ES2715289T3 - Formulaciones de furina recombinante - Google Patents

Abstract

Una composición acuosa estabilizada de furina recombinante (rfurina), comprendiendo la composición: (a) desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina; (b) desde 100 mM hasta 300 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; (d) desde el 2 % hasta el 20 % de azúcar o alcohol de azúcar; (e) desde 10 hasta 200 ppm de tensioactivo no iónico; (f) desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento; y (g) un pH desde 5,5 hasta 7,5.

Description

DESCRIPCION

Fórmulaciones de furina recombinante

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/492.712, presentada el 2 de junio de 2011.

Campo de la solicitud

Esta solicitud se refiere en general al campo de formulaciones de protema.

Antecedentes de la invencion

La familia de las proprotema convertasas de tipo subtilisina de mairnfero proteolfticas (SPC o PC) es homologa a Kex2p de levadura y subtilisinas bacterianas. Hasta la fecha, se han identificado siete miembros distintos de la familia de SPC, incluyendo furina, PC1 (tambien conocida como PC3), PC2, PACE4, PC4, PC5 (tambien conocida como PC6), PC7 (LPC, PC8 o SPC7), cada una de las cuales exhibe distribucion tisular unica.

La furina, tambien denominada PACE (enzima de escision de aminoácidos basicos emparejados) se expresa de manera ubicua en todas las lmeas celulares y tejidos de mamnferos y es capaz de procesar una amplia gama de protemas precursoras bioactivas en la ruta secretora, incluyendo tambien hormonas, factores de crecimiento, receptores, protemas bacterianas y vmcas, y protemas plasmaticas. Es una serina endoproteasa dependiente de calcio dispuesta estructuralmente en varios dominios, concretamente un peptido senal, propeptido, dominio catalftico, dominio central, (tambien denominado homo-B o dominio P), el dominio rico en cistemas ubicado en el extremo C-terminal, dominio transmembranario y la cola citoplasmatica. El sitio de escision de furina proteasa comprende una secuencia de reconocimiento que se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Arg-X-Lys/Arg-Arg (Hosaka et al., J Biol Chem. 1991; 266:12127-30).

La furina pertenece a la familia de las proprotema convertasas y es dependiente de calcio (Ca2+). La furina escinde espedficamente el enlace peptfdico C-terminal de la arginina dentro de una secuencia espedfica, que contiene arginina en las posiciones -1 y -4. Esta secuencia puede encontrarse en numerosas protemas humanas, mostrando que la furina desempena un papel importante en la maduracion de varias proprotemas humanas. Por consiguiente, la furina es una proprotema convertasa que procesa protemas precursoras latentes para dar sus productos biologicamente activos. La furina es una serina endoproteasa dependiente de calcio que escinde protemas precursoras en sus sitios de procesamiento de aminoácidos basicos emparejados. Un sustrato para la furina es el factor de Von Willebrand (vwF).

La furina (por ejemplo, rfurina) es capaz de convertir pro-VWF (profactor de Von Willebrand) en VWF maduro escindiendo del enlace peptfdico Arg741-Ser742 de VWF. Esta etapa de maduracion es parte de, por ejemplo, un procedimiento de produccion de rVWF que proporciona una terapia para la enfermedad de Von Willebrand de tipo B. La produccion de protemas recombinantes activadas es de alta importancia clmica y de diagnostico. Por ejemplo, pueden usarse protemas activas o maduras, como VWF maduro, para controlar la coagulacion sangumea.

Las formulaciones de furina, particularmente formulaciones de furina recombinante (rfurina), a menudo tienen menor vida util en almacenamiento (menos de 6 meses) debido a una perdida de actividad de rfurina a partir de la degradacion de la protema (a menudo a partir de la autoescision de la protema furina). Ademas, cuando se usa en determinados procedimientos de produccion, tales como produccion de VWF maduro, se diluyen formulaciones de rfurina, a menudo 200 veces, y la rfurina diluida muestra generalmente una perdida de actividad desproporcionada. Por consiguiente, existe la necesidad en el campo de metodos y formulaciones que estabilicen composiciones de furina (por ejemplo, rfurina), asf como metodos para diluir composiciones de furina (por ejemplo, rfurina) concentradas sin perder una fraccion sustancial de la actividad de furina.

Breve sumario de la invencion

La presente divulgacion cubre estas y otras necesidades en el campo de formulacion de furina (por ejemplo, rfurina), almacenamiento y manipulacion, proporcionando metodos y formulaciones para estabilizar la furina (por ejemplo, composiciones de rfurina). Estas necesidades se satisfacen, al menos en parte, por el descubrimiento de que la adicion de azucares, alcoholes de azucar y/o tensioactivos no ionicos aumenta significativamente la estabilidad de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina) durante el almacenamiento y el esfuerzo mecanico.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona formulaciones de furina altamente estabilizadas, particularmente formulaciones de rfurina altamente estabilizadas que muestran estabilidad aumentada en condiciones de alta temperatura, agitacion y pH variable en comparacion con las formulaciones de furina de partida (control).

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion acuosa estabilizada de furina recombinante (rfurina), comprendiendo la composicion: desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina; desde 100 mM hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable; desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar; desde 10 hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico; desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento; y un pH desde 5,5 hasta 7,5.

En una realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen de 150 mM a 250 mM de una sal farmaceuticamente aceptable. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen 190±10mM de una sal farmaceuticamente aceptable. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio. En otra realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de potasio.

En una realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen calcio 0,9±0,2 mM. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen calcio 0,92 mM.

En una realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen desde el 5 % hasta el 15 % de azucar o alcohol de azucar. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen el 10±2% de azucar o alcohol de azucar. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen el 10% de azucar o alcohol de azucar.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, el azucar o alcohol de azucar se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En otra realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En otra realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, el azucar o alcohol de azucar es sacarosa.

En una realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen desde 50 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen 75 ppm de tensioactivo no ionico.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80. En una realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen desde 50 mM hasta 150 mM de agente de tamponamiento. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen agente de tamponamiento 90±10 mM. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen agente de tamponamiento 91 mM.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, el agente de tamponamiento comprende acetato. En otra realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, el agente de tamponamiento comprende HEPES. En otra realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, el agente de tamponamiento comprende MES. En otra realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, el agente de tamponamiento comprende acetato y HEPES.

En una realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen desde 25 mM hasta 75 mM de acetato y desde 25 hasta 75 mM de HEPES. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen acetato 45±5 mM y HEPES 45±5 mM. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente incluyen acetato 45 mM y HEPES 46 mM.

En una realización, las composiciones proporcionadas anteriormente tienen un pH desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente tienen un pH desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente tienen un pH de 6,0±0,2. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente tienen un pH de 6,0.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composicion tiene estabilidad aumentada cuando se almacena a 37 °C en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un azucar o alcohol de azucar.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composicion mantiene un porcentaje mayor de actividad de rfurina cuando se almacena a 37 °C en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un azucar o alcohol de azucar.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composicion mantiene un porcentaje mayor de contenido de monomero de rfurina cuando se almacena a 37 °C en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un azucar o alcohol de azucar.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composicion tiene estabilidad aumentada cuando se agita en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un tensioactivo no ionico.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composicion mantiene un porcentaje mayor de actividad de rfurina cuando se agita en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un tensioactivo no ionico.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composicion mantiene un porcentaje mayor de contenido de monomero de rfurina cuando se agita en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un tensioactivo no ionico.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composicion tiene estabilidad aumentada cuando se diluye en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un tensioactivo no ionico.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composicion mantiene un porcentaje mayor de actividad de rfurina cuando se diluye en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un tensioactivo no ionico.

En una realizacion de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composicion mantiene un porcentaje mayor de contenido de monomero de rfurina cuando se diluye en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un tensioactivo no ionico.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion acuosa estabilizada de furina recombinante (rfurina), comprendiendo la composicion: desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina; cloruro de sodio 190 mM; calcio 0,92 mM; el 10% de trehalosa; 75 ppm de polisorbato 80; ácido acetico 45 mM; HEPES 46 mM y un pH desde 5,5 hasta 7,5.

En una realización, las composiciones proporcionadas anteriormente tienen un pH desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente tienen un pH desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente tienen un pH de 6,0±0,2. En otra realización, las composiciones proporcionadas anteriormente tienen un pH de 6,0.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para diluir una composicion de rfurina acuosa, comprendiendo el metodo anadir un tampon de dilucion que comprende desde 10 ppm hasta 200 ppm de un tensioactivo no ionico a la composicion de rfurina acuosa, formando de ese modo una composicion de rfurina diluida. En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de dilucion comprende desde 10 ppm hasta 100 ppm de un tensioactivo no ionico. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de dilucion comprende desde 50 ppm hasta 100 ppm de un tensioactivo no ionico. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de dilucion comprende 75 ppm de un tensioactivo no ionico. En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de dilucion tiene un pH desde 5,5 hasta 7,5. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de dilucion tiene un pH desde 5,5 hasta 6,5. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de dilucion tiene un pH de 6,0±0,2. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de dilucion tiene un pH de 6,0. En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la composicion de rfurina diluida comprende al menos el 50 % de la actividad de rfurina presente en la composicion de rfurina acuosa antes de la dilucion.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la composicion de rfurina diluida comprende al menos el 75 % de la actividad de rfurina presente en la composicion de rfurina acuosa antes de la dilucion.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona una formulacion de furina recombinante (rfurina) altamente estabilizada, comprendiendo dicha formulacion: 8.000 - 52.000 U/ml de rfurina; de 1 mM a 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable; de 0,1 mM a 2 mM de cloruro de calcio; del 1 % al 20% de azucar y/o azucar dihidratado; de 50 hasta 100 ppm de un tensioactivo y 1 de mM a 100 mM de un ácido carboxflico, un agente de tamponamiento en concentracion suficiente para mantener un pH de 4,0-7,0, o tanto dicho ácido carboxflico como dicho agente de tamponamiento.

En una realización, las formulaciones proporcionadas anteriormente incluyen sal 180-200 mM.

En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, la sal es cloruro de sodio.

En una realización, las formulaciones proporcionadas anteriormente incluyen calcio 0,5 -1,0 mM.

En una realización, las formulaciones proporcionadas anteriormente incluyen el 5-15% de azucar o azucar dihidratado.

En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, el azucar o azucar dihidratado se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos.

En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, el tensioactivo es polisorbato 80.

En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, el tensioactivo esta presente a una concentracion de aproximadamente 65 a aproximadamente 85 ppm.

En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, el ácido carboxflico es ácido acetico.

En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, el ácido carboxflico esta en una concentracion de 35-55 mM.

En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, el agente de tamponamiento es HEPES. En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, el agente de tamponamiento esta en una concentracion de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mM.

En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, la formulacion muestra estabilidad mejorada tras el almacenamiento a 37 °C en comparacion con una formulacion que no contiene un azucar o azucar dihidratado.

En una realizacion de las formulaciones proporcionadas anteriormente, se prepara la formulacion anadiendo rfurina a una composicion que comprende el 1 % de polisorbato 80, HEPES 500 mM; ácido acetico 400 mM, cloruro de calcio 1 mM y polvo de trehalosa dihidratada, en la que dicha composicion tiene un pH de 6,0 antes de la adicion a dicha rfurina.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona una formulacion de furina recombinante (rfurina) altamente estabilizada, comprendiendo dicha formulacion: 8.000 - 57.000 U/ml de rfurina; cloruro de sodio 190 mM; cloruro de calcio 0,92 mM; el 10% p/p de trehalosa dihidratada; 75 ppm de polisorbato 80; ácido acetico 45 mM y HEPES 46 mM.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona una formulacion de furina recombinante (rfurina) altamente estabilizada que incluye: (a) 8.000 - 52.000 U/ml de rfurina; (b) de 1 mM a 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable; (c) de 0,1 mM a 2 mM de cloruro de calcio; (d) del 1 % al 20 % de azucar y/o azucar dihidratado; (e) de 50 a 100 ppm de un tensioactivo y (f) de 1 mM a 100 mM de un ácido carboxflico o un agente de tamponamiento en concentracion suficiente para mantener un pH de 4,0-7,0 o tanto el ácido carboxflico como el agente de tamponamiento.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. rFurina en la formulacion de control - un estudio de la temperatura analizado usando el ensayo de actividad de furina. Se incubaron muestras de rfurina en la formulacion de control a: temperatura ambiente, 37 °C o 45 °C durante hasta siete dfas. Las actividades de muestras de rfurina se representan graficamente frente al numero de dfas de incubacion. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 2. rFurina en la formulacion de control - un estudio de la temperatura analizado usando SEC. Las mismas muestras que en la figura 1 se analizaron usando SEC. Se representan graficamente las alturas de pico de rfurina relativas frente al numero de dfas de incubacion. Las alturas de pico relativas se calcularon como los porcentajes de la altura de pico de rfurina a tiempo cero.

Figura 3. rFurina en la formulacion de control incubada a 37 °C analizada usando SEC. Se incubaron muestras de rfurina en la formulacion de control a 37 °C durante siete dfas. La figura 3 muestra una superposicion de perfiles de absorcion de SEC a 280 nm de seis puntos de tiempo. El mismo estudio que en la figura 1.

Figura 4. rFurina en la formulacion de control incubada a temperatura ambiente y 37 °C analizada usando inmunotransferencia de tipo Western. El mismo estudio que en la figura 1. Carril: (1) marcador de MWM; (2) T = 0; (3) rfurina incubada a temperatura ambiente durante 1 dfa; (4) rfurina incubada a temperatura ambiente durante 2 dfas; (5) rfurina incubada a temperatura ambiente durante 3 dfas; (6) rfurina incubada a temperatura ambiente durante 7 dfas; (7) marcador de MWM; (8) rfurina incubada a 37 °C durante 1 dfa; (9) rfurina incubada a 37 °C durante 2 dfas; (10) rfurina incubada a 37 °C durante 3 dfas y (11) rfurina incubada a 37 °C durante 7 dfas.

Figura 5. rFurina en la formulacion de control - un estudio de congelacion/descongelacion analizado usando el ensayo de actividad de furina. Se representa graficamente la actividad de rfurina frente al numero de ciclos de congelacion/descongelacion. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 6. rFurina en la formulacion de control - un estudio de congelacion/descongelacion analizado usando SEC. Se representan graficamente alturas de pico de rfurina frente al numero de ciclos de congelacion/descongelacion. Figura 7. rFurina en la formulacion de control - un estudio de agitacion analizado usando el ensayo de actividad. Se representa graficamente la actividad de rfurina frente al tiempo de agitacion. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 8. rFurina en la formulacion de control - un estudio de agitacion analizado usando SEC. Se representan graficamente las alturas de pico de rfurina frente al tiempo de agitacion.

Figura 9. Comparacion de diferentes lotes de rfurina usando inmunotransferencia de tipo Western. Se analizaron diversos lotes de rfurina usando inmunotransferencia de tipo Western. El orden de produccion se indica alfabeticamente. Carril: (1) marcador de MWM; (2) referencia de furina; (3) 04-03-09 (lote 0l8342, vial de 2 ml); (4) 08-03-09 (lote 018365, vial de 2 ml); (5) 15-03-09 (lote 018366, vial de 2 ml); (6) 01-03-09 (lote 018315, vial de 2 ml); (7) 26-07-10 (lote X572, frasco de 200 ml); (8) 06-03-09 (lote 018365, frasco de 200 ml); (9) 01-08-10 (lote X576, frasco de 200 ml); (10) 09-03-09 (lote 018366, frasco de 200 ml); (11) marcador de MWM; (12) referencia de furina; (13) 03-08-10 (lote X577, frasco de 200 ml); (14) 24-07-10 (lote X573, frasco de 200 ml); (15) 30-07-10 (lote X575, frasco de 200 ml); (16) 018346 (estabilidad de QC a -80 °C); (17) 018346 (estabilidad de QC a -25 °C); (18) 018315 (estabilidad de QC a -80 °C) y (19) 018315 (estabilidad de QC a -25 °C).

Figura 10. Impacto del metodo de descongelacion sobre la actividad de rfurina analizado usando el ensayo de actividad de furina. Se muestran actividades de muestras de rfurina como barras para diversos lotes de rfurina descongelados a o bien: 4 °C (izquierda) o bien a temperatura ambiente (TA; derecha). Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 11. Efecto de pH 5 y 5,5 sobre la actividad de rfurina analizado usando el ensayo de actividad de furina. Se incubaron muestras de rfurina a 37 °C a cualquiera de los pH: 5,0, 5,5 o 6,0 (formulacion de control) durante hasta siete dfas. Las actividades de muestras de rfurina se representan graficamente frente al numero de dfas de incubacion. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 12. Efecto de pH 5 y 5,5 sobre la actividad de rfurina analizado usando SEC. Se incubaron muestras de rfurina a 37 °C a cualquiera de los pH: 5,0, 5,5 o 6,0 (formulacion de control). Se representan graficamente alturas de pico relativas de rfurina frente al numero de dfas de incubacion. Las alturas de pico relativas se calcularon como el porcentaje de la altura de pico de rfurina a tiempo cero.

Figura 13. Estabilidad de rfurina a 37 °C en la formulacion de control analizada usando SEC. Se incubo una muestra de rfurina en la formulacion de control durante cuatro dfas a 37 °C. La superposicion de perfiles de absorcion a 280 nm muestra tres puntos de tiempo: T = 0, 1 dfa y 4 dfas de incubacion.

Figura 14. Estabilidad de rfurina en MES pH 6,0 analizada usando SEC. Se realizo una adicion conocida de una muestra de rfurina con MES (C final = 100 mM, pH 6,0) y se incubo durante cuatro dfas a 37 °C. Una superposicion de perfiles de absorcion a 280 nm muestra tres puntos de tiempo: T = 0, 1 dfa y 4 dfas de incubacion.

Figura 15. Estabilidad de rfurina en HEPES pH 7,0 analizada usando SEC. Se realizo una adicion conocida de una muestra de rfurina con HEPES (C final = 100 mM, pH 7,0) y se incubo durante cuatro dfas a 37 °C. La superposicion de perfiles de absorcion a 280 nm muestra tres puntos de tiempo: T = 0, 1 dfa y 4 dfas de incubacion.

Figura 16. Estabilidad de rfurina en HEPES pH 8,0 analizada usando SEC. Se realizo una adicion conocida de una muestra de rfurina con HEPES (C final = 100 mM, pH 8,0) y se incubo durante cuatro dfas a 37 °C. La superposicion de perfiles de absorcion a 280 nm muestra tres puntos de tiempo: T = 0, 1 dfa y 4 dfas de incubacion.

Figura 17. Efectos de aditivos de sacarosa y polisorbato 80 sobre la estabilidad de rfurina a 37 °C analizados usando SEC. Las muestras se incubaron a 37 °C durante cuatro dfas. Se representan graficamente alturas de pico relativas de rfurina frente al tiempo de incubacion. Las alturas de pico relativas se calcularon como los porcentajes de la altura de pico de rfurina a tiempo cero.

Figura 18. Efectos de sacarosa y polisorbato 80 sobre la estabilidad de rfurina en la formulacion de control a 37 °C analizados usando el ensayo de actividad de furina. Las actividades relativas de muestras de rfurina se representan graficamente frente al numero de dfas de incubacion para comparar las siguientes muestras: formulacion de control sin aditivos, formulacion de control mas el 10 % de sacarosa y formulacion de control mas el 10 % de sacarosa mas 25 ppm de polisorbato 80. Los valores de actividad relativa se calcularon como los porcentajes de la actividad de furina a tiempo cero. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar = 4.

Figura 19. Efectos de sacarosa y polisorbato 80 sobre la estabilidad de rfurina en tampon MES a 37 °C analizados usando el ensayo de actividad de furina. Las actividades relativas de muestras de rfurina se representan graficamente frente al numero de dfas de incubacion para comparar las siguientes muestras: formulacion de control sin aditivos, adicion conocida con MES (C final = 100 mM, pH 6,0), adicion conocida con MES (C final = 100 mM, pH 6 mas el 10 % de sacarosa y adicion conocida con MES (C final = 100 mM, pH 6,0) mas el 10 % de sacarosa mas 25 ppm de polisorbato 80. Los valores de actividad relativa se calcularon como los porcentajes de la actividad de furina a tiempo cero. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 20. Comparacion de la estabilidad de rfurina a 37 °C en la formulacion de control con la formulacion en tampon MES analizada usando el ensayo de actividad de furina. Las actividades relativas de muestras de rfurina se representan graficamente frente al numero de dfas de incubacion para comparar las siguientes muestras: formulacion de control sin aditivos, formulacion de control mas el 10 % de sacarosa y adicion conocida con MES (C final = 100 mM, pH 6,0) mas el 10% de sacarosa. Los valores de actividad relativa se calcularon como los porcentajes de la actividad de furina a tiempo cero. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 21. Comparacion de la estabilidad de rfurina a 37 °C en sacarosa con manitol analizada usando el ensayo de actividad de furina. Se realizaron adiciones conocidas de todas las muestras con HEPES/ácido acetico, pH 6,0. Las actividades relativas de muestras de rfurina se representan graficamente frente al numero de dfas de incubacion para comparar las siguientes muestras: sin aditivos, el 10 % de sacarosa, el 10 % de manitol, el 10 % de sacarosa mas 25 ppm de polisorbato 80 y el 10 % de manitol mas 25 ppm de polisorbato 80. Los valores de actividad relativa se calcularon como los porcentajes de la actividad de furina a tiempo cero. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 22. Estabilidad de rfurina a 37 °C: sacarosa frente a manitol analizada usando SEC. Se analizaron las mismas muestras que en la figura 21 usando SEC. Se representan graficamente alturas de pico de rfurina relativas frente al tiempo de incubacion. Las alturas de pico relativas se calcularon como los porcentajes de la altura de pico de rfurina a tiempo cero.

