ES2302811T3 - Procedimiento para proteger transplantes de islotes alogenicos usando moleculas mutantes soblules ctla4. - Google Patents

Procedimiento para proteger transplantes de islotes alogenicos usando moleculas mutantes soblules ctla4. Download PDF

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Abstract

Uso de una molécula mutante de CTLA4 soluble en la fabricación de un medicamento para inhibir el rechazo de trasplante de células de islotes, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble comprende dominio extracelular mutado de CTLA4, teniendo el dominio extracelular mutado de CTLA4 a) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 3. o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 3; b) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19; c) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20; d) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21; o

Description

Procedimiento para proteger transplantes de islotes alogénicos usando moléculas mutantes solubles CTLA4.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al campo de inhibición de transplante de las células de los islotes. En particular, la invención se refiere a los procedimientos para tratar diabetes, incluyendo diabetes de tipo 1 y tipo 2, mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de moléculas mutantes CTLA4.
Antecedentes de la invención
El transplante de órganos ha surgido como un procedimiento preferido de tratamiento de muchas formas de enfermedades que amenazan la vida que implican daño de órganos. Se han logrado resultados mejorados en el transplante clínico principalmente hasta del desarrollo de cada vez más fármacos potentes inmunosupresores no específicos que inhiben las respuestas del rechazo (Lancet, 345: 1321 - 1325 (1995)). Mientras los resultados a corto plazo han mejorado, los éxitos a largo plazo son inadecuados. Actualmente, los agentes inmunosupresores de larga vida se requieren para combatir el rechazo crónico del órgano trasplantado, y el uso de estos agentes incrementa de manera notable los riesgos de enfermedad cardiovascular, infecciones y malignidades.
El desarrollo de las estrategias para promover la aceptación de tejidos alogénicos sin la necesidad de inmunosupresión crónica puede reducir el riesgo de estas complicaciones de riesgo para la vida, y en gran medida extienden la aplicación de trasplante de órganos, tejido y celular para enfermedades tales como hemoglobinopatías, inmunodeficiencias genéticas, y enfermedades autoinmunes.
La diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) es uno de los trastornos metabólicos que se produce más frecuentemente en el mundo. En los Estados Unidos IDDM afecta aproximadamente a una de 300 a 400 personas, y los estudios epidemiológicos sugieren que la incidencia de IDDM está continuamente incrementándose. La IDDM está provocada por una respuesta inmune que da como resultado la destrucción mediada por los linfocitos T de las células de los islotes que producen insulina del páncreas.
Una vez que los síntomas clínicos de la IDDM se han hecho evidentes, la terapia más comúnmente empleada para controlar los síntomas clínicos de IDDM es el reemplazo exógeno de insulina. Aunque la terapia de reemplazo de insulina permite que la mayoría de los pacientes de IDDM lleven algo de vida normal, no reestablece completamente la homeostasis metabólica, y como resultado, son comunes graves complicaciones incluyendo disfunciones del ojo, riñón, corazón, y otros órganos en pacientes diabéticos que se someten a terapia de reemplazo de insulina.
Un tratamiento a largo plazo para los pacientes de IDDM es el trasplante de los islotes. Sin embargo, las células de los islotes trasplantadas que producen insulina se destruyen a menudo rápidamente mediante la misma respuesta inmune que previamente destruía las propias células de los islotes de los pacientes. De los 260 aloinjertos trasplantados desde 1990, solamente el 12,4% daban como resultado independencia de insulina durante períodos de más de una semana, y solamente un 8,25% han sido independientes de insulina durante períodos de más de un año (Linsley et al. Diabetes (1997) 46: 1120 - 3). En la mayoría de estos procedimientos, el régimen de base de la inmunosupresión consistía de la inducción de anticuerpos con una inmunoglobulina anti linfocito combinada con ciclosporina, azatiprina, y glucocorticoides.
Para cualquier tipo de procedimiento de trasplante, un equilibrio entre la eficacia y toxicidad es un factor clave para su aceptación clínica. Con respecto al trasplante de islotes, un asunto adicional es que muchos de los agentes inmunosupresoers actuales con glucocorticoides particulares o un inhibidor de la calcineurina, tal como Tarcolimus, lesión de las células beta o inducen resistencia a insulina (Zeng et al. Surgery (1993) 113: 98 - 102).
Un protocolo de inmunosupresores sin esteroides ("Protocolo Edmonton") que incluye sirolimus, Tarcolimus de dosis baja, y un anticuerpo monoclonal (mAb) contra el receptor de IL-2 se ha usado en un ensayo de trasplante de islotes solo para pacientes con diabetes de tipo 1 (Shapiro, A.M.J. et al, (2000), N. Eng. J. Med, 343: 230 - 238).
El éxito reciente que usa "Protocolo Edmonton" tiene un entusiasmo renovado para el uso de de trasplante de islotes para tratar diabetes. Sin embargo, los asuntos con relación a la toxicidad del Tarcolimus puede limitar la aplicación de esta terapia en seres humanos. Los agentes biológicos que bloquean las señales coestimuladoras de las células T claves en particular la ruta de CD28, son alternativas potenciales para proteger los islotes alogénicos. Los ejemplos de los agentes que bloquean la ruta de CD28 incluyen pero no se limitan a CTLA4 soluble incluyendo moléculas mutantes de CTLA4.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere al uso de una molécula mutante de CTLA4 en la fabricación de un medicamento para inhibir el rechazo de trasplante de células de islotes, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble comprende un dominio extracelular mutado de CTLA4, teniendo el dominio extracelular mutado de CTLA4
a) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +124 como se muestra en la Figura 3, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 3;
b) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19;
c) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20;
d) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21; o
e) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 22, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 22.
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La presente invención también se refiere a una molécula mutante de CTLA4 soluble para uso en la inhibición de del rechazo de trasplante de de células de islotes, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble es como se ha definido anteriormente.
De acuerdo con una realización particular de la invención, el trasplante de las células de los islotes es para tratar diabetes, en particular, la diabetes de tipo 1 o diabetes de tipo 2. El trasplante de células de islotes puede comprender células de islotes encapsuladas.
La inhibición de rechazo de trasplante de células de islotes puede comprender la administración de la molécula mutante de CTLA4 soluble antes, durante o después del trasplante de células de islotes.
De acuerdo con una realización particular de la invención, el dominio extracelular de CTLA4 está condensado a un resto no CTLA4, el resto no CTLA4 que comprende un resto de inmunoglobulina, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o parte de la misma tal como una que comprende una o más mutaciones para reducir la función del efector. La región constante de inmunoglobulina también puede comprender las regiones bisagra CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina. Además, la región constante de inmunoglobulina o parte de la misma puede ser una región constante de inmunoglobulina humana o de mono.
De acuerdo con una realización particular de la invención, la molécula mutante de CTLA4 soluble es:
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a) L104EA29YIg como se muestra en la Figura 3 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:6, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383);
b) L104EIg como se muestra en la Figura 19 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:8, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383);
c) L104EA29LIg como se muestra en la Figura 20 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:10, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383);
d) L104EA29TIg como se muestra en la Figura 21 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:12, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383; o
e) L104EA29WIg como se muestra en la Figura 22 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:14, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383).
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De acuerdo con una realización particular de la invención, la molécula mutante de CTLA4 soluble y al menos un compuesto adicional son para ello. El compuesto adicional se puede seleccionar entre el grupo constituido por compuestos inmunosupresores, compuestos inmunomoduladores y compuestos antiinflamatorios. En particular, el compuesto se puede seleccionar entre el grupo constituido por anakinra, adrenocorticosteroides, azatioprina, basiliximab, inhibidores de calcineurina, cloroquina, corticosteroides, ciclosporina, prednisona, ciclofosfamida, citoxan, 15-deoxispergualina y sus análogos, D-penicilamina, etanercept, acetato de glatiramer, FTY720 y sus análogos, glucocorticoides, sales de oro, globulina de timocitos anti-humana de caballo (ATGAM), anti-TAC (HAT) humanizado, hidroxicloroquina, infliximab, interferón beta-1a, interferón beta-1b, leflunomida y sus análogos, globulina inmune de linfocitos, agentes buscadores de linfocitos, metoxsalen, metotrexato, clorhidrato de mitoxantrona, ácido micofenólico, micofenolato mofetil, mizoribina, NSAIDs, globulina de timocitos anti-humano de conejo, globulina inmune Rho (D), sirolismus (rapamicina) y sus derivados (por ejemplo 40-0-(2-hidroxi)etilrapamicina), sulfasalazopirina, sulfasalzinae, tacrolismus (FK-506), talidomida, bloqueadores de TNF\alpha y agentes biológicos que que dirigen una citoquina inflamatoria, inhibidores TOR, compuestos que interfieren con CD40 y CD154, gp39 soluble, CD29 soluble, CD40 soluble, CD80 soluble (por ejemplo ATCC 68627), CD86 soluble, CD28 soluble, CD56 soluble, Thy-1 soluble, CD3 soluble, TCR soluble, VLA-4 soluble, VCAM-1 soluble, LECAM-1 soluble, ELAM-1 soluble, CD44 soluble, anticuerpos reactivos con gp39 (por ejemplo ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 y ATCC HB-12056), anticuerpos reactivos con CD40 (por ejemplo ATCC HB-9110), anticuerpos reactivos con B7 (por ejemplo ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341), anticuerpos reactivos con CD28 (por ejemplo ATCC HB-11944 o mAb 9.3), anticuerpos reactivos con LFA-1 (por ejemplo ATCC HB-9579 y ATCC TIB-213), anticuerpos reactivos con LFA-2, anticuerpos reactivos con IL-2, anticuerpos reactivos con IL-12, anticuerpos reactivos con IFN-gamma, anticuerpos reactivos con CD2, anticuerpos reactivos con CD48, anticuerpos reactivos con cualquier ICAM (por ejemplo, con ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 y ICAM-3), anticuerpos reactivos con CTLA4 (por ejemplo ATCC HB-304), anticuerpos reactivos con Thy-1, anticuerpos reactivos con CD56, anticuerpos reactivos con CD3, anticuerpos reactivos con CD29, anticuerpos reactivos con TCR, anticuerpos reactivos con VLA-4, anticuerpos reactivos con VCAM-1, anticuerpos reactivos con LECAM-1, anticuerpos reactivos con ELAM-1, anticuerpos reactivos con CD44, anticuerpos monoclonales a receptores de leucocitos, por ejemplo MHC, CD2, CD3, CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB o sus ligandos, CTLA4/CD28-Ig; antagonistas de LFA-1, antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4 y mAbs de IL-2R anti-humanos. La molécula mutante de CTLA4 soluble y el compuesto adicional se puede administrar conjuntamente, administrar de manera simultánea o en secuencia.
De acuerdo con una realización particular de la invención, la inhibición del rechazo de trasplante de células de islotes comprende un régimen inmunosupresor adicional. El régimen inmunosupresor adicional puede ser sin glucocorticoide o comprender un corticosteroide. De acuerdo con una realización de la invención, el régimen inmunosupresor adicional es sin inhibidor de calcineurina.
En particular, el régimen inmunosupresor adicional puede comprender uno o más de los compuestos anteriores a usar en combinación con la molécula mutante de CTLA4 soluble. Puede comprender un inhibidor de TOR, por ejemplo, rapamicina (sirolismus) o su derivado, y/o un agente biológico que dirige IL-2, por ejemplo, un anticuerpo reactivo con IL-2 o un mAb de IL-2R anti-humano tal como basiliximab; ácido micofenólico o micofenolato mofetil; o un compuesto que interfiere con la unión de CD40 a CD154, por ejemplo un anticuerpo anti-CD40 o un anticuerpo anti-CD154.
De acuerdo con una realización particular de la invención, la inhibición del rechazo de trasplante de células de islotes comprende la administración de células de médula ósea agotadas de células T. La administración de células de médula ósea agotadas de células T puede ser a aproximadamente el mismo tiempo que la colocación del trasplante de células de islotes o antes de la colocación del trasplante de células de islotes. La administración de las células de médula ósea agotadas de células T puede comprender una primera dosis y una segunda dosis.
Las moléculas mutante de CTLA4 solubles de la invención se unen a moléculas CD80 y/o CD86 sobre células positivas CD80 y/o CD86, inhibiendo por lo tanto las moléculas endógenas CD80 y/o CD86 a partir de la unión a CTLA4 y/o CD28 sobre las células T, y de este modo, bloquear las señales coestimuladoras de las células T clave T, en particular la ruta de CD28.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO.: 1) y de aminoácidos (SEQ ID NO.: 2) completa para el receptor de CTLA4 humano condensado al péptido de señal M de oncostatina. El péptido de señal M de oncostatina está indicado en la posición -25 a -1.
La Figura 2 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ m NO.: 3) y de aminoácidos (SEQ ID NO.: 4) de una CTLA4Ig que tiene un péptido de señal; una secuencia de aminoácidos de tipo salvaje del dominio extracelular de CTLA4 que comienza en metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, o que comienza en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; y una región de Ig.
La Figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO.: 5) y de aminoácidos (SEQ ID NO.: 6) de una molécula mutante de CTLA4 (L104EA29YIg) que comprende un péptido de señal; un dominio extracelular mutado de CTLA4 que comienza en metionina en la posición +1 y que termina en ácido aspártico en la posición +124, o que comienza en alanina en la posición -1 y que termina en ácido aspártico en la posición +124; y una región de Ig como se describe en el Ejemplo 1, más abajo.
La Figura 4 es un gráfico de líneas que ilustra el nivel de glucosa en plasma en ayunas en un sujeto normal, como se describe en el Ejemplo 3, más abajo.
La Figura 5 es un gráfico de líneas que ilustra el nivel de glucosa en plasma en sujetos pancreatectomizados con células de islotes pancreáticas trasplantadas como se describe en el Ejemplo 3. Los animales se trasplantaron con células de islotes el día 0, y o bien se trataron con un régimen inmunosupresor que contiene L104EA29YIg, y un régimen inmunosupresor de base (tratado), o solamente un régimen inmunosupresor de base (control). El régimen inmunosupresor de base contenía rapamicina y IL2R anti-humano.
La Figura 6 es un gráfico de líneas que ilustra el requerimiento de insulina en sujetos con células de islotes trasplantadas como se describe en el Ejemplo 3. Los animales se trasplantaron con células de islotes el día 0, y se trataron con un régimen inmunosupresor que contenía L104EA29YIg y un régimen inmunosupresor de base (tratado), o solamente un régimen inmunosupresor de base (control).
La Figura 7 es un gráfico de líneas que ilustra el nivel de glucosa en sangre en un ensayo de tolerancia a glucosa intravenosa antes y después del trasplante de islotes, como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 8 muestra un diagrama esquemático de un vector, piLN-L104EA29Y, que tiene la inserción
L104EA29YIg.
Las Figuras 9A y 9B ilustran los datos de los ensayos FACS que muestran la unión de L104EA29YIg, L104EIg, y CTLA4Ig a células CHO transfectadas CD80- o CD86 como se describe en el Ejemplo 2, más abajo.
Las Figuras 10A y 10B muestra la inhibición de la proliferación de células CHO CD80-positiva y CD86-positiva como se describe en el Ejemplo 2, más abajo.
Las Figuras 11A y 11B muestra que L104EA29YIg es más eficaz que CTLA4Ig en la inhibición de la proliferación de células T primarias y secundarias como se describe en el Ejemplo 2, más abajo.
Las Figuras 12A-C ilustran que L104EA29YIg es más eficaz que CTLA4Ig en la inhibición IL-2 (Fig. 12A), IL-4 (Fig. 12B), y producción de citoquinas de \gamma-interferon (Fig. 12C) de células T humanas aloestimuladas como se describe en el Ejemplo 2, más abajo.
La Figura 13 demuestra que L104EA29YIg es más eficaz que CTLA4Ig en la inhibición de la proliferación de células T de mono estimuladas con fitohemaglutinina- (FA) como se describe en el Ejemplo 2, más abajo.
Las Figuras 14A-C son gel de SDS gel (Fig. 14A) para CTLA4Ig (banda 1), L104EIg (banda 2), y L104EA29YIg (banda 3A); y cromatografías de exclusión de tamaño de CTLA4Ig (Fig. 14B) y L104EA29YIg (Fig. 14C).
Las Figuras 15A y 15B ilustran a un diagrama de bandas del pliegue de tipo V de Ig extracelular de CTLA4 generado a partir de la estructura de solución determinada por espectroscopía de RMN. La Fig. 15B muestra una vista expandida de la región S25-R33 y la región MYPPPY que indica la localización y orientación de la cadena lateral de las mutaciones que potencian la avidez, L104 y A29.
La Figura 16 muestra glucosa de sangre en ayunas para receptores tratados con LEA29YIg (A) y control (B) de islotes alogénicos (animales representativos) antes y después del trasplante. Todos los animales se sometieron a pancreastectomía quirúrgica al menos 2 semanas antes de del trasplante (requerimiento de insulina antes del trasplante medio de 8,76 \pm 0,18 unidades/día) (C) Después de la infusión intraportal de islotes alogénicos, los receptores rápidamente se hicieron euglicémicos que no requería un trasplante exógeno posterior de insulina. (D) La inducción de diabetes y función de los islotes después del trasplante se confirmó mediante el ensayo de tolerancia de glucosa intravenosa antes del trasplante 1 mes y 3 meses después del trasplante, como se describe en el Ejemplo 3, más abajo.
La Figura 17 muestra (A) la inmunohistología de islote trasplantado funcional confirmado mediante tinción positiva para insulin. (B) Islote de un animal que recibe régimen de control rodeado por infiltrado mononuclear, que indica rechazo, como se describe en el Ejemplo 3, más abajo.
La Figura 18 muestra la supresión de respuestas de células T- y B- anti-donante por el régimen L104EA29Y. (A) la respuesta de IFN-\gamma-ELISpot anti-donante corresponde al programa de rechazo en los controles. (\sim 1 semana después del trasplante). (B) el régimen L104EA29Y suprime de manera eficaz la generación de respuesta de células T anti-donante. (C) los animales que reciben mAb anti-IL-2R de rapamicina rápidamente producen anticuerpo anti-donante detectable, como se mide por procedimientos citométricos de flujo en el momento del rechazo. (D) los receptores de islotes que reciben el régimen que contiene L104EA29Y no genera una respuesta de anticuerpo anti-donante mientras se trata, como se describe en el Ejemplo 3, más abajo.
La Figura 19 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de L104EIg (SEQ ID NOs.: 7 - 8), como se describe en el Ejemplo 2, más abajo.
La Figura 20 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de L104EA29LIg (SEQ ID NOs.: 9 - 10).
La Figura 21 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de L104EA29TIg (SEQ ID NOs.: 11-12).
La Figura 22 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de L104EA29WIg (SEQ ID NOs.: 13-14).
La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos de una CTLA4Ig (SEQ ID NO.: 15) que tiene un péptido de señal; una secuencia de aminoácidos de tipo salvajes del dominio extracelular de CTLA4 que comienza en metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, o que comienza en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; y una región Ig.
La Figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos de CTLA4Ig (SEQ ID NO.: 16) que tiene un péptido de señal; una secuencia de aminoácidos de tipo salvaje del dominio extracelular de CTLA4 que comienza en metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, o que comienza en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; y una región Ig.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Todos los términos científicos y técnicos usados en esta solicitud tienen significado usado de manera común en la técnica salvo que se especifique de otra manera. Como se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.
