ES2763315T3 - Antagonistas del canal de potasio KV1.3 - Google Patents

Antagonistas del canal de potasio KV1.3 Download PDF

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Abstract

Compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 25.

Description

DESCRIPCIÓN
Antagonistas del canal de potasio KV1.3
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos que son capaces de unirse selectivamente a e inhibir la actividad del canal de potasio Kv1.3. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos y al uso de dichos compuestos y dichas composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la prevención de enfermedades autoinmunitarias, obesidad, parodontitis y/o rechazo de trasplante de tejido.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades autoinmunitarias son un grupo de más de 80 enfermedades distintas que surgen cuando la respuesta inmunitaria de un huésped no puede distinguir antígenos foráneos de las propias moléculas (autoantígenos), provocando de ese modo una respuesta inmunitaria aberrante. Las causas de las enfermedades autoinmunitarias son todavía desconocidas, sin embargo se piensa que están provocadas por una combinación de factores genéticos y medioambientales.
Los trastornos inmunoinflamatorios como la esclerosis múltiple, psoriasis y artritis reumatoide comparten un principio patógeno común. Su patogenia se caracteriza por células T de memoria autorreactivas que median en procesos infamatorios crónicos tras su estimulación. En particular, la exposición antigénica repetida, que se produce habitualmente en enfermedades autoinmunitarias, provoca células de memoria central longevas (Tcm), que, como las células vírgenes, se dirigen a los ganglios linfáticos para encontrarse con su antígeno relacionado, para diferenciarse en células de memoria efectoras efímeras (Tem) que no necesitan dirigirse a los ganglios linfáticos para la activación inducida por antígeno. Las células TEM activadas cambian a efectores de TEM, que migran rápidamente a sitios de inflamación en los que producen grandes cantidades de citocinas proinflamatorias. Las células Tem CD8+ producen además altas cantidades de perforina y son por tanto altamente destructivas.
Los tratamientos actuales para enfermedades autoinmunitarias incluyen el uso sistémico de fármacos antiinflamatorios y agentes inmunosupresores e inmunomoduladores potentes. Sin embargo, estos fármacos provocan numerosos efectos secundarios adversos incluyendo por ejemplo supresión del sistema inmunitario en su totalidad, con el riesgo de infección y neoplasia. Además, en algunos pacientes dichos fármacos son incapaces de inducir remisiones clínicamente significativas.
Los canales iónicos están presentes en las membranas de todas las células y por tanto también de las células inmunitarias. Se sabe que determinados péptidos de toxinas seleccionan como diana canales iónicos. El documento US 2009/0318341 A1 describe una composición de materia que comprende un análogo de péptido OSK1.
El canal de K+ Kv1.3 activado por voltaje es uno de los 76 canales de potasio en el genoma humano y se ha encontrado que está presente en linfocitos T humanos. Todas las células T humanas expresan el canal Kv1.3 así como el KCa3.1 activado por calcio, que juntos proporcionan el flujo de salida de potasio de contrapeso para el flujo de entrada de calcio que es necesario para la activación y proliferación de células T. El número de canales expresados por una célula dada depende de su estado de activación y diferenciación. Las células Tem CD4+ y c D8+ activadas por mitógeno o antígeno presentan una expresión aumentada de aproximadamente 4 a 5 veces de Kv1.3, mientras que las células Tcm o vírgenes regulan por incremento el canal KCa3.1 para regular el potencial de membrana y la señalización de Ca2+ en el estado activado.
En vista de esta sobreexpresión diferencial en células Tem, el canal Kv1.3 constituye una nueva diana terapéutica específica de células Tem prometedora para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, cuya patogenia implica células Tem autorreactivas tales como por ejemplo esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis y diabetes tipo 1, pero también para otras enfermedades inflamatorias crónicas, tales como por ejemplo parodontitis.
Además, existen indicios de que los canales Kv1.3 desempeñan un papel en la regulación del peso corporal. Ratones deficientes en Kv1.3 pesan significativamente menos que sus compañeros de camada de control. Además, los ratones deficientes están protegidos frente a la obesidad inducida por la dieta y aumentan significativamente menos de peso que los controles de compañeros de camada cuando siguen una dieta alta en grasa (Xu, Human Molecular Genetics, 2003, vol. 12, págs. 551). El canal Kv1.3 constituye también por tanto una diana prometedora para el tratamiento de la obesidad.
Por tanto, existe una necesidad continua de compuestos terapéuticos específicos de canales Kv1.3 que presenten una interacción fuerte y específica con el canal Kv1.3 y sean capaces de bloquear o reducir su actividad.
Objetivo y sumario de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar compuestos que sean capaces de unirse específicamente a e inhibir o reducir la actividad del canal de potasio Kv1.3. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar tales compuestos inhibidores y composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos inhibidores para uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tales como por ejemplo esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis y/o diabetes tipo 1, obesidad y/o parodontitis.
Estos y otros objetivos tal como resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción y reivindicaciones se logran mediante la materia de las reivindicaciones independientes. Algunas de las realizaciones preferidas se definen mediante las reivindicaciones dependientes.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.:25.
En otro aspecto la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos según la invención.
En todavía otro aspecto la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la invención.
La presente invención en un aspecto adicional se refiere también a un compuesto según la invención o una composición farmacéutica según la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad autoinmunitaria, obesidad, parodontitis y/o rechazo de trasplante de tejido.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Medición de la inhibición de canales Kv1.3, Kv1.5 y Kv1.1 mediante pinzamiento de voltaje.
Figura 2. Lista de secuencias cgtx 538-548.
Figura 3. Efecto del compuesto 1-8 (C1-8).
Compuesto 1: cgtx 538
Compuesto 2: cgtx 539
Compuesto 3: cgtx 540
Compuesto 4: cgtx 541
Compuesto 5: cgtx 542
Compuesto 6: cgtx 543
Compuesto 7: cgtx-544
Compuesto 8: cgtx 547
A la izquierda, perfiles de ejemplo de corrientes de hERG tras la aplicación de disolución externa (negro), aplicación de compuesto (azul) y quinidina (gris). El panel de la derecha muestra los cambios de la amplitud de corriente pico a lo largo del tiempo. Las líneas de puntos indican la aplicación de compuesto. Se evaluó el efecto de cada concentración compuesto durante 10 o 20 barridos. Todos los compuestos parecían no tener efecto o tener solo un efecto pequeño sobre hERG. En su lugar, la quinidina bloqueó completamente la corriente. Obsérvese que se produjo una reducción desde el comienzo de la aplicación de compuesto hasta el final de los barridos registrados.
Figura 4. Activación dependiente de voltaje representativa de canales Kv1.3 expresados en células Sf21 (A) y expresados de manera endógena en células Tem (B). (C) Protocolo de pulsos para la activación de Kv1.3 dependiente de voltaje.
Figura 5. Correlación de voltaje-corriente normalizada característica de canales Kv1.3 expresadas en células Sf21 (líneas central y superior) y Tem (línea inferior); n= 41, n= 12 y n=29, respectivamente. Con el sistema de expresión de baculovirus Sf21 es posible expresar altas cantidades de canales de potasio Kv1.3.
Figura 6. Comparación de células Tem y células Sf21. Bloqueo de canales Kv1.3 expresados en células Sf21 (A) y Tem (B) por cgtx-544. Se muestran perfiles de corriente sin procesar representativos y respuestas de tiempodosis en presencia de concentraciones crecientes del péptido antagonista de Kv1.3.
Figura 7. Representación esquemática de la inducción local de artritis en la rodilla de ratas.
Figura 8. Hinchazón de la articulación de la rodilla tras la inducción de artritis local.
Figura 9. Estado inmunitario de animales experimentales basado en recuentos de WBC en sangre periférica; AI: inducción de artritis, animales vírgenes = NaCl “animales inmunizados”, animales inmunizados = animales tratados con adyuvante de Freund incl. mBSA.
Figura 10. Diferencia de la hinchazón de la articulación de la rodilla entre animales de control no tratados y tratados con cgtx-544 (cada grupo: n=14; línea continua con rombos: animales de control no tratados; línea discontinua con cuadrados: animales tratados con cgtx-544).
Figura 11. Transcurso temporal de la diferencia del aumento de hinchazón de la rodilla absoluto en ratas artríticas con terapia convencional con metotrexato (MTX). Tras dos inmunizaciones el día -21 y día -14, se indujo la artritis inducida por antígeno (AIA) mediante inyección intraarticular de BSA metilada el día 0. La terapia con MTX de dosis alta recibió una aplicación de 1 mg/kg de peso corporal de MTX 1 x a la semana por vía s.c. comenzando el día -21 hasta el día 0. La terapia con MTX de dosis baja recibió una aplicación diaria de 100 pg/kg de peso corporal de MTX por vía i.v. comenzando el día -3 hasta el día 6 y el grupo de control de vehículo recibió una aplicación diaria de NaCl al 0,9% por vía i.v. comenzando el día 0 hasta el día 6. El aumento absoluto de la hinchazón de la rodilla es la diferencia entre valores de rodilla no inducida y valores de rodilla inducida por artritis por separado para cada grupo. Los valores son medias CE. Línea de puntos con círculos rellenos: grupo de MTX por vía s.c. 1 x a la semana (grupo J, n=7); línea de guion largo-punto con triángulos: grupo de m Tx por vía i.v. 1 x al día (grupo L, n=7); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H, n=14).
Figura 12. Transcurso temporal de la diferencia del aumento de hinchazón de la rodilla absoluto en ratas artríticas con terapia convencional con metotrexato (MTX) en comparación con terapia con péptido cgtx-544. Tras dos inmunizaciones el día -21 y día -14, se indujo la artritis inducida por antígeno (AIA) mediante inyección intraarticular de BSA metilada el día 0. La terapia con MTX de dosis baja recibió una aplicación diaria de 100 pg/kg de peso corporal de MTX por vía i.v. comenzando el día -3 hasta el día 6. En comparación, el grupo de terapia con cgtx-544 recibió una aplicación diaria de 1 mg/kg de peso corporal de cgtx-544 por vía i.v. comenzando el día -3 hasta el día 6 y el grupo de control de vehículo recibió también una aplicación diaria de NaCl al 0,9% por vía i.v. comenzando el día 0. El aumento absoluto de hinchazón de la rodilla es la diferencia entre valores de rodilla no inducida y valores de rodilla inducida por artritis por separado para cada grupo. Los valores son medias DE. Línea de guion largo-punto con triángulos: grupo de MTX por vía i.v. 1x al día (grupo L, n=7); línea discontinua con cuadrados: grupo de terapia con cgtx-544 (grupo I; n=14); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H, n=14).
Figura 13. Transcurso temporal de la diferencia del aumento de la hinchazón de la rodilla relativo en ratas artríticas con terapia convencional con metotrexato (MTX). Tras dos inmunizaciones el día -21 y día -14, se indujo la artritis inducida por antígeno (AIA) mediante inyección intraarticular de BSA metilada el día 0. La terapia con MTX de dosis alta recibió una aplicación de 1 mg/kg de peso corporal de MTX 1 x a la semana por vía s.c. comenzando el día -21 hasta el día 0. La terapia con MTX de dosis baja recibió una aplicación diaria con 100 pg/kg de peso corporal de MTX por vía i.v. comenzando el día -3 hasta el día 6 y el grupo de control de vehículo recibió una aplicación diaria de NaCl al 0,9% por vía i.v. comenzando el día 0 hasta el día 6. El aumento relativo de la hinchazón de la rodilla es la diferencia entre valores de rodilla no inducida y valores de rodilla inducida por artritis por separado para cada grupo tras la normalización de los valores. Los valores normalizados (día -21=1) son medias DE. Línea de puntos con círculos rellenos: grupo de MTX por vía s.c. 1 x a la semana (grupo J, n=7); línea de guion largo-punto con triángulos: grupo de MTX por vía i.v. 1 x al día (grupo L, n=7); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H, n=14).
Figura 14. Transcurso temporal de la diferencia del aumento de la hinchazón de la rodilla relativo en ratas artríticas con terapia convencional con metotrexato (MTX) en comparación con la terapia con cgtx-544. Tras dos inmunizaciones el día -21 y día -14, se indujo la artritis inducida por antígeno (AIA) mediante inyección intraarticular de BSA metilada el día 0. La terapia con MTX de dosis baja recibió una aplicación diaria de 100 pg/kg de peso corporal de MTX por vía i.v. comenzando el día -3 hasta el día 6. En comparación, el grupo de terapia con cgtx-544 recibió una aplicación diaria de 1 mg/kg de peso corporal de cgtx-544 por vía i.v. comenzando el día -3 hasta el día 6 y el grupo de control de vehículo recibió también una aplicación diaria de NaCl al 0,9% por vía i.v. comenzando el día 0. El aumento relativo de la hinchazón de la rodilla es la diferencia de valores de rodilla no inducida con respecto a valores de rodilla inducida por artritis por separado para cada grupo tras la normalización de los valores. Los valores normalizados (día -21=1) son medias DE. Línea de guion largo-punto con triángulos: grupo de MTX por vía i.v. 1x al día (grupo L, n=7); línea discontinua con cuadrados: grupo de terapia con péptido cgtx-544 (grupo I; n=14); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H, n=14).
Figura 15. Estado inmunitario de ratas artríticas con terapia convencional con metotrexato (MTX) en comparación con la terapia con cgtx-544. Recuento de glóbulos blancos (WBC) absoluto; los valores son medias DE (n=7). Línea de puntos con círculos rellenos: grupo de MTX por vía s.c. 1 x a la semana (grupo J, n=7); línea de guion largo-punto con triángulos: grupo de MTX por vía i.v. 1 x al día (grupo L, n=7); línea discontinua con cuadrados: grupo de terapia con péptido cgtx-544 por vía i.v. 1 x al día (grupo I, n=7); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) por vía i.v. 1 x al día (grupo H, n=7). Flechas negras: tiempo de inmunización con M. tuberculosis (750 pg) y mBSA. Se midió la sangre completa con EDTA con Sysmex XT-2000i.V.
Figura 16. Granulocitos neutrófilos en ratas artríticas con terapia convencional con metotrexato (MTX) en comparación con la terapia con cgtx-544. A. Los valores absolutos son medias DE (n=7). Línea de puntos con círculos rellenos: grupo de MTX por vía s.c. 1 x a la semana (grupo J, n=7); línea de guion largo-punto con triángulos: grupo de MTX por vía i.v. 1 x al día (grupo L, n=7); línea discontinua con cuadrados: grupo de terapia con cgtx-544 por vía i.v. 1 x al día (grupo I, n=7); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) por vía i.v. 1 x al día (grupo H, n=7). Flechas negras: tiempo de inmunización con M. tuberculosis (750 pg) y mBSA. B. Neutrófilos relativos (en %) referidos a la cantidad total de WBC. Los valores son medias DE (n=7). Línea de puntos con círculos rellenos: grupo de MTX por vía s.c. 1 x a la semana (grupo J, n=7); guion largopunto con triángulos: grupo de MTX por vía i.v. 1 x al día (grupo L, n=7); línea discontinua con cuadrados: grupo de terapia con cgtx-544 por vía i.v. 1 x al día (grupo I, n=7); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) por vía i.v. 1 x al día (grupo H, n=7). Flechas negras (se suponen en los días -21 y -14): tiempo de inmunización con M. tuberculosis (750 pg) y mBSA. Se midió la sangre completa con EDTA con Sysmex XT-2000i.V.
Figura 17. Transcurso temporal de linfocitos en ratas artríticas con terapia convencional con metotrexato (MTX) en comparación con terapia con cgtx-544. A. Los valores absolutos son medias DE (n=7). Línea de puntos con círculos rellenos: grupo de MTX por vía s.c. 1 x a la semana (grupo J, n=7); línea de guion largo-punto con triángulos: grupo de MTX por vía i.v. 1 x al día (grupo L, n=7); línea discontinua con cuadrados: grupo de terapia con péptido cgtx-544 por vía i.v. 1 x al día (grupo I, n=7); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) por vía i.v. 1 x al día (grupo H, n=7). Flechas negras: tiempo de inmunización con M. tuberculosis (750 pg) y mBSA. B. Porcentaje de linfocitos en ratas artríticas con terapia convencional con metotrexato (MTX) en comparación con terapia con cgtx-544 - linfocitos relativos (en %) referidos a la cantidad total de WBC. Los valores son medias DE (n=7). Línea de puntos con círculos rellenos: grupo de MTX por vía s.c. 1 x a la semana (grupo J, n=7); línea de guion largo-punto con triángulos: grupo de MTX por vía i.v. 1 x al día (grupo L, n=7); línea discontinua con cuadrados: grupo de terapia con cgtx-544 por vía i.v. 1 x al día (grupo I, n=7); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) por vía i.v. 1 x al día (grupo H, n=7). Flechas negras: tiempo de inmunización con M. tuberculosis (750 pg) y mBSA. Se midió la sangre completa con EDTA con Sysmex XT-2000i.V.
Figura 18. Tratamiento preventivo y dependencia de la dosis - transcurso temporal del aumento relativo de los diámetros de rodilla (dosis alta/media/baja). Los valores son medias DE. Línea de guion largo-punto con triángulos: grupo de terapia con péptido cgtx-5445 mg/kg de peso corporal (grupo N, n=5); línea discontinua con cuadrados negros: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo I, n=14); línea de puntos con círculos rellenos: grupo de terapia con péptido cgtx-5440,1 mg/kg de peso corporal (grupo M, n=5); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H #15-19, n=5). Líneas continuas con cuadrados blancos: sin aumento de diámetros de rodilla no inducida (grupos I, N, M y H; rodillas no inducidas izquierdas).
