ES2769778T3

ES2769778T3 - Composiciones inmunomoduladoras

Info

Publication number: ES2769778T3
Application number: ES14830898T
Authority: ES
Inventors: Matthias Corbascio; Makiko Kumagai
Original assignee: Swedish Stromabio AB
Current assignee: Swedish Stromabio AB
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2020-06-29
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: US10751370B2; US20160361364A1; EP3091991A1; EP3091991B1; WO2015088414A1; PT3091991T

Abstract

Una composición que comprende i) una población de CMM (células madre mesenquimales), ii) el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig, y iii) al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti- OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones inmunomoduladoras

Campo técnico

La presente invención se refiere, entre otros, a composiciones y usos médicos de una combinación de células madre mesenquimales (CMM) y agentes para el bloqueo de la coestimulación del sistema inmunológico, los llamados inhibidores de la coestimulación. La invención también pertenece a composiciones que comprenden además un trasplante terapéutico en forma de una célula, un tejido terapéutico y/o un órgano terapéutico.

Antecedentes de la técnica

El uso exitoso de las células madre mesenquimales para tratar la enfermedad de injerto contra huésped grave resistente a los esteroides (EICH) fue un hito en la medicina regenerativa (Le Blanc et al., Lancet, 2004). Desde que se publicaron esos informes iniciales, se han iniciado múltiples ensayos clínicos para evaluar el tratamiento con CMM de la EICH, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la esclerosis múltiple (Le Blanc et al., Nature Reviews Immunology, 2012). Esta amplia aplicabilidad es una implicación de la capacidad de las CMM para modular casi todos los componentes celulares del sistema inmunológico innato y adaptativo. Esto incluye reducir la inflamación y la activación de neutrófilos, modular los macrófagos hacia un fenotipo antiinflamatorio, inhibir la activación y la citotoxicidad de las células NK, modular la activación de las células dendríticas, además de modular las respuestas de los linfocitos T CD4+ y CD8+ (Selmani et al., Stem Cells, 2008).

De manera simultánea, el bloqueo de la coestimulación se ha convertido en una estrategia prometedora para reemplazar la inmunidad por la tolerancia. En un artículo crucial de 1996, se demostró que al bloquear B7 y CD40L con CTLA4Ig y anti-CD40L en el período perioperatorio, se podría lograr una supervivencia indefinida de aloinjertos vascularizados (Larsen et al., Nature, 1996). La inhibición de señales coestimuladoras, mientras permite que las interacciones de TCR/MHC permanezcan intactas, hace que los linfocitos T sean anérgicos al antígeno del donante. En estudios posteriores, se demostró que la tolerancia hacia los trasplantes se debe en parte al desarrollo de linfocitos T reguladores de Foxp3+ de intrainjerto generados específicamente hacia el antígeno del donante con la capacidad de inhibir específicamente las respuestas inmunitarias antidonante. Sin embargo, estudios posteriores mostrarían que esto no era universal para todos los modelos de trasplante y la inmunidad heteróloga, la reactividad cruzada de los linfocitos T de memoria al antígeno del donante, probablemente será una barrera importante en un entorno clínico.

Los estudios en ratones indican que la tolerancia puede inducirse eficazmente usando uno o más inhibidores de la coestimulación, pero la traducción a primates no humanos y humanos no ha estado exenta de obstáculos, debido a las complejidades de, por ejemplo, el sistema inmunológico humano. Por ejemplo, ciertos subconjuntos de linfocitos T, tales como los linfocitos T de memoria, que tienen una dependencia reducida de las vías de coestimulación, son relativamente resistentes al tratamiento con el bloqueo de coestimulación, llevando a, por ejemplo, una mayor incidencia de rechazo de trasplantes (Kinnear et al., Transplantation, 2013)). Además, cabe destacar que el desarrollo de nuevos reactivos para modular la vía de coestimulación ha dado lugar a eventos adversos graves, por ejemplo, tormentas de citocinas, etc.

El bloqueo de la coestimulación y el tratamiento con CMM modulan muchos de los mismos componentes del sistema inmunitario y pueden inducir la conversión periférica de los linfocitos T en linfocitos T reguladores. Estas dos estrategias de tratamiento se están probando de forma independiente en el trasplante clínico de órganos con la esperanza de mejorar la función del injerto y la supervivencia del receptor, pero debido a que estas estrategias convergen en algunas de las mismas dianas, los dos enfoques tradicionalmente se han considerado mutuamente excluyentes. Esta similitud terapéutica se evidencia en un estudio realizado por Sullivan y colaboradores (Sullivan et al., Stem Cells Dev, 2013), en el que las CMM que se modificaron genéticamente para expresar CTLA4Ig no aumentaron los efectos inmunosupresores de las CMM no modificadas al tratar ratones con artritis inducida por colágeno.

El documento WO 2007/143139 desvela el uso de preparaciones de CMM dérmicas en el tratamiento de receptores de trasplantes de órganos para mejorar la supervivencia del aloinjerto o en el tratamiento de pacientes con enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple de la artritis reumatoide.

El documento US 2002/0044923 desvela un método para inhibir una respuesta de linfocitos T a un antígeno, que comprende administrar CMM humanas a un hospedador, en donde las c Mm expresan una molécula que bloquea la coestimulación de los linfocitos T de manera que se inhibe la respuesta de los linfocitos T a un antígeno.

Zhang et al. (Journal of Orthopaedic Research 2008, vol 26, n.° 3, pág. 314-321) desvela los efectos inmunomoduladores de las CMM mediante la coexpresión mediada por adenovirus de CTLA4Ig.

Sumario de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La invención se refiere a composiciones farmacéuticas seguras y eficaces que comprenden células madre mesenquimales (CMM) (también llamadas células mesenquimales (CM), células estromales mesenquimales (CEM), células estromales multipotentes (CEM), etc.)) y agentes exógenos libres (solubilizados) que inhiben las señales secundarias en la activación inmunológica, es decir, los llamados inhibidores de la coestimulación. La presente invención, por lo tanto, tiene como objetivo superar y aliviar algunos de los problemas técnicos y científicos de la técnica anterior, a saber, para mejorar la eficacia de los inhibidores de la coestimulación y las c Mm en el contexto de afecciones relacionadas con el trasplante y en el contexto del tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios y autoinmunes. Los inventores han descubierto por casualidad que se puede lograr una sinergia altamente inesperada entre las CMM y los inhibidores de la coestimulación cuando se combinan las CMM con CTLA4Ig y al menos un inhibidor de coestimulación exógeno sistémicamente adicional seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos. De manera importante, la presente invención hace uso de inhibidores de coestimulación que tienen una prolongada semivida in vivo, lo que significa que ejercen sus efectos en el paciente durante largos períodos de tiempo, mientras que los efectos de las CMM son relativamente transitorios en la naturaleza, dando como resultado una estrategia de tratamiento combinatorio altamente eficaz. Las composiciones de la presente invención pueden estar compuestas por un conjunto de (es decir, una pluralidad de) composiciones, en donde la población de CMM puede ser una primera composición (por ejemplo, en un recipiente separado) y el al menos un agente que inhibe las señales coestimuladoras (es decir, el inhibidor de coestimulación) puede ser una composición posterior (o varias composiciones posteriores) (por ejemplo, un primer inhibidor de coestimulación está presente en una segunda composición y un segundo inhibidor de coestimulación está presente en una tercera composición).

Los inhibidores de la coestimulación pueden inhibir la señalización entre los linfocitos T y las células presentadoras de antígeno (CPA), así como señales entre los linfocitos T y sus dianas. Los agentes inhibidores en cuestión normalmente pueden estar destinados a inhibir las llamadas vías coestimuladoras y, por lo tanto, dichas moléculas pueden denominarse agentes inhibidores de señales coestimuladoras o inhibidores de coestimulación. Estos inhibidores de la coestimulación pueden comprender al menos un agente seleccionado del grupo que comprende al menos una proteína de fusión, al menos un anticuerpo monoclonal, al menos una molécula pequeña, y cualquier combinación de las mismas y, a diferencia, por ejemplo, del trabajo de Sullivan y colaboradores, los inhibidores de la coestimulación de la presente invención son exógenos (es decir, no provienen del propio cuerpo o de las CMM como tal) y están presentes en una composición (que puede ser una solución) como agentes biofarmacéuticos libres (y no expresados por CMM o cualquier otro tipo de vector de administración). Usando el enfoque de Sullivan et al., el comportamiento in vivo, la distribución en el paciente, los efectos locales transitorios de CTLA4Ig y el potencial de modificaciones postraduccionales del CTLA4Ig endógeno (uno de los primeros inhibidores de la coestimulación) son todos factores que pueden dar como resultado propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas subóptimas. En completo contraste, la presente invención enseña una combinación de CMM evaluadas terapéuticamente, inalteradas y no modificadas con inhibidores de coestimulación exógenos administrados por vía sistémica que preferentemente pueden tener una prolongada semivida in vivo (preferentemente una semivida de al menos 2 días) para garantizar que se vean los efectos sinérgicos entre las CMM y los inhibidores de la coestimulación, a diferencia del trabajo de Sullivan et al.

En un aspecto, por lo tanto, la presente invención pertenece a una composición y/o a una composición farmacéutica que comprende i) una población de células mesenquimales (CM), ii) el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig, y iii) al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional seleccionado de el grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos. La célula mesenquimal (CM) también puede denominarse, por ejemplo, una célula madre mesenquimal y/o una célula del estromal mesenquimática (CEM) y puede obtenerse de la médula ósea, sangre de cordón umbilical, tejido amniótico, gelatina de Wharton, tejido adiposo, piel, músculo adulto (por ejemplo, músculo cardíaco) y otros tejidos adecuados.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a las composiciones para su uso como medicamentos, y más específicamente en diversas enfermedades y trastornos inmunomediados, en trasplante e implantación, y en prácticamente cualquier enfermedad o trastorno con autoinmunidad y/o afectación inflamatoria.

Además, la presente invención también pertenece a una combinación de i) una población de CMM, ii) el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig, y iii) al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos, para su uso como un medicamento.

La presente invención también se refiere a una combinación de i) una población de CMM, ii) el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig, y iii) al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos, para su uso en la supresión y/o modulación del sistema inmunitario.

La presente invención, por lo tanto, ofrece un enfoque de tratamiento más eficaz, predecible y práctico para las enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunes, inflamatorias y asociados al trasplante, utilizando una combinación de CMM inmunomoduladoras e inhibidores de coestimulación exógenos inductores de tolerancia (que pueden estar presentes en forma de composiciones farmacéuticas solubilizadas para la administración sistémica a un paciente).

Tal como se mencionó anteriormente, la presente invención pertenece a la combinación de una población de CMM y los inhibidores de coestimulación con un trasplante o un injerto, normalmente en la forma de trasplante/implante de células terapéuticas, tejidos y/u órganos terapéuticos. Por lo tanto, la composición de la presente invención puede comprender, además de la CMM y del inhibidor de la coestimulación, una célula, tejido y/u órgano de origen alogénico y/o autólogo que trataría una indicación particular si se administra con éxito al paciente. De hecho, la célula terapéutica también puede ser una CMM. Para un paciente con diabetes de tipo 1, la modalidad de tratamiento puede comprender ventajosamente al menos una CMM, al menos un agente que inhibe las señales coestimuladoras y al menos una célula capaz de producir insulina (es decir, una llamada célula beta), con el fin de modular el sistema inmunitario del paciente para inhibir el rechazo celular y, por lo tanto, normalizar los niveles de glucosa en sangre. De manera similar, los hepatocitos podrían incluirse en una composición para tratar la insuficiencia hepática, y las células renales podrían incluirse en una composición que trata diversos trastornos renales.

Por lo tanto, la presente invención representa modalidades de tratamiento completamente nuevas para trastornos y enfermedades inmunomediados, donde una composición que comprende CMM y agentes inhibidores de la coestimulación modula y/o suprime el sistema inmunitario, que en sí mismo puede ser un tratamiento altamente eficaz para diversos trastornos y enfermedades inflamatorias y/o autoinmunes, pero también permite la implantación y/o el trasplante de células, tejidos y/u órganos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Supervivencia y función del aloinjerto de islotes. (A) Los ratones C57BL/6 diabéticos de ocho a 12 semanas de vida recibieron 250 islotes de donantes Balb/c completamente incompatibles con el MHC mediante inyección en la vena porta. Los receptores fueron asignados al azar al cotrasplante con 2,5 x 105 CMM que se originan en la médula ósea del receptor y al tratamiento con CTLA4Ig solamente o CTLA4Ig y anti-CD40L (o CTLA4Ig y anti-LFA1 o anti-CD40L y anti-LFA1 (datos no mostrados)) o anticuerpos de control de isotipo. Se hizo un seguimiento de la supervivencia del injerto mediante el estudio de glucosa en sangre en ayunas. La glucosa en sangre superior a 20 mM en más de dos días consecutivos se consideró rechazo (B) % de supervivencia del injerto. CMM CTLA4Ig anti-CD40L frente a CTLA4Ig anti-CD40L, ** P <0,01: CMM CTLA4Ig anti-CD40L frente a CTLA4Ig. (C) TTGIP de diferentes grupos receptores a los 30 días después del trasplante. Los receptores tratados con CMM CTLA4IG anti-CD40L, CMM CTLA4IG anti-LFA1 o CMM anti-CD40L anti-LFA1 tenían glucosa en sangre similar a los 90 minutos que los ratones sin tratamiento previo no trasplantados.

Figura 2. Evaluación histológica de los injertos de islotes en el hígado en el día postoperatorio 100. La tinción inmunofluorescente para insulina (rojo), Foxp3, CD4 y CD8 (verde) se realizó en hígados de receptores tratados con (A) CTLA4Ig MR1 (anti-CD40L), (B) CMM CTLA4Ig y (C, D) CMM CTLA4Ig MR1. Las células con Foxp3 teñido se indicaron mediante flechas.

Figura 3. Presencia de anticuerpos específicos del donante y supresión de la respuesta alorreactiva de linfocitos T. Los anticuerpos específicos del donante (AED) en suero de ratón se examinaron por citometría de flujo. Se comparó la IFM de cada grupo (A). * p<0,5. El grupo de control mostró una MCF media significativamente más alta en comparación con el grupo tratado con coestimulación con/sin coinyección con CMM.

Figura 4. Respuestas de linfocitos T del receptor al antígeno del donante y cuantificación de linfocitos T CD4 CD25 Foxp3 en el bazo. (A) Los esplenocitos (1 x 105) o (B) linfocitos intrahepáticos (1 x 104) de los receptores C57BL/6 se cultivaron conjuntamente con esplenocitos de Balb/c (4 x 105) en placas de 96 pocillos montadas con anticuerpos de captura durante 20 horas y se midieron las unidades formadoras de puntos y la actividad de IFNg. Los resultados se muestran como la media ± DT. *P <0,05 y ** P <0,01. (C) Se recolectaron esplenocitos de receptores C57BL/6 en el DPO 100 y se realizó un análisis FACs para la detección de linfocitos T CD4+CD25+Foxp3+. El porcentaje de linfocitos T CD4+Foxp3+ o CD25+Foxp3+ se muestra como media ± DT. Figura 5. Análisis por PCR en tiempo real de cuatro genes de hígados con trasplante de islotes. El ARN total se aisló de los hígados en todos los receptores con islotes trasplantados en el momento del sacrificio. La expresión de cada tránscrito de genes se normalizó al nivel de expresión del gen constitutivo, GAPDH y se da un valor relativo. Los resultados se muestran como la media ± DT. *P <0,05 y ** P <0,01.

