ES2745825T3 - Composiciones y métodos para modular la expresión del factor B del complemento - Google Patents

Composiciones y métodos para modular la expresión del factor B del complemento Download PDF

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Punit Seth
Eric Swayze
Tamar Grossman
Michael Mccaleb
Andrew Watt
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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 440, en donde el oligonucleótido es por lo menos un 80% complementario a la SEQ ID NO: 1 o 2 y en donde el grupo conjugado comprende:**Fórmula**

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para modular la expresión del factor B del complemento
Campo
La presente solicitud se refiere a métodos, compuestos y composiciones para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento administrando un inhibidor específico del Factor B del Complemento (CFB) a un sujeto.
Antecedentes
El sistema del complemento es parte del sistema inmune innato del huésped implicado en la lisis de células extrañas, mejorar la fagocitosis de antígenos, aglutinar agentes portadores de antígenos, y atraer macrófagos y neutrófilos. El sistema del complemento se divide en tres vías de iniciación, las vías clásica, lectina y alternativa, que convergen en el componente C3 para generar un complejo enzimático conocido como C3 convertasa, que escinde C3 en C3a y C3b. La C3b se asocia con la C3 convertasa mediada por CFB y da como resultado la generación de la C5 convertasa, que escinde C5 en C5a y C5b, lo que inicia la vía de ataque a membrana que resulta en la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC) que comprende los componentes C5b, C6, C7. C8, y C9. El complejo de ataque a la membrana (MAC) forma canales transmembrana e interrumpe la bicapa fosfolipídica de las células objetivo, lo que lleva a la lisis celular.
En el estado homeostático, la vía alternativa se activa continuamente a un nivel de "ralentr bajo como resultado de la activación de la vía alternativa por hidrólisis espontánea de C3 y la producción de C3b, que genera C5 convertasa.
La US7696344 B2 se refiere a maximizar la generación de un reactivo de silenciación de genes eficaz seleccionado ARNip particulares por diseño racional, así como métodos para silenciar genes.
La US2004/249178 A1 se refiere a conjugados, conectores degradables, composiciones, métodos de síntesis, y aplicaciones de los mismos, incluyendo conjugados derivados de colesterol, folato, galactosa, galactosamina, N-acetil galactosamina, PEG, fosfolípido, péptido y albúmina de suero humana (HSA) de compuestos biológicamente activos.
La WO2012/177947 A2 se refiere a ácido ribonucleico de cadena doble (ARNbc) dirigido a un gen de APOC3, y métodos de uso del ARNbc para inhibir la expresión de APOC3.
La WO2013/166121 A1 se refiere a conjugados que contienen tetraGaINAc y métodos de administración de oligonucleótidos.
M. Maier et al. (2203) se refiere a un motivo de reconocimiento de carbohidratos multivalente para el receptor de asialoglicoproteína, diseñado para la administración específica a tejidos y células de fármacos antisentido para células hepáticas de la parénquima.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 440 y en donde el grupo conjugado comprende:
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La presente invención también proporciona una composición que comprende el compuesto de la invención o sal del mismo y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona el compuesto o la composición de la invención para su uso en el tratamiento, prevención, o mejora de una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemente en un sujeto.
Sumario de la Divulgación
El sistema del complemento media la inmunidad innata y desempeña un papel importante en la respuesta inflamatoria normal a la lesión, pero su desregulación puede provocar lesiones graves. La activación de la vía del complemento alternativa más allá de su nivel constitutivo de "ralentí" puede llevar a una hiperactividad sin restricciones y se manifiesta como enfermedades de desregulación del complemento.
Ciertas realizaciones de la divulgación se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico del Factor B del Complemento (CFB). Varias realizaciones de la divulgación están dirigidas a un método para inhibir la expresión de CFB en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento mediante la administración de un inhibidor específico de CFB al sujeto. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un inhibidor específico de CFB al sujeto. En varias realizaciones de la divulgación, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un inhibidor específico de CFB al sujeto.
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo" así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativa. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los encabezados de sección usados en la presente son solo con propósitos organizativos y no deben interpretarse como limitativos de la materia descrita.
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son los bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico. Ciertas de tales técnicas y procedimientos pueden encontrarse, por ejemplo, en “Carbohydrate Modifications in Antisense Research" editado por Sangvi and Cook, American Chemical Society , Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21a edición, 2005; y "Antisense Drug Technology, Principies, Strategies, and Applications" editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; y Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"Nucleósido 2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende flúor en la posición 2'. A menos que se indique lo contrario, el flúor en un nucleósido 2'-F está en la posición ribo (reemplazando el OH de una ribosa natural).
"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-O (CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo en la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar modificada en 2'-MOE.
"Nucleósido 2'-sustituido" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosilo distinto de H u OH. En ciertas realizaciones, los nucleósidos 2' sustituidos incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcares bicíclicos.
"Sitio objetivo 3' " se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 3' de un compuesto antisentido particular.
"Sitio objetivo 5' " se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro del ±10% de un valor. Por ejemplo, si se indica, "los compuestos afectaron por lo menos aproximadamente al 70% de inhibición de CFB", está implicado que los niveles de CFB se inhiben dentro de un intervalo del 60% y el 80%.
"Administración" o "administrar" se refiere a las vías de introducción de un compuesto antisentido proporcionado en la presente a un sujeto para realizar su función pretendida. Un ejemplo de una vía de administración que puede usarse incluye, pero no está limitado a, la administración parenteral como inyección o infusión subcutánea, intravenosa o intramuscular.
"Alquilo", como se usa en la presente, significa un radical de hidrocarburos lineal o ramificado saturado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo incluyen típicamente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono (alquilo C 1-C 12), prefiriéndose más de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono.
Como se usa en la presente, "alquenilo" significa un radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un enlace doble de carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, sin limitación, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo, dienos como 1,3-butadieno y similares. Los grupos alquenilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, prefiriéndose más de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alquinilo" significa un radical de hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un enlace triple carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, sin limitación, etinilo, 1 -propinilo, 1 -butinilo y similares. Los grupos alquinilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, prefiriéndose más de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "acilo" significa un radical formado por la eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)-X donde X es típicamente alifático, alicíclico o aromático. Los ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "aNcídico" significa un sistema de anillos cíclico en el que el anillo es alifático. El sistema de anillos puede comprender uno o más anillos en los que por lo menos un anillo es alifático. Los alicíclicos preferidos incluyen anillos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico, como se usa en la presente, puede incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alifático" significa un radical de hidrocarburos lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono en el que la saturación entre dos átomos de carbono cualquiera es un enlace simple, doble o triple. Un grupo alifático contiene preferiblemente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, prefiriéndose más de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede interrumpirse con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Tales grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitación, polialcoxis como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alifáticos como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alcoxi" significa un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno en donde el átomo de oxígeno se usa para unir el grupo alcoxi a una molécula original. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "aminoalquilo" significa un radical alquilo C1-CI2 sustituido con amino. La parte alquilo del radical forma un enlace covalente con una molécula original. El grupo amino puede estar localizado en cualquier posición y el grupo aminoalquilo puede sustituirse con un grupo sustituyente adicional en las partes alquilo y/o amino.
Como se usa en la presente, "aralquilo" y "arilalquilo" significan un grupo aromático que está enlazado covalentemente a un alquilo C1-C12. La parte de radical alquilo del grupo aralquilo (o arilalquilo) resultante forma un enlace covalente con una molécula original. Los ejemplos incluyen, sin limitación, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales unidos al alquilo, el arilo o ambos grupos que forman el grupo radical.
Como se usa en la presente, "arilo" y "aromático" significan radicales del sistema de anillo carbocíclicos mono- o policíclicos que tienen uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. Los sistemas de anillo de arilo preferidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
"Mejora" se refiere a disminuir por lo menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. En ciertas realizaciones, la mejora incluye un retraso o una desaceleración en la progresión de uno o más indicadores de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un humano o animal no humano, incluyendo, pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo pero no limitados a, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificado por dicho ácido nucleico objetivo.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y cadena doble como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc y compuestos basados en la ocupación.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo en ausencia del compuesto antisentido.
Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con el ácido nucleico objetivo, en donde el resultado o el efecto de la hibridación es o la degradación del objetivo o la ocupación del objetivo con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o el corte y empalme.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.
"Complementariedad de base" se refiere a la capacidad para el apareamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico objetivo (es decir, hibridación), y está mediada por unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertida entre nucleobases correspondientes.
"Fracción de azúcar bicíclico" significa una fracción de azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a7 miembros (incluyendo pero no limitado a un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, lo que da como resultado una estructura bicíclica. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En ciertas de tales realizaciones, el puente conecta el carbono 2' y el carbono 41 del furanosilo.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" o "nucleósidos BNA" significa monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 41 y la 21 de la unidad de azúcar del nucleósido, formando de este modo un azúcar bicíclico. Ejemplos de tales azúcar bicíclico incluyen, pero no están limitados a A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (B) P-D-Metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (C) Etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-ON(R)-2') LNAy (E) Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') LnA, tal como se representa a continuación.
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Como se usa en la presente, los compuestos de LNA incluyen, pero no están limitados a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre las posiciones 41 y 21 del azúcar, en donde cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ri)(R2)]n-, -C(Ri)=C(R2)-, -C(Ri)=N-, -C(=NRi)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ri)2-, -S(=O)x- y -N(Ri)-; en donde: x e s 0 , 1 o 2 ; n e s
1, 2, 3 o 4; cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2 -C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo
C5-C20 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJi , NJ1J2, SJi , N3, C0 OJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(= O)2-Ji) o sulfoxilo (S(=O)-Ji); y cada J i y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo Ci -C12 sustituido, o un grupo protector.
Los ejemplos de grupos puente 4-2' abracados dentro de la definición de LNA incluyen, pero no están limitados a, uno de los fórmulas: -[C(Ri)(R2)]n-, -[C(Ri)(R2)]n-O-, -C(RiR2)-N(Ri)-O- o -C(RiR2)-O-N(Ri)-. Además, otros grupos puente incluidos en la definición de LNA son puentes '-CH2-2', 4'-(CH2)2-2',4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' y 4'-CH2-N(R1)-O-2'-, en donde cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
También se incluyen dentro de la definición de LNA de acuerdo con la invención los LNA en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando de este modo un puente metilenoxi (4'-CH2-O-2') para formar la fracción de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para el cual se usa el término metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA. Además; en el caso de la fracción de azúcar bicíclica que tiene un grupo puente etileno en esta posición, se usa el término etilenoxi (4 -CH2CH2-O-2') LNA. También se incluye en la definición de LNA a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2'), un isómero de metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, como se usa en la presente.
"Estructura de tapa" o "fracción de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.
"Carbohidrato" significa un carbohidrato de origen natural, un carbohidrato modificado, o un derivado de carbohidrato.
"Grupo de carbohidratos" significa un compuesto que tiene uno o más residuos de carbohidratos unidos a un andamiaje o grupo conector (ver, por ejemplo, Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, o Rensen et
al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, para ejemplos de grupos conjugados de carbohidratos).
"Derivado de carbohidratos" significa cualquier compuesto que puede sintetizarse usando un carbohidrato como material de partida o producto intermedio.
"cEt" o "acetato restringido" significa una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Modificación química" significa una diferencia química en un compuesto en comparación con una contrapartida de origen natural. Las modificaciones químicas de los oligonucleótidos incluyen modificaciones de nucleósidos (incluidas modificaciones de fracciones de azúcar y modificaciones de nucleobases) y modificaciones de enlaces internucleosídicos. En referencia a un oligonucleótido, la modificación química no incluye diferencias solo en la secuencia de nucleobases.
"Enlace escindible" significa cualquier enlace químico capaz de ser separado. En ciertas realizaciones, un enlace escindible se selecciona de entre: una amida, una poliamida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster de fosfato, un carbamato, un disulfuro o un péptido.
"Fracción escindible" significa un enlace o grupo que es capaz de ser separado bajo condiciones fisiológicas. En ciertas realizaciones, una fracción escindible se escinde dentro de una células o compartimentos subcelulares, como un lisosoma. En ciertas realizaciones, una fracción escindible se escinde por enzimas endógenas, como nucleasas. En ciertas realizaciones, una fracción escindible comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles.
"Conjugado" o "grupo conjugado" significa un átomo o grupo de átomos unidos a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que se unen incluyendo, pero no limitado a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o depuración.
"Conector conjugado" o "conector" en el contexto de un grupo conjugado significa una parte de un grupo conjugado que comprende cualquier átomo o grupo de átomos y que enlaza covalentemente (1) un oligonucleótido con otra parte del grupo conjugado o (2) dos o más partes del grupo conjugado.
Los grupos conjugados se muestran en la presente como radicales, proporcionando un enlace para formar una unión covalente con un compuesto oligomérico como un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 3' del grupo hidroxilo 3' del nucleósido terminal 3' del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 5' del grupo hidroxilo 5' del nucleósido terminal 5' del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, el enlace para formar la unión con el compuesto oligomérico es un enlace escindible. En ciertas de tales realizaciones dicho enlace escindible constituye todo o parte de una fracción escindible.
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden una fracción escindible (por ejemplo, un enlace escindible o nucleósido escindible) y una parte de grupo de carbohidratos, como una parte de grupo GalNAc. Dicha parte de grupo de carbohidratos comprende: una fracción de objetivo y, opcionalmente, un conector conjugado. En ciertas realizaciones, la parte del grupo de carbohidratos se identifica por el número y la identidad del ligando. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la parte del grupo de carbohidratos comprende 3 grupos GalNAc y se designa "GalNAc3". En ciertas realizaciones, la parte del grupo de carbohidratos comprende 4 grupos GalNAc y se designa "GalNAc4". En la presente se describen partes de grupos de carbohidratos específicas (que tienen grupos conectores de unión, ramificación y conjugado específicos) y se designan con la numeración romana seguida del subíndice "a". Por consiguiente, "GalNac3-la" se refiere a una parte de grupo de carbohidratos específicos de un grupo conjugado que tiene 3 grupos GalNac y grupos de unión, ramificación y enlace específicamente identificados. Dicho fragmento de grupo de carbohidratos se une a un compuesto oligomérico a través de una fracción escindible, como un enlace escindible o un nucleósido escindible.
"Compuesto conjugado" significa cualquier átomo, grupo de átomos o grupo de átomos enlazados adecuado para su uso como grupo conjugado. En ciertas realizaciones, los compuestos conjugados pueden poseer o impartir una o más propiedades, que incluyen, pero no están limitadas a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o depuración.
"Nucleósido de etilo restringido" (también nucleósido cEt) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Factor B del complemento (CFB)" significa cualquier ácido nucleico o proteína de CFB. "Ácido nucleico de CFB" significa cualquier ácido nucleico que codifique CFB. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de CFB incluye una secuencia de ADN que codifica CFB, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica CFB (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones), incluyendo una secuencia de ARN que no codifica proteínas (es decir, no codificante), y una secuencia de ARNm que codifica CFB. "ARNm de c Fb" significa un ARNm que codifica una proteína de c Fb .
"Inhibidor específico de CFB" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión o actividad de ARN de CFB y/o proteína de CFB a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de CFB incluyen ácidos nucleicos (incluyendo los compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas, y otros agentes capaces de inhibir la expresión de ARN de CFB y/o proteína de CFB.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.
"Compuestos antisentido quiméricos" significa compuestos antisentido que tienen por lo menos 2 regiones químicamente distintas, y cada posición tiene una pluralidad de subunidades.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Comprender', "comprende" y "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
“Desoxinucleósido” significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar de 2'-H furanosilo, como se encuentra en los desoxirribonucleótidos (ADN) de origen natural. En ciertas realizaciones, un 2'-desoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (por ejemplo, uracilo).
"Desoxirribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Diseñar" o "Diseñado para" se refiere al proceso de diseñar un compuesto oligomérico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Modificado de manera diferente" significa modificaciones químicas o sustituyentes químicos que son diferentes entre sí, incluyendo la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, un nucleósido MOE y un nucleósido de ADN no modificado están "modificados de manera diferente", aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. De igual manera, el ADN y el ARN están "modificados de manera diferente", aunque ambos son nucleósidos no modificados de origen natural. Los nucleósidos que son iguales pero que comprenden nucleobases diferentes no están modificados de manera diferente. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2'-OMe y una nucleobase de adenina no modificada y un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2'-OMe y una nucleobase de timina no modificada no están modificados de manera diferente.
"Cadena doble" se refiere a dos compuestos oligoméricos separados que se hibridan entre sí. Tales compuestos de cadena doble pueden tener uno o más nucleósidos no hibridantes en uno o ambos extremos de una o ambas cadenas (voladizos) y/o uno o más nucleósidos no hibridantes internos (malapareamientos) siempre que haya complementariedad suficiente para mantener la hibridación bajo condiciones fisiológicamente relevantes.
"Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo, y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
"Expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y operativas en una célula. Tales estructuras incluyen, pero no están limitadas a los productos de transcripción y traducción.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
“Furanosilo” significa una estructura que comprende un anillo de 5 miembros que comprende cuatro átomos de carbono y un átomo de oxígeno.
"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H está posicionado entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "hueco" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Halo" y "halógeno" significan un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
"Heteroarilo" y "heteroaromático" significan un radical que comprende un anillo aromático mono- o policíclico, un sistema de anillo o un sistema de anillo fusionado en el que por lo menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. También se entiende que el heteroarilo incluye sistemas de anillos fusionados que incluyen sistemas en los que uno o más de los anillos fusionados no contiene heteroátomos. Los grupos heteroarilo incluyen típicamente un átomo de anillo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo pueden unirse a una molécula original directamente o a través de una fracción de enlace como un grupo alifático o heteroátomo. Los grupos heteroarilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no están limitadas a, un compuesto antisentido y un objetivo de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no están limitadas a, un oligonucleótido antisentido y un objetivo de ácido nucleico.
"Identificar un animal que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno o afección" significa identificar a un animal al que se le ha diagnosticado la enfermedad, trastorno y/o afección o identificar un animal predispuesto a desarrollar la enfermedad, el trastorno y/o la afección. Tal identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y pruebas o evaluaciones clínicas estándar.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción, bloqueo de la expresión o actividad y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre los nucleósidos.
"Grupo de enlace neutro internucleosídico" significa un grupo de enlace neutro que enlaza directamente dos nucleósidos.
"Grupo de enlace de fósforo internucleosídico" significa un grupo de enlace de fósforo que enlaza directamente dos nucleósidos.
Los oligonucleótidos antisentido "alargados" son aquellos que tienen uno o más nucleósidos adicionales con respecto a un oligonucleótido antisentido divulgado en la presente.
"Motivo de enlace significa un patrón de modificaciones de enlace en un oligonucleótido o región del mismo. Los nucleósidos de dicho oligonucleótido pueden estar modificados o no modificados. A menos que se indique lo contrario, los motivos de la presente que describen solamente enlaces se entiende que son motivos de enlace. Por tanto, en tales casos, los nucleósidos no están limitados.
"Desoxinucleósido enlazado" significa una base de ácido nucleico (A, G, C, T, U) sustituida por desoxirribosa ligada por un éster de fosfato para formar un nucleótido.
"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes enlazados entre sí por un enlace internucleosídico.
“Nucleósido de ácido nucleico bloqueado” o “LNA” significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH2-O-2'.
"Malapareamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico u objetivo.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificada y/o una nucleobase modificada.
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un fracción de azúcar modificado, un enlace internucleosídico modificado, o una nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa la sustitución y/o cualquier cambio de un fracción de azúcar natural.
"Modular" se refiere a cambiar o ajustar una característica en una célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, modular el ARNm de CFB puede significar aumentar o disminuir el nivel de ARNm de CFB y/o proteína de CFB en una célula, tejido, órgano u organismo. Un "modulador" efectúa el cambio en la célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de CFB puede ser un modulador que disminuye la cantidad de ARNm de CFB y/o proteína de c Fb en una célula, tejido, órgano u organismo.
"Monómero" se refiere a una unidad individual de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean de origen natural o modificados.
Se entiende que "sistema de anillo mono o policíclico" incluye todos los sistemas de anillo seleccionados de sistemas de anillo radicales individuales o policíclicos en donde los anillos están fusionados o enlazados y se entiende que incluye sistemas de anillo individuales y mixtos seleccionados individualmente de alifático, alicíclico, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroaromático y heteroarilalquilo. Tales estructuras mono y policíclicas pueden contener anillos que tienen cada uno el mismo nivel de saturación o cada uno, independientemente, tienen varios grados de saturación, incluyendo completamente saturado, parcialmente saturado o completamente insaturado. Cada anillo puede comprender átomos del anillo seleccionados de C, N, O y S para dar lugar a anillos heterocíclicos, así como anillos que comprenden solo átomos en el anillo C que pueden estar presentes en un motivo mixto, como por ejemplo bencimidazol en el que un anillo tiene solo un anillo de átomos de carbono y el anillo fusionado tiene dos átomos de nitrógeno. El sistema de anillo mono o policíclico puede sustituirse adicionalmente con grupos sustituyentes como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos =0 unidos a uno de los anillos. Los sistemas de anillos mono o policíclicos pueden unirse a las moléculas originales usando varias estrategias, como directamente a través de un átomo del anillo, fusionarse a través de múltiples átomos del anillo, a través de un grupo sustituyente o mediante una fracción de enlace bifuncional.
"Motivo" significa el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido. "Fracción de azúcar natural" significa un fracción de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
“Grupo de enlace neutro" significa un grupo de enlace que no está cargado. Los grupos de enlace neutro incluyen, sin limitación, fosfo-triésteres, metilfosfonatos, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), amida-3 -(-CH2-C(=O)-N(H)-), amida-4 (-CH2-N-(H)-C(=O)-), formacetal (-O-CH2-O-) y tioformacetal (-S-CH2-O-). Grupos de enlace neutros adicionales incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (ver, por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, (págs. 40-65)). Grupos de enlace neutro adicionales incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a una pareja de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o soportan de otra manera la hibridación.
"Grupo de enlace neutro no internucleosídico" significa un grupo de enlace neutro que no enlaza directamente dos nucleósidos. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza un nucleósido con un grupo distinto de un nucleósido. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
"Grupo de enlace de fósforo no internucleosídico" significa un grupo de enlace de fósforo que no enlaza directamente dos nucleósidos. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza un nucleósido con un grupo distinto de un nucleósido. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no está limitado a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla y ácidos nucleicos de cadena doble.
"Nucleobase" significa un fracción de heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
"Complementariedad de nucleobase" se refiere a una nucleobase que es capaz de emparejar bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria de la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas realizaciones, nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejar bases con una nucleobase de su ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico objetivo, entonces se considera que la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo es complementaria en esa pareja de nucleobases.
“motivo de modificación de nucleobases” significa un patrón de modificaciones a nucleobases a lo largo de un oligonucleótido. A menos que se indique lo contrario, un motivo de modificación de nucleobases es independiente de la secuencia de nucleobases.
"Secuencia de nucleobase" significa el orden de las nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace y/o modificación de nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase ligada a un azúcar.
"Mimético de nucleósidos" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no de furanosa. El mimético de nucleótidos incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos enlazados por-N(H)-C(=O)-O- o otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se superpone con el término ligeramente más amplio mimético de nucleósidos, pero se pretende que indique el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en la presente son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en el que el grupo de azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un azúcar, nucleobase y/o enlace internucleosídico. En general, se usa un mimético en lugar de azúcar o la combinación de azúcar-enlaces-internucleosídico, y la nucleobase se mantiene para la hibridación a un objetivo seleccionado.
“Motivo de nucleósido” significa un patrón de modificaciones de nucleósidos en un oligonucleótido o una región del mismo. Los enlaces de dicho oligonucleótido pueden modificarse o no modificarse. A menos que se indique lo contrario, se entiende que los motivos en la presente que describen solo nucleósidos son motivos de nucleósidos. Por tanto, en tales casos, los enlaces no están limitados.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con por lo menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el que los enlaces internucleosídicos no contienen un átomo de fósforo.
"Oligonudeótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, independientemente uno del otro.
"Administración parenteral" significa la administración por inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
“Grupo de enlace de fósforo” significa un grupo de enlace que comprende un átomo de fósforo. Los grupos de enlace de fósforo incluyen sin limitación grupos que tienen la fórmula:
Figure imgf000012_0001
en donde:
Ra y Rb son cada uno, independientemente, O, S, CH2, NH, o NJ1 en donde J1 es alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
Rbes Oo S;
Rc es OH, SH, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, amino o amino sustituido; y
J1 es Rb es O o S.
Los grupos de enlace de fósforo incluyen sin limitación, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato, fosforamidato, fosforotioamidato, tioalquilfosfonato, tianoalquilfosfonato, fosfotriésteres, tionoalalquilfosfotriéster y boranofosfato.
"Parte" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" se refiere a retrasar o impedir la aparición, desarrollo o progresión de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
“Profármaco” significa una forma inactiva o menos activa de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto, se metaboliza para formar el compuesto activo, o más activo (por ejemplo, fármaco).