Figura 19. Análisis estadístico de los resultados de eficacia de cgtx-544: Diferencia de la hinchazón de la rodilla relativa con y sin terapia con péptido cgtx-544 (dosis alta/media/baja) el día 1(A) y día 3(B) tras la inducción de artritis. Todos los gráficos de cajas muestran la mediana, el intervalo intercuartílico, el mínimo y máximo de la muestra. Para el análisis de la significación se comparó el control de vehículo con los grupos de terapia. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
Figura 20. Tratamiento curativo - comienzo del tratamiento el d=0 o d=1 - transcurso temporal de la diferencia de diámetros de rodilla (intraindividual, sustracción ind./no ind.) en ratas artríticas con y sin terapia con péptido cgtx-544 (inicio del tratamiento el d0 y d1). Los valores son medias DE. Línea de guion largo-punto con triángulos -inicio el tratamiento el d1: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo Q, n=7); línea de puntos con círculos rellenos - inicio del tratamiento el d0: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo P, n=6); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H). Líneas continuas con cuadrados blancos: sin aumento de diámetros de rodilla no inducida (grupos Q, P y H; rodillas no inducidas izquierdas).
Figura 21. Análisis estadístico de resultados de eficacia de cgtx-544 el día 1(A), día 2(B) y día 3(C) tras la inducción de artritis: Diferencia de la hinchazón de la rodilla relativa con y sin terapia con péptido cgtx-544 -tratamiento curativo (comenzando el d0/d1). Todos los gráficos de cajas muestran la mediana, el intervalo intercuartílico, el mínimo y máximo de la muestra. Para el análisis de la significación se comparó el control de vehículo con los grupos de terapia. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P<0,001.
Figura 22. Tratamiento curativo - inicio del tratamiento el d=0 o d=1 - transcurso temporal del recuento de WBC en ratas artríticas con y sin terapia con péptido cgtx-544 (inicio del tratamiento el d0 y d1). Recuento de glóbulos blancos (WBC) absoluto; los valores son medias DE. Línea de guiones largos con triángulos - inicio del tratamiento el d1: grupo de terapia con péptido cgtx-544 (mezcla) 1 mg/kg de peso corporal (grupo Q, n=7); línea de puntos con círculos rellenos - inicio del tratamiento el d0: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo P, n=6); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H, n=5). Flechas negras: tiempo de inmunización con M. tuberculosis (750 pg) y mBSA.
Figura 23. Tratamiento curativo - inicio del tratamiento el d=0 o d=1 - transcurso temporal de la cantidad relativa de granulocitos neutrófilos en el porcentaje de WBC en ratas artríticas con y sin terapia con péptido cgtx-544 (inicio del tratamiento el d0 y d1). Neutrófilos (en %) en relación con la cantidad total de WBC. Los valores son medias DE. Línea de guion largo-punto con triángulos - inicio del tratamiento el d1: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo Q, n=7); línea de puntos con círculos rellenos - inicio del tratamiento el d0: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo P, n=6); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H, n=5). Flechas negras: tiempo de inmunización con M. tuberculosis (750 pg) y mBSA.
Figura 24. Tratamiento curativo - inicio del tratamiento el d=0 o d=1 - transcurso temporal de la cantidad relativa de linfocitos en el porcentaje de WBC en ratas artríticas con y sin terapia con péptido cgtx-544 (inicio del tratamiento el d0 y d1). Linfocitos (en %) en relación con la cantidad total de WBC. Los valores son medias DE. Línea de guion largo-punto con triángulos - inicio del tratamiento el d1: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo Q, n=7); línea de puntos con círculos rellenos - inicio del tratamiento el d0: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo P, n=6); línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H, n=5). Flechas negras: tiempo de inmunización con M. tuberculosis (750 pg) y mBSA.
Figura 25. Tratamiento curativo (una vez a la semana o dos veces a la semana) - Transcurso temporal del aumento relativo del diámetro de la articulación de la rodilla. Los valores son medias DE. Línea de guion largopunto con triángulos - un solo tratamiento el d1: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo R6-10, n=5); línea de puntos con círculos rellenos - un solo tratamiento el d1 y d4: grupo de terapia con péptido cgtx-544 1 mg/kg de peso corporal (grupo R1-5, n=5); ambos grupos combinados hasta el día 4. Línea continua con rombos: grupo de control de vehículo (NaCl) (grupo H, n=5).
Figura 26. Tratamiento curativo (una vez a la semana o dos veces a la semana) - análisis estadístico de la eficacia de cgtx-544: Diferencia de la hinchazón de la rodilla relativa con y sin terapia con péptido cgtx-544 el día 2(A) y día 5(B) tras la inducción de artritis. Todos los gráficos de cajas muestran la mediana, el intervalo intercuartílico, el mínimo y máximo de la muestra. Para el análisis de la significación, se comparó el control de vehículo con los grupos de terapia. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
Figura 27. Análisis de anticuerpos específicos de mBSA. En los grupos experimentales H y I todos los animales han producido anticuerpos contra el antígeno mBSA durante la inmunización y el periodo de inducción de AIA. En el grupo de control F (animales vírgenes) no pudieron detectarse anticuerpos específicos de mBSA.
Figura 28. Análisis estadístico de los resultados de eficacia de MTX: Diferencia de la hinchazón de la rodilla relativa con y sin terapia con MTX (dosis alta/baja) el día 1(A) y día 3(B) tras la inducción de artritis. Todos los gráficos de cajas muestran la mediana, el intervalo intercuartílico, el mínimo y máximo de la muestra. Para el análisis de la significación, se comparó el control de vehículo con los grupos de terapia. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, n.s. no significativo.
Figura 29. Esquema de la síntesis de péptidos.
Figura 30. Perfil de UPLC del péptido cgtx-544 tras el plegamiento.
Figura 31. CI50 de cgtx-544 (ind.). A. cgtx-544 (ind.) presentó un valor de CI50 de 6,9 nM cuando los resultados se ajustaron a la curva de Hill. B. Reducción gradual de la corriente con concentraciones cgtx-544 (ind.) crecientes. C. Perfiles de corriente durante la medición a diferentes concentraciones de cgtx-544 (ind.).
Figura 32. Selectividad de cgtx-544 (ind.). A. cgtx-544 (ind.) presentó un valor de CI50 de aproximadamente 6 pM sobre Kv1.1 cuando los resultados se ajustaron a la curva de Hill. B. Reducción gradual de la corriente con concentraciones de cgtx-544 (ind.) crecientes sobre Kv1.1. C. Perfiles de corriente durante la medición a diferentes concentraciones de cgtx-544 (ind.) sobre Kv1.1. D. Una disolución 10 pM de cgtx-544 (ind.) no indujo una reducción significativa de las corrientes de Kv1.5, mientras que las corrientes eran sensibles a quinidina. E.
Una disolución 100 nM de cgtx-544 (ind.) no alteró las corrientes de Kv1.2 en células CHO transfectadas de manera estable. Concentraciones > 1 pM dieron como resultado corrientes solo ligeramente reducidas. La CI50 se estableció a 2,5 pM.
Figura 33. Decaimiento de cgtx-544 (ind.) en suero humano a 37°C. Se añadió una cantidad conocida de cgtx-544 (ind.) a suero sanguíneo humano de 3 donantes de sangre y se incubó a 37°C durante un periodo de 57 días. Se midió la actividad bloqueante del péptido sobre los canales Kv1.3 a lo largo de este periodo. El péptido permanece estable durante 16 h, y todavía puede detectarse tras 45 días. A los 57 días el efecto bloqueante ya no es visible. El decaimiento se representa como la reducción de la concentración de cgtx-544 (ind.) tal como se determina mediante: C(t) = CI50 (fe)/CI50(t).C0. El decaimiento se ajusta mediante una curva de decaimiento simple: C (t) = C0.2(-t/t1/2), donde C0 es la concentración inicial de péptido en disolución, fe es el punto de incubación de 0 min a 37°C y ti /2 es la semivida.
Figura 34. Disminución de cgtx-544 (ind.) en el suero de ratas tratadas tras inyección i.v. Se calculó la concentración de cgtx-544 (ind.) circulante no unido basándose en una curva patrón. El error estándar de la media se representa en las barras de error (n=6).
Figura 35. A. La incubación prolongada de cgtx-544 da como resultado un valor de CI50 picomolar. Las corrientes de Kv1.3 se normalizaron a las corrientes pico iniciales y el bloqueo completo mediante el bloqueante de canales de potasio no específico quinidina (datos no mostrados). Mientras están en condiciones de control (curva superior, n=11) las corrientes son estables durante al menos 10 minutos, una sola aplicación (flecha) de cgtx-544 (curva inferior, n=13) provoca un bloqueo que aumenta a lo largo del tiempo. B. Curva de respuesta a la dosis de cgtx-544 a tiempos de incubación prolongados. En una línea discontinua negra se muestra una curva de respuesta a la dosis para cgtx-544 con tiempos de incubación cortos. La curva continua negra resulta cuando se incuba cgtx-544 con canales Kv1.3 durante tiempos prolongados, es decir 15 min. El bloqueo observado del 20% con tiempos de incubación cortos (punto blanco) en comparación con el bloqueo del 60% con tiempos de incubación largos (punto negro) da como resultado un desplazamiento a la izquierda de la curva de respuesta a la dosis y por tanto la CI50 (línea de puntos horizontal) es menor. C. Valores de CI50 de cgtx-544 sobre Kv1.3 y Kv1.1 con tiempos de incubación largos y cortos.
Descripción detallada de la invención
Antes de que sea descrita la presente invención en detalle a continuación, ha de entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También ha de entenderse que la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica. Las abreviaturas de aminoácidos de una y tres letras usadas en el presente documento corresponden a la nomenclatura IUPAC (véase, por ejemplo, European Journal of Biochemistry, 138: 9-37, 1984).
Se introducen las siguientes definiciones: Tal como se usan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones previstas, las formas singulares de “un” y “una” también incluyen los respectivos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Ha de entenderse que el término “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” no son limitativos. Para los fines de la presente invención, el término “que consiste en” se considera que es una realización preferida del término “que comprende”. Si a continuación en el presente documento se define que un grupo comprende al menos un determinado número de realizaciones, esto quiere decir que también abarca un grupo que consiste preferiblemente en estas realizaciones solamente.
Los términos “aproximadamente” y “de manera aproximada” en el contexto de la presente invención indican un intervalo de precisión que un experto en la técnica entenderá que garantiza todavía el efecto técnico de la característica en cuestión. El término abarca normalmente una desviación del valor numérico indicado de 10% y preferiblemente de 5%.
El término “péptido” tal como se usa en el presente documento se refiere a una cadena molecular de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; por tanto, se incluyen polipéptidos, oligopéptidos y proteínas dentro de la definición de péptido. Los péptidos según la definición pueden ser tanto péptidos que se producen de manera natural como péptidos sintéticos que pueden incluir aminoácidos que se produce de manera natural como que no se producen de manera natural. Además, se incluyen dentro de la definición derivados funcionales de los péptidos, es decir, péptidos que están modificados químicamente, por ejemplo modificando una cadena lateral, un extremo amino y/o carboxilo terminal libre de un aminoácido que se produce de manera natural o que no se produce de manera natural, preferiblemente sin cambiar la identidad del aminoácido respectivo. Por ejemplo, la cadena lateral o un extremo amino o carboxilo terminal libre de un aminoácido de un péptido puede modificarse por ejemplo mediante glicosilación, amidación, fosforilación, ubiquitinación, carboxilación, etc. En una realización preferida, un péptido según la invención puede modificarse mediante PEGilación, HESilación o PASilación.
Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que los compuestos dados a conocer en el presente documento son capaces de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3 con respecto a otros canales de potasio, como por ejemplo Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG o canales de K+ activados por Ca2+ de gran conductancia (canales BK). Dada la prevalencia de Kv1.3 en células Tem, los compuestos según la presente invención, por tanto, constituyen agentes terapéuticos potentes para enfermedades mediadas por células Tem, tales como por ejemplo enfermedades autoinmunitarias. Además, los compuestos dados a conocer proporcionan la ventaja de efectos secundarios reducidos, ya que no modulan sustancialmente la actividad de otros canales de potasio distribuidos en otros tipos de células o tejidos.
La descripción, por tanto, se refiere en general a compuestos que son capaces de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3 con respecto a otros canales de potasio, tales como por ejemplo Kv1.1. Tales compuestos se contemplan para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades autoinmunitarias. Tales compuestos pueden seleccionarse del grupo que consiste en un péptido, un anticuerpo o una molécula pequeña. En una realización particularmente preferida, dicho compuesto es un péptido tal como se describe para un primer, segundo y tercer aspecto de la divulgación y variantes del mismo.
Un anticuerpo capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3 puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo también puede seleccionarse de variantes o fragmentos de anticuerpo tales como por ejemplo anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, minicuerpos, fragmentos Fv de cadena sencilla (sc(Fv)), anticuerpos sc(Fv)2 , fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 , siempre que dichas variantes o fragmentos de anticuerpos sean capaces de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
El término “molécula pequeña” tal como se usa en el presente documento se refiere a compuestos orgánicos pequeños que tienen un bajo peso molecular.
Una molécula pequeña puede ser un compuesto sintético que no se sabe que se produzca en la naturaleza o un compuesto que se produce de manera natural aislado de o que se sabe que se produce en fuentes naturales, tales como por ejemplo células, plantas, hongos, animales y similares. Una molécula pequeña en el contexto de la presente divulgación tiene preferiblemente un peso molecular de menos de 5000 Dalton, más preferiblemente menos de 4000 Dalton, más preferiblemente menos de 3000 Dalton, más preferiblemente menos de 2000 Dalton o incluso más preferiblemente menos de 1000 Dalton. En una realización particularmente preferida, una molécula pequeña en el contexto de la presente divulgación tiene un peso molecular de menos de 800 Dalton.
En otra realización preferida, una molécula pequeña en el contexto de la presente divulgación tiene un peso molecular de 50 a 3000 Dalton, preferiblemente de 100 a 2000 Dalton, más preferiblemente de 100 a 1500 Dalton e incluso más preferiblemente de 100 a 1000 Dalton. Lo más preferiblemente, una molécula pequeña en el contexto de la presente divulgación tiene un peso molecular de 100 a 800 Dalton.
Las moléculas pequeñas capaces de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3 pueden identificarse, por ejemplo, examinando bibliotecas de compuestos pequeñas.
La presente divulgación, en un primer, segundo y tercer aspecto y variaciones del mismo, por tanto, se refiere a compuestos peptídicos que son capaces de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3. Preferiblemente, dichos compuestos son capaces de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3 con respecto a otros canales de potasio, tales como por ejemplo Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG o canales de K+ activados por Ca2+ de gran conductancia (canales BK). En una realización particularmente preferida, los compuestos según la divulgación son capaces de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3 con respecto al canal de potasio Kv1.1.
En un primer aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (SEQ ID No.:23),
en la que X1=T, Q, S, Y, N; X2=I, F, V, A, L, W; Xa=I, T, Y, S, V, A, L; X4=K, S, T, Y, R; Xs=R, T, K, S, Y; X6=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X7=P, S, T; X8=R, K, P; X9=D, Q, N, E; X10=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; Xn=D, R, P, K, E, S, T, Y; X12=P, H, V, I, L, A; X13=R, K, Q, N; X14=K, D, A, R, E, V, L, I; X15=E, Q, A, L, D, N, V, I; X16=Y, N, S, T, Q; X17=A, G, V, I, L; X18=K, R, X19=Y, N, Q, T, S y X20=G, R, K.
En una variación del primer aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 23,
en la que Xi=T, Q, S, Y, N; X2=I, F, V, A, L, W; Xa=I, T, Y, S, V, A, L; X4=K, S, T, Y, R; X5= R, T, K, S, Y; X6=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X7=P, S, T; X8=R, K, P; X9=D, Q, N, E; X10=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; Xn=D, R, P, K, E, S, T, Y; X12=P, H, V, I, L, A; X13=R, K, Q, N; X14=K, D, A, R, E, V, L, I; X15=E, Q, A, L, D, N, V, I; X16=Y, N, S, T, Q; X17=A, G, V, I, L; X18=K, R, X19=Y, N, Q, T, S y X20=G, R, K; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización preferida del primer aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (SEQ ID No.: 24);
en la que X1=T, Q; X2=I, F; Xa=I, T; X4=K, S; X5=R, T, K; X6=T, G, S, N, I; X7=P, S; X8=R, K, P; X9=D, Q, N, E; X10=A, Y, I, L, W; Xn=D, R, P, K, E, S; X12=P, H, V; X13=R, K, Q; X14=K, D, A, R; X15=E, Q, A, L; X16=Y, N; X17=A, G; X18=K, R, X19=Y, N y X20=G, R.
