ES2736126T3 - Anticuerpos ANTI-EGFRVIII y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo aislado y fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a EGFRvIII humana, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una combinación de secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos ANTI-EGFRVIII y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente a los mutantes de deleción del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, de sus siglas en inglés) humano, en particular, al mutante de deleción de clase III, EGFRvIII, y a los métodos terapéuticos y de diagnóstico para usar estos anticuerpos.
Antecedentes
La sobreexpresión y/o la amplificación génica del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF, de sus siglas en inglés), o EGFR, se han informado en múltiples tumores humanos, incluidos los de mama, ovario, vejiga, cerebro y varios carcinomas escamosos (Wong, A.J. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6899-6903; Harris et al., 1992, Natl. Cancer Inst. Monogr. 11:181-187). Sin embargo, el direccionamiento del EGFR como un método terapéutico antineoplásico ha sido problemático, ya que muchos tejidos normales también expresan este receptor y pueden ser dirigidos junto con las dianas neoplásicas. Mientras tanto, se ha informado de que muchos glioblastomas que tienen amplificación génica del EGFR con frecuencia contienen reordenamiento genético (Ekstrand, A.J. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4309-4313; Wong A.J. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2965-2969). En un estudio, se encontró que 17 de los 44 glioblastomas tenían una o más alteraciones en la secuencia de codificación del EGFR y todos estos casos contenían EGFR amplificado, mientras que ninguno de los 22 casos sin amplificación génica mostró ninguna anomalía de secuencia específica del tumor (Frederick, L. et al., 2000, Cancer Res 60:1383-1387). El mismo estudio también mostró que se pueden detectar múltiples tipos de mutaciones del EGFR en tumores individuales.
La variante de clase III del EGFR (EGFRvIII, de sus siglas en inglés) es la variante del EGFR encontrada con mayor frecuencia en el glioblastoma (Bigner et al., 1990, Cancer Res 50:8017-8022; Humphrey et al., 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:4207-4211; Yamazaki et al., 1990, Jap J Cancer Res 81:773-779; Ekstrand et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4309-4313; Wikstrand et al., 1995, Cancer Res 55:3140-3148; y Frederick et al., 2000, Cancer Res 60:1383-1387). La EGFRvIII se caracteriza por una eliminación de los exones 2-7 del gen EGFR, lo que da como resultado una eliminación en el marco de 801 pares de bases de la región de codificación, es decir, la eliminación de 6-273 restos de aminoácidos (basado en los números de restos del EGFR maduro), así como la generación de una nueva glicina en la unión de fusión (Humphrey et al., 1988, Cancer Res 48:2231-2238; Yamazaki et al., 1990, supra). Se ha demostrado que la EGFRvIll tiene una actividad cinasa débil pero constitutivamente activa, independiente del ligando, así como una tumorigenicidad mejorada (Nishikawa et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:7727-7731; y Batra et al., 1995, Cell Growth and Differentiation 6:1251-1259). Además de los gliomas, se ha detectado EGFRvIII en el carcinoma ductal e intraductal de mama (Wikstrand et al., 1995, Cancer Res 55: 3140-3148), carcinomas de pulmón de células no pequeñas (Garcia de Palazzo et al., 1993, Cancer Res 53:3217-3220), carcinomas de ovario (Moscatello et al., 1995, Cancer Res 55: 5536-5539), cáncer de próstata (Olapade-Olaopa et al., 2000, British J Cancer 82:186-194) y carcinoma de células escamosas de la cabeza y cuello (Tinhofer et al., 2011, Clin Cancer Res 17(15):5197-5204). Por el contrario, estos y otros estudios informan que los tejidos normales no expresan la EGFRvIII (Garcia de Palazzo et al., 1993, supra; Wikstrand et al., 1995, supra; y Wikstrand et al., 1998, J Neuro Virol 4:148-158). La naturaleza de la EGFRvIII altamente específica del tumor lo convierte en una diana especialmente útil para tratar los cánceres y tumores que expresan esta molécula.
Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del EGFR humano se muestran en las SEQ ID NO: 145 y 146, respectivamente, y la secuencia de aminoácidos de la EGFRvIII se muestra en la SEQ ID NO: 147. Los anticuerpos contra EGFRvIII se describen en, por ejemplo, los documentos US 5.212.290, US 7.736.644, US 7.589.180 y US 7.767.792. El documento WO 2009/067242 describe el anticuerpo 11F8 anti-EGFRvIII. El documento WO 2006/009694 describe el anticuerpo cetuximab anti-EGFRvIII. Freeman et al. (J. Clin. Oncol. 26 (Suplemento 15): 14536, 2008) describe panitumumab y cetuximab. El documento WO 2005/010151 describe la unión de anticuerpos anti-EGFRvIII dentro del péptido de unión. El documento US 2009/269343 describe anticuerpos que se unen a EGFR y anti-EGFRvIII. El documento WO 2010/096434 describe los anticuerpos AcM806, 528 y DH8.3 anti-EGFRvIII. Modjtahedi et al. (Int. J. Cancer 105(2): 273-280, 2003) describe el anticuerpo ICR62 anti-EGFR. Jiang et al. (J. Biol. Chem, 286(7): 5913-5920) describe el anticuerpo CH12 anti-EGFRvIII.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a la EGFRvIII humana, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una combinación de secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48. Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para dirigirse a células tumorales que expresan EGFRvIII. Los anticuerpos anti-EGFRvIII de la invención, y las porciones de unión a antígeno de los mismos, pueden usarse solos en forma no modificada, o pueden incluirse como parte de un conjugado anticuerpo-fármaco o un anticuerpo biespecífico.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención que se une específicamente a EGFRvIII y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo o fragmento del mismo puede ser un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo. En un aspecto relacionado, la invención proporciona una composición que es una combinación del anticuerpo anti-EGFRvIII y un segundo agente terapéutico. En una realización, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combine de forma ventajosa con un anticuerpo anti-EGFRvIII. La presente invención también proporciona conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC, de sus siglas en inglés) que comprenden el anticuerpo anti-EGFRvIII conjugado con un agente citotóxico. Las terapias de combinación, formulaciones conjuntas y ADC ejemplares que implican los anticuerpos anti-EGFRvIII de la presente invención se desvelan en otra parte en el presente documento.
En otro aspecto, la invención proporciona un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) para su uso en un método para tratar un cáncer, reducir el crecimiento del tumor y/o causar la regresión del tumor en un paciente, comprendiendo el ADC un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y una citotoxina, en donde (a) el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del ADC se une específicamente a EGFRvIII pero no se une al péptido de unión de la SEQ ID NO: 148 o al péptido de la SEQ ID NO: 165, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una combinación de secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de las SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48, y el método comprende administrar a un paciente que lo necesite el ADC; o (b) el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del ADC se une específicamente a EGFRvIII y también se une al péptido de unión de la SEQ ID NO: 148 y/o al péptido de la SEQ ID NO: 165, y el método comprende administrar a un paciente que lo necesite el ADC y un ADC adicional que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y una citotoxina, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del segundo ADC se une específicamente a EGFRvIII pero no se une al péptido de unión de la SEQ ID NO: 148 o al péptido de la SEQ ID NO: 165, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo del ADC adicional comprende una combinación de secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de las SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una parte de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv) y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
Los anticuerpos anti-EGFRvIII enumerados en las Tablas 1 y 2 en el presente documento se desvelan en el presente documento. La Tabla 1 expone los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (HCVR), las regiones variables de cadena ligera (LCVR), las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3), y las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de los anticuerpos anti-EGFRvIII ejemplares. La Tabla 2 expone los identificadores de secuencia de ácido nucleico de las HCVR, LCVR, HCDR1, Hc DR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los anticuerpos anti-EGFRvIII ejemplares.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1 emparejada con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1. Los fragmentos de unión a antígeno de los mismos se desvelan en el presente documento, comprendiendo un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-EGFRvIII ejemplares enumerados en la Tabla 1. En casos determinados, el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR se selecciona del grupo que consiste en: 2/20, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, y 130/138.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIlI se desvelan en el presente documento, comprendiendo una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % 0 al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3 y LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 emparejada con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1. En casos determinados, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-EGFRvIII ejemplares enumerados en la Tabla 1.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-EGFRvIII ejemplares enumerados en la Tabla 1. En determinados casos, el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en: 4-6-8-12-14-16; 20-22-24-28-30-32; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56­ 60-62-64; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94-96; 100-102-104-108-110-112; 116-118-120-124-126-128; y 132-134­ 136-140-142-144.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII se desvelan en el presente documento, comprendiendo un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas dentro de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se define mediante cualquiera de los anticuerpos anti-EGFRvIII ejemplares enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, se incluyen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a EGFRvIII, comprendiendo el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contenido dentro de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en: 18/26; 66/74; 274/282; 290/298; y 370/378. Los métodos y técnicas para identificar CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y se pueden usar para identificar CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas desveladas en el presente documento. Las convenciones ejemplares que se pueden usar para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un compendio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véanse, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). También están disponibles bases de datos públicas para identificar las secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-EGFRvIII o porciones de los mismos también se desvelan en el presente documento. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1 se desvelan en el presente documento; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1 se desvelan en el presente documento; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1 se desvelan en el presente documento; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1 se desvelan en el presente documento; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 se desvelan en el presente documento; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1 se desvelan en el presente documento; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1 se desvelan en el presente documento; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1 se desvelan en el presente documento; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR se desvelan en el presente documento, en donde la HCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3 es como se define mediante cualquiera de los anticuerpos anti-EGFRvIII ejemplares enumerados en la Tabla 1.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican una LCVR se desvelan en el presente documento, en donde la LCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, LCDR1-LCDR2-LCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de LCDR1-LCDR2-LCDR3 es como se define mediante cualquiera de los anticuerpos anti-EGFRvIII ejemplares enumerados en la Tabla 1.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR y una LCVR se desvelan en el presente documento, en donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, y en donde la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1. En casos determinados, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma, y una secuencia polinucleotídica seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma. En casos determinados, la molécula de ácido nucleico codifica una HCVR y una LCVR, en donde la HCVR y la LCVR proceden del mismo anticuerpo anti-EGFRvIII enumerado en la Tabla 1.
Los vectores de expresión recombinantes capaces de expresar un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-EGFRvIII se desvelan en el presente documento. Por ejemplo, la presente divulgación incluye vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR y/o CDR como se expone en la Tabla 1. También se incluyen dentro del alcance de la presente divulgación las células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como los métodos para producir los anticuerpos o porciones de los mismos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, y la recuperación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos así producidos.
La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFRvIII que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas realizaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación indeseables, o un anticuerpo que carezca de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede hacerse modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
Los métodos terapéuticos para destruir células tumorales o para inhibir o atenuar el crecimiento de células tumorales usando un anticuerpo anti-EGFRvIII o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo se desvelan en el presente documento. Los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo a un sujeto que lo necesite. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejore, mitigue, inhiba o prevenga mediante el direccionamiento de EGFRvIII y/o la inhibición de la señalización celular mediada por ligando a través de EGFRvIII.
Otras realizaciones se harán evidentes tras la revisión de la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra los resultados de la transferencia Western del EGFR y EGFRvIII utilizando anticuerpos anti-EGFRvIII [es decir, H1H1863N2(Fuc-), y Controles I y II en la Figura 1a; y H1H1911, H1H1912 y H1H1915 en la Figura 1b], o anticuerpo anti-His, en condiciones reducidas (paneles superiores) y no reducidas (paneles inferiores). Carriles 1 y 6: 10 pl del modelo BENCHMARK™ (INVITROGEN™); Carriles 2 y 7: 400 ng de hEGFR-mmh (SEQ ID NO: 154); Carriles 3 y 8: 400 ng de hEGFRvIII-mmh (SEQ ID NO: 152); y Carriles 4, 5, 9 y 10: espaciador. Control I: Anticuerpo peptídico de unión anti-EGFRvIII humana (IgG1) desvelado en la Patente de Estados Unidos N.° 7.736.644; y Control II: Anticuerpo quimérico anti-EGFRvIII/EGFR desvelado en la Patente de Estados Unidos N.° 7.589.180.