"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
“Grupo protector” significa cualquier compuesto o grupo protector conocido por los expertos en la técnica. Ejemplos no limitativos de grupos protectores pueden encontrarse en "Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. Greene, P. G. M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, Nueva York.
"Región" se define como una parte del ácido nucleico objetivo que tiene por lo menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonudeótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Compuesto antisentido basado en RISC" significa un compuesto antisentido en el que por lo menos algo de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible al Complejo de Silenciamiento Inducido por ARN (RISC).
"Compuesto antisentido basado en RNasa H" significa un compuesto antisentido en el que por lo menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible a la hibridación del compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo y la posterior escisión del ácido nucleico objetivo por la RNasa H.
"Segmentos" se definen como partes más pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Regiones separadas" significa partes de un oligonucleótido en el que las modificaciones químicas o el motivo de las modificaciones químicas de cualquier parte adyacente incluyen por lo menos una diferencia para permitir que las regiones separadas se distingan unas de otras
"Motivo de secuencia significa un patrón de nucleobases dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o una parte del mismo. A menos que se indique lo contrario, un motivo de secuencia es independiente de las modificaciones químicas y, por tanto, puede tener cualquier combinación de modificaciones químicas, incluyendo modificaciones no químicas.
"Efectos secundarios" significa una enfermedad fisiológica y/o afecciones atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de la inyección, anomalías de la prueba de función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, el aumento de los niveles de aminotransferasa en suero puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, el aumento de bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.
Los "sitios", como se usan en la presente, se definen como posiciones de nucleobases únicas dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Retardar la progresión" significa una disminución en el desarrollo de dicha enfermedad.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, a la vez que muestra efectos mínimos o ninguno sobre los ácidos nucleicos no objetivo en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos. Las "condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a las condiciones bajo las que un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia objetivo, pero con un número mínimo de otras secuencias.
"Sujeto" significa un humano o animal no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Sustituyente" y "grupo sustituyente" significa un átomo o grupo que reemplaza el átomo o grupo de un compuesto original nombrado. Por ejemplo, un sustituyente de un nucleósido modificado es cualquier átomo o grupo que difiere del átomo o grupo encontrado en un nucleósido de origen natural (por ejemplo, un sustituyente 2' modificado es cualquier átomo o grupo en la posición 2' de un nucleósido distinto de H o OH). Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o no protegidos. En ciertas realizaciones, los compuestos de la presente divulgación tienen sustituyentes en una o en más de una posición del compuesto original. Los sustituyentes también pueden estar sustituidos adicionalmente con otros grupos sustituyentes y pueden estar unidos directamente o a través de un grupo de enlace como un grupo alquilo o hidrocarbilo a un compuesto original.
De igual manera, como se usa en la presente, "sustituyente" en referencia a un grupo funcional químico significa un átomo o grupo de átomos que difiere del átomo o un grupo de átomos normalmente presente en el grupo funcional nombrado. En ciertas realizaciones, un sustituyente reemplaza un átomo de hidrógeno del grupo funcional (por ejemplo, en ciertas realizaciones, el sustituyente de un grupo metilo sustituido es un átomo o grupo distinto del hidrógeno que reemplaza uno de los átomos de hidrógeno de un grupo metilo no sustituido). A menos que se indique lo contrario, los grupos susceptibles para su uso como sustituyentes incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C-(O)-Raa), carboxilo (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxi sustituido (-O-Raa), arilo, aralquilo, radical heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (N (Rbb)-(Rcc)), imino (=NRbb), amido (C(O)N-(Rbb)(Rcc) o N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (NO2), ciano (-CN), carbamido (OC(O)N(Rbb)-(Rcc) o N(Rbb)-C(O)-ORaa), ureido (N(Rbb)C(O)-N(Rbb)(Rcc)), tioureido (N(Rbb)C— (S)N(Rbb) -(Rcc)), guanidinilo (N(Rbb) -C(=NRbb)-N(Rbb)(Rcc)), amidinilo (C(=NRbb)--N(Rbb)( Rcc) o N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfmilo (S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2Rbb) y sulfonamidilo (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) o N(Rbb)-S--(O)2Rbb). En donde cada Raa, Rbb y Rcc es, independientemente, H, un grupo funcional químico opcionalmente enlazado o un grupo sustituyente adicional con una lista preferida que incluye, sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. Los sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en la presente están presentes en un grado recursivo.
"Fracción de azúcar sustituida" significa un furanosilo que no es una fracción de azúcar de origen natural. Las fracciones de azúcar sustituidas incluyen, pero no están limitadas a furanosilos que comprenden sustituyentes en la posición 2', la posición 3', la posición 5' y/o la posición 4'. Ciertas fracciones de azúcar sustituidas son fracciones de azúcar bicíclico.
"Fracción de azúcar" significa una fracción de azúcar de origen natural o una fracción de azúcar modificada de un nucleósido.
"Motivo de azúcar significa un patrón de modificaciones de azúcar en un oligonucleótido o una región del mismo.
"Sustituto de azúcar" significa una estructura que no comprende un furanosilo y que es capaz de reemplazar la fracción de azúcar de origen natural de un nucleósido, de tal manera que las subunidades de nucleósidos resultantes son capaces de enlazarse entre sí y/o enlazarse con otros nucleósidos para formar un compuesto oligomérico que es capaz de hibridar con un compuesto oligomérico complementario. Tales estructuras incluyen anillos que comprenden un número diferente de átomos que el furanosilo (por ejemplo, anillos de 4, 6 o 7 miembros); reemplazo del oxígeno de un furanosilo con un átomo no de oxígeno (por ejemplo, carbono, azufre o nitrógeno); o tanto un cambio en el número de átomos como un reemplazo del oxígeno. Tales estructuras también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para fracciones de azúcar sustituidas (por ejemplo, sustitutos de azúcar carbocíclico bicíclico de 6 miembros que opcionalmente comprenden sustituyentes adicionales). Los sustitutos del azúcar también incluyen reemplazos de azúcar más complejos (por ejemplo, los sistemas sin anillo del ácido nucleico peptídico). Los sustitutos del azúcar incluyen, sin limitación, morfolinos, ciclohexenilos y ciclohexitoles.
"Objetivo" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
"Gen objetivo" se refiere a un gen que codifica un objetivo.
"Dirigir" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico objetivo", "ARN objetivo", "transcripción de ARN objetivo" y "objetivo de ácido nucleico" significan un ácido nucleico capaz de ser atacado por compuestos antisentido.
"Región objetivo" significa una porción de un ácido nucleico objetivo a la que se dirige uno o más compuestos antisentido.
"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5 '" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3 '" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.
"Grupo terminal" significa uno o más átomos unidos a cualquiera de, o ambos, el extremo 3' o el extremo 5' de un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, un grupo terminal es un grupo conjugado. En ciertas realizaciones, un grupo terminal comprende uno o más nucleósidos del grupo terminal.
"Enlace internucleosídico terminal" significa el enlace entre los dos últimos nucleósidos de un oligonucleótido o región definida del mismo.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica a un animal para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección en el animal. En ciertas realizaciones, se pueden administrar una o más composiciones farmacéuticas al animal.
Nucleobases "no modificadas" significan las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases de origen natural, fracciones de azúcar y enlaces internucleosídicos. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Ciertas Realizaciones
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de l0 a 30 nucleósidos enlazadas que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la SEQ ID NO:440.
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende la SEQ ID NO:440 En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores puede comprender por lo menos un enlace internucleosídico modificado, por lo menos un azúcar modificado y/o por lo menos una nucleobase modificada.
En ciertos aspectos, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores puede comprender por lo menos un azúcar modificado. En ciertos aspectos, por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo. En ciertos aspectos, por lo menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico como un grupo 4'-CH(CH3)-O-2', un grupo 4'-CH2-O-2', o un grupo 4'-(CH2)2-O-2'.
En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, como un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 enlaces internucleosídicos de fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado se selecciona de un enlace internucleosídico de fosfodiéster y un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende por lo menos una nucleobase modificada, como 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un grupo conjugado y un oligonucleótido modificado que comprende:
un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende o consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 440, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende o consiste de un oligonucleótido modificado de cadena sencilla y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 440, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 51 que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 31 que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 51 y el segmento de ala 3’, en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende o consiste de ISIS 588540 y un grupo conjugado. En ciertas realizaciones, ISIS 588540 tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000016_0001
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98%, por lo menos un 99% o 100% complementario a un ácido nucleico que codifica CFB.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser de cadena sencilla. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 51 del oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 3' del oligonucleótido modificado. El grupo conjugado comprende tres N-acetilgalactosaminas (GalNAc).
En ciertas realizaciones, un compuesto que tiene la siguiente estructura química comprende o consiste de ISIS 588540 con un 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GaINAc como se define en las reivindicaciones:
Figure imgf000017_0001
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende o consiste de la SEQ ID NO: 440, 5'-GaINAc, y modificaciones químicas como se representan por la estructura química siguiente:
Figure imgf000018_0001
en donde cualquier R1 es -OCH2CH2OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente en donde R1 es -O- y R2 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2-, y R1 y R2 están directamente conectados de tal manera que el puente resultante se selecciona de: -O-CH2-, -O-CH(CH3) - y -O-CH2CH2-;
Y para cada par de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada anillo: cualquier R3 se selecciona de H y -OCH2CH2OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es -CH2-, - CH(CH3)-, o -CH2CH2- y R3 y R4 están directamente conectados de tal manera que el puente resultante se selecciona de: - O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
Y R5 se selecciona de H y -CH3;
Y Z se selecciona de S' y O.
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende ISIS 696844. En ciertas realizaciones, un compuesto consiste de ISIS 696844. En ciertas realizaciones, ISIS 696844 tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000019_0001
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende ISIS 696845. En ciertas realizaciones, un compuesto consiste de ISIS 696845. En ciertas realizaciones, ISIS 696845 tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000020_0001
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende ISIS 698969. En ciertas realizaciones, un compuesto consiste de ISIS 698969. En ciertas realizaciones, ISIS 698969 tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000021_0001
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende ISIS 698970. En ciertas realizaciones, un compuesto consiste de ISIS 698970. En ciertas realizaciones, ISIS 698970tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000022_0001
Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden cualquiera de los compuestos que comprenden o que consisten de un oligonucleótido modificado dirigido a CFB o una sal del mismo y un grupo conjugado, y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en la presente son eficaces en virtud de tener al menos uno de un IC50 in vitro de menos de 250 nM, menos de 200 nM, menos de 150 nM, menos de 100 nM, menos de 90 nM , menos de 80 nM, menos de 70 nM, menos de 65 nM, menos de 60 nM, menos de 55 nM, menos de 50 nM, menos de 45 nM, menos de 40 nM, menos de 35 nM, menos de 30 nM , menos de 25 nM, o menos de 20 nM.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en la presente son altamente tolerables como lo demuestran teniendo por lo menos uno de un aumento de un valor de ALT o AST de no más de 4 veces, 3 veces o 2 veces sobre los animales tratados con solución salina o un aumento en el peso del hígado, bazo o riñón de no más del 30%, 20%, 15%, 12%), 10%, 5% o 2%. En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen la presente son altamente tolerables como lo demuestran no teniendo un aumento de ALT o AST sobre los animales tratados con solución salina. En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en la presente son altamente tolerables como lo demuestran no teniendo un aumento en el peso del hígado, bazo o riñón sobre los animales tratados con solución salina.
Ciertas realizaciones divulgan una composición que comprende el compuesto de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente o una sal del mismo y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos, la composición tiene una viscosidad de menos de aproximadamente 40 centipoise (cP), menos de aproximadamente 30 centipose (cP), menos de aproximadamente 20 centipose (cP), menos de aproximadamente 15 centipose (cP) o de menos de aproximadamente 10 centipose (cP). En ciertos aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades mencionadas anteriormente comprende un compuesto divulgado en la presente a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 125 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 175 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 225 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 275 mg/ml, o aproximadamente 300 mg/ml. En ciertos aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades y/o concentraciones de compuesto mencionadas anteriormente tiene una temperatura de temperatura ambiente o aproximadamente 20° C, aproximadamente 21 ° C, aproximadamente 22° C, aproximadamente 23° C, aproximadamente 24° C, aproximadamente 25° C, aproximadamente 26° C, aproximadamente 27° C, aproximadamente 28° C, aproximadamente 29° C, o aproximadamente 30° C.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto o composición descrito en la presente, tratando, previniendo o mejorando de este modo la enfermedad. En ciertos aspectos, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-808. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobase que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, y 598. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto o composición descrito en la presente, tratando, previniendo o mejorando de este modo la DMAE. En ciertos aspectos, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertos aspectos, la DMAE es DMAE húmeda. En ciertos aspectos, la DMAE es DMAE seca, como Atrofia Geográfica. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular en un sujeto, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), DMAE húmeda, DMAE seca o Atrofia Geográfica comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-808. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), DMAE húmeda, DMAE seca o Atrofia Geográfica en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobase que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), DMAE húmeda, DMAE seca o Atrofia Geográfica en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En ciertos aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad renal asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto o composición descrito en la presente, tratando, previniendo o mejorando de este modo la enfermedad renal. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad renal asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-808. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad renal asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad renal asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En ciertos aspectos, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertos aspectos, la enfermedad renal es nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5, o síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), o cualquier combinación de las mismas. En ciertos aspectos, la enfermedad renal está asociada con depósitos de C3, como depósitos de C3 en el glomérulo. En ciertos aspectos, la enfermedad renal está asociada con niveles de C3 circulantes más bajos de lo normal, como niveles de C3 en suero o plasma. En ciertos aspectos, la administración del compuesto o composición reduce o inhibe la acumulación de niveles de C3 oculares, como los niveles de proteína C3. En ciertos aspectos, la administración del compuesto o composición reduce el nivel de depósitos de C3 oculares o inhibe la acumulación de depósitos de C3 oculares. En ciertos aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral. En ciertos aspectos, la administración del compuesto o composición reduce o inhibe la acumulación de niveles de C3 en el riñón, como los niveles de proteína de C3. En ciertos aspectos, la administración del compuesto o composición reduce el nivel de depósitos de C3 en el riñón o inhibe la acumulación de depósitos de C3 en el riñón, como los niveles de C3 en el glomérulo. En ciertos aspectos, se identifica que el sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento, por ejemplo, detectando niveles de complemento o niveles complejos de membranaataque en la sangre del sujeto y/o realizando una prueba genética para mutaciones genéticas de factores del complemento asociados con la enfermedad.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para inhibir la expresión del Factor B del Complemento CFB) en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un compuesto o composición descritos en la presente al sujeto, inhibiendo de este modo la expresión de CFB en el sujeto. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para inhibir la expresión del Factor B del Complemento (CFB) en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste den un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-808. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para inhibir la expresión del Factor B del Complemento (CFB) en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para inhibir la expresión del Factor B del Complemento (CFB) en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En ciertos aspectos, la administración del compuesto o composición inhibe la expresión de CFB en el ojo. En ciertos aspectos, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), como DMAE húmeda y DMAE seca. En ciertos aspectos, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. La Atrofia Geográfica se considera una forma avanzada de DMAE seca que implica la degeneración de la retina. En ciertos aspectos, la administración del compuesto o composición inhibe la expresión de CFB en el riñón, como en el glomérulo. En ciertos aspectos, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5, o síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), o cualquier combinación de las mismas.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un compuesto o composición descritos en la presente al sujeto, reduciendo o inhibiendo de este modo la acumulación de depósitos de C3 en el ojo del sujeto. En ciertas realizaciones, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-808. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, y 598. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En ciertos aspectos, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), como DMAE húmeda y DMAE seca. En ciertos aspectos, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. En ciertos aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un compuesto o composición descritos en la presente al sujeto, reduciendo o inhibiendo de este modo la acumulación de depósitos de C3 en el riñón del sujeto. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-808. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, y 598. En ciertas realizaciones de la divulgación, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o consiste de ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En ciertos aspectos, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), o cualquier combinación de las mismas. En ciertos aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral.
Ciertas realizaciones de la divulgación están dirigidas al uso de un compuesto o composición descritos en la presente para tratar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento. Ciertas realizaciones de la divulgación están dirigidas al uso de un compuesto que comprende o que consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 6 -808, para tratar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento. Ciertas realizaciones de la divulgación están dirigidas al uso de un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598, para tratar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento. Ciertas realizaciones están dirigidas al uso de un compuesto que comprende o consiste de ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970 para tratar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento. En ciertos aspectos, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertos aspectos, la enfermedad es degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), que puede ser DMAE húmeda o DMAE seca. En ciertos aspectos, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. En ciertos aspectos, la enfermedad es una enfermedad renal como nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5, o síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), o cualquier combinación de las mismas. En ciertos aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral.
En ciertas realizaciones, un compuesto o composición descrito en la presente se administra por vía parenteral. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el compuesto o composición puede administrarse mediante inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal, o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 10 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 12 a 22 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 15 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 15 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 21 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 20 a 30 subunidades. En otras palabras, tales compuestos antisentido tienen de 12 a 30 subunidades enlazadas, 14 a 30 subunidades enlazadas, 14 a 20 subunidades, 15 a 30 subunidades, 15 a 20 subunidades, 16 a 30 subunidades, 16 a 20 subunidades, 17 a 30 subunidades, 17 a 20 subunidades, 18 a 30 subunidades, 18 a 20 subunidades, 18 a 21 subunidades, 20 a 30 subunidades o 12 a 22 subunidades enlazadas, respectivamente.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene 14 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene 16 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene 17 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene 18 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene 19 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene 20 subunidades de longitud. En otras realizaciones, el compuesto antisentido tiene de 8 a 80, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17 a 50, 18 a 22, 18 a 24, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 22, 19 a 30, 19 a 50, o 20 a 30 subunidades enlazadas. En ciertas de tales realizaciones, los compuestos antisentido tienen 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15 , 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 subunidades enlazadas de longitud, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores. En algunas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades enlazadas son nucleótidos.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una subunidad individual puede eliminarse del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de CFB puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando una subunidad adicional individual está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar localizada en el extremo 5' o el 3' del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases malapareadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases malapareadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían malapareamientos. De manera similar, la escisión específica del objetivo se logró usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo aquellos con 1 o 3 malapareamientos.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostró la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y con 3 malapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de tanto bcl -2 como bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Mahery Dolnick(Nuc. Acid. Res. 16 :3341-3358 ,1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, para su capacidad para detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo, fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Ciertos motivos y mecanismos de compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada para un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente por lo menos una región modificada para conferir resistencia aumentada a la degradación de las nucleasas, mayor captación celular, mayor afinidad de unión para el ácido nucleico objetivo y/o mayor actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede conferir otra propiedad deseada, por ejemplo, servir como un sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
La actividad antisentido puede ser el resultado de cualquier mecanismo que implique la hibridación del compuesto antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) con un ácido nucleico objetivo, en donde la hibridación en última instancia da como resultado un efecto biológico. En ciertas realizaciones, la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo está modulada. En ciertas realizaciones, la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo está reducida. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo da como resultado en última instancia una degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo no da como resultado la degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertas de tales realizaciones, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico objetivo (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico particular o un patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido funcionan a través de más de un mecanismo y/o a través de mecanismos que no se han dilucidado. Por consiguiente, los compuestos antisentido descritos en la presente no están limitados por un mecanismo particular.
Los mecanismos antisentido incluyen, sin limitación, antisentido mediado por RNasa H; mecanismos de ARNi, que utilizan la vía RISC e incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNmc y microARN; y mecanismos basados en la ocupación. Ciertos compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de tales mecanismos y/o a través de mecanismos adicionales.
Antisentido mediado por RNasa H
En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es resultado por lo menos en parte de la degradación del ARN objetivo por la RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena sencilla que son "similares a ADN" provocan la actividad de RNasa H en células de mamífero. Por consiguiente, los compuestos antisentido que comprenden por lo menos una parte de ADN o nucleósidos similares a ADN pueden activar la RNasa H, dando como resultado la escisión del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que utilizan RNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido comprenden por lo menos un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En ciertas de tales realizaciones, los nucleósidos modificados no soportan la actividad de la RNasa H. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido son gapmers, como se describe en la presente. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos de ADN. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos similares a ADN. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos similares a ADN.
Ciertos compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que apoya la escisión de la RNasaH está colocado entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de hueco sirve generalmente como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos del ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de fracciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de fracciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden incluir en algunas realizaciones p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2'-modificdos (tales nucleósidos 2'.modificados pueden incluir 2'-MOE y 2'-O-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados con azúcares bicíclicos (tales nucleósidos modificados con azúcares bicíclicos pueden incluir aquellos que tienen un etilo restringido). En ciertas realizaciones, los nucleósidos en las alas pueden incluir varias fracciones de azúcar modificado incluyendo, por ejemplo, 2'-MOE y fracciones de azúcares bicíclicos como etilo restringido o LNA. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias fracciones de azúcar modificado y no modificado. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias combinaciones de nucleósidos 2'-MOE, fracciones de azúcares bicíclico como nucleósidos de etilo restringidos o nucleósidos de LNA y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes, o fracciones de azúcar alternas. El motivo ala-hueco-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud del hueco y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender fracciones de azúcares uniformes, variantes o alternas. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en la presente, un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el hueco está colocado inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5' y 3'. Por tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y el hueco, o el hueco y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede tener un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones son diferentes. En ciertas realizaciones, "Y" está entre 8 y 15 nucleósidos. X, Y o Z puede ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleósidos.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de CFB tiene un motivo gapmer en el que el hueco consiste de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15 o 16 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene un motivo de azúcar descrito por la fórmula A de la siguiente manera: (J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
en donde:
cada A es independientemente un nucleósido 2'-sustituido;
cada B es independientemente un nucleósido bicíclico;
cada J es independientemente un nucleósido 2'-sustituido o un 2'-desoxinucleósido;
cada D es un 2'-desoxinucleósido;
m es 0-4; n es 0-2; p es 0-2; r es 0-2; t es 0-2; v es 0-2; w es 0-4; x es 0-2; y es 0-2; z es 0-4; g es 6-14;
siempre que:
por lo menos uno de m, n y r sea distinto de 0;
por lo menos uno de w y y sea distinto de 0;
la suma de m, n, p, r y t sea de 2 a 5; y
la suma de v, w, x, y y z sea de 2 a 5.
Compuestos de ARNi
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARN interferente (ARNi), que incluyen compuestos de ARN de cadena doble (también denominados ARN interferente corto o ARNip) y compuestos de ARNi de cadena sencilla (o ARNmc). Tales compuestos funcionan por lo menos en parte a través de la vía RISC para degradar y/o secuestrar un ácido nucleico objetivo (por tanto, incluyen compuestos de microARN/mímico de microARN). En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden modificaciones que los hacen particularmente adecuados para tales mecanismos.
i. Compuestos de ARNmc
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido incluyendo aquellos particularmente adecuados para su uso como compuestos de ARNi de cadena sencilla (ARNmc) comprenden un extremo 5'-terminal modificado. En ciertas de tales realizaciones, el extremo 5'-terminal comprende una fracción de fosfato modificado. En ciertas realizaciones, dicho fosfato modificado está estabilizado (por ejemplo, resistente a la degradación/escisión en comparación con el 5'-fosfato no modificado). En ciertas realizaciones, tales nucleósidos 5'-terminales estabilizan la fracción de 5'-fósforo. Ciertos nucleósidos 5'-terminales modificados pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo en la W O /2011/139702.
