ES2738101T3 - Mouse model of steatohepatitis-liver cancer - Google Patents
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Abstract
Un método para producir un modelo de ratón, que comprende las etapas de: (a) administrar a un ratón un inhibidor de la N-acetil-ß-D-glucosaminidasa para inducir resistencia a la insulina; y (b) criar el ratón con una dieta alta en grasas para inducir posteriormente hígado graso, esteatohepatitis, esteatohepatitis, fibrosis hepática y cirrosis hepática.A method of producing a mouse model, comprising the steps of: (a) administering to a mouse an N-acetyl-β-D-glucosaminidase inhibitor to induce insulin resistance; and (b) breed the mouse on a high-fat diet to subsequently induce fatty liver, steatohepatitis, steatohepatitis, liver fibrosis and liver cirrhosis.
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Ratón modelo de esteatohepatitis-cáncer de hígadoMouse model of steatohepatitis-liver cancer
Campo técnicoTechnical field
La presente invención se refiere a un ratón modelo de esteatohepatitis/cáncer de hígado, y a usos del mismo.The present invention relates to a mouse model of steatohepatitis / liver cancer, and uses thereof.
Técnica antecedenteBackground Technique
Anteriormente, se creía que la estatosis hepática (enfermedad de hígado graso) no alcohólica, era una enfermedad benigna que no progresaba. Sin embargo, se reveló que, incluso los no bebedores, desarrollaban una inflamación similar a la de la hepatitis alcohólica y que mostraban una histología de tipo fibrosis hepática, y actualmente la esteatosis hepática no alcohólica se conoce como una enfermedad con mal pronóstico. En particular, los síndromes metabólicos debidos a obesidad, diabetes, o similar, han sido foco de atención en los últimos años. El hecho de que la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) sea uno de dichos síndromes, se está convirtiendo en una opinión generalizada. Sin embargo, el mecanismo es incierto, y no se han establecido métodos y/o agentes eficaces para tratar la EHNA. Esto se debe, en parte, a que la EHNA se produce por enfermedades relacionadas con el estilo de vida de los seres humanos y, por tanto, no se han establecido animales experimentales apropiados.Previously, it was believed that nonalcoholic liver disease (fatty liver disease) was a benign disease that did not progress. However, it was revealed that, even non-drinkers, developed an inflammation similar to that of alcoholic hepatitis and that showed a liver fibrosis type histology, and currently non-alcoholic liver steatosis is known as a disease with poor prognosis. In particular, metabolic syndromes due to obesity, diabetes, or the like, have been the focus of attention in recent years. The fact that non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is one of these syndromes is becoming a general opinion. However, the mechanism is uncertain, and effective methods and / or agents to treat NASH have not been established. This is due, in part, to the fact that NASH is caused by diseases related to the lifestyle of human beings and, therefore, no appropriate experimental animals have been established.
Para el desarrollo de métodos y agentes eficaces para el tratamiento de la EHNA, es esencial aclarar el estado patológico de la misma, que progresa hacia enfermedades letales, tales como la cirrosis hepática y el cáncer de hígado. Sin embargo, los animales experimentales que se utilizan actualmente en la investigación, tal como el ratón modelo de EHNA, incluyen ratones con un solo gen modificado, tales como los ratones que carecen del receptor de leptina (documento no de patente 1), ratones que carecen de Pten (fosfatidil inositol-3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa) específica de hepatocitos (documento no de patente 2), y ratones transgénicos dominantes-negativos del receptor del ácido retinoico a (documento no de patente 3), y ratones inducidos con una dieta especial, tal como una dieta carente de metionina/colina (documento no de patente 4). Sin embargo, la patogenia humana difiere de la de los ratones modificados genéticamente en los que una mutación de un solo gen es responsable del desarrollo y de la progresión del estado patológico, y es poco probable que se deba únicamente a la ingesta de un nutriente en particular. Asimismo, la resistencia a la insulina y la fibrosis hepática no pueden controlarse simultáneamente en estos ratones. Asimismo, el índice de ALT (alanina transaminasa), un índice de análisis serobioquímico, está solo ligeramente elevado en los ratones que desarrollan fibrosis y, por lo tanto, se requieren varios cortes tisulares de ratón para evaluar su estado patológico. Por el contrario, se supone que el estado patológico es diferente al del ser humano porque la ALT se eleva a un nivel notablemente alto. Asimismo, el estado patológico se recupera espontáneamente después del tratamiento. Esto hace que sea difícil someter a ensayo los fármacos y evaluar su eficacia. Por tanto, para el desarrollo de métodos y agentes para el tratamiento de la EHNA, es deseable establecer un modelo animal experimental que sea compatible con la afección clínica humana.For the development of effective methods and agents for the treatment of NASH, it is essential to clarify its pathological status, which progresses to lethal diseases, such as liver cirrhosis and liver cancer. However, experimental animals that are currently used in research, such as the EHNA model mouse, include mice with a single modified gene, such as mice lacking the leptin receptor (non-patent document 1), mice that they lack hepatocyte-specific Pten (phosphatidyl inositol-3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase) (non-patent document 2), and dominant-negative transgenic mice of the retinoic acid receptor a (non-patent document 3), and Mice induced with a special diet, such as a methionine / choline-free diet (non-patent document 4). However, human pathogenesis differs from that of genetically modified mice in that a single gene mutation is responsible for the development and progression of the pathological state, and is unlikely to be due solely to the intake of a nutrient in particular. Likewise, insulin resistance and liver fibrosis cannot be controlled simultaneously in these mice. Likewise, the ALT index (alanine transaminase), an index of serobiochemical analysis, is only slightly elevated in mice that develop fibrosis and, therefore, several mouse tissue sections are required to assess their pathological status. On the contrary, the pathological state is assumed to be different from that of the human being because ALT rises to a remarkably high level. Likewise, the pathological state recovers spontaneously after treatment. This makes it difficult to test the drugs and evaluate their effectiveness. Therefore, for the development of methods and agents for the treatment of NASH, it is desirable to establish an experimental animal model that is compatible with the human clinical condition.
Aunque se han realizado diversos estudios, no hay animales experimentales que muestren estados patológicos similares a los de los seres humanos. Por tanto, en las circunstancias actuales, es difícil realizar una exploración con detalle para aclarar la patogenia o establecer métodos terapéuticos.Although several studies have been carried out, there are no experimental animals that show pathological conditions similar to those of humans. Therefore, in the current circumstances, it is difficult to perform a detailed examination to clarify the pathogenesis or establish therapeutic methods.
[Documentos de la técnica anterior][Documents of the prior art]
[Documento no de patente 1] Sahai A et al, Am J Physiol Gastroentest Liver Physiol 287: G1035, 2004 [Documento no de patente 2] Horie Y et al., J Clin Invest 113: 1774, 2004[Non-patent document 1] Sahai A et al, Am J Physiol Gastroentest Liver Physiol 287: G1035, 2004 [Non-patent document 2] Horie Y et al., J Clin Invest 113: 1774, 2004
[Documento no de patente 3] Yanagitani A et al., Hepatology 40, 366, 2004[Non-patent document 3] Yanagitani A et al., Hepatology 40, 366, 2004
[Documento no de patente 4] Rinella M et al., Journal of Hepatology 40: 47, 2004[Non-patent document 4] Rinella M et al., Journal of Hepatology 40: 47, 2004
Sumario de la invenciónSummary of the invention
[Problemas a resolver por la invención][Problems to be solved by the invention]
Un objetivo de la presente invención es proporcionar ratones modelo de esteatohepatitis y ratones modelo de cáncer de hígado que muestren hallazgos patológicos similares a los de los seres humanos, y usos de los mismos. Más específicamente, un objetivo de la presente invención es proporcionar técnicas para producir ratones modelo que desarrollen hígado graso, esteatohepatitis, fibrosis hepática, cirrosis hepática y cáncer de hígado por resistencia a la insulina.An objective of the present invention is to provide steatohepatitis model mice and liver cancer model mice that show pathological findings similar to those of humans, and uses thereof. More specifically, an objective of the present invention is to provide techniques for producing model mice that develop fatty liver, steatohepatitis, liver fibrosis, liver cirrhosis and liver cancer due to insulin resistance.
[Medios para resolver los problemas][Means to solve the problems]
Los presentes inventores realizaron estudios específicos para lograr los objetivos descritos anteriormente. Los presentes inventores indujeron la resistencia a la insulina administrando un agente para inducir la inflamación de los órganos, e indujeron el hígado graso en los ratones alimentándolos con una dieta alta en grasas. Como resultado, los presentes inventores desarrollaron satisfactoriamente la esteatohepatitis en ratones. Una observación detallada de los ratones reveló los siguientes hallazgos patológicos:The present inventors conducted specific studies to achieve the objectives described above. The The present inventors induced insulin resistance by administering an agent to induce inflammation of the organs, and induced fatty liver in mice by feeding them on a high-fat diet. As a result, the present inventors successfully developed steatohepatitis in mice. A detailed observation of the mice revealed the following pathological findings:
(1) deposición de grasa macrovesicular en células hepáticas y balonización de células hepáticas;(1) deposition of macrovesicular fat in liver cells and balonization of liver cells;
(2) infiltración de células inflamatorias; y(2) infiltration of inflammatory cells; Y
(3) fibrosis, principalmente alrededor de la vena central.(3) fibrosis, mainly around the central vein.
Los hallazgos patológicos descritos anteriormente son característicos de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) humana. Específicamente, utilizando el método descrito anteriormente, los presentes inventores produjeron, por primera vez y con éxito, ratones que mostraban hallazgos patológicos similares a los de la EHNA humana.The pathological findings described above are characteristic of human non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Specifically, using the method described above, the present inventors produced, for the first time and successfully, mice showing pathological findings similar to those of human NASH.