Figura 6. Supresión in vitro de la maduración de las CD y la proliferación de linfocitos T alorreactivos o de la inducción de linfocitos T Foxp3 por CMM. (A) Después de una estimulación de 24 horas con LPS, Las CD de la MO con o sin CMM se aislaron usando microperlas de anti-CD11c+ y sus marcadores de superficie se analizaron mediante FACS. Los resultados son representativos de cuatro experimentos independientes. CD-(B) CMM, CD-(A) CMM: dosis baja (1x104) y alta (1x105) de CD tratadas con CMM, respectivamente. *P <0,05 (B) los linfocitos T CD4+ (1x105) de C57BL/6 se cocultivaron con CD singénicas (2x104) y linfocitos T alogénicos (2x105) de Balb/c pan en presencia o ausencia de mAb durante 4 días. Los resultados se expresan como recuentos medios por minuto (cpm) de aumento relativo de los cuales se resta la respuesta singénica y se muestran como la media ± DT de seis experimentos independientes. * P <0,05 (C) linfocitos T CD4+ de C57BL/6 (2 x106) se cocultivaron con CD singénicas (4x105) y linfocitos T pan de Balb/c (4x106) en placas de 12 pocillos durante 4 días. Las células no adherentes se recolectaron después del aislamiento con CD4 y se tiñeron con CD4, CD25 y Foxp3 para análisis por FACS. Los resultados son uno de los representantes de tres experimentos independientes. (D) Se recolectaron los sobrenadantes después de 4 días del cultivo descrito en (C) y se analizaron las concentraciones de quinurenina mediante ELISA. Los resultados se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. * P < 0,05.

Figura 7. Caracterización de CMM y actividad supresora sobre la proliferación de linfocitos T por CMM. (A) Las CMM obtenidas de las células de la médula ósea se diferenciaron en adipocitos y osteocitos. Aumento original x200. Barra de escala: 20 mm. (B) Las MSC se marcaron con anticuerpos contra CD44, CD90.2, SCA-1, CD11c, CD31, CD34, CD45 y MHC de clase II. Las líneas grises indican el control del isotipo. (C) Los esplenocitos de C57BL/6 (2x105) se cocultivaron con esplenocitos irradiados de Balb/c (4x105) en ausencia o presencia de números calificados de CMM durante 4 días. La proliferación celular se midió por absorción de 3H-timidina durante las últimas 18 horas. Los resultados se muestran como cpms medios ± DT de cuadruplicados y son representativos de tres experimentos.

Figura 8. Los ratones Balb/c reciben sensibilización y luego infusión rectal de TNBS. Los ratones se asignan al azar al tratamiento con triple bloqueo de coestimulación (anti-LFA-1, CTLA4Ig y anti-CD40L), anticuerpos de control de isotipo solamente o con CMM y bloqueo de coestimulación (CMM CTLA4Ig anti-LFA-1 anti-CD40L, CMM CTLA4Ig) durante la primera semana después de la sensibilización. Se sigue a los ratones durante diez semanas y se pesan diariamente. Luego se sacrifican los ratones y se analizan los intestinos para determinar el grado de inflamación. La Figura 8 muestra una tabla de desarrollo de peso después de la infusión rectal.

Figura 9. Los ratones C57BL/6 se trasplantaron con corazones de Balb/c no compatibles con MHC y se trataron con IgG humana de control, CTLA4Ig, CMM, o una combinación de CMM y varios inhibidores de la coestimulación. El tratamiento con solo CMM no tuvo efecto en la prevención del rechazo de aloinjerto cardíaco. El tratamiento con CTLA4Ig indujo una prolongación significativa de la supervivencia del aloinjerto con un tiempo medio de supervivencia de 25 días. El tratamiento con terapia de CMM combinada con (i) CTLA4Ig, (ii) CTLA4Ig y anti-CD40L indujo una fuerte supervivencia del aloinjerto en cuatro de cinco receptores. Estos resultados implican que existe un efecto potenciador de combinar las CMM con al menos un inhibidor de polipéptido de señalización coestimuladora.

Figura 10. Se inmunizaron ratones C57BL/10Q mediante inyección subcutánea (s.c.) en la base de la cola con 100 microgramos de colágeno tipo II (CII) de rata emulsionados en un volumen igual de adyuvante de Freund a una concentración final de 2 mg/ml. Después de 21 días, los ratones recibieron una inyección de refuerzo cerca de la primera inyección con 50 microgramos de CII de rata. La gravedad de la enfermedad fue seguida por una puntuación clínica cada cinco días a partir del quinto día después de la inmunización. Los receptores fueron aleatorizados para recibir control de IgG humana o CTLA4ig (500 microgramos) el día 0, 2, 4, 6 después de la inmunización y/o CMM derivada de 2x106 de médula ósea de ratones C57BL/10Q el día de la inmunización. El tratamiento con CMM en combinación con un inhibidor de la coestimulación (CTLA4Ig) tuvo un efecto aceptable en la reducción de la puntuación media de artritis durante un seguimiento de 60 días. El tratamiento con ^cM^men combinación con CTLA4Ig y anti-CD40L conduce a una reducción significativa en la puntuación media de artritis en todos los puntos temporales observados a los 30 días y posteriormente.

Figura 11. Efecto de la terapia con células positivas para Isl 1 en combinación con el triple bloqueo de coestimulación triple (es decir, CTLA4Ig anti-CD40L anti-LFA1) sobre la función y dimensión del ventrículo izquierdo después del infarto de miocardio. Las ratas (N = 8) tratadas con una combinación de células mesenquimales Isl1+ (es decir, células mesenquimales positivas para Isl1) y bloqueo de coestimulación (cuadrados grises) se compararon con un grupo de control con placebo (N = 8) (círculos negros). Antes y después de la operación no hubo diferencias significativas en el diámetro diastólico del extremo ventricular izquierdo (DDEVI) o la fracción de eyección (FE) entre los dos grupos. Después de 1 y 6 semanas, el DDEVI se redujo significativamente en el grupo tratado con una combinación de células mesenquimales positivas para Isl y bloqueo de coestimulación, mientras que al mismo tiempo la FE había mejorado hacia el nivel preoperatorio. La eficacia terapéutica también se observó con una combinación de la población de CMM y CTLA4Ig y anti-CD40L. Datos presentados como media ± DT. En figura: *p <0,05.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a composiciones altamente eficaces y prácticamente utilizables que comprenden una población de células mesenquimales (CM), el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig y al menos un agente exógeno adicional que inhibe al menos una señal de coestimulación (es decir, un denominado inhibidor de coestimulación) seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos. El uso combinatorio de CMM (en forma de poblaciones de c Mm ), CTLA4Ig y al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional (que en realizaciones ventajosas tiene una semivida prolongada) da como resultado un efecto sinérgico muy sorprendente que mejora los resultados del tratamiento en numerosas enfermedades y afecciones autoinmunes, inflamatorias y asociadas al trasplante.

Para una mayor claridad, los términos "célula mesenquimal" ("CM"), "célula madre mesenquimal" ("CMM"), "célula estromal multipotente" ("CEM"), "célula estromal mesenquimática" ("CEM") y "célula estromal mesenquimática multipotente" se pueden usar indistintamente y se entenderá que se relacionan con células con al menos el fenotipo mínimo de CD105+, CD73+, CD90+ y C^d45-, CD14-, CD34-, HLA-DR-. Las CMM pueden ser alogénicas o autólogas y pueden aislarse de diferentes tejidos, incluidos, entre otros, la médula ósea (MO), sangre, dermis, periostio, placenta, gelatina de Wharton, tejido fetal o embrionario, sangre de cordón umbilical, tejido adiposo, hígado, músculo, corazón, riñón, páncreas, brote de diente, tejido amniótico, y pueden diferenciarse en al menos osteoblastos, condroblastos o adipocitos in vitro e in vivo. Las CMM pueden ser de origen alogénico (emparejado o no con el paciente) o de origen autólogo (es decir, del paciente a tratar), o la población de CMM puede ser una combinación que comprende tanto células alogénicas como autólogas. Generalmente, las CMM pueden formar fibroblastos unitarios formadores de colonias y proliferar ampliamente in vitro. En algunas realizaciones, las CMM de la presente invención pueden presentar una morfología en forma de huso y expresar CD73, CD90 y CD105, y ser negativas para (es decir, desprovistas de) CD34, CD45, CD14 e CD31. Las CMM de acuerdo con la presente invención pueden, naturalmente, también haber sufrido derivación y/o diferenciación, por ejemplo, derivación a células Isl1+ y/o diferenciación adicional a células de cierto tipo, por ejemplo, células cardíacas, células renales o neuronas. A modo de ejemplo, las CMM de la presente invención se pueden obtener a partir de diversos tipos de tejido (por ejemplo, médula ósea, tejido adiposo, brote de diente, tejido amniótico, sangre de cordón umbilical, gelatina de Wharton, etc.), pueden derivar en células mesenquimales Isl1+, y se pueden diferenciar en diferentes tipos de células (por ejemplo, células cardíacas (como cardiomiocitos)), y luego se pueden administrar a un paciente junto con al menos un agente que inhibe las señales coestimuladoras. Adicionalmente, las CMM de la presente invención pueden provenir de fuentes alogénicas, por ejemplo, de un donante sano (y este donante también puede ser el donante de una célula, tejido y/u órgano trasplantado). Dicho donante puede tener preferentemente menos de 50 años, más preferentemente menos de 40 años, incluso más preferentemente por debajo de los 40 años, aún más preferentemente por debajo de los 30 años, y nuevamente incluso más preferentemente por debajo de los 20 años. Naturalmente, las CMM y/o el trasplante de células, tejidos y/u órganos también puede ser de origen autólogo.

Para una mayor claridad, se entenderá que la expresión "al menos uno" en el contexto de, por ejemplo, CMM o más generalmente en el contexto de células, se refiere a poblaciones de células, Por ejemplo, una población de entre una célula y varios millones o incluso varios miles de millones de células. En el contexto de agentes que inhiben las señales coestimuladoras, se entenderá que la expresión "al menos uno" se refiere, por ejemplo, a uno (1), dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6), siete (7), ocho (8), nueve (9), diez (10), quince (15) o cualquier otro número adecuado de agentes que inhiban la coestimulación. Un número particularmente ventajoso de agentes que inhiben las señales coestimuladoras puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o cualquier otro número de un dígito de agentes (por ejemplo, una combinación de CTLA4Ig y anti-CD40, es decir, 2 agentes inhibidores).

Generalmente, todos los polipéptidos (principalmente los inhibidores de la coestimulación) y/o polinucleótidos desvelados en la presente solicitud abarcan naturalmente secuencias de polipéptidos y/o de nucleótidos que tienen al menos un parecido razonable con el polipéptido y/o con el polinucleótido en cuestión, por ejemplo, una identidad de secuencia del 50 % con el polipéptido y/o con el polinucleótido en cuestión, preferentemente, el 70 % de identidad de secuencia con el polipéptido y/o con el polinucleótido en cuestión, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 80 %, e incluso más preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 90 % con el polipéptido y/o polinucleótido en cuestión.

Las expresiones "positivo para" y "negativo para" en el contexto de la presente invención (por ejemplo, una CMM y/o normalmente una población de CMM que es "positiva para" un polipéptido y/o un polinucleótido en cuestión) se entenderán de acuerdo con el significado normalmente dado al término dentro de las ciencias biológicas y médicas, en esencia, una célula que es positiva para un cierto polipéptido y/o polinucleótido expresa dicho polipéptido y/o polinucleótido. El polipéptido y/o el polinucleótido en cuestión puede identificarse por diversos medios, por ejemplo, utilizando técnicas de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y/o técnicas inmunohistoquímicas y/o técnicas proteómicas tales como LC-MS y/o 2D- PAGE. La expresión "positivo para" puede entenderse en ciertos casos que comprende poblaciones celulares en las que al menos el 50 % de las células expresan el polipéptido (o polinucleótido o cualquier otro marcador) en cuestión, pero preferentemente al menos el 70 % o incluso más preferentemente al menos el 90 % de la población expresa el polipéptido en cuestión. La expresión "negativo para" puede, del mismo modo, entenderse naturalmente que es lo opuesto al término "positivo para", es decir, al menos el 50 %, pero preferentemente al menos el 70 % o incluso más preferentemente al menos el 90 %, de las células de la población no expresarán el polipéptido (u otro marcador adecuado) en cuestión.

Los términos "exógeno" o "derivado exógeno" se entenderán, en el contexto de los inhibidores de la coestimulación, como agentes que vienen/ que derivan del exterior del cuerpo o de fuera de una CMM, es decir, a diferencia de un agente endógeno que se originó dentro del cuerpo (a modo de ejemplo, un polipéptido CTLA4Ig endógeno que se expresa mediante una CMM modificada genéticamente). Los polipéptidos inhibidores de coestimulación exógenos mencionados en el presente documento se obtienen convencionalmente mediante tecnología recombinante y se pueden producir en un microorganismo de producción adecuado, por ejemplo, células bacterianas o de levadura. Se entenderá que los términos "sistémico" o "sistémicamente presente" pertenecen a un agente (o agentes) (normalmente los inhibidores de la coestimulación) que está presente sistémicamente, por ejemplo, esencialmente en todo el cuerpo de un sujeto, normalmente a través de la circulación sistémica que es impulsada con el ventrículo izquierdo del corazón. Para una mayor claridad, esto significa que los inhibidores de la coestimulación se distribuyen por todo el cuerpo después de la administración al paciente, para que puedan ejercer efectos inmunomoduladores y/o inmunosupresores sistémicos.

El término "población", que pueden relacionarse con las CMM o con vesículas extracelulares como exosomas (normalmente derivadas de las CMM en cuestión), se entenderá que abarca una pluralidad de entidades que constituyen una población dada, por ejemplo, las CMM individuales que cuando están presentes en una pluralidad constituyen una población de CMM. Por lo tanto, naturalmente, la presente invención se refiere también a las células y vesículas individuales de, por ejemplo, una población de CMM o una población de vesículas extracelulares, respectivamente.

Los términos "sujeto" y/o "individuo" y/o "paciente" pueden usarse indistintamente en el presente documento y deben entenderse que se refieren ampliamente a un animal, por ejemplo un ser humano, del que se pueden obtener células y/o para el que se proporciona un tratamiento, incluyendo profilaxis o tratamiento preventivo (por ejemplo, usando las células según la presente invención). Ventajosamente, el sujeto de los tratamientos como se describe en el contexto de la presente invención es un mamífero, preferentemente un ser humano u otros mamíferos, preferentemente mamíferos domesticados o de producción.

Debe entenderse que la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que da como resultado una mejora, el alivio o la remediación de la enfermedad, el trastorno, o los síntomas de la enfermedad o afección.

Los términos "administración", "introducción" y "trasplante" se usan indistintamente para los fines de la presente invención, por ejemplo en el contexto de la administración de las CMM a un paciente que padece cualquiera de las enfermedades y/o trastornos mencionados en el contexto de la presente invención. Un método o vía adecuada es una que conduce a una localización al menos parcial de las CMM en un sitio deseado. Las CMM y/o los inhibidores de la coestimulación se pueden administrar (suministrar) por cualquier vía apropiada que dé como resultado la administración de las células y/o los factores paracrinos excretados de las células (por ejemplo, exosomas) a una localización/tejido/sitio deseado en el sujeto. Los modos de administración adecuados para los fines de la presente invención comprenden por ejemplo (sin limitación) la administración intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e inyección e infusión intraesternal. Los modos de administración más ventajosos para la mayoría de los pacientes que tienen las enfermedades y trastornos descritos en el presente documento son probablemente la inyección intravenosa, la inyección intravenosa periférica, la inyección venosa central en la aurícula derecha, inyección en el ventrículo derecho del corazón, y/o inyección en el tronco/arteria pulmonar.

