ES2768224T3 - Conjugados ligando-enlazador de unión a PSMA y métodos para su uso - Google Patents

Conjugados ligando-enlazador de unión a PSMA y métodos para su uso Download PDF

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Abstract

Un conjugado que comprende un ligando del PSMA (B), un enlazador (L) y un fármaco (D), en el que el enlazador está unido covalentemente al medicamento y el enlazador está unido covalentemente al ligando, y en el que el enlazador comprende una cadena de al menos siete átomos o de al 5 menos aproximadamente 10 angstroms de longitud, en el que el ligando (a) comprende un ácido fosfónico o un ácido fosfínico, o (b) es una urea de dos aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados ligando-enlazador de unión a PSMA y métodos para su uso
Campo técnico
La invención descrita en el presente documento se refiere a conjugados y métodos para tratar enfermedades de la próstata, tales como cáncer de próstata y enfermedades relacionadas. Más específicamente, las realizaciones de la invención descritas en este documento pertenecen a conjugados de agentes biológicamente activos conjugados con ligandos de unión a PSMA.
Antecedentes
La próstata es uno de los órganos reproductores masculinos que se encuentran en la pelvis debajo de la vejiga urinaria. Funciona para producir y almacenar fluido seminal que proporciona nutrientes y fluidos que son vitales para la supervivencia de los espermatozoides introducidos en la vagina durante la reproducción. Al igual que muchos otros tejidos, las glándulas prostáticas también son propensas a desarrollar tumores malignos (cancerosos) o benignos (no cancerosos). La Sociedad Americana del Cáncer predijo que más de 230,000 hombres serían diagnosticados con cáncer de próstata y más de 30,000 hombres morirían por la enfermedad en el año 2005. De hecho, el cáncer de próstata es uno de los cánceres masculinos más comunes en las sociedades occidentales, y es la segunda forma principal de malignidad entre los hombres estadounidenses. Los métodos de tratamiento actuales para el cáncer de próstata incluyen terapia hormonal, radioterapia, cirugía, quimioterapia, terapia fotodinámica y terapia de combinación. La selección de un tratamiento generalmente varía según la etapa del cáncer. Sin embargo, muchos de estos tratamientos afectan la calidad de vida del paciente, especialmente aquellos hombres a quienes se les diagnostica cáncer de próstata mayores de 50 años. Por ejemplo, el uso de medicamentos hormonales a menudo se acompaña de efectos secundarios como osteoporosis y daño hepático. Tales efectos secundarios podrían mitigarse mediante el uso de tratamientos que sean más selectivos o específicos para el tejido responsable del estado de la enfermedad, y eviten tejidos no objetivo como los huesos o el hígado. Como se describe en el presente documento, el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) representa un objetivo para tales tratamientos selectivos o específicos.
El nombre de PSMA se debe principalmente a su mayor nivel de expresión en las células de cáncer de próstata; sin embargo, su función particular en las células de cáncer de próstata sigue sin resolverse. El PSMA se sobreexpresa en los tejidos malignos de la próstata en comparación con otros órganos del cuerpo humano, tales como los riñones, el intestino delgado proximal y las glándulas salivales. Aunque el PSMA se expresa en el cerebro, esa expresión es mínima, y la mayoría de los ligandos del PSMA son polares y no son capaces de penetrar la barrera hematoencefálica. El PSMA es una glicoproteína tipo II unida a la membrana de la superficie celular con un peso molecular de ~110 kD, que incluye un segmento intracelular (aminoácidos 1-18), un dominio transmembrana (aminoácidos 19-43) y un extenso dominio extracelular (aminoácidos 44 -750). Si bien actualmente se cree que las funciones del segmento intracelular y los dominios transmembrana son insignificantes, el dominio extracelular está involucrado en varias actividades distintas. El PSMA desempeña un papel en el sistema nervioso central, en el que metaboliza el N-acetilaspartil glutamato (NAAG) en ácido glutámico y ácido N-acetil aspártico. Por consiguiente, a veces también se le denomina dipeptidasa ácida ligada a N-acetil alfa (NAALADasa). El PSMA también se conoce a veces como folato hidrolasa I (FOLH I) o glutamato carboxipeptidasa (GCP II) debido a su papel en el intestino delgado proximal, en el que elimina el glutamato ligado a y del folato poli-y glutamato y el glutamato ligado a a de péptidos y moléculas pequeñas. El documento US2007/0160617A1 describe conjugados anticuerpo-fármaco.
El PSMA también comparte similitudes con el receptor de transferrina humano (TfR), porque tanto el PSMA como el TfR son glucoproteínas de tipo II. Más específicamente, el PSMA muestra 54% y 60% de homología con TfR1 y TfR2, respectivamente. Sin embargo, aunque TfR existe solo en forma dimérica debido a la formación de enlaces sulfhidrilo entre cadenas, el PSMA puede existir en forma dimérica o monomérica.
A diferencia de muchas otras proteínas unidas a la membrana, el PSMA se internaliza rápidamente en la célula de manera similar a los receptores unidos a la superficie celular como los receptores de vitaminas. El PSMA se internaliza a través de fosas recubiertas de clatrina y posteriormente puede reciclarse a la superficie celular o ir a los lisosomas. Se ha sugerido que la forma dimérica y monomérica del PSMA son interconvertibles, aunque se está debatiendo la evidencia directa de la interconversión. Aun así, solo el dímero de PSMA posee actividad enzimática, y el monómero no.
Aunque la actividad del PSMA en la superficie celular de las células de la próstata sigue bajo investigación, los inventores han reconocido que el PSMA representa un objetivo viable para la administración selectiva y/o específica de agentes biológicamente activos, incluido agentes de diagnóstico, agentes de formación de imágenes y agentes terapéuticos para tales células de próstata.
Sumario de la invención
El objeto de la invención es como se establece en las reivindicaciones.
Se ha descubierto que los compuestos biológicamente activos que se conjugan con ligandos capaces de unirse al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) a través de un enlazador pueden ser útiles en la obtención de imágenes, el diagnóstico y/o el tratamiento del cáncer de próstata y enfermedades relacionadas que implican poblaciones de células patógenas que expresan o sobreexpresan PSMA. El PSMA es una proteína de la superficie celular que se internaliza en un proceso análogo a la endocitosis observada con los receptores de la superficie celular, tales como los receptores de vitaminas. Por consiguiente, se ha descubierto que ciertos conjugados que incluyen un enlazador que tiene una longitud predeterminada y/o un diámetro predeterminado, y/o grupos funcionales preseleccionados a lo largo de su longitud pueden usarse para tratar, obtener imágenes y/o diagnosticar tales enfermedades.
En un aspecto, la invención se refiere a un conjugado que comprende un ligando del PSMA (B), un enlazador (L) y un fármaco (D), en el que el enlazador está unido covalentemente al medicamento y el enlazador está unido covalentemente al ligando, y en el que el enlazador comprende una cadena de al menos siete átomos o de al menos aproximadamente 10 angstroms de longitud, en el que el ligando
(a) comprende un ácido fosfónico o un ácido fosfínico, o
(b) es una urea de dos aminoácidos.
En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de la fórmula
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En otro aspecto, la invención se refiere a los conjugados descritos anteriormente, opcionalmente con un componente seleccionado del grupo que consiste en vehículos, diluyentes y excipientes, y combinaciones de los mismos, para usar en un método de tratamiento de una enfermedad que implica una población de células patógenas que expresan PSMA.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de los conjugados anteriores, opcionalmente con un componente seleccionado del grupo que consiste en vehículos, diluyentes y excipientes, y combinaciones de los mismos, en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad que implica una población de células patógenas que expresan PSMA.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los conjugados descritos anteriormente y un componente seleccionado del grupo que consiste en vehículos, diluyentes y excipientes, y combinaciones de los mismos.
Se describen conjugados que tienen la fórmula
B-L-D
en los que B es un ligando de unión o direccionamiento de antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), L es un enlazador y D es un fármaco. Como se usa en el presente documento, el término fármaco D incluye colectivamente agentes terapéuticos, agentes citotóxicos, agentes de formación de imágenes, agentes de diagnóstico y similares, a menos que se indique lo contrario o por el contexto. Por ejemplo, en una configuración ilustrativa, el conjugado descrito en el presente documento se usa para eliminar una población de células patógenas y, por lo tanto, el fármaco D es un agente terapéutico, un agente citotóxico y similares. En otra configuración ilustrativa, el conjugado descrito en el presente documento se usa para obtener imágenes y/o diagnosticar una enfermedad o estado de enfermedad y, por lo tanto, el fármaco D es un agente de formación de imágenes, un agente de diagnóstico y similares.
En una realización ilustrativa, el enlazador L puede ser un enlazador liberable o no liberable. En un aspecto, el enlazador L tiene al menos aproximadamente 7 átomos de longitud. En una variación, el enlazador L tiene al menos aproximadamente 10 átomos de longitud. En una variación, el enlazador L tiene al menos aproximadamente 14 átomos de longitud. En otra variación, el enlazador L tiene entre aproximadamente 7 y aproximadamente 31, entre aproximadamente 7 y aproximadamente 24, o entre aproximadamente 7 y aproximadamente 20 átomos de longitud. En otra variación, el enlazador L tiene entre aproximadamente 14 y aproximadamente 31, entre aproximadamente 14 y aproximadamente 24, o entre aproximadamente 14 y aproximadamente 20 átomos de longitud.
En un aspecto alternativo, el enlazador L tiene una longitud de al menos aproximadamente 10 angstroms (A). En una variación, el enlazador L tiene al menos aproximadamente 15 A de longitud. En otra variación, el enlazador L tiene al menos aproximadamente 20 A de longitud. En otra variación, el enlazador L está en el intervalo de aproximadamente 10 A a aproximadamente 30 A de longitud.
En un aspecto alternativo, al menos una porción de la longitud del enlazador L es de aproximadamente 5 A de diámetro o menos en el extremo conectado al ligando de unión B. En una variación, al menos una porción de la longitud del enlazador L tiene aproximadamente 4 A o menos, o aproximadamente 3 A o menos de diámetro en el extremo conectado al ligando de unión B. Se aprecia que las realizaciones ilustrativas que incluyen un requisito de diámetro de aproximadamente 5 A o menos, aproximadamente 4 A o menos, o aproximadamente 3 A o menos pueden incluir ese requisito para una longitud predeterminada del enlazador, definiendo así una porción de tipo cilindrico del enlazador. De forma ilustrativa, en otra variación, el enlazador incluye una porción cilindrica en el extremo conectado al ligando de unión que tiene al menos aproximadamente 7 A de longitud y aproximadamente 5 A o menos, aproximadamente 4 A o menos, o aproximadamente 3 A o menos de diámetro.
En otra realización, el enlazador L incluye uno o más enlazadores hidrófilos capaces de interactuar con uno o más residuos de PSMA, incluidos los aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófilas, tales como Ser, Thr, Cys, Arg, Orn, Lys, Asp, Glu, Gln y residuos similares. En otra realización, el enlazador L incluye uno o más enlazadores hidrófobos capaces de interactuar con uno o más residuos de PSMA, incluidos los aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas, tales como Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met y residuos similares. Debe entenderse que las realizaciones y aspectos anteriores se pueden incluirse en el enlazador L ya sea solo o en combinación entre sí. Por ejemplo, los enlazadores L que tienen al menos aproximadamente 7 átomos de longitud y aproximadamente 5 A, aproximadamente 4 A o menos, o aproximadamente 3 A o menos de diámetro o menos se contemplan y describen en este documento, y también incluyen uno o más enlazadores hidrófilos capaces de interactuar con uno o más residuos de PSMA, incluidos Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Met y se contemplan y describen residuos similares en este documento.
En otra realización, un extremo del enlazador no está ramificado y comprende una cadena de átomos de carbono, oxígeno, nitrógeno y azufre. En una realización, la cadena lineal de átomos de carbono, oxígeno, nitrógeno y azufre tiene al menos 5 átomos de longitud. En una variación, la cadena lineal tiene al menos 7 átomos, o al menos 10 átomos de longitud. En otra realización, la cadena de átomos de carbono, oxígeno, nitrógeno y azufre no está sustituida. En una variación, una porción de la cadena de átomos de carbono, oxígeno, nitrógeno y azufre se cicla con un fragmento divalente. Por ejemplo, un enlazador (L) que comprende el dipéptido Phe-Phe puede incluir una estructura de piperazin-1,4-diilo ciclando dos nitrógenos con un fragmento de etileno, o una variación sustituida del mismo.
En otra realización, las composiciones farmacéuticas se describen en este documento, en la que la composición farmacéutica incluye los conjugados descritos en este documento en cantidades efectivas para tratar enfermedades y estados de enfermedad, diagnosticar enfermedades o estados de enfermedad, y/o formar imágenes de tejidos y/o células que están asociados con poblaciones patógenas de células que expresan o sobreexpresan PSMA. De forma ilustrativa, las composiciones farmacéuticas también incluyen uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes.
En otra realización, los usos médicos para diagnosticar enfermedades o estados de enfermedad, y/o formar imágenes de tejidos y/o células que están asociados con poblaciones patógenas de células que expresan o sobreexpresan PSMA se describen en el presente documento. Tales métodos incluyen la etapa de administrar los conjugados descritos en este documento, y/o composiciones farmacéuticas que contienen los conjugados descritos en este documento, en cantidades efectivas para tratar enfermedades y estados de enfermedad, diagnosticar enfermedades o estados de enfermedad, y/o formar imágenes de tejidos y/o células que están asociados con poblaciones patógenas de células que expresan o sobreexpresan PSMA.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1A. Radioactividad unida a células frente a la concentración de SK28-99mTc (Kd = 18.12 nM) en presencia (A ) o ausencia (■) de exceso de PMPA.
Figura 1B. Estudios de unión in vitro utilizando células LNCaP y SK33 (enlazador de 14 átomos). Células LNCaP que contienen concentraciones crecientes de DUPA-99mTc en presencia (A ) o ausencia (■) de exceso de PMPA.
Figura 2. La radioactividad unida a la célula frente a la concentración de SK28-99mTc; a 4 °C (■) y a 37 °C (A).
Figura 3A. Gráfico de la radiactividad unida a la célula frente a la concentración de agentes de formación de imágenes de DUPA-Enlazador-99mTc: (■) enlazador de 0 átomos (Kd = 171 nM); (A ) enlazador de 7 átomos (Kd = 68 nM); (▼) enlazador de 14 átomos (Kd = 15 nM); (♦ ) enlazador de 16 átomos (Kd = 40 nM).
Figura 3B. Valores de Kd para compuestos de DUPA-Enlazador-99mTc que se unen a las células LNCaP.
Figura 4. Gráfico de días después de la inyección frente a volumen del tumor para tumores LNCaP: (a) 2.5 millones Matrigel; (b) 2.5 millones Matrigel de HC; (c) 5 millones Matrigel; (d) 5 millones Matrigel de HC.
Figura 5A. Gráfico de días después de la inyección frente al volumen del tumor para tumores LNCaP (27 ratones) y (b) células KB (5 ratones) y células A549 (5 ratones).
Figura 5B. Gráfico de días después de la inyección frente al volumen del tumor para células KB (5 ratones) y células A549 (5 ratones).
Figura 6A. Ratones (Grupo 1) previamente inyectados con tumores LNCaP, tratados con 1 ng/kg de SK28-99mTc (enlazador de 14 átomos), la imagen de la izquierda muestra imágenes de luz blanca y la imagen muestra una superposición de la radioimagen con la imagen de luz blanca. En cada panel, el ratón derecho se trató con 50 mg/kg de PMPA (para bloquear la unión de PSMA) y el ratón izquierdo se trató sin PMPA añadido.
Figura 6B. Ratones (Grupo 2) previamente inyectados con tumores LNCaP, tratados con 1ng/kg de SK28-99mTc (enlazador de 14 átomos), la imagen de la izquierda muestra imágenes de luz blanca y la imagen muestra una superposición de la imagen de la radioimagen con la imagen de luz blanca. En cada panel, el ratón derecho se trató con 50 mg/kg de PMPA (para bloquear la unión de PSMA) y el ratón izquierdo se trató sin PMPA añadido.
Figura 6C. Ratones (Grupo 3) previamente inyectados con tumores LNCaP, tratados con 1 ng/kg de SK28-99mTc (enlazador de 14 átomos), la imagen de la izquierda muestra imágenes de luz blanca y la imagen muestra una superposición de la radioimagen con la imagen de luz blanca. En cada panel, el ratón derecho se trató con 50 mg/kg de PMPA (para bloquear la unión de PSMA) y el ratón izquierdo se trató sin PMPA añadido.
Figura 6D. Muestra un estudio de un solo ratón para tumores LNCaP observados usando el generador de imágenes Kodak, 4 horas después de la inyección subcutánea (administrada por vía intraperitoneal) de 1 ng/kg de SK28-99mTc que muestra en la imagen de la izquierda una superposición de radioimagen con protección del riñón e imagen de luz blanca sin protección y en la imagen de la derecha una superposición de radioimagen con protección del riñón e imagen de rayos X sin protección.
Figura 7A. Ratones previamente inyectados con tumores LNCaP tratados con SK60-99mTc (enlazador de cero átomos). La imagen de la izquierda muestra imágenes de luz blanca, la imagen central muestra una superposición de radioimagen con imagen de luz blanca y la imagen de la derecha muestra una superposición de radioimagen con imagen de luz blanca al proteger el riñón de los ratones.
Figura 7B. Ratones previamente inyectados con células KB tratadas con SK28-99mTc (enlazador de 14 átomos). La imagen de la izquierda muestra imágenes de luz blanca, la imagen central muestra una superposición de radioimagen con imagen de luz blanca y la imagen de la derecha muestra una superposición de radioimagen con imagen de luz blanca al proteger el riñón de los ratones.
Figura 7C. Ratones previamente inyectados con células A549 tratadas usando SK28-99mTc (enlazador de 14 átomos). La imagen de la izquierda muestra imágenes de luz blanca, la imagen central muestra una superposición de radioimagen con imagen de luz blanca y la imagen de la derecha muestra una superposición de radioimagen con imagen de luz blanca al proteger el riñón de los ratones.
Figura 7D. Imágenes de todo el cuerpo de xenoinjertos de tumor sólido en ratones nu/nu tomadas 4 h después de la inyección de 150 |jCi de DUPA-99mTc. Superposición de radioimágenes de todo el cuerpo en imágenes de luz blanca de ratones con tumores LNCaP que fueron tratados con DUPA-99mTc en ausencia (a, c) o presencia (b, d) de exceso molar de PMPA de 100 veces. Superposición de radioimágenes en imágenes de luz blanca de ratones que tienen un tumor A549 (e) o un tumor KB (f) que fueron tratados de manera similar con DUPA-99mTc.
Figura 8A. Los datos de biodistribución medidos para el recuento directo de cpm frente al tejido para SK28-99mTc con o sin PMPA (como competidor) en LNCaP, (a) sin, (b) con; (c) A549; y (d) tumores KB implantados en los ejes axiales de ratones desnudos machos.
Figura 8B. Datos de biodistribución solo para tumor y riñón para SK28-99mTC con (b) o sin (a) PMPA (como competidor) en implantes de tumores LNCaP en los ejes axiales de ratones desnudos machos.
Figura 8C. Estudios de biodistribución de DUPA-99mTc en ratones nu/nu con tumores LNCaP, A549 o KB.
Figura 9A. MTD aguda (dosis única) que muestra el cambio porcentual en peso después de una dosis única de SK71; solución salina sola, 1.1 pmol/kg, 2.3 pmol/kg, 4.5 pmol/kg y 9 pmol/kg.
Figura 9B. MTD crónica que muestra el cambio porcentual en peso después de 5 dosis administradas en días alternos (L, Mc, V, L, Mc); solución salina sola, 2 pmol/kg y 4 pmol/kg.
Figura 10A. Estudio de eficacia que muestra el volumen del tumor en animales tratados con el conjugado SK71 administrado en 5 dosis en días alternos (L, Mc, V, L, Mc) a razón de 1 pmol/kg.
Figura 10B. Estudio de eficacia (grupo de control) que muestra el volumen del tumor en animales tratados con solución salina sola administrada en 5 dosis en días alternos (L, Mc, V, L, Mc).
Figura 10C. Estudio de eficacia (competición) que muestra el volumen del tumor en animales tratados con exceso de
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previamente con células LNCaP en Matrigel de HC. Ratones tratados (■), ratones no tratados (•), ratones tratados previamente inyectados con un exceso molar de 100 veces de PMPA (▲).
Figura 13B. El efecto del tratamiento con SK71 (1.5 pmol/kg) sobre el cambio porcentual en peso en ratones nu/nu tratados previamente con células LNCaP en Matrigel de HC. Ratones tratados (■), ratones no tratados (•), ratones tratados previamente inyectados con un exceso molar de 100 veces de PMPA (▲).
Figura 13c . El efecto del tratamiento con SK71 (2.0 pmol/kg) sobre el volumen del tumor en ratones nu/nu tratados previamente con células LNCaP en Matrigel de HC. Ratones tratados (■), ratones no tratados (•), ratones tratados previamente inyectados con un exceso molar de 30 veces de PMPA (▼).
Figura 13D. El efecto del tratamiento con SK71 (2.0 pmol/kg) sobre el cambio porcentual en peso en ratones nu/nu tratados previamente con células LNCaP en Matrigel de HC. Ratones tratados (■), ratones no tratados (•), ratones tratados previamente inyectados con un exceso molar de 30 veces de PMPA ().
Figura 14a . El efecto del tratamiento con SK77 (2.0 pmol/kg) sobre el volumen del tumor en ratones nu/nu tratados previamente con células LNCaP en Matrigel de HC. Ratones no tratados (■), ratones tratados (▼).
Figura 14B. El efecto del tratamiento con SK77 (2.0 pmol/kg) sobre el cambio porcentual en peso en ratones nu/nu tratados previamente con células LNCaP en Matrigel de HC. Ratones no tratados (■), ratones tratados (▼).
