BE1022857A1

BE1022857A1 - Immunisation contre staphylococcus aureus

Info

Publication number: BE1022857A1
Application number: BE20155175A
Authority: BE
Inventors: Fabio Bagnoli; Luigi Fiaschi; Guido Grandi; Maria Scarselli
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2016-09-27
Also published as: PL3122378T3; JP2021035950A; BE1022744A1; IL282104A; ES2769647T3; MX2016012538A; AU2015238512B2; SI3122378T1; RS59971B1; EA037818B1; SG11201606887WA; JP6894237B2; EP3639850A1; CY1122537T1; ZA201605818B; BR112016022011A2; KR20190040101A; KR20160132109A; CN106103469A; CN112521464A

Abstract

Une immunisation avec EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, Hla et un SpA mutant fournit des résultats surprenants dans un modèle d'abcès rénal d'infection à S. aureus. Le SpA mutant présente une affinité diminuée pour la partie Fcd des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3.

Description

IMMUNISATION CONTRE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Cette demande revendique les priorités des demandes de brevet européen 14161861.1 (déposée le 26 mars 2014) et 14192913.3 (déposée le 12 novembre 2014), dont l'intégralité des deux demandes est incorporée dans la présente par référence pour tous les objets.

Domaine technique

Cette invention concerne une immunisation contre une infection par S. aureus.

Contexte de l'art

Staphylococcus aureus est une bactérie sphérique Gram positif. La mortalité annuelle aux Etats-Unis dépasse celle de toutes les autres maladies infectieuses, y compris le VIH/SIDA, et S. aureus est la cause majeure d'infections de la circulation sanguine, des voies respiratoires basses, de la peau et des tissus mous. Il est également la cause prédominante des infections osseuses dans le monde entier, et ces affections sont douloureuses, invalidantes et difficiles à traiter.

Le traitement de S. aureus est de plus en plus difficile à cause du développement d'une résistance aux antibiotiques par de nombreuses souches de S. aureus. S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) est trouvé dans plus de la moitié de toutes les infections communautaires et nosocomiales. Ces dernières années ont vu l'émergence de souches de SARM qui sont également résistantes à la vancomycine, l'antibiotique de dernier ressort, et qui sont essentiellement intraitables.

Il n'existe actuellement aucun vaccin autorisé. Un vaccin à base d'un mélange de polysaccharides de la surface provenant des types bactériens 5 et 8, StaphVAX™, n'est pas parvenu à réduire les infections comparativement au groupe placebo dans un essai clinique en phase III. De façon similaire, le vaccin V710 [1], à base d'antigène IsdB [2], n'est pas parvenu à réduire le taux d'infections postopératoires à S. aureus [3].

Le besoin d'un vaccin est particulièrement aigu à cause du problème de la résistance aux antibiotiques et du fait qu'une infection à S. aureus ne fournit pas d'immunité contre une infection future en raison de ses capacités bien développées d'échapper au système immunitaire. Les propriétés permettant d'échapper au système immunitaire de S. aureus à leur tour rendent le développement de vaccins efficaces plus difficile. Les mécanismes permettant d'échapper au système immunitaire ne sont pas totalement compris, mais ils sont au moins en partie dus à la protéine staphylococcique A (SpA) , une molécule de surface de S. aureus qui se lie au Fc de l'immunoglobuline (Ig) et à la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B de type VH3. L'interaction de SpA avec les récepteurs des lymphocytes B mène à une expansion clonale et à la mort cellulaire subséquente des populations de lymphocytes B, menant à la suppression de la réponse immunitaire adaptative. La liaison de SpA au Fc d'Ig interfère avec la clairance opsonophagocytaire des staphylocoques par les leucocytes polynucléés.

Des formes mutantes de SpA avec une affinité réduite envers les immunoglobulines ont été développées. Le document WO 2011/005341 décrit une SpA avec des mutations ponctuelles dans chacun des cinq domaines de liaison à l'Ig qui réduisent la capacité de la protéine à se lier aux IgG.

La référence 4 divulgue diverses approches pour fournir des vaccins améliorés contre S. aureus, y compris deux combinaisons d'immunogènes préférées appelées « Combo-1 » et « Combo-2 ». « Combo-1 » comprenait cinq antigènes EsxA, EsxB, un Hla mutant, FhuD2, et StaOll, tandis que « Combo-2 » utilisait un fragment de IsdA à la place du Hla mutant. Ces deux combinaisons ont été testées avec des adjuvants d'hydroxyde d'aluminium et elles ont augmenté le temps de survie moyen dans un modèle de souris d'infection comparativement au tampon seul ou à l'antigène IsdB. « Combo-1 » a été également testé avec un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium et un agoniste du TLR7, et l'addition de l'agoniste du TLR7 a amélioré les réponses [5],

En dépit des résultats positifs avec « Combo-1 » et « Combo-2 », il demeure un besoin de compositions autres et améliorées pour une immunisation contre S. aureus.

Divulgation de l'invention

La protéine A (SpA) (SEQ ID NO : 43) , une protéine de la surface ancrée à la paroi cellulaire de Staphylococcus aureus, est responsable du fait gue les bactéries échappent aux réponses immunitaires innées et adaptatives. La protéine A lie les immunoglobulines au niveau de leur partie Fc, interagit avec le domaine VH3 des récepteurs des lymphocytes B stimulant de façon inappropriée la prolifération des lymphocytes B et l'apoptose, se lie aux domaines Al du facteur de von Willebrand pour activer la coagulation intracellulaire, et se lie également au récepteur 1 du TNF pour contribuer à la pathogenèse de la pneumonie staphylococcique. De par le fait que la protéine A capture les immunoglobulines et affiche des attributs toxiques, la possibilité que cette molécule de surface puisse fonctionner comme un vaccin chez les êtres humains n'a pas été poursuivie de façon rigoureuse. Ici, les inventeurs démontrent que des variants de la protéine A qui ne sont plus capables de se lier aux immunoglobulines, qui sont de cette façon débarrassés de leur potentiel toxigénique, c'est-à-dire, sont non toxigéniques, stimulent les réponses immunitaires humorales qui protègent contre la maladie staphylococcique.

Par conséquent, l'invention propose des antigènes SpA mutants tels que décrits ci-dessous. Lesdits mutants présentent de préférence une affinité diminuée pour la partie FcD des IgG humaines par rapport au SpA non modifié. Les mutants peuvent également présenter une affinité diminuée, par rapport au SpA non modifié, pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3.

Les inventeurs ont découvert que le vaccin « Combo-1 » connu peut être amélioré en ajoutant une protéine staphylococcique A (SpA) mutante qui a été modifiée pour diminuer son affinité pour la partie FcD des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B contenant VH3. Cet antigène supplémentaire augmente l'efficacité protectrice de la combinaison et fournit des résultats surprenants dans un modèle d'abcès rénal. Aucune des combinaisons d'antigènes testées dans la référence 4 n'incluait un antigène SpA.

Par conséquent, l'invention propose en outre une composition immunogène comprenant les antigènes EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla, caractérisée en ce que la composition comprend en outre un antigène SpA mutant, où le mutant présente une affinité diminuée, par rapport au SpA non modifié, pour la partie FcD des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3. L'invention propose également une composition immunogène comprenant : (i) au moins un antigène choisi dans le groupe constitué des antigènes EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla ; et (ii) un antigène SpA mutant qui présente une affinité diminuée, par rapport au SpA non modifié, pour la partie FcD des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3. Ainsi, 1, 2, 3, 4 ou de préférence les 5 de EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla peuvent être utilisés en combinaison avec le SpA mutant.

Sauf définition contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés dans la présente ont la même signification que celle couramment comprise par l'homme du métier.

Pour des raisons pratiques, la signification de certains termes et de certaines phrases employés dans la description, les exemples et les revendications est fournie.

Antigènes de S. aureus L'invention concerne entre autres un antigène SpA mutant. La SpA de type sauvage (protéine staphylococcique A) est une protéine de la surface ancrée à la paroi cellulaire qui est un facteur de virulence crucial pour les infections pulmonaires, la septicémie, et le développement d'abcès et elle est exprimée par la plupart des isolats cliniques de S. aureus. La SpA de type sauvage se lie à la partie Fc des IgG humaines, aux récepteurs des lymphocytes B contenant VH3, au facteur de von Willebrand au niveau de son domaine Al, et au récepteur 1 du TNF-D. L'interaction de la SpA avec les récepteurs des lymphocytes B mène à une expansion clonale et à la mort cellulaire subséquente des populations de lymphocytes B avec des effets sur les réponses immunitaires adaptatives et innées, tandis que sa liaison au FcD des IgG interfère avec la clairance opsonophagocytaire des staphylocoques par les leucocytes polynucléés. La partie N-terminale de la SpA mature est composée de quatre ou cinq domaines de liaison d'Ig de 56 à 61 résidus, qui se replient en faisceaux à triple hélice reliés par des lieurs (« linkers ») courts, et sont désignés dans l'ordre par E, D, A, B, et C [6] . Ces domaines affichent ~80 % d'identité au niveau des acides aminés, ont une longueur de 56 à 61 résidus, et sont organisés sous forme de répétitions en tandem [7] . La région C-terminale est composée de « Xr », un octapeptide hautement répétitif cependant variable, et de « Xc », un domaine qui jouxte la structure d'ancre à la paroi cellulaire de la SpA. '

Dans la souche NCTC 8325, spa est SAOUHSC_00069 et a la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 43 (GI : 88193885) . Dans la souche Newman, il est nwmn_0055 (GI : 151220267) . Les antigènes SpA utilisés dans l'invention peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 43 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 43 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 43, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces antigènes SpA comprennent des variants de SEQ ID NO : 43. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 43. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 43 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 43. Les 35 acides aminés C-terminaux finaux de SEQ ID NO : 43 peuvent être omis de façon utile. Les 36 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 43 peuvent être omis de façon utile. La référence 8 suggère que des domaines de liaison d'IgG individuels pourraient être des immunogènes utiles, seuls ou en combinaison.

Un fragment utile de SEQ ID NO : 43 correspond aux acides aminés 37 à 325. Ce fragment contient les cinq domaines de liaison d'Ig de SpA (qui sont arrangés naturellement de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale dans l'ordre E, D, A, B, C) et comprend le domaine le plus exposé de SpA. Il réduit également la similarité de l'antigène avec les protéines humaines. D'autres fragments utiles peuvent omettre 1, 2, 3 ou 4 des domaines naturels A, B, C, D et/ou E pour prévenir l'expansion excessive des lymphocytes B et ensuite l'apoptose qui pourrait survenir si spa fonctionne comme un superantigène des lymphocytes B. Comme il est rapporté dans la référence 18, d'autres fragments utiles peuvent comprendre seulement 1, 2, 3 ou 4 des domaines naturels A, B, C, D et/ou E, par exemple comprendre seulement le domaine SpA(A) mais pas B à E, ou comprendre seulement le domaine SpA(D) mais pas A, B, C ou E, etc. Ainsi, un antigène spa utile pour l'invention peut comprendre 1, 2, 3, 4 ou 5 domaines de liaison des IgG, mais idéalement en comprend 4 ou moins.

Ainsi, un autre fragment utile de SpA comprend ou est constitué de la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 50 dans laquelle le doublet d'acides aminés en positions 60 et 61 n'est pas Gln-Gln. Ledit doublet peut être muté comme il est décrit ci-dessous, par exemple en Lys-Arg. Ainsi, ledit fragment peut comprendre ou être constitué de SEQ ID NO : 51 ou 52 .

Si un antigène comprend seulement un type de domaine de spa (par exemple, seulement le domaine SpA(A), SpA(D) ou SpA(E)), il peut comprendre plus d'une copie de ce domaine, par exemple, des domaines SpA(E) multiples dans une seule chaîne polypeptidique. Il peut comprendre également un type de domaine de SpA et une autre protéine ou un autre polypeptide. Ainsi, un antigène de l'invention peut être une protéine de fusion comprenant seulement un type de domaine de SpA, comme le domaine SpA(E), et un autre antigène protéinique, comme EsxA ; EsxB ; FhuD2 ; StaOll ; et Hla.

Les antigènes SpA de l'invention sont mutés par rapport à SEQ ID NO : 43, de telle façon qu'ils présentent une affinité diminuée pour la partie FcD des IgG humaines. Par exemple, le dipeptide QQ au niveau des résidus 60-61 de SEQ ID NO : 43 peut être muté pour réduire l'affinité pour les immunoglobulines. Des substitutions de dipeptides utiles à un dipeptide QQ sont discutées ci-dessous, et une substitution préférée est un dipeptide KR. Ainsi, un antigène SpA utile peut comprendre SEQ ID NO : 49, dans laquelle un ou plusieurs (de préférence la totalité) des 11 dipeptides XX diffèrent des dipeptides correspondants au sein de SEQ ID NO : 43. Par exemple, l'antigène SpA peut comprendre SEQ ID NO : 46, et un exemple préféré de SEQ ID NO : 46 est SEQ ID NO : 47. Lorsqu'il est exprimé avec une méthionine N-terminale, l'antigène SpA comprenant SEQ ID NO : 47 peut être constitué de SEQ ID NO : 48.

Les antigènes SpA utilisés dans l'invention peuvent être en outre mutés par rapport à SEQ ID NO : 43, de telle façon qu'ils présentent une affinité diminuée pour la partie FcD des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3. Ceci peut être obtenu et estimé, par exemple, en suivant les indications dans la référence 9. Ainsi, au moins un dipeptide Gln-Gln dans le SpA de type sauvage peut être muté (par exemple, en Lys-Lys ; d'autres mutations possibles comprennent Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Ala-Ala, Ser-Ser, Ser-Thr, Thr-Thr, etc.) et/ou au moins un dipeptide Asp-Asp dans le SpA de type sauvage peut être muté (par exemple, en Ala-Ala ; d'autres mutations possibles comprennent Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg, Arg-Lys, His-His, Val-Val, etc.). Ces séquences cibles pour une mutation sont soulignées ci-dessous, où les tirets séparent les cinq domaines de liaison d'Ig : MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTP-AANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGF IQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK-ADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQS LKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK-ADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPS QSANLLSEAKKLNESQAPK-ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLL AEAKKLNDAQAPK-ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKL NDAQAPK-EE DNNKPGKE DNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKE DNNKPGKE DGNKPGKE DNKKPGK EDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHWKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADN KLADKNMIKPGQELWDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRR EL (SEQ ID NO: 43)

Un domaine individuel au sein de l'antigène peut être muté au niveau de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides aminés ou plus par rapport à SEQ ID NO : 43 (par exemple, voir ci-dessus en relation avec les séquences Gln-Gln et Asp-Asp, mais voir également la référence [22] qui divulgue des mutations au niveau des résidus 3 et/ou 24 du domaine D, au niveau du résidu 46 et/ou 53 du domaine A, etc.)· De telles mutations ne devront pas éliminer la capacité de l'antigène à déclencher un anticorps qui reconnaît SEQ ID NO : 43, mais éliminera la liaison de l'antigène aux IgG et/ou à d'autres protéines humaines (comme des protéines du sang humain) comme il a été noté ci-dessus. En particulier, l'antigène SpA mutant est de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 43 mutée dans au moins 1, plus particulièrement au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 et de manière même plus particulière 20 acides aminés au niveau de la position 43, 44, 70, 71, 104, 105, 131, 132, 162, 163, 190, 191, 220, 221, 247, 248, 278, 279, 305 et/ou 306 de SEQ ID NO : 43. Les substitutions utiles pour ces positions sont mentionnées ci-dessus.

En outre, l'extrémité N-terminale native peut être éliminée, et les 36 premiers acides aminés de SEQ ID NO : 43 peuvent être omis de façon utile. De façon similaire, l'extrémité C-terminale native peut être éliminée, et la séquence en aval du cinquième domaine de liaison d'Ig peut être omise de façon utile (c'est-à-dire, en aval de Lys-327 dans SEQ ID NO : 43) . Ainsi, un antigène SpA utile comprend SEQ ID NO : 44 :

AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFN KDXXSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKXXPSQS TNVLGEAKKLNE SQAPKADNNFNKEXXNAF YEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLP NLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLTEEQR NGFIQSLKXXPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK dans laquelle les 10 dipeptides XX soulignés diffèrent des dipeptides correspondants au sein de SEQ ID NO : 43. Ainsi un QQ au niveau de ces positions dans SEQ ID NO : 43 ne sera pas QQ dans SEQ ID NO : 44, et idéalement n'inclut pas de résidu de glutamine, par exemple, il est KK. De façon similaire, un DD au niveau de ces positions dans SEQ ID NO : 43 ne sera pas DD dans SEQ ID NO : 44, et idéalement n'inclut pas de résidu d'aspartate, par exemple, il est AA. La forme préférée de SpA pour une utilisation dont fait l'invention comprend ainsi SEQ ID NO : 45.

En plus des substitutions au niveau des dipeptides XX dans SEQ ID NO : 44, il est possible de modifier la séquence d'acides aminés avec jusqu'à 5 changements d'acides aminés simples à condition que la séquence modifiée puisse déclencher des anticorps qui se lient encore à un polypeptide constitué de SEQ ID NO : 44. Ainsi, SEQ ID NO : 45 peut être modifiée par 1, 2 ou 3 substitutions au niveau de positions en dehors des dipeptides XX au sein de SEQ ID NO : 44. Par exemple, le dipeptide QQ au niveau des résidus 60-61 de SEQ ID NO : 44 peut être muté pour encore réduire l'affinité pour les immunoglobulines. Les substitutions de dipeptides utiles à un dipeptide QQ sont discutées ci-dessus, et une substitution préférée est le dipeptide KR. Ainsi, un antigène SpA utile peut comprendre SEQ ID NO : 49, dans laquelle un ou plusieurs (de préférence la totalité) des 11 dipeptides XX diffèrent des dipeptides correspondants au sein de SEQ ID NO : 43. Par exemple, l'antigène SpA peut comprendre SEQ ID NO : 4 6, et un exemple préféré de SEQ ID NO : 46 est SEQ ID NO : 47. Lorsqu'il est exprimé avec une méthionine N-terminale, l'antigène SpA comprenant SEQ ID NO : 47 peut être constitué de SEQ ID NO : 48.

Comme il a été discuté ci-dessus, un fragment utile de SpA peut comprendre seulement 1, 2, 3 ou 4 des domaines naturels A, B, C, D et/ou E, par exemple, comprendre seulement le domaine SpA(E) mais pas D, A, B ou C. Ainsi, un antigène SpA utile pour l'invention peut comprendre seulement le domaine SpA(E) muté comme il a été décrit ci-dessus, c'est-à-dire la séquence d'acides aminés comprenant ou étant constituée de SEQ ID NO : 54 mutée dans au moins 1 acide aminé au niveau des positions 60 et 61 de SEQ ID NO : 54, les acides aminés 1 à 67 de SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 ou SEQ ID NO : 49, ou les acides aminés 1 à 68 de SEQ ID NO : 48. Par exemple, ledit antigène peut comprendre SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 52 ou SEQ ID NO : 53. Ledit antigène de préférence ne comprendra pas une autre séquence que SpA. Il peut comprendre plus d'une copie du domaine SpA(E), et/ou en outre comprendre un autre antigène protéinique comme un antigène EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, ou Hla tel que décrit dans la présente.