Como se usa en el presente documento "CTLA4 de tipo salvaje" tiene la secuencia de aminoácidos de origen natural, CTLA4 de longitud completa (Patentes de Estados Unidos Números. 5.434.131, 5.844.095, 5.851.795), o cualquiera de sus partes que se une a la molécula B7 (CD80 y/o CD86), o interfiere con una molécula de B7 (por ejemplo, CD80 y/o CD86) de manera que bloquee su unión a su ligando, o bloquea su unión al dominio extracelular de CTLA4 o sus partes. En particular realizaciones, CTLA4 de tipo salvaje comienza con metionina en la posición +1 y termina en ácido aspártico en la posición +124, o CTLA4 de tipo salvaje comienza con alanina en la posición - 1 y termina en ácido aspártico en la posición +124. En otras realizaciones, CTLA4 de tipo salvaje consta de los 187 aminoácidos del receptor de CTLA4 como se describe en la Fig. 3 de las patentes de Estados Unidos números 5.434.131. 5.844.095. 5.851.795. y se muestra en el presente documento como la Figura 1. CTLA4 de tipo salvaje es una proteína de superficie celular, que tiene un dominio extracelular N-terminal, un dominio transmembrana, y un dominio citoplásmico C-terminal. El dominio extracelular se une a antígenos diana, tales como CD80 y CD86. En una célula, las proteínas de CTLA4 de tipo salvaje, de origen natural se traducen como un polipéptido inmaduro, que incluye un péptido de señal en el extremo N-terminal. El polipéptido inmaduro que experimenta el procesamiento después de la traducción, que incluye la escisión y retirada del péptido de señal para generar un producto de escisión de CTLA4 que tiene un extremo N-terminal generado recientemente a partir del extremo N-terminal en la forma inmadura. Los expertos en la técnica apreciarán que se puede producir un procesamiento adicional después de traducción, que elimina uno o más de los aminoácidos del extremo N-terminal generado recientemente del producto de escisión de CTLA4. La forma madura de la molécula de CTLA4 incluye el dominio extracelular de CTLA4, o cualquier parte del mismo, que se une a CD80 y/o CD86.
Como se usa en el presente documento "el domino extracelular CTLA4" es la parte del receptor de CTLA4 que se extiende fuera de la membrana celular, e incluye cualquier parte de CTLA4 que se extiende fuera de la membrana celular que reconoce y se une a ligandos de CTLA4, tal como una molécula de B7 (por ejemplo, moléculas CD80 y/o CD86). Por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124 (Figura 2). Como alternativa, un dominio extracelular de CTLA4 comprende alanina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +125 (Figura 1). El dominio extracelular incluye fragmentos o derivados de CTLA4 que se unen a una molécula de B7 (por ejemplo, CD80 y/o CD86).
Como se usa en el presente documento una "secuencia de proteínas no CTLA4" o "molécula no CTLA4" se define como cualquier molécula que no se une a CD80 y/o CD86 y no interfiere con la unión de CTLA4 a su diana. Un ejemplo incluye, pero no se limita a, una región constante de inmunoglobulina (Ig) o su parte. Preferiblemente, la región de Ig constante es una región constante de Ig, por ejemplo, humano C (gamma)1, incluyendo las regiones bisagra, CH2 y CH3. La región constante de Ig se puede mutar para reducir sus funciones efectoras (Patentes de Estados Unidos Números: 5.637.481; y 6.090.914).
Como se usa en el presente documento, "soluble" se refiere a cualquier molécula, o sus fragmentos o derivados, no unida o anexada a la célula, es decir, circulante. Por ejemplo, CTLA4, L104EA29YIg, B7 o CD28 se puede hacer soluble mediante la anexión de un resto de inmunoglobulina (Ig) al dominio extracelular de CTLA4, B7 o CD28, respectivamente. Otras moléculas pueden ser producto génico E7 de papilomavirus (E7), antígeno asociado a melanoma p97 (p97) o proteína env de VIH (env gp120). Como alternativa, una molécula tal como CTLA4 se puede hacer soluble eliminando su dominio transmembrana. Típicamente, las moléculas solubles en los procedimientos de la invención no incluyen una secuencia de señal (o guía).
"CTLA4Ig" es una proteína de fusión soluble que comprende un dominio extracelular de CTLA4, o una parte del mismo que se une a CD80 y/o CD86, que se une a la cola de Ig. Una realización particular comprende el dominio extracelular de CTLA4 de tipo salvaje que comienza en metionina en la posición +1 y que termina en ácido aspártico en la posición +124; o que comienza en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; un resto de aminoácido de conexión glutamina en la posición +125; y una parte de inmunoglobulina que comprende ácido glutámico en la posición +126 por medio de lisina en la posición +357 (Figura 2). ADN que codifica CTLA4Ig se depositó el 31 de mayo de 1991 con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 bajo las disposiciones del Tratado de Budapest, y se ha acordado en número de acceso de ATCC ATCC 68629; Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1:793 - 80). CTLA4Ig-24, se depositó una línea celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) que expresa CTLA4Ig se depositó el 31 de mayo de 1991 con el número de identificación de ATCC CRL-10762). Las moléculas de CTLA4Ig solubles usadas en los procedimientos y/o kits de la invención puede o no puede incluir una secuencia de péptido señal (guía). Típicamente, en los procedimientos y/o kits de la invención, las moléculas no incluyen una secuencia de péptido señal.
Como se usa en el presente documento, "moléculas de CTLA4 solubles" significa moléculas de CTLA4 no unidas a la superficie de las células (es decir, circulantes) (tipo salvaje o mutante) o cualquier parte funcional de una molécula de CTLA4 que se une a B7 que incluye, pero no se limita a: proteínas de fusión de CTLA4Ig (por ejemplo, ATCC 68629), en las que el dominio extracelular de CTLA4 está condensada a un resto de inmunoglobulina (Ig) que hace la molécula de fusión soluble, o sus fragmentos y derivados; proteínas con el dominio extracelular de CTLA4 condensada o unida a una parte de una proteína biológicamente activa o químicamente activa tal como el producto génico de papilomavirus E7 (CTLA4-E7), antígeno asociado a melanona p97 (CTLA4-p97) o proteína env de VIH (CTLA4-env gp 120), o sus fragmentos o derivados; proteínas de fusión híbridas (quiméricas) tal como CD28/CTLA4Ig, o sus fragmentos y derivados; las moléculas de CTLA4 con el dominio transmembrana eliminado para hacer la proteína soluble (Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular Immunology 201:144 - 153), o sus fragmentos y derivados. "Moléculas de CTLA4 solubles" también incluyen sus fragmentos, partes o, derivados, y moléculas mutantes de CTLA4 solubles que tienen actividad de unión de CTLA4. Las moléculas de CTLA4 solubles usadas en los procedimientos de la invención pueden o no pueden incluir una secuencia de péptido de señal (guía). Típicamente, en los procedimientos de la invención, las moléculas no incluyen una secuencia de péptido de señal.
Como se usa en el presente documento, a "proteína de fusión" se define como una o más secuencias de aminoácidos unidas conjuntamente usando los procedimientos bien conocidos en la técnica y descritos en las patentes de Estados Unidos Números 5.434.131 o 5.637.481. Por lo tanto las secuencias de aminoácidos unidas forman una proteína de fusión.
Como se usa en el presente documento a "molécula mutante de CTLA4" es una molécula que puede ser CTLA4 de longitud completa o sus partes (derivados o fragmentos) que tienen una mutación o mutaciones múltiples en CTLA4 (preferiblemente en el dominio extracelular de CTLA4) de manera que es similar pero no idéntica a la molécula de CTLA4 de tipo salvaje. Las moléculas mutantes de CTLA4 se unen a una molécula de B7 (por ejemplo, o bien CD80 o CD86, o ambas). Las moléculas mutantes de CTLA4 pueden incluir una molécula biológica o químicamente activa no CTLA4 en ella o unida a ella. Las moléculas mutantes pueden ser solubles (es decir, circulantes) o unidas a la superficie. Las moléculas mutantes de CTLA4 pueden incluir el dominio extracelular entero de CTLA4 o sus partes, por ejemplo, fragmentos o derivados. Las moléculas mutantes de CTLA4 se pueden preparar de manera sintética o recombinante.
Como se usa en el presente documento, el término "mutación" es un cambio en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de un polipéptido de tipo salvaje. La presente invención proporciona una mutación o un cambio en el dominio extracelular de CTLA4 de tipo salvaje. Los cambios en la secuencia de CTLA4 de tipo salvaje incluyen cambios conservadores y no conservadores. El cambio puede ser un cambio de aminoácidos que incluye sustituciones, supresiones, adiciones, o truncamientos. Una molécula mutante puede tener una o más mutaciones. Las mutaciones en una secuencia de nucleótidos puede o no puede dar como resultado una mutación en la secuencia de aminoácidos como se entiende bien en la técnica. A este respecto ciertos codones de nucleótidos codifican el mismo aminoácido. Los ejemplos incluyen los codones de nucleótidos CGT, CGG, CGC, y CGA que codifican el aminoácido, arginina (R); o codones GAT, y GAC que codifican el aminoácido, ácido aspártico (D). De este modo, una proteína puede estar codificada por una o más moléculas de ácido nucleico que difieren en su secuencia de nucleótidos específica, pero todavía codifican moléculas de proteínas que tienen secuencias idénticas. La secuencia que codifican los aminoácidos es como sigue:
1
2
"L104EA29YIg" es una proteína de fusión que es una molécula mutante de CTLA4 soluble que comprende un dominio extracelular de CTLA4 de tipo salvaje que tiene cambios de aminoácidos A29Y (un resto de aminoácido tirosina que se sustituye por una alanina en la posición 29) y L104E (un resto de aminoácido ácido glutámico que se sustituye por una leucina en la posición +104), o su parte que se une a una molécula B7, unida a una cola de Ig (se incluye en la Figura 3; el ADN que codifica L104EA29YIg se depositó con la Colección Americana de Cultivos Tipo el 20 de junio 2000 y asignado el número de ATCC PTA-2104). Las moléculas solubles de L104EA29YIg usadas en los procedimientos y/o kits de la invención pueden o no pueden incluir una secuencia de péptido de señal (guía). Típi-
camente, en los procedimientos y/o kits de la invención, las moléculas no incluyen una secuencia de péptido de señal.
La molécula mutante puede tener una o más mutaciones. Como se usa en el presente documento, a "una secuencia de proteína no CTLA4" o "molécula no CTLA4" significa cualquier molécula de proteína que no se une a B7 y no interfiere con la unión de CTLA4 a su diana. Un ejemplo incluye, pero no se limita a, una región constante de inmunoglobulina (Ig) o su parte. Preferiblemente, la regios constante de Ig es una región constante de Ig de ser humano o de mono, por ejemplo, C(gamma)1 humana, que incluye las regiones bisagra CH2 y CH3. la región constante de Ig se puede mutar para reducir sus funciones efectoras (Patentes de Estados Unidos números 5.637.481. 5.844.095 y 5.434.131).
Como se usa en el presente documento, un "fragmento" o "parte" es cualquier parte o segmento de una molécula por ejemplo CTLA4 o CD28, preferiblemente el dominio extracelular de CTLA4 o CD28 o su parte o segmento, que reconoce y se une a su diana, por ejemplo, una molécula de B7.
Como se usa en el presente documento, "B7" se refiere a la familia de B7 de moléculas que incluyen, pero no se limitan a B7-1 (CD80) (Freeman et al, 1989, J Immunol. 143: 2714 - 2722, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad), B7-2 (CD86) (Freeman et al, 1993, Science 262: 909 - 911 incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad; Azuma et al, 1993, Nature 366:76 - 79 incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad) que puede reconocer y unirse a CTLA4 y/o CD28.
Como se usa en el presente documento, "CD28" se refiere a la molécula que reconoce y se une a B7 como se describe en los documentos de Estados Unidos Números de serie 5.580.756 y 5.521.288 (incorporadas en el presente documento por referencia en su totalidad).
Como se usa en el presente documento, "células positivas de B7" son cualesquiera con uno o más tipos de moléculas de B7 expresadas sobre la superficie celular.
Como se usa en el presente documento, un "derivado" es una molécula que comparte similitud de secuencia y actividad de su molécula precursora. Por ejemplo, un derivado de CTLA4 incluye una molécula de CTLA4 soluble que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 70% similar al dominio extracelular de CTLA4 de tipo salvaje, y que reconoce y se une a B7 por ejemplo CTLA4Ig o molécula mutante de CTLA4 soluble L104EA29YIg.
Como se usa en el presente documento, "bloquear" o "inhibir" un receptor, señal o molécula que interfiere con la activación del receptor, señal o molécula, como se detecta por un ensayo reconocido en la técnica. Por ejemplo, el bloqueo de una respuesta inmune mediada por célula se puede detector mediante la determinación de de la reducción de los síntomas asociados a enfermedades reumáticas. El bloqueo o inhibición puede ser parcial o total.
Como se usa en el presente documento, "bloqueo de la interacción de B7" significa que interfiere con la unión de B7 a sus ligandos, tales como CD28 y/o CTLA4, Obstruyendo por lo tanto las interacciones de células T y células B7 positivas. Los ejemplos de agentes que bloquean las interacciones de B7 incluyendo, pero sin limitación a, moléculas tal como un anticuerpo (o su parte o derivado) que reconoce y se une a cualesquiera de las moléculas CTLA4, CD28 o B7 (por ejemplo B7-1, B7-2); una forma soluble (o su parte o derivado) de las moléculas tal como CTLA4 soluble; un fragmento peptídico u otra molécula pequeña diseñada para interferir con la señal de la célula mediante la interacción mediada por CTLA4/CD28B7. En una realización preferida, el agente bloqueador es una molécula de CTLA4 soluble, tal como CTLA4Ig (ATCC 68629) o L104EA29YIg (ATCC PTA-2104), una molécula de CD28 soluble tal como CD28Ig (ATCC 68628), una molécula de B7 soluble tal como B7Ig (ATCC 68627), un anticuerpo monoclonal anti-B7 (por ejemplo ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 y anticuerpos monoclonales como describen Anderson et al en la Patente de Estados Unidos Nº 6.113.898 o Yokochi et al., 1982. J. Immun., 128 (2): 823 - 827), un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 (por ejemplo ATCC HB-304, y anticuerpos monoclonales como se describe en las referencias 82-83) y/o un anticuerpo monoclonal anti-CD28 (por ejemplo ATCC HB 11944 y mAb 9.3 como ha descrito Hansen (Hansen et al., 1980. Immunogenetics 10: 247 - 260) o Martin (Martin et al., 1984. J. Clin. Immun., 4(1): 18 - 22)).
Como se usa en el presente documento, "enfermedad del sistema inmune" significa cualquier enfermedad mediada por las interacciones de células T con células B7 positivas Que incluye, pero no se limita a, enfermedades autoinmunes, trastornos relacionados con injertos y enfermedades inmunoproliferativas. Los ejemplos de enfermedades del sistema inmune incluyen enfermedad del huésped contra injerto (GVHD) (por ejemplo, tales como las que se producen a partir de trasplante de médula ósea, o en la inducción de tolerancia), trastornos inmunes asociados a rechazo de trasplante de injertos, rechazo crónico, y trasplantes de tejidos o de células homólogo o heterólogo, incluyendo órganos sólidos, piel, islotes, músculos, hepatocitos, neuronas. Los ejemplos de enfermedades inmunoproliferativas incluyen, pero no se limitan a, psoriasis, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda de células T, linfoma de células T angiocéntrico testicular, angiitis linfática benigna, lupus (por ejemplo lupus eritematoso, lupus nefritis), tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmune, enfermedad de Addison, diabetes (por ejemplo diabetes mellitus insulina dependiente, diabetes mellitus de tipo I, diabetes mellitus de tipo II), síndrome de Good Pasture, miastemoa grave, pénfigo, enfermedad de Crohn, oftalmia simpática, uveitis autoinmune, esclerosis múltiple, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis de acción crónica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, enfermedades reumáticas (por ejemplo artritis reumatoide), polimiositis, escleroderma, y enfermedad de tejido conectivo mixta.
Como se usa en el presente documento, "sujeto" incluye pero no se limita a seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, ratón, mono), oveja, conejo, cerdo, perro, gato, ratón, o rata.
Como se usa en el presente documento, "trasplante de tejidos" se define como un tejido de todo, o parte de, un órgano que se trasplanta a un sujeto receptor. En ciertas realizaciones, el tejido es procedenet de uno o más órganos sólidos. Los ejemplos de tejidos u órganos incluyen, pero no se limitan a, piel, corazón, páncreas, riñón, hígado, médula ósea, células de los islotes pancreáticos, células del tronco pluripotentes, suspensiones celulares, y células modificaads genéticamente. El tejido se puede eliminar de un sujeto donante, o se puede desarrollar in vitro. El traslante puede ser un autotrasplante, isotrasplante, alotrasplante o heterotrasplante o su combinación.
Como se usa en el presente documento, "rechazo de trasplante" se define como la pérdida casi completa o completa de tejido de injerto viable del sujeto receptor.
Como se usa en el presente documento, "encapsulación" se define como un procedimiento que aísla de manera inmunológica células y/o grupos de células, que producen y secretan sustancias terapéuticas, por ejemplo insulina, y al uso médico de estas formulaciones. El procedimiento de encapsulación implica la colocación de las células y/o grupos de células dentro de una barrera de membrana semipermeable antes de trasplante con el fin de evitar el rechazo por el sistema inmune. El corte del peso molecular de la membrana de encapsulación se puede controlar mediante el procedimiento de encapsulación de manera que excluya la difusión hacia el interior de inmunoglobulina y factores líticos del sistema de complemento, pero permite el paso de moléculas más pequeñas tales como glucosa e insulina. La encapsulación permite que las células de los islotes respondan fisiológicamente a cambios en la glucosa en sangre pero evita el contacto con los componentes del sistema inmune. Los procedimientos de encapsulación de células de los islotes pancreáticos se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 6.080.412.
Como se usa en el presente documento, "ligando" se refiere a una molécula que reconoce y se une de manera específica a otra molécula, por ejemplo, un ligando para CTLA4 es una molécula de CD80 y/o CD86.
Como se usa en el presente documento, "un ligando soluble que reconoce y se une a antígeno de CD80 y/o CD86 "incluye los ligandos tales como CTLA4Ig, CD28Ig u otras formas solubles de CTLA4 y CD28; CTLA4 y CD28 recombinantes; moléculas de CTLA4 mutantes tales como L104EA29YIg; y cualquier molécula de anticuerpo, su fragmento o proteína de unión recombinante que reconoce y se une a antígeno CD80 y/o CD86. Estos agentes también se consideran "agentes inmunosupresores".
Como se usa en el presente documento, "ruta coestimuladora" se define como una ruta bioquímica que se produce a partir de la interacción de las señales coestimuladoras sobre las células T y las células que presentan antígeno (APCs). Las señales coestimuladoras ayudan a determinar la magnitud de la respuesta inmunológica a un antígeno. Una señal coestimuladora se proporciona mediante la interacción con los receptores de las células T CD28 y CTLA4 con las moléculas CD80 y/o CD86 sobre APCs.
Como se usa en el presente documento, "CD80 y/o CD86" incluye B7-1 (también llamado CD80). B7-2 (también llamado CD86), B7-3 (también llamado CD74), y the B7 family, por ejemplo, a combinación of B7-1, B7-2, y / o B7-3.
Como se usa en el presente documento, "bloqueo coestimulador" se define como un protocolo de administración a un sujeto, uno o más agentes que interfieren o bloquean una ruta coestimuladora, como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de agentes que interfieren con el bloqueo coestimulador incluyen, pero no se limitan a, CTLA4 soluble, CTLA4 mutante, CD28 soluble, anticuerpos monoclonales anti-B7 (mAbs), CD40 soluble, y mAbs anti-gp39. En una realización, L104EA29YIg es un agente preferido que interfiere con el bloqueo coestimulador.