Debe entenderse que la frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" tal como se usa en el presente documento se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo una carga sólida o líquida, un diluyente, un excipiente, un vehículo, un disolvente o un material encapsulante, implicado en la suspensión, el mantenimiento de la actividad o el transporte los agentes sujetos desde un órgano o porción del cuerpo, a otro órgano o parte del cuerpo.

Cuando las características, las realizaciones, los aspectos o las alternativas de la presente invención se describen en términos de grupos Markush, el experto en la materia reconocerá que la invención también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush. El experto en la materia reconocerá que la invención también se describe de esta manera en términos de cualquier combinación de miembros o subgrupos de miembros del grupo Markush. Esto también se refiere a cualquier otro grupo o lista de miembros mencionado en el presente documento. Además, cabe señalar que cualquier realización, característica, aspecto o alternativa descrita en relación con una determinada realización, característica, aspecto o alternativa de la presente invención también puede ser aplicable, haciendo los cambios necesarios, a todas las otras realizaciones, características, aspectos y alternativas de la invención. Por ejemplo, el al menos un inhibidor de coestimulación exógeno descrito en relación con las composiciones y/o las composiciones farmacéuticas que se usarán en el tratamiento médico de un paciente se entenderá que son relevantes también para el uso in vitro de dicho al menos un agente. Como otro ejemplo, las etapas, características, alternativas o aspectos de los métodos descritos en el presente documento para cultivar CMM pueden ser naturalmente aplicables, de forma aislada o en conjunto en cualquier combinación, a todos los aspectos, las realizaciones, características y alternativas relacionadas, por ejemplo, con las CMM comprendidas en las composiciones farmacéuticas, lo que significa que las CMM de las composiciones (farmacéuticas) de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse mediante cultivo usando los métodos de cultivo descritos en el presente documento o usando cualquier aspecto adecuado, realizaciones, características y alternativas descritas en relación con esos métodos, de forma aislada o en cualquier combinación de tales aspectos, realizaciones, características y/o alternativas. Como ejemplo adicional, las alternativas o realizaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, en relación con los inhibidores de coestimulación exógenos en las composiciones (farmacéuticas) también son naturalmente aplicables, de forma aislada o en conjunto en cualquier combinación, a todos los aspectos, realizaciones, características y alternativas relacionadas, por ejemplo, con métodos de tratamiento y/o usos médicos de las CMM en combinación con los inhibidores de la coestimulación. Por ejemplo, aunque las CMM y los inhibidores de la coestimulación pueden describirse en relación con composiciones (farmacéuticas) de acuerdo con la presente invención, también pueden utilizarse juntos como un método de tratamiento combinado y/o en un uso médico sin estar necesariamente presentes en una o más composiciones farmacéuticas. Por lo tanto, en resumen, todos los aspectos, realizaciones, características y alternativas de la presente invención pueden ser aplicables, implementadas, relevantes y transferibles a todos los demás aspectos, realizaciones, características y alternativas del presente documento sin apartarse del alcance de la presente invención.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende i) al menos una célula madre mesenquimal (CMM), ii) el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig, y iii) al menos un agente adicional que inhibe al menos una señal coestimuladora (denominada indistintamente en el presente documento como un inhibidor de coestimulación) seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos. Las señales coestimuladoras a veces también se denominan "señales de adhesión" y las señales que están siendo inhibidas por el(los) agente(s) de la presente invención también incluyen señales de adhesión relevantes. La unión de LFA-1 a ICAM 1, 2, 3 es la molécula de adhesión crucial central para la unión de leucocitos a un endotelio inflamado. Sin embargo, LFA-1 es también una de las moléculas coestimuladoras más importantes en la activación de los linfocitos T CD4+ y CD8+ y, por lo tanto, el eje LFA-1/ICAM puede considerarse tanto una molécula de adhesión como una molécula coestimuladora. Otro eje de señalización importante es la unión de LFA-3 a CD2. Esta vía es a la vez adhesiva y estabilizadora del receptor de linfocitos T que se une a las células presentadoras de antígeno, además de proporcionar una señalización importante para activar los linfocitos T. Generalmente, se requiere coestimulación para el montaje de una respuesta inmunológica eficaz y tanto los linfocitos B como los linfocitos T pueden estar expuestos a señales coestimuladoras. A modo de ejemplo, los linfocitos T normalmente requieren dos señales para activarse completamente: la primera señal es específica de antígeno y se proporciona a través de la interacción entre el receptor de linfocitos T y el receptor del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) presente en la membrana de una célula presentadora de antígeno (CPA) (por ejemplo, una célula dendrítica (CD)). La segunda señal es coestimuladora (y no específica de antígeno) y es proporcionada por la interacción entre una señal coestimuladora (que puede ser expresada por la CPA) y un receptor presente en el linfocito T. Al inhibir las señales coestimuladoras, como se propone en la presente invención, los linfocitos no se activan por completo, dando como resultado un efecto inmunomodulador.

La presente invención se refiere a una combinación de i) células mesenquimales (CMM), ii) el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig, y iii) al menos un agente adicional que inhibe la señal o las señales coestimuladoras seleccionadas del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos. Esta combinación puede tomar ventajosamente la forma de una composición o de varias composiciones separadas pero también se desvelan otras formas físicas en el presente documento, por ejemplo, un cultivo celular o un kit que comprende CMM (y opcionalmente otros tipos terapéuticos de células o tejidos, por ejemplo, células de islote u órganos, por ejemplo, un riñón) combinadas con CTLA4Ig y el al menos un agente exógeno adicional que inhibe las señales coestimuladoras. Esta combinación de CMM, CTLA4Ig y al menos un agente adicional que inhibe la señal o señales coestimuladoras seleccionadas del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos, puede usarse en la profilaxis y/o el tratamiento del trasplante/implante de células, tejidos u órganos, o esencialmente cualquier enfermedad inflamatoria y/o autoinmune.

Sin desear quedar ligado a ninguna teoría en particular, se supone que el uso de CTLA4Ig y el al menos un inhibidor de coestimulación adicional en combinación con la administración de CMM también pueden mejorar la eficacia de las CMM per se. Se puede suponer que la inhibición de la coestimulación puede contribuir a una mayor supervivencia de las CMM in vivo, dando a las CMM un período de tiempo más largo para proporcionar efectos terapéuticos al sujeto. Tal como se desvela en el presente documento, el uso de CTLA4Ig y el al menos un inhibidor de la coestimulación aumenta la eficacia terapéutica de las CMM, tanto in vitro como in vivo. Además, los inventores se han dado cuenta inesperadamente de que cuando se combinan las CMM con CTLA4Ig y al menos un agente adicional que inhibe la coestimulación, se logra un claro efecto inmunomodulador sinérgico, en completo contraste con la disminución del efecto inmunomodulador que se observa al combinar las CMM con inmunosupresores convencionales tales como la ciclosporina A y/o la dexametasona. Este hallazgo fue de naturaleza muy fortuita y da como resultado un tratamiento combinatorio extremadamente potente.

En una realización, la al menos una CMM se puede obtener de prácticamente cualquier fuente adecuada de células/tejidos, por ejemplo de médula ósea, sangre de cordón umbilical, líquido de amniótico, gelatina de Wharton, tejido adiposo, células iPS, piel, tejido embrionario o fetal humano, cordón umbilical, etc., pero también directamente de órganos adultos como el riñón, hígado, corazón, páncreas, etc. A modo de ejemplo, obtener CMM directamente de, por ejemplo, un riñón podría facilitar la implantación / el trasplante de un riñón junto con la aplicación de la composición farmacéutica que comprende la al menos una CMM y el al menos un agente que inhibe las señales coestimuladoras. De manera importante, las CMM son esencialmente insensibles a la coestimulación, ya que normalmente carecen de los polipéptidos necesarios que intervienen en las vías de coestimulación, lo que significa que las CMM y los inhibidores de la coestimulación pueden coexistir en prácticamente cualquier sistema. Por ejemplo, una sola composición farmacéutica puede comprender tanto una población de CMM como varios inhibidores de coestimulación sin ninguna reactividad entre los componentes celulares y de polipéptidos de la composición.

En una realización adicional, la al menos una CMM puede ser de origen alogénico y/o autólogo, dependiendo de factores tales como la disponibilidad, el estado inmunológico del paciente, etc. Para conservar la potencia inmunomoduladora de las CMM, es preferible pasar las células la menor cantidad de veces posible, por ejemplo menos de 20 veces, preferentemente menos de 10 veces, y más preferentemente menos de 5 veces. En una realización adicional, las CMM se pueden cultivar en un medio de cultivo que comprende trombocitos humanos (plaquetas) lisados, preferentemente al menos 107 (o incluso números más altos, tales como 108 o 109) trombocitos humanos lisados por ml de medio de cultivo. En una realización adicional, cuando las células se van a utilizar para el tratamiento médico de un paciente que padece cualquiera de las enfermedades y trastornos que pueden prevenirse, tratarse, curarse o aliviarse por CMM, se pueden recolectar las células (y posteriormente se pueden utilizar para el tratamiento terapéutico) cuando la población de CMM ha alcanzado como máximo 5000x106, preferentemente como máximo 2500x106 células, más preferentemente como máximo 1000x106, incluso más preferentemente como máximo 750x106 células, pero aún más preferentemente como máximo 500x106 células, a partir de, como máximo 200 ml (cm3), más preferentemente, como máximo 100 ml, incluso más preferentemente como máximo 60 ml, de muestra que contiene células (como un aspirado), por ejemplo, obtenidas de la médula ósea. Por lo tanto, a modo de ejemplo, todo el procedimiento desde la obtención de las células hasta la preparación de una composición farmacéutica puede implicar la obtención de no más de 200 ml (preferentemente no más de 40 ml y aún más preferentemente no más de 30 ml) de muestra que contiene células de un donante sano (a modo de ejemplo, de cresta ilíaca y/o de esternón), cultivar las CMM obtenidas de la muestra que contiene células a no más de 750 * 106 células, y, finalmente, recolectar las células para preparar una composición farmacéutica para que sea administrada a un paciente. Las CMM obtenidas por los métodos de la presente invención muestran un nivel altamente sorprendente de potencia terapéutica y, por lo tanto, se puede administrar un número significativamente menor de células a un paciente sin reducir la eficacia terapéutica, simplificando y acelerando de este modo todo el procedimiento. Un aspecto clave detrás de la potencia terapéutica mejorada reside en el menor número de divisiones celulares que han sufrido las CMM de acuerdo con la presente invención, lo que significa que se conservan sus características inmunomoduladoras beneficiosas. Cuando se obtienen CMM del donante y/o del paciente, pueden congelarse inmediatamente, seguido de la descongelación y el inicio del cultivo celular ante la necesidad de intervención terapéutica (como alternativa, las células se pueden obtener (y cultivar directamente) de un donante y/o paciente cuando surge una necesidad clínica de CMM). Tal como se mencionó anteriormente, es importante no cultivar las CMM por más tiempo, preferentemente menos de 30 pases (después de obtener las células del donante o después de descongelar), más preferentemente menos de 20 traspasos, incluso más preferentemente no más de 10 traspasos, y aún más preferentemente no más de 5 traspasos, para conservar la potencia de las CMM. Por lo tanto, al optimizar las propiedades de las CMM y usarlas en combinación con al menos un agente que inhibe la coestimulación, la presente invención proporciona un enfoque inmunomodulador y/o inmunosupresor completamente nuevo para enfermedades y trastornos autoinmunes y/o inflamatorios, y también para trasplante, tejido y rechazo celular.

También se desvelan en el presente documento CMM que muestran una potencia inmunomoduladora altamente eficaz, para garantizar la eficacia cuando se combinan las CMM con CTLA4Ig y al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional. Asegurar que las CMM tengan una capacidad inmunomoduladora clínicamente eficaz es un aspecto importante pero en la técnica anterior que con frecuencia se pasa por alto. Por lo tanto, la presente invención utiliza poblaciones de CMM que cumplen ciertos criterios inmunomoduladores, que pueden determinarse evaluando la(s) población(es) de CMM para asegurar que se cumpla preferentemente al menos uno de los siguientes criterios de inmunomodulación:

(a) la población de CMM es positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos: vimentina (SEQ ID NO 1), caldesmon (SEQ ID NO 2), anexina A1 (SEQ ID NO 3), 14-3-3 proteína épsilon (SEQ ID NO 4), factor 1 de ribosilación de ADP (SEQ ID NO 5), calnexina (SEQ ID NO 6), factor 5 de ribosilación de ADP (s Eq ID NO 7), proteína transformante RhoA (SEQ ID NO 8), CD44 (SEQ ID NO 9), proteína similar a la coactosina (SEQ ID ⁿO 10), proteína cinasa activada por mitógeno 3 (SEQ ID NO 11), proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 7 (SEQ ID NO 12), N-acetil-glucosamina-6-sulfatasa (SEQ ID NO 13), proteína de unión a ácido retinoico celular 2 (SEQ ID NO 14), polipéptido 1 del factor de elongación de la transcripción B (SEQ ID No 15), NEDD8 (SEQ ID No 16), proteína de unión a ácidos grasos, corazón (SEQ ID NO 17). Preferentemente, la población de CMM es positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos: vimentina (SEQ ID NO 1), anexina A1 (SEQ ID NO 3) y/o proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 7 (SEQ ID NO 12); (b) una población de vesículas extracelulares derivadas de la población de CMM es positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos: serotransferrina (SEQ ID NO 18), proteína versican central (SEQ ID NO 19), anexina A2 (SEQ ID NO 20), serina proteasa HTRA1 (SEQ ID NO 21), proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 3 (SEQ ID NO 22), factor de crecimiento del tejido conectivo (SEQ ID NO 23), vinculina (SEQ ID NO 24), proteína asociada a la diferenciación de neuroblastos AHNAK (SEQ ID NO 25), proteína asociada a microtúbulos 1B (SEQ ID NO 26), ácido graso sintasa (SEQ ID NO 27), triosa-fosfato isomerasa (SEQ ID NO 28), ATP-citrato sintasa (SEQ ID NO 29), calreticulina (S^eQ ID NO 30), vigilina (SEQ ID NO 31), subunidad catalítica de la proteína cinasa dependiente de ADN (SEQ ID NO 32), inhibidor de la disociación Rab GDP beta (SEQ ID NO 33), subunidad beta de la ATP sintasa, mitocondrial (SEQ ID NO 34).). Preferentemente, la población de vesículas extracelulares derivadas de la población de CMM es positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos: serotransferrina (SEQ ID NO 18), anexina A2 (SEQ ID NO 20), y/o proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 3 (SEQ ID NO 22);

(c) la población de CMM en (a) muestra el siguiente orden de abundancia de polipéptidos: vimentina> anexina A1. Preferentemente, la población de CMM presenta el siguiente orden de abundancia de polipéptidos: vimentina> anexina A1> CD44> proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 7> proteína de unión a ácidos grasos 3;

(d) la población de vesículas extracelulares en (b) muestra el siguiente orden de abundancia de polipéptidos: serotransferrina > anexina A2. Preferentemente, la población de vesículas extracelulares muestra la siguiente abundancia de polipéptidos: serotransferrina > anexina A2 > factor de crecimiento del tejido conectivo

(e) la expresión de aumento de la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la población de CMM es <10 cuando las CMM se preparan con 15 ng/ml de TNF-alfa;

(f) la expresión de aumento de la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la población de CMM es >100 cuando las CMM se ceban con 10 ng/ml de IFN-gamma;

(g) la viabilidad de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) se incrementa en al menos el 20 % (preferentemente al menos el 30 % o incluso más preferentemente al menos el 50 %) cuando se cultiva conjuntamente con CMM de la población de CMM cebada con IFN-gamma o TNF-alfa de acuerdo con (e) o (f);

(h) el número de monocitos CD14+HLA-DRbajo aumentan al menos 1,5 veces (más preferentemente al menos 2 veces, o incluso más preferentemente al menos 3 veces) cuando las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMSC) de control sano se cultivan conjuntamente con la población de CMM cebada con IFN- gamma o TNF-alfa de acuerdo con (e) o (f);

(i) el número de linfocitos T CD4+CD25alt°CD127baj° reguladores (TReg) aumenta al menos 1,5 veces (más preferentemente al menos 2 veces, o incluso más preferentemente al menos 3 veces) cuando las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMSC) de control sano se cultivan conjuntamente con la población de CMM cebada con IFN-gamma o TNF-alfa de acuerdo con (e) o (f).