La Figura 2 muestra las características de unión de H1H1863N2(Fuc-). El péptido de unión EGFRvIII o el péptido de los restos 311-326 de EGFR ("péptido EGFR311-326"), cada uno de los cuales se marcó mediante un enlazador con biotina en el extremo C, se capturó en puntas de OCTET® recubiertas con estreptavidina en un instrumento FORTEBIO® OCTET® RED y reaccionó con H1H1863N2(Fuc-) o Control I-III. Controles I y II: Lo mismo que arriba; y Control III: Anticuerpo anti-EGFRvIII humanizado (hIgG1) desvelado en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2010/0056762. (□): Péptido de unión EGFRvIII marcado con biotina en el extremo C (SEQ ID NO: 149); y (■): Péptido de unión e Gf R311-326 marcado con biotina en el extremo C (SEQ ID NO: 151).
La Figura 3 muestra la internización del AcM anti-EGFRvIII por células HEK293 que expresan EGFRvIII (HEK293/EGFRvIII). Los anticuerpos anti-EGFRvIII unidos a la superficie celular y los anticuerpos de control se detectaron mediante un anticuerpo secundario conjugado con colorante (Fab); se adquirieron imágenes a 40x y se cuantificaron vesículas internizadas. Controles I y II: Lo mismo que arriba; y Control IV: Anticuerpo quimérico anti-EGFR desvelado en la Patente de Estados Unidos N.° 7.060.808. (□): Internización a 37 °C; y (■): Internización a 4 °C.
La Figura 4 muestra la unión e internización del anticuerpo H1H1863N2(Fuc-) anti-EGFRvIII por tumores B16F10.9 o tumores B16F10.9 que expresan EGFRvIII (B16F10.9/EGFRvIII) que se xenoinjertaron en ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID, de sus siglas en inglés). El anticuerpo anti-EGFRvIII o anticuerpo de control de isotipo unido a la superficie celular (Figura 4a) o unido a la superficie celular más internizado (Figura 4b), se detectó mediante un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con aloficocianina (hFc-APC) usando citometría de flujo. Se muestran las intensidades medias de fluorescencia (MIF) a los 10 minutos (□), 4 horas ( 0 l) y 24 horas (■), después de la inyección del anticuerpo.
La Figura 5 muestra los resultados del análisis farmacocinético para el anticuerpo H1H863N2(Fuc+) anti-EGFRvIII (Fig. 5d) y los anticuerpos de control (como se describió anteriormente), es decir, Control I (Fig. 5b), Control III (Fig. 5c) y Control IV (Fig. 5a), en ratones de tipo silvestre (•) o ratones que expresan EGFR humano (■).
Descripción detallada
Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la materia a la cual pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar del valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
Definiciones
El término "EGFRvIII", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la variante de clase III del EGFR humano que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 147, o un fragmento biológicamente activo de la misma, que exhibe cualquier característica específica para EGFRvIII, en oposición a aquellas en común con el EGFR normalmente expresado, a menos que se indique específicamente lo contrario. La EGFRvIII carece de los restos de aminoácidos 6 a 273 del EGFR maduro (es decir, la SEQ ID NO: 146 sin el péptido señal, es decir, los restos 1-24) y contiene un nuevo resto de glicina en la posición 6 entre los restos de aminoácidos 5 y 274.
Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteínas en el presente documento pretenden referirse a la versión humana de la respectiva proteína, polipéptido o fragmento de proteína, a menos que se especifique explícitamente que son de una especie no humana. Por lo tanto, la expresión "EGFRvIII" significa EGFRvIII humana a menos que se especifique que sea de una especie no humana, por ejemplo, "EGFRvIII de ratón", "EGFRvIII de mono", etc.
Como se usa en el presente documento, la expresión "EGFRvIII expresada en la superficie celular" significa una o más proteínas EGFRvIII, o el dominio extracelular de las mismas, que se expresa en la superficie de una célula in vitro o in vivo, de modo que al menos una porción de una proteína EGFRvIII se expone al lado extracelular de la membrana celular y es accesible a una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. Una "EGFRvIII expresada en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína EGFRvIII expresada en la superficie de una célula que normalmente expresa la proteína EGFRvIII. Como alternativa, "EGFRvIII expresada en la superficie celular" puede comprender o consistir en la proteína EGFRvIII expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa EGFRvIII humana en su superficie pero se ha modificado genéticamente de forma artificial para expresar EGFRvIII en su superficie.
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo anti-EGFRvIII" incluye tanto anticuerpos monovalentes con una especificidad única, como anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer brazo que se une a EGFRvIII y un segundo brazo que se une a un segundo antígeno (diana), en donde el brazo anti-EGFRvIII comprende cualquiera de las secuencias de HCVR/LCVR o CDR como se exponen en la Tabla 1 en el presente documento. La expresión "anticuerpo anti-EGFRvIII" también incluye conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) que comprenden un anticuerpo anti-EGFRvIII o porción de unión a antígeno del mismo conjugada a un fármaco o toxina (es decir, un agente citotóxico). La expresión "anticuerpo anti-EGFRvIII" también incluye conjugados anticuerporadionúclido (ARC, de sus siglas en inglés) que comprenden un anticuerpo anti-EGFRvIII o porción de unión a antígeno del mismo conjugada a un radionúclido.
El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR, de sus siglas en inglés) que se une específicamente a o interacciona con un antígeno particular (por ejemplo, EGFRvIII). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, de sus siglas en inglés). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, Cd R3, FR4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-EGFRvIII (o porción de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse de forma natural o artificial. Una secuencia consenso de aminoácidos se puede definir basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.
El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se utiliza en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden proceder, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y opcionalmente constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente en, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas genomanipuladas, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de CDR injertada, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (p. ej., nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP, de sus siglas en inglés) y dominios IgNAR variables de tiburón, también están abarcados dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno," como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprenderá normalmente al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones no limitativas, a modo de ejemplo, de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-CH3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ejemplares enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra completa o parcial o enlazadora. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que producen una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en los que cada dominio variable puede unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ejemplares divulgados en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.
Los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). "Citotoxicidad dependiente de complemento" (CDC) se refiere a lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células, en que células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de ese modo da lugar a la lisis de la célula diana. La CDC y la ADCC pueden medirse usando ensayos que son bien conocidos y están disponibles en la técnica. (Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.500.362 y 5.821.337 y Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.
En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-EGFRvIII de la invención son anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en que las secuencias CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
Los anticuerpos de la invención pueden, en algunas realizaciones, ser anticuerpos humanos recombinantes. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se han preparado, expresado, creado o aislado por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (descrito más adelante con más detalle), anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante de anticuerpos humanos combinatorios (descritos más adelante), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que están asociadas con heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos por un enlace disulfuro intercatenario de cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta de una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.
La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta se debe a, pero sin limitación, diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles normalmente observados usando una bisagra de IgG1 humana. La presente invención incluye anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, Ch2 o Ch3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Los anticuerpos de la invención son anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o retirado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en la que existe de forma natural o se produce de forma natural el anticuerpo, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.
Los anticuerpos anti-EGFRvIII develados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que procedían los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden averiguarse fácilmente mediante la comparación de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. Los anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se obtienen a partir de cualquiera de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento, en las que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácido conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se mencionan en el presente documento colectivamente como "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la técnica, partiendo con las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones de la línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En casos determinados, todos los restos marco y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl mutan de vuelta a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal humana de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros casos, únicamente determinados restos mutan de vuelta a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros casos, uno o más de los restos marco y/o CDR se mutan al resto o restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo originalmente el anticuerpo). Además, los anticuerpos pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en las que determinados restos individuales están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden ensayarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, mejor especificidad de unión, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según pueda ser el caso), menor inmunogenicidad, etc. Dentro de la presente divulgación se incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general.
La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-EGFRvIII que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR desveladas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-EGFRvIII que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones de aminoácidos conservativas relativas a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR expuestas en la Tabla 1 en el presente documento.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por yuxtaposición espacial de aminoácidos de diferentes segmentos de cadena de polipéptido lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 95 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, medida por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencias, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tenga la misma, o sustancialmente similar, secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco por defecto, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 desvelada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se menciona como identidad de secuencia, se mide normalmente usando un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas acopla secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
Unión dependiente de pH
La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFRvIII con características de unión dependientes de pH. Por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFRvIII de la presente invención puede exhibir una unión reducida a EGFRvIII a pH ácido en comparación con pH neutro. Como alternativa, los anticuerpos anti-EGFRvIII de la invención pueden exhibir una unión mejorada a EGFRvIII a pH ácido en comparación con pH neutro. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH inferiores a aproximadamente 6,2, por ejemplo, aproximadamente 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0, o menos. Como se usa en el presente documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7,4.
En determinados casos, la "unión reducida a EGFRvIII a pH ácido en comparación con el pH neutro" se expresa en términos de una relación del valor Kd de la unión del anticuerpo a EGFRvIII a pH ácido al valor Kd de la unión del anticuerpo a EGFRvIII a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede considerarse que exhibe "unión reducida a EGFRvIII a pH ácido en comparación con pH neutro" para los fines de la presente invención si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo exhibe una relación Kd ácida/neutra de aproximadamente 3,0 o mayor. En determinadas realizaciones ilustrativas, la relación Kd ácida/neutra para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención puede ser aproximadamente 3,0, 3,5, 4.0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20.0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 o mayor.
Los anticuerpos con características de unión dependientes de pH pueden obtenerse, por ejemplo, mediante la selección de una población de anticuerpos para determinar la unión reducida (o mejorada) a un antígeno particular a pH ácido en comparación con el pH neutro. Además, las modificaciones del dominio de unión a antígeno en el nivel de aminoácidos pueden producir anticuerpos con características dependientes de pH. Por ejemplo, mediante la sustitución de uno o más aminoácidos de un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, dentro de una CDR) con un resto de histidina, se puede obtener un anticuerpo con unión a antígeno reducida a pH ácido en relación con pH neutro.
Anticuerpos anti-EGFRvIII que comprenden variantes Fc
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-EGFRvIII que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-EGFRvIII que comprenden una mutación en la región Ch2 o Ch3 del dominio Fc, en donde la mutación(es) aumenta la afinidad del dominio Fc a FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento en la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitativos de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, l/y /F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/I/r /s /P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, A, W, H, F o Y [N434A, N434W, N434H, N434F o N434Y]); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F), y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 259I (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y una modificación 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T, y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P). En otra realización más, la modificación comprende una modificación 265A (por ejemplo, D265A) y/o 297A (por ejemplo, N297A).
Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-EGFRvIII que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); 257I y 3111 (por ejemplo, P257I y Q3111); 257I y 434H (por ejemplo, P257I y N434H); 376V y 434H (por ejemplo, D376V y N434H); 307A, 380A y 434A (por ejemplo, T307A, E380A y N434A); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las combinaciones posibles de las anteriores mutaciones del dominio Fc, y otras mutaciones dentro de los dominios variables de anticuerpos desveladas en el presente documento, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFRvIII que comprenden una región constante (Ch) de cadena pesada quimérica, en donde la región CH quimérica comprende segmentos procedentes de las regiones CH de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden comprender una región Ch quimérica que comprende parte o la totalidad de un dominio Ch2 procedente de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, combinada con parte o la totalidad de un dominio Ch3 procedente de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región Ch quimérica que tiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de la "bisagra superior" (restos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU) procedente de una región bisagra de una IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana, combinada con una secuencia de "bisagra inferior' (restos de aminoácidos de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU) procedente de una región bisagra de una IgG 1 humana, una IgG2 humana o de IgG4 humana. De acuerdo con determinadas realizaciones, la región bisagra quimérica comprende restos de aminoácidos procedentes de una bisagra superior de una IgG1 humana o una IgG4 humana y restos de aminoácidos procedentes de una bisagra inferior de IgG2 humana. Un anticuerpo que comprende una región Ch quimérica como se describe en el presente documento puede, en determinadas realizaciones, exhibir funciones efectoras de Fc modificadas sin afectar adversamente las propiedades terapéuticas o farmacocinéticas del anticuerpo. (Véase, por ejemplo, el documento WO 2014/022540, presentado el 31 de julio de 2013).
Conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC)
La presente invención proporciona conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) que comprenden un anticuerpo anti-EGFRvIII o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado a una fracción terapéutica tal como un agente citotóxico, un fármaco quimioterapéutico o un radioisótopo.
Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para el crecimiento, viabilidad o propagación de las células. Los ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterapéuticos adecuados que pueden conjugarse con anticuerpos anti-EGFRvIII de acuerdo con este aspecto de la invención incluyen, por ejemplo, 1-(2cloroetil)-1,2-dimetanosulfonil hidrazida, 1,8-dihidroxibiciclo [7,3,1]trideca-4,9-dieno-2,6-diyno-13-ona, 1-deshidrotestosterona, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, 9-amino camptotecina, actinomicina D, amanitinas, aminopterina, anguidina, antraciclina, antramicina (AMC), auristatinas, bleomicina, busulfán, ácido butírico, calicheamicinas, camptotecina, carminomicinas, carmustina, cemadotinas, cisplatino, colchicina, combretastatinas, ciclofosfamida, citarabina, citocalasina B, dactinomicina, daunorrubicina, dacarbazina, diacetoxipentildoxorrubicina, dibromomanitol, dihidroxiantracindiona, disorazoles, dolastatina, doxorrubicina, duocarmicina, equinomicinas, eleuterobinas, emetina, epotilonas, esperamicina, estramustinas, bromuro de etidio, etopósido, fluorouracilos, geldanamicinas, gramicidina D, glucocorticoides, Irinotecán, leptomicinas, leurosinas, lidocaína, lomustina (CCNU), maitansinoides, mecloretamina, melfalán, mercatopurinas, metopterinas, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, N8-acetil espermidina, podofilotoxinas, procaína, propranolol, pteridinas, puromicina, pirrolobenzodiazepinas (PDB), rizoxinas, estreptozotocina, talisomicinas, taxol, tenopósido, tetracaína, tioepa clorambucilo, tomaimicinas, topotecán, tubulisina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbinas, y derivados de cualquiera de los anteriores. De acuerdo con determinadas realizaciones, el agente citotóxico que se conjuga con un anticuerpo anti-EGFRvIII es un maitansinoide tal como DM1 o DM4, un derivado de tomaimicina o un derivado de dolastatina. Otros agentes citotóxicos conocidos en la técnica se contemplan dentro del alcance de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, toxinas proteicas tales como la ricina, toxina de C. difficile, exotoxina de pseudomonas, ricina, toxina diftérica, toxina botulínica, briodina, saporina, toxinas de hierba carmín (es decir, fitolaccatoxina y fitolaccigenina), y otras tales como las expuestas en Sapra et al., Pharmacol. & Therapeutics, 2013, 138:452-469.
La presente invención también incluye conjugados de anticuerpo-radionúclido (ARC) que comprenden anticuerpos anti-EGFRvIII conjugados a uno o más radionúclidos. Los radionúclidos ejemplares que se pueden usar en el contexto de este aspecto de la invención incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, 225Ac, 212Bi, 213Bi, 131I, 186Re, 227Th, 222Rn, 223Ra, 224Ra, y 90Y.
En determinadas realizaciones de la presente invención, se proporcionan ADC que comprenden un anticuerpo anti-EGFRvIlI conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, cualquiera de los agentes citotóxicos desvelados anteriormente) a través de una molécula enlazadora. Se puede usar cualquier molécula enlazadora o tecnología enlazadora conocida en la técnica para crear o construir un ADC de la presente invención. En determinadas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. De acuerdo con otras realizaciones, el enlazador es un enlazador no escindible. Los enlazadores ejemplares que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, enlazadores que comprenden o consisten en,por ejemplo, MC (6-maleimidocaproilo), MP (maleimidopropanoilo), val-cit (valina-citrulina), val-ala (valina-alanina), sitio dipeptídico en el enlazador escindible por proteasa, ala-phe (alanina-fenilalanina), sitio dipeptídico en el enlazador escindible por proteasa, PAB (paminobenziloxicarbonilo), SPP (4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo), SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 carboxilato de N-succinimidilo, SIAB ((4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo), y variantes y combinaciones de los mismos. Se desvelan ejemplos adicionales de enlazadores que pueden usarse en el contexto de la presente invención, por ejemplo, en el documento US 7.754.681 y en Ducry, Bioconjugate Chem., 2010, 21:5-13, y las referencias allí citadas.
La presente invención comprende ADC en los que un enlazador conecta un anticuerpo anti-EGFRvIII o una molécula de unión a antígeno a un fármaco o citotoxina a través de una unión a un aminoácido particular dentro del anticuerpo o molécula de unión a antígeno. Ejemplos de uniones de aminoácidos que se pueden usar en el contexto de este aspecto de la invención incluyen, por ejemplo, lisina (véase, por ejemplo, el documento US 5.208.020; el documento u S 2010/0129314; Hollander et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; el documento WO 2005/089808; el documento US 5.714.586; el documento US 2013/0101546; y el documento US 2012/0585592), cisteína (véase, por ejemplo, el documento US 2007/0258987; el documento W o 2013/055993; el documento WO 2013/055990; el documento WO 2013/053873; el documento WO 2013/053872; el documento WO 2011/130598; el documento US 2013/0101546; y el documento US 7.750.116), selenocisteína (véase, por ejemplo, el documento WO 2008/122039; y Hofer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105:12451-12456), formilglicina (véase, por ejemplo,, Carrico et al., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110:46-51, y Rabuka et al., Nat. Protocols, 2012, 10:1052-1067), aminoácidos no naturales (véase, por ejemplo, los documentos WO 2013/068874 y WO 2012/166559), y aminoácidos ácidos (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/05982). Los enlazadores también pueden conjugarse con una proteína de unión a antígeno mediante la unión a carbohidratos (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0305497, y Ryan et al., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13:127-130) y enlazadores disulfuro (véase, por ejemplo, el documento WO 2013/085925, el documento WO 2010/010324, el documento WO 2011/018611, y Shaunak et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313).
Cualquier método conocido en la técnica para conjugar una fracción química con un péptido, polipéptido u otra macromolécula se puede usar en el contexto de la presente invención para elaborar un ADC anti-EGFRvIII como se describe en el presente documento. Un método ejemplar para la conjugación de anticuerpo-fármaco a través de un enlazador se expone en el Ejemplo 12 en el presente documento. Los expertos en la materia apreciarán las variaciones en este método ejemplar y se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
De acuerdo con determinadas realizaciones, la presente invención proporciona ADC, en donde el anticuerpo anti-EGFRvIII (por ejemplo, el anticuerpo designado H1H1863N2) se conjuga con una composición de fármaco-enlazador como se expone en el documento WO2014/145090 (por ejemplo, el compuesto "7", también denominado en el presente documento "M0026") (véase también el Ejemplo 12, en el presente documento).
Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas
El epítopo al que se unen los anticuerpos descritos en el presente documento puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos de una proteína EGFRvIII. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) de EGFRvIII. En algunos casos, el epítopo se ubica en o cerca del dominio de unión a ligando de EGFRvIII. En otros casos, el epítopo se ubica fuera del dominio de unión a ligando de EGFRvIII, por ejemplo, en una ubicación en la superficie de EGFRvIII en la que un anticuerpo, cuando se une a dicho epítopo, no interfiere con la unión del ligando a EGFRvIII.
La presente invención, de acuerdo con determinadas realizaciones, se refiere a anticuerpos anti-EGFRvIII que se unen específicamente a EGFRvIII (y no se unen a EGFR), en donde los anticuerpos reconocen el péptido de unión EGFRvIII (por ejemplo, SEQ ID NO: 148). Dichos anticuerpos pueden denominarse en el presente documento "aglutinantes de péptidos de unión", "anticuerpos de unión a péptidos EGFRvIII", y similares. La presente invención, de acuerdo con otras realizaciones, se refiere a anticuerpos anti-EGFRvIII que se unen específicamente a EGFRvIII (y no se unen a EGFR), en donde los anticuerpos no reconocen el péptido de unión EGFRvIII (por ejemplo, no reconocen el péptido de unión de la SEQ ID NO: 148, y/o no reconocen el péptido de la SEQ ID NO: 165). Dichos anticuerpos pueden denominarse en el presente documento "aglutinantes conformacionales", "aglutinantes conformacionales de epítopos EGFRvIII" y similares.
Pueden usarse diversas técnicas conocidas para los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interacciona con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas ejemplares incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de barrido con alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), y análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interacciona un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos excepto los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interacciona el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.
T En el presente documento se desvelan anticuerpos anti-EGFRvIII que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos específicos ejemplares descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se exponen en la Tabla 1 del presente documento). En el presente documento también se desvelan anticuerpos anti-EGFRvIII que compiten por la unión a EGFRvIII con cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se exponen en la Tabla 1 del presente documento).
Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-EGFRvIII de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica y ejemplificados en el presente documento. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-EGFRvIII de referencia, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína EGFRvIII. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo de unirse a la molécula EGFRvIII. Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a EGFRvIII después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-EGFRvIII de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-EGFRvIII de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula EGFRvIII después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-EGFRvIII de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo anti-EGFRvIII de referencia. Entonces puede realizarse experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada.
Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica. En algunos casos, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o a epítopos solapantes) si, por ejemplo, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso un 99 %, medida en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Como alternativa, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión (o compite de forma cruzada por la unión) con un anticuerpo anti-EGFRvIII de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína EGFRvIII en condiciones de saturación seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula EGFRvIII. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula EGFRvIII en condiciones de saturación seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula EGFRvIII. Si, en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (de saturación) puede unirse a la molécula EGFRvIII, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a EGFRvIII. Como apreciará un experto en la materia, es posible que un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia no se una necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Preparación de anticuerpos humanos
Los anticuerpos anti-EGFRvIII de la invención pueden ser anticuerpos completamente humanos. Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos son conocidos en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a EGFRvIII humana.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE™, por ejemplo, o cualquier otro método conocido similar para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra EGFRvIlI se aíslan inicialmente teniendo una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, entre las que se incluyen la afinidad, la actividad de bloqueo del ligando, la selectividad, el epítopo, etc. Si es necesario, las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada, para generar un anticuerpo anti-EGFRvIII completamente humano. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable. En determinados casos, los anticuerpos anti-EGFRvIII completamente humanos se aíslan directamente de los linfocitos B positivos para el antígeno.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-EGFRvIII y fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse a EGFRvIII humana. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-EGFRvIII de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia desvelada, pero que codifican un anticuerpo anti-EGFRvIII o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-EGFRvIII o fragmento de anticuerpo de la divulgación. Anteriormente se han analizado ejemplos de dichas secuencias variantes de aminoácido y ADN.
Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su tasa de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en los que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-EGFRvIII de la divulgación pueden construirse, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o eliminando restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse con otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo anti-EGFRvIII que comprenden cambios de aminoácido que modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.
Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie
La presente invención, de acuerdo con determinadas realizaciones, proporciona anticuerpos anti-EGFRvIII se unen a EGFRvIII humana, pero no a EGFRvIII de otras especies. La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFRvIII que se unen a EGFRvIII humana y a EGFRvIII de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-EGFRvIlI de la invención pueden unirse a EGFRvIlI humana y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más EGFRvIII de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero, tití, macaco de la India o chimpancé. De acuerdo con determinadas realizaciones ejemplares de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-EGFRvIII que se unen específicamente a EGFRvIII humana y EGFRvIII de macaco cangrejero (por ejemplo, Macaca fascicularis). Otros anticuerpos anti-EGFRvIII de la invención se unen a EGFRvIII humana, pero no se unen, o se unen solo débilmente, a EGFRvIII de macaco cangrejero.
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-EGFRvIII de la presente invención pueden unirse a o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.
La presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de una inmunoglobulina se une a EGFRvIII humana, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un segundo antígeno. En determinadas realizaciones, el brazo de unión a EGFRvIII se une a EGFRvIII humana y bloquea la unión del ligando a EGFRvIII. En otras realizaciones, el brazo de unión a EGFRvIII se une a EGFRvIII humana pero no bloquea la unión del ligando a EGFRvIII.
Un formato de anticuerpo biespecífico ejemplar que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en el que el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en el que al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Dentro del alcance de la presente invención se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Otros formatos biespecíficos ejemplares que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o diacuerpos, fusiones IgG-scFv, dominio variable dual (DVD) -Ig, Cuadroma, pomos en agujeros, cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con pomos en agujeros, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duobody, IgG1/IgG2, formatos biespecíficos Fab (DAF)-IgG y Mab2 de doble acción (véase, por ejemplo, Klein et al. 2012, AcM 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el presente documento, para una revisión de los formatos anteriores). Los anticuerpos biespecíficos también se pueden construir utilizando la conjugación péptido/ácido nucleico, por ejemplo, en donde aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal se usan para generar conjugados de oligonucleótidosanticuerpos específicos del sitio que luego se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de diciembre de 2012]).
Formulación terapéutica y administración
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-EGFRvIII o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una transferencia, administración, tolerancia y similares mejoradas. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también, Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y las dimensiones del paciente, la enfermedad diana, las condiciones, la vía de administración y similares. La dosis preferida se calcula normalmente de acuerdo con el peso corporal o el área superficial del cuerpo. En un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosificaciones eficaces y posologías para administrar anticuerpos anti-EGFRvIII pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente por evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Además, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res.
8:1351).
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y vías orales. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede suministrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto al administración subcutánea, un dispositivo de administración de pluma preparado tiene aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de administración de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración de pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de administración de pluma entonces puede reutilizarse. En un dispositivo de administración de pluma desechable, no hay un cartucho reemplazable. En cambio, el dispositivo de administración de pluma desechable viene prellenado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.
Numerosos dispositivos de administración de pluma y autoinyector reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianáolis, IN), n Ov OPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma b D™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.), y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, anteriormente citado; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede ubicarse en las proximidades de la diana de la composición, requiriendo por tanto solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pág. 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión por Langer, 1990, Science 249:1527-1533.
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos para el público. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal, descrita anteriormente, en un medio acuoso estéril o un medio oleoso convencionalmente usado para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleaginoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de semilla de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se introduce preferentemente en una ampolla apropiada.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
La presente invención incluye composiciones para su uso en un método para tratar un cáncer o tumor que expresa EGFRvIII. Los métodos pueden comprender administrar a un sujeto que lo necesite una composición terapéutica que comprende el anticuerpo anti-EGFRvIII de la invención o un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo anti-EGFRvIII de la invención. La composición terapéutica también puede comprender un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Los anticuerpos y ADC de la invención son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento, prevención y/o mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la expresión o actividad de EGFRvIII, o se pueden tratar mediante el bloqueo de la interacción entre EGFRvIII y un ligando de EGFR o la inhibición de otro modo de la actividad y/o señalización de EGFRvIII, y/o la promoción de la internización del receptor y/o la disminución del número de receptores en la superficie celular. Por ejemplo, los anticuerpos y ADC de la presente invención son útiles para el tratamiento de tumores que expresan EGFRvIII y/o que responden a la señalización mediada por ligando. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención también pueden usarse para tratar tumores primarios y/o metastásicos que surgen en el cerebro y las meninges, orofaringe, el árbol pulmonar y bronquial, el tracto gastrointestinal, el sistema reproductor masculino y femenino, el músculo, hueso, la piel y anejos cutáneos, el tejido conjuntivo, bazo, el sistema inmunitario, las células que forman la sangre y la médula ósea, el hígado y el sistema urinario, y órganos sensitivos especiales tales como el ojo. En determinadas realizaciones, los anticuerpos y ADC de la invención se usan para tratar uno o más de los siguientes cánceres: carcinoma de células renales, carcinoma de páncreas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (por ejemplo, cáncer gástrico con amplificación MET), mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer microcítico de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides, cáncer de mama o melanoma.
En el contexto de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-EGFRvIII puede administrarse como una monoterapia (es decir, como el único agente terapéutico) o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales (cuyos ejemplos se describen en otra parte en el presente documento).
De acuerdo con realizaciones específicas, la presente invención proporciona composiciones para su uso en un método para tratar un cáncer, reducir el crecimiento del tumor y/o causar la regresión del tumor en un paciente. Los métodos pueden comprender administrar a un paciente un primer conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) solo o en combinación con un segundo anticuerpo anti-EGFRvIII o ADC. El primer a Dc comprenderá normalmente un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo y una citotoxina, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del primer ADC se une específicamente a EGFRvIII pero no se une al péptido EGFRvIII de unión de la SEQ ID NO: 148 o al péptido de la s Eq ID NO: 165 (es decir, el primer ADC comprende un anticuerpo de unión a EGFRvIII conformacional). En realizaciones en las que se administra un segundo anticuerpo o ADC, el segundo anticuerpo o ADC normalmente comprenderá un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo y una citotoxina, en donde el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une específicamente a EGFRvIII y también se une al péptido EGFRvIII de unión de SEQ ID NO: 148 y/o al péptido de SEQ ID NO: 165 (es decir, el segundo anticuerpo o ADC comprende un anticuerpo de unión a péptido de unión EGFRvIII). Cuando se usan dos ADC anti-EGFRvIII separados en el contexto de este aspecto de la invención, ambos ADC pueden, en determinadas realizaciones, comprender el mismo agente citotóxico o la misma clase de agente citotóxico. En otras realizaciones en las que se usan dos ADC anti-EGFRvIII separados, cada ADC puede comprender un agente citotóxico diferente y/o una clase diferente de agente citotóxico. Las realizaciones ejemplares no limitativas de este aspecto de la invención se exponen en el presente documento en el Ejemplo 14. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del primer ADC (es decir, el anticuerpo de unión a EGFRvIII conformacional) comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 36, 38, 40, 44, 46 y 48, o la región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 42.
Terapias combinadas y formulaciones
La presente invención incluye composiciones y formulaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-EGFRvIII de la invención en combinación con uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales, y métodos de tratamiento que comprenden administrar dichas combinaciones a sujetos que lo necesiten.
Los anticuerpos anti-EGFRvIlI de la presente invención se pueden formular conjuntamente con y/o administrar en combinación con uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales seleccionados del grupo que consiste en: un antagonista de PRLR (por ejemplo, un anticuerpo anti-PRLR o inhibidor de molécula pequeña de PRLR), un antagonista de EGFR (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR [por ejemplo, cetuximab o panitumumab] o inhibidor de molécula pequeña de EGFR [por ejemplo, gefitinib o erlotinib]), un antagonista de otro miembro de la familia EGFR tal como Her2/ErbB2, ErbB3 o ErbB4 (por ejemplo, anti-ErbB2 [por ejemplo, trastuzumab o T-DM1 {KADCYLA®}], anticuerpo anti-ErbB3 o anti-ErbB4 o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de ErbB2, ErbB3 o ErbB4), un antagonista de cMET (por ejemplo, un anticuerpo anti-cMET), un antagonista de IGF1R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF1R), un inhibidor de B-raf (por ejemplo, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibidor de PDGFR-a (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-a), un inhibidor de PDGFR-p (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-p o inhibidor de cinasa de molécula pequeña tal como, por ejemplo, mesilato de imatinib o malato de sunitinib), un inhibidor del ligando de PDGF (por ejemplo, anticuerpo anti-PDGF-A, -B, -C o -D, aptámero, ARNip, etc.), un antagonista de VEGF (por ejemplo, un VEGF-T rap tal como aflibercept, véase, por ejemplo, el documento US 7087411 (también mencionado en el presente documento como "proteína de fusión inhibidora de VEGF"), anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor de cinasa de molécula pequeña del receptor de VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib)), un antagonista de DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL4 desvelado en el documento US 2009/0142354 como REGN421), un antagonista de Ang2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang2 desvelado en el documento US 2011/0027286 como H1H685P), un antagonista de Fo LH1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-FOLH1), un antagonista de STEAP1 o STEAP2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-STEAP1 o un anticuerpo anti-STEAP2), un antagonista de TMPRSS2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-TMPRSS2), un antagonista de MSLN (por ejemplo, un anticuerpo anti-MSLN), un antagonista de CA9 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CA9), un antagonista de uroplakin (por ejemplo, un anti-uroplakin [por ejemplo, anticuerpo anti-UPK3A]), un antagonista de MUC16 (por ejemplo, un anticuerpo anti-MUC16), un antagonista de antígeno Tn (por ejemplo, un anticuerpo anti-Tn), un antagonista de CLEC12A (por ejemplo, un anticuerpo anti-CLEC12A), un antagonista de TNFRSF17 (por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFRSF17), un antagonista de LGR5 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LGR5), un antagonista de CD20 monovalente (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 monovalente tal como rituximab), un anticuerpo PD-1, un anticuerpo PD-L1, un anticuerpo CD3, un anticuerpo CTLA-4, etc. Otros agentes que pueden administrarse beneficiosamente en combinación con las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, inhibidores de la aromatasa, y los inhibidores de citocinas, incluyendo inhibidores de citocina de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 o a sus receptores respectivos.
La presente invención incluye composiciones y formulaciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-EGFRvIII descritos en la invención en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (Cytoxan™); alquilsulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clorofazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como las aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK™; razoxana; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (Taxotere™; Aventis Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos que incluyen tamoxifeno, raloxifeno, inhibidores de la aromatasa 4(5)-imidazoles, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores.
Los anticuerpos anti-EGFRvIII de la invención también pueden administrarse y/o formularse conjuntamente en combinación con antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticoesteroides, esteroides, oxígeno, antioxidantes, inhibidores de COX, cardioprotectores, quelatos metálicos, IFN-gamma y/o AINE.
El o los componentes terapéuticamente activos adicionales, por ejemplo, cualquiera de los agentes enumerados anteriormente o derivados de los mismos, pueden administrarse justo antes de, simultáneamente con o poco después de la administración de un anticuerpo anti-EGFRvIII de la presente invención; (para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-EGFRvIII "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional). La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en las que un anticuerpo anti-EGFRvIII de la presente invención se formula conjuntamente con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte en el presente documento.
Regímenes de administración
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo anti-EGFRvIII (o una composición farmacéutica que comprende una combinación de un anticuerpo anti-EGFRvIII y cualquiera de los agentes terapéuticamente activos adicionales mencionados en el presente documento) puede administrarse en dosis múltiples a un sujeto durante un período de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo anti-EGFRvIII de la invención. Como se usa en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de anticuerpo anti-EGFRvIII se administra al sujeto en un diferente punto en el tiempo, por ejemplo, en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una única dosis inicial de un anticuerpo anti-EGFRvIII, seguida por una o más dosis secundarias del anticuerpo anti-EGFRvIII, y opcionalmente seguidas por una o más dosis terciarias del anticuerpo anti-EGFRvIII.
Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración del anticuerpo anti-EGFRvIII de la invención. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también mencionada como la "dosis basal"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis iniciales, secundarias y terciarias pueden contener la misma cantidad de anticuerpo anti-EGFRvIII, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de anticuerpo anti-EGFRvIII contenida en la dosis inicial, secundaria y/o terciaria varía entre sí (por ejemplo, ajustada hacia arriba o hacia abajo según sea apropiado) durante el curso del tratamiento. En determinadas realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis se administran al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").
En determinadas realizaciones ejemplares de la presente invención, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 41/ 2, 5, 51/ 2, 6, 61/ 2, 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 9 / , 10, 101/ 2, 11, 111/ 2, 12, 121/ 2, 13, 131/ 2, 14, 14 /, 15, 15 /, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21 ,21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se utiliza en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de anticuerpo anti-EGFRvIII que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.
Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención pueden comprender administrar a un paciente cualquier cantidad de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo anti-EGFRvIII. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se administra únicamente una sola dosis secundaria al paciente. En otras realizaciones, se administran al paciente dos o más dosis secundarias (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más). Asimismo, en determinadas realizaciones, se administra únicamente una sola dosis terciaria al paciente. En otras realizaciones, se administran al paciente dos o más dosis terciarias (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más). El régimen de administración puede llevarse a cabo indefinidamente a lo largo de la vida de un sujeto en particular, o hasta que dicho tratamiento ya no sea terapéuticamente necesario o ventajoso.
En realizaciones que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas o de 1 a 2 meses después de la dosis inmediatamente anterior. De forma similar, en realizaciones que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 12 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. En determinadas realizaciones de la invención, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el curso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarse durante el curso de tratamiento por un médico dependiendo de las necesidades del paciente individual después de examen clínico.
La presente invención incluye regímenes de administración en los que se administran de 2 a 6 dosis de carga a un paciente en una primera frecuencia de (por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, etc.), seguido de la administración de dos o más dosis de mantenimiento al paciente con menos frecuencia. Por ejemplo, de acuerdo con este aspecto de la invención, si las dosis de carga se administran con una frecuencia de una vez al mes, entonces las dosis de mantenimiento se pueden administrar al paciente una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, etc.
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-EGFRvIII de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir EGFRvIII, o células que expresan EGFRvIII, en una muestra, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFRvIII, o fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión aberrante (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) de EGFRvIII. Los ensayos de diagnóstico ejemplares para EGFRvIII pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-EGFRvIII de la invención, en donde el anticuerpo anti-EGFRvIII está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo anti-EGFRvIII no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; una fracción fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano rusticano o luciferasa. Los ensayos ejemplares específicos que pueden usarse para detectar o medir EGFRvIII en una muestra incluyen ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Las muestras que pueden usarse en ensayos de diagnóstico de EGFRvIII de acuerdo con la presente divulgación incluyen cualquier tejido o muestra de fluido que se puede obtener de un paciente que contiene cantidades detectables de proteína EGFRvIII o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, se medirán los niveles de EGFRvIII en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por una enfermedad o afección asociada con niveles o actividad de EGFRvIII anómalos) para establecer inicialmente un nivel de referencia, o patrón, de EGFRvIII. Este nivel de referencia de EGFRvIII después puede compararse con los niveles de EGFRvIII medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen un trastorno o afección relacionado con EGFRvIII.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados, pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es o está cerca de la atmosférica.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos anti-EGFRvIII
Se obtuvieron anticuerpos anti-EGFRvIII mediante la inmunización de un ratón VELOCIMMUNE® (es decir, un ratón diseñado por ingeniería genética que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera kappa de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno que comprende el dominio extracelular de EGFRvIII. Los anticuerpos del primer conjunto incluyen los anticuerpos designados como H1H2194P, H1H2195P, H2M1863N2, H2M1911N, H2M1912N, H2M1915N, H2M1917N, H2M1918N y H3M1913N (como se muestra en las Tablas 1 y 2).
La respuesta inmunitaria de anticuerpo se controló por un inmunoensayo específico de EGFRvIII. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar líneas celulares que producían anticuerpos específicos para EGFRvIII. Usando esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-EGFRvIII(es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón). Además, varios anticuerpos anti-EGFRvIII completamente humanos se aislaron directamente de linfocitos B positivos para antígenos sin fusión a células de mieloma, como se describe en el documento US 2007/0280945A1.
Por separado, también se preparó H1H1863N2 con fucosilación reducida ["H1H1863N2(Fuc-)"] en una línea de células hospedadoras CHO que se describió como "8088" en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2010/0304436A1. En resumen, las secuencias de cadena ligera y cadena pesada de H1H1863N2 se clonaron en vectores de expresión. Dos millones de células 8088 se transfectaron con los plásmidos de cadena ligera y pesada, y el vector pR4004 que contiene el gen que codifica Cre. Las células transfectadas que sobrevivieron a la selección con 400 pg/ml de higromicina se adaptaron para crecer en suspensión en un medio sin suero y sin fucosa. Las células que expresaban la proteína fluorescente EGFP pero no DsRed o ECFP de las células transfectadas se aislaron mediante citometría de flujo. Las células clasificadas se sembraron en un matraz agitador a 4 x 105 células/ml y, tres días después, se recogió el medio de cultivo y la proteína del anticuerpo [es decir, H1H1863N2(Fuc-)] se purificó mediante cromatografía de Proteína A. El análisis de espectrometría de masas del H1H1863N2(Fuc-) resultante confirmó que la fucosa central se eliminó en relación con el anticuerpo original H1H1863N2(Fuc+). Las designaciones, "H1H1863N2" y "H1H1863N2(Fuc+)" en el presente documento, indican el anticuerpo original sin modificaciones de fucosilación.
Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-EGFRvIlI ejemplares generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos expuestos a continuación.
Ejemplo 2. Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera
La Tabla 1 expone los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las c Dr de anticuerpos anti-EGFRvIlI seleccionados. Los correspondientes identificadores de secuencia de ácido nucleico se exponen en la Tabla 2.
Tabla 1: Identificadores de secuencia de aminoácidos
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Tabla 2: Identificadores de secuencia de ácido nucleico
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Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo Fc (por ejemplo, "H1H", "H2M," "H3M," etc.), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "2194", "2195," "1863," etc.), seguido de un sufijo "P" o "N", como se muestra en las Tablas 1 y 2. Por lo tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento como, por ejemplo, "H1H2194N," "H2M1911N," "H3M1913N," etc. Los prefijos H1H, H2M y H3M en las designaciones de anticuerpos usadas en el presente documento indican el isotipo particular de la región Fc del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H1H" tiene un Fc de IgG1 humana, un anticuerpo "H2M" tiene un Fc de IgG2 de ratón, y un anticuerpo "H3M" tiene un Fc de IgG3 de ratón, (todas las regiones variables son completamente humanas como se indica por la primera "H" en la designación del anticuerpo). Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que tenga un isotipo Fc particular puede convertirse en un anticuerpo con un isotipo Fc diferente (por ejemplo, un anticuerpo con un Fc de IgG1 de ratón puede convertirse en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluidas las CDR), indicados por los identificadores numéricos mostrados en las Tablas 1 y 2, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.
Construcciones de control usadas en los siguientes Ejemplos
Se incluyeron construcciones de control en los siguientes experimentos con fines comparativos: Control I: Anticuerpo anti-EGFRvIII humana (IgG 1) con dominios variables de cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos correspondientes a las SEQ ID NO: 142 y 144, respectivamente, del anticuerpo "13.1.2" desvelado en la Patente de Estados Unidos N.° 7.736.644; Control II: Anticuerpo anti-EGFRvIII quimérico (hIgG1) con dominios variables de cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos correspondientes a las SEQ ID NO: 11 y 12, respectivamente, del anticuerpo "ch806" desvelado en la Patente de Estados Unidos N.° 7.589.180; Control III: Anticuerpo anti-EGFRvIII humanizado (hIgG 1) con dominios variables de cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos correspondientes a las SEQ ID NO: 42 y 47, respectivamente, del anticuerpo "hu806" desvelado en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2010/0056762; Control IV: un anticuerpo anti-EGFR quimérico con dominios variables de cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de los dominios correspondientes de "C225", como se expone en el documento US 7.060.808; y Control V: Anticuerpo anti-EGFRvIII humana (hIgG1) con dominios variables de cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos correspondientes a las SEQ ID NO: 2 y 19, respectivamente, del anticuerpo "131" de la Patente de Estados Unidos N.° 7.736.644 B2. Se sabe que el anticuerpo "13.1.2" es específico para el péptido de unión (SEQ ID NO: 148) de EGFRvIII; y se sabe que los anticuerpos "ch806" y "hu806" se unen a los restos 311-326 (SEQ ID NO: 165) de EGFR (SEQ ID NO: 146), que está amplificado o sobreexpresado, o los restos 44-59 de EGFRvIII (SEQ ID NO: 147).
Ejemplo 3. Determinación de la afinidad de unión de EGFRvIII
Las afinidades de unión y constantes cinéticas de anticuerpos anti-EGFRvIII monoclonales humanos se determinaron por resonancia de plasmón de superficie a 37 °C. Las mediciones se realizaron en un instrumento T100 BIACORE™. Los anticuerpos, expresados como Fc de IgG1 humana (es decir, designaciones "H1H"), se capturaron en una superficie del sensor de Fc antihumano (formato de captura de AcM), y las proteínas monoméricas [EGFR-mmh (SEQ ID NO: 154) y EGFRvIII-mmh (SEQ ID NO: 152)] o diméricas [EGFR-mFc (SEQ ID NO: 155) y EGFRvIII-mFc (SEQ ID NO: 153)] solubles se inyectaron sobre la superficie. En el formato captura de receptor, se capturó EGFRvIII-mFc o EGFR-mFc, en el chip BIACORE™ y los anticuerpos respectivos fluyeron. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron mediante el procesamiento y el ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) = kd/ka; y t1/2 (min) = In2/(60*kd).
Los resultados se presentan en las Tablas 3 y 4. SU = sin unión en las condiciones probadas; NP = no probado.
Tabla 3 Cinética de unión de los anticuer os Fc humanos
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continuación
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Tabla 4 Cinética de unión de los anticuer os Fc humanos
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continuación
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Como se muestra en las Tablas 3 y 4, varios anticuerpos mostraron selectividad por EGFRvIlI y no se unieron a EGFR de tipo silvestre en el formato de captura de AcM. En el formato de captura de receptor (Tabla 4), H1H863N2, H1H1915N y Control I mostraron la mayor selectividad.
Experimento 4: Especificidad de anticuerpos determinada por ELISA
Para caracterizar adicionalmente los AcM anti-hEGFRvIII, se examinó su especificidad de unión mediante ELISA. Las placas se recubrieron con uno de los siguientes: EGFR-mmh (SEQ ID NO: 154); EGFRvIII-mmh (SEQ ID NO: 152); y un péptido de unión (péptido J) (SEQ ID NO: 148). Para los péptidos de unión que se unieron a biotina en el extremo C (SEQ ID NO: 149) o en el extremo N (SEQ ID NO: 150) a través de un enlazador, las placas se recubrieron previamente con avidina. Además, se recubrió un péptido irrelevante (péptido de control) con o sin biotina en su extremo N. Se añadieron anticuerpos anti-EGFRvIII, así como un anticuerpo de control de isotipo, a las placas recubiertas y se dejaron incubar durante 1 hora a 25 °C. Luego, se lavaron las placas y se detectaron AcM anti-EGFRvIII unidos con anticuerpos anti-Fc humanos conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP). Las placas se desarrollaron con una solución de sustrato de tetra-metil-bencidina (TMB) para producir una reacción colorimétrica y se neutralizaron con ácido sulfúrico antes de leer la absorbancia a 450 nm en un lector de placas VICTOFR™ X5. El análisis de los datos usó un modelo de respuesta a dosis sigmoideo dentro del programa informático PRISM™. El valor de CE50 calculado, definido como el 50 % de la concentración de anticuerpo requerida para desarrollar la respuesta máxima, se usó como un indicador de la potencia de unión. Los resultados se muestran en la Tabla 5. NP: No probado. Controles I-III: Como se ha descrito anteriormente.
