ch o se g m e n to s ^{g é n ico s}V^{h hum a n o s y to d o s los se g m e n to s de los genes}D^{h y JH h u m a n o s co m b in a d o s con d ie c isé is se g m e n to s g é n ico s}Vk ^{hum a n o s y to d o s los se g m e n to s de los genes}Jk ^{hum anos. Los ra tones V E L O C IM M U N E ® 2 (V 2 ) y}V E L O C IM M U N E ® (V 3 ) han a u m e n ta d o los rep e rto rio s de la reg ión va ria b le que co n tie ne n un to ta l de tre in ta y nueve V^{h y tre in ta}Vk, ^{y och e n ta}V^{h y cu a re n ta}Vk, ^{resp e c tiva m e n te . D eb ido a que se han su s titu id o co m p le ta m e n te las re g io n e s g e n ó m ic a s que co d ifica n los se g m e n to s g é n ico s}V^h, D^{h y}J^{h de ra tón y los s e g m e n to s g é n ico s}V^{k y}J^k, ^losa n ticu e rp o s p ro d u c id o s p o r to d a s las v e rs io n e s de ra to n e s V E L O C IM M U N E ® co n tie ne n re g io n e s v a ria b le s hum a n a s un idas a reg io n e s co n s tan te s de ra tón . Los loc i de la cadena lige ra A de ra tón p e rm anecen in ta c tos en va rias re a lizac ion e s de ra to n e s V E L O C IM M U N E ® y s irven co m o un c o m p a ra d o r de la e fica c ia y la e xp res ión de los d ive rso s loci de la ca d e na lige ra k de V E L O C IM M U N E ® .

Se g e n e ra ron ra to n e s d o b le m e n te h o m o c ig ó tico s para las h u m a n iz a c io n e s de la ca d e na pe sa da de in m u n o g lo b u lin a y las h u m a n iz a c io n e s de la ca d e na lige ra ^ka p a rtir de un su b co n ju n to de los a le lo s d e sc rito s en el E je m p lo 1. T od o s los g e n o tip o s o b se rva d o s du ran te el cu rso de la rep ro d u cc ió n generan ra to n e s d o b le m e n te h o m o c ig ó tico s que se p rodu ce n en p ro p o rc io n es g ro se ra m e n te M end e lia n a s . La p rogen ie h o m o c ig ó tica de m ach o s para cada uno de los a le lo s de la cadena pesada hum ana d e m o s tró una fe rtilida d reduc ida , que d io com o resu lta d o la pé rd ida de la a c tiv id a d de A D A M 6 de ra tón . El locus gén ico de la reg ión v a ria b le de la ca d e na pesada de ra tón con tie ne dos genes A D A M 6 fu n c io n a le s inc lu id o s (A D A M 6 a y A D A M 6 b ). D u ran te la in m un iza c ió n de l locus gé n ico de la reg ión v a ria b le de la ca d e na pe sa da de ra tón , la se cu e nc ia g e n ó m ica hu m a n a in se rta d a co n ten ía un p seudogen A D A M 6. P uede req u e rirse A D A M 6 de ra tón para la fe rtilida d , y de esta m ane ra , la c a re n c ia de g e n es A D A M 6 de ra tón en loci g é n ico s va ria b le s de la ca d e na pesada h u m a n iza d a pueden c o n d u c ir a una red u cc ió n de la fe rtilid a d a p e sa r de la p re se n c ia de l p se u do g e n hum ano . Los E je m p lo s 7-11 d e sc rib e n la g e n o m a n ip u la c ió n de los g e n es A D A M 6 de ratón en un locus g é n ico de la reg ión v a ria b le de la ca d e na pesada h u m a n iza d a , y la re s ta u ra c ió n de la fe rtilid a d a n ive l na tu ra l en ra to n e s con un locus de in m un o g lo b u lin a de la ca d e na pesada hum an izada .

Tabla 5

Ejemplo 3

Poblaciones de linfocitos en ratones con genes de inmunoglobulina humanizados

Las p o b la c io n e s de lin fo c ito s B m a d u ro s en las tre s v e rs io n e s d ife re n te s de ra to n e s V E L O C IM M U N E ® se e va lu a ro n m ed ia n te c ito m e tría de flu jo .

En resum en , su sp e n s io n e s ce lu la re s p ro ce d e n te s de la m éd u la ósea , bazo y tim o se p re p a ra ro n con m é to d o s co n ve n c io n a le s . Las cé lu la s se resu sp e n d ie ro n a 5 x105 cé lu la s /m l en ta m p ó n de tin c ió n BD P ha rm in g e n FA C S , b lo q u ea d o con a n ticu e rp o d ir ig id o co n tra IgG de ra tón C D 16 /32 (B D P h a rm in g e n ), te ñ id o con el cóc te l de a n ticu e rp o s a d e cua d o y fija d o con BD C Y T O F IX ™ , to d o e llo de a cu e rd o con las in s tru cc io n e s de l fa b rica n te . Los a g lo m e ra d os ce lu la re s fin a le s se su sp e n d ie ro n en 0 ,5 ml de ta m p ó n de tin c ió n y se a n a liza ro n con un BD F A C S C A L IB U R ™ y un p ro g ra m a in fo rm á tico B D C E L L Q U E S T P R O ™ . T o d o s los a n ticu e rp o s (B D P h a rm in g e n ) se p re p a ra ro n en una m asa de d ilu c ió n /có c te l y se a ñ a d ie ro n a una co n ce n tra c ió n fina l de 0 ,5 m g /105 cé lu las.

Los có c te le s de a n tic u e rp o s pa ra tin c ió n de la m éd u la ó sea (A -D ) fu e ro n los s ig u ie n te s : A: IgM b-F IT C d ir ig id o con tra IgG de ratón, IgM a-P E d ir ig id o co n tra IgG de ratón, C D 45 R (B 220 )-A P C d ir ig id o con tra IgG de ratón; B: C D 43 (S 7 )-P E d ir ig id o co n tra IgG de ratón, C D 45 R (B 220 )-A P C d ir ig id o co n tra IgG de ratón; C: C D 24 (H S A )-P E d ir ig id o con tra IgG de ratón; C D 45 R (B 220 )-A P C d ir ig id o con tra IgG de ratón; D: B P -1 -P E d ir ig id o con tra IgG de ratón, C D 45 R (B 220 )-A P C d ir ig id o con tra IgG de ratón.

Los cóc te le s de a n ticu e rp o para tin c ió n de l bazo y el ga n g lio lin fá tico ingu ina l (E -H ) fu e ro n los s igu ien tes : E: Ig M b-F IT C d ir ig id o co n tra IgG de ratón, IgM a-P E d ir ig id o con tra IgG de ratón, C D 45 R (B 220 )-A P C d ir ig id o con tra IgG de ^{ratón; F: Ig, A 1, A2, A 3 C a d e n a lig e ra -F IT C d ir ig id o co n tra IgG de ra tón , Ig ca d e na lige ra}k-PE ^{d ir ig id o con tra IgG de}ratón, C D 45 R (B 220 )-A P C d ir ig id o con tra IgG de ratón; G: L y6 G /C -F IT C d irig ido con tra IgG de ratón, C D 49 b (D X 5 )-PE d ir ig id o co n tra IgG de ra tón , C D 11 b -A P C d ir ig id o co n tra IgG de ratón; H: C D 4 (L 3 T 4 )-F IT C d ir ig id o co n tra IgG de ratón, C D 45 R (B 220 )-P E d ir ig id o con tra IgG de ratón, C D 8 a -A P C d ir ig id o co n tra IgG de ratón. Los resu lta d o s se m ue s tra n en la FIG . 6.

Los lin fo c ito s a is la d o s de l bazo o los g a n g lio s lin fá tico s de ra to n e s V E L O C IM M U N E ® te ñ id o s pa ra e s ta b le c e r la e xp re s ió n en la su p e rfic ie de los m a rca d o re s B 220 e IgM y se a n a liza ro n usando c ito m e tría de flu jo (F IG . 6). Los ta m a ñ o s de las p o b la c io ne s de lin foc itos B B220+ IgM+ m a d u ro s en to d a s las v e rs io n e s de los ra tones V E L O C IM M U N E ® e n sa yad o s fue ron v ir tu a lm e n te id én ticos a los de los ra tones s ilves tres , in d e p e n d ie n te m e n te del ^{nú m e ro de se g m e n to s gén ico s}V^{h que con ten g a n . A d e m á s , los ra to n e s que con tie ne n loc i de la cadena pesada de}la in m u n o g lo b u lin a h u m a n iza d a h íb rida hom o c ig ó tico s , inc luso los que so la m e n te con tie ne n 3 s e g m e n to s gén icos V H pero loci de la ca d e na lige ra k de la in m u n o g lo b u lin a de ra tón no rm a l con loci de la ca d e na p esada de la in m u n o g lo b u lin a de ra tón no rm a l, tu v ie ro n ta m b ié n c ifras no rm a le s de lin fo c ito s B220+ IgM+ en sus co m p a rtim e n to s p e rifé rico s (no se m ue s tra ). E stos resu lta d o s ind ican que los loc i q u im é rico s con se g m e n to s gén ico s va riab le s h u m a n o s y reg io n e s co n s tan te s de ratón pueden p o b la r c o m p le ta m e n te el co m p a rtim e n to de lin fo c ito s B m aduros. A d e m á s , el nú m e ro de s e g m e n to s g é n ico s v a ria b le s en los loci ta n to de la ca d e na pe sa da co m o de la ca d e n a lige ra k, ^{y po r ta n to la d ive rs ida d te ó ric a de l re p e rto rio de a n ticu e rp o s , no se co rre la c io n a con la ca p a c id ad de g e n e ra r}p o b la c io n e s s ilve s tres de lin fo c ito s B m adu ros . P o r el con tra rio , los ra tones con tra n sg e n e s de in m u n o g lo b u lin a c o m p le ta m e n te h u m a n a in te g ra d o s a le a to ria m e n te y loc i de in m u n o g lo b u lin a de ra tón in a c tiv a d o s han red u c id o las c ifras de lin foc itos B en e s tos co m p a rtim e n to s , donde la g ravedad de l d é fic it depende de l nú m e ro de se g m e n to s génicos variables incluidos en el transgén (Green y Jakobovits, 1998, Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes, J Exp Med 188:483-495). Esto demuestra que la "estrategia de humanización genética "in situ " da como resultado un resultado funcional fundamentalmente diferente que los transgenes integrados aleatoriamente conseguidos en el enfoque "desactivación genética más transgénica".

Exclusión alélica y selección de locus. La capacidad de mantener la exclusión alélica se examinó en ratones heterocigóticos para diferentes versiones del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado.