Además, la población de vesículas extracelulares obtenible de la población de CMM puede ser preferentemente negativa (es decir, estar desprovista de) para al menos uno de los siguientes polipéptidos: proteína de dominio único LIM 7 (SEQ ID NO 35), Dominio LIM y proteína de unión a actina 1 (SEQ ID NO 36), complejo de proteína de revestimiento, subunidad beta 2 (Beta prime), isoforma CRA_b (SEQ ID NO 37), inhibidor de ribonucleasa (SEQ ID NO 38), PDZ y proteína de dominio LⁱM 5 (SEQ ID NO 39), reticulocalbina-1 (^sE^qID NO 40), antígeno endosómico temprano 1 (SEQ ID NO 41), septina-2 (^sE^qID NO 42), subunidad 2 del complejo 2/3 de proteína relacionada con la actina (SEQ ID NO 43), septina 11 (SEQ ID NO 44).

Naturalmente, el cultivo de CMM (es decir, la población de CMM, la población de vesículas extracelulares derivadas de las CMM y tanto la población de CMM como la población de vesículas extracelulares derivadas de las CMM) pueden cumplir solo uno (1) de los criterios anteriores, pero preferentemente se cumplen varios criterios. Por ejemplo, el cultivo puede cumplir los criterios (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c), (a) y (d), (a) y (e), (b) y (d), (a) y (e), (a), (i) y (c), (a), (b) y (d), (b), (c) y (i), (c), (d) y (i), (d) y (e), (a), (f) y (g), (i), (f) y (g), (a), (b) y (g), (a), (g) y (f), etc., etc. Por lo tanto, el cultivo de CMM puede cumplir con todas las combinaciones y permutaciones posibles de los criterios anteriores (a)-(i) sin apartarse del alcance de la presente invención.

Esencialmente, basándose en la detección de una gran cantidad de cultivos de CMM, los inventores se han dado cuenta de que ciertos perfiles de polipéptidos de las células y los componentes extracelulares contribuyen fuertemente a la eficacia inmunomoduladora terapéutica, y cuando estas células se combinan con al menos un inhibidor de coestimulación exógeno se obtiene una modalidad terapéutica altamente eficaz. Algunas de las características clave de expresión de polipéptidos se resumen en las tablas a continuación, pero otros patrones de expresión de polipéptidos además de los mencionados explícitamente también se han relacionado con propiedades inmunomoduladoras.

Tal como se mencionó anteriormente, en el presente documento se describe una población de CMM inmunomoduladoras que tienen el siguiente perfil de antígeno: CD73+, CD90+, CD105+, C^d34-, CD45-, CD14- y CD3-. En otro caso, la población de CMM puede ser positiva para vimentina y/o anexina A1, y también positiva para la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 7 y/o la proteína de unión a ácidos grasos 3 y/o anexina A1.

Las CMM se definen normalmente como funcionales y biológicamente activas a través de una prueba de formación de unidades de colonias (UFC) y diferenciación en adipocitos (células grasas), osteoblastos (células óseas) y condrocitos (células de cartílago). Madeira y coautores (PLOS One, 2012) han comparado MSC biológicamente activas e inactivas y descubrieron que en las células inactivas, la expresión de anexina A1 está regulada positivamente 1,5 veces. La anexina A1 es una proteína conocida relacionada con la apoptosis, que afecta a la inmunidad adaptativa e innata. Por el contrario, la expresión de vimentina, que es un componente del citoesqueleto celular, está regulado negativamente 2,5 veces en las CMM biológicamente inactivas en comparación con las activas. Esto probablemente refleja una regulación negativa en la capacidad de proliferación de las CMM inactivas. Sin embargo, lo que los inventores de la presente invención han descubierto inesperadamente es que es claramente preferencial con una mayor abundancia de vimentina (y polipéptidos relacionados) que de anexina A1 (y polipéptidos relacionados). Además, los presentes inventores han descubierto que la abundancia tanto de anexina A1 como de anexina A2 es mayor en la fracción extracelular (por ejemplo, en vesículas extracelulares como exosomas) de las CMM inmunomoduladoras que de las CMM no inmunomoduladoras y que este es un factor importante para la capacidad inmunomoduladora en diversos trastornos inflamatorios.

De manera similar, los inventores han identificado otros patrones de abundancia que dan como resultado una potencia inmunomoduladora mejorada, por ejemplo en el contexto de los lisados de células completas: Vimentina > Caldesmon, Vimentina > CD44 y Vimentina > Anexina A1 > CD44. Y, en el contexto del lisado de la fracción que contiene vesículas extracelulares: Serotransferrina > Proteína central de Versican, Serotransferrina > Anexina a 2 > Factor de crecimiento del tejido conectivo, y Serotransferrina > Anexina A2 > Vinculina. De manera importante, los diferentes perfiles de polipéptidos de las CMM y las vesículas extracelulares pueden coexistir, por ejemplo, en que el lisado celular completo (es decir, el patrón de polipéptido de CMM) puede mostrar una mayor abundancia de vimentina que de anexina A1, mientras que la fracción de vesículas extracelulares derivada de la población de CMM presenta una mayor abundancia de serotransferrina que de anexina A2.

En otro caso, la población de CMM puede ser positiva para el antígeno CD44, y CD44 puede estar presente ventajosamente en una abundancia menor que la anexina A1.

Los presentes inventores también se han dado cuenta de que ciertos polipéptidos relacionados con el metabolismo de la glucosa juegan un papel extraordinariamente importante en la modulación del sistema inmunitario. Otro criterio de inmunomodulación según la presente invención se refiere a la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 7 (IGFBP7), que es clave para inducir a los linfocitos T a cambiar a linfocitos T reguladores y estimular la producción de prostaciclina, que pueden ser mecanismos importantes detrás de la capacidad inmunomoduladora de las CMM. Por lo tanto, en una realización preferida, las CMM inmunomoduladoras (y naturalmente las poblaciones de CMM de las mismas) eficaces en el tratamiento de la miocarditis de la presente invención también pueden cumplir los criterios de ser positivas para IGFBP7, y además la fracción celular y la fracción extracelular (por ejemplo, las vesículas extracelulares) pueden expresar cantidades aproximadamente iguales (+/- el 30 %, pero preferentemente /- el 20 %) de IGFBP7 (es decir, tienen una abundancia aproximadamente igual del polipéptido en cuestión). Por el contrario, la fracción extracelular de las CMM no inmunomoduladoras (es decir, las CMM que no cumplen los criterios de inmunomodulación según la presente invención) se pueden distinguir de las CMM inmunomoduladoras por tener una abundancia de IGFBP7 significativamente menor.

Por el contrario, las CMM inmunomoduladoras con actividad terapéutica en inflamación, trasplante y/o autoinmunidad pueden estar esencialmente desprovistas (o al menos tener una expresión/abundancia muy baja) de IGFBP2 (SEQ ID NO 45) tanto en la fracción de células completas como en la fracción extracelular (por ejemplo, en las vesículas extracelulares), mientras que las CMM sin capacidad inmunomoduladora pueden tener una expresión de IGFBP2 significativamente mayor.

Naturalmente, los perfiles mencionados anteriormente pueden detectarse/evaluarse, por ejemplo, en el momento de obtener el material de un donante, en diversos puntos temporales durante el crecimiento/cultivo de las CMM antes de la aplicación clínica, en diversos puntos temporales después de que las células hayan sido cultivadas in vitro y/o en el momento en que es hora de administrar las CMM y/o las vesículas extracelulares a un paciente a tratar.

Tal como se desvela en el presente documento, el al menos otro inhibidor de coestimulación exógeno adicional puede inhibir al menos una de las siguientes vías de señalización:

a. la vía de CD28/CTLA4: CD80/CD86;

b. la vía de CD40 : CD154;

c. la vía de ICOS : ICOSL;

d. la vía de 41BB : 41BBL;

e. la vía de CD27 : CD70;

f. la vía de LFA-1 : ICAM;

g. la vía de VLA-4 : VCAM;

h. la vía de OX40: OX40L,

i. Fas (CD95): FasL (CD95L), y,

j. la vía de TIM,

k. la vía LFA-3: CD2.

Las vías anteriores son importantes para la coestimulación de las células inmunitarias y la inhibición de al menos una vía apropiada, en combinación con la administración de las CMM, da como resultado importantes beneficios clínicos, por ejemplo, cuando se combina con el trasplante de células de islotes productoras de insulina (para tratar la diabetes de tipo 1), hepatocitos (para tratar, por ejemplo, la insuficiencia hepática aguda o crónica) o células renales (para tratar, por ejemplo, la insuficiencia renal aguda o crónica). De manera similar, aplicar la composición (que comprende CMM e inhibidores de la coestimulación) puede ser muy beneficioso en el contexto del trasplante de órganos completos, por ejemplo trasplante de hígado, trasplante de riñón, trasplante de corazón, etc. También, los trasplantes de células hematopoyéticas también pueden ser relevantes dentro del contexto de la presente invención. No obstante, administrar la composición farmacéutica de la presente invención (es decir, una composición que comprende CMM, CTLA4Ig y el al menos un inhibidor de coestimulación adicional) solo también pueden ser altamente beneficiosos en el tratamiento y/o la profilaxis de numerosas enfermedades autoinmunes e inflamatorias, por ejemplo diabetes tipo 1, insuficiencia renal, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, ELA, EM, SDRA, colitis ulcerosa, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), insuficiencia renal, enfermedades renales autoinmunes, insuficiencia hepática, enfermedades hepáticas autoinmunes, artritis reumatoide, enfermedad de Parkinson, trasplante de células hematopoyéticas, LES, enfermedad de Alzheimer, arteriosclerosis, enfermedades inflamatorias crónicas o agudas, artritis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia cardíaca posterior a la cardiotomía, enfermedades alérgicas de la piel o de las vías respiratorias, vasculitis autoinmunitaria, etc.

En una realización adicional, el al menos un agente adicional que inhibe al menos una señal coestimuladora (es decir, el inhibidor de la coestimulación) puede seleccionarse de un grupo que comprende prácticamente cualquier agente que pueda inhibir la al menos una de las señales coestimuladoras, por ejemplo, un anticuerpo contra cualquiera de los componentes de las vías adecuadas enumeradas anteriormente como a-j (por ejemplo, CD28, CD80, CD86, CD40, CD154, ICOS, ICOSL, 41BB, 41BBL, CD27, CD70L, LFA-1, ICAM, VLA-4, VCAM, OX40, OX40L, Fas (CD95), FasL (CD95L), TIM, etc.), LFA-3:CD2 o una proteína de fusión de cualquiera de los componentes anteriores con, por ejemplo, un componente Fc. Normalmente, el al menos un agente que inhibe al menos una señal coestimuladora comprende un polipéptido, es decir, estos agentes pueden ser polipéptidos, que pueden sintetizarse, pero con mayor frecuencia provienen de la tecnología recombinante.

El al menos un agente adicional que inhibe al menos una señal coestimuladora puede seleccionarse de un grupo que comprende CTLA4-Ig, anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1 y anti-B7.2 (anti-CD80 y anti-CD86), CD40 y su ligando CD154, anti-LFA1 (CD11) y anti-ICAM-1 (CD54), anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4, anti-VCAM y sus variantes o derivados, y cualquier combinación de los mismos. De manera interesante, en seres humanos, el eje CD40-CD40L se inhibe preferentemente mediante el bloqueo de CD40 con, por ejemplo, un anticuerpo contra CD40, mientras que, en roedores, la inhibición de la vía CD40-CD40L se puede lograr mediante el bloqueo de anti-CD40 o anti-CD40L. Sin embargo, los agentes que bloquean CD40L pueden usarse en seres humanos bajo ciertas condiciones y/o con ciertas modificaciones, por ejemplo, en una realización preferida de la presente invención, la molécula anti-CD40L-Tn3 (que inhibe el eje CD40: CD40L sin inducir la agregación plaquetaria) puede usarse en seres humanos junto con la población de CMM.

Una composición particularmente ventajosa según la presente invención puede comprender CTLA4-Ig y una población de CMM. CTLA4-Ig es una proteína de fusión compuesta del fragmento Fc de una IgG1 humana unida al dominio extracelular de CTLA-4, y existe en varias variantes y derivados modificados que están todos dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo, belatacept (SEQ ID NO 46) (también conocido como Nulojix) y abatacept (SEQ ID NO 47) (también conocido como Orencia).

La combinación de la presente invención de CMM con inhibidores de coestimulación exógenos, libres, solubilizados y sistémicamente presentes significa que uno puede aprovechar los efectos positivos de la distribución sistémica del al menos un inhibidor y los efectos de referencia de las CMM para sitios diana dentro del cuerpo, por ejemplo, sitios de inflamación y/o de lesión/traumatismo. Por lo tanto, la presente invención asegura la administración eficaz y segura de CTLA4Ig y el al menos un agente adicional que inhibe la coestimulación combinada con al menos una CMM, opcionalmente combinada además con al menos un trasplante terapéutico en forma de una célula, tejido y/u órgano.

Los inhibidores de la coestimulación utilizados en combinación con las CMM pueden modificarse ventajosamente para que tengan una semivida prolongada. Por lo tanto, en una realización preferida, los agentes que inhiben la coestimulación tienen una semivida in vivo de al menos 2 días, preferentemente al menos 5 días, e incluso más preferentemente al menos 8 días. Esencialmente, la semivida prolongada de los agentes que inhiben las señales de coestimulación implica que los inhibidores de coestimulación pueden detectarse en el cuerpo de un paciente durante un período prolongado de tiempo, normalmente al menos 2 días pero preferentemente durante períodos de tiempo más largos.