Como se usa en el presente documento, "médula ósea agotada de células T" se define como una médula ósea retirada del hueso que se ha expuesto a un protocolo de células anti-T. Un protocolo de células anti-T se define como un procedimiento para retirar las células T de la médula ósea. Los procedimientos de la retirada de las células T de manera selectiva son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de un protocolo de células T es la exposición de la médula ósea a anticuerpos específicos de células T, tales como anticuerpos monoclonales anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5, anti-CD8, y anti-CD90, en la que los anticuerpos son citotóxicos para las células T. Como alternativa, los anticuerpos se pueden acoplar a partículas magnéticas que permiten la retirada de las células T de la médula ósea usando campos magnéticos. Otro ejemplo de un protocolo de células anti-T es exponer a las células T de médula ósea a suero anti-linfocito o globulina anti-timocito.
Como se usa en el presente documento, "dosis de tolerancia de médula ósea agotada de células T" se define como una dosis inicial de médula ósea agotada de células T que se administra a un sujeto con el propósito de inactivar las células potenciales T reactivas al donante.
Como se usa en el presente documento, "dosis de injerto de médula ósea agotada de células T" se define como una dosis posterior de médula ósea agotada de células T que se administra a un sujeto con el propósito de establecer una quimera hematopoyética mixta. La dosis de injerto de médula ósea agotada de células T se administrará de manera adecuada después de la dosis de tolerancia de médula ósea agotada de células T.
Como se usa en el presente documento, "quimera hematopoyética mixta" se define como la presencia de células del progenitor y maduras de sangre del donante y receptor (por ejemplo, células de derivación de sangre) en la ausencia (o presencia no detectable) de una respuesta inmune.
Como se usa en el presente documento "emparejamiento de donante-receptor" se definen basándose en la tipificación molecular usando un panel de alelos de de histocompatibilidad principal definidos anteriormente (8 clases I y 12 clases II) (Lobashevsky A, et al., Tissue Antigens 54: 254 - 263, (1999); Knapp LA, et al., Tissue Antigens 50:657 - 661, (1997); Watkins D.I., Crit Rev Immunol 15:1 - 29, (1995)). La disparidad maximizada de emparejamientos en ambos loci de las clases I y II.
Como se usa en el presente documento, "administrar" o "administración" a un sujeto incluye pero no se limita a administración intravenosa (i.v.), administración intraperitoneal (i.p.), administración intramuscular (i.m.), administración subcutánea, administración oral, administración mediante inyección, como un supositorio, o el implante de un dispositivo de liberación lenta tal como una bomba miniosmótica al sujeto.
Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con el agente reactivo, mantiene la actividad biológica del agente reactivo, por ejemplo, especificidad de unión y es no reactivo con el sistema inmune del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tal como emulsión de aceite / agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Otros vehículos también pueden incluir soluciones estériles, comprimidos, que incluyen comprimidos revestidos y cápsulas. Típicamente, tales vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales, de los mismos, estearato de magnesio, talco, grasas vegetales o aceites, gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Tales vehículos también pueden incluir aditivos de aroma y color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden tales vehículos se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos.
Como se usa en el presente documento, "agentes inmunosupresores" se definen como una composición que tiene uno o más tipos de moléculas que evitan la aparición de una respuesta inmune, o debilita un sistema inmune del sujeto. Preferiblemente, los agentes reducen o evitan la proliferación de de las células T. Algunos agentes pueden inhibir la proliferación de las células T mediante la inhibición de la interacción de las células T con otras células que presentan antígeno (APCs). Un ejemplo de APCs es células B. Los ejemplos de agentes que interfieren con las interacciones de células T con, y por lo tanto inhiben la proliferación de las células T, incluyen, pero no se limitan a, ligandos para los antígenos CD80 y/o CD86, ligandos para el antígeno CTLA4, y ligandos para el antígeno CD28. Los ejemplos de ligandos para los antígenos CD80 y/o CD86 incluyen, pero no se limitan a, CTLA4 soluble, mutante de CTLA4 soluble, CD28 soluble, o anticuerpos monoclonales que reconocen y se unen a antígenos CD80 y/o CD86, o sus fragmentos. Un agente preferido es L104EA29YIg. Los ligandos para los antígenos CTLA4 o CD28 incluyen anticuerpos monoclonales que reconocen y se unen a CTLA4 y/o CD28, o sus fragmentos. Otros ligandos para CTLA4 o CD28 incluyen moléculas de CD80 y/o CD86 solubles, tal como CD80 y/o CD86Ig. Los expertos en la técnica entenderán fácilmente que se pueden usar otros agentes o ligandos para inhibir la interacción de CD28 con CD80 y/o CD86.
Los agentes inmunosupersores incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE ^{R}), etanercept, bloqueadores de TNF\alpha, un agente biológico que dirige una citoquina inflamatoria, un fármaco antiinflamatorios no esteroide (NSAIDs). Los NSAIDs incluyen, pero no se limitan a ácido acetil salicílico, colina magnesio salicilato, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenac, etodolac, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolac, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetin, acetaminofeno, ibuprofeno, inhibidores de Cox-2 y tramadol.
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Composiciones de la invención
Las moléculas CTLA4, con las secuencias mutantes o de tipo salvaje, se pueden hacer solubles suprimiendo el segmento trans-membrana de CTLA4 (Oaks, M. K., et al, 2000 Cellular Immunology 201:144 - 153).
Como alternativa, las moléculas de CTLA4 solubles, con secuencias mutantes o de tipo salvaje, pueden ser proteínas de fusión, en las que las moléculas de CTLA4 están condensadas a restos no CTLA4 tales como moléculas de inmunoglobulina-(Ig) que hacen que las moléculas de CTLA4 sean solubles. Por ejemplo, una proteína de fusión CTLA4 puede incluir el dominio extracelular de CTLA4 condensado a un dominio constante de inmunoglobulina, que da como resultado la molécula de CTLA4Ig (Figura 2) (Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1: 793 - 80).
Para los protocolos clínicos, se prefiere que el resto de inmunoglobulina no induce una respuesta inmune perjudicial en un sujeto. El resto preferido es la región constante de inmunoglobulina, que incluye las regiones constantes de inmunoglobulina de ser humano y de mono. Un ejemplo de la región de inmunoglobulina adecuada es Cyl humana, que incluye las regiones bisagra CH2 y CH3 que pueden mediar las funciones efectoras tales como la unión a receptores de Fc, que median la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), o median en la citotoxicidad mediada por las células dependiente de anticuerpos (ADCC). El resto de inmunoglobulina puede tener una o más mutaciones en ella (por ejemplo, en el dominio CH2, para reducir las funciones efectoras tales como CDC o ADCC) donde la mutación modula la capacidad de la inmunoglobulina a su ligando, mediante el aumento o disminución de de la capacidad de unión de la inmunoglobulina a los receptores de Fc. Por ejemplo, las mutaciones en el resto de inmunoglobulina puede incluir cambios en cualquiera o todos sus restos de cisteína dentro del dominio bisagra, por ejemplo, las cisteínas en las posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas con serina (Figura 24). El resto de inmunoglobulina también puede incluir la prolina en la posición +148 sustituida con una serina, como se muestra en la Figura 24. Además, las mutaciones en el resto de inmunoglobulina puede incluir que tenga la leucina en la posición +144 sustituida con fenilalanina, leucina en la posición +145 sustituida con ácido glutámico, o glicina en la posición +147 sustituida con alanina.
Los restos adicionales no-CTLA4 para uso en las moléculas de CTLA4 solubles o moléculas mutantes de CTLA4 solubles incluyen, pero no se limitan a, molécula de p97, molécula de env gp 120, molécula E7, y molécula ova (Dash, B. et al. 1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6):1389 - 97; Ikeda, T., et al. 1994 Gene 138(1-2):193-6; Falk, K., et al. 1993 Cell. Immunol. 150(2): 447 - 52; Fujisaka, K. et al. 1994 Virology 204 (2): 789-93). También son posibles otras moléculas (Gerard, C. et al. 1994 Neuroscience 62(3):721; Byrn, R et al. 1989 63(10):4370; Smith, D. et al. 1987 Science 238:1704; Lasky, L. 1996 Science 233:209).
La presente invención proporciona moléculas de CTLA4 solubles que incluyen una secuencia de péptido de señal unida al extremo N-terminal del dominio extracelular de la parte de CTLA4 de la molécula. El péptido de señal puede ser cualquier secuencia que permitirá la secreción de la molécula mutante, que incluye el péptido de señal de la oncostatina M (Malik, et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847 - 2853), o CD5 (Jones, N. H. et al., 1986 Nature 323: 346 - 349), o el péptido de señal de cualquier de cualquier proteína extracelular. La molécula de CTLA4 soluble de la invención puede incluir el péptido de señal de oncostatina M unido al extremo N-terminal del dominio extracelular de CTLA4, y la molécula de inmunoglobulina humana (por ejemplo, bisagra, CH2 y CH3) unida al extremo C-terminal del dominio extracelular (tipo salvaje o mutado) de CTLA4. Esta molécula incluye el péptido de señal de oncostatina M que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición -26 hasta de alanina en la posición -1, la parte de CTLA4 que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, una unión del resto de aminoácido glutamina en la posición +125, y la parte de inmunoglobulina que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357.
En una realización, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención, que comprenden las secuencias de CTLA4 mutadas descritas más abajo más abajo, son moléculas de fusión que comprenden restos de IgC(gamma)1 humana (es decir, IgCyl) condensados a los fragmentos de CTLA4. Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles pueden comprender una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos,) en el dominio extracelular de CTLA4.
Por ejemplo, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles pueden incluir una mutación o mutaciones dentro o en estrecha proximidad a la región abarcada por la serina en la posición +25 hasta arginina en la posición +33 (por ejemplo, S25-R33, que usa los símbolos de aminoácidos de una letra convencionales). Las moléculas de CTLA4 mutantes pueden incluir una sustitución de aminoácidos en cualquiera de las posiciones: S25, P26, G27, K28, A29, T30, E31, o R33.
En otra realización, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles pueden incluir una mutación o mutaciones dentro o en estrecha proximidad a la región abarcada por ácido glutámico en la posición +95 a glicina en la posición +107 (por ejemplo, E95-G107) Las moléculas de CTLA4 mutantes pueden incluir una sustitución de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: K93, L96, M97, Y98, P99, P100, P101, Y102, Y103, L104, G105, I106, y
G107.
Adicionalmente, la invención proporciona moléculas mutantes de CTLA4 solubles que tienen una mutación o mutaciones dentro o en estrecha proximidad a la región abarcada por asparagina +108 a isoleucina en la posición +115 (por ejemplo, N108-I115). La molécula mutante de CTLA4 puede incluir una sustitución de aminoácidos en cualquiera o más de las posiciones: L104, G105, I106, G107, Q111, Y113, o I115.
En una realización, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles comprenden IgC\gamma1 condensada a un fragmento de CTLA4 que comprende una mutación en un solo sitio en el dominio extracelular. El dominio extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo, Figura 1). La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo, Figura 1).
Los ejemplos de mutaciones de un solo sitio incluyen los siguientes en los que leucina en la posición +104 se cambia a por cualquier otro aminoácido:
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Además, la invención proporciona moléculas mutantes que tienen el dominio extracelular de CTLA4 con dos mutaciones, condensado a un resto Ig C\gamma1. Los ejemplos incluyen los siguientes en los que leucina en la posición +104 está cambiada por otro aminoácido (por ejemplo ácido glutámico) y la glicina en la posición +105, la serina en la posición +25, la treonina en la posición +30 o la alanina en la posición +29 se cambia por cualquier otro aminoácido:
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Además todavía, la invención proporciona moléculas mutantes que tienen el dominio extracelular de CTLA4 que comprenden tres mutaciones, condensadas a un resto Ig C\gamma1. Los ejemplos incluyen los siguientes en los que la leucina en la posición +104 está cambiada por otro aminoácido (por ejemplo ácido glutámico), la alanina en la posición +29 está cambiada por otro aminoácido (por ejemplo tirosina) y la serina en la posición +25 está cambiada por otro aminoácido:
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Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles pueden tener un resto de aminoácido de unión que se localiza entre la parte de CTLA4 y la parte Ig de la molécula. El aminoácido de unión puede ser cualquier aminoácido, incluyendo glutamina. El aminoácido de unión se puede introducir mediante procedimientos de síntesis moleculares o químicos conocidos en la técnica.
La invención proporciona moléculas mutantes de CTLA4 solubles que comprenden una mutación de un solo sitio en el dominio extracelular de CTLA4 tal como L104EIg (como se incluye en la Figura 19) o L104SIg, en los que L104EIg y L104SIg están mutados en sus secuencias de CTLA4 de manera que la leucina en la posición +104 está sustituida con ácido glutámico o serina, respectivamente. Las moléculas de mutación de un solo sitio además incluyen partes de CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un resto de aminoácido de unión de glutamina en la posición +125, y una parte de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La parte de inmunoglobulina de la molécula mutante también puede estar mutada de manera que las cisteínas en las posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148 está sustituida con serina. Como alternativa, molécula mutante de CTLA4 soluble de un solo sitio puede tener una parte de CTLA4 que abarca alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124.
La invención proporciona moléculas mutantes de CTLA4 solubles que comprenden mutación de un doble sitio en el dominio extracelular de CTLA4, tales como L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg o L104EA29WIg, en los que leucina en la posición +104 está sustituida con a ácido glutámico y alanina en la posición +29 está cambiaba a tirosina, leucina, treonina y triptófano, respectivamente. Las secuencias para L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg y L104EA29WIg, que comienza en metionina en la posición +1 y que termina con lisina en la posición +357, más una secuencia de péptido de señal (guía) se incluyen en las secuencias como se muestra en las Figuras 3 y 20-22 respectivamente. Las moléculas mutantes de doble sitio además comprenden partes de CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un resto de aminoácido de unión glutamina en la posición +125, y una parte de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La parte de inmunoglobulina de la molécula mutante también puede estar mutada, de manera que las cisteínas en las posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148 está sustituida con serina. Como alternativa, estas moléculas mutantes pueden tener una parte de CTLA4 que abarca alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124.
La invención proporciona moléculas mutantes de CTLA4 solubles que comprenden una mutación de doble sitio en el dominio extracelular de CTLA4, tales como L104EG10SFIg, L104EG105WIg y L104EG105LIg, en los que leucina en la posición +104 está sustituida con a ácido glutámico y glicina en la posición +105 está sustituida con fenilalanina, triptófano y leucina, respectivamente. Las moléculas mutantes de doble sitio además comprenden partes de CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un resto de aminoácido de unión glutamina en la posición +125, y una parte de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La parte de inmunoglobulina también puede estar mutada, de manera que las cisteínas en las posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148 está sustituida con serina. Como alternativa, estas moléculas mutantes pueden tener una parte de CTLA4 que abarca alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124.
La invención proporciona L104ES25RIg que es una molécula mutante de doble sitio que incluye una parte de CTLA4 que abarca metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un resto de aminoácido de unión glutamina en la posición +125, y la parte de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La parte que tiene el dominio extracelular de CTLA4 está mutada de manera que la serina en la posición +25 está sustituida con arginina, y leucina en la posición +104 está sustituida con ácido glutámico. Como alternativa, L104ES25RIg puede tener una parte de CTLA4 que abarca alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124.
La invención proporciona moléculas mutantes de CTLA4 solubles que comprenden una mutación de doble sitio en el dominio extracelular de CTLA4, tales como L104ET30GIg y L104ET30NIg, en los que leucina en la posición +104 está sustituida con a ácido glutámico y treonina en la posición +30 está sustituida con glicina y asparagina, respectivamente. Las moléculas mutantes de doble sitio además comprenden partes de CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un resto de aminoácido de unión glutamina en la posición +125, y una parte de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La parte de inmunoglobulina de la molécula mutante también puede estar mutada, de manera que las cisteínas en las posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148 está sustituida con serina. Como alternativa, estás moléculas mutantes pueden tener una parte de CTLA4 que abarca alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124.
La invención proporciona moléculas mutantes de CTLA4 solubles que comprenden una mutación de triple sitio en el dominio extracelular de CTLA4, tales como L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg, L104EA29YS25RIg, en los que leucina en la posición +104 está sustituida con a ácido glutámico, alanina en la posición +29 está cambiada a tirosina y serina en la posición +25 está cambiada a lisina, asparagina y arginina, respectivamente. Las moléculas mutantes de triple sitio además comprenden partes de CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124, un resto de aminoácido de unión glutamina en la posición +125, y una parte de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 hasta lisina en la posición +357. La parte de inmunoglobulina de la molécula mutante también puede estar mutada, de manera que las cisteínas en las posiciones +130, +136, y +139 están sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148 está sustituida con serina. Como alternativa, estas moléculas mutantes pueden tener una parte de CTLA4 que abarcan alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124.
Realizaciones adicionales de moléculas mutantes de CTLA4 solubles incluyen moléculas mutantes homólogas de CTLA4/CD28 que se unen a una B7 (Peach, R. J., et al., 1994 J Exp Med 180: 2049 - 2058). Los ejemplos de estas moléculas mutantes quiméricas de CTLA4/CD28 incluyen HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS 12, HS13 y HS14 (Patente de Estados Unidos Nº 5.773.253).
Las realizaciones preferidas de la invención son moléculas solubles de CTLA4 tal como CTLA4Ig (como se muestra en la Figura 2, que comienza en metionina en la posición +1 y que termina en lisina en la posición +357) y L104EA29YIg mutante soluble de CTLA4 (como se muestra en la Figura 3, que comienza en metionina en la posición +1 y que termina en lisina en la posición +357).
La invención además proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos que corresponden a las moléculas solubles de CTLA4 de la invención. En una realización, la molécula de ácido nucleico es un ADN (por ejemplo, ADNc) o su híbrido. El ADN que codifica CTLA4Ig (Figura 2) se depositó el 31 de mayo de 1991 con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 y se ha acordó con el número de acceso de ATCC ATCC 68629. El ADN que codifica L104EA29YIg (seceuncia incluida en la Figura 3) se depositó el 19 de junio de 2000 con la ATCC y se ha acordado el número de acceso de ATCC PTA-2104. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico son ARN o uno de sus híbridos.
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Híbridos de CTLA4
La presente invención proporciona moléculas mutantes de CTLA4 solubles que comprenden al menos el dominio extracelular de CTLA4 o sus partes que se unen a CD80 y/o CD86. La parte extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo, Figura 1). La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo, Figura 1). La parte extracelular de CTLA4 puede comprender ácido glutámico en la posición +95 hasta cisteína en la posición +120. La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 hasta cisteína en la posición +21 y ácido glutámico en la posición +95 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 hasta tirosina en la posición +23 y valina en la posición +32 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido glutámico en la posición +31 y ácido glutámico en la posición +95 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido glutámico en la posición +31 y ácido glutámico en la posición +95 hasta isoleucina en la posición +112. La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido glutámico en la posición +31 y tirosina en la posición +113 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +50 hasta ácido glutámico en la posición +57 y ácido glutámico en la posición +95 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido glutámico en la posición +31; alanina en la posición +50 hasta ácido glutámico en la posición +57; y ácido glutámico en la posición +95 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +50 hasta ácido glutámico en la posición +57 y ácido glutámico en la posición +95 hasta isoleucina en la posición +112. La parte extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido glutámico en la posición +31; alanina en la posición +50 hasta ácido glutámico en la posición +57; y ácido glutámico en la posición +95 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta valina en la posición +94. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 hasta cisteína en la posición +21. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 hasta cisteína en la posición +21. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender ácido glutámico en la posición +95 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 hasta valina en la posición +94. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 hasta valina en la posición +94. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 hasta ácido glutámico en la posición +31. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 hasta tirosina en la posición +23. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 hasta tirosina en la posición +23. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender valina en la posición +32 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender tirosina en la posición +113 hasta ácido aspártico en la posición +122. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender ácido glutámico en la posición +95 hasta isoleucina en la posición +112. La parte extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición +50 hasta ácido glutámico en la posición +57.