En una realización preferida de la variación del primer aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 24,
en la que X1=T, Q; X2=I, F; Xa=I, T; X4=K, S; X5=R, T, K; X6=T, G, S, N, I; X7=P, S; X8=R, K, P; X9=D, Q, N, E; X10=A, Y, I, L, W; Xn=D, R, P, K, E, S; X12=P, H, V; X13=R, K, Q; X14=K, D, A, R; X15=E, Q, A, L; X16=Y, N; X17=A, G; X18=K, R, X19=Y, N y X20=G, R; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización más preferida del primer aspecto y su variación, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.25 (cgtx-544) o SEQ ID No.26 (cgtx 547). En este contexto, más realización preferida del primer aspecto y sus variaciones, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98% o al menos aproximadamente el 99% de porcentaje de identidad con SEQ ID No.25 (cgtx-544). La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se logra preferiblemente usando el algoritmo matemático de Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Un algoritmo de este tipo se incorpora por ejemplo en los programas de BLASTn y BLASTp de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 disponibles en NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge). La determinación del porcentaje de identidad se realiza preferiblemente con los parámetros convencionales de los programas BLASTn y BLASTp. Las búsquedas de polinucléotidos con BLAST se realizan preferiblemente con el programa BLASTn. Para los parámetros generales, el recuadro de “secuencias diana máx.” puede fijarse a 100, el recuadro de “consultas cortas” puede seleccionarse, el recuadro de “umbral esperado” puede fijarse a 10 y el recuadro de “tamaño de palabra” puede fijarse a 28. Para los parámetros de puntuación, las “puntuaciones de apareamiento/desapareamiento” pueden fijarse a 1, -2 y el recuadro de “costes de hueco” puede fijarse en lineal. Para los parámetros de filtros y enmascaramiento, el recuadro de “regiones de complejidad baja” puede no seleccionarse, el recuadro de “repeticiones específicas de especie” puede no seleccionarse, el recuadro de “máscara para tabla de búsqueda solo” puede seleccionarse, el recuadro de “máscara de letras minúsculas” puede no seleccionarse. Las búsquedas de proteínas con BLAST se realizan preferiblemente con el programa BLASTp. Para los parámetros generales, el recuadro de “secuencias diana máx.” puede fijarse a 100, el recuadro de “consultas cortas” puede seleccionarse, el recuadro de “umbral esperado” puede fijarse a 10 y el recuadro de “tamaño de palabra” puede fijarse a “3”. Para los parámetros de puntuación, el recuadro “matriz” puede fijarse a “BLOSUM62”, el recuadro de “costes de hueco” puede fijarse a “existencia: 11 extensión:1”, el recuadro de “ajustes de composición” puede fijarse a “ajuste de matriz de puntuación de composición condicional”. Para los parámetros de filtros y enmascaramiento, el recuadro de “regiones de complejidad baja” puede no seleccionarse, el recuadro de “máscara para tabla de búsqueda solo” puede no seleccionarse y el recuadro de “máscara de letras minúsculas” puede no seleccionarse.
El compuesto según la invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.25 (cgtx-544).
Las realizaciones descritas a continuación en el presente documento se refieren preferiblemente a compuestos del primer aspecto de la divulgación y su variación. Sin embargo, es necesario entender que estas realizaciones, por ejemplo la longitud de los péptidos tal como se comenta a continuación en el presente documento, la selectividad para Kv1.3 frente a Kv1.1, etc. también se aplican a compuestos de los aspectos segundo y tercero de la divulgación y su variación así como realizaciones preferidas de los mismos tal como se describe a continuación en el presente documento.
El compuesto según la invención es un péptido.
El compuesto según la invención tiene preferiblemente una longitud de menos de 1000 aminoácidos, menos de 500 aminoácidos, menos de 200 aminoácidos, preferiblemente de menos de 150 aminoácidos, de menos de 100 aminoácidos, menos de 90 aminoácidos, menos de 80 aminoácidos, menos de 70 aminoácidos, menos de 60 aminoácidos, menos de 50 aminoácidos o menos de 40 aminoácidos.
En una realización adicional preferida, un compuesto según la invención tiene una longitud de entre al menos 20 y 1000 aminoácidos, preferiblemente entre al menos 25 y 500 aminoácidos, más preferiblemente entre al menos 30 y 200 aminoácidos, más preferiblemente entre al menos 34 y 150 aminoácidos, más preferiblemente entre al menos 34 y 100 aminoácidos, más preferiblemente entre al menos 34 y 90 aminoácidos, e incluso más preferiblemente entre al menos 34 y 80 aminoácidos, entre al menos 34 y 70 aminoácidos, entre 34 y 60 aminoácidos, entre 34 y 50 aminoácidos o entre 34 y 40 aminoácidos.
En una realización más preferida, un compuesto según la invención consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos tal como se indica.
Los aminoácidos comprendidos en los compuestos según la invención puede ser L- o D-aminoácidos. Preferiblemente, los aminoácidos comprendidos en los compuestos según la invención son L-aminoácidos. En algunas realizaciones, en particular en casos en los que se desea una alta resistencia a la proteólisis, pueden preferirse D-aminoácidos.
Compuestos que inhiben la actividad de diferentes canales de potasio al mismo tiempo podrían tener efectos secundarios significativos si se aplican a un organismo vivo debido a la distribución diferencial de diferentes canales de potasio en diferentes tipos de células. La presente invención proporciona por tanto compuestos que son capaces de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3 en comparación con otros canales de potasio, en particular en comparación con el canal de potasio Kv1.1.
El término “que se une selectivamente” tal como se usa en el presente documento se refiere a la unión preferente de un compuesto según la invención al canal Kv1.3 con respecto a otros canales iónicos y particularmente con respecto a canales de potasio como por ejemplo Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG o canales de K+ activados por Ca2+ de gran conductancia (canales BK).
Preferiblemente, un compuesto según la invención es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3 con respecto al canal de potasio Kv1.1. En este caso, un compuesto según la invención se une al canal Kv1.3 con una afinidad sustancialmente mayor que al canal Kv1.1.
En el contexto de la presente invención, la toxina HsTx 1 no se considera un compuesto que sea capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3, ya que también se une e inhibe de manera potente canales Kv1.1. En una realización preferida, un compuesto que según la invención se une selectivamente a Kv1.3 se une al canal de potasio Kv1.3 con un valor de Kd que es al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 2000 veces, preferiblemente al menos 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10000 veces menor en comparación con el valor de Kd con el que dicho compuesto se une al canal Kv1.1. En una realización adicional preferida, un compuesto que según la invención se une selectivamente a Kv1.3 se une al canal de potasio Kv1.3 con un valor de Kd que es al menos 4000, 5000 o 10000 veces menor en comparación con el valor de Kd con el que dicho compuesto se une a otros canales de potasio como por ejemplo Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG o canales de K+ activados por Ca2+ de gran conductancia (canales BK).
En una realización particularmente preferida, un compuesto que según la invención se une selectivamente a Kv1.3 se une al canal de potasio Kv1.3 con un valor de Kd que es al menos 4000, 5000 o 10000 veces menor en comparación con el valor de Kd con el que dicho compuesto se une al canal Kv1.1.
En una realización preferida, un compuesto según la invención se une al canal de potasio Kv1.3 normalmente con un valor de Kd de entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente 250 nM, entre aproximadamente 0,5 nM y aproximadamente 250 nM, entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 225 nM, entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 200 nM, incluso más preferiblemente entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 100 nM, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 50 nM. Un compuesto según la invención se une a otros canales de potasio, tales como por ejemplo Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG o canales de K+ activados por Ca2+ de gran conductancia (canales BK) preferiblemente con un valor de Kd mayor de 0,1 mM, mayor de 0,2 mM, mayor de 0,3 mM, mayor de 0,4 mM o mayor de 0,5 mM. En una realización preferida particularmente, un compuesto según la invención se une al canal Kv1.1 con un valor de Kd mayor de 0,1 mM, mayor de 0,2 mM, mayor de 0,3 mM, mayor de 0,4 mM o mayor de 0,5 mM.
Un compuesto según la invención se une por tanto preferiblemente al canal de potasio Kv1.3 con un valor de Kd de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 200 nM tal como aproximadamente 1 o 2 nM y aproximadamente 200 nM y al canal Kv1.1 con un valor de Kd mayor de 0,1 mM, mayor de 0,2 mM, mayor de 0,3 mM, mayor de 0,4 mM o mayor de 0,5 mM. Más preferiblemente, un compuesto según la invención se une al canal de potasio Kv1.3 con un valor de Kd de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 100 nM tal como aproximadamente 1 o 2 nM y aproximadamente 100 nM y al canal Kv1.1 con un valor de Kd mayor de 0,1 mM, mayor de 0,2 mM, mayor de 0,3 mM, mayor de 0,4 mM o mayor de 0,5 mM. Incluso más preferiblemente, un compuesto según la invención se une al canal de potasio Kv1.3 con un valor de Kd de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 50 nM tal como aproximadamente 1 o 2 nM y aproximadamente 50 nM y al canal Kv1.1 con un valor de Kd mayor de 0,5 mM.
Un compuesto según la invención preferiblemente es capaz de unirse selectivamente a y bloquear o reducir la actividad del canal de potasio Kv1.3. Un compuesto según la invención puede reducir la actividad del canal de potasio Kv1.3 en al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% en comparación con un control. En algunas realizaciones preferidas, un compuesto según la invención puede bloquear la actividad del canal de potasio Kv1.3 en el 100%.
La capacidad de un compuesto según la invención para unirse selectivamente a y bloquear o reducir la actividad del canal Kv1.3 puede someterse a prueba mediante ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en un enfoque, pueden ponerse en contacto líneas celulares de mamífero que expresan Kv1.3 u otro canal de potasio, tal como por ejemplo Kv1.1, Kv1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG o canales de K+ activados por Ca2+ de gran conductancia (canales BK), con los compuestos de la invención y pueden medirse las corrientes de canales mediante el método de pinzamiento de voltaje tal como se describe por ejemplo en Grissmer et al. (Mol Pharmacol 45; 1227-34 (1994)) o a continuación en el presente documento en la sección de ejemplos. Cada compuesto puede someterse a prueba por ejemplo a diferentes concentraciones. El valor de Kd de los compuestos según la invención puede determinarse entonces por ejemplo ajustando la ecuación de Hill a la reducción medida de la corriente pico.
Ha de entenderse que los métodos para determinar la Kd tal como se describen por ejemplo en el ejemplo 2 no tienen en cuenta el número de canales que se miden, por lo que para los fines de la presente divulgación la Kd corresponde al valor de CI50 de modo que los términos Kd y CI50 se usan de manera sinónima en el presente documento. Ha de entenderse que pueden observarse valores de Kd inferiores cuando se usan péptidos completamente plegados y purificados frente a mezclas que comprenden péptidos plegados de manera incompleta (véase el ejemplo 2).
En algunas realizaciones, un compuesto según la invención puede tener unido a su grupo amino N-terminal o su grupo carboxilo C-terminal un anticuerpo u otra molécula que sea capaz de reconocer y seleccionar como diana una célula TEM.
Los compuestos de la presente invención pueden prepararse usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, un péptido puede sintetizarse usando química de Fmoc en fase sólida, por ejemplo según los principios inicialmente descritos por Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85; 7129 (1963)) tal como se modificaron posteriormente por Meienhofer et al. (J. Peptide Prot. Res. 13; 35 (1979)) y Campos, et al., Peptide Res. 4; 95 (1991)). Tal síntesis puede llevarse a cabo por ejemplo en sintetizadores de péptidos automatizados. Una vez sintetizadas, las secuencias pueden verificarse usando un secuenciador de péptidos automatizado.
Los canales de potasio mencionados en el contexto de la presente invención, tal como por ejemplo los canales de potasio Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG o canales de K+ activados por Ca2+ de gran conductancia (canales BK), se conocen bien en la técnica. Por tanto, el experto promedio puede recuperar fácilmente las secuencias de polinucleótido y de aminoácidos de estos canales e isoformas ortólogas y de corte y empalme de las mismas a partir de cualquier base de datos pública tal como por ejemplo la base de datos del NCBI (por ejemplo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/).
En un segundo aspecto, la presente divulgación se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No:1);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xs=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; Xg=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N; X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I; X14=Y, N, S, T, Q; X15=A, G, V, I, L; X16=K, R, X17=Y, N, Q, T, S y Xi8=G, R, K.
En una realización preferida, dicho compuesto no es HsTx 1 (SEQ ID NO: 32).
En una variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 1,
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xs=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N;X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I; X14=Y, N, S, T, Q; X15=A, G, V, I, L; X16=K, R, X17=Y, N, Q, T, S y X18=G, R, K; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización preferida, dicho compuesto no es HsTx 1.
En una realización preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No:2);
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=Y, N; X15=A, G; X16=K, R, X17=Y, N y X18=G, R.; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización preferida, dicho compuesto no es HsTx 1.
En una realización preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 2,
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=Y, N; X15=A, G; X16=K, R, X17=Y, N y X18=G, R; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización preferida, dicho compuesto no es HsTx 1.
En una realización preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (SEQ ID No.:3); en la que X6=R, K, P; X7=D, K, Q, N; X12=K, D,
Figure imgf000012_0001
En una realización preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 3,
en la que X6=R, K, P; X7=D, K, Q, N; X12=K, D,
Figure imgf000012_0002
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (SEQ ID No.:4); en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=K, R, X15=Y, N y X16=G, R.
En una realización más preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 4,
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; Xs=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L,
W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; Xrs=E, Q, A, L; X14=K, R, X15=Y, N y X16=G, R;
y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En otra realización preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (SEQ ID No.:5);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xs=P, S, T; X6=R, K,
P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N;
X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I; X14=Y, N, S, T, Q; X15=A, G, V, I, L y X16=K, R.
En otra realización preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 5,
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xs=P, S, T; X6=R, K,
P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N;
X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I; X14=Y, N, S, T, Q; X15=A, G, V, I, L y X16=K, R; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (SEQ ID No.:6);
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; Xs=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=Y, N; X15=A, G y X16=K, R.
En una realización más preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 6,
en la que , I, L, W; X9=D,
Figure imgf000013_0001
G y X16=K, R; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En otra realización preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (SEQ ID No.:7);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X5=P, S, T; X6=R, K,
P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N;
X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I y X14=K, R.
En otra realización preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 7,
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X5=P, S, T; X6=R, K,
P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N;
X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I y X14=K, R; y en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (SEQ ID No.:8);
en la que Xi=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; Xy=D, Q, N, E; Xs=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L y X14=K, R.
En una realización más preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 8, en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; Xy=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L y X14=K, R; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización incluso más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.: 9 (cgtx 538).
En otra realización preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.:10); en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X5=P, S, T; X6=R, K, P; X7=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X8=P, H, V, I, L, A; X9=R, K, Q, N y X10=K, D, A, R, E, V, L, I.
En otra realización preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 10, en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X5=P, S, T; X6=R, K, P; X7=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X8=P, H, V, I, L, A; X9=R, K, Q, N y X10=K, D, A, R, E, V, L, I; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.:11); en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; X7=A, Y, I, L, W; X8=P, H, V, I, L, A; X9=R, K, Q, N y X10=K, D, A, R, E, V, L, I.
En una realización más preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 11, en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; X7=A, Y, I, L, W; X8=P, H, V, I, L, A; X9=R, K, Q, N y X10=K, D, A, R, E, V, L, I; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización incluso más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.12 (cgtx 539).
En otra realización preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No:13);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X4=P, S, T; Xa=R, K, P; X6=R, K, Q, N; X7=K, D, A, R, E, V, L, I y X8=E, Q, A, L, D, N, V, I.
En otra realización preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 13, en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X4=P, S, T; Xa=R, K, P; X6=R, K, Q, N; X7=K, D, A, R, E, V, L, I y X8=E, Q, A, L, D, N, V, I; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 14);
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=T, G, S, N, I; X4=P, S, T; Xs=R, K, P; X6=R, K, Q; X7=K, D, A, R y X8=E, Q, A,
L.; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización más preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 14,
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=T, G, S, N, I; X4=P, S, T; Xs=R, K, P; X6=R, K, Q; X7=K, D, A, R y X8=E, Q, A,
L; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización incluso más preferida del segundo aspecto el compuesto según la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.15 (cgtx 540).
En otra realización preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (SEQ ID No.:
16);
en la que T; X6=R, K, P; X7=D, R, K, Q, N; X12=K, D,
Figure imgf000015_0001
En otra realización preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 16,
en la que T; X6=R, K, P; X7=D, R, K, Q, N; X12=K, D,
Figure imgf000015_0002
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (SEQ ID No.:17);
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; Xs=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=Y, N y X15=G, R.
En una realización más preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 17,
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; Xs=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=Y, N y X15=G, R; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización incluso más particularmente preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.18 (cgtx 541) o SEQ ID No.19 (cgtx 542).
En otra realización preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 20);
en la que X1= R, T, K, S, Y; X2=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xa=P, S, T; X4=R, K, P; Xa=D, Q, N, E; X6=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; Xy=D, R, P, K, E, S, T, Y; Xs=P, H, V, I, L, A; Xg=R, K, Q, N; X i0=K, D, A, R, E, V, L, I y Xii=E, Q, A, L, D, N, V, I.
En otra realización preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 20,
en la que X1=R, T, K, S, Y; X2=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X3=P, S, T; X4=R, K, P; X5=D, Q, N, E; X6=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; Xy=D, R, P, K, E, S, T, Y; Xs=P, H, V, I, L, A; Xg=R, K, Q, N; X10=K, D, A, R, E, V, L, I y Xn=E, Q, A, L, D, N, V, I; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X1 1 T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 21);
en la que X1=R, T, K; X2=T, G, S, N, I; X3=P, S; X4=R, K, P; X5=D, Q, N, E; X6=A, Y, I, L, W; X7=D, R, P, K, E, S; X8=P, H, V; X9=R, K, Q; X10=K, D, A, R y Xn=E, Q, A, L.