La humanización de los loci de la inmunoglobulina se llevó a cabo en una línea F1 ES (F1 H4, Valenzuela et al., 2003), derivada de los embriones heterocigóticos 129S6lSvEvTac y C57BLl6NTac. Las secuencias génicas variables de la línea germinal de la cadena pesada humana se dirigieron hacia el alelo 129S6, que transporta el haplotipo IgMa mientras que el alelo C576BLl6N no modificado de ratón tiene el haplotipo IgMb . Estas formas alélicas de IgM se pueden distinguir mediante citometría de flujo usando anticuerpos específicos de los polimorfismos encontrados en los alelos IgMa o IgMb . Tal como se muestra en la Fig. 6 (fila inferior), los linfocitos B identificados en ratones heterocigóticos para cada versión del locus de la cadena pesada humanizado solamente expresa un único alelo, ya sea IgMa (el alelo humanizado) o IgMb (el alelo de tipo silvestre). Esto demuestra que los mecanismos implicados en la exclusión alélica están intactos en los ratones VELOCIMMUNE®. Además, el número relativo de linfocitos B positivos para el alelo humanizado (IgMa) es aproximadamente proporcional al número de segmentos génicos de V^hpresentes. El locus de inmunoglobulina humanizado se expresa en aproximadamente el 30 % de los linfocitos B en ratones heterocigóticos VELOCIMMUNE® 1, que tienen l8 segmentos génicos V^h, y un 50 % de los linfocitos B en ratones heterocigóticos VELOCIMMUNE® 2 y 3 (no se muestra), con 39 y 80 segmentos génicos V^h, respectivamente. De forma notable, la relación de células que expresan el alelo humanizado comparado con el alelo de ratón silvestre (0,5 para ratones VELOCIMMUNE® 1 y 0,9 para ratones VELOCIMMUNE® 2) es mayor que la relación del número de segmentos génicos variables incluidos en los loci humanizados comparados con los loci silvestres (0,2 para ratones VELOCIMMUNE® 1 y 0,4 para ratones VELOCIMMUNE® 2). Esto puede indicar que la probabilidad se selección de alelo es algo intermedio entre una selección aleatoria de uno u otro cromosoma y una selección aleatoria de cualquier RSS de un segmento V particular. Además, puede ser que una fracción de los linfocitos B, pero no todos, en los que un alelo queda accesible para la recombinación, complete el proceso y deshabilite la recombinación antes de que el otro alelo quede accesible. Además, la distribución equitativa de células que tienen IgM superficial (sIgM) derivada bien del locus de la cadena pesada híbrido humanizado o bien el locus de la cadena pesada de ratón silvestre es evidencia de que el locus híbrido está funcionando a su nivel normal. Por el contrario, los transgenes de inmunoglobulina humana integrados aleatoriamente compiten mal con los loci de la inmunoglobulina de ratón silvestre (Bruggemann et al., 1989, A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice, PNAS 86:6709-6713; Green et al., 1994; Tuaillon et al., 1993, Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in mu and gamma transcripts, PNAS USA 90:3720-3724). Esto demuestra adicionalmente que las inmunoglobulinas producidas por ratones VELOCIMMUNE® son funcionalmente distintas que las producidas mediante los transgenes integrados aleatoriamente en ratones conseguidos con el enfoque "desactivación genética más transgénica".

Los polimorfismos de las regiones Ck no están disponibles en 129S6 o C57BLl6N para examinar la exclusión alélica de los loci de cadena ligera ^khumanizados en comparación con los no humanizados. Sin embargo, Todos los ratones VELOCIMMUNE® tienen los loci de cadena ligera k de ratón silvestre, por lo tanto, es posible observar si la reordenación y la expresión de los loci de cadena ligera k humanizados pueden evitar la expresión de los loci de cadena ligera ^kde ratón. La relación entre el número de células que expresan la cadena ligera ^khumanizada con respecto al número de células que expresan la cadena ligera A de ratón resultó relativamente inalterada en los ratones VELOCIMMUNE® comparados con los ratones silvestres, independientemente del número de segmentos génicos de V^khumana insertados en el locus de cadena ligera ^k(FIG. 6, tercera fila desde la parte superior). Además, no se produjo incremento en el número de células doble positivas (^ky A), lo que indica que la recombinación productiva en el loci de cadena ligera k híbrido da como resultado una supresión correcta de la recombinación del loci de cadena ligera A de ratón. Por el contrario, los ratones que contenían transgenes de cadena ligera k integrados aleatoriamente junto con loci de cadena ligera k de ratón inactivados pero con loci de cadena ligera A de ratón mostraron valores fuertemente aumentados de la relación A/k (Jakobovits, 1998), lo que implica que los transgenes de la cadena ligera k introducidos no funcionan bien en este tipo de ratones. Esto demuestra adicionalmente el resultado funcional diferente observado en las inmunoglobulinas preparadas por los ratones VELOCIMMUNE® comparado con los preparados con ratones de tipo "desactivación genética más transgénica".

Desarrollo de linfocitos B. Puesto que las poblaciones de linfocitos B maduros en ratones VELOCIMMUNE® se parecen a los de los ratones silvestres (descritos anteriormente), es posible que los defectos en una diferenciación temprana de linfocitos B se compensen con la expansión de las poblaciones de linfocitos B maduros. Las diferentes fases de la diferenciación de los linfocitos B se examinaron mediante el análisis de poblaciones de linfocitos B usando citometría de flujo. La Tabla 6 define la relación de la fracción de células en cada linaje de linfocitos B definida por FACs, usando marcadores específicos de la superficie celular, en ratones VELOCIMMUNE® comparados con las crías homólogas silvestres.

El desarrollo inicial de los linfocitos B se produce en la médula ósea, y las diferentes fases de la diferenciación de linfocitos B se caracterizan por cambios en los tipos y cantidades de expresión de los marcadores de la superficie celular. Estas diferencias en la expresión superficial se correlacionan con los cambios moleculares que se producen en los loci de inmunoglobulina en el interior de la célula. La transición de pro-B a pre-B requiere una reordenación con éxito y la expresión de la proteína de cadena pesada funciona, mientras que la transición de pre-B a la fase B madura está controlada por la reordenación correcta y la expresión de una cadena ligera ^ko A. De esta manera, la transición ineficaz entre las fases de diferenciación de los linfocitos B se puede detectar mediante los cambios en las poblaciones relativas de linfocitos B en una fase dada.

Tabla 6

No se observaron defectos importantes en la diferenciación de linfocitos B en cualquiera de los ratones VELOCIMMUNE®. La introducción de segmentos génicos de la cadena pesada humana no parece afectar la transición de pro-B a pre-B, y la introducción de segmentos génicos de la cadena ligera ^kno afecta la transición de pre-B a B en ratones VELOCIMMUNE®. Esto demuestra que las moléculas "quiméricas inversas" de inmunoglobulina que tienen regiones variables humanas y regiones constantes de ratón funcionan normalmente en el contexto de señalización de linfocitos B y moléculas correceptoras que conducen a una diferenciación adecuada de linfocitos B en un entorno de ratón. Por el contrario, el equilibrio entre las diferentes poblaciones durante la diferenciación de linfocitos B está perturbado en cantidades variables en ratones que contienen transgenes de inmunoglobulina integrados aleatoriamente y loci de cadena pesada o de cadena ligera k inactivados endógenamente (Green and Jakobovits, 1998).

Ejemplo 4

Repertorio de genes variables en ratones con inmunoglobulina humanizada

El uso de segmentos génicos variables humanos en el repertorio de anticuerpos humanizados de los ratones VELOCIMMUNE® se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de las regiones variables humanas procedentes de fuentes múltiples incluyendo esplenocitos y células de hibridoma. Se determinaron la secuencia de la región variable, el uso del segmento génico, la hipermutación somática, y la diversidad de unión de los segmentos génicos reordenados de la región variable.

En resumen, el ARN total se extrajo de 1x107 - 2x107 esplenocitos o aproximadamente 104 - 105 células de hibridoma usando TRIZOL™ (Invitrogen) o Qiagen RNEASY™ Mini Kit (Qiagen) y se cebaron con cebadores específicos de la región constante de ratón usando el sistema de RT-PCR SUPERSCRIPT™ III One-Step RT-PCR (Invitrogen). Las reacciones se realizaron con 2-5 pl de ARN de cada muestra usando los cebadores específicos 3' constantes anteriormente mencionados emparejados con cebadores líderes combinados para cada familia de regiones constantes humanas tanto de la cadena pesada como la cadena ligera k, independientemente. Los volúmenes de reactivos y cebadores, y las condiciones de RT-PCR/PCR se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebadores se basaron en fuentes múltiples (Wang y Stollar, 2000, Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR, J Immunol Methods 244:217-225; Ig-primer sets, Novagen). Según necesidad, se realizaron reacciones PCR anidadas secundarias con los cebadores marco combinados específicos de la familia y el mismo cebador específico constante de la inmunoglobulina 3' de ratón utilizado en la reacción principal. Se analizaron alícuotas (5 ml) de cada región mediante electroforesis en agarosa y los productos de reacción se purificaron de la agarosa usando un kit de extracción en gel MONTAGE™ (Millipore). Los productos purificados se clonaron mediante el sistema de clonación TOPO™ TA (Invitrogen) y se transformaron en células DH10p E. coli mediante electroporación. Se seleccionaron clones individuales de cada reacción de transformación y se hicieron crecer en cultivos con 2 ml de caldo LB con selección mediante antibióticos durante la noche a 37 °C. El ADN plásmido se purificó a partir de los cultivos bacterianos mediante un abordaje de tipo kit (Qiagen).

Uso de los genes variables de inmunoglobulina. Se secuenció el ADN plásmido de clones tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera k con los cebadores inversos T7 o M13 en el equipo ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Los datos de secuencia brutos se importaron al equipo SEQUENCHER™ (v4.5, Gene Codes). Cada secuencia se ensamblo en cóntigos y se alineo con las secuencias de inmunoglobulina humana usando IMGT V-Quest (Brochet et al., 2008, IMGT/V-Q^uEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis, Nucleic Acids Res 36:W503-508) como función de búsqueda para identificar el uso de los segmentos humanos V^h, D^h, J^hy Vk, Jk. Las secuencias se compararon con las secuencias de la línea g e rm in a l para h ip e rm u ta c io n e s so m á tica s y an á lis is de un ión con recom b inac ión .

Los ra tones se g e n e ra ron a p a rtir de cé lu la s ES que co n ten ía n la m od ifica c ió n in ic ia l de la ca d e na pesada (a le lo h íb rid o 3hVH -C R E, pa rte in fe rio r de la F IG . 2 A ) m ed ia n te co m p le m e n ta c ió n R A G (C hen e t al., 1993, R A G -2 -d e fic ie n t b la s to c y s t c o m p le m e n ta ro n : an a ssa y o f g ene fu n c tio n in lym p h o cy te d e ve lo p m e n t, P N A S U S A 90 :4528 -4532 ), y se p re p a ró A D N c a p a rtir de A R N de e sp le n oc ito s . El A D N c se a m p lificó usando co n ju n to s de ce b a do re s (de sc rito s a n te r io rm e n te ) e sp e c ífico s de l A R N m de la ca d e na pe sa da q u im é rica que su rg iría de la re co m b in a c ió n V (D )J d e n tro de los se g m e n to s g é n ico s hum a n o s in se rta d o s y el p o s te r io r co rte y e m p a lm e con cu a lq u ie ra de los d o m in io s co n s ta n te s IgM o IgG. Las se cu e n c ia s d e riva d a s de e s tos c lones de A D N c (no m os tra d a s ) d e m u e s tran que se ha p ro d u c id o la re co m b in a c ió n co rre c ta V (D )J d e n tro de las se cu e n c ia s g é n ica s v a ria b le s hum anas, que los se g m e n to s g é n ico s V (D )J h u m a n o s reo rd e n ad o s han e xp e rim e n ta d o co rre c ta m e n te el co rte y e m p a lm e en m arco hac ia las reg io n e s co n s ta n te s de ratón, y que se ha p ro d u c id o la reco m b in a c ió n con ca m b io de c lase . S e rea lizó un an á lis is de se cu e nc ia a d ic io n a l de los p ro d u c to s de A R N m de los loci h íb ridos de in m u n o g lo b u lin a pos te rio res .