Les combinaisons d'antigènes de l'invention utilisent 1, 2, 3, 4 ou les 5 des antigènes suivants : EsxA ; EsxB ; FhuD2 ; StaOll ; et Hla. Ces cinq antigènes sont déjà connus de l'état de l'art (par exemple, voir les références 4-514) et d'autres détails sont donnés ci-dessous. Une composition particulièrement utile comprend les cinq de ces antigènes (de préférence où le Hla est une forme mutante non toxique (c'est-à-dire détoxifiée)). L'antigène « EsxA » dans la souche NCTC 8325 a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 (GI : 88194063) . Les antigènes EsxA utilisés dans la présente invention peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 1 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 1 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 1, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou plus). Ces polypeptides EsxA comprennent des variants de SEQ ID NO : 1. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 1. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 1 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 1. L'antigène « EsxB » dans la souche NCTC 8325 a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2 (GI : 88194070) . Les antigènes EsxB utilisés dans la présente invention peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 2 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 2 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 2, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou plus). Ces polypeptides EsxB comprennent des variants de SEQ ID NO : 2. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 2. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 2 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 2. A un antigène EsxB utile, il manque le résidu de cystéine interne de SEQ ID NO : 2, par exemple, il comprend SEQ ID NO : 35, dans laquelle le résidu X en position 30 est soit absent soit un résidu d'acide aminé sans groupe thiol libre (dans des conditions réductrices), par exemple, il est un acide aminé naturel quelconque à l'exception d'une cystéine. L'antigène « FhuD2 » est annoté comme « protéine de liaison du ferrichrome », et il a été également étudié dans la littérature [15] . Il a été également connu comme « Sta006 » (par exemple, dans les références 4-14). Dans la souche NCTC 8325, FhuD2 a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3 (GI : 88196199). Les antigènes FhuD2 utilisés dans la présente invention peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 3 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 3 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 3, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces polypeptides FhuD2 comprennent des variants de SEQ ID NO : 3. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 3. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 3 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 3. Les 17 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 3 peuvent être omis de façon utile (pour fournir SEQ ID NO : 6) . Des formes mutantes de FhuD2 sont rapportées dans la référence 16. A un antigène FhuD2 utile, il manque le résidu de cystéine de SEQ ID NO : 3, par exemple, il comprend SEQ ID NO : 34 et ne comprend aucun résidu d'acide aminé avec un groupe thiol libre (dans des conditions réductrices) , par exemple, il est dépourvu de cystéine. Un antigène FhuD2 peut être lipidé, par exemple avec une cystéine N-terminale acylée. Une séquence de FhuD2 utile est SEQ ID NO : 7, qui a une séquence Met-Ala-Ser-à l'extrémité N-terminale ; SEQ ID NO : 37 est une autre séquence de ce type, mais il lui manque la cystéine présente dans SEQ ID NO : 7. L'antigène « StaOll » a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4 (GI : 88193872) dans la souche NCTC 8325. Les antigènes StaOll utilisés dans la présente invention peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 4 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 4 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 4, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces polypeptides StaOll comprennent des variants de SEQ ID NO : 4. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 4. A d'autres fragments préférés, il mangue un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 4 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 4. Les 23 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 4 peuvent être omis de façon utile (pour fournir SEQ ID NO : 33) . A un antigène StaOll utile, il manque le résidu de cystéine de SEQ ID NO : 4, par exemple, il comprend SEQ ID NO : 36 et ne comprend aucun résidu d'acide aminé avec un groupe thiol libre (dans des conditions réductrices) , par exemple, il est dépourvu de cystéine. Un antigène StaOll peut être lipidé, par exemple, avec une cystéine N-terminale acylée. Une séquence de StaOll utile est SEQ ID NO : 8, qui comporte une méthionine N-terminale ; SEQ ID NO : 39 est une autre séquence de ce type, mais il lui manque la cystéine présente dans SEQ ID NO : 8. Des formes variantes de SEQ ID NO : 4 qui peuvent être utilisées en tant que ou pour préparer des antigènes StaOll comprennent, mais n'y sont pas limitées, SEQ ID NO : 9, 10 et 11 avec divers substitutions Ile/Val/Leu (et des variants dépourvus de Cys de ces séquences peuvent être également utilisés dans l'invention). StaOll peut exister sous la forme d'un monomère ou d'un oligomère, avec des ions Ca++ favorisant 1'oligomérisation. L'invention peut utiliser des monomères et/ou des oligomères de StaOll. L'antigène « Hla » est le « précurseur de l'alpha-hémolysine » connu également comme la « toxine alpha » ou simplement « 1'hémolysine ». Dans la souche NCTC 8325, Hla a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5 (GI : 88.194865) . Hla est un déterminant de virulence important produit par la plupart des souches de S. aureus, possédant une activité de formation de pores et hémolytique. Les anticorps anti-Hla peuvent neutraliser les effets délétères de la toxine dans des modèles animaux, et Hla est particulièrement utile pour une protection contre la pneumonie.

Les antigènes Hla utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 5 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 5 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 5, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces antigènes Hla comprennent des variants de SEQ ID NO : 5. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 5. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 5 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 5. Les 26 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 5 peuvent être omis de façon utile (par exemple, pour donner SEQ ID NO : 12) . La troncature à l'extrémité C-terminale peut être également utilisée, par exemple, en laissant seulement 50 acides aminés (résidus 27 à 76 de SEQ ID NO : 5) [17].

En particulier, l'antigène Hla est un antigène Hla détoxifié, c'est-à-dire une forme mutante de Hla, où la toxicité naturelle de Hla a été éliminée. La toxicité de Hla peut être évitée par une inactivation chimique (par exemple, en utilisant du formaldéhyde, du glutaraldéhyde ou d'autres réactifs de réticulation). Toutefois, à la place, il est préférable d'utiliser des formes mutantes de Hla qui éliminent son activité toxique tout en conservant son immunogénicité. Plus particulièrement, l'antigène Hla détoxifié est une forme mutante de Hla, où la toxicité de Hla a été éliminée alors que l'immunogénicité de Hla a été retenue. De tels mutants détoxifiés sont déjà connus de l'état de l'art. Un antigène Hla préféré est une hémolysine mutante de S. aureus comportant une mutation au niveau du résidu 61 de SEQ ID NO : 5, qui est le résidu 35 de l'antigène mature (c'est-à-dire, après omission des 26 premiers acides aminés N-terminaux = résidu 35 de SEQ ID NO : 12) . Ainsi, le résidu 61 ne peut pas être une histidine, et il peut à la place être, par exemple, Ile, Val ou de préférence Leu. Une mutation His-Arg au niveau de cette position peut être également utilisée. Par exemple, SEQ ID NO : 13 est la séquence de la forme mutante H35L mature de Hla (par exemple, SEQ ID NO : 12 avec une mutation H35L) et un antigène Hla détoxifié utile est de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 13. Une autre mutation utile remplace une longue boucle par une courte séquence, par exemple, pour remplacer le 39-mer au niveau des résidus 136 à 174 de SEQ ID NO : 5 par un tétramère comme PSGS (SEQ ID NO : 14), comme dans SEQ ID NO : 15 (qui comprend également la mutation H35L) et SEQ ID NO : 16 (qui ne comprend pas la mutation H35L). Une autre mutation utile remplace le résidu Y101, par exemple, par une leucine (SEQ ID NO : 17) .

Une autre mutation utile remplace le résidu D152, par exemple, par une leucine (SEQ ID NO : 18). Un autre mutant utile remplace les résidus H35 et Y101, par exemple, par une leucine (SEQ ID NO : 19) . Un autre mutant utile remplace les résidus H35 et D152, par exemple, par une leucine (SEQ ID NO : 20). D'autres antigènes Hla utiles sont divulgués dans les références 18 et 19. SEQ ID NO : 21, 22 et 23 sont trois fragments utiles de SEQ ID NO : 5 ('Hla27-76', 'Hla27-89' et 'Hla27-79' , respectivement) . SEQ ID NO : 24, 25 et 26 sont les fragments correspondants à partir de SEQ ID NO : 13.

Une séquence de Hla utile est SEQ ID NO : 27. Elle comporte une Met N-terminale, puis un dipeptide Ala-Ser provenant du vecteur d'expression, puis SEQ ID NO : 13 (provenant de la souche NCTC8325) y compris la mutation H35L.

Lorsqu'une composition comprend les deux antigènes EsxA et EsxB, ceux-ci peuvent être présents sous la forme d'un seul polypeptide (c'est-à-dire, sous la forme d'un polypeptide de fusion comprenant ou constitué à la fois de EsxA et EsxB) . Ainsi, un polypeptide unique peut déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'il est administré à un être humain) qui reconnaissent à la fois SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2. Le polypeptide unique peut comprendre : (i) une première séquence polypeptidique présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 1 et/ou comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 1, comme il a été défini ci-dessus pour EsxA ; et (ii) une seconde séquence polypeptidique présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 2 et/ou comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 2, comme il a été défini ci-dessus pour EsxB. Les première et seconde séquences polypeptidiques peuvent être dans n'importe quel ordre, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale. SEQ ID NO : 28 (« EsxAB ») et 29 (« EsxBA ») sont des exemples de tels polypeptides, les deux comportant des lieurs (« linkers ») hexapeptidiques ASGGGS (SEQ ID NO : 30) . Un autre hybride « EsxAB » comprend SEQ ID NO : 31, qui peut être fourni avec une méthionine N-terminale (par exemple, SEQ ID NO : 32) . A un variant utile de EsxAB, il manque le résidu de cystéine interne de EsxB, par exemple, il comprend SEQ ID NO : 40 dans laquelle le résidu X en position 132 est soit absent soit un résidu d'acide aminé sans groupe thiol libre (dans des conditions réductrices), par exemple, il est un acide aminé naturel quelconque à l'exception d'une cystéine. Ainsi, un antigène EsxAB préféré pour une utilisation dont fait l'invention a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 38.

Ainsi, un polypeptide utile comprend une séquence d'acides aminés (a) présentant 80 % ou plus d'identité (par exemple, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 31 ; et/ou (b) comprenant à la fois, un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs des acides aminés 1 à 96 de SEQ ID NO : 31, et un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs des acides aminés 103 à 205 de SEQ ID NO : 31, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus). Ces polypeptides (par exemple, SEQ ID NO : 32) peuvent déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaissent à la fois la protéine staphylococcique de type sauvage comprenant SEQ ID NO : 1 et la protéine staphylococcique de type sauvage comprenant SEQ ID NO : 2. Ainsi la réponse immunitaire reconnaîtra les deux antigènes EsxA et EsxB. Les fragments préférés de (b) fournissent un épitope provenant de SEQ ID NO : 1 et un épitope provenant de SEQ ID NO : 2. L'invention utilise 1, 2, 3, 4 ou les 5 de EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla (de préférence un Hla mutant non toxique). Comme il a été mentionné ci-dessus, une composition particulièrement utile comprend les cinq de ces antigènes, mais dans certains modes de réalisation, l'invention comprend seulement 1, 2, 3 ou 4 de ces cinq antigènes, c'est-à-dire, 1, 2, 3 ou 4 de EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla est absent de la composition.

Une composition préférée comprend les quatre de : (i) un polypeptide unique comprenant à la fois un antigène EsxA et un antigène EsxB, par exemple comprenant SEQ ID NO : 31 ; (ii) un antigène FhuD2, par exemple, comprenant SEQ ID NO : 6 ; (iii) un antigène StaOll, par exemple, comprenant SEQ ID NO : 33 ; et (iv) une forme mutante H35L de Hla, par exemple, comprenant SEQ ID NO : 13.

Bien que SEQ ID NO : 31, 6, 33 et 13 soient des séquences d'acides aminés utiles dans une combinaison, l'invention n'est pas limitée à ces séquences précises. Ainsi, 1, 2, 3 ou les 4 de ces séquences peuvent être modifiées indépendamment par jusqu'à 5 changements d'acides aminés simples (c'est-à-dire, 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés simples) à condition que la séquence modifiée puisse déclencher des anticorps qui se lient encore à un polypeptide constitué de la séquence non modifiée.

Une autre composition utile comprend les quatre de : (i) un premier polypeptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 32 ; (ii) un deuxième polypeptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7 ; (iii) un troisième polypeptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8 ; et (iv) un quatrième polypeptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 27.

Bien que SEQ ID NO : 32, 7, 8 et 27 soient des séquences d'acides aminés utiles dans une combinaison, l'invention n'est pas limitée à ces séquences précises. Ainsi, 1, 2, 3 ou les 4 de ces séquences peuvent être modifiées indépendamment par 1, 2, 3, 4 ou 5 changements d'acides aminés simples (c'est-à-dire, 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, délétions et/ou insertions d'acides aminés simples) à condition que la séquence modifiée puisse déclencher des anticorps qui se lient encore à un polypeptide constitué de la séquence non modifiée. Dans un mode de réalisation préféré, une composition comprend ainsi ces quatre polypeptides spécifiés avec 1, 2, 3 ou les 4 de SEQ ID NO : 32, 7, 8 et 27 modifiées indépendamment par 1 substitution, délétion et/ou insertion d'acide aminé simple.

Par exemple, les séquences polypeptidiques de FhuD2, StaOll et EsxAB de type sauvage (par exemple, SEQ ID NO : 6, 31 et 33) comprennent chacune un seul résidu de cystéine qui peut mener à des ponts disulfure interpolypeptidiques, formant à la fois des homodimères et des hétérodimères. De tels polypeptides interliés sont indésirables et ainsi les séquences de Sta006, StaOll et EsxAB peuvent être modifiées pour éliminer leurs résidus de cystéine naturels, de telle façon qu'elles ne contiennent pas de groupe thiol libre (dans des conditions réductrices). La cystéine de type sauvage peut être délétée ou elle peut être substituée par un acide aminé différent.

Ainsi : un antigène FhuD2 peut comprendre SEQ ID NO : 34 ; un antigène StaOll peut comprendre SEQ ID NO : 3 6 ; un antigène EsxB peut comprendre SEQ ID NO : 35 (par exemple, sous la forme d'un hybride EsxAB comprenant SEQ ID NO : 40). Les exemples de ces séquences comprennent, mais n'y sont pas limités, SEQ ID NO : 37, 39, et 38. Ces séquences peuvent être utilisées en simple en tant que substituts aux séquences de type sauvage correspondantes, ou en combinaison. Ainsi, une composition particulièrement utile comprend les quatre de : (i) un premier polypeptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 38 ; (ii) un deuxième polypeptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 37 ; (iii) un troisième polypeptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 39 ; et (iv) un quatrième polypeptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 27.

Ainsi, une composition préférée de l'invention comprend les cinq de : (i) un polypeptide unique comprenant à la fois un antigène EsxA et un antigène EsxB, par exemple, comprenant SEQ ID NO : 31 ; (ii) un antigène FhuD2, par exemple, comprenant SEQ ID NO : 6 ; (iii) un antigène StaOll, par exemple, comprenant SEQ ID NO : 33 ; (iv) une forme mutante H35L de Hla, par exemple, comprenant SEQ ID NO : 13 ; et (v) un SpA mutant, par éxemple, comprenant SEQ ID NO : 45 ou 47, ou un antigène comprenant un seul domaine de celui-ci, par exemple, SEQ ID NO : 50, 51, 52 ou 53. Ainsi, en particulier, la composition selon l'invention comprend : (i) un polypeptide unique comprenant à la fois un antigène EsxA et un antigène EsxB, particulièrement de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 31 ; (ii) un antigène FhuD2, particulièrement de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 6 ; (iii) un antigène StaOll, particulièrement de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 33 ; (iv) une forme mutante H35L de HLA, particulièrement de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 13 ; et (v) un antigène SpA mutant, particulièrement de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 47, ou SEQ ID NO : 52.

Une autre composition préférée selon l'invention comprend : (i) un premier polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 32, plus particulièrement constituée de SEQ ID NO : 32' ; (ii) un deuxième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 7, plus particulièrement constituée de SEQ ID NO : 7 ; (iii) un troisième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 8, plus particulièrement constituée de SEQ ID NO : 8 ; (iv) un quatrième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 27, plus particulièrement constituée de SEQ ID NO : 27 ; et (v) un cinquième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 52, plus particulièrement comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 45 modifiée par jusqu'à 3 substitutions d'acides aminés (par exemple, comprenant SEQ ID NO : 47 ou constituée de SEQ ID NO : 48).

Une autre composition préférée selon l'invention comprend : (i) un premier polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 38, plus particulièrement constituée de SEQ ID NO : 38 ; (ii) un deuxième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 37, plus particulièrement constituée de SEQ ID NO : 37 ; (iii) un troisième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 39, plus particulièrement constituée de SEQ ID NO : 39 ; (iv) un quatrième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 27, plus particulièrement constituée de SEQ ID NO : 27 ; et (v) un cinquième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 52, plus particulièrement comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 45 modifiée par jusqu'à 3 substitutions d'acides aminés (par exemple, comprenant SEQ ID NO : 47 -ou constituée de SEQ ID NO : 48).

Les protéines (i) à (v) dans ces combinaisons peuvent, comme il a été expliqué ci-dessus, être modifiées indépendamment par jusqu'à 5 changements d'acides aminés simples à condition que la séquence modifiée puisse déclencher des anticorps qui se lient toujours à un polypeptide constitué de la séquence non modifiée. Dans certains modes de réalisation, une composition peut comprendre un ou plusieurs autres polypeptides ; dans d'autres modes de réalisation, les seuls peptides dans une composition sont ces cinq polypeptides spécifiés, et ces polypeptides peuvent même être les seuls composants immunogènes dans une composition.

Lorsque plus d'un polypeptide est présent, ils peuvent être présents à des masses substantiellement égales, c'est-à-dire que la masse de chacun d'entre eux se situe à i 5 % de la masse moyenne de tous les polypeptides. Ainsi, lorsque cinq polypeptides sont présents, ils peuvent être présents dans un rapport de masse de a/b/c/d/e, où chacun de a à e se situe entre 0,95 et 1,05.

En dehors de EsxA, EsxB, Hla, FhuD2, StaOll, et SpA, il existe d'autres antigènes de S. aureus, et une composition peut comprendre éventuellement un ou plusieurs autres antigènes de S. aureus. Par exemple, des antigènes à la fois saccharidiques et polypeptidiques sont connus pour S. aureus. Ainsi, une composition pourra comprendre un antigène saccharidique de S. aureus, par exemple, les antigènes saccharidiques connus comprennent 1'exopolysaccharide de S. aureus, qui est une poly-N-acétylglucosamine (PNAG), et les saccharides capsulaires de S. aureus, qui peuvent être, par exemple, de type 5, de type 8 ou de type 336. Une composition pourra également comprendre un antigène ClfA, un antigène IsdA, un antigène IsdB, un antigène IsdC, et/ou un antigène IsdH (chacun tel que défini aux pages 15 à 17 de la référence 5) .