En una realización más preferida de la variación del segundo aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 21, en la que X1=R, T, K; X2=T, G, S, N, I; X3=P, S; X4=R, K, P; X5=D, Q, N, E; X6=A, Y, I, L, W; X7=D, R, P, K, E, S; X8=P, H, V; X9=R, K, Q; X10=K, D, A, R y Xn=E, Q, A, L; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización incluso más preferida del segundo aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.22 (cgtx 545).
En un tercer aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.:27);
en la que X1=P,I, F, V, A, L, W; X2=K, S, T, Y, R; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xg=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, , N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K,
Figure imgf000016_0001
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización preferida del tercer aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.: 28);
en la que X1=P,I, F; X2=K, S; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; Xg=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; Xrs=E, Q, A, L; X14=Y, N; X15=A, G; X16=K, R, X17=Y, N y X18=G, R.
En una realización preferida de la variación del tercer aspecto, la presente divulgación también se refiere a un compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No: 28,
en la que X1=P,I, F; X2=K, S; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; Xrs=E, Q, A, L; X14=Y, N; X15=A, G; X16=K, R, Xi7=Y, N y Xi8=G, R; y
en la que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
En una realización particularmente preferida del tercer aspecto, el compuesto según la divulgación comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.29 (cgtx 543), SEQ ID No.30 (cgtx 546) o SEQ ID No.31 (cgtx 548).
Por tanto, se prefiere particularmente que el compuesto según la divulgación comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos según SEQ iD NO. 9, 12, 15, 18, 19, 22, 25, 26, 29, 30 o 31.
En algunas realizaciones, los compuestos mencionados anteriormente que comprenden o que consisten en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO. 9, 12, 15, 18, 19, 22, 25, 26, 29, 30 o 31 pueden comprender entre 0 y 5, es decir 0, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, siempre que los compuestos sean todavía capaces de unirse selectivamente a y/o bloquear o reducir la actividad del canal de potasio Kv1.3. Los compuestos con tales mutaciones de aminoácidos se denominan variantes y también forman parte de la divulgación.
Una sustitución puede ser una sustitución conservativa o una no conservativa, preferiblemente la sustitución es una sustitución conservativa. Una sustitución conservativa comprende la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una propiedad química similar al aminoácido que se sustituye. En algunas realizaciones, una sustitución puede ser también un intercambio de un aminoácido que se produce de manera natural por un aminoácido no natural.
Los términos “deleción de aminoácido” e “inserción de aminoácido” se usan en el presente documento según su significado convencional y bien conocido en la técnica.
La presente invención en otro aspecto también proporciona un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos según la invención.
En el contexto de la presente invención, los términos “ácido nucleico” o “secuencia de ácido nucleico” se refieren a un polímero de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos sintético o que se produce de manera natural en forma o bien mono o bien bicatenaria que es capaz de codificar para una secuencia de aminoácidos dada. El término también abarca derivados de un polímero de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos dado que puede diferir del polímero de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos original en que uno o más nucleótidos de la secuencia original se sustituyen por otros nucleótidos y/o se modifican (químicamente) mediante métodos conocidos por el experto, siempre que el polímero de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos sea todavía capaz de codifica para su secuencia de aminoácidos respectiva.
Resultará evidente para el experto que debido a la degeneración del código genético una secuencia de aminoácidos dada según la invención puede estar codificada por diferentes secuencias de nucleótidos.
La presente divulgación en un aspecto adicional también proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la invención.
El vector puede ser cualquier vehículo molecular tal como por ejemplo un vector de plásmido, un vector de virus, un vector de bacteriófago o cualquier otro vehículo, que contiene una o más secuencias de nucleótidos según la invención y está preferiblemente diseñado para la transferencia entre diferentes células huésped. En una realización preferida, el vector es un vector de expresión procariota o eucariota.
El término “vector de expresión” tal como se usa en el presente documento se refiere a un vector que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante operativamente unida y es capaz de inducir la expresión de proteínas en un organismo huésped particular (por ejemplo, bacterias, levadura, planta, insecto o mamífero) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de expresión pueden comprender elementos funcionales tales como, por ejemplo, un promotor que está operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico que va a transcribirse, una secuencia de terminación que permite la terminación apropiada de la transcripción y un marcador seleccionable. El experto en la técnica será consciente de que la naturaleza del promotor dependerá de si el vector va a usarse en una célula huésped procariota o eucariota. Para obtener una expresión estable durante un período de tiempo prolongado, el vector de expresión puede comprender además un origen de replicación (ORI). El experto en la técnica conoce vectores de expresión adecuados. Dependiendo de si la expresión ha de lograrse en una célula huésped procariota o eucariota o en sistemas de expresión in vitro, los vectores pueden ser vectores de expresión procariotas y/o eucariotas tales como plásmidos, cósmidos, minicromosomas, fagos bacterianos, vectores retrovirales, etc. El experto estará familiarizada con cómo seleccionar un vector apropiado según la necesidad específica.
La presente divulgación en otro aspecto se refiere a una célula huésped que comprende una secuencia de ácido nucleico o un vector según la invención.
Dependiendo del área de aplicaciones, la célula huésped puede ser una célula huésped procariota o eucariota. Las células huésped procariotas típicas incluyen células bacterianas tales como por ejemplo Escherichia coli (E. coli) Las células huésped eucariotas típicas incluyen, por ejemplo, células de levadura tales como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, células de insectos tales como por ejemplo células Sf9/Sf21, células vegetales y células de mamíferos tales como por ejemplo células COS, c Ho y HeLa.
La presente invención en un aspecto adicional también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la invención.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica según la invención puede comprender más de uno de los compuestos según la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica según la invención puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 de los compuestos según la invención. En algunas realizaciones preferidas, una composición farmacéutica de la invención puede comprender uno o más compuestos según la invención, en la que los compuestos se seleccionan del grupo de compuestos que comprenden o que consisten en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 9, 12, 15, 18, 19, 22, 25, 26, 29, 30 o 31.
Los péptidos que se considera que son particularmente preferidos a lo largo de toda la presente divulgación para uso terapéutico son péptidos de SEQ ID No.: 25 (cgtx-544), SEQ ID No.: 29 (cgtx 543) y SEQ ID No.: 9 (cgtx 538). Se observa que la mayoría de los experimentos descritos a continuación en el presente documento se han realizado usando péptidos de SEQ ID No.: 25 (cgtx-544). Sin embargo, los péptidos de SEQ ID No.: 29 (cgtx 543) y SEQ ID No.: 9 (cgtx 538) también se han sometido a prueba para determinar su selectividad frente a hERG y, basándose en su similitud de secuencia, parece por tanto razonable concluir que pueden observarse efectos similares a para ctgx 544 para estos péptidos.
Estos péptidos, así como otros péptidos descritos en el presente documento, pueden fabricarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como síntesis en fase sólida. Se observa que estos péptidos comprenden residuos de cisteína y, por tanto, pueden requerir un plegamiento activo para dar un estado nativo para lograr una actividad óptima. La actividad puede potenciarse adicionalmente purificando péptidos completamente plegados. El plegamiento puede lograrse sometiendo los péptidos sintetizados a oxidación para lograr puentes disulfuro entre los residuos de cisteína. Esto puede hacerse incubando los péptidos en por ejemplo tampón fosfato a pH de ~8,0 en presencia de oxígeno atmosférico tal como se describe en el ejemplo 8. El plegamiento puede ir seguido por espectrometría de masas ya que el péptido plegado mostrará una masa ligeramente reducida correspondiente a la pérdida de átomos de hidrógeno durante la formación del puente disulfuro. En el caso de ctgx 544, la diferencia en masa sería 4212 frente a 4220.2 Da.
La purificación de péptidos completamente plegados puede lograrse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como purificación por HPLC. Un enfoque adecuado se describe en el ejemplo 8.
Una composición farmacéutica según la invención puede administrarse por vía oral, por ejemplo en forma de píldoras en polvo inhalables, comprimidos, comprimidos lacados, comprimidos recubiertos de azúcar, gránulos, cápsulas de gelatina duras y blandas, disoluciones acuosas, alcohólicas u oleosas, jarabes, emulsiones o suspensiones, o por vía rectal, por ejemplo en forma de supositorios.
La administración también puede llevarse a cabo por vía intranasal o por vía sublingual.
La administración puede realizarse además por vía parenteral, por ejemplo por vía subcutánea, por vía intramuscular o por vía intravenosa en forma de disoluciones para inyección o infusión. Otras formas de administración adecuadas son, por ejemplo, administración percutánea o tópica, por ejemplo en forma de pomadas, tinturas, aerosoles o sistemas terapéuticos transdérmicos, o la administración inhalatoria en forma de aerosoles nasales o mezclas de aerosoles.
Las formas de administración que se considera que son particularmente preferidas a lo largo de toda la presente divulgación son administración intravenosa, intramuscular o subcutánea.
Para la producción de píldoras, comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar y cápsulas de gelatina duras es posible usar, por ejemplo, lactosa, almidón, por ejemplo almidón de maíz, o derivados de almidón, talco, ácido esteárico o sus sales, etc. Portadores para cápsulas de gelatina blandas y supositorios son, por ejemplo, grasas, ceras, polioles semisólidos y líquidos, aceites naturales o endurecidos, etc. Portadores adecuados para la preparación de disoluciones, por ejemplo, disoluciones para inyección, o de emulsiones o jarabes son, por ejemplo, agua, disolución fisiológica de cloruro de sodio, alcoholes tales como etanol, glicerol, polioles, sacarosa, azúcar invertido, glucosa, manitol, aceites vegetales, etc. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener aditivos, por ejemplo, cargas, disgregantes, aglutinantes, lubricantes, agentes humectantes, estabilizadores, emulsionantes, dispersantes, conservantes, edulcorantes, colorantes, aromatizantes, aromatizantes, espesantes, diluyentes, sustancias tampón, disolventes, solubilizantes, agentes para lograr un efecto de depósito, sales para alterar la presión osmótica, agentes de recubrimiento o antioxidantes.
Pueden encontrar ejemplos de excipientes adecuados para las diversas formas diferentes de composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento en el “Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 2a edición, (1994), editado por A Wade y PJ Weller.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden ser formulaciones de liberación sostenida. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica según la invención, además del al menos un compuesto según la invención, puede comprender además otros agentes inmunosupresores que son adecuados para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Los ejemplos de tales agentes inmunosupresores incluyen, por ejemplo, cortisol, hidrocortisol, dexametasona, ciclofosfamida, nitrosoureas, metotrexato, mercaptopurina, mitomicina C, bleomicina, mitramicina, ciclosporina, rapamicina, azatioprina, prednisona y desoxiespergualina e interferones.
En otras realizaciones preferidas, pueden administrarse composiciones diferenciadas que comprenden los agentes inmunosupresores adicionales mencionados anteriormente a un mamífero que lo necesita en combinación con una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos según la invención. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un compuesto según la invención o una composición farmacéutica según la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad que implica células efectoras de memoria (células Tem).
La presente invención se refiere preferiblemente a un compuesto según la invención o una composición farmacéutica según la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad autoinmunitaria, obesidad, parodontitis y/o rechazo de trasplante de tejido.
Para los fines de la presente divulgación, el término “tratamiento” se refiere al alivio curativo de una enfermedad, mientras que el término “prevención” se refiere a profilaxis preventiva. Debe entenderse que ambos términos no implican una remisión o prevención completa de la enfermedad respectiva, sino más bien que hay una mejora en comparación con una situación en la que no se administra ningún agente farmacéuticamente activo con fines o bien curativos o bien preventivos.
En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere al uso de un compuesto según la invención o una composición farmacéutica según la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad autoinmunitaria.
En el contexto de la presente invención, el término “enfermedad autoinmunitaria” o “enfermedades autoinmunitarias” se refiere a un estado patológico provocado por una respuesta autoinmunitaria inapropiada que se está dirigida a una entidad codificada por uno mismo, es decir, un autoantígeno. Se abarca dentro de la definición cualquiera de varios trastornos provocados por un defecto del sistema inmunitario que permite que el cuerpo ataque a sus propios tejidos. En una realización preferida, la enfermedad autoinmunitaria es un trastorno autoinmunitario mediado por células T.
Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias que pueden tratarse o prevenirse mediante los compuestos y composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen por ejemplo esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, diabetes tipo 1, vasculitis, enfermedad de Hashimoto, asma, dermatitis atópica, enfermedades oculares autoinmunitarias, síndrome de Sjogren, encefalomielitis diseminada aguda (ADEM), enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpo antifosfolípido (APS), anemia aplásica, hepatitis autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, penfigoide gestacional, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Grave, síndrome de Guillian-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Kawasaki, lupus eritematoso, miastenia grave, síndrome opsoclonomioclono, neuritis óptica, tiroiditis de Ord, pénfigo, anemia perniciosa, poliartritis (en perros), cirrosis biliar primaria, síndrome de Reiter, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, anemia hemolítica autoinmunitaria caliente, granulomatosis de Wegener, vasculitis sistémica asociada a ANCA, síndrome de Churg-Strauss, poliangiitis microscópica, colitis, enfermedades inflamatorias del intestino, uveítis y artritis psoriásica.
Algunas de estas enfermedades autoinmunitarias se han vinculado a células Tem, por ejemplo vasculitis sistémica asociada a ANCA (Abdulahad, Nephrology, 2009 vol. 14 pág. 26), síndrome de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener, poliangiitis microscópica (Berden, Artritis & Rheumatism, 2009, vol. 60, pág. 1578), espondilitis anquilosante, enfermedad de Behget, colitis, enfermedad de Crohn, enfermedades inflamatorias del intestino, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus tipo 1 (Ulivieri, Expert Rev. Vaccines, 2013 vol. 12 pág. 297), lupus eritematoso sistémico (Devarajan, Immunol. Res, 2013 vol.
57 pág. 12), uveítis (Amadi-Obi, Nephrology, 2009, vol. 14 pág. 26) y artritis psoriásica (De Vlam, Acta Derm. Venereol, 2014, vol. 94, pág. 627).
Lo mismo se aplica a la obesidad (Xu, Human Molecular Genetics, 2003, vol. 12, pág. 551).
Dado que se ha mostrado que ctgx544 actúa selectivamente sobre células Tem y tiene efecto sobre la artritis reumatoide, parece razonable suponer que cgtx544 y los otros péptidos dados a conocer en el presente documento pueden usarse para tratar o prevenir tales enfermedades.
En una realización preferida, la enfermedad autoinmunitaria que va a tratarse o prevenirse mediante los compuestos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, diabetes tipo 1 y vasculitis.
El trasplante de órganos y tejidos a un nuevo huésped a menudo puede provocar rechazo del órgano o tejido trasplantado debido a una respuesta inmunitaria mediada por células T contra el nuevo órgano o tejido (por ejemplo corazón, hígado, riñón, páncreas o piel). La presente invención también se refiere por tanto a un compuesto según la invención o una composición farmacéutica según la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de rechazo de trasplante de tejido u órgano. También se ha mostrado que el rechazo de trasplante de órgano implica células Tem (véase por ejemplo Macedo, Transplantation, 2012 vol. 93 pág. 813). Dada la alta selectividad de cgtx544 y los otros péptidos dados a conocer en el presente documento, parece razonable suponer que cgtx544 y los otros péptidos dados a conocer en el presente documento pueden usarse para tratar o prevenir tales enfermedades.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmunitaria, obesidad, parodontitis y/o rechazo de trasplante de tejido en un mamífero administrando un compuesto según la invención o una composición farmacéutica según la invención a un mamífero que lo necesita.
Preferiblemente la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, diabetes tipo 1 y vasculitis.
El término “mamífero” tal como se usa en el presente documento incluye por ejemplo seres humanos, primates no humanos, ratones, ratas, conejos, cobayas, perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras y similares. El mamífero preferido es ser humano.
Una forma de dosificación unitaria de una composición farmacéutica según la invención puede contener cualquier cantidad eficaz adecuada de un compuesto según la invención acorde con el intervalo de dosificación diaria previsto que va a emplearse.
Un mamífero que necesita la administración de un compuesto según la invención o una composición farmacéutica según la invención es por ejemplo un mamífero que padece o corre el riesgo de desarrollar una enfermedad mediada por células T, preferiblemente una enfermedad autoinmunitaria mediada por células T. En una realización preferida, dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, diabetes tipo 1 y vasculitis.
La presente divulgación, en un aspecto adicional, también se refiere a un método de fabricación de un compuesto según la invención, una secuencia de ácido nucleico según la invención, un vector según la invención o una composición farmacéutica según la invención.
La presente divulgación también se refiere a:
(1) Un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ
ID No.: 1);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xs=P, S, T;
X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A;
Xn=R, K, Q, N; X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I; X14=Y, N, S, T, Q; X15=A, G, V, I, L; X16=K, R, X17=Y, N, Q, T, S y X18=G, R, K.
En una realización preferida, dicho compuesto no es HsTx 1 (SEQ ID No.: 32)
(2) Un compuesto según (1) que comprende una secuencia de aminoácidos: X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.: 2);
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; Xs=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; Xk f P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=Y, N; X15=A, G; Xi6=K, R, Xi7=Y, N y Xi8=G, R.
En una realización preferida, dicho compuesto no es HsTx 1.
(3) Un compuesto según (1) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (SEQ ID No.: 3);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X5=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N; X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I; X14=K, R, X15=Y, N, Q, T, S y X16=G, R, K.