En un e xp e rim e n to s im ila r, lin foc itos B p ro ce d e n te s de ra to n e s s ilve s tre s y ra tones V E L O C IM M U N E ® no in m un iza d o s se se p a ra ro n m ed ia n te c ito m e tría de f lu jo en fun c ió n de la e xp res ión s u p e rfic ia l de B 220 y IgM o IgG. Los lin fo c ito s B220+ IgM+ o las IgG+ (sIgG ) de la s u p e rfic ie se co m b in a ro n y se o b tuv ie ro n las se cu e n c ia s de V h y V k d e sp ué s de la a m p lifica c ió n y c lo n a c ió n m ed ia n te R T -P C R (d e sc rita a n te rio rm e n te ). Se reg is tró el uso de g e nes re p re se n ta tivo s usa n do un co n ju n to de v a r io s A D N c a m p lificad o s m ed ia n te R T -P C R p ro ce d e n te s de ra to n e s V E L O C IM M U N E ® 1 no in m u n iz a d o s (T a b la 7 ) y ra to n e s V E L O C IM M U N E ® 3 (T a b la 8 ) (*R S S d e fe c tivo ; fa lta de t o pseudogén ). A s te risco : se g m e n to s g é n ico s con R S S de fec tivo . t: el se g m e n to gén ico fa lta o pseudogén .

Tabla 7

Ċ

Tabla 8

Como se muestra en las Tablas 7 y 8, se utilizaron casi todos los segmentos génicos V^h, D^h, J^h, Vk y Jk humanos funcionalizados. De los segmentos génicos variables funcionales descritos pero no detectados en el ratón VELOCIMMUNE® de este experimento, se ha notificado que algunos tienen secuencias señal de recombinación (RSS) defectivas y, por tanto, no se esperaría que se expresaran (Feeney, 2000, Factors that influence formation of B cell repertoire, Immunol Res 21:195-202). El análisis de otros conjuntos de secuencias de inmunoglobulina diferentes procedentes de varios ratones VELOCIMMUNE®, aislados de repertorios tanto silvestres como inmunizados, han demostrado el uso de estos segmentos génicos, aunque con menores frecuencias (no se muestran los datos). Los datos agregados del uso génico ha demostrado que todos los segmentos génicos V^h, D^h, J^h, V^k, y J^kfuncionales humanos incluidos en los ratones VELOCIMMUNE® se habían observado en diferentes repertorios silvestres e inmunizados (no se muestran los datos). Aunque el segmento génico V^h7-81 humano se había identificado en el análisis de las secuencias del locus de la cadena pesada humana (Matsuda et al., 1998, The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus, J Exp Med 188:2151-2162), no está presente en el ratón VELOCIMMUNE® tal como se confirma mediante la resecuenciación completa del genoma del ratón VELOCIMMUNE® 3.

Se sabe que las secuencias de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos muestran una variabilidad excepcional, especialmente en segmentos polipeptídicos cortos con reordenación del dominio variable. Estas regiones, conocidas como regiones hipervariables o regiones determinantes de la complementareidad (CDR), crean el sitio de unión para el antígeno en la estructura de la molécula de anticuerpo. Las secuencias de polipéptido intervinientes se denominan regiones marco (FR). Existen tres CDR (CDR1, Cd R2, CDR3) y 4 FR (FR1, FR2, FR3, FR4) tanto en las cadenas ligeras como en las pesadas. Una CDR, CDR3, es único en que estas CDR se crean mediante la recombinación de ambos segmentos génicos V^h, D^hy J^hy V^ky J^ky genera una cantidad significativa de diversidad de repertorio antes de encontrar al antígeno. La unión es imprecisa debido a ambas deleciones de nucleótido realizadas mediante actividad exonucleasa y las adiciones no codificadas en el molde mediante la desoxinucleotidil transferasa (TdT) del extremo y, por tanto, permite que aparezcan secuencias novedosas a partir del proceso de recombinación. Aunque las FR pueden mostrar una mutación somática sustancial debido a la elevada capacidad de mutación de la región variable en su conjunto, la variabilidad, sin embargo, no se distribuye de manera uniforme a lo largo de la región variable. Las CDR son regiones de elevada variabilidad concentradas y localizadas en la superficie de la molécula de anticuerpo que permiten la unión al antígeno. Las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpos seleccionados procedentes de ratones VELOCIMMUNE® alrededor de la unión CDR3 que demuestran diversidad en la unión se muestra en la FIG. 7A y 7B, respectivamente.

Tal como se muestra en la Fig. 7A, las adicionales de nucleótidos no codificadas en el molde (N-adiciones) se observan en ambas uniones V^h-D^hy D^h-J^hen los anticuerpos procedentes de los ratones VELOCIMMUNE®, indicando la función correcta de TdT con los segmentos humanos. Los puntos finales de los segmentos V^H, D^Hy J^Hcon respecto a sus homólogos en la línea germinal indican que también se ha producido actividad exonucleasa. A diferencia del locus de la cadena pesada, las reordenaciones de la cadena ligera k humana muestran poca o ninguna adición de sat CDR3, que se forma mediante la recombinación de los segmentos Vk y Jk (FIG. 7B). Esto se esperaba debido a la falta de expresión de TdT en los ratones durante las reordenaciones de la cadena ligera en la transición de prelinfocito B a linfocito B. La diversidad observada en la CDR3 de reordenación de las regiones V^khumanas se introduce predominantemente mediante actividad exonucleasa durante el acontecimiento de recombinación.

Hipermutación somática. Se añadió diversidad adicional a las regiones variables de los genes de inmunoglobulina reordenados durante la reacción del centro germinal mediante un proceso denominado hipermutación somática. Los linfocitos B que expresan regiones variables mutadas compiten somáticamente con otros linfocitos B para acceder al antígeno presentado por las células dendríticas foliculares. Estos linfocitos B, con mayor afinidad por el antígeno, se expandirán adicionalmente y experimentarán cambio de clase antes de salir en dirección a la periferia. De esta manera, los linfocitos B que expresan isotipos cambiados habitualmente se han encontrado con el antígeno y experimentado reacciones en el centro germinal y tendrán un número de mutaciones aumentado con respecto a los linfocitos B no expuestos. Además, se esperaría que las secuencias de regiones variables procedentes de linfocitos B sIgM⁺predominantemente no expuestos tuvieran relativamente menos mutaciones que las secuencias variables procedentes de linfocitos B sIgG⁺B que han experimentado selección mediante antígeno.

Las secuencias de clones aleatorios VH o Vk procedentes de linfocitos B sIgM+ o sIgG+ B procedentes de ratones VELOCIMMUNE® no inmunizados o linfocitos B sIgG⁺B procedentes de ratones inmunizados se compararon con los segmentos génicos variables de su línea germinal y se anotaron los cambios con respecto a la secuencia de la línea germinal. Las secuencias de nucleótidos resultantes se tradujeron in silico y también se anotaron las mutaciones que conducían a cambios de aminoácidos. Los datos se recogieron de todas las regiones variables y se calculó el cambio porcentual en una posición dada (FIG. 8).

Tal como se muestra en la Fig. 8, las regiones variables de la cadena pesada humana derivadas de linfocitos B sIgG+ procedentes de ratones VELOCIMMUNE® no inmunizados muestran más nucleótidos comparado con los linfocitos B sIgM⁺B procedentes de los mismos esplenocitos combinados, y las regiones variables de la cadena pesada derivados de ratones inmunizados muestran incluso más cambios. El número de cambios aumenta en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) con respecto a las regiones marco, indicando selección mediante antígeno. Las correspondientes secuencias de aminoácidos procedentes de las regiones variables de cadena pesada también muestran cifras significativamente más elevadas de mutaciones en IgG comparado con IgM e incluso más en IgG inmunizada. Estas mutaciones parecen ser de nuevo más frecuentes en las ^cD^rcomparadas con las regiones marco, lo que sugiere que los anticuerpos fueron seleccionados in vivo mediante antígenos. Un aumento similar en el número de mutaciones de nucleótidos y aminoácidos se observa en las secuencias V^kderivadas de linfocitos B IgG+ B procedentes de ratones inmunizados.

El uso génico y la frecuencia de hipermutaciones somáticas observados en ratones VELOCIMMUNE® demuestran que esencialmente todos los segmentos génicos presentes pueden reordenarse para formar anticuerpos quiméricos inversos completamente funcionales en estos ratones. Además, los anticuerpos de VELOCIMMUNE® participan completamente en el sistema inmunitario del ratón para experimentar selección por afinidad y maduración para crear anticuerpos humanos completamente maduros que pueden neutralizar eficazmente su antígeno diana. Los ratones VELOCIMMUNE® pueden desencadenar respuestas inmunes sólidas frente a numerosas clases de antígeno como resultado del uso de una amplia gama de anticuerpos humanos que al mismo tiempo tienen una elevada afinidad y son adecuados para su uso terapéutico (no se muestran los datos).

Ejemplo 5

Análisis de la estructura linfoide y los isotipos séricos

Las estructuras fundamentales del bazo, ganglios linfáticos inguinales, placas de Peyer y timo de las muestras de tejido procedentes de ratones silvestres o VELOCIMMUNE® teñidas con H&E se examinaron al microscopio óptico. Los niveles de isotipos de inmunoglobulina en el suero procedentes de ratones silvestres o VELOCIMMUNE® se analizaron con la tecnología LUMINEX™.

Estructura del órgano linfoide. La estructura y función de los tejidos linfoides dependen, en parte, del desarrollo correcto de las células hematopoyéticas. Un defecto en el desarrollo o la función de los linfocitos B se puede mostrar como una alteración en la estructura de los tejidos linfoides. Tras el análisis de las secciones tisulares teñidas, no se identificó una diferencia significativa en el aspecto de los órganos linfoides secundarios entre los ratones silvestres o VELOCIMMUNE® (no se muestran los datos).