Dans certains modes de réalisation, une composition comprend un antigène de S. aureus tel que défini ci-dessus, et également un antigène provenant d'un organisme différent (par exemple, provenant d'un virus ou d'une autre bactérie).

Compositions immunogènes et médicaments

Les compositions immunogènes selon l'invention peuvent être utiles en tant que vaccins. Les vaccins selon l'invention peuvent être soit prophylactiques (c'est-à-dire, pour prévenir une infection) soit thérapeutiques (c'est-à-dire, pour traiter une infection), mais ils seront généralement prophylactiques.

Les compositions peuvent être ainsi pharmaceutiquement acceptables. Elles comprendront habituellement des composants en plus des antigènes, par exemple, elles comprendront généralement un ou plusieurs supports et/ou excipients pharmaceutiquement acceptables. Une discussion complète portant sur de tels composants est disponible dans la référence 121.

Les compositions seront généralement administrées à un mammifère sous forme aqueuse. Toutefois, avant l'administration, la composition peut avoir été sous une forme non aqueuse. Par exemple, bien que certains vaccins soient fabriqués sous forme aqueuse, puis versés et répartis et administrés également sous forme aqueuse, d'autres vaccins sont lyophilisés durant la fabrication et sont reconstitués sous une forme aqueuse au moment de l'utilisation. Ainsi, une composition peut être séchée, comme une formulation lyophilisée. La référence 10 divulgue l'utilisation de la lyophilisation avec des compositions immunogènes de S. aureus.

Une composition peut comprendre des conservateurs comme le thiomersal ou le 2-phénoxyéthanol. Toutefois, il est préférable que le vaccin soit substantiellement dépourvu (c'est-à-dire, moins de 5 Dg/ml) de matériau mercuriel, par exemple, dépourvu de thiomersal. Les vaccins ne contenant aucun mercure sont davantage préférés. Les vaccins dépourvus de conservateur sont particulièrement préférés.

Pour améliorer la stabilité thermique, une composition peut comprendre un agent protecteur contre la température (voir ci-dessous).

Pour contrôler la tonicité, il est préférable d'inclure un sel physiologique, comme un sel de sodium. Le chlorure de sodium (NaCl) est préféré, lequel peut être présent à une concentration située entre 1 et 20 mg/ml, par exemple, environ 10 ± 2 mg/ml de NaCl. D'autres sels qui peuvent être présents comprennent le chlorure de potassium, le dihydroqénophosphate de potassium, le phosphate disodique déshydraté, le chlorure de magnésium, le chlorure de calcium, etc.

Les compositions auront généralement une osmolalité située entre 200 mOsm/kg et 400 mOsm/kg, de préférence entre 240 et 360 mOsm/kg, et elle se situera de manière davantage préférée au sein de la plage de 290 à 310 mOsm/kg.

Les compositions peuvent comprendre un ou plusieurs tampons. Les tampons types comprennent : un tampon phosphate ; un tampon Tris ; un tampon borate ; un tampon succinate ; un tampon histidine (particulièrement avec un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium) ; ou un tampon citrate. Les tampons seront généralement inclus dans la plage de 5 à 20 mM.

Les compositions peuvent comprendre un chélateur d'ions métalliques, en particulier un chélateur d'ions métalliques bivalents comme l'EDTA. La référence 10 divulgue que l'inclusion d'EDTA peut améliorer la stabilité des compositions divulguées dans la présente. La concentration finale d'EDTA dans une composition immunogène peut être d'environ 1 à 50 mM, environ 1 à 10 mM ou environ 1 à 5 mM, de préférence environ 2,5 mM.

Le pH d'une composition sera généralement situé entre 5,0 et 8,1, et plus généralement entre 6,0 et 8,0, par exemple, 6,5 et 7,5, ou entre 7,0 et 7,8.

La composition est de préférence stérile. La composition est de préférence non pyrogène, par exemple, contenant < 1 UE (unité d'endotoxine, une mesure classique) par dose, et de préférence < 0,1 UE par dose. La composition est de préférence dépourvue de gluten.

La composition peut comprendre du matériau pour une seule immunisation, ou elle peut comprendre du matériau pour des immunisations multiples (c'est-à-dire, un kit « multidose »). L'inclusion d'un conservateur est préférée dans les arrangements multidoses. Comme variante (ou en outre) à l'inclusion d'un conservateur dans les compositions multidoses, les compositions peuvent être contenues dans un récipient comportant un adaptateur aseptique pour le prélèvement du matériau.

Les infections à S. aureus peuvent affecter diverses zones du corps et ainsi une composition peut être préparée sous des formes variées. Par exemple, une composition peut être préparée sous la forme d'injectables, soit sous la forme de solutions liquides soit sous la forme de suspensions. Des formes solides appropriées pour une solution, ou une suspension, dans des véhicules liquides avant l'injection peuvent être également préparées (par exemple, une composition lyophilisée ou une composition cryodesséchée par pulvérisation) . Une composition peut être préparée pour une administration topique, par exemple, sous la forme d'une pommade, d'une crème ou d'une poudre. Une composition peut être préparée pour une administration orale, par exemple, sous la forme d'un comprimé ou d'une capsule, sous la forme d'une pulvérisation, ou sous la forme d'un sirop (éventuellement aromatisé). Une composition peut être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple, sous la forme d'un inhalateur, en utilisant une poudre fine ou une pulvérisation. Une composition peut être préparée sous la forme d'un suppositoire ou d'un ovule. Une composition peut être préparée pour une administration nasale, auriculaire ou oculaire, par exemple, sous la forme de gouttes. Une composition peut être sous forme de kit, conçu de telle façon qu'une composition combinée est reconstituée juste avant l'administration à un patient. De tels kits peuvent comprendre un ou plusieurs antigènes sous forme liquide et un ou plusieurs antigènes lyophilisés.

Lorsqu'une composition doit être préparée extemporanément juste avant l'utilisation (par exemple, lorsqu'un composant est présenté sous forme lyophilisée) et est présenté sous la forme d'un kit, le kit peut comprendre deux flacons, ou il peut comprendre une seringue préremplie et un flacon, avec le contenu de la seringue étant utilisé pour réactiver le contenu du flacon avant l'injection.

Les vaccins humains sont généralement administrés dans un volume de dosage d'environ 0,5 ml, bien qu'un demi-volume (c'est-à-dire, environ 0,25 ml) puisse être utile, par exemple, pour les enfants.

Les compositions immunogènes administrées selon l'invention peuvent également comprendre un ou plusieurs agents immunorégulateurs. De préférence, un ou plusieurs des agents immunorégulateurs comprennent un ou plusieurs adjuvants (voir ci-dessous).

Les compositions peuvent déclencher à la fois une réponse immunitaire à médiation cellulaire ainsi qu'une réponse immunitaire humorale. Cette réponse immunitaire induira de préférence des anticorps de longue durée (par exemple, neutralisants) et une immunité à médiation cellulaire qui peut rapidement répondre lors d'une exposition à S. aureus.

Les compositions immunogènes utilisées en tant que vaccins comprennent une quantité immunologiquement efficace d'antigène (s), ainsi que de tous les autres composants éventuels, selon les besoins. Par « quantité immunologiquement efficace », il est signifié que l'administration de cette quantité à un individu, soit en une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité varie selon la santé et la condition physique de l'individu à traiter, l'âge, le groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple, primate non humain, primate, etc.), la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection désiré, la formulation du vaccin, l'estimation du médecin traitant de la situation médicale, et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que la quantité se situe au sein d'une plage relativement large qui peut être déterminée à l'aide d'essais de routine. Lorsque plus d'un antigène est inclus dans une composition, alors deux antigènes peuvent être présents à la même dose l'un par rapport à l'autre ou à des doses différentes.

Comme il a été susmentionné, une composition peut comprendre un agent protecteur contre la température, et ce composant peut être particulièrement utile dans les compositions adjuvées (particulièrement celles contenant un adjuvant minéral, comme un sel d'aluminium). Comme il est décrit dans la référence 20, un agent protecteur contre la température liquide peut être ajouté à une composition vaccinale aqueuse pour abaisser son point de congélation, par exemple, pour réduire le point de congélation au-dessous de 0 °C. Ainsi, la composition peut être stockée au-dessous de 0 °C, mais au-dessus de son point de congélation, pour inhiber la dégradation thermique. L'agent protecteur contre la température permet également de congeler la composition tout en protégeant les adjuvants à base de sels minéraux contre une agglomération ou une sédimentation après la congélation et la décongélation, et il peut également protéger la composition à des températures élevées, par exemple, au-dessus de 40 °C. Un vaccin aqueux de départ et l'agent protecteur contre la température liquide peuvent être mélangés de telle façon que l'agent protecteur contre la température liquide forme de 1 à 80 % en volume du mélange final. Les agents protecteurs contre la température appropriés devront être sans risque pour une administration à un être humain, facilement miscibles/solubles dans l'eau, et ils ne devront pas endommager les autres composants (par exemple, l'antigène et l'adjuvant) dans la composition. Les exemples comprennent la glycérine, le propylène glycol, et/ou le polyéthylène glycol (PEG). Les PEG appropriés peuvent avoir un poids moléculaire moyen situé dans la plage de 200 à 20 000 Da. Dans un mode de réalisation préféré, le polyéthylène glycol peut avoir un poids moléculaire moyen d'environ 300 Da (« PEG-300 »).

Procédés de traitement, et administration d'une composition immunogène L'invention concerne la composition immunogène selon l'invention pour une utilisation en tant que médicament. L'invention concerne également la composition immunogène selon l'invention pour une utilisation en tant que médicament dans la prévention et/ou le traitement d'une infection à S. aureus. L'invention propose également un procédé pour la prévention et/ou le traitement d'une infection à S. aureus chez un mammifère comprenant l'étape d'administration à un mammifère en ayant besoin d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition immunogène selon l'invention telle que définie ci-dessus. Les modes de réalisation avantageux sont tels que définis ci-dessus. L'invention propose également l'utilisation de (i) au moins un antigène choisi dans le groupe constitué des antigènes EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla, et (ii) un

antigène SpA mutant qui présente une affinité diminuée, par rapport à un SpA non modifié, pour la partie FcD des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3, dans la fabrication d'un médicament pour la prévention ou le traitement d'une infection à S. aureus chez un mammifère. Les modes de réalisation avantageux sont tels que définis ci-dessus. L'invention propose également (i) au moins un antigène choisi dans le groupe constitué des antigènes EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla, et (ii) un antigène SpA mutant qui présente une affinité diminuée, par rapport à un SpA non modifié, pour la partie FcD des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3, pour une utilisation dans l'immunisation d'un mammifère pour prévenir ou traiter une infection à S. aureus. Les modes de réalisation avantageux sont tels que définis ci-dessus. L'invention propose également (i) au moins un antigène choisi dans le groupe constitué des antigènes EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla, et (ii) un antigène SpA mutant qui présente une affinité diminuée, par rapport à un SpA non modifié, pour la partie FcD des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3, pour une utilisation dans un procédé d'immunisation d'un mammifère pour prévenir ou traiter une infection à S. aureus par l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace des antigènes au mammifère. Les modes de réalisation avantageux sont tels que définis ci-dessus.

Comme il a été noté ci-dessus, 1, 2, 3, 4 ou de préférence les 5 de EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla peuvent être utilisés en combinaison avec le SpA mutant. De cette manière, les procédés, les utilisations, les compositions et les combinaisons d'antigènes de l'invention déclenchent une réponse immunitaire qui est efficace pour la prévention ou le traitement des infections à S. aureus. La réponse immunitaire peut impliquer des anticorps et/ou une immunité à médiation cellulaire. En soulevant une réponse immunitaire chez le mammifère par ces utilisations et ces procédés, le mammifère peut être protégé contre une infection à S. aureus, y compris une infection nosocomiale. Plus particulièrement, le mammifère peut être protégé contre une infection de la peau, une pneumonie, une méningite, une ostéomyélite, une endocardite, un syndrome de choc toxique, et/ou une septicémie. L'invention est également utile pour protéger contre une infection à S. aureus des os et des articulations d'un mammifère (et ainsi pour prévenir des troubles comprenant, mais sans y être limités, l'ostéomyélite, l'arthrite septique, et l'infection de prothèses articulaires). Dans de nombreux cas, ces troubles peuvent être associés à la formation d'un biofilm de S. aureus. S. aureus infecte divers mammifères (y compris des vaches, des chiens, des chevaux, et des porcs), mais le mammifère préféré pour une utilisation dont fait l'invention est un être humain. L'être humain peut être un enfant (par exemple, un jeune enfant ou un nourrisson), un adolescent, ou un adulte. Dans certains modes de réalisation, l'être humain peut avoir une prothèse osseuse ou articulaire, ou il peut être un receveur prévu pour de telles prothèses (par exemple, un patient de chirurgie orthopédique en préopératoire). Un vaccin prévu pour les enfants peut être également administré à des adultes, par exemple, pour estimer l'innocuité, le dosage, l'immunogénicité, etc. Toutefois, les vaccins ne sont pas appropriés uniquement pour ces groupes et ils peuvent être utilisés plus généralement dans une population humaine.

Une manière pour vérifier l'efficacité d'un traitement thérapeutique implique la surveillance d'une infection à S. aureus après l'administration des compositions ou des antigènes selon l'invention. Une manière pour vérifier l'efficacité d'un traitement prophylactique implique la surveillance des réponses immunitaires, au niveau systémique (comme la surveillance du taux de production des IgGl et des IgG2a) et/ou au niveau mucosal (comme la surveillance du taux de production des IgA) , contre les antigènes dans la composition administrée après son administration. Une autre manière pour estimer l'immunogénicité des compositions est d'exprimer les antigènes de façon recombinante pour cribler les sérums ou les sécrétions mucosales des patients par immunoblot et/ou micropuces. Une réaction positive entre la protéine et l'échantillon du patient indique que le patient a monté une réponse immunitaire contre la protéine en question. L'efficacité des compositions vaccinales peut être également déterminée in vivo par stimulation (« challenging ») de modèles animaux d'infection à S. aureus, par exemple, des cobayes ou des souris, avec les compositions vaccinales. Il existe trois modèles animaux généralement utiles pour l'étude d'une maladie infectieuse à S. aureus, à savoir : (i) le modèle d'abcès murin [21], (ii) le modèle d'infection létale murin [21] , et (iii) le modèle de pneumonie murin [22] . Le modèle d'abcès murin exmaine les abcès dans les reins de souris après stimulation (« challengin ») intraveineuse. Le modèle d'infection létale murin examine le nombre de souris qui survivent après avoir été infectées par une dose normalement létale de S. aureus par la voie intraveineuse ou intrapéritonéale. Le modèle de pneumonie examine également le taux de survie, mais utilise une infection intranasale. D'autres modèles utiles sont divulgués dans la référence 23 pour l'étude à la fois d'une maladie à S. aureus en relation avec une infection d'implant médiée par un biofilm, d'une infection de la peau et des tissus mous (IPTM) , et d'une septicémie. Un vaccin utile peut être efficace dans un ou plusieurs de ces modèles. Par exemple, pour certaines situations cliniques, il peut être souhaitable de protéger contre la pneumonie, sans avoir besoin de prévenir la diffusion hématique ou de favoriser l'opsonisation ; dans d'autres situations, le souhait principal peut être de prévenir la diffusion hématique ou la septicémie. Différents antigènes, et différentes combinaisons d'antigènes, peuvent contribuer à différents aspects d'un vaccin efficace.

Les compositions seront généralement administrées directement à un patient. Une administration directe peut être accomplie par une injection parentérale (par exemple, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par voie mucosale, comme par voie rectale, orale (par exemple, un comprimé, une pulvérisation), vaginale, topique, transdermique ou transcutanée, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou une autre administration mucosale. L'injection intramusculaire est la voie la plus typique pour l'administration des compositions selon l'invention. L'invention peut être utilisée pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosale, de préférence pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosale amplifiée. De préférence, une immunité systémique et/ou mucosale amplifiée est reflétée par une réponse immunitaire TH1 et/ou TH2 amplifiée. De préférence, la réponse immunitaire amplifiée comprend une augmentation de la production des IgGl et/ou des IgG2a et/ou des IgA.

Le dosage peut être administré par un calendrier d'une dose unique ou un calendrier de doses multiples. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un calendrier d'immunisation de sensibilisation et/ou dans un calendrier d'immunisation de rappel. Dans un calendrier de doses multiples, les diverses doses peuvent être données par la même voie ou par des voies différentes, par exemple, une sensibilisation parentérale et un rappel mucosal, une sensibilisation mucosale et un rappel parentéral, etc. Les doses multiples seront généralement administrées à au moins 1 semaine d'écart (par exemple, environ 2 semaines, environ 3 semaines, environ 4 semaines, environ 6 semaines, environ 8 semaines, environ 10 semaines, environ 12 semaines, environ 16 semaines, etc.).

Les compositions immunogènes peuvent être administrées à des patients substantiellement en même temps (par exemple, durant la même consultation médicale ou visite à un professionnel de santé ou un centre de vaccination) que d'autres vaccins.

Les compositions immunogènes peuvent être administrées à des patients en combinaison avec un antibiotique. Par exemple, elles peuvent être administrées substantiellement en même temps qu'un antibiotique. De façon similaire, elles peuvent être administrées à un sujet qui reçoit un traitement antibiotique. De façon similaire, elles peuvent être administrées comme faisant partie d'un cotraitement qui implique l'administration à la fois d'une composition telle que discutée dans la présente et d'un antibiotique. L'antibiotique sera efficace contre une bactérie S. aureus, par exemple, un bêta-lactame.

Souches et variants

Les antigènes sont discutés ci-dessus en référence à une nomenclature existante (par exemple, « EsxA ») et à des exemples de séquences donnés en numéros GI et également dans le listage de séquences. L'invention n'est pas limitée à ces séquences précises. Les séquences génomiques de plusieurs souches de S. aureus sont disponibles, y compris celles des souches de SARM N315 et Mu50 (24], MW2, N315, COL, MRSA252, MSSA476, RF122, USA300 (très virulente), JH1, JH9, NCTC 8325, et Newman. Des techniques classiques de recherche et d'alignement peuvent être utilisées pour identifier parmi l'une quelconque de ces (ou autres) séquences génomiques, l'homologue de toute séquence particulière mentionnée dans la présente. En outre, les séquences spécifiques divulguées dans la présente peuvent être utilisées pour concevoir des amorces pour l'amplification de séquences homologues provenant d'autres souches. Ainsi, l'invention englobe de tels variants et homologues provenant d'une souche quelconque de S. aureus, ainsi que des variants non naturels. En général, les variants appropriés d'une SEQ ID NO particulière comprennent ses variants alléliques, ses formes polymorphes, ses homologues, ses orthologues, ses paralogues, ses mutants, etc.