En ciertas realizaciones, el 5'-nucleósido de un compuesto de ARNmc tiene la Fórmula IIc:
Figure imgf000029_0001
en donde:
Ti es un fracción de fósforo opcionalmente protegida;
T2 es un grupo de enlace intemudeosídico que enlaza el compuesto de Fórmula IIc con el compuesto oligomérico;
A tiene una de las fórmulas:
Figure imgf000029_0002
Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alcoxi C 1 -C6 , alcoxi C 1 -C6 sustituido, alquenilo C 2 -C6 , alquenilo C 2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 , alquinilo C 2-C6 sustituido o N(Ra)(R4);
Qa es O, S, N(Ra) o C(R6)(Rt);
cada R3 , R4 , R5 , R6 y R7 es, independientemente, H, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido o alcoxi C 1 -C6 ;
M3 es O, S, NR 14 , C(Ri5)(Ri6), C(Ri5)(Ri6) C(Ri7)(Ri8), C(Ri5)=C(Ri7), OC(Ri5)(Ri6) o OC(Ri5)(Bx2);
R 14 es H, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alcoxi C 1 -C6 , alcoxi C 1 -C6 sustituido, alquenilo C2-C6 , alquenilo C 2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 o alquinilo C 2-C6 sustituido;
R 15 , Ri6, R 17 y Ri8 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alcoxi C 1 -C6 , alcoxi C 1 -C6 sustituido, alquenilo C 2-C6 , alquenilo C 2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 o alquinilo C 2-C6 sustituido;
Bxi es un fracción de base heterocíclica;
o si Bx2 está presente, entonces Bx2 es una fracción de base heterocíclica y Bxi es H, halógeno, alquilo Ci-C6, alquilo C 1 -C6 sustituido, alcoxi C 1 -C6 , alcoxi C 1 -C6 sustituido, alquenilo C2 -C6 , alquenilo C 2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 o alquinilo C 2 -C6 sustituido;
J 4 , J 5 , J6 y J 7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alcoxi
C 1 -C6 , alcoxi C 1 -C6 sustituido, alquenilo C2 -C6 , alquenilo C2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 o alquinilo C2 -C6 sustituido;
o J 4 forma un puente con uno de J 5 o J 7 en donde dicho puente comprende de 1 a 3 grupos birradicales enlazados seleccionados de O, S, NR 19 , C(R2o)(R2 i), C(R2 o)=C(R2 i), C[=C(R2 o)(R 21 )] y C(=o ) y los otros dos de J 5 , J6 y J 7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alcoxi
C 1 -C6 , alcoxi C 1 -C6 sustituido, alquenilo C2 -C6 , alquenilo C2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 o alquinilo C2 -C6 sustituido;
cada R 19 , R20 y R21 es, independientemente, H, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alcoxi C 1 -C6 , alcoxi C6 sustituido, alquenilo C2 -C6 , alquenilo C 2-C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 o alquinilo C 2 -C6 sustituido;
G es H, OH, halógeno o O-[C(R8 )(R9 )]n-[(C=O)m-Xi]j-Z;
cada R8 y R9 es, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C6 o alquilo C 1 -C6 sustituido;
Xi es O, S o N (Ei);
Z es H, halógeno, alquilo Ci-C6, alquilo Ci-C6 sustituido, alquenilo C2 -C6 , alquenilo C 2-C6 sustituido, alquinilo
C 2 -C6 , alquinilo C 2 -C6 sustituido o N(E2)(E3);
Ei, E2 y E3 son cada uno, independientemente, H, alquilo Ci-C6o alquilo Ci-C6 sustituido;
n es de i a aproximadamente 6;
m es 0 o i;
j es 0 o i;
cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, OJi, N (Ji)(J2 ), =NJi, S Ji , N3 , CN, OC(=X2 )Ji, OC(=X2 )N(Ji)(J2 ) y C(=X2)N(Ji)(J2);
X2 es O, S o N J3
cada Ji, J 2 y J 3 es, independientemente, H o alquilo Ci-C6;
cuando j es i, Z es distinto de halógeno o N(E 2 )(E3 ); y
en donde dicho compuesto oligomérico comprende de 8 a 40 subunidades monoméricas y puede hibridar con por lo menos una parte de un ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, M3 es O, CH=CH, OCH2 o OC(H)(Bx2 ). En ciertas realizaciones, M3 es O.
En ciertas realizaciones, J 4 , J 5 , J6 y J 7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, J 4 forma un puente con uno de J 5 o J 7.
En ciertas realizaciones, Atiene una de las fórmulas:
Figure imgf000030_0001
en donde:
Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alcoxi C 1 -C6 o alcoxi C 1 -C6 sustituido. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 son cada uno H. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H o halógeno. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 es H y el otro de Q1 y Q2 es F, CH3 o OCH3.
En ciertas realizaciones, T 1 tiene la fórmula:
Figure imgf000030_0002
en donde:
Ra y Rc son cada uno, independientemente, hidroxilo protegido, tiol protegido, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alcoxi C 1 -C6 , alcoxi C 1 -C6 sustituido, amino protegido o amino sustituido; y
Rb es O o S. En ciertas realizaciones, Rb es O y Ra y Rc son cada uno, independientemente, OCH3 , OCH2 CH3 o CH(CH3)2.
En ciertas realizaciones, G es halógeno, OCH3 , OCH2 F, OCHF2 , OCF3 , OCH2 CH3 , O(CH2 )2 F, OCH2 CHF2 , OCH2 CF 3 , OCH2-CH=CH2 , O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R1ü)(Rh ), O(CH2 )2-ON(R10 )(Rn), O(CH2 )2 -O(CH2 )2-N(R1 ü)(Rh ), OCH2 C(=O)-N(R1 ü)(Rh ), OCH2 C(=O)-N(R12 )-(CH2 )2 -N(R1 ü)(Rh ) o O(CH2 )2 -N(R12 )-C(=NR13 )[N(R1 ü)(Rh )] en donde R 1 Ü, R 11, R 12 y R 13 son cada uno, independientemente, H o alquilo C 1 -C6. En ciertas realizaciones, G es halógeno, O OCH3 , OCF3 , OCH2 CH3 , OCH2 CF 3 , OCH2 -CH=CH2 , O(c H2 )2-OCH3 , O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)-N(H)CH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2 o OCH2-N(H)-C(=NH)NH2. En ciertas realizaciones, G es F, OCH3 o O(CH2 )2 -OCH3. En ciertas realizaciones, G es O(CH2 )2 -OCH3.
En ciertas realizaciones, el nucleósido 5'-terminal tiene la Fórmula IIe:
Figure imgf000030_0003
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluidos los particularmente adecuados para ARNmc, comprenden uno o más tipos de fracciones de azúcar modificado y/o fracciones de azúcar de origen natural dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Tales motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar tratadas en la presente y/o otras modificaciones de azúcar conocidas.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una región que tiene modificaciones de azúcar uniformes. En ciertas de tales realizaciones, cada nucleósido de la región comprende la misma modificación de azúcar similar a ARN. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-F. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido cEt. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido de LNA. En ciertas realizaciones, la región uniforme constituye todo o esencialmente todo el oligonucleótido. En ciertas realizaciones, la región constituye el oligonucleótido completo a excepción de los nucleósidos terminales 1-4.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una o más regiones de modificaciones de azúcar alternas, en donde los nucleósidos alternan entre nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un primer tipo y nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de ambos tipos son nucleósidos similares a ARN. En ciertas realizaciones, los nucleósidos alternos se seleccionan de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA y cEt. En ciertas realizaciones, las modificaciones alternas son 2'-F y 2'-OMe. Tales regiones pueden ser contiguas o pueden estar interrumpidas por nucleósidos modificados de manera diferente o nucleósidos conjugados.
En ciertas realizaciones, la región alterna de modificaciones alternas consisten cada una en un único nucleósido (es decir, el patrón es (AB)xAy donde A es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un primer tipo y B es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un segundo tipo; x es 1-20 e y es 0 o 1). En ciertas realizaciones, una o más regiones alternas en un motivo alterno incluye más de un único nucleósido de un tipo. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden incluir una o más regiones de cualquiera de los siguientes motivos de nucleósidos:
AABBAA;
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA; o
ABABBAABBABABAA;
en donde A es un nucleósido de un primer tipo y B es un nucleósido de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, A y B se seleccionan cada uno de 2'-F, 2'-OMe, b Na y MOE.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen tal motivo alterno también comprenden un nucleósido 5' terminal modificado, tales como los de fórmula IIc o IIe.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo 2-2-3. Tal región comprende el siguiente motivo:
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
en donde: A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B y C son nucleósidos que están modificados de manera diferente de A, sin embargo, B y C pueden tener modificaciones iguales o diferentes entre sí;
x e y son de 1 a 15.
En ciertas realizaciones, A es un nucleósido 2'-OMe modificado. En ciertas realizaciones, B y C son ambos nucleósidos 2'-F modificados. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido 2'-OMe modificado y B y C son ambos nucleósidos 2'-F modificados.
En ciertas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(AB)xAy-(D)z
en donde:
Q es un nucleósido que comprende un fracción de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B es un segundo tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente a la del nucleósido adyacente a él.
Por tanto, si y es 0, entonces D debe modificarse de manera diferente que B y si y es 1, entonces D debe modificarse de manera diferente que A. En ciertas realizaciones, D difiere de tanto A como B.
X es 5-15;
Y es 0 o 1;
Z es 0-4.
En ciertas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(A)x-(D)z
en donde
Q es un nucleósido que comprende un fracción de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente de A.
X es 11-30 ;
Z es 0-4.
En ciertas realizaciones, A, B, C y D en los motivos anteriores se seleccionan de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA y cEt. En ciertas realizaciones, D representa nucleósidos terminales. En ciertas realizaciones, tales nucleósidos terminales no están diseñados para hibridar con el ácido nucleico objetivo (aunque uno o más podrían hibridar por casualidad). En algunas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es adenina, independientemente de la identidad de la nucleobase en la posición correspondiente del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es timina.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluyendo aquellos particularmente adecuados para su uso como ARNmc comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón o un motivo de enlace internucleosídico modificado definidos. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de enlaces internucleosídicos uniformemente modificados. En ciertas de tales realizaciones, el oligonucleótido comprende una región que está ligada uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido está enlazado uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es fosforotioato
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado dentro de 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
Los oligonucleótidos que tienen cualquiera de los varios motivos de azúcar descritos en la presente, pueden tener cualquier motivo de enlace. Por ejemplo, los oligonucleótidos, incluyendo pero no limitado a los descritos anteriormente, pueden tener un motivo de enlace seleccionado de los no limitativos de la tabla siguiente:
Figure imgf000032_0001
ii. Compuestos de ARNip
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARNi de cadena doble (ARNip). En tales realizaciones, una o ambas cadenas pueden comprender cualquier motivo de modificación descrito anteriormente para ARNmc. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNmc pueden ser ARN no modificado. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNip pueden comprender nucleósidos de ARN no modificados, pero enlaces internucleosídicos modificados.
Varias realizaciones se refieren a composiciones de cadena doble en las que cada cadena comprende un motivo definido por la localización de uno o más nucleósidos modificados o no modificados. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden un primer y un segundo compuesto oligomérico que están total o por lo menos parcialmente hibridados para formar una región dúplex y que comprenden además una región que es complementaria e hibrida con un objetivo de ácido nucleico. Es adecuado que tal composición comprenda un primer compuesto oligomérico que es una cadena antisentido que tenga complementariedad total o parcial con un objetivo de ácido nucleico y un segundo compuesto oligomérico que es una cadena con sentido que tenga una o más regiones de complementariedad y forme por lo menos una región dúplex con el primer compuesto oligomérico.
Las composiciones de varias realizaciones modulan la expresión génica hibridando con un objetivo de ácido nucleico dando como resultado la pérdida de su función normal. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo es CFB. En ciertas realizaciones, la degradación del CFB objetivo se facilita por un complejo RISC activado que se forma con las composiciones de la invención.
Varias realizaciones están dirigidas a composiciones de cadena doble en las que una de las cadenas es útil para, por ejemplo, influir en la carga preferencial de la cadena opuesta en el complejo RISC (o escisión). Las composiciones son útiles para apuntar a moléculas de ácido nucleico seleccionadas y modular la expresión de uno o más genes. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención hibridan con una parte de un ARN objetivo dando como resultado la pérdida de la función normal del ARN objetivo.
Ciertas realizaciones están dirigidas a composiciones de cadena doble en las que ambas cadenas comprenden un motivo hemímero, un motivo completamente modificado, un motivo modificado posicionalmente o un motivo alterno. Cada cadena de las composiciones de la presente invención puede modificarse para cumplir una función particular en, por ejemplo, la vía del ARNip. Usando un motivo diferente en cada cadena o el mismo motivo con diferentes modificaciones químicas en cada cadena permite dirigir la cadena antisentido para el complejo RISC mientras se inhibe la incorporación de la cadena con sentido. Dentro de este modelo, cada cadena puede modificarse independientemente de tal manera que se mejora para su función particular. La cadena antisentido puede modificarse en el extremo 5' para mejorar su función en una región del RISC mientras que el extremo 3' puede modificarse diferencialmente para mejorar su función en una región diferente del RISC.
Las moléculas de oligonucleótidos de cadena doble pueden ser una molécula de polinucleótidos de cadena doble que comprende regiones con sentido y antisentido auto-complementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma y la región con sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma. Las moléculas de oligonucleótidos de cadena doble pueden ensamblarse a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una cadena es la cadena con sentido y la otra es la cadena antisentido, en donde las cadenas antisentido y con sentido son auto-complementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la secuencia de nucleótidos en la otra cadena; tal como donde la cadena antisentido y la cadena con sentido forman una estructura dúplex o de cadena doble, por ejemplo, en donde la región de cadena doble es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pares de bases; la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma y la cadena con sentido comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 o más nucleótidos de la molécula de oligonucleótido de cadena doble son complementarios al ácido nucleico objetivo o una parte del mismo). Alternativamente, el oligonucleótido de cadena doble se ensambla a partir de un único oligonucleótido, donde las regiones con sentido y antisentido auto-complementarias del ARNip se enlazan por medio de un conector(es) a base de ácido nucleico o no a base de ácido nucleico.
El oligonucleótido de cadena doble puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria dúplex, dúplex asimétrico, de horquilla o de horquilla asimétrica, que tiene regiones con sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula ácido nucleico objetivo separada o una parte de la misma y la región con sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma. El oligonucleótido de cadena doble puede ser un polinucleótido de cadena sencilla circular que tiene dos o más estructuras de giro y un vástago que comprende regiones con sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácidos nucleicos o una parte de la misma, y en donde el polinucleótido circular puede procesarse o in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar ARNi.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de cadena doble comprende secuencias o regiones con sentido y antisentido separadas, en donde las regiones con sentido y antisentido están enlazadas covalentemente por moléculas de conectores nucleotídicos o no nucleotídicos como se conoce en la técnica, o están alternativamente enlazadas no covalentemente por interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der waals, interacciones hidrófobas, y/o interacciones de apilamiento. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de cadena doble comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo. En otra realización, el oligonucleótido de cadena doble interactúa con la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo de una manera que provoca la inhibición de la expresión del gen objetivo.
Como se usa en la presente, los oligonucleótidos de cadena doble no necesitan estar limitados a aquellas moléculas que contienen solo ARN, sino que también incluyen nucleótidos modificados químicamente y no nucleótidos. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico interferente corto carecen de nucleótidos que contienen 2'-hidroxi (2'-OH). En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos interferente cortos opcionalmente no incluyen ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH). Sin embargo, tales oligonucleótidos de cadena doble que no requieren la presencia de ribonucleótidos dentro de la molécula para soportar ARNi pueden tener un conector o conectores unidos u otros grupos, fracciones o cadenas unidas o asociadas, que contienen uno o más nucleótidos con grupos 2'-OH. Opcionalmente, los oligonucleótidos de cadena doble pueden comprender ribonucleótidos en aproximadamente el 5, 10, 20, 30, 40, o el 50% de las posiciones de nucleótidos. Como se usa en la presente, se entiende que el término ARNip es equivalente a otros términos usados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar ARNi específicos de secuencia, por ejemplo, ARN interferente corto (ARNip), ARN de cadena doble (ARNbc), micro-ARN (miARN), RNA de horquilla corta (ARNhc), oligonucleótido interferente corto, ácido nucleico interferente corto, oligonucleótido modificado interferente corto, ARNip modificado químicamente, ARN silenciador de genes post-transcripcional (ARNsgpt), y otros. Además, como se usa en la presente, se entiende que el término ARNi es equivalente a otros términos usados para describir ARN interferente específico de secuencia, como silenciamiento génico postranscripcional, inhibición translacional o epigenética. Por ejemplo, Los oligonucleótidos de cadena doble pueden usarse para silenciar epigenéticamente genes tanto en el nivel post-transcripcional como en el nivel pre-transcripcional. En un ejemplo no limitativo, la regulación epigenética de la expresión génica por las moléculas de ARNip de la invención puede ser resultado de la modificación mediada por ARNip de la estructura de la cromatina o del patrón de metilación para alterar la expresión génica (ver, por ejemplo, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818 -1819 ; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837 ; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215 -2218 ; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
Se contempla que los compuestos y composiciones de varias realizaciones proporcionadas en la presente puedan dirigirse a CFB mediante un silenciamiento génico mediado por ARNbc o un mecanismo de ARNi, incluyendo, por ejemplo, moléculas de efector de ARN de cadena doble de tipo "horquilla" o vástago-giro en las que una cadena de ARN individual con las secuencias auto-complementarias es capaz de asumir una conformación de cadena doble, o moléculas de efector de ARNb dúplex que comprenden dos cadenas separadas de ARN. En diversas realizaciones, el ARNbc consiste completamente en ribonucleótidos o consiste de una mezcla de ribonucleótidos y desoxinucleótidos, como los híbridos de ARN/ADN divulgados, por ejemplo, por la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000 o la US N° de Serie 60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999. EL ARNbc o la molécula efectora de ARNbc puede ser una molécula individual con una región de auto-complementariedad tal que los nucleótidos en un segmento de la base de la molécula se emparejen con nucleótidos en otro segmento de la molécula. En varias realizaciones, un ARNbc que consiste de una molécula individual consiste completamente de ribonucleótidos o incluye una región de ribonucleótidos que es complementaria a una región de desoxirribonucleótidos. Alternativamente, el ARNbc puede incluir dos cadenas diferentes que tienen una región de complementariedad entre sí.
En varias realizaciones, ambas cadenas consisten completamente de ribonucleótidos, una cadena consiste completamente en ribonucleótidos y una cadena consiste completamente en desoxirribonucleótidos, o una o ambas cadenas contienen una mezcla de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. En ciertas realizaciones, las regiones de complementariedad son por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% complementarias entre sí y con una secuencia de ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la región del ARNbc que está presente en una conformación de cadena doble incluye por lo menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75,100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos o incluye todos los nucleótidos en un ADNc u otra secuencia de ácido nucleico objetivo que está representada en el ARNbc. En algunas realizaciones, el ARNbc no contiene ninguna región de cadena sencilla, como extremos de cadena sencilla, o el ARNbc es una horquilla. En otras realizaciones, el ARNbc tiene una o más regiones de cadena sencilla o voladizos. En ciertas realizaciones, los híbridos de ARN/ADN incluyen una cadena o región de ADN que es una cadena o región antisentido (por ejemplo, tiene por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de complementariedad con un ácido nucleico objetivo) y una cadena o región de ARN que es una cadena o región con sentido (por ejemplo, tiene por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de identidad con un ácido nucleico objetivo) y viceversa.
En varias realizaciones, el híbrido de ARN/ADN se realiza in vitro usando métodos sintéticos enzimáticos o químicos como los descritos en la presente o los descritos en la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000 o la US N° de Serie 60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999. En otras realizaciones, una cadena de ADN sintetizada in vitro se compleja con una cadena de ARN elaborada in vivo o in vitro antes, después, o concurrentemente con la transformación de la cadena de ADN en la célula. En otras realizaciones más, el ARNbc es un ácido nucleico circular individual que contiene una región con sentido y una antisentido, o el ARNbc incluye un ácido nucleico circular y o un segundo ácido nucleico circular o un ácido nucleico lineal (ver, por ejemplo, la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000 o la US N° de Serie 60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999). Los ácidos nucleicos circulares ejemplares incluyen estructuras de lazo en las que el grupo fosforilo 5' libre de un nucleótido se enlaza con el grupo hidroxilo 2' de otro nucleótido en una forma de giro posterior.
En otras realizaciones, el ARNbc incluye uno o más nucleótidos modificados en los que la posición 2' en el azúcar contiene un halógeno (como el grupo flúor) o contiene un grupo alcoxi (como un grupo metoxi) que aumenta la vida media del ARNbc in vitro o in vivo en comparación con el ARNbc correspondiente en el que la posición 2' correspondiente contiene un hidrógeno o un grupo hidroxilo. En otras realizaciones más, el ARNbc incluye uno o más enlaces entre nucleótidos adyacentes distintos de un enlace fosfodiéster de origen natural. Los ejemplos de tales enlaces incluyen enlaces de fosforamida, fosforotioato y fosforoditioato. Los ARNbc también pueden ser moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente como se enseña en la Patente de Estados Unidos N° 6.673.661. En otras realizaciones, el ARNbc contiene una o dos cadenas con caperuza, como se divulga, por ejemplo, por la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000 o la US N° de Serie 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999.
En otras realizaciones, el ARNbc puede ser cualquiera de las moléculas ARnbc divulgadas por lo menos parcialmente en la WO 00/63364, así como cualquier otra de las moléculas de ARNbc descritas en la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/399.998; y la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/419.532 y el PCT/US2003/033466. Cualquiera de los ARNbc puede expresarse in vitro o in vivo usando los métodos descritos en la presente o métodos estándar, como los descritos en la WO 00/63364.
Ocupación
En ciertas realizaciones, no se espera que los compuestos antisentido den como resultado la escisión o el ácido nucleico objetivo a través de la RNasa H o que den como resultado la escisión o el secuestro a través de la vía de RISC. En ciertas de tales realizaciones, la actividad antisentido puede ser resultado de la ocupación, en donde la presencia del compuesto antisentido hibridado interrumpe la actividad del ácido nucleico objetivo. En ciertas de tales realizaciones, el compuesto antisentido puede modificarse uniformemente o puede comprender una mezcla de modificaciones y/o nucleósidos modificados y no modificados.
Ácidos nucleicos objetivo, regiones objetivo y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican el Factor B del Complemento (CFB) incluyen, sin limitación, las siguientes: N° de Acceso de GENBANK N M _001710.5 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 1), N° de Acceso de GENBANK NT_007592.15 truncada de los nucleótidos 31852000 a 31861000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de Acceso de GENBANK N W _001116486.1 truncada de los nucleótidos 536000 a 545000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de Acceso de GENBANK X M _001113553.2 (incorporada en la presente como S e Q ID NO: 4), o N° de Acceso de GENBANK NM_008198.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 5).
Hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación tiene lugar entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico de CFB. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen invertidos) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede tener lugar bajo condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas del ácido nucleico a hibridar.
Los métodos para determinar si una secuencia puede hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico de CFB.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido pueden unirse mediante enlaces de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de tal manera que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de CFB).
Pueden tolerarse nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de CFB siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de CFB, de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de giro, un malapareamiento o una estructura de horquilla).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o una parte específica de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios con un ácido nucleico de CFB, una región objetivo, un segmento objetivo, o una parte específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos rutinarios.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarios con una región objetivo y, por lo tanto, hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 nucleobases con cuatro nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría una complementariedad total del 77,8% con el ácido nucleico objetivo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente usando programas (BLAST) (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215 , 403 410 ; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o partes específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) con un ácido nucleico objetivo, o parte específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario con un ácido nucleico de CFB, o una región objetivo, o un segmento objetivo o una secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de un emparejamiento de bases preciso de bases con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una parte de 20 nucleobases correspondiente del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria con el compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una parten específica del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una parte de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" con una secuencia objetivo que tenga una longitud de 400 nucleobases. La parte de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria con la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una parte correspondiente de 20 nucleobases en la que cada nucleobase es complementaria a la parte de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede ser o no completamente complementario con la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias con la secuencia objetivo.
La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, enlazadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 11 , 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de CFB, o una parte específica del mismo.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 11 , 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de CFB, o una parte específica del mismo.
Los compuestos antisentido de la presente también incluyen aquellos que son complementarios a una parte de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en el presente documento, "parte" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "parte" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una parte de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una parte de 9 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una parte de 10 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una parte de 11 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una parte de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a de por lo menos una parte de 13 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una parte de 14 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de por lo menos una parte de 15 nucleobases de un segmento objetivo. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios de por lo menos una parte de 9, 10, 11, 12 , 13 , 14, 15 , 16, 17 , 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento objetivo, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o un compuesto representado por un número de Isis específico, o una parte del mismo. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente, así como compuestos que tienen bases no idénticas con relación a los compuestos antisentido de la presente. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o estar dispersas en todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen emparejamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se está comparando.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o partes de los mismos, son, o son por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o las SEQ ID NO, o una parte de los mismos, divulgados en la presente.
En ciertas realizaciones, una parte del compuesto antisentido se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una parte de 8, 9, 10, 11, 12 , 13 , 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, una parte del oligonucleótido antisentido se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una parte de 8, 9, 10, 11, 12 , 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La parte de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un fracción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la parte de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede enlazarse a la fracción hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, se hace referencia comúnmente a los grupos fosfato como formadores de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones en los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, fracciones de azúcar, o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados se prefieren a menudo sobre las formas nativas debido a las propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad aumentada para el objetivo del ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas, o actividad inhibidora aumentada.