Figura 23. Estabilidad de rfurina en trehalosa tras 5 dfas de incubacion a 37 °C analizada mediante el ensayo de actividad de furina. Se examinaron los efectos de cantidades variadas de trehalosa y polisorbato 80 sobre la estabilidad de rfurina a 37 °C usando el ensayo de actividad de furina. En primer lugar, se realizaron adiciones conocidas de todas las muestras con HEPES y ácido acetico (concentraciones finales: HEPES - 50 mM, ácido acetico - 50 mM, pH 6,0) entonces, se anadieron o bien el 10 % de sacarosa o bien diversas cantidades de trehalosa y/o polisorbato 80. Tambien se incluye una muestra de rfurina en la formulacion de control. Los datos se ordenan desde los valores de actividad mas altos hasta los mas bajos tras 5 dfas de incubacion a 37 °C (barra derecha en cada par). La barra izquierda en cada par representa valores de actividad de furina a tiempo cero. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 24. Actividad de rfurina en trehalosa tras 5 dfas de incubacion a 37 °C. Se presentan las mismas muestras que en la figura 23 tras volver a calcular para mostrar que porcentaje de actividad inicial de cada muestra permanece tras cinco dfas de incubacion a 37 °C. Tambien se incluye una muestra de rfurina en la formulacion de control. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 25. Estabilidad de rfurina en trehalosa tras 5 dfas de incubacion a 37 °C analizada usando SEC. Las mismas muestras que en la figura 24. El grafico muestra que porcentaje de pico de rfurina inicial de cada muestra permanece tras cinco dfas de incubacion a 37 °C. Tambien se incluye una muestra de rfurina en la formulacion de control.

Figura 26. Estabilidad de rfurina en trehalosa tras 5 dfas de incubacion a 35 °C analizada usando inmunotransferencia de tipo Western. Las mismas muestras que en la figura 24. Se emparejan las muestras: primera muestra - tiempo cero, segunda muestra - incubada a 37 °C durante 5 dfas. Carriles: (1) marcador de MWM; (2) referencia de furina, (3) control; (4) formulacion de control, T = 0; (5) formulacion de control, 5 dfas; (6) el 10 % de sacarosa, T = 0; (7) el 10 % de sacarosa, 5 dfas; (8) el 2 % de trehalosa, T = 0; (9) el 2 % de trehalosa, 5 dfas; (10) ^{el 10 % de trehalosa, T = 0; (11) el 10 % de trehalosa, 5 dfas; (12) marcador de} MWm; ^{(13) referencia de furina; (14 )} control; (15) el 5% de trehalosa, T = 0; (16) el 5% de trehalosa, 5 dfas; (17) el 5% de trehalosa, 10 ppm de Tween80, T = 0; (18) el 5% de trehalosa, 10 ppm de Tween80, 5 dfas; (19) el 5% trehalosa, 25 ppm de Tween80, T = 0; (20) el 5 % de trehalosa, 25 ppm de Tween80, 5 dfas; (21) el 5 % de trehalosa, 100 ppm de Tween80, T = 0 y (22) el 5 % de trehalosa, 100 de ppm Tween80, 5 dfas.

Figura 27. Efecto del contenido de trehalosa sobre la actividad de rfurina sometido a prueba tras 5 dfas de incubacion a 37 °C. El mismo experimento que en la figura 24. En primer lugar, se realizaron adiciones conocidas de todas las muestras con HEPES y ácido acetico (concentraciones finales: HEPES - 50 mM, ácido acetico - 50 mM, pH 6,0) luego, se anadieron diversas cantidades de trehalosa. Se representa graficamente la actividad de furina tras cinco dfas de incubacion a 37 °C frente el porcentaje de trehalosa anadida a las muestras. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 28. Efecto del contenido de trehalosa sobre la estabilidad de rfurina a 37 °C analizado usando SEC tras 5 dfas de incubacion. El mismo experimento que en la figura 27. Se representan graficamente las alturas de pico de rfurina tras cinco dfas de incubacion a 37 °C frente al porcentaje de trehalosa anadida a las muestras.

Figura 29. Efecto del contenido de polisorbato 80 sobre la actividad de rfurina sometido a prueba tras 5 dfas de incubacion a 37 °C. El mismo experimento que en la figura 24. En primer lugar, se realizaron adiciones conocidas de todas las muestras con HEPES, ácido acetico (concentraciones finales: HEPES - 50 mM, ácido acetico - 50 mM, pH 6,0) y el 5 % de trehalosa, luego, se anadieron diversas cantidades de polisorbato 80. Se representa graficamente la actividad de furina tras cinco dfas de incubacion a 37 °C frente a la cantidad de polisorbato 80 anadido a las muestras. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 30. Efecto del contenido de polisorbato 80 sobre la estabilidad de rfurina a 37 °C analizado usando SEC tras 5 dfas de incubacion. Las mismas muestras que en la figura 29. Se representan graficamente alturas de pico de rfurina tras cinco dfas de incubacion a 37 °C frente a la cantidad de polisorbato 80 anadido a las muestras.

Figura 31. rFurina en la formulacion altamente estabilizada - estudio de agitacion analizado usando el ensayo de actividad de furina. Se realizaron adiciones conocidas de las muestras de rfurina en la formulacion altamente estabilizada con diversas cantidades de polisorbato 80. El grafico muestra valores de actividad de furina antes y despues de tres horas de agitacion. Los datos se ordenan desde la actividad mas alta hasta la mas baja. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4. Las barras de la izquierda en cada par muestran la actividad a tiempo 0, las barras de la derecha en cada par muestran la actividad tras la agitacion.

Figura 32. rFurina en la formulacion altamente estabilizada - estudio de agitacion analizado usando SEC. El mismo experimento que en la figura 31. El grafico muestra alturas de pico de rfurina antes y despues de tres horas de agitacion. Los datos se ordenan desde el mas alto hasta el mas bajo. Las barras de la izquierda en cada par muestran la actividad a tiempo 0, las barras de la derecha en cada par muestran la actividad tras la agitacion.

Figura 33. rFurina en la formulacion altamente estabilizada - efectos del contenido de polisorbato en un estudio de agitacion analizado usando el ensayo de actividad de furina. Las mismas muestras que en la figura 32. Se representa graficamente la actividad de furina tras tres horas de agitacion frente al contenido de polisorbato 80. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 34. rFurina en la formulacion altamente estabilizada - efecto de polisorbato 80 en el estudio de agitacion analizado usando SEC. Las mismas muestras que en la figura 32. Se representan graficamente alturas de pico de rfurina tras tres horas de agitacion frente al contenido de polisorbato 80.

Figura 35. rFurina en la formulacion de control - estudio de agitacion analizado usando SEC. El cromatograma muestra una superposicion de perfiles de absorcion de SEC a 280 nm que comparan muestras de rfurina en la formulacion de control antes y despues de tres horas de agitacion. El pico de rfurina de la muestra agitada es significativamente mas pequeno que la muestra de control. Se observa la ausencia de picos de alta masa molecular en la muestra agitada (para una explicacion, vease el parrafo 3.5.1).

Figura 36. Espectros UV de rfurina en la formulacion de control (las mismas muestras que en la figura 35). El espectro UV de la muestra de rfurina tras tres horas de agitacion muestra un perfil inclinado y extremadamente elevado comparado con la muestra antes de la agitacion, lo cual indica la presencia de un nivel significativo de agregados en la muestra agitada.

Figura 37. Espectros UV de las muestras de rfurina en la formulacion altamente estabilizada sin polisorbato 80. El espectro UV de la muestra de rfurina tras tres horas de agitacion muestra un perfil elevado comparado con la muestra antes de la agitacion, lo cual indica la presencia de un nivel significativo de agregados en la muestra agitada.

Figura 38. rFurina en la formulacion altamente estabilizada sin polisorbato 80 - un estudio de agitacion analizado usando SEC. El cromatograma muestra una superposicion de perfiles de absorcion de SEC a 280 nm que comparan muestras de rfurina en la formulacion altamente estabilizada sin polisorbato 80 antes y despues de tres horas de agitacion. El pico de rfurina de la muestra agitada es significativamente mas pequeno que la muestra de control. Se observa la ausencia de picos de alta masa molecular.

Figura 39. Espectros UV de las muestras de rfurina en la formulacion altamente estabilizada que contiene 10 ppm de polisorbato 80. El espectro UV de la muestra de rfurina tras tres horas de agitacion muestra un perfil ligeramente elevado comparado con la muestra tras la agitacion, lo cual indica la presencia de agregados en la muestra agitada. El espectro "agitado" esta mas proximo al espectro "antes de agitarse", en relacion con aquellos observados en muestras sin polisorbato (figuras 36 y 37), lo cual indica que el nivel de agregacion es menor que el observado en muestras sin polisorbato.

Figura 40. Espectros UV de las muestras de rfurina en la formulacion altamente estabilizada que contiene 25 ppm de polisorbato 80. El espectro UV de la muestra de rfurina tras tres horas de agitacion muestra un perfil ligeramente elevado comparado con la muestra tras la agitacion, lo cual indica la presencia de una pequena cantidad de agregados en la muestra agitada.

Figura 41. Espectros UV de las muestras de rfurina en la formulacion altamente estabilizada que contiene 50 ppm de polisorbato 80. El espectro UV de la muestra de rfurina tras tres horas de agitacion muestra un perfil muy similar al de la muestra antes de la agitacion. Ningun espectro esta inclinado o elevado, lo cual indica que ninguna muestra contiene cantidades significativas de agregados grandes.

Figura 42. Espectros UV de las muestras de rfurina en la formulacion altamente estabilizada que contiene 100 ppm de polisorbato 80. El espectro UV de la muestra de rfurina tras tres horas de agitacion muestra un perfil muy similar al de la muestra antes de la agitacion. Ningun espectro esta inclinado o elevado, lo cual indica que ninguna muestra contiene cantidades significativas de agregados grandes.

Figura 43. rFurina en la formulacion altamente estabilizada - un estudio de congelacion/descongelacion analizado usando el ensayo de actividad de furina. Se realizaron adiciones conocidas de las muestras de rfurina en la formulacion altamente estabilizada con diferentes cantidades de polisorbato 80. Los datos muestran actividad de rfurina en las muestras antes y despues de 5 ciclos de congelacion/descongelacion. Los datos se ordenan desde el mas alto hasta el mas bajo. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 44. rFurina en la formulacion altamente estabilizada - un estudio de congelacion/descongelacion analizado usando SEC. Las mismas muestras que en la figura 43. Los datos muestran las alturas de pico de rfurina antes y despues de 5 ciclos de congelacion/descongelacion. Los datos se ordenan desde el mas alto hasta el mas bajo. Figura 45. rFurina en la formulacion altamente estabilizada - un estudio de congelacion/descongelacion analizado usando SEC. Las mismas muestras que en la figura 44. Las alturas de pico relativas de rfurina se representan graficamente frente al numero de ciclos de congelacion/descongelacion. Las alturas de pico relativas se calcularon como los porcentajes de las alturas de pico de rfurina antes del primer ciclo de congelacion/descongelacion.

Figura 46. Estabilidad de rfurina en la formulacion altamente estabilizada a 37 °C analizada usando el ensayo de actividad de furina. Se incubaron muestras de rfurina en o bien la formulacion de control o bien la formulacion altamente estabilizada a 37 °C durante 4 dfas. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 47. Estabilidad de rfurina en the formulacion altamente estabilizada a 37 °C analizada usando el ensayo de actividad de furina. Volvieron a calcularse las mismas muestras que en la figura 46. Se calculo la actividad relativa de cada muestra como el porcentaje de su actividad inicial. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4. Figura 48. Estabilidad de rfurina en la formulacion altamente estabilizada a 37 °C analizada usando SEC. Las mismas muestras que en la figura 46. La altura de pico relativa de rfurina para cada muestra se calculo como el porcentaje de su altura de pico inicial. Las barras de error son ± 1 desviacion estandar; n = 4.

Figura 49. Efecto de la temperatura sobre el pH (B) y la conductividad (A) del tampon madre de formulacion altamente estabilizada (HEPES 500 mM, ácido acetico 400 mM, CaCl21 mM, pH 6,0).

Descripcion detallada de la invencion

I. Introduccion

La presente divulgacion se basa en parte en el descubrimiento de que composiciones de furina acuosas pueden estabilizarse frente a diversos esfuerzos mecanicos y qrnmicos mediante la adicion de azucares, alcoholes de azucar y tensioactivos no ionicos. Las composiciones de furina acuosas descritas en el presente documento son significativamente mas estables cuando se almacenan a por encima de la temperatura ambiente, asf como cuando se someten a tensionos mecanicos, en comparacion con composiciones de furina similares que carecen de azucares, alcoholes de azucar y tensioactivos no ionicos. La presente divulgacion tambien se basa en parte en el descubrimiento de que la adicion de tensioactivos no ionicos a tampones de dilucion de furina permite una mayor recuperacion de actividad de furina cuando se diluye la enzima a concentraciones inferiores usadas durante la fabricacion de diversos compuestos biologicos recombinantes, tales como VWF.

Ventajosamente, los estudios descritos en el presente documento demuestran que la adicion de azucar o alcoholes de azucar a una composicion de furina potencia la estabilidad de la composicion cuando se almacena a lo largo de un periodo de tiempo. Por ejemplo, se muestra en el presente documento que la inclusion de tan solo el 2 % de azucar o alcohol de azucar en una formulacion de furina acuosa puede aumentar la estabilidad de la composicion en mas del 10 %. Ademas, se muestra que la inclusion del 10 % de azucar o alcohol de azucar en una formulacion de furina acuosa puede aumentar la estabilidad de la composicion en mas del 75 %.

Ventajosamente, los estudios descritos en el presente documento tambien demuestran que la adicion de tensioactivo no ionico a una composicion de furina potencia la estabilidad de la composicion cuando se somete a esfuerzo mecanico. Por ejemplo, se muestra en el presente documento que la inclusion de tan solo 10 ppm de tensioactivo no ionico en una formulacion de furina acuosa puede aumentar la estabilidad de la composicion en mas del 75 %.

Ventajosamente, los estudios descritos en el presente documento tambien demuestran que la inclusion de tensioactivo no ionico en un tampon de dilucion de furina aumenta la recuperacion de actividad de furina tras la dilucion. Por ejemplo, se muestra en el presente documento que la inclusion de 75 ppm de tensioactivo no ionico en un tampon de dilucion de furina aumenta la recuperacion de actividad de furina tras la dilucion en de 3 a 4 veces. Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona composiciones de formulaciones de furina altamente estabilizadas. Aunque la mayona de la discusion en el presente documento es en cuanto a formulaciones altamente estabilizadas de furina recombinante (rfurina), se apreciara que cualquier protema furina, incluyendo furina aislada de un sujeto o cualquier derivado o mutante de furina, puede incluirse en las formulaciones de la presente invencion. En un aspecto, la presente divulgacion proporciona formulaciones de furina altamente estabilizadas que muestran estabilidad mejorada con respecto a formulaciones de control cuando se someten a ensayo tras someter la formulacion a uno o mas factores de esfuezo, incluyendo sin limitacion la exposicion de las formulaciones a un intervalo de temperaturas, a varios ciclos de congelacion/descongelacion y/o a agitacion. Se evalua la estabilidad mejorada generalmente mediante el nivel de actividad de furina, por ejemplo, tras el almacenamiento a una temperatura superior a la temperatura ambiente ambiental, una formulacion de furina altamente estabilizada mostrara un nivel superior de actividad que una formulacion de control almacenada en condiciones identicas en comparacion con la actividad de cada una antes del almacenamiento (es decir, a tiempo = 0). Se describen metodos para evaluar la estabilidad de una formulacion de furina en el presente documento.

En aspectos adicionales, la presente divulgacion proporciona metodos para formar formulaciones de furina altamente estabilizadas de la presente invencion. Tales metodos incluyen metodos para estabilizar una formulacion de furina durante el almacenamiento, incluyendo almacenamiento congelado, almacenamiento a temperatura ambiente ambiental o superior o liofilizacion.

En aun otros aspectos, la presente divulgacion proporciona metodos para diluir disoluciones de furina concentradas que dan como resultado una retencion aumentada de actividad de furina tras la dilucion. En comparacion con composiciones de furina diluidas con disoluciones que carecen de tensioactivo no ionico, las composiciones acuosas de furina diluidas segun los metodos proporcionados en el presente documento retienen de 3 a 4 veces mas actividad enzimatica.

II. Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, el termino "furina" se refiere a cualquier protema o polipeptido con actividad de furina, particularmente la capacidad para escindir el enlace peptfdico entre los residuos Arg-763 y Ser-764 del polipeptido de profactor de Von Willebrand (pro-VWF). En una realizacion a modo de ejemplo, furina se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoácidos identica o altamente identica a la de NP_002560.1 (preproprotema furina humana). En una realizacion a modo de ejemplo, furina se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoácidos identica o altamente identica a los aminoácidos 25-794 de n P_002560.1 (proprotema furina humana). En una realizacion a modo de ejemplo, furina se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoácidos identica o altamente identica a los aminoácidos 108-794 de NP_002560.1 (protema furina madura humana). Tal como se usa en el presente documento, los polipeptidos de furina tambien incluyen variantes naturales de furina con actividad de escision de VWF, asf como construcciones de furina modificada con actividad de escision de VWF. Tal como se usa en el presente documento, furina abarca cualquier variante natural, secuencia alternativa, protema mutante o isoforma que retiene algo de actividad basal (por ejemplo, al menos el 1 %, el 5 %, el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, o mas actividad en comparacion con la actividad de furina de tipo natural). Los ejemplos de mutaciones de furina encontrados en la poblacion humana incluyen, sin limitacion, A43E, A43G, A43V, R50W, Y64C, L77P, R81C, E97A, E97V, V109M, V109L, R130W, A139V, P169T, N245S, E271K, Q339R, N407S, E457Q, R464W, K469R, S524Y, T536S, L570F, D624N, A642T, S685P, V728I, V735I, R745Q, P772L y A793T. Los polipeptidos de furina tambien incluyen polipeptidos que contienen modificacion postraduccional. Por ejemplo, se ha demostrado que la furina se fosforila en los residuos S773 y S775 y se ha predicho que la furina se glicosila en los residuos N387, N440 y N553.

En el contexto de la presente divulgacion, las protemas furina incluyen polipeptidos de furina recombinante, asf como polipeptidos de furina nativa aislados a partir de un material original (por ejemplo, tejido o sangre). Los polipeptidos de furina (recombinante y purificada original) pueden derivarse de cualquier organismo adecuado, por ejemplo, un mairnfero tal como un primate, humano, mono, conejo, cerdo, roedor, raton, rata, hamster, jerbo, canino, felino, y derivados biologicamente activos de los mismos. Tambien estan comprendidos polipeptidos de furina variantes y mutantes que tienen actividad de escision de VWF, cuando sean fragmentos funcionales, y protemas de fusion que comprenden polipeptidos de furina. Ademas, los polipeptidos de furina descritos en el presente documento pueden comprender ademas etiquetas que facilitan la purificacion, la deteccion, o ambas. Los polipeptidos de furina descritos en el presente documento pueden modificarse ademas con un resto terapeutico o un resto adecuado para la obtencion de imagenes in vitro o in vivo.

Puede prepararse furina recombinante proteolfticamente activa mediante expresion en cultivo celular (por ejemplo, cultivo celular de mairnferos). Ejemplos no limitativos de metodos de expresion y purificacion para preparar furina recombinante se describen en los documentos WO 1991/06314, WO 1992/09698, las patentes estadounidenses n.° 6.210.929 y 6.596.526, asf como en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n^ 2009/0181423 y 2009/0304669.

Tal como se usa en el presente documento, "actividad" se refiere a una actividad funcional o actividades funcionales de furina o porcion de la misma asociada(s) con una protema de longitud completa (mtegra). Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biologica, incluyendo la participacion en la maduracion proteolftica de sustratos de proprotema y la escision de sustratos de prueba tales como Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO:1; AMC = 7-amino-4-metoxicumarina). Los sustratos para furina incluyen factor de Von Willebrand, prohormona paratiroidea, precursor del factor de crecimiento transformante beta 1, proalbumina, probetasecretasa, metaloproteinasa de la matriz de tipo 1 de membrana y la subunidad beta del profactor de crecimiento nervioso. En una realización, una unidad (U) de actividad de furina se define como la cantidad de furina que libera 1 pmol de AMC a partir de Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO:1) por minuto.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "estabilidad" (tal como estabilidad de furina o estabilidad de formulacion de furina) se usa en un contexto estructural, por ejemplo, referente a la integridad estructural de una protema, o en un contexto funcional, por ejemplo, referente a la capacidad de la protema para retener su funcion y/o actividad a lo largo del tiempo. Como se apreciara, la protema en discusion puede estar contenida dentro de una formulacion segun los metodos y composiciones descritos en el presente documento, y la estabilidad de esa protema se refiere a su estabilidad en esa formulacion. En una realización, la estabilidad de una composicion de furina se determina midiendo la actividad de furina de la composicion. Por ejemplo, usando un sustrato de furina detectable tal como Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 1; por ejemplo, ALX-260-040-M001 comercializado por Enzo Life Sciences), por ejemplo, en un ensayo tal como se describe en Malloy SS, et al., J Biol Chem. 15 de agosto de 1992; 267(23):16396-402. En una realización, la estabilidad de la composicion de furina formulada con azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico, tal como se describe en el presente documento, se compara con una composicion de furina formulada sin el azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico.