Ainsi, par exemple, les polypeptides utilisés dans l'invention peuvent, comparativement à la SEQ ID NO dans la présente, comprendre une ou plusieurs (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) substitutions d'acides aminés, comme des substitutions conservatives (c'est-à-dire, des substitutions d'un acide aminé par un autre qui comporte une chaîne latérale . apparentée). Les acides aminés codés génétiquement sont généralement divisés en quatre familles : (1) acides, c'est-à-dire, aspartate, glutamate ; (2) basiques, c'est-à-dire, lysine, arginine, histidine ; (3) non polaires, c'est-à-dire, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane ; et (4) polaires non chargés, c'est-à-dire, glycine, asparagine, glutamine, cystéine, sérine, thréonine, tyrosine. La phénylalanine, le tryptophane, et la tyrosine sont parfois classés ensemble en tant qu'acides aminés aromatiques. En général, la substitution d'acides aminés simples au sein de ces familles n'a pas d'effet majeur sur l'activité biologique. Les polypeptides peuvent également comprendre une ou plusieurs (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) délétions d'acides aminés simples par rapport aux séquences SEQ ID NO. Les polypeptides peuvent également comprendre une ou plusieurs (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) insertions (par exemple, chacune de 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés) par rapport aux séquences SEQ ID NO.

De façon similaire, un polypeptide utilisé dans l'invention peut comprendre une séquence d'acides aminés qui : (a) est identique (c'est-à-dire, identique à 100 %) avec une séquence divulguée dans le listage de séquences ; (b) partage une identité de séquence (par exemple, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec une séquence divulguée dans le listage de séquences (idéalement sur la longueur entière de ladite séquence) ; (c) présente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 (ou plus) modifications d'acides aminés simples (délétions, insertions, substitutions), qui peuvent être au niveau d'emplacements séparés ou qui peuvent être contiguës, comparativement aux séquences de (a) ou (b) ; ou (d) lorsqu'elle est alignée avec une séquence particulière issue du listage de séquences en utilisant un algorithme d'alignement par paires, chaque fenêtre mobile de x acides aminés de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale (de telle façon que pour un alignement qui s'étend à p acides aminés, où p > x, il y a p - x + 1 de ces fenêtres) comporte au moins x-y acides aminés alignés identiques, où : x est choisi parmi 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 ; y est choisi parmi 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0, 91, 0,92, 0, 93, 0,94, 0,95, 0, 96, 0, 97, 0, 98, 0,99 ; et si x-y n'est pas un nombre entier, alors il est arrondi au nombre entier le plus proche. L'algorithme d'alignement par paires préféré est l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch [25] en utilisant les paramètres par défaut (par exemple, avec une pénalité d'ouverture de brèche = 10,0, et avec une pénalité d'extension de brèche = 0,5, en utilisant la matrice de score EBLOSUM62). Cet algorithme est mis en œuvre de façon pratique dans l'outil needle dans le progiciel EMBOSS [26].

Lorsque des polypeptides hybrides sont utilisés, les antigènes individuels au sein de l'hybride (c'est-à-dire les entités -X- individuelles) peuvent provenir d'une ou de plusieurs souches. Lorsque n = 2, par exemple, X2 peut provenir de la même souche que Χχ, ou d'une souche différente. Lorsque n = 3, les souches peuvent être (i) Χχ=Χ2=Χ3 (ii) Χχ=Χ2^Χ3 (iü) Χχ^Χ2=Χ3 (iv) Χχ^Χ2^Χ3 or (v) Χχ=Χ3^Χ2, etc.

Au sein du groupe (c), les délétions ou les substitutions peuvent être à l'extrémité N-terminale et/ou à l'extrémité C-terminale, ou elles peuvent se situer entre les deux extrémités. Ainsi, une troncature est un exemple d'une délétion. Les troncatures peuvent impliquer la délétion de jusqu'à 40 (ou plus) acides aminés à l'extrémité N-terminale et/ou à l'extrémité C-terminale. Une troncature N-terminale peut éliminer des peptides de tête, par exemple, pour faciliter l'expression recombinante dans un hôte hétérologue. Une troncature C-terminale peut éliminer des séquences d'ancrage, par exemple, pour faciliter l'expression recombinante dans un hôte hétérologue.

En général, lorsqu'un antigène comprend une séquence qui n'est pas identique à une séquence complète de S. aureus provenant du listage de séquences (par exemple, lorsqu'elle comprend un listage de séquences avec < 100 % d'identité de séquence avec celle-ci, ou lorsqu'elle comprend un fragment de celle-ci), il est préférable dans chaque cas individuel que l'antigène puisse déclencher un anticorps qui reconnaît la séquence complète respective de S. aureus.

Polypeptides utilisés dans l'invention

Les polypeptides utilisés dans l'invention peuvent prendre diverses formes (par exemple, native, fusion, glycosylée, non glycosylée, lipidée, non lipidée, phosphorylée, non phosphorylée, myristoylée, non myristoylée, monomérique, multimérique, etc.).

Les polypeptides utilisés dans l'invention peuvent être préparés par divers moyens (par exemple, une expression recombinante, une purification à partir de cultures cellulaires, une synthèse chimique, etc.). Les protéines exprimées de façon recombinante sont préférées, particulièrement pour les polypeptides hybrides.

Les polypeptides utilisés dans l'invention sont de préférence fournis sous une forme purifiée ou substantiellement purifiée, c'est-à-dire, substantiellement dépourvus d'autres polypeptides (par exemple, dépourvus de polypeptides existant à l'état naturel), particulièrement d'autres polypeptides staphylococciques ou de la cellule hôte, et ils sont en général au moins purs à environ 50 % (en poids), et habituellement au moins pur à environ 90 %, c'est-à-dire, moins qu'environ 50 %, et de manière davantage préférée moins qu'environ 10 % (par exemple, 5 %) d'une composition est constituée d'autres polypeptides exprimés. Ainsi, les antigènes dans les compositions sont séparés de l'organisme entier avec lequel la molécule est exprimée.

Le terme « polypeptide » se rapporte à des polymères d'acides aminés de toute longueur. Le polymère peut être linéaire ou ramifié, il peut comprendre des acides aminés modifiés, et il peut être interrompu par des acides non aminés. Le terme englobe également un polymère d'acides aminés qui a été modifié naturellement ou par intervention ; par exemple, formation de liaisons disulfure, glycosylation, lipidation, acétylation, phosphorylation, ou toute autre manipulation ou modification, comme une conjugaison avec un composant de marquage. Sont également compris, par exemple, des polypeptides contenant un ou plusieurs analogues d'acides aminés (y compris, par exemple, des acides aminés non naturels, etc.), ainsi que d'autres modifications connues de l'état de l'art. Les polypeptides peuvent apparaître sous la forme de chaînes simples ou de chaînes associées.

Bien que l'expression des polypeptides de l'invention puisse prendre place dans un Staphylococcus, l'invention utilisera habituellement un hôte hétérologue pour une expression (expression recombinante). L'hôte hétérologue peut être procaryote (par exemple, une bactérie) ou eucaryote. Ce peut être E. coli, mais d'autres hôtes appropriés comprennent Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (par exemple, M. tuberculosis) , des levures, etc. Comparativement aux gènes de type sauvage de S. aureus codant pour les polypeptides de l'invention, il est utile de changer les codons pour optimiser l'efficacité de l'expression dans de tels hôtes sans affecter les acides aminés codés.

Adj uvants

Comme il a été susmentionné, les compositions immunogènes utilisées selon l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants. Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans l'invention comprennent, mais n'y sont pas limités : A. Compositions contenant des minéraux

Les compositions contenant des minéraux appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent des sels minéraux, comme des sels d'aluminium et des sels de calcium (ou leurs mélanges) . Les sels de calcium comprennent le phosphate de calcium (par exemple, les particules de « CAP » divulguées dans la référence 27) . Les sels d'aluminium comprennent des hydroxydes et des phosphates, etc., avec les sels prenant toute forme appropriée (par exemple, gel, cristalline, amorphe, etc.). L'adsorption sur ces sels est préférée (par exemple, tous les antigènes peuvent être adsorbés). Les compositions contenant des minéraux peuvent être également formulées sous la forme d'une particule de sel de métal [28] .

Les adjuvants connus comme 1'hydroxyde d'aluminium et le phosphate d'aluminium peuvent être utilisés. Ces noms sont conventionnels, mais sont utilisés uniquement pour des raisons pratiques, car ni l'un ni l'autre n'est une description précise du véritable composé chimique qui est présent (par exemple, voir le chapitre 9 de la référence 29) . L'invention peut utiliser l'un quelconque des adjuvants « hydroxyde » ou « phosphate » qui sont en général utilisés en tant qu'adjuvants. Les adjuvants connus comme « 1'hydroxyde d'aluminium » sont généralement des sels d'oxyhydroxyde d'aluminium, qui sont habituellement au moins partiellement cristallins. Les adjuvants connus comme le « phosphate d'aluminium » sont généralement des hydroxyphosphates d'aluminium, contenant aussi souvent une petite quantité de sulfate (c'est-à-dire, hydroxyphosphate sulfate d'aluminium). Ils peuvent être obtenus par précipitation, et les conditions réactionnelles et les concentrations durant la précipitation influencent le degré de substitution du phosphate à l'hydroxyle dans le sel.

Une morphologie fibreuse (par exemple, comme il est observé sur les micrographies électroniques à transmission) est typique des adjuvants d'hydroxyde d'aluminium. Le pi des adjuvants d'hydroxyde d'aluminium est généralement d'environ 11, c'est-à-dire que l'adjuvant lui-même possède une charge de surface positive à pH physiologique. Des capacités d'adsorption entre 1,8 et 2,6 mg de protéine par mg de Al+++ à pH 7,4 ont été rapportées pour les adjuvants d'hydroxyde d'aluminium.

Les adjuvants de phosphate d'aluminium présentent généralement un rapport molaire PO4/AI entre 0,3 et 1,2, de préférence entre 0,8 et 1,2, et de manière davantage préférée 0,95 ± 0,1. Le phosphate d'aluminium sera généralement amorphe, particulièrement pour les sels d'hydroxyphosphate. Un adjuvant type est 1 'hydroxyphosphate d'aluminium amorphe avec un rapport molaire PO4/AI entre 0,84 et 0,92, y compris à 0,6 mg de Al3+/ml. Le phosphate d'aluminium sera généralement particulaire (par exemple, une morphologie de type plaque comme il est observé sur les micrographies électroniques à transmission). Les diamètres types des particules se situent dans la plage de 0,5 à 20 Dn (par exemple, environ 5 à 10 On) après 1'adsorption d'un antigène quelconque. Des capacités d'adsorption entre 0,7 et 1,5 mg de protéine par mg de Al+++ à pH 7,4 ont été rapportées pour les adjuvants de phosphate d'aluminium.

Le point de charge zéro (PZC) du phosphate d'aluminium est inversement proportionnel au degré de substitution du phosphate à l'hydroxyle, et ce degré de substitution peut varier selon les conditions réactionnelles et la concentration des réactifs utilisés pour préparer le sel par- précipitation. Le PZC est également modifié en changeant la concentration des ions phosphate libres en solution (plus de phosphate = PZC plus acide) ou en ajoutant un tampon comme un tampon histidine (rend le PZC plus basique). Les phosphates d'aluminium utilisés selon l'invention auront généralement un PZC entre 4.0 et 7,0, de manière davantage préférée entre 5,0 et 6,5, par exemple environ 5,7.

Les suspensions de sels d'aluminium utilisées pour préparer des compositions de l'invention peuvent contenir un tampon (par exemple, un tampon phosphate ou un tampon histidine ou un tampon Tris), mais celui-ci n'est pas toujours nécessaire. Les suspensions sont de préférence stériles et apyrogènes. Une suspension peut comprendre des ions phosphate aqueux libres, par exemple, présents à une concentration entre 1.0 et 20 mM, de préférence entre 5 et 15 mM, et de manière davantage préférée environ 10 mM. Les suspensions peuvent également comprendre du chlorure de sodium. L'invention peut utiliser un mélange à la fois d'un hydroxyde d'aluminium et d'un phosphate d'aluminium. Dans ce cas, il peut y avoir plus de phosphate d'aluminium que d'hydroxyde, par exemple, un rapport pondéral d'au moins 2/1, par exemple, ^ 5/1, ^6/1, ^ 7/1, ^ 8/1, ^ 9/1, etc.

La concentration de Al+++ dans une composition pour une administration à un patient est de préférence inférieure à 10 mg/ml, par exemple, ^ 5 mg/ml, ^ 4 mg/ml, ^ 3 mg/ml, ^ 2 mg/ml, ^ 1 mg/ml, etc. Une plage préférée est entre 0,3 et 1 mg/ml. Un maximum de 0,85 mg/dose est préféré. B. Emulsions huileuses

Les compositions d'émulsions huile dans l'eau appropriées pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention ' comprennent des émulsions squalènè dans l'eau, comme le MF59 [voir chapitre 10 de la référence 29 ; voir également la référence 30] et AS03 [31].

Divers adjuvants à base d'émulsions huile dans l'eau sont connus, et ils comprennent généralement au moins une huile et au moins un tensioactif, avec l'huile/les huiles et le (s) tensioactif (s) étant biodégradables (métabolisables) et biocompatibles. L'émulsion comprendra des gouttelettes d'huile submicroniques, et les émulsions avec des gouttelettes ayant un diamètre inférieur à 220 nm sont préférées car elles peuvent être soumises à une stérilisation par filtration. L'émulsion comprend une ou plusieurs huiles. L'huile/les huiles appropriées comprennent celles, par exemple, de source animale (comme de poissons) ou végétale. L'huile est idéalement biodégradable (métabolisable) et biocompatible. Les sources pour les huiles végétales comprennent des noix, des graines et des grains. L'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile de noix de coco, et l'huile d'olive, la plus couramment disponible, exemplifient les huiles de noix. L'huile de jojoba peut être utilisée, par exemple, obtenue à partir de la fève de jojoba. Les huiles de graines comprennent l'huile de carthame, l'huile de graines de coton, l'huile de graines de tournesol, l'huile de graines de sésame et analogues. Dans le groupe des grains, l'huile de maïs est la plus facilement disponible, mais l'huile d'autres grains de céréales comme le blé, l'avoine, le seigle, le riz, le teff, le triticale et analogues peut être également utilisée. Des esters d'acides gras à 6 à 10 carbones de glycérol et de 1,2-propanediol, tout en n'existant pas naturellement dans les huiles de graines, peuvent être préparés par hydrolyse, séparation et estérification des matériaux appropriés en démarrant à partir des huiles de noix et de graines. Les graisses et les huiles de laits de mammifères sont métabolisables et peuvent donc être utilisées. Les procédures pour la séparation, la purification, la saponification et d'autres moyens nécessaires pour obtenir des huiles pures de sources animales sont bien connus de l'état de l'art.

La plupart des poissons contiennent des huiles métabolisables qui peuvent être facilement récupérées. Par exemple, l'huile de foie de morue, les huiles de foie de requin, et l'huile de baleine comme le spermaceti exemplifient plusieurs des huiles de poissons qui peuvent être utilisées dans la présente. Un certain nombre d'huiles à chaîne ramifiée sont synthétisées par biochimie en unités d'isoprène à 5 carbones et elles sont généralement appelées terpénoïdes. Les émulsions préférées comprennent du squalène, une huile de foie de requin qui est un terpénoïde insaturé ramifié. Le squalane, l'analogue saturé au squalène, peut être également utilisé. Les huiles de poissons, y compris le squalène et le squalane, sont faciles à obtenir auprès de sources commerciales ou elles peuvent être obtenues par des procédés connus de l'état de l'art. D'autres huiles utiles sont les tocophérols, particulièrement en combinaison avec du squalène. Lorsque la phase huileuse d'une émulsion comprend un tocophérol, l'un quelconque des tocophérols α, β, γ, δ, ε ou □ peut être utilisé, mais les D-tocophérols sont préférés. Le D-D-tocophérol et le DL-D-tocophérol peuvent être tous les deux utilisés. Un D-tocophérol préféré est le DL-D-tocophérol. Une combinaison d'huiles comprenant du squalène et un tocophérol (par exemple, le DL-D-tocophérol) peut être utilisée. L'huile dans l'émulsion peut comprendre une combinaison d'huiles, par exemple, le squalène et au moins une autre huile.

Le composant aqueux de l'émulsion peut être de l'eau pure (par exemple, de l'eau pour injectables) ou il peut comprendre d'autres composants, par exemple des solutés. Par exemple, il peut comprendre des sels pour former un tampon, par exemple des sels citrate ou phosphate, comme des sels de sodium. Les tampons types comprennent : un tampon phosphate ; un tampon Tris ; un tampon borate ; un tampon succinate ; un tampon histidine ; ou un tampon citrate. Une phase aqueuse tamponnée est préférée, et les tampons seront généralement inclus dans la plage de 5 à 20 mM.

En plus de l'huile et du lipide cationique, une émulsion peut comprendre un tensioactif non ionique et/ou un tensioactif zwittérionique. De tels tensioactifs comprennent, mais n'y sont pas limités : les tensioactifs d'esters de sorbitane polyoxyéthylène (communément appelés Tween), spécialement le polysorbate 20 et le polysorbate 80 ; les copolymères d'oxyde d'éthylène (EO), d'oxyde de propylène (PO), et/ou d'oxyde de butylène (BO), vendus sous le nom commercial de DOWFAX™, comme les copolymères séquencés linéaires EO/PO ; les octoxynols, qui peuvent varier dans le nombre de groupes éthoxy répétitifs (oxy-1,2-éthanediyle), avec 1'octoxynol-9 (Triton X-100, ou le t-octylphénoxy-polyéthoxyéthanol) étant d'un intérêt particulier ; 1'(octylphénoxy)polyéthoxyéthanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; des phospholipides comme la phosphatidylcholine (lécithine) ; des éthers gras polyoxyéthylène dérivés des alcools laurylique, cétylique, stéarylique et oléylique (connus comme les tensioactifs Brij), tels que le triéthylène glycol monolauryl-éther (Brij 30) ; le polyoxyéthylène-9-lauryl-éther ; et les esters de sorbitane (couramment connus sous le nom de Span), comme le trioléate de sorbitane (Span 85) et le monolaurate de sorbitane. Les tensioactifs préférés pour une inclusion dans l'émulsion sont le polysorbate 80 (Tween 80 ; monooléate de sorbitane polyoxyéthylène), le Span 85 (trioléate de sorbitane), la lécithine et le Triton X-100.

Des mélanges de tensioactifs peuvent être utilisés, par exemple des mélanges de Tween 80/Span 85, ou des mélanges de Tween 80/Triton-X100. Une combinaison d'un ester de sorbitane polyoxyéthylène comme le monooléate de sorbitane polyoxyéthylène (Tween 80) et d'un octoxynol comme le t-octylphénoxy-polyéthoxyéthanol (Triton X-100) est également appropriée. Une autre combinaison utile comprend du laureth 9 plus un ester de sorbitane polyoxyéthylène et/ou un octoxynol. Les mélanges utiles peuvent comprendre un tensioactif avec une valeur de BHL située dans la plage de 10 à 20 (par exemple, le polysorbate 80, avec une BHL de 15,0) et un tensioactif avec une valeur de BHL située dans la plage de 1 à 10 (par exemple, le trioléate de sorbitane, avec une BHL de 1,8).