La técnica anterior (ejemplificada por Sullivan y colaboradores) simplemente describe la administración local de CTLA4Ig a través de la transducción adenovírica de las CMM con una construcción que expresa CTLA4Ig. La presente invención se basa en la administración sistémica de inhibidores de la coestimulación con una semivida prolongada, lo que permite un tratamiento terapéuticamente eficaz y rentable de pacientes durante largos períodos de tiempo, en completo contraste con las enseñanzas de Sullivan y colaboradores, que simplemente enseñan un concepto teórico sin aplicabilidad clínica. Además, los efectos inmunomoduladores sinérgicos de las CMM, CTLA4Ig y al menos un agente adicional que inhibe la coestimulación descubierta por los presentes inventores no se ven cuando se utiliza la tecnología descrita por Sullivan y colaboradores, ya que se necesita la presencia sistémica de al menos un inhibidor de coestimulación exógeno. Específicamente, Sullivan et al. no detectaron ninguna disminución en las citocinas inflamatorias tales como IFN-gamma y TNF-alfa, al contrario de la presente invención. Además, al ser capaces de administrar la infusión del al menos un inhibidor de coestimulación exógeno por vía sistémica, la administración puede repetirse en casos en los que puede producirse una recaída de una enfermedad sin tener que volver a administrar el sistema de suministro basado en CMM descrito por Sullivan y colaboradores, es decir, una célula que produce un cierto inhibidor de la coestimulación. La administración repetida de células puede conducir a la sensibilización con efectos desconocidos que incluyen reacciones alérgicas o anafilaxia o rechazo del sistema de suministro basado en células que limita la semivida y, por lo tanto, la eficacia, así como la inmunización que puede aumentar la reacción cruzada hacia un posible trasplante o embarazo en el futuro.

Además, al eliminar la necesidad de un sistema de vehículo celular para la administración de medicamentos, se evita la manipulación de las CMM, eliminando la interferencia de la biología de las CMM y su capacidad para modular el sistema inmunitario en el hospedador. Las CMM genéticamente modificadas no se evalúan fácilmente por sus propiedades inmunomoduladoras y la necesidad de vectores víricos siempre aumenta el riesgo de eventos adversos. Todos los inhibidores coestimuladores exógenos utilizados en el contexto de la presente invención se desarrollan individualmente y la seguridad se prueba antes de combinar con la terapia con c Mm . Además, el hecho de que el al menos un inhibidor de la coestimulación sea sistémico y exógeno (es decir, no producido endógenamente por las CMM) da como resultado un mayor tiempo de supervivencia de las CMM y, por lo tanto, mejora los efectos inmunomoduladores y/o inmunosupresores de las células.

Por lo tanto, para optimizar la combinación inmunomoduladora de las CMM e inhibidores de la coestimulación, en otra realización particularmente ventajosa, las composiciones según la presente invención comprenden al menos dos agentes que inhiben las señales coestimuladoras, por ejemplo CTLA4-Ig y anti-CD40 y/o anti-LFA1 (o variantes y/o derivados de los mismos). Por lo tanto, en realizaciones ventajosas adicionales, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender al menos una CMM, CTLA4-Ig, y cualquier agente que pueda bloquear, por ejemplo, CD40 o LFA1, ya sea directamente o interactuando con cualquier diana adecuada que anule la actividad del eje CD40:CD40L y/o la vía de LFA1. El anti-CD40 y el anti-LFA1 pueden ser los anticuerpos contra CD40 y LFA-1, respectivamente, pero también podrían ser cualquier tipo de polipéptido que se una e inhiba la acción de cualquiera de CD40/CD40L o LFA1/ICAM1-3. En una realización ventajosa adicional, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender al menos una CM, anti-CD40 y/o anti-CD40L y anti-LFA1. El agente anti-LFA1 puede ser el Efalizumab clínicamente aprobado (también conocido como Raptiva) y el agente anti-CD40 puede ser anti-CD40L-Tn3 (es decir, un armazón de Tenascina 3 que comprende una subunidad monomérica específica de CD40L), y/o un agente conocido como 4D11 y/o un agente conocido como ASKP1240 (anticuerpo monoclonal contra CD40), que actualmente se encuentran en evaluación clínica. Además, otro inhibidor de coestimulación de interés puede ser un anticuerpo monoclonal anti-B7RP1.

En una realización adicional, la dosis de CTLA4-Ig (en forma de, por ejemplo, Belatacept) puede variar desde tan solo 0,1 mg/kg, a 1 mg/kg, a 10 mg/kg, a 100 mg/kg e incluso a dosis más altas si la afección a tratar así lo requiere. La dosis de anti-LFA1 (por ejemplo, en forma de Efalizumab (SEQ ID NO 48 (región variable de la cadena pesada) y SEQ ID NO 49 (región variable de la cadena ligera)) u Odulimomab) puede variar desde tan solo 0,01 mg/kg, a 0,1 mg/kg, a 10 mg/kg, a 100 mg/kg e incluso a dosis más altas si la afección a tratar así lo requiere. Naturalmente, la dosis puede variar mucho también fuera de los intervalos indicativos anteriores dependiendo, por ejemplo, de la duración del tratamiento, de la frecuencia de administración del agente, de la enfermedad que se vaya a tratar, de la combinación con otros agentes, de la afección médica y/o inmunológica del paciente que se va a tratar, etc.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden comprender varios excipientes farmacéuticamente aceptables para asegurar que las CMM y los inhibidores de la coestimulación puedan administrarse al paciente de manera eficaz. Las CMM y los inhibidores de la coestimulación pueden estar presentes en diferentes composiciones farmacéuticas con diferentes excipientes, diluyentes o propiedades; como alternativa, las CMM y los inhibidores de la coestimulación pueden estar presentes en la misma composición farmacéutica. El al menos un excipiente puede ser un líquido, un disolvente, una solución, una carga, una matriz de proteínas como una laminina, un vehículo, un material encapsulante, o cualquier combinación de los mismos. En una realización ventajosa, las CMM y el trasplante/implante opcional de células, tejido y/u órgano puede administrarse a un paciente junto con al menos una laminina (LN), para mejorar, entre otros, el injerto y la eficacia. Las lamininas adecuadas pueden ser LN-111, LN-211, LN221, LN-511, LN-521, LN-411, LN-421, LN-311, LN-321, LN-332 y cualquier combinación de los mismos (como LN-211 combinado con LN-521 o LN-421 combinado con LN-521).

En una realización adicional de la presente invención, la población de CMM y los inhibidores de coestimulación exógenos pueden estar presentes en recipientes o vasos separados. Tal como se mencionó anteriormente, como alternativa, la CMM y los agentes que inhiben las señales coestimuladoras también pueden estar presentes en el mismo vaso, ya que las CMM son coestimulantes inertes y el uso de un solo vaso para las CMM y los inhibidores de la coestimulación puede ser ventajoso en un entorno clínico, por ejemplo, la combinación de CMM e inhibidores (en una bolsa contenedora para infusión) se administra por vía intravenosa a un paciente. El uso de más de un contenedor puede permitir la administración de las CMM y los inhibidores de la coestimulación independientemente uno del otro (por ejemplo, que las CMM se administran primero, seguido de la administración de los inhibidores de la coestimulación, o viceversa, que los inhibidores de la coestimulación se administran primero seguido de la administración de las CMM). Cuando las CMM y los inhibidores de la coestimulación están presentes en contenedores separados, los contenedores pueden ser para diferentes usos, por ejemplo, las CMM pueden administrarse/implantarse directamente en un determinado órgano del paciente (en ese caso, el recipiente puede ser una jeringa, etc.) mientras que los inhibidores de la coestimulación pueden administrarse por vía intravenosa (en cuyo caso el recipiente puede ser, por ejemplo, una jeringa o una bolsa para infusión, etc.).

De manera interesante, en parte debido a su tendencia a albergar inflamación y/o traumatismo, las CMM de la composición farmacéutica de la presente invención pueden administrarse sistémicamente (por ejemplo, por administración intravenosa), pero también pueden ser guiadas a un determinado sitio, tejido u órgano mediante trasplante/implantación, u opcionalmente como parte del dispositivo médico.

En una realización adicional, la composición farmacéutica puede comprender además al menos un trasplante terapéutico en forma de una célula, tejido y/u órgano que se administrará a un paciente. Una "célula terapéutica", "tejido terapéutico" y/u "órgano terapéutico" se entenderán como una célula, tejido y/u órgano destinado a realizar una determinada función fisiológica en el cuerpo del paciente que recibe la célula, tejido y/u órgano en cuestión. La célula, el tejido y/u órgano terapéutico pueden tener la misma función que lo que hubieran hecho en el donante: por ejemplo, las células de los islotes pancreáticos que se administran a un paciente con diabetes de tipo 1 en combinación con la composición según la presente invención estarían destinadas a realizar la misma función en el paciente que recibe las células de los islotes pancreáticos como lo habrían hecho en el donante, es decir, producir insulina. El mismo razonamiento es aplicable al trasplante de riñón, en donde un riñón de un donante estaría destinado a realizar la misma función en el paciente que recibe el riñón que en el donante. Por lo tanto, las expresiones "célula terapéutica", "tejido terapéutico" y "órgano terapéutico" se entenderán como una célula, tejido y/u órgano que, cuando se administra a un paciente en combinación con la composición de la presente invención, restaura una función o característica particular del cuerpo del paciente. En una realización, una composición puede comprender, por lo tanto, una población de CMM, CTLA4Ig y el al menos un agente adicional que inhibe las señales coestimuladoras, y al menos una célula, por ejemplo, células de islotes pancreáticos, neuronas, hepatocitos, nefrocitos, cardiomiocitos, etc. Estas células pueden ser autólogas y/o alogénicas, en función del propósito de la administración de las células. La combinación de la composición farmacéutica con el implante/trasplante (básicamente cualquier tipo de administración) de una célula (y/o tejido y/u órgano) puede dar como resultado una supervivencia del injerto significativamente mejorada, por ejemplo, uno podría administrar células de islotes a una persona que padece diabetes de tipo 1 y debido a los efectos inmunomoduladores de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, las células de los islotes no serían la diana de un ataque del sistema inmunitario del huésped (del paciente) o ese ataque se inhibiría al menos parcialmente. Las células terapéuticas que se van a administrar (por ejemplo, células de los islotes, neuronas o hepatocitos) pueden estar comprendidos en la misma composición que las CMM y los inhibidores de la coestimulación, pero dichas células también pueden estar presentes en una composición separada (en un recipiente separado). Como alternativa, las CMM y las células terapéuticas (por ejemplo, células de los islotes, las neuronas o los hepatocitos) pueden estar comprendidas en una composición separada (en un recipiente separado) que se puede administrar directamente en un tejido, órgano o sitio del paciente adecuado. La administración de las CMM y las células terapéuticas puede tener lugar antes, después, o esencialmente al mismo tiempo que la administración de los inhibidores de la coestimulación.

La implantación de las CMM se puede administrar como una infusión al paciente o a un órgano como un régimen de acondicionamiento fuera del cuerpo antes del trasplante. Las CMM se pueden implantar directamente en el órgano que se va a dirigir al paciente o como tratamiento sistémico. Las CMM pueden funcionar como terapia celular para enfermedades autoinmunes o inflamatorias y no necesariamente con un trasplante concomitante de otro tipo celular u órgano alogénico o singénico. Los inhibidores de la coestimulación pueden administrarse en el momento de la implantación de las CMM o posteriormente y ambas terapias pueden repetirse como terapia de mantenimiento o como una terapia de inducción única o una serie de terapias repetidas en el momento de la actividad de la enfermedad o como una terapia profiláctica para prevenir nuevos episodios de aparición de la enfermedad. Un retraso temporal de la administración de la terapia con CMM y los inhibidores de la coestimulación pueden lograr efectos beneficiosos ya que la vida media de las terapias biológicamente activas se puede mantener en el huésped durante semanas e incluso meses. Esto incluye cualquier combinación de administración local o sistémica de CMM e inhibidor de coestimulación con o sin otro trasplante de células u órganos o implante de células singénicas.

La composición farmacéutica que comprende las CMM se puede administrar ventajosamente a un paciente que padece cualquiera de las enfermedades, trastornos y/o afecciones mencionadas en el presente documento más de una vez dentro de un cierto período de tiempo, por ejemplo, la composición farmacéutica puede administrarse dentro de 1 semana de la primera dosis, dentro de las 2 semanas de la primera dosis, dentro de las 3 semanas de la primera dosis, dentro de 1 mes de la primera dosis, dentro de los 2 meses de la primera dosis, dentro de los 6 meses de la primera dosis, e incluso dentro de 1 año de la primera dosis, con el fin de mejorar el efecto terapéutico. Además, la composición farmacéutica que comprende las CMM también se puede administrar con intervalos más largos, ya sea en respuesta a la reincidencia de la enfermedad o como parte del tratamiento regular.

Antes de administrar las composiciones de CMM+inhibidor y/o la combinación de CMM+inhibidor, el paciente puede ser tratado con fragmina y/o heparina para reducir el atrapamiento celular en los pulmones y evitar que las CMM causen coágulos pulmonares o formación de émbolos. Además, el paciente también puede ser tratado previamente con corticosteroides (tales como prednisolona), antihistamínicos y antibióticos, de una manera convencional.

Las composiciones (que comprenden las CMM, CTLA4Ig y el al menos un agente adicional que inhibe la coestimulación) se pueden administrar ventajosamente al paciente mediante infusión a través de un catéter venoso central. Esto es particularmente ventajoso cuando se dirige a enfermedades del pulmón en donde las CMM tienden a estar secuestradas después de la infusión i.v. La vía de administración de la composición farmacéutica puede ser importante para lograr la eficacia terapéutica y, por lo tanto, las composiciones según la presente invención pueden administrarse a través de varias rutas diferentes, por ejemplo auricular (ótica), bucal, conjuntiva, cutánea, dental, por electroosmosis, endocervical, endosinusal, endotraqueal, enteral, epidural, extra-amniótica, extracorpórea, por hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótica, intraarterial, intraarticular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracardíaca, intracartilaginosa, intracaudal, intracavernosa, intracavitario, intracerebral, intracisternal, intracorneal, intracoronal (dental), intracoronaria, intracorpórea cavernosa, intradérmica, intradiscal, intraductal, intraduodenal, intradural, intraepidérmica, intraesofágica, intragástrica, intragingival, intraileal, intralesional, intraluminal, intralinfática, intramedular, intrameníngea, intramuscular, intraocular, intraovárica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrasinal, intraespinal, intrasinovial, intratendinosa, intratesticular, intratecal, intratorácica, intratubular, intratumoral, intratimpánica, intrauterina, intravascular, intravenosa, bolo intravenoso, goteo intravenoso, intraventricular, intravesical, intravítrea, iontoforesis, irrigación, laríngea, nasal, nasogástrica, por técnica de vendaje oclusivo, oftálmica, oral, orofaríngea, otras, parenteral, percutánea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, rectal, respiratoria (inhalación), retrobulbar, en tejidos blandos, subaracnoidea, subconjuntiva, subcutánea, sublingual, submucosa, tópica, transdérmica, transmucosa, transplacentaria, transtraqueal, transtimpánica, ureteral, uretral y/o administración vaginal, y/o cualquier combinación de las vías de administración anteriores.

Tal como se desvela en el presente documento, la dosis terapéutica de CMM comprendidas en las composiciones farmacéuticas puede variar de al menos 100.000 CMM por kg de peso corporal, o al menos 500.000 CMM por kg de peso corporal, o al menos 1.000.000 de CMM por kg de peso corporal, o al menos 2.000.000 de CMM por kg de peso corporal, o incluso un mayor número de ^cM^mpor kg de peso corporal. El rango terapéutico de las ^cM^mpuede variar para la mayoría de las enfermedades de 100.000 a 10.000.000 de CMM por kg de peso corporal del paciente. Tal como se desvela en el presente documento, la composición farmacéutica puede comprender además plasma de un tipo sanguíneo adecuado para el paciente a tratar. Sorprendentemente, el plasma del tipo sanguíneo AB se puede usar ventajosamente independientemente del tipo de sangre del paciente al que se va a administrar la composición farmacéutica. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se supone que la ausencia de anticuerpos contra los antígenos A o B es ventajosa cuando se administra la composición farmacéutica a un paciente. El plasma puede estar presente en cualquier concentración superior al 1%, preferentemente alrededor del 10 %. El plasma se obtiene fresco, normalmente criorreducido, y posteriormente almacenado a -20 °C hasta su uso. En una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser una solución acuosa que comprende al menos el 5 % en p/v de cloruro de sodio, pero también pueden emplearse otros vehículos farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables. La concentración de cloruro de sodio en la solución acuosa es preferentemente de alrededor del 9 % en p/v.