Figura 15A. Agente para obtención de imágenes MUPA 99mTc conjugado (enlazador de 9 átomos) con modelo computacional con energía minimizada.
Figura 15B. Agente para obtención de imágenes MUPA 99mTc conjugado (syn-SK33, enlazador de 14 átomos) con modelo computacional con energía minimizada.
Descripción detallada
Los conjugados de suministro de fármacos se describen en el presente documento en los que un ligando de unión a PSMA está unido a un enlazador liberable o no liberable que está unido a un fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico o agente de formación de imágenes.
De manera ilustrativa, los enlazadores bivalentes descritos en el presente documento pueden incluirse en enlazadores utilizados para preparar conjugados de fármacos de unión a PSMA, conjugados de agentes de formación de imágenes de unión a PSMa y conjugados de agente de diagnóstico de unión a PSMA de las siguientes fórmulas:
B-L-TA
B-L-IA
B-L-DA
en las que B es una fracción de unión a PSMA, que incluye análogos o derivados del mismo, L es un enlazador, TA es un agente terapéutico, que incluye análogos o derivados del mismo, IA es un agente de formación de imágenes, incluidos análogos o derivados del mismo, y DA es un agente de diagnóstico, incluidos análogos o derivados de los mismos. El enlazador L puede comprender múltiples enlazadores bivalentes, incluidos los enlazadores bivalentes descritos en este documento. También debe entenderse que, como se usa en el presente documento, TA colectivamente se refiere a agentes terapéuticos, y análogos y derivados de los mismos, IA colectivamente se refiere a agentes de formación de imágenes, y análogos y derivados de los mismos, y DA colectivamente se refiere a agentes de diagnóstico, y análogos y derivados de los mismos.
El enlazador también puede incluir uno o más enlazadores espaciadores y opcionalmente enlazadores liberables adicionales. Los enlazadores, espaciadores y liberables se pueden unir entre sí en cualquier orden o combinación. De manera similar, el ligando de unión a PSMA puede estar unido a un enlazador espaciador o a un enlazador liberable. De manera similar, el fármaco, el agente terapéutico, el agente de diagnóstico o el agente de formación de imágenes pueden estar unidos a un enlazador espaciador o a un enlazador liberable. Cada uno de estos componentes de los conjugados puede estar conectado a través de heteroátomos existentes o adicionales en el ligando de direccionamiento, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente de formación de imágenes, enlazador liberable o espaciador. Los heteroátomos ilustrativos incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y las fórmulas - (NHR1NHR2)-, -SO-, -(SO2)- y -N(R3)O-, en las que R1, R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, heteroarilalquilo y similares, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido.
En una realización ilustrativa, se describen en el presente documento compuestos que incluyen enlazadores que tienen dimensiones de longitud y diámetro predeterminadas. En un aspecto, se describen en el presente documento los enlazadores que satisfacen uno o más requisitos de longitud mínima, o un requisito de longitud que cae dentro de un intervalo predeterminado. En otro aspecto, puede entenderse que la satisfacción de un requisito de longitud mínima se determina mediante el modelado por ordenador de las conformaciones extendidas de enlazadores. En otro aspecto, puede entenderse que la satisfacción de un requisito de longitud mínima se determina teniendo un cierto número de átomos, sustituidos o no, formando una cadena principal de átomos que conectan el ligando de unión (B) con el fármaco (D). En otra realización, la cadena principal de átomos se cicla con otro fragmento divalente. En otro aspecto, se describen en el presente documento los enlazadores que satisfacen uno o más requisitos de diámetro máximo o mínimo. En otro aspecto, puede entenderse que la satisfacción de un requisito de diámetro máximo o mínimo se determina mediante el modelado por ordenador de varias conformaciones de enlazadores modelados como configuraciones de relleno de espacio, CPK o similares. En otro aspecto, puede entenderse que la satisfacción de un requisito de diámetro máximo o mínimo se aplica a una o más porciones seleccionadas del enlazador, por ejemplo, la porción del enlazador proximal al ligando de unión (B), o la porción del enlazador proximal al fármaco (D), y similares. En otro aspecto, se describen en el presente documento enlazadores que satisfacen uno o más requisitos de composición química, tales como enlazadores que incluyen uno o más grupos polares que pueden interactuar positivamente con uno o más nitrógenos de cadena lateral de Arg o Lys y/u oxígenos de cadena lateral de Asp o Glu que se encuentran en la porción del embudo de PSMA. En una variación, se describen en el presente documento los enlazadores que satisfacen uno o más requisitos de composición química, tales como los enlazadores que incluyen uno o más grupos no polares que pueden interactuar positivamente con uno o más carbonos de cadena lateral de Tyr o Phe que se encuentran en la porción del embudo de PSMA.
En una realización, la longitud de átomos del enlazador se define por el número de átomos que separan el ligando de unión o direccionamiento B, o análogo o derivado del mismo, y el fármaco D, o análogo o derivado del mismo. Por consiguiente, en configuraciones en las que el ligando de unión B, o análogo o derivado del mismo, está unido directamente al fármaco D, o análogo o derivado del mismo, la unión también se denomina en el presente documento como un enlazador de "0 átomos". Se entiende que dichos enlazadores de 0 átomos incluyen la configuración en la que B y D se unen directamente eliminando un átomo de hidrógeno de cada punto de unión en B y D, respectivamente. También se entiende que dichos enlazadores de 0 átomos incluyen la configuración en la que B y D están unidos a través de un heteroátomo superpuesto eliminando un átomo de hidrógeno de uno de B o D, y un grupo funcional de heteroátomo, tal como OH, SH, NH2 y similares del otro de B o D. También se entiende que tales enlazadores de 0 átomos incluyen la configuración en la que B y D están unidos a través de un doble enlace, que puede formarse eliminando dos átomos de hidrógeno de cada punto de unión en B y D, respectivamente, o mediante el cual B y D se unen a través de uno o más heteroátomos superpuestos mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno, un hidrógeno y un grupo funcional de heteroátomo, o dos grupos funcionales de heteroátomo, tales como OH, SH, NH2 y similares de cada uno de B o D. Además, B y D pueden estar unidos a través de un doble enlace formado mediante la eliminación de un grupo funcional de heteroátomo de doble enlace, tal como O, S, NH y similares, de uno o ambos de B o D. También debe entenderse que dichos grupos funcionales de heteroátomo incluyen aquellos unidos a átomos de carbono saturados, átomos de carbono insaturados (incluidos los grupos carbonilo) y otros heteroátomos. Del mismo modo, la longitud de los enlazadores que son mayores que 0 átomos se definen de manera análoga.
Por consiguiente, en otra realización ilustrativa, se describen enlazadores (L) que tienen una longitud de cadena de al menos 7 átomos. En una variación, se describen enlazadores (L) que tienen una longitud de cadena de al menos 14 átomos. En otra variación, se describen enlazadores (L) que tienen una longitud de cadena en el intervalo de aproximadamente 7 átomos a aproximadamente 20 átomos. En otra variación, se describen enlazadores (L) que tienen una longitud de cadena en el intervalo de aproximadamente 14 átomos a aproximadamente 24 átomos.
En otra realización, la longitud del enlazador (L) se define midiendo la longitud de una conformación extendida del enlazador. Dichas conformaciones extendidas se pueden medir en programas de modelamiento por ordenador reconocidos en la técnica, tales como PC Model 7 (MMX). Por consiguiente, en otra realización ilustrativa, se describen enlazadores que tienen una longitud de cadena de al menos 15 A, al menos 20 A o al menos 25 A.
En otra realización, se describen enlazadores que tienen al menos un grupo de cadena lateral hidrófoba, tal como un grupo alquilo, cicloalquilo, arilo, arilalquilo o similar, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido. En un aspecto, el grupo hidrófobo se incluye en el enlazador incorporando uno o más grupos Phe o Tyr, incluyendo variantes sustituidas de los mismos, y análogos y derivados de los mismos, en la cadena del enlazador. Se aprecia que tales grupos de cadena lateral de Phe y/o Tyr pueden formar interacciones positivas pi-pi (n-n) con los residuos de Tyr y Phe encontrados en el embudo de PSMA. Además, se aprecia que la presencia de grandes ramificaciones de la cadena lateral, tales como los grupos arilalquilo que se encuentran en Phe y Tyr, puede proporcionar un nivel de rigidez conformacional al enlazador, lo que limita los grados de libertad y reduce el enrollamiento y promueve conformaciones extendidas del enlazador. Sin estar limitado por la teoría, se aprecia que tales restricciones de entropía pueden aumentar la energía de unión global de los conjugados unidos descritos en el presente documento. Además, se aprecia que los aumentos de rigidez que pueden proporcionar las cadenas laterales estéricamente impedidas, tal como Phe y Tyr descritas en el presente documento, pueden reducir o evitar el enrollamiento y las interacciones entre el ligando y el agente de formación de imágenes. Por ejemplo, la minimización de energía por ordenador de un enlazador representativo de 9 átomos y 14 átomos (véase, por ejemplo, las Figuras 15A y 15B) muestra que no hay interacciones intramoleculares entre el ligando y el agente de formación de imágenes. Además, la presencia de la cadena lateral de las dos cadenas laterales de Phe parece promover una conformación más extendida en syn-SK33 (Figura 15B) que en el conjugado que contiene ácido aminohexanoico (Figura 15A).
Se ha descubierto en el presente documento que el túnel en forma de embudo que conduce al sitio catalítico o al sitio activo de PSMA impone requisitos de longitud, forma y/o composición química en la porción enlazadora de conjugados de ligandos de unión a PSMa y agentes terapéuticos, de diagnóstico y de formación de imágenes que afectan positiva y negativamente las interacciones entre PSMA y esos conjugados. En el presente documento se describen realizaciones ilustrativas de aquellos conjugados que incluyen tales requisitos de longitud, forma y/o composición química en el enlazador. Tales requisitos de longitud, forma y/o composición química se evaluaron utilizando modelamiento molecular. Por ejemplo, el relleno de espacio y el modelo de superficie del complejo de PSMA con (s)-2-(4-yodobencensilfosfonometil)-pentanodioico [derivado de 2-PMPA]PDB con código 2C6P se generaron usando p Ro TEIN EXPLORER. El modelo PROTEIN EXPLORER verificó el embudo de 20 A de profundidad y también mostró características de diámetro en varios lugares a lo largo del embudo que pueden usarse para definir enlazadores que tienen características estructurales favorables. Además, el modelo mostró que cerca del sitio activo de PSMA, hay un mayor número de residuos hidrófobos que pueden proporcionar interacciones de unión adicionales cuando los grupos funcionales correspondientes se incluyen en el enlazador. Finalmente, el modelo mostró la presencia de tres bolsillos hidrófobos que pueden proporcionar interacciones de unión adicionales cuando los grupos funcionales correspondientes se incluyen en el enlazador.
En otra realización ilustrativa, se crearon los siguientes modelos moleculares para un conjugado de MUPA y un agente de formación de imágenes del tripéptido 99mTc conectado por un enlazador de 9 átomos, como se muestra en la Figura 15A, y syn-SK33 que incluye un enlazador ramificado de 14 de átomos, como se muestra en la Figura 15B. Los modelos se crearon usando PC Model 7 (MMX) con minimización de energía, y usando los siguientes parámetros de longitud de enlace: C-C (sp3-sp3) = 1.53 A, C-C (sp3-sp2) = 1.51 A, C-N (sp3-N) = 1.47 A, C-N (sp2-N) = 1.38 A. Dichos modelos pueden usarse para calcular la longitud del enlazador que conecta el ligando de unión (B) y el fármaco (D). Además, dichos modelos pueden modificarse para crear conformaciones extendidas, y posteriormente usarse para calcular la longitud del enlazador que conecta el ligando de unión (B) y el fármaco (D).
El primer gen de PSMA humano se clonó a partir de células LNCaP y se informó que se encuentra en el cromosoma 11p11-12. Además, hay un gen similar a PSMA ubicado en los loci 11q14.3. La estructura cristalina de PSMA ha sido reportada por dos grupos diferentes a diferentes resoluciones, y cada uno muestra que el sitio activo contiene dos átomos de zinc, lo que confirma que PSMA también se considera una metaloproteasa de zinc. Davis et al., PNAS, 102: 5981-86, (2005) informaron la estructura cristalina a baja resolución (3.5 A), mientras que Mesters et al., The EMBO Journal, 1-10 (2006) informaron la estructura cristalina a mayor resolución (2-2.2 A). Las estructuras cristalinas muestran que PSMA es un homodímero que contiene un dominio de proteasa, un dominio apical, un dominio helicoidal y un dominio de dimerización de CPG2. El dominio de proteasa de PSMA contiene un sitio de zinc binuclear, residuos catalíticos y una región de unión al sustrato que incluye tres residuos de arginina (también denominado parche de arginina de unión al sustrato). En la estructura cristalina, los dos iones de zinc en el sitio activo están cada uno ligado a un oxígeno de fosfato, o a la fracción fosfinato del inhibidor GPI 18431 para la estructura de cocristal. En las estructuras cristalinas de alta resolución del dominio extracelular, el PSMA se cocristalizó con inhibidores potentes, inhibidores débiles y glutamato a 2.0, 2.4 y 2.2 A, respectivamente. La estructura cristalina de alta resolución muestra un túnel en forma de embudo de 20 A de profundidad que conduce al sitio catalítico o al sitio activo de PSMA. El embudo está revestido con las cadenas laterales de varios residuos de Arg y Lys, residuos de Asp y Glu, y residuos de Tyr y Phe.
En otra realización, el enlazador (L) es una cadena de átomos seleccionados entre C, N, O, S, Si y P. El enlazador puede tener una amplia variedad de longitudes, tales como en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 100. Los átomos utilizados en la formación del enlazador pueden combinarse de todas las formas químicamente relevantes, tales como cadenas de átomos de carbono que forman grupos alquileno, cadenas de átomos de carbono y oxígeno que forman grupos de polioxialquileno, cadenas de átomos de carbono y nitrógeno que forman poliaminas, y otros. Además, debe entenderse que los enlaces que conectan los átomos en la cadena pueden estar saturados o insaturados, de modo que, por ejemplo, alcanos, alquenos, alquinos, cicloalcanos, arilenos, imidas y similares pueden ser radicales divalentes que están incluidos en el enlazador. Además, debe entenderse que los átomos que forman el enlazador también pueden ciclarse entre sí para formar radicales cíclicos divalentes en el enlazador. En cada uno de los enlazadores anteriores y otros descritos en el presente documento, la cadena que forma el enlazador puede estar sustituida con una amplia variedad de grupos.
En otra realización, se describen enlazadores (L) que incluyen al menos un enlazador liberable. En una variación, se describen enlazadores (L) que incluyen al menos dos enlazadores liberables. En otra variación, se describen enlazadores (L) que incluyen al menos un enlazador autoinmolativo. En otra variación, se describen enlazadores (L) que incluyen al menos un enlazador liberable que no es un disulfuro. En otra realización, se describen enlazadores (L) que no incluyen un enlazador liberable.
Se aprecia que los enlazadores liberables pueden usarse cuando el fármaco a administrar se libera ventajosamente del conjugado ligando-enlazador de unión para que el fármaco libre tenga el mismo o casi el mismo efecto en el objetivo que cuando se administra sin el direccionamiento proporcionado por los conjugados descritos en el presente documento. En otra realización, el enlazador L es un enlazador no liberable. Se aprecia que los enlazadores no liberables se pueden usar cuando el fármaco se retiene ventajosamente por el conjugado ligando-enlazador de unión, tal como en la formación de imágenes, diagnóstico, usos de los conjugados descritos en este documento. Debe entenderse que la elección de un enlazador liberable o un enlazador no liberable puede hacerse independientemente para cada aplicación o configuración de los conjugados, sin limitar la invención descrita en el presente documento. Debe entenderse además que los enlazadores L descritos en el presente documento comprenden diversos átomos, cadenas de átomos, grupos funcionales y combinaciones de grupos funcionales. Cuando sea apropiado en la presente descripción, se puede hacer referencia al enlazador L por la presencia de enlazadores espaciadores, enlazadores liberables y heteroátomos. Sin embargo, tales referencias no deben interpretarse como limitantes de la definición de los enlazadores L descritos en el presente documento.
El enlazador (L) que comprende enlazadores espaciadores y/o liberables (es decir, enlazadores escindibles) puede ser cualquier enlazador biocompatible. El enlazador liberable o escindible puede ser, por ejemplo, un enlazador susceptible de escisión en las condiciones reductoras u oxidantes presentes en o sobre las células, un enlazador sensible al pH que puede ser un enlazador lábil a los ácidos o lábil a las bases, o un enlazador que es escindible por procesos bioquímicos o metabólicos, tal como un enlazador lábil a las enzimas. En una realización, el enlazador espaciador y/o liberable comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 30 átomos, o aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos. También se describen enlazadores de menor peso molecular (es decir, aquellos que tienen un peso molecular aproximado de aproximadamente 30 a aproximadamente 300). Los precursores de dichos enlazadores pueden seleccionarse para que tengan grupos funcionales nucleofílicos o electrofílicos, o ambos, opcionalmente en una forma protegida con un grupo protector fácilmente escindible para facilitar su uso en la síntesis de las especies intermedias.
El término "enlazador liberable", como se usa en el presente documento, se refiere a un enlazador que incluye al menos un enlace que puede romperse en condiciones fisiológicas (por ejemplo, un enlace lábil al pH, lábil a los ácidos, lábil a la oxidación o lábil a las enzimas). El enlace o enlaces escindibles pueden estar presentes en el interior de un enlazador escindible y/o en uno o ambos extremos de un enlazador escindible. Debe apreciarse que tales condiciones fisiológicas que resultan en la ruptura de enlaces incluyen reacciones de hidrólisis química estándar que ocurren, por ejemplo, a pH fisiológico, o como resultado de la compartimentación en un orgánulo celular tal como un endosoma que tiene un pH más bajo que el pH citosólico. A manera de ilustración, los enlazadores bivalentes descritos en el presente documento pueden sufrir escisión bajo otras condiciones fisiológicas o metabólicas, tal como por la acción de un mecanismo mediado por glutatión. Se aprecia que la labilidad del enlace escindible puede ajustarse incluyendo grupos funcionales o fragmentos dentro del enlazador bivalente L que pueden ayudar o facilitar dicha ruptura del enlace, también denominada asistencia de anclaje. La labilidad del enlace escindible también se puede ajustar, por ejemplo, mediante cambios por sustitución en o cerca del enlace escindible, tal como incluir ramificación alfa adyacente a un enlace disulfuro escindible, aumentando la hidrofobicidad de los sustituyentes en el silicio en una fracción que tiene un enlace de silicio-oxígeno que puede hidrolizarse, homologando grupos alcoxi que forman parte de un cetal o acetal que puede hidrolizarse, y similares. Además, se aprecia que pueden incluirse grupos o fragmentos funcionales adicionales dentro del enlazador bivalente L que pueden ayudar o facilitar la fragmentación adicional de los conjugados de enlazador de fármacos de unión a PSMA después de la ruptura del enlace del enlazador liberable.
En otra realización, el enlazador incluye radicales que forman uno o más enlazadores espaciadores y/o enlazadores liberables que se toman juntos para formar los enlazadores descritos en este documento que tienen ciertos requisitos de longitud, diámetro y/o grupo funcional.
Otra realización ilustrativa de los enlazadores descritos en el presente documento, incluye enlazadores liberables que se escinden en las condiciones descritas en el presente documento mediante un mecanismo químico que implica la eliminación beta. En un aspecto, dichos enlazadores liberables incluyen ácidos carboxílicos sustituidos con beta-tio, beta-hidroxi y beta-amino y sus derivados, tales como ésteres, amidas, carbonatos, carbamatos y ureas. En otro aspecto, tales enlazadores liberables incluyen 2-tioarilésteres y 4-tioarilésteres, carbamatos y carbonatos.
Debe entenderse que los enlazadores liberables también pueden referirse a los grupos funcionales que contienen, de manera ilustrativa como grupos disulfuro, grupos cetal y similares, como se describe en el presente documento. Por consiguiente, se entiende que un enlace escindible puede conectar dos átomos adyacentes dentro del enlazador liberable y/o conectar otros enlazadores, o el ligando de unión B, o el agente terapéutico, de diagnóstico o de formación de imágenes D, como se describe en el presente documento, en uno o ambos extremos del enlazador liberable. En el caso de que un enlace escindible conecte dos átomos adyacentes dentro del enlazador liberable, después de la ruptura del enlace, el enlace liberable se divide en dos o más fragmentos. Alternativamente, en el caso de que haya un enlace escindible entre el enlazador liberable y otra fracción, tal como un heteroátomo adicional, un enlazador espaciador, otro enlazador liberable, el fármaco D, o análogo o derivado del mismo, o el ligando de unión B, o análogo o derivado del mismo, después de la ruptura del enlace, el enlazador liberable se separa de la otra fracción.
En otra realización, los enlazadores liberables y espaciadores pueden estar dispuestos de tal manera que, después de la escisión de un enlace en el enlazador bivalente, los grupos funcionales liberados ayudan de forma anclada a la ruptura o escisión de enlaces adicionales, como se describió anteriormente. Una realización ilustrativa de dicho enlazador bivalente o una porción del mismo incluye compuestos que tienen la fórmula:
Figure imgf000009_0001
en la que X es un heteroátomo, tal como nitrógeno, oxígeno o azufre, n es un número entero seleccionado de 0, 1, 2 y 3, R es hidrógeno o un sustituyente, incluido un sustituyente capaz de estabilizar una carga positiva inductivamente o por resonancia en el anillo de arilo, tal como alcoxi y similares, y el símbolo (*) indica puntos de unión para enlazadores espaciadores o liberables adicionales, o heteroátomos, que forman el enlazador bivalente, o alternativamente para la unión del fármaco, o análogo o derivado del mismo, o la vitamina, o análogo o derivado de la misma. Se aprecia que pueden estar presentes otros sustituyentes en el anillo de arilo, el carbono de bencilo, el ácido alcanoico o el puente de metileno, que incluyen pero no se limitan a hidroxi, alquilo, alcoxi, alquiltio, halo y similares. La escisión asistida puede incluir mecanismos que involucran compuestos intermedios de bencilo, compuestos intermedios de bencina, ciclación de lactona, compuestos intermedios de oxonio, eliminación beta y similares. Se aprecia además que, además de la fragmentación posterior a la escisión del enlazador liberable, la escisión inicial del enlazador liberable puede facilitarse mediante un mecanismo asistido por anclaje.