Niveles de inmunoglobulina sérica. El nivel de expresión de cada isotipo es similar entre los ratones silvestres o VELOCIMMUNE® (FIG. 9A, 9B y 9C). Esto demuestra que la humanización de los segmentos génicos variables no tiene aparentemente ningún efecto adverso sobre el cambio de clase o la expresión y secreción de inmunoglobulina y por tanto mantiene aparentemente todas las secuencias endógenas de ratón necesarias para estas funciones. Ejemplo 6

Inmunización y producción de anticuerpos en ratones con inmunoglobulina humanizada

Diferentes versiones de ratones VELOCIMMUNE® se inmunizaron con antígeno para examinar la respuesta humoral contra el desafío de un antígeno extraño.

Inmunización y desarrollo de hibridoma. Ratones VELOCIMMUNE® y silvestres se pueden inmunizar con un antígeno en forma de proteína, ADN, una combinación de ADN y proteína, o células que expresan el antígeno. Los animales se sometieron a refuerzo cada tres semanas para un total de dos a tres veces. Después de cada refuerzo con antígeno, se recogieron y analizaron muestras de suero de cada animal para determinar respuestas de anticuerpo específicas de antígeno mediante la determinación de los títulos en suero. Antes de la fusión, los ratones recibieron un refuerzo pre-fusión final de 5 |jg de proteína o ADN, según se desee, mediante inyecciones intraperitoneales o intravenosas. Se recogieron los esplenocitos que se fusionaron con células Ag8.653 de mieloma en una cámara de electrofusión de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD, Diez días después del cultivo, se seleccionaron los hibridomas para determinar la especificidad de antígeno usando un ensayo ELISA (Harlow y Lane, 1988, Anticuerpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York). Como alternativa, se aislaron linfocitos B específicos de antígeno directamente a partir de ratones VELOCIMMUNE® inmunizados que se seleccionaron con técnicas convencionales, que incluyen las descritas en el presente documento, para obtener anticuerpos humanos específicos del antígeno de interés (por ejemplo, véase el documento US 2007/0280945A1).

Determinación del título sérico. Para controlar la respuesta sérica dirigida contra el antígeno del animal, se recogieron muestras de suero durante aproximadamente 10 días después de cada refuerzo y se determinaron los títulos utilizando ELISA específico de antígeno. En resumen, placas de 96 pocillos Nunc MAXISORP™ 96 se revistieron con 2 jg/m de antígeno durante la noche a 40 °C y se bloquearon con albúmina de suero bovino (Sigma, St. Louis, MO). Muestras en suero diluidas en serie 3 veces se dejaron unir a las placas durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 % y la IgG se detectó con FC de cabra dirigido contra Ig de ratón conjugado con HRP (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) para determinar el título de IgG total, o anticuerpos específicos del isotipo marcados con biotina o anticuerpos policlonales específicos de la cadena ligera (Southern Biotech Inc.) para determinaron los títulos específicos del isotipo, respectivamente. Para los anticuerpos marcados con biotina, tras el lavado de la placa, se añadió estreptavidina conjugada con HRP (Pierce, Rockford, IL). Todas las placas se revelaron con sustratos colorimétricos tales como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Tras determinar la reacción con ácido fosfórico 1 M, se registraron las absorbancias ópticas a 450 nM y los datos se analizaron con el programa informático PRISM™ de Graph Pad. Las diluciones necesarias para obtener dos veces la señal del fondo se definieron como el título.

En un experimento, los ratones VELOCIMMUNE® se inmunizaron con el receptor de la interleuquina-6 humano (hIL-6R). Un conjunto representativo de títulos séricos para ratones VELOCIMMUNE® y silvestres inmunizados con hIL-6R se muestra en la FIG. 10A y 10B.

Los ratones VELOCIMMUNE® y silvestres desencadenaron respuestas intensas contra IL-6R con intervalos de títulos similares (FIG. 10A). Algunos ratones de las cohortes VELOCIMMUNE® y silvestre alcanzaron una respuesta máxima después de un solo refuerzo con antígeno. Estos resultados indican que la intensidad de la respuesta inmune y la cinética de este antígeno fueron similares en los ratones VELOCIMMUNE® y silvestres. Estas respuestas de anticuerpo específicas de antígeno se analizaron adicionalmente para examinar los isotipos concretos de los anticuerpos específicos de antígeno descubiertos en el suero. Ambos grupos VELOCIMMUNE® y silvestre desencadenaron predominantemente una respuesta IgG1 (FIG. 10B), lo que sugiere que el cambio de clase durante la respuesta humoral es similar en los ratones de cada tipo.

Determinación de la afinidad de la unión entre antígeno y anticuerpo en solución. Un ensayo de competición en solución basado en ELISA se diseñó de forma típica para determinar la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno.

En resumen, los anticuerpos en medio condicionado se premezclaron con diluciones en serie de proteína de antígeno comprendidas entre 0 y 10 mg/ml. Las soluciones del anticuerpo y la mezcla de antígeno se incubaron a continuación de dos a cuatro horas a temperatura ambiente hasta alcanzar el equilibrio de unión. A continuación se determinó la cantidad de anticuerpo libre en las mezclas usando un ELISA en sándwich cuantitativo. Placas MAXISORB™ de 96 pocillos (VWR, West Chester, PA) se revistieron con 1 pg/ml de proteína de antígeno en solución de PBS durante la noche a 4 °C seguido por bloqueo con BSA no específico. Las soluciones de mezcla anticuerpo-antígeno se transfirieron a continuación a dichas placas seguidas por incubación durante una hora. A continuación, las placas se lavaron con tampón de lavado y los anticuerpos unidos a la placa se detectaron con un reactivo de anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra IgG de ratón conjugado con HRP (Jackson Immuno Research Lab) y se desarrollaron usando sustratos colorimétricos como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Tras determinar la reacción con ácido fosfórico 1 M, se registraron las absorbancias ópticas a 450 nM y los datos se analizaron con el programa informático PRISM™ de Graph Pad. La dependencia de las señales de las concentraciones de antígeno en solución se analizó mediante un análisis de ajuste de 4 parámetros y se notificaron como CI⁵⁰, la concentración de antígeno necesaria para conseguir una reducción del 50 % de la señal comparada con las muestras de anticuerpo sin presencia de antígeno en solución.

En un experimento, ratones VELOCIMMUNE® se inmunizaron con hIL-6R (como se ha descrito anteriormente.). La FIG. 11A y 11 B muestran un conjunto representativo de medidas de afinidad de anticuerpos dirigidos contra hIL6R procedentes de ratones VELOCIMMUNE® y silvestres.

Tras la inmunización los ratones recibieron un tercer refuerzo de antígeno, se determinaron los títulos séricos con un ensayo ELISA. Se aislaron esplenocitos de cohortes de ratones silvestres y VELOCIMMUNE® seleccionadas y se fusionaron con células AgB.653 de mieloma para formar hibridomas que se hicieron crecer con selección (como se ha descrito anteriormente). De un total de 671 hibridomas contra IL-6R producidos, se encontró que 236 expresaban anticuerpos específicos de antígeno. El medio recogido de los pocillos positivos para antígeno se utilizó para determinar la afinidad de unión del anticuerpo con el antígeno usando un ELISA de competición en solución. Los anticuerpos derivados de ratones VELOCIMMUNE® mostraron una amplia gama de afinidad en su unión con el antígeno en solución (FIG. 11A). Además, se encontró que 49 de 236 hibridomas contra IL-6R bloqueaban la unión entre IL-6 y el receptor en un bioensayo in vitro (no se muestran los datos). Además, estos 49 anticuerpos bloqueantes dirigidos contra IL-6 mostraron una gama de afinidades elevadas en solución similar a la de los anticuerpos bloqueantes derivados de la inmunización paralela de los ratones silvestres (FIG. 11B).

Ejemplo 7

Construcción de un vector director de ratón ADAM6

Debido a la sustitución de los loci génicos variables de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón por los loci génicos variables de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, las versiones iniciales de los ratones VELOCIMMUNE® carecen de la expresión de los genes de los ratones ADAM6. En particular, los ratones VELOCIMMUNE® macho demuestran una reducción en la fertilidad. De esta manera, la capacidad de expresar ADAM6 se volvió a genomanipular en los ratones VELOCIMMUNE® para recuperar el defecto de fertilidad.

Se construyó un vector director para insertar los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón en un locus de la cadena pesada humanizado usando tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (más arriba) para modificar un cromosoma bacteriano artificial (BAC) 929d24, que se obtuvo del Dr. Frederick Alt (Universidad de Harvard). El ADN de 929d24 BAC se genomanipuló para incluir fragmentos genómicos que incluyeran los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón y un casete de higromicina para la deleción dirigida de un pseudogen ADAM6 humano (hADAM6l+l) situado entre los segmentos génicos V^h1-2 and V^h6-1 humanos de un locus de la cadena pesada humanizado (FIG. 12).

En primer lugar, un fragmento genómico que contenía el gen ADAM6b de ratón, de ~800 pb en de la secuencia en dirección ascendente (5') y ~4800 pb de la secuencia en dirección descendente (3') se subclonó en el clon 929d24 BAC. Un segundo fragmento genómico que contenía el gen ADAM6a de ratón, de ~300 pb en de la secuencia en dirección ascendente (5') y ~3400 pb de la secuencia en dirección descendente (3'), se subclonó independientemente del clon 929d24 BAC. Los dos fragmentos genómicos que contenían los genes ADAM6b y ADAM6a de ratón se unieron a un casete de higromicina flanqueado por sitios de recombinación Frt para crear el vector director (vector director ADAM6 de ratón, Figura 12; ^sE^cID N°: 3). Se manipularon genéticamente varios sitios de enzimas de restricción en el extremo 5' del vector director después del gen ADAM6b de ratón y en el extremo 3' después del gen ADAM6a de ratón (parte inferior de la FIG. 12) para su unión en el locus de la cadena pesada humanizado.

Se realizó una modificación independiente en un clon BAC que contenía una sustitución de los loci génicos variables de la cadena pesada de ratón por loci génicos variables de la cadena pesada humana incluyendo el pseudogen ADAM6 humano (hADAM6l+l) situado entre los segmentos génicos V^h1-2 y V^h6-1 humanos del locus humanizado para la posterior unión del vector director ADAM6 de ratón (FIG. 13).

En resumen, se genomanipuló un casete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación loxP para incluir brazos de homología conteniendo la secuencia genómica humana en las posiciones 3' del segmento génico V^h1-2 humano (en 5' con respecto a hADAM6^) y a 5' del segmento génico V^h6-1 humano (en 3' con respecto a hADAM6^; véase la parte central de la FIG. 13). La situación del sitio de inserción de esta construcción directora era 1,3 kb en 5' y ~350 pb en 3' del pseudogen ADAM6 humano. La construcción directora también incluía los mismos sitios de restricción que el vector director ADAM6 de ratón para permitir la posterior unión a BAC entre el clon BAC modificado que contenía la deleción del pseudogen ADAM6 humano y el vector director ADAM6 de ratón.