Tal como se usa en el presente documento, una composicion de furina acuosa "estable en almacenamiento" se refiere a una disolucion de polipeptidos de furina (por ejemplo, una disolucion de polipeptidos de rfurina) que se ha formulado para aumentar la estabilidad de la protema en disolucion, por ejemplo, en al menos el 10 %, a lo largo de un tiempo de almacenamiento dado. En el contexto de la presente divulgacion, una disolucion de polipeptidos de furina (por ejemplo, una disolucion de polipeptidos de rfurina) puede hacerse "estable en almacenamiento" mediante la adicion de un azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico como agente estabilizante. En algunas realizaciones, puede medirse la estabilidad del polipeptido de furina en cualquier formulacion dada, por ejemplo, monitorizando la formacion de agregados, la perdida de actividad enzimatica a granel o la formacion de productos de degradacion, a lo largo de un periodo de tiempo. La estabilidad absoluta de una formulacion, y los efectos estabilizantes del azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico, variaran dependiendo de la composicion particular que se estabiliza. En una realización, la estabilidad de una composicion de furina se determina midiendo la actividad de furina de la composicion. Por ejemplo, usando un sustrato de furina detectable tal como Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO:1; por ejemplo, ALX-260-040-M001 comercializado por Enzo Life Sciences), en un ensayo, por ejemplo, tal como se describe en Malloy SS, et al., J Biol Chem. 15 de agosto de 1992; 267(23):16396-402. En una realización, la estabilidad de la composicion de furina formulada con azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico, tal como se describe en el presente documento, se compara con una composicion de furina formulada sin el azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico.

Tal como se usa en el presente documento, "vida util en almacenamiento" se refiere al periodo de tiempo que una formulacion mantiene un nivel predeterminado de estabilidad a una temperatura predeterminada. En realizaciones particulares, la temperatura predeterminada se refiere a almacenamiento congelado (por ejemplo, -80 °C, -25 °C, 0 °C), refrigerado (por ejemplo, de 0° a 10 °C) o a temperatura ambiente (por ejemplo, de 18 °C a 32° C).

Tal como se usa en el presente documento, el termino "tiempo de estabilidad" se refiere a la cantidad de tiempo que una formulacion se considera estable. Por ejemplo, el tiempo de estabilidad para una formulacion puede referirse a la cantidad de tiempo durante el cual el nivel de agregacion y/o degradacion de protema en la formulacion permanece por debajo de un umbral determinado (por ejemplo, el 1 %, el 2 %, el 3 %, el 4 %, el 5 %, el 6 %, el 7 %, el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 11 %, el 12 %, el 13 %, el 14 %, el 15 %, el 16 %, el 17 %, el 18 %, el 19 %, el 20 %, etc.), y/o la cantidad de tiempo que una formulacion mantiene una actividad biologica por encima de un umbral determinado (por ejemplo, el 100 %, el 95 %, el 90 %, el 85 %, el 80 %, el 75 %, el 70 %, el 65 %, el 60 %, el 55 %, el 50 %, etc.) de la cantidad de actividad presente en la formulacion en el inicio del periodo de almacenamiento.

En el contexto de la presente divulgacion, una composicion acuosa estable en almacenamiento de un polipeptido de furina (por ejemplo, polipeptido de rfurina) formulada con un azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico tendra un tiempo de estabilidad mas prolongado que una composicion del mismo polipeptido de furina formulada sin el azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico. En algunas realizaciones, una composicion acuosa estable en almacenamiento de un polipeptido de furina, tendra un tiempo de estabilidad que es, por ejemplo, al menos el 10 % mayor que el tiempo de estabilidad para la misma composicion formulada en ausencia del azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico, o al menos el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, el 110%, el 120 %, el 130 %, el 140 %, el 150 %, el 160 %, el 170 %, el 180 %, el 190 % mayor, o al menos 2 veces mayor, o al menos 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, 5,0 veces, 5,5 veces, 6,0 veces, 6,5 veces, 7,0 veces, 7,5 veces, 8,0 veces, 8,5 veces, 9,0 veces, 9,5 veces, 10 veces, o mas veces mayor que el tiempo de estabilidad para la misma composicion formulada en ausencia del azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico.

Tal como se usa en el presente documento, "almacenamiento" significa que una formulacion no se administra de manera inmediata a un sujeto o se utiliza en un procedimiento de produccion una vez preparada, sino que se conserva durante un periodo de tiempo en condiciones particulares (por ejemplo, temperatura particular) antes de su uso. Por ejemplo, una formulacion de furina puede conservarse durante dfas, semanas, meses o anos, antes de su administracion a un sujeto a temperaturas variadas tales como de congelacion (por ejemplo, -80 °C, -25 °C, 0 °C), refrigeradas (por ejemplo, de 0° a 10 °C) o a temperatura ambiente (por ejemplo, de 18 °C a 32 °C). Tal como se apreciara, tales formulaciones pueden ser formulaciones lfquidas o liofilizadas.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "aproximadamente" indica un intervalo aproximado de mas o menos el 10 % de un valor especificado. Por ejemplo, la expresion "aproximadamente el 20 %" abarca un intervalo del 18-22 %.

Tal como se usa en el presente documento, cuando se hace referencia a una concentracion de un componente individual de una composicion, las frases "no mas de X" y "desde 0 hasta X" son equivalentes y se refieren a cualquier concentracion entre e incluyendo 0 y X. Por ejemplo, las frases "una concentracion de no mas del 2 %" y "una concentracion desde el 0 % hasta el 2 %" son equivalentes e incluyen el 0 %, el 1 % y el 2 %.

Tal como se usa en el presente documento, cuando se hace referencia a una concentracion de un componente individual de una composicion, las frases "no menos de X" se refiere a cualquier concentracion X o mayor. Por ejemplo, la frase "una concentracion de no menos del 98 %" incluye el 98 %, el 99 % y el 100 %.

Tal como se usa en el presente documento, cuando se hace referencia a una concentracion de un componente individual de una composicion, las frases "entre X e Y" y "desde X hasta X" son equivalentes y se refieren a cualquier concentracion entre e incluyendo X e Y. Por ejemplo, las frases "una concentracion de entre el 49 % y el 51 %" y "una concentracion desde el 49 % hasta 51 %" son equivalentes e incluyen el 49 %, el 50 % y el 51 %. Tal como se usa en el presente documento, un "azucar" se refiere a monosacaridos que tienen la formula general CxH2yOy (lineal) o CxH(2y-1)Oy (dclico), y disacaridos que consisten en dos unidades de monosacaridos formados a traves de una reaccion de deshidratacion. Los monosacaridos pueden clasificarse por el numero de atomos de carbono que contienen: diosa (2), triosa (3), tetrosa (4), pentosa (5), hexosa (6), heptosa (7), etc. Por consiguiente, tal como se usa en el presente documento, un azucar C(X) se refiere a un azucar que contienen un numero X de moleculas de carbono. Por ejemplo, un azucar C(5) se refiere a un azucar pentosa, mientras que un azucar C(6) se refiere a un azucar hexosa. Los ejemplos no limitativos de azucares que pueden usarse en las formulaciones proporcionadas en el presente documento incluyen: azucar diosa glicolaldetudo, azucares triosa gliceraldetudo y dihidroxiacetona; azucares tetrosa eritrosa, treosa y eritrulosa; azucares pentosa arabinosa, lixosa, ribosa, xilosa, ribulosa y xilulosa; azucares hexosa alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, psicosa, fructosa, sorbosa y tagatosa; azucares heptosa sedoheptulosa, manoheptulosa y L-glicero-D-mano-heptosa; y todas las posibles combinaciones de azucares disacaridos formados a partir de los mismos, incluyendo sin limitacion sacarosa, lactulosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, kojibiosa, nigerosa, isomaltosa, p,p-trehalosa, a,ptrehalosa, soforosa, laminaribiosa, gentiobiosa, turanosa, maltulosa, palatinosa, gentiobiulosa, manobiosa, melibiosa, melibiulosa, rutinosa, rutinulosa y xilobiosa.

Tal como se usa en el presente documento, un "alcohol de azucar" se refiere a una forma hidrogenada de un mono o disacarido, cuyo grupo carbonilo se ha reducido para formar un hidroxilo primario o secundario. En una realización, el alcohol de azucar tiene entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8 atomos de carbono. Los ejemplos no limitativos de alcoholes de azucar que pueden usarse en formulaciones proporcionadas en el presente documento incluyen glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, fucitol, iditol, volmitol, isomaltitol, maltitol, lactitol, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol.

Tal como se usa en el presente documento, una "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sal que es segura para su administracion a un sujeto (por ejemplo, un humano) en una formulacion de farmaco. La seleccion y el uso de sales farmaceuticamente aceptables se conoce bien en la tecnica, por ejemplo, vease Stahl y Wermuth, Pharmaceutical Sales: Properties, Selection, and Use, 2.a edicion revisada, Wiley, Hoboken, Nueva Jersey. En determinadas realizaciones, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio, cloruro de potasio o una combinacion de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "tensioactivo no ionico" se refiere a un agente tensioactivo que no esta ionizado en condiciones fisiologicamente relevantes. Los ejemplos no limitativos de tensioactivos no ionicos utiles para las composiciones de furina acuosas estabilizadas proporcionadas en el presente documento incluyen: mono, di y trigliceridos solubles en agua no ionicos (por ejemplo, dicaprilato/dicaprato de propilenglicol (por ejemplo MIGLYOL® 840), mono y digliceridos de cadena media (por ejemplo CAPMUL® e IMWITOR® 72), trigliceridos de cadena media (por ejemplo trigliceridos capfflico y caprico tales como LAVRAFAC, MIGLYOL® 810 o 812, CRODAMOL® GTCC-PN y ^s O^fTISON 378), monogliceridos de cadena larga (por ejemplo monooleatos de glicerilo tales como PECEOL® y monolinoleatos de glicerilo tales como MAISINE®), aceite de ricino de polioxilo (por ejemplo ricinoleato de macrogolglicerol, hidroxiestearato de macrogolglicerol, cetostearil eter de macrogol)); mono y diesteres de ácidos grasos solubles en agua no ionicos de polietielenglicol; esteres de ácidos grasos de sorbitano solubles en agua no ionicos (por ejemplo, monolauratos de sorbitano tales como monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano (TWEEN 20) y monolaurato de sorbitano (SPAN 20); monopalmitatos de sorbitano tales como monopalmitatos de polioxietileno (20) sorbitano (TWEEN 40) y monopalmitato de sorbitano (SPAN 40); monoestearatos de sorbitano tales como monoestearato de polioxietileno (20) sorbitano (TWEEN 60) y monoestearato de sorbitano (SPAN 60); monooleatos de sorbitano tales como monooleato de polioxietileno (20) sorbitano (TWEEN 80) y monooleato de sorbitano (SPAN 80); trioleatos de sorbitano tales como trioleato de sorbitano (SPAN 85); y trioestearatos de sorbitano tales como trioestearato de sorbitano (SPAN65)); gliceridos poliglicolizados (por ejemplo, gliceridos de lauroilmacrogol 6 (Labrafil® M2130CS); succinato de d-a-tocoferilo de polietilenglicol l000 (TPGS), 12-hidroxiestearato de polietilenglicol 660 (SOLUTOL® HS 15), oleato y estearato de polioxilo (por ejemplo monoestearato de PEG 400 y monoestearato de PEG 1750)); copolfmeros de tribloque solubles en agua no ionicos (por ejemplo copolfmeros de tribloque de poli(oxido de etileno)/poli(oxido de propileno)/poli(oxido de etileno) tales como poffmero de metiloxirano con oxirano BHT (PLURONIC® F-127)).

En una realización, se proporcionan composiciones de furina (por ejemplo, rfurina) estables en almacenamiento que contienen un tensioactivo no ionico seleccionado de un monoglicerido soluble en agua no ionico, un diglicerido soluble en agua no ionico, un triglicerido soluble en agua no ionico, esteres de ácidos monograsos solubles en agua no ionicos de polietielenglicol, esteres de ácidos digrasos solubles en agua no ionicos de polietielenglicol, un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico, un glicerido poliglicolizado no ionico, un copoffmero de tribloque soluble en agua no ionico y una combinacion de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "derivado biologicamente activo", cuando se usa en el contexto de polipeptido de furina, tambien abarca polipeptidos obtenidos a traves de tecnologfa de ADN recombinante. Esto puede incluir cualquier metodo conocido en la tecnica para (i) la produccion de ADN recombinante mediante ingenieffa genetica, por ejemplo, a traves de transcripcion inversa de ARN y/o amplificacion de ADN, (ii) introduccion de ADN recombinante en celulas procariotas o eucariotas mediante transfeccion, por ejemplo, a traves de electroporacion o microinyeccion, (iii) cultivo de dichas celulas transformadas, por ejemplo, de manera continua o discontinua, (iv) expresion de la protema furina, por ejemplo, de manera constitutiva o tras la induccion, y (v) aislamiento de dicha protema furina, por ejemplo, a partir del medio de cultivo o recogiendo las celulas transformadas, con el fin de (vi) obtener protema furina recombinante sustancialmente purificada, por ejemplo, a traves de cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de exclusion molecular, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de interaccion hidrofoba, y similares. El termino "derivado biologicamente activo" incluye tambien moleculas quimericas tales como, por ejemplo, una protema furina o fragmento funcional de la misma, en combinacion con un segundo polipeptido, por ejemplo, un dominio Fc de inmunoglobulina o un dominio de albumina, con el fin de mejorar las propiedades biologicas/farmacologicas tales como, por ejemplo, semivida de la protema furina en el sistema de circulacion de un mairfffero, particularmente un humano.

Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte de manera clara lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un agente de tamponamiento" se refiere a un agente o mezclas de tales agentes, y la referencia a "el metodo" incluye la referencia a etapas y metodos equivalentes conocidos por los expertos en la tecnica, y asf sucesivamente.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cienffficos usados en el presente documento tienen el mismo significado como entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la cual esta invencion pertenece.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la decima de la unidad del lfmite inferior a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el lfmite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio, se abarca dentro de la invencion. Los lfmites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos que pueden incluirse independientemente en los intervalos mas pequenos tambien se abarcan dentro de la invencion, conforme a cualquier lfmite excluido espedficamente en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos lfmites, tambien se incluyen en la invencion intervalos que excluyen cualquiera de ambos de esos lfmites incluidos.

Tal como se usa en el presente documento, "BDS" se refiere a "principio activo a granel".

III. Composiciones acuosas estabilizadas de furina recombinante

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona formulaciones acuosas estabilizadas de furina, por ejemplo, rfurina. Las siguientes realizaciones se basan en parte en el descubrimiento de que la inclusion de un azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico estabiliza composiciones de furina acuosas, en comparacion con composiciones que carecen del azucar, alcohol de azucar y/o tensioactivo no ionico.

Tal como reconocera un experto en la tecnica, composiciones de furina (por ejemplo, composiciones de rfurina) formuladas segun las realizaciones proporcionadas en el presente documento pueden contener, ademas de los componentes divulgados de manera explfcita, contraiones aportados mediante la inclusion de componentes de la disolucion o agentes modificadores del pH, por ejemplo, sodio o potasio aportados por una sal de acetato, hidroxido de sodio o hidroxido de potasio o cloruro aportado por cloruro de calcio o ácido clorlddrico. En el contexto de la presente divulgacion, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estable en almacenamiento que consiste en o que consiste esencialmente en una formulacion dada puede comprender ademas uno o mas contraiones, como se requiera por el procedimiento de formulacion a un pH particular.

En una realización, una composicion de furina estable en almacenamiento (por ejemplo, composicion de rfurina) proporcionada en el presente documento se estabilizara a temperatura ambiente (es decir, entre 18 °C y 32 °C) durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, en una realización, una composicion de inmunoglobulina acuosa, estable en almacenamiento sera estable cuando se almacena a temperatura ambiente durante al menos 4 dfas. En otras realizaciones, la composicion sera estable a temperatura ambiente durante al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28 o mas dfas. En otras realizaciones, la composicion sera estable durante al menos 1 mes. En aun otras realizaciones, la composicion sera estable durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o mas meses. En determinadas realizaciones, temperatura ambiente se refiere a entre 20 °C y 30 °C, entre 21 °C y 29 °C, entre 22 °C y 28 °C, entre 23 °C y 27 °C, entre 24 °C y 26 °C, o aproximadamente 25 °C. En una realizacion espedfica, la composicion sera estable durante un periodo de tiempo prolongado cuando se almacena a una temperatura de entre 20 °C y 25 °C.

En una realización, una composicion de furina estable en almacenamiento (por ejemplo, composicion de rfurina) proporcionada en el presente documento se estabilizara a temperatura refrigerada (es decir, entre 2 °C y 10 °C) durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, en una realización, una composicion de inmunoglobulina acuosa, estable en almacenamiento sera estable cuando se almacena a temperatura refrigerada durante al menos 4 dfas. En otras realizaciones, la composicion sera estable a temperatura refrigerada durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28 o mas dfas. En otras realizaciones, la composicion sera estable durante al menos 1 mes. En aun otras realizaciones, la composicion sera estable durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,48 o mas meses. En una realizacion espedfica, la composicion sera estable durante un periodo de tiempo prolongado cuando se almacena a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C.

En una realización, una composicion de furina estable en almacenamiento (por ejemplo, composicion de rfurina) proporcionada en el presente documento se estabilizara a temperatura elevada (es decir, entre 32 °C y 42 °C) durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, en una realización, una composicion de inmunoglobulina acuosa, estable en almacenamiento sera estable cuando se almacena a temperatura elevada durante al menos 4 dfas. En otras realizaciones, la composicion sera estable a temperatura elevada durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28 o mas dfas. En otras realizaciones, la composicion sera estable durante al menos 1 mes. En aun otras realizaciones, la composicion sera estable durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o mas meses. En una realizacion espedfica, la composicion sera estable durante un periodo de tiempo prolongado cuando se almacena a una temperatura de entre 35 °C y 40 °C.

En una realización, una composicion de furina almacenada se considera estable en almacenamiento siempre que la composicion mantenga al menos el 40 % de la actividad de furina presente al inicio del periodo de almacenamiento (por ejemplo, a tiempo = 0). En otra realización, una composicion almacenada se considera estable siempre que la composicion mantenga al menos el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o mas de la actividad de furina presente al inicio del periodo de almacenamiento (por ejemplo, a tiempo = 0). En una realización, se mide la actividad de furina en un ensayo tal como se describe en Malloy S^s , et al., J Biol Chem. 15 de agosto de 1992; 267(23):16396-402.

En una realización, una composicion de furina se considera que se ha estabilizado por la adicion de un agente estabilizante (por ejemplo, un azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico) cuando la composicion contiene al menos el 10 % mas de actividad de furina tras el almacenamiento durante un periodo de tiempo, en comparacion con una composicion de furina que no contiene el agente estabilizante o que contiene una cantidad inferior del agente estabilizante. En otras realizaciones, una composicion de furina se considera que se ha estabilizado por la adicion de un agente estabilizante (por ejemplo, un azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico) cuando la composicion contiene al menos el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 100%, o un porcentaje mayor de mas actividad de furina tras el almacenamiento durante un periodo de tiempo, en comparacion con una composicion de furina que no contiene el agente estabilizante o que contiene una cantidad inferior del agente estabilizante.

En una realización, una composicion de furina almacenada se considera estable siempre que el porcentaje de furina presente en un estado agregado permanezca en no mas del 50 %. En otras realizaciones, una composicion de furina almacenada se considera estable siempre que el porcentaje de furina presente en un estado agregado permanezca en no mas del 45 %, el 40 %, el 35 %, el 30 %, el 25 %, el 24 %, el 23 %, el 22 %, el 21 %, el 20 %, el 19 %, el 18 %, el 17 %, el 16 %, el 15 %, el 14 %, el 13 %, el 12 %, el 11 %, el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 %, el 1 % o menos.

En una realización, una composicion de furina se considera que se ha estabilizado por la adicion de un agente estabilizante (por ejemplo, un azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico) cuando la composicion contiene al menos el 10% menos de furina presente en un estado agregado tras el almacenamiento durante un periodo de tiempo, en comparacion con una composicion de furina que no contiene el agente estabilizante o que contiene una cantidad inferior del agente estabilizante. En otras realizaciones, una composicion de furina se considera que se ha estabilizado por la adicion de un agente estabilizante (por ejemplo, un azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico) cuando la composicion contiene al menos el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, o un porcentaje mayor de menos furina presente en un estado agregado tras el almacenamiento durante un periodo de tiempo, en comparacion con una composicion de furina que no contiene el agente estabilizante o que contiene una cantidad inferior del agente estabilizante.