También pueden emplearse nucleósidos modificados químicamente para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico objetivo. Consecuentemente, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleosídicos modificados
El enlace intemucleosídico de origen natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces intemucleosídicos modificados, es decir, no de origen natural, se seleccionan a menudo sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural, debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos objetivo y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no están limitados a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de CFB comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos están dispuestos en un motivo con huecos. En tales realizaciones, los enlaces internucleosídicos en cada una de las dos regiones de ala son diferentes de los enlaces internucleosídicos en la región de hueco. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos en las alas son fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos en el hueco son fosforotioato. El motivo de nucleósido se selecciona independientemente, por lo que tales oligonucleótidos que tienen un motivo de enlace internucleosídico con huecos pueden tener o no un motivo de nucleósido con huecos y, si tiene un motivo de nucleósido con huecos, las longitudes de ala y hueco pueden ser iguales o no.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos de la presente invención comprenden una región de enlaces internucleosídicos modificados uniformemente. En ciertas de tales realizaciones, el oligonucleótido comprende una región que está enlazada uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido está enlazado uniformemente por fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado dentro de 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más enlaces de metilfosponato. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen un motivo de nucleósido gapmer comprenden un motivo de enlace que comprende todos los enlaces de fosforotioato excepto por uno o dos enlaces de metilfosponato. En ciertas realizaciones, un enlace de metilfosponato está en el hueco central de un oligonucleótido que tiene un motivo de nucleósido gapmer.
En ciertas realizaciones, es deseable disponer el número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato y enlaces internucleosídicos de fosfodiéster para mantener la resistencia a la nucleasa. En ciertas realizaciones, es deseable disponer el número y la posición de los enlaces internucleosídicos de fosforotioato y el número y la posición de los enlaces internucleosídicos de fosfodiéster para mantener la resistencia a la nucleasa. En ciertas realizaciones, el número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato puede disminuirse y el número de enlaces internucleosídicos de fosfodiéster puede aumentarse. En ciertas realizaciones, el número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato puede disminuirse y el número de enlaces internucleosídicos de fosfodiéster puede aumentarse mientras se mantiene la resistencia a la nucleasa. En ciertas realizaciones, es deseable disminuir el número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato mientras se mantiene la resistencia a la nucleasa. En ciertas realizaciones, es deseable aumentar el número de enlaces internucleosídicos de fosfodiéster mientras se mantiene la resistencia a la nucleasa.
Fracciones de azúcar modificado
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir una estabilidad de nucleasas mejorada, una afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden fracciones de anillos de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2', puente de los átomos del anillo no germinales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S, N(R) o C(R 1 )(R2 )(R, R 1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C 1 -C 12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen el nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2008 /101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5'-2'-bis sustituidos divulgados) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con una sustitución adicional en la posición 2' (ver Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente, la sustitución 5' de un BNA (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2007/134181 Publicada el 22/11/07 en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o un grupo 5'-vinilo).
Ejemplos de nucleósidos que tienen fracciones de azúcares modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), '-S, 2'-F, 2 -OCH3 , 2 -OCH2 CH3 , 2'-OCH2 CH2 F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O- alquilo C 1 -C 10 , OCF3 , OCH2 F, O(CH2)2SCH3, O(CH2 )2 -O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(R-iMCH2 )2 -N(Rm)(Rn), donde cada R 1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C 1 -C 10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en la presente, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un fracción de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente 4' a 2', incluyen pero no están limitados a una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también referido como etilo restringido o cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de la misma, ver la Patente de Estados Unidos 7.399.845, concedida el 15 de julio del 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de la misma ver la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de la misma, ver la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada U S2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C 1 -C 12 , o un grupo protector (ver Patente de Estados Unidos 7.427.672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Zhou et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118 -134 ); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de la misma, ver la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
También pueden encontrarse informes adicionales relacionados con los nucleósidos bicíclicos en la bibliografía publicada (ver, por ejemplo, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243: Patentes de Estados Unidos N° 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; 8.530.640; y 7.696.345; Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° US2008-0039618; U S2009-0012281; Patentes de Estados Unidos N° de Serie 61/026.995 y 61/097.787; Solicitudes Internacionales de PCT Publicadas WO 2009/067647; WO 2011/ 017521; WO 2010/036698 WO 1999/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134 181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcares estereoquímicos incluyendo, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (ver la Solicitud Internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcares bicíclicos de los nucleósidos de BNA incluyen, pero no están limitados a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre las posiciones 4' y 2' de la fracción de azúcar de pentofuranosilo en donde tales puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-;
en donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C 1 -C 12 , alquilo C 1 -C 12 sustituido, alquenilo C 2 -C 12 , alquenilo C 2-C 12 sustituido, alquinilo C2 -C 12 , alquinilo C 2-C 12 sustituido, arilo C 5 -C 20 , arilo C 5 -C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C 5 -C7 , radical alicíclico C 5 -C7 sustituido, halógeno, O J 1 , N J1 J 2 , S J 1 , N3 , COOJ1 , acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2- J 1 ), o sulfoxilo (S(=O)-J1 ); y
cada J 1 y J 2 es, independientemente, H, alquilo C 1 -C 12 , alquilo C 1 -C 12 sustituido, alquenilo C 2-C 12 , alquenilo C 2 -C 12 sustituido, alquinilo C 2-C 12 , alquinilo C 2 -C 12 sustituido, arilo C 5 -C20 , arilo C5 -C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C 1 -C 12 , aminoalquilo C 1 -C 12 sustituido o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de un fracción de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2 -O-2 ', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C 1 -C 12.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2 'metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, se han incorporado a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no están limitados a, (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, y (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2 ') BNA, (J) propilen carbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA y (K) vinilo BNA como se representa a continuación:
Figure imgf000040_0001
en donde Bx es la fracción de base y R es independientemente H, un grupo protector, alquilo C 1 -C 12 o alcoxi C 1 -C 12.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
Figure imgf000041_0001
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2 -, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2 -O-N(Rc)-, -CH2 -N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2 ;
Rc es alquilo C 1 -C 12 o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, aun fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
Figure imgf000041_0002
en donde:
Bx es un fracción base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C 1 -C6 , alquenilo C 2 -C6 , alquinilo C2 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alquenilo C 2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3 , OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C 1 -C6 , o alquilo C 1 -C6 sustituido y X es O o NJc.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
Figure imgf000041_0003
en donde:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C 1 -C6 , alquenilo C 2 -C6 , alquinilo C2 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alquenilo C 2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
Figure imgf000042_0001
en donde:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alquenilo C 2 -C6 , alquenilo C2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 o alquinilo C 2 -C6 sustituido;
cada qa, qb, qCy qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alquenilo C 2 -C6, alquenilo C 2-C6 sustituido, alquinilo C 2-C6 o alquinilo C2 -C6 sustituido, alcoxilo C 1 -C6 , alcoxilo C 1 -C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C 1 -C6 o aminoalquilo C 1 -C6 sustituido;
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos quetienen la Fórmula V:
Figure imgf000042_0002
en donde:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C 1 -C 12 , alquilo C 1 -C 12 sustituido, alquenilo C2 -C 12 , alquenilo C 2 -C 12 sustituido, alquinilo C 2 -C 12 , alquinilo C 2 -C 12 sustituido, alcoxi C 1 -C 12 , alcoxi C 1 -C 12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO 2 Jj, NJjJk, N3 , CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qfjuntos son =C(qg)(q h);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C 12 o alquilo C 1 -C 12 sustituido.
Se han descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metilenoxi (4-CH2-O-21) BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos. (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y su preparación también se describen en la WO 98/39352 y la WO 99/14226.
También se han preparado análogos de metilenoxi (4-CH2-O-21) BNA y 2-tio-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., WO 99/14226). Además, la síntesis de 2-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad comformacionalmente restringido, se ha descrito en la técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2-amino- y 2-metilamino-BNA y se ha informado anteriormente de la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas ARN y de ADN complementarias.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos quetienen la Fórmula VI:
Figure imgf000043_0001
en donde:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qky ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C 12 , alquilo C1-C^sustituido, alquenilo C 2-C 12 , alquenilo C2 -C 12 sustituido, alquinilo C 2 -C 12 , alquinilo C2 -C 12 sustituido, alcoxilo C 1 -C 12 , alcoxilo C 1 -C 12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO 2Jj, N JjJk, N3 , CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkoN(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh),
Figure imgf000043_0003
en donde
Figure imgf000043_0002
qh son cada uno, alquilo C 1 -C 12 o alquilo C 1 - C 12 sustituido.
Se ha descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org.
Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
Como se usa en la presente, "nucleósido bicíclico 4 '-2 '" o "nucleósido bicíclico de 4' a 2' '' se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar modificado que no son fracciones de azúcares bicíclico. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar, o análogo de fracción azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
Como se usa en la presente, "azúcar 2'-modificado" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, incluyendo, pero no limitado a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan de los sustituyentes que incluyen, pero no están limitados a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2 )nNH2 , O(CH2)nCH3, O(CH2 )nF, O(CH2 )nONH2 , OCH2C(=O)N(H)CH3, y O(CH2 )nON[(CH2 )nCH3]2 , donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos 2'-sustituyentes también pueden seleccionarse de: alquilo C 1 -C 12 , alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH 3 , OCN, Cl, Br, CN, F, CF 3 , OCF3 , SOCH3 , SO 2 CH3 , ONO2 , NO2 , N3 , NH2 , heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como 2'-O-metilo, O-propilo, y O-aminopropilo. Los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE también han mostrado ser inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (Martin, Helv.
Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans.,
1996, 24, 630-637; yAltmann etal., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en la presente, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el fracción de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto del azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no están limitados a, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico anitol (ANA), ácido nucleico manitol (MNA) (ver Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
Figure imgf000044_0001
En ciertas realizaciones, se seleccionan sustitutos de azúcar que tienen la Fórmula VII:
Figure imgf000044_0002
en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo nucleosídico de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5'o 3-terminal;
q-i, q2 , q3 , q4 , q5 , q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C 1 -C6 , alquilo C 1 -C6 sustituido, alquenilo C 2 -C6 , alquenilo C 2-C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 o alquinilo C2 -C6 sustituido; y cada uno de Ri y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, N J 1 J 2 , S Ji, N3 , oC(=X)Ji, OC(=X)NJiJ2 , N J3 C(=X)NJiJ2 y CN, en donde X es O, S o NJi y cada Ji, J 2 y J 3 es, independientemente, H o alquilo Ci-C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en los que qi, q2 , q3, q4 , q5 , q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de qi, q2 , q3 , q4 , q5 , q6 y q7 es distinto de H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de qi, q2 , q3 , q4 , q5 , q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de t Hp de fórmula VII en los que uno de Ri y R2 es flúor. En ciertas realizaciones, Ri es flúor y R2 es H; Ri es metoxi y R2 es H, y Ri es metoxietoxi y R2 es H.
En ciertas realizaciones, los sustitutos del azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (ver, por ejemplo, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 4 i, 4503-45i0; y Patentes de Estados Unidos 5.698.685; 5.i66.3 i5 ; 5.i85.444; y 5.034.506). Como se usa aquí, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la fórmula siguiente:
Figure imgf000044_0003
En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Tales sustitutos del azúcar son referidos en la presente como "morfolinos modificados".
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2008 /i0 ii57 publicada el 2i/8/08 para otros nucleósidos sustituidos con 5',2'-bis divulgados) y el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y una sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada U S2005-0i30923, publicada el i6 de junio de 2005) o alternativamente, la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2007 /i34 i8 i, publicada el 22/ii/07 en donde un nucleósido bicíclico 4-CH2-O-2' está sustituido adicionalmente en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo). También se han descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (ver, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no están limitados a, los descritos en la técnica (ver, por ejemplo, Solicitud de PCT publicada de titularidad compartida
WO 2010/036696, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984;
Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30),
9340-9348; Gu et al.,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic
Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, f 61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111 - 2123 ; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic
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PCT publicado, WO 06/047842; y Solicitud de PCT publicado WO 01/049687). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la Fórmula X.
Figure imgf000045_0001
en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo nucleosídico de ciclohexenilo con un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano con un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado, o un grupo 51 o 3-terminal; y
q 1, q2 , q3 , q4 , q5 , q6, q7 , qs y q9 son cada uno, independientemente, H, alquilo C 1 -C6 , alquilo alquenilo C 2 -C6 , alquenilo C2 -C6 sustituido, alquinilo C 2 -C6 , alquinilo C 2 -C6 sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Como se usa en la presente, "2'-modificado" o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 21 diferente de H u OH. Los nucleósidos 2-modificados incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 21 y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con 2-substituents sin puente, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O- alquilo C 1 -C 10 , -OCF3 , O-(CH2 )2 -O-CH3 , 2 ’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2 )2 -O-N(Rm)(Rn), o O-CH2 -C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C 1 -C 10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2-modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en la presente, "2-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo flúor en la posición 21 del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "2-OMe" o " 2 -OCH3 " o "2-O-metilo" se refieren a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 21 del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "MOE" o "2-MOE" o " 2 -OCH2 CH2 OCH3 " o "2-O-metoxietilo" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2 CH2 OCH3 en la posición 21 del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver por ejemplo artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Tales sistemas de anillos pueden experimentar varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Algunas patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134 ; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
En nucleótidos que tienen fracciones de azúcar modificado, las fracciones de nucleobase (naturales, modificados o combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un objetivo de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos 2'-MOE modificados están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.
N ucleobases m odificadas
Las modificaciones o sustituciones de nucleobase (o base) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con nucleobases no modificadas de origen natural o sintéticas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobase pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobases, incluyendo las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, las sustituciones de 5-metilcitosina han mostrado que aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2° C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
Las nucleobases modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2 -tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinílicos de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
Las fracciones de bases heterocíclicas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de CFB comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido acortados o ampliados con huecos dirigidos a un ácido nucleico de CFB comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Com puestos antisentido conjugados
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados que comprenden un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido y reducir la cantidad o actividad de un transcrito de ácido nucleico en una célula.
Se ha descrito con anterioridad el receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R). Ver, por ejemplo, Park et al., PNAS vol. 102, N° 47, págs. 17125 - 17129 (2005). Tales receptores se expresan en las células del hígado, particularmente en los hepatocitos. Además, se ha demostrado que los compuestos que comprenden grupos de tres ligandos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) son capaces de unirse al ASGP-R, dando como resultado la captación del compuesto en la célula. Ver, por ejemplo, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, pp 5216 -5231 (mayo de 2008). Por consiguiente, los conjugados que comprenden tales grupos de GalNAc se han usado para facilitar la captación de ciertos compuestos en células hepáticas, específicamente los hepatocitos. Por ejemplo, se ha demostrado que ciertos conjugados que contienen GalNAc aumentan la actividad de los compuestos de ARNip dúplex en células hepáticas in vivo. En tales casos, el conjugado que contiene GalNAc se une típicamente a la cadena con sentido del dúplex de ARnip. Como la cadena con sentido se descarta antes de que la cadena antisentido hibride en última instancia con el ácido nucleico objetivo, hay poca preocupación de que el conjugado interfiera con la actividad. Típicamente, el conjugado está unido al extremo 3' de la cadena con sentido del ARNip. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8.106.022. Ciertos grupos conjugados descritos en la presente son más activos y/o más fáciles de sintetizar que los grupos conjugados descritos anteriormente.
En ciertas realizaciones de la presente invención, los conjugados se unen a compuestos antisentido de cadena sencilla, incluyendo, pero no limitados a, compuestos antisentido a base de RNasa H y compuestos antisentido que alteran el corte y empalme de un ácido nucleico objetivo pre-ARNm. En tales realizaciones, el conjugado debe permanecer unido al compuesto antisentido el tiempo suficiente para proporcionar un beneficio (captación mejorada en las células) pero luego debe escindirse, o no interferir de otra manera con los pasos posteriores necesarios para la actividad, como la hibridación con un ácido nucleico objetivo y la interacción con RNasa H o enzimas asociadas con el corte y empalme o la modulación del corte y empalme. Este equilibrio de propiedades es más importante en el establecimiento de compuestos antisentido de cadena sencillas que en los compuestos de ARNip, donde el conjugado puede unirse simplemente a la cadena con sentido. En la presente se divulgan compuestos antisentido de cadena sencilla conjugados que tienen una potencia mejorada en células hepáticas in vivo en comparación con el mismo compuesto antisentido que carece del conjugado. Dado el equilibrio de propiedades requerido para estos compuestos tal potencia mejorada es sorprendente.
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados de la presente comprenden una fracción escindible. Como se ha indicado, sin desear estar limitados por ningún mecanismo, es lógico que el conjugado permanezca en el compuesto el tiempo suficiente como para proporcionar una mejora en la captación, pero después de eso, es deseable que una parte o, idealmente, todo el conjugado se escinda, liberando el compuesto original (por ejemplo, compuesto antisentido) en su forma más activa. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es un nucleósido escindible. Tales realizaciones aprovechan las nucleasas endógenas en la célula uniendo la fracción del conjugado (el grupo) con el oligonucleótido antisentido a través de un nucleósido mediante uno o más enlaces escindibles, como los de un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo se une al nucleósido escindible a través de un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el nucleósido escindible se une al oligonucleótido antisentido (compuesto antisentido) mediante un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado puede comprender dos o tres nucleósidos escindibles. En tales realizaciones, dichos nucleósidos escindibles se enlazan entre sí, al compuesto antisentido y/o al grupo a través de enlaces escindibles (como los de un enlace fosfodiéster). Ciertos conjugados de la presente no comprenden un nucleósido escindible y en su lugar comprenden un enlace escindible. Se muestra que esa escisión suficiente del conjugado del oligonucleótido se proporciona por al menos un enlace que es vulnerable a la escisión en la célula (un enlace escindible).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son profármacos. Tales profármacos se administran a un animal y finalmente se metabolizan a una forma más activa. Por ejemplo, los compuestos antisentido conjugados se escinden para eliminar todo o parte del conjugado dando como resultado la forma activa (o más activa) del compuesto antisentido que carece de todo o parte del conjugado.
En ciertas realizaciones, los conjugados están unidos en el extremo 5' de un oligonucleótido. Ciertos de tales conjugados 5' se escinden más eficientemente que sus contrapartidas que tienen un grupo conjugado similar unido en el extremo 3'. En ciertas realizaciones, una actividad mejorada puede correlacionarse con una escisión mejorada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 5' tienen mayor eficacia que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 3' (ver, por ejemplo, los Ejemplos 56, 81, 83 y 84). Además, la unión 5' permite una síntesis de oligonucleótidos más simple. Típicamente, los oligonucleótidos se sintetizan sobre un soporte sólido en la dirección 3' a 5'. Para elaborar un oligonucleótido 3' conjugado, típicamente se une un nucleósido 3' preconjugado al soporte sólido y luego se construye el oligonucleótido como de costumbre. Sin embargo, unir ese nucleósido conjugado al soporte sólido añade complicación a la síntesis. Además, usando ese enfoque, el conjugado está entonces presente a lo largo de la síntesis del oligonucleótido y puede degradarse durante los pasos posteriores o puede limitar el tipo de reacciones y reactivos que pueden usarse. Usando las estructuras y técnicas descritas en la presente para oligonucleótidos 5' conjugados, se puede sintetizar el oligonucleótido usando técnicas automatizadas estándar e introducir el conjugado con el nucleósido final (más 5') o después de que el oligonucleótido se haya escindido del soporte sólido.
En vista de la técnica y la presente divulgación, un experto en la técnica puede elaborar fácilmente cualquiera de los conjugados y oligonucleótidos conjugados de la presente. Además, la síntesis de ciertos de tales conjugados y oligonucleótidos conjugados divulgados en la presente es más fácil y/o requiere pocos pasos, y por lo tanto es menos costosa que la de los conjugados divulgados anteriormente, proporcionando ventajas en la fabricación. Por ejemplo, la síntesis de ciertos grupos conjugados consta de menos pasos sintéticos, dando como resultado un rendimiento aumentado, en relación con los grupos conjugados descritos anteriormente. Los grupos conjugados como el GalNAc3-10 en el Ejemplo 46 y el GalNAc3-7 en el Ejemplo 48 son mucho más simples que los conjugados descritos anteriormente, como los descritos en las U.S. 8.106.022 o U.S. 7.262.177 que requieren el ensamblaje de más productos químicos intermedios. Por consiguiente, estos y otros conjugados descritos en la presente tienen ventajas sobre los compuestos descritos anteriormente para su uso con cualquier oligonucleótido, incluyendo los oligonucleótidos de cadena sencilla y cualquier cadena de los oligonucleótidos de cadena doble (por ejemplo, ARNip).
De manera similar, en la presente se divulgan grupos conjugados que tienen solo uno o dos ligandos de GalNAc. Como se muestra, tales grupos conjugados mejoran la actividad de los compuestos antisentido. Tales compuestos son mucho más fáciles de preparar que los conjugados que comprenden tres ligandos de GalNAc. Los grupos conjugados que comprenden uno o dos ligandos de GalNAc pueden unirse a cualquier compuesto antisentido, incluyendo los oligonucleótidos de cadena sencilla y cualquier cadena de oligonucleótidos de cadena doble (por ejemplo, ARNip).
En ciertas realizaciones, los conjugados de la presente no alteran sustancialmente ciertas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en la presente se muestra que los compuestos antisentido conjugados no son más inmunogénicos que los compuestos originales no conjugados. Como se mejora la potencia, las realizaciones en las que la tolerabilidad sigue siendo la misma (o incluso si la tolerabilidad empeora solo ligeramente en comparación con las ganancias en potencia) tienen propiedades mejoradas para la terapia.
En ciertas realizaciones, la conjugación permite alterar compuestos antisentido de maneras que tienen consecuencias menos atractivas en ausencia de conjugación. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, reemplazar uno o más enlaces de fosforotioato de un compuesto antisentido de fosforotioato completo con enlaces de fosfodiéster da como resultado una mejora en algunas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en ciertos casos, tales compuestos antisentido que tienen uno o más fosfodiésteres son menos inmunogénicos que el mismo compuesto en el que cada enlace es un fosforotioato. Sin embargo, en ciertos casos, como se muestra en el Ejemplo 26, ese mismo reemplazo de uno o más enlaces de fosforotioato con enlaces de fosfodiéster también da como resultado una captación celular y/o pérdida en la potencia reducidas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados descritos en la presente toleran dicho cambio en los enlaces con poca o ninguna pérdida en la captación y en la potencia cuando se comparan con la contrapartida de fosforotioato completo conjugado. De hecho, en ciertas realizaciones, por ejemplo, en los Ejemplos 44, 57, 59 y 86, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado y al menos un enlace internucleosídico de fosfodiéster muestran en realidad potencia aumentada in vivo incluso en relación con una contrapartida de fosforotioato completo que también comprende el mismo conjugado. Además, como la conjugación da como resultado aumentos sustanciales en la captación/potencia, una pequeña pérdida en esa ganancia sustancial puede ser aceptable para lograr una tolerabilidad mejorada. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden por lo menos un enlace fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, la conjugación de compuestos antisentido en la presente da como resultado un suministro, captación y actividad aumentados en los hepatocitos. Por tanto, se suministra más compuesto al tejido hepático. Sin embargo, en ciertas realizaciones, ese suministro aumentado por sí solo no explica el aumento completo de la actividad. En ciertas de tales realizaciones, se introduce más compuesto en los hepatocitos. En ciertas realizaciones, incluso esa captación de hepatocitos aumentada no explica el aumento completo de la actividad. En tales realizaciones, aumenta la captación productiva del compuesto conjugado. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 102, ciertas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc aumentan el enriquecimiento de oligonucleótidos antisentido en hepatocitos frente a células no parenquimatosas. Este enriquecimiento es beneficioso para oligonucleótidos que se dirigen a los genes que se expresan en los hepatocitos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados de la presente dan como resultado una exposición renal reducida. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 20, las concentraciones de oligonucleótidos antisentido que comprenden ciertas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc son más bajas en el riñón que la de los oligonucleótidos antisentido que carecen de un conjugado que contiene GalNAc. Esto tiene varias implicaciones terapéuticas beneficiosas. Para las indicaciones terapéuticas donde no se busca actividad en el riñón, la exposición al riñón corre el riesgo de toxicidad renal sin el beneficio correspondiente. Además, la alta concentración en el riñón da como resultado generalmente la pérdida del compuesto en la orina, lo que resulta en una depuración más rápida. De acuerdo con los objetivos no renales, la acumulación renal no es deseada.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos conjugados antisentido que tienen la estructura:
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000049_0002
Fracción dirigida a la célula
i. Ciertas Fracciones Escindibles
En ciertas realizaciones, una fracción escindible es un enlace escindible. En ciertas realizaciones, una fracción escindible comprende un enlace escindible. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado comprende una fracción escindible. En ciertas de tales realizaciones, la fracción escindible se une al oligonucleótido antisentido. En ciertas de tales realizaciones, la fracción escindible se une directamente a la fracción dirigida a la célula. En ciertas de tales realizaciones, la fracción escindible se une al conector conjugado. En ciertas realizaciones, la fracción escindible comprende un fosfato o fosfodiéster. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es un nucleósido o análogo de nucleósido escindible. En ciertas realizaciones, el nucleósido o análogo de nucleósido comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de una purina, purina sustituida, pirimidina o pirimidina sustituida. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es un nucleósido que comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N- benzoiladenina, guanina y 2-N-isobutirilguanina. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es 2-desoxi nucleósido que está unida a la posición 31 del oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster y está unida al conector por un enlace fosfodiéster o fosforotioato. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es 2-desoxi adenosina que está unida a la posición 31 del oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster y está unida al conector por un enlace fosfodiéster o fosforotioato. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es 2 ’-desoxi adenosina que está unida a la posición 3 ’ del oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster y están unida al conector por un enlace fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, la fracción escindible está unida a la posición 31 del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, la fracción escindible está unida a la posición 51 del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, la fracción escindible está unida a una posición 21 del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, la fracción escindible está unida al oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, la fracción escindible está unida al conector por un enlace fosfodiéster o un enlace fosforotioato. En ciertas realizaciones, la fracción escindible está unida al conector por un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado no incluye una fracción escindible.
ii. En ciertas realizaciones, la fracción escindible se escinde después de que el complejo se ha administrado a un animal solo después de ser internalizado por una célula objetivo. Dentro de la célula, la fracción escindible se escinde liberando de este modo el oligonucleótido antisentido activo. Sin querer estar atado por la teoría, se cree que la fracción escindible se escinde por una o más nucleasas dentro de la célula. En ciertas realizaciones, la una o más nucleasas escinden el enlace fosfodiéster entre la fracción escindible y el conector.