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Procedimientos para producir las moléculas de la invención
La expresión de las moléculas mutantes de CTLA4 puede estar en las células procarióticas. Los procariotas lo más frecuentemente están representados por diversas cepas de bacterias. Las bacterias pueden ser gran positivas o gran negativas. También se pueden usar otras cepas microbianas.
Las secuencias de nucleótidos de moléculas mutantes de CTLA4 se pueden insertar en un vector diseñado para expresar secuencias foráneas en las células procarióticas tal como E. coli. Estos vectores pueden incluir secuencias de control procarióticas usadas de manera común que se definen en el presente documento para que incluyan promotores para el inicio de la trascripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitio de unión de ribomas, incluyen tales promotores usados de manera común como los sistemas promotores de beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) y el promotor P_{L} derivado de lambda y el sitio unión de ribosoma del gen N (Shimatake, et al., (1981) Nature 292: 128).
Tales vectores de inclusión también incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables, tal como un gen de beta-lactamasa o de neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia a antibióticos, de manera que los vectores se pueden replicar en bacterias y células que llevan los plásmidos se pueden seleccionar cuando se desarrollan en la presencia de antibióticos, tales como ampicilina o kanamicina.
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El plásmido de expersión se puede introducir en células procarióticas mediante una diversidad de procedimientos convencionales, que incluyen pero no se limitan a cloque de CaCl_{2} (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110, y Sambrook et al. (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press, (1989)) y electroporación.
De acuerdo con la práctica de la invención, las células eucarióticas son también son también células huésped adecuadas. Los ejemplos de células eucarióticas incluyen cualquier célula animal, ya sea primaria o levadura inmortalizada (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris), y células vegetales. Las células de mieloma, COS y CHO son ejemplos de células animales que se pueden usar como huéspedes. Las células de CHO particulares incluyen, pero no se limitan a, DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555 - 556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901 - 10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-Una línea celular (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO clon 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO clon B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF designada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), y RR-CHOK1 designada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Las células ejemplares vegetales incluyen células de tabaco (plantas enteras, cultivo de células, o callo), maíz, soja, y arroz. Semillas de maíz, soja, y arroz son también aceptables.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas mutantes de CTLA4 también se pueden insertar en un vector diseñado para expresar secuencias foráneas en un huésped eucariótico. Los elementos reguladores del vector pueden variar de acuerdo con el huésped eucariótico particular. La molécula de ácido nucleico que codifica L104EA29YIg está contenida en pD16 L104EA29YIg y se depositó el 19 de junio de 2000 con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 (ATCC No. PTA-2104). El vector pD16 L104EA29YIg es un derivado del vector pcDNA3 (INVITROGEN).
Las secuencias de control eucarióticas usadas de manera común para uso en los vectores de expresión incluyen promotores y secuencias de control compatibles con las células de mamífero tales como, por ejemplo, promotor de CMV (vector CDM8) y virus de sarcoma aviar (ASV) (vector \piLN). Otros promotores usados de manera común incluyen los promotores tempranos tardíos del Virus 40 de Simios (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature 273: 113), o u otros promotores virales tales como los derivados de polioma, Adenovirus 2, y virus de papiloma bovino. También se puede usar un promotor inducible, tal como hMII (Karin, et al., (1982) Nature 299: 797 - 802).
Los vectores para expresar moléculas mutantes de CTLA4 en eucariotos también pueden llevar secuencias llamadas regiones potenciadoras. Éstas son importantes en la optimización de la expresión génica y se encuentran o bien cadena arriba o cadena debajo de la región promotora.
Los ejemplos de expresión para las células huésped eucarióticas incluyen, pero no se limitan a, vectores para células huésped de mamíferos (por ejemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); vectores pVPakc, vectores pCMV, vectores pSG5 (Stratagene)), vectores retrovirales (por ejemplo, vectores pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) o sus formas modificadas, vectores adenovirales; vectores de virus asociados a Adeno, vectores baculovirus, vectores de levaduras (por ejemplo, vectores pESC (Stratagene)).
Las secuencias de nucleótidos que codifican moléculas mutantes de CTLA4 se pueden integrar en el genoma de la célula huésped eucariótica y replicarse a medida que se replica el genoma huésped. Como alternativa, el vector que lleva moléculas mutantes de CTLA4 pueden contener los orígenes de replicación que permite la replicación extracromosómica.
Para la expresión de las secuencias en Saccharomyces cerevisiae, el origen de de replicación del plásmido, se puede usar el círculo de 2\mu. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307). Como alternativa, se pueden usar las secuencias del genoma de levadura capaz de promover la replicación autónoma (véase, por ejemplo, Stinchcomb et al., (1979) Nature 282: 39); Tschemper et al., (1980) Gene 10: 157; y Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101: 300).
Las secuencias de transcripción de la transcripción para los vectores de levaduras incluyen promotores para la síntesis de enzimas glicolíticas (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17: 4900). Los promotores adicionales conocidos en la técnica incluyen el promotor de CMV proporcionado en el vector CDM8 (Toyama y Okayama, (1990) FEBS 268: 217 - 221); el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073), y aquellos para otras enzimas glicolíticas.
Otros promotores son inducibles debido a que se pueden regular mediante estímulos ambientales o el medio de crecimiento de las células. Estos promotores inducibles incluyen los de los genes para las proteínas de choque térmico, alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas asociadas a nitrógeno, y enzimas responsables para la utilización de maltosa y galactosa.
También se pueden colocar secuencias reguladoras en el extremo 3' de las secuencias de codificación. Estas secuencias pueden actuar para estabilizar el ARN mensajero. Tales terminadores se encuentran en la región no traducida de 3' después de las secuencias de notificación en varios genes derivados de levaduras y de mamíferos.
Los vectores ejemplares para las plantas y células de plantas incluyen, pero no se limitan a, plásmidos de Agrobacterium T_{i}, virus del mosaico de coliflor (CaMV), y virus del mosaico amarillo del tomate (TGMV).
Los aspectos generales de transformaciones del sistema de huésped de células de mamíferos se han descrito por Axel (Patente de Estados Unidos Nº 4.399.216 emitida el 16 de agosto de 1983). Las céluals de mamíferos se pueden transformar mediante procedimientos que incluyen pero no se limitan a, transfección en la presencia de fosfato de calcio, microinyección, electroporación, o mediante transducción con vectores virales. Los procedimientos para introducir secuencias de ADN foráneo en genomas de plantas y levaduras incluyen (1) procedimientos mecánicos, tales como microinyección de ADN en células individuales o protoplastos, células agitadas en un aparato Vóretx con perlas de vidrio en presencia de ADN, o disparo de esferas de tungsteno u oro revestidas de ADN en células o protoplastos; (2) introducción de ADN preparando membranas celulares permeables a macromoléculas mediante tratamiento de polietilen glicol o someter a altos pulsos eléctricos de tensión (electroporación); o (3) el uso de liposomas (que contienen ADNc) que se funden a los membranas celulares.
La expresión de las moléculas mutantes de CTLA4 se pueden detector mediante tinción de geles SDS-PAGE de tinción de Coomassie y inmunotransferencia que usa anticuerpos que se unen a CTLA4. La recuperación de proteínas se puede realizar usando medios de purificación de proteínas convencionales, por ejemplo, cromatografía de afinidad o cromatografía de intercambio iónico, para producir producto sustancialmente puro (R. Scopes en: "Protein Purification, Principles y Practice", tercera Edición, Springer-Verlag (1994)).
La invención además proporciona moléculas de proteínas mutantes de CTLA4 solubles producidas por los procedimientos en el presente documento.
Mutagénesis basada en codón de CTLA4IG
En una realización, la mutagénesis dirigida al sitio y el procedimiento de selección novedosos se usaron para identificar varias mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4 que mejoran la actividad de unión para CD86. En esta realización, se llevaron a cabo mutaciones en los residuos en las regiones del el dominio extracelular de CTLA4 desde serina 25 hasta arginina 33, la hebra de C' (alanina 49 y treonina 51), la hebra F (lisina 93, ácido glutámico 95 y leucina 96), y en la región desde metionina 97 hasta tirosina 102, tirosina 103 hasta glicina 107 y en la hebra G en las posiciones glutamina 111, tirosina 113 e isoleucina 115. Estos sitios se eligieron basándose en los estudios de proteínas de fusión de CD28/CTLA4 quiméricas (Peach et al., J. Exp. Med., 1994, 180: 2049 - 2058), y en un modelo de predicción de qué cadenas de laterales de restos de aminoácidos se expondrían de manera solvente, y una carencia de identidad u homología de restos de aminoácidos en ciertas posiciones entre CD28 y CTLA4. También, cualquier resto que está espacialmente en proximidad cercana (5 a 20 Unidades Angstrom) a los restos identificados se considera parte de la presente invención.
Para sintetizar y seleccionar moléculas mutantes de CTLA4 solubles con afinidades alteradas para CD80 y / o CD86, se adoptó una estrategia de dos etapas. Los experimentos ocasionaron primero generación una genoteca de mutaciones en un codón específico de una parte extracelular de CTLA4 y después seleccionando estos de BIAcore para identificar mutantes con reactividad alterada a CD80 o CD86. El sistema de ensayo de Biacore (Farmacia, Piscataway, N.J.) usa un sistema detector de resonancia de plasmón superficial que esencialmente implica la unión covalente de o bien CD80Ig o CD86Ig a un procesador sensor revestido de dextrano que se localiza en un detector. La molécula de ensayo se puede después inyectar en la cámara que contiene el procesador sensor y la cantidad de proteína complementaria que se une se puede determinar basándose en el cambio en la masa molecular que está físicamente asociada físicamente al lado revestido de dextrano del procesador sensor, el cambio de masa< molecular se puede medir mediante el sistema detector.
Composiciones farmacéuticas de la invención
La invención incluye composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de enfermedades del sistema inmune que comprende cantidades farmacéuticamente eficaces de moléculas mutantes de CTLA4 solubles. En ciertas realizaciones, las enfermedades del sistema inmune están mediadas por interacciones de las células CD28- y/o CTLA4-positivas con células CD80 y/o CD86 positivas. Las moléculas de CTLA4 solubles son preferiblemente moléculas de CTLA4 solubles con secuencia de tipo salvaje y/o moléculas de CTLA4 solubles que tienen una o más mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4. La composición farmacéutica puede incluir moléculas de proteínas de CTLA4 o CTLA4 mutantes y / moléculas de ácidos nucleicos, y/o vectores que codifican las moléculas. En una realización preferida, la molécula mutante de CTLA4 soluble tiene la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CTLA4 como se muestra en cualquiera de las Figuras 3 (L104EA29Y). Incluso más preferiblemente, la molécula mutante de CTLA4 soluble es L104EA29YIg como se describe en el presente documento y se muestra en la Figura 3. Las composiciones pueden de manera adicional incluir otros agentes terapéuticos, que incluyen, pero no se limitan a, agentes inmunosupresores, NSAIDs, corticosteroides, glucococoticoides, fármacos, toxinas, enzimas, anticuerpos, o conjugados.
Una realización de la composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de una molécula de CTLA4 soluble sola o en combinación con una cantidad eficaz de al menos otro agente terapéutico, incluyendo un agente inmunosupresor, o NSAID.
Las cantidades eficaces de CTLA4 soluble en la composición farmacéutica puede variar entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/kg por peso del sujeto. En otra realización, la cantidad eficaz puede ser una cantidad entre aproximadamente 0,5 y 5 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 5 y 10 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 10 y 15 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 15 y 20 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 20 y 25 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 25 y 30 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 30 y 35 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 35 y 40 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 40 y 45 mg/kg de un sujeto, aproximadamente entre 45 y 50 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 50 y 55 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 55 y 60 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 60 y 65 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 65 y 70 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 70 y 75 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 75 y 80 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 80 y 85 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 85 y 90 mg/kg por peso de un sujeto, aproximadamente entre 90 y 95 mg/kg por peso de un sujeto, o aproximadamente entre 95 y 100 mg/kg por peso de un sujeto. En una realización, la cantidad eficaz es 2 mg/kg por peso de un sujeto. En otra realización, la cantidad eficaz es 10 mg/kg por peso de un sujeto. En una realización, la cantidad eficaz de una molécula de CTLA4 soluble es 2 mg/kg por peso de un sujeto. En una realización, la cantidad eficaz de una molécula de CTLA4 soluble es 10 mg/kg por peso de un sujeto.
La cantidad de un agente inmunosupresor administrado a un sujeto varía dependiendo de varios factores incluyendo la eficacia del fármaco sobre un sujeto específico y la toxicidad (es decir, la tolerancia) de un fármaco a un sujeto.
El metotrexato se administra de manera común en una cantidad entre aproximadamente 0,1 y 40 mg por semana con una dosificación común que varía entre aproximadamente 5 y 30 mg por semana. El metotrexato se puede administrar a un sujeto en diversos incrementos: aproximadamente entre 0,1 y 5 mg/semana, aproximadamente entre 5 y 10 mg/semana, aproximadamente entre 10 y 15 mg/semana, aproximadamente entre 15 y 20 mg/semana, aproximadamente entre 20 y 25 mg/semana, aproximadamente entre 25 y 30 mg/semana, aproximadamente entre 30 y 35 mg/semana, o aproximadamente entre 35 y 40 mg/semana. En una realización, una cantidad eficaz de un agente inmunosupresor, incluyendo metotrexato, es una cantidad entre aproximadamente 10 y 30 mg/semana.
Las cantidades eficaces de metotrexato varían entre aproximadamente 0,1 y 40 mg/semana. En una realización, la cantidad eficaz varía entre aproximadamente 0,1 y 5 mg/semana, aproximadamente entre 5 y 10 mg/semana, aproximadamente entre 10 y 15 mg/semana, aproximadamente entre 15 y 20 mg/semana, aproximadamente entre 20 y 25 mg/semana, aproximadamente entre 25 y 30 mg/semana, aproximadamente entre 30 y 35 mg/semana, o aproximadamente entre 35 y 40 mg/ semana. En una realización, el metotrexato se administra en una cantidad que varía entre aproximadamente 10 y 30 mg/semana.
La ciclofosfamida, un agente alcalino, se puede administrar en dosificaciones que varían entre aproximadamente 1 y 10 mg/kg de peso corporal al día.
Ciclosporina (por ejemplo NEORAL^{R}) también conocida como Ciclosporina A, se administra de manera común en dosificaciones que varían entre aproximadamente 1 y 10 mg/kg de peso corporal al día. Las dosificaciones que varían entre aproximadamente 2,5 y 4 mg por peso corporal al día son comúnmente usadas.
La Cloroquina o hidroxicloroquina (por ejemplo PLAQUENIL^{R}); se administra de manera común en dosificaciones que varían entre aproximadamente 100 y 1000 mg al día. Las dosificaciones preferidas varían entre aproximadamente 200 - 600 mg administrados al día.
Sulfasalazina (por ejemplo, AZULFIDINE EN-tabs^{R}) se administra de manera común en dosificaciones que varían entre aproximadamente 50 y 5000 mg al día, con una dosificación común de aproximadamente entre 2000 y 3000 mg al día para adultos. Las dosificaciones para niños están de manera común entre aproximadamente 5 y 100 mg/kg de peso corporal, hasta 2 gramos al día.
Las sales de oro se formulan para administración: inyección u oral. Las sales de oro inyectables se prescriben de manera común en dosificaciones entre aproximadamente 5 y 100 mg dosis cada dos a cuatro semanas. Las sales de oro administradas por vía oral se prescriben de manera común en dosificaciones que varían entre aproximadamente 1 y 10 mg al día.
D-penicilamina o penicilamina (CUPRIMINE^{R}) se administra de manera común en dosificaciones entre aproximadamente 50 y 2000 mg al día, con dosificaciones preferidas entre aproximadamente 125 mg al día hasta 1500 mg al día.
La Azatioprina se administra de manera común en dosificaciones entre aproximadamente 10 y 250 mg al día. Las dosificaciones preferidas varían entre aproximadamente 25 y 200 mg al día.
La anakinra (por ejemplo KINERET^{R}) es un antagonista del receptor de interleukina-1. Un intervalo de dosificación para anakinra está entre aproximadamente 10 y 250 mg al día, con una dosificación recomendada de aproximadamente 100 mg al día.
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Infliximab (REMICADE^{R}) es un anticuerpo monoclonal quimérico que se une al factor alfa de necrosis tumoral (TNF\alpha). Infliximab se administra de manera común en dosificaciones entre aproximadamente 1 y 20 mg/kg de peso corporal cada cuatro a ocho semanas. Las dosificaciones entre aproximadamente 3 y 10 mg/kg se peso corporal se pueden administrar cada cuatro a ocho semanas dependiendo del sujeto.
Etanercept (por ejemplo ENBREL^{R}) es una proteína de fusión dimérica que se une al factor de necrosis tumoral (TNF) y bloquea sus interacciones con los receptores de TNF. Las dosificaciones administradas de manera común de etanercept están entre aproximadamente 10 y 100 mg por semana para adultos con una dosificación preferida de aproximadamente 50 mg por semana Las dosificaciones para los sujetos juveniles varían entre aproximadamente 0,1 y 50 mg/kg de peso corporal por semana con un máximo de aproximadamente 50 mg por semana.
Leflunomida (ARAVA^{R}) se administra de manera común en dosificaciones entre aproximadamente 1 y 100 mg al día. Una dosificación diaria común esta entre aproximadamente 10 y 20 mg al día.
Las composiciones farmacéuticas también preferiblemente incluyen vehículos y adyuvantes adecuados que incluyen cualquier material que cuando se combina con la molécula de la invención (por ejemplo, una molécula mutante de CTLA4 soluble, por ejemplo, L104EA29YIg) retiene la actividad de la molécula y es no reactiva con el sistema inmune del sujeto. Los ejemplos de vehículos y adyuvantes adecuados, incluyen, pero no se limitan a, albúmina sérica bovina; intercambiadores de iones; alúmina; lecitina; sustancias tampón, tales como fosfatos; glicina; ácido sórbico; sorbato de potasio; y sales o electrolitos, tal como sulfato de protamina. Otros ejemplos incluyen cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales tales como solución salina tamponada con fosfato; agua; emulsiones, tal como emulsión de aceite/agua; y diversos tipos de agentes humectantes. Otros vehículos también incluir soluciones estériles; comprimidos, incluyendo comprimidos y cápsulas revestidos. Típicamente tales vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sus sales, estearato de magnesio o estearato de calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Tales vehículos también pueden incluir aditivos de sabor y de color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden tales vehículos se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos. Tales composiciones también se pueden formular dentro de diversas composiciones de lípidos, tales como, por ejemplo, liposomas, así como en diversas composiciones poliméricas, tales como microesferas de polímeros.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar modos convencionales de administración que incluyen, pero no se limitan a, administración intravenosa (i. v), administración intraperitoneal (i.p.), administración intramuscular (i.m.), administración subcutánea, oral, administración en forma de supositorio, o en forma de contacto tópico, o la implantación de un dispositivo de liberación lenta tal como una bomba miniosmótica, al sujeto.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en una variedad de formas de dosificación, que incluyen, pero no se limitan a, soluciones o suspensiones líquidas, comprimidos, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas, y soluciones inyectables o infusibles; La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica.
El modo más eficaz de administración y régimen de dosificación para las composiciones de esta invención depende de la gravedad y curso de la enfermedad, la salud del paciente y respuesta al tratamiento y juicio del médico de tratamiento. De acuerdo con lo anterior, las dosificaciones de las composiciones se deben ajustar para el paciente individual.
Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles se pueden administrar a un sujeto en una cantidad en una cantidad y durante un tiempo (por ejemplo duración del tiempo y/o tiempos múltiples) suficiente para bloquear las moléculas endógenas de B7 (por ejemplo, CD80 y/o CD86) de unión a sus ligandos respectivos, en el sujeto. El bloqueo de unión de B7 endógeno /ligando inhibe por lo tanto las interacciones entre células B7-positivas (por ejemplo, células CD80- y/o CD86-positivas) con células CD28- y/o CTLA4-positivas. La dosificación de un agente terapéutico depende de muchos factores que incluyen, pero no se limita al, tipo de tejido afectado, el tipo de enfermedad autoimmune que se está tratando, la gravedad de la enfermedad, la salud del sujeto, y la respuesta del sujeto al tratamiento con los agentes. De acuerdo con lo anterior, las dosificaciones de los agentes pueden variar dependiendo del sujeto y modo de administración. Las moléculas mutantes de CTLA4 solubles se pueden administrar en una cantidad entre 0,1 y 20,0 mg/kg del peso del paciente/día, preferiblemente entre 0,5 y 10,0 mg/kg/día. La administración de las composiciones farmacéuticas de la invención se puede realizar en varias veces. En una realización, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar durante una o varias horas. Además, la administración de se puede repetir dependiendo de la gravedad de la enfermedad así como otros factores como se entiende en la técnica.
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Procedimientos de la invención
La presente invención proporciona procedimientos para tratar enfermedades del sistema inmune y enfermedades autoinmunes en un sujeto que comprende la administración al sujeto de cantidad eficaz de una molécula CTLA4 o a CTLA4 mutante que se une a moléculas CD80 y/o CD86 sobre células CD80 y/o CD86-positivas de manera que inhiba la unión a CD80 y/o CD86 a CTLA4 y/o CD28. Los procedimientos comprenden la administración de una composición terapéutica, que comprende moléculas de CTLA4 o CTLA4 mutantes solubles de la invención, a un sujeto en una cantidad eficaz para suprimir al menos uno de los síntomas asociados a las enfermedades del sistema inmune. De manera adicional, la invención puede proporcionar terapia a largo plazo para las sistemas del sistema immune mediante el bloqueo de las interacciones de las células T /células B7 positivas, bloqueando por lo tanto la activación /estimulación de las células T mediante las señales de coestimulación tales como unión de B7 a CD28, que conduce a la inducción de la anergia o tolerancia a células T.
Las moléculas de CTLA4 o CTLA4 mutantes de la invención muestran propiedades inhibidoras in vivo. En condiciones en las que las interacciones de células T /B7 positivas, por ejemplo interacciones de células T / células B, se producen como resultado del contacto entre las células T cells y células B7 positivas, unión de moléculas de CTLA4 introducidas que reaccionan con las células B7 positivas, por ejemplo células B, pueden interferir, es decir, inhibir, las interacciones de las células T / células B7 positivas que dan como resultado la regulación de respuestas inmunes. La inhibición de las respuestas de las células T mediante la administración de una molécula de CTLA4 soluble también puede ser útil para tratar trastornos autoinmunes que se producen por una activación inapropiada de las T que son reactivas contra autoantígenos, y que promueven la producción de citoquinas y autoanticuerpos que están implicados en la patología de la enfermedad. La administración de la molécula de L104EA29YIg en un sujeto que sufre o es susceptible a un trastorno susceptible puede prevenir la activación de células T autorreactivas y pueden reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad. Este procedimiento también puede comprender la administración al sujeto de una molécula de L104EA29YIg de la invención, sola o conjuntamente, con ligandos adicionales, tales como los reactivos con IL-2, IL-4, o \gamma-interferón.
La invención proporciona procedimientos para regular respuestas inmunes. Las respuestas inmunes se pueden regular hacia abajo (reducir) mediante las moléculas de CTLA4 o de CTLA4 mutantes de la invención pueden ser mediante la inhibición o bloqueo de una respuesta inmune que ya está en marcha o puede prevenir la inducción de una respuesta inmune. Las moléculas de CTLA4 o de CTLA4 mutantes de la invención pueden inhibir las funciones de las células T, tales como proliferación de linfocitos T y secreción de citoquinas, mediante la supresión de las respuestas de las células T o mediante la inducción de tolerancia específica en las células T, o ambos. Además, las moléculas de CTLA4 o de CTLA4 mutantes de esta invención, que interfieren con la ruta de CTLA4/CD28/B7 puede inhibir la proliferación de las células T y/o secreción de citoquina, y de esta manera da como resultado la destrucción de tejido e inducción de la falta de respuesta de las células T o anergia.
La invención además proporciona procedimientos para inhibir el rechazo de trasplantes de órganos o tejidos en sujetos que comprenden la administración de una cantidad eficaz de al menos una molécula de CTLA4 o CTLA4 soluble, por ejemplo, L104EA29YIg, al sujeto antes, durante y/o después del trasplante. En otra realización, el procedimiento de la invención incluye la administración a un sujeto de al menos una molécula de CTLA4 o mutante CTLA4 soluble en combinación con al menos otro agente terapéutico, que incluye, pero no se limita a un fármaco, una enzima, un anticuerpo, o un conjugado.
El trasplante de órganos o tejidos puede ser a partir de cualquier tipo de órgano o tejido capaz de trasplante. En una realización, el tejido trasplantado puede ser un tejido pancrático. En una realización preferida, el tejido trasplantado es células de islotes pancreáticos. La invención también proporciona procedimientos para tratar diabetes de tipo 1 y/o diabetes de tipo 2 en sujetos mediante la inhibición del rechazo de trasplante de células de islotes.
La presente invención además proporciona un procedimiento para inhibir rechazo de trasplante de islotes pancreáticos en un sujeto, siendo el sujeto un receptor de tejido trasplantado. Típicamente, en los trasplantes de tejidos, el rechazo de los injertos se inicia mediante su reconocimiento como extraños por las células T, seguido de una respuesta inmune que destruye el injerto. La administración de una molécula de CTLA4 soluble en el procedimiento de esta invención inhibe la proliferación de las células T y/o secreción de citoquina, que da como resultado la reducción de destrucción de tejidos e inducción de la falta de respuesta de células T específicas de antígeno que puede dar como resultado la aceptación a largo plazo, sin la necesidad de inmunosupresión generalizada.
Una realización preferida de la invención comprende el uso de la molécula mutante de CTLA4 soluble
L104EA29YIg para regular las interacciones funcionales de las células CTLA4- y CD28-positivas con las células B7 positivas, para tratar enfermedades del sistema inmune tales como diabetes y/o regular hacia abajo respuestas inmunes. La L104EA29YIg de la invención es una molécula mutante de CTLA4 soluble que comprende al menos los dos cambios de aminoácidos, la leucina (L) a ácido glutámico. (E) en la posición +104 y la alanina (A) a tirosina (Y) cambio en la posición +29. La molécula de L104EA29YIg puede abarcar además mutaciones más allá de dos especificadas en el presente documento.
El procedimiento puede además comprender la administración con las moléculas mutantes de CTLA4 solubles, un régimen inmunosupresor de base al sujeto. El régimen de base inmunosupresor puede incluir (pero no se limita a: ciclosporina, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, globulina inmune de linfocitos, anticuerpos anti-CD3, globulina inmune Rho (D), adrenocorticosteroides, sulfasalzina, FK-506. metoxsalen, micofenolato mofetil (CELLCEPT), globulina de timocitos anti-humana de caballo (ATGAM), anti-TAC humanizado (HAT), basiliximab (SIMULECT), globulina de timocitos anti-humana de conejo (THYMOGLOBULIN), sirolimus, talidomida, metotrexato, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina, sulfasalazopirina, leflunomida, sales de oro, D-penicilamina, azatioprina, anakinra, infliximab, etanercept, bloqueadores de TNF\alpha o un agente biológico que dirige una citoquina inflamatoria. En una realización preferida, el régimen inmunosupersor de base no tiene esteroide. Más preferiblemente, el régimen inmunosupersor de base comprende rapamicina y mAb anti-humano IL-2 R.
Una realización de la invención comprende el uso de una molécula que bloquea la interacción entre B7 y CTLA4 junto con un agente inmunosupresor que regula una respuesta inmune con el fin de tratar una enfermedad del sistema inmune tal como diabetes. La molécula usada para bloquear la interacción de B7/CTLA4 puede ser una CTLA4 soluble tal como CTLA4Ig, CTLA4Ig/CD28Ig o L104EA29YIg, una CD28 soluble tal como CD28Ig, una B7 (B7-1 o B7-2) soluble tal como B7Ig, anticuerpos monoclonales anti-CTLA4, anticuerpos monoclonales anti-CD28 o anticuerpos monoclonales anti-B7.
Los sujetos tratados por la presente invención incluyen sujetos de mamíferos, incluyendo, ser humano, mono, simio, perro, gato, vaca, caballo, cabra, cerdo, conejo, ratón y rata.
La presente invención proporciona diversos procedimientos, locales o sistémicos, para la administración de las composiciones terapéuticas de la invención tal como una molécula de CTLA4 soluble sula o junto con un agente inmunosupresor y / u otro fármaco terapéutico. Los procedimientos incluyen procedimientos intravenosos, intramusculares, intraperitoneales, orales, de inhalación y subcutáneos, así como bomba implantable, infusión continua, terapia génica, liposomas, supositorios, contacto tópico, vesículas, cápsulas e inyección. El agente terapéutico, mezclado con un vehículo, se liofiliza de manera común para almacenamiento y se reconstituye con agua o una solución tamponada con un pH neutro (aproximadamente pH 7 - 8, por ejemplo, pH 7,5) antes de la administración.
Como es una práctica convencional en la técnica, las composiciones de la invención se pueden administrar al sujeto en cualquier forma farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con la práctica de la invención, los procedimientos de la invención, los procedimientos comprenden la administración a un sujeto de las moléculas de CTLA4 solubles de la invención que regulan las interacciones de las células CD28- y/o CTLA4 positivas con las células B7 -positivas. Las células B7 positivas se ponen en contacto con una cantidad eficaz de las moléculas de CTLA4 solubles de la invención, o sus fragmentos o derivados, de manera que formen complejos CTLA4/B7 solubles. Los complejos interfieren con la interacción entre moléculas endógenas CTLA4 y CD28 con las moléculas de la familia B7.
Las moléculas de CTLA4 solubles se pueden administrar a un sujeto en una cantidad y durante un tiempo (por ejemplo, duración del tiempo y/o tiempos múltiples) suficiente para bloquear las moléculas endógenas de B7 a partir de su unión a sus ligandos respectivos, en el sujeto. Por lo tanto inhibiendo el bloqueo de la unión de B7 endógena/ligando las interacciones entre células B7 positivas con células CD28- y/o CTLA4 positivas.
La dosificación de un agente terapéutico depende depende de muchos factores que incluyen, pero no se limitan al, tipo de tejido afectado, el tipo de enfermedad autoinmune que se está tratando, la gravedad de la enfermedad de la enfermedad, la salud del sujeto y respuesta al tratamiento con agentes. De acuerdo con lo anterior, las dosificaciones de los agentes pueden variar dependiendo de cada sujeto y el modo de administración. Las moléculas de CTLA4 solubles se pueden administrar en una cantidad de entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/kg por peso del paciente/día.
La invención también abarca el uso de las composiciones de la invención conjuntamente con otros agentes farmacéuticos para tratar enfermedades del sistema inmune. Por ejemplo, diabetes se puede tratar con las moléculas de la invención junto con, pero no se limita a, agentes inmunosupresores tales como corticosteroides, ciclosporina (Mathiesen 1989 Cancer Lett. 44(2): 151 - 156), prednisona, azatioprina, (R. Handschumacher, en: "Drugs Used for Immunosuppression" páginas 1264 - 1276), bloqueadores o antagonistas de TNF\alpha (New England Journal of Medicine, vol. 340: 253 - 259, 1999; The Lancet vol. 354: 1932 - 39, 1999, Annals of Internal Medicine, vol. 130: 478 - 486), o cualquier otro agente biológico que dirige cualquier citoquina inflamatoria, fármacos antiinflamatorios no esteroides / inhibidores de la Cox-2, hidroxicloroquina, sulfasalazopriina, sales de oro, etanercept, infliximab, rapamicina, micofenolato mofetil, azatioprina, tacrolismus, basiliximab, citoxan, interferón beta-1a, interferón beta-1b, glatiramer acetato, mitoxantrona clorhidrato, anakinra y / u otros agente biológicos.
Las moléculas de CTLA4 solubles (preferiblemente, L104EA29YIg) también se pueden usar en combinación con uno o más de los siguientes agentes que regulan una respuesta inmune: gp39 soluble (también conocida como ligando CD40 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), CD29 soluble, CD40 soluble, CD80 soluble (por ejemplo ATCC 68627), CD86 soluble, CD28 soluble (por ejemplo 68628), CD56 soluble, Thy-1 soluble, CD3 soluble, TCR soluble, VLA-4 soluble, VCAM-1 soluble, LECAM-1 soluble, ELAM-1 soluble, CD44 soluble, anticuerpos reactivos con gp39 (por ejemplo ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 y ATCC HB-12056), anticuerpos reactivos con CD40 (por ejemplo ATCC HB-9110), anticuerpos reactivos con B7 (por ejemplo ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, etc), anticuerpos reactivos con CD28 (por ejemplo ATCC HB-11944 o mAb 9.3 como se describe por Martin et al (J. Clin. Immun. 4(1): 18 - 22, 1980), anticuerpos reactivos con LFA-1 (por ejemplo ATCC HB-9579 y ATCC TIB-213), anticuerpos reactivos con LFA-2, anticuerpos reactivos con IL-2, anticuerpos reactivos con IL-12, anticuerpos reactivos con IFN-gamma, anticuerpos reactivos con CD2, anticuerpos reactivos con CD48, anticuerpos reactivos con cualquier ICAM (por ejemplo, ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 y ICAM-3), anticuerpos reactivos con CTLA4 (por ejemplo ATCC HB-304)'' anticuerpos reactivos con Thy-1, anticuerpos reactivos con CD56, anticuerpos reactivos con CD3, anticuerpos reactivos con CD29, anticuerpos reactivos con TCR, anticuerpos reactivos con VLA-4, anticuerpos reactivos con VCAM-1, anticuerpos reactivos con LECAM-1, anticuerpos reactivos con ELAM-1, anticuerpos reactivos con CD44. En ciertas realizaciones, se prefieren anticuerpos monoclonales. En otras realizaciones, se prefieren fragmentos de anticuerpos. Como las personas expertas en la técnica entenderán fácilmente, la combinación puede incluir las moléculas de CTLA4 solubles de la invención y otro agente inmunosupresor, las moléculas de CTLA4 solubles con otros dos agentes inmunosupresores, las moléculas de CTLA4 solubles con tros tres agentes inmunosupresores, etc. La determinación de la combinación óptima y dosificaciones se pueden determinar y optimizar usando procedimientos bien conocidos en la técnica.
Algunas combinaciones específicas incluyen los siguientes: L104EA29YIg y anticuerpos monoclonales (mAbs) de CD80; L104EA29YIg y mAbs de CD86; L104EA29YIg, mAbs de CD80, y CD86; L104EA29YIg y mAbs de gp39; L104EA29YIg y mAbs de CD40; L104EA29YIg y mAbs de CD28; L104EA29YIg, mAbs de CD80 y CD86, y mAbs de gp39; L104EA29YIg, mAbs de CD80 y CD86 y mAbs de CD40; y L104EA29YIg, mAb anti-LFA1, y mAb anti-gp39. Un ejemplo específico de un mAb de gp39 es MR1. Otras combinaciones serán fácilmente apreciadas y entendidas por los expertos en la técnica.
Las moléculas de CTLA4 solubles de la invención, por ejemplo L104EA29YIg, se pueden administrar solas o conjuntamente con otros fármacos en regímenes de inmunomodulación u otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de rechazo agudo o crónico de trasplantes homólogos o heterólogos o trastorno inflamatorio o autoinmune, o para inducir tolerancia. Por ejemplo, se puede usar en combinación con un inhibidor de calcineurina, por ejemplo ciclosporina A o FK506; un macrólido inmunosupresor, por ejemplo rapamicina o su derivado (por ejemplo 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina); a un agente buscador de de linfocitos, por ejemplo FTY720 o su análogo; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida o su análogo; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetil; 15-deoxispergualina o su análogo; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales a receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD 27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB o sus ligandos; u otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo CTLA4/CD28-Ig, u otros inhibidores de la molécula de adhesión, por ejemplo mAbs o inhibidores de bajo peso molecular que incluyen antagonistas de LFA-1, antagonistas de Selectina y antagonistas de VLA-4. El compuesto es particularmente útil en combinación con un compuesto que interfiere con CD40 y su ligando, por ejemplo anticuerpos con CD40 y anticuerpos para CD40-L.
Cuando las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención se administran junto con otra terapia inmunosupresora/inmunomoduladora o anti-inflamatoria, por ejemplo como se ha especificado anteriormente en el presente documento, las dosificaciones del compuesto inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio administrado conjuntamente, variará naturalmente dependiendo del tipo de cofármaco empleado, por ejemplo si es un esteroide o una ciclosporina, del fármaco específico empleado, de la afección, de la afección que se está tratando y así sucesivamente.
De acuerdo con lo anterior la presente invención proporciona todavía en un aspecto adicional procedimientos como se han definido anteriormente que comprende la administración conjunta, por ejemplo de manera simultánea o en secuencia, de una cantidad terapéuticamente eficaz de moléculas de CTLA4 solubles de la invención, por ejemplo CTLA4Ig y/o L104EA29YIg, en la forma libre o en la forma de sal farmacéuticamente aceptable, y una segunda sustancia fármaco, siendo dicha segunda sustancia fármaco un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio, por ejemplo como se ha indicado anteriormente.
Además se proporcionan combinaciones terapéuticas, por ejemplo un kit, que comprende una molécula de CTLA4 soluble, en la forma libre o en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable, a usar de manera simultánea o en secuencia con al menos una composición farmacéutica que comprende un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio, por ejemplo, NSAID, glucocorticoide o corticosteroide. El kit puede comprender instrucciones para la administración. Los kits de la invención se pueden usar en cualquier en cualquier procedimiento de la presente invención.
En otra realización de la invención, el rechazo de trasplante de tejidos u órganos se inhibe mediante la administración a un sujeto de CTLA4 soluble y células de médula ósea agotadas de células T al sujeto. La administración de médula ósea agotada de células T se puede producir a aproximadamente el mismo tiempo que el sujeto recibe el trasplante de tejido u órgano o en un momento diferente. La administración de médula ósea a aproximadamente el mismo tiempo indica que la médula ósea se administra al sujeto como parte de la preparación para los procedimientos para administrar el trasplante de tejido u órgano. No se requiere que la médula ósea se trasplante a exactamente la misma clase (es decir, en minutos) que el trasplante de órgano.
En realizaciones preferidas, la médula ósea agotada de células T se administra antes del trasplante de órganos. Las realizaciones particulares incluyen la administración de la médula ósea agotada de células T en un día, en doce horas o en seis horas del trasplante de órgano sólido. Sin embargo, la médula ósea agotada de células T se puede administrar de manera temprana, mientras que los efectos resultantes de la médula ósea agotada de células T se logran todavía junto con el trasplante de órgano o tejido. En realizaciones alternativas, puede ser deseable administrar médula ósea agotada de células T después del trasplante de órganos.
En una realización, el procedimiento comprende la administración de una dosis de células de médula ósea agotada de células T (dosis de tolerancia) a un sujeto, y posteriormente la administración de una dosis adicional de células de médula ósea agotada de células T (dosis de injerto) al sujeto. En ciertas realizaciones, el agente inmunosupresor comprende al menos uno o más tipos de ligandos que interfieren con la unión de antígeno de CD28 aCD80 y/o antígeno de CD86. Como se ha descrito anteriormente, el ligando es preferiblemente una molécula mutante de CTLA4, tal como L104EA29YIg.
Además, la cantidad de médula ósea agotada de células T se puede determinar mediante experimentación rutinaria optimizar de manera empírica. Por ejemplo, la cantidad de médula ósea agotada de células T se puede valorar durante la experimentación de rutina para ajustar la cantidad suficiente para lograr los efectos deseados.