El modelo de ratón de EHNA producido por los presentes inventores, es diferente al de los modelos animales convencionales en los siguientes puntos:The mouse model of EHNA produced by the present inventors is different from that of conventional animal models in the following points:
(1) de manera similar a lo observado en los hallazgos histopatológicos de seres humanos, la degeneración de grasa y la fibrosis de las células hepáticas progresan principalmente alrededor de la vena central en lugar de la vena porta; y(1) similar to what was observed in the histopathological findings of humans, fat degeneration and fibrosis of liver cells progress mainly around the central vein instead of the portal vein; Y
(2) las imágenes histopatológicas de EHNA humana, se observan con un aspecto "quemado", en las que solo se observa fibrosis hepática, aunque a medida que progresa el estado patológico, se observa deposición de grasa y pérdida de células inflamatorias.(2) Histopathological images of human NASH are observed with a "burned" aspect, in which only hepatic fibrosis is observed, although as the pathological state progresses, fat deposition and loss of inflammatory cells are observed.
El modelo de ratón de la presente invención es característico ya que se produce sin modificación genética. Asimismo, los ratones modelo de la presente invención, desarrollan infaliblemente (100%) un estado patológico similar al de la progresión y pronóstico de la EHNA humana a un curso constante, y son los primeros ratones modelo que muestran el mismo curso de progresión de estado patológico en seres humanos. Además, los ratones modelo de la presente invención tienen un efecto notablemente beneficioso ya que la resistencia a la insulina, la esteatosis hepática, la esteatohepatitis, la fibrosis hepática y la cirrosis hepática, pueden observarse, todas ellas, al mismo tiempo.The mouse model of the present invention is characteristic as it is produced without genetic modification. Likewise, the model mice of the present invention, infallibly develop (100%) a pathological state similar to that of the progression and prognosis of human NASH to a constant course, and are the first model mice that show the same state progression course pathological in humans. In addition, the model mice of the present invention have a remarkably beneficial effect since insulin resistance, liver steatosis, steatohepatitis, liver fibrosis and liver cirrhosis can all be observed at the same time.
Por otra parte, los presentes inventores descubrieron recientemente que los ratones modelo de EHNA descritos anteriormente, desarrollaban cáncer de hígado después de cirrosis hepática mientras continuaban criando. Este es el mismo cambio de estado patológico que el observado en seres humanos. Por tanto, los animales preparados por los métodos de la presente invención son muy útiles como ratones modelo de cáncer de hígado humano.On the other hand, the present inventors recently discovered that the EHNA model mice described above developed liver cancer after liver cirrhosis while continuing to breed. This is the same change in pathological state as that observed in humans. Therefore, animals prepared by the methods of the present invention are very useful as model mice of human liver cancer.
El cáncer de hígado humano produce abultamiento de la superficie del hígado. Sin embargo, animales modelo convencionales para el cáncer de hígado, que se preparan mediante la administración de una sustancia química, desarrollan cáncer de hígado que no produce abultamiento de la superficie del hígado. Por ahora, los ratones modelo de la presente invención, que se preparan sin modificación genética ni administración de fármacos, muestran abultamiento de la superficie del hígado de una manera similar al caso del cáncer de hígado humano. Por tanto, el modelo de la presente invención es un modelo mucho más cercano al cáncer de hígado humano. Asimismo, la cirrosis hepática no se desarrolla mediante la administración de sustancias químicas, mientras que los ratones modelo de la presente invención desarrollan carcinoma de células hepáticas de aspecto acordonado de tipo masivo. Asimismo, en los ratones modelo de la presente invención, se observa que la infiltración de células inflamatorias y el desarrollo de cáncer de hígado causado por cirrosis, desplaza a las células hepáticas normales. En el modelo, el origen del cáncer de hígado es la esteatosis hepática macrovesicular que muestra un estado patológico muy similar al de la EHNA humana. El cáncer de hígado se desarrolla por fibrosis hepática y cirrosis hepática. Por tanto, el modelo de ratón de la presente invención es muy útil, ya anteriormente no había informes del mismo.Human liver cancer causes bulging of the liver surface. However, conventional model animals for liver cancer, which are prepared by administering a chemical, develop liver cancer that does not cause liver surface bulge. For now, the model mice of the present invention, which are prepared without genetic modification or drug administration, show liver surface bulging in a manner similar to the case of human liver cancer. Therefore, the model of the present invention is a much closer model to human liver cancer. Likewise, liver cirrhosis does not develop through the administration of chemical substances, while the model mice of the present invention develop hepatic cell carcinoma of massive cord-like appearance. Likewise, in the model mice of the present invention, it is observed that infiltration of inflammatory cells and the development of liver cancer caused by cirrhosis displaces normal liver cells. In the model, the origin of liver cancer is macrovesicular liver steatosis that shows a pathological state very similar to that of human NASH. Liver cancer develops by liver fibrosis and liver cirrhosis. Therefore, the mouse model of the present invention is very useful, there were no reports of it before.
Como se describe anteriormente, los presentes inventores produjeron satisfactoriamente ratones modelo de esteatohepatitis y cáncer de hígado que mostraban hallazgos patológicos similares a los de los seres humanos, y así completaron la presente invención. Utilizando estos ratones modelo, es posible explorar, de manera eficaz, sustancias para tratar o prevenir enfermedades y evaluar, de manera eficaz, la eficacia de sustancias medicinales. La presente invención se refiere a ratones modelo que se desarrollan esteatosis hepática, esteatohepatitis, fibrosis hepática, cirrosis y cáncer de hígado por resistencia a la insulina, y más específicamente, la presente invención proporciona:As described above, the present inventors successfully produced steatohepatitis and liver cancer model mice that showed pathological findings similar to those of humans, and thus completed the present invention. Using these model mice, it is possible to effectively explore substances to treat or prevent diseases and to effectively evaluate the efficacy of medicinal substances. The present invention relates to model mice that develop liver steatosis, steatohepatitis, liver fibrosis, cirrhosis and liver cancer due to insulin resistance, and more specifically, the present invention provides:
1. Un método para producir un modelo de ratón, que comprende las etapas de:1. A method of producing a mouse model, comprising the steps of:
(a) administrar a un ratón un inhibidor de la N-acetil-p-D-glucosaminidasa para inducir resistencia a la insulina: y (b) criar el ratón con una dieta alta en grasas para inducir posteriormente esteatosis hepática, esteatohepatitis, fibrosis hepática y cirrosis hepática.(a) administer to a mouse an N-acetyl-pD-glucosaminidase inhibitor to induce insulin resistance: and (b) raise the mouse with a high fat diet to subsequently induce hepatic steatosis, steatohepatitis, hepatic fibrosis and cirrhosis hepatic
2. El método del punto 1, que adicionalmente comprende las etapas de: 2. The method of point 1, which additionally comprises the steps of:
(c) criar adicionalmente el ratón con una dieta alta en grasas para inducir cáncer de hígado.(c) further breed the mouse with a high fat diet to induce liver cancer.
3. Un modelo de ratón, que se produce mediante el método del punto 1 o 2.3. A mouse model, which is produced by the method of point 1 or 2.
4. El modelo de ratón del punto 3, que se caracteriza estructuralmente por la siguiente morfología patológica: (a) carcinoma de células hepáticas de aspecto acordonado de tipo masivo;4. The mouse model of point 3, which is structurally characterized by the following pathological morphology: (a) hepatic cell carcinoma of massive-type cordon-like appearance;
(b) infiltración de células inflamatorias; o(b) infiltration of inflammatory cells; or
(c) cáncer de hígado producido por cirrosis, desarrollado de tal manera que desplaza a las células hepáticas normales.(c) liver cancer caused by cirrhosis, developed in such a way that it displaces normal liver cells.
5. Un método de detección de una sustancia para tratar o prevenir la esteatohepatitis no alcohólica o el cáncer de hígado, que comprende las etapas de:5. A method of detecting a substance to treat or prevent non-alcoholic steatohepatitis or liver cancer, which comprises the stages of:
(a) administrar una sustancia de ensayo al modelo de ratón del punto 3 o 4; y(a) administer a test substance to the mouse model of item 3 or 4; Y
(b) evaluar un efecto terapéutico sobre la esteatohepatitis no alcohólica o el cáncer de hígado.(b) evaluate a therapeutic effect on non-alcoholic steatohepatitis or liver cancer.
6. Un método para evaluar la eficacia de una sustancia medicinal frente al tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica o del cáncer de hígado, que comprende las etapas de:6. A method for evaluating the efficacy of a medicinal substance against the treatment of non-alcoholic steatohepatitis or liver cancer, which comprises the stages of:
(a) administrar una sustancia medicinal de ensayo al modelo de ratón del punto 3 o 4; y(a) administer a medicinal test substance to the mouse model of item 3 or 4; Y
(b) evaluar un efecto terapéutico sobre la esteatohepatitis no alcohólica o el cáncer de hígado.(b) evaluate a therapeutic effect on non-alcoholic steatohepatitis or liver cancer.
7. El uso del modelo de ratón del punto 3 o 4 como un modelo de esteatohepatitis no alcohólica o de cáncer de hígado.7. The use of the mouse model of item 3 or 4 as a model of non-alcoholic steatohepatitis or liver cancer.