En esta realización, el ácido hidroxialcanoico, que puede ciclarse, facilita la escisión del puente de metileno, por ejemplo, un ion oxonio, y facilita la escisión del enlace o la posterior fragmentación después de la escisión del enlace del enlazador liberable. Alternativamente, la escisión asistida por iones de oxonio catalizada por ácido del puente de metileno puede comenzar una cascada de fragmentación de este enlazador bivalente ilustrativo, o fragmento del mismo. Alternativamente, la hidrólisis catalizada por ácido del carbamato puede facilitar la eliminación beta del ácido hidroxialcanoico, que puede ciclarse, y facilitar la escisión del puente de metileno, por ejemplo mediante un ion oxonio. Se aprecia que otros mecanismos químicos de ruptura o escisión de enlaces bajo las condiciones metabólicas, fisiológicas o celulares descritas en el presente documento pueden iniciar tal cascada de fragmentación. Se aprecia que otros mecanismos químicos de ruptura o escisión de enlaces bajo las condiciones metabólicas, fisiológicas o celulares descritas en el presente documento pueden iniciar tal cascada de fragmentación.
Los mecanismos ilustrativos para la escisión de los enlazadores bivalentes descritos en el presente documento incluyen los siguientes mecanismos de fragmentación 1,4 y 1,6
Figure imgf000010_0001
en los que X es un nucleófilo, glutatión o agente biorreductor exógeno o endógeno, y similares, y cualquiera de Z o Z' es un ligando de unión a PSMA, o un fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico o agente de formación de imágenes, o bien Z o Z' es un ligando de unión a PSMA, o un fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico o agente de formación de imágenes conectado a través de otras partes del enlazador bivalente. Debe entenderse que aunque los mecanismos de fragmentación anteriores se representan como mecanismos concertados, se pueden llevar a cabo cualquier cantidad de etapas discretas para lograr la fragmentación final del enlazador bivalente de los productos finales mostrados. Por ejemplo, se aprecia que la escisión del enlace también puede producirse mediante la eliminación catalizada por ácido de la fracción de carbamato, que puede ser asistida por anclaje mediante la estabilización proporcionada por el grupo arilo del azufre beta o el disulfuro ilustrado en los ejemplos anteriores. En esas variaciones de esta realización, el enlazador liberable es la fracción carbamato. Alternativamente, la fragmentación puede ser iniciada por un ataque nucleofílico en el grupo disulfuro, causando que la escisión forme un tiolato. El tiolato puede desplazar intermolecularmente una fracción de ácido carbónico o ácido carbámico y formar el tiaciclopropano correspondiente. En el caso de los enlazadores bivalentes que contienen bencilo, después de una ruptura ilustrativa del enlace disulfuro, el tiolato de fenilo resultante puede fragmentarse adicionalmente para liberar una fracción de ácido carbónico o ácido carbámico formando un compuesto intermedio estabilizado por resonancia. En cualquiera de estos casos, la naturaleza liberable de los enlazadores bivalentes ilustrativos descritos en este documento puede realizarse por cualquier mecanismo que pueda ser relevante para las presentes condiciones químicas, metabólicas, fisiológicas o biológicas.
Otros mecanismos ilustrativos para la escisión del enlace del enlazador liberable incluyen la escisión asistida por oxonio como sigue:
Figure imgf000011_0001
en los que Z es la vitamina, o análogo o derivado de la misma, o el fármaco, o análogo o derivado del mismo, o cada uno es una fracción de vitamina o fármaco junto con otras porciones del enlazador polivalente, tal como un fármaco o fracción de vitamina que incluye uno o más enlazadores espaciadores y/u otros enlazadores liberables. En esta realización, la eliminación catalizada por ácido del carbamato conduce a la liberación de CO2 y la fracción que contiene nitrógeno unida a Z, y a la formación de un catión bencilo, que puede quedar atrapado por el agua o cualquier otra base de Lewis.
En una realización, el enlazador liberable incluye un disulfuro.
En otra realización, el enlazador liberable puede ser un radical divalente que comprende alquilenaziridin-1-ilo, alquilencarbonilaziridin-1-ilo, carbonilalquilaziridin-1-ilo, alquilensulfoxilaziridin-1-ilo, sulfoxilalquilaziridin-1-ilo, sulfonilalquilaziridin-1-ilo, o alquilensulfonilaziridin-1-ilo, en el que cada uno de los enlazadores liberables está opcionalmente sustituido con un sustituyente X2, como se define a continuación.
Los enlazadores liberables ilustrativos adicionales incluyen metileno, 1-alcoxialquileno, 1-alcoxicicloalquileno, 1-alcoxialquilencarbonilo, 1-alcoxicicloalquilencarbonilo, carbonilarilcarbonilo, carbonil(carboxiaril)carbonilo, carbonil(bis-carboxiaril)carbonilo, haloalquilencarbonilo, alquilen(dialquilsililo), alquilen(alquilarilsililo), alquilen(diarilsililo), (dialquilsilil)arilo, (alquilarilsilil)arilo, (diarilsilil)arilo, oxicarboniloxi, oxicarboniloxialquilo, sulfoniloxi, oxisulfonilalquilo, iminoalquilidenilo, carbonilalquilideniminilo, iminocicloalquilidenilo, carbonilcicloalquilideniminilo, alquilentio, alquilenariltio, y carbonilalquiltio, en los que cada uno de los enlazadores liberables están opcionalmente sustituidos con un sustituyente X2, como se define a continuación.
En la realización anterior, el enlazador liberable puede incluir oxígeno, y los enlazadores liberables pueden ser metileno, 1-alcoxialquileno, 1-alcoxicicloalquileno, 1-alcoxialquilencarbonilo y 1-alcoxicicloalquilencarbonilo, en los que cada uno de los enlazadores liberables está opcionalmente sustituido con un sustituyente X2, como se define a continuación, y el enlazador liberable se une al oxígeno para formar un acetal o cetal. Alternativamente, el enlazador liberable puede incluir oxígeno, y el enlazador liberable puede ser metileno, en el que el metileno está sustituido con un arilo opcionalmente sustituido, y el enlazador liberable está unido al oxígeno para formar un acetal o cetal. Además, el enlazador liberable puede incluir oxígeno, y el enlazador liberable puede ser sulfonilalquilo, y el enlazador liberable está unido al oxígeno para formar un alquilsulfonato.
En otra realización de la realización del enlazador liberable anterior, el enlazador liberable puede incluir nitrógeno, y los enlazadores liberables pueden ser iminoalquilidenilo, carbonilalquilideniminilo, iminocicloalquilidenilo y carbonilcicloalquilideniminilo, en los que cada uno de los enlazadores liberables está opcionalmente sustituido con un sustituyente X2, como se define a continuación, y el enlazador liberable se une al nitrógeno para formar una hidrazona. En una configuración alternativa, la hidrazona puede acilarse con un derivado de ácido carboxílico, un derivado de ortoformiato o un derivado de carbamoilo para formar diversos enlazadores liberables de acilhidrazona.
Como alternativa, el enlazador liberable puede incluir oxígeno, y los enlazadores liberables pueden ser alquilen(dialquilsililo), alquilen(alquilarilsililo), alquilen(diarilsililo), (dialquilsilil)arilo, (alquilarilsilil)arilo y (diarilsilil)arilo, en los que cada uno de los enlazadores liberables está opcionalmente sustituido con un sustituyente X2, como se define a continuación, y el enlazador liberable está unido al oxígeno para formar un silanol.
En la realización del enlazador liberable anterior, el fármaco puede incluir un átomo de nitrógeno, el enlazador liberable puede incluir nitrógeno, y los enlazadores liberables pueden ser carbonilarilcarbonilo, carbonil(carboxiaril)carbonilo, carbonil(bis-carboxiaril)carbonilo, y el enlazador liberable puede estar unido al nitrógeno del heteroátomo para formar una amida, y también unido al nitrógeno del fármaco para formar una amida.
En la realización del enlazador liberable anterior, el fármaco puede incluir un átomo de oxígeno, el enlazador liberable puede incluir nitrógeno, y los enlazadores liberables pueden ser carbonilarilcarbonilo, carbonil(carboxiaril)carbonilo, carbonil(bis-carboxiaril)carbonilo y el enlazador liberable puede formar una amida y también se unen al oxígeno del fármaco para formar un éster.
Los sustituyentes X2 pueden ser alquilo, alcoxilo, alcoxialquilo, hidroxilo, hidroxialquilo, amino, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, halo, haloalquilo, sulfhidrilalquilo, alquiltioalquilo, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, carboxi, carboxialquilo, carboxilato de alquilo, alcanoato de alquilo, guanidinalquilo, R4-carbonilo, R5-carbonilalquilo, R6-acilamino y R7-acilaminoalquilo, en los que R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de aminoácidos, derivados de aminoácidos y péptidos, y en los que R6 y R7 se seleccionan cada uno independientemente de aminoácidos, derivados de aminoácidos y péptidos. En esta realización, el enlazador liberable puede incluir nitrógeno, y el sustituyente X2 y el enlazador liberable pueden formar un heterociclo.
Los heterociclos pueden ser pirrolidinas, piperidinas, oxazolidinas, isoxazolidinas, tiazolidinas, isotiazolidinas, pirrolidinonas, piperidinonas, oxazolidinonas, isoxazolidinonas, tiazolidinonas, isotiazolidinonas y succinimidas.
En una realización, los enlazadores polivalentes descritos en este documento son o incluyen compuestos de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000012_0001
en las que n es un número entero seleccionado de 1 a aproximadamente 4; Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo, que incluye alquilo inferior tal como alquilo C1-C4 que están opcionalmente ramificados; o Ra y Rb se toman junto con el átomo de carbono unido para formar un anillo carbocíclico; R es un grupo alquilo opcionalmente sustituido, un grupo acilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno seleccionado adecuadamente; y (*) indica puntos de unión para el fármaco, vitamina, agente de formación de imágenes, agente de diagnóstico, otros enlazadores polivalentes u otras partes del conjugado.
En otra realización, los enlazadores polivalentes descritos en este documento son o incluyen compuestos de las siguientes fórmulas
Figure imgf000012_0002
en las que m es un número entero seleccionado de 1 a aproximadamente 4; R es un grupo alquilo opcionalmente sustituido, un grupo acilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno seleccionado adecuadamente; y (*) indica puntos de unión para el fármaco, vitamina, agente de formación de imágenes, agente de diagnóstico, otros enlazadores polivalentes u otras partes del conjugado.
En otra realización, los enlazadores polivalentes descritos en este documento son o incluyen compuestos de las siguientes fórmulas
Figure imgf000013_0001
en las que m es un número entero seleccionado de 1 a aproximadamente 4; R es un grupo alquilo opcionalmente sustituido, un grupo acilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno seleccionado adecuadamente; y (*) indica puntos de unión para el fármaco, vitamina, agente de formación de imágenes, agente de diagnóstico, otros enlazadores polivalentes u otras partes del conjugado.
En otra realización, el enlazador L incluye uno o más enlazadores espaciadores. Dichos enlazadores espaciadores pueden ser 1-alquilenosuccinimid-3-ilo, opcionalmente sustituido con un sustituyente X1, como se define a continuación, y los enlazadores liberables pueden ser metileno, 1-alcoxialquileno, 1-alcoxicicloalquileno, 1-alcoxialquilencarbonilo, 1-alcoxicicloalquilencarbonilo, en los que cada uno de los enlazadores liberables está opcionalmente sustituido con un sustituyente X2, como se define a continuación, y en los que el enlazador espaciador y el enlazador liberable están unidos cada uno al enlazador espaciador para formar un acetal o cetal de succinimid-1-ilalquilo.
Los enlazadores espaciadores pueden ser carbonilo, tionocarbonilo, alquileno, cicloalquileno, alquilencicloalquilo, alquilencarbonilo, cicloalquilencarbonilo, carbonilalquilcarbonilo, 1-alquilensuccinimid-3-ilo, 1-(carbonilalquil) succinimid-3-ilo, alquilensulfoxilo, sulfonilalquilo, alquilensulfoxilalquilo, alquilensulfonilalquilo, carboniltetrahidro-2H-piranilo, carboniltetrahidrofuranilo, 1-(carboniltetrahidro-2H-piranil)succinimid-3-ilo y 1-(carboniltetrahidrofuranil) succinimid-3-ilo, en los que cada uno de los enlazadores espaciadores está opcionalmente sustituido con un sustituyente X1, como se define a continuación. En esta realización, el enlazador espaciador puede incluir un nitrógeno adicional, y los enlazadores espaciadores pueden ser alquilencarbonilo, cicloalquilencarbonilo, carbonilalquilcarbonilo, 1-(carbonilalquil)succinimid-3-ilo, en los que cada uno de los enlazadores espaciadores está opcionalmente sustituido con un sustituyente X1, como se define a continuación, y el enlazador espaciador se une al nitrógeno para formar una amida. Alternativamente, el enlazador espaciador puede incluir un azufre adicional, y los enlazadores espaciadores pueden ser alquileno y cicloalquileno, en los que cada uno de los enlazadores espaciadores está opcionalmente sustituido con carboxi, y el enlazador espaciador está unido al azufre para formar un tiol. En otra realización, el enlazador espaciador puede incluir azufre, y los enlazadores espaciadores pueden ser 1-alquilenosuccinimid-3-ilo y 1-(carbonilalquil)succinimid-3-ilo, y el enlazador espaciador está unido al azufre para formar un succinimid-3-iltiol.
En una alternativa a las realizaciones descritas anteriormente, el enlazador espaciador puede incluir nitrógeno, y el enlazador liberable puede ser un radical divalente que comprende alquilenaziridin-1-ilo, carbonilalquilaziridin-1-ilo, sulfoxilalquilaziridin-1-ilo o sulfonilalquilaziridin-1-ilo, en el que cada uno de los enlazadores liberables está opcionalmente sustituido con un sustituyente X2, como se define a continuación. En esta realización alternativa, los enlazadores espaciadores pueden ser carbonilo, tionocarbonilo, alquilencarbonilo, cicloalquilencarbonilo, carbonilalquilcarbonilo, 1-(carbonilalquil)succinimid-3-ilo, en los que cada uno de los enlazadores espaciadores está opcionalmente sustituido con un sustituyente X1, como se define a continuación, y en el que el enlazador espaciador está unido al enlazador liberable para formar una aziridinamida.
Los sustituyentes X1 pueden ser alquilo, alcoxilo, alcoxialquilo, hidroxilo, hidroxialquilo, amino, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, halo, haloalquilo, sulfhidrilalquilo, alquiltioalquilo, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, carboxi, carboxialquilo, carboxilato de alquilo, alcanoato de alquilo, guanidinalquilo, R4-carbonilo, R5-carbonilalquilo, R6-acilamino y R7-acilaminoalquilo, en los que R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de aminoácidos, derivados de aminoácidos y péptidos, y en los que R6 y R7 se seleccionan cada uno independientemente de aminoácidos, derivados de aminoácidos y péptidos. En esta realización, el enlazador liberable puede incluir nitrógeno, y el sustituyente X1 y el enlazador espaciador al cual están unidos forman un heterociclo.
Los enlazadores espaciadores ilustrativos adicionales incluyen alquilen-amino-alquilencarbonilo, alquilen-tio-(carbonilalquilsuccinimid-3-ilo) y similares, como se ilustra adicionalmente mediante las siguientes fórmulas:
Figure imgf000014_0001
en las que los números enteros x e y son 1, 2, 3, 4 o 5:
En otra realización, también se describen enlazadores que incluyen regiones hidrófilas. En un aspecto, la región hidrófila del enlazador forma parte o la totalidad de un enlazador espaciador incluido en los conjugados descritos en este documento. Los enlazadores espaciadores hidrófilos ilustrativos se describen en la solicitud internacional PCT WO 2009/002993, presentada el 25 de junio de 2008.
El término "cicloalquilo" como se usa en el presente documento incluye fragmentos moleculares o radicales que comprenden una cadena bivalente de átomos de carbono, una porción de la cual forma un anillo. Debe entenderse que el término cicloalquilo, como se usa en el presente documento, incluye fragmentos y radicales unidos a átomos de anillo o a átomos que no son de anillo, tales como, por ejemplo, ciclopropilo, ciclohexilo, 3-etilciclopent-1-ilo, ciclopropiletilo, ciclohexilmetilo y similares.
El término "cicloalquileno" como se usa en el presente documento incluye fragmentos moleculares o radicales que comprenden una cadena bivalente de átomos de carbono, una porción de la cual forma un anillo. Debe entenderse que el término cicloalquilo, como se usa en el presente documento, incluye fragmentos y radicales unidos a átomos de anillo o átomos que no son de anillo, tales como cicloprop-1,1-diilo, cicloprop-1,2-diilo, ciclohex-1,4-diilo, 3-etilciclopent-1,2-diilo, 1-metilenciclohex-4-ilo y similares.
Los términos "heteroalquilo" y "heteroalquileno" tal como se usan en el presente documento incluyen fragmentos moleculares o radicales que comprenden grupos monovalentes y divalentes, respectivamente, que se forman a partir de una cadena lineal o ramificada de átomos de carbono y heteroátomos, en la que los heteroátomos se seleccionan de nitrógeno, oxígeno y azufre, tales como alcoxialquilo, alquilenoxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, alquilenaminoalquilo, alquiltioalquilo, alquilentioalquilo, alcoxialquilaminoalquilo, alquilaminoalcoxialquilo, alquilenoxialquilaminoalquilo y similares.
El término "heterociclilo", como se usa en el presente documento, incluye fragmentos moleculares o radicales que comprenden una cadena monovalente de átomos de carbono y heteroátomos, en la que los heteroátomos se seleccionan de nitrógeno, oxígeno y azufre, una porción de los cuales, incluyendo al menos un heteroátomo, forman un anillo, tal como aziridina, pirrolidina, oxazolidina, 3-metoxipirrolidina, 3-metilpiperazina y similares. En consecuencia, como se usa en el presente documento, heterociclilo incluye alquilheterociclilo, heteroalquilheterociclilo, heterociclilalquilo, heterociclilheteroalquilo y similares. Debe entenderse que el término heterociclilo, como se usa en el presente documento, incluye fragmentos y radicales unidos a átomos de anillo o a átomos que no son de anillo, tales como tetrahidrofuran-2-ilo, piperidin-1-ilo, piperidin-4-ilo, piperazin-1-ilo, morfolin-1-ilo, tetrahidrofuran-2-ilmetilo, piperidin-1-iletilo, piperidin-4-ilmetilo, piperazin-1-ilpropilo, morfolin-1-iletilo y similares.
El término "arilo", como se usa en el presente documento, incluye fragmentos moleculares o radicales que comprenden un anillo aromático mono o policíclico de átomos de carbono, tales como fenilo, naftilo y similares.
El término "heteroarilo" como se usa en el presente documento incluye fragmentos moleculares o radicales que comprenden un anillo aromático mono o policíclico de átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno y azufre, tal como piridinilo, pirimidinilo, indolilo, benzoxazolilo, y similares.
El término "arilo sustituido" o "heteroarilo sustituido" como se usa en el presente documento incluye fragmentos moleculares o radicales que comprenden arilo o heteroarilo sustituido con uno o más sustituyentes, tales como alquilo, heteroalquilo, halo, hidroxi, amino, alquilo o dialquilamino, alcoxi, alquilsulfonilo, aminosulfonilo, carboxilato, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, ciano, nitro y similares. Debe entenderse que los grupos alquilo en tales sustituyentes pueden estar opcionalmente sustituidos con halo.
El término "iminoalquilidenilo" como se usa en el presente documento incluye fragmentos moleculares o radicales que comprenden un radical divalente que contiene alquileno como se define en el presente documento y un átomo de nitrógeno, en el que el carbono terminal del alquileno está doblemente unido al átomo de nitrógeno, tal como las fórmulas -(CH)=N-, -(CH2)2(CH)=N-, -CH2C(Me)=N-, y similares.
El término "aminoácido" como se usa en el presente documento incluye fragmentos moleculares o radicales que comprenden un aminoalquilcarboxilato, en el que el radical alquilo está opcionalmente sustituido con alquilo, hidroxialquilo, sulfhidrilalquilo, aminoalquilo, carboxialquilo y similares, incluidos grupos correspondientes a los aminoácidos naturales, tales como serina, cisteína, metionina, ácido aspártico, ácido glutámico y similares.
Por ejemplo, en una realización, el aminoácido es un radical divalente que tiene la fórmula general:
-N(R)-(CR'R")q-C(O)-
en la que R es hidrógeno, alquilo, acilo o un grupo protector de nitrógeno adecuado, R' y R" son hidrógeno o un sustituyente, cada uno de los cuales se selecciona independientemente en cada caso, y q es un número entero tal como 1,2, 3, 4, o 5. De forma ilustrativa, R' y/o R" corresponden independientemente, pero no se limitan a, hidrógeno o las cadenas laterales presentes en aminoácidos naturales, tales como metilo, bencilo, hidroximetilo, tiometilo, carboxilo, carboxilmetilo, guanidinpropilo, y similares, y derivados y derivados protegidos de los mismos. La fórmula descrita anteriormente incluye todas las variaciones estereoisoméricas. Por ejemplo, el aminoácido puede seleccionarse de asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, lisina, glutamina, arginina, serina, ornitina, treonina y similares. En una variación, el aminoácido puede seleccionarse de fenilalanina, tirosina y similares, derivados de los mismos y variantes sustituidas de los mismos.