En una realización, una composicion de furina almacenada se considera estable siempre que la composicion mantenga al menos el 40 % de la actividad de furina de partida (por ejemplo, a tiempo = 0) tras someterse a esfuerzo mecanico. En otra realización, una composicion almacenada se considera estable siempre que la composicion mantenga el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o mas de la actividad de furina de partida (por ejemplo, a tiempo = 0) tras someterse a esfuerzo mecanico. En una realizacion espedfica, el esfuerzo mecanico es agitacion (por ejemplo, removiendo).

En una realización, una composicion de furina se considera que se ha estabilizado por la adicion de un agente estabilizante (por ejemplo, un azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico) cuando la composicion contiene al menos el 10% mas de actividad de furina tras someterse a esfuerzo mecanico, en comparacion con una composicion de furina que no contiene el agente estabilizante o que contiene una cantidad inferior del agente estabilizante. En otras realizaciones, una composicion de furina se considera que se ha estabilizado por la adicion de un agente estabilizante (por ejemplo, un azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico) cuando la composicion contiene al menos el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 100%, o un porcentaje mayor de mas actividad de furina tras someterse a esfuerzo mecanico, en comparacion con una composicion de furina que no contiene el agente estabilizante o que contiene una cantidad inferior del agente estabilizante. En una realizacion espedfica, el esfuerzo mecanico es agitacion (por ejemplo, removiendo).

En una realización, una composicion de furina almacenada se considera estable siempre que el porcentaje de furina presente en un estado agregado permanezca en no mas del 50 % tras someterse a esfuerzo mecanico. En otras realizaciones, una composicion de furina almacenada se considera estable siempre que el porcentaje de furina presente en un estado agregado permanezca en no mas del 45 %, el 40 %, el 35 %, el 30 %, el 25 %, el 24 %, el 23 %, el 22 %, el 21 %, el 20 %, el 19 %, el 18 %, el 17 %, el 16 %, el 15 %, el 14 %, el 13 %, el 12 %, el 11 %, el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 %, el 1 %, o menos tras someterse a esfuerzo mecanico. En una realizacion espedfica, el esfuerzo mecanico es agitacion (por ejemplo, removiendo).

En una realización, una composicion de furina se considera que se ha estabilizado por la adicion de un agente estabilizante (por ejemplo, un azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico) cuando la composicion contiene al menos el 10% menos de furina presente en un estado agregado tras someterse a esfuerzo mecanico, en comparacion con una composicion de furina que no contiene el agente estabilizante o que contiene una cantidad inferior del agente estabilizante. En otras realizaciones, una composicion de furina se considera que se ha estabilizado por la adicion de un agente estabilizante (por ejemplo, un azucar, alcohol de azucar o tensioactivo no ionico) cuando la composicion contiene al menos el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, o un porcentaje mayor de menos furina presente en un estado agregado tras someterse a esfuerzo mecanico, en comparacion con una composicion de furina que no contiene el agente estabilizante o que contiene una cantidad inferior del agente estabilizante. En una realizacion espedfica, el esfuerzo mecanico es agitacion (por ejemplo, removiendo).

Aunque las formulaciones de furina (por ejemplo, rfurina) descritas en esta solicitud pueden liofilizarse y reconstituirse en las concentraciones indicadas, se apreciara que estas preparaciones tambien pueden reconstituirse en una forma mas diluida. Por ejemplo, una preparacion segun la presente divulgacion que se liofiliza y/o se reconstituye normalmente en 2 ml de disolucion tambien puede reconstituirse en un volumen mayor de diluyente, tal como 5 ml. Del mismo modo, formulaciones de furina (por ejemplo, rfurina) liofilizadas tambien pueden reconstituirse en una forma mas concentrada. Por ejemplo, una preparacion segun la presente divulgacion que se liofiliza y/o se reconstituye normalmente en 2 ml de disolucion tambien puede reconstituirse en un volumen menor, tal como 1 ml.

Ventajosamente, en un aspecto, las formulaciones de furina (por ejemplo, rfurina) altamente estabilizadas de la presente invencion se combinan con un diluyente que confiere recuperacion de furina aumentada cuando la composicion resultante se usa en un metodo de produccion, por ejemplo, en la maduracion de rVWF (tambien denominado en el presente documento como "metodo de maduracion de rVWF"). La maduracion de profactor de

Von Willebrand (vWF) a su forma activa necesita un procesamiento proteolttico tras un par de aminoácidos dibasicos

(-Lys-Arg-) en el residuo 763. Se ha mostrado que el vWF se procesa de manera preferente por la enzima de escision de aminoácidos dibasicos apareados furina. Los procedimientos de produccion para vWF incluyen por tanto el uso de furina, preferiblemente en una formulacion altamente estabilizada. En un aspecto adicional, la formulacion altamente estabilizada en este diluyente aumenta la recuperacion de la actividad de furina en la etapa de maduracion de rVWF en de tres a cuatro veces comparado con formulaciones de control colocadas en diluyentes de control.

En ciertos aspectos, las formulaciones altamente estabilizadas de la invencion tienen una vida util en almacenamiento de al menos 6 meses. Tal como se apreciara, esta vida util en almacenamiento puede ser a temperaturas de congelacion (es decir, -80 °C, -25 °C, 0 °C), refrigeradas (de 0 °C a 10 °C) o a temperatura ambiente (de 20 °C a 32 °C) en forma lfquida o liofilizada. En aspectos adicionales, las formulaciones altamente estabilizadas de la invencion tienen una vida util en almacenamiento de al menos 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54 o 60 meses.

En aspectos adicionales y segun lo anterior, la vida util en almacenamiento se determina por un porcentaje de actividad que permanece tras el almacenamiento a cualquier de las temperaturas anteriores durante cualquiera de los periodos de tiempo anteriores. En determinadas realizaciones, vida util en almacenamiento significa que la formulacion retiene al menos el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 100 %

de actividad de furina medida mediante cualquier de los ensayos descritos en el presente documento o conocidos en la tecnica en comparacion con la actividad antes del almacenamiento durante cualquiera de las cantidades de tiempo anteriores a cualquiera de las temperaturas anteriores.

En un aspecto, una formulacion altamente estabilizada de furina (por ejemplo, rfurina) segun la presente divulgacion incluye: (a) 8.000 U/ml - 57.000 U/ml de furina (por ejemplo, rfurina); (b) cloruro de sodio 190 mM; (c) cloruro de calcio 0,92 mM; (d) el 10 % p/p de trehalosa dihidratada; (e) 75 ppm de polisorbato 80; (f) ácido acetico 45 mM y (g) HEPES 46 mM.

En ciertos aspectos, las formulaciones altamente estabilizadas de la presente divulgacion incluyen los siguientes componentes: HEPES 47 mM, ácido acetico 46 mM, cloruro de sodio 195 mM, cloruro de calcio 0,094 mM, el 0,0075 % de polisorbato 80, el 10 % p/p de trehalosa dihidratada, pH 6,0.

En aspectos adicionales, las formulaciones de furina altamente estabilizadas, incluyendo rfurina, segun la presente divulgacion incluyen (a) de aproximadamente 5.500 U/ml a 55.000 U/ml; de 6.000 U/ml a 50.000 U/ml; de 6.500 U/ml a 45.000 U/ml; de 7.000 U/ml a 40.000 U/ml; de 7.500 U/ml a 35.000 U/ml; de 8.000 U/ml a 30.000 U/ml; de

8.500 U/ml a 25.000 U/ml; de 9.000 U/ml a 20.000 U/ml; de 9.500 U/ml a 15.000 U/ml o 10.000 U/ml de furina; (b) de aproximadamente 100 mM a 300 mM, de 110 mM a 280 mM, de 120 mM a 260 mM, de 130 mM a 240 mM, de

140 mM a 220 mM, de 150 mM a 200 mM o de 160 mM a 180 mM de cloruro de sodio; (c) de aproximadamente

0,5 mM a 9 mM, de 1 mM a 8 mM, de 1,5 mM a 7 mM, de 2 mM a 6 mM, de 2,5 mM a 5 mM o de 3 mM a 4,5 mM de cloruro de calcio; (d) de aproximadamente el 0,5 % al 19 %, del 1 % al 18 %, del 1,5 % al 17 %, del 2,0 % al 16 %, del 2,5 % al 15 %, del 3,0 % al 14 %, del 3,5 % al 13 %, del 4,0 % al 12 %, del 4,5 % al 11 %, del 5,0 % al 10 %, d 5,5 % al 9 % o del 6,0 % al 8 % de trehalosa dihidratada; (e) de aproximadamente 0,5 ppm a 140 ppm, de 1,0 ppm a

130 ppm, de 10 ppm a 120 ppm, de 20 ppm a 110 ppm, de 30 ppm a 100 ppm, de 40 ppm a 95 ppm, de 50 ppm a

90 ppm, de 55 ppm a 85 ppm, de 60 ppm a 80 ppm o de 70 ppm a 75 ppm de polisorbato 80; (f) de aproximadamente 25 mM a 90 mM, de 30 mM a 80 mM, de 35 mM a 70 mM, de 40 mM a 60 mM o de 45 mM a 50 mM de ácido acetico, y (g) de 15 mM a 95 mM, de 20 mM a 90 mM, de 25 mM a 85 mM, de 30 mM a 80 mM, de 35 mM a 75 mM, de 40 mM a 70 mM, de 45 mM a 65 mM o de 50 mM a 60 mM de HEPES.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un composicion de furina (por ejemplo, rfurina) acuosa estabilizada que comprende: furina (por ejemplo, rfurina), desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, desde 50 mM hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 10 mM de calcio, un agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el azucar es un azucar pentosa o hexosa.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) acuosa estabilizada comprende: furina (por ejemplo, rfurina), desde 100 mM hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable; desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde el 2% hasta el 20% de un azucar o alcohol de azucar; desde 100 hasta 200 ppm de un tensioactivo no ionico; desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el azucar es un azucar pentosa o hexosa.

En una realizacion espedfica, las formulaciones altamente estabilizadas de la invencion incluyen los siguientes componentes: HEPES 47 mM, ácido acetico 46 mM, cloruro de sodio 195 mM, cloruro de calcio 0,094 mM, el 0,0075 % de polisorbato 80, el 10 % p/p de trehalosa dihidratada, pH 6,0.

En otra realizacion espedfica, una formulacion altamente estabilizada de furina (por ejemplo, rfurina) segun la presente invencion incluye: (a) 8.000 - 57.000 U/ml de rfurina; (b) cloruro de sodio 190 mM; (c) cloruro de calcio 0,92 mM; (d) el 10% p/p de trehalosa dihidratada; (e) 75 ppm de polisorbato 80; (f) ácido acetico 45 mM y (g) HEPES 46 mM.

A. Agente estabilizantes

Ventajosamente, se encontro que la inclusion de azucares, alcoholes de azucar y tensioactivos no ionicos estabiliza composiciones acuosas de furina (por ejemplo, rfurina). Estos efectos se demuestran en los ejemplos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, la adicion de estos agentes aumenta la retencion de actividad de furina tras el almacenamiento en estado lfquido, reduce la agregacion de polipeptidos de furina tras el almacenamiento en estado lfquido, reduce la degradacion de polipeptidos de furina tras el almacenamiento en estado lfquido, reduce la perdida de actividad de furina tras la agitacion de una composicion de furina acuosa y reduce la agregacion provocada por la agitacion de una composicion de furina acuosa.

Por consiguiente, en una realización, la presente divulgacion proporciona una composicion de furina acuosa (por ejemplo, una composicion de rfurina) que comprende desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar y desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realización, la composicion comprende desde el 2 % hasta el 10% de azucar o alcohol de azucar y desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realización, la composicion comprende el 10±2 % de azucar o alcohol de azucar y 75±25 ppm de tensioactivo no ionico. En una realizacion espedfica, la composicion comprende el 10 % de azucar o alcohol de azucar y 75 ppm de tensioactivo no ionico. En aun otras realizaciones, la composicion comprende una combinacion de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9.

Tabla 1. Realizaciones a modo de ejemplo para la combinacion de concentraciones de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Azucar o alcohol de azucar (%)

Var. = Variacion

Tabla 2. Realizaciones a modo de ejemplo para la combinacion de concentraciones de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Azucar o alcohol de azucar (%)

Var. = Variacion

Tabla 3. Realizaciones a modo de ejemplo para la combinacion de concentraciones de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Azucar o alcohol de azucar (%)

Var. = Variacion

Tabla 4. Realizaciones a modo de ejemplo para la combinacion de concentraciones de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Var. = Variacion

Tabla 5. Realizaciones a modo de ejemplo para la combinacion de concentraciones de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Azucar o alcohol de azucar (%)

Var. = Variacion

Tabla 6. Realizaciones a modo de ejemplo para la combinacion de concentraciones de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Azucar o alcohol de azucar (%)

Var. = Variacion

Tabla 7. Realizaciones a modo de ejemplo para la combinacion de concentraciones de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Azucar o alcohol de azucar (%)

Var. = Variacion

Tabla 8. Realizaciones a modo de ejemplo para la combinacion de concentraciones de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Var. = Variacion

Tabla 9. Realizaciones a modo de ejemplo para la combinacion de concentraciones de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Var. = Variacion

1. Azucares y alcoholes de azucar

Ventajosamente, se encontro que la adicion de azucar y/o alcohol de azucar a composiciones de furina (por ejemplo, composiciones de rfurina) aumenta la estabilidad en almacenamiento de la composicion. Por ejemplo, tal como se muestra en las figuras 17 a 20 y 22 a 25, la inclusion de tan solo el 2 % de azucar y/o alcohol de azucar puede aumentar la estabilidad en almacenamiento de una composicion de furina en al menos el 20 %. Y la inclusion del 10 % de azucar y/o alcohol de azucar puede aumentar la estabilidad en almacenamiento de una composicion de furina en al menos el 75 %. Por consiguiente, en un aspecto de la presente divulgacion, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estable en almacenamiento contiene una cantidad estabilizante de azucar y/o alcohol de azucar.

En una realización, la composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estable en almacenamiento contiene azucar monosacarido. En una realizacion particular, el azucar monosacarido se selecciona del grupo que consiste en un azucar diosa, un azucar triosa, un azucar tetrosa, un azucar pentosa, un azucar hexosa, un azucar heptosa y un azucar octosa. En una realizacion particular, el azucar es un azucar pentosa, un azucar hexosa o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar es un azucar hexosa.

En otra realización, la composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estable en almacenamiento contiene un azucar disacarido. En una realizacion particular, el azucar disacarido se selecciona de azucares disacaridos formados a partir de monosacaridos de pentosa y/o hexosa. En otra realizacion particular, el azucar se selecciona de azucares disacaridos formados a partir de monosacaridos de hexosa. En una realización, el azucar es sacarosa, trehalosa o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar es sacarosa. En otra realizacion espedfica, el azucar es trehalosa. En una realización, el azucar se formula como trehalosa dihidratada.

En otra realización, la composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estable en almacenamiento contiene un alcohol de azucar. En una realizacion particular, el alcohol de azucar se selecciona de glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, fucitol, iditol, volmitol, isomaltitol, maltitol, lactitol, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En otra realizacion particular, el alcohol de azucar es manitol.

En aun otra realización, la composicion estable de furina (por ejemplo, rfurina) contiene una mezcla de azucar y alcohol de azucar. En una realización, la mezcla contiene al menos dos de un monosacarido, un disacarido y un alcohol de azucar. En otra realización, la mezcla contiene al menos dos de un azucar pentosa, un azucar hexosa, un disacarido formado a partir de monosacaridos de pentosa y/o hexosa y un alcohol de azucar. En otra realización, la mezcla contiene al menos dos de sacarosa, trehalosa y manitol.

En una realización, el azucar o alcohol de azucar esta presente en una concentracion desde el 2 % hasta el 20 %, del 2 % al 17,5 %, del 2 % al 15 %, del 2 % al 12,5 %, del 2 % al 10 %, del 2 % al 9 %, del 2 % al 8 %, del 2 % al 7 %, del 5 % al 20 %, del 5 % al 17,5 %, del 5 % al 15 %, del 5 % al 12,5 %, del 5 % al 10 %, del 7,5 % al 20 %, del 7,5 % al 17,5 %, del 7,5 % al 15 %, del 7,5 % al 12,5 %, del 10 % al 20 %, del 10 % al 17,5 %, del 10 % al 15 %, el 4±2 %, el 5±2 %, el 6±2 %, el 7±2 %, el 8±2 %, el 9±2 %, el 10±2 %, el 11±2 %, el 12±2 %, el 13±2 %, el 14±2 %, el 15±2 %, el 16±2 %, el 17±2 %, el 18±2 %, el 3±1 %, el 4±1 %, el 5±1 %, el 6±1 %, el 7±1 %, el 8±1 %, el 9±1 %, el 10±1 %, el 11±1 %, el 12±1 %, el 13±1 %, el 14±1 %, el 15±1 %, el 16±1 %, el 17±1 %, el 18±1 %, el 19±1 %, el 2 %, el 3 %, el 4 %, el 5 %, el 6 %, el 7 %, el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 11 %, el 12 %, el 13 %, el 14 %, el 15 %, el 16 %, el 17%, el 18%, el 19% o el 20%. En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 mM hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento comprende ademas desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 20 % de trehalosa, desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; una combinacion de trehalosa y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento comprende ademas desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 mM hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 mM hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 20 % de trehalosa, desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; una combinacion de trehalosa y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; el 10±5% de azucar o alcohol de azucar, agente de tamponamiento 90±25 mM y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento ademas comprende desde 10 hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10 ± 2 % de azucar o alcohol de azucar. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±1 % de azucar o alcohol de azucar. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10 % de azucar o alcohol de azucar.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; el 10±5 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento 90±25 mM y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±2 % de azucar o alcohol de azucar. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±1 % de azucar o alcohol de azucar. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10 % de azucar o alcohol de azucar.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; el 10±5% de trehalosa, desde 10 hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento 90±25 mM y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±2% de trehalosa. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±1 % de trehalosa. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10 % de trehalosa.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, agente de tamponamiento 90±25 mM y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; una combinacion de trehalosa y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 90±25 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; el 10±5% de azucar o alcohol de azucar, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6,0±0,2. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento comprende ademas desde 10 hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±2 % de azucar o alcohol de azucar. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±1 % de azucar o alcohol de azucar. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10 % de azucar o alcohol de azucar.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; el 10±5 % de azucar o alcohol de azucar, 75 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±2 % de azucar o alcohol de azucar. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±1 % de azucar o alcohol de azucar. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10 % de azucar o alcohol de azucar.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; el 10±5% de trehalosa, 75 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6,0±0,2. En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±2 % de trehalosa. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10±1 % de trehalosa. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene el 10 % de trehalosa.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; una combinacion de trehalosa y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6,0±0,2. En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En algunas realizaciones, los agentes estabilizantes usados en las formulaciones de la presente divulgacion se seleccionan de un grupo que incluye, sin limitacion: sacarosa, trehalosa, manitol, rafinosa y arginina. Estos agentes estan presentes en las formulaciones de la presente invencion en una cantidad desde el 0,1 % hasta el 20 %. En determinadas realizaciones, el agente estabilizante esta presente en una cantidad desde el 5% hasta el 15%, o aproximadamente el 10%. En realizaciones adicionales, las formulaciones de la presente divulgacion incluyen agentes estabilizantes en una cantidad desde el 0,5 % hasta el 19 %, del 1 % al 18 %, del 1,5 % al 17 %, del 2,0 % al 16 %, del 2,5 % al 15 %, del 3,0 % al 14 %, del 3,5 % al 13 %, del 4,0 % al 12 %, del 4,5 % al 11 %, del 5,0 % al 10%, del 5,5% al 9% o del 6,0% al 8 %. Ciertas formulaciones incluyen manitol, sacarosa y/o trehalosa en combinacion con uno o mas de cualquier otro componente de la formulacion divulgados en el presente documento.

2. Tensioactivos no ionicos

Ventajosamente, se encontro que la adicion de tensioactivo no ionico de azucar a composiciones de furina (por ejemplo, composiciones de rfurina) aumenta la estabilidad de la composicion a esfuerzo mecanico. Por ejemplo, tal como se muestra en las figuras 31 a 42, la inclusion de tan solo 10 ppm de tensioactivo no ionico puede aumentar la estabilidad de una composicion de furina sometida a esfuerzo mecanico en al menos el 25 %. Y la inclusion de 50 ppm de tensioactivo no ionico puede aumentar la estabilidad de una composicion de furina sometida a esfuerzo mecanico en al menos el 40 %. Por consiguiente, en un aspecto de la presente divulgacion, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estable en almacenamiento contiene una cantidad estabilizante de tensioactivo no ionico.