Los procedimientos de la invención también se pueden practicar mediante administración, además de la molécula mutante de CTLA4 soluble, dos o más dosis de médula ósea agotada de células T al sujeto, sola, o en combinación con uno o más agentes inmunosupresores.
Como se ha descrito, en los procedimientos de la invención, la administración de una molécula de CTLA4 o CTLA4 mutante solubles se puede llevar a cabo de muchas formas diferentes incluyendo vías de administración locales o sistémicas. Por ejemplo, moléculas mutantes de CTLA4 solubles se pueden administrar por vía intravenosa, intramuscular, o intraperitoneal. Como alternativa, CTLA4 mutante se puede administrar por vía oral o subcutánea. Otros procedimientos de administración serán reconocidos por los expertos en la técnica. De manera similar, la médula ósea agotada de células T se puede administrar de muchas formas diferentes como conocen los expertos en la técnica. Un ejemplo es mediante infusión intravenosa.
El (los) agente inmunosupresor(s) se puede(n) administrar (antes o después de la administración del mutante de CTLA4 soluble y/o antes o después del trasplante de órgano / tejido. Preferiblemente, la médula ósea y agente inmunosupresor se administran antes de la administración de molécula mutante de CTLA4 soluble. En una realización, una primera dosis de médula ósea agotada de células T (dosis de tolerancia) y el agente inmunosupresor se administra a aproximadamente el mismo tiempo que el trasplante de órganos.
Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención. La metodología y resultados pueden variar dependiendo del objetivo propuesto de tratamiento y los procedimientos empleados. Los ejemplos no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la invención.
Ejemplos Ejemplo 1
Este ejemplo proporciona una descripción de los procedimientos usados para generar las secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas mutantes de CTLA4 solubles de la invención. Un mutante de un solo sitio L104EIg se generó y se ensayó para cinética de unión a CD80 y/o CD86. La secuencia de nucleótidos de L104EIg se usó como un molde para generar la secuencia mutante de doble sitio CTLA4, L104EA29YIg, que se ensayó para determinar la cinética de unión a CD80 y/o CD86.
Mutagénesis basada en codón CTLA4Ig
Una estrategia de mutagénesis y selección se desarrolló para identificar moléculas de CTLA4Ig mutantes que tenían velocidades de disociación más lentas (velocidades de "desconexión") a partir de las moléculas de unión de CD86. La secuencias de nucleótidos mutantes de un solo sitio se generaron usando CTLA4Ig (Patentes de Estados Unidos Números: 5.844.095; 5.851.795; y 5.885.796; Nº acceso de ATCC 68629) como molde. Los cebadores de la PCR de oligonucleótidos mutagénicos se diseñaron para mutagénesis al azar de un codón de ADNc específico permitiendo cualquier base en las posiciones 1 y 2 del codón, pero solamente guanina o timina en la posición 3 (XXG/T; también conocido como NNG/T). De esta manera, un codón específico que codifica un aminoácido se debe mutar al azar para que codifique cada uno de los 20 aminoácidos. A este respecto, la mutagénesis de XXG/T produce 32 codones potenciales que codifican cada uno de los 20 aminoácidos. Los productos de PCR que codifican mutaciones en estrecha proximidad a -M97- G107 de CTLA4Ig (véase la Figura 1 o 2), se digirieron con SacI/XbaI y se subclonaron en el vector de expresión de CTLA4Ig \piLN cortado de manera similar. Este procedimiento se usó para generar la molécula mutante de CTLA4 de un solo sitio L104EIg.
Para la mutagénesis en proximidad a S25-R33 de CTLA4Ig, se introdujo primero un sitio de restricción silencioso NheI en 5' a este bucle, mediante la mutagénesis dirigida al cebador de la PCR. Los productos de la PCR se digirieron con NheI/XbaI y se subclonaron en vectores similares de CTLA4Ig o L104EIg cortados de manera similar. Este procedimiento se usó para generar la molécula mutante de CTLA4 de doble sitio L104EA29YIg (Figura 3). En particular, la molécula de ácido nucleico que codifica la molécula mutante de CTLA4 de un solo sitio, L104EIg, se usó como molde para generar la molécula mutante de CTLA4 de doble sitio, L104EA29YIg.
Ejemplo 2
Lo siguiente proporciona una descripción de los procedimientos de selección usados para identificar los polipéptidos mutantes de CTLA4 de un solo o doble sitio, que se expresa a partir de las instrucciones descritos en el Ejemplo 1, que mostraron una mayor avidez de unión por antígenos de CD80 y CD86, comparado con las moléculas no mutadas de CTLA4Ig.
Los estudios actuales in vitro y in vivo indican que CTLA4Ig por sí misma es incapaz de bloquear completamente el cebado de células T activadas por antígeno específico. Los estudios in vitro con CTLA4Ig y cualquier anticuerpo monoclonal específico para CD80 o CD86 que miden la inhibición la proliferación de las células T indican que el anticuerpo monoclonal anti-CD80 no aumentó la inhibición de CTLA4Ig. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal anti-CD86 no aumentó la inhibición, indicando que CTLA4Ig no era eficaz en el bloqueo de las interacciones de CD86. Estos datos apoyan los hallazgos anteriores por Linsley et al. (Immunity. (1994), 1: 793 - 801) que muestran que la inhibición de las respuestas celulares mediadas por CD80 requerían aproximadamente 100 veces menos concentraciones de CTLA4Ig que para las respuestas mediadas por CD86. Basándose en estos hallazgos, se supuso que las moléculas mutantes de CTLA4 solubles que tienen una mayor avidez por CD86 que CTLA4 de tipo salvaje debe ser capaz de bloquear mejor el cebado de células activadas específicas de antígeno que CTLA4Ig.
Con este fin, las moléculas mutantes de CTLA4 solubles descritas en el Ejemplo 1 anteriormente se seleccionaron usando un procedimiento de selección novedoso para identificar varias mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4 que mejoran la avidez de unión por CD80 y CD86. Esta estrategia de selección proporcionó un procedimiento eficaz para identificar directamente los mutantes con unas velocidades más lentas de "desconexión" sin la necesidad de purificación o cuantificación de proteínas ya que la determinación de la velocidad de "desconexión" es independiente de la concentración (O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212: 457 - 468).
Se transfectaron células COS con ADN de plásmido purificado por miniprep individual y se propagó durante varios días. Se aplicó un medio de cultivo acondicionado tres días a procesadores biosensores de BIAcore (Farmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) revestidos con CD80Ig o CD86Ig solubles. La unión y disociación específica y de proteínas mutantes se midió mediante resonancia de plasmón superficial (O'Shannessy, D. J., et al., (1993) Anal. Biochem. 212: 457 - 468). Todos los experimentos se llevaron a cabo en biosensores BIAcore^{TM} o BIAcore^{TM} 2000 a 25ºC. Se inmovilizaron los ligandos sobre procesadores sensores NCM5 (Farmacia) de calidad de investigación usando acoplamiento a N-etil-N'-(dimetilaminopropil). carbodiimidN-hidroxisuccinimida (Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268 - 277; Khilko, S.N., et al. (1993) J. Biol. Chem 268: 5425 - 15434).
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Procedimiento de selección
Células COS desarrolladas en placas de tejido de 24 pocillos se transfectaron de manera transitoria con AND que codifica CTLA4Ig mutante. Medio de cultivo que contenía CTLA4Ig mutante soluble secretada se recogió 3 días después.
Se dejó que el medio de cultivo de células COS cese dejara fluir sobre procesadores biosensores BIAcore derivatizados con CD86Ig o CD80Ig (como se ha descrito en Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 26762 - 26771), y moléculas mutantes se identificaron con velocidades más lentas de "desconexión" que las observadas para CTLA4Ig de tipo salvaje. Los ADNc correspondientes a muestras de medios seleccionadas se secuenciaron y se prepare ADN para realizar la transfección transitoria de células COS a mayor escala, a partir de lo cual se preparó la proteína CTLA4Ig después de la purificación de la proteína A del medio de cultivo.
Las condiciones del análisis de BIAcore y análisis de datos de equilibrio se realizaron como se describe en J. Greene et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771, y como se describe en el presente documento.
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Análisis de datos BIAcore
Las condiciones de inicio del Senosorgrama se normalizaron hasta unidades de respuesta cero (RU) antes de análisis. Las muestras se ensayaron sobre celdas de flujo derivatizadas simuladas para determinar los valores de la unidad de respuesta de fondo (RU) debido a las diferencias de índice de refracción aparente entre soluciones. Las constantes de disociación de equilibrio (K_{d}) se calcularon a partir de representaciones gráficas de R_{eq} contra C, donde R_{eq} es la respuesta en estado constante menos la respuesta sobre un procesador derivatizado simulado y C es la concentración molar de analito. Las curvas de unión se analizaron usando el software de ajuste de curves no lineal comercial (Prism, GraphPAD Software).
Los datos experimentales se ajustaron primero a un modelo a un modelo para la unión de un ligando individual a un receptor individual (modelo de 1 solo sitio, es decir, un sistema langmuir simple, A+B AB), y constantes de asociación de equilibrio (K_{d}=[A]\cdot[B]\[AB]) se calcularon a partir de la ecuación R = R_{max}\cdotC/(K_{d}+C). Posteriormente, los datos se ajustaron al modelo de dos sitios más simple de unión a ligando (es decir, a un receptor que tiene dos sitios de unión independientes que no interactúan como se describe por la ecuación R = R_{max1}\cdotC\(K_{d1}+C)+R_{max2}\cdotC\(K_{d2}+C)).
La bondad de los ajustes de estos dos modelos se analizaron visualmente mediante comparación con los datos experimentales y estadísticamente mediante un ensayo F de las sumas de cuadrados. El modelo de un sitio más simple se eligió como el mejor ajuste, salvo que el modelo de dos sitios se ajuste significativamente mejor (p<0.1).
Los análisis de asociación y disociación se realizaron usando el Software de evaluación BIA 2.1 (Farmacia). Las constantes de velocidad de asociación k_{on} se calcularon de dos formas, asumiendo ambos ambas interacciones de un solo sitio homogéneas e interacciones de dos sitios en paralelo. Para las interacciones de un solo sitio, los valores de k_{on} se calcularon de acuerdo con la ecuación R_{t} = R_{eq}(1-exp^{-ks(t-t}_{0}), donde R_{t} es una respuesta a un tiempo dado, t; R_{eq} es la respuesta en tiempo constante; t_{0} es el tiempo al comienzo de la inyección; y k_{s} = dR/dt = k_{on}\cdotCk_{off}, y donde C es una concentración de analito, calculada en términos de sitios de unión monomérica. Para las interacciones de dos sitios los valores de k_{on} se calcularon de acuerdo con la ecuación R_{t} = R_{eq1} (1-exp ^{-ks1(t-t}_{0}) + R_{eq2} (1-exp^{ks2(t-t)}_{0}. Para cada modelo, los valores de k_{on} se determinaron a partir de la pendiente calculada (hasta aproximadamente 70% de asociación máxima) de representaciones gráficas de k_{s} contra C.
Los datos de disociación se analizaron de acuerdo con los modelos de un sitio (AB = A+B) o dos sitios (AiBj = Ai+Bj), y las constantes de velocidad (k_{off}) se calcularon a partir de las curvas de mejor ajuste. El modelo de sitio de unión se usó excepto cuando los residuos eran mayor que el fondo de la máquina (2-10 RU, de acuerdo con la máquina), en cuyo caso se usó el modelo del sitio de dos uniones. Los tiempos medios de ocupación del receptor se calcularon usando la relación t_{^{1}/_{2}} = 0.693/k_{off}.
Citometría de flujo
mAb L307.4 murino (anti-CD80) se compró en Becton Dickinson (San Jose, California) y IT2.2 (anti-B7-0 [también conocido como CD86]), de Farmingen (San Diego, California). Para la tinción inmunológica, células CHO CD80-positivas y/o CD86-positivas se retiraron de los recipientes de cultivo mediante incubación en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía EDTA 10 mM. Se incubaron primero células CHO (1 - 10 x 10^{5}) con mAbs o proteínas de fusión de inmunoglobulina en DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS), después se lavaron y se incubaron con reactivos de segunda etapa de inmunoglobulina de anti-ratón o anti-humano de cabra conjugados a isotiocianoato de fluoresceína (Tago, Burlingame, California). A las células se les proporcionó un lavado final y se analizaron sobre un FACScan (Becton Dickinson).
SDS-PAGE y Cromatografía de exclusión por tamaño
Se realizó SDS-PAGE sobre geles de Tris/glicina 4 - 20% de acrilamida (Novex, San Diego, CA). Los geles analíticos se tiñeron con azul de Coomassie, y se obtuvieron las imágenes de los ges húmedos obtenidos mediante barrido diferencial. Se analizaron CTLA4Ig (25 \mug) y L104EA29YIg (25 \mug) mediante cromatografía de exclusión de tamaño usando una columna TSK-GEL G300 SW_{XL} (7,8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) equlibrada en solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,02% de NAN_{3} a un caudal de 1,0 ml/min.
CTLA4X_{C120S} y L104EA29YX_{C120S}
CTLA4X_{C120S} de una sola cadena se preparó como se ha descrito previamente (Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270: 15417 - 15424). En resumen, un plásmido de expresión de oncostatina M CTLA4 (OMCTLA4) se usó como molde, el cebador directo,
GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEQ ID NO.: 17) se eligió para aparear las secuencias en el vector; y el cebador inverso,
GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEQ ID NO.: 18) correspondía a los últimos siete aminoácidos (es decir, aminoácidos 118 - 124) en el dominio extracelular de CTLA4, y contenía un sitio de enzima de restricción, y un codón de parada (TGA). El cebador inverso especificó una mutación C120S (cisteína a serina en la posición 120). En particular, la secuencia de nucleótidos GCA (nucleótidos 34 - 36) del cebador inverso mostrado anteriormente se reemplaza con una de las siguientes secuencias de nucleótidos: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, o GCT. Como las personas en la técnica entenderán, la secuencia de nucleótidos GCA ies una secuencia complementaria inversa del codón TGC para cisteína. De manera similar, las secuencias de nucleótidos AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, o GCT son secuencias complementarias inversas de los codones para serina. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se digirieron con HindIII/XbaI y se subclonaron direccionalmente en el vector de expresión \piLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YX_{c120S} se preparó de una manera idéntica. Cada construcción se verificó mediante secuenciación de ADN.
Identificación y caracterización bioquímica de mutantes de alta avidez
Se eligieron veinticuatro aminoácidos para mutagénesis y las \sim 2300 proteínas mutantes resultantes se ensayaron para determinar la unión a CD86Ig mediante resonancia de plasmón superficial (SPR; como se ha descrito, anteriormente). Los efectos predominantes de la mutagénesis en cada sitio se resumen en la Tabla II. La mutagénesis al azar de algunos aminoácidos en el S25-R33 aparentemente no alteraron la unión al ligando. La mutagénesis de E31 y R33 y los restos M97-Y102 dieron como resultado aparentemente una reducción de la unión a ligando. La mutagénesis de los residuos, S25, A29, y T30, K93, L96, Y103, L104, y G105, dieron como resultado velocidades lentas de "conexión" y/o lentas de "desconexión". Estos resultados confirman los hallazgos previos de los residuos en la región S25-R33, y los residuos en o cerca de M97-Y102 influencian la unión a ligandos (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180: 2049 - 2058.
La mutagénesis de los sitios S25, T30, K93, L96, Y103, y G105 dio como resultado la identificación de algunas proteínas mutantes que tenían velocidades más lentas de "desconexión" de CD86Ig. Sin embargo, en estos casos, la velocidad lenta de "desconexión" solucionó mediante una velocidad lenta de "desconexión" que dio como resultado proteínas mutantes con una avidez global para CD86Ig que era aparentemente similar a la observada con CTLA4Ig de tipo salvaje. Además, la mutagénesis de K93 dio como resultado la agregación significativa que ha sido responsable de los cambios cinéticos observados.
La mutagénesis al azar de L104 seguida de la transfección de las células COS y selección por SPR de las muestras del medio de cultivo sobre CD86Ig inmovilizada produjo seis muestras de medio que contenían proteínas mutantes con aproximadamente 2 veces velocidades más lentas de "desconexión" que CTLA4Ig de tipo salvaje. Cuando el ADNc correspondiente de estos mutantes se secuenció, cada uno de ellos se encontró que codificaba una mutación de leucina a ácido glutámico (L104E). Aparentemente, la sustitución de leucina 104 a ácido aspártico (L104D) no afectó la unión de CD86Ig.
Se repitió después la mutagénesis en cada sitio enumerado en la Tabla II, esta vez usando L104E como molde de la PCR en lugar de CTLA4Ig de tipo salvaje, como se ha descrito anteriormente. El análisis SPR, de Nuevo usando CD86Ig inmovilizada, identificó seis muestras de medio de cultivo de mutagénesis de alanina 29 con proteínas que tenían aproximadamente 4 veces más lentas las velocidades de "desconexión" que CTLA4Ig de tipo salvaje. Las dos más lentas eran las sustituciones de tirosina (L104EA29Y), dos eran leucina (L104EA29L), uno era triptófano (L104EA29W), y uno era treonina (L104EA29T). Aparentemente, no se identificaron mutantes de velocidad lenta de "desconexión" cuando alanina 29 se mutó al azar, sola, en CTLA4Ig de tipo salvaje.
El peso molecular relativo y estado de agregación de L104E purificado y L104EA29YIg se determinó mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño. L104EA29YIg (\sim1 \mug; banda 3) y L104EIg (\sim1 \mug; banda 2) aparentemente tenían la misma movilidad electroforética que CTLA4Ig (\sim1 \mug; banda 1) en condiciones reductoras (\sim50 kDa; +\betaME; más 2-mercaptoetanol) y no reductoras (\sim100 kDa; -\betaME) (Fig. 14A). La cromatografía de exclusión por tamaño demostró que L104EA29YIg (Fig. 14C) aparentemente tenía la misma movilidad que CTLA4Ig dimérica (Fig. 14B). Los máximos principales representan dímero de proteína mientras que el máximo secundario que eluía más rápido en la Fig. 14B representa agregados de peso molecular mayores. Aproximadamente 5,0% de CTLA4Ig estaba presente como agregados de peso molecular mayores pero no existía evidencia de agregación de L104EA29YIg o L104EIg. Por lo tanto, la unión más fuerte a CD86Ig observada con L104EIg y L104EA29YIg no se podía atribuir a la agregación inducida por mutagénesis.
Análisis de Equilibrio y de Unión Cinética
El análisis de equilibrio y unión cinética se realizó sobre CTLA4Ig, L104EIg, y L104EA29YIg purificada de proteína A usando resonancia de plasmón superficial (SPR). Los resultados se muestran en la Tabla I. Las constantes de disociación de equilibrio observadas (K_{d}; Tabla I) se calcularon a partir de curvas de unión generadas en un intervalo de concentraciones (5,0 - 200 nM). L104EA29YIg se une más fuertemente a CD86Ig que lo hace L104EIg o CTLA4Ig. El valor de K_{d} menor de L104EA29YIg (3,21 nM) que L104EIg (6,06 nM) o CTLA4Ig (13,9 nM) indica la mayor avidez de unión de L104EA29YIg a CD86Ig. El valor menor de K_{d} de L104EA29YIg (3,66 nM) que L104EIg (4,47 nM) o CTLA4Ig (6,51 nM) indica la mayor avidez de unión de L104EA29YIg a CD80Ig.