Los términos "arilalquilo" y "heteroarilalquilo" tal como se usan en el presente documento incluyen fragmentos moleculares o radicales que comprenden arilo y heteroarilo, respectivamente, tal como se definen en el presente documento sustituidos con un grupo alquileno lineal o ramificado, tal como bencilo, fenetilo, a-metilbencilo, picolinilo, pirimidiniletilo y similares.
Debe entenderse que los términos descritos anteriormente pueden combinarse para generar grupos químicamente relevantes, tales como "haloalcoxialquilo" que se refiere, por ejemplo, a trifluorometiloxietilo, 1,2-difluoro-2-cloroet-1-iloxipropilo y similares.
El término "derivado de aminoácido", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a aminoalquilcarboxilato, en el que el radical amino o el radical carboxilato están cada uno opcionalmente sustituido con alquilo, carboxilalquilo, alquilamino y similares, o están opcionalmente protegidos; y el fragmento de alquilo divalente que interviene está opcionalmente sustituido con alquilo, hidroxialquilo, sulfhidrilalquilo, aminoalquilo, carboxialquilo y similares, incluidos los grupos correspondientes a las cadenas laterales que se encuentran en los aminoácidos naturales, tal como los que se encuentran en serina, cisteína, metionina, ácido aspártico, ácido glutámico y similares.
El término "péptido" como se usa en el presente documento incluye fragmentos moleculares o radicales que comprenden una serie de aminoácidos y análogos de aminoácidos y derivados unidos covalentemente uno a otro por enlaces amida.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-tiosuccinimid-1-ilalquiloximetiloxi, en el que de el metilo está opcionalmente sustituido con alquilo o arilo sustituido.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-tiosuccinimid-1-ilalquilcarbonilo, en el que el carbonilo forma una acilaziridina con el fármaco, o análogo o derivado del mismo.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 1-alcoxicicloalquilenoxi.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar carboxilato de alquilenaminocarbonil(dicarboxilarileno).
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador liberable, un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar ditioalquilcarbonilhidracida, en la que la hidracida forma una hidrazona con el fármaco, o un análogo o derivado de la misma.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-tiosuccinimid-1-ilalquilcarbonilhidracida, en la que la hidracida forma una hidrazona con el fármaco, o análogo o derivado del mismo.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-tioalquilsulfonilalquil(silildisustituido)oxi, en el que el sililo disustituido está sustituido con alquilo o arilo opcionalmente sustituido.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende una pluralidad de enlazadores espaciadores seleccionados del grupo que consiste en los aminoácidos naturales y sus estereoisómeros.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador liberable, un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-ditioalquiloxicarbonilo, en el que el carbonilo forma un carbonato con el fármaco, o análogo o derivado del mismo.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador liberable, un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-ditioarilalquiloxicarbonilo, en el que el carbonilo forma un carbonato con el fármaco, o análogo o derivado del mismo, y el arilo está opcionalmente sustituido.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-tiosuccinimid-1-ilalquiloxialquiloxialquilideno, en el que el alquilideno forma una hidrazona con el fármaco, o análogo o derivado del mismo, cada alquilo es independientemente seleccionado, y el oxialquiloxi está opcionalmente sustituido con alquilo o arilo opcionalmente sustituido.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador liberable, un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-ditioalquiloxicarbonilhidracida.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador liberable, un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-ditioalquilamino, en el que el amino forma una amida viníloga con el fármaco, o análogo o derivado del mismo.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador liberable, un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-ditioalquilamino, en el que el amino forma una amida viníloga con el fármaco, o análogo o derivado del mismo, y el alquilo es etilo.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador liberable, un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-ditioalquilaminocarbonilo, en el que el carbonilo forma un carbamato con el fármaco, o análogo o derivado del mismo.
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador liberable, un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-ditioalquilaminocarbonilo, en el que el carbonilo forma un carbamato con el fármaco, o análogo o derivado del mismo, y el alquilo es etilo
En otra realización, el enlazador bivalente comprende un enlazador liberable, un enlazador espaciador y un enlazador liberable tomados juntos para formar 3-ditioarilalquiloxicarbonilo, en el que el carbonilo forma un carbamato o una carbamoilaziridina con el fármaco, o un análogo o derivado del mismo.
En otra realización, el enlazador polivalente incluye enlazadores espaciadores y enlazadores liberables conectados para formar un grupo 3-tiosuccinimid-1-ilalquiloximetiloxi polivalente, ilustrado por la siguiente fórmula
Figure imgf000016_0001
en la que n es un número entero de 1 a 6, el grupo alquilo está opcionalmente sustituido y el metilo está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo adicional o arilo opcionalmente sustituido, cada uno de los cuales está representado por un grupo R independientemente seleccionado. Los símbolos (*) indican puntos de unión del fragmento enlazador polivalente a otras partes de los conjugados descritos en el presente documento.
En otra realización, el enlazador polivalente incluye enlazadores espaciadores y enlazadores liberables conectados para formar un grupo 3-tiosuccinimid-1-ilalquilcarbonilo polivalente, ilustrado por la siguiente fórmula
Figure imgf000016_0002
en la que n es un número entero de 1 a 6, y el grupo alquilo está opcionalmente sustituido. Los símbolos (*) indican puntos de unión del fragmento de enlace polivalente a otras partes de los conjugados descritos en este documento. En otra realización, el enlazador polivalente incluye enlazadores espaciadores y enlazadores liberables conectados para formar un grupo 3-tioalquilsulfonilalquilo(silil disustituido)oxi polivalente, en el que el sililo disustituido está sustituido con grupos alquilo y/o arilo opcionalmente sustituido.
En otra realización, el enlazador polivalente incluye enlazadores espaciadores y enlazadores liberables conectados para formar un grupo ditioalquilcarbonilhidracida polivalente, o una 3-tiosuccinimid-1-ilalquilcarbonilhidracida polivalente, ilustrada por las siguientes fórmulas
Figure imgf000017_0001
en las que n es un número entero de 1 a 6, el grupo alquilo está opcionalmente sustituido y la hidracida forma una hidrazona con (B), (D) u otra parte del enlazador polivalente (L). Los símbolos (*) indican puntos de unión del fragmento enlazador polivalente a otras partes de los conjugados descritos en este documento.
En otra realización, el enlazador polivalente incluye enlazadores espaciadores y enlazadores liberables conectados para formar un grupo de 3-tiosuccinimid-1-ilalquiloxialquiloxialquilideno polivalente, ilustrado por la siguiente fórmula
Figure imgf000017_0002
en la que cada n es un número entero independientemente seleccionado de 1 a 6, cada grupo alquilo se selecciona independientemente y está opcionalmente sustituido, tal como con alquilo o arilo opcionalmente sustituido, y en el que el alquilideno forma una hidrazona con (B), (D) u otro parte del enlazador polivalente (L). Los símbolos (*) indican puntos de unión del fragmento enlazador polivalente a otras partes de los conjugados descritos en este documento. En el documento WO 2006/012527 se describen enlazadores ilustrativos adicionales. Los enlazadores adicionales se describen en la siguiente Tabla, en la que el átomo (*) es el punto de unión de espaciador adicional o enlazadores liberables, el fármaco y/o el ligando de unión.
Enlazadores liberables ilustrativos
Figure imgf000017_0003
Figure imgf000018_0001
Cada uno de los espaciadores y enlazadores liberables descritos en el presente documento es bivalente. Además, las conexiones entre los enlazadores espaciadores, los enlazadores liberables, los fármacos D y los ligandos B pueden ocurrir en cualquier átomo que se encuentre en los diversos enlazadores espaciadores, enlazadores liberables, fármacos D y ligandos B.
El fármaco puede incluir un átomo de nitrógeno, y el enlazador liberable puede ser haloalquilencarbonilo, opcionalmente sustituido con un sustituyente X2, y el enlazador liberable está unido al nitrógeno del fármaco para formar una amida.
El fármaco puede incluir un átomo de oxígeno, y el enlazador liberable puede ser haloalquilencarbonilo, opcionalmente sustituido con un sustituyente X2, y el enlazador liberable está unido al oxígeno del fármaco para formar un éster.
El fármaco puede incluir un átomo de nitrógeno de doble enlace, y en esta realización, los enlazadores liberables pueden ser alquilencarbonilamino y 1-(alquilencarbonilamino)succinimid-3-ilo, y el enlazador liberable puede unirse al nitrógeno del fármaco para formar una hidrazona
El fármaco puede incluir un átomo de azufre, y en esta realización, los enlazadores liberables pueden ser alquilentio y carbonilalquiltio, y el enlazador liberable puede unirse al azufre del fármaco para formar un disulfuro.
En otra realización, el ligando de unión o direccionamiento capaz de unirse o dirigirse a PSMA es un ácido fosfórico, fosfónico o fosfínico o derivado del mismo. En un aspecto, el ácido fosfórico, fosfónico o fosfínico o derivado del mismo incluye uno o más grupos de ácido carboxílico. En otro aspecto, el ácido fosfórico, fosfónico o fosfínico o derivado del mismo incluye uno o más grupos tiol o derivados del mismo. En otro aspecto, el ácido fosfórico, fosfónico o fosfínico o derivado del mismo incluye uno o más bioisoésteres de ácido carboxílico, tales como un tetrazol opcionalmente sustituido y similares.
En otra realización, el ligando del PSMA es un derivado del ácido pentanodioico. De forma ilustrativa, el derivado de ácido pentanodioico es un compuesto de la fórmula:
Figure imgf000019_0001
en la que X es RP(O)(OH)CH2-(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,968,915);
RP(O)(OH)N(R1)-(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,863,536);
RP(O)(OH)O-(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,795,877);
Rn (o H)C(O)Y- o RC(O)NH(OH)Y, en las que Y es -CR1R2-, -NR3- u -O-(véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,962,521); RS(O)Y, RSO2Y o RS(O)(NH)Y, en las que Y es -CR1R2-, -NR3- u -O-(véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,902,817); y RS-alquilo, en el que R es, por ejemplo, hidrógeno, alquilo, arilo o arilalquilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido (véase, por ejemplo, J. Med. Chem. 46: 1989­ 1996 (2003)).
En cada una de las fórmulas anteriores, R, R1, R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo de cadena lineal o ramificada C1-C9 , alquenilo de cadena lineal o ramificada C2-C9 , cicloalquilo C3-C8 , cicloalquenilo C5-C7 y arilo. Además, en cada caso, cada uno de R, R1, R2 y R3 puede estar opcionalmente sustituido, tal como con uno o más grupos seleccionados de cicloalquilo C3-C8 , cicloalquenilo C5-C7 , halo, hidroxi, nitro, trifluorometilo, -Alquilo de cadena lineal o ramificada C1-C6 , alquenilo de cadena lineal o ramificada C2-C6 , alcoxi C1-C4 , alqueniloxi C2-C4 , fenoxi, benciloxi, amino, arilo. En un aspecto, el arilo se selecciona de 1-naftilo, 2-naftilo, 2-indolilo, 3-indolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, bencilo y fenilo, y en cada caso el arilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más, de manera ilustrativa con uno a tres, grupos seleccionados de halo, hidroxi, nitro, trifluorometilo, alquilo de cadena lineal o ramificada C1-C6 , alquenilo de cadena lineal o ramificada C2-C6 , alcoxi C1-C4 , alqueniloxi C2-C4 , fenoxi, benciloxi y amino. En una variación de cada una de las fórmulas anteriores, R no es hidrógeno.
Los ligandos ilustrativos de PSMA descritos en la patente de Estados Unidos No. 5,968,915 incluyen ácido 2-[[metilhidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[etilhidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[propilhidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[butilhidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[ciclohexilhidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[fenilhidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[2-(tetrahidrofuranil)hidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(2-tetrahidropiranil)hidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[((4-piridil)metil)hidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[((2-piridil)metil)hidroxifosfinil]metil] pentanodioico; ácido 2-[[(fenilmetil)hidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[((2-feniletil)metil)hidroxifosfinil]metil] pentanodioico; ácido 2-[[((3-fenilpropil)metil)hidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[((3-fenilbutil)metil) hidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[((2-fenilbutil)metil)hidroxifosfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(4-fenilbutil) hidroxifosfinil]metil]pentanodioico; y ácido 2-[[(aminometil)hidroxifosfinil]metil]pentanodioico.
Los ligandos ilustrativos de PSMA descritos en la patente de Estados Unidos No. 5,863,536 incluyen ácido N-[metilhidroxifosfinil]glutámico; ácido N-[etilhidroxifosfinil]glutámico; ácido N-[propilhidroxifosfinil]glutámico; ácido N-[butilhidroxifosfinil]glutámico; ácido N-[fenilhidroxifosfinil]glutámico; ácido N-[(fenilmetil)hidroxifosfinil]glutámico; ácido N-[((2-feniletil) etil)hidroxifosfinil]glutámico; y ácido N-metil-N-[fenilhidroxifosfinil]glutámico.
Los ligandos ilustrativos de PSMA descritos en la patente de Estados Unidos No. 5,795,877 incluyen ácido 2-[[metilhidroxifosfinil]oxi]pentanodioico; ácido 2-[[etilhidroxifosfinil]oxi]pentanodioico; ácido 2-[[propilhidroxifosfinil]oxi] pentanodioico; ácido 2-[[butilhidroxifosfinil]oxi]pentanodioico; ácido 2-[[fenilhidroxifosfinil]oxi]pentanodioico; ácido 2-[[((4-piridil)metil)hidroxifosfinil]oxi]pentanodioico; ácido 2-[[((2-piridil)metil)hidroxifosfinil]oxi]pentanodioico; ácido 2-[[(fenilmetil)hidroxifosfinil]oxi]pentanodioico; y ácido 2[[((2-feniletil)metil)hidroxifosfinil]oxi]pentanodioico.
Los ligandos ilustrativos de PSMA descritos en la patente de Estados Unidos No. 5,962,521 incluyen ácido 2-[[(N-hidroxi)carbamoil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(N-hidroxi-N-metil)carbamoil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[((N-butil-N-hidroxi)carbamoil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(N-bencil-N-hidroxi)carbamoil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(N-hidroxi-N-fenil)carbamoil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(N-hidroxi-N-2-feniletil)carbamoil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(N-etil-N-hidroxi)carbamoil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(N-hidroxi-N-propil)carbamoil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(N-hidroxi-N-3-fenilpropil)carbamoil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(N-hidroxi-N-4-piridil)carbamoil]metil]pentano dioico; ácido 2-[[(N-hidroxi)carboxamido]metil]pentanodioico; ácido 2-[[N-hidroxi(metil)carboxamido]metil]pentano dioico; ácido 2-[[N-hidroxi(bencil)carboxamido]metil]pentanodioico; ácido 2-[[N-hidroxi(fenil)carboxamido] metil] pentanodioico; ácido 2-[[N-hidroxi(2-feniletil)carboxamido]metil]pentanodioico; ácido 2-[[N-hidroxi(etil)carboxamido] metil]pentanodioico; ácido 2-[[N-hidroxi(propil)carboxamido]metil]pentanodioico; ácido 2-[[N-hidroxi(3-fenilpropil) carboxamido]metil]pentanodioico; y ácido 2-[[N-hidroxi(4-piridil)carboxamido]metil]pentanodioico.
Los ligandos ilustrativos de PSMA descritos en la patente de Estados Unidos No. 5,902,817 incluyen ácido 2-[(sulfinil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(metilsulfinil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(etilsulfinil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(propilsulfinil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(butilsulfinil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(fenilsulfinil]metil]pentano dioico; ácido 2-[[(2-feniletil)sulfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(3-fenilpropil)sulfinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(4 piridil)sulfinil]metM]pentanodioico; ácido 2-[(bencilsulfinil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(sulfonil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(metilsulfonil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(etilsulfonil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(propilsulfonil)metil] pentanodioico; ácido 2-[(butilsulfonil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(fenilsulfonil]metil] pentanodioico; ácido 2-[[(2-feniletil)sulfonil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(3-fenilpropil)sulfonil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(4-piridil)sulfonil] metil]pentanodioico; ácido 2-[(bencilsulfonil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(sulfoximinil) metil]pentanodioico; ácido 2-[(metilsulfoximinil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(etilsulfoximinil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(propilsulfoximinil) metil]pentanodioico; ácido 2-[(butilsulfoximinil)metil]pentanodioico; ácido 2-[(fenilsulfoximinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(2-feniletil)sulfoximinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(3-fenilpropil) sulfoximinil]metil]pentanodioico; ácido 2-[[(4-piridil)sulfoximinil]metil]pentanodioico; y ácido 2-[(bencilsulfoximinil)metil]pentanodioico.
Se ha informado que los derivados de ácido pentanodioico descritos en el presente documento tienen una alta afinidad de unión a PSMA, incluyendo pero sin limitarse a, los siguientes derivados de ácido fosfónico y fosfínico.
Figure imgf000020_0001
con las constantes de disociación (valores de Ki) que se muestran para el complejo E-I (véase, Current Medicinal Chem. 8: 949-.957 (2001); Silverman, "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", Elsevier Academic Press (2a Ed 2003).
En otra realización ilustrativa, el derivado de ácido pentanodioico incluye un grupo tiol, tal como los compuestos de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000020_0002
(R, S) 90 ± 26 nM
(R) 85 ± 33 nM
(S) 67 ± 29 nM
con las constantes de inhibición (valores de IC50) que se muestran para el complejo E-I.
En otra realización, el ligando del PSMA es una urea de dos aminoácidos. En un aspecto, los aminoácidos incluyen uno o más ácidos carboxílicos adicionales. En otro aspecto, los aminoácidos incluyen uno o más ácidos fosfórico, fosfónico, fosfínico, sulfínico, sulfónico o borónico adicionales. En otro aspecto, los aminoácidos incluyen uno o más grupos tiol o derivados de los mismos. En otro aspecto, los aminoácidos incluyen uno o más bioisoésteres de ácido carboxílico, tales como tetrazoles y similares.
En otra realización, el ligando del PSMA es un derivado de aminocarbonilo de ácido pentanodioico. De forma ilustrativa, el derivado de ácido aminocarbonilpentanodioico es un compuesto de la fórmula:
Figure imgf000021_0001
en la que R1 y R2 se seleccionan cada uno de hidrógeno, ácidos carboxílicos opcionalmente sustituidos, tales como ácidos tiolacéticos, ácidos tiolpropiónicos y similares; ácidos malónicos, ácidos succínicos, ácidos glutámicos, ácidos adípicos y similares; y otros. Los derivados ilustrativos del ácido aminocarbonilpentanodioico se describen en J. Med. Chem 44: 298-301 (2001) y J. Med. Chem 47: 1729-38 (2004).
En otra realización, el ligando del PSMA es un compuesto de la fórmula:
Figure imgf000021_0002
(continuación)
Figure imgf000022_0002
Se aprecia que los compuestos de urea descritos en el presente documento también pueden ser ventajosos en la preparación de los ligandos también descritos en el presente documento debido a la potencia subnanomolar, solubilidad en agua y/o estabilidad a largo plazo de estos compuestos. Los compuestos de urea descritos en el presente documento generalmente se pueden preparar a partir de materiales de partida disponibles comercialmente como se describe en el presente documento.
Se aprecia que en cada uno de los compuestos ilustrativos de ácido pentanodioico y compuestos de urea ilustrativos anteriores, hay al menos un átomo de carbono asimétrico. En consecuencia, las fórmulas ilustrativas anteriores están destinadas a referirse tanto individual como colectivamente a todos los estereoisómeros como enantiómeros puros, o mezclas de enantiómeros y/o diastereómeros, incluidas, entre otras, mezclas racémicas, mezclas que incluyen un epímero en un primer carbono asimétrico pero permiten mezclas en otros carbonos asimétricos, incluidas mezclas racémicas, y similares.
En otra realización ilustrativa, el agente de unión es una urea de un ácido amino dicarboxílico, tal como ácido aspártico, ácido glutámico y similares, y otro ácido amino dicarboxílico, o un análogo del mismo, tal como un agente de unión de las fórmulas
Figure imgf000022_0001
en las que Q es un ácido amino dicarboxílico, tal como ácido aspártico, ácido glutámico, o un análogo del mismo, n y m se seleccionan cada uno de un número entero entre 1 y aproximadamente 6, y (*) representa el punto de unión para el enlazador L.
En otra realización, el ligando del PSMA incluye al menos cuatro grupos de ácido carboxílico, o al menos tres grupos de ácido carboxílico libres después de que el ligando del PSMA se conjuga con el agente o enlazador. Se entiende que, como se describe en el presente documento, los grupos de ácido carboxílico en el ligando del PSMA incluyen bioisoésteres de ácidos carboxílicos.
De forma ilustrativa, el ligando del PSMA es un compuesto de las fórmulas:
Figure imgf000023_0001
En otra realización, el ligando del PSMA es ácido 2-[3-(1-carboxi-2-mercapto-etil)-ureido]-pentanodioico (MUPA) o ácido 2-[3-(1,3-dicarboxipropil))-ureido]-pentanodioico (DUPA).
Otros ejemplos ilustrativos de ligandos del PSMA incluyen análogos de péptidos tales como ácido quisquálico, glutamato de aspartato (Asp-Glu), Glu-Glu, Gly-Glu, Y-Glu-Glu, beta-N-acetil-L-aspartato-L-glutamato (p-NAAG), y similares.