En una realización, se proporcionan composiciones de furina (por ejemplo, rfurina) estables en almacenamiento que contienen un tensioactivo no ionico seleccionado de un monoglicerido soluble en agua no ionico, un diglicerido soluble en agua no ionico, un triglicerido soluble en agua no ionico, esteres de ácidos monograsos solubles en agua no ionicos de polietielenglicol, esteres de ácidos digrasos solubles en agua no ionicos de polietielenglicol, un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico, un glicerido poliglicolizado no ionico, un copolfmero de tribloque soluble en agua no ionico y una combinacion de los mismos. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano).

En una realización, el tensioactivo no ionico esta presente en una concentracion desde 10 hasta 200 ppm, de 10 a 175 ppm, de 10 a 150 ppm, de 10 a 125 ppm, de 10 a 100 ppm, de 10 a 90 ppm, de 10 a 80 ppm, de 10 a 75 ppm, de 10 a 70 ppm, de 10 a 60 ppm, de 10 a 50 ppm, de 10 a 25 ppm, de 25 a 200 ppm, de 25 a 175 ppm, de 25 a 150 ppm, de 25 a 125 ppm, de 25 a 100 ppm, de 25 a 90 ppm, de 25 a 80 ppm, de 25 a 70 ppm, de 25 a 60 ppm, de 25 a 50 ppm, de 50 a 200 ppm, de 50 a 175 ppm, de 50 a 150 ppm, de 50 a 125 ppm, de 50 a 90 ppm, de 50 a 80 ppm, de 75 a 200 ppm, de 75 a 175 ppm, de 75 a 150 ppm, de 100 a 200 ppm, de 100 a 175 ppm, 50±25 ppm, 60±25 ppm, 70±25 ppm, 75±25 ppm, 80±25 ppm, 90±25 ppm, 100±25 ppm, 125±25 ppm, 150±25 ppm, 175±25 ppm, 30±10 ppm, 40±10 ppm, 50±10 ppm, 60±10 ppm, 70±10 ppm, 75±10 ppm, 80±10 ppm, 90±10 ppm, 100±10 ppm, 110±10 ppm, 120± 10 ppm, 125±10 ppm, 130±10 ppm, 140±10 ppm, 150±10 ppm, 160±10 ppm, 170±10 ppm, 175±10 ppm, 180±10 ppm, 190±10 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 75 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 100 ppm, 110 ppm, 120 ppm, 125 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 150 ppm, 160 ppm, 170 ppm, 175 ppm, 180 ppm, 190 ppm o 200 ppm. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano).

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 mM hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento comprende ademas desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; desde el 2% hasta el 10% de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; desde el 2% hasta el 10% de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 200 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En aun otra realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico y el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5.5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En aun otra realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento ademas comprende desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 mM hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 10 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es desde 5.5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 mM hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 10 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 200 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En aun otra realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico y el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 100 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 10 mM hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En aun otra realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; el 75±25 % de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento 90±25 mM y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento ademas comprende desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En una realizacion espedfica, la composicion contiene 75±15 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75±5 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75 ppm de tensioactivo no ionico.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 10 % de azucar o alcohol de azucar, 75±25 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento 90±25 mM y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En una realizacion espedfica, la composicion contiene 75±15 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75±5 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75 ppm de tensioactivo no ionico.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; desde el 2 % hasta el 10 % de azucar o alcohol de azucar, 75±25 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico, agente de tamponamiento 90±25 mM y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En aun otra realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En una realizacion espedfica, la composicion contiene 75±15 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75±5 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, agente de tamponamiento 90±25 mM y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En aun otra realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico y el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5.5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, desde 90±25 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En aun otra realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5.5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; el 75±25 % de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6,0±0,2. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento comprende ademas desde el 2 % hasta el 10 % de azucar o alcohol de azucar. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En una realizacion espedfica, la composicion contiene 75±15 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75±5 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75 ppm de tensioactivo no ionico.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; el 10 % de azucar o alcohol de azucar, 75±25 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6,0±0,2. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En una realizacion espedfica, la composicion contiene 75±15 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75±5 ppm de tensioactivo no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75 ppm de tensioactivo no ionico.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; el 10 % de azucar o alcohol de azucar, 75±25 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6 ,0±0 ,2. En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En aun otra realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina. En una realizacion espedfica, la composicion contiene 75±15 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75±5 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En otra realizacion espedfica, la composicion contiene 75 ppm de ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y tensioactivo no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En aun otra realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico y el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM; una combinacion de azucar o alcohol de azucar y ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico seleccionada a partir de las variaciones 1 a 6035 indicadas en la tabla 1 a la tabla 9, agente de tamponamiento 91 mM y un pH de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En otra realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En aun otra realizacion espedfica, el ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico es polisorbato 80 (monooleato polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

Las composiciones de furina (por ejemplo, rfurina) de la presente invencion tambien incluyen preferiblemente un tensioactivo, preferiblemente un tensioactivo no ionico, y preferiblemente en una cantidad desde 0,1 ppm hasta 150 ppm, o desde 65 ppm hasta 80 ppm, o a aproximadamente 75 ppm. En realizaciones adicionales, las composiciones de furina (por ejemplo, rfurina) incluyen un tensioactivo en una cantidad desde 0,5 ppm hasta 140 ppm, de 1,0 ppm a 130 ppm, de 10 ppm a 120 ppm, de 20 ppm a 110 ppm, de 30 ppm a 100 ppm, de 40 ppm a 95 ppm, de 50 ppm a 90 ppm, de 55 ppm a 85 ppm, de 60 ppm a 80 ppm o de 70 ppm a 75 ppm. En determinadas realizaciones, el tensioactivo se elige del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80, polioles pluronicos, glicerol, glucamidas (tales como Mega 8 ), tritones y Brij 35 (lauril eter de polioxietileno 23). Estan disponibles varias calidades de polioles pluronicos (comercializados bajo el nombre comercial Pluronic, fabricados por BASF Wyandotte Corporation). Estos polioles, de pesos moleculares (desde 1.000 hasta mas de 16.000) y propiedades fisicoqmmicas diversos, se han usado como tensioactivos. Pluronic F-38, de un peso molecular de 5.000 y Pluronic F-68 , peso molecular de 9.000, contienen ambos (en peso) el 80 por ciento de grupos polioxietileno hidrofilos y el 20 por ciento de grupos polioxipropileno hidrofobos. En una realización, el tensioactivo es polisorbato 80. En una realizacion particular, el polisorbato 80 es polisorbato 80 derivado de vegetales.

B. Sales farmaceuticamente aceptables

Las composiciones estabilizadas de furina (por ejemplo, rfurina) proporcionadas en el presente documento incluyen generalmente una sal farmaceuticamente aceptable a una concentracion tolerada por el polipeptido de furina durante el almacenamiento. En una realización, la sal farmaceuticamente aceptable es una sal de cloruro. En una realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es una sal de cloruro monovalente. En una realizacion mas espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio, cloruro de potasio o una combinacion de las mismas.

En una realización, la concentracion de sal farmaceuticamente aceptable en una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada proporcionada en el presente documento es desde 10 mM hasta 500 mM. En otra realización, la concentracion de sal farmaceuticamente aceptable es desde 100 mM hasta 300 mM. En otra realización, la concentracion de sal farmaceuticamente aceptable es desde 150 mM hasta 250 mM. En aun otras realizaciones, la concentracion de sal farmaceuticamente aceptable en las composiciones estabilizadas de furina (por ejemplo, rfurina) proporcionadas en el presente documento se selecciona a partir de las variaciones 6036 a 6180 indicadas en la tabla 10.

Tabla 10. Concentraciones de sal farmaceuticamente aceptable a modo de ejemplo utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Var. = Variacion

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende una sal farmaceuticamente aceptable a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6036 a 6180 indicadas en la tabla 10, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento comprende ademas desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio, cloruro de potasio o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio. En otra realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de potasio. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende una sal farmaceuticamente aceptable a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6036 a 6180 indicadas en la tabla 10, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento ademas comprende desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico. En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio, cloruro de potasio o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio. En otra realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de potasio. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende una sal farmaceuticamente aceptable a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6036 a 6180 indicadas en la tabla 10, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio, cloruro de potasio o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio. En otra realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de potasio. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende una sal farmaceuticamente aceptable a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6036 a 6180 indicadas en la tabla 10, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde el 2 % hasta el 10 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio, cloruro de potasio o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio. En otra realizacion espedfica, sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de potasio. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende una sal farmaceuticamente aceptable a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6036 a 6180 indicadas en la tabla 10, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio, el 10±5% de azucar o alcohol de azucar, 75±25 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio, cloruro de potasio o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio. En otra realizacion espedfica, sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de potasio. En una realización, la concentracion del agente de tamponamiento es de 90±25 mM. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende una sal farmaceuticamente aceptable a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6036 a 6180 indicadas en la tabla 10, desde 0,9 mM de calcio, el 10 % de azucar o alcohol de azucar, 75 ppm de tensioactivo no ionico, desde 91 mM de agente de tamponamiento y un pH de 6,0±0,2. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio, cloruro de potasio o una combinacion de las mismas. En una realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio. En otra realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de potasio. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En algunas realizaciones, se usan sales de cloruro monovalentes, tales como cloruro de sodio y cloruro de potasio, en formulaciones de la presente divulgacion. Aunque el componente de la formulacion que comprende sales cloruro monovalentes se describe principalmente en cuanto a cloruro de sodio, se apreciara que cualquier sal cloruro monovalente, incluyendo cloruro de potasio, puede usarse segun las descripciones en el presente documento por cloruro de sodio. En determinadas realizaciones, se incluye cloruro de sodio en las presentes formulaciones a una cantidad desde 50 hasta 500 mM. En otras realizaciones, se incluye cloruro de sodio en las formulaciones a una cantidad desde 100 hasta 300 mM, desde 150 hasta 250 mM, o a aproximadamente 190 mM. En realizaciones adicionales, se incluye cloruro de sodio en las presentes formulaciones en una cantidad desde 100 hasta 300 mM, de 110 a 280 mM, de 120 a 260 mM, de 130 a 240 mM, de 140 a 220 mM, de 150 a 200 mM o de 160 a 180 mM. En una realizacion espedfica, la formulacion incluye cloruro de sodio 190 mM en combinacion con uno o mas de algunos otros componentes de la formulacion divulgados en el presente documento.

C. Agentes de tamponamiento

Ventajosamente, se encontro que se estabilizan composiciones de furina (por ejemplo, rfurina) a pH de 6,0 a 7,0. Por ejemplo, se muestra en las figuras 11 y 12 que composiciones de furina formuladas a pH 5,5 estan estabilizadas en comparacion con composiciones de furina formuladas a pH 5,0. Tambien se muestra que composiciones de furina formuladas a pH 6,0 estan estabilizadas adicionalmente en comparacion con composiciones formuladas a pH 5,5. Ademas, tal como se muestra en la figura 17, composiciones de furina (por ejemplo, rfurina) formuladas a pH 7,0 tienen una estabilidad similar a las composiciones formuladas a pH 6,0.

Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las composiciones estabilizadas de furina (por ejemplo, rfurina) proporcionadas en el presente documento se formulan a un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realizacion espedfica, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada se formula a un pH desde 6,0 hasta 7,0. En otra realizacion espedfica, una composicion de furina estabilizada se formula a pH 6,0±0,2. En una realizacion mas espedfica, una composicion de furina estabilizada se formula a pH 6,0. En aun otras realizaciones, una composicion de furina estabilizada se formula a pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11. Tabla 11. Intervalos de pH a modo de ejemplo utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Var. = Variacion

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento ademas comprende desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento ademas comprende desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico. En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde el 2% hasta el 10% de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de sorbitano polioxietilenado (20)). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio, desde el 2% hasta el 10% de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio, el 10±5 % de azucar o alcohol de azucar, 75±25 ppm de tensioactivo no ionico, desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento y un pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio, el 10±5% de azucar o alcohol de azucar, 75±25 ppm de tensioactivo no ionico, desde 90±25 mM de agente de tamponamiento y un pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 191 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM, el 10% de azucar o alcohol de azucar, 75 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento 91 mM y un pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, las composiciones estabilizadas de furina (por ejemplo, rfurina) proporcionadas en el presente documento se formulan a un pH apropiado usando uno o mas agentes de tamponamiento. En una realización, el uno o mas agentes de tamponamiento se seleccionan de histidina, imidazol, fosfato, citrato, Tris, acetato (por ejemplo, ácido acetico), BIS-Tris propano, PIPES, MOPS, HEPES, MES, ACES y una combinacion de los mismos. En una realizacion particular, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES.

El agente de tamponamiento esta presente en las composiciones estabilizadas de furina (por ejemplo, rfurina) a una concentracion adecuada para mantener el pH de la composicion durante el almacenamiento a lo largo de un periodo de tiempo (por ejemplo, semanas, meses o anos). En una realización, la concentracion de agente de tamponamiento en la formulacion es desde 10 mM hasta 300 mM. En otra realización, la concentracion de agente de tamponamiento en la formulacion es de entre 10 mM y 200 mM. En una realizacion espedfica, la concentracion de agente de tamponamiento en la formulacion es de 90±25 mM. En aun otras realizaciones, la concentracion de agente de tamponamiento en la composicion se selecciona a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12.

Tabla 12. Concentraciones (mM) de agente de tamponamiento a modo de ejemplo utiles para la estabilizacion de composiciones de furina (por ejemplo, rfurina).

Var. = Variacion

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12 y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento comprende ademas desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, agente de tamponamiento a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12 y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, la composicion de furina estable en almacenamiento comprende ademas desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico. En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12 y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 500 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 5 mM de calcio, desde el 2% hasta el 10% de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12 y un pH desde 5,5 hasta 7.5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio, desde el 2% hasta el 10% de azucar o alcohol de azucar, desde 10 ppm hasta 100 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12 y un pH desde 5,5 hasta 7.5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende desde 50 hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio, el 10±5 % de azucar o alcohol de azucar, 75±25 de ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12 y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 190±50 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio, el 10±5% de azucar o alcohol de azucar, 75±25 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12 y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

En una realización, una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) estabilizada comprende 191 mM de una sal farmaceuticamente aceptable, calcio 0,9 mM, el 10% de azucar o alcohol de azucar, 75 ppm de tensioactivo no ionico, agente de tamponamiento a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12 y un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano). En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano) y el azucar o alcohol de azucar es trehalosa. En una realización, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES. En una realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH de la composicion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH de la composicion es de 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH de la composicion es de 6,0. En una realizacion espedfica, la composicion contiene desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina.

Tambien pueden estar presentes tampones en las formulaciones de la invencion en combinacion con uno o mas de cualquier otro componente de la formulacion descrito en el presente documento. Tal como se muestra en los ejemplos, las formulaciones altamente estabilizadas de la presente invencion muestran estabilidad aumentada a pH 6,0. En determinadas realizaciones, el pH de las formulaciones altamente estabilizadas debe mantenerse preferiblemente en el intervalo desde 6,0 hasta 8,0, o a un pH de aproximadamente 6,0. El agente de tamponamiento puede ser cualquier entidad qmmica o combinacion de entidades qmmicas fisiologicamente aceptable que tenga la capacidad de actuar como tampones, incluyendo, sin limitacion: histidina, imidazol, fosfato, citrato, Tris, acetato, BIS-Tris propano, PIPES, MOpS, HEPES, MES y ACES. Las designaciones qmmicas completas de muchos de estos agentes de tamponamiento se enumeran en la tabla 1 a continuacion. En determinadas realizaciones, si esta presente calcio en la formulacion a una concentracion por encima de aproximadamente 5 mM, no se usa fosfato como agente de tamponamiento. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento se incluye en una concentracion desde 10 mM hasta 200 mM, o de 10 a 100 mM, o 30-60 mM, o aproximadamente 46 mM. En realizaciones adicionales, se incluye un agente de tamponamiento individual en una concentracion desde 15 hasta 95 mM, de 20 a 90 mM, de 25 a 85 mM, de 30 a 80 mM, de 35 a 75 mM, de 40 a 70 mM, de 45 a 65 mM o de 50 a 60 mM. En determinadas realizaciones, la formulacion contiene dos agentes de tamponamiento.

Tabla 13. Agentes de tamponamiento a modo de ejemplo

En ciertos aspectos las presentes formulaciones incluyen un ácido carboxflico en combinacion con uno o mas de los componentes de la formulacion descritos en el presente documento. En aspectos adicionales, el ácido carboxflico es preferiblemente ácido acetico (por ejemplo, acetato). En determinadas realizaciones, la formulacion incluye desde 20 mM hasta 100 mM de ácido acetico, o desde 30 mM hasta 50 mM, o aproximadamente 45 mM de ácido acetico o cualquier otro ácido carboxflico. En realizaciones adicionales, la formulacion incluye desde 25 mM hasta 90 mM, de 30 mM a 80 mM, de 35 mM a 70 mM, de 40 mM a 60 mM o de 45 mM a 50 mM de ácido acetico o cualquier otro ácido carboxflico.

D. Componentes de la formulacion adicionales

Las formulaciones altamente estabilizadas de la presente divulgacion incluyen furina, por ejemplo, rfurina, y uno o mas de agentes estabilizantes, agentes de tamponamiento, cloruro de sodio, sales y otros excipientes. Tales componentes se describen en mayor detalle a continuacion. Tal como se apreciara, cualquiera de los componentes de la formulacion descritos en el presente documento puede usarse individualmente o en cualquier combinacion. Las formulaciones de furina altamente estabilizadas de la presente divulgacion muestran estabilidad aumentada hacia el esfuerzo por cizallamiento (agitacion), liofilizacion y congelacion/descongelacion, asf como resistencia a la perdida de producto o desnaturalizacion en las superficies de recipientes en comparacion con las formulaciones de control o de partida.

Se incluye furina en formulaciones de la presente divulgacion en concentraciones desde 5.000 hasta 500.000 U/ml. En determinadas realizaciones, se incluye furina en concentraciones desde 5.500 hasta 55.000, desde 6.000 hasta 50.000, desde 6.500 hasta 45.000, desde 7.000 hasta 40.000, desde 7.500 hasta 35.000, desde 8.000 hasta 30.000, desde 8.500 hasta 25.000, desde 9.000 hasta 20.000, desde 9.500 hasta 15.000, y aproximadamente 10.000 U/ml. En aun otras realizaciones, se incluye furina en las formulaciones de la presente divulgacion a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6470 a 6533 indicadas en la tabla 14, notificadas en miles de unidades de actividad de furina por ml. En realizaciones espedficas, la furina contenida en las formulaciones altamente estabilizadas de la presente divulgacion es rfurina.

Tabla 14. Concentraciones de furina (por ejemplo, rfurina) a modo de ejemplo (expresadas en miles de unidades de actividad de furina por ml) usadas en las composiciones estabilizadas proporcionadas en el presente documento.

Var. = Variacion

En otra realización, la concentracion de furina (por ejemplo, rfurina) de una composicion estabilizada proporcionada en el presente documento puede expresarse como la masa de furina presente en la composicion. En una realización, la furina (por ejemplo, rfurina) esta presente en una composicion estabilizada tal como se describe en el presente documento a una concentracion desde 100 ng/ml hasta 100 mg/ml. En otra realización, la furina (por ejemplo, rfurina) esta presente en una composicion estabilizada tal como se describe en el presente documento a una concentracion desde 1 pg/ml hasta 10 mg/ml. En otra realización, la furina (por ejemplo, rfurina) esta presente en una composicion estabilizada tal como se describe en el presente documento a una concentracion desde 1 pg/ml hasta 1 mg/ml. En aun otras realizaciones, la furina (por ejemplo, rfurina) esta presente en una composicion estabilizada tal como se describe en el presente documento a una concentracion seleccionada a partir de las variaciones 6534 a 6638 indicadas en la tabla 15. En realizaciones espedficas, la furina contenida en las formulaciones altamente estabilizadas de la presente divulgacion es rfurina.

Tabla 15. Concentraciones de furina (por ejemplo, rfurina) a modo de ejemplo usadas en las composiciones estabilizadas proporcionadas en el presente documento.

Var. = Variacion

En algunos aspectos de la presente divulgacion, las formulaciones de furina (por ejemplo, rfurina) incluyen calcio u otros cationes metalicos divalentes. En aspectos adicionales, el cation divalente esta presente como una sal, preferiblemente una sal de cloruro. En determinadas realizaciones, puede usarse desde 0,1 mM hasta 10 mM de una sal de cation divalente, o desde 0,5 mM hasta 2 mM, o aproximadamente 0,92 mM. En todavfa realizaciones adicionales, se usa desde 0,5 mM hasta 9 mM, desde 1 mM hasta 8 mM, desde 1,5 mM hasta 7 mM, desde 2 mM hasta 6 mM, desde 2,5 mM hasta 5 mM o desde 3 mM hasta 4,5 mM de sal de cation divalente en formulaciones de la invencion. Cuando se usa sal de calcio, es preferiblemente cloruro de calcio, pero tambien pueden ser otras sales de calcio tales como gluconato de calcio, glubionato de calcio o gluceptato de calcio. Pueden incluirse cationes divalentes, incluyendo calcio, en combinacion con uno o mas de otros componentes de la formulacion divulgada en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de cationes metalicos divalentes utiles en las formulaciones proporcionadas en el presente documento incluyen calcio, bario; manganeso, magnesio, cobalto, cobre, mquel y cinc.