Tal como se desvela en el presente documento, la composición farmacéutica según la presente invención puede usarse en medicina, en donde el trasplante/implante de la al menos una célula, tejido u órgano se administra conjuntamente junto con la población de CMM, y los inhibidores de la coestimulación se administran por separado antes, después, o esencialmente al mismo tiempo que la combinación de CMM y el trasplante/implante de al menos una célula, tejido u órgano.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a un artículo de fabricación que comprende una pluralidad de recipientes y/o envases, en donde un primer vaso comprende una población de CMM y al menos un recipiente posterior comprende CTLA4Ig y el al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional. El artículo de fabricación, que puede tener la forma de un kit para su uso como medicamento, puede comprender además al menos un trasplante en forma de una célula terapéutica, tejido y/u órgano, opcionalmente en otro vaso posterior más, pero también en cualquiera de los vasos que comprenden CMM y/o inhibidores de coestimulación. El artículo de fabricación puede, a modo de ejemplo, comprender (a) una población de CMM que se puede obtener de cualquier fuente adecuada, por separado (b) CTLA4-Ig y el al menos un agente adicional que inhibe la coestimulación, por ejemplo anti-CD40, o anti-LFA1, o cualquier combinación de los mismos, y, opcionalmente, por separado (c) al menos una célula terapéutica, tejido y/u órgano, por ejemplo células de los islotes, células del riñón, hepatocitos, un riñón, un corazón, un hígado, o cualquier combinación de los mismos.

También se describe en el presente documento al menos una CMM, CTLA4-Ig y al menos un agente adicional que inhibe las señales coestimuladoras para su uso en un método de tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un sujeto, comprendiendo el método las etapas de (a) administrar al sujeto al menos una CMM, y (b) administrar al sujeto CTLA4-Ig y al menos un agente adicional que inhibe al menos una señal coestimuladora. Dicho método puede comprender la temporización de la administración de al menos una CM y de CTLA4-Ig y al menos un agente adicional que inhibe las señales coestimuladoras, de modo que la administración se realice esencialmente de forma simultánea o secuencial en cualquier manera secuencial. Por ejemplo, la al menos una CM se puede administrar al sujeto en un cierto punto temporal, y la administración de CTLA4-Ig y el al menos un agente adicional que inhibe las señales coestimuladoras puede tener lugar antes de la administración de la CM o después la administración de la CM, o tanto antes como después. La administración de los inhibidores de la coestimulación puede tener lugar, por ejemplo, varias semanas o meses antes de la administración de las CMM, o por ejemplo, varios días u horas antes de la administración de las CMM. Por el contrario, la administración de los inhibidores de coestimulación puede tener lugar, por ejemplo, varias semanas o meses después de la administración de las CMM, o por ejemplo, varios días u horas después de la administración de las CMM. El método también puede comprender una etapa adicional (c) de administrar a un sujeto al menos una célula, tejido y/u órgano terapéutico. De nuevo, la administración de la célula, tejido y/u órgano terapéutico pueden tener lugar esencialmente al mismo tiempo que la administración de las CMM y/o los inhibidores de coestimulación, o en momentos posteriores o anteriores. Por lo tanto, la secuencia de etapas (a), (b), y la etapa opcional (c) puede variar, por ejemplo de la siguiente manera:

- Etapa (a) seguida de etapa (b)

- Etapa (b) seguida de etapa (a)

- Etapa (a) seguida de etapa (b) seguida de etapa (c)

- Etapa (a) seguida de etapa (c) seguida de etapa (b)

- Etapa (b) seguida de etapa (a) seguida de etapa (c)

- Etapa (b) seguida de etapa (c) seguida de etapa (a)

- Etapa (c) seguida de etapa (a) seguida de etapa (b)

- Etapa (c) seguida de etapa (b) seguida de etapa (a)

- Etapa (a) y etapa (c) llevadas a cabo a la vez seguidas de etapa (b)

- Etapa (a) seguida de etapa (b) y etapa (c) llevadas a cabo a la vez

- Etapa (b) seguida por etapa (a) y etapa (c) llevadas a cabo a la vez

- Etapa (a) y etapa (b) llevadas a cabo a la vez seguidas de letapa (c)

La elección de cómo emplear el método puede estar influenciada por la enfermedad o trastorno, si la intención es profiláctica y/o terapéutica, el estado médico del paciente, el estado inmunológico del paciente, etc.

En otra realización más, la presente invención se refiere a una combinación de i) una población de CMM, ii) CTLA4-Ig y iii) al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos, para su uso en la supresión y/o modulación del sistema inmunitario en un sujeto.

También se desvela en el presente documento un método de tratamiento de un paciente que padece diabetes de tipo I, que comprende administrar una población de CMM, CTLA4-Ig y al menos un agente adicional que inhibe las señales coestimuladoras, y opcionalmente al menos una célula de islote pancreático y/o un páncreas.

También se desvela en el presente documento un método de tratamiento de un paciente que padece insuficiencia renal aguda y/o crónica, que comprende administrar una población de CMM, CTLA4-Ig y al menos un agente adicional que inhibe las señales coestimuladoras, y opcionalmente al menos una célula renal y/o al menos un riñón. También se desvela en el presente documento un método de tratamiento de un paciente que padece insuficiencia cardíaca crónica y/o aguda, que comprende administrar una población de CMM, CTLA4-Ig y al menos un agente adicional que inhibe las señales coestimuladoras, y opcionalmente al menos una célula cardíaca y/o un corazón. También se desvela en el presente documento un método de tratamiento de un paciente que padece insuficiencia hepática aguda y/o crónica, que comprende administrar al menos una CM, CTLA4-Ig y al menos un agente adicional que inhibe las señales coestimuladoras, y opcionalmente al menos un hepatocito y/o un hígado.

En una realización, la presente invención se refiere al uso (in vivo o in vitro) de una combinación de CMM, CTLA4-Ig y el al menos un agente adicional que inhibe las señales coestimuladoras para modular y/o suprimir el sistema inmunitario innato y/o adaptativo. De manera más específica, la combinación de una población de CMM, CTLA4-Ig y el al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional se puede usar in vitro o in vivo para reducir la respuesta inmune, la inflamación y la activación de neutrófilos, modular los macrófagos hacia un fenotipo antiinflamatorio, inhibir la activación y la citotoxicidad de las células NK, modular la activación de células dendríticas (CD), modular respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+, y/o reprogramar linfocitos T convencionales en linfocitos T reguladores.

También se desvelan en el presente documento reactivos, kits, medios celulares y procesos de cultivo celular como se describió anteriormente. Por ejemplo, los procesos de cultivo celular que utilizan los métodos para obtener las CMM de la presente invención pueden emplearse en varios entornos adecuados, utilizando cualquier combinación adecuada de fuentes celulares. También se desvela en el presente documento el uso in vitro de las composiciones según la presente invención, es decir, composiciones que comprenden una población de CMM, CTLA4-Ig y el al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional, y opcionalmente una célula, tejido u órgano adicional (que normalmente en sí mismo tiene ciertas funciones fisiológicas). También se desvela en el presente documento un kit que puede comprender en un contenedor al menos una CMM, en otro contenedor CTLA4-Ig y al menos un agente adicional que inhibe al menos una señal coestimuladora, y opcionalmente contenedores y componentes adicionales para utilizar el kit in vitro.

Debe entenderse que los aspectos ejemplificadores descritos anteriormente, las realizaciones, alternativas y las variantes pueden modificarse sin apartarse del alcance de la invención, entre otros, con respecto a los constituyentes, componentes y materiales descritos, etc. (por ejemplo, las CMM, los inhibidores de coestimulación exógenos, la célula, tejido u órgano terapéutico, etc. que se va a administrar a un paciente, etc.). La invención se ejemplificará ahora con la sección experimental adjunta, que naturalmente también puede modificarse sin apartarse del alcance de la invención.

Sección experimental

Animales experimentales

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética local para la Investigación Animal y se realizaron de acuerdo con las normas y reglamentos locales institucionales y nacionales suecos.

Aislamiento, cultivo y caracterización de CMM de ratón

Las CMM de médula ósea (MO) de los C57BL/6 se extrajeron de los fémures y tibias y se cultivaron con medios basales de células madre mesenquimales de ratón con suplementos (STEMCELL Technologies, Grenoble, Francia). Se utilizaron de 3 a 10 traspasos de CMM y se fenotiparon, así como se estudió la capacidad de diferenciarse en adipocitos y osteocitos, y la capacidad de inhibir la activación de los linfocitos T.

Aislamiento, cultivo y caracterización de CMM humanas

Se aspiraron entre 10 y 40 ml de médula ósea de voluntarios sanos de terceros no compatibles con HLA. Las CMM se obtuvieron adicionalmente de la gelatina de Wharton, del tejido adiposo y de la sangre del cordón umbilical. Las CMM de grado clínico se generaron en condiciones de buenas prácticas de fabricación (BPF) de acuerdo con un protocolo común elaborado por el Comité de Desarrollo de la e BmT, acreditado por la Junta Nacional de Salud y Bienestar de Suecia. Las células (alrededor de 150x106) se sembraron en matraces de 175 cm2 (Falcon, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) en medio Eagles modificado por Dulbecco medio-bajo en glucosa (DMEM-LG, Life Technologies, Gaithersburg, MD, EE.UU.) suplementado con plaquetas humanas lisadas (las concentraciones finales van desde 107 a 109, normalmente 108/ml). Cuando los cultivos estaban cerca de la confluencia (> 80 %), las células se separaron mediante tratamiento con tripsina y EDTA (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) y se volvieron a colocar de nuevo a una densidad de 4.000 células/cm2. Las CMM se recolectaron y se crioconservaron en dimetilsulfóxido al 10 % (WAK-Chemie Medical GmbH, Alemania). Después de descongelar, las células se lavaron tres veces en PBS y se resuspendieron en solución salina al 0,9 % con la adición de plasma AB al 10 %, a una concentración final de 2x106 células/ml.

Los criterios de liberación de CMM para uso clínico incluyeron: ausencia de agrupaciones visibles, morfología de la forma del huso, ausencia de contaminación por patógenos (bacterias y micoplasmas) y viabilidad > 95 %. Las CMM expresaron CD73, CD90, CD105, HLA-ABC y fueron negativos para CD14, CD31, CD34, CD45 y HLA-DR.

Evaluación de la capacidad inmunomoduladora de las CMM

• Las CMM crecidas ex vivo se pretrataron (CMM cebadas, CMMc) o no (CMM) con 10 ng/ml de IFN-y y 15 ng/ml de TNF-a durante 48 horas antes de usarse en cocultivos con PMN con o sin activación por endotoxina (100 ng/ml de lipopolisacáridos (LPS)). Después del cebado inflamatorio, las CMM regularon positivamente la expresión en superficie celular de CD54 (IcAM-1), CD106 (VCAM-1) y HLA-ABC y -DR, así como la expresión de la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), un potente mediador de muchas funciones reguladoras inmunes de CMM.

• El incremento de la expresión de IDO después de la estimulación con TNFa de las CMM del donante debería ser < 10 y el aumento de la expresión de IDO después de la estimulación de INF^ydebería ser mayor que > 100 (p0,05). Las CMM se cultivaron en presencia de TNF-a (15 ng/ml) o IFN-y (10 ng/ml).

• La viabilidad de los PMN preferentemente mejoró significativamente (p0,05), preferentemente mejoró al menos en un 10 %, o más preferentemente en al menos el 20 %, después de añadir CMM y LPS o CMMc con o sin LPS como cocultivo. Se investigaron los niveles de viabilidad y expresión de los marcadores de superficie por control o los PMN estimulados con LPS después de 40 horas de cocultivo directo ya sea con reposo o con CMMc. La expresión de CD16 (FcyR-III) se usó como marcador sustituto de la viabilidad de los PMN. En ausencia de LPS, la supervivencia de los PMN se mejoró solo en presencia de las CMMc. Cuando se añadió LPS al cocultivo, tanto los CMMc en reposo como los protegidos protegieron a los PMN de la apoptosis. Por consiguiente, el porcentaje de PMN positivos para CD16 coincidió con el porcentaje de PMN viables en todas las condiciones de cultivo. En paralelo, la expresión de CD11b y CD54 se asocia normalmente con el estado de activación de los PMN. Como cabía esperar, el porcentaje de PMN positivos en Cd11b fue mayor en presencia de CMM y mejoró aún más con el tratamiento con LPS, mientras que la intensidad de fluorescencia media relativa (IFMr) de CD11b no cambió significativamente, lo que sugiere que se están activando más PMN después de la exposición a CMM o CMMc. Lo que significa que CD11b debería mejorar significativamente (p 0,05) en la presencia de CMM, CMMc con o sin LPS. Por el contrario, la IFMr de CD54 debería estar significativamente regulada (p0,05) por el tratamiento con LPS y este efecto fue mejorado por el cocultivo con CMM. En general, la mayor supervivencia y activación de los PMN desencadenada por las CMM sugiere que las CMM pueden influir en la respuesta innata dependiente de los PMN a través de modificaciones funcionales en lugar de efectos proapoptóticos.

• Las CMM de donantes están aumentando preferentemente el número de células supresoras derivadas de mieloides (CSDM) en un factor de 1,5 o más, preferentemente en un factor de 2. El cocultivo de los PMN con CMM condujo a un marcado aumento en células maduras CD11bbrillante/CD16brillante/CD62Ldim (Tipo N2) células con núcleos hipersegmentados compatibles con CMM granulocíticas. De manera similar, el cocultivo de CMM con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMSC) de control saludable en diferentes proporciones promovió un aumento significativo (p0,05) de monocitos CD14 HLA-DRbajo que se asemejan a las CSDM monocíticas.

Las CMM de donantes están aumentando significativamente (p 0,05), preferentemente 1,5 veces o incluso más preferentemente 2 veces, el número de linfocitos T reguladores como se ejemplifica por linfocitos T CD4+CD25altoCD127bajo reguladores (TReg), una población celular inmunorreguladora clave, también se expandió en experimentos de cocultivo con PBMSC. Esto correspondió con mayores niveles de Treg CD4+CD25altoCD127bajo en circulación que se observó en la sangre periférica observada en sujetos tratados hasta 20 días después de la administración de CMM (TRegs entre los linfocitosT CD4+ en controles sanos (n=11) 3,84+/-1,60 %, intervalo de TReg en pacientes 3,34-17,8 %). Este hallazgo podría haber sido el resultado de una producción tímica elevada, como lo indica la mayor proporción de emigrantes tímicos recientes CD31+ entre linfocitos TReg CD45RA+ sin exposición previa en pacientes y/o la conversión estimulada por CMM de linfocitos T convencionales en la periferia.

Trasplante de islotes en modelo de ratones con diabetes de tipo 1

Aislamiento, cultivo y caracterización fenotípica de CD

Las CD inmaduras (CDinm) de C57BL/6 se aislaron de acuerdo con los métodos descritos por Choi y colaboradores (Choi et al., Immunol Invest, 2012). Las CMM se añadieron con 500 ng/ml de LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para examinar el efecto inhibidor sobre la maduración de las CD. Las CD CD11c+ se tiñeron con anticuerpos monoclonales (mAbs contra CD11c, CD80, CD86, MHC de clase II y controles que coinciden en isotipo (eBioscience, Hatfield, Reino Unido). Los datos se presentaron como la intensidad de fluorescencia media.