Ciertos Conectores
El grupo conjugado del compuesto de la invención comprende un conector. En ciertas de tales realizaciones, el conector se une covalentemente a la fracción escindible. En ciertas de tales realizaciones, el conector se une covalentemente al oligonucleótido antisentido. El conector se une covalentemente a una fracción dirigida a la célula.
El conector es un grupo lineal que comprende grupos alquilo, amida y éter. En ciertas realizaciones, el grupo lineal se une covalentemente a la fracción dirigida a la célula y la fracción escindible. En ciertas realizaciones, el grupo lineal se une covalentemente a la fracción dirigida a la célula y el oligonucleótido antisentido.
El conector conjugado del compuesto de la invención tiene la estructura:
Figure imgf000050_0001
iii. Ciertas Fracciones Dirigidas a las Células
El grupo conjugado del compuesto de la invención comprende fracciones dirigidas a las células. Ciertas de tales fracciones dirigidas a las células aumentan la captación celular de los compuestos antisentido. Las fracciones dirigidas a las células comprenden un grupo de ramificación, tres uniones, y tres ligandos.
1. Ciertos Grupos de Ramificación
El grupo conjugado del compuesto de la invención comprende una fracción dirigida que comprende un grupo de ramificación y tres ligandos unidos. El grupo de ramificación une el conector conjugado. El grupo de ramificación está unido covalentemente al conector y cada uno de los tres ligandos unidos. El grupo de ramificación del compuesto de la invención tiene la estructura:
Figure imgf000050_0002
2. Ciertas Uniones
El grupo conjugado del compuesto de la invención comprende tres uniones unidas covalentemente al grupo de ramificación. La unión se une al grupo de ramificación a través de un grupo éter. La unión se une al ligando a través de un grupo éter.
La unión del compuesto de la invención tiene la estructura:
Figure imgf000050_0003
3. Ciertos Ligandos
Cada ligando del compuesto está unido covalentemente a una unión. En ciertas realizaciones, cada ligando se selecciona para tener una afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula objetivo. En ciertas realizaciones, se seleccionan ligandos que tienen una afinidad por al menos un tipo de receptor en la superficie de una célula hepática de mamífero. En ciertas realizaciones, se seleccionan ligandos que tienen afinidad por el receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGP-R). En ciertas realizaciones de la divulgación, cada ligando es un carbohidrato. Cada ligando del compuesto de la invención es N-acetil galactoseamina (GalNAc). En ciertas realizaciones de la divulgación, la fracción dirigida del compuesto de la invención comprende 3 ligandos de N-acetil galactoseamina.
En ciertas realizaciones, "GalNac" o "Gal-NAc" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, comúnmente referida en la bibliografía como N-acetil galactosamina. En ciertas realizaciones, "N-acetil galactosamina" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa. "GalNac" o "Gal-NAc" del compuesto de la invención se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, que está en la forma p: 2-(acetilamino)-2-desoxi-P-D-galactopiranosa. Adicionalmente a la presente invención, se divulga en la presente la forma a: 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, que está representada por la referencia siguiente:
Figure imgf000051_0001
2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa
Figure imgf000051_0002
2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa
Figure imgf000051_0003
2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa
i. Ciertos Conjugados
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden las características estructurales anteriores que son consistentes con las reivindicaciones adjuntas.
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la estructura siguiente:
Figure imgf000052_0001
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la estructura siguiente:
Figure imgf000052_0002
a Ciertos compuestos antisentido conjugados
En ciertas realizaciones, los conjugados están unidos a un nucleósido de un oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3' o 5' del nucleósido. El compuesto antisentido conjugado puede tener la estructura siguiente:
A-B-C-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es la fracción escindible
C es el conector conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es una unión
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la estructura siguiente:
A-C-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el conector conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es una unión
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas de tales realizaciones, el conector conjugado comprende por lo menos un enlace escindible.
En ciertas de tales realizaciones, el grupo de ramificación comprende por lo menos un enlace escindible. En ciertas realizaciones cada unión comprende por lo menos un enlace escindible.
En ciertas realizaciones, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3', o 5' del nucleósido.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la estructura siguiente:
A-B-C(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es la fracción escindible
C es el conector conjugado
cada E es una unión
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas realizaciones, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3' o 5' del nucleósido. En ciertas realizaciones de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la estructura siguiente:
A-C(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el conector conjugado
cada E es una unión
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la estructura siguiente:
A-B-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es la fracción escindible
D es el grupo de ramificación
cada E es una unión
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la estructura siguiente:
A-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
D es el grupo de ramificación
cada E es una unión
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
Las Patentes de Estados Unidos, publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos, y publicaciones internacionales de solicitud de patente representativas que enseñan la preparación de ciertos conjugados, compuestos antisentido conjugados, uniones, conectores, grupos de ramificación, ligandos, fracciones escindibles, así como otras modificaciones, indicados anteriormente incluyen, sin limitación, US 5.994.517, US 6.300.319, US 6.660.720, US 6.906.182, US 7.262.177, US 7.491.805, US 8.106.022, US 7.723.509, US 2006/0148740, US 2011/0123520 , WO 2013/033230 y WO 2012/037254
Las publicaciones representativas que enseñan la preparación de ciertos conjugados, compuestos antisentido conjugados, uniones, conectores, grupos de ramificación, ligandos, fracciones escindibles, así como otras modificaciones, indicados anteriormente incluyen, sin limitación, BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIe S s EN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38 :1538-1546 , LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, REN Se N et al., "Design and Synthesis of Novel NAcetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618, y Valentijn et al., "Solidphase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden un oligonucleótido a base den RNasa H (como un gapmer) o un oligonucleótido modulador de corte y empalme (como un oligonucleótido completamente modificado) y cualquier grupo conjugado que comprenda por lo menos uno, dos o tres grupos GalNAc. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado comprende cualquier grupo conjugado encontrado en cualquiera de las referencias siguientes: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546 ; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8 , 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132 -5135 ; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15 , 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 1 6 , 5216 -5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012 , 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012 , 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022 ; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8 , 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313 , 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410 -5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128 ; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013 21, 5275-5281; Solicitudes Internacionales W O 1998/013381; W O2011/038356; WO1997/046098 WO2008/098788 W O 2004/101619 W O2012/037254 W O 2011/120053 W O 2011/100131 W O 2011/163121 W O 2012/177947 W O2013/033230 W O2013/075035 W O2012/083185 WO2012/083046 WO2009/082607 WO2009/134487 W O2010/144740 W O 2010/148013 WO1997/020563 WO2010/088537 WO2002/043771 W O2010/129709 W O2012/068187 WO2009/126933 WO2004/024757 WO2010/054406 W O2012/089352 WO2012/089602 W O 2013/166121; W O 2013/165816; Patentes de Estados Unidos 4.751.219 ; 8.552.163; 6.908.903 7.262.177 5.994.517; 6.300.319; 8.106.022; 7.491.805; 7.491.805; 7.582.744; 8.137.695; 6.383.812; 6.525.031 6.660.720 7.723.509; 8.541.548; 8.344.125; 8.313.772; 8.349.308; 8.450.467; 8.501.930; 8.158.601; 7.262.177 6.906.182 6.620.916; 8.435.491; 8.404.862; 7.851.615 ; Publicaciones de Solicitudes de Patente de Estados Unidos Publicadas US2011/0097264; US2011/0097265; US2013/0004427; US2005/0164235; US2006/0148740 US2008/0281044 US2010/0240730 U S2003/0119724 US2006/0183886 US2008/0206869 U S2011/0269814 US2009/0286973 US2011/0207799 U S2012/0136042 U S2012/0165393 US2008/0281041 US2009/0203135 U S2012/0035115 US2012/0095075 U S2012/0101148 US2012/0128760 U S2012/0157509 US2012/0230938 U S2013/0109817 U S2013/0121954 U S2013/0178512 US2013/0236968 U S2011/0123520 US2003/0077829 US2008/0108801 y US2009/0203132
Prueba in vitro de oligonucleótidos antisentido
En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en el cultivo.
Un reactivo usado comúnmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con LIPOFECTINA en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTINA que puede variar de 2 a 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en medio de suero reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA que puede variar de 2 a 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Otra técnica más usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la captación libre de los oligonucleótidos por las células.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos rutinarios. Las células pueden recogerse 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido antisentido, momento en el que los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana se miden mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos repetidos.
La concentración de oligonucleótido antisentido usada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración de oligonucleótidos antisentido óptima para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINA. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislam iento de A R N
El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A) . Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Ciertas indicaciones
Ciertas realizaciones de la divulgación se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de CFB, como un compuesto antisentido dirigido a CFB.
Los ejemplos de enfermedades renales asociadas con la desregulación de la vía alternativa del complemento tratables, prevenibles y/o mejorables con los métodos proporcionados en la presente incluyen glomerulopatía C3, síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), enfermedad por depósito denso (DDD; también conocida como MPGN Tipo II o C3Neph), y nefropatía CFHR5.
Las enfermedades renales adicionales asociadas con la desregulación de la vía alternativa del complemento tratables, prevenibles y/o mejorables con los métodos proporcionados en la presente incluyen nefropatía por IgA; glomerulonefritis mesangiocapilar (membranoproliferativa) (MPGN); trastornos autoinmunes que incluyen nefritis lúpica y lupus eritematoso sistémico (LES); glomerulonefritis inducida por infección (también conocida como glomerulonefritis postinfecciosa); y lesión por isquemia-reperfusión renal, por ejemplo, lesión por isquemia-reperfusión renal posterior al trasplante.
Los ejemplos de trastornos no renales asociados con la desregulación de la vía alternativa del complemento tratables y/o prevenibles con los métodos proporcionados en la presente incluyen enfermedades oculares como la degeneración macular, por ejemplo degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), incluyendo la DMAE húmeda y la DMAE seca, como la Atrofia Geográfica; neuromielitis optica; enfermedad de la córnea, como inflamación de la córnea; uveítis autoinmune; y la retinopatía diabética. Se ha informado que el sistema del complemento está implicado en las enfermedades oculares. Jh a P, et al., Mol Immunol (2007) 44(16):3901-3908. Ejemplos adicionales de trastornos no renales asociados con la desregulación de la vía alternativa del complemento tratables y/o prevenibles con los métodos proporcionados en la presente incluyen vasculitis asociada a ANCA, síndrome antifosfolípido (también conocido como síndrome de anticuerpo antifosfolípido (APS)), asma, artritis reumatoide, Miastenia grave y esclerosis múltiple.
Ciertas realizaciones de la divulgación se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad renal asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de CFB, tal como un compuesto antisentido dirigido a CFB. En ciertas realizaciones, la enfermedad renal es nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome urémico hemolítico atípico (aUSH), o cualquier combinación de las mismas.
Ciertas realizaciones de la divulgación se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de CFB, como un compuesto antisentido dirigido a CFB. En ciertos aspectos, la DMAE es DMAE húmeda o DMAE seca. En ciertos aspectos, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. Los estudios han demostrado la asociación de la desregulación de la vía alternativa del complemento y la DMAE. Los componentes del complemento son constituyentes comunes de las drusas oculares, el material extracelular que se acumula en la mácula de los pacientes con DMAE. Además, se ha informado que las variantes de CFH y CFB representan casi el 75% de los casos de DMAE en el norte de Europa y América del Norte. También se ha descubierto que un polimorfismo de CFB específico confiere protección contra DMAE. Patel, N. et al., Eye (2008) 22(6):768-76. Además, los ratones nulos homocigotos con CFB tienen una actividad de la vía del complemento más baja, muestran lesiones oculares más pequeñas y neovascularización coroidea (CNV) después de fotocoagulación con láser. Rohrer, B. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2009) 50 (7):3056-64 . Además, el tratamiento con ARNip del CFB protege a los ratones de la CNV inducida por láser. Bora, NS et al., J. Immunol. (2006) 177(3):1872-8 . Los estudios también han demostrado que el riñón y el ojo comparten vías de desarrollo y características estructurales incluyendo la composición del protómero IV de colágeno de la membrana basal y la vascularidad. Savige et al., J Am Soc Nephrol. (20 11) 22(8):1403-15. Hay evidencias de que la vía del complemento está implicada en enfermedades renales y oculares. Por ejemplo, la deficiencia proteica reguladora del complemento hereditaria provoca predisposición al síndrome urémico hemolítico atípico y la DMAE. Richards A et al., Adv Immunol. (2007) 96 :141-77 . Además, la enfermedad renal crónica se ha asociado con DMAE. Nitsch, D. et al., Ophthalmic Epidemiol. (2009) 16(3):181-6; Choi, J. et al, Ophtalmic Epidemiol. (2011) 18(6):259-63. La enfermedad por depósito denso (DDD), una enfermedad renal asociada con la vía alternativa del complemento desregulada, se caracteriza por síndrome nefrítico agudo y drusas oculares. Cruz y Smith, GeneReviews (2007) 20 de julio. Además, los ratones que albergan deleción genética de un componente de la vía alternativa del complemento tienen fenotipos de enfermedades renales y oculares coexistentes. Se ha informado que los ratones nulos homocigotos de CFH desarrollan DDD y presentan anomalías retinales y disfunción visual. Pickering et al., Nat Genet. (2002) 31(4):424-8 . Los modelos de ratón de enfermedades renales asociadas con la desregulación de la vía alternativa del complemento también se aceptan como modelos de DMAE. Pennesi ME et al., Mol Apects Med (2012) 33:487-509 . Los ratones nulos de CFH, por ejemplo, son un modelo aceptado para enfermedades renales, como la DDD y la DMAE. Además, se ha informado que la DMAE está asociada con la fuente sistémica de factores del complemento, que se acumulan localmente en el ojo para impulsar la activación del complemento de la vía alternativa. Loyer et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. (2012) 53 (10):6628-37.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran ciertas realizaciones de la presente divulgación y no son limitativos. Además, cuando se proporcionan realizaciones específicas, los inventores han contemplado la aplicación genérica de esas realizaciones específicas. Por ejemplo, la divulgación de un oligonucleótido que tiene un motivo particular proporciona un soporte razonable para oligonucleótidos adicionales que tienen el mismo motivo o uno similar. Y, por ejemplo, cuando aparece una modificación de alta afinidad particular en una posición particular, otras modificaciones de alta afinidad en la misma posición se consideran adecuadas, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1: Método general para la preparación de fosforamiditas, Compuestos 1, 1a y 2
Figure imgf000056_0001
Bx es una base heterocíclica;
Los compuestos 1, 1a y 2 se prepararon de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica como se describe en la especificación de la presente (ver Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011 , 21(4), 1122 - 1125 , J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569 -1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); y ver también las Solicitudes Internacionales de PCT publicadas (WO 2011/ 115818 , WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478, y WO 2007/090071), y la Patente de Estados Unidos 7.569.686).
Ejemplo 2: Preparación del Compuesto 7
Figure imgf000057_0001
Los compuestos 3 (2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acet¡l-2-desoxi-p-Dgalactop¡ranosa o galactosamina pentaacetato) están comercialmente disponibles. El compuesto 5 se preparó de acuerdo con procedimientos publicados (Weber et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 2692).
Ejemplo 3: Preparación del Compuesto 11
Figure imgf000057_0002
Los compuestos 8 y 9 están disponibles comercialmente.
Ejemplo 4: Preparación del Compuesto 18
Figure imgf000058_0001
El Compuesto 11 se preparó de acuerdo con los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 3. El Compuesto 14 está disponible comercialmente. El Compuesto 17 se preparó usando procedimientos similares informados por Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
Ejemplo 39: Método general para la preparación del compuesto oligomérico 83h que comprende un Conjugado de GaINAc3-3 en el extremo terminal 5' (GaINAc3-1 modificado para unión de extremo 5') a través de Soporte Sólido
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
NHAc
El Compuesto 18 se preparó de acuerdo con los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 4. Los Compuestos 83a y 83b están disponibles comercialmente. El Compuesto oligomérico 83e que comprende una hexilamina enlazada con fosfodiéster se preparó usando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos estándar. El tratamiento del compuesto oligomérico protegido con amoniaco acuoso proporcionó el compuesto oligomérico conjugado 5'-GaINAc3-3 (83h).
En donde GaINAc3-3 tiene la estructura:
Figure imgf000060_0002
La parte del grupo GaINAc3 del grupo conjugado GaINAc3-3 (GaINAc3-3a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados en donde GaINAc3-3a tiene la fórmula:
Figure imgf000061_0001
Ejemplo 44: Efecto de los enlaces PO/PS sobre la inhibición antisentido de ASO que comprenden el conjugado GalNAc3-1 (ver el Ejemplo 9) en el extremo terminal 3 dirigido a SRB-1
Se probaron ISIS 655861 y 655862 que comprenden un conjugado GalNAc3-1 en el extremo terminal 3', cada uno dirigido a SR B -1 en un único estudio de administración para su capacidad para inhibir SR B -1 en ratones. El compuesto no conjugado original, ISIS 353382, se incluyó en el estudio por comparación.
Los ASO son gapmers 5-10-5 MOE, en donde la región de hueco comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y cada región ala comprende cinco nucleósidos 2'-MOE modificados. Los ASO se prepararon usando métodos similares a los ilustrados anteriormente en el Ejemplo 19 y se describen en la Tabla 36, a continuación.
Tabla 36
Figure imgf000061_0002
Subíndices: "e" indica nucleósido 2'-MOE modificado; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO); y "o '" indica -O-P(=O)(OH)-. El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas. La estructura de "GalNAc3-1" se muestra en el Ejemplo 9.
Tratamiento
Se inyectó por vía subcutánea una vez a ratones Balb/c macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a la dosificación mostrada a continuación con ISIS 353382, 655861, 655862 o con control tratado con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Antes del tratamiento, así como después de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se analizaron muestras de plasma. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBO GREEN ® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con los protocolos estándar. Los niveles de ARNm de SR B -1 se determinaron con respecto al ARN total (usando Ribogreen), antes de la normalización al control tratado con PBS. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizado al control tratado con PBS y se denota como "% de PBS". Se midieron las ED50 usando métodos similares a los descritos anteriormente y se informan a continuación.
Como se ilustra en la Tabla 37, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de ARNm de SR B -1 de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control tratado con PBS. De hecho, los oligonucleótidos antisentido que comprendían el conjugado GalNAc3-1 en el extremo terminal 3' (ISIS 655861 y 655862) mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Además, ISIS 655862 con enlaces PS/PO mixtos mostró una mejora en la potencia con respecto al PS completo (ISIS 655861).
Tabla 37
Figure imgf000062_0001
Se midieron los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, con respecto a los ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron los pesos de los órganos. Los resultados demostraron que no se observó elevación en los niveles de transaminasas (Tabla 38) o pesos de los órganos (datos no mostrados) en ratones tratados con ASO en comparación con el control PBS. Además, el ASO con enlaces PS/PO mixtos (ISIS 655862) mostró niveles de transaminasas similares en comparación con el PS completo (ISIS 655861).
Tabla 38
Figure imgf000062_0002
Ejemplo 45: Preparación de Éster de PFP, Compuesto 110a
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
Se trató el compuesto 4 (9,5 g, 28,8 mimóles) con el compuesto 103a o 103b (38 mimóles), individualmente, y TMSOTf (0,5 equivalentes) y tamices moleculares en diclorometano (200 ml), y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. En ese momento, la capa orgánica se filtró a través de celite, luego se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salmuera. Luego se separó la capa orgánica y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo bajo presión reducida. El aceite resultante se purificó por cromatografía en gel de sílice (2%--> 10% de metanol/diclorometano) para dar los compuestos 104a y 104b con un rendimiento >80%. La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 104a y 104b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar los compuestos 105a y 105b con >90% de rendimiento. La LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 105a y 105b se trataron, individualmente, con el compuesto 90 bajo las mismas condiciones que para los compuestos 901a-d, para dar los compuestos 106a (80%) y 106b (20%). La LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 106a y 106b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 96a-d (Ejemplo 47), para dar 107a (60%) y 107b (20%). La LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 107a y 107b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 97a-d (Ejemplo 47), para dar los compuestos 108a y 108b con un rendimiento del 40-60%. La LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los compuestos 108a (60%) y 108b (40%) se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar los compuestos 109a y 109b con rendimientos de >80%. La LCMS y R m N de protones fueron consistentes con la estructura.
El Compuesto 109a se trató en las mismas condiciones que para los compuestos 101a-d (Ejemplo 47), para dar el Compuesto 110 a con un rendimiento del 30-60%. La LCMS y NMR de protones fueron consistentes con la estructura. Alternativamente, el Compuesto 110 b puede prepararse de manera similar comenzando con el Compuesto 109b.
Ejemplo 48: Preparación de Oligonucleótido 119 que comprende GalNAc3-7
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El compuesto 112 (5 g, 8,6 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1 : 1 (22 ml/22 ml). Se añadió hidróxido de paladio sobre carbono (0,5 g). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de la reacción se filtró a través de una almohadilla de celite y se lavó la almohadilla con metanol/acetato de etilo 1 : 1. El filtrado y los lavados se combinaron y se concentraron hasta la sequedad para producir el Compuesto 105a (cuantitativo). La estructura fue confirmada por LCMS.
Se disolvieron el compuesto 113 (1,25 g, 2,7 mmol), HBTU (3,2 g, 8,4 mmol) y DIEA (2,8 ml, 16 ,2 mmol) en DMF anhidro (17 ml) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A esto se añadió una solución del Compuesto 105a (3,77 g, 8,4 mmol) en DMF anhidro (20 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El solvente se eliminó a presión reducida para obtener un aceite. El residuo se disolvió en CH2 Cl2 (100 ml) y se lavó con solución de NaHCO3 acuosa saturada (100 ml) y salmuera (100 ml). La fase orgánica se separó, se secó (Na2 SO 4 ), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 10 al 20% en diclorometano para producir el Compuesto 114 (1,45 g, 30%). La estructura se confirmó por LCMS y análisis 1H NMR.
El compuesto 114 (1,43 g, 0,8 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1 : 1 (4 ml/4 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0 ,14 g). La mezcla de la reacción se enjuagó con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de la reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los lavados se combinaron juntos y se evaporaron a presión reducida para producir el Compuesto 115 (cuantitativo). La estructura se confirmó por LCMS y análisis 1H n Mr .
Se disolvieron el compuesto 83a (0,17 g, 0,75 mmol), HBTU (0,31 g, 0,83 mmol) y DIEA (0,26 ml, 1 ,5 mmol) en DMF anhidro (5 ml) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A esto se añadió una solución del Compuesto 115 (1,22 g, 0,75 mmol) en DMF anhidro y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se disolvió en CH2 CI2. La capa orgánica se lavó con solución de NaHCO3 acuosa saturada y salmuera y se secó sobre Na2 SO 4 anhidro y se filtró. La capa orgánica se concentró hasta la sequedad y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 3 al 15% en diclorometano para producir el Compuesto 116 (0,84 g, 61% ). La estructura se confirmó por LC MS y análisis 1H NMR.
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Se disolvió el compuesto 116 (0,74 g, 0,4 mmol) en metanol/acetato de etilo 1 : 1 (5 ml/5 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,074 g). La mezcla de la reacción se enjuagó con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de la reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los lavados se combinaron y se evaporaron a presión reducida para producir el compuesto 117 (0,73 g, 98%). La estructura se confirmó por LCMS y análisis 1H NMR.
Se disolvió el compuesto 117 (0,63 g, 0,36 mmol) en DMF anhidro (3 ml). A esta solución se le añadieron N,N-diisopropiletilamina (70 pl, 0,4 mmol) y trifluoro acetato de pentafluorofenilo (72 pl, 0,42 mmol). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 h y se vertió en una solución de NaHCO3 acuosa saturada. La mezcla se extrajo con diclorometano, se lavó con salmuera y se secó sobre Na2 SO 4 anhidro. La solución de diclorometano se concentró hasta la sequedad y se purificó con cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con del 5 al 10% de MeOH en diclorometano para producir el compuesto 118 (0,51 g, 79%). La estructura se confirmó por LCMS y 1H y 1H y 19F NMR.