Tras la digestión de BAC el ADN derivado de ambas construcciones, los fragmentos genómicos se unieron entre sí para construir un clon BAC genomanipulado que contenía un locus de cadena pesada humanizado que contenía una secuencia genómica situada ectópicamente que comprendía las secuencias de nucleótidos ADAM6a y ADAM6b de ratón. La construcción directora final para la deleción de un gen ADAM6 humano dentro de un locus de cadena pesada humanizado y la inserción de las secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón en células ES contenía, de 5' a 3', un fragmento genómico 5' que contenía ~13 kb de la secuencia genómica humana en 3' del segmento génico V^h1-2 humano, ~800 pb de la secuencia genómica de ratón en dirección 3' del gen ADAM6b de ratón, el gen ADAM6b de ratón, ~4800 pb de la secuencia genómica en dirección 5' del gen ADAM6b de ratón, un sitio Frt en 5', un casete de higromicina, un sitio Frt en 3', ~300 pb de la secuencia genómica de ratón en dirección 3' del gen ADAM6a de ratón, el gen ADAM6a de ratón, ~3400 pb de la secuencia genómica de ratón en dirección 5' del gen ADAM6a de ratón, y un fragmento genómico 3' que contenía ~30 kb de la secuencia genómica humana en 5' del segmento génico V^h6-1 humano (parte inferior de la FIG. 13).

El clon BAC genomanipulado (descrito anteriormente) se utilizó para electroporar células ES de ratón que contenían un locus de cadena pesada humanizado para crear células ES modificadas que comprenden una secuencia genómica de ratón situada ectópicamente que comprende las secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón dentro de un locus de cadena pesada humanizado. Las células ES positivas que contenían el fragmento genómico de ratón situado ectópicamente dentro del locus de cadena pesada humanizado se identificaron mediante un ensayo con PCR cuantitativa usando sondas TAQMAN™ (Lie and Petropoulos, 1998, Advances in quantitative PCR technology: 5'nuclease assays, Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48). Las regiones 3' y 5' situadas fuera de la parte modificada del locus de cadena pesada humanizado se confirmaron mediante PCR usando cebadores y sondas situados dentro de la región modificada para confirmar la presencia de la secuencia genómica ectópica de ratón dentro del locus de cadena pesada humanizado, así como la presencia del casete de higromicina. La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción en 5' incluyó lo siguiente, que indica la secuencia genómica de la cadena pesada humana en dirección 5' del punto de inserción, así como un sitio de restricción (I-Ceul (incluido entre paréntesis a continuación) unido de forma contigua a la secuencia genómica de ratón presente en el punto de inserción. (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA

G)GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEC ID N°: 4). La secuencia de nucleótidos a través de la inserción en dirección 5' en el extremo 3' de la región diana incluyó lo siguiente, que indica una secuencia genómica de ratón y un sitio de restricción PISceI (incluido entre paréntesis a continuación) unido de forma contigua a la secuencia genómica de la cadena pesada humana en dirección 3' del punto de inserción: (AGGGGTCGAG G G G G A A T T T T A C A A A G A A C A A A G A A G C G G G C A T C T G C T G A C A T G A G G G C C G A A G T C A G G C T C C A G G C A G C G G G A G C T C C A C C G C G G T G G C G C C A T T T C A T T A C C T C T T T C T C C G C A C C C G A C A T A G A T A A A G C T T ) A T C C C C C A C C A A G C A A A T C C C C C T A C C T G G G G C C G A G C T T C C C G T A T G T G G G A A A A T G A A T C C C T G A G G T C G A T T G C T G C A T G C A A T G A A A T T C A A C T A G (S E C ID N°: 5).

Las cé lu la s ES d iana a n te rio rm e n te d e sc rita s se u tiliza ron com o cé lu la s ES d o n an te s en un em brión de ra tón en la fase de 8 cé lu la s según el m é to d o de g e n o m a n ip u la c ió n de l ratón V E L O C IM O U S E ® (véase , p o r e jem p lo , P a te n te de los E s ta d o s U n idos. N ros 7 ,6598 , 442 , 7.576.259 , 7.294.754 ). Los ra to n e s que co n ten ía n un locus de ca d e na p esada h u m a n iza d o que inc lu ía una se cu e nc ia g e n óm ica ec tó p ica de ra tón que co m p re n d ía las se cu e nc ias A D A M 6 a y A D A M 6 b de ra tón se id e n tifica ro n m ed ia n te g e n o tip a d o usando una m o d ifica c ió n de l ensa yo de a le lo s (V a le n zu e la e t al., 2003 ) que d e tec tó la p re se n c ia de los g e n es A D A M 6 a y A D A M 6 b de ra tón d e n tro de l locus de ca d e na p esada h um an izado .

Los ra tones que co n ten ía n un locus de ca d e na pesada h u m a n iza d o que inc lu ía los genes A D A M 6 a y A D A M 6 b de ra tón se rep ro d u je ro n para co n s e g u ir una raza de ratón que inc lu ía el e lim in a d o r FLP e (véase , p o r e jem p lo , R o d riguez e t al., 2000, H ig h -e ffic ie n cy d e le te r m ice sh o w th a t FLP e is an a lte rn a tive to C re -loxP . N a tu re G en e tics 25 :139 -140 ) para e lim in a r los case tes de h ig ro m ic in a en F rt in tro d u c id o s m ed ia n te el v e c to r d ire c to r que no se hub ie ra n e lim inado , p o r e jem p lo , en la fase de c é lu la ES o en el em b rió n . De m an e ra opc iona l, el case te de h ig ro m ic in a q u e da re ten ido en los ratones.

Las c rías se g e n o tip a ro n y las c rías h e te ro c ig ó tica s para el lo cus de ca d e na pesada h u m a n iza d o que con tie ne un fra g m e n to g e n óm ico e c tó p ico de ra tón que co m p re n d e las se cu e n c ia s A D A M 6 a y A D A M 6 b de ra tón se se le cc io n a ro n para ca ra c te r iz a r la e xp res ión gén ica y la fe rtilizad de l ra tón A D A M 6.

Ejemplo 8

Caracterización de los ratones de rescate ADAM6

Citometría de flujo. ^{T re s ra to n e s de 25 se m a n a s de e dad h o m o c ig ó tico s pa ra los loci g é n ico s v a r ia b le s de ca d e na}p esada h u m a n o s y la cadena lige ra ^khu m a n a (H /+k+/+) y tres ra tones de 18 -20 se m a n a s de edad h o m o c ig ó tico s pa ra la ca d e na p esada hu m a n a y la ca d e na lige ra ^khum ana que tie n e n el fra g m e n to g e n óm ico e c tóp ico de ratón que co d ifica los genes A D A M 6 a y A D A M 6 b de ra tón d en tro de a m b o s a le los de l locus de ca d e na pesada hum ano ^(H+/+A6resK^{+/+) se sa c rifica ro n para id e n tifica c ió n y aná lis is de las p o b la c io ne s de lin fo c ito s m ed ia n te FA C S en el}s is tem a BD LS R II (B D B iosc ience ). Los lin foc itos se c la s ifica ron en lina jes ce lu la re s e sp e c ífico s y se an a liza ro n para e s ta b le c e r su p ro g reso po r las d ife re n te s fa se s de l d e sa rro llo de los lin fo c ito s B. Los te jid o s reco g id o s de los a n im a le s in c lu ye ro n sangre , bazo y m éd u la ósea . La sangre se reco g ió en tu b o s BD m ic ro ta in e r con E D T A (B D B io sc ie n ce s ). La m éd u la ósea se reco g ió de los fé m u re s lava n d o con m ed io R P M I co m p le to su p le m e n ta d o con sue ro de fe to de te rn e ra , p iruva to de sod io , H E P E S , 2 -m e rca p to e ta n o l, a m in o á c id o s no esen c ia le s , y gen tam ic ina . Los g ló b u lo s ro jos p ro ce d e n te de las p re p a ra c io ne s de sangre , bazo y m édu la ósea se lisa ron con un ta m p ó n de lisis b asado en c lo ru ro de am o n io (p o r e jem p lo , el ta m p ó n de lis is A C K ), se g u id o po r lavado con m ed io R P M I com p le to . P ara te ñ ir las p o b la c io ne s ce lu la re s , 1 x 106 cé lu la s de d ife re n te s fu e n te s de te jid o se in cu b a ro n con a n ticue rpo C D 16 /C D 32 d ir ig id o co n tra IgG de ra tón (2.4G 2 , BD B io sc ie n ce s ) en h ie lo d u ra n te 10 m inu tos , se g u id o po r m arca d o con uno o una co m b in a c ió n de los s ig u ie n tes có c te le s de a n ticu e rp o d u ra n te 30 m in u to s so b re hie lo.

M éd u la ósea : a n ticu e rp o s con tra IgG de ratón F IT C -C D 43 (1 B11, B ioLegend ), P E -ck it (2B 8, B ioLegend ), P eC y7 -IgM (II/41 , eB io sc ie n ce ), P e rC P -C yS .S -Ig D (11 -26 c .2a , B ioLegend ), A P C -e F lu o r780 -B 220 (R A 3-6B 2 , e B iosc ience ), A 700 -C D 19 (1 D3, B ^dB iosc iences).

^{S a n g re p e rifé rica y bazo: a n ticu e rp o s co n tra IgG de ra tón F IT C -}k ^{(187.1 , BD B iosc ie n ce s ), PE -}A ^{(R M L-42 ,}B ioLegend ), P e C y7 - IgM (II/41 , e B io sc ie n ce ), P e rC P -C yS .S -Ig D (11 -26 c .2a , B ioL e g e n d ), A P C -C D 3 (14 S -2 C 11 , BD), A 700 -C D 19 (1D 3, BD), A P C -e F lu o r780 -B 220 (R A 3 -6B 2 , e B io sc ie n ce ). T ra s la incubac ión con los an ticu e rp o s m arcados , las cé lu la s se lava ron y se fija ron en fo rm a ld e h íd o al 2 %. La a d q u is ic ió n de d a tos se rea lizó en un ^{c itó m e tro de flu jo LS R II y se a n a liza ro n con F low Jo (T re es ta r, Inc.). Los resu lta d o s de un ra tón H+/+}k^{+/+ y H+/+A6res}K^+/+rep re se n ta tivo se m uestran en las F IG S . 14 - 18 ,

^{Los resu lta d o s d e m u e s tran que los lin fo c ito s B de los ra tones H+/+A6res}K^{+/+ p ro g resan po r las fa se s de de sa rro llo de}los lin fo c ito s B de una fo rm a s im ila r a la de los ra to n e s H+/+k+/+ en la m éd u la ó sea y los co m p a rtim e n to s de la sa n g re ^{pe rifé rica , y m ue s tra n m od e lo s de m ad u ra c ió n n o rm a le s cu a n do han a lca n za d o la pe rife ria . Los ra to n e s H+/+A6res}K^+/+d e m o s tra ro n una p o b lac ión de cé lu la s C D 43 intCD19+ m a yo r en co m p a ra c ió n con los ra to n e s H+/+k+/+ (F IG . 16B). Esto puede in d ic a r una exp re s ió n IgM a ce le ra d a p roceden te de l locus de ca d e na p esada h u m a n iza d o que in c lu ye un fra g m e n to g e n ó m ico ec tó p ico de ra tón que com p re n d e las se cu e nc ias A D A M 6 a y A D A M 6 b de ratón en los ra to n e s ^H+/+A6resK^{+/+. En la p e rife ria , las p o b la c io n e s de lin fo c ito s B y T de los ra to n e s H+/+A6res}K^{+/+ p a re ce no rm a l y s im ila r a}la de los ra to n e s H+/+k+/+.