En otra realización ilustrativa, el agente de unión es una urea de un ácido amino dicarboxílico, tal como ácido aspártico, ácido glutámico y similares, y otro ácido amino dicarboxílico, o un análogo del mismo, y el enlazador es péptido de aminoácidos, incluidos los aminoácidos naturales y no naturales. En una realización, el enlazador es un péptido que comprende aminoácidos seleccionados de Glu, Asp, Phe, Cys, beta-amino Ala y ácidos aminoalquilcarboxílicos, tales como Gly, beta Ala, ácido aminovalérico, ácido aminocaproico y similares. En otra realización, el enlazador es un péptido que consiste en aminoácidos seleccionados de Glu, Asp, Phe, Cys, beta-amino Ala y ácidos aminoalquilcarboxílicos, tales como Gly, beta Ala, ácido aminovalérico, ácido aminocaproico y similares. En otra realización, el enlazador es un péptido que comprende al menos una Phe. En variaciones, el enlazador es un péptido que comprende al menos dos residuos de Phe, o al menos tres residuos de Phe. En otra realización, el enlazador es un péptido que comprende Glu-Phe o un dipéptido de un ácido aminoalquilcarboxílico y Phe. En otra realización, el enlazador es un péptido que comprende Glu-Phe-Phe o un tripéptido de un ácido aminoalquilcarboxílico y dos residuos de Phe. En otra realización, el enlazador es un péptido que comprende uno o más residuos de Phe, en el que al menos un Phe es de aproximadamente 7 a aproximadamente 11, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 átomos del ligando de unión B. En otra realización, el enlazador es un péptido que comprende Phe-Phe de aproximadamente 7 a aproximadamente 11, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 átomos del ligando de unión B. Debe entenderse que en cada una de las realizaciones y variaciones anteriores, uno o más residuos de Phe pueden reemplazarse con Tyr, u otra variante sustituida de los mismos.
En otra realización ilustrativa, el agente de unión es una urea de un ácido amino dicarboxílico, tal como ácido aspártico, ácido glutámico y similares, y otro ácido aminodicarboxílico, o un análogo del mismo, y el enlazador incluye uno o más grupos arilo o arilalquilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido, unido a la cadena principal del enlazador. En otra realización, el enlazador es un péptido que comprende uno o más grupos arilo o arilalquilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido, unido a la cadena principal del enlazador aproximadamente 7 a aproximadamente 11 átomos del ligando de unión B. En otra realización, el enlazador es un péptido que comprende dos grupos arilo o arilalquilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido, unido a la cadena principal del enlazador, en la que un grupo arilo o arilalquilo es de aproximadamente 7 a aproximadamente 11, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 átomos del ligando de unión B, y el otro grupo arilo o arilalquilo es de aproximadamente 10 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 17 átomos del ligando de unión B.
Como se describe en el presente documento, los conjugados están dirigidos a células que expresan o sobreexpresan PSMA, usando un ligando de unión a PSMA. Una vez suministrados, los conjugados se unen a PSMA. Se entiende que en ciertas realizaciones los conjugados permanecen en la superficie de la célula durante un período de tiempo suficiente para la obtención de imágenes y/o el diagnóstico. En otras realizaciones, los conjugados se internalizan en la célula que expresa o sobreexpresa PSMA por mecanismos celulares endógenos, tales como endocitosis, para la formación de imágenes y/o diagnóstico, o tratamiento posterior. Una vez internalizados, los conjugados pueden permanecer intactos o descomponerse, degradarse o alterarse para permitir la liberación del agente que forma el conjugado. Se aprecia que en las configuraciones de formación de imágenes y/o diagnóstico, el agente puede permanecer intacto como el conjugado o liberarse una vez que se ha internalizado en la célula objetivo. Se aprecia además que en configuraciones terapéuticas, el agente se libera ventajosamente del conjugado una vez que se ha internalizado en la célula objetivo.
En una realización ilustrativa, el fármaco es un agente de formación de imágenes. En otra variación ilustrativa, el fármaco es un agente de diagnóstico. En otra variación ilustrativa, el fármaco es un agente quimioterapéutico.
En un aspecto, el agente de formación de imágenes es un radioisótopo unido covalentemente al enlazador. En otro aspecto, el agente de formación de imágenes es un isótopo radiactivo, tal como un isótopo radiactivo de un metal, coordinado a un grupo quelante. Los isótopos metálicos radiactivos ilustrativos incluyen tecnecio, renio, galio, gadolinio, indio, cobre y similares, incluidos los isótopos 111In, 99mTc, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, y similares. Ejemplos ilustrativos adicionales de agentes de formación de imágenes de radionúclidos se describen en la patente de los Estados Unidos No. 7,128,893. Los grupos quelantes ilustrativos adicionales son tripéptidos o tetrapéptidos, que incluyen pero no se limitan a tripéptidos que tienen la fórmula:
Figure imgf000024_0001
en la que R se selecciona independientemente en cada caso de H, alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, heteroarilalquilo y similares, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido. Debe entenderse que una R incluye un heteroátomo, tal como nitro, oxígeno o azufre, y es el punto de unión del enlazador L. De forma ilustrativa, se describen los siguientes grupos quelantes:
Figure imgf000024_0002
en los que X es oxígeno, nitrógeno o azufre, y en los que X está unido al enlazador L, y n es un número entero de 1 a aproximadamente 5.
En otro aspecto, el agente de formación de imágenes es un agente fluorescente. Los agentes fluorescentes incluyen agentes fluorescentes Oregon Green, incluidos, entre otros, Oregon Green 488, Oregon Green 514 y similares, agentes fluorescentes AlexaFluor, incluidos, entre otros, AlexaFluor 488, AlexaFluor 647 y similares, fluoresceína y análogos relacionados, agentes fluorescentes BODIPY, incluidos, entre otros, BODIPY F1, BODIPY 505 y similares, agentes fluorescentes de rodamina, incluidos, entre otros, tetrametilrodamina y similares, agentes fluorescentes DyLight, incluidos, entre otros, DyLight 680, DyLight 800 y similares, CW 800, Texas Red, ficoeritrina y otros. El agente fluorescente ilustrativo se muestra en las siguientes estructuras generales ilustrativas:
Figure imgf000024_0003
en las que X es oxígeno, nitrógeno o azufre, y en las que X está unido al enlazador L; Y es ORa, NRa2 , o NRV; e Y' es O, NRa o NRV; en los que cada R se selecciona independientemente en cada caso de H, flúor, ácido sulfónico, sulfonato y sus sales, y similares; y Ra es hidrógeno o alquilo.
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en la que X es oxígeno, nitrógeno o azufre, y en la que X está unido al enlazador L; y cada R se selecciona independientemente en cada caso de H, alquilo, heteroalquilo y similares; y n es un número entero de 0 a aproximadamente 4.
En otro aspecto, el agente de formación de imágenes es un agente de formación de imágenes de PET, o un agente de formación de imágenes de FRET. Agentes de formación de imágenes de PET incluyen 18F, 11C, 64Cu, 65Cu, y similares. Los agentes de formación de imágenes de FRET incluyen 64Cu, 65Cu y similares. Se aprecia que en el caso de 18F, 11C, el isótopo de formación de imágenes puede estar presente en cualquier parte del enlazador, o alternativamente puede estar presente en una estructura unida al enlazador. Por ejemplo, en el caso de 18F, se describen grupos fluoroarilo, tales como fluorofenilo, difluorofenilo, fluoronitrofenilo y similares. Por ejemplo, en el caso de 11C, se describen alquilo y alquil arilo.
En otro aspecto, el agente quimioterapéutico es un compuesto citotóxico. Los compuestos citotóxicos descritos en este documento operan por cualquiera de una gran cantidad de mecanismos de acción. En general, los compuestos citotóxicos alteran los mecanismos celulares que son importantes para la supervivencia celular y/o la proliferación celular y/o causan apoptosis.
El fármaco puede ser cualquier molécula capaz de modular o bien modificar la función celular, incluidos los compuestos farmacéuticamente activos. Las moléculas adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a: péptidos, oligopéptidos, oligopéptidos retro-inversos, proteínas, análogos de proteínas en los que al menos un enlace no peptídico reemplaza un enlace peptídico, apoproteínas, glicoproteínas, enzimas, coenzimas, inhibidores enzimáticos, aminoácidos y sus derivados, receptores y otras proteínas de membrana; antígenos y anticuerpos de los mismos; haptenos y anticuerpos de los mismos; hormonas, lípidos, fosfolípidos, liposomas; toxinas, antibióticos, analgésicos, broncodilatadores; bloqueadores beta; agentes antimicrobianos; agentes antihipertensivos; agentes cardiovasculares que incluyen antiarrítmicos, glucósidos cardíacos, antianginosos y vasodilatadores; agentes del sistema nervioso central, incluidos estimulantes, psicotrópicos, antimaníacos y depresivos; agentes antivirales; antihistamínicos, medicamentos contra el cáncer, incluidos agentes quimioterapéuticos; tranquilizantes antidepresivos; antagonistas de H-2; anticonvulsivos; antinauseantes; prostaglandinas y análogos de prostaglandinas; relajantes musculares; sustancias antiinflamatorias; estimulantes descongestionantes; antieméticos; diuréticos antiespasmódicos; antiasmáticos; agentes contra el Parkinson; expectorantes; supresores de la tos; mucolíticos; y aditivos minerales y nutricionales.
Además, el fármaco puede ser cualquier fármaco conocido en la técnica que sea citotóxico, mejore la permeabilidad del tumor, inhiba la proliferación de células tumorales, promueva la apoptosis, disminuya la actividad antiapoptótica en las células objetivo, se use para tratar enfermedades causadas por agentes infecciosos, mejora una respuesta inmune endógena dirigida a las células patógenas, o es útil para tratar un estado de enfermedad causado por cualquier tipo de célula patógena. Los fármacos adecuados para su uso de acuerdo con esta invención incluyen adrenocorticoides y corticosteroides, agentes alquilantes, antiandrógenos, antiestrógenos, andrógenos, aclamicina y derivados de aclamicina, estrógenos, antimetabolitos tales como arabinósido de citosina, análogos de purina, análogos de pirimidina y metotrexato, busulfano, carboplatino, clorambucilo cisplatino y otros compuestos de platino, taxanos, como tamoxifeno, taxol, paclitaxel, derivados de paclitaxel, Taxotere® y similares, maitansinas y análogos y derivados de los mismos, ciclofosfamida, daunomicina, doxorrubicina, rizoxina, toxina T2, alcaloides vegetales, prednisona, hidroxiurea, tenipósido, mitomicinas, discodermólidos, inhibidores de microtúbulos, epotilonas, tubulisina, ciclopropil benz[e]indolona, seco-ciclopropil benz[e]indolona, O-Ac-seco-ciclopropil benz[e] indolona, bleomicina y cualquier otro antibiótico, mostazas nitrogenadas, nitrosoureas, vincristina, vinblastina y sus análogos y derivados, tales como monohidracida de desacetilvinblastina, colchicina, derivados de colchicina, alocolchicina, tiocolchicina, tritil cisteína, halicondrina B, dolastatinas tales como dolastatina 10, amanitinas tales como a-amanitina, camptotecina, irinotecano y otros derivados de los mismos camptotecina, geldanamicina y derivados de geldanamicina, estramustina, nocodazol, MAP4, colcemida, agentes inflamatorios y proinflamatorios, péptidos e inhibidores de la transducción de señales peptidomiméticas, y cualquier otro fármaco o toxina reconocida en la técnica. Otros medicamentos que se pueden usar de acuerdo con la invención incluyen penicilinas, cefalosporinas, vancomicina, eritromicina, clindamicina, rifampicina, cloranfenicol, antibióticos de aminoglicósidos, gentamicina, anfotericina B, aciclovir, trifluridina, ganciclovir, zidovudina, amantadina, ribavirina y cualquier otro compuesto antimicrobiano reconocido en la técnica.
Se describen fármacos ilustrativos y otros agentes terapéuticos en las publicaciones de las solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. US-2005-0002942-A1, US-2001-0031252-A1 y US-2003-0086900-A1. Los agentes ilustrativos de formación de imágenes y los agentes de diagnóstico se describen en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos No. US-2004-0033195-A1 y la publicación de la solicitud internacional de patente No. WO 03/097647.
La invención descrita en el presente documento también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad de un conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión (B) efectivo para eliminar una población de células patógenas en un animal huésped cuando se administra en una o más dosis. El conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión se administra preferiblemente al animal huésped por vía parenteral, por ejemplo, por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o intratecal. Alternativamente, el conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión se puede administrar al animal huésped mediante otros procesos médicamente útiles, tales como por vía oral, y se puede usar cualquier dosis efectiva y forma de dosificación terapéutica adecuada, incluidas formas de dosificación de liberación prolongada.
Los ejemplos de formas de dosificación parenteral incluyen soluciones acuosas del agente activo, en una solución salina isotónica, glucosa al 5% u otros vehículos líquidos farmacéuticamente aceptables bien conocidos, tales como alcoholes, glicoles, ésteres y amidas líquidos. La forma de dosificación parenteral de acuerdo con esta invención puede estar en forma de un liofilizado reconstituible que comprende la dosis del conjugado de liberación de fármacos. En un aspecto de la presente realización, se puede administrar cualquiera de una serie de formas de dosificación de liberación prolongada conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, las matrices de carbohidratos biodegradables descritas en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,713,249; 5,266,333; y 5,417,982, o, alternativamente, se puede usar una bomba lenta (por ejemplo, una bomba osmótica).
En un aspecto ilustrativo, al menos una composición adicional que comprende un factor terapéutico se puede administrar al huésped en combinación o como un adyuvante a la metodología detallada anteriormente, para mejorar la eliminación de la población de células patógenas mediada por el conjugado de suministro del fármaco del ligando de unión, o se puede administrar más de un factor terapéutico adicional. El factor terapéutico se puede seleccionar de un agente quimioterapéutico u otro factor terapéutico capaz de complementar la eficacia del conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión administrado.
En un aspecto ilustrativo, se pueden usar combinaciones terapéuticamente eficaces de estos factores. En una realización, por ejemplo, se pueden usar cantidades terapéuticamente efectivas del factor terapéutico, por ejemplo, en cantidades que varían de aproximadamente 0.1 MIU/m2/dosis/día hasta aproximadamente 15 MIU/m2/dosis/día en un régimen diario de dosis múltiples, o por ejemplo, en cantidades que varían desde aproximadamente 0.1 MIU/m2/dosis/día hasta aproximadamente 7.5 MIU/m2/dosis/día en un régimen diario de dosis múltiples, junto con el los conjugados de suministro de fármacos del ligando de unión para eliminar, reducir o neutralizar células patógenas en un animal huésped que alberga las células patógenas (MIU = millón de unidades internacionales; m2 = área de superficie corporal aproximada de un humano promedio).
En otra realización, los agentes quimioterapéuticos, que son, por ejemplo, citotóxicos por sí mismos o pueden funcionar para mejorar la permeabilidad del tumor, también son adecuados para su uso en el método de la invención en combinación con los conjugados de liberación de fármacos del ligando de unión. Dichos agentes quimioterapéuticos incluyen adrenocorticoides y corticosteroides, agentes alquilantes, antiandrógenos, antiestrógenos, andrógenos, aclamicina y derivados de aclamicina, estrógenos, antimetabolitos tales como arabinósido de citosina, análogos de purina, análogos de pirimidina y metotrexato, busulfano, carboplatino, clorambucilo, cisplatino y otros compuestos de platino, tamoxifeno, taxol, paclitaxel, derivados de paclitaxel, Taxotere® ciclofosfamida, daunomicina, doxorrubicina, rizoxina, toxina T2, alcaloides de plantas, prednisona, hidroxiurea, tenipósido, mitomicinas, discodermólidos, inhibidores de microtúbulos, epotilonas, tubulisina, ciclopropil benz[e]indolona, seco-ciclopropil benz[e]indolona, O-Acseco-ciclopropil benz[e]indolona, bleomicina y cualquier otro antibiótico, mostaza nitrogenada, nitrosoureas, vincristina, vinblastina y análogos y derivados de los mismos, tales como monohidracida de desacetilvinblastina, colchicina, derivados de colchicina, alocolchicina, tiocolchicina, tritil cisteína, halicondrina B, dolastatinas tales como dolastatina 10, amanitinas tales como a-amanitina, camptotecina, irinotecano y otros derivados de camptotecina de los mismos, geldanamicina y derivados de geldanamicina, estramustina, nocodazol, MAP4, colcemida, agentes inflamatorios y proinflamatorios, inhibidores de la transducción de señal de péptidos y peptidomiméticos, y cualquier otro fármaco o toxina reconocida en la técnica. Otros fármacos que se pueden usar de acuerdo con la invención incluyen penicilinas, cefalosporinas, vancomicina, eritromicina, clindamicina, rifampicina, cloranfenicol, antibióticos de aminoglicósidos, gentamicina, anfotericina B, aciclovir, trifluridina, ganciclovir, zidovudina, amantadina, ribavirina, maitansinas y análogos y derivados de los mismos, gemcitabina y cualquier otro compuesto antimicrobiano reconocido en la técnica.
El factor terapéutico se puede administrar al animal huésped antes, después o al mismo tiempo que los conjugados de liberación de fármacos del ligando de unión y el factor terapéutico se puede administrar como parte de la misma composición que contiene el conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión o como parte de una composición diferente que el conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión. Cualquier composición terapéutica de este tipo que contenga el factor terapéutico a una dosis terapéuticamente efectiva puede usarse en la presente invención.
Además, se puede usar más de un tipo de conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión. De forma ilustrativa, por ejemplo, el animal huésped puede tratarse con conjugados con diferentes vitaminas, pero el mismo fármaco en un protocolo de dosificación conjunta. En otras realizaciones, el animal huésped puede tratarse con conjugados que comprenden el mismo ligando de unión unido a diferentes fármacos, o diversos ligandos de unión unidos a diversos fármacos. En otra realización ilustrativa, se pueden usar conjugados de liberación de fármacos del ligando de unión con las mismas o diferentes vitaminas, y se podrían usar los mismos o diferentes fármacos que comprenden múltiples vitaminas y múltiples fármacos como parte del mismo conjugado de liberación de fármacos.
En otro aspecto ilustrativo, se puede usar cualquier régimen eficaz para administrar los conjugados de liberación de fármacos del ligando de unión. Por ejemplo, los conjugados de liberación de fármacos del ligando de unión pueden administrarse como dosis únicas, o pueden dividirse y administrarse como un régimen diario de dosis múltiples. En otras realizaciones, un régimen escalonado, por ejemplo, de uno a tres días por semana puede usarse como una alternativa al tratamiento diario, y con el propósito de definir esta invención, dicho régimen diario intermitente o escalonado se considera equivalente al tratamiento diario y dentro del alcance de esta invención. En una realización, el huésped se trata con múltiples inyecciones del conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión para eliminar la población de células patógenas. En otra realización, el huésped se inyecta múltiples veces (preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 veces) con el conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión, por ejemplo, a intervalos de 12-72 horas o a intervalos de 48-72 horas. En otras realizaciones, pueden administrarse inyecciones adicionales del conjugado de liberación de fármacos del ligando de unión al paciente en un intervalo de días o meses después de la inyección o inyecciones iniciales y las inyecciones adicionales evitan la recurrencia del estado de enfermedad causado por las células patógenas.
De forma ilustrativa, los conjugados de liberación de fármacos del ligando de unión se pueden administrar parenteralmente al animal o paciente que padece el estado de enfermedad, por ejemplo, en forma intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, los conjugados de liberación de fármacos del ligando de unión pueden administrarse al animal o paciente mediante otros procedimientos médicamente útiles y pueden administrarse dosis eficaces en formas de dosificación de liberación estándar o de liberación prolongada. En otro aspecto, el método terapéutico puede usarse solo o en combinación con otros métodos terapéuticos reconocidos para el tratamiento de estados de enfermedad mediados por macrófagos activados.
En este documento se describe un método para obtener imágenes de poblaciones de células patógenas que expresan o sobreexpresan PSMA.
En este documento se describe un método para diagnosticar enfermedades y estados de enfermedad que están relacionados con poblaciones de células patógenas que expresan o sobreexpresan PSMA. Los compuestos descritos en el presente documento se unen selectiva y/o específicamente a células que expresan o sobreexpresan PSMA. Además, no solo muestran selectividad entre células patógenas y tejidos normales, sino que también muestran selectividad entre poblaciones de células patógenas (véase la Figura 8, en la que las células LnCAP que expresan PSMA se visualizan preferentemente en comparación con tumores A549 o tumores KB, que no lo hacen). Además, la respuesta es específica para la unión de PSMA como lo indican los estudios de competencia realizados con los conjugados descritos en el presente documento, en los que la unión se determina con el conjugado solo o en presencia de exceso de PMPA, un ligando de unión conocido de PSMA. La unión tanto en el riñón como en el tumor se bloquea en presencia de un exceso de PMPA (véase, por ejemplo, los Ejemplos de métodos descritos en el presente documento).
En otra realización, el conjugado tiene una constante de unión Kd de aproximadamente 100 nM o menos. En otro aspecto, el conjugado tiene una constante de unión Kd de aproximadamente 75 nM o menos. En otro aspecto, el conjugado tiene una constante de unión Kd de aproximadamente 50 nM o menos. En otro aspecto, el conjugado tiene una constante de unión Kd de aproximadamente 25 nM o menos.
En otra realización, los conjugados descritos en este documento exhiben selectividad por células o tejidos que expresan PSMA o que sobreexpresan PSMA en relación con tejidos normales tales como sangre, oído, pulmón, hígado, bazo, duodeno, piel, músculo, vejiga y próstata, con al menos una selectividad de 3 veces, o al menos una selectividad de 5 veces. En una variación, los conjugados descritos en la presente memoria exhiben selectividad por células o tejidos que expresan PSMA o que sobreexpresan PSMA con respecto a tejidos normales con una selectividad de al menos 10 veces. Se aprecia que la selectividad observada para la obtención de imágenes es indicativa de la selectividad que puede observarse en el tratamiento de estados de enfermedad que responden a la eliminación selectiva o específica de células o poblaciones de células que expresan o sobreexpresan PSMA.