(4) Un compuesto según (3) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (SEQ ID No.: 4);
en la que X1=A, V, I X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=K, R, X15=Y, N y X16=G, R.
(5) Un compuesto según (1) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (SEQ ID No.: 5);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3= R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X5=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N; X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I; X14=Y, N, S, T, Q; X15=A, G, V, I, L y X16=K, R.
(6) Un compuesto según (5) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (SEQ ID No.: 6);
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; Xs=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=Y, N; X15=A, G y X16=K, R.
(7) Un compuesto según (1) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (SEQ ID No.: 7);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xs=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N; X12=K, D, A, R, E, V, L, I; X13=E, Q, A, L, D, N, V, I y X14=K, R.
(8) Un compuesto según (7) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (SEQ ID No.: 8);
en la que A, Y, I, L, W; X
Figure imgf000021_0001
(9) Un compuesto según (8) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 9.
(10) Un compuesto según (1) que comprende una secuencia de aminoácidos: X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 10);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xs=P, S, T; X6=R, K, P; X7=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X8=P, H, V, I, L, A; X9=R, K, Q, N y X10=K, D, A, R, E, V, L, I.
(11) Un compuesto según (10) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 11); en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3= R, T, K; X4=T, G, S, N, I; Xs=P, S; X6=R, K, P; X7=A, Y, I, L, W; X8=P, H, V, I, L, A; X9=R, K, Q, N y X10=K, D, A, R, E, V, L, I.
(12) Un compuesto según (11) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 12.
(13) Un compuesto según (1) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 13); en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X4=P, S, T; X5=R, K, P; X6=R, K, Q, N; X7=K, D, A, R, E, V, L, I y X8=E, Q, A, L, D, N, V, I.
(14) Un compuesto según (13) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 14); en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3=T, G, S, N, I; X4=P, S, T; X5=R, K, P; X6=R, K, Q; X7=K, D, A, R y X8=E, Q, A, L.
(15) Un compuesto según (14) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 15.
(16) Un compuesto según (1) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (SEQ ID No.: 16);
en la que X1=A, V, I, L; X2=S, R, K, T, Y; X3= R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; Xs=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N; X12=K, D, A, R, E, V, L, I; Xrs=E, Q, A, L, D, N, V, I; X14=Y, N, Q, T, S y X15=G, R, K.
(17) Un compuesto según (16) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X 5-C (SEQ ID No.: 17);
en la que X1=A, V, I; X2=S, R, K; X3= R, T, K; X4=T, G, S, N, I; Xs=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; X13=E, Q, A, L; X14=Y, N y X15=G, R.
(18) Un compuesto según (17) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 18 o SEQ ID No. 19.
(19) Un compuesto según (1) que comprende una secuencia de aminoácidos:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 20); en la que X1=R, T, K, S, Y; X2=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X3=P, S, T; X4=R, K, P; X5=D, Q, N, E; X6=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X7=D, R, P, K, E, S, T, Y; X8=P, H, V, I, L, A; X9=R, K, Q, N; X10=K, D, A, R, E, V, L, I y Xn=E, Q, A, L, D, N, V, I.
(20) Un compuesto según (19) que comprende una secuencia de aminoácidos:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 21); en la que X1=R, T, K; X2=T, G, S, N, I; X3=P, S; X4=R, K, P; X5=D, Q, N, E; X6=A, Y, I, L, W; X7=D, R, P, K, E, S; X8=P, H, V; X9=R, K, Q; X10=K, D, A, R y Xn=E, Q, A, L.
(21) Un compuesto según (20) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 22.
(22) Un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos:
Xl -X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (SEQ ID No.: 23),
en la que X1=T, Q, S, Y, N; X2=I, F, V, A, L, W; Xa=I, T, Y, S, V, A, L; X4=K, S, T, Y, R; X5=R, T, K, S, Y; X6=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X7=P, S, T; X8=R, K, P; X9=D, Q, N, E; X10=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; Xn=D, R, P, K, E, S, T, Y; X12=P, H, V, I, L, A; Xrs=R, K, Q, N; X14=K, D, A, R, E, V, L, I; X15=E, Q, A, L, D, N, V, I; X16=Y, N, S, T, Q; X17=A, G, V, I, L; X18=K, R, X19=Y, N, Q, T, S y X20=G, R, K.
(23) Un compuesto según (22) que comprende una secuencia de aminoácidos:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (SEQ ID No.: 24);
en la que X1=T, Q; X2=I, F; Xa=I, T; X4=K, S; X5=R, T, K; X6=T, G, S, N, I; X7=P, S; X8=R, K, P; X9=D, Q, N, E; X10=A, Y, I, L, W; Xn=D, R, P, K, E, S; X12=P, H, V; Xrs=R, K, Q; X14=K, D, A, R; X15=E, Q, A, L; X16=Y, N; X17=A, G; X18=K, R, X19=Y, N y X20=G, R.
(24) Un compuesto según (23) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 25 o SEQ ID No. 26.
(25) Un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.: 27);
en la que X1=P,I, F, V, A, L, W; X2=K, S, T, Y, R; X3=R, T, K, S, Y; X4=T, G, S, N, I, K, Q, A, V, L, Y; X5=P, S, T; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W, S, T, V, L, F; X9=D, R, P, K, E, S, T, Y; X10=P, H, V, I, L, A; Xn=R, K, Q, N; X12=K, D, A, R, E, V, L, I; Xrs=E, Q, A, L, D, N, V, I; X14=Y, N, S, T, Q; X15=A, G, V, I, L; X16=K, R, X17=Y, N, Q, T, S y X18=G, R, K.
(26) Un compuesto según (25) que comprende una secuencia de aminoácidos:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.: 28);
en la que X1=P,I, F; X2=K, S; X3=R, T, K; X4=T, G, S, N, I; X5=P, S; X6=R, K, P; X7=D, Q, N, E; X8=A, Y, I, L, W; X9=D, R, P, K, E, S; X10=P, H, V; Xn=R, K, Q; X12=K, D, A, R; Xrs=E, Q, A, L; X14=Y, N; X15=A, G; X16=K, R, X17=Y, N y X18=G, R.
(27) Un compuesto según (26) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 29, SEQ ID No.: 30 o SEQ ID No.: 31.
(28) Un compuesto según cualquiera de (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (13), (14), (17), (19), (20), (22), (23), (25) o (26), en el que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3.
(29) Un compuesto según cualquiera de (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (13), (14), (17), (19), (20), (22), (23), (25) o (26), en el que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kv1.3 en comparación con el canal de potasio Kv1.1.
(30) Una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos tal como se menciona en cualquiera de (1) a (27).
(31) Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según (30).
(32) Una célula huésped que comprende una secuencia de ácido nucleico según (30) o un vector según (31).
(33) Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de (1) a (29).
(34) Un compuesto según cualquiera de (1) a (29) o una composición farmacéutica según (33) para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, obesidad, parodontitis y/o rechazo de trasplante de tejido.
(35) Uso de un compuesto según cualquiera de (1) a (29) o una composición farmacéutica según (33) en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria, obesidad, parodontitis y/o rechazo de trasplante de tejido.
(36) Método de tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmunitaria, obesidad, parodontitis y/o rechazo de trasplante de tejido en un mamífero administrando un compuesto según cualquiera de (1) a (29) o una composición farmacéutica según (33) a un mamífero que lo necesita.
(37) Método de fabricación de un compuesto según cualquiera de (1) a (29) usando una secuencia de ácido nucleico según (30), un vector según (31) o una célula huésped según (32).
Ejemplos
Ejemplo 1 - Mediciones electrofisiológicas
Se midieron corrientes de potasio mediante el uso de células de Spodoptera frugiperda (Sf 21), que expresan el canal Kv1.3 humano (hKv1.3). Se induce la actividad del canal tras la despolarización de la membrana hasta voltajes más positivos que -40 mV. La cinética de activación es rápida y fuertemente dependiente del voltaje, mientras que la inactivación es mucho más lenta y no muestra dependencia del voltaje significativa. En células Sf 21, hKv1.3 tiene una amplitud de corriente promedio de entre 250 pA - 5 nA a 40 mV.
1 - 3 días tras la infección, se registraron las corrientes de potasio con la técnica de pinzamiento de voltaje plano, usando el dispositivo Port-A-Patch (Nanion Technologies GmbH). Se activaron corrientes iónicas mediante etapas de voltaje hasta un potencial de despolarización de 40 mV durante 200 ms.
Se cultivaron células Sf 21 en medio de células de insecto de Grace suplementado con FBS al 10% (suero bovino fetal), glutamina 2 mM, 1x Yeastolate (a partir de una disolución madre 50x) y Pluronic® F68 al 0,1% (BASF) hasta una densidad celular de 2 - 3 x 106 células/ml.
Los tampones electrofisiológicos fueron los siguientes:
Tampón externo: NaCl 160 mM
KCl 4,5 mM
MgCl21 mM
CaCl22 mM
D-Glucosa monohidratada 5 mM
HEPES 10 mM / NaOH pH 7,4
Tampón interno: KCl 75 mM
NaCl 10 mM
Fluoruro de K 70 mM
MgCl22 mM
EGTA 10 mM
HEPES 10 mM / KOH pH 7,2
Para demostrar la selectividad de los péptidos descritos en el presente documento (SEQ ID No.: 1 a 31 y en particular cgtx-544 (SEQ ID No.: 25), Se determinaron las CI50 para la unión de cgtx-544 a Kv1.3, Kv1.1 y Kv1.5. HsTx 1 (SEQ ID No.: 32) se sometió a prueba como control.
Se disolvieron los péptidos a 1 pg/pl en tampón NaPO420 mM pH 8,2 (1 mg en 1 ml de tampón de plegamiento) y se dializaron frente al mismo tampón 3x 1 l, punto de corte de Float-a-Lyzer de 500 Da (Spectrapor) a temperatura ambiente.
Se sometió a prueba la unión de HsTx 1 a diversas concentraciones de por ejemplo 100 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM y 1 pM, dependiendo del canal sometido a prueba. Se representan mediciones representativas para Kv 1.1, Kv1.3 y Kv1.5 en las figuras 1 a), 1b) y 1 c) respectivamente.
La CI50 para la unión de HsTx 1 a Kv1.3 era de 25 2,1 nM. La CI50 para la unión de HsTx 1 a Kv1.1 era de 11,3 pM. No pudo detectarse unión para Kv1.5. Por tanto, HsTx 1 tiene una selectividad ~450 veces mayor para Kv1.3 frente a Kv1.1.
Se sometió a prueba la unión de Cgtx-544 a diversas concentraciones de por ejemplo1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 1 pM y 5 pM, dependiendo del canal sometido a prueba. Se representan mediciones representativas para Kv1.1, Kv1.3 y Kv1.5 en las figuras 1 d), 1e) y 1) f, respectivamente.
La CI50 para la unión de cgtx-544 a Kv1.3 era de 6,9 nM. Hasta una concentración de 10 pM, no pudo detectarse unión a Kv1.5. Se bloqueó Kv1.1 hasta aproximadamente el 22% a 10 pM. Por tanto, cgtx-544 tiene una selectividad mayor para Kv1.3 frente a Kv1.1 en comparación con HsTx 1.
Ejemplo 2 - Comparación de la unión a Kv1.3 y hERG
En el siguiente ejemplo, se comparó la unión de los péptidos seleccionados a Kv1.3 y hERG mediante mediciones electrofisiológicas.
Sistemas celulares
Para determinar la unión a Kv1.3, se usaron células Jurkat que expresaban de manera endógena Kv1.3. Para la unión a hERG, se usaron células HEK que expresaban de manera endógena hERG.
Cultivo celular
Se realizó el cultivo celular usando técnicas de cultivo celular convencionales. En resumen, se hicieron crecer las células sobre placas de cultivo de 10 cm o frascos de cultivo T75 en medios basados en DMEM. Con una confluencia de aproximadamente el 60 - 80%, se dividieron las células cada 2 - 3 días. Para los registros en el dispositivo Patchliner (Nanion), se resuspendieron células Jurkat y luego se centrifugaron en una centrífuga. Antes centrifugar, se trataron las células HEK con tripsina, para desprenderlas de la superficie de la placa. Tras centrifugar, se resuspendieron las células en tampón de registro externo hasta una densidad de aproximadamente 1 - 2 millones de células por ml.
Disolución de registro interna: KCl 50 mM
NaCl 10 mM
KF 60 mM
EGTA 20 mM
HEPES 10 mM/KOH, pH 7,2, (Osm: -290 mOsm)
Se añadieron Mg-ATP 5 mM y Na-GTP 0,3 mM a la disolución interna y se ajustó el pH a 7,2.
Tampón de registro externo: NaCl 140 mM
KCl 4 mM
MgCl21 mM
CaCl22 mM
D-Glucosa monohidratada 5 mM
HEPES 10 mM/NaOH pH 7,4, (Osm: -298 mOsm)
Compuestos
Se sometieron a prueba los siguientes compuestos:
Compuesto 1: cgtx 538
Compuesto 2: cgtx 539
Compuesto 3: cgtx 540
Compuesto 4: cgtx 541
Compuesto 5: cgtx 542
Compuesto 6: cgtx 543
Compuesto 7: cgtx-544
Compuesto 8: cgtx 547
Mediciones electrofisiológicas
Se realizaron registros electrofisiológicos con un dispositivo Patchliner, que registra hasta 8 canales, simultáneamente. El dispositivo Patchliner es un sistema de pinzamiento de voltaje automatizado que utiliza chips de vidrio de borosilicato (NPC-16) para pinzamiento de voltaje plano, y que funciona por medio del software PatchControlHT. Se usaron para los registros chips NPC-16 con una resistencia de 3-5 MQ para células Jurkat y 2-3 MQ para células HEK. Durante los registros, se mantuvieron las células en un “hotel de células” donde se pipetearon periódicamente arriba y abajo para mantener la viabilidad. Las células eran viables durante aproximadamente 2 - 3 horas.
Software PatchControlHT
Para hacer funcionar el dispositivo Patchliner, se ejecutan dos programas en el ordenador, simultáneamente, PatchControlHT de Nanion y PatchMaster de HEKA.
PatchMaster controla los amplificadores HEKA EPC10 y ejecuta los registros. Pueden generarse protocolos de pulsos y análisis en línea dentro de este programa. Se usa PatchControlHT para definir la rutina experimental completa desde la captura y el sellado de las células hasta llegar a la célula completa y la obtención de los registros deseados. La comunicación bidireccional entre PatchControlHT y PatchMaster permite que PatchControlHT ajuste sus acciones según el estado de la célula (gigasello, configuración de célula completa). El programa navega completamente por las funciones robóticas del dispositivo Patchliner incluyendo la pipeta para realizar intercambios de disolución. Simultáneamente, PatchControlHT también controla el amplificador lee todos los parámetros de pinzamiento importantes a partir del PatchMaster. PatchControlHT es una interfaz de usuario gráfica, en donde se definen todos los parámetros y criterios de éxito para el experimento. Si los criterios de éxito no se alcanzan para un pocillo de registro, está disponible la opción de que PatchControlHT interrumpa el registro de ese pocillo particular.
Rutina experimental
Para establecer las condiciones de registro apropiadas, se lograron el llenado del chip, la captura de células, el sellado y la penetración en modo de célula completa mediante funciones de procedimiento convencionales del dispositivo Patchliner. Al final de esta rutina, los parámetros del amplificador (por ejemplo potencial de retención, compensación de capacidad lenta y ganancia) se establecieron apropiadamente para los registros deseados, luego se inició el registro.
Dentro de cada experimento, se lavaron las células tres veces con disolución externa para permitir registros estables. Los compuestos 1-8 se sometieron a prueba adicionalmente en células que expresan hERG. El tiempo de exposición de cada compuesto fue de 4 minutos, en total, cada experimento duró 24 minutos.
Protocolo de voltaje
Para hERG: se provocaron corrientes de hERG usando un protocolo de etapas de voltaje desde un potencial de retención de -80 mV a -40 mV durante 500 ms seguido por una etapa hasta 40 mV durante 500 ms, un pulso de prueba de -40 mV durante 500 ms para obtener la corriente de cola, y luego regresando al potencial de retención. La etapa se repitió cada 10 segundos.
Los protocolos se ejecutaron de manera continua y se leyeron los resultados en línea de manera continua. Se realizó esto de modo que los cambios debidos a lavados y/o aplicación de compuestos pudieran monitorizarse y evaluarse el logro de un estado estacionario.
Análisis de datos
Se realizaron el registro y análisis de datos con 2x amplificadores EPC10 Quadro, el paquete de software PatchMaster (HEKA Electronics, Lambrecht/Pfalz, Alemania), Excel y Igor (WaveMetrics, EE.UU.).
Para la farmacología en hERG, se calculó la amplitud de pico en la 2a etapa de -40 mV (corriente de cola) usando funciones de análisis en línea en PatchMaster. Se restó la fuga (calculada desde la 1a etapa hasta -40 mV) de este pico para calcular el pico verdadero y estos podrían representarse gráficamente en función del tiempo.