En algunas realizaciones, las formulaciones de furina (por ejemplo, rfurina) incluyen un antioxidante. Se ha encontrado que la adicion de antioxidantes a formulaciones liofilizadas y acuosas mejora la estabilidad de estas formulaciones, y por tanto prolonga sus vidas utiles de almacenamiento. Los antioxidantes usados deben ser compatibles para su uso con una preparacion farmaceutica, y ademas son preferiblemente solubles en agua. Cuando se anaden antioxidantes a una formulacion, es preferible anadir tales antioxidantes tan tarde como sea posible en el procedimiento antes de la liofilizacion, con el fin de evitar la oxidacion espontanea del antioxidante. La tabla 2 a continuacion enumera antioxidantes adecuados, que estan disponibles comercialmente a traves de empresas tales como Calbiochem y Sigma.

Tabla 16. Antioxidantes a modo de ejemplo

Pueden usarse concentraciones en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a mas de 1,0 mg/ml de antioxidantes, y se cree que concentraciones superiores tambien senan utiles (hasta el punto de ningun efecto toxico o efecto de fabricacion adverso, tal como una depresion de la temperatura de transicion vftrea del producto liofilizado). Por consiguiente, en una realización, la composicion de furina (por ejemplo, rfurina) comprende desde 0,05 mg/ml hasta 1,0 mg/ml de antioxidante. En otras realizaciones, la composicion de furina (por ejemplo, rfurina) comprende desde 0,05 hasta 0,5 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 0,9 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 0,8 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 0,7 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 0,6 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 0,5 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 0,4 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 0,3 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 0,2 mg/ml, de 0,2 mg/ml a 0,9 mg/ml, de 0,2 mg/ml a 0,8 mg/ml, de 0,2 mg/ml a 0,7 mg/ml, de 0,2 mg/ml a 0,6 mg/ml, de 0,2 mg/ml a 0,5 mg/ml, de 0,2 mg/ml a 0,4 mg/ml, de 0,2 mg/ml a 0,3 mg/ml, de 0,3 mg/ml a 0,7 mg/ml, de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml de antioxidante.

E. Desarrollo de la formulacion

En ciertos aspectos de la presente divulgacion, se preparan formulaciones de furina (por ejemplo, rfurina) altamente estabilizadas propocionando una formulacion de furina (control) de partida y anadiendo componentes para lograr un nivel deseado de concentraciones de componentes. Por ejemplo, la adicion de una parte de 750 ppm de tensioactivo no ionico con respecto a 9 partes de composicion de furina que carece de tensioactivo no ionico para proporcionar una formulacion final que comprende 75 ppm de tensioactivo no ionico. Este procedimiento tambien se denomina "adicion conocida" a una formulacion de partida.

En determinadas realizaciones, para producir las formulaciones de furina (por ejemplo, rfurina) altamente estabilizadas de la presente divulgacion, la furina esta contenida en una formulacion de partida y se realiza una adicion conocida de una composicion de tampon en la formulacion de partida. En otras realizaciones, la formulacion altamente estabilizada de furina (por ejemplo, rfurina) se forma usando dialisis segun metodos conocidos en la tecnica. En algunas realizaciones, los metodos de formulacion implican la adicion conocida de una composicion de tampon concentrada en una formulacion de partida de furina. En una realización, se anade polisorbato 80 a la formulacion de partida antes de la adicion de otros componentes, particularmente antes de la adicion de trehalosa, con el fin de proteger a la furina frente a la agitacion durante el mezclado.

En una realizacion a modo de ejemplo, esta contenido principio activo a granel (BDS) de furina (por ejemplo, rfurina) en una formulacion de partida de acetato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 230 mM, cloruro de calcio 1 mM, pH 6,0. En una realización, se realizan adiciones conocidas de los siguientes componentes en la formulacion de partida: el 1 % de polisorbato 80, HEPES 500 mM, ácido acetico 400 mM, CaCl21 mM, pH 6,0 y polvo de trehalosa dihidratada para lograr la siguiente composicion: HEPES 46 mM, ácido acetico 45 mM, NaCl 190 mM, CaCl20,92 mM, 75 ppm de polisorbato 80, el 10 % p/p de trehalosa dihidratada, pH 6,0. El aumento de ácido acetico y la adicion de HEPES da como resultado una mayor estabilidad del pH. Aunque a pH 6,0 tanto el ácido acetico como el HEPES estan fuera de su capacidad de tamponamiento mas alta, la alta concentracion de estos productos qmmicos aumenta enormemente la capacidad de tamponamiento de la formulacion altamente estabilizada. En determinadas realizaciones, el polisorbato 80 se anade a la formulacion de partida antes que los otros componentes para proteger la furina de la agregacion y adsorcion sobre superficies de recipientes durante el mezclado cuando se anaden los otros reactivos. En determinadas realizaciones, la furina en la formulacion de partida se mezcla con polisorbato 80 y/o cualquier otro componente excepto trehalosa. Se anaden trehalosa y cualquier componente restante tras anadirse polisorbato 80 para proteger la furina de la agregacion y adsorcion durante el mezclado.

En determinadas realizaciones, la formulacion estabilizada se combina con un diluyente de modo que la formulacion puede usarse en metodos tales como un procedimiento de maduracion de rVWF. En realizaciones adicionales, un diluyente estabilizado se prepara mediante adicion conocida de un diluyente de partida (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, pH 7,0) con polisorbato 80 hasta 75 ppm. La combinacion de la formulacion altamente estabilizada de furina (por ejemplo, rfurina) de la presente divulgacion con este diluyente estabilizado aumenta la recuperacion de furina en la etapa de maduracion de rVWF de tres a cuatro veces en comparacion con el uso de las formulaciones de diluyente y furina de partida.

En determinadas realizaciones, las formulaciones de furina altamente estabilizadas de la presente divulgacion se liofilizan. Durante la liofilizacion, la formulacion se convierte de estar en una fase acuosa a estar en una fase solida amorfa, que se cree que protege a la protema de la inestabilidad qmmica y/o conformacional. En realizaciones adicionales, la preparacion liofilizada no solo contiene una fase amorfa, sino que tambien incluye un componente que se cristaliza durante la liofilizacion.

Uno o mas componentes de formulaciones altamente estabilizadas pueden dispersarse en algunas realizaciones en la fase amorfa de la torta liofilizada. Ademas, preferiblemente la temperatura de transicion vftrea aparente (Tg') de la fase amorfa es relativamente alta durante el secado por congelacion, y la temperatura de transicion vftrea (Tg) del solido es asimismo preferiblemente alta durante almacenamiento.

IV. Metodos para diluir composiciones acuosas de furina recombinante

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona metodos para diluir composiciones acuosas de furina (por ejemplo, rfurina) tal como se describe adicionalmente en las reivindicaciones. Las siguientes realizaciones se basan en parte en el descubrimiento de que la inclusion de un tensioactivo no ionico en un tampon usado para diluir furina (por ejemplo, rfurina) da como resultado la recuperacion de 3-4 veces mas actividad de furina en comparacion con la dilucion con un tampon que carece del tensioactivo no ionico.

En una realización, el metodo incluye anadir un tampon de dilucion que contiene un tensioactivo no ionico a una composicion de furina (por ejemplo, rfurina), para formar una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) diluida. En algunas realizaciones, el tampon de dilucion se anade a una razon desde 1 :1 (tampon de dilucion:composicion de furina) hasta 1.000:1 (tampon de dilucion:composicion de furina). En otra realización, el tampon de dilucion se anade a una razon desde 1:1 (tampon de dilucion:composicion de furina) hasta 500:1 (tampon de dilucion:composicion de furina). En otra realización, el tampon de dilucion se anade a una razon desde 1:1 (tampon de dilucion:composicion de furina) hasta 250:1 (tampon de dilucion:composicion de furina). En otra realización, el tampon de dilucion se anade a una razon desde 1 :1 (tampon de dilucion:composicion de furina) hasta 200 :1 (tampon de dilucion:composicion de furina). En otra realización, el tampon de dilucion se anade a una razon desde 1:1 (tampon de dilucion:composicion de furina) hasta 100:1 (tampon de dilucion:composicion de furina). En otra realización, el tampon de dilucion se anade a una razon desde 1:1 (tampon de dilucion:composicion de furina) hasta 50:1 (tampon de dilucion:composicion de furina).

En una realización, el metodo comprende una primera etapa de anadir un tensioactivo no ionico a una composicion de furina (por ejemplo, rfurina) y una segunda etapa de anadir un tampon de dilucion a la composicion de furina (por ejemplo, rfurina) que contiene el tensioactivo no ionico, para formar una composicion de furina diluida. En una realización, el tensioactivo se anadira a la composicion de furina a una concentracion final de X veces una concentracion deseada en la composicion de furina diluida, donde X es el factor de dilucion. Por ejemplo, si se desea una concentracion final de 10 ppm de tensioactivo no ionico en una composicion de furina que va a diluirse 100 veces, el tensioactivo no ionico se anade a la composicion de furina de partida a una concentracion final de 1.000 ppm (10 ppm x 100 veces de dilucion), y la composicion se diluye posteriormente anadiendo 99 partes de tampon de dilucion por 1 parte de disolucion de partida (representado el volumen anadido durante la adicion del tensioactivo no ionico).

En determinadas realizaciones, la composicion de furina (por ejemplo, rfurina) se diluye desde 1 vez hasta 1.000 veces, desde 1 vez hasta 500 veces, desde 1 vez hasta 250 veces, desde 1 vez hasta 200 veces, desde 1 vez hasta 100 veces, desde 1 vez hasta 50 veces, desde 1 vez hasta 10 veces, desde 10 veces hasta 1.000 veces, desde 10 veces hasta 500 veces, desde 10 veces hasta 250 veces, desde 10 veces hasta 200 veces, desde 10 veces hasta 100 veces, desde 10 veces hasta 50 veces, desde 50 veces hasta 1.000 veces, desde 50 veces hasta 500 veces, desde 50 veces hasta 250 veces, desde 50 veces hasta 200 veces, desde 50 veces hasta 100 veces, desde 100 veces hasta 1.000 veces, desde 100 veces hasta 500 veces, desde 100 veces hasta 250 veces, desde 100 veces hasta 200 veces, desde 200 veces hasta 1.000 veces, desde 200 veces hasta 500 veces o desde 200 veces hasta 250 veces.

A. Tampon de dilucion de furina

En una realización, el tampon de dilucion de furina incluira una sal farmaceuticamente aceptable, tensioactivo no ionico y un agente de tamponamiento. En una realización, el tampon de dilucion ademas incluye calcio. En otra realización, el tampon de dilucion ademas incluye un azucar y/o alcohol de azucar.

En una realización, la sal farmaceuticamente aceptable esta presente en el tampon de dilucion a una concentracion desde 10 mM hasta 500 mM. En otra realización, la concentracion de sal farmaceuticamente aceptable es desde 100 mM hasta 300 mM. En otra realización, la concentracion de sal farmaceuticamente aceptable es desde 150 mM hasta 250 mM. En aun otras realizaciones, la concentracion de sal farmaceuticamente aceptable en el tampon de dilucion de furina se selecciona a partir de las variaciones 6036 a 6180 indicadas en la tabla 10. En una realización, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio, cloruro de potasio o una combinacion de las mismas. En una realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio. En otra realizacion espedfica, la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de potasio.

En una realización, el tampon de dilucion tiene un pH desde 5,5 hasta 7,5. En una realización, el pH del tampon de dilucion es desde 5,5 hasta 7,0. En otra realización, el pH del tampon de dilucion es desde 5,5 hasta 6,5. En otra realización, el pH del tampon de dilucion es 6,0±0,2. En una realizacion espedfica, el pH del tampon de dilucion es 6,0. En otras realizaciones, el tampon de dilucion tiene un pH seleccionado a partir de las variaciones 6181 a 6403 indicadas en la tabla 11.

En una realización, el agente de tamponamiento esta presente en el tampon de dilucion a una concentracion desde 10 mM hasta 300 mM. En otra realización, la concentracion de agente de tamponamiento en el tampon de dilucion es de entre 10 mM y 200 mM. En otras realizaciones, la concentracion de agente de tamponamiento en el tampon de dilucion se selecciona a partir de las variaciones 6404 a 6469 indicadas en la tabla 12. En una realización, el agente de tamponamiento es acetato, HEPES o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el agente de tamponamiento es una combinacion de acetato y HEPES.

En algunas realizaciones, el tampon de dilucion de furina incluye calcio u otro cation metalico divalente. En una realización, el cation divalente se anade como una sal, preferiblemente una sal de cloruro. En determinadas realizaciones, la concentracion de cation divalente (por ejemplo, calcio) en el tampon de dilucion es desde 0,1 mM hasta 10 mM, desde 0,5 mM hasta 2 mM o aproximadamente 0,92 mM. En todavfa realizaciones adicionales, desde 0,5 mM hasta 9 mM, desde 1 mM hasta 8 mM, desde 1,5 mM hasta 7 mM, desde 2 mM hasta 6 mM, desde 2,5 mM hasta 5 mM o desde 3 mM hasta 4,5 mM de cation divalente se usa en el tampon de dilucion. Cuando se usa sal de calcio, es preferiblemente cloruro de calcio, pero tambien pueden ser otras sales de calcio tales como gluconato de calcio, glubionato de calcio o gluceptato de calcio. Pueden incluirse cationes divalentes, incluyendo calcio, en combinacion con uno o mas de otros componentes de la formulacion divulgados en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de cationes metalicos divalentes utiles en los tampones de dilucion proporcionados en el presente documento incluyen calcio, bario, manganeso, magnesio, cobalto, cobre, mquel y cinc.

En algunas realizaciones, el tampon de dilucion de furina incluye un azucar y/o alcohol de azucar. En una realización, el tampon de dilucion contiene un azucar monosacarido. En una realizacion particular, el azucar monosacarido se selecciona del grupo que consiste en un azucar diosa, un azucar triosa, un azucar tetrosa, un azucar pentosa, un azucar hexosa, un azucar heptosa y un azucar octosa. En una realizacion particular, el azucar es un azucar pentosa, un azucar hexosa o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar es un azucar hexosa.

En otra realización, el tampon de dilucion contiene un azucar disacarido. En una realizacion particular, el azucar disacarido se selecciona de azucares disacaridos formados a partir de monosacaridos de pentosa y/o hexosa. En otra realizacion particular, el azucar se selecciona de azucares disacaridos formados a partir de monosacaridos de hexosa. En una realización, el azucar es sacarosa, trehalosa o una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar es sacarosa. En otra realizacion espedfica, el azucar es trehalosa. En una realización, el azucar se formula como trehalosa dihidratada.

En otra realización, el tampon de dilucion contiene un alcohol de azucar. En una realizacion particular, el alcohol de azucar se selecciona de glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, fucitol, iditol, volmitol, isomaltitol, maltitol, lactitol, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En otra realizacion particular, el alcohol de azucar es manitol.

En aun otra realización, el tampon de dilucion contiene una mezcla de azucar y alcohol de azucar. En una realización, la mezcla contiene al menos dos de un monosacarido, un disacarido y un alcohol de azucar. En otra realización, la mezcla contiene al menos dos de un azucar pentosa, un azucar hexosa, un disacarido formado a partir de monosacaridos de pentosa y/o hexosa y un alcohol de azucar. En otra realización, la mezcla contiene al menos dos de sacarosa, trehalosa y manitol.

En una realización, el azucar o alcohol de azucar esta presente en el tampon de dilucion a una concentracion desde el 2 % hasta el 20 %, del 2 % al 17,5 %, del 2 % al 15 %, del 2 % al 12,5 %, del 2 % al 10 %, del 2 % al 9 %, del 2 % al 8 %, del 2 % al 7 %, del 5 % al 20 %, del 5 % al 17,5 %, del 5 % al 15 %, del 5 % al 12,5 %, del 5 % al 10 %, del 7,5 % al 20 %, del 7,5 % al 17,5 %, del 7,5 % al 15 %, del 7,5 % al 12,5 %, del 10 % al 20 %, del 10 % al 17,5 %, del 10% al 15%, el 4±2 %, el 5±2 %, el 6±2 %, el 7±2 %, el 8±2 %, el 9±2 %, el 10±2%, el 11±2%, el 12±2%, el 13±2 %, el 14±2 %, el 15±2 %, el 16±2 %, el 17±2 %, el 18±2 %, el 3±1 %, el 4±1 %, el 5±1 %, el 6±1 %, el 7±1 %, el 8±1 %, el 9±1 %, el 10±1 %, el 11±1 %, el 12±1 %, el 13±1 %, el 14±1 %, el 15±1 %, el 16±1 %, el 17±1 %, el 18±1 %, el 19±1 %, el 2 %, el 3 %, el 4 %, el 5 %, el 6 %, el 7 %, el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 11 %, el 12 %, el 13 %, el 14 %, el 15 %, el 16 %, el 17 %, el 18 %, el 19 % o el 20 %. En una realización, el azucar o alcohol de azucar se selecciona de sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el azucar o alcohol de azucar es trehalosa.

En una realización, se proporcionan composiciones de furina (por ejemplo, rfurina) estables en almacenamiento que contienen un tensioactivo no ionico seleccionado de un monoglicerido soluble en agua no ionico, un diglicerido soluble en agua no ionico, un triglicerido soluble en agua no ionico, esteres de ácidos monograsos solubles en agua no ionicos de polietielenglicol, esteres de ácidos digrasos solubles en agua no ionicos de polietielenglicol, un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico, un glicerido poliglicolizado no ionico, un copolfmero de tribloque soluble en agua no ionico y una combinacion de los mismos. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano).

1. Tensioactivos no ionicos

En una realización, el tampon de dilucion de furina, o disolucion de tensioactivo no ionico anadida antes de la dilucion, contiene un tensioactivo no ionico seleccionado de un monoglicerido soluble en agua no ionico, un diglicerido soluble en agua no ionico, un triglicerido soluble en agua no ionico, esteres de ácidos monograsos solubles en agua no ionicos de polietielenglicol, esteres de ácidos digrasos solubles en agua no ionicos de polietielenglicol, un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico, un glicerido poliglicolizado no ionico, un copolfmero de tribloque soluble en agua no ionico y una combinacion de los mismos. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano).

En una realización, el tensioactivo no ionico esta presente en el tampon de dilucion a una concentracion desde 10 hasta 200 ppm, de 10 a 175 ppm, de 10 a 150 ppm, de 10 a 125 ppm, de 10 a 100 ppm, de 10 a 90 ppm, de 10 a 80 ppm, de 10 a 75 ppm, de 10 a 70 ppm, de 10 a 60 ppm, de 10 a 50 ppm, de 10 a 25 ppm, de 25 a 200 ppm, de 25 a 175 ppm, de 25 a 150 ppm, de 25 a 125 ppm, de 25 a 100 ppm, de 25 a 90 ppm, de 25 a 80 ppm, de 25 a 70 ppm, de 25 a 60 ppm, de 25 a 50 ppm, de 50 a 200 ppm, de 50 a 175 ppm, de 50 a 150 ppm, de 50 a 125 ppm, de 50 a 90 ppm, de 50 a 80 ppm, de 75 a 200 ppm, de 75 a 175 ppm, de 75 a 150 ppm, de 100 a 200 ppm, de 100 a 175 ppm, 50±25 ppm, 60±25 ppm, 70±25 ppm, 75±25 ppm, 80±25 ppm, 90±25 ppm, 100±25 ppm, 125±25 ppm, 150±25 ppm, 175±25 ppm, 30±10 ppm, 40±10 ppm, 50±10 ppm, 60±10 ppm, 70±10 ppm, 75±10 ppm, 80±10 ppm, 90±10 ppm, 100± 10 ppm, 110±10 ppm, 120±10 ppm, 125±10 ppm, 130±10 ppm, 140±10 ppm, 150±10 ppm, 160±10 ppm, 170±10 ppm, 175±10 ppm, 180±10 ppm, 190±10 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 75 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 100 ppm, 110 ppm, 120 ppm, 125 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 150 ppm, 160 ppm, 170 ppm, 175 ppm, 180 ppm, 190 ppm o 200 ppm. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano).