Morfología del testículo y caracterización del esperma. ^{P ara d e te rm in a r si la in fe rtilida d en ra tones que tienen}loc i va ria b le s de la ca d e na p esada de la in m u n o g lo b u lin a hum a n a se debe a d e fe c to s en los te s tíc u lo s o en la p ro d u cc ió n de espe rm a , se e xa m in ó la m o rfo lo g ía y el co n ten id o de e sp e rm a de l ep id íd im o .

En resum en , te s tíc u lo s p roce d e n te s de dos g ru p o s (n=5 po r g rupo ; g rupo 1: ra tones h o m o c ig ó tico s para los loci g é n ico s va ria b le s de ca d e na pesada y ca d e na lige ra ^khum anos, H+/+k+/+; g rupo 2: ra tones h e te ro c ig ó tico s pa ra los loc i g é n ico s va ria b le s de ca d e na pesada y ca d e na lige ra ^kh u m anos, H+/-k+/+) se d is e cc io n a ro n con el ep id íd im o in tac to y se pesa ron . A c o n tin u a c ió n los e sp e c ím e n e s se fija ron , se in c lu ye ro n en pa ra fina , se s e cc io n a ro n y se tiñ e ro n con c o lo ra n te de h e m a to x ilin a y eo s in a (H E ). S e cc io n e s te s tic u la re s (2 te s tíc u lo s po r ra tón , para un to ta l de 20 ) se e xa m in a ro n pa ra e x a m in a r d e fe c to s en la m o rfo lo g ía y e v id e n c ia en la p ro d u cc ió n de e sp e rm a , m ie n tra s que las se cc io n e s del e p id íd im o se e xa m in a ro n para d e te rm in a r la p re se n c ia de esperm a.

En es te e xp e rim e n to , no se o b se rva ro n d ife re n c ia s en el peso o m orfo log ía de los te s tíc u lo s en tre los ra to n e s H+/+k+/+ y los ra tones H+/-k+/+. Se o b se rvó el e sp e rm a ta n to de los te s tíc u lo s com o de l e p id íd im o de to d o s los geno tipos . E stos resu lta d o s e s ta b lec ie ro n que la a u se nc ia de genes A D A M 6 a y A D A M 6 b de ratón no con d uce a cam b ios d e te c ta b le s en la m o rfo lo g ía te s ticu la r, y que el e sp e rm a se p ro d u ce en los ra tones en p re se n c ia y a u se n c ia de ^{a m b o s genes. P o r tan to , no son p ro bab les d e fec to s en la fe rtilida d de los ra tones H+/+}K^{+/+m acho d e b id os a la baja}p ro d u cc ió n de esperm a.

Motilidad y migración del esperma. ^{Los ra to n e s que ca re ce n de o tro s m ie m b ro s de la fa m ilia de g e n es A D A M son}in fé rtile s de b id o a d e fec to s en la m o tilid ad de l e sp e rm a o m ig rac ión . La m ig ra c ió n de l e sp e rm a se de fine co m o la ca p a c id ad de l e sp e rm a pa ra p a sa r de l ú te ro al ov id u c to , y n o rm a lm e n te es n e ce sa ria pa ra la fe rtiliza c ió n en ra tones. P a ra d e te rm in a r si la d e le c ió n de los A D A M 6 a y A D A M 6 b en ra to n e s a fe c ta e s te p roceso , la m ig ra c ió n y la m o tilidad de l e sp e rm a se e va lu a ro n en ra tones H+/+k+/+.

En resum en , se o b tuvo e sp e rm a de los te s tíc u lo s de (1 ) ra to n e s h e te ro c ig ó tic o s pa ra los loc i g é n ico s v a ria b le s de la ca d e na pesada hu m a n a y h o m o c ig ó tico s pa ra los loci gén ico s va ria b le s de la ca d e n a lige ra k h u m a n a (H+/-k+/+); (2) ra tones h o m o c ig ó tico s para los loc i gén ico s va ria b le s de la ca d e na p esada hum ana y h o m o c ig ó tico s para los loci g é n ico s va ria b le s de la c a d e n a lige ra ^khum ana (H+/+k+/+); (3) ra tones h o m o c ig ó tico s pa ra los loc i gén ico s va riab le s de la ca d e na pesada hum ana y h o m o c ig ó tico s para para la ca d e na lige ra ^ks ilve s tre (H ^^tik); y, (4) ra tones C S 7 B L /6 s ilve s tre s (W T). No se o b se rva ro n a n o m a lía s s ig n ific a tiv a s en el re cu e n to e s p e rm á tic o o en la m ov ilid a d g loba l de l e sp e rm a tra s la insp e cc ió n . En to d o s los ra to n e s se o b se rvó d isp e rs ió n de l cú m u lo , in d ica n d o q ue cada m ue s tra de e sp e rm a pudo p e n e tra r las cé lu la s de l cú m u lo y un irse in v itro a la zo n a pe lúc ida . E stos resu lta d o s e s tab lecen que los ra to n e s H+/+k+/+ tienen e sp e rm a que pueden p e n e tra r en el cú m u lo y u n irse a la zo n a pe lúc ida .

La fe rtiliza c ió n de los o va rio s de ra tón in v itro ( IV F ) se rea lizó usa n do e sp e rm a de ra tones co m o se ha descrito a n te rio rm e n te . S e o b se rva ro n un núm ero lig e ram e n te in fe rio r de e m b rio n e s e sc in d id o s para los ra tones H+/+k+/+ el d ía p o s te r io r a IVF, a s í com o un nú m e ro red u c id o en el e sp e rm a un ido a los óvu los . E s tos resu lta d o s e s ta b lece n que el e sp e rm a de ra tones una ve z e xp u es to a un óvu lo , puede p e n e tra r en el cú m u lo y un irse a la zona pe lúc ida .

En o tro expe rim e n to , la ca p a c id ad de l e sp e rm a de los ra tones H+/+k+/+ para m ig ra r desde el ú te ro y a tra vé s del o v id u c to se d e te rm in ó en un en sa yo de m ig rac ión de esperm a.

En resum en , un p rim e r g rupo de ra to n e s h em bra s u p e ro vu la d a s (n= 5 ) se e m p a re ja ro n con m ach o s H+/+k+/+ (n= 5 ) y un se g u n d o g ru p o de ra to n e s h e m b ra su p e ro v u la d a s (n= 5 ) se e m p a re ja ro n con m ach o s H+/-k+/+ (n=5). Se o b se rvó la co p u la c ió n de las pare jas , y de c inco a se is h o ras d e sp u é s de la cop u la c ió n , se e x tra jo el ú te ro y el o v id u c to un ido de to d a s las hem b ra s , y se lava ron pa ra su aná lis is . Las s o lu c io n e s de la va d o se in ve s tig a ro n pa ra e n c o n tra r óvu los pa ra v e r if ic a r la o v u la c ió n y o b te n e r un re cu e n to de e sp e rm a . La m ig ra c ió n de l e s p e rm a se e va lu ó de dos m a n e ra s d ife re n te s . En p rim e r lugar, a m bos o v id u c tos se e x tra je ron de l ú tero , se lava ron con su e ro sa lino , y se con ta ro n to d o s los e sp e rm a to zo id e s id e n tifica do s . T am b ié n se a n o tó la p re se n c ia de ó vu lo s com o e v id e n c ia de la ovu lac ión . En se g u nd o lugar, los o v id u c to s se un ie ron al ú te ro po r su izq u ie rd a y se fija ro n a m bos te jid o s , se in c lu ye ro n en pa ra fina , se se cc io n a ro n y se tiñ e ro n (com o se ha desc rito a n te rio rm e n te ). Las se cc io n e s se e xa m in a ro n para d e te rm in a r la p re se n c ia de espe rm a , ta n to en el ú te ro co m o en a m b o s ov iduc tos .

De las h e m b ra s e m p a re ja d a s con los c in co m ach o s

se e n co n tró poco e sp e rm a en la so lu c ió n de l a va d o del ov id u c to . Las so lu c io n e s de lavado p roce d e n te s de los o v id u c tos de las hem b ra s e m p a re ja d as con los m ach o s H+/-k+/+ m os tra ro n un n ive l de e sp e rm a a p ro x im a d a m e n te 25 a 30 v e c e s m a y o r (prom . n = 10 o v id u c to s ) que el p rese n te en las s o lu c io n e s de la va d o p ro c e d e n te s de los o v id u c to s de las h e m b ra s e m p a re ja d a s con los m a ch o s H+/+k+/+. En ^{la T a b la 9 se m ue s tra una co m p a ra c ió n rep re se n ta tiva de la rep ro d u cc ió n de los ra tones H+/+}k^{+/+ y H+/+A6res}K^+/+.

Se p re p a ra ro n se cc io n e s h is to ló g ica s de l ú te ro y de l ov iduc to . Las se cc io n e s se e xa m in a ro n pa ra d e te rm in a r la p re se n c ia de e sp e rm a en el ú te ro y en el o v iduc to (el co n d uc to co licu la r). La inspecc ión de las se cc iones h is to ló g ic a s de l o v id u c to y de l ú te ro reve ló que , pa ra las h e m b ra s e m p a re ja d a s con los ra to n e s H+/+K+/+, se enco n tró e sp e rm a en el ú te ro pero no en el ov id u c to . A d e m á s , las se cc io n e s p roce d e n te s de h e m b ra s e m p a re ja d a s con los ra tones H+/+k+/+ reve ló que no a p a re c ía e sp e rm a en la un ión u te ro -tub a l (U TJ). En se cc io n e s p ro ce d e n te s de h e m b ra s e m p a re ja d a s con los ra to n e s H+/"K+/+, se iden tificó e sp e rm a en la U TJ y en el ov iducto .