Se exportaron los valores a Excel para calcular las curvas de respuesta a la concentración en Igor. Se dibujaron las figuras y se exportaron usando Igor (WaveMetrics, EE.UU.). Se construyeron curvas de respuesta a la concentración en Igor. Se ajustó una ecuación de Hill para estimar la CI50 para cada compuesto y se calculó la CI50 en relación con el bloqueo máximo. Los valores se representan como promedio EEM cuando es posible. Resultados
Compuestos 1-8 sometidos a prueba sobre corriente de hERG
Las mediciones electrofisiológicas de los compuestos 1-8 sobre corrientes de Kv1.3 indicaron que estos péptidos eran activos. Por tanto, se sometieron a prueba los compuestos 1-8 en células HEK que expresaban hERG. Para investigar el efecto de estos compuestos, se realizó un procedimiento de cribado de dos puntos. Habitualmente, se sometieron a prueba de 3 a 5 células para garantizar la precisión. Cada experimento comentó con tres lavados para garantizar corrientes estables. Las corrientes de hERG aumentaron ligeramente, pero se volvieron estables tras el segundo lavado. Los compuestos 1, 2, 4, 5, 7 y 8 parecían tener solo efectos bajos sobre la corriente de hERG. Habitualmente, los efectos de los compuestos 1-8 podían explicarse también mediante los efectos de descarga de las corrientes de hERG. Los resultados se muestran en la figura 3. En la tabla 1 se representa un resumen del bloqueo de corriente medio EEM de todos los compuestos.
Tabla 1
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Análisis adicional
El análisis anterior se realizó tras someter los respectivos péptidos a un protocolo de plegamiento tal como se describe en el ejemplo 8 sin purificar los péptidos completamente plegados.
Además, se plegó y purificó cgtx-544 tal como se describió anteriormente. Entones se repitió el análisis con este cgtx-544 (ind.). Además, se sometió entonces a prueba cgtx-544 (ind.) sobre Kv1.3 incubando durante periodos de tiempo más prolongados, concretamente 20 min aproximadamente, un tiempo que se correlaciona mejor con la con la velocidad de activación larga del péptido. En estas condiciones, cgtx-544 (ind.) presenta una CI50 de aproximadamente 900 pM tras el plegamiento y la purificación en comparación con 6,9 nM del cgtx-544 sin purificar (véase el ejemplo 1). Los resultados se representan en la figura 35.
Ejemplo 3 - Estabilidad de cgtx-544 (SEQ ID No.: 25) en plasma humano y de rata
1. Determinación de la estabilidad ex vivo en muestras de suero humano y de rata
El objetivo era someter a prueba la estabilidad del péptido cgtx-544 en plasma sanguíneo de mamíferos tras diferentes tiempos de incubación a temperatura ambiente (TA) y 37°C. Se definió la estabilidad como el valor de CI50 de cgtx-544 tras diferentes tiempos de incubación a TA y 37°C. Se preparó plasma sanguíneo a partir de muestras de sangre nuevas de seres humanos o ratas sanos. Se añadió heparina a las muestras de sangre nuevas para prevenir la coagulación. Se realizó la preparación de plasma mediante centrifugación durante 2 min a 2000xg a TA.
La CI50 de cgtx-544 se definió antes del inicio del experimento, el ensayo electrofisiológico proporcionó un valor de CI50 de 46,1 nM 3,9 nM (para n= 5 células). Puesto que el péptido cgtx-544 usado en estos experimentos estaba plegado de manera incompleta, se determinó una CI50 mayor de lo normal. Un control negativo del plasma de ser humano y rata preparado no mostró unión inespecífica de componentes del plasma a canales Kv1.3 expresados en células de insecto Sf21.
Para investigar la estabilidad y actividad en plasma, se añadió el péptido a plasma sanguíneo humano y de rata recién preparado a una concentración final de 20 pM. Se dividieron las muestras en dos alícuotas y se incubaron a 37°C y a temperatura ambiente (TA, 20°C). Para el análisis electrofisiológico, se prepararon diluciones en serie de las muestras.
Punto de tiempo de 0 h: Directamente tras añadir el péptido al plasma, se analizaron las muestras y presentaban una fuerte afinidad por canales Kv1.3. El valor de CI50 mejoró hasta 20,9 nM para cgtx-544 en plasma humano y 15,0 nM en plasma de rata (datos no mostrados).
Punto de tiempo de 24 h: Durante las siguientes 24 horas, no pudo detectarse un cambio significativo en la actividad de las sondas peptídicas almacenadas a 37°C y TA.
Punto de tiempo de 48 h: Tras 48 horas, la actividad del péptido incubado a 37°C disminuyó y los valores de CI50 de cgtx-544 incubado en plasma humano o en plasma de rata eran dos veces mayores en comparación con t= 0 h (37,3 nM y 57,8 nM respectivamente). La actividad de cgtx-544 almacenado a TA permaneció sin cambios.
Punto de tiempo de 14 días: Tras 14 días de incubación a 37°C, no se detectó actividad. Sondas de cgtx-544 incubadas a TA presentaban una actividad sin cambios.
Ejemplo 4 - Eficacia de cgtx-544 (SEQ ID No.: 25) sobre células Tem humana aisladas
1. Análisis de corrientes de Kv1.3 Tem humanas aisladas
Se usó la línea de células de insecto Spodoptera frugiperda (Sf21) en combinación con un sistema de infección por Baculovirus para la expresión heteróloga de canales iónicos recombinantes. Las células Sf21 ofrecen una expresión de proteínas altamente específica y modificaciones postraduccionales correctas que dan como resultado canales funcionales con la comparabilidad propuesta de parámetros electrofisiológicos de canales iónicos in vivo. Por tanto, era necesario comparar las propiedades electrofisiológicas del canal iónico selectivo de potasio Kv1.3 expresado en células Sf21 y canales Kv1.3 expresados endógenamente en células Tem.
Para la comparación de la activación característica del canal Kv1.3 dependiente de voltaje, se usó un protocolo de voltaje típico de desde -60 mV hasta 60 mV en etapas de 20 mV (pulso de activación de 200 ms). Las células se pinzaron a un potencial de retención de -100 mV. La figura 4 muestra la respuesta de corriente de dos células Sf21 y Tem individuales (figuras 4A y 4B, respectivamente) y el protocolo de pulsos para la activación de Kv1.3 dependiente de voltaje (figura 4C).
La figura 5 muestra la correlación normalizada de voltaje-corriente correspondiente. Kv1.3 comienza a abrirse a una despolarización de la membrana desde el potencial de retención (-100 mV) hasta -20 mV y alcanza su estado abierto máximo a 60 mV. Aun cuando la expresión de Kv1.3 es mucho mayor en células Sf21, la activación característica dependiente de voltaje permanece sin cambios.
La corriente máxima observada, que se origina claramente a partir de la actividad de Kv1.3, y el voltaje aplicado permiten evaluar la conductividad total de todos los canales Kv1.3. En consecuencia, el número de canales puede extraerse usando la conductividad conocida de un solo canal Kv1.3. La corriente de salida de K+ máxima se define como la diferencia entre las corrientes no bloqueada activada y bloqueadas de manera máxima (bloqueo total) durante el primer 20% del perfil de corriente. Mediante la variación de las condiciones de infección, es posible controlar el nivel de expresión de Kv1.3 en células Sf21, según las necesidades de la investigación. En las condiciones convencionales, puede estimarse una corriente máxima de 2 - 5 nA, una conductancia de 33 - 50 nS y un número de 2500 a 3800 canales por célula.
El sistema de expresión heterólogo en células Sf21 presenta un método adecuado para el análisis electrofisiológico de canales iónicos farmacológicamente interesantes in vitro. Basándose en estas observaciones, puede suponerse que el plegamiento y la inserción de canales iónicos Kv1.3 en la membrana plasmática de células Sf21 es comparable a proteínas Kv1.3 nativas en células Tem.
Podría demostrarse claramente que los canales Kv1.3 expresados de manera heteróloga pueden servir como sistema modelo para estudiar el direccionamiento de fármacos mediante la evaluación de parámetros electrofisiológicos. Se realizó un bloqueo de Kv1.3 específico con el compuesto peptídico cgtx-544. El péptido muestra una alta afinidad en canales Kv1.3 tal como se mostró anteriormente y también se sometió a prueba en células Tem humanas aisladas (figura 6). Obsérvese que el cgtx-544 usado en estos experimentos estaba plegado de manera incompleta y presenta una CI50 más alta de lo normal. No obstante, el compuesto presentó los mismos valores en células Sf21 transfectadas con Kv1.3 que en células Tem humanas (figura 6).
Ejemplo 5 - Terapia de artritis inducida por antígeno con el péptido cgtx-544 (SEQ ID No.: 25)
1. Modelo experimental
1. AIA - Artritis inducida por antígeno
El modelo de enfermedad de artritis inducida por antígeno (AIA) en ratas representa una artritis autoinmunitaria dependiente de células T, que se asemeja a muchas características de la artritis reumatoide en seres humanos. Por tanto, este sistema puede servir como modelo de enfermedad para la evaluación del éxito terapéutico de péptidos supresores de células T descritos en el presente documento. Una ventaja importante de este enfoque terapéutico con respecto a las terapias actuales (por ejemplo, el uso de citostática general) es el hecho de que solo se suprime el subconjunto pequeño del sistema inmunitario que está causalmente implicado en la generación de la enfermedad, mientras que otros componentes importantes de la defensa inmunitaria como, por ejemplo, el sistema inmunitario innato todavía está intacto. Además, este modelo de enfermedad permite las pruebas de eficacia y tolerancia de péptidos cgtx in vivo.
2. Inducción de artritis.
Todo el experimento tiene lugar en un período de tiempo de 4 semanas. La preinmunización tiene lugar el día -21 (inicio del experimento) y el día -14, mediante inyección subcutánea de una mezcla de mBSA y preparaciones de M. tuberculosis en adyuvante incompleto de Freund (IFA). La inducción local de inflamación en una articulación de la rodilla se induce mediante una única inyección intraarticular del antígeno mBSA en la rodilla derecha el día 0. En esta configuración experimental, la segunda articulación de la rodilla no tratada (izquierda) sirve como control intraindividual.
Las articulaciones de la rodilla tratadas desarrollan una reacción de hinchazón grave durante las primeras horas después de la inducción, que habitualmente alcanza un máximo de hinchazón los días 1 y 2 después de la inducción. Este fenotipo es estable durante otros 2 a 3 días y después de eso la hinchazón disminuye nuevamente.
Este esquema permite la inducción de una artritis local, reproducible en > 95% de los animales experimentales. En los experimentos de control negativo, se administró el mismo volumen (como para la disolución de inducción de mBSA) de NaCl al 0,9% en la rodilla de los animales de control (véanse las figuras 7 y 8).
2. Material y métodos
2.1 Animales
Ratas Lewis, hembra, de 180-200 g de peso corporal (PC), de edad aprox. de 8 semanas, Janvier, Francia. Los animales se mantuvieron en condiciones convencionales de alojamiento: 5 animales por jaula Makrolon tipo IV, comida y agua a voluntad en un ritmo de 12 horas de día/noche, temperatura ambiente a 22 /- 2°C con humedad del aire al 55 /- 5%.
2.2. Producción de la emulsión para inmunización, inmunización animal e inducción de artritis local.
2.2.1. Emulsión para inmunización y el proceso de inmunización.
2.2.1.1. Material: Mycobacterium tuberculosis H37 Ra (BD 231141)
Adyuvante incompleto de Freund (Sigma F5506)
mBSA (Sigma A1009-1G)
NaCl al 0,9% (Braun)
Isoflurano (Abbott)
2.2.1.2. Emulsión preinmunización:
Disolución A: Disolución madre de mBSA (50 mg/ml): Adición de 20 ml de agua para iny. a 1 vial de mBSA (1g) en condiciones asépticas. La disolución estéril puede almacenarse a 4°C durante varios meses.
Disolución B: Disolución madre de adyuvante completo de Freund (CFA) (10 mg/ml): Adición de 10 ml (1 vial) de adyuvante incompleto de Freund a 1 vial de M. tuberculosis que contiene 100 mg de bacterias. La disolución puede almacenarse a 4°C durante 1 mes.
Preparación de la mezcla
Ambos componentes se mezclan a volúmenes iguales dando como resultado una emulsión (mezclado en condiciones asépticas en una mesa de trabajo limpia). Los componentes se pipetean a un tubo Falcon de 15 ml o 50 ml como se describe a continuación:
1. Disolución A - disolución madre de mBSA
2. Disolución B - disolución de M. tuberculosis.
Directamente después de la adición de los componentes, el tubo se agita con vórtex durante 20 segundos. En la última etapa de preparación, la disolución se emulsiona con un procesador ultrasónico (0,5 ciclos con una amplitud del 60%) hasta que se forma una emulsión espesa.
2.2.1.3. Preinmunización
Los animales se preinmunizaron dos veces antes de la inducción final de la artritis. Las preinmunizaciones tuvieron lugar el día 21 y el día 14. En estos puntos de tiempo, la disolución de inmunización se inyectó por vía subcutánea. Después de la inducción de narcosis con isoflurano al 5%, se mantuvo la anestesia con isoflurano al 2%. Se aplicaron un total de 500 pl de la disolución emulsionada usando una cánula de 25 G. Se inyectaron 125 pl de emulsión de preinmunización por vía subcutánea en 2 lados (derecho e izquierdo) de la base de la cola, así como en 2 lados por encima de la escápula izquierda y derecha.
2.2.1.4. Inducción de artritis local.
El día 0, se indujo artritis mediante administración intraarticular del antígeno (500 pg de mBSA en 50 pl de NaCl al 0,9%) en la articulación de la rodilla derecha. La rodilla izquierda se dejó intacta como control intraindividual. Los animales se narcotizaron y el sitio de inyección se desinfectó. La aplicación se realizó con una cánula corta y fina (30 G, 1/2) para minimizar el daño tisular. Después de la administración del antígeno y la retirada de la cánula, la articulación se flexionó y se extendió lentamente varias veces.
2.2.2. Medición de la hinchazón de la articulación de la rodilla.
Se determinó el diámetro sagital de la articulación de la rodilla con un calibre. Los animales experimentales se narcotizaron durante un breve período de tiempo y colocaron de espaldas. Se ajustó la pierna en un ángulo de 90 grados y se llevó a cabo la medición del diámetro sagital de la rodilla tres veces.
2.2.3. Extracción de sangre
Para la extracción de sangre, se narcotizaron los animales brevemente, se desinfectó la cola y se puncionó la vena de la cola con una cánula, se extrajeron 50 pl de sangre con una pipeta recubierta con heparina y se mezclaron con 5 pl de un agente estabilizante (CPD) y 1 pl de heparina (1,5 U/pl diluida 1:4 en NaCl al 0,9%). 2.2.3. Hematología
Se contaron los glóbulos blancos (WBC) con un contador Coulter en el modo automático.
2.2.4. Medición del peso corporal
Se midió el peso corporal de los animales experimentales una vez al día entre las 8:00 y las 9:00 a.m.
2.2.5. Examen clínico y medición de la hinchazón de las articulaciones de la rodilla.
Después de la inducción de artritis local, se examinaron los animales experimentales diariamente. Se midió la hinchazón de las articulaciones de la rodilla y se puntuó el estado de salud general.
2.3. Tratamiento de animales de experimentación.
El tratamiento de los animales comenzó el día -3 con la aplicación del péptido cgtx-544 (SEQ ID No. 25) con una dosificación de 1 mg/kg de peso corporal (PC) en un volumen de 0,6 ml de NaCl al 0,9% o alternativamente para los animales de control con el mismo volumen de NaCl al 0,9% (excipiente). El péptido o el excipiente, respectivamente, se administró por vía i.v. en la vena de la cola de los animales narcotizados. Los animales tratados se observaron durante aprox. una hora después del tratamiento.
3. Resultados
Durante la fase de preinmunización, los animales experimentales se monitorizaron intensamente y los días -21, -14, -7, 0 y 7 se extrajeron muestras de sangre para la monitorización del estado inmunitario de los animales. Había una muy buena correlación entre el desarrollo de la inflamación y los recuentos de glóbulos blancos (WBC, leucocitos) en la sangre periférica en los puntos de tiempo correspondientes del análisis.
El número de WBC en la sangre periférica de los animales recién inmunizados (día -21 y día -14) aumenta drásticamente en comparación con los animales no tratados (véase la figura 9). El número de WBC alcanza un máximo entre los días -14 y -7 y disminuye después de eso. El aumento de los WBC se correlaciona con la gravedad de la inflamación inducida por la inmunización.
Inmediatamente después de la inducción de la artritis local, los WBC muestran un aumento a corto plazo (véase la figura 9). Sin embargo, este aumento a corto plazo es menor porque la respuesta inflamatoria está localizada. Los animales de control que se inmunizaron con NaCl al 0,9% no mostraron diferencias en los recuentos de WBC.
Los animales preinmunizados desarrollan una reacción de hinchazón grave de la articulación de la rodilla derecha solo unas pocas horas después de la inducción de artritis local mediante inyección de mBSA (véase la figura 8). Por el contrario, la rodilla izquierda no tratada que sirve como rodilla de control intraindividual no muestra ningún signo de reacción de hinchazón.
La comparación de animales que se han tratado con péptido cgtx-544 con los controles no tratados (excipiente) revela que el tratamiento con cgtx-544 conduce a una reducción clara de la hinchazón de la articulación de la rodilla en comparación con los animales de control no tratados (véase la figura 10). Puede concluirse que los animales tratados con cgtx-544 muestran una reducción obvia de la hinchazón de la articulación de la rodilla y una regresión más rápida de la hinchazón en comparación con los animales de control no tratados.