El análisis de unión cinética reveló que las velocidades comparativas de "conexión" para CTLA4Ig, L104EIg, y L104EA29YIg unión a CD80 eran similares, como eran las velocidades de "conexión" para CD86Ig (Tabla I). Sin embargo, las velocidades de "desconexión" para estas moléculas no eran equivalentes (Tabla I). Comparado con CTLA4Ig, L104EA29YIg tenía aproximadamente 2 veces menor velocidad de "desconexión" de CD80Ig, y aproximadamente 4 veces menor velocidad de "desconexión" de CD86Ig. L104E tenía velocidades de "desconexión" intermedias entre L104EA29YIg y CTLA4Ig. Ya que la introducción de estas no afectó significativamente a las velocidades de "conexión", el incremento en avidez para CD80Ig y CD86Ig observado con L104EA29YIg se debía probablemente a una disminución en las velocidades de "desconexión".
Para determinar si el incremento en avidez de L104EA29YIg para CD86Ig y CD80Ig se debía a las mutaciones que afectan a la forma en que cada monómero se asocia como un dímero, o si tenían avidez por la potenciación de los cambios estructurales introducidos en cada monómero, se prepararon construcciones de cadena sencilla de CTLA4 y dominios extracelulares de L104EA29Y después de la mutagénesis de cisteína 120 a serina como se ha descrito anteriormente, y por Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270: 15417 - 15424. Las proteínas purificadas CTLA4X_{C120S} y L104EA29YX_{C120S} se mostraron que eran monoméricas mediante cromatografía de permeación de gel (Linsley et al., (1995), anteriormente), antes de que sus propiedades de union a ligandos se analizaran por SPR Los resultados mostraron que la afinidad de unión de ambas proteínas monoméricas para CD86Ig era aproximadamente 35 - 80 veces menos que la observada para sus respectivos dímeros (Tabla I). Esto apoya los datos publicados previamente que establecen que la dimerización de CTLA4 era requerida para la unión de ligando de alta avidez (Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762 - 26771).
h104EA29YX_{C120s} unido con aproximadamente 2 veces mayor afinidad que CTLA4X_{C120S} a tanto CD80Ig como CD86Ig. El aumento de afinidad se debía a que la velocidad de disociación de ambos ligandos era aproximadamente 3 veces menor. Por lo tanto, la unión de ligandos más fuerte por L104EA29Y era lo más probablemente debido los cambios estructurales que potencian la avidez que se han introducido en cada cadena monomérica mejor que las alteraciones en las que la molécula está dimerizada.
Análisis de localización y estructural de mutaciones que potencian la avidez
La estructura de la solución del dominio extracelular de tipo IgV de CTLA4 se ha determinado recientemente mediante espectroscopía RMN (Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol., 4: 527 - 531. Esto permitió la localización precisa de leucina 104 y alanina 29 en los pliegues tridimensionales (Fig. 15A-B). Leucina 104 se sitúa cerca de la secuencia de aminoácidos MYPPPY altamente conservada. Alanina 29 se sitúa cerca del extremo C-terminal de la región S25-R33, que es espacialmente adyacente a la región MYPPPY. Mientras que existe una interacción significativa entre los restos y la base de estas dos regiones, no existe aparentemente interacción directa entre L104 y A29 aunque ambos comprenden parte de un núcleo hidrófobo continuo en la proteína. Las consecuencias estructurales de los mutantes que potencian la avidez se determinaron mediante modelación. La mutación A29Y se puede acomodar fácilmente en la grieta entre la región S25- R33 y la región MYPPPY, y puede servir para estabilizar la conformación de la región MYPPPY. En CTLA4 de tipo salvaje, L104 forma interacciones hidrófobas extensivas con L96 y V94 cerca de la región 1VIYPPPY. Parece altamente improbable que la mutación de ácido glutámico adopte una conformación similar a la de L104 por dos razones. Primero, hay un espacio insuficiente para acomodar la cadena secundaria de ácido glutámico más larga en la estructura sin perturbación significativa a la región S25-R33. Segundo, el coste energético de ocultación de la carga negativa de la cadena secundaria de ácido glutámico en la región hidrófoba sería grande. En cambio, los estudios de modelación predicen que la cadena secundaria del ácido glutámico se mueve hacia la superficie donde su carga se puede estabilizar mediante solvatación. Tal cambio conformacional se puede acomodar fácilmente mediante G105, con una distorsión mínima otros residuos en las regiones.
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Unión de mutantes de alta avidez a las células CHO que expresan CD80 o CD86
El análisis FACS (Fig. 9) de CTLA4Ig y moléculas mutantes que se unen a células CD80+ y CD86+CHO trasnfectadas establemente se realizó como se ha descrito en el presente documento. Las células CHO CD80-positivas y CD86-positivas se incubaron con concentraciones crecientes de CTLA4Ig, L104EA29YIg, o L104EIg, y después se lavaron. La proteína de fusión de inmunoglobulina unida se detectó se detectó usando inmunoglobulina anti-humano de cabra conjugado a isotiocianoato de fluoresceína.
Como se muestra en la Figura 9, células CHO CD80-positivas y CD86-positivas (1,5 x 10^{5}) se incubaron con las concentraciones indicadas de CTLA4Ig (cuadrados negros), L104EA29YIg (círculos), o L104EIg (triángulos) durante 2 horas a 23ºC, se lavaron y se incubaron con anticuerpo de inmunoglobulina anti-humano de cabra conjugada a isotiocianoato de fluoresceína. Se analizó la unión sobre un total de 5.000 células viables (determinación sencilla) sobre un FACScan, y se determinó la intensidad de fluorescencia media (MFI) a partir de los datos de histogramas que usan PC-LYSYS. Se corrigieron los datos a partir de la fluorescencia de fondo medida sobre células incubadas con reactivo de segunda etapa solamente (MFT = 7). El mAb L6 de control (80 \mug/ml) proporcionó MFI < 30. Estos resultados son representativos de cuatro experimentos independientes.
La unión de L104EA29YIg, L104EIg, y CTLA4Ig a células CHO transfectadas con CD80 es aproximadamente equivalente (Fig. 9A). L104EA29YIg y L104EIg se unen de manera más fuerte a las células CHO transfectadas de manera estable con CD86 humanas que lo hace CTLA4Ig (Fig. 9B).
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Ensayos funcionales
Se aislaron células T CD4-positivas mediante selección negativa inmunomagnética (Linsley et. al., (1992) J. Exp. Med. 176: 1595 - 1604). Se estimularon células T CD4-positivas aisladas con forbal miristato acetato (PMA) más células CHO CD80-positivas o CD86-positivas en la presencia de concentraciones ajustadas de inhibidor. Las células T CD4-positivas (8 -10 x 10^{4}/pocillo) se cultivaron en presencia de 1 nM PMA con o sin estimuladores de células CHO. Se midieron las respuestas proliferativas mediante la adición de 1 \muCi/pocillo de [3H]timidina durante las 7 horas finales de un cultivo de 72 horas. Se realizó la inhibición de PMA más CHO CD80-positivas, o CHO CD86-positivas, células T estimuladas por L104EA29YIg y CTLA4Ig. Los resultados se muestran en la Fig. 10. L104EA29YIg inhibe la proliferación de células CHO tratadas con PMA CD80-positivas más que CTLA4Ig (Fig. 10A). L104EA29YIg también es más eficaz CTLA4Ig en la inhibición de la proliferación de células CHO tratadas con PMA CD86-positivas (Fig. 10B). Por lo tanto, L104EA29YIg en un inhibidor más potente de la coestimulación de las células T mediada tanto por CD80- como CD86-.
La figura 11 muestra la inhibición por L104EA29YIg y CTLA4Ig de células T humanas aloestimuladas con una línea celular de linfoblastos B humanos (LCL) llamada PM que expresó CD80 y CD86 (células T a 3,0 x 10^{4}/pocillo y PM a 8,0 \times 10^{3}/pocillo). La aloestimulación primaria se produjo durante 6 días, después las células se pulsaron con ^{3}H-timidina durante 7 horas, antes se determinó la incorporación de etiqueta radiactiva.
La aloestimulación secundaria se realizó como sigue. Se recogieron las células T aloestimuladas primarias de siete días sobre medio de separación de linfocitos (LSM) (ICN, Aurora, OH) y se dejaron en reposo durante 24 horas. Las células T después se volvieron a estimular (secundario), en la presencia de cantidades ajustadas de CTLA4Ig o L104EA29YIg, mediante la adición de PM en la misma relación que antes. La estimulación se produjo durante 3 días, después las células se pulsaron con etiqueta radiactiva y se recogieron como antes. El efecto de L104EA29YIg sobre las células T aloestimulaads primarias se muestra en la Fig. 11A. El efecto de L104EA29YIg sobre las células T aloestimuladas secundarias se muestra en la Fig. 11B. L104EA29YIg inhibe las respuestas proliferativas de células T tanto primarias como secundarias mejor que CTLA4Ig.
Para medir la producción de citoquina (Figura 12), se habilitaron placas de aloestimulación secundarias por duplicado. Después de 3 días, se ensayaron medios de cultivo usando kits ELISA (Biosource, Camarillo, CA) usando las condiciones recomendadas por el fabricante. L104EA29YIg se encontró que era más potente que CTLA4Ig en el bloqueo de la producción de citoquinas IL-2, IL-4, y \gamma-IFN de células T después del estímulo alogénico secundario (Figs. 12A-C).
Los efectos de L104EA29YIg y CTLA4Ig en la respuesta de linfocitos mixtos de mono (MLR) se muestran en la Figura 13. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC'S; 3,5 x 10^{4} células/pocillo de cada mono) de 2 monos se purificaron sobre medio de separación de linfocitos (LSM) y se mezclaron con 2 \mug/ml de fitohemaglutinina (FA). Las células se estimularon 3 días después se pulsaron con etiqueta radiactiva 16 horas aantes de la recogida. L104EA29YIg inhibía la proliferación de de las células T mejor que CTLA4Ig.
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TABLA I
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TABLA II
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Ejemplo 3
Este ejemplo proporciona una descripción de pancreatectomía de donante y aislamiento de islotes, y procedimientos de trasplante de islotes en un modelo animal.
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Materiales y Procedimiento
Animales. Monos rhesus machos adolescentes criados en cautividad (Macaca mulatta) (\sim 4 - 20 kg) se usaron como receptores y donantes. La ausencia de anticuerpos donante - específico preformado en el receptor se confirmó antes del trasplante. Todos los donantes y receptores potenciales se ensayaron para anticuerpos anti-CMV y solamente los animales que eran seropositivos para CMV se usaron como receptores.
Pancreatectomía y aislamiento de islotes de donantes. La pancreatectomía del donante se realizó un día antes del trasplante. El procedimiento se realizó bajo anestesia general (una combinación de ketamina parenteral e isoflurano mediante inhalación) mediante una incisión abdominal en la línea media. Se dividieron los ligamentos esplenorrenales y esplenocólicos de manera que se movilizó el bazo, conjuntamente con la cola del páncreas. La cabecera del páncreas y segunda parte del duodeno se movilizaron después de la maniobra de Kocher. Después de la administración de heparina (200 U/kg), la aorta se canuló justo antes de su bifurcación y el animal se exanguinó. La pasta fría se colocó inmediatamente en el saco inferior y detrás del cuerpo del páncreas. El cuerpo y el cuello del páncreas se escindieron cuidadosamente mediante una disección aguda teniendo cuidado de no violar la cápsula pancreática. El conducto biliar común, los conductos pancreáticos principales y accesorios se identificaron y se ligaron, la cabecera del páncreas se diseccionó de la segunda parte del duodeno.
Se completó el aislamiento de los islotes de los monos rhesus mediante modificaciones secundarias del procedimiento automático para el aislamiento de islotes humanos (Ricordi, (1988) Diabetes, 37: 413; Ranuncoli, (2000) Cell Transplant 9: 409) usando Liberasa (Roche/Boehringer Mannheim, Indpls, IN) a una concentración de 0,47 - 0,71 mg/ml. Se usaron gradiente Euroficoll discontinuo, de tres fases (densidades 1,108, 1,097, 1,037; Meditech, Hemdon, VA) y un procesador de células sanguíneas Cobe 2991. (Gambro, Lakewood, CO) se usaron para purificación de islotes de la digestión pancreática. Las muestras de la preparación de islotes finales se tiñó con ditizona (Sigma, St. Louis, MO), y la preparación se valoró mediante conteo del número del número de islotes en cada uno de los siguientes intervalos de tamaño: 50 - 100, 100 - 150, 150 - 200, 200 - 250, 250 - 300, 300 - 350, y 350 - 400 \mum. Los datos se convirtieron matemáticamente para determinar el número de islotes con un diámetro medio de 150\mum y se expresaron como equivalentes de islotes (IEQ) (Ricordi C. et al., Acta Diabetol Lat 27: 185 - 195, 1990).
Pancreatectomía y trasplante de las células de los islotes intrahepáticos del receptor. La pancreatectomía total, sin duodenoctomía o esplenoctomía, se realizó al menos una semana antes del trasplante. La cola y cuerpo del páncreas se diseccionaron junto con la arteria y vena esplénica, que se conservó cuidadosamente mediante ligamiento y división de las ramas pancreáticas solamente. Las venas mesentérica inferior y cólica media se identificaron y se conservaron durante la disección del cuerpo del páncreas. Las venas portal y mesentérica superior se reconocieron y las venas pancreáticas se ligaron y se dividieron.
Se movilizó el duodeno y las ramas de los vasos pancreáticoduodenales que entran en el páncreas se ligaron y se dividieron, dejando las ramas duodenales intactas. El conducto biliar común se identificó y se conservó durante la disección roma entre la cabecera del páncreas y el bucle c del duodeno. Los conductos pancreáticos principales y accesorios se ligaron, se dividieron, y se retiró el páncreas de la cavidad abdominal. Todos los animales se sometieron a tolerancia a glucosa intravenosa para evaluar la eficacia del procedimiento de pancreatectomía. Todas se documentaron que eran negativas al péptido c antes del trasplante de islotes.
Durante la noche los islotes cultivados se lavaron en medio de trasplante, que consistía en medio RPMI 1640 (Mediatech) suplementado con 2,5% de albúmina sérica bovina, y se contó para determinar el número de IEQ. Después los islotes se sedimentaron y se volvieron a suspender en 20 ml de medio de trasplante complementado con 200 unidades de heparina. El trasplante de islotes intrahepáticos se realizó mediante drenaje por gravedad de los islotes en un sigmoide o rama de la vena cólica izquierda que drena en la vena portal a través de un catéter intravenoso de calibre 22.
Control de glucosa en sangre, administración de insulina, y definición de rechazo. Los niveles de glucosa en sangre en ayunas y post-prandial se controlaron dos veces al día (antes del desayuno y después de la comida) mediante una picadura en al oreja, seguido de ensayo en sangre con un glucometer elite (Bayer, Elkhart, IN). Se administró Insulina (NPH, Ultralente; Eli Lilly, Indinapolis, IN) tres veces al día con la intención de mantener la glucosa en sangre en ayunas en < 300 mg/dl en animales pancreatectomizados antes del trasplante o en aquellos que habían rechazado sus trasplantes homólogos.
Grupos experimentales y protocolos inmunosupresores. Se ensayaron dos protocolos de de tratamiento: (1) protocolo Edmonton - que usa Tacrolimus, Sirolimus, y anti-IL-2R mAb (Shapiro, A.M.J. et al, (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230 - 238) y (2) L104EA29Y-protocolo Edmonton - que usa L104EA29YIg, Sirolimus, y mAb anti-IL-2R. El grupo de control incluyó receptores tratados con un régimen inmunosupresor de base'' que tiene rapamicina y anti-IL-2R solo. Tacrolimus se proporcionó a 0,05 mg/kg dos veces al día POD 0 - 14 (niveles diana 5 - 8) y 0,06 mg/kg al día (niveles diana 3 - 5) POD 15 - 120. L104EA29YIg se administró pro vía intravenosa en la operación (10 mg/kg) y después de la operación los días 4 (15 mg/kg), 14, 28, 42, 56, 70, 84, 98, 112, 126 (20 mg/kg) para mantener los niveles en suero mayores que 30 \mug/ml. El mAb IL-2R anti-humano quimérico (0,3 mg/kg iv), se administró dentro de la operación y 4 POD. Sirolimus (Rapamune®) se administró por vía oral 1,25 mg/kg dos veces al día (niveles diana 10 - 15) POD 0 - 50, 1 mg/kg dos veces al día (niveles diana 7 - 10) POD 50 - 100, y después se redujo para terminar la dosificación por POD130. Sirolimus (Rapamune®) y Tacrolimus (Prograf®) se compraron en la Farmacia del Hospital de la Universidad de Emory. El mAb de IL-2R anti-humano quimérico (Simulect®) fue proporcionado por Novartis Farma AG (Basel, Suiza).
Necropsia. Todos los receptores tuvieron una necropsia completa realizada por el personal veterinario de Yerkes en el momento de su muerte.
Detección de anticueropos antidonante. La presencia de aloanticuerpo específico donante detectable se determinó usando citometría de flujo. Los leucocitos de sangre periférica sirvieron como las células diana para los análisis antes del trasplante. Los leucocitos aislados de ganglios linfáticos obtenidos en el momento de trasplante eran las células diana para los ensayos después del trasplante.
Estadística. La supervivencia de los injertos de islotes entre los injertos de islotes entre los grupos experimentales se compara usando el ensayo Mann-Whitaey-Wilcoxon (Armitage et al. (1987) Statistical methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publication, Oxford).
Ensayo de inmunotransferencia unido a enzima antidonante. Las respuestas se midieron mediante ensayo de immunotransferencia unido a enzimas (ELISpot) de interferon-\gamma (IFN-\gamma) usando leucocitos de sangre periférica obtenidos a partir de animales receptores y donantes. Un número igual de estimuladores (leucocitos donantes) y respondedores (leucocitos receptores) se añadieron a placas con fondo de éster celulosa (Millipore, Bedford, MA) revestidas con el anticuerpo de captura, IFN-\gamma anti-humano de ratón (clon GZ-4; Mabtech, Suecia). Después de 14 - 16 h de incubación, se añadió IFN-\gamma anti-humano de ratón biotinilado (clon 7-B6-1; Mabtech, Suecia), se retiró el anticuerpo no unido, y se añadió peroxidasa de rábano picante-Avidina D (Vector, Burlingame, CA). Se desarrollaron las manchas con 3-amino-9-etilcarbazol (Sigma). Cada mancha representa una célula que secreta IFN-\gamma; la frecuencia de estas células se puede determinar dividiendo el número de manchas generadas por el número total de células respondedoras sembradas.
Resultados
La terapia basada en el bloqueo de la ruta de CD28 prolonga la supervivencia de los trasplantes homólogos ten macacos Rhesus. Se indujo diabetes mediante pancreatectomía quirúrgica de animales receptores y se confirmó mediante ensayo de tolerancia a glucosa intravenosa antes del trasplante. Las parejas donantes - receptor se definieron basándose en la tipificación molecular usando un panel de alelos de histocompatibilidad principal definidos anteriormente (8 clases I y 12 clases II) (Lobashevsky A, et al., Tissue Antigens 54:254 - 263, (1999); Knapp LA, et al., Tissue Antigens 50: 657 - 661, (1997); Watkins D.L, Crit Rev Immunol 15: 1 - 29, (1995)). Las parejas maximizaron disparidad a ambos loci de las clases I y II. Se definió el rechazo como dos valores consecutivos de glucosa en sangre en ayunas >125 mg/dl en días posteriores. La infusión intraportal de islotes de trasplantes homólogos (>10,000 IEQ/Kg) dio como resultado una restauración inicial de euglicemia e independencia de insulina en monos diabéticos en ambos grupos.