En una realización, la concentracion objetivo de tensioactivo no ionico tras la dilucion es desde 10 hasta 200 ppm, de 10 a 175 ppm, de 10 a 150 ppm, de 10 a 125 ppm, de 10 a 100 ppm, de 10 a 90 ppm, de 10 a 80 ppm, de 10 a 75 ppm, de 10 a 70 ppm, de 10 a 60 ppm, de 10 a 50 ppm, de 10 a 25 ppm, de 25 a 200 ppm, de 25 a 175 ppm, de 25 a 150 ppm, de 25 a 125 ppm, de 25 a 100 ppm, de 25 a 90 ppm, de 25 a 80 ppm, de 25 a 70 ppm, de 25 a 60 ppm, de 25 a 50 ppm, de 50 a 200 ppm, de 50 a 175 ppm, de 50 a 150 ppm, de 50 a 125 ppm, de 50 a 90 ppm, de 50 a 80 ppm, de 75 a 200 ppm, de 75 a 175 ppm, de 75 a 150 ppm, de 100 a 200 ppm, de 100 a 175 ppm, 50±25 ppm, 60±25 ppm, 70±25 ppm, 75±25 ppm, 80±25 ppm, 90±25 ppm, 100±25 ppm, 125±25 ppm, 150±25 ppm, 175±25 ppm, 30±10 ppm, 40±10 ppm, 50±10 ppm, 60±10 ppm, 70±10 ppm, 75±10 ppm, 80±10 ppm, 90±10 ppm, 100±10 ppm, 110±10 ppm, 120±10 ppm, 125±10 ppm, 130±10 ppm, 140±10 ppm, 150±10 ppm, 160±10 ppm, 170±10 ppm, 175±10 ppm, 180±10 ppm, 190±10 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 75 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 100 ppm, 110 ppm, 120 ppm, 125 ppm, 130 ppm, 140 ppm, 150 ppm, 160 ppm, 170 ppm, 175 ppm, 180 ppm, 190 ppm o 200 ppm. En una realización, el tensioactivo no ionico es un ester de ácido graso de sorbitano soluble en agua no ionico. En una realizacion espedfica, el tensioactivo no ionico es polisorbato 80 (monooleato de polioxietileno (20 ) sorbitano).

En una realización, la inclusion de un tensioactivo no ionico en un tampon de dilucion de furina, o la adicion antes de la dilucion, aumenta la actividad de furina recuperada en una composicion de furina diluida en al menos el 10 %, en comparacion con la actividad recuperada en una composicion de furina diluida sin el uso del tensioactivo no ionico, o con el uso del tensioactivo no ionico a una concentracion inferior. En otras realizaciones, la actividad de furina recuperada tras la dilucion usando un tensioactivo no ionico es de al menos el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, el 125 %, el 150 %, el 175 %, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, o mas mayor que la actividad de furina recuperada tras la dilucion sin el tensioactivo no ionico, o usando una concentracion inferior del tensioactivo no ionico.

V. Ensayos de estabilidad

Tal como se ha comentado en el presente documento, las formulaciones de furina (por ejemplo, rfurina) altamente estabilizadas de la presente divulgacion muestran estabilidad mejorada en comparacion con las formulaciones de control. En una realización, estabilidad mejorada incluye retencion de un porcentaje mayor de actividad que las formulaciones de control en diversos ensayos de estabilidad. Pueden usarse tales ensayos para determinar si una formulacion es una formulacion altamente estabilizada. En algunas realizaciones, la formulacion altamente estabilizada tiene al menos el 5 %, el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o mayor actividad que una formulacion de control cuando se somete a ensayo mediante cualquiera de los ensayos de estabilidad comentados en el presente documento o conocidos en la tecnica.

En aspectos adicionales, se sometieron a prueba formulaciones de furina (por ejemplo, rfurina) en condiciones de factores de esfuerzo, tales como almacenamiento a alta temperatura, agitacion, ciclos de congelacion/descongelacion, o alguna combinacion de los mismos. Tras tales factores de esfuerzo, las formulaciones se sometieron a ensayo usando cualquiera de los metodos descritos en el presente documento o conocidos en la tecnica para determinar la estabilidad en estas condiciones.

En un aspecto, se usan ensayos de actividad de furina para evaluar la estabilidad de una formulacion. En algunas realizaciones, los ensayos de actividad de furina implican una medicion de la escision del sustrato. En una realización, el sustrato es Boc-Arg-Val- Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 1; AMC = 7-amino-4-metoxicumarina), que se escinde mediante la furina, liberando 7-amino-4-metoxicumarina. El ensayo se realiza, por ejemplo, en una placa para ELISA. La actividad de furina en una muestra se determina a partir de una curva patron creada, por ejemplo, a partir de un patron de furina de control de calidad (QC). Los valores de actividad se calculan generalmente como valores medios a partir de dos diluciones, cada una por duplicado.

En otro aspecto, se usa cromatograffa de exclusion molecular (SEC) para evaluar la estabilidad de una formulacion de furina (por ejemplo, rfurina). En tales ensayos, la estabilidad esta indicada por la altura del pico correspondiente a la furina monomerica. Una reduccion en la altura del pico de monomero significa que el producto se esta perdiendo (inestable) y la generacion de picos de peso molecular superior indica que esta produciendose agregacion y los picos de peso molecular inferior significan que el producto se degrada. En una realizacion a modo de ejemplo, tras 4 dfas a 37 °C, la altura de pico relativa de una formulacion de furina de control fue del 58,5 %, pero en una formulacion altamente estabilizada, la altura de pico relativa fue del 74,8 % (figura 48). Por tanto, la formulacion altamente estabilizada mantuvo la estabilidad de furina en la composicion y conservo un mayor porcentaje de la altura de pico en comparacion con lo observado antes del almacenamiento a cuatro dfas a una temperatura superior (37 °C).

En otro aspecto, se usaron ensayos cualitativos tales como analisis de inmunotransferencia de tipo Western, para evaluar la estabilidad de una formulacion de furina. Por ejemplo, la figura 26 muestra que, tras 5 dfas a 35 °C, esta presente un porcentaje mayor de la senal como molecula de furina intacta en lugar de las especies degradadas en la formulacion estabilizada (carril 11), en comparacion con una formulacion no estabilizada (carril 5).

En todavfa otro aspecto, se usaron ensayos cualitativos tales como los espectros UV para evaluar la estabilidad. Tales ensayos son particularmente utiles cuando el factor de esfuerzo usado es agitacion. Los espectros UV pueden indicar la presencia de agregado (la presencia de un agregado es una indicacion de inestabilidad). Por ejemplo, la figura 36 muestra un mayor desplazamiento de los espectros hacia arriba (indicando agregacion) cuando se agita la formulacion de control. Las figuras 41 y 42 muestran el poder protector de una formulacion altamente estabilizada porque, con agitacion, el espectro de la muestra agitada no se desplaza hacia arriba, sino que se superpone con la muestra no agitada, lo cual indica que no se forma agregacion cuando la formulacion se somete a esfuerzo a traves de agitacion.

La practica de la presente invencion puede emplear, a menos que se indique lo contrario, descripciones y tecnicas convencionales de qmmica organica, tecnologfa de polfmeros, biologfa molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), biologfa celular, bioqmmica e inmunologfa, que estan dentro del conocimiento de la tecnica. Tales tecnicas convencionales incluyen smtesis de matrices polimericas, hibridacion, ligamiento y deteccion de hibridacion usando un marcador. Pueden obtenerse ilustraciones espedficas de tecnicas adecuadas por referencia al ejemplo a continuacion en el presente documento. Sin embargo, pueden usarse, por supuesto, otros procedimientos convencionales equivalentes. Tales descripciones y tecnicas convencionales pueden encontrarse en manuales de laboratorio habituales tales como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (volumenes. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos de Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4.a ed.) Freeman, Highly stabilized York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, Londres, Nelson y Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3.a ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y. y Berg et al. (2002) Biochemistry, 5.a ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y.

En la siguiente descripcion, se exponen numerosos detalles espedficos para proporcionar un entendimiento mas completo de la presente invencion. Sin embargo, resultara evidente para un experto en la tecnica que la presente invencion puede ponerse en practica sin uno o mas de estos detalles espedficos. En otros casos, no se han descrito caractensticas bien conocidas y procedimientos bien conocidos por los expertos en la tecnica con el fin de no dificultar la compresion de la invencion.

Aunque la presente invencion se describe principalmente con referencia a realizaciones espedficas, tambien se preve que otras realizaciones resultaran evidentes para los expertos en la tecnica al leer la presente divulgacion, y se pretende que tales realizaciones esten contenidas dentro de los presentes metodos de la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Estabilidad en almacenamiento de formulaciones de rfurina acuosas

Se sometio a prueba la estabilidad de una formulacion de furina de control a tres temperaturas diferentes: temperature ambiente (por ejemplo, 25 °C), 37 °C y 45 °C. Estos estudios a elevadas temperatures se usaron para estudiar la estabilidad acelerada, que es comparable a estudios de estabilidad a largo plazo a temperatures inferiores. Se sometieron a prueba las muestras a tiempo cero, despues tras 1, 2, 3, 4 y 7 dfas de incubacion. Los analisis incluyeron el ensayo de actividad de furina, SEC e inmunotransferencia de tipo Western.

En resumen, se llenaron varios viales de polipropileno de 5 ml con 3 ml de rfurina y se incubaron a tres temperatures diferentes: ambiental (ambiente), 37 °C y 45 °C. Se extrajo un vial a partir de cada condicion de incubacion a tiempo cero, despues tras 1, 2, 3, 4 y 7 dfas. Se prepararon alfcuotas de 200 pl en viales de polipropileno de 0,65 ml y se congelaron a -80 °C a la espera de analisis.

Se determino la estabilidad de varias formulaciones de furina en estas condiciones. En la tabla 17 se facilitan detalles de las diversas formulaciones.

Tabla 17. Fórmulaciones de furina sometidas a prueba para determinar la estabilidad durante el almacenamiento a temperaturas elevadas.

Un metodo de evaluacion de la estabilidad es a traves de un ensayo de actividad de furina. En este ensayo, se determina la actividad de furina a partir de la velocidad de escision de un sustrato. Se escinde el sustrato, Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 1; AMC = 7-amino-4-metoxicumarina), mediante furina y se libera una AMC fluorescente. Se realiza el ensayo, por ejemplo, sobre una placa para ELISA. Se determina la actividad de furina en una muestra a partir de una curva patron creada, por ejemplo, a partir de un patron de rfurina de control de calidad. Se calcularon los valores de actividad como valores medios a partir de dos diluciones, cada una por duplicado. Estabilidad de rfurina a 37 °C en la formulacion altamente estabilizada. El proposito de este experimento era someter a prueba la estabilidad de rfurina en una formulacion estabilizada que contema 75 ppm de polisorbato 80. Hubo un pequeno cambio en la composicion de esta muestra porque se uso trehalosa dihidratada (Ci2H22On*2 H2O, PF 378,33), en lugar de trehalosa no hidratada (C12H22O11, PF 342,30). El uso de la trehalosa dihidratada creo una muestra ligeramente mas diluida. Los estudios de agitacion sugirieron que la concentracion de polisorbato 80 debe mantenerse entre 50 ppm y 100 ppm para proporcionar la mejor proteccion contra la desnaturalizacion de rfurina inducida por agitacion. En este estudio, se realizo una adicion conocida en una muestra de rfurina de la formulacion de prueba n.° 1 con polisorbato 80 hasta 75 ppm y se incubo a 37 °C durante cuatro dfas. Una muestra de rfurina formulada con la formulacion de control sirvio como control.

Los analisis mediante el ensayo de actividad de furina (figura 1) muestran perdida de actividad en las muestras en la formulacion de control que se incubaron a 37 °C y 45 °C. Ya que la muestra de 45 °C estaba altamente degradada y se agrego justo dos dfas despues, no se sometio a prueba la muestra tras ese tiempo. Para las muestras incubadas a temperatura ambiente, los datos no fueron concluyentes como resultado de la cantidad de variabilidad en el ensayo, pero los datos sugirieron que la actividad de rfurina era relativamente estable, siendo la actividad tras 7 dfas aproximadamente equivalente a T = 0.

En contraste con los datos en la formulacion de control, los analisis mediante el ensayo de actividad de furina (figura 46) muestran que la rfurina en la formulacion de prueba n.° 1 retuvo mas de su actividad que en la formulacion de control. Tras cuatro dfas de incubacion a 37 °C, la rfurina retuvo el 76,7 % de su actividad original, mientras que la formulacion de control conservo solamente el 55,5 % de su actividad original (figura 47).

Tambien se uso cromatograffa de exclusion molecular (SEC) para evaluar la estabilidad de diversas formulaciones de furina. Para los metodos de SEC, se usaron los siguientes equipos y materiales:

• Serie HPLC Agilent 1100 equipado con un inyector automatico de temperatura controlada y un detector de red de fotodiodos

• Viales de polipropileno de 100 pl de inyector automatico

• Columna de cromatograffa de exclusion molecular de TOSOH Bioscience, TSKgel

• G3000SWxl, 7,8 mm de DI x 30 cm, 5 pm

Ademas, se usaron las siguientes condiciones para el metodo de SEC:

• Fase movil: MOPS 50 mM, sulfato de sodio 200 mM, el 0,02 % de azida de sodio, pH 7,0

• Caudal: 0,5 ml/min

• Tiempo de procesamiento: 30 min

• Volumen de muestra: 100 pl

• Temperatura del inyector automatico: 4 °C

• Temperatura de la columna: ambiental

Se uso absorcion a una unica longitud de onda a 280 nm (sin referencia) para crear cromatograffas. Tras la integracion manual, se uso la altura del pico principal a 19 min, que corresponde al contenido de rfurina de la formulacion, para evaluar la estabilidad. La razon para usar la altura del pico en vez del area del pico fue que los picos cromatograficos a menudo no se separaron del nivel inicial, lo cual puede conducir a grandes errores. Se llevo a cabo solamente una inyeccion de cada muestra. Los analisis repetidos de la formulacion de control de rfurina mostraron menos del 2 % de variacion en la altura de pico (datos no mostrados).

Los resultados de SEC se correlacionaban con los resultados del ensayo de actividad de furina presentados anteriormente. Los analisis mediante SEC (figura 2) muestran que la altura del pico de monomero de rfurina (tiempo de retencion 19 min) de la formulacion de control disminuyo con el tiempo de incubacion para todas las temperaturas. La disminucion de la velocidad del pico de monomero de rfurina era relativamente baja en las muestras incubadas a temperatura ambiente, ya que el 82 % de la altura del pico permaneda tras siete dfas de incubacion. Sin embargo, a 37 °C, la altura del pico de monomero de rfurina cayo hasta el 21,6%, de la altura original, tras siete dfas de incubacion. A 45 °C, tras dos dfas de incubacion, el pico principal disminuyo hasta el 14,1 %. Coherente con la perdida de contenido de monomero de rfurina, empezaron a aparecer otros picos cromatograficos a lo largo del tiempo (figura 3), que correspondfan a agregados (que se eluyeron a puntos de tiempo mas tempranos) y productos de degradacion (que se eluyeron en puntos de tiempo posteriores). Estos picos adicionales indican tanto degradacion como agregacion de rfurina en la formulacion de control. Tambien se confirmo degradacion aumentada a 37 °C en comparacion con el almacenamiento a temperatura ambiente mediante inmunotransferencia de tipo Western (figura 4). La degradacion de rfurina puede estar provocada por proteasas que se purificaron conjuntamente con rfurina, o mediante la actividad autocatalttica de la propia rfurina.

En cambio, los analisis de SEC confirmaron la estabilidad aumentada de la formulacion de prueba n.° 1 (figura 48), que contema trehalosa, en comparacion con la formulacion de control, que no contiene azucar o alcohol de azucar. La figura 48 muestra que la formulacion de prueba n.° 1 mantuvo el 74,8 % de altura del pico de monomero de rfurina de la disolucion de partida tras incubacion a 37 °C durante 4 dfas, en comparacion con la formulacion de control, que mantuvo solamente el 58,5 % de altura del pico de monomero de rfurina de la disolucion de partida durante la misma incubacion.

Ejemplo 2 - Estabilidad en almacenamiento de formulaciones de rfurina acuosas tras congelacidn/descongelacidn Se sometieron a prueba la estabilidad de la formulacion de control y de las formulaciones de prueba n.° 2-6 mediante un estudio de congelacion/descongelacion. Se completaron cinco ciclos de congelacion/descongelacion y se analizaron muestras mediante el ensayo de actividad de furina y SEC. La investigacion del impacto de la congelacion/descongelacion es importante porque se almacenan congeladas muestras de rfurina en este estudio y BDS de rfurina. Los experimentos de congelacion/descongelacion que usan la formulacion de control (n = 4) demuestran una menor perdida de actividad de furina (aproximadamente el 7 %) tras un total de cinco ciclos de congelacion/descongelacion. Aunque parece existir una tendencia descendente, esto puede deberse a una perdida real de protema o un reflejo de la variabilidad del ensayo. De todas formas, estos datos respaldan la capacidad para congelar y descongelar la rfurina, no solamente una, sino multiples veces, con poca o ninguna perdida de actividad. Asimismo, los analisis de SEC del estado oligomerico de furina en la formulacion de control no mostraron perdida en el contenido monomerico en el transcurso del experimento de congelacion/descongelacion (figura 6 ).

Ya que la rfurina se almacena generalmente congelada, se evaluo el impacto de un metodo de descongelacion. Los analisis mediante el ensayo de actividad (figura) no demostraron diferencias significativas entre los dos metodos de descongelacion: descongelacion a 4 °C durante la noche, o a temperatura ambiente durante 2 horas.

Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que la rfurina en la formulacion de control es relativamente estable durante periodos cortos a temperatura ambiente. Ademas, la perdida de actividad durante el almacenamiento a temperaturas elevadas se correlaciona tanto con degradacion como con agregacion de rfurina. Ademas, la rfurina en la formulacion de control conserva bien su actividad incluso tras cinco ciclos de congelacion/descongelacion.

Estudio de congelacion/descongelacion de rfurina en una formulacion altamente estabilizada. Se llevo a cabo el estudio de congelacion/descongelacion usando el mismo conjunto de muestras que el estudio de congelacion/descongelacion anterior; se evaluo la estabilidad de rfurina en formulaciones de prueba n.° 2 (0 ppm de polisorbato 80), n.° 3 (10 ppm de polisorbato 80), n.° 4 (25 ppm de polisorbato 80), n.° 5 (50 ppm de polisorbato 80) y n.° 6 (100 ppm de polisorbato 80). La furina en la formulacion de control sirvio como control. Coherente con el analisis anterior de la formulacion de control, el analisis de actividad de furina (figura 43) no demostro perdida significativa de actividad tras cinco ciclos de congelacion/descongelacion en cualquiera de las formulaciones sometidas a prueba. Los analisis del contenido de monomero de rfurina mediante SEC (figuras 44 y 45) demostraron solamente una pequena tendencia al deterioro de la muestra tras congelar/descongelar. Incluso tras cinco ciclos de congelacion/descongelacion, todas las muestras conservaron mas del 95 % de su actividad original.

Ejemplo 3 - Estabilidad en almacenamiento de formulaciones de rfurina acuosas tras esfuerzo mecanico

Sin limitarse a la teona, un posible mecanismo del efecto de la agitacion sobre muestras de rfurina es que induce la desnaturalizacion de rfurina, exponiendo superficies hidrofobas. Las superficies hidrofobas son atrafdas hacia otras superficies hidrofobas, tales como otras protemas rfurina desnaturalizadas, lo que induce agregacion, o produciendo adsorcion a superficies hidrofobas en tubos y materiales de muestra.

El estudio de agitacion no se diseno para simular el procedimiento real de uso de rfurina, sino para sobrecargar la muestra. Para considerarse estabilizada, una formulacion de rfurina se comporta al menos tan bien como la formulacion de control, y una formulacion altamente estabilizada se comporta mejor que la formulacion de control. Se llevo a cabo el estudio de agitacion removiendo una muestra de rfurina en un frasco que contema bolas de teflon. Se tomaron muestras tras 2 y 17 horas de agitacion y se analizaron mediante ensayo de actividad de furina y SEC. Tal como se muestra en los resultados tanto para el ensayo de actividad de furina como para el analisis de SEC (figuras 7 y 8 , respectivamente), la rfurina en la formulacion de control es bastante resistente a la agitacion durante un periodo limitado de tiempo. Tras dos horas de agitacion vigorosa, tal como puede producirse durante una etapa de diafiltracion, mas del 85 % de rfurina estaba aun activa en la formulacion de control. Sin embargo, tras 17 horas de agitacion, como puede producirse durante el envfo de una muestra, menos del 10 % del contenido de rfurina permaneda activo.

Ademas se sometio a prueba el efecto sobre las formulaciones de prueba de furina n.° 2 a 6 , que se crearon mediante adicion conocida de nueve partes de una muestra de rfurina con una parte de HEPES 500 mM, ácido acetico 400 mM, CaCl21 mM, pH 6 mas el 10 % p/p de trehalosa mas cantidades variadas de polisorbato 80.

Este estudio de agitacion se llevo a cabo removiendo las formulaciones de rfurina de prueba y formulacion de control contenidas en frascos con bolas de teflon durante tres horas. Se evaluaron formulaciones de prueba que conteman los siguientes niveles de polisorbato 80: nada, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm o 100 ppm. Tal como se muestra en la figura 31, el polisorbato 80 en las formulaciones de prueba proporciono proteccion significativa a la rfurina durante la agitacion. Tras tres horas de agitacion, la actividad de rfurina en las muestras que conteman polisorbato 80 oscilo entre 31499±1.218 U/ml y 36.787±847 U/ml, mientras que la muestra en las formulaciones sin polisorbato 80 tema 17.835±1.706 U/ml de actividad de furina. La muestra en la formulacion de control (acetato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 230 mM, cloruro de calcio 1 mM, pH 6,0) tema una actividad de 24.368±1.135 U/ml.