E stos resu lta d o s e s tab lecen que los ra tones que ca recen de los genes A D A M 6 a y A D A M 6 b fa b rica n esp e rm a que m ue s tra un de fec to de m ig ra c ió n in vivo. En to d o s los casos, se o b se rvó e sp e rm a en el in te rio r de l ú tero , lo que ind ica que la cop u la c ió n y la libe rac ión de e sp e rm a se p rodu ce n a p a re n te m e n te de fo rm a norm a l, pero no se o b se rvó poco o n ingún e sp e rm a d e n tro de los o v id u c to s d e s p u é s de la co p u la c ió n , ta l co m o se m ide ta n to m ed ian te el recuen to de e sp e rm a com o m ed ia n te o b se rva c ió n h is to lóg ica . E stos resu lta d o s e s tab lecen que los ra tones que ca re ce n de los g e n es A D A M 6 a y A D A M 6 b p rodu ce n un e sp e rm a que m ue s tra una in ca p a c id ad pa ra m ig ra r d e sd e el ú te ro has ta el o v id u c to . E ste de fec to co n d u ce a p a re n te m e n te a la in fe rtilida d p o rq u e el e sp e rm a no p uede a tra v e s a r la un ión ú te ro -tu b a l en el o v id u c to , d o n d e los ó vu lo s se fe rtiliza n . En su co n ju n to , to d o s e s to s re su lta d o s co n ve rg e n en re s p a ld a r la h ipó tes is de que los g enes A D A M 6 de ra tón ayu d an a d ir ig ir el e sp e rm a con m o tilid ad no rm a l para m ig ra r fu e ra de l ú tero , a tra v é s de la un ión ú te ro -tub a l y h ac ia el ov iduc to , y a ce rca rse de esta fo rm a a un ó vu lo para c o n s e g u ir el a c o n te c im ie n to de fe rtiliza c ió n . El m e ca n ism o m ed ia n te el cua l A D A M 6 a lca n za esto puede e s ta r d ir ig id o m e d ia n te una o a m b a s p ro te ín a s A D A M 6 , o a tra v é s de una e xp re s ió n co o rd in a d a con o tra s p ro te ínas , p o r e jem p lo , o tra s p ro te ín a s A D A M , en la cé lu la espe rm á tica , com o se d e sc rib e m ás ade lan te .

Tabla 9

Expresión de la familia de genes ADAM. ^{S e sabe que un co m p le jo de p ro te ín a s A D A M está p resen te com o}co m p le jo en la su p e rfic ie de l e sp e rm a en m ad u ra c ió n . Los ra tones que ca recen de o tro s m ie m b ro s de la fa m ilia de los g e n es p ie rden este co m p le jo a m ed ida que el e sp e rm a m adura , y m ue s tra n una red u cc ió n en m ú ltip les p ro te ín a s A D A M en el e sp e rm a m aduro . P a ra d e te rm in a r si una fa lta de los g e n es A D A M 6 a y A D A M 6 b a fe c ta o tras p ro te ín a s A D A M de una fo rm a s im ila r, se rea liza ro n tra n s fe re n c ia s W e s te rn de e x tra c to s de p ro te ín a s de l te s tíc u lo (esp e rm a in m ad u ro ) y los e p id íd im o s (esp e rm a m ad u ro ) para d e te rm in a r los n ive les de e xp res ión de o tro s m ie m b ro s de la fa m ilia de los g e n es A D A M .

En este e xp e rim e n to , se a n a liza ro n e x tra c to s de p ro te ínas p ro ce d e n te s de g ru p o s (n=4 po r g ru p o ) de ra tones H+/+k+/+ y H+/-k+/+. Los resu lta d o s m ostra ron que la exp re s ió n de A D A M 2 y A D A M 3 no se v ie ron a fe c tad o s en los e x tra c to s de te s tícu lo . S in e m ba rgo , a m bas A D A M 2 y A D A M 3 se redu je ro n d rá s tica m e n te en los e x tra c to s de ep id íd im o . E sto de m u e s tra que la a u se nc ia de A D A M 6 a y A D A M 6 b en el e sp e rm a de ra to n e s H+/+k+/+ puede te n e r un e fe c to d irec to so b re la e xp re s ió n y qu izás la fun c ió n de o tra s p ro te ín a s A D A M a m ed id a que el e sp e rm a m ad u ra (p o r e je m p lo , A D A M 2 y A D A M 3 ). E s to su g ie re que A D A M 6 a y A D A M 6 b fo rm a n pa rte de un co m p le jo de p ro te ín a A ^dA ^ms itu a d o en la su p e rfic ie del espe rm a , que puede se r fu n d a m e n ta l para una co rre c ta m ig rac ión de l esperm a.

Ejemplo 9

Utilización de los genes variables de la cadena pesada humana en ratones ADAM6

El uso de g e n e s v a ria b le s de la ca d e na pe sa da h u m a n a se le cc io n a d o s se d e te rm in ó en ra to n e s h o m o c ig ó tico s para los loc i de la ca d e n a p e sa d a y la c a d e n a lige ra k h u m a n a s qu e b ien ca re c ía n de los g e n e s A D A M 6 a y A D A M 6 b de ra tón (H+/+k+/+) o co n te n ía n un fra g m e n to g e n ó m ico e c tó p ico que co d ifica b a los g e n es A D A M 6 a y A D A M 6 b de ra tón ^(H+/+A6resK^{+/+) m ed ia n te un ensa yo de P C R cu a n tita tivo usa n do so n d as T A Q M A N ™ (com o se ha descrito}an te rio rm e n te ).

^{En resum en , Se p u rifica ron lin fo c ito s B CD19+ B a p a rtir de bazos de ra to n e s H+/+}k^{+/+ y H+/+A6res}K^{+/+ usando}C D 19 M ic ro b e a d s (M ilte n y i B io te c ) de ra tón y el A R N to ta l se pu rificó con el M in i k it R N E A S Y ™ (Q iagen ). S e re tiró el A R N g e n ó m ico usa n do D N asa e xe n ta de R N a sa m ed ia n te tra ta m ie n to en una c o lu m n a (Q iagen ). A p ro x im a d a m e n te 200 ng de A R N m se tra n s c r ib ió in ve rsa m e n te a A D N c usando el k it de s ín te s is F irs t S tand cD N A ( In v itro g e n ) y a co n tin ua c ió n se a m p lificó con la T A Q M A N ™ U n ive rsa l PC R M a s te r M ix (A pp lied B io sys te m s) usando el s is te m a de d e tecc ión de se cu e nc ia A B I 7900 (A pp lied B iosys te m s). La e xp res ión re la tiva de cada gen se n o rm a lizó a la ^{e xp re s ió n de la reg ión co n s tan te de la ca d e na lige ra k de ra tón (m C}K^{). La T ab la 10 de fine las c o m b in a c io n e s de}sonda de sen tid o d ire c to /se n tid o c o n tra r io /T A Q M A N ™ M G B u tiliza d a s en este expe rim e n to .

Tabla 10

En este experimento, se observó en las muestras analizadas la expresión de los cuatro genes V^hhumanos. Además, los niveles de expresión fueron comparables entre los ratones H^+/+k+/+y H+/+A6resK+/+. Estos resultados demuestran que los genes V^hhumanos que eran a la vez distales al sitio de la modificación (V^h3-23 y V^h1-69) y proximales al sitio de modificación (V^h1-2 y V^h6-1) pudieron recombinarse para constituir una cadena pesada humana funcionalmente expresada. Estos resultados demuestran que el fragmento genómico ectópico que comprendía las secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón insertadas en una secuencia genómica de cadena pesada humana no afectó la recombinación V(D)J de los segmentos de la cadena pesada humana dentro del locus, y estos ratones pudieron recombinar segmentos génicos de la cadena pesada humana de forma normal para producir proteínas de la cadena pesada de la inmunoglobulina funcionales.

Ejemplo 10

Respuesta inmune humoral en ratones ADAM6 de rescate

La respuesta inmune humoral se determinó en ratones homocigóticos para los loci de la cadena pesada y la cadena ligera ^khumanas que bien carecían de los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (H^+/+k+/+) o contenían un fragmento genómico ectópico que codificaba los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (H+/+A6resK+/+) mediante un esquema de inmunización multiantígeno seguido por aislamiento y caracterización de anticuerpos. Se compararon los resultados para determinar cualquier efecto sobre la recombinación de V(D)J que implique los segmentos génicos de la inmunoglobulina humana, valoración de la evolución de los títulos séricos, producción de anticuerpos mediante hibridomas y afinidad por el antígeno.

Protocolo de inmunización: un receptor de la superficie celular humano (Antígeno A), un anticuerpo humano específico de un receptor de la proteína tirosina quinasa humano (Antígeno B), una proteína humana secretada que funciona en la regulación de la ruta de señalización TGF-p (Antígeno C), y un receptor de la tirosina quinasa humano (Antígeno D) se utilizaron para realizar inmunizaciones comparativas en grupos de ratones. Se recogió suero de grupos de ratones antes de la inmunización con los antígenos anteriores. Cada antígeno (2,3 |jg cada uno) se administró en una inmunización inicial mezclado con 10 jg de oligonucleótido CpG como adyuvante (Invivogen). El inmunógeno se administró en la almohadilla plantar (a.p.) en un volumen de 25 j l por ratón. Posteriormente, los ratones recibieron un refuerzo en la a.p. con 2,3 jg de antígeno junto con 10 jg de CpG y 25 jg de Adju-Phos (Brenntag) como adyuvantes en los días 3, 6, 11, 13, 17, y 20 para un total de seis refuerzos. Se extrajo sangre de los ratones en los días 15 y 22 después de los refuerzos cuarto y sexto, respectivamente, y se ensayaron los antisueros para determinar el título de anticuerpo para cada antígeno específico.

Se determinaron los títulos de anticuerpo en los sueros de los ratones inmunizados mediante un ensayo ELISA. Placas de microtitulación de noventa y seis pocillos (Thermo Scientific) se revistieron con el correspondiente antígeno (2 jg/ml) en suero salino tamponado con fosfato (PBS, Irvine Scientific) durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron con suero salino tamponado con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (PBS-T, Sigma-Aldrich) cuatro veces usando un lavador de placas (Molecular Devices). Las placas se bloquearon a continuación con 250 j l de albúmina de suero bovino al 0,5 % (BSA, Sigma-Aldrich) en PBS y se incubaron durante una hora a te m p e ra tu ra a m b ien te . A co n tin ua c ió n se lava ron las p lacas cua tro ve ce s con P B S -T . El su e ro de los ra tones in m un iza d o s y p re in m u n iza d o s se d iluyó en se rie tres ve ce s en B S A -P B S al 0 ,5 % co m e n za n d o a p a rtir de 1 :300 o 1 :1000 y se a ñ a d ie ro n a las p lacas b lo q u ea d a s po r d u p lica d o y se in cuba ron a te m p e ra tu ra am b ie n te d u ra n te una hora. Los ú ltim os dos po c illo s se de ja ro n en b lanco pa ra u sa rse com o co n tro l de a n ticu e rp o secunda rio . Las p lacas se vo lv ie ro n a la va r cua tro ve ce s con P B S -T en un la va d o r de p lacas. U na d iluc ión 1 :5000 /1 :10000 de a n ticu e rp o de ca b ra d ir ig id o co n tra IgG de ra tón - F c -p e ro x id a sa de rábano p ican te (H R P , Ja ckso n Im m u n o re se a rch ) o a n ticu e rp o se cu n d a rio de cab ra d ir ig id o co n tra IgG de ra tó n -ka p p a -co n ju g a d o con H R P (S o u the rn B io te ch ) se añ a d ió a las p lacas y se incubó a te m p e ra tu ra am b ie n te du ran te una hora. Las p lacas se vo lv ie ro n a la va r ocho v e c e s con P B S -T y se reve la ro n usa n do T M B /H 2O 2 co m o sus tra to . El su s tra to se incubó d u ra n te v e in te m in u to s y la reacc ión se d e tuvo con H 2S O 42 N (V W R ) o H 3P O 41 N (JT B ake r). Las p lacas se leye ron en un e sp e c tro fo tóm e tro (V ic to r, P erk in E lm e r) a 450 nM. Los títu lo s de a n ticu e rp o s se ca lcu la ro n usando el p ro g ra m a in fo rm á tico G rap h p a d P R IS M .