El tratamiento de macacos pancreatectomizados con régimen de L104EA29YIg/Rapamicina/anti-1L-2R mAb prolongaba significativamente la supervivencia de los trasplantes homólogos de islotes (204, 190, 216, >220 y 56 días, respectivamente). Los animales que recibían el régimen de L104EA29YIg/Rapamicina/anti-IL-2R dio como resultado un control adecuado de glucosa como se indica por los niveles de glucosa en sangre (Figuras 5 y 16B). Además, estos animales no requerían terapia de reemplazo de insulina durante un período de tiempo significativamente prolongado (Figura 6). Por el contrario, los animales que recibían el régimen de base solo (Rapamicina/mAb anti-IL-2R) rechazaron los islotes trasplantados en una semana (Figura 16C). Los animales de control mostraron niveles significativamente elevados de glucosa en plasma en ayunas (Figuras 5). Además, los animales de control requirieron terapia de reemplazo de insulina en una semana de trasplante de islotes (Figura 6). Cuatro de los cinco animales que recibieron el régimen L104EA29YIg tuvieron supervivencia sin rechazo durante el período de tratamiento (Tabla III). El ensayo de tolerancia de glucosa intravenosa con medición de los niveles de insulina y glucosa en sangre confirmó la función de los islotes después de trasplante (animal representativo, Figuras 7 y 16D).
TABLA III Supervivencia de trasplante homólogo de islotes y tratamiento
10
A los 100 días después del trasplante, la dosificación de rapamicina disminuyó y se redujo a cero el día 121. Los animales continuaron manteniendo la insulino dependencia mientras se recibía monoterapia de L104EA29YIg. A \sim150 días después del trasplante, los receptores de los islotes remanentes recibían su dosis final de L104EA29YIg, cesando cualquier terapia de inmunosupresor.
Como se espera, \sim 1 - 2 meses después de la descontinuación de la terapia, los receptores se volvieron hiperglicémicos y requirieron terapia de insulina exógena. El análisis histológico reveló un infiltrado mononuclear, que sugería en gran medida el rechazo como la etiología de la pérdida de control de glucosa (Figura 17). En un ensayo de tolerancia a glucosa intravenosa, los animales de ensayo que recibían régimen L104EA29YIg/Rapamicina/anti-IL-2R mAb demostraron niveles normales de glucosa después del trasplante de islotes (Figuras 7 y 16D).
La frecuencia de células que producen IFN-\gamma anti-donante se detectó mediante ensayo de ELISpot y se analizó usando un sistema de formación de imágenes de inmunotransferencia. Los animales que recibían el régimen inmunosupresor de base demostró números aumentados significativamente de células T que producen IFN\gamma reactivos al donante (células 84t4.6), mientras que los animales que recibían el régimen de L104EA29YIg no tenía respuesta detectable (2 \pm 0,56 células).
La terapia de L104EA29YIg inhibe el cebado de las respuestas de células T y B anti-donante. La frecuencia de células T alo-reactivas cebadas Tse pueden detector de manera eficaz usando el ensayo ELISpot, que puede discriminar la producción de IFN-\gamma a nivel de una sola célula. Muestras de sangre periférica de los receptores de islotes se analizaron en diversos momentos tanto antes como después del trasplante para determinar su capacidad de generar IFN-\gamma en respuesta al antígeno del donante. Los animales tratados con el régimen de base solo desarrollaron rápidamente una respuesta que se puede medir anti-donante que coincidía con el rechazo 1 semana después del trasplante. Por el contrario, la frecuencia de células que producen IFN-\gamma anti-donante en animales que reciben el régimen que contiene L104EA29YIg era indetectable hasta que se retiró la terapia (los animales representativos, Figura 18A y B). De este modo, el régimen de L104EA29YIg bloqueaba eficazmente la generación de las respuestas de células T anti-donante como se mide por la capacidad de producir IFN-\gamma.
Se usó la citometría de flujo para examinar el desarrollo de respuestas de anticuerpo anti-donante. un animal dentro del grupo de control una fuerte respuesta de Ab anti-donante Ab, mientras que el otro no desarrollaba una respuesta detectable, presumiblemente debido a que se sacrificaron antes de que la respuesta del anticuerpo se pudiera medir para desarrollar una respuesta detectable (Figura 18C). Por el contrario, cuatro de los cinco animales no generaron una respuesta de anticuerpo mientras recibía la terapia de L104EA29YIg. Esto es consistente con los resultados reseñados previamente que usan CTLA4-Ig en un modelo de trasplante de islotes (Levisetti, M.G. et al., J Immunol 159: 5187 - 5191, 1997) así como nuestra experiencia en un modelo de trasplante homólogo de riñón donde los receptores no generaron anticuerpos anti-donante (Pearsow T, ET AL., (Resumen). En los Programas y Resúmenes de la 17ª Conferencia Anual de la Sociedad Americana de Médicos de Trasplantes, Chicago, 10 - 14 de mayo de 1997. Chicago, Sociedad Americana de Médicos de Trasplantes). Un animal de cinco receptores experimentaron un episodio de rechazo mientras que recibía la terapia de L104EA29YIg y posteriormente desarrolló una respuesta de anticuerpo anti-donante. Como se esperaba, los cuatro animales restantes que recibían el régimen de L104EA29YIg desarrollaron de manera consistente respuestas de anticuerpo anti-donante aproximadamente en el momento del rechazo (\sim 200 días después del trasplante, 50 días después de la dosis final de L104EA29YIg).
El trasplante de islotes se hace rápidamente una opción de tratamiento viable para pacientes con diabetes de tipo 1 frágil. Las reseñas recientes que describen los regímenes inmunosupresores sin esteroides, que dan como resultado una insulina independencia exitosa después del trasplante de islotes, han introducido un renovado optimismo para la aplicación práctica del trasplante de islotes. Mientras que la eliminación de glucocorticoides de regímenes inmunosupresores representa una etapa principal hacia delante en el esfuerzo para tratar la diabetes de tipo 1, la dependencia de la terapia del inhibidor de calcineurina para la inmunosupresión primaria puede limitar la aplicación de esta planteamiento. Los inhibidores de calcineurina tienen numerosos efectos secundarios no deseados, incluyendo nefrotoxicidad, diabetes, hipertensión, metabolismo de lípidos alterado, e hirusitismo (Kahan B.D. et al., N Engl J Med 321: 1725 - 1738, 1989; Group TUSMFLS: A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation: the U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N Engl J Med 331:1110 - 1115, 1994; de Mattos AM et al., Am J Kidney Disease 35: 333 - 346, 2000). Incluso cuando los niveles de fármaco se mantienen bajos, se pueden desarrollar efectos secundarios significativos. Esto es particularmente verdad en la población de pacientes diabéticos cuando la función renal ya puede estar alterada. De hecho, en las reseñas más recientes de Edmonton, dos pacientes con niveles de creatinina antes del trasplante ligeramente elevados tenían disminuciones significativas en la función renal aunque la terapia de inhibidor de calcineurina y por último se requería la retirada de este fármaco (Ryan E.A., et al., Diabetes 50: 710 - 719, 2001). En la misma reseña, dos tercios de los receptores desarrollaron algún grado de intolerancia a glucosa, desarrollando un cuarto diabetes franca después del trasplante que se pensó que estaba relacionado con el uso de tacrolimus. Esto subraya la naturaleza atrayente y esencial de un régimen inmunosupresor sin inhibidor de calcineurina, particularmente para el trasplante de islotes.
El bloqueo de las rutas coestimuladoras de las células T es una estrategia prometedora para el desarrollo de regímenes inmunosupresores y potencialmente tolerogénicos. Este planteamiento dirige a las células T que reciben la "señal 1" durante el período de administración de fármacos. Por ejemplo, el tratamiento durante el período después del trasplante se cree que hace a las células T aloespecíficas impotentes tras encontrarse con el nuevo órgano o tejido, mientras que otras células se quedan inalteradas (Li Y, et al., Nat Med 5:1298 - 1302, 1999). El bloqueo de la ruta CD28B7 ha demostrado ser prometedor notablemente en modelos experimentales de autoinmunidad y trasplante, haciéndolo una diana inmunosupresora particularmente atrayente en el trasplante de islotes, donde presumiblemente existen obstáculos tanto auto- como alo-inmunes. El potencial del bloqueo de CD28 en un modelo de trasplante animal de islotes se describió por Levisetti MG, et al., (J Immunol 159: 5187 - 5191, 1997). El tratamiento con CTLA4-Ig se encontró que prolonga de manera significativa, aunque modestamente la supervivencia del trasplante homólogo de islotes en primates no humanos (Levisetti MG, et al., J Immunol 159: 5187 - 5191, 1997). La monoterapia de CTLA4-Ig prolongaba poco la supervivencia de trasplante homólogo renal (Pearson T. et al., (Resumen). En Programas y Resúmenes. De la 17ª Conferencia Anual de la Sociedad Americana de Médicos de Trasplantes, Chicago, 10 - 14 de mayo de 1997. Chicago, Sociedad Americana de Médicos de Trasplantes). Recientemente, existen varias reseñas de supervivencia a largo plazo de trasplantes homólogos de islotes en modelos de primates no humanos. La terapia con mAb anti-CD40L ha mostrado los resultados más impresionantes hasta ahora; sin embargo, de manera similar a los experimentos que usan un modelo de trasplante renal, no se logró tolerancia, como la retirada de la terapia eventualmente dio como resultado el rechazo (Kenyon, N.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8132 - 8137 (1999); Kirk, A.D., et al., Nat. Med. 5, 686 - 693 (1999). EN otra reseña alentadora, Thomas et al. (Diabetes 50: 1227 - 1236, (2001)) describieron recientemente el uso de una inmunotoxina anti-CD3 y el agente modulador inmune DSG (15 deoxispergualina) para prolongar notablemente la supervivencia de islotes en los primates con diabetes inducida por estreptozotocina. Aunque prometedoras, estas reseñas, usaron agentes terapéuticos cuyo potencial clínico en el momento presente es todavía incierto.
Los datos in vivo que usan L104EA29YIg, una forma mutante de CTLA4-Ig, en el modelo de injerto homólogo de islotes de Rhesus es consistente con la evidencia in vitro que indica que esta molécula de segunda generación es un inhibidor más potente de las respuestas de las células T que la molécula precursora. Dado que CTLA4-Ig ha mostrado ya eficacia en un ensayo clínico de pacientes de psoriasis (Abrams, J.R. et al., J. Clin. Invest. 103: 1243 -
1252 (1999)), existe un entusiasmo significativo para el ensayo que usa L104EA29YIg como el inminosupersor primario. Es claramente evidente, si no sinérgico, con agentes inmunosupresores aprobados clínicamente (anti-IL-2R mAb y rapamicina) que facilita el diseño de ensayos clínicos. Los ensayos humanos iniciales con L104EA29YIg están ya en proceso en pacientes aquejados de artritis reumatoide y los sometidos a trasplante renal. Aunque uan directa comparación del protocolo basado en tacrolimus y el régimen de L104EA29YIg no se intentó debido a las toxicidades reseñadas intolerables en primates no humanos (Montgomery, S.P., et al., Am J. Transplant 1 (Suppl. 1):438, 2001), los resultados de los inventores sugieren que L104EA29YIg tiene el potencial de ser al menos tan eficaz como tacrolimus como inmunosupresor primario.
Conclusiones
Se describe un régimen inmunosupresor sin inhibidor/esteroide que proporciona protección significativa del rechazo y prolonga la supervivencia de de los trasplantes homólogos de islotes en primates no humanos. El agente biológico L104EA29YIg es un potente inmunosupresor. L104EA29YIg puede reemplazar Tacrolimus en el protocolo Edmonton, eliminando por lo tanto los efectos secundarios no deseados del inhibidor de calcineurina.
Como será evidente para los expertos en la técnica a la que la invención pertenece, la presente invención puede ser realizada en las formas diferentes de las descritas específicamente anteriormente sin salirse de las características esenciales de la invención. Las realizaciones particulares de la invención descritas anteriormente, por lo tanto, se han de considerar como ilustrativas y no restrictivas. El alcance de la presente invención es como se establece en las reivindicaciones anexas en lugar de estar limitado a los ejemplos contenidos en la descripción anterior.
<110> Bristol-Myers Squibb Company
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<120> PROCEDIMIENTOS PARA PROTEGER TRANSPLANTES DE ISLOTES ALOGÉNICOS USANDO MOLÉCULAS MUTANTES SOLUBLES CTLA4
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<130> M/44335-EP
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<140> 02734556.0
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<141> 2002-05-23
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<150> 60/293,402
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<151> 2001-05-23
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<160> 18
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<170> PatentIn version 3.1
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<213> Homo sapiens 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de CTLA4Ig
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador directo de Oncostatina M CTLA4 (OMCTLA4)
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador inverso de Oncostatina M CTLA4 (OMCTLA4)
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gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 
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42

Claims (34)

1. Uso de una molécula mutante de CTLA4 soluble en la fabricación de un medicamento para inhibir el rechazo de trasplante de células de islotes, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble comprende dominio extracelular mutado de CTLA4, teniendo el dominio extracelular mutado de CTLA4
a) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 3. o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 3;
b) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19;
c) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20;
d) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21; o
e) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 22, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 22.
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2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el trasplante de las células de los islotes es para tratar diabetes.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que diabetes es diabetes de tipo 1 o diabetes de tipo 2.
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el trasplante de las células de los islotes comprende células de islotes encapsuladas.
5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la inhibición del rechazo del trasplante de células de islotes comprende la administración de la molécula mutante de CTLA4 soluble antes, durante o después trasplante de células de islotes.
6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el dominio extracelular está condensado a un resto no-CTLA4.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el resto no-CTLA4 comprende un resto de inmunoglobulina.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el resto de inmunoglobulina es una región constante de inmunoglobulina o su parte.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la región constante de inmunoglobulina o su parte comprende una o más mutaciones para reducir la función efectora.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en el que la región constante de inmunoglobulina comprende las regiones bisagra, CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina.
11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 to 10, en el que la región constante de inmunoglobulina o su parte es una región constante de inmunoglobulina humana o de mono.
12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble es:
a) L104EA29YIg como se muestra en la Figura 3 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:6, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383);
b) L104EIg como se muestra en la Figura 19 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:8, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383);
c) L104EA29LIg como se muestra en la Figura 20 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 10, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383);
d) L104EA29TIg como se muestra en la Figura 21 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:12, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383; o
e) L104EA29WIg como se muestra en la Figura 22 que comienza con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y que termina con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO:14, que comienza con Ala en la posición 26 y que termina con Lys en la posición 383, o que comienza con Met en la posición 27 y que termina con Lys en la posición 383).
\vskip1.000000\baselineskip
13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble se usa en combinación con al menos un compuesto adicional que se selecciona entre el grupo constituido por compuestos inmunosupresores, compuestos inmunomoduladores y compuestos anti-inflammatorios.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el compuesto se selecciona entre el grupo constituido por anakinra, adrenocorticosteroides, azatioprina, basiliximab, inhibidores de calcineurina, cloroquina, corticosteroides, ciclosporina, prednisona, ciclofosfamida, citoxan, 15-deoxispergualina y sus análogos, D-penicilamina, etanercept, acetato de glatiramer, FTY720 y sus análogos, glucocorticoides, sales de oro, globulina de timocitos anti-humana de caballo (ATGAM), anti-TAC (HAT) humanizado, hidroxicloroquina, infliximab, interferón beta-1a, interferón beta-1b, leflunomida y sus análogos, globulina inmune de linfocitos, agentes buscadores de linfocitos, metoxsalen, metotrexato, clorhidrato de mitoxantrona, ácido micofenólico, micofenolato mofetil, mizoribina, NSAIDs, globulina de timocitos anti-humano de conejo, globulina inmune Rho (D), sirolismus (rapamicina) y sus derivados (por ejemplo 40-0-(2-hidroxi)etilrapamicina), sulfasalazopirina, sulfasalzinae, tacrolismus (FK-506), talidomida, bloqueadores de TNF\alpha y agentes biológicos que que dirigen una citoquina inflamatoria, inhibidores TOR, compuestos que interfieren con CD40 y CD154, gp39 soluble, CD29 soluble, CD40 soluble, CD80 soluble (por ejemplo ATCC 68627), CD86 soluble, CD28 soluble, CD56 soluble, Thy-1 soluble, CD3 soluble, TCR soluble, VLA-4 soluble, VCAM-1 soluble, LECAM-1 soluble, ELAM-1 soluble, CD44 soluble, anticuerpos reactivos con gp39 (por ejemplo ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 y ATCC HB-12056), anticuerpos reactivos con CD40 (por ejemplo ATCC HB-9110), anticuerpos reactivos con B7 (por ejemplo ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341), anticuerpos reactivos con CD28 (por ejemplo ATCC HB-11944 o mAb 9.3), anticuerpos reactivos con LFA-1 (por ejemplo ATCC HB-9579 y ATCC TIB-213), anticuerpos reactivos con LFA-2, anticuerpos reactivos con IL-2, anticuerpos reactivos con IL-12, anticuerpos reactivos con IFN-gamma, anticuerpos reactivos con CD2, anticuerpos reactivos con CD48, anticuerpos reactivos con cualquier ICAM (por ejemplo, con ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 y ICAM-3), anticuerpos reactivos con CTLA4 (por ejemplo ATCC HB-304), anticuerpos reactivos con Thy-1, anticuerpos reactivos con CD56, anticuerpos reactivos con CD3, anticuerpos reactivos con CD29, anticuerpos reactivos con TCR, anticuerpos reactivos con VLA-4, anticuerpos reactivos con VCAM-1, anticuerpos reactivos con LECAM-1, anticuerpos reactivos con ELAM-1, anticuerpos reactivos con CD44, anticuerpos monoclonales a receptores de leucocitos, por ejemplo MHC, CD2, CD3, CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB o sus ligandos, CTLA4/CD28-Ig; antagonistas de LFA-1, antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4 y mAbs de IL-2R anti-humanos.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble y el compuesto adicional se han de administrar conjuntamente.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble y el compuesto adicional se han de administrar de manera simultánea o en secuencia.
17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la inhibición del rechazo de trasplante de células de islotes comprende un régimen inmunosupresor adicional.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el régimen inmunosupresor adicional es sin glucocorticoide.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el régimen inmunosupresor adicional comprende un corticosteroide.
20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el régimen inmunosupresor adicional es calcineurina sin inhibidor.
21. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que el régimen inmunosupresor adicional comprende uno o más compuestos de la reivindicación 14.
22. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que el régimen inmunosupresor adicional comprende un inhibidor TOR y/o un agente biológico que dirige IL-2.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el inhibidor TOR es rapamicina (sirolismus) o su derivado.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el agente biológico que dirige un IL-2 es un anticuerpo reactivo con IL-2 o un mAb IL-2R antihumano.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el mAb IL-2R antihumano es basiliximab.
26. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, en el que el régimen inmunosupresor adicional comprende ácido micofenólico o micofenolato mofetil.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el régimen inmunosupresor adicional comprende un compuesto que interfiere con la unión de CD40 a CD154.
28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el compuesto que interfiere con la unión de CD40 a CD154 es un anticuerpo anti-CD40.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el compuesto que interfiere con la unión de CD40 a CD154 es un anticuerpo anti-CD154.
30. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el rechazo de trasplante de las células de los islotes comprende la administración de células de médula ósea agotada de células T.
31. El uso de acuerdo con la reivindicación 30, en el que la administración de células de médula ósea agotada de células T es a aproximadamente al mismo tiempo que la colocación del trasplante de células de islotes.
32. El uso de acuerdo con la reivindicación 30, en el que la administración de células de médula ósea agotada de células T es anterior a la colocación del trasplante de células de islotes.
33. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en el que la administración de células de médula ósea agotada de células T comprende una primera dosis y una segunda dosis.
34. Una molécula mutante de CTLA4 soluble para uso en un procedimiento de inhibición del rechazo de trasplante de células de islotes, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble comprende un dominio extracelular mutado de CTLA4, teniendo el dominio extracelular mutado de CTLA4
a) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 3, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 3;
b) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 19;
c) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 20;
d) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 21; or
e) una secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición +1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 22, o que comienza con alanina en la posición -1 y termina con ácido aspártico en la posición +124 como se muestra en la Figura 22.
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