Los analisis mediante SEC confirmaron el efecto beneficioso del polisorbato 80 en este estudio (figura 32). Tras tres horas de agitacion, las alturas del pico de rfurina en las muestras que conteman polisorbato 80 oscilaron entre 37,5 mAU y 35,9 mAU, mientras que la altura del pico de rfurina en la formulacion sin polisorbato 80 fue de 22,1 mAU. La altura del pico de rfurina en la formulacion de control fue de 29,9 mAU. Tambien se muestra el efecto del polisorbato 80 en las figuras 33 y 34. La pequena tendencia sugiere que la adicion de 10 ppm y 25 ppm de polisorbato 80, aunque aun beneficiosa, no es tan eficaz como el uso de 50 ppm o 100 ppm de polisorbato 80. El perfil de SEC para la muestra agitada en la formulacion de control (figura 35) no muestra ningun pico adicional en comparacion con la muestra no agitada. Esto sugerina que la adsorcion en superficie era el motivo principal para la perdida de actividad. Sin embargo, los espectros de absorcion UV (figura 36) muestran que la muestra agitada tiene un perfil inclinado y elevado, que es un signo de dispersion y oscurecimiento de la luz producidos por la presencia de agregados. El oscurecimiento de la luz se produce generalmente por diversos agregados grandes que son mas opacos que moleculas mas pequenas, lo cual produce una elevacion de los espectros UV. Este fenomeno no puede distinguirse de la absorcion mediante un espectrofotometro porque su detector mide la cantidad de luz que pasa a traves de una muestra. Ya que llega menos luz al detector, se notifica como absorcion; por lo tanto, se eleva el perfil de absorcion.

La luz tambien puede dispersarse por los agregados, lo que tambien disminuina la cantidad de luz que llega a un detector. Cuanto mas corta es la longitud de onda, mas luz se dispersa (la cantidad de luz dispersada es inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda). Esto significa que cuanto mas corta es la longitud de onda, menos luz llega a un detector; por lo tanto, el perfil de absorcion se inclina. Es probable que los agregados estuvieran presentes en esta muestra, pero el analisis de SEC fue incapaz de detectarlos. Este tipo de problemas con los analisis de SEC no son infrecuentes porque los agregados de protemas son a menudo demasiado grandes para hacerlos pasar a traves de la columna, o quedan absorbidos por la matriz de la columna. El espectro de absorcion UV de la muestra de rfurina en la formulacion sin polisorbato 80 (figura 37) muestra un perfil elevado similar. De nuevo, no se detectaron agregados en el analisis de SEC de esta muestra (figura 38). Las muestras formuladas con polisorbato 80 muestran menor agregacion que aquellas sin polisorbato 80 cuando se analizaron mediante los espectros de absorcion UV (figuras 39 a 42). Aunque un espectro de UV no puede cuantificar la cantidad de agregados, de nuevo, puede observarse una pequena tendencia que insinua que las muestras con polisorbato 80 a 50 ppm y 100 ppm eran mejores en la proteccion de la rfurina contra la agregacion que 10 ppm o 25 ppm. Los datos sugieren que el polisorbato 80 incluido en la formulacion a un nivel de 75 ppm sena eficaz, ya que esta concentracion esta en el centro de una meseta amplia (50-10 ppm) y representana una condicion robusta.

Se llevo a cabo el analisis de espectrofotometna UV usando los siguientes equipos y materiales:

• Espectrofotometro Agilent 8453

• Cubeta de cuarzo de trayectoria optica de 1 cm

Se llevo a cabo el analisis de espectrofotometna situando primero 0,5 ml de una formulacion apropiada en una cubeta y se midio como blanco. Luego, se situaron 0,5 ml de una muestra de rfurina en una cubeta, y se tomo el barrido desde 240 nm hasta 400 nm.

Ejemplo 4 - Impacto de pH, sacarosa y polisorbato 80 sobre la estabilidad de rfurina

Se realizaron adiciones conocidas de muestras de rfurina con diversos tampones con el fin de ajustar el pH a 5,0, 5,5, 6,0, 7,0 y 8,0. Ademas, se anadieron sacarosa y/o polisorbato 80 a las muestras un pH 6,0, 7,0 y 8,0. Se incubaron las muestras a 37 °C y se sometieron a prueba mediante el ensayo de actividad de furina y SEC.

Tanto el ensayo de actividad de furina (figura 11) como la SEC (figura 12) mostraron que a 37 °C la rfurina era mas estable a pH 6,0 que a pH 5,0 o 5,5. Las muestras a pH 6,0, tanto en la formulacion de control (figura 13) como en MES (figura 14), fueron mas estables que las formuladas en pH 7,0 o 8,0 (figuras 15 y 16) cuando se analizaron mediante SEC. La adicion de sacarosa a las muestras en pH 6,0 y 7,0 tema un efecto beneficioso sobre la estabilidad de rfurina. Los analisis de SEC (figura 17) mostraron que tras cuatro dfas de incubacion a 37 °C, las alturas del pico de las muestras que conteman sacarosa fueron en promedio del 75 % de T = 0, en comparacion con el 52 % sin la sacarosa. Los analisis mediante el ensayo de actividad de furina confirmaron los resultados de los experimentos de SEC (figuras 18 y 19). La adicion de sacarosa mejoro la estabilidad de rfurina tanto en la formulacion de control como en MES pH 6,0 (figuras 18 y 19), con estabilidad similar observada usando cualquier tampon (figura 20). Los efectos del polisorbato 80 sobre la estabilidad de rfurina en una formulacion que contema sacarosa a 37 °C fueron mmimos, si los hubo, tal como se muestra en las figuras 17, 18 y 19.

Estos datos sugieren que a 37 °C la rfurina es mas estable en las formulaciones de pH 6,0 en comparacion con pH 5,0, 5,5, 7,0 y 8,0. Los datos muestran ademas que la sacarosa tuvo un efecto beneficioso sobre la estabilidad de rfurina a 37 °C. Ademas, no se observo diferencia significativa en la estabilidad de rfurina entre el tampon de control (acetato) o MES a pH 6,0 en presencia del 10% de sacarosa. Finalmente, no hubo un efecto significativo del polisorbato 80 sobre la estabilidad de rfurina en una formulacion de sacarosa a 37 °C.

Ejemplo 5 - Comparacion de la estabilidad de formulaciones de furina en sacarosa y manitol

Tal como se observa en el ejemplo 4, la adicion de sacarosa ralentizo la degradacion y/o perdida de actividad de rfurina a 37 °C. Aunque no se usa sacarosa en aplicaciones posteriores tales como el procedimiento de rVWF, se usan otros azucares y/o alcoholes de azucar, tales como manitol. La adicion de manitol a la formulacion de rfurina, en lugar de sacarosa, no introducina por tanto un nuevo material de partida en el procedimiento de vWF. Este estudio se llevo a cabo para determinar si la adicion de manitol tendna un efecto beneficioso sobre la estabilidad de rfurina. La formulacion de prueba tambien posefa una capacidad de tamponamiento mejorada mediante la adicion de HEPES y ácido acetico a concentraciones finales de 50 mM cada uno a pH 6,0. Se creo una formulacion estabilizada mediante la adicion conocida de una muestra de rfurina con el 10 % de HEPES 500 mM, ácido acetico 400 mM, CaCl2 1 mM, pH 6 , y luego, anadiendo o bien sacarosa, manitol y/o bien polisorbato 80. Los analisis mediante tanto el ensayo de actividad de furina (figura 21) como la SEC (figura 22) mostraron que tras cuatro dfas de incubacion a 37 °C, el manitol y la sacarosa teman efectos estabilizantes similares sobre formulaciones de rfurina. De nuevo, el efecto del polisorbato 80 sobre estas formulaciones no era significativo. Aunque los datos de actividad (figura 21) muestran que la muestra que contema manitol y polisorbato 80 tras 4 dfas de incubacion a 37 °C fue mejor que las otras muestras, esta muestra no solo no segrna el patron global, sino que ademas los analisis de SEC (figura) no lo confirmaron. Es probable que este resultado fuera un resultado atfpico.

Ejemplo 6 - Comparacion de la estabilidad de formulaciones de furina en sacarosa y trehalosa

Diversas publicaciones han mostrado que el manitol acelera la desnaturalizacion de protemas durante la congelacion, lo que ha provocado cierta inquietud sobre su inclusion en el tampon de formulacion de rfurina. No se han notificado este tipo de problemas con trehalosa, otro azucar que ya forma parte del procedimiento de produccion de rVWF. Este estudio se llevo a cabo para determinar si la adicion de trehalosa tendna un efecto beneficioso sobre la estabilidad de rfurina. Ademas, se evaluaron diversas concentraciones de polisorbato 80. Los analisis usando el ensayo de actividad de furina (figuras 23 y 24) mostraron que, tras 5 dfas de incubacion a 37 °C, la muestra que contema el 10% de sacarosa conservo el 66,2 %±2,9 % de su actividad original mientras que la muestra que contema el 10% de trehalosa conservo el 60,1 %±4 %. La diferencia entre estas muestras no es significativa. Ambas muestras fueron significativamente mejores en la conservacion de la actividad de rfurina que la formulacion de control, que conservo solamente el 37,5 %±4,2 % de su actividad original.

Los analisis mediante SEC (figura 25) confirmaron los analisis de actividad. El pico de rfurina para la muestra en el 10 % de sacarosa conservo el 78,3 % de su altura en comparacion con el 75,1 % para la muestra en el 10 % de trehalosa y el 44,2 % para la formulacion de control. Ademas, los analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western (figura 26) mostraron la menor degradacion en las muestras que conteman el 10 % de sacarosa o el 10 % de trehalosa. Observese que se presentan las muestras como pares, con el dfa 0 seguido por el dfa 5 para cada una de las formulaciones.

Tanto los analisis del ensayo de actividad de furina (figura 27) como de la SEC (figura 28) muestran que el 10 % de trehalosa fue mejor que el 5 % o el 2 % en la conservacion de la actividad de rfurina a 37 °C. Estos hallazgos tambien se confirmaron mediante inmunotransferencia de tipo Western (figura 26). El impacto del polisorbato 80 sobre la estabilidad de rfurina a 37 °C fue mmimo segun los analisis mediante el ensayo de actividad de furina y la SEC (figuras 29 y 30, respectivamente).

Se llevaron a cabo ensayos de SEC y actividad de furina tal como se describio anteriormente. Se realizo inmunotransferencia de tipo Western usando los siguientes equipos y materiales:

• Anticuerpo primario de cabra antifurina (peptido) (n.° de cat. SC-12484) de Santa Cruz Biotechnology, Inc.

• Anticuerpo secundario conjugado con HRP de conejo anti-IgG de cabra (n.° de cat. A5420) de Sigma

• Kit de sustrato mejorado con metal Pierce que contiene DAB/concentrado de metal 10X,

• Pierce (n.° de cat. 1856090) y tampon de peroxidasa estable, Pierce (n.° de cat. 185591)

• Gel de Tris-glicina al 4-20 % (n.° de cat. EC6025BOX) de Invitrogen

• Agente reductor de muestra NuPAGE® (DTT 0,5 M, 10x, n.° de cat. NP0004) de Invitrogen

• Tampon de muestra no reductor (4X, n.° de cat. 84788) de Thermo

• PBS (n.° de cat. P4417) de Sigma

• Tween 20 (n.° de cat. 9480) de EMD Chemicals

• BSA (n.° de cat. A7906) de Sigma

• Dispositivo de transferencia de gel (iBLOT n.° de cat. IB401001) de Invitrogen

• Membrana de transferencia de PVDF (Immobilon-P, n.° de cat. IPVH07850) de Millipore

Se uso un anticuerpo policlonal en este estudio en vez de uno monoclonal para aumentar la deteccion de productos de degradacion de rfurina. Se combinaron 5 pl de una muestra con 1 pl de DTT 10x, y 4 pl de colorante no reductor 4x. Se calento la muestra a de 70 °C a 75 °C durante 10 minutos. Se cargaron 10 pl de la muestra en gel de SDS-PAGE al 4-20 %, y se proceso a 150 V durante de 60 a 70 minutos. Se transfirio el gel de protemas a una membrana de PVDF usando el instrumento iBLOT a 20 V durante 6 minutos. Entonces se bloqueo la membrana de PVDF con tampon PBS que contema el 0,1 % de TWEEN 20 y el 3 % de BSA durante 1 hora. Se incubo la membrana durante una hora en el anticuerpo primario diluido 125 veces con el mismo tampon. Se lavo la membrana con tampon PBST durante cinco minutos, tres veces cada uno. Se incubo la membrana durante una hora en el anticuerpo secundario diluido 10.000 veces con el mismo tampon que el anticuerpo primario. El tiempo de incubacion fue de 1 hora. Se lavo la inmunotransferencia con tampon PBST durante cinco minutos, tres veces cada uno. Se revelo la inmunotransferencia en 10 ml de sustrato cromogenico premezclado (1 ml de concentrado mas 9 ml de tampon de peroxidasa estable) seguido por el lavado con agua durante 10 minutos.

Ejemplo 7 - Efectos de agentes estabilizantes tras la dilucion de composiciones de furina

Se llevo a cabo el estudio de dilucion de rfurina para comparar una formulacion de partida y su diluyente con una formulacion estabilizada y un diluyente estabilizado. El estudio imito el metodo de dilucion que se uso en el procedimiento de maduracion de rVWF. Brevemente, se hizo pasar BDS de rfurina a traves de un filtro seguido por la adicion de un volumen de 200 veces del diluyente. La principal diferencia entre el metodo de dilucion de prueba y el metodo de dilucion de partida es que en el metodo de prueba (altamente estabilizado), estan presentes 75 ppm de polisorbato 80 tanto en el BDS de rfurina como en el diluyente, mientras que, en el metodo de partida, no hay polisorbato 80 ni en el BDS de rfurina ni en el diluyente.

Se llevaron a cabo dos experimentos de dilucion, y ambos han mostrado que la combinacion de la formulacion estabilizada con su diluyente estabilizado fue superior a las formulaciones de diluyente y furina de partida. En el primer experimento, el metodo de prueba usando las formulaciones estabilizadas recupero del 83 % al 87 % de la actividad de rfurina esperada, mientras que los metodos de control recuperaron solo del 21 % al 22 % (tabla 18). En este experimento, se hizo pasar la muestra de rfurina a traves de un filtro y le siguio un volumen de 200 veces de un diluyente. Se recogio el filtrado en una bolsa y luego se transfirio a un cilindro graduado.

Tabla 18. Resultados experimentales de experimentos de dilucion de rfurina realizados con y sin tensioactivo no ionico.

En el segundo experimento, el metodo de prueba recupero el 80 % de la actividad de rfurina esperada, mientras que el metodo de control recupero solamente el 27% (tabla 19). En este experimento, se hizo pasar la muestra de rfurina a traves de un filtro y le siguio un volumen de 200 veces de un diluyente. Se recogio el filtrado en un cilindro. La combinacion de la formulacion de rfurina estabilizada y el diluyente estabilizado aumento la recuperacion de rfurina de tres a cuatro veces en comparacion con el metodo de control. La recuperacion mejorada esta ligada, sin limitarse a la teona, a la presencia de polisorbato 80.

Tabla 19. Resultados experimentales de experimentos de dilucion de rfurina realizados con y sin tensioactivo no ionico.

Ejemplo 8 - Caractensticas del tampon madre de formulacion estabilizada

El tampon madre para la formulacion de rfurina estabilizada (HEPES 500 mM, ácido acetico 400 mM, CaCl21 mM, pH 6,0) puede elaborarse de manera sistematica (tabla 20). Las DER para pH y conductividad fueron < 0,3 %. El pH se correlaciono ligera e indirectamente con la temperatura, cayendo 0,014 unidades por grado Celsius, mientras que la conductividad se correlaciono directamente con la temperatura, subiendo 0,40 mS/cm por grado C (figura 49). La temperatura promedio de las muestras cuando se midieron el pH y la conductividad fue de 27,6 °C. En fabricacion, las muestras se leen a 25±0,5 °C. Basados en las regresiones lineales en la figura 48, se calcularon el pH y la conductividad esperados a 25 °C. Se aplico la desviacion estandar relativa a partir de la tabla 20 a este valor para determinar el intervalo esperado (±3 de). El pH a 25 °C se espera que sea de 6,04 (±0,01). La conductividad a 25 °C se espera que sea de 19,9±0,2 mS/cm. Estos intervalos esperados se basan en tres lotes realizados en circunstancias limitadas. Los intervalos de especificacion para el tampon no necesitan ajustarse de manera estricta. La especificacion de pH sera la misma que la especificacion de pH del BDS final, 5,90-6,10. El intervalo de conductividad sera similar a aquel usado para el tampon de BDS anterior, por ejemplo, con un intervalo de ±20 %, para una especificacion de 15,9-23,9 mS/cm. Los requisitos del procedimiento de rVWF no son generalmente motivo de preocupacion en el ajuste de las especificaciones del tampon porque la rfurina se diluira 200 veces en el procedimiento de rVWF. Los datos experimentales en la tabla 21 y tabla 22 corresponden a los graficos presentados en la figura 49.

Tabla 20. Caractensticas del tampon madre de formulacion estabilizada.

Tabla 21. Dependencia de la conductividad del tampon madre de la temperatura.

Tabla 22. Dependencia del pH del tampon madre de la temperatura.

Referencias

Pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones de esta solicitud sin apartarse de su alcance, como resultara evidente para los expertos en la tecnica. Las realizaciones espedficas descritas en el presente documento se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y la solicitud ha de limitarse solamente mediante los terminos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de equivalentes a los que dan derecho las reivindicaciones.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composicion acuosa estabilizada de furina recombinante (rfurina), comprendiendo la composicion:

(a) desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina;

(b) desde 100 mM hasta 300 mM de una sal farmaceuticamente aceptable;

(c) desde 0,5 mM hasta 2 mM de calcio;

(d) desde el 2 % hasta el 20 % de azucar o alcohol de azucar;

(e) desde 10 hasta 200 ppm de tensioactivo no ionico;

(f) desde 10 hasta 200 mM de agente de tamponamiento; y

(g) un pH desde 5,5 hasta 7,5.

2. La composicion de la reivindicacion 1, que comprende desde 150 mM hasta 250 mM, preferiblemente que comprende 190±10 mM, mas preferiblemente que comprende 190 mM de una sal farmaceuticamente aceptable.

3. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la sal farmaceuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio.

4. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende calcio 0,9±0,2 mM, o preferiblemente que comprende calcio 0,92 mM.

5. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende desde el 5 % hasta el 15%, o preferiblemente que comprende el 10±2%, o mas preferiblemente que comprende el 10% de azucar o alcohol de azucar.

6. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el azucar o alcohol de azucar se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinacion de los mismos, preferiblemente en la que el azucar o alcohol de azucar es trehalosa, o preferiblemente en la que el azucar o alcohol de azucar es sacarosa.

7. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende desde 10 ppm hasta 100 ppm, o preferiblemente que comprende desde 50 ppm hasta 100 ppm, o mas preferiblemente que comprende 75 ppm de tensioactivo no ionico.

8. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el tensioactivo no ionico es polisorbato 80.

9. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende desde 50 mM hasta 150 mM, o que comprende 90±10 mM, o que comprende 91 mM de agente de tamponamiento.

10. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el agente de tamponamiento comprende acetato o HEPES o MES o la combinacion de los mismos.

11. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el agente de tamponamiento comprende acetato y HEPES.

12. La composicion de la reivindicacion 11, que comprende desde 25 mM hasta 75 mM de acetato y desde 25 hasta 75 mM de HEPES, o preferiblemente que comprende acetato 45±5 mM y HEPES 45±5 mM, o mas preferiblemente que comprende acetato 45 mM y HEPES 46 mM.

13. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que tiene un pH desde 5,5 hasta 7,0, o preferiblemente que tiene un pH desde 5,5 hasta 6,5, o preferiblemente que tiene un pH de 6,0±0,2, o mas preferiblemente que tiene un pH de 6,0.

14. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la composicion tiene estabilidad aumentada y/o mantiene un porcentaje mayor de actividad de rfurina y/o mantiene un porcentaje mayor de contenido de monomero de rfurina cuando se almacena a 37 °C en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un azucar o alcohol de azucar.

La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la composicion tiene estabilidad aumentada y/o mantiene un porcentaje mayor de actividad de rfurina y/o mantiene un porcentaje mayor de contenido de monomero de rfurina cuando se agita en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un tensioactivo no ionico.

La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que la composicion tiene estabilidad aumentada y/o mantiene un porcentaje mayor de actividad de rfurina y/o mantiene un porcentaje mayor de contenido de monomero de rfurina cuando se diluye en comparacion con una composicion de rfurina que no contiene un tensioactivo no ionico.

Una composicion acuosa estabilizada de furina recombinante (rfurina), comprendiendo la composicion: (a) desde 8.000 U/ml hasta 500.000 U/ml de rfurina;

(b) cloruro de sodio 190 mM;

(c) calcio 0,92 mM;

(d) el 10 % de trehalosa;

(e) 75 ppm de polisorbato 80;

(f) ácido acetico 45 mM;

(g) HEPES 46 mM; y

(h) un pH desde 5,5 hasta 7,5.

La composicion de la reivindicacion 17, que tiene un pH desde 5,5 hasta 7,0, preferiblemente desde 5,5 hasta 6,5, o preferiblemente de 6,0±0,2 o mas preferiblemente de 6,0.