Tabla 5
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Los anticuerpos H1H1863N2, H1H1915 y Control I mostraron una fuerte unión a EGFRvIII pero no una unión (> 10 nM) a EGFR de tipo silvestre. Ninguno de los anticuerpos, excepto el Control I (que tiene las secuencias que corresponden a las secuencias de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo "13.1.2" procedente de ratones inmunizados con péptido de unión (Patente de Estados Unidos N.° 7.736.644), mostró unión a los péptidos de unión.
Ejemplo 5: Transferencia Western de EGFR y EGFRvIII utilizando anticuerpos anti-EGFRvIII
Uno de los anticuerpos, H1H1863N2, se probó para determinar sus características de unión con transferencias Western en condiciones tanto reducidas como no reducidas. EGFR-mmh (SEQ ID NO: 154) o EGFRvIII-mmh (SEQ ID NO: 152) se cargó en geles de Tris-Glicina SDS PAGE, se ejecutó y luego se transfirió a nitrocelulosa. Después del bloqueo, las membranas se cortaron por la mitad y se probaron con anticuerpos anti-EGFRvIII o anticuerpos anti-His. Los controles I y II son como los descritos anteriormente.
Tal como se muestra en la Figura 1a, H1H1862N2 (Fuc-) no se une a EGFRvIII o EGFR-mmh reducido o no reducido y, por lo tanto, tiene un epítopo conformacional a EGFRvIII. Por el contrario, el Control II se une tanto al EGFR de tipo silvestre como a la variante III en condiciones reducidas y no reducidas, mientras que el Control I, un aglutinante de péptidos de unión, es específico para EGFRvIII. Tanto el control I como el II, en contraste con H1H1863N2, tienen epítopos de unión lineal. La Figura 1b muestra otros anticuerpos contra EGFRvIII, que muestran comportamientos mixtos en transferencias Western.
Ejemplo 6: Unión de péptidos EGFR/EGFRvIlI y ensayos de competencia de anticuerpos
H1H1863N2(Fuc-) se probó para determinar sus características de unión mediante unión de péptidos y ensayos de competencia de anticuerpos. Para los experimentos de unión de péptidos, el péptido de unión EGFRvIII (SEQ ID NO: 148) se marcó a través de un enlazador con biotina en su extremo C [es decir, LEEKKGNYVVDHGGGGSK (SEQ ID NO: 149)-biotina] o el péptido que consiste en los restos 311-326 de EGFR (el "péptido EGFR 311-326"; Se Q ID NO: 165) marcado a través de un enlazador con biotina en su extremo C [es decir, CGADSYEMEEDGVRKCGGGGSK (SEQ ID NO: 151 )-biotina] se capturó a ~ 0,4 nM de densidad utilizando puntas OCTET® recubiertas con estreptavidina en un instrumento FORTEBIO® OCTET® RED. Después de la captura del péptido, las puntas recubiertas se colocaron en soluciones 1 pM de anticuerpo y se registraron las respuestas de unión (véase Figura 2). Los controles I-III son los mismos que los descritos anteriormente.
Como se predijo, el Control I se unió al péptido de unión con biotina en el extremo C y los Controles II y III se unieron al péptido EGFR 311-326 con biotina en el extremo C. H1H1863N2(Fuc-) no pudo unirse a ninguno de los péptidos.
Para la competencia cruzada de anticuerpos, se capturaron -200 unidades de resonancia (UR) de hEGFRvIII-mmh (SEQ ID NO: 152) en una superficie BIACORE™ recubierta con un anticuerpo policlonal antipentahistidina de alta densidad (n.° de catálogo 34660, QUIAGEN). Usando una metodología de inyección simultánea, el hEGFRvIII-mmh capturado se saturó con una inyección de 5 minutos de 500 nM de un primer AcM inmediatamente seguido de otra inyección de 5 minutos de un segundo AcM (500 nM) que se complementó con 500 nM del primer AcM. La unión significativa, expresada como UR, del segundo AcM se interpretó que no compite por la unión con el primer AcM. Para los experimentos de control, se utilizaron AcM emparejados con isotipo como primer AcM o como segundo AcM. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6
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H1H1863N2(Fuc-) no compitió con ninguno de los anticuerpos de control I-III para unirse a la superficie de captura de hEGFRvIII-mmh. Como se esperaba, los controles II y III, de los cuales se sabe que se unen a los restos 311-326 de EGFR, compitieron entre sí por la unión a la superficie de captura de EGFRvIII-mmh.
Ejemplo 7: Selectividad de unión a células de anticuerpos anti-EGFRvIII
Para determinar la especificidad de los AcM anti-EGFRvIII, su unión a HEK293, células HEK293 que expresan EGFRvIII (HEK293/EGFRvIII) y células A431, se analizaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, de sus siglas en inglés). Las células HEK293/EGFRvIII se prepararon mediante la transfección de células HEK293 con vectores de ADN resistentes a neomicina que expresaban constitutivamente hEGFRvIII de longitud completa (SEQ ID NO: 147) utilizando el reactivo de transfección LIPOFECTAMINE™ 2000 (INVITROGEN™). Dos días después de la transfección, las células se colocaron bajo la selección de G418 durante aproximadamente dos semanas. Las poblaciones que expresaban positivamente EGFRvIII se aislaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Las células HEK293 que expresan ~ 3 x 106 copias de EGFRvIII por célula se utilizaron en el experimento. En resumen, los anticuerpos anti-EGFRvIII a 10 pg/ml se incubaron con células durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron, se incubaron con un anticuerpo secundario, es decir, F(ab')2 de cabra marcado con ficoeritrina (PE) contra IgG humana (n.° de catálogo 109-116-170, Jackson ImmunoResearch Laboratories), seguido de un lavado final antes del análisis FACS. En otro conjunto de experimentos, los anticuerpos anti-EGFRvIII se conjugaron directamente a través de sus restos de lisina con el colorante fluorescente, el colorante ALEXA FLUOR® 488 (INVITROGEN ™), eliminando así la etapa que utiliza el anticuerpo secundario. Los resultados de las células HEK293 y las células HEK293/EGFRvIII que usan anticuerpos anti-EGFRvIII marcados directamente se muestran en la Tabla 7 y los que usan el anti-Fc (humano o de ratón) marcado con PE secundario se muestran en la Tabla 8. Los resultados de las células A431 que usan anticuerpos anti-EGFRvIII marcados directamente se muestran en la Tabla 9 y los que usan el anti-Fc (humano o de ratón) marcado con PE secundario se muestran en la Tabla 10. Los controles I, II, III, IV y V se describen anteriormente. MFI: Intensidad media de fluorescencia.
Tabla 7
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Tabla 8
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Tabla 9
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Tabla 10
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Varios anticuerpos anti-EGFRvIlI mostraron una clara preferencia de unión por la línea celular HEK293/EGFRVIII sobre las células HEK293 parentales cuando se detectaron utilizando anticuerpos anti-EGFRvIII marcados directamente (Tabla 7) o un anti-IgG humana marcada con PE (Tabla 8). La mayoría de los anticuerpos cuando se incubaron con células A431 (30 minutos a 4 °C) mostraron una unión mínima o nula, a excepción de los anticuerpos Controles III y IV (Tablas 9 y 10).
Ejemplo 8: Internización de AcM anti-EGFRvIlI por células HEK293/EGFRvIII
Se incubaron AcM anti-EGFRvIII (10 pg/ml) con células HEK293/EGFRVIII (véase el Ejemplo 7, supra) durante 2 horas en hielo seguido de dos lavados con PBS. Las células se sometieron luego a una incubación de 30 minutos en hielo con fragmentos Fab anti-IgG humana conjugados con DYLIGHT™ 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories) seguida de dos lavados adicionales con PBS. Los anticuerpos se dejaron internizar durante 1 hora a 37 °C en un tampón de internización (PBS FBS) o se mantuvieron a 4 °C. Las células se fijaron en formaldehído al 4 % y los núcleos se tiñeron con colorante de ADN DRAQ5® (Cell Signaling Technology, Inc.). Las imágenes se adquirieron a 40x en el sistema de alto contenido IMAGEXPRESS™ (Molecular Devices) y las vesículas internizadas se cuantificaron utilizando el programa informático Columbus (Perkin Elmer). Los resultados se muestran en la Tabla 11 y la Figura 3.
Tabla 11
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Se produjo una internización consistente a 37 °C para H1H1863N2, Control II y Control IV. También se observó internización para H1H1911N, H1H1912N y Control I.
Ejemplo 9: Unión del anticuerpo anti-EGFRvIII al xenoinjerto tumoral U87/EGFRvIII
Para determinar adicionalmente la especificidad de H1H1863N2, se preparó la línea celular U87 de glioblastoma humano que expresa EGFRvIII como se describe para las células HEK293/EGFRvIII en el Ejemplo 7. En el experimento se usaron células U87 que expresan ~ 1,5 x 105 copias de EGFRvIII por célula (U87/EGFRvIII). Las células U87/EGFRvIII (3 x 106 células) se xenoinjertaron en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y los tumores se dejaron crecer hasta que se obtuvo tamaño medio de 200-300 mm3. Los ratones se inyectaron con H1H1863N2(Fuc-) o control de isotipo a través de la vena de la cola. A los 10 minutos, 4 horas y 24 horas después de la inyección del anticuerpo, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los tumores y se colocaron en PBS. Los tumores se disociaron inmediatamente y se tiñeron con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con aloficocianina (APC) (hFc-APC). Las células teñidas se lavaron 3 veces con PBS de flujo que contenía suero de ternera fetal al 2 % y azida de sodio al 0,1 %. Los tumores en los puntos temporales de 10 minutos y 4 horas se fijaron durante la noche y luego se midieron mediante citometría de flujo. Los tumores recogidos en el punto temporal de 24 horas se midieron sin estar fijados. Todas las muestras se recolectaron en un ACCURI® C6 FlOw CYTOMETER® (Accuri Cytometers, Inc.) y se determinó la intensidad media de fluorescencia (MFI). Los resultados se muestran en la Tabla 12. Los valores de MFI son el promedio de 2-3 repeticiones biológicas ± el error estándar de la media (EEM).
Tabla 12
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En comparación con el control de isotipo, el anticuerpo H1H1863N2(Fuc-) se unió a las células tumorales U87/EGFRvIII de manera eficaz y dependiente del tiempo.
Ejemplo 10: Unión del anticuerpo anti-EGFRvIlI al xenoinjerto tumoral B16F10.9/EGFRvIII
Los ratones SCID se implantaron con cincuenta mil células de melanoma murino B16F10.9 o B16F10.9 que sobreexpresa EGFRvIII (B16F10.9/EGFRvIII). Las células B16F10.9/EGFRvIII se prepararon como se describe para las células HEK293/EGFRvIII en el Ejemplo 7. Se usan células B16F10.9 que expresan ~ 1,5 x 105 copias de EGFRvIII por célula para este experimento. Los tumores se dejaron crecer durante aproximadamente 14 días, hasta que se obtuvo un tamaño medio de 200-300 mm3 Luego, los ratones se inyectaron con H1H1863N2(Fuc-) o control de isotipo a través de la vena de la cola. A los 10 minutos, 4 horas y 24 horas después de la inyección del anticuerpo, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los tumores y se colocaron en PBS. Los tumores se disociaron inmediatamente y se tiñeron con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con aloficocianina (hFc-APC). Las células teñidas se lavaron 3X con PBS de flujo (1xPBS, suero de ternera fetal al 2 %, azida de sodio al 0,1 %), se fijaron y se permeabilizaron usando métodos estándar. La citometría de flujo se utilizó para detectar H1H1863N2(Fuc-) unido a la superficie celular y el análisis se realizó con el programa informático FlowJo (Tree Star, Inc.). Los resultados se muestran en la Tabla 13 y la Figura 4a. Para detectar tanto los anticuerpos unidos a la superficie celular como los unidos intracelularmente, las células se tiñeron por segunda vez utilizando el mismo anticuerpo anti-Fc humano (hFc-APC) después de las etapas de fijación y permeabilización. Esto permitió detectar el anticuerpo intracelular. Los resultados se muestran en la Tabla 14 y la Figura 4b. Todas las muestras se recolectaron en un ACCURI® C6 FLOW CYTOMETER® y se determinó la intensidad media de fluorescencia (MFI). La MFI para cada muestra se informó después de restar la MFI del control no teñido. Los valores de MFI son el promedio de dos repeticiones biológicas (N = 2) ± el error estándar de la media (EEM). * N = 1 para este punto temporal.