Además, en el presente documento se desvela:In addition, this document reveals:
[I] Un modelo animal no humano de esteatohepatitis producido mediante la administración de un agente para inducir la inflamación de órganos;[I] A non-human animal model of steatohepatitis produced by the administration of an agent to induce inflammation of organs;
[2] El animal no humano de [1], en el que la esteatohepatitis es una esteatohepatitis no alcohólica;[2] The non-human animal of [1], in which the steatohepatitis is a non-alcoholic steatohepatitis;
[3] un modelo animal no humano de diabetes producido mediante la administración de un agente para inducir la inflamación de órganos;[3] a non-human animal model of diabetes produced by the administration of an agent to induce inflammation of organs;
[4] el animal no humano de uno cualquiera de [1] a [3], en el que el agente para inducir la inflamación de órganos es un inhibidor de la N-acetil-p-D-glucosaminidasa;[4] the non-human animal of any one of [1] to [3], in which the agent for inducing organ inflammation is an inhibitor of N-acetyl-p-D-glucosaminidase;
[5] el animal no humano de uno cualquiera de [1] a [4], que comprende la etapa de inducir esteatosis hepática, mediante la administración de un agente para inducir, en el animal, la inflamación de órganos, y criar el animal con una dieta alta en grasas;[5] the non-human animal of any one of [1] to [4], comprising the stage of inducing hepatic steatosis, by administering an agent to induce, in the animal, inflammation of organs, and raising the animal with a high fat diet;
[6] el animal no humano de uno cualquiera de [1] a [5], en el que el mamífero no humano es un ratón;[6] the non-human animal of any one of [1] to [5], in which the non-human mammal is a mouse;
[7] un método para producir un modelo animal no humano de esteatohepatitis, que comprende la etapa de inducir inflamación en un órgano del animal no humano;[7] a method for producing a non-human animal model of steatohepatitis, which comprises the stage of inducing inflammation in an organ of the non-human animal;
[8] un método de detección de una sustancia para tratar o prevenir la esteatohepatitis, que comprende las etapas de: (a) administrar una sustancia de ensayo al modelo animal no humano de esteatohepatitis de [1]; y[8] a method of detecting a substance to treat or prevent steatohepatitis, comprising the steps of: (a) administering a test substance to the non-human animal model of steatohepatitis of [1]; Y
(b) evaluar un efecto de mejora sobre la esteatohepatitis;(b) evaluate an effect of improvement on steatohepatitis;
[9] un método para evaluar la eficacia de una sustancia medicinal frente a la mejora en la esteatohepatitis, que comprende las etapas de:[9] a method to evaluate the efficacy of a medicinal substance against the improvement in steatohepatitis, which comprises the stages of:
(a) administrar una sustancia medicinal de ensayo al modelo animal no humano de esteatohepatitis de [1]; y (b) evaluar un efecto de mejora sobre la esteatohepatitis;(a) administer a medicinal test substance to the non-human animal model of steatohepatitis of [1]; and (b) evaluate an improvement effect on steatohepatitis;
[10] un método de detección de una sustancia para tratar o prevenir un trastorno diabético, que comprende las etapas de:[10] a method of detecting a substance to treat or prevent a diabetic disorder, comprising the steps of:
(a) administrar una sustancia de ensayo al modelo animal no humano de un trastorno diabético de [3]; y(a) administer a test substance to the non-human animal model of a diabetic disorder of [3]; Y
(b) evaluar un efecto de mejora sobre el trastorno diabético;(b) evaluate an effect of improvement on diabetic disorder;
[ I I ] un método para evaluar los riesgos de que se produzcan efectos secundarios de un agente farmacéutico para tratar o prevenir un trastorno diabético, que comprende las etapas de:[I I] a method for assessing the risks of side effects of a pharmaceutical agent to treat or prevent a diabetic disorder, comprising the steps of:
(a) administrar un agente farmacéutico de ensayo al modelo animal no humano de un trastorno diabético de [3]; y (b) evaluar los riesgos de que se produzcan efectos secundarios del agente farmacéutico para tratar o prevenir un trastorno diabético;(a) administering a pharmaceutical test agent to the non-human animal model of a diabetic disorder of [3]; and (b) assess the risks of side effects of the pharmaceutical agent to treat or prevent a diabetic disorder;
[12] un modelo animal no humano de cáncer de hígado, que se produce criando adicionalmente el animal no humano de uno cualquiera de [1] a [6];[12] a non-human animal model of liver cancer, which is produced by further breeding the non-human animal of any one of [1] to [6];
[13] el animal no humano de [12], que se caracteriza estructuralmente por la siguiente morfología patológica:[13] the non-human animal of [12], which is structurally characterized by the following pathological morphology:
(a) carcinoma de células hepáticas de aspecto acordonado de tipo masivo;(a) cornered-looking hepatic cell carcinoma of the massive type;
(b) infiltración de células inflamatorias; o (b) infiltration of inflammatory cells; or
(c) cáncer de hígado producido por cirrosis, desarrollado de tal manera que desplaza a las células hepáticas normales;(c) liver cancer caused by cirrhosis, developed in such a way that it displaces normal liver cells;
[14] un método de detección de una sustancia para tratar o prevenir el cáncer de hígado, que comprende las etapas de:[14] a method of detecting a substance to treat or prevent liver cancer, which comprises the steps of:
(a) administrar una sustancia de ensayo al modelo animal no humano para el cáncer de hígado de [12] o [13]; y(a) administer a test substance to the non-human animal model for liver cancer of [12] or [13]; Y
(b) evaluar un efecto terapéutico sobre el cáncer de hígado; y(b) evaluate a therapeutic effect on liver cancer; Y
[15] un método para evaluar la eficacia de una sustancia medicinal frente al tratamiento del cáncer de hígado, que comprende las etapas de:[15] a method to evaluate the efficacy of a medicinal substance against the treatment of liver cancer, which comprises the steps of:
(a) administrar una sustancia medicinal de ensayo al modelo animal no humano de cáncer de hígado de [12] o [13]; y (b) evaluar un efecto terapéutico sobre el cáncer de hígado.(a) administering a medicinal test substance to the non-human animal model of liver cancer of [12] or [13]; and (b) evaluate a therapeutic effect on liver cancer.
[Efectos de la invención][Effects of the invention]
Para producir animales experimentales que desarrollen estados patológicos similares a los de los seres humanos, se indujo resistencia a la insulina en ratones, y la esteatosis hepática se indujo alimentándolos con una dieta alta en grasas.To produce experimental animals that develop pathological conditions similar to those of humans, insulin resistance was induced in mice, and liver steatosis was induced by feeding them on a high-fat diet.
Se sacrificaron ratones de diferentes edades y cada órgano, principalmente el hígado, se analizó histopatológicamente (tinción con HE, tinción de grasa, inmunotinción para macrófagos y fibroblastos). La Puntación de Actividad de NAFlD (ENA; referencia: "Kleiner DE et al., Hepatology. Junio de 2005; 41(6): 1313-21 "), se calculó para evaluar con detalle las características patológicas. La EHNa de los animales modelo de la presente invención, también puede evaluarse utilizando la misma Puntuación de Actividad de NAFLD que la de los de seres humanos. Por tanto, los animales modelo de la presente invención son muy útiles como animales modelo de EHNA.Mice of different ages were sacrificed and each organ, mainly the liver, was analyzed histopathologically (staining with HE, fat staining, immunostaining for macrophages and fibroblasts). The NAF l D Activity Score (ENA; reference: "Kleiner DE et al., Hepatology. June 2005; 41 (6): 1313-21"), was calculated to assess in detail the pathological characteristics. The EHNa of the model animals of the present invention can also be evaluated using the same NAFLD Activity Score as that of humans. Therefore, the model animals of the present invention are very useful as model animals of EHNA.
Asimismo, utilizando el sistema FUJIFILM DRI-CHEM, se realizaron pruebas serobioquímicas. El análisis de expresión de genes se realizó utilizando PCR con transcriptasa inversa en tiempo real (Takara).Also, using the FUJIFILM DRI-CHEM system, serobiochemical tests were performed. Gene expression analysis was performed using real-time reverse transcriptase PCR (Takara).
Como se describe anteriormente, los presentes inventores produjeron satisfactoriamente animales modelo de esteatohepatitis (por ejemplo, animales modelo de EHNA) y animales modelo de cáncer de hígado que mostraban hallazgos patológicos similares a los de los seres humanos.As described above, the present inventors successfully produced steatohepatitis model animals (eg, model animals of NASH) and liver cancer model animals that showed pathological findings similar to those of humans.
La presente invención proporciona técnicas sencillas para producir, de manera estable, animales que desarrollen, en un estadio temprano, un estado patológico similar al de la EHNA humana, que conduce a esteatosis hepática, esteatohepatitis, fibrosis hepática y cirrosis hepática, seguido del desarrollo espontáneo de cáncer de hígado como resultado de la progresión del estado patológico, induciendo resistencia a la insulina en animales experimentales, tales como ratones, y abasteciéndolos con una dieta alta en grasas.The present invention provides simple techniques for stably producing animals that develop, at an early stage, a pathological state similar to that of human NASH, which leads to liver steatosis, steatohepatitis, liver fibrosis and liver cirrhosis, followed by spontaneous development. of liver cancer as a result of the progression of the pathological state, inducing insulin resistance in experimental animals, such as mice, and supplying them with a high-fat diet.
Asimismo, en los animales pueden observarse simultáneamente trastornos diabéticos (nefritis diabética, retinopatía, hiperlipidemia y arteriorclerosis). Por tanto, la presente invención también proporciona técnicas para producir animales experimentales que permitan observar al mismo tiempo los estados patológicos del síndrome metabólico. Por ahora, en ratones ob/ob y en ratones db/db, que se utilizan habitualmente como un modelo de EHNA, el estado patológico no se desarrolla de manera uniforme con el envejecimiento. Para evaluar con precisión el estado de la enfermedad de EHNA, es necesario controlar el estado patológico de los ratones, lo que hace que los experimentos sean engorrosos y complicados. Asimismo, las lesiones patológicas no siempre son irreversibles. Esto ha dificultado la evaluación de la eficacia (Horie Y et al. J clin Invest 113: 1774-1783, 2004; Yanagitani A et al., Hepatology 40: 366-375, 2004; Anstee QM et al., Int J Exp Path 87: 1-16, 2006). Por ahora, en los animales modelo de la presente invención, el período que conduce al estado patológico maduro es constante y su progresión es irreversible. Por tanto, los ratones modelo de la presente invención pueden utilizarse para resolver los problemas descritos anteriormente.Likewise, in animals, diabetic disorders (diabetic nephritis, retinopathy, hyperlipidemia and arteriorclerosis) can be observed simultaneously. Therefore, the present invention also provides techniques for producing experimental animals that allow to observe at the same time the pathological states of the metabolic syndrome. For now, in ob / ob mice and db / db mice, which are commonly used as a model of NASH, the pathological state does not develop uniformly with aging. To accurately assess the status of EHNA disease, it is necessary to control the pathological status of mice, which makes the experiments cumbersome and complicated. Likewise, pathological lesions are not always irreversible. This has hindered the evaluation of efficacy (Horie Y et al. J clin Invest 113: 1774-1783, 2004; Yanagitani A et al., Hepatology 40: 366-375, 2004; Anstee QM et al., Int J Exp Path 87: 1-16, 2006). For now, in the model animals of the present invention, the period leading to the mature pathological state is constant and its progression is irreversible. Therefore, the model mice of the present invention can be used to solve the problems described above.