Aislamiento y trasplante de islotes

Los islotes de Balb/c fueron aislados por colagenasa P (Roche Dagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Los ratones receptores C57BL/6 se hicieron diabéticos mediante inyección intravenosa de aloxano (75 mg/kg) (Sigma) 3 días antes del trasplante y se trasplantaron con 250 equivalentes de islotes (EQI) de Balb/c solos o junto con CMM de C57BL/6 (2,5 x 105 células/ratón) a través de la vena porta. Los ratones fueron tratados con CTLA4Ig y anti-CD40L (clon MR1) en días alternos hasta el día posoperatorio 10 a dosis de 0,5 mg el día 0 y 0,25 mg el día 2, 4, 6, 8, 10 o con controles de isotipo a dosis similares. Todos los anticuerpos se adquirieron de Bio X Cell (West Lebanon, NH). Los tratamientos también se llevaron a cabo con CTLA4Ig anti-LFA1 CMM, y con anti-LFA1 anti-CD40L CMM. Los niveles de glucosa en sangre de menos de 11,1 mmol/l se consideraron una reversión de la diabetes y el rechazo de islotes se definió como > 20 mmol/l de glucosa en sangre sin ayunar durante 2 días consecutivos.

Inmunohistoquímica

Los hígados de los receptores que sobrevivieron hasta 100 días después del trasplante se congelaron rápidamente, se seccionaron en piezas de 5 mm y se fijaron en formaldehído al 4 %. Para la tinción de FoxP3 se usó suero de burro al 10 % (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA) como agente bloqueante y para la tinción de CD4/CD8 suero de burro al 5 % y suero de ratón al 5 % (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Las secciones se incubaron con anti-FoxP3 de ratón en rata (eBioscience) o anti-CD4/CD8 de ratón en rata (Serotec, Oslo, Noruega) durante la noche. Se añadió anti-IgG de rata en burro (Alexa flúor) y los portaobjetos se incubaron durante 1 hora y se montaron con el reactivo antidifuminación que contenía 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Pierce, Rockford, IL). Para la tinción de insulina, las secciones se incubaron con anticuerpo antiinsulina conjugado con rodamina (Mabtech AB, Nacka, Suecia) durante 1 h, seguido de tinción con DAPI.

Ensayo de inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT)

Para examinar la actividad de los linfocitos T específicos del injerto, los esplenocitos y los linfocitos intrahepáticos (LIH) se aislaron de los hígados receptores y se usaron como células de respuesta. Los esplenocitos (1 x 105/pocillo) o los LIH (1 x 104/pocillo) se sembraron por triplicado con esplenocitos de Balb/c irradiados (4 x 105/pocillo) durante 18 horas. Las placas pretratadas de 96 pocillos y el kit de ELISPOT con anti-IFNY de rata fueron obsequios de Mabtech AB. El cálculo del número de unidades formadoras de puntos y la actividad de las citocinas se determinaron mediante el programa informático de conteo ELISPOT, versión 3.5 (AID, Estrasburgo, Alemania) y supone una cuantificación relativa de los niveles de citocinas.

Expresión de IDO, TGFB, Insulina y Foxp3

El ARN total se aisló de los hígados receptores. La PCR en tiempo real se realizó con la mezcla Green Master Mix de FAST SYBR® a 2x (Life Technologies) por triplicado usando el sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias del cebador (Life Technologies) y los tamaños de los fragmentos de los genes se muestran en la Tabla complementaria. El nivel de ARNm de la muestra fue normalizado por GAPDH como control interno.

Reacción de linfocitos mezclados (RLM)

Los linfocitos T CD4+ (1 x 105/pocillo) del bazo de C57BL/6 sin exposición previa y los linfocitos T pan irradiados (2 x 105/pocillo) del bazo de Balb/c sin exposición previa se usaron como células de respuesta y estimuladoras, respectivamente. Se utilizaron CD maduras (Cdm) derivadas de C57BL/6 o CD cocultivadas con MSC (CMM-CD) como células presentadoras de antígeno (CPA) (2 x 104/pocillo). En algunos experimentos, las CMM (2 x 104/pocillo) se sembraron en los pocillos con CDm (CDm CMM). Después de 3 días de cultivo, las células se pulsaron con 1 pCi [3H] timidina (Perkin Elmer, Waltham MA) durante 18 horas. Los resultados se expresan como recuento medio por minuto (cpm) de aumento relativo del que se restó la respuesta singénica.

Análisis de linfocitos T reguladores por citometría de flujo

Los esplenocitos de los receptores se recolectaron en el DPO 100 y se marcaron para CD4-FITC y CD25-PE de superficie, y FoxP3-PerCP intracelular (eBioscience). Los linfocitos T CD4+ de C57BL/6 (1 x 106/ml) y las CD CD11c+ derivadas de C57BL/6 (2 x 105/ml) se cultivaron conjuntamente con linfocitos T pan de Balb/c (2 x 106/ml) con o sin CMM (2 x 105/ml) en una proporción de 5 : 1 : 1 (T CD4 : CD : CMM). Después de 96 horas de incubación, los linfocitos T CD4+ se purificaron nuevamente y se marcaron para CD4, CD25 y FoxP3. Las concentraciones de L-quinurenina de los sobrenadantes se determinaron por ELISA (MyBioSource Inc., San Diego, CA).

Supervivencia del trasplante de islotes

Los ratones que recibieron trasplantes de células de islotes tratados con anticuerpos de control de isotipo rechazaron el trasplante con un tiempo medio de supervivencia (TMS) de 7 días, lo que demuestra la fuerte respuesta inmune a los islotes completamente incompatibles con el MHC después de la inyección intraportal. El trasplante conjunto con las CMM receptoras produjo un tiempo medio de supervivencia de 8,83 días (Figura 1A). En el grupo tratado solo con CTLA4Ig, 2 de 6 ratones fueron normoglucémicos a 100 días (TMS = 45,8 días). En el grupo tratado con CTLA4Ig y anti-CD40L, 5 de 9 receptores lograron una supervivencia del injerto a largo plazo de 100 días (TMS = 65,9 días). Cuando se trataron con CMM y CTLA4Ig, el TMS fue de 82,4 días con 4 de 5 supervivientes a 100 días. El cotrasplante de CMM prolongó la supervivencia del injerto de islotes en todos los receptores cuando se trató además con bloqueo de coestimulación en forma de CTLA4Ig y anti-CD40L (TMS >100 días). Se obtuvieron resultados muy similares al tratar a los animales con CMM anti-CD40L anti-LFA1 y con CMM CTLA4-Ig anti-LFA1. Este aumento en la supervivencia del injerto fue significativo en comparación con todos los otros grupos de tratamiento (Figura 1B). Para evaluar la función del injerto, se realizaron ^tT^gIP un mes después del trasplante. Los receptores tratados con CMM, CTLA4Ig y anti-CD40L tuvieron TTGIP significativamente mejores en comparación con los grupos que recibieron solo el bloqueo de coestimulación a los 90 minutos (p <0,05) (Figura 1C). El TTGIP fue equivalente en el grupo de las CMM, CTLA4Ig y anti-CD40L para ratones no trasplantados sin tratamiento previo a los 90 minutos. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, es posible utilizar solo un agente que inhiba las señales coestimuladoras (por ejemplo, cualquiera de CTLA4-Ig, anti-CD40L o anti-LFA1) pero puede ser preferible usar al menos dos agentes que inhiban las señales coestimuladoras (por ejemplo, cualquier combinación de CTLA4-Ig, anti-CD40L y anti-LFA1).

Los islotes productores de insulina se pueden encontrar en los diferentes grupos receptores en ratones con niveles normales de glucosa a los 100 días después del trasplante (Figura 2). Los receptores tratados con CTLA4Ig y anti-CD40L que habían sobrevivido hasta 100 días después del trasplante, tenía un número equivalente de linfocitos CD4+ y CD8+ infiltrantes en el hígado, pero solo unas pocas tinciones positivas para Foxp3 (Figura 2). En ratones tratados con CMM y CTLA4Ig, se observó una infiltración similar de linfocitos T CD4+ y CD8+, pero hubo más células Foxp3+ encontradas en el hígado de los receptores tratados con CTLA4Ig, anti-CD40L. En el grupo que recibió tratamiento con CMM, CTLA4Ig y anti-CD40L, se pudo encontrar muy poco infiltrado linfocítico con la excepción de las células Foxp3 detectadas alrededor de los islotes.

Para estudiar la presencia de respuestas de anticuerpos anti-donante, los linfocitos T pan de Balb/c se expusieron a sueros y luego se tiñeron con anti-IgG. Los receptores tratados con bloqueo de coestimulación y los receptores tratados con CMM y bloqueo de coestimulación tenían significativamente menos anticuerpos anti-donantes en comparación con los receptores control y los tratados con CMM (Figura 3A). La intensidad de fluorescencia media (IFM) fue equivalente a la encontrada en ratones sin tratamiento previo, lo que indica que la activación de linfocitos B no se había producido a un nivel sustancial en estos receptores. Los receptores tratados con CMM y bloqueo de coestimulación mostraron una tinción menos positiva de las células de Balb/c que el grupo de bloqueo de coestimulación (Figura 3B).

Respuestas de linfocitos T y aumento de linfocitos T CD4+CD25+Foxp3+

Los esplenocitos de ratones que recibieron CTLA4Ig y anti-CD40L con o sin CMM (159,9 ± 43,8 o 164,1 ± 63,2 %) tuvieron respuestas alorreactivas significativamente reducidas en comparación con el control (513,5 ± 190 %) a los 30 días. Este efecto se observó incluso si los receptores fueron tratados solo con CMM (240,7 ± 105,8 %, p <0,05) (Fig. 3C). A los 100 días, los receptores tratados con CTLA4Ig y anti-CD40L indujeron significativamente más respuestas alorreactivas que los de sin tratamiento previo (solo CTLA4Ig: 242,6 ± 70,3, CTLA4Ig mAb anti-CD40L: 253,3 ± 124,5 %, p < 0,05). Sin embargo, las CMM combinadas con los grupos tratados con bloqueo de coestimulación tuvieron respuestas alorreactivas reducidas y no hubo diferencias significativas en comparación con las de sin exposición previa (Figura 3D). Además, los receptores tratados con CMM, CTLA4Ig y anti-CD40L (122,3 ± 22,8 %) habían reducido significativamente la proliferación de linfocitos T alorreactivos en comparación con los receptores tratados con CTLA4Ig y anti-CD40L (p <0,01) (Figura 3D). Se obtuvieron resultados similares a los de CMM, CTLA4Ig y anti-CD40L al evaluar las siguientes combinaciones: CMM anti-CD40L anti-LFA1 y CMM CTLA4Ig anti-LFA1.

Para caracterizar la población de linfocitos T en diferentes grupos receptores, se aislaron esplenocitos y LIH a los 30 días después del trasplante. Estos linfocitos se cultivaron con esplenocitos de Balb/c sin tratamiento previo y se midió la actividad de IFN. Los esplenocitos de receptores tratados con CTLA4Ig y anti-CD40L con o sin CMM (actividades de 24,3 ± 19,7 o 26,8 ± 9,8, respectivamente) mostraron una producción significativamente menor de IFNy en comparación con el control de isotipo o los receptores tratados solamente con CMM (actividades de 257,6 ± 128,2 o 180,0 ± 49,7, respectivamente) (p <0,01 o p < 0,05) (Figura 4A). La actividad de los LIH productores de IFNy de los receptores con CTLA4Ig y anti-CD40L con o sin CMM (actividades de 1,5 ± 2,6 o 0,6 ± 3,1) fue significativamente menor que la de los receptores de control (268,8 ± 144,8, p <0,05) y los tratados con CMM (249 ± 176) (Figura 4B). La frecuencia de los linfocitos T CD4+CD25+Foxp3+ en el bazo se evaluó el DPO 100. Los receptores tratados con CMM, CTLA4Ig y anti-CD40L (6,0 ± 2,3 %) y CMM y CTLA4Ig solamente (7,0 ± 1,0 %) tuvieron significativamente más linfocitos T CD4+CD25+Foxp3+ en comparación con los ratones que recibieron solo CTLA4Ig y anti-CD40L (3,3 ± 0,9 %, p < 0,01 o p <0,05) (Figura 4C).

Expresión intrahepática de IDO, TGFB, Insulina y Foxp3

Los niveles de ARNm de IDO en hígados injertados en islotes de ratones tratados con CMM, CTLA4Ig y anti-CD40L (1,25 ± 1,43) parecían ser más altos que los ratones que recibieron CTLA4Ig y anti-CD40L (0,48 ± 0,72) en el DPO 100, pero no fueron estadísticamente significativos (Figura 5A). La expresión de ARNm de IDO en los otros grupos fue insignificante. Los niveles de expresión de ARNm de TGFp se incrementaron significativamente en el DPO 100 en todos los receptores de injerto funcionales a largo plazo en comparación con el DPO 30 en todos los grupos (Figura 5B). Para estimar la masa funcional de injerto de islote, se midieron los niveles de ARNm de Ins2 en los hígados. Solo cuando CTLA4Ig y anti-CD40L se combinaron con CMM (1,0 ± 0,85 x10-3) los receptores mantuvieron niveles de Ins2 significativamente más altos que aquellos que recibieron anticuerpos de control (0,0002 ± 3,79E-5 x10-3) o solo CMM (0,0002 ± 0,0002 x10-3, p < 0,05). La expresión de ARNm de Ins2 en el grupo de CMM, CTLA4Ig y anti-CD40L disminuyó gradualmente, pero fue significativamente mayor que el grupo de CTLA4Ig y anti-CD40L a los 100 días (0,33 ± 0,11 x10-3 frente a 0,16 ± 0,17 x10-3, p < 0,05) (Figura 5C). La combinación de c Mm , CTLA4Ig y anti-CD40L (0,3 ± 0,26) aumentaron los niveles de transcripción de Foxp3 más que CTLA4Ig y anti-CD40L (0,09 ± 0,12), pero no se alcanzó la significación estadística (Figura 5D).

Las CMM atenúan la maduración de CD

Para determinar los posibles mecanismos subyacentes a la función inmunomoduladora de las CMM en CD, se examinó el efecto directo de las CMM en la maduración de las CD. El análisis FACS mostró que la expresión de CD86 y MHC de clase II se reguló significativamente (p <0,05) de forma dependiente de la dosis en CD cocultivadas con CMM (CMM-CD) en comparación con CD maduras (CDm) (Figura 6A). Por el contrario, la expresión de CD80 en CMM-CD se reguló significativamente en comparación con las CDm, lo que sugiere que la maduración de las CD se vio afectada por las CMM.

Para evaluar la función de las CD, Las RLM se realizaron con linfocitos T CD4+ sin tratamiento previo de C57BL/6 y linfocitos T pan sin tratamiento previo de Balb/c en presencia de CDm o CMM-CD. La proliferación de linfocitos T se suprimió significativamente cuando las CDm se cultivaron conjuntamente con CMM (142,6 ± 176,1) en comparación con las CDm (6960,7 ± 2276,9) o CMM-CD (4613,1 ± 1268,1) (p <0,01: Figura 6B). La adición de CTLA4Ig y anti-CD40L disminuyó significativamente la proliferación cuando se agregó a las CDm y cuando se añadió a las CMM-CD. Cuando las CD maduras (CDm) se cultivaron con CMM, la proliferación de linfocitos T fue completamente anulada independientemente de la presencia de bloqueo de coestimulación.