Les quantités préférées d'huile (% en volume) dans l'émulsion finale sont situées entre 2 et 20 %, par exemple 5 à 15 %, 6 à 14 %, 7 à 13 %, 8 à 12 %. Une teneur en squalène d'environ 4 à 6 % ou d'environ 9 à 11 % est particulièrement utile.

Les quantités préférées des tensioactifs (% en poids) dans l'émulsion finale se situent entre 0,001 % et 8 %. Par exemple : les esters de sorbitane polyoxyéthylène (comme le polysorbate 80) 0,2 à 4 %, en particulier entre 0,4 et 0,6 %, entre 0,45 et 0,55 %, environ 0,5 % ou entre 1,5 et 2 %, entre 1,8 et 2,2 %, entre 1,9 et 2,1 %, environ 2 %, ou 0,85 à 0,95 %, ou environ 1 % ; les esters de sorbitane (comme le trioléate de sorbitane) 0,02 à 2 %, en particulier environ 0,5 % ou environ 1 % ; les octyl- ou nonyl-phénoxy-polyoxyéthanols (comme le Triton X-100) 0,001 à 0,1 %, en particulier 0,005 à 0,02 % ; les éthers de polyoxyéthylène (comme le laureth 9) 0,1 à 8 %, de préférence 0,1 à 10 % et en particulier 0,1 à 1 % ou environ 0,5 %.

Les quantités absolues d'huile et de tensioactif, et leur rapport, peuvent varier au sein de larges limites tout en formant encore une émulsion. L'homme du métier peut facilement varier les proportions relatives des composants pour obtenir une émulsion souhaitée, mais un rapport pondéral situé entre 4/1 et 5/1 pour l'huile et le tensioactif est typique (excès d'huile) .

Un paramètre important pour assurer l'activité immunostimulante d'une émulsion, particulièrement chez les grands animaux, est la taille des gouttelettes d'huile (diamètre). Les émulsions les plus efficaces ont une taille de gouttelette située dans la plage submicronique. De façon appropriée, les tailles des gouttelettes seront situées dans la plage de 50 à 750 nm. De la façon la plus utile entre toutes, la taille moyenne des gouttelettes est inférieure à 250 nm, par exemple inférieure à 200 nm, inférieure à 150 nm. La taille moyenne des gouttelettes est située de façon utile dans la plage de 80 à 180 nm. Idéalement, au moins 80 % (en nombre) des gouttelettes d'huile de l'émulsion sont inférieures à 250 nm en diamètre, et de préférence au moins 90 %. Ces tailles de gouttelette peuvent être obtenues de façon pratique par des techniques comme la microfluidisation. Des appareils pour déterminer la taille moyenne des gouttelettes dans une émulsion, et la distribution des tailles, sont disponibles dans le commerce. Ceux-ci utilisent généralement les techniques de diffusion dynamique de la lumière et/ou la détection optique des particules simples, par exemple la série des instruments Accusizer™ et Nicomp™ disponible chez Partiele Sizing Systems (Santa Barbara, Etats-Unis) , ou les instruments Zetasizer™ de Malvern Instruments (Royaume-Uni), ou les instruments Partiele Size Distribution Analyzer de Horiba (Kyoto, Japon).

Idéalement, la distribution des tailles des gouttelettes (en nombre) présente un seul maximum, c'est-à-dire qu'il y a une seule population de gouttelettes distribuées autour d'une moyenne (mode), plutôt que d'avoir deux maxima. Les émulsions préférées présentent une polydispersité < 0,4, par exemple 0,3, 0,2, ou inférieure. '

Les adjuvants spécifiques des émulsions huile dans l'eau utiles pour l'invention comprennent, mais n'y sont pas limités : . ’ □ Une émulsion submicronique de squalène, Tween 80, et Span 85. La composition de l'émulsion en volume peut être environ 5 % de squalène, environ 0,5 % de polysorbate 80 et environ 0,5 % de Span 85. En termes de poids, ces rapports deviennent 4,3 % de squalène, 0,5 % de polysorbate 80 et 0,48 % de Span 85. Cet adjuvant est connu sous le nom de « MF5 9 » [32 à 34] , tel que décrit plus en détail dans le chapitre 10 de la référence 35 et le chapitre 12 de la référence 36. L'émulsion MF59 comprend de façon avantageuse des ions citrate, par exemple du tampon citrate de sodium 10 mM. □ Une émulsion comprenant du squalène, un tocophérol, et du polysorbate 80. L'émulsion peut comprendre de la solution tampon phosphate. Ces émulsions peuvent avoir en volume de 2 à 10 % de squalène, de 2 à 10 % de tocophérol et de 0,3 à 3 % de polysorbate 80, et le rapport pondéral du squalène/tocophérol est de préférence < 1 (par exemple, 0,90) car ceci peut fournir une émulsion plus stable. Le squalène et le polysorbate 80 peuvent être présents dans un rapport de volume d'environ 5/2 ou dans un rapport pondéral d'environ 11/5. Ainsi, les trois composants (squalène, tocophérol, polysorbate 80) peuvent être présents dans un rapport pondéral de 1068/1186/485 ou environ 55/61/25. Une telle émulsion (« AS03 ») peut être fabriquée par dissolution de Tween 80 dans du PBS pour donner,une solution à 2 %, puis mélange de 90 ml de cette solution avec un mélange de (5 g de DL-c*-tocophérol et 5 ml de squalène), puis microfluidisation du mélange. L'émulsion résultante peut avoir des gouttelettes d'huile submicroniques, par exemple avec un diamètre moyen situé entre 100 et 250 nm, de préférence environ 180 nm. L'émulsion peut également comprendre un monophosphoryl-lipide A 3-dés-0-acylé (3d MPL). Une autre émulsion utile de ce type peut comprendre, par dose humaine, 0,5 à 10 mg de squalène, 0,5 à 11 mg de tocophérol, et 0,1 à 4 mg de polysorbate 80 [37] par exemple, dans les rapports discutés ci-dessus. □ Une émulsion de squalène, d'un tocophérol, et d'un détergent Triton (par exemple, Triton X-100). L'émulsion peut également comprendre un 3d-MPL (voir ci-dessous). L'émulsion peut contenir un tampon phosphate. □ Une émulsion comprenant un polysorbate (par exemple, polysorbate 80), un détergent Triton (par exemple, Triton X-100) et un tocophérol (par exemple, un succinate d'a-tocophérol). L'émulsion peut comprendre ces trois composants dans un rapport massique d'environ 75/11/10 (par exemple, 750 pg/ml de polysorbate 80, 110 pg/ml de

Triton X-100 et 100 pg/ml de succinate d'a-tocophérol), et ces concentrations devront inclure toute contribution de ces composants à partir des antigènes. L'émulsion peut également comprendre du squalène. L'émulsion peut également comprendre un 3d-MPL (voir ci-dessous). La phase aqueuse peut contenir un tampon phosphate. □ Une émulsion de squalane, polysorbate 80 et poloxamer 401 (« Pluronic™ L121 ») . L'émulsion peut être formulée dans de la solution tampon phosphate, pH 7,4. Cette émulsion est un véhicule d'administration utile pour les muramyl-dipeptides, et elle a été utilisée avec du thréonyl-MDP dans l'adjuvant « SAF-1 » [38] (0,05 à 1% de Thr-MDP, 5 % de squalane, 2,5 % de Pluronic L121 et 0,2 % de polysorbate 80) . Elle peut être également utilisée sans le Thr-MDP, comme dans l'adjuvant « AF » [3 9] (5 % de squalane, 1,25 % de Pluronic L121 et 0,2 % de polysorbate 80). La microfluidisation est préférée. □ Une émulsion comprenant du squalène, un solvant aqueux, un tensioactif non ionique hydrophile d'éther alkylique polyoxyéthylène (par exemple, l'éther cétostéarylique polyoxyéthylène (12)) et un tensioactif non ionique hydrophobe (par exemple, un ester de sorbitane ou un ester de mannide, comme le monooléate de sorbitane ou « Span 80 ») . L'émulsion est de préférence thermoréversible et/ou a au moins 90 % des gouttelettes d'huile (en volume) avec une taille inférieure à 200 nm [40] . L'émulsion peut également comprendre un ou plusieurs de : alditol ; un agent cryoprotecteur (par exemple, un sucre, comme le dodécylmaltoside et/ou le saccharose) ; et/ou un alkylpolyglycoside. L'émulsion peut comprendre un agoniste du TLR4 [41] . De telles émulsions peuvent être lyophilisées. □ Une émulsion de squalène, poloxamer 105 et Abil-Care [42] . La concentration finale (poids) de ces composants dans des vaccins adjuvés sont de 5 % de squalène, 4 % de poloxamer 105 (polyols pluronic) et 2 % de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 diméthicone ; triglycéride caprylique/caprique). □ Une émulsion ayant de 0,5 à 50 % d'une huile, 0,1 à 10 % d'un phospholipide, et 0,05 à 5 % d'un tensioactif non ionique. Comme il est décrit dans la référence 43, les composants phospholipidiques préférés sont la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol, le phosphatidylglycérol, l'acide phosphatidique, la sphingomyéline et le cardiolipide. Les tailles submicroniques des gouttelettes sont avantageuses. □ Une émulsion huile dans l'eau submicronique d'une huile non métabolisable (comme une huile minérale légère) et d'au moins un tensioactif (comme la lécithine, Tween 80 ou Span 80) . Des additifs peuvent être inclus, comme la saponine QuilA, le cholestérol, un conjugué saponine-lipophile (comme GPI-0100, décrit dans la référence 44, produit par addition d'une amine aliphatique à une désacyl-saponine par l'intermédiaire du groupe carboxyle de l'acide glucuronique), le bromure de dimethyldioctadécylammonium et/ou la N,N-dioctadécyl-N,N-bis(2-hydroxyéthyl)propanediamine. □ Une émulsion dans laquelle une saponine (par exemple, QuilA ou QS21) et un stérol (par exemple, un cholestérol) sont associés sous la forme de micelles hélicoïdales [45] . □ Une émulsion comprenant une huile minérale, un alcool gras éthoxylé lipophile non ionique, et un tensioactif hydrophile non ionique (par exemple, un alcool gras éthoxylé et/ou un copolymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxypropylène) [46] . □ Une émulsion comprenant une huile minérale, un alcool gras éthoxylé hydrophile non ionique, et un tensioactif lipophile non ionique (par exemple, un alcool gras éthoxylé et/ou un copolymère séquencé de polyoxyéthylène- polyoxypropylène) [46] .

Dans certains modes de réalisation, une émulsion peut être mélangée avec un ou plusieurs antigènes extemporanément, au moment de l'administration, et ainsi l'adjuvant et l'antigène ou les antigènes peuvent être gardés séparément dans un vaccin conditionné ou distribué, prêts pour la formulation finale au moment de l'utilisation. Dans d'autres modes de réalisation, une émulsion est mélangée avec un antigène durant la fabrication, et ainsi la composition est conditionnée sous une forme adjuvée liquide. L'antigène sera généralement sous une forme aqueuse, de telle façon que le vaccin est finalement préparé en mélangeant deux liquides. Le rapport des volumes des deux liquides pour le mélange peut varier (par exemple, entre 5/1 et 1/5) mais il est généralement d'environ 1/1. Lorsque les concentrations des composants sont données dans les descriptions ci-dessus d'émulsions spécifiques, ces concentrations sont généralement pour une composition non diluée, et ainsi la concentration après le mélange avec une solution de l'antigène diminuera. C. Formulations de saponines [chapitre 22 de la référence 29] Des formulations de saponines peuvent être également utilisées en tant qu'adjuvants dans l'invention. Les saponines sont un groupe hétérogène de stérol-glycosides et de glycosides triterpénoïdes qui se 'trouvent dans l'écorce, les feuilles, les tiges, les racines et même les fleurs d'un large éventail d'espèces végétales. Les saponines provenant de l'écorce de l'arbre Quillaia saponaria Molina ont été largement utilisées en tant qu'adjuvants. Les saponines peuvent être également obtenues commercialement à partir de Smilax ornata (salsepareille) , Gypsophilla paniculata (voile de mariée) , et Saponaria officinalis (racine savon). Les formulations d'adjuvants de saponines comprennent des formulations purifiées, comme QS21, ainsi que des formulations lipidiques, comme les ISCOM. QS21 est commercialisé sous le nom de Stimulon™.

Les compositions de saponines ont été purifiées en utilisant la CLHP et la RP-CLHP. Des fractions purifiées spécifiques en utilisant ces techniques ont été identifiées, y compris QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B et QH-C. De préférence, la saponine est le QS21. Un procédé de production de QS21 est divulgué dans la référence 47. Les formulations de saponines peuvent également comprendre un stérol, comme un cholestérol [48] .

Des combinaisons de saponines et de cholestérols peuvent être utilisées pour former des particules appelées ISCOM (chapitre 23 de la référence 29) . Les ISCOM comprennent généralement un phospholipide comme la phosphatidyl-éthanolamine ou la phosphatidylcholine. Toute saponine connue peut être utilisée dans les ISCOM. De préférence, 1'ISCOM comprend un ou plusieurs de QuilA, QHA et QHC. Les ISCOM sont en outre décrits dans les références 48 à 50. Eventuellement, les ISCOM peuvent être dépourvus de détergent supplémentaire [51] .

Une description du développement d'adjuvant à base de saponine peut être trouvée dans les références 52 et 53. D. Dérivés bactériens ou microbiens

Les adjuvants appropriés pour une utilisation dans l'invention comprennent des dérivés bactériens ou microbiens comme des dérivés non toxiques du lipopolysaccharide (LPS) entérobactérien, des dérivés du lipide A, des oligonucléotides immunostimulants et des toxines ADP-ribosylantes et des dérivés détoxifiés de celles-ci.

Les dérivés non toxiques du LPS comprennent le monophosphoryl-lipide A (MPL) et le MPL 3-0-désacylé (3dMPL). Le 3dMPL est un mélange de monophosphoryl-lipide A 3-dés-0-acylé avec 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Une forme préférée à « petites particules » de monophosphoryl-lipide A 3-dés-0-acylé est divulgué dans la référence 54. De telles « petites particules » de 3dMPL sont suffisamment petites pour être stérilisées par filtration à travers une membrane de 0,22 μπι [54]. D'autres dérivés non toxiques du LPS comprennent des mimétiques du monophosphoryl-lipide A, comme des dérivés d'aminoalkyl-glucosaminide phosphate, par exemple RC-529 (voir ci-dessous).

Les dérivés du lipide A comprennent des dérivés du lipide A d'Escherichia coli comme OM-174. OM-174 est décrit, par exemple dans les références 55 et 56.

Les oligonucléotides immunostimulants appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans l'invention comprennent des séquences nucléotidiques contenant un motif CpG (une séquence dinucléotidique contenant une cytosine non méthylée liée par une liaison phosphate à une guanosine) . Des ARN double brin et des oligonucléotides contenant des séquences palindromiques ou des séquences poly(dG) ont été également démontrés comme étant immunostimulants.

Les CpG peuvent comprendre des modifications/analogues nucléotidiques comme des modifications phosphorothioate et peuvent être double brin ou simple brin. Les références 57, 58 et 59 divulguent des substitutions analogues possibles, par exemple, le remplacement de la guanosine par la 2'-désoxy-7-déazaguanosine. L'effet adjuvant des oligonucléotides à CpG est en outre décrit dans les références 60 à 65.

La séquence CpG peut être dirigée contre le TLR9, comme le motif GTCGTT ou TTCGTT [66] . La séquence CpG peut être spécifique pour induire une réponse immunitaire Thl, comme un O DN CpG-A, ou il peut être plus spécifique pour l'induction d'une réponse des lymphocytes B, comme un ODN CpG-B. Les ODN CpG-A et CpG-B sont décrits dans les références 67 à 69. De préférence, le CpG est un ODN CpG-A. .

De préférence, l'oligonucléotide à CpG est construit de telle façon que l'extrémité 5' est accessible pour la reconnaissance du récepteur. Eventuellement, deux séquences d'oligonucléotides à CpG peuvent être fixées à leurs extrémités 3' pour former des « immunomères ». Voir, par exemple, les références 66 et 70 à 72.

Un adjuvant CpG utile est CpG7909, également connu sous le nom de ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Un autre est CpG1826. Comme variante, ou en plus, de l'utilisation de séquences CpG, des séquences TpG peuvent être utilisées [73], et ces oligonucléotides peuvent être dépourvus de motifs CpG non méthylés. L'oligonucléotide immunostimulant peut être riche en pyrimidine. Par exemple, il peut comprendre plus d'un nucléotide thymidine consécutif (par exemple TTTT, comme il est décrit dans la référence 73), et/ou il peut avoir une composition nucléotidique avec > 25 % de thymidine (par exemple, > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.) . Par exemple, il peut comprendre plus d'un nucléotide cytosine consécutif (par exemple CCCC, comme il est décrit dans la référence 73), et/ou il peut avoir une composition nucléotidique avec > 25 % de cytosine (par exemple, > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.) . Ces oligonucléotides peuvent être dépourvus de motifs CpG non méthylés. Les oligonucléotides immunostimulants comprendront généralement au moins 20 nucléotides. Ils peuvent comprendre moins de 100 nucléotides.

Un adjuvant particulièrement utile basé autour d'oligonucléotides immunostimulants est connu sous le nom de IC-31™ [74]. Ainsi, un adjuvant utilisé dans l'invention peut comprendre un mélange de (i) un oligonucléotide (par exemple, entre 15 et 40 nucléotides) y compris au moins un (et de préférence de multiples) motifs Cpl (c'est-à-dire, une cytosine liée par une inosine pour former un dinucléotide), et (ii) un polymère polycationique, comme un oligopeptide (par exemple, entre 5 et 20 acides aminés) y compris au moins une (et de préférence de multiples) séquences tripeptidiques Lys-Arg-Lys. L'oligonucléotide peut être un désoxynucléotide comprenant une séquence 26-mer 5'-(IC)i3-3' (SEQ ID NO : 41). Le polymère polycationique peut être un peptide comprenant une séquence d'acides aminés 11-mer KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO : 42) . L'oligonucléotide et le polymère peuvent former des complexes, par exemple tels que décrits dans les références 75 et 76.

Les toxines bactériennes ADP-ribosylantes et leurs dérivés détoxifiés peuvent être utilisés en tant qu'adjuvants dans l'invention. De préférence, la protéine est dérivée d'E. coli (entérotoxine thermolabile « LT » d'E. coli), du choléra (« CT ») , ou de la coqueluche (« PT ») . L'utilisation de toxines ADP-ribosylantes détoxifiées en tant qu'adjuvants mucosaux est décrite dans la référence 77 et en tant qu'adjuvants parentéraux dans la référence 78. La toxine ou l'anatoxine est de préférence sous la forme d'une holotoxine, comprenant les deux sous-unités A et B. De préférence, la sous-unité A contient une mutation détoxifiante ; de préférence, la sous-unité B n'est pas mutée. De préférence, l'adjuvant est un mutant de LT détoxifié comme LT-K63, LT-R72, et LT-G192. L'utilisation de toxines ADP-ribosylantes et de leurs dérivés détoxifiés, en particulier LT-K63 et LT-R72, en tant qu'adjuvants peut se trouver dans les références 79 à 86. Un mutant de CT utile est CT-E29H [87]. La référence numérique pour les substitutions d'acides aminés est de préférence basée sur les alignements des sous-unités A et B des toxines ADP- ribosylantes présentés dans la référence 88, spécifiquement incorporée ici par référence dans son intégralité.