Los ratones modelo de la presente invención pueden utilizarse en ensayos preclínicos para investigar diversos agentes terapéuticos, y son muy útiles en el desarrollo de agentes y en la búsqueda de dianas terapéuticas.The model mice of the present invention can be used in preclinical assays to investigate various therapeutic agents, and are very useful in the development of agents and in the search for therapeutic targets.
Breve descripción de los dibujosBrief description of the drawings
La figura 1 muestra un resultado de un ensayo serobioquímico en los ratones de la presente invención.Figure 1 shows a result of a serobiochemical assay in the mice of the present invention.
La figura 2 muestra fotografías de un resultado de tinción de grasa del hígado de un ratón de la presente invención. La figura 3 muestra fotografías de un resultado de inmunotinción de hígado de un ratón de la presente invención.Figure 2 shows photographs of a liver fat staining result of a mouse of the present invention. Figure 3 shows photographs of a liver immunostaining result of a mouse of the present invention.
La figura 4 muestra fotografías de un resultado de tinción con HE del hígado de un ratón de 20 semanas de vida de la presente invención.Figure 4 shows photographs of a result of HE staining of the liver of a 20-week-old mouse of the present invention.
La figura 5 muestra fotografías de un resultado de tinción con HE del hígado de ratones C57BL/6J y un gráfico de Puntuación de Actividad de NAFLD.Figure 5 shows photographs of a HE staining result of the liver of C57BL / 6J mice and a NAFLD Activity Score graph.
La figura 6 muestra fotografías de un resultado de inmunotinción con F4/80 de páncreas y tejido adiposo de ratones C57BL/6J.Figure 6 shows photographs of a result of immunostaining with F4 / 80 of the pancreas and adipose tissue of C57BL / 6J mice.
La figura 7 muestra fotografías de un resultado de inmunotinción con F4/80 y ER-TR7 de ratones BALB/c y C3H/HeN de 8 semanas de vida.Figure 7 shows photographs of an immunostaining result with F4 / 80 and ER-TR7 of BALB / c and C3H / HeN mice 8 weeks of life.
La figura 8 muestra fotografías de cáncer de hígado en ratones C3H/HeN de 20 semanas de vida.Figure 8 shows photographs of liver cancer in C3H / HeN mice 20 weeks old.
La figura 9 muestra fotografías de resultados reproducibles de ratones modelo de EHNA criados con otras dietas hiperlipídicas.Figure 9 shows photographs of reproducible results of model EHNA mice raised with other hyperlipidic diets.
La figura 10 muestra fotografías y gráficos de resultados de ensayos farmacológicos utilizado los ratones modelo de EHNA. 1 muestra fotografías del resultado de análisis histológicos. 2 muestra fotografías del resultado de análisis de expresión de genes.Figure 10 shows photographs and graphs of results of pharmacological trials used the EHNA model mice. 1 shows photographs of the histological analysis result. 2 shows photographs of the result of gene expression analysis.
La figura 11 muestra fotografías de la aparición de complicaciones diabéticas. 1 muestra fotografías de nefropatía diabética, mientras que 2 muestra fotografías de retinopatía diabética (imágenes de inmunotinción de nuevos vasos sanguíneos; CD31).Figure 11 shows photographs of the occurrence of diabetic complications. 1 shows photographs of diabetic nephropathy, while 2 shows photographs of diabetic retinopathy (immunostaining images of new blood vessels; CD31).
Modo para llevar a cabo la invenciónMode for carrying out the invention
La presente invención se refiere a ratones modelo de esteatohepatitis producidos mediante la inducción de resistencia a la insulina.The present invention relates to steatohepatitis model mice produced by inducing insulin resistance.
En una realización preferida, la presente invención proporciona ratones modelo de esteatohepatitis (en este documento a veces denominados "animales modelo de la presente invención") preparados mediante la administración de agentes para inducir la inflamación de órganos.In a preferred embodiment, the present invention provides steatohepatitis model mice (herein referred to as "model animals of the present invention") prepared by administering agents to induce inflammation of organs.
Los ratones modelo de la presente invención se preparan administrando, a animales experimentales, agentes para inducir la inflamación de órganos y después alimentándolos preferentemente con una dieta alta en grasas.The model mice of the present invention are prepared by administering, to experimental animals, agents to induce inflammation of organs and then preferably feeding them on a high fat diet.
Adicionalmente, en el presente documento se desvelan animales no humanos, preferentemente vertebrados no humanos, más preferentemente mamíferos no humanos, y aún más preferentemente roedores. Como ejemplos de animales que pueden utilizarse para preparar animales modelo se incluyen ratones, ratas, conejos, perros, pollos y monos (a estos animales a veces también se les conoce simplemente como "animales experimentales").Additionally, non-human animals, preferably non-human vertebrates, more preferably non-human mammals, and even more preferably rodents are disclosed herein. Examples of animals that can be used to prepare model animals include mice, rats, rabbits, dogs, chickens and monkeys (these animals are also sometimes referred to simply as "experimental animals").
El acervo genético de los animales que se utilizarán para producir animales modelo no está particularmente limitado; y es posible utilizar animales con cualquier origen genético. En general, preferentemente pueden utilizarse animales de tipo silvestre.The genetic heritage of animals that will be used to produce model animals is not particularly limited; and it is possible to use animals with any genetic origin. In general, preferably wild-type animals can be used.
En la presente invención, los agentes para inducir la inflamación de órganos (en el presente documento a veces también denominados simplemente "agentes") no están particularmente limitados, siempre y cuando tengan una actividad para inducir directa o indirectamente inflamación en diversos órganos. Los órganos para inducir inflamación incluyen, por ejemplo, páncreas, tejidos adiposos y tejidos musculares. Los agentes para inducir inflamación de órganos también incluyen agentes que inducen directa o indirectamente inflamación en tejidos periféricos.In the present invention, the agents for inducing inflammation of organs (sometimes also simply referred to herein as "agents") are not particularly limited, as long as they have an activity to directly or indirectly induce inflammation in various organs. The organs for inducing inflammation include, for example, pancreas, adipose tissues and muscle tissues. Agents for inducing inflammation of organs also include agents that directly or indirectly induce inflammation in peripheral tissues.
Los agentes para inducir inflamación de órganos incluyen preferentemente inhibidores de la N-acetil-p-D-glucosaminidasa.Agents for inducing inflammation of organs preferably include inhibitors of N-acetyl-p-D-glucosaminidase.
En una realización preferida, los ratones modelo de la presente invención se producen administrando inhibidores de la N-acetil-p-D-glucosaminidasa a los ratones experimentales descritos anteriormente. Dichos inhibidores incluyen, por ejemplo, estreptozotocina y Pugnac.In a preferred embodiment, the model mice of the present invention are produced by administering N-acetyl-p-D-glucosaminidase inhibitors to the experimental mice described above. Such inhibitors include, for example, streptozotocin and Pugnac.
Como alternativa, los ácidos nucleicos que tienen una actividad de inhibición de la N-acetil-p-D-glucosaminidasa, también pueden utilizarse como un agente de la presente invención. Específicamente, dichos ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, los ARNip que suprimen la expresión del gen de la O-GlcNAcasa (GenBank n.° de registro NM_023799.3), los antisentido del gen y las ribozimas que se dirigen al gen.Alternatively, nucleic acids that have an N-acetyl-p-D-glucosaminidase inhibition activity can also be used as an agent of the present invention. Specifically, said nucleic acids include, for example, siRNAs that suppress the expression of the O-GlcNAcasa gene (GenBank registration no. NM_023799.3), the antisense of the gene and the ribozymes that target the gene.
En la producción de los ratones modelo de la presente invención, la forma de dosificación de los agentes para inducir la inflamación de órganos no está particularmente limitada. Por ejemplo, la forma de dosificación incluye, por ejemplo, administración subcutánea (inyección subcutánea, etc.), administración intravenosa, administración oral y administración intraperitoneal.In the production of the model mice of the present invention, the dosage form of the agents for inducing inflammation of organs is not particularly limited. For example, the dosage form includes, for example, subcutaneous administration (subcutaneous injection, etc.), intravenous administration, oral administration and intraperitoneal administration.
La dosis del agente a administrar no está limitada, y es típicamente de 50 a 500 |jg, preferentemente de 100 a 300 jg, y más preferentemente de 200 jg cuando el agente es estreptozotocina.The dose of the agent to be administered is not limited, and is typically 50 to 500 µg, preferably 100 to 300 µg, and more preferably 200 µg when the agent is streptozotocin.
El momento para administrar el agente es el siguiente. Habitualmente, el agente se administra de uno a cinco días después del nacimiento (período neonatal, preferentemente de uno a cinco días de vida, y más preferentemente dos días) y preferentemente dos días después del nacimiento.The time to administer the agent is as follows. Usually, the agent is administered one to five days after birth (neonatal period, preferably one to five days of life, and more preferably two days) and preferably two days after birth.