Ejemplo 5a - Eficacia preventiva del péptido cgtx-544 en el modelo de rata con AIA de RA
1. Material y métodos
Después de dos inmunizaciones el día 21 y el día -14 con una emulsión del antígeno mBSA en adyuvante completo de Freund y 750 pg de Mycobacterium (M.) tuberculosis inactivado por calor, se indujo AIA mediante inyección intraarticular de BSA metilada el día 0 en la rodilla derecha tal como se describe en el ejemplo 5. Para estudios de eficacia del péptido cgtx-544, las ratas recibieron inyecciones intravenosas diarias de 0,1, 1 o 5 mg/kg de péptido cgtx-544 (nivel de dosis bajo, medio y alto) comenzando el día -3 o vehículo (NaCl al 0,9%) durante un período de 10 días (día -3 hasta día 6).
La gravedad de la artritis se monitorizó mediante la medición de los diámetros de la articulación de la rodilla por triplicado con un calibre. Los valores se normalizaron al día -21. La diferencia de los valores de hinchazón de la rodilla se calculó restando los diámetros de la rodilla izquierda (no inducida) de la derecha (inducida).
Se tomaron muestras de sangre regularmente para la monitorización de parámetros hematológicos. Los parámetros hematológicos se evaluaron semanalmente en todos los animales antes de la inducción, el día de la inducción y 10 días después de la inducción (días -21, -14, -7, 0 y 10). Los datos hematológicos de animales no tratados (día -21) fueron comparables a los notificados en la bibliografía (Waynforth y Flecknell, 1992). Los recuentos absolutos de glóbulos blancos (WBC), granulocitos y linfocitos de neutrófilos se analizaron entre otros, los dos últimos también se establecieron en porcentaje de w Bc totales. Se midió la sangre completa con EDTA de siete individuos tanto del grupo de terapia con péptido cgtx-544 como con vehículo con el dispositivo Sysmex XT-2000i.
2. Resultados
Todos los niveles de dosis sometidos a prueba de cgtx-544 (0,1, 1 y 5 mg/kg de PC) mostraron un claro efecto reductor, dependiente de la dosis y estadísticamente significativo sobre la hinchazón de la rodilla en animales tratados (figura 18).
Para un análisis estadístico de los resultados, se usó la prueba de la t de dos muestras de Welsh. A continuación, se muestra el análisis estadístico de todos los niveles de dosis sometidos a prueba de cgtx-544 (0,1, 1 y 5 mg/kg de PC) para el día 1 y 3. Todos los niveles de dosis sometidos a prueba mostraron una reducción estadísticamente significativa en la hinchazón de la rodilla en comparación con el grupo de control de vehículo (figura 19).
En resumen, la terapia con péptido cgtx-544 en el modelo de AIA tuvo un fuerte efecto sobre los síntomas artríticos inflamatorios, particularmente sobre la hinchazón de la rodilla con una reducción máxima del 70%. Después de siete días de tratamiento, los diámetros de la rodilla en el grupo de terapia disminuyeron adicionalmente hasta un diámetro casi comparable a la rodilla de control intraindividual no inducida. Además, WBC, granulocitos neutrófilos y linfocitos (datos no mostrados) de individuos tratados con péptido cgtx-544 mostraron recuentos celulares absolutos y relativos comparables a los individuos tratados con vehículo.
Ejemplo 5B - Eficacia curativa de cgtx-544 en el modelo de rata con AIA de RA
1. Materiales y métodos
Después de dos inmunizaciones el día -21 y el día -14 con una emulsión del antígeno mBSA en adyuvante completo de Freund y 750 pg de Mycobacterium (M.) tuberculosis inactivado por calor, se indujo AIA mediante inyección intraarticular de BSA metilada el día 0 en la rodilla derecha tal como se describió anteriormente en el ejemplo 5. Para los estudios de eficacia del péptido cgtx-544, las ratas recibieron inyecciones intravenosas diarias de 1 mg/kg de péptido cgtx-544 comenzando el día 0 inmediatamente después de la inducción de artritis o comenzando el día 1. Los animales de control recibieron inyecciones diarias de vehículo (NaCl al 0,9%).
La gravedad de la artritis se monitorizó mediante la medición de los diámetros de la articulación de la rodilla por triplicado usando un calibre. Los valores se normalizaron al día -21. Las diferencias de los valores de hinchazón de la rodilla se calcularon restando los diámetros de la rodilla izquierda (no inducida) de la derecha (inducida). 2. Resultados
Ambos puntos de tiempo sometidos a prueba de inicio del tratamiento con cgtx-544 (mezcla) (1 mg/kg de PC) mostraron un claro efecto reductor y estadísticamente significativo sobre la hinchazón de la rodilla en los animales tratados (figura 20).
Para un análisis estadístico de los resultados, se usó la prueba de la t de dos muestras de Welsh. A continuación, se muestra el análisis estadístico de ambos regímenes de tratamiento de cgtx-544 (d0 y d1) para los días 1, 2 y 3. Ambos regímenes de tratamiento mostraron una reducción estadísticamente significativa en la inflamación de la rodilla en comparación con el control del vehículo (figura 21) .
El transcurso temporal del recuento de glóbulos blancos (WBC) se muestra en la figura 22. El transcurso temporal de los neutrófilos se muestra en la figura 23. El transcurso temporal de los linfocitos se muestra en la figura 24.
El tratamiento con cgtx-544 (mezcla) muestra una reducción significativa en la hinchazón de la articulación de la rodilla. Se supuso que la hinchazón restante en los animales tratados se debía a reacciones de antígeno/anticuerpo. Por tanto, se sometieron a prueba animales inmunizados así como vírgenes para detectar la presencia de anticuerpos específicos de mBSA. Pudieron detectarse anticuerpos contra mBSA en todos los animales inmunizados de los grupos H e I siete días después de la inducción de la artritis (figura 27). Los animales vírgenes (grupo experimental F) no mostraron ninguna reactividad en mBSA. La terapia con cgtx-544 no parece suprimir los linfocitos B y la formación de anticuerpos. Además, los animales inmunizados después de 10 días bajo terapia con péptido cgtx-544 no mostraron reactividad en cgtx-544 (mezcla) (proteína de fusión L544-2a con etiqueta de trx, datos no mostrados).
En resumen, la terapia con péptido cgtx-544 en el modelo de AIA tuvo un fuerte efecto sobre los síntomas artríticos inflamatorios, particularmente sobre la hinchazón de la rodilla con una reducción máxima del 40% si la terapia comenzaba el día 0 inmediatamente después de la inducción de la artritis o del 58% si la terapia comenzaba el día 1. Después de siete días de tratamiento, los diámetros de la rodilla en los grupos de terapia disminuyeron adicionalmente hasta un diámetro casi comparable a la rodilla de control intraindividual no inducida. Además, WBC, granulocitos neutrófilos y linfocitos de individuos tratados con péptido cgtx-544 mostraron recuentos celulares absolutos y relativos comparables a los individuos tratados con vehículo.
Ejemplo 5C - Eficacia sostenida de cgtx-544 (mezcla) en el modelo de rata con AIA de RA
Experimentos previos (véanse los ejemplos 5A y 5B) habían demostrado que cgtx-544 tiene una excelente eficacia en el modelo de rata con AIA bajo diferentes regímenes de tratamiento, curativos y preventivos, cuando se aplica diariamente. Se intentó aclarar durante cuánto tiempo se mantiene la actividad de cgtx-544 en el modelo de AIA con el fin de una idea de cuánto durarán los intervalos de tratamiento con cgtx-544. Por tanto, se estableció un régimen de tratamiento curativo con un esquema de aplicación una vez a la semana.
1. Materiales y métodos
Después de dos inmunizaciones el día -21 y el día -14 con una emulsión del antígeno mBSA en adyuvante completo de Freund y 750 pg de Mycobacterium (M.) tuberculosis inactivado por calor, se indujo AIA por inyección intraarticular de BSA metilada el día 0 en la rodilla derecha tal como se describió anteriormente en el ejemplo 5. Para los estudios de efecto de la terapia sostenida y eficacia del péptido cgtx-544, las ratas (10 individuos) recibieron una única inyección intravenosa de 1 mg/kg de péptido cgtx-544 el día 1 (d1) después de la inducción de la artritis. El día 4 (d4) el grupo de terapia con cgtx-544 se dividió en dos subgrupos de 5 individuos cada uno. El primer subgrupo recibió una segunda inyección de cgtx-544 con el fin de evaluar si una segunda inyección conduciría a una reducción adicional de la hinchazón. El segundo subgrupo no recibió una dosis adicional. Los animales de control recibieron una única inyección de vehículo (NaCl al 0,9%) el día 1.
La gravedad de la artritis se monitorizó midiendo los diámetros de la articulación de la rodilla por triplicado usando un calibre. Los valores se normalizaron al día -21. Las diferencias de los valores de hinchazón de la rodilla se calcularon restando los diámetros de la rodilla izquierda (no inducida) de la derecha (inducida).
2. Resultados
La inyección individual (1 x d1) con cgtx-544 (1 mg/kg de PC) mostró una reducción clara y estadísticamente significativa de la hinchazón de la rodilla en los animales tratados 24 h después de la aplicación (figura 25). La hinchazón pudo reducirse nuevamente hasta un valor significativo después de una segunda inyección individual en el día 4 (1 x d1 y 1 x d4). La hinchazón de la rodilla permaneció al mismo nivel y no aumentó después de la primera y segunda inyección.
Para un análisis estadístico de los resultados, se usó la prueba de la t de dos muestras de Welsh. A continuación se muestra el análisis estadístico de ambos regímenes de tratamiento de cgtx-544 (1 x d1 o 1 x d1 y 1 x d4) para el día 2 (antes de que el grupo se dividiera) y el día 5 (grupos divididos). Ambos regímenes de tratamiento mostraron una reducción estadísticamente significativa en la hinchazón de la rodilla 24 h después de cada inyección en comparación con el control del vehículo (figura 26).
En resumen, la terapia con péptido cgtx-544 en el modelo de AIA tuvo un efecto fuerte y sostenido sobre los síntomas artríticos inflamatorios, particularmente sobre la hinchazón de la rodilla con un comienzo de la reducción de la hinchazón 24 h después de una inyección individual. Incluso tres días después de la inyección individual, el péptido cgtx-544 demostró efecto clínico y actividad sostenidos, permaneciendo el nivel de hinchazón de la rodilla constante. Por tanto, el péptido no tiene que administrarse diariamente para lograr un efecto terapéutico sostenido en el modelo de rata con AIA. Por tanto, es posible lograr intervalos de tratamiento de 3-4 días para administración i.v. (o más largos para una posible ruta de administración s.c.).
Ejemplo 6 - Comparación de la terapia con metotrexato (MTX) con la terapia con péptido cgtx-544 (SEQ ID No.: 25) en el modelo de rata con AIA
1. Comparación de la terapia con metotrexato (MTX) con la terapia con cgtx-544 (SEQ ID No.: 25) en el modelo de rata con AIA
Dependiendo de la forma y gravedad de la enfermedad, la terapia con metotrexato (MTX) difiere en a dosis y el régimen. Comparable a terapias convencionales, se examinó una terapia con MTX de dosis alta 1 mg/kg de peso corporal 1 x a la semana por vía s.c. (grupo J, n=7) y una terapia con MTX de dosis baja con 100 pg/kg de peso corporal 1 x al día por vía i.v. (grupo L, n=7) en el modelo de rata con AIA. La terapia con MTX de dosis alta comenzó el primer día del experimento (día -21) y se administró otras tres veces (día -14, - 7, 0). La terapia con MTX de dosis baja comenzó tres días antes de la inducción de artritis (día -3) y duró otros siete días después de la inducción de artritis. Se compararon los resultados con el grupo de terapia con cgtx-544 I (1 mg/kg de peso corporal de cgtx-544, mismo régimen que el grupo L) y el grupo de control de vehículo H (NaCl al 0,9% 1 x al día por vía i.v. comenzando el día de la inducción, día 0). Se monitorizó la gravedad de la artritis mediante la medición de los diámetros de la articulación de la rodilla por triplicado usando un calibre. Se tomaron muestras de sangre completa con EDTA regularmente para monitorizar el estado inmunitario.
1.1 Reducción de la hinchazón de la rodilla hasta un menor grado con la terapia con MTX en comparación con la terapia con cgtx-544
En primer lugar, el parámetro de rodilla de los grupos de terapia con MTX de dosis alta (J) y dosis baja (L) se compara con el grupo de control de vehículo (H), con el fin de mostrar posibles diferencias de eficacia dependiendo de la dosis y el régimen. En segundo lugar, se comparan los tres grupos con el mismo régimen (aplicación i.v. diaria), grupo de terapia con MTX de dosis baja (L), grupo de terapia con cgtx-544 (I) y grupo de control de vehículo (H). Se calculó la diferencia del aumento absoluto de la hinchazón restando los diámetro de la rodilla izquierda (no inducida) de la derecha (inducida). La diferencia calculada al comienzo del experimento de los grupos de terapia con MTX tanto de dosis alta como de dosis baja estaba próxima a cero (0,01 0,06 mm y 0,0 0,03 mm respectivamente), ya que ambas rodillas tienen un tamaño comparable. Un día después de la inducción de artritis, la diferencia se eleva hasta 3,17 1,26 mm y 3,45 0,87 mm, respectivamente (figura 11).
En contraposición al grupo de terapia con cgtx-544, la disminución de la hinchazón no es muy rápida en comparación con el grupo de control de vehículo que tiene una diferencia absoluta de 3,79 1,10 mm (figura 12).
Para la normalización de los valores con un aumento a escala entre 0 y 1, el aumento relativo de la hinchazón se fija a 0 al comienzo del experimento (día -21), y la diferencia del aumento relativo de la hinchazón se calculó como anteriormente. La diferencia relativa de los grupos de terapia con MTX de dosis alta y dosis baja llegó a 0,39 0,16 y 0,43 0,11, respectivamente (figura 13).
En comparación, el grupo de control de vehículo y el grupo de terapia con cgtx-544 llegó a 0,46 0,14 y 0,18 0,05, respectivamente (figura 14). En resumen, en relación con el grupo de control de vehículo, se observó una reducción de la hinchazón de la rodilla en un promedio del 15% en ratas con terapia con MTX de dosis alta y del 7% en ratas con terapia con MTX de dosis baja, en comparación con el 60% en ratas con terapia con cgtx-544 24 h después de la inducción de artritis.
1.2 Efecto citostático de MTX sobre células en proliferación
Para examinar el estado de salud de todos los individuos, se usaron de nuevo hemogramas completos. Se midió la sangre completa con EDTA de siete individuos de los grupos de terapia con MTX de dosis alta y dosis baja con el dispositivo Sysmex XT-2000i.V semanalmente antes de la inducción, el día de la inducción y 4 y 7 días después de la inducción (día -21, -14, -7, 0, 4 y 7; grupo de terapia con MTX de dosis baja adicionalmente el día -3, cuando comenzó la aplicación i.v.). Los datos hematológicos de los animales no tratados (día -21) son comparables a los datos proporcionados en la bibliografía.
1.2.1 Glóbulos blancos
Al comienzo del experimento (día -21), el recuento de glóbulos blancos del grupo de terapia con MTX de dosis alta y dosis baja llegó a 9,41 1,42 x 103/pl y 11,66 2,81 x 103/pl, respectivamente. Debido a las reacciones inflamatorias del sistema inmunitario, el recuento de WBC se elevó tras la primera y segunda inmunización hasta 20,79 5,96 x 103/pl y 24,01 3,81 x 103/pl, respectivamente (día -7). Los valores son comparables al grupo de control de vehículo y el grupo de terapia con cgtx-544. En el plazo de siete días, el recuento de WBC disminuyó ligeramente. Cuatro días después de la inducción de artritis, el recuento de WBC del grupo de terapia con m Tx de dosis alta aumentó de nuevo, probablemente debido a procesos inflamatorios agudos relacionados con la inducción. No puede decirse si este efecto también se produce en el grupo de terapia con cgtx-544 y el grupo de control de vehículo, ya que para estos dos grupos no se analizó sangre completa con EDTA ese día. Además, para el grupo de terapia con MTX de dosis baja, el recuento de WBC puede no servir como comparación apropiada, ya que el efecto citotóxico de MTX puede influir en la composición sanguínea cuatro días después de la inducción de artritis. Otros siete días después de la inducción de artritis, el recuento de WBC disminuyó adicionalmente en los grupos de terapia con MTX tanto de dosis alta como de dosis baja hasta 14,68 2,15 x 103/pl y 6,63 1,37 x 103/pl, respectivamente (día 7) (figura 15), mostrando por tanto un efecto citostático de la terapia con MTX de dosis baja. Los recuentos de WBC disminuyeron en casi el 50% en comparación con el comienzo del experimento. En contraposición, el recuento de WBC del grupo de terapia con MTX de dosis alta es comparable a los del grupo de terapia con cgtx-544 y grupo de control de vehículo.
1.2.2 Granulocitos neutrófilos
Al comienzo del experimento (día -21), el recuento de granulocitos neutrófilos absoluto del grupo de terapia con MTX de dosis alta y dosis baja llegó a 1,55 0,52 x 103/pl y 1,93 0,6 x 103/pl respectivamente (figura 16A) (igual al 16,39 ± 4,85% de neutrófilos relativos del recuento de WBC total y el 16,64 ± 4,07% de neutrófilos relativos del recuento de WBC total, respectivamente (figura 16B)). Como el recuento de WBC, el recuento de granulocitos neutrófilos también se elevó después de la primera y segunda inmunización hasta 7,54 3,19 x 103/pl y 10,77 2,7 x 103/pl respectivamente (día -7, igual al 35,46 7,08% de WBC y el 44,33 5,4% de WBC, respectivamente). En el plazo de siete días, el recuento de granulocitos neutrófilos disminuyó y siete días después de la inducción los recuentos del grupo de terapia con MTX de dosis alta eran comparables a los del comienzo del experimento (1,94 1,1 x 103/pl, igual al 12,63 6,1% de WBC). Este efecto también se observó en el grupo de terapia con cgtx-544 y el grupo de control de vehículo. El grupo de terapia con MTX de dosis baja mostró un aumento mucho más mayor con 0,33 0,36 x 103/pl de granulocitos neutrófilos (día 7, igual al 4,41 4,63% de WBC).