La dosificación diaria unitaria del conjugado de liberación de fármacos puede variar significativamente dependiendo de la condición del huésped, el estado de la enfermedad que se está tratando, el peso molecular del conjugado, su vía de administración y distribución en los tejidos, y la posibilidad de uso conjunto de otros tratamientos terapéuticos tal como la radioterapia. La cantidad efectiva que se administrará a un paciente se basa en el área de superficie corporal, el peso del paciente y la evaluación médica de la condición del paciente. Las dosis efectivas pueden variar, por ejemplo, de aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 500 pg/kg, de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 pg/kg, y de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 10 pg/kg.
Generalmente, cualquier manera de formar un conjugado entre el enlazador bivalente (L) y el ligando de unión (B), o análogo o derivado del mismo, entre el enlazador bivalente (L) y el fármaco, o análogo o derivado del mismo, incluyendo cualquiera de los heteroátomos que intervienen puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. Además, puede usarse cualquier método reconocido en la técnica para formar un conjugado entre el enlazador espaciador, el enlazador liberable y uno o más heteroátomos para formar el enlazador bivalente (L). El conjugado se puede formar por conjugación directa de cualquiera de estas moléculas, por ejemplo, a través de enlaces de hidrógeno, iónicos o covalentes. La unión covalente puede ocurrir, por ejemplo, mediante la formación de enlaces amida, éster, disulfuro o imino entre los grupos ácido, aldehído, hidroxi, amino, sulfhidrilo o hidrazo.
Los métodos de síntesis se eligen dependiendo de la selección de los heteroátomos opcionalmente incluidos o los heteroátomos que ya están presentes en los enlazadores espaciadores, enlazadores liberables, el fármaco y/o el ligando de unión. En general, las reacciones de formación de enlaces relevantes se describen en Richard C. Larock, "Comprehensive Organic Transformations, a guide to functional group preparations", VCH Publishers, Inc. Nueva York (1989), y en Theodora E. Greene & Peter G.M. Wuts, "Protective Groups ion Organic Synthesis", 2a edición, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York (1991).
Más específicamente, los grupos disulfuro se pueden formar generalmente haciendo reaccionar un derivado de alquil o aril sulfoniltioalquilo, o el derivado de heteroarilditioalquilo correspondiente tal como un derivado de piridin-2-ilditioalquilo, y similares, con un derivado de alquilentiol. Por ejemplo, el derivado de alquil o aril sulfoniltioalquilo requerido puede prepararse de acuerdo con el método de Ranasinghe y Fuchs, Synth. Commun. 18 (3), 227-32 (1988). Otros métodos de preparación de disulfuros de dialquilo asimétricos se basan en una transtiolación de disulfuros de heteroaril-alquilo asimétricos, tales como 2-tiopiridinilo, 3-nitro-2-tiopiridinilo y disulfuros similares, con alquil tiol, como se describe en el documento WO 88/01622, solicitud de patente europea No. 0116208A1, y la patente de los Estados Unidos No. 4,691,024. Además, los carbonatos, tiocarbonatos y carbamatos generalmente se pueden formar haciendo reaccionar un compuesto sustituido con hidroxilo, un compuesto sustituido con tio o un compuesto sustituido con amina, respectivamente, con un derivado de alcoxicarbonilo activado que tiene un grupo saliente adecuado.
Ejemplos
Los compuestos descritos en este documento pueden prepararse mediante métodos convencionales de síntesis orgánica. Además, los compuestos descritos en este documento pueden prepararse como se indica a continuación. A menos que se indique lo contrario, todos los materiales y reactivos de partida están disponibles a través de proveedores comerciales. Todos los materiales de partida de aminoácidos se adquirieron a través de Chem-Impex Int (Chicago, IL). Los espectros de RMN de 1H se obtuvieron usando una criosonda Bruker de 500 MHz, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1A. Síntesis general de compuestos intermedios inhibidores de PSMA para conjugación. Ilustrado por la síntesis específica del derivado de DUPA 1 -terc-butil éster del ácido 2-[3-(1,3-Bis-terc-butoxicarbonil-propil)-ureido]-pentanodioico (I).
Esquema 2.1
Figure imgf000028_0001
Peso molecular: 488,57
SK09. A una mezcla de clorhidrato de di-terc-butiléster de L-glutamato (1.0 g, 3.39 mmol) y trifosgeno (329.8 mg, 1.12 mmol) en CH2Cl2 (25.0 mL) enfriada a -78 °C, se le añadió trietilamina (1.0 mL, 8.19 mmol). Después de agitar durante 2 h a -78 °C bajo atmósfera de nitrógeno, se añadió una mezcla de L-Glu(OBn)-O-terc-Bu (1.2 g, 3.72 mmol) y trietilamina (600 j L, 4.91 mmol) en CH2CI2 (5.0 mL). Se dejó que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente durante un período de 1 hora y continuó agitándose a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción lavado con HCl 1 N, salmuera y se secó sobre Na2SO4. El producto crudo se purificó usando cromatografía ultrarrápida (hexano: EtOAc = 1:1, Rt = 0.67) para producir SK09 (1.76 g, 90.2%). C30H46N2O9 ; PM = 578.69 g/mol; aceite incoloro; RMN de 1H (CDCb) 81.43 (s, 9H, CH3-tBu); 1.44 (s, 9H, CH3-tBu); 1.46 (s, 9H, CH3-tBu); 1.85 (m, 1H, Glu-H); 1.87 (m, 1H, Glu-H); 2.06 (m, 1H, Glu-H); 2.07 (m, 1H, Glu-H); 2.30 (m, 2H, Glu-H); 2.44 (m, 2H, Glu-H); 4.34 [s (ancho), 1H, aH]; 4.38 [s (ancho), 1H, a-H]; 5.10 (s, 2H, CH2-Ar); 5.22 [s (ancho), 2H, Urea-H); 7.34 (m, 5H, Ar-H), RMN de 13C (CDCb) 8 28.16; 28.25; 28.54; 28.60; 30.52; 31.73; 53.13; 53.22; 66.58; 80.71; 82.25; 82.35; 128.39; 128.71; 136.03; 156.96; 172.01; 172.16; 172.65; 173.13: CI-MS = 579 (M+H)+, ESI-MS = 579 (M+H)+, 601 (aducto de M+Na).
SK23. A una solución del compuesto SK09 (250 mg, 432 mmol) en CH2O 2 , se le añadió Pd/C al 30% (50 mg). La mezcla de reacción se hidrogenó a 1 atm, temperatura ambiente durante 24 h. Pd/C se filtró a través de una almohadilla de Celite y lavado con CH2Cb. El producto crudo se purificó usando una cromatografía ultrarrápida (hexano: EtOAc = 40:60, Rt = 0.58) para producir s K23 (169 mg, 80.2%). C23H40N2O9 ; PM = 488.57 g/mol; aceite incoloro; RMN de 1H (CDCb) 81.46 (m, 27H, CH3-tBu); 1.91 (m, 2H,Glu-H); 2.07 (m, 1H, Glu-H); 2.18 (m, 1H, Glu-H); 2.33 (m, 2H, Glu-H); 2.46 (m, 2H, Glu-H); 4.31 (s (ancho), 1H, aH); 4.35 (s (ancho), 1H, a-H); 5.05 (t, 2H, Urea-H); CI-MS = 489 (M+H)+, ESI-MS = 489 (M+H)+, 511 (aducto de M+Na), 487 (M-H)\
Ejemplo 1B. Síntesis general de compuestos intermedios inhibidores de PSMA para conjugación. Ilustrado por la síntesis específica del derivado de MUPA protegido con butilo terciario di-terc-butil éster del ácido 2-[3-(1-tercbutoxicarbonil-2-mercapto-etil)-ureido]-pentanodioico (II).
Esquema 2.2
Figure imgf000029_0001
SK15. A una mezcla de clorhidrato de di-terc-butiléster de L-glutamato (200 mg, 0.676 mmol) y trifosgeno (67 mg, 0.228 mmol) en CH2Cl2 (5.0 mL), enfriada a -78 °C, se le añadió trietilamina (50 j L, 0.410 mmol). Después de agitar durante 2 h a -78 °C bajo atmósfera de nitrógeno, se añadió una mezcla de D-Cys(Fm)-OtBu (291.4 mg, 0.774 mmol) y trietilamina (30 j L, 240 mmol) en CH2Cl2 (1.0 mL). Se dejó que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente durante un período de 1 hora y continuó agitándose a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción lavado con HCl 1 N, salmuera y se secó sobre Na2SO4. El producto crudo se purificó usando una cromatografía ultrarrápida (hexano: EtOAc = 50:50, Rt = 0.6) para producir s K15 (374 mg, 86.4%). C35 H48 N2 O7 S; PM = 640.83 g/mol; aceite de color amarillo pálido; RMN de 1H (CDCl3) 81.45 (s, 27H, CH3-tBu); 1.88 (m, 1H, Glu-H); 2.10 (m, 1H, Glu-H); 2.32 (m, 2H, Glu-H); 2.97 (m, 2H, Fm-CH2); 3.13 (m, 2H, Cys-H); 4.09 (t, 1H, Fm-H); 4.38 (m, 1H, aH); 4.66 (m, 1H, a-H); 5.55 (d, 1H, Urea-H); 5.67 (d, 1H, Urea-H); 7.30 (q, 2H, Ar-H); 7.36 (q, 2H, Ar-H); 7.73 (m, 4H, Ar-H), RMN de 13C (CDCb) 828.05; 28.14; 28.42; 31.64; 36.27; 37.25; 53.07; 53.73; 80.51; 81.98; 82.42; 119.85; 124.95; 125.09; 127.09; 127.51; 141.09; 145.99; 156.76; 170.80; 172.15; 172.43; CI-MS = 641 (M+H)+, ESI-MS = 641 (M+H)+.
Ejemplo 2A. Síntesis general de conjugados del agente de formación de imágenes de PSMA. Ilustrado por la síntesis del compuesto enlazador de 14 átomos SK28.
Esquema 2.3
Figure imgf000030_0001
SK28 se sintetizó usando la síntesis estándar de péptidos en fase sólida (SPPS) de fluoroenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) a partir de la resina Fmoc-Cys (Trt)-Wang (Novabiochem; Catálogo # 04-12-2050). SK28 se purificó usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C i810 |jm; 19 x 250 mm) A = 0.1 de TFA, B = Acetonitrilo (ACN); A = 257 nm; gradiente de disolvente: 5% de B a 80% de B en 25 minutos, lavado con 80% de B 30 minutos, (61%). Los compuestos purificados se analizaron usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C18 5 jm ; 3.0 x 15 mm); A = 0.1 de TFA, B = ACN; A = 257 nm, 5% de B a 80% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos. C47H65N2O17S; PM = 1060.13 g/mol; sólido de color blanco; Rt = 7.7 min; RMN de 1H (DMSO-d6/D2O) 8 0.93 (m, 2H); 1.08 (m, 5H); 1.27 (m, 5H); 1.69 (m, 2H); 1.90 (m, 2H); 1.94 (m, 2H); 2.10 (m, 2H); 2.24 (q, 2H); 2.62 (m, 2H); 2.78 (m, 4H); 2.88 (dd, 1H); 2.96 (t, 2H); 3.01 (dd, 1H); 3.31 (dd, 1H); 3.62 (dd, 1H); 3.80 (q, 1H, aH); 4.07 (m, 1H, aH); 4.37 (m, 1H, aH); 4.42 (m, 2H, aH); 4.66 (m, 1H, aH); 7.18 (m, 10H, Ar-H): LC-MS = 1061 (M+H)+; ESI-MS = 1061 (M+H)+.
Ejemplo 2AA. El siguiente compuesto de ejemplo se sintetizó mediante un proceso análogo.
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Ejemplos 2B-2E. Los siguientes compuestos se sintetizaron de acuerdo con los procesos descritos en este documento usando Fmoc SPPS a partir de la resina Fmoc-Cys(Trt)-Wang (Novabiochem; Catálogo # 04-12-2050), y se purificaron usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra Ci8 10 pm; 19 x 250 mm) y analizados mediante HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C185 pm; 3.0 x 15 mm):
Figure imgf000031_0002
SK60 (enlazador de 0 átomos): gradiente de disolvente A = 0.1 de TFA, B = ACN; A = 220 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 50% de B en 25 minutos, lavado con 80% de B durante 30 minutos (75.3%). C21H32N6O14S; PM = 624.58 g/mol; sólido de color blanco; Rt = 6.3 min; RMN de 1H (DMSOd6/D2O) 61.70 (m, 2H); 1.92 (m, 2H); 2.17 (m, 2H); 2.23 (m, 2H); 2.57 (m, 1H); 2.77 (m, 4H); 3.45 (dd, 1H); 3.54 (dd, 1H); 3.83 (t, 1H, aH); 4.06 (m, 1H, aH); 4.38 (m, 1H, a-H); 4.63 (m, 1H, a-H); ESI-MS = 625 (M+H)+
Figure imgf000031_0003
SK62 (enlazador de 7 átomos): gradiente de disolvente A = 0.1 de TFA, TFA, B = ACN; A = 220, 257 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 50% de B en 25 minutos, lavado con 80% de B durante 30 minutos, (72%). C35H48N8O18S; PM = 900.86 g/mol; sólido de color blanco; Rt = 8.2 min; RMN de 1H (DMOS-d6/D2O) 61.62 (m, 1H);1.70 (m, 2H); 1.79 (m, 1H); 1.90 (m, 2H); 2.09 (t, 2H); 2.16 (m, 2H); 2.24 (m, 2H); 2.60 (m, 1H); 2.75 (m, 4H);2.81 (m, 1H); 2.97 (m, 1H); 3.33 (dd, 1H); 3.60 (dd, 1H); 3.81 (t, 1H, aH); 4.07 (m, 2H, aH); 4.33 [m, 1H, a-H]; 4.39 (t, a-H); 4.65 (m, 1H, a-H); 7.20 (m, 5H, Ar-H); ESI-MS = 901 (M+H)+.
Figure imgf000031_0004
SK38 (enlazador de 16 átomos): gradiente de disolvente A = NH4OAC 10 mM, B = ACN; A = 257 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 80% de B en 25 minutos, lavado con 80% de B durante 30 minutos, (63%). C43H63N9O19S, PM = 1042.07 g/mol; sólido de color blanco; Rt = min; RMN de 1H (DMSOd6/D2O) 80.94 (m, 2H); 1.08 (m, 5H); 1.27 (m, 5H); 1.66 (m, 2H);1.70 (m, 2H); 1.79 (m, 1H); 1.90 (m, 2H); 2.09 (t, 2H); 2.74 (m, 2H); 2.84 (m, 1H); 2.95 (t, 3H); 3.07 (d, 2H); 3.23 (m, 1H); 3.43 (dd, 1H); 3.52 (dt, 1H); 3.78 (m, 1H, aH); 3.81 (m, 1H, aH); 3.88 (m, 1H, aH); 4.11 (m, 1H, aH); 4.39 [m, 2H, a-H]; 4.65 (m, 1H, a-H); 7.14 (m, 1H, Ar-H); 7.21 (m, 4H, Ar-H): ESI-MS = 1043 (M+H)+.
Figure imgf000032_0001
SK57 (enlazador de 24 átomos): gradiente de disolvente A = 0.1 de TFA, B = ACN; A = 257 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 50% de B en 25 minutos, lavado con 80% de B durante 30 minutos, (56%). C45H70N8O22S, PM = 1107.14 g/mol; sólido incoloro; RMN de 1H (DMSO-d6/D2O) 8 1.66 (m, 2H); 2.07 (m, 4H); 2.31 (t, 1H); 2.43 (m, 1H); 2.77 (m, 2H); 2.98 (dd, 1H); 3.14 (t, 2H); 3.24 (d, 1H); 3.40 (m, 4H, PEG-H); 3.46 (s, 24H, PEG-H); 3.78 (t, 1H); 3.81 (t, 1H); 4.03 (m, 1H, aH); 4.40 (m, 2H, a-H); 7.16 (m, 1H, Ar-H); 7.22 (m, 4H, Ar-H): ESI-MS = 1108 (M+H)+.
Ejemplo 2F. El siguiente compuesto puede sintetizarse de acuerdo con los procesos descritos en este documento.
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(enlazador de 9 átomos)
Ejemplo 3A. Proceso general para agregar radionúclidos al grupo quelante. Ilustrado para el radiomarcado de SK28 con 99mTc para preparar SK33.
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Preparación de kits de formulación de SK28. Se añadió agua filtrada Millipore de grado HPLC (50 mL) a una botella de 100 mL y se purgó con argón durante al menos 10 minutos. El dihidrato de a-D-glucoheptonato de sodio (800 mg) se disolvió en agua purgada con argón (5 mL). El cloruro de estaño dihidratado (10 mg) se disolvió en HCl 0.02 M (10 mL) mientras burbujeaba argón. Se añadió cloruro estanoso (0.8 mL) a la solución de glucoheptonato de sodio bajo atmósfera de argón. Se añadió SK28 (1.4 mg) a la solución de glucoheptonato de sodio/cloruro estanoso bajo atmósfera de argón. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 6.8 ± 0.2 usando NaOH 0.1 N. Se añadió agua purgada con argón (5.2 mL) a la mezcla de reacción para obtener un volumen total de 10 mL. Se dispensó 1.0 mL de mezcla de reacción a cada vial (10 viales) en atmósfera de argón y se liofilizó durante 36-48 h. Los viales se sellaron con tapones de goma y sellos de aluminio bajo atmósfera de argón para hacer kits de formulación de SK28. Los viales del kit de formulación se almacenaron a -20 °C hasta su uso.
Marcación de SK28 con 99mTc. El radiomarcaje de SK28 con 99mTc puede realizarse de acuerdo con los procedimientos publicados. Un vial de formulación se calentó a temperatura ambiente durante 10 minutos y se calentó en un baño de agua hirviendo durante 3 minutos. Luego, se inyectaron 15 mCi de pertechnetato de sodio 99mTc (1.0 mL) y se extrajo un volumen igual de gas del vial para normalizar la presión. El vial se calentó en el baño de agua hirviendo durante 15-20 minutos y luego se enfrió a temperatura ambiente antes de usarlo en el experimento. La pureza radioquímica se analizó mediante TLC radioactiva (>98%), que mostró isómeros sin y anti del compuesto radiomarcado (SK33/SK28-99mTc).
Ejemplos 3B-3E. Los siguientes ejemplos se prepararon de acuerdo con los procesos descritos en el presente documento (se obtuvieron los isómeros sin y anti; solo se muestra el isómero sin):
Figure imgf000033_0002
SK60-99m Tc (enlazador de 0 átomos, 1.0 mg),
SK62-99mTc (enlazador de 7 átomos, 1.0 mg),
Figure imgf000034_0001
SK38-99mTc (enlazador de 16 átomos, 1.4 mg)
Figure imgf000034_0002
SK57-99m Tc (enlazador de 24 átomos, 1.8 mg).
Ejemplo 3F. El siguiente compuesto puede sintetizarse de acuerdo con los procesos descritos en este documento.
Figure imgf000034_0003
(enlazador de 9 átomos)
Ejemplo 4. Síntesis general de conjugados de agentes de formación de imágenes de PSMA ilustrados para SK59 usando resina universal PSMA (DUPA), un enlazador de 2 átomos y FITC. Este conjugado también puede usarse para detectar células tumorales circulantes en pacientes con cáncer de próstata.
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1M HOBten uCM/TFE (1 ;11
a la resina hinchada en DCM
Figure imgf000035_0002
Síntesis de resina universal del PSMA y SK59. La resina universal del ligando del PSMA (DUPA) se sintetizó usando resina Universal NovaTagMR (Novabiochem; Catálogo # 04-12-3910). El grupo Fmoc se desprotegió usando 20% de piperidina/DMF (N,N-dimetilformamida), después de hinchar la resina con d Cm (CH2Cb) y DMF. DUPA protegido con terc-butilo se acopló usando HATU [hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,3,3-tetrametiluronio] y DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) en DMF. El Mmt colgante (4-metoxitritilo) se eliminó con HOBT 1 M (1-hidroxibenzotriazol) en DCM/TFE (trifluoroetanol). El compuesto intermedio de resina puede lavarse con DMF y usarse inmediatamente en etapas de síntesis posteriores o lavarse con DCM/DMF y luego con MeOH, y secarse para uso posterior.
La resina universal de PSMA se hizo reaccionar con FITC disponible comercialmente (1.25 equivalentes) en presencia de DIPEA (4 equivalentes) en DMF para producir el constructo SK59 (enlazador de 2 átomos). El compuesto final se escindió de la resina usando una mezcla de TFA (ácido trifluoroacético), TIPS (triisopropilsilano) y agua. La purificación se realizó por HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C185 pm; 19 x 150 mm) A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 488 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 50% de B en 25 min, lavado con 80% de B durante 40 min, (63%). SK59 se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C185 pm; 3.0 x 15 mm); A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 488 nm, 1% de B a 50% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos; C34H33N6O13 S; PM = 751.72 g/mol; color naranja sólido, Rt = 7.2 min; ESI-MS = 752 (M+H)+; 774 (M Na)+; 750 (M-H)-.
Ejemplo 5A. Síntesis general de los conjugados de agentes de formación de imágenes de PSMA ilustrada para SK64 usando resina Universal de PSMA (DUPA), un enlazador de 16 átomos y FITC.
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La resina universal de PSMA se acopló con Fmoc-Glu-(O lBu)-OH y Fmoc-EAOA (ácido 8-aminooctonoico) usando Fmoc SPPS estándar. Después de conjugar con isotiocianato de fluoresceína (1.25 equivalentes) en presencia de DIPEA (4 equivalentes) en DMF, el compuesto SK64 (enlazador de 16 átomos) se separó de la resina usando TFA/TIPS/H2O. La purificación se realizó usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C18 5 pm; 19 x 150 mm) A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 488 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 50% de B en 25 minutos, lavado con 80% de B durante 40 minutos, (57%). SK64 se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C185 pm; 3.0 x 150 mm); A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 488 nm, 1% de B a 50% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos; C47H55N7O17S; PM = 1022.04 g/mol; color naranja sólido, Rt = 7.8 min; ESI-MS = 1022 (M+H)+; 1020 (M-H)-.