Tabla 13
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Tabla 14
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H1H1863N2(Fuc-) se unió eficazmente a la superficie de las células B16F10.9 que expresan EGFRvIII de una manera dependiente del tiempo, mientras que la unión del control de isotipo fue mínima. El aumento en la unión total (es decir, unión a la superficie celular más unión interna) de H1H1863N2(Fuc-), en comparación con su unión a la superficie celular solamente, indicó que los anticuerpos unidos a la superficie celular fueron eficazmente internizados por las células B16F10.0.
Ejemplo 11: Farmacocinética de los anticuerpos anti-EGFRvIlI en ratones
Para determinar la selectividad in vivo de los anticuerpos anti-EGFRvIII, se llevó a cabo un estudio farmacocinético utilizando ratones de tipo silvestre ("ratones TS") que expresan EGFR de ratón de forma natural, y ratones EGFR humanizados ("ratones hEGFR") que expresan EGFR humano. Los ratones procedían de cepas cruzadas con antecedentes que contenía C57BL6 (75 %) y 129Sv (25 %). Las cohortes contenían 5 ratones TS o hEGFR. Todos los anticuerpos se administraron por vía subcutánea a una dosis de 0,2 mg/kg. Las muestras de sangre se recogieron a las 0 horas, 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días, 10 días, 14 días, 21 días y 30 días después de la administración. Los niveles en suero de anticuerpos humanos se determinaron mediante ELISA de sándwich. En resumen, un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana (específico de Fc) (Jackson ImmunoResearch) se recubrió en placas de 96 pocillos a una concentración de un pg/ml y se incubó durante la noche a 4 °C. Después de bloquear las placas con BSA, las muestras de suero en diluciones en serie de seis dosis y los estándares de referencia de los respectivos anticuerpos en diluciones en serie de doce dosis se añadieron a la placa y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar para eliminar el anticuerpo no unido, los anticuerpos humanos capturados se detectaron utilizando el mismo anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana (específico de Fc) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch) y se desarrollaron mediante tetrametilbencidina colorimétrica estándar (TMB) de acuerdo con la recomendación del fabricante. Las absorbancias a 450 nm se registraron en un lector de placas y la concentración de hlgG en muestras de suero se calculó utilizando la curva estándar de referencia generada en la placa de muestras. Los anticuerpos de ratón antihumanos (MAHA, de sus siglas en inglés) se midieron utilizando métodos estándar y generalmente fueron bajos.
Las figuras 5a-5d muestran las gráficas de la concentración de anticuerpos frente al tiempo para los cuatro anticuerpos probados. Se sabe que el Control IV ("AcM C225") se une al EGFR humano pero no a su homólogo de ratón. Como se esperaba, este anticuerpo mostró un rápido aclaramiento en ratones hEGFR y un aclaramiento lento (es decir, sin aclaramiento mediado por la diana) en ratones TS (Fig. 5a). Se sabe que el Control I ("AcM 13.1.2") se une al péptido de unión EGFRvIII "LEEKKGNYVVTDH" que no está presente en el EGFR humano o de ratón. El anticuerpo no se une al EGFR humano o de ratón in vivo. Como se esperaba, este anticuerpo mostró tasas de aclaramiento farmacocinético lentas idénticas en ambos tipos de ratones (Fig. 5b) y no se observó un aclaramiento mediado por la diana. El anticuerpo de control III ("AcM hu806") mostró un mayor aclaramiento en ratones con hEGFR en comparación con ratones TS (Fig. 5c). Este hallazgo es consistente con su capacidad para unirse a hEGFR in vitro según lo determinado por Biacore (véase el Ejemplo 3, Tabla 4) y FACS (Ejemplo 7, Tabla 9). La Figura 5d muestra el aclaramiento de H1H1863N2(Fuc+). Este anticuerpo, similar al control I, mostró tasas de aclaramiento lento idénticas en ambos tipos de ratones. Por lo tanto, H1H1863N2 no se une a EGFR humano o de ratón in vivo.
Ejemplo 12: Un conjugado de anticuerpo anti-EGFRvIII-fármaco inhibe el crecimiento tumoral en modelos de aloinjerto de cáncer de mama positivos para EGFRvIII in vivo
En este ejemplo, se probaron dos conjugados de anticuerpo-fármaco diferentes del anticuerpo H1H1863N2 anti-EGFRvIII ejemplar para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Se produjo un primer ADC mediante la conjugación de H1H1863N2 con la toxina maitansinoide DM1 a través de un enlazador de MCC no escindible (véase, por ejemplo, el documento US 5.208.020 y la publicación de solicitud de Estados Unidos n° 2010/0129314) para producir "H1H1863N2-MCC-DM1". Se produjo un segundo ADC mediante la conjugación de H1H1863N2 con una versión modificada de DM1 unida a un nuevo enlazador escindible, denominado "M0026" (también conocido como "compuesto 7" en el documento WO2014/145090), para producir "H1H1863N2-M0026". Cuando se probó la citotoxicidad in vitro contra células MMT/EGFRvIII, H1H1863N2-MCC-DM1 exhibió una CI50 de 12 nM mientras que H1H1863N2-7 exhibió una CI50 de 0,8 nM basado en equivalentes de fármacos.
Para comparar la eficacia in vivo de los anticuerpos anti-EGFRvIII conjugados con DM1 y M0026, se realizaron estudios en ratones inmunocomprometidos que portaban aloinjertos de cáncer de mama positivos para EGFRvIII.
En resumen, se establecieron aloinjertos tumorales mediante la implantación subcutánea de 0,5 x 106 células MMT/EGFRvIII en el flanco izquierdo de ratones hembra SCID CB17 (Taconic, Hudson, NY). Una vez que los tumores alcanzaron un volumen promedio de 140 mm3 (-Día 8), los ratones se asignaron al azar en grupos de siete y se les administró ADC anti-EGFRvIII utilizando el formato de fármaco-enlazador MCC-DM1 o M0026. También se evaluaron los reactivos de control, incluidos los ADC no unidos que utilizan el formato de fármaco-enlazador MCC-DM1 o M0026, y el vehículo PBS. Los ADC se administraron a 1 y 5 mg/kg tres veces durante una semana y luego se controlaron hasta que se alcanzó un tamaño promedio de tumor de aproximadamente 2000 mm3 en el grupo administrado con vehículo solo. En este punto, la inhibición del crecimiento tumoral se calculó como se describe a continuación.
El tamaño promedio del tumor en relación con el grupo tratado con el vehículo se calculó de la siguiente manera: los tumores se midieron con calibradores dos veces por semana hasta que el tamaño promedio del grupo del vehículo alcanzó 1000 mm3; el tamaño del tumor se calculó utilizando la fórmula (longitud x ancho2)/2. La inhibición del crecimiento tumoral se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: (1-((Tf¡nal-T¡n¡c¡al)/(Ofinal-Cin¡c¡al)))*100, donde T (grupo tratado) y O (grupo de control) representan la masa tumoral media en el día en que el grupo vehículo alcanzó 1000 mm3. Los resultados se resumen en la Tabla 15.
Tabla 15
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Como se resume en la tabla 15, la mayor inhibición tumoral se observó en ratones a los que se les administró 5 mg/kg de H1H1863N2-M0026, donde se observó la regresión del tumor inicial. La inhibición del crecimiento tumoral del 102 % resultante del tratamiento con 5 mg/kg H1H1863N2-M0026 fue significativamente mayor que la observada después del tratamiento del tumor con 5 mg/kg H1H1862N2-MCC-DM1 (83 %). La superioridad de la inhibición del crecimiento tumoral inducida por H1H1863N2-M0026 en comparación con H1H1863N2-mcc-DM1 también se mantuvo en la dosis de 1 mg/kg. No se observó ningún efecto antitumoral en los grupos tratados con ADO de Control utilizando MCC-DM1 o M0026.
Por lo tanto, este ejemplo muestra que los anticuerpos anti-EGFRvlII de la presente invención, cuando se administran en forma de conjugados de anticuerpo-fármaco, son altamente potentes para inhibir el crecimiento tumoral. El presente Ejemplo además apoya un papel para que los ADO de la invención promuevan realmente la regresión del tumor, especialmente en el contexto de los anticuerpos anti-EGFRvlII de la invención (por ejemplo, H1H1863N2) conjugados a la nueva molécula enlazador/fármaco M0026.
El alcance de la presente invención no debe limitarse a las realizaciones específicas descritas en el presente documento. De hecho, a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas, diversas modificaciones de la invención, además de las descritas en el presente documento, serán obvias para los expertos en la técnica. Se pretende incluir dichas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 13: Los anticuerpos anti-EGFRvIlI-DMI muestran especificidad por las células que expresan EGFRvIlI y demuestran una potente actividad de destrucción celular
En este ejemplo, se determinó la capacidad de los anticuerpos anti-EGFRvIII humanas conjugados a la toxina de la maitansina DM1 para reducir la viabilidad celular utilizando ensayos basados en células in vitro.
Se introdujo de forma estable EGFRvIII humana de longitud completa (SEQ ID NO: 147) o EGFR humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 146) en líneas celulares HEK293 (293/hEGFRvIII, 293/hEGFRts), U251 (U251/hEGFRvIII) y MMT 060562 (MMT). Todas las células se generaron mediante metodologías basadas en lipofectamina 2000 y se cultivaron en medios de crecimiento completos en presencia de G418.
La expresión en la superficie celular de EGFR ts o EGFRvIII se midió mediante análisis FAOS. En resumen, se incubaron 1 x 106 células con 10 pg/ml de anticuerpo H1H1863N2 anti-EGFRvIII, un AcM de control anti-EGFRts (Control IV) o un control de isotipo durante 30 min. en hielo en tampón de dilución de anticuerpos. Después de dos lavados con tampón de dilución de anticuerpos, las células se incubaron con 10 pg/ml de anticuerpo secundario antihumano conjugado con PE durante 30 minutos en hielo. Después de dos lavados adicionales, las muestras se ejecutaron en un citómetro Accuri O6 (BD) o Hypercyt (Intellicyt) y se analizaron los datos utilizando el programa informático FlowJo. Los resultados se resumen en la Tabla 16. n.d. = no determinado.
Tabla 16: Expresión de la superficie celular en líneas celulares modificadas por ingeniería genética EGFRts y
EGFRvIII
Figure imgf000032_0002
Estos resultados muestran que la expresión superficial de EGFRvIlI fue comparable en las líneas celulares HEK293/hEGFRvIII y MMT/EGFRvIII, mientras que los niveles de expresión de U251/EGFRvIII fueron aproximadamente 20 veces más bajos que en los sistemas celulares HEK293/hEGFRvIII y MMT/hEGFRvIII. La unión de EGFRvIII a través de H1H1863N2 no fue detectable en las líneas celulares parentales. Por el contrario, el anticuerpo de control anti-EGFRts (Control IV) se unió a las células parentales HEK293 en 49 veces por encima del control de isotipo. La incorporación estable de un vector de expresión EGFRts en células HEK293 aumentó la expresión a 332 veces por encima de lo ya registrado y fue comparable a la expresión de EGFRvIII en células HEK293/hEGFRvIII y MMT/hEGFRvIII.