Como se describe anteriormente, la resistencia a la insulina puede inducirse administrando los agentes. Después de la administración de los agentes como se describe anteriormente, los animales se crían para producir animales modelo de la presente invención. En general, los animales se alimentan preferentemente con una dieta alta en grasas. Dichas dietas hiperlipídicas incluyen diversas dietas generales para animales que están disponibles en el comercio.As described above, insulin resistance can be induced by administering the agents. After administration of the agents as described above, the animals are raised to produce model animals of the present invention. In general, animals preferably feed on a high fat diet. Such hyperlipidic diets include various general diets for animals that are available in the Commerce.
Los ingredientes principales de las dietas hiperlipídicas descritas anteriormente incluyen, por ejemplo, grasa cruda, proteína cruda, fibra cruda, ceniza cruda, extracto sin nitrógeno y agua. Las dietas hiperlipídicas de la presente invención no están particularmente limitadas; sin embargo, el contenido de grasa cruda es del 20 % o más, y preferentemente del 30 % o más; y la proporción de las calorías procedentes de grasa con respecto a las calorías totales es habitualmente del 50 % o más, y preferentemente del 60 % o más. Como ingredientes que se incluyen en la formulación de las dietas hiperlipídicas se incluyen, por ejemplo, sebo de vacuno en polvo, caseína láctea, clara de huevo en polvo, L-cistina, aceite de cártamo, celulosa cristalina, maltodextrina, lactosa y sacarosa. Estas sustancias se muestran como un ejemplo de los ingredientes de las dietas hiperlipídicas, y no están necesariamente contenidas en las dietas.The main ingredients of the hyperlipidic diets described above include, for example, raw fat, crude protein, raw fiber, raw ash, nitrogen-free extract and water. The hyperlipidic diets of the present invention are not particularly limited; however, the crude fat content is 20% or more, and preferably 30% or more; and the proportion of calories from fat with respect to total calories is usually 50% or more, and preferably 60% or more. Ingredients included in the formulation of hyperlipidic diets include, for example, beef tallow powder, milk casein, egg white powder, L-cystine, safflower oil, crystalline cellulose, maltodextrin, lactose and sucrose. These substances are shown as an example of the ingredients of hyperlipidic diets, and are not necessarily contained in the diets.
Las dietas hiperlipídicas descritas anteriormente incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, aquellas que tienen un mayor contenido de grasa cruda (por ejemplo, mayor en aproximadamente un 30 % o más) que las dietas normales. Como ejemplos de dichas dietas hiperlipídicas se incluyen las que están disponibles en el comercio como dietas para animales de laboratorio, tales como la dieta alta en grasas High Fat Diet32 (CLEA Japón Inc.) y D12492 (Research Diets).The hyperlipidic diets described above include, but are not limited to, for example, those that have a higher crude fat content (for example, greater than about 30% or more) than normal diets. Examples of such hyperlipidic diets include those that are commercially available as diets for laboratory animals, such as the High Fat Diet32 (CLEA Japan Inc.) and D12492 (Research Diets).
Por ejemplo, cuando los animales son ratones, la alimentación con la dieta alta en grasas descrita anteriormente, comienza habitualmente a las 2 a 6 semanas de vida, preferentemente a las 3 a 5 semanas, y más preferentemente a las 4 semanas de vida. Además, por ejemplo, en el caso de los ratones, la cantidad de dieta alta en grasas que se administra cada vez es de aproximadamente 3 a 6 g. En general, los ratones se alimentan preferentemente con la dieta alta en grasas durante una semana o más.For example, when the animals are mice, feeding with the high fat diet described above usually begins at 2 to 6 weeks of life, preferably at 3 to 5 weeks, and more preferably at 4 weeks of life. In addition, for example, in the case of mice, the amount of high fat diet that is administered each time is about 3 to 6 g. In general, mice preferably feed on the high fat diet for a week or more.
Los expertos en la técnica pueden regular (ajustar) adecuadamente la cantidad de dieta alta en grasas dependiendo del tipo, tamaño, peso, o similares, de los animales experimentales que van a utilizarse. La esteatosis hepática, puede inducirse alimentándolos con una dieta alta en grasas. Por tanto, en una realización preferida, la presente invención proporciona ratones modelo de esteatohepatitis, que comprende la etapa de inducir esteatosis hepática, administrando a los animales agentes para inducir la inflamación de órganos y alimentándolos con una dieta alta en grasas.Those skilled in the art can properly regulate (adjust) the amount of high fat diet depending on the type, size, weight, or the like, of the experimental animals to be used. Hepatic steatosis can be induced by feeding them with a high fat diet. Therefore, in a preferred embodiment, the present invention provides steatohepatitis model mice, which comprises the stage of inducing hepatic steatosis, administering to the animals agents to induce inflammation of organs and feeding them with a high fat diet.
Los animales producidos por el método descrito anteriormente desarrollan síntomas de esteatohepatitis y son útiles como ratones modelo de esteatohepatitis. Los ratones modelo de la presente invención tienen la característica de desarrollar simultáneamente estados patológicos que se observan en animales preparados por los métodos de la presente invención. Se prefiere que los ratones modelo desarrollen simultáneamente resistencia a la insulina y/o fibrosis hepática. Sin embargo, dichos estados patológicos no se limitan a estos ejemplos.Animals produced by the method described above develop symptoms of steatohepatitis and are useful as model mice of steatohepatitis. The model mice of the present invention have the characteristic of simultaneously developing pathological states that are observed in animals prepared by the methods of the present invention. It is preferred that model mice simultaneously develop insulin resistance and / or liver fibrosis. However, such pathological states are not limited to these examples.
En una realización preferida, los animales modelo de la presente invención son característicos por que los estados patológicos del síndrome metabólico, pueden observarse al mismo tiempo, ya que los trastornos diabéticos (nefritis diabética, retinopatía, hiperlipidemia y arteriosclerosis) pueden observarse simultáneamente en los animales modelo de la presente invención.In a preferred embodiment, the model animals of the present invention are characteristic in that the disease states of the metabolic syndrome can be observed at the same time, since diabetic disorders (diabetic nephritis, retinopathy, hyperlipidemia and arteriosclerosis) can be observed simultaneously in the animals Model of the present invention.
Asimismo, dado que los animales modelo de la presente invención tienen la característica de que el estado patológico no se recupera espontáneamente, los animales pueden utilizarse adecuadamente para someter a ensayo y evaluar la eficacia de fármacos.Also, since the model animals of the present invention have the characteristic that the pathological state does not recover spontaneously, the animals can be suitably used to test and evaluate the efficacy of drugs.
En una realización preferida de los ratones modelo de la presente invención, la esteatohepatitis descrita anteriormente es hepatitis no alcohólica (HNA). Específicamente, la presente invención proporciona animales modelo de hepatitis no alcohólica (HNA), que se preparan administrando agentes para inducir la inflamación de órganos. Los animales desarrollan regularmente, a un curso constante, estados patológicos con progresión y pronóstico similares a los de la HNA humana.In a preferred embodiment of the model mice of the present invention, the steatohepatitis described above is nonalcoholic hepatitis (HNA). Specifically, the present invention provides non-alcoholic hepatitis (HNA) model animals, which are prepared by administering agents to induce inflammation of organs. Animals regularly develop, at a constant course, pathological states with progression and prognosis similar to those of human HNA.
En una realización preferida, los ratones modelo de hepatitis no alcohólica de la presente invención tienen al menos uno (preferiblemente, todos) de los siguientes hallazgos patológicos:In a preferred embodiment, the non-alcoholic hepatitis model mice of the present invention have at least one (preferably, all) of the following pathological findings:
(1) deposición de grasa macrovesicular en células hepáticas y balonización de células hepáticas;(1) deposition of macrovesicular fat in liver cells and balonization of liver cells;
(2) infiltración de células inflamatorias; y(2) infiltration of inflammatory cells; Y
(3) fibrosis, principalmente alrededor de la vena central.(3) fibrosis, mainly around the central vein.
Por consiguiente, en una realización preferida, los ratones modelo de la presente invención se caracterizan estructuralmente por las morfologías patológicas descritas anteriormente.Accordingly, in a preferred embodiment, the model mice of the present invention are structurally characterized by the pathological morphologies described above.
A medida que la crianza continuaba, los animales modelo de esteatohepatitis descritos anteriormente desarrollaron cirrosis hepática que condujo a cáncer de hígado. Por tanto, los animales modelo de esteatohepatitis de la presente invención también son útiles, por ejemplo, como animales (materiales de partida) para producir ratones modelo de cirrosis hepática o ratones modelo de cáncer de hígado. Específicamente, la presente invención proporciona materiales para preparar ratones modelo de cirrosis hepática o de cáncer de hígado, que comprende los ratones modelo de esteatohepatitis de la presente invención. As breeding continued, the steatohepatitis model animals described above developed liver cirrhosis that led to liver cancer. Thus, the steatohepatitis model animals of the present invention are also useful, for example, as animals (starting materials) for producing liver cirrhosis model mice or liver cancer model mice. Specifically, the present invention provides materials for preparing liver cirrhosis or liver cancer model mice, comprising the steatohepatitis model mice of the present invention.
Asimismo, en el presente documento también se desvelan métodos para producir animales modelo de la presente invención como se describe anteriormente. En una realización preferida, la presente invención proporciona métodos para producir animales modelo de esteatohepatitis, que comprenden la etapa de administrar agentes para inducir la inflamación de órganos a animales no humanos.Likewise, methods for producing model animals of the present invention as described above are also disclosed herein. In a preferred embodiment, the present invention provides methods for producing steatohepatitis model animals, which comprise the step of administering agents to induce inflammation of organs to non-human animals.