Además, se observó un mayor número de linfocitos T CD4+CD25+Foxp3+ en RLM con linfocitos T CD4+ cocultivados con CDm y CMM que en RLM cocultivados con CDm o CMM-CD, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 6C). La actividad de IDO en RLM también se examinó mediante la cuantificación de los niveles de quinurenina en el sobrenadante de cultivo. Los niveles de quinurenina en el sobrenadante fueron significativamente mayores con CDm cultivadas con CMM (6580 ± 4234 pg/ml) que con CDm (17,3 ± 30,0 pg/ml) o CMM-CD (19,9 ± 27,9 pg/ml) solo en presencia de CTLA4Ig y anti-CD40L (p <0,05) sugieren un efecto sinérgico de combinar el bloqueo de coestimulación con el cocultivo de CMM en el nivel de actividad IDO (Figura 6D).

Tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino

Los ratones Balb/c reciben sensibilización y luego infusión rectal de TNBS. Los ratones se asignaron al azar al tratamiento con anti-LFA-1, CTLA4Ig y anti-CD40L, solo anti-LFA-1, CTLA4Ig y solo anti-CD40L, anticuerpos de control de isotipo solamente o con CMM y bloqueo de coestimulación (CMM CTLA4Ig, CMM CTLA4Ig anti-LFA-1, CMM anti-LFA-1, CMM CTLA4Ig anti-LFA-1 anti-CD40L, CMM anti-CD40L, CMM anti-CD40L anti-LFA1, CMM anti-CD40L CTLA4Ig) durante la primera semana después de la sensibilización. Se sigue a los ratones durante seis semanas y se pesan diariamente. Luego se sacrifican los ratones y se analizan los intestinos para determinar el grado de inflamación. La Figura 8 muestra una tabla que comprende el análisis inmunohistoquímico realizado para estudiar el número de linfocitos T CD4+ y CD8+, así como macrófagos y neutrófilos. El número de linfocitos T reguladores CD4+CD25+foxp3+ también se cuantifica.

Trasplante de corazón en modelo de ratones C57BL/6

Los ratones C57BL/6 se trasplantaron con corazones de Balb/c no compatibles con MHC y se trataron con IgG humana de control, CTLA4Ig, CMM, o una combinación de CMM y varios polipéptidos que inhiben la coestimulación. El tratamiento con solo CMM no tuvo efecto en la prevención del rechazo de aloinjerto cardíaco. El tratamiento con CTLA4Ig indujo una prolongación significativa de la supervivencia del aloinjerto con un tiempo medio de supervivencia de 25 días. El tratamiento con terapia de CMM combinada con (i) CTLA4Ig, (ii) CTLA4Ig y anti-LFA1, y (iii) CTLA4Ig, anti-LFA1 y anti-CD40L indujeron supervivencia indefinida del aloinjerto en cuatro de los cinco receptores (Figura 9). Un receptor produjo rechazo a los 88 días después del trasplante. Estos resultados implican que existe un efecto potenciador de combinar las CMM con al menos un inhibidor de la señalización coestimuladora.

Tratamiento de la artritis derivada del colágeno

Se inmunizaron ratones C57BL/10Q mediante inyección subcutánea (s.c.) en la base de la cola con 100 microgramos de colágeno tipo II (CII) de rata emulsionados en un volumen igual de adyuvante de Freund a una concentración final de 2 mg/ml. Después de 21 días, los ratones recibieron una inyección de refuerzo cerca de la primera inyección con 50 microgramos de CII de rata. La gravedad de la enfermedad fue seguida por una puntuación clínica cada cinco días a partir del quinto día después de la inmunización. Los receptores fueron aleatorizados para recibir control de IgG humana o CTLA4ig (500 microgramos) el día 0, 2, 4, 6 después de la inmunización y/o CMM derivada de 2x106 de médula ósea de ratones C57BL/10Q el día de la inmunización. El tratamiento con CTLA4Ig o CMM tuvo un efecto intermedio en la reducción de la puntuación media de artritis durante un seguimiento de 60 días. El tratamiento con CMM y CTLA4Ig llevó a una reducción significativa en la puntuación media de artritis en todos los puntos de temporales observados a los 30 días y posteriormente (Figura 10).

Tratamiento del infarto de miocardio

Se estudió el efecto de la terapia con células positivas para Isl1 en combinación con el triple bloqueo de coestimulación (es decir, CTLA4Ig anti-CD40L anti-LFA1) sobre la función y dimensión del ventrículo izquierdo después del infarto de miocardio. Las ratas (N = 8) tratadas con una combinación de células mesenquimales Isl1 (es decir, células mesenquimales positivas para Isl1) y bloqueo de coestimulación (cuadrados grises) se compararon con un grupo de control con placebo (N = 8) (círculos negros). Antes y después de la operación no hubo diferencias significativas en el diámetro diastólico del extremo ventricular izquierdo (DDEVI) o la fracción de eyección (FE) entre los dos grupos. Después de 1 y 6 semanas, el DDEVI se redujo significativamente en el grupo tratado con una combinación de células mesenquimales positivas para Isl y bloqueo de coestimulación, mientras que al mismo tiempo la FE había mejorado hacia el nivel preoperatorio. La eficacia terapéutica también se observó con una combinación de la población de CMM y CTLA4Ig y anti-CD40L. Datos presentados como media ± DT. En figura: *p <0,05.

Discusión

La presente invención demuestra que combinando la administración de CMM con CTLA4-Ig y al menos un inhibidor exógeno adicional de la señal o señales coestimuladoras se puede lograr un efecto inmunomodulador complementario y potenciado, que puede explotarse en una gran cantidad de trastornos inflamatorios y/o autoinmunes, y en entornos de trasplante y relacionados con el trasplante. Las CMM como monoterapia pueden no tener siempre efectos suficientes sobre la supervivencia del injerto y sobre diferentes trastornos inflamatorios, mientras que la combinación de CMM, CTLA4-Ig y al menos un inhibidor de coestimulación adicional (por ejemplo, anti-CD40L, anti-LFA1, etc.) produce efectos terapéuticos altamente eficaces.

Como un ejemplo no limitante basado en los experimentos de trasplante de islotes descritos anteriormente, CTLA4Ig combinado con anti-CD40L indujo normoglucemia a largo plazo en 5 de 9 receptores, pero muchos tenían un control de glucosa inestable. La combinación de CTLA4Ig con CMM produjo supervivencia a largo plazo del injerto en la mayoría de los receptores, la presencia de linfocitos T Foxp3+ alrededor de los injertos de islotes, redujo la IFNy tras la reexposición al antígeno del donante y aumentó los números de linfocitos T reguladores en el bazo. La expresión de TGFp e insulina estaba significativamente regulada positivamente en el hígado receptor.

La adición de CMM a CTLA4Ig y anti-CD40L (o anti-CD40L y anti-LFA1, o anti-LFA1 y CTLA4Ig) conduce a la normoglucemia y a la supervivencia indefinida del injerto en todos los receptores. Cuando la función del injerto se probó con TTGIP, estos receptores demostraron un mejor control de la glucosa y tenían niveles de glucosa en sangre similares a los de los ratones sin trasplante ni tratamiento previo. El análisis histológico de estos receptores mostró bajos niveles de infiltrados linfocíticos. Las células que estaban presentes eran CD4+ y expresaron Foxp3. No se encontraron infiltrados de CD8+ en los hígados de estos receptores. Los niveles de IgG anti-donante fueron más bajos en estos ratones en comparación con los receptores que recibieron solo bloqueo de coestimulación, lo que indica un aumento de la inhibición de las respuestas de linfocitos B. Los esplenocitos de estos receptores cuando se cultivaron conjuntamente con el antígeno del donante demostraron una proliferación reducida tanto a los 30 como a los 100 días, lo que implica que la respuesta inhibida de los linfocitos T se mantuvo a largo plazo. Los esplenocitos y los LIH de estos donantes expresaron niveles bajos de IFNy cuando se expusieron al antígeno del donante, lo que indica una respuesta atenuada por los linfocitos que recuerdan las respuestas de los linfocitos T observadas en individuos tolerantes. La citometría de flujo de esplenocitos demostró un aumento significativo en el número de linfocitos CD4+Foxp3+ y Foxp3+CD25+, lo que indica que el número de linfocitos T reguladores aumentó en los receptores que recibieron bloqueo de coestimulación y CMM. La expresión de ARNm de IDO, TGFp y Foxp3+ tuvo una tendencia hacia una mayor expresión en los hígados de los receptores tratados con la combinación de bloqueo de coestimulación y CMM.

Para estudiar el efecto de las CMM en las CD, las células fueron cocultivadas y se estudió la expresión de moléculas coestimuladoras y del MHC de clase II. La exposición a un gran número de CMM redujo la expresión de CD86 y aumentó los niveles de CD80, lo que indica que las CD tenían un fenotipo como de CD inmadura. Cuando las CMM se cultivaron con CD maduras, la proliferación de linfocitos T fue abrogada casi por completo. La adición del bloqueo de coestimulación redujo la proliferación de linfocitos T cuando se expuso a CD cocultivadas con CMM, lo que indica un efecto aditivo de esta combinación. Al estudiar los sobrenadantes de estas RLM, se descubrió que un nivel aumentado de quiurenina implicaba una actividad IDO sustancial y una posible modulación inmune por parte de las CMM y CD.

Las CMM pueden mejorar los resultados en los trasplantes singénicos al reducir la inflamación y mejorar la angiogénesis. Es muy probable que estos procesos funcionen en los experimentos demostrados anteriormente porque la inflamación y la inmunidad no son dos fenómenos separados sino que están unidos integralmente. Una reducción de la inflamación puede conducir posteriormente a una reducción en la activación de CD y la activación inmune. Sin embargo, estos estudios sugieren que las CMM también están afectando directamente la maduración de las CD.

El bloqueo de coestimulación, limitando la disponibilidad de moléculas coestimuladoras, lleva a la población de linfocitos T reactivos a interpretar las interacciones con las CD como si estuviera en contacto de células con una CD tolerogénica o inmadura. Esta interacción conduce a una respuesta anérgica y a la conversión periférica de los linfocitos T en linfocitos T reguladores. Las CMM tienen la capacidad de modular la diferenciación de CD en una CD tolerogénica o inmadura con el consiguiente efecto de que la CD induce linfocitos T reguladores. De esta manera, tanto el bloqueo de coestimulación como las CMM convergen en la maduración de las CD y en cómo los linfocitos T las perciben. Las CMM también son capaces de inducir directamente los linfocitos T reguladores mediante la degradación del triptófano y la producción de metabolitos de quinurenina. El catabolismo del triptófano es una vía inmunorreguladora que el bloqueo de coestimulación y las CMM también tienen en común. Una de las principales vías en las que CTLA4Ig induce la generación de linfocitos T reguladores es a través de la producción de IDO por CD después de unirse a B7 en la superficie de las CD. La sinergia observada en este modelo entre la infusión de CMM y el bloqueo coestimulador podría deberse en parte al aumento de la actividad de IDO por parte del MSC y al bloqueo de coestimulación de las CD manipuladas que trabajan en concierto.

La presente invención demuestra claramente la amplia utilidad de combinar las CMM (preferentemente CMM que han sido validadas para la capacidad inmunomoduladora), CTLA4-Ig y al menos un inhibidor de coestimulación adicional (por ejemplo, anti-LFA1, anti-CD40L, anti-CD40, etc.) en varios entornos de trasplante, en autoinmunidad y en inflamación. Los presentes inventores han descrito con anterioridad la aplicación exitosa de esta modalidad combinatoria también en el trasplante cardíaco, en el tratamiento del infarto de miocardio, el tratamiento del SII, en el tratamiento de la artritis reumatoide, etc.

CTLA4Ig recibió recientemente la aprobación de la FDA como terapia de mantenimiento para trasplante renal. En la presente solicitud, se muestra una combinación de administración de CMM y bloqueo de coestimulación (es decir, la administración de al menos un agente que inhibe al menos una señal coestimuladora) para potenciar los efectos inmunomoduladores de la inhibición de coestimulación en una serie de enfermedades autoinmunes donde las terapias de coestimulación ya se están estudiando individualmente. La combinación de bloqueo de coestimulación (es decir, al menos un agente que inhibe la(s) señal(es) coestimuladoras) con las CMM puede usarse para inhibir las respuestas inmunes en diversos entornos diferentes, para inducir linfocitos T reguladores (positivos para FoxP3) (tanto in vitro como in vivo), y para tratar numerosas enfermedades inmunomediadas y, en consecuencia, podrían tener implicaciones fundamentales para el campo de la medicina regenerativa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende i) una población de CMM (células madre mesenquimales), ii) el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig, y iii) al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos.

2. La composición según la reivindicación 1, en donde el al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional se selecciona del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L y anti-LFA1, y cualquier combinación de los mismos.

3. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el al menos un inhibidor de coestimulación exógeno tiene una semivida en el cuerpo humano de al menos 2 días, preferentemente 5 días.

4. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición comprende además al menos un trasplante terapéutico en forma de una célula, un tejido y/o un órgano.

5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la población de CMM, el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig y el al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional están presentes en la misma composición o en composiciones separadas.

6. Una composición farmacéutica que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición farmacéutica según la reivindicación 6 para su uso como un medicamento.

8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición farmacéutica según la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de diabetes de tipo I, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, ELA, hepatitis autoinmunitaria, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), enfermedad de injerto contra huésped (EICH), insuficiencia renal, enfermedades renales autoinmunes, insuficiencia hepática, enfermedades hepáticas autoinmunes, artritis reumatoide, enfermedad de Parkinson, trasplante de células hematopoyéticas, LES, enfermedad de Alzheimer, arteriosclerosis, enfermedades inflamatorias crónicas o agudas, artritis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia cardíaca poscardiotomía, enfermedades alérgicas de la piel o de las vías respiratorias, vasculitis autoinmunitaria, rechazo de trasplante de células de islote, rechazo de trasplante de páncreas, rechazo de trasplante de riñón, rechazo de trasplante de células renales, rechazo de trasplante de hígado, rechazo de trasplante de hepatocitos, rechazo de trasplante de corazón, rechazo de trasplante de células cardíacas, rechazo de trasplante de piel, rechazo de trasplante de dermatocitos u otras enfermedades, trastornos y afecciones similares o relacionadas.

9. Una combinación que comprende i) una población de CMM, ii) el inhibidor de coestimulador exógeno CTLA4Ig, y iii) al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos, para su uso en la supresión y/o la modulación del sistema inmunitario.

10. Un artículo de fabricación que comprende una pluralidad de vasos, en donde un primer vaso comprende una población de CMM y al menos un vaso posterior comprende el inhibidor de coestimulación exógeno CTLA4Ig y al menos un inhibidor de coestimulación exógeno adicional seleccionado del grupo que comprende anti-CD40, anti-CD40L, anti-B7.1, anti-B7.2, anti-LFA1, anti-ICAM-1, anti-CD27/CD70, anti-OX40/OX40L, anti-41BB/41BBL, anti-VLA4 y anti-VCAM, y cualquier combinación de los mismos.

11. El artículo de fabricación según la reivindicación 10, que comprende además un vaso posterior que comprende al menos un trasplante terapéutico en forma de una célula, un tejido y/o un órgano.

12. El artículo de fabricación según cualquiera de las reivindicaciones 10-11 para uso en medicina.