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1. Tampon de borato, DMSO, pH 8.5, rt
18
2. amoniaco acuoso
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El Compuesto oligomérico 119 , que comprende un grupo conjugado GalNAc3-7, se preparó usando los procedimientos generales ilustrados en el Ejemplo 46. La parte del grupo GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-7 (GalNAc33-7a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
A continuación se muestra la estructura de GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-):
Figure imgf000068_0002
Ejemplo 51: Preparación del oligonucleótido 155 que comprende GaINAc3 -6
Figure imgf000068_0003
El compuesto 146 se sintetizó como se describe en la bibliografía (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54­ 60).
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Se disolvieron el compuesto 4 (15 g, 45,55 mmol) y el compuesto 35b (14 ,3 gramos, 57 mmol) en CH2 CI2 (200 ml). Se añadieron tamices moleculares activados (4 A, 2 g, en polvo), y la reacción se dejó agitar durante 30 minutos bajo atmósfera de nitrógeno. Se añadió TMS-OTf (4,1 ml, 22,77 mmol) y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche. Tras finalizar, la reacción se inactivó vertiéndola en solución de NaHCO3 acuosa saturada (500 ml) y hielo picado (~150 g). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró hasta un aceite naranja a presión reducida. El material bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2 Ch para producir el Compuesto 112 (16 ,53 g, 63%). La LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el compuesto esperado.
Se disolvió el compuesto 112 (4,27 g, 7,35 mmol) en MeOH/EtOAc 1 : 1 (40 ml). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono, 400 mg), y se burbujeó gas de hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada (TLC MeOH al 10% en CH2 Ch y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró por evaporación rotatoria, y se secó brevemente a vacío alto para producir el Compuesto 105a (3,28 g). La LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto deseado.
Se disolvió el compuesto 147 (2,31 g, 11 mmol) en DMF anhidro (100 ml). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (DIEA, 3,9 ml, 22 mmol), seguido de HBTU (4 g, 10 ,5 mmol). La mezcla de la reacción se dejó agitar durante ~ 15 minutos bajo nitrógeno. A esto se añadió una solución del compuesto 105a (3,3 g, 7,4 mmol) en DMF seco y se agitó durante 2 h bajo atmósfera de nitrógeno. La reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. Se separó la fase orgánica, se secó (MgSO4 ), se filtró y se concentró hasta un jarabe de naranja. El material bruto se purificó por cromatografía en columna de MeOH al 2-5% en CH2 Ch para producir el Compuesto 148 (3,44 g, 73%). La LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto esperado.
Se disolvió el compuesto 148 (3,3 g, 5,2 mmol) en MeOH/EtOAc 1 : 1 (75 ml). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (350 mg). Se burbujeó gas de hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), se eliminó el catalizador por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró por evaporación rotatoria, y se secó brevemente a vacío alto para producir el Compuesto 149 (2,6 g). La LCMS fue consistente con el producto deseado. El residuo se disolvió en DMF seco (10 ml) y se usó inmediatamente en el siguiente paso.
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Se disolvió el compuesto 146 (0,68 g, 1,73 mmol) en DMF seco (20 ml). A esto se le añadieron DIEA (450 |j|, 2,6 mmol, 1,5 equivalentes) y HBTU (1,96 g, 0,5,2 mmol). La mezcla de la reacción se dejó agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. S e añadió una solución del compuesto 149 (2,6 g) en DMF anhidro (10 ml). El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de DIEA (si era necesario). La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 h. Una vez completada, la reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado acuoso, seguido de salmuera. Se separó la fase orgánica, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2 Ch para producir el Compuesto 150 (0,62 g, 20%). La LCMS y 1H n Mr fueron consistentes con el producto deseado.
Se disolvió el compuesto 150 (0,62 g) en MeOH/EtOAc 1 : 1 (5 l). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (60 mg). Se burbujeó gas de hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración (filtro de teflón con punta de jeringuilla, 0,45 jm). El filtrado se concentró por evaporación rotatoria, y se secó brevemente a vacío alto para producir el Compuesto 151 (0,57 g). La LCMS fue consistente con el producto deseado. El producto se disolvió en 4 ml de DMF seco y se usó inmediatamente en el paso siguiente.
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54
Se disolvió el compuesto 83a (0 ,11 g, 0,33 mmol) en DMF anhidro (5 ml) y se añadieron N,N-diisopropiletMamina (75 pl, 1 mmol) y PFP-TFA (90 pl, 0,76 mmol). La mezcla de la reacción se volvió magenta tras el contacto y gradualmente se volvió naranja durante los 30 minutos siguientes. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC y LCMS. Una vez completada (formación del éster PFP), se añadió una solución del compuesto 151 (0,57 g, 0,33 mmol) en DMF. El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de N,N-diisopropiletilamina (si fue necesario). La mezcla de la reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~ 30 min. Una vez completado, se eliminó la mayoría del solvente a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2 Ch y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró hasta un jarabe naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH al 2-10% en CH2 Cl2 ) para producir el Compuesto 152 (0,35 g, 55%). La LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto deseado.
Se disolvió el compuesto 152 (0,35 g, 0 ,182 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1 :1 (10 ml). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (35 mg). S e burbujeó gas de hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración (filtro de teflón con punta de jeringuilla, 0,45 pm). El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a vacío alto para dar el Compuesto 153 (0,33 g, cuantitativo). La LCMS fue consistente con el producto deseado.
Se disolvió el compuesto 153 (0,33 g, 0 ,18 mmol) en DMF anhidro (5 ml) con agitación bajo nitrógeno. A esto se añadieron N,N-diisopropiletilamina (65 pl, 0,37 mmol) y PFP-TFA (35 pl, 0,28 mmol). La mezcla de la reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~30 min. La mezcla de la reacción se volvió magenta tras el contacto y se volvió gradualmente naranja. El pH de la mezcla de la reacción se mantuvo a pH = 9-10 añadiendo más N,-diisopropiletilamina. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC y LCMS. Una vez completada, se eliminó la mayoría del solvente a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2 Ch (50 ml) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSOz, se filtró y se concentró hasta un jarabe naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2 Ch para producir el Compuesto 154 (0,29 g, 79%). La LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto deseado.
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El Compuesto oligomérico 155, que comprende un grupo conjugado GalNAc3 -6 , se preparó usando los procedimientos generales ilustrados en el Ejemplo 46. La parte del grupo GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3 - 6 (GalNAc3 - 6 a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible -P(=O)(OH)-Ad-P(=o)(OH)-.
A continuación se muestra la estructura de GalNAc3 - 6 (GalNAc3 - 6 a-CM-):
Figure imgf000072_0002
E j e m p l o 56 : E s t u d i o d e p e n d i e n t e d e l a d o s i s d e o l i g o n u c l e ó t i d o s q u e c o m p r e n d e n o u n g r u p o c o n j u g a d o 3 ' o u n o 5 ' ( c o m p a r a c i ó n d e G a l N A c 3 - 1 , 2 , 3 , 5 , 6 , 7 y 1 0 ) d i r i g i d o a S R B - 1 in vivo
Los oligonucleótidos enumerados a continuación se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SR B -1 en ratones. Se incluyo ISIS 353382 no conjugado como un estándar. Cada uno de los varios grupos conjugados GaINAc3 se unió en el extremo terminal 5' del oligonucleótido respectivo por un nucleósido 2'-desoxiadenosina enlazado (fracción escindible) excepto para ISIS 655861 que tenía un grupo conjugado GaINAc3 unido en el extremo terminal 3'.
Tabla 42
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Las letras mayúsculas indican la nucleobase para cada nucleósido y mC indica una 5-metil citosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido 2'-MOE modificado; "d" indica un p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internucleosídico de fosforotioato (PS); "o" indica un enlace internucleosídico de fosfodiéster (PO); y "o" indica -O-P(=O)(OH)-. Los grupos conjugados están en negrita.
La estructura de GalNAc3 - 1 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9. La estructura de GalNAc3 -2 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 37. La estructura de GalNAc3 -3 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39. La estructura de GalNAc3 -5 a se ha mostrado anteriormente en Ejemplo 49. La estructura de GalNAc3 -6 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 51. La estructura de GalNAc3 -7 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48. La estructura de GalNAc3 - 10 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 46.
Tratamiento
Se inyectó a ratones Balb/c macho de seis sem anas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) por vía subcutánea una vez a la dosificación mostrad a continuación con ISIS 353382, 655861, 664507, 661161 , 666224, 666961, 666981, 666881 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió de 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBO GREEN ® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con los protocolos estándar. Los resultados siguientes se presentan como el porcentaje medio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control de solución salina.
Como se ilustra en la Tabla 43, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis. De hecho, los oligonucleótidos antisentido conjugados mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Los oligonucleótidos antisentido 5' conjugados mostraron un ligero aumento en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido conjugado 3'.
Tabla 43
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Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron con respecto a los ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron la bilirrubina total y BUN. El cambio en los pesos corporales se evaluó sin un cambio significativo del grupo de solución salina. Los valores de ALT, AST, bilirrubina total y BUN se muestran en la Tabla 44 a continuación.
Tabla 44
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continuación
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E j e m p l o 8 0 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o in vivo p o r o l i g o n u c l e ó t i d o s d i r i g i d o s a A n t i t r i p s i n a A l f a - 1 ( A 1 A T ) q u e c o m p r e n d e n u n C o n j u g a d o G a l N A c 3
Se probaron los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 72 a continuación en un estudio para determinar la inhibición dependiente de la dosis de A1AT en ratones.
T a b l a 72
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continuación
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La estructura de GaINAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, GaINAc3-3aSe ha mostrado en el Ejemplo 39, GaINAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48, GaINAc3-10a se ha mostrado en el Ejemplo 46, y GaINAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62.
Tratamiento
Se inyectó a ratones C57BL/6 macho de seis sem anas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) por vía subcutánea una vez por semana a una dosificación mostrada a continuación, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 72 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm hepático de A1AT se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBO GREEN ® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de proteína en plasma de A1AT se determinaron usando el ELISA de alfa 1 -antitripsina de ratón (N° de catálogo 41-A1AMS-EOl, Alpco, Salem, NH). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de ARNm hepático de A1AT y los niveles de proteínas en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control de PBS.
Como se ilustra en la Tabla 73, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de ARNm hepático y de proteína en plasma de A1AT de manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron significativamente más potentes que el original (ISIS 476366).
Tabla 73
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continuación
Figure imgf000077_0001
La transaminasa hepática y los niveles de BUN en plasma se midieron en el momento del sacrificio usando protocolos estándar. También se midieron los pesos corporales y los pesos de los órganos. Los resultados se muestran en la Tabla 74 a continuación. El peso corporal se muestra como % con respecto al valor de referencia. Los pesos de los órganos se muestran como % del peso corporal con respecto al grupo de control PBS.
Tabla 74
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Ejemplo 81: Duración de la acción in vivo de oligonucleótidos dirigidos a A1AT que comprenden un grupo GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 72 se probaron en un estudio de dosis individual para la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
Se inyectó a ratones C57BL/6 macho de seis semanas de edad por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 72 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a los 5, 12 , 19 y 25 días después de la dosis. Los niveles de proteína de A1AT en plasma se midieron mediante ELISA (ver el Ejemplo 80). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína de A1AT en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado a los niveles de referencia. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron más potentes y tuvieron una duración de acción más larga que el original que carecía de un conjugado GalNAc (ISIS 476366). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 678381, 678382, 678383 y 678384) fueron generalmente incluso más potentes con una duración de acción incluso más larga que el oligonucleótido que comprendía un conjugado 3'-GalNAc (ISIS 656326).
Tabla 75
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Ejemplo 82: Inhibición antisentido in v itro por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden un conjugado GaINAc3
Se sembraron hepatocitos de hígado de ratón primarios en placas de 96 pocillos a 15.000 células/pocillo 2 horas antes del tratamiento. Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 76 se añadieron a 2, 10, 50 o 250 nM en medio E de Williams y las células se incubaron durante la noche a 37° C en 5% de CO2. Las células se lisaron 16 horas después de la adición de oligonucleótidos, y el ARN total se purificó usando RNease 3000 Bio Robot (Qiagen). Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBO GREEN ® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los valores de IC50 se determinaron usando el software Prism 4 (GraphPad). Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden una variedad de grupos conjugados de GalNAc diferentes y una variedad de fracciones escindibles diferentes son significativamente más potentes en un experimento de captación libre in vitro que los oligonucleótidos originales que carecen de un grupo conjugado de GalNAc (ISIS 353382 y 666841).
Tabla 76
Figure imgf000079_0001
continuación
Figure imgf000080_0001
continuación
Figure imgf000081_0002
La estructura de GaINAc3 - 1 a, se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, GaINAc3 - 1 a se ha mostrado en el Ejemplo 39, GaINAc3 -5 a se ha mostrado en el Ejemplo 49, GaINAc3 -6 a se ha mostrado en el Ejemplo 51, GaINAc3 -7 a se ha mostrado en el Ejemplo 48, GaINAc3 -8 a se ha mostrado en el Ejemplo 47, GaINAc3 -9 a se ha mostrado en el Ejemplo 52, GaINAc3 - 10 a se ha mostrado en el Ejemplo 46, GaINAc3 - 1 2 a se ha mostrado en el Ejemplo 61, GaINAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62, GaINAc3-14a se ha mostrado en el Ejemplo 63, GaINAc3-15a se ha mostrado en el Ejemplo 64, GaINAc3-17a, se ha mostrado en el Ejemplo 6 8 , GaINAc3-18a se ha mostrado en el Ejemplo 69, GaINAc3-19a se ha mostrado en el Ejemplo 70, GaINAc3 -2 0 a, se ha mostrado en el Ejemplo 71, y GaINAc3-23a se ha mostrado en el Ejemplo 76.
Ejemplo 83: Inhibición antisentido in vivo por factor de direccionamiento de oligonucleótidos XI que comprende un clúster GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 siguiente se probaron en un estudio para la inhibición dependiente de la dosis del Factor XI en ratones.
Tabla 77
Figure imgf000081_0001
continuación
Figure imgf000082_0001
La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, GalNAc3-3a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39, GalNAc3-7a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48, GalNAc3-10a se ha mostrado anteriormente 46, y GalNAc3-13a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 62.
Tratamiento
Se inyectó a cada uno de los ratones de seis a ocho semanas de edad por vía subcutánea una vez por semana a una dosificación mostrada a continuación, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado a continuación o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la dosis final. Los niveles de ARNm del hígado del Factor XI se midieron usando PCR en tiempo real y se normalizaron a ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. También se midieron las transaminasas hepáticas, BUN y bilirrubina. Los resultados siguientes se presentan como el porcentaje medio para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control de PBS.
Como se ilustra en la Tabla 78, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó el ARNm hepático del Factor XI de manera dependiente de la dosis. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron más potentes que el original que carecía de un conjugado GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron incluso más potentes que el oligonucleótido que comprendía un conjugado 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 78
Figure imgf000082_0002
continuación
Figure imgf000083_0001
Ejemplo 84: Duración de la acción in vivo de oligonucleótidos dirigidos al Factor XI que comprenden un Conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 se probaron en un estudio de dosis individual para la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
A cada uno de los ratones de seis a ocho sem anas de edad se les inyectó por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 77 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. La sangre se extrajo mediante hemorragias en la cola el día antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a los 3, 10 y 17 días después de la dosis. Los niveles de proteína del Factor XI en plasma se midieron por ELISA usando captura de Factor XI y anticuerpos de detección biotinilados de R & D Systems, Minneapolis, MN (N° de catálogo AF2460 y BAF2460, respectivamente) y el conjunto B de reactivos OptEIA (N° de catálogo 550534, BD Biosciences, San José, CA). Los resultados siguientes se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína del Factor XI en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado a los niveles de referencia. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron más potentes con una duración de acción más larga que el original que carecía de un conjugado GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprendían un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron incluso más potentes con una duración de acción incluso más larga que el oligonucleótido que comprendía un conjugado 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 79
Figure imgf000083_0002
continuación
Figure imgf000084_0002
Ejemplo 93: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden alas mixtas y un conjugado 5 '-GaINAc3
Se probaron los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 100 en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 100
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La estructura de GalNAc3 -3 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39, y la estructura de GalNAc3 -7 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48. Subíndices: "e" indica nucleósido 2'-MOE modificado; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "k" indica nucleósido bicíclico 6 -S T C H 3 (cEt); "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO). Superíndice "m" indica 5-metilcitosinas.
Tratamiento
Se inyectó subcutáneamente a ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) una vez a la dosificación mostrada a continuación con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 100 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm de SR B -1 en el hígado se midieron usando PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de SRB-1 se normalizaron a los niveles de ARNm de ciclofilina según los protocolos estándar. Los resultados se presentan como el porcentaje medio de los niveles de ARNm de SR B -1 para cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control de solución salina. Como se ilustra en la Tabla 101, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de ARNm de SR B -1 de manera dependiente de la dosis, y los oligonucleótidos gapmer que comprendían un conjugado GalNAc y que tenían alas que eran o modificaciones de cEt completas o modificaciones de azúcar mixtas fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carecía de un conjugado y que comprendía alas modificadas con cEt completo.
También se midieron los pesos corporales, las transaminasas hepáticas, la bilirrubina total y el BUN, y en la Tabla 101 se muestran los valores medios para cada grupo de tratamiento. El peso corporal se muestra como el porcentaje medio de peso corporal con respecto al peso corporal de referencia (% BL) medido justo antes de la dosis de oligonucleótidos.
Tabla 101
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Ejemplo 95: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden nucleósidos bicíclicos y un conjugado 5 '-GaINAC3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 104 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SR B -1 en ratones.
Tabla 104
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continuación
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El subíndice "g" indica un nucleósido de fluoro-HNA, el subíndice "1" indica un nucleósido bloqueado que comprende un puente 2-O-CH2-4 '. Ver la leyenda de la tabla del Ejemplo 74 para otras abreviaturas. La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, la estructura de GalNAc3-3a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39, y la estructura de GalNAc3-7a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48.
Tratamiento
El estudio se completó usando el protocolo descrito en el Ejemplo 93. Los resultados se muestran en la Tabla 105 a continuación y muestran que los oligonucleótidos que comprendían un conjugado GalNAc y varias modificaciones de nucleósidos bicíclicos fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carecía de un conjugado y que comprendía modificaciones de nucleósidos bicíclicos. Además, el oligonucleótido que comprende un conjugado de GalNAc y modificaciones de fluoro-HNA fue significativamente más potente que el original que carecía de un conjugado y que comprendía modificaciones de fluoro-HNA. Los resultados las mediciones de los pesos corporales, las transaminasas hepáticas, la bilirrubina total y de BUN indicaron que todos los compuestos fueron bien tolerados.
Tabla 105
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Ejemplo 96: Unión a proteínas plasmáticas de oligonucleótidos antisentido que comprenden un grupo conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 70 dirigidos a ApoC-III y los oligonucleótidos en la Tabla 106 dirigidos a Apo(a) se probaron en un ensayo de ultrafiltración para evaluar la unión a proteínas plasmáticas.
Tabla 106
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Ver el Ejemplo 47 para la leyenda de la tabla . La estructura de GaINAc3-7a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48.
Se pre-acondicionaron unidades de ultrafiltración Ultrafree-MC (30.000 NMWL, membrana de celulosa regenerada de baja unión, Millipore, Bedford, MA) con 300 pl de Tween 80 al 0,5% y se centrifugaron a 2000 g durante 10 minutos, luego con 300 pl de 300 pg/ml de solución de un oligonucleótido de control en H2 O y se centrifugaron a 2000 g durante 16 minutos. Para evaluar la unión no específica a los filtros de cada oligonucleótido de prueba de las Tablas 70 y 106 que se usarán en los estudios, se colocaron 300 pl de una solución de oligonucleótido de 250 ng/ml en H2 O a pH 7,4 en los filtros preacondicionados. y se centrifugaron a 2000 g durante 16 minutos. Las muestras no filtradas y filtradas se analizaron mediante un ensayo ELISA para determinar las concentraciones de oligonucleótidos. Se usaron tres réplicas para obtener una concentración media para cada muestra. La concentración media de la muestra filtrada con respecto a la muestra no filtrada se usa para determinar el porcentaje de oligonucleótido que se recupera a través del filtro en ausencia de plasma (% de recuperación).
Las muestras de plasma entero congelado recogidas en K3-EDTA de voluntarios humanos normales libres de drogas, monos cynomolgus y ratones CD-1, se adquirieron de Bioreclamation LLC (Westbury, NY). Los oligonucleótidos de prueba se añadieron a alícuotas de 1,2 ml de plasma a dos concentraciones (5 y 150 pg/ml). Se colocó una alícuota (300 pl) de cada muestra de plasma enriquecida en una unidad de filtro pre-acondicionada y se incubaron a 37° C durante 30 minutos, seguido inmediatamente por centrifugación a 2000 g durante 16 minutos. Se analizaron alícuotas de muestras de plasma enriquecidas filtradas y no filtradas mediante un ELISA para determinar la concentración de oligonucleótidos en cada muestra. Se usaron tres réplicas por concentración para determinar el porcentaje medio de oligonucleótido unido y no unido en cada muestra. La concentración media de la muestra filtrada con respecto a la concentración de la muestra no filtrada se usa para determinar el porcentaje de oligonucleótido en el plasma que no está unido a las proteínas plasmáticas (% no unido). Los valores finales de oligonucleótidos no unidos se corrigen para la unión no específica dividiendo el % no unido por el % de recuperación para cada oligonucleótido. Los valores finales de % de oligonucleótido unido se determinan restando los valores finales de % no unido de 100. Los resultados se muestran en la Tabla 107 para las dos concentraciones de oligonucleótido analizadas (5 y 150 pg/ml) en cada especie de plasma. Los resultados muestran que los grupos conjugados GalNAc no tienen un impacto significativo sobre la unión a proteínas plasmáticas. Además, los oligonucleótidos con enlaces internucleosídicos PS completos y enlaces PO/PS mixtos se unen ambos a proteínas plasmáticas, y aquellos con enlaces PS completos se unen a proteínas plasmáticas en un grado algo mayor que aquellos con enlaces PO/PS mixtos.
Tabla 107
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continuación
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Ejemplo 98: Evaluación de los efectos proinflamatorios de oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc en el ensayo de hPMBC
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 109 fueron probados para efectos proinflamatorios en un ensayo de hPMBC como se describe en los Ejemplos 23 y 24. (Ver las Tablas 30, 83, 95 y 108 para las descripciones de los oligonucleótidos). ISIS 353512 es un respondedor alto usado como control positivo, y los otros oligonucleótidos se describen en las Tablas 83, 95 y 108. Los resultados mostrados en la Tabla 109 se obtuvieron usando sangre de un donante voluntario. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden enlaces internucleosídicos PO/PS mixtos produjeron respuestas proinflamatorias significativamente más bajas en comparación con los mismos oligonucleótidos que tienen enlaces PS completos. Además, el grupo conjugado GalNAc no tuvo un efecto significativo en este ensayo.
Tabla 109
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Ejemplo 99: Afinidades de unión de oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc para el receptor de asialoglicoproteína
Se probaron las afinidades de unión de los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 110 (ver Tabla 76 para las descripciones de los oligonucleótidos) para el receptor de asialoglicoproteína en un ensayo de unión de receptor competitivo. El ligando competidor, la glicoproteína a1-ácida (AGP), se incubó en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5) con 1 U de neuraminidasa-agarosa durante 16 horas a 37° C, y se confirmó >90% de desialilación mediante ensayo de ácido siálico o cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se usó monocloruro de yodo para yodar el AGP de acuerdo con el procedimiento de Atsma et al. (ver J Lipid Res. enero 1991; 32(1): 173-81). En este método, se añadió glucoproteína a1-ácida desialilada (de-AGP) a cloruro de yodo 10 mM, Na125I y glicina 1 M en NaOH 0,25 M. Después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, el de-AGP marcado con 125I se separó del 125l libre concentrando la mezcla dos veces utilizando una columna giratoria de 3 KDMWCO. Se probó la proteína para la eficacia del etiquetado y la pureza en un sistema HPLC equipado con una columna Agilent SEC-3 (7,8x300 mm) y un contador p-RAM. Los experimentos de competición que utilizan de-AGP marcado con 125I y varios diversos ASO que contienen grupos GalNAc se realizaron de la siguiente manera. Se colocaron en placas células HepG2 humanas (106 células/ml) en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de crecimiento apropiado. Se usaron medios MEM suplementados con suero bovino fetal al 10% (FBS), L-Glutamina 2 mM y He P e S 10 mM. Las células se incubaron 16-20 horas a 37° C con 5% y 10% de CO2 , respectivamente. Las células se lavaron con medio sin FBS antes del experimento. Las células se incubaron durante 30 minutos a 37° C con una mezcla competitiva de 1 ml que contenía medio de crecimiento apropiado con FBS al 2%, de-AGP marcado con 125I 10 '8 M y grupo de GalNAc que contenía ASO a concentraciones que varían de 10 '11 a 10 '5. Se determinó la unión inespecífica de 5 M. en presencia de azúcar GalNAc 10 '2 M. Las células se lavaron dos veces con medio sin FBS para eliminar el de-AGP marcado con 125I no unido y el ASO de GalNAc competidor. Las células se lisaron usando tampón RLT de Qiagen que contenía p-mercaptoetanol al 1% . Los lisados se transfirieron a tubos de ensayo de fondo redondo después de un breve ciclo de congelación/descongelación de 10 minutos y se analizaron en un contador y . La unión no específica se sustrajo antes de dividir los recuentos de proteínas 125I por el valor de los recuentos de concentración de GalNAc-ASO más bajos. Las curvas de inhibición se ajustaron de acuerdo con una ecuación de unión de competición de sitio único usando un algoritmo de regresión no lineal para calcular las afinidades de unión (Kd).