Asimismo, utilizando los ratones modelo de la presente invención pueden detectarse sustancias para tratar o prevenir la esteatohepatitis. Específicamente, la presente invención proporciona métodos de detección de sustancias para tratar o prevenir la esteatohepatitis, que comprende las etapas de:Also, using the model mice of the present invention substances can be detected to treat or prevent steatohepatitis. Specifically, the present invention provides methods of detecting substances to treat or prevent steatohepatitis, which comprises the steps of:
(a) administrar una sustancia de ensayo a un ratón modelo de esteatohepatitis de la presente invención; y(a) administering a test substance to a steatohepatitis model mouse of the present invention; Y
(b) evaluar su efecto de mejora sobre la esteatohepatitis.(b) evaluate its effect of improvement on steatohepatitis.
Las sustancias de ensayo que se utilizarán en estos métodos no están particularmente limitadas. Por ejemplo, dichas sustancias incluyen compuestos individuales tales como compuestos naturales, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos, proteínas y péptidos, así como bibliotecas de compuestos, productos de expresión de genotecas, extractos celulares, sobrenadantes de cultivos celulares, productos de microorganismos fermentadores, extractos de organismos marinos y extractos vegetales, pero no se limita a los mismos.The test substances that will be used in these methods are not particularly limited. For example, such substances include individual compounds such as natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins and peptides, as well as compound libraries, library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermenting microorganism products, extracts of Marine organisms and plant extracts, but not limited to them.
Los métodos para administrar sustancias de ensayo o las sustancias medicinales de la presente invención no están particularmente limitados; sin embargo, pueden administrarse, por ejemplo, por vía oral o por inyección. Cuando dicha sustancia de ensayo es una proteína, por ejemplo, puede construirse un vector vírico que lleve un gen que codifique la proteína y puede introducirse en los animales modelo de la presente invención utilizando su capacidad de infección.The methods for administering test substances or the medicinal substances of the present invention are not particularly limited; however, they can be administered, for example, orally or by injection. When said test substance is a protein, for example, a viral vector can be constructed that carries a gene encoding the protein and can be introduced into the model animals of the present invention using its infectivity.
En la etapa (b), el efecto de mejora sobre la esteatohepatitis puede evaluarse determinando si la esteatohepatitis se mejora al evaluar los hallazgos patológicos de los animales modelo.In step (b), the effect of improvement on steatohepatitis can be assessed by determining whether steatohepatitis is improved by evaluating the pathological findings of the model animals.
Los hallazgos patológicos de la esteatohepatitis incluyen, por ejemplo, los hallazgos patológicos descritos anteriormente (morfologías patológicas). En el presente documento, "mejora" significa que los síntomas de la esteatohepatitis se alivian o se restablecen a la normalidad. Utilizando como indicador los hallazgos patológicos descritos en el presente documento, los expertos en la técnica pueden evaluar adecuadamente si los síntomas de la esteatohepatitis mejoran en los ratones modelo.Pathological findings of steatohepatitis include, for example, the pathological findings described above (pathological morphologies). In this document, "improvement" means that the symptoms of steatohepatitis are relieved or restored to normal. Using the pathological findings described herein as an indicator, those skilled in the art can adequately assess whether the symptoms of steatohepatitis improve in model mice.
En la presente invención, las sustancias que producen el efecto de mejora en la etapa (b) anterior, pueden seleccionarse como sustancias para tratar o prevenir la esteatohepatitis.In the present invention, the substances that produce the improvement effect in step (b) above, can be selected as substances to treat or prevent steatohepatitis.
Asimismo, utilizando los animales modelo de la presente invención, puede evaluarse la eficacia de sustancias medicinales sobre la mejora de la esteatohepatitis. Específicamente, la presente invención proporciona métodos para evaluar la eficacia de sustancias medicinales sobre la mejora de la esteatohepatitis, que comprende las etapas de:Also, using the model animals of the present invention, the efficacy of medicinal substances on the improvement of steatohepatitis can be evaluated. Specifically, the present invention provides methods for evaluating the efficacy of medicinal substances on the improvement of steatohepatitis, which comprises the steps of:
(a) administrar una sustancia medicinal de ensayo a un ratón modelo de esteatohepatitis de la presente invención; y (b) evaluar su efecto de mejora sobre la esteatohepatitis.(a) administering a test drug substance to a steatohepatitis model mouse of the present invention; and (b) evaluate its effect of improvement on steatohepatitis.
El tipo de sustancias medicinales que pueden evaluarse para determinar su eficacia mediante los métodos descritos anteriormente no está particularmente limitado; y dichas sustancias medicinales incluyen, por ejemplo, diversos agentes farmacéuticos conocidos (compuestos de bajo peso molecular, proteínas, ácidos nucleicos, o similares). Cuando una sustancia medicinal de ensayo ejerce un efecto de mejora sobre la esteatohepatitis, se considera que la sustancia medicinal tiene un efecto terapéutico sobre la esteatohepatitis.The type of medicinal substances that can be evaluated to determine their effectiveness by the methods described above is not particularly limited; and said medicinal substances include, for example, various known pharmaceutical agents (low molecular weight compounds, proteins, nucleic acids, or the like). When a medicinal test substance exerts an improvement effect on steatohepatitis, the medicinal substance is considered to have a therapeutic effect on steatohepatitis.
Asimismo, los animales modelo de la presente invención se caracterizan por mostrar trastornos diabéticos (nefritis diabética, retinopatía, o similares), que se desarrollan como una complicación de la diabetes, simultáneamente junto con esteatohepatitis. Por tanto, los ratones modelo de la presente invención son útiles como animales modelo de diabetes.Likewise, the model animals of the present invention are characterized by showing diabetic disorders (diabetic nephritis, retinopathy, or the like), which develop as a complication of diabetes, simultaneously with steatohepatitis. Therefore, the model mice of the present invention are useful as diabetes model animals.
Específicamente, la presente invención proporciona animales no humanos modelo de diabetes preparados mediante la administración de agentes para inducir la inflamación de órganos. Utilizando los animales modelo de diabetes de la presente invención, pueden desarrollarse agentes para tratar o prevenir trastornos diabéticos (nefritis diabética, la retinopatía, o similares). Por ejemplo, pueden detectarse compuestos candidatos para tratar o prevenir trastornos diabéticos, administrando sustancias de ensayo a los ratones modelo de diabetes de la presente invención, y evaluando su efecto de mejora sobre los trastornos diabéticos.Specifically, the present invention provides non-human diabetes model animals prepared by administering agents to induce inflammation of organs. Using the diabetes model animals of the present invention, agents can be developed to treat or prevent diabetic disorders (diabetic nephritis, retinopathy, or the like). For example, candidate compounds for treating or preventing diabetic disorders can be detected by administering test substances to the diabetes model mice of the present invention, and evaluating their effect of improvement on diabetic disorders.
En una realización preferida, la presente invención proporciona métodos de detección de sustancias para tratar o prevenir trastornos diabéticos, que comprende las etapas de:In a preferred embodiment, the present invention provides methods of detecting substances for treating or preventing diabetic disorders, comprising the steps of:
(a) administrar una sustancia de ensayo a un modelo animal no humano de trastorno diabético de la presente invención; y (a) administering a test substance to a non-human animal model of diabetic disorder of the present invention; Y
(b) evaluar su efecto de mejora sobre el trastorno diabético.(b) evaluate its effect of improvement on diabetic disorder.
Muchos pacientes con EHNA también son diabéticos y se cree que desarrollan diversas complicaciones. Los animales modelo de la presente invención desarrollan complicaciones diabéticas y, por lo tanto, son muy útiles como animales modelo, porque los riesgos, tales como los efectos secundarios descubiertos en ensayos clínicos, pueden evaluarse en fases tempranas utilizando los animales modelo.Many patients with NASH are also diabetic and are believed to develop various complications. The model animals of the present invention develop diabetic complications and, therefore, are very useful as model animals, because the risks, such as the side effects discovered in clinical trials, can be evaluated early using the model animals.
Específicamente, la presente invención proporciona métodos para evaluar los riesgos de que los agentes farmacéuticos produzcan efectos secundarios utilizando los animales modelo de diabetes de la presente invención. En una realización preferida, la presente invención se refiere a métodos para evaluar el riesgo de que los agentes farmacéuticos produzcan efectos secundarios para tratar o prevenir trastornos diabéticos, que comprende las etapas de:Specifically, the present invention provides methods for assessing the risks of pharmaceutical agents producing side effects using the diabetes model animals of the present invention. In a preferred embodiment, the present invention relates to methods for assessing the risk that pharmaceutical agents produce side effects to treat or prevent diabetic disorders, comprising the steps of:
(a) administrar un agente farmacéutico de ensayo al modelo animal no humano de trastorno diabético de la presente invención; y(a) administering a pharmaceutical test agent to the non-human animal model of diabetic disorder of the present invention; Y
(b) evaluar los efectos secundarios del agente farmacéutico para tratar o prevenir el trastorno diabético.(b) evaluate the side effects of the pharmaceutical agent to treat or prevent diabetic disorder.
Asimismo, los presentes inventores descubrieron, por primera vez, que a medida que continuaba la crianza, los animales modelo de esteatohepatitis de la presente invención descritos anteriormente, desarrollaban cirrosis hepática que condujo a cáncer de hígado. Por tanto, la presente invención proporciona ratones modelo de cirrosis hepática y animales modelo de cáncer de hígado, que se preparan continuando la crianza de los animales modelo de esteatohepatitis descritos anteriormente.Likewise, the present inventors discovered, for the first time, that as the breeding continued, the steatohepatitis model animals of the present invention described above developed liver cirrhosis that led to liver cancer. Thus, the present invention provides liver cirrhosis model mice and liver cancer model animals, which are prepared by continuing to raise the steatohepatitis model animals described above.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a ratones modelo de cáncer de hígado que se preparan continuando la crianza de los animales modelo de esteatohepatitis preparados mediante la administración de agentes para inducir la inflamación de órganos.In a preferred embodiment, the present invention relates to liver cancer model mice that are prepared by continuing to breed steatohepatitis model animals prepared by administering agents to induce inflammation of organs.