E. Agonistes des TLR

Les compositions peuvent comprendre un agoniste de TLR, c'est-à-dire un composé qui peut exercer un effet agoniste sur un récepteur de type Toll. De manière préférée entre toutes, un agoniste de TLR est un agoniste d'un TLR humain. L'agoniste de TLR peut activer l'un quelconque de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 ou TLR11 ; de préférence il peut activer le TLR4 humain ou le TLR7 humain. L'activité agoniste d'un composé contre un récepteur quelconque de type Toll particulier peut être déterminée par des tests classiques. Des sociétés comme Imgenex et Invivogen fournissent des lignées cellulaires qui sont cotransfectées de façon stable avec des gènes de TLR humain et le NFkB, plus des gènes rapporteurs appropriés, pour mesurer les voies d'activation des TLR. Elles sont conçues pour la sensibilité, une dynamique de large plage de travail, et elles peuvent être utilisées pour un criblage à haut débit. L'expression constitutive d'un ou de deux TLR spécifiques est typique dans de telles lignées cellulaires. Voir également la référence 89. De nombreux agonistes des TLR sont connus de l'état de l'art, par exemple, la référence 90 décrit certaines molécules de lipopeptides qui sont des agonistes du TLR2, les références 91 à 94 décrivent chacune des classes d'agonistes à petite molécule du TLR7, et les références 95 et 96 décrivent des agonistes du TLR7 et du TLR8 pour le traitement de maladies.

Un agoniste de TLR utilisé dans l'invention comprend idéalement au moins une entité d'adsorption. L'inclusion de telles entités dans des agonistes de TLR leur permet de s'absorber sur des sels d'aluminium insolubles (par exemple, par échange de ligand ou tout autre mécanisme approprié) et améliorent leur comportement immunologique [97]. Les entités d'adsorption contenant du phosphore sont particulièrement utiles, et ainsi une entité d'adsorption peut comprendre un phosphate, un phosphonate, un phosphinate, un phosphonite, un phosphinite, etc. De préférence, l'agoniste de TLR comprend au moins un groupe phosphonate.

Ainsi, dans des modes de réalisation préférés, une composition comprend un agoniste de TLR (de manière davantage préférée, un agoniste du TLR7) qui comprend un groupe phosphonate. Ce groupe phosphonate permet l'adsorption de l'agoniste sur un sel d'aluminium insoluble [97].

Les agonistes de TLR utiles pour l'invention peuvent comprendre une seule entité d'adsorption, ou ils peuvent en comprendre plus d'une, par exemple entre 2 et 15 entités d'adsorption. Généralement, un composé comprendra 1, 2 ou 3 entités d'adsorption.

Les agonistes de TLR contenant du phosphore utiles peuvent être représentés par la formule (Al) :

dans laquelle :

Rx et RY sont choisis indépendamment parmi H et un groupe alkyle en Ci à Ce ; X est choisi parmi une liaison covalente, 0 et NH ; Y est choisi parmi une liaison covalente, 0, C(0), S et NH ; L représente un lieur (« linker »), par exemple choisi parmi les groupes alkylène en Ci à Ce, alcénylène en Ci à 0e, arylène, hétéroarylène, alkylénoxy en Ci à Cë et -( (CH2) pO) q (CH2) p- chacun éventuellement substitué par 1 à 4 substituants choisis indépendamment parmi les groupes halogéno, OH, alkyle en Ci à C4, -OP (0) (OH) 2 et -P(0) (OH) 2 ; chaque p est choisi indépendamment parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6 ; . q est choisi parmi 1, 2, 3 et 4 ; n est choisi parmi 1, 2 et 3 ; et A représente une entité agoniste de TLR.

Dans un mode de réalisation, l'agoniste de TLR selon la formule (Al) est comme suit : Rx et RY représentent H ; X représente O ; L est choisi parmi les groupes alkylène en Ci à Ce et - ( (CH2) p0) q(CH2) p- chacun éventuellement substitué par 1 à 2 atomes d'halogène ; p est choisi parmi 1, 2 et 3 ; q est choisi parmi 1 et 2 ; et n vaut 1. Ainsi, dans ces modes de réalisation, l'entité d'adsorption comprend un groupe phosphate. D'autres agonistes de TLR utiles de formule (Al) sont divulgués aux pages 6 à 13 de la référence 98.

Les compositions peuvent comprendre un composé imidazoquinolone, comme Imiquimod (« R-837 ») [99,100], Résiquimod (« R-848 ») [101], et leurs analogues ; et leurs sels (par exemple, les sels chlorhydrates). D'autres détails concernant des imidazoquinolines immunostimulantes peuvent être trouvés dans les références 102 à 106.

Les compositions peuvent comprendre un agoniste du TLR4, et de manière préférée entre toutes un agoniste du TLR4 humain. Le TLR4 est exprimé par des cellules du système immunitaire inné, y compris les cellules dendritiques et les macrophages traditionnels [107] . Le déclenchement par l'intermédiaire du TLR4 induit une cascade de signalisation qui utilise les voies à la fois MyD88- et TRIF-dépendantes, menant à l'activation du NF-κΒ et de l'IRF3/7, respectivement. L'activation du TLR4 induit généralement une production robuste d'IL-12p70 et amplifie fortement les réponses immunitaires cellulaires et humorales de type Thl.

Divers agonistes du TLR4 utiles sont connus de l'état de l'art, dont un grand nombre sont des analogues de l'endotoxine ou du lipopolysaccharide (LPS). Par exemple, l'agoniste du TLR4 peut être : le 3d-MPL (c'est-à-dire, le monophosphoryl- lipide A 3-0-désacylé ; présent dans l'adjuvant « AS04 » de GSK, avec d'autres détails dans les références 108 à 111 ; le glucopyranosyl-lipide A (GLA) (112] ou son sel d'ammonium ; un aminoalkyl-glucosaminide phosphate, comme RC-529 ou CRX-524 [113 à 115] ; E5564 [116,117] ; ou un composé de formule I, II ou III tel que défini dans la référence 118, ou l'un de ses sels, comme les composés « ER 803058 », « ER 803732 », « ER 804053 », « ER 804058 », « ER 804059 », « ER 804442 », « ER 804680 », « ER 803022 », « ER 804764 » ou « ER 804057 » (également connu comme E6020) . L'invention est particulièrement utile lors de l'utilisation d'agonistes du TLR7 humain, comme un composé de formule (K) . Ces agonistes sont discutés en détail dans la référence 119 :

dans laquelle : R1 représente H, un groupe alkyle en Ci à Ce, -C(R5)2OH, -L!R5, -L1R6, -L2R5, -L2R6, -OL2R5, ou -OL2R6; L1 représente-C (O)- ou -O- ; L2 représente un groupe alkylène en Ci à Ce, alcénylène en C2 a Ce, arylène, hétéroarylène ou - ( (CR4R4) p0) q (CH2) p-, où les groupes alkylène en Ci à Ce et alcénylène en C2 à Ce de L2 sont éventuellement substitués par 1 à 4 groupes fluoro ; chaque L3 est choisi indépendamment parmi les groupes alkylène en Ci à C6 et - ( (CR4R4) p0) q (CH2) p-, où le groupe alkylène en Ci à Ce de L3 est éventuellement substitué par 1 à 4 groupes fluoro ; L4 représente un groupe arylène ou hétéroarylène ; R2 représente H ou un groupe alkyle en Ci à Ce ; R3 est choisi parmi les groupes alkyle en Ci à C4, -L3R5, -IùR5, -L3R7, -L3L4L3R7, -L3L4R5, -L3L4L3R5, -OL3R5, -OL3R7, -OL3L4R7, -OL3L4L3R7, -OR8, -OL3L4R5, -OL3L4L3R5 et -C (R5) 20H ; chaque R4 est choisi indépendamment parmi H et un groupe fluoro ; R5 représente un groupe -P(0) (OR9)2 ; R6 représente un groupe -CF2P (0) (OR9)2 ou -C(0)0R1Û ; R7 représente un groupe -CF2P(0) (OR9)2 ou -C(0)0R10 ; R8 représente H ou un groupe alkyle en Ci à C4 ; chaque R9 est choisi indépendamment parmi H et un groupe alkyle en Ci à Ce ; R10 représente H ou un groupe alkyle en Ci à C4 ; chaque p est choisi indépendamment parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6, et q vaut 1, 2, 3 ou 4.

Le composé de formule (K) est de préférence de formule (K') :

dans laquelle : P1 est choisi parmi H, les groupes alkyle en Ci à Ce éventuellement substitué par COOH et -Y-L-X-P(O) (ORx) (ORY) ; P2 est choisi parmi H, les groupes alkyle en Ci à Ce, alcoxy en Ci à C5 et -Y-L-X-P(O) (ORx) (0RY) ; à condition qu'au moins l'un de P1 et P2 représente un groupe -Y-L-X-P(O) (0RX) (0RY) ; RB est choisi parmi H et un groupe alkyle en Ci à Ce ;

Rx et RY sont choisis indépendamment parmi H et un groupe alkyle en Ci à Cô ; X est choisi parmi une liaison covalente, 0 et NH ; Y est choisi parmi une liaison covalente, 0, C(0), S et NH ; L est choisi parmi une liaison covalente alkylène en Ci à Ce, alcénylène en Ci à Ce, arylène, hétéroarylène, alkylénoxy en Ci à Ce et - ( (CH2) p0) q (CH2) p- chacun éventuellement substitué par 1 à 4 substituants choisis indépendamment parmi les groupes halogéno, OH, alkyle en Ci à C4, -0P(0)(0H)2 et -P(0) (OH) 2 ; chaque p est choisi indépendamment parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6 ; et q est choisi parmi 1, 2, 3 et 4.

Dans certains modes de réalisation de la formule (K') : P1 est choisi parmi les groupes alkyle en Ci à C6 éventuellement substitué par COOH et -Y-L-X-P(O) (0RX) (0RY) ; P2 est choisi parmi les groupes alcoxy en Ci à Ce et -Y-L-X-

P (O) (0RX) (0RY) ; RB représente un groupe alkyle en Ci à Ce ; X représente une liaison covalente ; L est choisi parmi les groupes alkylène en Ci à Ce et - ( (CH2) p0) q (CH2) p- chacun éventuellement substitué par 1 à 4 substituants choisis indépendamment parmi les groupes halogéno, OH, alkyl en Ci à C4, . -OP(0)(OH)2 et —P(0)(OH)2 ; chague p est choisi indépendamment parmi 1, 2 et 3 ; g est choisi parmi 1 et 2.

Un composé préféré de formule (K) pour une utilisation dont fait l'invention est l'acide 3-(5-amino-2-(2-méthyl-4-(2-(2 - (2-phosphonoéthoxy)éthoxy)éthoxy)phénéthyl)benzo[f] [1,7]-naphtyridin-8-yl)propanoïque, ou composé « Kl » :

Ce composé peut être utilisé sous forme de base libre ou sous la forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable, par exemple un sel d'arginine [120]. F. Microparticules

Des microparticules peuvent être également utilisées en tant qu'adjuvants dans l'invention. Les microparticules (c'est-à-dire, une particule de -100 nm à -150 pm de diamètre, de manière davantage préférée -200 nm à -30 pm de diamètre, et de manière préférée entre toutes -500 nm à -10 pm de diamètre) formées à partir de matériaux qui sont biodégradables et non toxiques (par exemple, un poly(acide a-hydroxylé), un polyacide hydroxybutyrique, un polyorthoester, un polyanhydride, une polycaprolactone, etc.), avec un poly(lactide-co-glycolide) sont préférées, éventuellement traitées pour avoir une surface chargée négativement (par exemple, avec du SDS) ou une surface chargée positivement (par exemple, avec un détergent cationique, comme le CTAB).

Combinaisons d'adjuvants

Les adjuvants individuels énumérés ci-dessus peuvent être également inclus en combinaisons. Par exemple, une combinaison d'un hydroxyde d'aluminium et d'un adjuvant de phosphate d'aluminium peut être utilisée. De façon similaire, une combinaison de phosphate d'aluminium et de 3dMPL peut être utilisée.

Une combinaison d'adjuvants particulièrement préférée est un sel de métal insoluble (par exemple, un sel d'aluminium, comme un hydroxyde d'aluminium) et un agoniste de TLR (par exemple, un agoniste du TLR7 humain, comme le composé « Kl » identifié ci-dessus), comme il est divulgué dans les références 5 et 97. Ainsi, en particulier, ledit adjuvant est choisi dans le groupe constitué de : - sels d'aluminium, particulièrement des hydroxydes d'aluminium et des phosphates d'aluminium ; - agonistes des TLR humains, particulièrement des agonistes du TLR7 ; et - un mélange de ceux-ci. L'agoniste de TLR est de préférence adsorbé sur le sel de métal, et 1 'antigène/les antigènes de S. aureus peuvent être également adsorbés sur le sel de métal.

Une composition comprenant un agoniste de TLR de l'invention adsorbée sur un sel de métal peut également comprendre un tampon (par exemple, un tampon phosphate ou un tampon histidine ou un tampon Tris). Toutefois, lorsqu'une telle composition comprend un tampon phosphate, il est préférable cependant que la concentration des ions phosphate dans le tampon soit inférieure à 50mM, par exemple < 40 mM, < 30 mM, < 20 mM, < 10 mM, ou < 5 mM, ou entre 1 et 15 mM. Un tampon histidine est préféré, par exemple, entre 1 et 50 mM, entre 5 et 25 mM, ou environ 10 mM.

Une composition peut comprendre un mélange à la fois d'un oxyhydroxyde d'aluminium et d'un hydroxyphosphate d'aluminium, et un agoniste de TLR peut être adsorbé sur l'un ou sur les deux de ces sels.

Comme il a été susmentionné, un maximum de 0,85 mg/dose d'Al+++ est préféré. Parce que l'inclusion d'un agoniste de TLR peut améliorer l'effet adjuvant des sels d'aluminium, alors l'invention permet de façon avantageuse des quantités inférieures d'Al+++ par dose, et ainsi une composition peut comprendre de façon utile entre 10 et 250 pg d'Al+++ par dose unitaire. Les vaccins pédiatriques actuels comprennent généralement au moins 300 pg d'Al+++. En termes de concentration, une composition peut avoir une concentration en Al+++ entre 10 et 500 pg/ml, par exemple entre 10 et 300 pg/ml, entre 10 et 200 pg/ml, ou entre 10 et 100 pg/ml.

En général, lorsqu'une composition comprend à la fois un agoniste de TLR et un sel d'aluminium, le rapport pondéral de l'agoniste sur Al+++ sera inférieur à 5/1, par exemple inférieur à 4/1, inférieur à 3/1, inférieur à 2/1, ou inférieur à 1/1. Ainsi, par exemple, avec une concentration en Al+++ de 0,5 mg/ml, la concentration maximale d'agoniste de TLR sera de 1,5 mg/ml. Mais des taux supérieurs ou inférieurs peuvent être utilisés.

Lorsqu'une composition comprend un agoniste de TLR et un sel de métal insoluble, il est préférable qu'au moins 50 % (en masse) de l'agoniste dans la composition soit adsorbé sur le sel de métal, par exemple ^ 60 %, ^ 70 %, ^ 80 %, > 85 %, > 90 %, > 92 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, ^ 99 %, ou même 100 %.

Ainsi, dans un mode de réalisation, l'invention utilise une composition immunogène comprenant : □ un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium ; □ un agoniste du TLR7 de formule (K), comme le composé Kl ; □ un premier polypeptide comprenant SEQ ID NO : 6, ou une séquence d'acides aminés modifiée qui diffère de SEQ ID NO : 6 par jusqu'à 5 changements simples d'acide aminé à condition que la séquence modifiée puisse déclencher des anticorps qui se lient à un polypeptide constitué de SEQ ID NO : 6 ; □ un deuxième polypeptide comprenant SEQ ID NO : 13, ou une séquence d'acides aminés modifiée qui diffère de SEQ ID NO : 13 par jusqu'à 5 changements simples d'acide aminé à condition que la séquence modifiée puisse déclencher des anticorps qui se lient à un polypeptide constitué de SEQ ID NO : 13 ; □ un troisième polypeptide comprenant SEQ ID NO : 31, ou une séquence d'acides aminés modifiée qui diffère de SEQ ID NO : 31 par jusqu'à 5 changements simples d'acide aminé à condition que la séquence modifiée puisse déclencher des anticorps qui se lient à un polypeptide constitué de SEQ ID NO : 31 ; □ un quatrième polypeptide comprenant SEQ ID NO : 33, ou une séquence d'acides aminés modifiée qui diffère de SEQ ID NO : 33 par jusqu'à 5 changements simples d'acide aminé à condition que la séquence modifiée puisse déclencher des anticorps qui se lient à un polypeptide constitué de SEQ ID NO : 33 ; et □ un cinquième polypeptide comprenant SEQ ID NO : 45, ou une séquence d'acides aminés modifiée qui diffère de SEQ ID NO : 45 par jusqu'à 5 changements simples d'acide aminé à condition que la séquence modifiée puisse déclencher des anticorps qui se lient à un polypeptide constitué de SEQ ID NO : 43 ; et dans laquelle l'agoniste du TLR7 et/ou au moins l'un des polypeptides est/sont adsorbé(s) sur l'adjuvant d'hydroxyde d'aluminium.

Par exemple, comme il est expliqué plus en détail ailleurs dans la présente : le premier polypeptide peut comprendre SEQ ID NO : 34 ; le deuxième polypeptide peut comprendre SEQ ID NO : 13 ; le troisième polypeptide peut comprendre SEQ ID NO : 40 ; et le quatrième polypeptide peut comprendre SEQ ID NO : 36 ; et le cinquième polypeptide peut comprendre SEQ ID NO : 45, éventuellement modifié par jusqu'à 3 substitutions d'acides aminés (autres qu'au niveau des positions qui sont X dans SEQ ID NO : 44) . Ainsi, la composition peut utiliser un mélange de cinq polypeptides ayant SEQ ID NO : 37, 27, 38, 39, et 45 (sauf que SEQ ID NO : 45 peut être modifiée par jusqu'à 3 substitutions d'acides aminés comme il a été discuté ci-dessus).

Groupes chimiques

Sauf définition spécifique contraire, les groupes chimiques discutés dans la présente ont la signification suivante lorsqu'ils sont utilisés dans la présente description :

Le terme « alkyle » comprend des résidus d'hydrocarbures saturés comprenant : - des groupes linéaires jusqu'à 10 atomes (Ci à C10) , ou jusqu'à 6 atomes (Ci à Cê) , ou jusqu'à 4 atomes (Ci à C4) . Les exemples de tels groupes alkyle comprennent, mais n'y sont pas limités, les groupes méthyle en Ci, éthyle en C2, propyle en C3 et n-butyle en C4. - des groupes ramifiés de 3 à 10 atomes (C3 à Cio) , ou jusqu'à 7 atomes (C3 à C7) , ou jusqu'à 4 atomes (C3 à C4) . Les exemples de tels groupes alkyle comprennent, mais n'y sont pas limités, les groupes iso-propyle en C3, sec-butyle en C4, iso-butyle en C4, tert-butyle en C4 et néo-pentyle en C5.