La unión selectiva del anticuerpo H1H1863N2 anti-EGFRvIII a EGFRvIII se evaluó mediante FACS utilizando HEK293 parental, HEK293/hEGFRts, HEK293/hEGFRvIII, líneas de células A431. Los resultados se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17: Es ecificidad de unión del anticuer o anti-EGFRvIII a las líneas celulares ue ex resan EGFRvIII
Figure imgf000032_0001
Como se muestra en la Tabla 17, tanto H1H1863N2 como el anticuerpo de control anti-EGFRts (Control IV) mostraron una fuerte unión (> 650 veces por encima de lo ya registrado) a las células HEK293/EGFRvIII en relación con un control de isotipo. Por el contrario, H1H1863N2 se unió débilmente a la línea celular ts-EGFR HEK293 (3 veces por encima de lo ya registrado) y expresaba de manera endógena la línea celular A431 del EGFR (13 veces por encima del control). El anticuerpo de control anti-EGFR-ts se unió fuertemente a las células que expresan EGFR ts, confirmando la selectividad de H1H1863N2 para EGFRvIII sobre EGFR de tipo silvestre.
A continuación, se determinó la capacidad de los anticuerpos anti-EGFRvIII humanas conjugados a la toxina de la maitansina DM1 para reducir la viabilidad celular utilizando ensayos basados en células in vitro. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con PDL a 250 - 2000 células por pocillo en medios de crecimiento completos y se dejaron crecer durante la noche. Para las curvas de viabilidad celular, se añadió ADC o fármaco libre (DM1-SMe) a las células en concentraciones finales que varían entre 500 nM y 5 pM y se incubaron durante 3 días. Las células se incubaron con CCK8 (Dojindo) durante las 1-3 h finales y se determinó la absorbancia a 450 nm (DO450) en Flexstation3 (Molecular Devices). Los niveles de DO450 antecedentes de las células tratadas con digitonina (40 nM) se restaron de todos los pocillos y la viabilidad se expresa como un porcentaje de los controles no tratados. Los valores de CI50 se determinaron a partir de una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 10 puntos (GraphPad Prism). Los resultados se presentan en las Tablas 18A y 18B. Los valores de CI50 están en nM y se normalizan para la proporción particular de fármaco/anticuerpo (DAR, de sus siglas en inglés).
T l 1 A: P n i r i n l l r l n f rm - n i r n i-E FRvIII-DM1
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Tabl 1 B: P n i r i n l l r l n f rm - n i r n i-E FRvIII-DM1
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Como se muestra en las Tablas 18A y 18B, H1H1863N2-MCC-DM1 redujo la viabilidad de las líneas celulares HEK293/hEGFRvIII, U251/hEGFRvIII y MMT/hEGFRvIII con CI50 que varían de 1,0 a 4,0 nM. Por el contrario, un control de isotipo conjugado con DM1 redujo la viabilidad de las células 293/EGFRvIII y MMT/hEGFRvIII con CI50 mayores que 100 nM y células U251/hEGFRvIII con una CI50 de 35 nM. H1H1863N2-m Cc -DM1 no tuvo impacto en las células HEK293 que expresan EGFR de tipo silvestre (293/hEGFRts) o en las líneas celulares parentales de control, lo que sugiere especificidad para las células que expresan EGFRvIII.
Por lo tanto, este Ejemplo demuestra que el anticuerpo H1H1863N2 de EGFRvIII tiene especificidad por las líneas celulares que expresan EGFRvIII y demuestra capacidad de destrucción celular específica cuando se conjuga con la toxina DM1.
Ejemplo 14: Se logra una potencia de destrucción de células mejorada cuando un conjugado de fármacoanticuerpo de unión conformacional EGFRvIII se dosifica en combinación con un conjugado de fármacoanticuerpo de unión a péptido de unión EGFRvIII
En este ejemplo, se determinó la capacidad para mejorar la destrucción celular mediante la administración conjunta de dos tipos diferentes de conjugados de fármaco-anticuerpo anti-EGFRvIII. Para este Ejemplo, las combinaciones probadas consistieron en dos anticuerpos anti-EGFRvIII diferentes: (1) un anticuerpo anti-EGFRvIII específico que no reconoce el ADC de péptido de unión EGFRvIII (denominado en el presente documento como "aglutinante conformacional"); y (2) un anticuerpo anti-EGFRvIII específico que reconoce el péptido de unión EGFRvIII (denominado en el presente documento como "aglutinante peptídico"). Como se ha demostrado en el Ejemplo 6, el anticuerpo H1H1863N2 anti-EGFRvIII no se une al péptido de unión EGFRvIII o a los restos 311-326 de EGFR humano y, por lo tanto, se considera un "aglutinante conformacional".
Competencia cruzada in vitro
En primer lugar, la capacidad de H1H1863N2 para competir de forma cruzada con un anticuerpo que se une al péptido de unión EGFRvIII se determinó a través de un ensayo de competencia de unión. El anticuerpo anti-EGFRvIII de unión al péptido de unión utilizado en este ejemplo fue el Control V.
La competencia cruzada se determinó utilizando un ensayo en tiempo real de interferometría de biomasa sin marcar (BLI) en un biosensor Octet HTX (ForteBio Corp., una división de Pall Life Sciences). Todo el experimento se realizó a 25 °C en un tampón compuesto por HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, BSA 1,0 mg/ml (tampón Octet HBST) con agitación de la placa a una velocidad de 1000 rpm. Para evaluar si dos anticuerpos compitieron de manera cruzada por la unión en EGFRvIII humana recombinante (hEGFRvlll.mmh; SEQ ID: 152), aproximadamente ~ 0,35 nm de hEGFRvlll.mmh se capturaron en biosensores Octet recubiertos con antipenta-His. Los biosensores capturados con antígeno se saturaron luego con el primer anticuerpo monoclonal anti-EGFRvIII (posteriormente denominado AcM-1) mediante inmersión en pocillos que contienen una solución de AcM-1 de 50 |jg/ml durante 5 minutos. Los biosensores se sumergieron posteriormente en pocillos que contenían una solución de 50 |jg/ml de un segundo anticuerpo monoclonal anti-EGFRvIlI (posteriormente denominado AcM-2) durante 3 minutos. Todos los biosensores se lavaron en tampón Octet HBST entre cada paso del experimento. La respuesta de unión en tiempo real fue monitoreada durante el curso del experimento y se registró la respuesta de unión al final de cada paso. Se comparó la respuesta de unión de AcM-2 a hEGFRvIII que formó un complejo previamente con AcM-1 y se determinó el comportamiento competitivo/no competitivo de diferentes anticuerpos monoclonales anti-EGFRvIII. Usando este formato experimental de competencia cruzada, H1H1863N2 no mostró competencia cruzada con el aglutinante peptídico de unión EGFRvIII probado, ni compitió de manera cruzada por la unión a EGFRvIII con Control II o Control Iv . Los resultados de este ensayo de competencia cruzada indican, por lo tanto, que H1H1863N2 tiene un epítopo de unión distinto al del aglutinante peptídico de unión EGFRvIII, así como los Controles II y IV.
Actividad de destrucción celular de conjugados de fármaco-anticuerpo anti-EGFRvIlI individuales
A continuación, se evaluó la capacidad de H1H1863N2-MCC-DM1 y un ADC de unión al péptido anti-EGFRvIII para reducir la viabilidad celular cuando se administra en combinación. La capacidad del Control V para inducir la destrucción celular cuando se conjugó con SMCC-DM1 (es decir, Control V-MCC-DM1) se determinó usando un ensayo basado en células in vitro como se describió en el Ejemplo 13. Los resultados se resumen en la Tabla 19. T l 1 : P n i r i n l l r l n f rm - n i r n i-E FRvIII-DM1
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Como se resume en la tabla 19, los ADC anti-EGFRvIII redujeron la viabilidad celular de varias líneas celulares que sobreexpresaban EGFRvIII con valores de CI50 que varían de 0,25 nM a 3,25 nM.
Actividad de destrucción celular de combinaciones por pares de conjugados de fármaco-anticuerpo anti-EGFRvIII
A continuación, se probó la potencia de destrucción celular de H1H1863N2-MCC-DM1 emparejado con el ADC de unión al péptido anti-EGFRvIII en líneas celulares que sobreexpresan EGFRvIII en una relación 1:1. Los resultados se muestran en la Tabla 20.
T l 2 : P n i r i n l l r m in i n r r AD n -E FRvIII-DM1
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Como se resume en la tabla 20, la combinación de H1H1863N2-MCC-DM1 (un aglutinante de epítopo conformacional) y el Control V-MCC-DM1 (un aglutinante de péptidos de unión) dio como resultado una potencia de destrucción celular

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado y fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a EGFRvIlI humana, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una combinación de secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo muestra una constante de disociación de equilibrio (Kd) para un dímero de EGFRvIII humana de aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 5,0 nM o menos, aproximadamente 1,0 nM o menos, aproximadamente 0,5 nM o menos, medida mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se conjuga con una citotoxina, opcionalmente en donde la citotoxina se selecciona del grupo que consiste en (i) biotoxinas, agentes quimioterapéuticos y radioisótopos o (ii) maitansinoides, auristatinas, tomaimicinas, duocarmicinas, 225Ac, 227Th y derivados de los mismos.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo exhibe una Kd para un dímero de EGFR humano superior a la del dímero de EGFRvIII en al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 500 veces, al menos aproximadamente 1000 veces, al menos aproximadamente 2000 veces o al menos aproximadamente 3000 veces, medida mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial, opcionalmente en donde el anticuerpo o fragmento del mismo no se une a un dímero de EGFR a un nivel detectable mediante un ensayo de resonancia de plasmón de superficie.
5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde:
(a) la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; o
(b) la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprende un par de secuencias de HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 34/42.
7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, agentes antiinflamatorios y analgésicos.
8. Una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 7 para su uso en un método para tratar un cáncer o tumor que expresa EGFRvIII, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 7.
9. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 8, en donde el cáncer o tumor se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, carcinoma ductal o intraductal de mama, carcinoma pulmonar no microcítico, carcinomas de ovario, cáncer de próstata y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello.
10. Un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) para su uso en un método para tratar un cáncer, reducir el crecimiento del tumor y/o causar la regresión del tumor en un paciente, comprendiendo el ADC un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y una citotoxina, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del ADC se une específicamente a EGFRvIII pero no se une al péptido de unión de la SEQ ID NO: 148 o al péptido de la SEQ ID NO: 165, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una combinación de secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de las SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48, y comprendiendo el método administrar a un paciente que lo necesite el ADC.
11. El ADC para su uso de la reivindicación 10, en donde el método comprende además administrar al paciente un ADC adicional que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo y una citotoxina, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del ADC adicional se une específicamente a EGFRvIII y también se une al péptido de unión de la SEQ ID NO: 148 y/o al péptido de la SEQ ID NO: 165.
12. El ADC para su uso de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del ADC comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 42.
13. Un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) para su uso en un método para tratar un cáncer, reducir el crecimiento del tumor y/o causar la regresión del tumor en un paciente, comprendiendo el ADC un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y una citotoxina, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del primer ADC se une específicamente a EGFRvIII y también se une al péptido de unión de la SEQ ID NO: 148 y/o al péptido de la SEQ ID NO: 165, y comprendiendo el método administrar a un paciente que lo necesite el ADC y un ADC adicional que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y una citotoxina, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del adicional ADC se une específicamente a EGFRvIII pero no se une al péptido de unión de la SEQ ID NO: 148 o al péptido de la SEQ ID NO: 165, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo del ADC adicional comprende una combinación de secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de las SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48.
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