Los ratones modelo de esteatohepatitis de la presente invención descritos anteriormente, desarrollan posteriormente cirrosis hepática. Los animales modelo de cáncer de hígado pueden producirse criando adicionalmente a los animales. En la producción de dichos ratones modelo, habitualmente el período de crianza después de haberse desarrollado la cirrosis hepática es, por ejemplo, de 2 a 20 semanas o más, y preferentemente de 10 semanas o más, cuando el animal experimental es un ratón.The steatohepatitis model mice of the present invention described above subsequently develop liver cirrhosis. Model animals of liver cancer can be produced by additionally raising the animals. In the production of said model mice, usually the breeding period after liver cirrhosis has developed is, for example, 2 to 20 weeks or more, and preferably 10 weeks or more, when the experimental animal is a mouse.
Los animales modelo de cáncer de hígado de la presente invención se caracterizan estructuralmente, por ejemplo, por al menos una (preferentemente todas) las características seleccionadas de los siguientes hallazgos patológicos (morfologías patológicas):The liver cancer model animals of the present invention are structurally characterized, for example, by at least one (preferably all) selected features of the following pathological findings (pathological morphologies):
(a) carcinoma de células hepáticas de aspecto acordonado de tipo masivo;(a) cornered-looking hepatic cell carcinoma of the massive type;
(b) infiltración de células inflamatorias; y(b) infiltration of inflammatory cells; Y
(c) cáncer de hígado producido por cirrosis, desarrollado de tal manera que desplaza a las células hepáticas normales.(c) liver cancer caused by cirrhosis, developed in such a way that it displaces normal liver cells.
Los ratones modelo de cáncer de hígado que tienen las características descritas anteriormente presentan las morfologías patológicas descritas anteriormente, y por lo tanto, son estructuralmente diferentes de los animales modelo de cáncer de hígado convencionales preparados mediante la administración de sustancias químicas (sustancias cancerígenas).Liver cancer model mice that have the characteristics described above have the pathological morphologies described above, and therefore, are structurally different from conventional liver cancer model animals prepared by administering chemical substances (carcinogenic substances).
Las sustancias para tratar o prevenir el cáncer de hígado pueden seleccionarse utilizando los animales modelo de cáncer de hígado descritos anteriormente de la presente invención.Substances for treating or preventing liver cancer can be selected using the liver cancer model animals described above of the present invention.
En una realización preferida, los métodos descritos anteriormente de la presente invención, incluyen métodos de detección de sustancias para tratar o prevenir el cáncer de hígado, que comprende las etapas de:In a preferred embodiment, the methods described above of the present invention include methods of detecting substances for treating or preventing liver cancer, which comprises the steps of:
(a) administrar una sustancia de ensayo a un animal modelo de cáncer de hígado de la presente invención; y (b) evaluar su efecto terapéutico sobre el cáncer de hígado.(a) administering a test substance to a liver cancer model animal of the present invention; and (b) evaluate its therapeutic effect on liver cancer.
En los métodos anteriormente descritos, el efecto terapéutico puede evaluarse adecuadamente, por ejemplo, utilizando como indicador los hallazgos patológicos de cáncer de hígado descritos anteriormente. Por ejemplo, cuando el carcinoma de células hepáticas de aspecto acordonado de tipo masivo se elimina en un animal modelo de la presente invención al que se le administra una sustancia de ensayo, se considera que la sustancia de ensayo tiene efecto terapéutico sobre el cáncer de hígado.In the methods described above, the therapeutic effect can be adequately evaluated, for example, using the pathological findings of liver cancer described above as an indicator. For example, when massive-type cordon-looking liver cell carcinoma is removed in a model animal of the present invention to which a test substance is administered, the test substance is considered to have a therapeutic effect on liver cancer. .
Asimismo, de acuerdo con la presente invención, la eficacia de las sustancias medicinales puede evaluarse en el tratamiento del cáncer de hígado utilizando ratones modelo de cáncer de hígado de la presente invención. En una realización preferida, los métodos incluyen, por ejemplo, aquellos que comprenden las etapas de:Also, in accordance with the present invention, the efficacy of medicinal substances can be evaluated in the treatment of liver cancer using liver cancer model mice of the present invention. In a preferred embodiment, the methods include, for example, those comprising the steps of:
(a) administrar una sustancia medicinal de ensayo a un modelo de ratón de cáncer de hígado de la presente invención; y(a) administering a medicinal test substance to a mouse model of liver cancer of the present invention; Y
(b) evaluar su efecto terapéutico sobre el cáncer de hígado. (b) evaluate its therapeutic effect on liver cancer.
EjemplosExamples
A continuación, en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los Ejemplos, pero sin limitarse a los mismos.Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to the Examples, but not limited thereto.
[Ejemplo 1] Preparación de animales modelo de EHNA y de animales modelo de cáncer de hígado[Example 1] Preparation of ANHNA model animals and liver cancer model animals
(a) Preparación de ratones modelo de EHNA(a) Preparation of EHNA model mice
Se criaron hembras de ratón C57BL6J/JJcl, C3H/HeNJcl y BALB/cByJJcl (CLEA Japan Inc.) y C57BL6J/NCrlCrlj (Charles River Japón, Inc.), que después de gestar parieron. Dos días después del nacimiento, se indujo inflamación pancreática en los ratones C57BL6J/JcL, BALB/cByJJcl y C3H/HeNJcl (CLEA Japón Inc.) macho, con citotoxicidad específica para la N-acetil-beta-D-glucosaminidasa (O-GlcNAcasa) en células p pancreáticas (por ejemplo, administrando por vía subcutánea 10 mg/ml de estreptozotocina (SIGMA) a 20 pl /cabeza). Por tanto, la resistencia a la insulina se indujo suscitando directa o indirectamente la inflamación en tejidos periféricos. Los ratones se criaron con una dieta CE-2 (CLEA Japón Inc.) y agua estéril hasta las cuatro semanas de vida y se destetaron. Después, los ratones se criaron hasta las 2o semanas de vida con agua estéril y dieta alta en grasas (CLEA Japón Inc.) o con D12492 (Research Diets), que tenía un mayor contenido de grasa cruda (o un 30 % o más) que la dieta normal. (b) Evaluación histológicaC57BL6J / JJcl, C3H / HeNJcl and BALB / cByJJcl (CLEA Japan Inc.) and C57BL6J / NCrlCrlj (Charles River Japan, Inc.) mouse females were raised, which, after gestating, gave birth. Two days after birth, pancreatic inflammation was induced in male C57BL6J / JcL, BALB / cByJJcl and C3H / HeNJcl (CLEA Japan Inc.) mice, with specific cytotoxicity for N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (O-GlcNAcasa ) in pancreatic p cells (for example, subcutaneously administering 10 mg / ml of streptozotocin (SIGMA) at 20 pl / head). Therefore, insulin resistance was induced directly or indirectly causing inflammation in peripheral tissues. The mice were raised on a CE-2 diet (CLEA Japan Inc.) and sterile water until four weeks of age and weaned. The mice were then reared until the 2nd week of life with sterile water and high fat diet (CLEA Japan Inc.) or with D12492 (Research Diets), which had a higher crude fat content (or 30% or more) than the normal diet. (b) Histological evaluation
Después de que los ratones de diferentes edades se mantuvieran en ayunas durante 24 horas, se sacrificaron utilizando anestesia con éter y se extrajo su sangre. Cada órgano se congeló en compuesto OCT (Sakura Fine Technical) y después se cortó en secciones para realizar el análisis patológico. Un ensayo serobioquímico mostró que todos los niveles de glucemia en ayunas, de alanina aminotransferasa (ALT) y de grasa neutra, fueron más altos en este modelo en comparación con el grupo de animales normales. Por tanto, los animales modelo desarrollaron resistencia a la insulina e hiperlipemia (Fig. 1). Histológicamente, a las cinco semanas de vida se observó esteatosis hepática grave con balonización de los hepatocitos. A las ocho semanas de vida, la grasa se eliminó casi por completo del hígado y, por lo tanto, la progresión del estado histopatológico fue muy similar a la de la EHNA humana de aspecto quemado (Fig. 2). A las seis semanas, en el hígado se observó acumulación e infiltración de células inflamatorias, incluidos macrófagos, y la fibrosis progresó alrededor de la vena central del hígado. El resultado obtenido, observando cambios adicionales con el tiempo, mostró que, a las ocho semanas, las venas centrales se conectaban a medida que progresaba la fibrosis, y a las diez semanas (Fig. 3), se observó cirrosis hepática con formación de nódulos en regeneración. Asimismo, la ENA se calculó basándose en los datos histopatológicos. El resultado mostró que, en el estadio de EHNA, la puntuación fue, en promedio, de 5. Por tanto, se demostró que el efecto farmacológico podría evaluarse controlando cambios de esta puntuación (Fig. 5).After the mice of different ages were fasting for 24 hours, they were sacrificed using ether anesthesia and their blood was drawn. Each organ was frozen in OCT compound (Sakura Fine Technical) and then cut into sections for pathological analysis. A serobiochemical trial showed that all levels of fasting blood glucose, alanine aminotransferase (ALT) and neutral fat were higher in this model compared to the group of normal animals. Therefore, the model animals developed insulin resistance and hyperlipemia (Fig. 1). Histologically, at five weeks of age, severe hepatic steatosis was observed with hepatocyte balonization. At eight weeks of age, the fat was almost completely eliminated from the liver and, therefore, the progression of the histopathological state was very similar to that of the human NASH of burned appearance (Fig. 2). At six weeks, accumulation and infiltration of inflammatory cells, including macrophages, was observed in the liver, and fibrosis progressed around the central vein of the liver. The result obtained, observing additional changes over time, showed that, at eight weeks, the central veins connected as the fibrosis progressed, and at ten weeks (Fig. 3), liver cirrhosis with nodule formation was observed in regeneration. Likewise, the ENA was calculated based on histopathological data. The result showed that, in the stage of NASH, the score was, on average, 5. Therefore, it was demonstrated that the pharmacological effect could be evaluated by controlling changes in this score (Fig. 5).