Le terme « alkylène » se rapporte au radical d'hydrocarbure bivalent dérivé d'un groupe alkyle, et il devra être interprété conformément à la définition ci-dessus.

Le terme « alcényle » comprend des résidus d'hydrocarbures monoinsaturés comprenant : - des groupes linéaires de 2 à 6 atomes (C2 à Ce) . Les exemples de tels groupes alcényle comprennent, mais n'y sont pas limités, les groupes vinyle en C2, 1-propényle en C3, allyle en C3, 2-butényle en C4. - des groupes ramifiés de 3 à 8 atomes (C3 à Cs) · Les exemples de tels groupes alcényle comprennent, mais n'y sont pas limités, les groupes 2-méthyl-2-propényle en C4 et 2,3-diméthyl-2-butényle en Ce.

Le terme alcénylène se rapporte au radical d'hydrocarbure bivalent dérivé d'un groupe alcényle, et il devra être interprété conformément à la définition ci-dessus.

Le terme « alcoxy » comprend des résidus d'hydrocarbures O-liés comprenant : - des groupes linéaires de 1 à 6 atomes (Ci à C6), ou de 1 à 4 atomes (Ci à C4) . Les exemples de tels groupes alcoxy comprennent, mais n'y sont pas limités, les groupes méthoxy en Ci, éthoxy en C2, n-propoxy en C3 et n-butoxy en C4. - des groupes ramifiés de 3 à 6 atomes (C3 à Câ) ou de 3 à 4 atomes (C3 à C4). Les exemples de tels groupes alcoxy comprennent, mais n'y sont pas limités, les groupes iso-propoxy en C3, et sec-butoxy et tert-butoxy en C4. L'halogène est choisi parmi Cl, F, Br et I. L'halogène est de préférence F.

Le terme « aryle » comprend un système de cycle aromatique simple ou fusionné contenant 6 à 10 atomes de carbone ; où, sauf indication contraire, à chaque apparition le groupe aryle peut être éventuellement substitué par jusqu'à 5 substituants choisis indépendamment parmi des groupes alkyle en Ci à Ce, alcoxy en Ci à Ce, OH, halogéno, CN, COOR14, CF3 et NR14R15 ; tels que définis ci-dessus. Généralement, le groupe aryle sera éventuellement substitué par 1, 2 ou 3 substituants. Les substituants éventuels sont choisis parmi ceux indiqués ci-dessus. Les exemples de groupes aryle appropriés comprennent les groupes phényle et naphtyle (chacun éventuellement substitué comme il a été indiqué ci-dessus). Arylène se rapporte au radical bivalent dérivé d'un groupe aryle, et il devra être interprété conformément à la définition ci-dessus.

Le terme « hétéroaryle » comprend un cycle aromatique monocyclique ou bicyclique de 5, 6, 9 ou 10 chaînons, contenant 1 ou 2 atomes N et, éventuellement, un atome NR14, ou un atome NR14 et un atome S ou O, ou un atome S, ou un atome O ; où, sauf indication contraire, ledit groupe hétéroaryle peut être éventuellement substitué par 1, 2 ou 3 substituants choisis indépendamment parmi les groupes alkyle en Ci à Ce, alcoxy en Ci à Ce, OH, halogéno, CN, COOR14, CF3 et NR14R15 ; tels que définis ci-dessous. Les exemples de groupes hétéroaryle appropriés comprennent les groupes thiényle, furanyle, pyrrolyle, pyrazolyle, imidazoyle, oxazolyle, isoxazolyle, thiazolyle, isothiazolyle, triazolyle, oxadiazolyle, thiadiazolylê, tétrazolyle, pyridinyle, pyridazinyle, pyrimidinyle, pyrazinyle, indolyle, benzimidazolyle, benzotriazolyle, quinoléinyle et isoquinoléinyle (éventuellement substitué comme il a été indiqué ci-dessus). L'hétéroarylène se rapporte au radical bivalent dérivé d'un groupe hétéroaryle, et il devra être interprété conformément à la définition ci-dessus.

Le terme « hétérocyclyle » est un cycle monocyclique ou bicyclique non aromatique de 3 à 10 chaînons C-lié ou N-lié, où ledit cycle hétérocycloalkyle contient, lorsque c'est possible, 1, 2 ou 3 hétéroatomes choisis indépendamment parmi N, NR14, S (O)q et O ; et ledit cycle hétérocycloalkyle contient éventuellement, lorsque c'est possible, 1 ou 2 liaisons doubles, et est éventuellement substitué sur le carbone par 1 ou 2 substituants choisis indépendamment parmi les groupes alkyle en Ci à Ce, alcoxy en Ci à Ce, OH, CN, CF3, halogéno, COOR14, NR14R15 et aryle.

Dans les définitions ci-dessus, R14 et R15 sont choisis indépendamment parmi H et un groupe alkyle en Ci à Ce.

Lorsqu'une formule structurale est définie avec un substituant fixé au cœur de la molécule par une liaison non spécifiée ou « flottante », par exemple, comme pour le groupe P3 dans le cas de la formule (C) , cette définition englobe les cas où le substituant non spécifié est fixé à l'un quelconque des atomes sur le cycle dans lequel la liaison flottante est localisée, tout en observant la valence permise pour cet atome.

Dans le cas des composés de l'invention qui peuvent exister sous des formes tautomères (c'est-à-dire, sous des formes céto ou énol), par exemple les composés de formule (C) ou (H) , la référence à un composé particulier comprend éventuellement toutes ces formes tautomères. Généralités

La pratique de la présente invention emploiera, sauf indication contraire, des procédés traditionnels de chimie, biochimie, biologie moléculaire, immunologie et pharmacologie, connues de l'homme du métier. De telles techniques sont pleinement expliquées dans la littérature. Voir, par exemple, les références 121 à 128, etc.

La numérotation « GI » est utilisée ci-dessus. Un numéro GI, ou « Identifiant Genlnfo », est une série de chiffres assignés consécutivement à chaque enregistrement de séquence traité par le NCBI lorsque des séquences sont ajoutées à ses bases de données. Le numéro GI n'a aucune relation avec le numéro d'accession de l'enregistrement de la séquence. Lorsqu'une séquence est mise à jour (par exemple, pour une correction, ou pour ajouter d'autres annotations ou informations) alors elle reçoit un nouveau numéro GI. Ainsi, la séquence associée à un numéro GI donné n'est jamais changée.

Lorsque l'invention concerne un « épitope », cet épitope peut être un épitope de lymphocyte B et/ou un épitope de lymphocyte T. De tels épitopes peuvent être identifiés de façon empirique (par exemple, en utilisant PEPSCAN [129,130] ou des procédés similaires) , ou ils peuvent être prédits (par exemple, en utilisant l'index antigénique de Jameson-Wolf [131], des approches basées sur des matrices [132], MAPITOPE [133], TEPITOPE [134,135], des réseaux neuronaux [136], OptiMer et EpiMer [137,138], ADEPT [139], Tsites [140], 1'hydrophilicité [141], l'index antigénique [142] ou les procédés divulgués dans les références 143 à 147, etc.). Les épitopes sont les parties d'un antigène qui sont reconnues par et se lient aux sites de liaison d'un antigène des anticorps ou des récepteurs des lymphocytes T, et ils peuvent être également appelés « déterminants antigéniques ».

Lorsqu'un « domaine » d'antigène est omis, ceci peut impliquer l'omission d'un peptide signal, d'un domaine cytoplasmique, d'un domaine transmembranaire, d'un domaine extracellulaire, etc.

Le terme « comprenant » englobe « incluant » ainsi que « constitué de », par exemple une composition « comprenant » X peut être constituée exclusivement de X ou elle peut comprendre quelque chose d'autre, par exemple X + Y.

Le terme « environ » en relation avec une valeur numérique x est facultatif et signifie, par exemple, x + 10 %.

Les références à un pourcentage d'identité de séquence entre deux séquences d'acides aminés signifient que, lorsqu'elles sont alignées, ces pourcentages d'acides aminés sont identiques en comparant les deux séquences. Cet alignement et le pourcentage d'homologie ou l'identité de séquence peuvent être déterminés en utilisant des programmes de logiciels connus de l'état- de l'art, par exemple ceux décrits dans la section 7.7.18 de la référence 148. Un alignement préféré est déterminé par l'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman en utilisant une recherche affine de brèche avec une pénalité d'ouverture de brèche de 12 et une pénalité d'extension de brèche de 2, la matrice BLOSUM de 62. L'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman est divulgué dans la référence 149. Le pourcentage d'identité avec toute séquence particulière (par exemple, à une SEQ ID particulière) est idéalement calculé sur la longueur entière de cette séquence. L'affinité de liaison peut être déterminée par tout procédé connu de l'état de l'art, y compris la résonance plasmonique de surface, la calorimétrie à titrage isotherme, les tests de liaison compétitive, le test à décalage thermique, etc. Bien que les chiffres absolus obtenus en utilisant les différents procédés peuvent varier, il est envisagé que l'affinité de liaison relative à la détermination d'une protéine comparativement à une autre ne dépende pas du procédé utilisé.

Les adjuvants contenant du phosphore utilisés dans l'invention peuvent exister sous un certain nombre de formes protonées et déprotonées selon le pH de l'environnement immédiat, par exemple le pH du solvant dans lequel ils sont dissous. Par conséquent, bien qu'une forme particulière puisse être illustrée, il est prévu que ces illustrations soient simplement représentatives et non limitatives à une forme protonée ou déprotonée spécifique. Par exemple, dans le cas d'un groupe phosphate, celui-ci a été illustré comme -OP (0) (OH)2 mais la définition comprend les formes protonées (0P(0) (OH2) (0H)]+ et -[OP (O) (OH)2]2+ qui peuvent exister dans des conditions acides et les formes déprotonées ~[0P(0) (OH) (0)]~ et [0P(0) (0)2]2~ qui peuvent exister dans des conditions basiques.

Les composés peuvent exister sous la forme de sels pharmaceutiquement acceptables. Ainsi, les composés (par exemple, les adjuvants) peuvent être utilisés sous la forme de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, c'est-à-dire des sels physiologiquement ou toxicologiquement tolérables (ce qui comprend, lorsque c'est approprié, des sels d'addition de base pharmaceutiquement acceptables et des sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables).

Le terme « substantiellement » n'exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « substantiellement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Lorsque c'est nécessaire, le terme « substantiellement » peut être omis de la définition de 1'invention.

Modes de réalisation de l'invention Mutant SpAkR

Le SpA est un facteur de virulence crucial dans S. aureus et il agit par interférence avec la clairance opsonophagocytaire de la bactérie et par ablation des réponses immunitaires adaptatives. La séquence de type sauvage SEQ ID NO : 43 comprend cinq domaines de liaison d'Ig (IgBD), comme il a été montré ci-dessus, et on sait muter des résidus d'acides aminés au sein de ces domaines pour abolir l'activité de liaison au Fc/Fab tout en conservant l'immunogénicité, par exemple, voir la référence [19], qui remplace les dipeptides Gln-Gln par Lys-Lys et/ou remplace les dipeptides Asp-Asp par Ala-Ala.

Il a été produit un nouveau SpA mutant dans lequel un autre dipeptide Gln-Gln est muté en Lys-Arg. Ce dipeptide a été identifié en se basant sur une analyse par bioinformatique et les prédictions d'un site supplémentaire impliqué dans la liaison des Ig. En particulier, les résidus 96 et 97 de SEQ ID NO : 43 ont été supposés être impliqués dans la liaison des Ig. Ce site a été négligé dans des travaux antérieurs parce qu'il se situe en dehors des IgBD conservés et ne fait pas partie des structures résolues. Le nouveau mutant est appelé « SpAkR » et il a la séquence d'acides aminés suivante, où la substitution QQ/KR supplémentaire par rapport au mutant « SpAkkAA » antérieur est encadrée MAQH DEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQ SLKAAP S QSANVLGEAQKLNDSQAPKADA|kr|nNF NKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNA FYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHL PNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQ RNGFIQSLKAAPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 48)

Le mutant SpAkR a été confirmé comme présentant une affinité réduite pour les immunoglobulines par rapport aux mutants connus, tout en conservant une immunogénicité.

Des analyses de CD et DSC ont montré que l'introduction du mutant KR n'a pas affecté matériellement la structure de SpA. Les spectres de CD de SpAkkAA et SpAkR ont été identiques. Les Tml et Tm2 issues de l'analyse de DSC ont été les suivantes. Tml : SpAkkAA 48,9 °C ; SpAKR 51,1 °C. Tm2 :

SpAkkAA 68,1 °C ; SpAKR 68,0 °C. L'affinité de SpA de type sauvage, et des mutants SpAkkAA et SpAkR, pour les IgG, les IgA et les IgM humaines a été testée en utilisant la résonance plasmonique de surface. Les protéines ont été immobilisées sur une puce capteur et des IgG, des IgA et des IgM humaines ont été utilisées en tant qu'analytes. Les deux mutants ont affiché une capacité de liaison grandement réduite comparativement au type sauvage, mais alors que le SpAkkAA a montré une liaison résiduelle aux IgG et aux IgM, aucune interaction détectable avec aucune immunoglobuline n'a été observée avec le SpAkR. Les activités de liaison résiduelle du SpAkkAA envers les IgG et les IgM ont été très faibles (11 à 12 fois inférieures au type sauvage) , mais reproductibles et dépendantes de la concentration.

La survie de S. aureus en présence de SpA (type sauvage, SpAkkAA et SpAkR) a été estimée dans un test de survie sur du sang total (WBA) . 1 ml de sang total provenant de donneurs en bonne santé, complémenté avec 50 mg/1 d'anticoagulant lépirudine (10 CH/ml de sang), a été incubé avec 0,15 CM de SpA ou avec du PBS, pendant 15 min à 37 °C, avant d'ajouter approximativement 2,5 x 105 CFU de S. aureus USA300 LAC (DC>6ocu 0,4) diluées dans du BHI. Des aliquotes de cette culture ont été déposées sur de la gélose BHI pour déterminer les CFU au départ. Après incubation à 37 °C pendant 2 h avec agitation (180 tr/min), les neutrophiles ont été lysés à 0,5 % de saponine-PBS pendant 3 min sur de la glace. Le nombre des bactéries viables a été déterminé par des dilutions en série au dixième dans du BHI et dépôt sur des plaques de gélose nutritive. Les colonies ont été dénombrées après incubation des plaques à 37 °C pendant 18 h. Le témoin était l'échantillon de sang préincubé avec du PBS. La survie relative a été calculée en se basant sur les CFU au départ comparativement aux CFU après incubation. Les expériences ont été réalisées en triple ; il y a eu peu de variation entre les expériences.

Dans le test WBA, la survie relative de S. aureus dans le sang total humain a été considérablement inférieure lors d'une incubation avec le SpAkR par rapport au SpA de type sauvage (p < 0,001, Mann-Whitney) ou avec le SpAkkAA (p < 0,05) . L'incubation avec le SpA de type sauvage a entraîné une augmentation de la survie du S. aureus comparativement au témoin (p < 0,001), tandis que la survie dans le test WBA incubé avec le SpAkkAA a été comparable au témoin. L'incubation avec le SpAkR a réduit la survie d'environ la moitié de celle du témoin.

Il a été trouvé que le SpAkkAA et le SpAkR formulés avec l'adjuvant d'hydroxyde d'aluminium sont faiblement immunogènes chez les souris en eux-mêmes, mais l'inclusion de l'agoniste du TLR7 « Kl » adsorbé a significativement augmenté les titres en anticorps. Du fait que le mécanisme d'action associé à l'immunisation avec le SpA semble être dirigé principalement par des anticorps, ceci représente une amélioration importante.

Vaccins contre S. aureus

Le SpAkR, le SpAkkAA, le domaine E du SpAkR seul et le domaine E du SpAkR fusionné à HlaH35L ont été testés dans le modèle d'abcès rénal, adjuvés avec de 1'hydroxyde d'aluminium (Al-H) à 2 mg/ml (sel total). Les antigènes étaient chacun présents à 10 dg dans une dose de 100 DI pour une injection intramusculaire.

Des souris (CDI) âgées de quatre ou cinq semaines ont été immunisées par voie intramusculaire (IM) avec des injections de sensibilisation-rappel avec un intervalle de 14 jours. Les souris témoins ont reçu des quantités égales d'adjuvants seuls. Le sérum a été prélevé des souris à la fois avant et après la vaccination pour documenter les titres en anticorps sériques dirigés contre chaque composant protéinique dans le vaccin combiné. Ces titres ont été mesurés par la technologie Luminex en utilisant des antigènes vaccinaux recombinants conjugués à des microsphères.

Modèle d'abcès rénal : des animaux immunisés ont été stimulés (« challengés) au jour 24 par une injection intraveineuse d'une dose sous-létale de la souche Newman de S. aureus (~ 2 à 6 x 107 CFU) . Au jour 28, les souris ont été euthanasiées et les reins ont été prélevés et homogénéisés dans 2 ml de PBS et déposés sur un milieu de gélose en double pour la détermination des unités formant une colonie (CFU).

Une réduction comparable en logio des CFU/ml (réduction autour de 1 log) a été obtenue avec la vaccination avec le SpAkR, le SpAkkAA, le domaine E du SpAkR seul et le domaine E du SpAkR fusionné à HlaH35L, comparativement à l'adjuvant seul.

Vaccins combinés contre S. aureus

Un vaccin pentavalent et un vaccin hexavalent ont été préparés. Le vaccin pentavalent comprenait des antigènes constitués de SEQ ID NO : 7, 8, 27 et 32 (FhuD2, StaOll, Hla- H35L, et EsxAB) ; le vaccin hexavalent comprenait également le mutant SpAkR. Les vaccins ont été adjuvés avec : (i) de l'hydroxyde d'aluminium, Al-H ; (ii) Al-H + agoniste du TLR7 Kl adsorbé ; ou (iii) l'émulsion huile dans l'eau MF59. Le Al-H a été utilisé à 2 mg/ml (sel total), Kl était présent à 50 pg par dose, et le MF59 a été mélangé avec les antigènes dans un rapport en volume de 1/1. Les antigènes étaient chacun présents à 10 pg dans une dose de 100 pl pour une injection intramusculaire.

Des souris (CDI) âgées de quatre ou cinq semaines ont été immunisées avec des injections de sensibilisation-rappel avec un intervalle de 14 jours. Les souris témoins ont reçu des quantités égales d'adjuvants seuls. Le sérum a été prélevé des souris à la fois avant et après la vaccination pour documenter les titres en anticorps sériques dirigés contre chaque composant protéinique dans le vaccin combiné. Ces titres ont été mesurés par la technologie Luminex en utilisant les antigènes vaccinaux recombinants conjugués à des microsphères.