Ejemplos 5B-5C. Los siguientes compuestos se prepararon usando los procesos de síntesis descritos en el presente documento:
Figure imgf000036_0002
SK63 (enlazador de 7 átomos, C39H40N6O17, Peso molecular: 864.76) se preparó usando resina universal de PSMA y Fmoc SPPS estándar conjugado con Fmoc-Glu-(OtBu)-OH. Después del acoplamiento con FITC, los compuestos se escindieron de la resina usando un cóctel de TFA/TIPS/H2O y se purificaron con HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C185 pm; 19 x 150 mm) A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 488 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 50% de B en 25 min, lavado con 80% de B durante 40 min, (65%); se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C185 pm; 3.0 x 150 mm); A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 488 nm, 1% de B a 50% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos; SK63: C39H40N6O16S; PM = 880.83 g/mol; color naranja sólido, Rt = 6.8 min; ESI-MS = 881 (M H)+; 903 (M Na)+; 863 (M-H)-.
Figure imgf000037_0001
Se preparó SK58 (enlazador de 24 átomos, C49H62N6O20S, Peso molecular: 1087.11) usando resina universal de Ps Ma y Fmoc Sp Ps estándar conjugado con Fmoc-(PEG)6-OH y purificado por HPLC 1% B a 60% B en 25 min, lavado con 80% de B durante 40 min (65%); se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C18 5 |jm; 3.0 x 150 mm); A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 488 nm, 1% de B a 60% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos; C49H60N6O20S; PM = 1087.11 g/mol; color naranja sólido, Rt = 7.3 min; ESI-MS = 1087 (M H)+; 1109 (M Na)+; 1085 (M-H)-.
Ejemplo 6A. Síntesis general de conjugados del agente de formación de imágenes Cys-maleimida PSMA ilustrada para SK56 usando resina Wang de PSMA (DUPA), un enlazador de 28 átomos y Oregon Green 488, en la que n = 3.
Figure imgf000037_0002
Los análogos relacionados en los que n es un número entero de 4 a aproximadamente 30 también se pueden preparar de acuerdo con los procesos descritos en este documento.
SK54 se preparó usando Fmoc SPPS estándar a partir de resina Fmoc-Cys(T rt)-Wang (Novabiochem; Catálogo # 04­ 12-2050), se purificó usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C18 10 jm ; 19 x 250 mm) A = 0.1 de TFA; B = Ac N; A = 257 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 60% de B en 25 min, lavado con 80% de B durante 40 min, (63%), y se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C185 jm ; 3.0 x 50 mm); A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 257 nm, 1% de B a 50% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos; C38H59N5O18S, PM = 905.96 g/mol; sólido incoloro; Rt = 9.2 min, LC-MS = 906.3 g/mol; ESI-MS = 906 (M H)+; 904 (M-H)-.
SK56 (enlazador de 24 átomos). El agua Milli-Q de calidad HPLC y NaHCO3 saturado se purgaron con argón durante 10 minutos. SK54 se disolvió en 1.0 mL de agua purgada con argón mientras burbujeaba argón. El pH de la solución se aumentó hasta 6.8 y se añadió a la mezcla de reacción Oregon Green 488 maleimida disuelto en 1.0 mL de THF. La reacción se controló por HPLC analítica (NH4OAc 10 mM, pH = 7.0; 1% de B a 50% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos) y la reacción se completó en 10 minutos. El THF se evaporó y la mezcla de reacción se diluyó con 5.0 mL de tampón de fosfato 7 mM. La purificación se realizó usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C18 10 jm ; 19 x 250 mm) A = tampón de fosfato 7 mM pH = 7.2, B = ACN; A = 488 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 50% de B en 25 minutos, lavado con 80% de B durante 40 minutos, (89%); y se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C185 jm ; 3.0 x 150 mm); A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 488 nm, 1% de B a 50% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos; C62H70F2N6O25S; PM = 1369.31 g/mol; color naranja sólido, Rt = 7.0 min; LC-MS = 1370.2; ESI-MS = 1391 (M Na)+. Los siguientes compuestos enlazadores de 24 átomos se prepararon de manera análoga a los descritos en el presente documento usando las síntesis generales descritas en el presente documento.
Ejemplo 6B. El siguiente compuesto conjugado AlexaFluor 488 se preparó de acuerdo con los procesos descritos en este documento comenzando con SK55, en el que n = 3.
Figure imgf000038_0001
Los análogos relacionados en los que n es un número entero de 4 a aproximadamente 30 también se pueden preparar de acuerdo con los procesos descritos en este documento.
Ejemplos 7A-7C. Los siguientes compuestos conjugados de agentes de formación de imágenes DUPA, SK51, SK45 y SK49 se prepararon de acuerdo con los procesos descritos en este documento, en los que n es 5:
Figure imgf000038_0002
SK51 (enlazador de 25 átomos, y AlexaFluor 647, PM 2300 (disponible comercialmente a través de Invitrogen)). Los análogos relacionados en los que n es un número entero de 0 a aproximadamente 12 también se pueden preparar de acuerdo con los procesos descritos en este documento.
Figure imgf000038_0003
SK45 (enlazador de 25 átomos BODIPY 505, C67H87BF2N13O20S, Peso molecular: 1475.35)
Los análogos relacionados donde n es un número entero de 0 a aproximadamente 12 también se pueden preparar de acuerdo con los procesos descritos en este documento.
Figure imgf000039_0001
SK49 (enlazador de 25 átomos-Oregon Green 488, C71H76F2N10O24, Peso molecular: 1523.48).
Los análogos relacionados en los que n es un número entero de 0 a aproximadamente 12 también se pueden preparar de acuerdo con los procesos descritos en este documento.
Síntesis del enlazador. En cada uno de los ejemplos anteriores, el enlazador se sintetizó usando Fmoc SPPS estándar a partir de resina Fmoc-Cys(Trt)-Wang (Novabiochem; Catálogo # 04-12-2050); C47H65N2O17S; PM = 1060.13 g/mol; sólido de color blanco; Rt = 7.7 min; RMN de 1H (DMSO-d6/D2O) 50.93 (m, 2H); 1.08 (m, 5 H); 1.27 (m, 5 H); 1.69 (m, 2 H); 1.90 (m, 2 H); 1.94 (m, 2 H); 2.10 (m, 2 H); 2.24 (q, 2H); 2.62 (m, 2 H); 2.78 (m, 4 H); 2.88 (dd, 1H); 2.96 (t, 2H); 3.01 (dd, 1H); 3.31 (dd, 1H); 3.62 (dd, 1H); 3.80 (q, 1H, aH); 4.07 (m, 1 H, aH); 4.37 (m, 1H, aH); 4.42 (m, 2H, aH); 4.66 (m, 1H, aH); 7.18 (m, 10H, Ar-H): LC-MS = 1061 (M+H)+; ESI-MS = 1061 (M+H)+.
Síntesis de SK51 (conjugado AlexaFluor 647), SK45 (conjugado BODIPY) y SK49 (conjugado Oregon Green 488). El agua Milli-Q de calidad HPLC y NaHCO3 saturado se purgaron con argón durante 10 minutos. El enlazador se disolvió en 1.0 mL de argón purgado mientras burbujeaba argón. El pH de la solución se aumentó a 6.8 y se disolvió AlexaFluor maleimida, BODIPY maleimida u Oregon Green 488 maleimida, respectivamente, en 1.0 mL de tetrahidrofurano (THF) y se añadió a la mezcla de reacción. El progreso de la reacción se controló por HPLC analítica (NH4OAc 10 mM, pH = 7.0; 1% de B a 50% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos) y la reacción se completó en 10 minutos. El THF se evaporó y la mezcla de reacción se diluyó con 5.0 mL de tampón de fosfato 1 mM (pH = 7.2)
Los compuestos se purificaron usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C185 |jm; 18 x 150 mm) A = tampón de fosfato 1 mM pH = 7.2, B = ACN; A = 647 o 488 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 50% de B en 25 min, lavado con 80% de B durante 40 min; y se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C18 5 jm ; 3.0 x 50 mm); A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 588 o 488 nm, 1% de B a 50% de B en 10 min, lavado con 80% de B durante 15 min.
SK51: PM ~ 2360.13 g/mol; color azul sólido, Rt = 6.7 min; (no se conoce la estructura de AlexaFluor 647);
SK45: C67H87BF2N13O20S; PM = 1475.35 g/mol; color naranja sólido, Rt = 7.6 min; LC-MS = 1475.3 (M+H)+;
SK49: C71H76F2N10O24S; PM = 1523.48 g/mol; color naranja sólido, Rt = 6.7 min; LC-MS = 1524 (M+H)+.
Ejemplo 8A. Síntesis general del compuesto intermedio del enlazador de disulfuro de PSMA para el conjugado de agente liberable, ilustrado para SK68.
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000040_0001
, ,
Figure imgf000040_0002
SK68 se sintetizó usando Fmoc SPPS estándar a partir de resina Fmoc-Cys(Trt)-Wang (Novabiochem; Catálogo # 04­ 12-2050), se purificó usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C18 10 pm; 19 x 250 mm) A = 0.1 de TFA, B = Ac N; A = 257 nm; gradiente de disolvente: 1% de B a 50% de B durante 30 minutos, lavado con 80% de B durante 40 minutos, (68%); y se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C185 pm; 3.0 x 15 mm); A = 0.1 de TFA, B = ACN; A = 257 nm, 1% de B a 50% de B en 10 min, lavado con 80% de B durante 15 min. C32H42N6O17S; PM = 814.77 g/mol; sólido blanco; Rt = 8.2 min; RMN de 1H (DMOS-d6/D2O) 8 1.70 (m, 3H); 1.90 (m, 3H); 2.10 (m, 2H); 2.17 (m, 2H); 2.23 (m, 2H); 2.36 (m, 1H); 2.59 (dd, 1H); 2.79 (m, 3H); 3.04 (dd, 1H); 4.07 (m, 2H, aH); 4.13 (m, 1H, aH); 4.37 [m, 1H, a-H]; 4.47 (m, 2H, a-H); 7.19 (m, 5H, Ar-H); 7.87 (d, Urea-NH); 8.20 (d, 1H, Urea-NH); LC-MS = 815.3 (M+H)+.
Ejemplo 8B. Síntesis general del compuesto intermedio del enlazador de disulfuro de PSMA para el conjugado de agente liberable, ilustrado para SK28L.
Figure imgf000041_0001
Se sintetizó SK28 usando Fmoc-SPPS estándar a partir de resina Fmoc-Cys(Trt)-Wang (Novabiochem; Catálogo # 04-12-2050); purificado usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra Ci8 10 pm; 19 x 250 mm) A = 0.1 de TFA, B = Ac N; A = 257 nm; gradiente de disolvente: 5% de B a 80% de B en 25 minutos, lavado con 80% de B durante 30 minutos, (61%); y se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C185 pm; 3.0 x 15 mm); A = 0.1 de TFA, B = ACN; A = 257 nm, 5% de B a 80% de B durante 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos. SK28L: C47H65N2O17S; PM = 1060.13 g/mol; sólido de color blanco; Rt = 7.7 min; RMN de 1H (DMSO-d6/D2O) 80.93 (m, 2H); 1.08 (m, 5H); 1.27 (m, 5H); 1.69 (m, 2H); 1.90 (m, 2H); 1.94 (m, 2H); 2.10 (m, 2H); 2.24 (q, 2H); 2.62 (m, 2H); 2.78 (m, 4H); 2.88 (dd, 1H); 2.96 (t, 2H); 3.01 (dd, 1H); 3.31 (dd, 1H); 3.62 (dd, 1H); 3.80 (q, 1H, aH); 4.07 (m, 1H, aH); 4.37 (m, 1H, aH); 4.42 (m, 2H, aH); 4.66 (m, 1H, aH); 7.18 (m, 10H, Ar-H): LCMS = 1061 (M+H)+; ESI-MS = 1061 (M+H)+.
Ejemplo 9A. Síntesis general para preparar conjugados unidos por disulfuro, ilustrada para el conjugado de tubulisina B SK71 (enlazador de 20 átomos).
Figure imgf000041_0002
Síntesis de EC0312. La tubulisina B (30 mg, 0.036 mmol) se disolvió en acetato de etilo (600 pL) bajo atmósfera de argón a -15 °C. Se añadieron a la mezcla de reacción cloroformiato de isobutilo (4.7 pL, 0.054 mmol) y diisopropiletilamina (13.2 pL, 0.076 mmol); la reacción se agitó a -15°C durante 45 minutos bajo atmósfera de argón. Se añadió EC0311 (13.4 mg, 0.054 mmol) disuelto en acetato de etilo (500 pL). La mezcla de reacción se agitó a -15°C durante otros 15 minutos y luego a temperatura ambiente durante 45 minutos. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó usando una columna corta (metanol al 2%-8% en CH2Cl2) para obtener EC0312 (34.4 mg, 90.5%). EC0312 se caracterizó usando RMN (Varian 300 MHz, en CDCh) y LC-MS = 1058.3 (M H)+.
Síntesis de SK71. Se purgaron agua Milli-Q de calidad HPLC y NaHCO3 saturado con argón durante 10 minutos. SK68 se disolvió en 1.0 mL de agua purgada con argón mientras se burbujeaba argón a través de la solución. El pH de la solución se aumentó hasta 6.8 usando NaHCO3 purgado con argón y se añadió EC0312 disuelto en THF (2.0 mL) a la mezcla de reacción. El progreso de la reacción se controló mediante HPLC analítica (NH4OAc 10 mM, pH = 7.0; A = 254; 1% de B a 50% de B en 10 minutos lavado con 80% de B durante 15 minutos) y la reacción se completó en 10 minutos. El THF se evaporó y la mezcla de reacción se diluyó con 5.0 mL de tampón de fosfato 2 mM. SK71 (61.3%) se purificó usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C1810 pm; 19 x 250 mm) A = tampón de fosfato 2 mM, B = ACN; A = 254 nm; 5% de B a 80% de B en 25 minutos lavado con 80% de B durante 40 minutos; y se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C185 pm; 3.0 x 15 mm); A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; A = 254 nm, 1% de B a 50% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos. C77H109N13O28S3 : PM = 1760.95 g/mol; sólido de color blanco, Rt = 7.6 min; RMN de 1H (DMSO-d6/D2O) fue consistente con la estructura de SK71; HRMS (MALDI) (m/z): (M-H)- calculado para, C77H110N13O28S3, 1758.6594; encontrado, 1758.7033; LRMS (LCMS) (m/z) : (M+H)+ calculado para 1761.9; encontrado, 1761.8; UV/Vis: Amáx = 254 nm.
Ejemplo 9B. De manera similar, el D-Cys análogo de SK71 se preparó como se describe en el presente documento.
Figure imgf000042_0001
Ejemplo 9C. Síntesis general para preparar conjugados unidos por disulfuro, ilustrada para el conjugado de tubulisina B SK77 (enlazador de 31 átomos).
HO
Figure imgf000042_0002
Cga Hi33 Ni 4O26S3
Peso molecular: 2006.32
Esquema 6.4
El agua Milli-Q de calidad HPLC y NaHCO3 saturado se purgaron con argón durante 10 minutos. SK68 se disolvió en 1.0 mL de agua purgada con argón mientras se burbujeaba argón. El pH de la solución se aumentó a 6.8 usando NaHCO3 purgado con argón y se añadió EC0312 disuelto en THF (2.0 mL) a la mezcla de reacción. El progreso de la reacción se controló mediante HPLC analítica (NH4OAc 10 mM, pH = 7.0; Á = 254; 1% de B a 50% de B en 10 minutos lavado con 80% de B durante 15 minutos) y la reacción se completó en 10 minutos. El THF se evaporó y la mezcla de reacción se diluyó con 5.0 mL de tampón de fosfato 2 mM. SK77 (61%) se purificó usando HPLC preparativa de fase inversa (Waters, xTerra C18 10 |jm; 19 x 250 mm) A = tampón de fosfato 2 mM, B = ACN; Á = 254 nm; 5% de B a 80% de B en 25 minutos lavado con 80% de B durante 40 minutos; y se analizó usando HPLC analítica de fase inversa (Waters, X-Bridge C18 5 jm ; 3.0 x 15 mm); A = NH4OAc 10 mM, B = ACN; Á = 254 nm, 1% de B a 50% de B en 10 minutos, lavado con 80% de B durante 15 minutos. C93H133N16O28S3 : PM = 2006.32 g/mol; sólido de color blanco, Rt = 7.7 min; RMN de 1H (DMSO-d6/D2O); LC-MS = 2007.0 (M+H)+.
Ejemplo 9D. De manera similar, el análogo D-Cys de SK77 se preparó como se describe en el presente documento.
Figure imgf000043_0001
Ejemplo 9E. De manera similar, el D-Cys, análogo de ácido propanoico de SK77 se preparó como se describe en el presente documento.
Figure imgf000043_0002
Ejemplos 9F-9G. Los siguientes compuestos vinblastina DUPA y camptotecina DUPA, SK37 y SK45, respectivamente, se prepararon de acuerdo con los procesos descritos en el presente documento.
Figure imgf000043_0003
SK37 (conjugado de vinblastina, C93H123N15O26S2 , Peso molecular: 1931.19) preparado con un rendimiento del 63.1%. C93H123N15O26S2 : PM = 1931.19 g/mol; sólido de color blanco, Rt = 7.7 min; RMN de 1H (DMSO-d6/D2 O); LC-MS = 1932.6 (M+H)+.
Figure imgf000043_0004
SK45 (conjugado de camptotecina, C70H83N11O23S2 , Peso molecular: 1510.60) preparado con un rendimiento del 66%. C70H83N11O23S2 : PM = 1510.60 g/mol; sólido de color blanco, Rt = 7.5 min; Rm N de 1H (DMSO-d6/D2 O); LC-MS = 1511.1 (M+H)+.
Ejemplo 9H. De manera similar, se preparó el análogo de Glu-Asp-Phe de SK37 como se describe en el presente documento.
Figure imgf000044_0001
Ejemplo 10. Los siguientes compuestos se prepararon usando los procesos de síntesis descritos en este documento: SK125 (conjugado de FITC)
Figure imgf000044_0002
SK131 (conjugado de rodamina)
Figure imgf000044_0003
SK179 (conjugado de FITC)
Figure imgf000044_0004
Conjugado de FITC
Figure imgf000044_0005
Conjugado de DyLight 680
Figure imgf000045_0001
Conjugado de DyLight 800
Figure imgf000045_0002
Conjugado del agente de PET
Figure imgf000045_0003
Conjugado del agente de PET
Figure imgf000045_0004
Conjugado del agente de PET
Figure imgf000045_0005
Conjugado de DOTA capaz de quelar, por ejemplo, 64Cu, 65Cu y similares
Figure imgf000046_0001
Conjugado DOTA capaz de quelar, por ejemplo, 64Cu, 65Cu y similares
Figure imgf000046_0002
Conjugado DTPA capaz de quelar, por ejemplo In, Ga, Ir, Yr y similares
Figure imgf000046_0003
Conjugado tripéptido capaz de quelar, por ejemplo Tc, óxidos de Tc y similares
Figure imgf000046_0004
Los ejemplos de las realizaciones anteriores pretenden ser ilustrativas de la invención, y no deben interpretarse o considerarse como limitantes de ninguna manera de la invención como se describe en el presente documento.
Ejemplos de métodos
Ejemplo 1A
Estudios de unión in vitro usando células LNCaP y SK28 (espaciador de 14 átomos). Las células LNCaP (una línea celular de cáncer de próstata humano que sobreexpresa PSMA, adquirida a través de la American Type Culture Collection (ATCC)) se sembraron en dos placas Falcon de 24 pozos (120,000 células/pozo) y se les permitió crecer en monocapas adherentes durante 48 horas en RPMI con glutamina (2 mM) (medio Gibco RPMI 1640, catálogo # 22400) más FBS al 10% (suero bovino fetal), piruvato de sodio al 1% (100 mM) y PS al 1% (estreptomicina penicilina) en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C. Las células de una placa de 24 pozos se incubaron con concentraciones crecientes de SK28-99mTc de 0 nM a 450 nM (por triplicado para cada concentración) en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C durante 1 hora. Las células de la segunda placa de 24 pozos se incubaron con PMPA 50 pM en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C durante 30 minutos, luego se incubaron con concentraciones crecientes de SK28-99mTc de 0 nM - 450 nM (por triplicado para cada concentración) en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C durante 1 hora (estudio de competición). Las células se enjuagaron tres veces con 1.0 mL de RPMI. Las células se lisaron con tampón tris, se transfirieron a viales individuales de gammagrafía y se contó la radioactividad. El gráfico de la radioactividad unida a la célula frente a la concentración del compuesto radiomarcado se usó para calcular el valor de Kd. El estudio de competición se utilizó para determinar la especificidad de unión del ligando (DUPA) al PSMA (Figura 1A).
Ejemplo 1B
Estudios de unión in vitro usando células LNCaP y SK33 (espaciador de 14 átomos). Se sembraron células LNCaP (150,000 células/pozo) en placas Falcon de 24 pozos y se les permitió formar monocapas confluentes durante 48 h. El medio gastado en cada pozo se reemplazó con medio fresco (0.5 mL) que contenía concentraciones crecientes de DUPA-99mTc en presencia (A ) o ausencia (■) de exceso de PMPA. Después de incubar durante 1 hora a 37 °C, las células se enjuagaron con medio de cultivo (2 x 1.0 mL) y tampón tris (1 x 1.0 mL) para eliminar cualquier radioactividad no unida. Después de suspender las células en tampón tris (0.5 mL), se contó la radioactividad unida a las células usando un contador gamma (Packard, Packard Instrument Company). La constante de disociación (Kd) se calculó utilizando un gráfico de radioactividad unida a las células frente a la concentración del radiotrazador mediante regresión no lineal en GraphPad Prism 4. Las barras de error representan una desviación estándar de 1 (n = 3). El experimento se realizó tres veces con resultados similares. (Figura 1B).