La patogenia de la EHNA en este modelo de ratón es que la inflamación pancreática desencadena inflamación crónica en tejidos periféricos tales como hígado y tejidos adiposos; se desarrolla resistencia a la insulina; y la inflamación sistémica persistente conduce a esteatosis hepática (Fig. 6). Después, a medida que envejecían los ratones, los nódulos en regeneración se agrandaban. A las 20 semanas (Fig. 4), se observó infiltración de células inflamatorias, aumento de hepatocitos atípicos y desarrollo de cáncer, que desplazaba a las células hepáticas normales. Por otra parte, en ratones de otras líneas (Figuras 7 y 8), también pueden desarrollarse lesiones que son histológicamente compatibles con la lesión por EHNA, que conducen a cáncer de hígado. Las lesiones por EHNA eran reproducibles incluso si se cambiaba el tipo de dieta alta en grasas (Fig. 9).The pathogenesis of NASH in this mouse model is that pancreatic inflammation triggers chronic inflammation in peripheral tissues such as liver and adipose tissues; insulin resistance develops; and persistent systemic inflammation leads to hepatic steatosis (Fig. 6). Then, as the mice aged, the regenerating nodules enlarged. At 20 weeks (Fig. 4), infiltration of inflammatory cells, increase of atypical hepatocytes and development of cancer was observed, which displaced normal liver cells. On the other hand, in mice of other lines (Figures 7 and 8), lesions that are histologically compatible with NASH injury, which lead to liver cancer, can also develop. NASH lesions were reproducible even if the type of high-fat diet was changed (Fig. 9).
Asimismo, como un ensayo de terapia para EHNA, durante dos semanas, al modelo de la presente invención, se le administró por vía oral un antagonista de receptores de angiotensina (ARA), que es un agente antihipertensivo. De acuerdo con un informe clínico (Georgescu EF et al. 15: 942), la comparación entre el grupo al que se le administró ARA y el grupo no tratado, mostró una mejoría histológica en el hígado y efectos de mejora sobre la inflamación y la fibrosis, que se detectaron mediante un ensayo genético, lo que sugiere que el resultado es muy parecido a los resultados clínicos (Fig. 10).Likewise, as a therapy trial for NASH, for two weeks, the model of the present invention was administered orally with an angiotensin receptor antagonist (ARA), which is an antihypertensive agent. According to a clinical report (Georgescu EF et al. 15: 942), the comparison between the group that was given ARA and the untreated group showed histological improvement in the liver and improvement effects on inflammation and fibrosis, which were detected by a genetic test, which suggests that the result is very similar to the clinical results (Fig. 10).
Asimismo, en el modelo de ratón de la presente invención, la inflamación del tejido adiposo también se induce al mismo tiempo y esto potencia la resistencia a la insulina. La hiperglucemia crónica persistente resultante causa microangiopatía y, como tal, conduce a complicaciones diabéticas (nefropatía diabética, retinopatía y neuropatía). Después, se estudiaron con detalle lesiones patológicas en otros órganos. Como resultado, a las diez semanas, se observó fibrosis glomerular e intersticial, que se caracterizaba por la acumulación de macrófagos inflamatorios y fibroblastos dentro y alrededor de los glomérulos renales, y por tanto, los animales desarrollaron nefropatía diabética (Fig. 11). Asimismo, a las 20 semanas de vida, utilizando un anticuerpo CD31, se evaluó la neovascularización en los ojos. En los ratones modelo de la presente invención, se observó hiperplasia sanguínea neovascular en la retina, lo que sugería que los ratones desarrollaban retinopatía diabética (Fig. 11).Also, in the mouse model of the present invention, inflammation of adipose tissue is also induced at the same time and this enhances insulin resistance. The resulting persistent chronic hyperglycemia causes microangiopathy and, as such, leads to diabetic complications (diabetic nephropathy, retinopathy and neuropathy). Then, pathological lesions in other organs were studied in detail. As a result, at ten weeks, glomerular and interstitial fibrosis was observed, which was characterized by the accumulation of inflammatory macrophages and fibroblasts in and around the renal glomeruli, and therefore, the animals developed diabetic nephropathy (Fig. 11). Also, at 20 weeks of age, using a CD31 antibody, neovascularization in the eyes was evaluated. In the model mice of the present invention, neovascular blood hyperplasia was observed in the retina, suggesting that the mice developed diabetic retinopathy (Fig. 11).
Por tanto, la presente invención proporciona animales modelo de EHNA que desarrollan esteatosis hepática que conduce a cáncer de hígado. El uso de dichos animales modelo facilita el análisis de la patogenia y el estado patológico de la EHNA humana, y el desarrollo de técnicas y agentes para el tratamiento de la EHNA humana. Therefore, the present invention provides model animals of NASH that develop hepatic steatosis that leads to liver cancer. The use of such model animals facilitates the analysis of the pathogenesis and the pathological state of human NASH, and the development of techniques and agents for the treatment of human NASH.
Aplicabilidad industrialIndustrial applicability
Las causas de la acumulación de grasa en el hígado incluyen el alcoholismo, la obesidad, la diabetes, las anomalías del metabolismo de los lípidos, los agentes farmacéuticos y la desnutrición grave. Sin embargo, en líneas generales, las causas se clasifican como debidas o no al alcoholismo. La esteatosis hepática alcohólica conduce a hepatitis, fibrosis hepática y cirrosis hepática. Por ahora, se ha creído que la esteatosis hepática no alcohólica es un estado patológico que no progresa. Sin embargo, a finales de los 90, a medida que aumentaba la población obesa y se conocía el concepto de la enfermedad, se reveló que la esteatosis hepática no alcohólica era una enfermedad de alta incidencia junto con la hepatitis tipo C y la hepatitis alcohólica en Europa y en los Estados Unidos. Se informó que el estado patológico progresaba a cirrosis hepática y finalmente a cáncer de hígado, lo que generó interés por la enfermedad. En Japón, la población obesa con obesidad también está aumentando constantemente debido a la baja secreción de insulina predispuesta genéticamente y a las dietas occidentalizadas y falta de actividad física. En estas circunstancias, el número de pacientes diagnosticados con EHNA está aumentando y es por ello que existe una imperiosa necesidad de desarrollar y establecer métodos y agentes para tratar dicha enfermedad.The causes of fat accumulation in the liver include alcoholism, obesity, diabetes, lipid metabolism abnormalities, pharmaceutical agents and severe malnutrition. However, in general, the causes are classified as due or not due to alcoholism. Alcoholic liver steatosis leads to hepatitis, liver fibrosis and liver cirrhosis. For now, it has been believed that non-alcoholic liver steatosis is a pathological state that does not progress. However, in the late 1990s, as the obese population increased and the concept of the disease was known, it was revealed that nonalcoholic liver steatosis was a high incidence disease along with type C hepatitis and alcoholic hepatitis in Europe and in the United States. It was reported that the disease status progressed to liver cirrhosis and finally to liver cancer, which generated interest in the disease. In Japan, the obese population with obesity is also steadily increasing due to the low secretion of genetically predisposed insulin and westernized diets and lack of physical activity. In these circumstances, the number of patients diagnosed with NASH is increasing and that is why there is an urgent need to develop and establish methods and agents to treat this disease.
El modelo de la presente invención es muy similar al estado patológico de la EHNA humana en cuanto a progresión de la enfermedad, y puede utilizarse para determinar el estadio para analizar las fases de la resistencia a la insulina, esteatosis hepática, esteatohepatitis, fibrosis hepática y cirrosis hepática, dependiendo del sujeto que vaya a tratarse. Asimismo, buscando factores patógenos implicados en la progresión de cada fase, la presente invención también puede contribuir al desarrollo de métodos o agentes completamente nuevos para el tratamiento de la EHNA humana, fibrosis hepática y cirrosis hepática, así como biomarcadores para las enfermedades. Además, la presente invención es aplicable para evaluar la farmacocinética en lesiones por EHNA. Por otra parte, el modelo de la presente invención finalmente conduce a cáncer de hígado. Por tanto, la presente invención permite la detección de agentes supresores del cáncer o similares, la investigación del mecanismo de aparición del cáncer de hígado y de productos farmacéuticos que se dirijan a moléculas en el desarrollo del cáncer de hígado.The model of the present invention is very similar to the pathological state of human NASH in terms of disease progression, and can be used to determine the stage to analyze the phases of insulin resistance, liver steatosis, steatohepatitis, liver fibrosis and liver cirrhosis, depending on the subject to be treated. Also, by looking for pathogenic factors involved in the progression of each phase, the present invention can also contribute to the development of completely new methods or agents for the treatment of human NASH, liver fibrosis and liver cirrhosis, as well as biomarkers for diseases. In addition, the present invention is applicable to evaluate the pharmacokinetics in NASH lesions. On the other hand, the model of the present invention ultimately leads to liver cancer. Therefore, the present invention allows the detection of cancer suppressing agents or the like, the investigation of the mechanism of occurrence of liver cancer and pharmaceutical products that target molecules in the development of liver cancer.
Además de las enfermedades descritas anteriormente, también pueden analizarse al mismo tiempo trastornos diabéticos. Por tanto, se espera que la presente invención contribuya en gran medida a desarrollar métodos y agentes para enfermedades hepáticas, a aclarar las relaciones entre los estados patológicos sistémicos en un animal sujeto, así como a desarrollar métodos/agentes terapéuticos y biomarcadores. In addition to the diseases described above, diabetic disorders can also be analyzed at the same time. Therefore, the present invention is expected to contribute greatly to developing methods and agents for liver diseases, to clarifying the relationships between systemic pathological conditions in a subject animal, as well as to developing therapeutic / biomarker methods / agents.
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