Modèle d'abcès rénal : des animaux immunisés ont été stimulés (« challengés ») au jour 24 par une injection intraveineuse d'une dose sous-létale de S. aureus (~ 2 à 6 x 107 CFU, où 1'inoculum spécifique a varié selon la souche de stimulation (« challenge ») ) . Au jour 28, les souris ont été euthanasiées et les reins ont été prélevés et homogénéisés dans 2 ml de PBS et déposés sur un milieu de gélose en double pour la détermination des unités formant une colonie (CFU). Les reins ont été également traités pour une histopathologie.

Modèle de péritonite : séparément, des animaux immunisés ont été stimulés (« challengés ») au jour 24 par une injection intrapéritonéale d'une dose létale de S. aureus 2 à 5 x 108 CFU) et ensuite surveillés quotidiennement pendant 14 jours.

Modèle d'infection de la peau : des souris immunisées ont été inoculées par une injection sous-cutanée dans le flanc droit rasé avec 2 x 107 CFU de la souche LAC de S. aureus (clone USA300, qui est l'un des clones les plus importants dans le monde et qui est hautement associé à des infections cutanées acquises en communauté) . La masse et la formation d'abcès (taille et dermonécrose) ont été surveillées à des intervalles de 24 heures sur une période de 7 jours. La taille d'un abcès et de la lésion dermonécrotique sous-jacente associée a été déterminée en utilisant un logiciel d'analyse d'images. La peau des souris et les abcès ont été récoltés au jour 7 après l'inoculation pour le dénombrement des CFU. Ce modèle a été utilisé uniquement avec l'adjuvant Al-H/Kl.

Les résultats ont été les suivants :

*p < 0,05 comparativement au témoin ; **p < 0,01 comparativement au témoin

Ces résultats démontrent que le mutant SpAkR améliore le produit pentavalent Combo-1 dans les deux modèles. En outre, les meilleurs résultats ont été observés en utilisant l'adjuvant Al-H/Kl. De façon surprenante, avec les résultats dans le modèle de l'abcès rénal, le vaccin hexavalent avec Al-H/K a approché de la stérilité.

Dans le modèle de péritonite, le vaccin hexavalent avec Al-H/Kl a été statistiquement supérieur comparativement au témoin négatif (voir le tableau ci-dessus), et également comparativement au vaccin pentavalent avec Al-H. Dans le modèle de l'abcès, le vaccin hexavalent avec Al-H/Kl a été statistiquement supérieur comparativement au témoin négatif (voir le tableau ci-dessus), au vaccin pentavalent Al-H, et au vaccin pentavalent Al-H/Kl, montrant ainsi que la contribution du mutant de SpA va au-delà de l'amplification qui était seulement due à l'agoniste Kl.

Dans le modèle de l'infection de la peau, les vaccins pentavalent et hexavalent ont réduit significativement la formation d'abcès et le nombre des CFU (voir le tableau ci-dessus). La dermonécrose a été absente chez les souris vaccinées alors qu'elle a été observée chez toutes les souris qui ont reçu l'adjuvant seul (« N/A » dans le tableau) . En outre, la réduction des CFU a été significativement améliorée par l'inclusion de SpAkR dans le vaccin, et il a été observé moins de souris avec des abcès distinguables au niveau macroscopique (71 % contre 88 %).

Les titres en anticorps anti-SpA ont été également comparés pour les trois adjuvants. Les titres médians en utilisant du Al-H ou du MF59 n'ont pas été significativement différents, mais le titre en utilisant du Al-H/Kl a été significativement supérieur comparativement à l'utilisation du Al-H seul (p = 0,0047, test de Mann-Whitney) et du MF59 (p = 0,01). Ainsi la formulation qui a fonctionné le mieux dans les tests fonctionnels a été celle qui a déclenché les titres les plus élevés en anticorps anti-SpA, en ligne avec l'hypothèse que l'activité du SpA en tant qu'antigène vaccinal dépend des anticorps qui peuvent le lier et inhiber son activité lui permettant d'échapper au système immunitaire.

Il faudra comprendre que l'invention a été décrite à titre d'exemple uniquement et que des modifications peuvent être effectuées tout en demeurant au sein de la portée et de l'esprit de l'invention. Références [1] Sheridan (2009) Nature Biotechnology 27:499-501.

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Listage de séquences SEQIDNO: 1 (EsxA)

MAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLE

EIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQ SEQ ID NO : 2 (EsxB)

MGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQLAEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELV

QPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP SEQ ID NO : 3 (FhuD2)

MKKLLLPLIIMLLVLAACGNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAWAPTYAGGLKKLGANIVA

VNQQVDQSKVLKDKFKGVTKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTVWDYNKHKYLEQQE

MLGKIVGKEDKVKAWKKDWEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGL

KMQPEQQKLTAKAGWAEVKQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWY

NDPYTLDFMRKDLKEKLIKAAK SEQ ID NO : 4 (Sta011)

MMKRLNKLVLGIIFLFLVISITAGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGT WIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKE IKDEKIKKEIENFKFFVQYGDFKNLKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAP KLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV SEQ ID NO : 5 (Hla)

MKTRIVSSVTTTLLLGSILMNPVANAADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFID

DKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMS

TLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDR

DSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRD

DYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO : 6 (FhuD2 tronqué à l'extrémité N-termi nale de SEQ ID NO : 3)

CGNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAWAPTYAGGLKKLGANIVAVNQQVDQSKVLKDKFKG VTKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTVWDYNKHKYLEQQEMLGKIVGKEDKVKAWKK DWEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGLKMQPEQQKLTAKAGWAE VKQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWYNDPYTLDFMRKDLKEKL IKAAK SEQ ID NO : 7 (exemple de séquence de FhuD2)

MASCGNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAWAPTYAGGLKKLGANIVAVNQQVDQSKVLKDK FKGVTKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTWVDYNKHKYLEQQEMLGKIVGKEDKVKA WKKDWEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGLKMQPEQQKLTAKAG WAEVKQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWYNDPYTLDFMRKDLK EKLIKAAK SEQ ID NO: 8 (exemple de séquence de Sta011 )

MGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGTWIINSEMVIQPNNEDMVAKGMV LYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKEIKDEKIKKEIENFKFFVQYGDF KNLKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAPKLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEF TFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV SEQID NO : 9 (exempl e de séquence de Sta011 )

MMKRLNKLVLGIIFLFLVISITAGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGT WIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKE IKDEKLKKEIENFKFFVQYGDFKNIKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAP KLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV SEQ ID NO : 10 (exempl e de séquence de Sta011 )

MMKRLNKLVLGIIFLFLVISITAGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGT WIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKE IKDEKVKKEIENFKFFVQYGDFKNIKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAP KLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV SEQ ID NO : 11 (exemple de séquence de Sta011)

MMKRLNKLVLGIIFLFLVISITAGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGT WIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKE IKDEKLKKEIENFKFFVQYGDFKNVKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAP KLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV SEQID NO: 12(HlatronquéàrextrémitéN^terminaleSEQID NO: 5)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE

EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV

SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF

LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE

RYKIDWEKEEMTN SEQID NO: 13(Hla-H35L mature)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE

EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV

SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF

LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE

RYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO : 14 (tétramère)

PSGS SEQ ID NO : 15 (Hla-H35L avec substitution de PSGS)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE

EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTPSGSVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMV

NQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNI

DVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO : 16 (Hla avec substitution de PSGS)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE

EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTPSGSVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMV

NQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNI

DVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO : 17 (Hlaavec mutation Y101)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE

EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDLYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV

SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF

LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE

RYKIDWEKEEMTN SEQIDNO: 18 (Hla avec mutation D152)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPLFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN SEQID NO : 19 (Hla avec les mutations H35 et Y101)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDLYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN SEQID NO: 20 (Hla avec les mutations H 53 et D152)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPLFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO : 21 (fragment de Hla)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNK SEQ ID NO : 22 (fragment de Hla)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAG SEQ ID NO : 23 (fragment de Hla)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLL SEQ ID NO : 24 (fragment de Hla-H35L)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNK SEQ ID NO : 25 (fragment de Hla-H35L)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAG SEQ ID NO : 26 (fragment de Hla-H35L)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLL SEQ ID NO : 27 (séquencede HLA utile avec la mutation H35L)

MASADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRV YSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIG ANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAA DNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDR SSERYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO : 28 (exemple de EsxAB)

MAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLE

EIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSMGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQ

LAEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP SEQ ID NO : 29 (exemplede EsxBA)

MGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQLAEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELV

QPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNPASGGGSMAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILS

DLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLEEIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQ SEQ ID NO : 30 (Meur — « linker »)

ASGGGS SEQ ID NO: 31 (exempledeEsxAB)

AMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLEE IKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQLA EYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP SEQ ID NO : 32 (exemplede EsxAB)

MAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLE EIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQL AEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP SEQ ID NO : 33 (SEQ ID NO : 4 tronquée à l'extrémité N^erminale)

GCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGTWIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVL

YMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKEIKDEKIKKEIENFKFFVQYGDFK

NLKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAPKLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFT

FVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV SEQ ID NO : 34 (FhuD2)

GNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAVVAPTYAGGLKKLGANIVAVNQQVDQSKVLKDKFKGV

TKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTVWDYNKHKYLEQQEMLGKIVGKEDKVKAWKKD

WEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGLKMQPEQQKLTAKAGWAEV

KQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWYNDPYTLDFMRKDLKEKLI

KAAK SEQ ID NO : 35 (séquence de EsxB dépourvue de Cys)

GGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEAXQKQTQQLAEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQ

PMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP SEQ ID NO : 36 (versi on dépourvue de Cys de Sta011 SEQ ID NO : 4)

GIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGTWIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYM

NRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKEIKDEKIKKEIENFKFFVQYGDFKNL

KNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAPKLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFV

EKKEENIYFSDSLDYKKSGDV SEQ ID NO : 37 (version dépourvue de Cys de FhuD2 SEQ ID NO : 7) MASGNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAWAPTYAGGLKKLGANIVAVNQQVDQSKVLKDKF KGVTKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTVWDYNKHKYLEQQEMLGKIVGKEDKVKAW KKDWEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGLKMQPEQQKLTAKAGW AEVKQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWYNDPYTLDFMRKDLKE KLIKAAK . SEQID NO: 38 (mutant Cys-Ala de EsxAB)

MAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLE EIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEAAQKQTQQL AEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP SEQID NO : 39 (séquencedeSta011 utile)

MGSGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGTWIINSEMVIQPNNEDMVAKGMV

LYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKEIKDEKIKKEIENFKFFVQYGDF

KNLKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAPKLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEF

TFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV SEQ ID NO : 40 (exemple de EsxAB dépourvu de Cys) AMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLEE IKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEAXQKQTQQLA EYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP . SEQ ID NO: 41 icicicicicicicicicicicicic SEQID NO: 42

KLKLLLLLKLK SEQ ID NO : 43 (SpA)

MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKD DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVL GEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAP KADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQN AFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKP GKEDNNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGN GVHWKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELWDKKQPANHADANKAQALPETGEENP FIGTTVFGGL S LALGAALLAGRRREL SEQ ID NO : 44 (SpAkkAA)

AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDXXS

AFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKXXPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEXXNAFYEILNMPNLN

EEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLK

XXPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKXXPSVSKEILAE

AKKLNDAQAPK SEQID NO: 45(SpAkkAA)

AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDKKS

AFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLN

EEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLK

AAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAE

AKKLNDAQAPK SEQ ID NO : 46 (SpAkR)

AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAXXNNFNKDKKS

AFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLN

EEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLK

AAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAE

AKKLNDAQAPK SEQID NO: 47(SpAkR)

AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKRNNFNKDKKS AFYEILNMPNLNEAQRNGFIQ SLKAAPSQS TNVLGEAKKLNE S QAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLN EEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLK AAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAE AKKLNDAQAPK SEQ ID NO : 48 (SpAkR utilisé dans l'exemple)

MAQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKRNNFNKDKK

SAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNL

NEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSL

KAAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILA

EAKKLNDAQAPK SEQID NO: 49(SpAkR)

AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAXXNNFNKDXXS AFYEILNMPNLNEAQRNGFIQ S LKXXPS QS TNVLGEAKKLNE SQAPKADNNFNKEXXNAFYEILNMPNLN EEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLK XXPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKXXPSVSKEILAE AKKLNDAQAPK SEQ ID NO : 50 (domaine E de SpAkR)

AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAXXNNFNKD SEQ ID NO : 51 (domaine E de SpAkR)

AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKRNNFNKD SEQ ID NO : 52 (domai ne E de SpAkR)

AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKRNNFNKD SEQ ID N0: 53 (dornane E de SpAkR utilisé dans I'exemple)

MAQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQS LKAAP S Q SANVLGEAQKLNDS QAPKADAKRNNFNKD SEQ ID NO : 54 (dorna ne E de SpA)

AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKD

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition immunogène comprenant les antigènes EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla, caractérisée en ce que la composition comprend en outre un antigène SpA mutant, où le mutant présente une affinité diminuée, par rapport au SpA non modifié, pour la partie FcD des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3.
2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle - l'antigène EsxA déclenche des anticorps chez le mammifère qui reconnaissent SEQ ID NO : 1 ; - l'antigène EsxB déclenche des anticorps chez le mammifère qui reconnaissent SEQ ID NO : 2 ; - l'antigène FhuD2 déclenche des anticorps chez le mammifère qui reconnaissent SEQ ID NO : 3 ; - l'antigène StaOll déclenche des anticorps chez le mammifère qui reconnaissent SEQ ID NO : 4 ; - l'antigène Hla déclenche des anticorps chez le mammifère qui reconnaissent SEQ ID NO : 5 ; et - l'antigène SpA mutant déclenche des anticorps chez le mammifère qui reconnaissent SEQ ID NO : 43.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'antigène Hla est un antigène Hla détoxifié, particulièrement une forme mutante H35L de Hla.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle les antigènes EsxA et EsxB sont dans un polypeptide unique.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l'antigène SpA mutant est de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 43 mutée dans au moins 1, particulièrement au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 et plus particulièrement 20 acides aminés au niveau de la position 43, 44, 70, 71, 96, 97, 104, 105, 131, 132, 162, 163, 190, 191, 220, 221, 247, 248, 278, 279, 305 et/ou 306 de SEQ ID NO : 43 ; même plus particulièrement est de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 44 ou SEQ ID NO : 49.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où la composition comprend : (i) un polypeptide unique comprenant à la fois un antigène EsxA et un antigène EsxB, particulièrement de séquence comprenant SEQ ID NO : 31 ; (ii) un antigène FhuD2, particulièrement de séquence comprenant SEQ ID NO : 6 ; (iii) un antigène StaOll, particulièrement de séquence comprenant SEQ ID NO : 33 ; (iv) une forme mutante H35L de Hla, particulièrement de séquence comprenant SEQ ID NO : 13 ; et (v) un antigène SpA mutant, particulièrement de séquence comprenant SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 45 ou SEQ ID NO : 47.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où la composition comprend : (i) un premier polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 32 ; (ii) un deuxième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 7 ; (iii) un troisième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 8 ; (iv) un quatrième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 27 ; et (v) un cinquième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 52, éventuellement comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 45 modifiée par jusqu'à 3 substitutions d'acides aminés, éventuellement SEQ ID NO : 47.
8. Composition selon l'une . quelconque des revendications 1 à 5, où la composition comprend : (i) un premier polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 38 ; (ii) un deuxième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 37 ; (iii) un troisième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 39 ; (iv) un quatrième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 27 ; et (v) un cinquième polypeptide de séquence comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 52, éventuellement comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 45 modifiée par jusqu'à 3 substitutions d'acides aminés, éventuellement SEQ ID NO : 47.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle la composition comprend également un adjuvant.
10. Composition selon la revendication 9, où ledit adjuvant est choisi dans le groupe constitué de : - sels d'aluminium, particulièrement des hydroxydes d'aluminium et des phosphates d'aluminium ; - agonistes des TLR humains, particulièrement des agonistes du TLR7 ; et - un mélange de ceux-ci.
11. Composition selon la revendication 10, dans laquelle ledit agoniste du TLR7 est un composé de la formule (K) suivante :

dans laquelle : R1 représente H, un groupe alkyle en Ci à Ce, -C(R5)20H, -L1R5, -L1R6, -L2R5, -L2R6, -OL2R5, OU -OL2R6; L1 représente-C (O)- ou -O- ; L2 représente un groupe alkylène en Ci à Ce, alcénylène en C2 à Ce, arylène, hétéroarylène ou - ( (CR4R4) pO) q (CH2) p-, où les groupes alkylène en Ci à Ce et alcénylène en C2 à Ce de L2 sont éventuellement substitués par 1 à 4 groupes fluoro ; chaque L3 est choisi indépendamment parmi les groupes alkylène en Ci à Ce et - ( (CR4R4) pO) q (CH2) p-, où le groupe alkylène en Ci à Ce de L3 est éventuellement substitué par 1 à 4 groupes fluoro ; L4 représente un groupe arylène ou hétéroarylène ; R2 représente H ou un groupe alkyle en Ci à Ce ; R3 est choisi parmi les groupes alkyle en Ci à C4, -L3R5, -L1R5, -L3R7, -L3L4L3R7, -L3L4R5, -L3L4L3R5, -OL3R5, -OL3R7, -OL3L4R7, -OL3L4L3R7, -OR8, -OL3L4R5, -OL3L4L3R5 et -C(R5)2OH ; chaque R4 est choisi indépendamment parmi H et un groupe fluoro ; R5 représente un groupe -P(O) (OR9) 2 ; R6 représente un groupe -CF2P (0) (OR9)2 ou -C(0)0R10 ; R7 représente un groupe -CF2P (0) (OR9)2 ou -C(0)0R10 ; R8 représente H ou un groupe alkyle en Ci à C4 ; chaque R9 est choisi indépendamment parmi H et un groupe alkyle en Ci à Ce ; R10 représente H ou un groupe alkyle en Ci à C4 ; chaque p est choisi indépendamment parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6, et q vaut 1, 2, 3 ou 4 ; particulièrement l'acide 3-(5-amino-2-(2-méthyl-4-(2-(2-(2-phosphonoéthoxy)éthoxy)éthoxy)phénéthyl)benzo[f][1,7]-naphtyridin-8-yl)propanoïque (Kl).
12. Composition selon la revendication 10 ou 11, dans laquelle l'adjuvant comprend un agoniste des TLR humains adsorbé sur un sel d'aluminium.
13. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour une utilisation en tant que médicament.
14. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour une utilisation en tant que médicament dans la prévention et/ou le traitement d'une infection à S. aureus.
15. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour une utilisation selon la revendication 13 ou 14 chez un être humain.
16. Composition immunogène comprenant : (i) 1, 2, 3 ou 4 antigènes du groupe constitué des antigènes EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll, et Hla, particulièrement tels que définis dans l'une quelconque des revendications 2 à 6 ; et (ii) un antigène SpA mutant qui présente une affinité diminuée, par rapport au SpA non modifié, pour la partie FcD des IgG humaines et pour la partie Fab des récepteurs des lymphocytes B humains contenant VH3, particulièrement tel que défini selon la revendication 2 ou 6.