El títu lo de l sue ro se ca lcu ló com o d iluc ión de l su e ro den tro de l in te rva lo de titu la c ió n e xp e rim e n ta l en la seña l de un ión a a n tíge n o e q u iva le n te a dos ve ce s el v a lo r de l fondo . Los resu lta d o s de la resp u e s ta hum ora l inm une se m ue s tra n en la F IG . 19 (A n tíg e n o A ), La FIG . 20 (A n tíg e n o B), La F IG . 21 (A n tíg e n o C), y la F ig. 22 (A n tíg e n o D). La pu n tu a c ió n pos itiva pa ra los a n tíg e n o s de h ib rido m a s fa b rica d o s a p a rtir de dos bazos a is la d o s de ra tones de cada g rupo de in m u n iza c io n e s s e le cc io n a d a s se m ue s tra en la T ab la 11 (la pun tu a c ió n de l a n tíge n o es igua l a 2 X /fondo). T a l com o se m ue s tra en este E jem p lo , los títu lo s de a n ticu e rp o g e n e ra d o s p o r los ra tones de resca te A d a m 6 ^(H+/+^{A 6}resK+/+^{) fu e ro n co m p a ra b le s a los g e n e ra d o s po r ra tones que ca re c ía n de A D M A 6 a y A D A M 6 b y que te n ía n una ca d e na p esada h u m a n iza d a (H+/+}k^{+/+). A d em ás, Los bazos de ra to n e s H}+/+^{A 6}resK+/+ ^{p ro p o rc io n a ro n h ib ridom as}p o s itivo s pa ra el a n tíg e n o para to d o s los a n tíg e n o s e n sa yad o s , in c lu ye n d o los a n ticu e rp o s de a lta a fin idad , a n ive les co m p a ra b le s con los ra tones H+/+k+/+. De esta m anera , no se c ree que e x is ta un d e se q u ilib r io en la recom b inac ión V (D )J de los se g m e n to s gén ico s de la in m un o g lo b u lin a hu m a n a en los ra tones A d a m 6 de resca te dada la p ro d u cc ió n de a n ticu e rp o s con a fin idad e le va d a que co n tienen g e nes de in m u n o g lo b u lin a hum ana.

Tabla 11

Ejemplo 11

Determinación de la afinidad de unión al antígeno

Se s e le cc io n a ro n las a fin id a de s de un ión de los a n ticu e rp o s que m o s tra b a n una un ión e sp e c ífica al A n tíg e n o B usa n do un b io se n so r de re so n a n c ia de p lasm ón su p e rfic ia l en tie m p o rea l (B IA co re 2000). D uran te la se lecc ión re a lizad a con el eq u ip o B IA core se u tiliza ron m ed io s co n d ic io n ad o s p roce d e n te s de h ib rid o m a s a is la d o s de dos ^{cepas de ra to n e s in m un iza d o s con el A n tíg e n o B (H /+}K^{+/+ y H /+ A 6 res}K^{+/+). La su p e rfic ie de l se n s o r B IA co re se}d e riva tizó en p rim e r lu g a r con a n ticu e rp o p o lic lo n a l de cone jo d ir ig id o co n tra IgG de ra tón (G E ) para c a p tu ra r los a n ticu e rp o s d ir ig id os con tra el A n tíg e n o B p ro ce d e n te s de los m ed io s co n d ic io n ad o s . D u ran te la to ta lid a d del p ro ce so de se le cc ió n se u tilizó H B S T (H E P E S 0,01 M pH 7,4, N aC l 0 ,15 M, E D T A 3 m M , T e n s io a c tivo P 20 al 0 ,005 % ) com o ta m p ó n de aná lis is . El fra g m e n to Fab del A n tíg e n o B se inyec tó sob re la su p e rfic ie que había ca p tu ra d o el a n ticu e rp o d ir ig id o co n tra el A n tíg e n o B a una v e lo c id a d de flu jo de 50 p l/m inu to a una c o n ce n tra c ió n de 100 nM. La a so c ia c ió n a n ticu e rp o -a n tíg e n o se v ig iló du ran te tre s m in u to s m ie n tra s que la d iso c ia c ió n de l an tíge n o p ro ce d e n te de l a n ticu e rp o ca p tu ra d o se v ig iló d u ra n te c inco m in u to s en ta m p ó n de a n á lis is H B S T. El e xp e rim e n to se rea lizó a 25 °C. Las co n s tan te s c in é tica s de v e lo c id a d de a so c ia c ió n (ka) y d iso c ia c ió n (kd) se d e te rm in a ro n p ro ce sa n d o y a ju s ta nd o los da tos a un m od e lo de un ión 1:1 usa n do el p ro g ra m a in fo rm á tico de a jus te de cu rvas S c ru b b e r 2.0. Las co n s tan te s de l e q u ilib rio de d iso c ia c ió n de la un ión (K d) y se m iv id as de d iso c ia c ió n (T %) se ca lc u la ro n a p a rtir de las c o n s ta n te s c in é tic a s de la s ig u ie n te fo rm a : K d (M ) = kd / ka; y T % (m in ) = ( In2 /(60 *kd ). Los resu lta d o s de los a n ticu e rp o s d ir ig id os con tra el A n tíg e n o B s e le cc io n a d o s se m uestran en la T ab la 12.

Tabla 12

En un experimento similar, se determinó la cinética de diferentes anticuerpos monoclonales presentes en medio condicionado con hibridomas para su unión con el Antígeno A usando un ensayo con un biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (BIAcore 4000). Todos los clones de hibridoma producidos en este ensayo se produjeron en ratones H+/+A6res^K+/+.

En resumen, para capturar los anticuerpos específicos del Antígeno A, anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra IgG de ratón (n° de catálogo GE BR1008-38) se inmovilizó en primer lugar en el chip sensor. La selección mediante BIAcore se realizó en dos tampones diferentes - PBSP, pH 7,2 y PBSP, pH 6,0. Ambos tampones estuvieron suplementados con 0,1 mg/ml de BSA. Después de la captura de los anticuerpos dirigidos contra el Antígeno A de los medios condicionados, se inyectó 1 pM de monómero del Antígeno A (preparado en el correspondiente tampón de análisis) sobre la superficie con el anticuerpo capturado durante 1,5 minutes a 30 pl/minuto y la disociación del monómero de Antígeno A unido se vigiló durante 1,5 minutos en el correspondiente tampón de análisis a 25 °C. Se determinaron las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 utilizando el software de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Se calcularon las constantes de equilibrio de disociación de la unión (K^d) y las semividas disociativas (t1^ ) a partir de las constantes cinéticas de la siguiente forma: K^d(M) = kd / ka; y T%(min) = (In2/(60*kd). La Tabla 13 define los parámetros de la cinética de unión para anticuerpos dirigidos contra el Antígeno A seleccionados que se unen al monómero de Antígeno A a pH 7,2 y pH 6.0. ND: no se detectó unión en las condiciones experimentales actuales.

Tabla 13

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ra tón que e xp re sa a n ticu e rp o s , en el que cad a ca d e na pe sa da en los a n tic u e rp o s e xp re s a d o s c o m p re n d e una reg ión v a ria b le hu m a n a y una reg ión co n s tan te de ratón, en d onde el ra tón e xp re sa tam b ié n :

(i) una p ro te ín a A D A M 6 a de ra tón o un o rtó lo g o o u n h om ó lo g o de la m ism a que es fu n c io n a l en un ra tón m acho; y

(ii) una p ro te ín a A D A M 6 b de ra tón o un o rtó lo g o o un ho m ó lo g o de la m ism a que es fu n c io na l en un ratón m acho, en d o n de las p ro te ín a s A D A M 6 a y A D A M 6 b o los o rtó lo g o s o los h o m ó lo g o s de las m ism a s se e xp re sa n a p a rtir de una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico in te g ra d a que e s tá p re se n te d e n tro de l locus e n d ó g e n o de la c a d e n a p e sa da de la in m u n o g lo b u lin a de ra tón que com p re n d e al m e n o s un se g m e n to V h hum ano , al m en o s un se g m e n to D h hum ano y al m en o s un se g m e n to J ^hhum ano,

en d o n de el ra tón ca re ce de un gen A d a m 6 e n d óg e n o func iona l.

2. El ra tón de la re iv in d icac ió n 1, en el que los a n ticu e rp o s p ro d u c id o s po r el ra tón ca re ce n de una reg ión v a ria b le de la ca d e na pe sa da de la in m u n o g lo b u lin a de ratón.

3. El ra tón de la re iv in d icac ió n 1, en d o n de el ra tón tiene un g e n o m a que co m p re n d e una d e le c ió n de uno o m ás s e g m e n to s de la reg ión v a r ia b le de la in m u n o g lo b u lin a de ra tón y la inse rc ión de los s e g m e n to s de la reg ión v a ria b le de la in m un o g lo b u lin a hum ana, y en d onde el ra tón ca re ce de un locus de A D A M 6 e n d óg e n o de ra tón func iona l.

4. El ra tón de la re iv in d ica c ió n 3, en el que los se g m e n to s D ^hy J ^hde ra tón y al m en o s 3, al m en o s 10, al m en o s 20, al m en o s 40, a l m en o s 60, o al m enos 80 se g m e n to s de V ^hde l locus de la ca d e na pe sa da de la in m u n o g lo b u lin a de ra tón están su s titu id os p o r se g m e n to s de la reg ión v a ria b le de la in m u n o g lo b u lin a hum ana.

5. El ra tón de la re iv in d ica c ió n 3, en el qu e to d o s los se g m e n to s D ^h, J ^hy V ^hde ra tón de l locus de la ca d e na p esada de la in m un o g lo b u lin a de ra tón están su s titu id os po r se g m e n to s de la reg ión v a ria b le de la in m un o g lo b u lin a hum ana.

6. El ra tón de la re iv in d icac ió n 5, en el que d icha se cu e nc ia de á c ido nuc le ico in te g ra d a está p resen te :

(a ) in m e d ia ta m e n te a d ya cen te al e x tre m o 3' de los se g m e n to s V ^hhum anos;

(b ) en tre dos s e g m e n to s V h hum anos; o

(c) en tre dos se g m e n to s V ^hen a p ro x im a d a m e n te 20 kb has ta a p ro x im a d a m e n te 40 kb de l e x tre m o 3' de los s e g m e n to s V ^hh u m a n o s inse rtados.

7. El ra tón de la re iv in d icac ió n 5, en el que la sus tituc ión inc luye se g m e n to s V h hum a n o s V h1-2 y V h6-1 y d icha se cu e nc ia de á c ido nuc le ico in te g ra d a está p resen te co rrien te a b a jo del se g m e n to V ^h1-2 y co rrien te a rriba del s e g m e n to V ^h6-1.

8. U na cé lu la a is la d a o un te jid o a is la d o de un ratón de una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-7.