1.2.3 Linfocitos
Al comienzo del experimento (día -21), el recuento de linfocitos absoluto del grupo de terapia con MTX de dosis alta y dosis baja llegó a 7,39 1,05 x 103/pl y 9,21 2,4 x 103/pl, respectivamente (figura 17A) (igual al 78,77 4,76% de WBC y el 78,97 3,94% de WBC, respectivamente (figura 17B)). El recuento de linfocitos en los grupos de terapia con MTX tanto de dosis alta como de dosis baja, a diferencia de los recuentos de WBC y de granulocitos, no se elevó significativamente después de la primera y segunda inmunización, contando 11,68 2,8 x 103/pl y 11,83 1,35 x 103/pl, respectivamente (día -7). Esto es igual al 57,01 6,45% de WBC y el 49,83 5,45% de WBC, respectivamente (día -7), mostrando porcentajes disminuidos ya que el recuento de WBC total aumentó fuertemente. En el plazo de siete días, el porcentaje de linfocitos de WBC aumentó de nuevo y siete días después de la inducción, en el grupo de terapia con MTX de dosis alta, era comparable al porcentaje al comienzo del experimento (el 78,16 7,20% de WBC, día 7) a diferencia del grupo de terapia con MTX de dosis baja, en donde incluso se volvió más alto (el 93,13 4,66% de WBC, día 7). Los recuentos absolutos del grupo de terapia con MTX de dosis alta aumentaron y los del grupo de terapia con MTX de dosis baja disminuyeron, en comparación con el comienzo del experimento: 11,38 1,15 x 103/pl y 6,14 ± 1,11 x 103/pl, respectivamente (día 7). Aunque el recuento de linfocitos absoluto del grupo de terapia con MTX de dosis baja se reduce siete días después de la inducción de artritis en comparación con el comienzo del experimento, todavía representan aproximadamente el 93% de todos los glóbulos blancos. Esto conduce a la suposición de que otras subpoblaciones de leucocitos se ven más afectadas por el efecto citotóxico que la población de linfocitos.
El tratamiento con MTX conduce a una inhibición de dihidrofolato reductasa y da como resultado un efecto citostático sobre células en proliferación. A diferencia de los individuos con terapia con cgtx-544, que no mostraron una inmunosupresión generalizada, los individuos tratados con MTX mostraron diferentes efectos en los hemogramas en comparación con el grupo de control de vehículo. Siete días después de la inducción de artritis, los individuos tratados con dosis baja tenían una reducción del recuento de WBC, recuento de granulocitos neutrófilos y recuento de linfocitos. Además, esto da como resultado una composición diferente de todos los porcentajes de glóbulos blancos. Además, se observó una reducción mucho más pequeña de la hinchazón de la rodilla en comparación con el 60% en ratas con terapia con cgtx-544 24 h después de la inducción de artritis en ambos regímenes con MTX (el 7% y el 15%).
Para el análisis estadístico de los resultados de eficacia de MTX, se usó la prueba de la t de dos muestras de Welsh. A continuación se muestra el análisis estadístico de todos los niveles de dosis de MTX sometidos a prueba (0,1 mg/kg de PC por vía i.v. y 1 mg/kg de PC por vía s.c.) para el día 1 y 3 (figura 28).
En resumen, el tratamiento con MTX conduce a una inhibición de la dihidrofolato reductasa y da como resultado un efecto citostático sobre células en proliferación. A diferencia de los individuos con terapia con péptido cgtx-544, los individuos tratados con MTX mostraron efectos diferentes en el hemograma en comparación con el grupo de control de vehículo. Siete días después de la inducción de artritis, los individuos tratados con dosis baja tenían una reducción del recuento de WBC, el recuento de granulocitos neutrófilos y el recuento de linfocitos. Adicionalmente, esto da como resultado una composición diferente de todos los porcentajes de glóbulos blancos. Además, se observó una reducción mucho más pequeña de la hinchazón de la rodilla en comparación con el 70% máximo en ratas con terapia con péptido cgtx-544 24 h después de la inducción de artritis en ambos regímenes con MTX (el 7% y el 15%).
Ejemplo 7 - Caracterización adicional de cgtx-544
El péptido cgtx-544 consiste en 38 aminoácidos naturales sin modificaciones y tiene un peso molecular de aproximadamente 4220 Da. Comparte determinadas similitudes de dominios funcionales con la subfamilia a-KTx6 de péptidos de escorpión. cgtx-544 está restringido por 4 puentes disulfuro y la estructura tridimensional comprende una conformación de hélice a/lámina p.
Fabricación de cgtx-544
La figura 29 proporciona una vista esquemática de las etapas de fabricación del péptido cgtx-544. La síntesis de péptidos se lleva a cabo sobre una resina de poliestirol insoluble con una estrategia de F-moc. La amina N-terminal libre de un péptido unido a la fase sólida se acopla a una única unidad de aminoácido protegido en N. Esta unidad se desprotege luego (los grupos F-moc se escinden a pH básico mediante piperidina), revelando una nueva amina N-terminal a la que puede unirse un aminoácido adicional. Los grupos terc-butiloxicarbonilo (Boc) sirven como grupos de protección de la cadena lateral permanentes y se escinden después de que la síntesis de péptidos termine por tratamiento con TFA (ácido trifluoroacético).
Después de completar la síntesis del péptido, el péptido se desprotege y se escinde de la resina de poliestirol. En este momento, el producto peptídico en bruto presenta una pureza de aproximadamente el 50% seguido por UPLC y CL-EM analíticas. En una etapa posterior, el péptido en bruto se purifica por HPLC preparativa dando como resultado un producto peptídico lineal con una pureza de > 90%.
Plegamiento del péptido cgtx-544
Esta disolución de péptido se pliega mediante oxidación (formación de enlaces disulfuro). El método de plegamiento se basa en la formación de enlaces en tampón fosfato a pH 8,3 en presencia de oxígeno atmosférico. El análisis por HPLC de cgtx-544 plegado según este protocolo mostró que el péptido existe como una mezcla de variantes plegadas y parcialmente plegadas. Este producto de plegamiento intermedio se denomina cgtx-544 (mezcla). Basándose en datos electrofisiológicos generados con material de diferentes picos de UPLC aislados, se concluyó que un pico (tiempo de retención de 12,77 min) en la mezcla de plegamiento se correlaciona con el péptido activo nativo, mientras que todos los demás picos no se correlacionan con la actividad electrofisiológica (figura 30). Por tanto, después de la reacción de plegamiento, el péptido activo (tiempo de retención de 12,77 min) se purificó de la mezcla cgtx-544 de péptidos plegados y parcialmente plegados mediante HPLC preparativa. Después de esta etapa de purificación, el péptido activo, denominado cgtx-544 (ind.), tiene habitualmente una pureza estimada de más del 95%. El péptido cgtx-544 (ind.) purificado es altamente soluble y estable en disolución de NaCl al 0,9% a temperatura ambiente y 4°C durante varias semanas.
Debido al desarrollo del proceso, el péptido purificado cgtx-544 (ind.) se produjo solo en un formato a pequeña escala. Por tanto, el material estaba limitado y se usó en experimentos destinados a identificar los valores de CI50 de cgtx-544 (ind.) en Kv1.3, Kv1.1, Kv1.2 y Kv1.5 (véase el ejemplo 8). La mezcla de plegamiento no purificada de cgtx-544 (cgtx-544 (mezcla)) se usó en todos los demás experimentos descritos en el presente documento (ejemplos 1 a 6) a menos que el término cgtx-544 (ind.) indique lo contrario. El contenido de material activo en la mezcla se calculó que era del 15%.
En resumen, el péptido cgtx-544 presenta las siguientes propiedades bioquímicas que se vuelven importantes para el análisis bioquímico:
• cgtx-544 es un péptido altamente básico, que contiene 6 aminoácidos de lisina y 2 de arginina y es capaz de adherirse a superficies de viales de vidrio a bajas concentraciones (< 100 ng/ml).
• Contiene 8 aminoácidos de cisteína, que están conectados por 4 puentes disulfuro.
• Punto isoeléctrico: 9,29.
• PM: 4212 Da cuando los puentes disulfuro están unidos, PM: 4220,2 Da en forma reducida
• Debido a la presencia de 4 puentes disulfuro, la estructura de cgtx-544 es compacta.
Ejemplo 8 - Caracterización adicional de la selectividad de canales iónicos de cgtx-544 (ind.) basándose en análisis electrofisiológico
1. Materiales y métodos
Se expresaron canales iónicos por medio de células Sf21 infectadas por Baculovirus (constructos de Kv1.1, Kv1.3 y Kv1.5) o células CHO transfectadas de manera estable (Kv1.2) tal como se describió en los ejemplos 1, 2 y 4. El análisis electrofisiológico se realizó en el dispositivo de pinzamiento de voltaje automatizado “Patchliner” (Nanion Technologies, Munich, Alemania). El dispositivo Patchliner se basa en un chip de vidrio de borosilicato (NPC-16) de método de pinzamiento de voltaje plano en lugar de una pipeta de vidrio. El dispositivo Patchliner es capaz de registrar cuatro células al mismo tiempo. Todos los registros de canales se realizaron en el modo de célula completa. Los registros de datos se realizaron con el software PatchMaster (HEKA Electronics, Lambrecht/Pfalz, Alemania). La visualización de los resultados experimentales se realizó con el software IGOR (Wavemetrics, EE.UU.). Los datos promedio se presentan como media error estándar de la media (EEM). Se usaron compuestos de prueba como disoluciones madre concentradas (principalmente 1,5 pg/pl). Las disoluciones madre se diluyeron en tampón hasta las concentraciones finales requeridas.
2. Resultados
2.1 CI50 - Análisis del canal Kv1.3 diana
Después de la síntesis química (véase el ejemplo 7), el péptido se plegó mediante oxidación con oxígeno atmosférico y la fracción de péptido correctamente plegada (biológicamente activa) se purificó por HPLC preparativa. Este péptido cgtx-544 purificado se designó cgtx-544 (ind.) para el pico singular.
El análisis electrofisiológico de cgtx-544 (ind.) dio como resultado un excelente valor de CI50 de 6,9 nM (figura 31).
2.2 Análisis electrofisiológico de cgtx-544 (ind.) en Kv1.1, Kv1.2 y Kv1.5
El análisis electrofisiológico de cgtx-544 (ind.) en Kv1.1, Kv1.2 y Kv1.5 demostró que cgtx-544 es altamente selectivo. Los resultados de la caracterización electrofisiológica de cgtx-544 (ind.) en Kv1.1, Kv1.2 y Kv1.5 se resumen en la figura 32.
Ejemplo 9 - Resistencia a proteasas de cgtx-544 (ind.)
Además de los experimentos descritos en el ejemplo 3, la estabilidad del péptido cgtx-544 se sometió a prueba en muestras de suero sanguíneo en condiciones in vitro. Por tanto, se determinó la estabilidad de cgtx-544 (ind.) en suero sanguíneo humano mediante la adición de una cantidad conocida de cgtx-544 (ind.) al suero sanguíneo humano y una incubación posterior a 37°C. La actividad de bloqueo de ctx-544 (ind.) se midió en canales Kv1.3 a lo largo de un período de 57 días. cgtx-544 (ind.) es extremadamente estable en suero sanguíneo humano. Su actividad permanece constante durante al menos 16 horas y decae lentamente hasta que no puede detectarse más efecto de bloqueo de péptidos después de 57 días. Esto demuestra que cgtx-544 es muy resistente a la acción de proteasas sanguíneas (figura 33).
No se observa reducción en la potencia de bloqueo en relación con las mediciones realizadas en ausencia de suero, con la CI50 restante en el intervalo de 7 nM. Las muestras de control de suero sin péptido no mostraron bloqueo inespecífico de Kv1.3. Por tanto, se concluyó que el efecto de bloqueo observado se debe únicamente al efecto de cgtx-544 (ind.). En representación de la concentración de cgtx-544 (ind.) medida en la disolución incubada a lo largo de los 57 días, se retuvo el 50% de actividad de cgtx-544 (ind.) durante un período de 5 días en suero humano a 37°C.
En resumen, la persistencia de cgtx-544 en suero humano a 37°C es muy alta. cgtx-544 no se une a componentes del suero, en el caso de que lo haga, con afinidades muy bajas, y es extremadamente resistente a la degradación por proteasas presentes en el suero humano.
Ejemplo 10 - Semivida in vivo de cgtx-544 (ind.)
El objetivo de este estudio fue implementar un bioensayo para evaluar la semivida in vivo de cgtx-544 (ind.) en la rata. Experimentos previos (ejemplo 3) habían demostrado que cgtx-544 no se degrada rápidamente cuando se realizan adiciones conocidas al suero y se incuba a 37°C.
1. Materiales y métodos
Las ratas recibieron inyecciones i.v. de cgtx-544 (ind.) (750 |ig/kg de PC). Se extrajo sangre en los puntos de tiempo de 0, 1, 10 y 60 minutos. Posteriormente, se preparó suero a partir de muestras de sangre. El contenido de cgtx-544 en estas muestras se analizó electrofisiológicamente midiendo el efecto de bloqueo sobre canales Kv1.3 expresados en células CHO. La muestra de control de suero sin péptido (0 minutos) no mostró bloqueo inespecífico de Kv1.3, y la actividad cgtx-544 (ind.) de la muestra de 1 minuto se consideró como el 100%. La muestra recogida en el tercer punto de tiempo (60 minutos) presentaba el 10% de la actividad de bloqueo original. Con el fin de estudiar la cantidad de cgtx-544 (ind.) no unido en la rata, se calculó la cantidad de cgtx-544 (ind.) presente en la sangre circulante en los puntos de tiempo mencionados anteriormente a través de una curva de calibración. Esta curva de calibración se obtuvo añadiendo cantidades conocidas de cgtx-544 (ind.) al suero sanguíneo y mediciones electrofisiológicas posteriores en canales Kv1.3. El bloqueo de las corrientes de Kv1.3 mediante estas muestras con adiciones conocidas fue similar al obtenido con cgtx-544 (ind.) en ausencia de suero (datos no mostrados).
2. Resultados
El decaimiento de cgtx-544 (ind.) en la sangre de ratas tratadas sigue la curva de decaimiento típica, produciendo una semivida de aproximadamente t1/2 = 26 min (figura 34), con una concentración aproximada de 62 nM de cgtx-544 (ind.) en la sangre circulante. Esta concentración es suficiente para lograr un bloqueo completo de los canales Kv1.3. Esta semivida está en el intervalo observado para otros bloqueantes de canales peptídicos: las variantes de la toxina ShK presentan una semivida de entre 20 y 50 minutos.
En resumen, la semivida in vivo de cgtx-544 después de la aplicación i.v. en la rata está en el intervalo del péptido competidor ShK. La semivida in vivo es de aproximadamente 26 minutos. Debido al tamaño pequeño y la estructura compacta de cgtx-544, se supone que el péptido se aclara de la sangre lo más probablemente por medio de filtración renal. Es razonable suponer que la semivida de cgtx-544 en seres humanos sea más larga que en ratas, porque la rata tiene una tasa metabólica mucho más rápida que los seres humanos. La semivida in vivo no se corresponde con la duración del efecto del fármaco ya que el péptido se une fuertemente al canal iónico y lo bloquea durante largos períodos de tiempo.
Ejemplo 11 - Datos clínicos

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 25.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kvl.3.
3. Compuesto según las reivindicaciones 1 o 2, en el que el compuesto es capaz de unirse selectivamente al canal de potasio Kvl.3 en comparación con el canal de potasio Kv1.1.
4. Secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos tal como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3.
5. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 o composición farmacéutica según la reivindicación 5, en el que dicho compuesto o composición farmacéutica es adecuado para administración oral, nasal, sublingual, percutánea, intravenosa o intramuscular.
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 o composición farmacéutica según la reivindicación 5 o 6, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad autoinmunitaria, obesidad, parodontitis y/o rechazo de trasplante de tejido.
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 o composición farmacéutica según la reivindicación 5 o 6, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad autoinmunitaria, seleccionada del grupo que comprende esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, diabetes tipo 1, vasculitis, enfermedad de Hashimoto, síndrome de Sjogren, encefalomielitis diseminada aguda (ADEM), enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpo antifosfolípido (APS), anemia aplásica, hepatitis autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, penfigoide gestacional, gota, enfermedad de Behcet, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Grave, síndrome de Guillian-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Kawasaki, lupus eritematoso, miastenia grave, síndrome opsoclono-mioclono, neuritis óptica, tiroiditis de Ord, pénfigo, anemia perniciosa, poliartritis (en perros), cirrosis biliar primaria, síndrome de Reiter, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, anemia hemolítica autoinmunitaria caliente y granulomatosis de Wegener.
9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 o composición farmacéutica según la reivindicación 5 o 6, para su uso en el tratamiento o la prevención de artritis reumatoide.
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