Los resultados en la Tabla 110 se obtuvieron de experimentos realizados en cinco días diferentes. Los resultados para los oligonucleótidos marcados con el superíndice "a" son la media de los experimentos ejecutados en dos días diferentes. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc en el extremo 5' se unen al receptor de asialoglicoproteína en células HepG2 humanas con una afinidad de 1,5 a 1,6 veces mayor que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc en el extremo 3'.
T a b l a 110
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E j e m p l o 101 : i n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o p o r o l i g o n u c l e ó t i d o s q u e c o m p r e n d e n u n g r u p o G a l N A c u n i d o a t r a v é s d e u n a f r a c c i ó n e s t a b l e
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 112 se probaron para la inhibición de la expresión de APOC-III de ratón in vivo. A cada uno de los ratones C57B1/6 se le inyectó por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 112 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Cada ratón tratado con ISIS 440670 recibió una dosis de 2, 6, 20 o 60 mg/kg. Cada ratón tratado con ISIS 680772 o 696847 recibió 0,6, 2, 6 o 20 mg/kg. El grupo conjugado GalNAc de ISIS 696847 está enlazado a través de una fracción estable, un enlace de fosforotioato en lugar de un enlace que contiene fosfodiéster fácilmente escindible. Los animales fueron sacrificados 72 horas después de la dosis. Los niveles de ARNm de APOC-III en el hígado se midieron usando PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de APOC-III se normalizaron a niveles de ARNm de ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados se presentan en la Tabla 112 como el porcentaje medio de los niveles de ARNm de APOC-III para cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control de solución salina. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido que carece de un grupo conjugado. Además, el oligonucleótido que comprendía un grupo conjugado de GalNAc enlazado al oligonucleótido a través de una fracción escindible (ISIS 680772) fue incluso más potente que el oligonucleótido que comprendía un grupo conjugado de GalNAc enlazado al oligonucleótido a través de una fracción estable (ISIS 696847).
T a b l a 112
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La estructura de GaINAc3 -7 a se muestra en el Ejemplo 48.
E j e m p l o 1 1 3 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o in v ivo p o r o l i g o n u c l e ó t i d o s d i r i g i d o s a C F B
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 121 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido del Factor B del Complemento (CFB) humano en ratones.
T a b l a 121
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La estructura de GaINAc3- 3 a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39.
Tratamiento
Se inyectó a ratones transgénicos que expresan CFB humano (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) por vía subcutánea una vez por semana durante 3 semanas (un total de 4 dosis) un oligonucleótido enumerado en la Tabla 122 o con solución salina. Los cuatro grupos de tratamiento que recibieron ISIS N° 588540 recibieron 6 , 12, 25 o 50 mg/kg por dosis. Los cuatro grupos de tratamiento que recibieron ISIS N° 687301 recibieron 0,25, 0,5, 2 o 6 mg/kg por dosis. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Los ratones se sacrificaron 2 días después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de CFB y ciclofilina humana del hígado y riñón usando PCR en tiempo real de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de ARNm de CFB se normalizaron a los niveles de ciclofilina, y se usaron las medias para cada grupo de tratamiento para determinar la dosis que logró una inhibición del 50% de la expresión del transcrito de CFB humano (ED50 ). Los resultados son las medias de cuatro experimentos completados con dos conjuntos de sondas de cebador diferentes y se muestran en la Tabla 122.
T a b l a 122
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Se midieron los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, con respecto a los ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron la bilirrubina total, el BUN y el peso corporal. Los resultados muestran que no hubo cambios significativos en ninguno de los grupos de tratamiento con respecto al grupo tratado con solución salina (datos no mostrados), lo que indica que ambos oligonucleótidos fueron muy bien tolerados.
E j e m p l o 1 1 4 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o in v ivo p o r o l i g o n u c l e ó t i d o s d i r i g i d o s a C F B
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 123 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de CFB humano en ratones.
Tratamiento
Se inyectó a ratones transgénicos que expresan CFB humano (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) por vía subcutánea una vez con 0,6, 1, 6 o 18 mg/kg de un oligonucleótido enumerado en la Tabla 123 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 o 5 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la dosis para determinar los niveles de ARNm de CFB y ciclofilina humana en el hígado usando PCR en tiempo real de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de ARNm de CFB se normalizaron a los niveles de ciclofilina, y se usaron las medias para cada grupo de tratamiento para determinar la dosis que logró una inhibición del 50% de la expresión del transcrito de CFB humano (ED50 ). Los resultados se muestran en la Tabla 123.
T l 12
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La estructura de GaINAc3 -7a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48.
Ejemplo 115 : Inhibición antisentido del Factor B del Complemento humano (CFB) en células HepG2 por gapmers de MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos en el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. S e usó un conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 (secuencia directa AGTCTCTGTGGCATGGTTTGG, designada en la presente como SEQ ID NO: 810; secuencia inversa GGGCGAATGACTGAGATCTTG, designada en la presente como SEQ ID NO: 811 ; secuencia de sonda TACCGATTACCACAAGCAACCATGGCA, designada en la presente como SEQ ID NO: 812) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers de 5-10-5 MOE. Los gapmers de 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central está compuesto de diez 2 '-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia genética humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en secuencia genética humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido al ARNm de c Fb humano, designado en la presente como s Eq ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM _001710.5) o la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso de GENBANK NT_007592.15 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética en particular con un 10 0 % de complementariedad.
T a b l a 124
Figure imgf000091_0002
continuación
Figure imgf000092_0001
continuación
Figure imgf000093_0001
T a b l a 125
Figure imgf000093_0002
continuación
Figure imgf000094_0001
continuación
Figure imgf000095_0001
T a b l a 126
Figure imgf000095_0002
continuación
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continuación
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T l 12
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continuación
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continuación
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T a b l a 128
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continuación
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continuación
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Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3460_MGB (secuencia directa CGAAGCAGCTCAATGAAATCAA, designada en la presente como SEQ ID NO: 813; secuencia inversa TGCCTGGAGGGCCTTCTT, designada en la presente como SEQ ID NO: 814; secuencia de sonda AGACCACAAGTTGAAGTC, designada en la presente como SEQ ID NO: 815) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control sin tratar.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers de 5-10-5 MOE. Los gapmers de 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central está compuesto de diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia genética humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia genética humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes se dirige al ARNm de CFB humano, designado en la presente como s Eq ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM _001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso de g E n BANK NT_007592015 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100% de complementariedad
T a b l a 129
Figure imgf000103_0001
continuación
Figure imgf000104_0001
continuación
Figure imgf000105_0002
Figure imgf000105_0001
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 5.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo al contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguiente se diseñaron como gapmers de 5-10-5 MOE. Los gapmers tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central consiste de diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' comprendiendo cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia genética humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia genética humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido al ARNm de CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM _001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso de G e NBANK NT_007592.15 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia genética en particular con un 100% de complementariedad. En caso de que no se muestre la alineación de la secuencia para un gen objetivo en una tabla particular, se entiende que ninguno de los oligonucleótidos presentados en esa tabla se alinea con una complementariedad del 100% con ese gen objetivo.
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Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos en el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 3.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se uso el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de a R n , medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers de 4-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 3-10-4 MOE, 3-10-7 MOE, 6-7-6 MOE, 6-8-6 MOE o 5-7-5 MOE, o como desoxi, MOE y (S)-cEt oligonucleótidos.
Los gapmers de 4-8-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y cinco nucleósidos, respectivamente. Los gapmers de 5-9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos del ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 5- 10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 5-7-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 3-10-4 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3 'que comprenden tres y cuatro nucleósidos, respectivamente. Los gapmers de 3-10-7 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y siete nucleósidos, respectivamente. Los gapmers 6-7-6 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos del ala en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los gapmers de 6- 8-6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.
Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en donde el nucleósido tiene o una modificación de azúcar de MOE, una modificación de azúcar de (S)-cEt o una modificación de desoxi. La columna "Química" describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. 'k' indica una modificación de azúcar (S)-cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación de MOE.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido al ARNm de CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM _001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso de GENBANK NT_007592015 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia de genes particular con un 100% de complementariedad.
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Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20 .0 00 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 2.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers de 4-8-5 MOE, 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE, 3-10-5 MOE, o 6 -8 - 6 MOE.
Los gapmers de 4-8-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y cinco nucleósidos, respectivamente. Los gapmers de 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2 '-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers 5-9­ 5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 5-10-5 de MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2 '-dexinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 3-10-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2 '-desoxinucleósidos 'y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y cinco nucleósidos, respectivamente. Los gapmers de 6-7-6 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los gapmers de 6 -8 - 6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2 '-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido al ARNm de CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM _001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de acceso de GENBANK NT_007592.15 truncada a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia de genes en particular con un 10 0 % de complementariedad.
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Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 1.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en donde el nucleósido tiene una modificación de azúcar de MOE, una modificación de azúcar de (S)-cEt o una modificación de desoxi. La columna "Química" describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. 'k' indica una modificación de azúcar (S)-cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación de MOE.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes se dirige al ARNm de CFB humano, designado en la presente como s Eq ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM _001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso G E n Ba NK NT_007592015 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia genética en particular con un 10 0 % de complementariedad.
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Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan por separada en las tablas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de a Rn , medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt, o como gapmers de 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE , 3­ 10-5 MOE, o 6 -8 - 6 MOE.
Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en donde el nucleósido tiene o una modificación de azúcar de MOE, una modificación de azúcar de (S)-cEt o una modificación desoxi. La columna "Química" describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. 'k' indica una modificación de azúcar (S)-cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación de MOE.
Los gapmers 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers 5-9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende nueve 2 '-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2 '-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers 3-10-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprenden tres y cinco nucleósidos, respectivamente. Los gapmers 6-7-6 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende siete 2 '-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los gapmers 6 -8 - 6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.
Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes se dirige al ARNm de CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM _001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso GENBANK NT_007592015 truncada a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia genética en particular con un 10 0 % de complementariedad.
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Ejemplo 122 Inhibición antisentido dependiente de la d osis de CFB humano en células HepG2 por gapm ers 5-10-5 MOE
Se seleccionaron gapmers de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro del ARNm de CFB y se probaron a varias dosis en células HepG2. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0 ,313 j M, 0,625 j M, 1,25 j M, 2,50 j M, 5,00 j M o 10,00 j M de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 148
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Ejemplo 123 Inhibición antisentido dependiente de la d osis de CFB humano en células HepG2
Se seleccionaron gapmers de los estudios descritos anteriormente que mostraron inhibición in vitro del ARNm de CFB y se probaron a varias dosis en células HepG2. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en varios experimentos con condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,08 j M, 0,25 j M, 0,74 j M, 2,22 j M, 6,67 j M y 20,00 j M, como se especifica en la Tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido
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E j e m p l o 124 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e p e n d i e n t e d e l a d o s i s d e C F B h u m a n o e n c é l u l a s H e p G 2
Se seleccionaron gapmers de los estudios descritos anteriormente que mostraron inhibición in vitro del ARNm de CFB y se probaron a varias dosis en células HepG2. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en varios experimentos con condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,06 j M, 0,25 j M, 1,00 j M y 4,00 j M de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles del ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control sin tratar.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
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E j e m p l o 125 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e p e n d i e n t e d e l a d o s i s d e C F B h u m a n o e n c é l u l a s H e p G 2
Se seleccionaron gapmers de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro del ARNm de CFB y se probaron a varias dosis en células HepG2. Además, se diseñó un oligonucleótido desoxi, MOE y (S)-cEt, ISIS 594430, con la misma secuencia (CTCCTTCCGAGTCAGC, SEQ ID NO: 549) y región objetivo (sitio de inicio objetivo 2195 de la SEQ ID NO: 1 y sitio de inicio objetivo 6983 de SEQ ID NO: 2) como ISIS 588870, otro oligonucleótido desoxi, MOE y (S)-cEt. ISIS 594430 es un gapmer de (S)-cEt 3-10-3.
Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,01 j i M, 0,04 j i M, 0 ,12 j i M, 0,37 j iM, 1 , 11 |jM, 3,33 jiM y 10,00 jiM, como se especifica en la Tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50 ) para cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
T a b l a 160
Figure imgf000149_0001
E j e m p l o 126 : T o l e r a b i l i d a d d e g a p m e r s d e M O E d i r i g i d o s a C F B h u m a n o e n r a t o n e s C D 1
Los ratones C D 1® (Charles River, MA) son un modelo de ratón multipropósito, utilizado frecuentemente para pruebas de seguridad y eficacia. Los ratones se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron los cambios en los niveles de varios marcadores de química del plasma.
Estudio 1 (con gapmers de 5-10-5 MOE)
Se inyectaron subcutáneamente a ratones CD1 machos de siete sem anas de edad una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido ISIS. Un grupo de ratones CD1 macho se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Un grupo de ratones se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 sem anas con 100 mg/kg del oligonucleótido de control ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, designado en la presente como SEQ ID NO: 809, gapmer de 5-10-5 MOE sin objetivo murino conocido). Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
M arcadores de quím ica del plasm a
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles de plasma de las transaminasas y BUN utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 161
Figure imgf000150_0001
P e so s
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 40 antes de sacrificar a los ratones. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de sacrificar a los ratones. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 162
Figure imgf000150_0002
Estudio 2 (con gapmers de 5-10-5 MOE)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 machos de seis a ocho semanas de edad subcutáneamente una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido ISIS. Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Un grupo de ratones se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con 100 mg/kg del oligonucleótido de control ISIS 141923. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis, y se recogieron los órganos y el plasma para análisis adicional.
M arcadores de quím ica del plasm a
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 163
Figure imgf000151_0001
P e so s
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 42. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 45. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 164
Figure imgf000151_0002
Estudio 3 (con gapmers de 5-10-5 MOE)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 machos de seis a ocho semanas de edad subcutáneamente una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido ISIS. Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional. M arcadores de quím ica del plasm a
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasmas de transaminasas, albúmina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 165
Figure imgf000152_0001
P e so s
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 42. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 42. Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 166
Figure imgf000152_0002
Estudio 4 (con gapmers de (S) cEt y oligonucleótidos de desoxi, MOE y (S)-cEt)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 machos de diez semanas de edad por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 sem anas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS de los estudios descritos anteriormente. Además, se diseñaron dos oligonucleótidos, ISIS 594431 e ISIS 594432, como gapmers de 3-10-3 (S)-cEt y también se probaron en este estudio. ISIS 594431 (ACCTCCTTCCGAGTCA, SEQ ID NO: 550) está dirigido a la misma región que ISIS 588871, un gapmer de desoxi, MOE y (S)-cEt (sitio de inicio objetivo 2197 de la SEQ ID NO: 1 y sitio de inicio objetivo 6985 de la SEQ ID NO: 2). ISIS 594432 (TGGTCACATTCCCTTC, SEQ ID NO: 542) está dirigido a la misma región que ISIS 588872 un gapmer de desoxi, MOE y (S)-cEt (sitio de inicio objetivo 154 de la SEQ ID NO: 1 y sitio de inicio objetivo 1875 de la s Eq ID NO: 2).
Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 sem anas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
M arcadores de quím ica del plasm a
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 167
Figure imgf000153_0001
P e so s
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 39. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 42. Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 45
Figure imgf000153_0002
continuación
Figure imgf000154_0002
Estudio 5 (con gapmers de MOE, gapmers de (S) cEt y oligonucleótidos de desoxi, MOE y (S)-cEt)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 machos de ocho a nueve sem anas de edad por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS. Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional. M arcadores de quím ica del plasm a
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 169
Figure imgf000154_0001
continuación
Figure imgf000155_0001
P e so s
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 40. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 42. Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 170
Figure imgf000155_0002
Estudio 6 (con oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt)
S e inyectaron a grupos de ratones CD1 macho de ocho a nueve semanas de edad por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 sem anas 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 sem anas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
M arcadores de quím ica del plasm a
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina, bilirrubina y BUN utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 171
Figure imgf000156_0001
P e so s
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 40. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 45. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 172
Figure imgf000156_0002
Estudio 7 (con gapmers de MOE y desoxi, oligonucleótidos MOE y (S)-cEt)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 macho de ocho a nueve semanas de edad subcutáneamente una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótidos ISIS. Un grupo de ratones CD1 macho se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 sem anas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
M arcadores de quím ica del plasm a
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 173
Figure imgf000157_0002
P e so s
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 44. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 49. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Figure imgf000157_0001
continuación
Figure imgf000158_0003
Estudio 8 (con gapmers MOE, oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt, y gapmers (S)-cEt)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 macho de ocho a nueve semanas de edad por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de gapmers MOE, o 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt o gapmers (S)-cEt. Un grupo de ratones CD1 macho se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para análisis adicional.
M arcadores de quím ica del plasm a
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente.
T a b l a 175
Figure imgf000158_0001
P e so s
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 36. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 43. Los resultados para los pesos de los órganos se expresaron como una relación con los pesos corporales y se normalizaron a la relación de control PBS.
T a b l a 176
Figure imgf000158_0002
continuación
Figure imgf000159_0003
En sa yo s de citoquinas
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para medir los distintos niveles de citoquinas, como IL-6, MDC, MIP1p, IP-10, MCP1, M IP-1a y RANTES. Los resultados se presentan en la Tabla 54.
T a b l a 177
Figure imgf000159_0002
En sa yo s de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para mediciones de hematocritos (HCT), así como de las varias células sanguíneas, como WBC, RBC y plaquetas, y el contenido de hemoglobina total (Hb). Los resultados se presentan en la tabla 55.
T a b l a 178
Figure imgf000159_0001
E j e m p l o 127 : T o l e r a b i l i d a d d e o l i g o n u c l e ó t i d o s a n t i s e n t i d o d i r i g i d o s a C F B h u m a n o e n r a t a s S p r a g u e -D a w l e y
Las ratas Sprague-Dawley son un modelo multipropósito usado para evaluaciones de seguridad y eficacia. Las ratas se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS de los estudios descritos en los Ejemplos anteriores y se evaluaron los cambios en los niveles de varios marcadores de química del plasma.
Estudio 1 (con gapmers de 5-10-5 MOE)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho, de siete a ocho semanas de edad, en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez una semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmers 5-10-5 MOE. Un grupo de control de 6 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 sem anas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 179
Figure imgf000160_0002
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 180
Figure imgf000160_0001
P e so s
Se tomaron mediciones del peso corporal el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
T a b l a 181
Figure imgf000161_0001
Estudio 2 (con oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a diez semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez una semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. Dos grupos de control de 3 ratas cada uno se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 sem anas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 42 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y albúmina y los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 182
Figure imgf000161_0002
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 183
Figure imgf000162_0002
P e so s
Las mediciones del peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
T a b l a 184
Figure imgf000162_0003
Estudio 3 (con gapmers MOE)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a diez semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez una semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmers MOE. Un grupo de control de 6 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para un análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 43 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 185
Figure imgf000162_0001
continuación
Figure imgf000163_0002
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 186
Figure imgf000163_0003
P e so s
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
T a b l a 187
Figure imgf000163_0001
Estudio 4 (con gapmers MOE)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a diez semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez una semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmers MOE. Un grupo de control de 6 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 42 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 188
Figure imgf000164_0001
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 189
Figure imgf000164_0002
P e so s
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
T a b l a 190
Figure imgf000165_0003
Estudio 5 (con gapmers MOE y oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a diez semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmer MOE o con 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. Un grupo de control de 4 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 42 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 191
Figure imgf000165_0001
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal se midieron los niveles en plasma y orina de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en las Tablas siguientes, expresados en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 192
Figure imgf000165_0002
continuación
Figure imgf000166_0002
T a b l a 193
Figure imgf000166_0003
P e so s
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
T a b l a 194
Figure imgf000166_0001
Estudio 6 (gapmers MOE, oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt y gapmers (S)-cEt)
Se mantuvieron ratas macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmers de MOE o con 50 mg/kg de oligonucleótido desoxi, MOE y (S)-cEt o gapmer (S)-cEt. Un grupo de control de 4 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 sem anas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 42 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l.
T a b l a 195
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Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles de proteína total y creatinina en la orina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
T a b l a 196
Figure imgf000167_0003
P e so s
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los resultados para los pesos de los órganos se expresaron como una relación con los pesos corporales y se normalizaron para la relación de control de PBS.
T a b l a 197
Figure imgf000167_0002
continuación
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E j e m p l o 128 : E f i c a c i a d e o l i g o n u c l e ó t i d o s a n t i s e n t i d o c o n t r a A R N m d e C F B e n r a t o n e s t r a n s g é n i c o s h C F B
Se probaron compuestos seleccionados para determinar su eficacia en ratones transgénicos CFB humanos, línea fundadora N° 6. El gen de CFB humano está localizado en el cromosoma 6: posición 31913721 ­ 31919861. Se seleccionó un Fosmid (ABC14-50933200C23) que contenía la secuencia de CFB para hacer ratones transgénicos que expresan el gen CFB humano. Se usaron las enzimas de restricción Cla I (31926612) y Age I (31926815) para generar un fragmento de 22.127 pb que contiene el gen de CFB para inyección pronuclear. El ADN se confirmó mediante análisis de enzimas de restricción usando Pvu I. El fragmento de a Dn de 22.127 pb se inyectó en embriones C57BL/6NTac. Se criaron 6 fundadores positivos. El fundador N° 6 expresó el ARNm de CFB humano del hígado y se cruzó con la 3a generación. Se usó la progenie de los ratones de 3a generación para evaluar ASO de CFB humanos para la reducción de ARNm de CFB humano.
Tratamiento
Se inyectaron a grupos de 3 ratones cada uno por vía subcutánea dos veces a la semana durante la primera semana 50 mg/kg de oligonucleótidos ISIS, seguido de una dosificación semanal de 50 mg/kg de oligonucleótidos ISIS durante tres sem anas adicionales. Un grupo de control de 4 ratones se inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 2 sem anas durante la primera semana con PBS durante la primera semana durante tres semanas adicionales. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, los ratones se sacrificaron y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Análisis de A R N
Al final del período de dosificación, el ARN se extrajo del hígado y el riñón para el análisis de PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de CFB. Los niveles de ARNm de CFB humano se midieron usando el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459. Los niveles de ARNm de CFB se normalizaron a RIBOGREEN®, y también al gen de mantenimiento, Ciclofilina. Los resultados se calcularon como porcentaje de inhibición de la expresión del ARNm de CFB en comparación con el control. Todos los oligonucleótidos antisentido efectuaron la inhibición de los niveles de ARNm de CFB humano en el hígado.
T a b l a 198
Figure imgf000168_0002
E j e m p l o 1 2 9 I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o in vivo d e C F B m u r i n o
Se diseñaron varios oligonucleótidos antisentido que se dirigieron al ARNm de CFB murino (N° de Acceso de GENBANK NM_008198.2, incorporado en la presente como SEQ ID NO: 5). Los sitios de inicio objetivo y las secuencias de cada oligonucleótido se describen en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la tabla siguiente se diseñaron como gapmers 5-10-5 MOE. Los gapmers tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central está compuesto por 10 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.
T a b l a 199
Figure imgf000169_0001
Tratamiento
Se inyectaron a grupos de cuatro ratones C57BL/6 50 mg/kg de ISIS 516269, ISIS 516272, ISIS 516323, ISIS 516330 o ISIS 516341 administrados semanalmente durante 3 semanas. A un grupo de ratones de control se le inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 3 semanas.