Ejemplo 2
Cuantificación de moléculas de PSMA en células LNCaP. Las células LNCaP se sembraron en una placa Falcon de 24 pozos y se dejaron crecer hasta monocapas adherentes durante 48 horas en RPMI (medio Gibco RPMI 1640, catálogo # 22400) más FBS al 10% (suero fetal bovino), glutárico al 1% y PS al 1% (penicilina estreptomicina) en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C. Las células se incubaron luego con concentraciones crecientes de SK28-99mTc de 0 nM - 450 nM (por triplicado para cada concentración) en una atmósfera de 5% de CO2 a 4 °C o a 37 °C durante 1 hora. Las células se enjuagaron tres veces con 1.0 mL de RPMI. Las células se lisaron con tampón tris, se transfirieron a viales individuales de gammagrafía y se contó la radiactividad. El gráfico de la radioactividad unida a la célula frente a la concentración del compuesto radiomarcado se usó para calcular el número de PSMA/ célula LNCaP. Se contó la radioactividad de una muestra de 30 nM de SK28-99mTc (20 pL). A 4 °C (para prevenir la endocitosis de PSMA), el número de moles en la muestra de 30 nM = 30 nM x 20 pL = (30 x 10-9 mol/L) x (20 x 10-6 L) = 6 x 10-13 mol. El número de átomos en la muestra de 30 nM = (6 x 10-13 mol) x (6.023 x 1023 átomo/mol) = 3.6 x 1011 átomos. El conteo de radiación de 20 pL de la muestra de 30 nM = 20477 cpm (cpm/átomo = 3.6 x 1.011/20.477 = 1.76 x 107). La radioactividad unida a las células en el punto de saturación a 4 °C = 12,000 cpm. El número de átomos en el punto de saturación = (1.76 x 107 átomos) x (12,000 cpm). El número de células/pozo = 245,000. El número de PSMA/célula a 4 °C = (2.12 x 1011)/2.45 x 105 = 864,396.4 ~ 0.9 x 106 PSMA/célula LNCaP.
La radioactividad unida a la célula en el punto de saturación a 37 °C = 33,000 cpm (aproximadamente tres veces mayor que a 4 °C). Esto muestra que el PSMA sufre endocitosis, descargando el fármaco y reciclando, similar a los receptores de la superficie celular. Véase la Figura 2.
Ejemplo 3
Estudios de unión dependiente del espaciador. Las células LNCaP se sembraron en placas Falcon de 24 pozos (120,000 células/placa) (10 placas) y se dejaron crecer hasta monocapas adherentes durante 48 horas en RPMI (medio Gibco RPMI 1640, catálogo # 22400) más FBS al 10% (suero bovino fetal), piruvato de sodio al 1% y PS al 1% (penicilina estreptomicina) en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C. Las células fueron incubadas con concentraciones crecientes de SK60-99mTc (espaciador de cero átomos), SK62-99mTc (espaciador de 7 átomos), SK28-99mTc (espaciador de 14 átomos), SK38-99mTc (espaciador de 16 átomos) y SK57-99mTc (espaciador de 24 átomos) de 0 nM - 1280 nM (por triplicado para cada concentración) en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C durante 1 hora. Además, en placas separadas, las células se incubaron con PMPA 50 pM en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C durante 30 minutos y luego se incubaron con una concentración creciente de SK60-99mTc (espaciador de cero átomos), SK62-99mTc (espaciador de 7 átomos ), SK28-99mTc (espaciador de 14 átomos), SK38-99mTc (espaciador de 16 átomos) y SK57-99mTc (espaciador de 24 átomos) de 0 nM - 1280 nM (por triplicado para cada concentración) en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C durante 1 hora (estudios de competición; datos no mostrados). Las células se enjuagaron tres veces con 1.0 mL de RPMI. Las células se lisaron con tampón tris, se transfirieron a viales individuales de gammagrafía y se contó la radioactividad. El gráfico de radioactividad unida a la célula frente a la concentración del compuesto radiomarcado se usó para calcular el valor de Kd. Se muestra el gráfico del % de saturación frente a la concentración del compuesto radiomarcado, así como el gráfico para Kd frente a la longitud del espaciador (Figura 3A y B).
Ejemplo 4
Crecimiento in vivo de células tumorales LNCaP humanas en ratones desnudos. Las células LNCaP se mantuvieron en RPMI 1640 (medio Gibco RPMI 1640, catálogo # 22400) con glutamina (2 mM), FBS al 10% (suero bovino fetal), piruvato de sodio al 1% (100 mM) y PS al 1% (penicilina estreptomicina) en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C. Se obtuvieron ratones desnudos (nu/nu) machos atímicos de cuatro a cinco semanas de edad través del NCI Charles River y se mantuvieron en un ambiente estéril. Los ratones se alojaron en jaulas de cajas de zapatos de policarbonato con tapas superiores de alambre y se mantuvieron con una dieta normal. A los ratones se les permitió aclimatarse durante una semana antes de la inoculación de las células LNCaP. Matrigel y matrigel de alta concentración (HC) se adquirieron a través de BD Biosciences. Los ratones desnudos fueron inoculados con 2.5 x 106 o 5.0 x 106 células LNCaP propagadas in vitro en Matrigel al 50% (100 pL de medio RPMI 100 pL de Matrigel) o Matrigel altamente concentrado al 50% (100 pL de medio RPMI 100 pL de Matrigel HC) para determinar las condiciones óptimas, incluido el número de células, vehículo, etc. Las células se inyectaron por vía subcutánea en cada eje axial y en cada flanco de los ratones desnudos para determinar el sitio óptimo. El volumen de cada tumor se midió en direcciones perpendiculares dos veces por semana usando un calibrador y el peso corporal se midió una vez por semana (datos no mostrados).
El volumen de cada tumor se calculó como 0.5 x L x W2, en el que L = medición del eje más largo en milímetros y W = medición del eje perpendicular a L en milímetros. Aproximadamente 5.0 x 106 células LNCaP en Matrige1HC al 50% en el eje axial produjeron tumores de 600 mm3 en 30 días. Véase la Figura 4.
Ejemplo 5
Comparación del crecimiento tumoral de células LNCaP, KB y A549 en ratones. Las células LNCaP, KB y A549 se mantuvieron en RPMI 1640 (medio Gibco RPMI 1640, catálogo # 22400) con glutamina (2 mM), FBS al 10% (suero bovino fetal), piruvato de sodio al 1% (100 mM) y PS al 1% (penicilina estreptomicina) en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 °C. Se obtuvieron ratones desnudos (nu/nu) machos de cuatro a cinco semanas de edad a través del NCI Charles River y se mantuvieron en un ambiente estéril. Los ratones se alojaron en jaulas de cajas de zapatos de policarbonato con tapas superiores de alambre y se mantuvieron con una dieta normal. A los ratones se les permitió aclimatarse durante una semana antes de la inoculación de las células.
Para la inoculación de células tumorales, se inyectaron subcutáneamente 5.0 x 106 células LNCaP en Matrigel concentrado al 50%, 1.0 x 106 células KB en medio RPMI, o 1,0 x 106 células A549 en medio RPMI por vía subcutánea en el eje axial derecho (algunos animales fueron inyectados en ambos) de los ratones desnudos. El volumen de cada tumor se midió en dos direcciones perpendiculares dos veces por semana usando un calibrador (véanse las Figuras 5A y 5B) y el peso corporal se midió una vez por semana (datos no mostrados). El volumen de los tumores se calculó como 0.5 x L x W2, en la que L = medición del eje más largo en milímetros y W = medición del eje perpendicular a L en milímetros.
Ejemplo 6A
Formación de imágenes in vivo de tumores en ratón usando PSMA-99mTc. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de entre 500 y 600 mm3, los compuestos marcados con 99mTc (por ejemplo, SK28-99mTc, SK60-99mTc, etc.) preparados como se describió, se administraron mediante inyección intraperitoneal (subcutánea). Cuatro horas después, los animales se sacrificaron y se extrajo sangre con un punzón cardiovascular y se transfirió a viales de gammagrafía individuales por cada animal. Los experimentos de formación de imágenes se llevaron a cabo utilizando un generador de imágenes Kodak o una cámara de gammagrafía (Figuras 6A, 6B, 6C, 7A, 7B y 7C). [Nota: PMPA se inyectó 30 minutos antes de inyectar SK28 -99mTc. Además de la absorción en las masas cancerosas, la distribución SK28-99mTc se limitó a los riñones (Figuras 6A, 6B y 6C). Ambos ratones (Figuras 7A, 7B y 7C) fueron inyectados con SK60-99mTc y la distribución se limitó principalmente a los riñones (sin absorción por el tumor incluso después de proteger ambos riñones)].
Las Figuras 6A, 6B y 6C muestran imágenes de ratones con tumores LNCaP humanos usando SK28-99mTc (espaciador de 14 átomos radiomarcado). Las Figuras 6A-6C representan 3 conjuntos separados de ratones: la imagen de la izquierda muestra imágenes de luz blanca y la imagen de la derecha muestra una superposición de la radioimagen con la imagen de luz blanca de ratones con tumores LNCaP de imágenes obtenidas con una cámara Kodak 4 horas después de la inyección subcutánea (administrada mediante inyección intraperitoneal) de 1 ng/kg de SK28-99mTc sin [ratón izquierdo en cada conjunto de imágenes] y con 50 mg/kg de PMPA [ratón derecho en ambos conjuntos de imágenes] para bloquear PSMA (como competidor). La Figura 6D muestra un estudio de un solo ratón para tumores LNCaP de imágenes obtenidas usando el generador de imágenes Kodak 4 horas después de la inyección subcutánea (administrada por vía intraperitoneal) de 1 ng/kg de SK28-99mTc que muestra en la imagen de la izquierda una superposición de radioimagen con protección renal e imagen de luz blanca sin protección y en la imagen de la derecha una superposición de radioimagen con protección del riñón e imagen de rayos X sin protección.
Ejemplo 6B
Formación de imágenes in vivo de tumores en ratón usando dupa-99mTc. Para establecer aún más la especificidad de nuestros conjugados de DUPA para las células de cáncer de próstata, se inyectó DUPA-99mTc por vía intraperitoneal (i.p.) en ratones atímicos desnudos con tumores LNCaP en sus hombros. Después de 4 h para permitir la eliminación del conjugado no unido, se obtuvo una imagen mediante gammagrafía de la distribución de DUPA-99mTc retenida. Como se observa en la Figura 7D (a) y 7D (c), el radiotrazador 99mTc dirigido se acumuló principalmente en el tumor LNCaP positivo para PSMA, con poca o ninguna radioactividad en otros tejidos, excepto los riñones. Es importante destacar que la captación renal puede ser peculiar del ratón, ya que los análisis inmunohistoquímicos y por RT-PCR sugieren que la expresión de PSMA es alta en los riñones murinos pero mínima en los riñones humanos. La especificidad in vivo del agente de formación de imágenes dirigido a PSMA se probó adicionalmente mediante la administración previa de un exceso de PMPA para bloquear todos los sitios de PSMA antes de la administración de DUPA-99mTc. Como se muestra en la Figura 7D (b) y 7D (d), los tumores LNCaP bloqueados no muestran absorción de DUPA-99mTc, lo que confirma la especificidad del conjugado de DUPA para PSMA in vivo . Para documentar aún más esta especificidad, el radiotrazador también se administró a dos modelos de xenoinjerto de ratón negativos para PSMA [A549 (una línea celular de cáncer de pulmón humano) y KB (una línea celular de cáncer de nasofaringe humano)], y nuevamente se tomaron imágenes de todo el cuerpo. Como se anticipó, no se observó radioactividad en los tumores KB o A549 (Figs. 7D (e) y 7D (f)), incluso después de que se realizó la protección de los riñones para permitir la detección de niveles bajos de DUPA-99mTc en otros tejidos. Por lo tanto, estos estudios confirman que se produce muy poca unión de DUPA-99mTc a sitios no relacionados con PSMA in vivo.
La Figura 7D muestra las imágenes de todo el cuerpo de xenoinjertos de tumor sólido en ratones nu/nu tomadas 4 h después de la inyección de 150 |jCi de DUPA-99mTc. Superposición de radioimágenes de todo el cuerpo en imágenes de luz blanca de ratones con tumores LNCaP que fueron tratados con DUPA-99mTc en ausencia 7D (a, c) o presencia 7D (b, d) de exceso molar de PMPA de 100 veces. También se obtuvieron superposiciones de radioimágenes en imágenes de luz blanca de ratones con un tumor A549 7D (e) o un tumor KB 7D (f) que fueron tratados de manera similar con DUPA-99mTc. Excepto en las imágenes 7D (a) y 7D (b), los riñones estaban protegidos con almohadillas de plomo. Todas las imágenes se tomaron usando una estación de formación de imágenes Kodak 4 h después de una inyección intraperitoneal de DUPA-99mTc. Las flechas indican xenoinjertos de tumor sólido. Se obtuvieron imágenes similares en los 5 ratones en cada grupo de tratamiento.
Ejemplo 7A
Estudios de biodistribución. Después de la obtención de imágenes, todos los animales fueron sometidos a disección aproximadamente 6-7 h después de administrar SK28-99mTc o SK60-99mTc [u otros compuestos radiomarcados (datos no mostrados)] y se transfirieron los órganos (sangre, tumor, corazón, hígado, riñón, bazo, piel, músculo, etc.) a viales de gammagrafía individuales para cada animal y se contó la radiactividad. Nota: se recogieron muestras de sangre (utilizando un punzón cardíaco) inmediatamente después de sacrificar al animal y antes de obtener imágenes del animal. El gráfico de la relación de tumor/tejido en cpm/g frente al tejido se usó para determinar la biodistribución del agente de formación de imágenes (Figuras 8A y 8B).
Ejemplo 7B
Estudios de biodistribución de DUPA-99mTc en ratones nu/nu con tumores LNCaP, A549 o KB. Los ratones portadores de tumor se sacrificaron 4 h después de la inyección intraperitoneal de DUPA-99mTc (50 pmol/kg, 150 |jCi) y se contó la radiactividad acumulada en el tejido utilizando un contador gamma. El porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido húmedo se calculó como se describe en los Métodos. Los datos se obtuvieron en un solo experimento y las barras de error representan sd (n = 5). Tumores LNCaP (barras rellenas), tumores LNCaP en ratones previamente inyectados con un exceso molar de 100 veces de PMPA (barras sin relleno), tumores A549 (barras sombreadas), tumores KB (barras sombreadas horizontalmente) (Figura 8C).
Ejemplo 8
Toxicidad de dosis única en ratones vivos. La administración de SK71 fue con una dosis única como se indica. Los datos muestran que la MTD para el conjugado es de aproximadamente 4.5 pmol/kg para una dosis única (véase la Figura 9A).
Ejemplo 9
Toxicidad de dosis múltiples en ratones vivos. SK71 se administró en 5 dosis en días alternos (L, Mc, V, L, Mc). Los datos muestran que la MTD para SK71 es de 2 pmol/kg para dosificación múltiple, y que el conjugado es efectivo en tumores LNCaP (ratones utilizados para MTD 2 semanas después de la implantación de células LNCaP antes de iniciar el tratamiento). Los 4 ratones en el grupo de control con solución salina tenían tumores grandes, mientras que ningún ratón en los dos grupos tratados tenía tumores visibles después de 18 días de tratamiento (véase la Figura 9B).
Ejemplo 10
Estudio de eficacia comparado con el grupo control y el grupo de competición. Los animales fueron tratados con (a) el conjugado SK71 administrado en 5 dosis en días alternos (L, Mc, V, L, Mc) a razón de 1 mol.kg, y se compararon con (b) animales tratados con vehículo (Figura 10B), y (c) animales tratados con el conjugado junto con PMPA. El tratamiento a razón de 1 pmol/kg muestra una disminución sucesiva en el tamaño del tumor (tamaño del tumor inicial de aproximadamente 250 mm3) durante el curso del tratamiento. Con la dosis más baja de 1 pmol/kg que se muestra en la Figura 10A, los volúmenes tumorales se recuperaron al cesar la dosificación. A la dosis más alta de al menos 2 (pmol/kg, se observó la desaparición completa del tumor durante el período de prueba. Los experimentos de competición (véase la Figura 10C) indican que el tratamiento exitoso del tumor implantado está relacionado con el direccionamiento selectivo o específico de la liberación mediada por PSMA.
Ejemplo 11
Estudio de eficacia (1 micromol/kg cada dos días durante 10 días; es decir, 5 dosis). Los datos (véase la Figura 11) indican que los tumores en animales tratados disminuyeron de tamaño durante la duración del tratamiento.
Ejemplo 12
Evaluación de un agente terapéutico dirigido a PSMA in vitro. Análisis de SK71 (Figura 12A), SK77 (Figura 12B), SK37 (Figura 12C) y SK45 (Figura 12D), toxicidad para las células LNCaP en cultivo. Las células LNCaP se pulsaron durante 2 h con concentraciones crecientes de SK71 o SK77 en presencia (A ) o ausencia (■) de exceso molar de PMPA de 100 veces. Después de 2 lavados, las células se incubaron 66 h adicionales en medio fresco a 37 °C. La viabilidad celular se analizó luego usando el ensayo de incorporación de [3H]-timidina, como se describe en el presente documento. Los datos se obtuvieron en un solo experimento y las barras de error representan la s.d. (n = 3 pozos por concentración).
Ejemplo 13
Potencia in vivo. Efecto de SK71 sobre el crecimiento de tumores subcutáneos (Figura 13A y 13C, y sobre los pesos de los ratones tratados (Figura 13B y 13D). Las células LNCaP en Matrigel de HC se implantaron por vía subcutánea en los hombros de ratones nu/nu machos. Una vez que los tumores alcanzaron ya sea 100 mm3 (13A, 13B) o 330 mm3 (13C, 13D) en volumen, los animales fueron tratados con SK71 [1.5 pmol/kg (a, b) o 2.0 pmol/kg (c, d)]. Ratones tratados (■), ratones no tratados (•), ratones tratados previamente inyectados con exceso molar de 100 veces (13A, 13B) o 30 veces (13C, 13D) de PMPA (A y ▼, respectivamente). Los datos se obtuvieron en un solo experimento y las barras de error representan la sd [n = 4 (13A, 13B) o 3 (13C, 13D)]. Figuras 10. Potencia de SK71 in vivo.
Potencia in vivo. Efecto de SK77 sobre el crecimiento de tumores subcutáneos (Figura 14A) y sobre los pesos de los ratones tratados (Figura 14B). Las células LNCaP en Matrigel de HC se implantaron por vía subcutánea en los hombros de ratones nu/nu machos. Una vez que los tumores alcanzaron un volumen de 100 mm3, los animales fueron tratados con SK77 (2 pmol/kg). Ratones no tratados (■), ratones tratados (▼). Los datos se obtuvieron en un solo experimento y las barras de error representan sd (n = 4 ratones/grupo).

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que comprende un ligando del PSMA (B), un enlazador (L) y un fármaco (D), en el que el enlazador está unido covalentemente al medicamento y el enlazador está unido covalentemente al ligando, y en el que el enlazador comprende una cadena de al menos siete átomos o de al menos aproximadamente 10 angstroms de longitud,
en el que el ligando
(a) comprende un ácido fosfónico o un ácido fosfínico, o
(b) es una urea de dos aminoácidos.
2. El conjugado de la reivindicación 1b, en el que el ligando es una urea de un ácido amino dicarboxílico y otro ácido amino dicarboxílico.
3. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una porción de la cadena de átomos está ciclada con un fragmento divalente.
4. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el enlazador comprende un péptido.
5. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el enlazador comprende uno o más residuos de fenilalanina, cada uno de los cuales está independientemente opcionalmente sustituido.
6. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enlazador comprende al menos un enlazador liberable.
7. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enlazador comprende un disulfuro o un carbonato.
8. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enlazador comprende un enlazador liberable distinto de un disulfuro.
9. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el enlazador no es liberable.
10. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como dependiente de la reivindicación 1 (a), en el que el ligando es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en
Figure imgf000051_0001
o
reivindicación 1 (b), en el que el ligando es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en
en el que Q es un ácido amino dicarboxílico, n y m se seleccionan cada uno de un número entero entre 1 y aproximadamente 6, y (*) representa el punto de unión para el enlazador L.
11. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el fármaco se selecciona del grupo que consiste en alcaloides de la vinca, taxanos, tubulisinas, mitomicinas, epotilonas y camptotecinas.
12. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el fármaco es un agente de formación de imágenes de PET o un agente de formación de imágenes seleccionado del grupo que consiste en Oregon Green, AlexaFluor, fluoresceínas, agentes fluorescentes BODIPY, rodaminas, agentes fluorescentes DyLight y un compuesto de la fórmula
Figure imgf000052_0001
en la que R se selecciona independientemente en cada caso de H, alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, heteroarilalquilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido, en la que un R incluye un heteroátomo, tal como nitrógeno, oxígeno, o azufre, y es el punto de unión del enlazador L.
13. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el fármaco es un isótopo radiactivo de un metal, coordinado a un grupo quelante.
14. Un conjugado de la fórmula.
Figure imgf000052_0002
15. Un conjugado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, opcionalmente con un componente seleccionado del grupo que consiste en vehículos, diluyentes y excipientes, y combinaciones de los mismos, para usar en un método de tratamiento de una enfermedad que implica una población de células patógenas que expresa PSMA.
16. Uso de un conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, opcionalmente con un componente seleccionado del grupo que consiste en vehículos, diluyentes y excipientes, y combinaciones de los mismos, en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad que involucra una población de células patógenas que expresa PSMA.
17. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un componente seleccionado del grupo que consiste en vehículos, diluyentes y excipientes, y combinaciones de los mismos.
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