Análisis del A R N de C F B
Al final del estudio, se extrajo el ARN del tejido hepático para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430 (secuencia directa GGGCAAACAGCAATTTGTGA, designada en la presente como SEQ ID NO: 816; secuencia inversa TGGCTACCCACCTCTCCTTGT, designada en la presente como SEQ ID NO: 817; secuencia de sonda CTGGATACTGTCCCAATCCCGGTATTCCX, designada en la presente como SEQ ID NO: 818). Los niveles de ARNm se normalizaron usando RIBOGREEN®. Como se muestra en la Tabla siguiente, algunos de los oligonucleótidos antisentido lograron la reducción de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
T a b l a 200
Figure imgf000169_0002
Análisis de proteínas
Los niveles de proteína CFB se midieron en el riñón, el hígado, el plasma y en el ojo mediante transferencia Western usando anticuerpo anti-CFB de cabra (Sigma Aldrich). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control de PBS. 'n/a' indica que no se tomaron mediciones para esa muestra. Como se muestra en la Tabla siguiente, la inhibición antisentido de CFB por los oligonucleótidos ISIS dio como resultado una reducción de la proteína de CFB en varios tejidos. Como se muestra en la Tabla siguiente, la administración sistémica de oligonucleótidos ISIS fue efectiva para reducir los niveles de CFB en el ojo.
T a b l a 201
Figure imgf000169_0003
E j e m p l o 130 : I n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e p e n d i e n t e d e l a d o s i s d e C F B m u r i n o
Se inyectaron a grupos de cuatro ratones C57BL/6 cada uno 25 mg/kg, 50 mg/kg o 100 mg/kg de ISIS 516272, e ISIS 516323 administrado semanalmente durante 6 semanas. A otros dos grupos de ratones se les inyectaron 100 mg/kg de ISIS 516330 o ISIS 516341 administrados semanalmente durante 6 semanas. A dos grupos de ratones de control se les inyectó una solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 6 semanas.
Análisis del A R N de C F B
Se extrajo ARN de los tejidos hepáticos y renales para análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Los niveles de ARNm se normalizaron usando RIBOGREEN®. Como se muestra en la Tabla siguiente, los oligonucleótidos antisentido lograron una reducción dependiente de la dosis de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
T a b l a 202
Figure imgf000170_0001
Análisis de proteínas
Se midieron los niveles de proteína de CFB en el plasma mediante transferencia Western usando anticuerpo anti-CFB de cabra (Sigma Aldrich). Como se muestra en la tabla siguiente, la inhibición antisentido de CFB por los oligonucleótidos ISIS dio como resultado una reducción de la proteína CFB. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control de PBS. 'n/a' indica que no se realizaron mediciones para esa muestra.
Los niveles de proteína de CFB también se midieron en el ojo mediante transferencia Western. Todos los grupos de tratamiento demostraron una inhibición de CFB en un 95%, con algunas mediciones de muestras que estaban por debajo de los niveles de detección del ensayo.
T a b l a 203
Figure imgf000170_0002
E j e m p l o 131 : E f e c t o d e l a i n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e C F B e n e l m o d e l o d e r a t ó n N Z B / W F 1
El NZB/W F1 es el modelo clásico más antiguo de lupus, donde los ratones desarrollan fenotipos severos similares a lupus comparables a los de los pacientes con lupus (Theofilopoulos, A.N. y Dixon, F.J. Advances in Immunology, vol. 37, pp. 269-390, 1985 ). Estos fenotipos similares a lupus incluyen linfadenopatía, esplenomegalia, autoanticuerpos antinucleares séricos elevados (ANA) que incluyen IgG anti-ADNbc, la mayoría de los cuales son IgG2a e IgG3, y glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios (GN) que se manifiesta a los 5-6 m eses de edad, lo que lleva a insuficiencia renal y muerte a los 10 -12 m eses de edad.
Estudio 1
Se realizó un estudio para demostrar que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB mejoraría la patología renal en el modelo de ratón. Se adquirieron ratones hembra NZB/W F1 de 17 semanas de edad de Jackson Laboratories. Grupos de 16 ratones recibieron cada uno dosis de 100 pg/kg/semana de ISIS 516272 o ISIS 516323 durante 20 semanas. Otro grupo de 16 ratones recibió dosis de 100 pg/kg/semana de oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 20 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de PBS durante 20 sem anas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de la última dosis inyectada.
Análisis del A R N de C F B
Se extrajo ARN del tejido hepático y renal para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Los niveles de ARNm se normalizaron usando RIBOGREEN®. Como se muestra en la Tabla siguiente, algunos de los oligonucleótidos antisentido lograron la reducción de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
T a b l a 204
Figure imgf000171_0003
Proteinuria
Se espera una proteinuria en el 60% de los animales en este modelo de ratón. La incidencia acumulada de proteinuria grave se midió calculando la proporción de proteína total a creatinina usando un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB logró una reducción de la proteinuria en los ratones en comparación con los ratones tratados con control de PBS y con oligonucleótidos de control.
T a b l a 205
Figure imgf000171_0002
Supervivencia
La supervivencia de los ratones se controló llevando la cuenta de los ratones al comienzo del tratamiento y luego nuevamente en la semana 20. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB aumentó la supervivencia en los ratones en comparación con los ratones tratados con PBS de control y con oligonucleótidos de control.
Figure imgf000171_0001
Deposición glomerular
La cantidad de deposición de C3, así como la deposición de IgG, en los glomérulos de los riñones se midió mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-C3. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB logró una reducción de las deposiciones de C3 e IgG en los glomérulos renales en comparación con los ratones tratados con control de PBS y con oligonucleótidos de control.
Figure imgf000172_0001
Estudio 2
Se adquirieron ratones NZB/W F1 hembra de 16 semanas de edad de Jackson Laboratories. Un grupo de 10 ratones recibió dosis de 100 pg/kg/semana de ISIS 516323 durante 12 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de 100 pg/kg/semana del oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 12 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de PBS durante 12 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de que se inyectase la última dosis.
Análisis del A R N de C F B
Se extrajo ARN del tejido hepático y renal para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con ISIS 516323 logró una reducción del CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
T a b l a 208
Figure imgf000172_0004
Proteinuria
Se evaluó la incidencia acumulada de proteinuria grave midiendo la proporción de proteína a creatinina total en orina, así como midiendo los niveles totales de microalbúmina. Los resultados se presentan en las tablas siguientes y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB redujo la proteinuria en los ratones en comparación con los ratones tratados con control de PBS y con oligonucleótidos de control.
T a b l a 209
Figure imgf000172_0002
T a b l a 210
Figure imgf000172_0003
Supervivencia
Se controló la supervivencia de los ratones llevando la cuenta de los ratones al inicio del tratamiento y luego nuevamente en la semana 12. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB aumentó la supervivencia en los ratones en comparación con los ratones tratados con control de PBS y con oligonucleótidos de control.
Figure imgf000173_0001
E j e m p l o 132 : E f e c t o d e l a i n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e C F B e n e l m o d e l o d e r a t ó n M R L
El modelo de ratón de nefritis lúpica MRL/lpr desarrolla un fenotipo tipo LES caracterizado por linfadenopatía debido a una acumulación de células T doble negativas (CD4- CD8- ) y B220+. Estos ratones muestran una tasa de mortalidad acelerada. Además, los ratones tienen altas concentraciones de inmunoglobulinas circulantes, que incluyen niveles elevados de autoanticuerpos como ANA, anti-ADNmc, anti-ADNbc, anti-Sm y factores reumatoides, lo que resulta en grandes cantidades de complejos inmunes (Andrews, B. et al., J. Exp. Med.
148: 1198 - 1215 , 1978).
Tratamiento
Se realizó un estudio para investigar si el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB revertiría la patología renal en el modelo de ratón. Se adquirieron ratones MRL/lpr hembra de 14 semanas de edad de Jackson Laboratories. Un grupo de 10 ratones recibió dosis de 50 pg/kg/semana de ISIS 516323 durante 7 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de 50 pg/kg/semana de oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 7 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de PBS durante 7 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de la última dosis de inyección.
Análisis del A R N de C F B
Se extrajo ARN de tejido hepático para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Como se muestra en la Tabla siguiente, ISIS 516323 redujo el CFB sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
T a b l a 212
Figure imgf000173_0003
Patología renal
La patología renal se evaluó por dos métodos. Se tiñeron secciones histológicas del riñón con hematoxilina y eosina. El control de PBS demostró la presencia de precipitados tubulares crecientes multiglomerulares, que es un síntoma de glomeruloesclerosis. Por el contrario, las secciones de ratones tratados con ISIS 516323 mostraron la ausencia de precipitados tubulares crecientes con cambios fibróticos en la cápsula de bowman mínimos, expansión de células mesangiales segmentarias de moderada a grave y engrosamiento de la membrana basal glomerular.
También se evaluó la acumulación de C3 en el riñón mediante inmunohistoquímica con anticuerpos anti-C3. La puntuación de la intensidad de la inmunohistoquímica de C3 del riñón completa se calculó mediante el sistema de puntuación de la intensidad, que se calculó capturando 10 glomérulos por riñón y calculando la intensidad de la tinción de C3 positiva. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con ISIS 516323 redujo la acumulación de C3 renal en comparación con los grupos de control.
T a b l a 213
Figure imgf000173_0002
Niveles de C 3 en plasm a
La reducción de CFB inhibe la activación de la vía alternativa del complemento, evitando el consumo de C3 y llevando a una elevación aparente de los niveles de C3 en plasma. Los niveles de C3 en plasma de la hemorragia terminal se midieron mediante un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con ISIS 516323 aumentó los niveles de C3 (p <0,001) en el plasma en comparación con los grupos de control.
T a b l a 214
Figure imgf000174_0003
Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB revierte la patología renal en el modelo de ratón de lupus.
E j e m p l o 133 : E f e c t o d e l a i n h i b i c i ó n a n t i s e n t i d o d e C F B e n e l m o d e l o d e r a t ó n C F H H e t
El modelo de ratón heterocigótico de CFH (CFH Het, CFH+/-) expresa una proteína del Factor H mutante en combinación con la proteína de ratón de longitud completa (Pickering, M.C. et al., J. Exp. Med. 2007. 204: 1249-56). La histología renal permanece normal en estos ratones hasta los seis m eses de edad.
Estudio 1
Grupos de 8 ratones CFH+/- de 6 semanas de edad recibieron cada uno dosis de 75 mg/kg/semana de ISIS 516323 o ISIS 516341 durante 6 semanas. Otro grupo de 8 ratones recibió dosis de 75 mg/kg/semana de oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 6 semanas. Otro grupo de 8 ratones recibió dosis de PBS durante 6 sem anas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de la última dosis de inyección.
Análisis del A R N de C F B
Se extrajo ARN del tejido hepático y renal para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Como se muestra en la Tabla siguiente, los oligonucleótidos antisentido redujeron el CFB sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
T a b l a 215
Figure imgf000174_0002
Niveles de C 3 en plasm a
La reducción de CFB inhibe la activación de la vía alternativa del complemento, evitando el consumo de C3 y llevando a una elevación aparente de los niveles de C3 en plasma. Los niveles de C3 en plasma de la colección de plasma terminal se midieron mediante un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con ISIS 516323 aumentó el C3 a niveles normales en el plasma.
Figure imgf000174_0001
Estudio 2
Grupos de 5 ratones CFH+/- cada uno recibieron dosis de 12 ,5 mg/kg/semana, 25 mg/kg/semana, 50 mg/kg/semana, 75 mg/kg/semana o 100 mg/kg/semana de ISIS 516323 o ISIS 516341 durante 6 semanas. Otro grupo de 5 ratones recibió dosis de 75 pg/kg/semana de oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 6 semanas. Otro grupo de 5 ratones recibió dosis de PBS durante 6 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de la última dosis de inyección.
Análisis del A R N de C F B
Se extrajo ARN del tejido hepático y renal para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Como se muestra en la Tabla siguiente, los oligonucleótidos antisentido redujeron el CFB sobre el control de PBS de una manera dependiente de la dosis. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
T a b l a 217
Figure imgf000175_0001
Niveles de C 3 en plasm a
La reducción de CFB inhibe la activación de la vía alternativa del complemento, evitando el consumo de C3 y llevando a una elevación aparente de los niveles de C3 en plasma. Los niveles de C3 en plasma de la colección de plasma terminal se midieron mediante un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dirigidos a CFB aumentó los niveles de C3 en el plasma.
T a b l a 218
Figure imgf000175_0002
E j e m p l o 134 : E f e c t o d e l o s o l i g o n u c l e ó t i d o s a n t i s e n t i d o I S I S d i r i g i d o s a C F B h u m a n o e n m o n o s c y n o m o l g u s Se trataron monos Cynomolgus con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos en los Ejemplos anteriores. Se evaluaron la eficacia y tolerabilidad del oligonucleótido antisentido, así como su perfil farmacocinético en el hígado y el riñón.
En el momento en que se realizó este estudio, la secuencia genómica del mono cynomolgus no estaba disponible en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI); por lo tanto, la reactividad cruzada con la secuencia del gen del mono cynomolgus no pudo ser confirmada. En su lugar, se usaron las secuencias de los oligonucleótidos antisentido ISIS usados en los monos cynomolgus con una secuencia de monos rhesus para homología. Los oligonucleótidos antisentido humanos analizados a continuación tienen reactividad cruzada (con 0 o 1 malapareamientos) con la secuencia genómica derhesus (N° de Acceso de GENBANK NW _ 001116486.1 truncado a partir de los nucleótidos 536000 a 545000, designada en la presente como SEQ ID NO: 3). Los sitios de inicio y parada de cada oligonucleótido dirigidos a la SEQ ID NO: 3 se presentan en la Tabla siguiente. "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia de genes del mono rhesus. Los "malapareamientos" indican el número de nucleobases en el oligonucleótido humano que no coinciden con la secuencia genómica de rhesus.
T a b l a 219
Figure imgf000176_0001
Tratamiento
Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante por lo menos un período de 30 días, durante los cuales los animales se observaron diariamente para su salud general. Los monos tenían 2-4 años y pesaban entre 2 y 4 kg. Once grupos de 4-6 monos cynomolgus macho asignados al azar fueron inyectados cada uno por vía subcutánea con oligonucleótido ISIS o PBS en cuatro sitios en la espalda en una rotación en sentido de las agujas del reloj (es decir, izquierda, superior, derecha e inferior), un sitio por dosis. Los monos recibieron cuatro dosis de carga de PBS o 40 mg/kg de ISIS 532800, ISIS 532809, ISIS 588540, ISIS 588544, ISIS 588548, ISIS 588550, ISIS 588553, ISIS 588555, ISIS 588848, o ISIS 594430 durante la primera semana (días 1, 3, 5 y 7), y posteriormente se administró una dosis por semana durante 12 sem anas (días 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 y 84) con PBS o 40 mg/kg de oligonucleótido ISIS.
Reducción del objetivo hepático
Análisis del A R N
En el día 86, se recogieron muestras de hígado y riñón por duplicado (aproximadamente 250 mg cada una) para el análisis de ARNm de CFB. Las muestras se congelaron al instante en nitrógeno líquido en necropsia en el plazo de aproximadamente 10 minutos después del sacrificio.
Se extrajo ARN del hígado y el riñón para el análisis de PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de CFB. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, con respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Los niveles de ARN también se normalizaron con el gen doméstico, Ciclofilina A. Los niveles de ARN se midieron con los conjuntos de sondas de cebador RTS3459, descritos anteriormente, o RTS4445_MGB (secuencia directa CGAAGAAGCTCAGTGAAATCAA, designada en la presente como SEQ ID NO: 819; secuencia inversa TGCCTGGAGGGCCTCTT, designada en la presente como SEQ ID NO: 820; secuencia de sonda AGACCACAAGTTGAAGTC, designada en la presente como SEQ ID NO: 815).
Como se muestra en las Tablas siguientes, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción del ARNm de CFB en comparación con el control de PBS. El análisis de los niveles de ARNm de CFB reveló que varios de los oligonucleótidos ISIS redujeron los niveles de CFB en el hígado y/o riñón. Aquí '0' indica que los niveles de expresión no se inhibieron. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares.
T a b l a 220
Figure imgf000177_0001
T a b l a 221
Figure imgf000177_0002
Análisis de proteínas
Se recogió aproximadamente 1 ml de sangre de todos los animales disponibles en el día 85 y se colocó en tubos que contenían la sal de potasio de EDTA. Las muestras de sangre se colocaron en hielo húmedo o Kryorack inmediatamente, y se centrifugaron (3000 rpm durante 10 minutos a 4° C) para obtener plasma (aproximadamente 0,4 ml) en el plazo de 60 minutos desde la recogida. Los niveles en plasma de CFB se midieron en el plasma mediante inmunodifusión radial (RID), usando un anticuerpo policlonal anti-Factor B. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. El ISIS 532770 se probó en un estudio separado y los niveles de proteína plasmática se midieron el día 91 o 92 en ese grupo.
El análisis de CFB en plasma reveló que varios oligonucleótidos ISIS redujeron los niveles de proteína de manera sostenida. El ISIS 532770, que se probó en un estudio separado, redujo los niveles de proteína de CFB en el día 91/92 en un 50% en comparación con los valores de referencia. La reducción en los niveles de proteína de CFB en plasma se correlaciona bien con la reducción del nivel de ARNm de CFB hepático en los grupos correspondientes de animales.
T a b l a 222
Figure imgf000177_0003
Estudios de tolerabilidad
M ediciones de peso corporal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales y de órganos y se presentan en la Tabla siguiente. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares y es la media de las mediciones de monos macho y hembra. Los resultados indican que el efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre el peso corporal y de los órganos estuvo dentro del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido.
T a b l a 223
Figure imgf000178_0001
T a b l a 224
Figure imgf000178_0002
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se tomaron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. Se recogió sangre (1,5 ml) en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron (aproximadamente 3.000 rpm durante 10 minutos) para obtener suero. Los niveles de varios marcadores de la función hepática se midieron usando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón).
Se midieron los niveles en plasma de ALT y AST y los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en IU/l. La bilirrubina, un marcador de la función hepática, se midió de manera similar y se presenta en la tabla siguiente expresada en mg/dl. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares y es la media de las mediciones de monos macho y hembra. Los resultados indican que la mayoría de los oligonucleótidos antisentido no tuvieron efecto sobre la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
T a b l a 225
Figure imgf000179_0002
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se tomaron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron (aproximadamente 3.000 rpm durante 10 minutos) para obtener suero. Los niveles de BUN y creatinina se midieron usando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares y es la media de las mediciones de monos macho y hembra.
Para el análisis de orina, se recogió orina fresca de todos los animales por la mañana usando una bandeja de jaula limpia en hielo húmedo. La comida se retiró durante la noche el día anterior a la recogida de la orina, pero se suministró agua. Se analizaron las muestras de orina (aproximadamente 1 ml) para determinar la relación de proteína a creatinina (P/C) usando un analizador de química automatizado Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). 'n.d.' indica que el nivel de proteína en la orina estaba por debajo del límite de detección del analizador.
Los datos químicos del plasma y la orina indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tuvieron ningún efecto sobre la función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido.
T a b l a 226
Figure imgf000179_0001
T l 22
Figure imgf000179_0003
continuación
Figure imgf000180_0002
Hematología
Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus sobre los parámetros hematológicos, se recogieron muestras de sangre de aproximadamente 0,5 ml de sangre de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contenían K2 -EDTA. Las muestras se analizaron para el recuento de glóbulos rojos (RBC), el recuento de glóbulos blancos (WBC), los recuentos de glóbulos blancos individuales, como el onocitos, neutrófilos, linfocitos, así como el recuento de plaquetas, el contenido de hemoglobina y hematocrito, usando un analizador de hematología ADVIA120 (Bayer, USA). Los datos se presentan en las tablas siguientes. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares y es la media de las mediciones de monos macho y hembra.
Los datos indican que los oligonucleótidos no provocaron cambios en los parámetros hematológicos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido a esta dosis.
T a b l a 228
Figure imgf000180_0001
T a b l a 229
Figure imgf000181_0002
Medición de la concentración de oligonucleótidos.
Se midió la concentración del oligonucleótido de longitud completa en los tejidos del riñón y el hígado. El método usado es una modificación de los métodos publicados anteriormente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consisten en una extracción con fenol-cloroformo (líquido-líquido) seguida de una extracción en fase sólida. Las concentraciones de la muestra de tejido se calcularon usando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1, 14 pg/g. Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada como pg/g de tejido hepático o renal.
Figure imgf000181_0001
Se probaron dos oligonucleótidos antisentido que tienen la misma secuencia de nucleobases: oligonucleótido antisentido no conjugado ISIS 588540 y oligonucleótido antisentido conjugado 5'-THA-GalNAc3 ISIS 696844 en ratones transgénicos con CFB humano (ratones hCFB-Tg).
Se administró por vía subcutánea a los ratones ISIS 696844 a dosis de 0,1, 1,25, 0,5, 2,0, 6,0 o 12,0 mg/kg/semana o ISIS 588540 a dosis de 2, 6, 12 , 25 o 50 mg/kg/semana durante 6 semanas. A un grupo control de ratones se administró por vía subcutánea PBS durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis. Los niveles de ARNm hepático se analizaron por qRT-PCR.
Estudio 1
Los resultados se presentan en la Tabla siguiente y demuestran que el oligonucleótido antisentido conjugado 5'-THA-GalNAc3 dirigido a CFB es más potente que el oligonucleótido antisentido no conjugado con la misma secuencia.

Claims (9)

  1. R E I V I N D I C A C I O N E S
    1 . Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 440, en donde el oligonucleótido es por lo menos un 80% complementario a la SEQ ID NO: 1 o 2 y en donde el grupo conjugado comprende:
    Figure imgf000337_0001
  2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, por lo menos un azúcar modificado, o por lo menos una nucleobase modificada, opcionalmente en el que el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
  3. 3. El compuesto de la reivindicación 2, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
    a) por lo menos 1 enlace internucleosídico de fosfodiéster;
    b) por lo menos 2 enlaces internucleosídicos de fosfodiéster;
    c) por lo menos 3 enlaces internucleosídicos de fosfodiéster;
    d) por lo menos 4 enlaces internucleosídicos de fosfodiéster;
    e) por lo menos 5 enlaces internucleosídicos de fosfodiéster;
    f) por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosfodiéster;
    g) por lo menos 7 enlaces internucleosídicos de fosfodiéster;
    opcionalmente en donde:
    i) cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado se selecciona de un enlace internucleosídico de fosfodiéster y un enlace internucleosídico de fosforotioato; o
    ii) cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado comprende un enlace internucleosídico de fosforotioato.
  4. 4. El compuesto de la reivindicación 2 o 4, en el que:
    a) el azúcar modificado es un azúcar bicíclico, opcionalmente en el que el azúcar bicíclico se selecciona del grupo que consiste de: 4 '-(CH2 )-O-2 ' (LNA); 4 '-(CH2 )2-O-2 ' (ENA); y 4'-CH(CHa)-O-2' (cEt); o
    b) el azúcar modificado es 2'-O-metoxietilo; y/o
    c) la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
  5. 5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
    (a) un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos enlazados;
    (b) un segmento del ala 5' que consiste de nucleósidos enlazados; y
    (c) un segmento del ala 3' que consiste de nucleósidos enlazados;
    en donde el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
  6. 6 . El compuesto de la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados teniendo una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO:440, en donde el oligonucleótido modificado comprende un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento del ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
    un segmento del ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
    en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar 2 '-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
  7. 7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el oligonucleótido es por lo menos un 85%, 90%, 95% o 100% complementario a la SEQ ID NO: 1 o 2.
  8. 8 . El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que:
    a) el compuesto es de cadena sencilla; o
    b) el compuesto es de cadena doble; y/o
    c) el compuesto comprende:
    i) ribonucleótidos; o
    ii) desoxirribonucleótidos.
  9. 9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el grupo conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado:
    i) en el extremo 5' del oligonucleótido modificado; o
    ii) en el extremo 3' del oligonucleótido modificado; o
    1 0 . Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la fórmula:
    a)
    Figure imgf000339_0001
    en donde cualquier R1 es -OCH2 CH2 OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente en donde R1 es -O- y R2 es -CH2 -, -CH(CH3 )-, o -CH2 CH2 -, y R1 y R2 están directamente conectados de tal manera que el puente resultante se selecciona de: -O-CH2 -, -O-CH(CH3 ) - y -O-CH2 CH2 -;
    y para cada par de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada anillo: cualquier R3 se selecciona de H y -OCH2 CH2 OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es -CH2 -, -CH(CH3 )-, o -CH2 CH2 - y R3 y R4 están directamente conectados de tal manera que el puente resultante se selecciona de: - O-CH2-, -O-CH(CH3 )- y -O-CH2 CH2 -;
    Y R5 se selecciona de H y -CH3 ;
    Y Z se selecciona de S ' y O.
    b)
    Figure imgf000340_0001
    c)
    Figure imgf000341_0001
    o
    d)
    Figure imgf000342_0001
    1 . Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la formula:
    Figure imgf000343_0001
    1 2 . Una composición que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11 o una sal del mismo y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
    1 3 . Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11 o una composición de acuerdo con la reivindicación 1 2 para su uso en el tratamiento, prevención, o mejora de una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto.
    1 4 . El compuesto o composición para el uso de la reivindicación 13 , en el que la enfermedad es:
    a) degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), DMAE húmeda, DMAE seca o Atrofia Geográfica;
    b) una enfermedad renal, opcionalmente en donde la enfermedad renal es nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS).
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