KR100905450B1 - 약독화된 인간-소 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스백신의 제조 방법 - Google Patents

약독화된 인간-소 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스백신의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100905450B1
KR100905450B1 KR1020027000318A KR20027000318A KR100905450B1 KR 100905450 B1 KR100905450 B1 KR 100905450B1 KR 1020027000318 A KR1020027000318 A KR 1020027000318A KR 20027000318 A KR20027000318 A KR 20027000318A KR 100905450 B1 KR100905450 B1 KR 100905450B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rsv
delete delete
human
gene
chimeric
Prior art date
Application number
KR1020027000318A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20020092343A (ko
Inventor
우르술라 부쉬홀즈
피터 엘. 콜린스
브라이언 알. 머피
스테판 에스. 화이트헤드
크리스틴 디. 크렘플
Original Assignee
더 가버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤 휴먼 서비씨즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 가버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤 휴먼 서비씨즈 filed Critical 더 가버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤 휴먼 서비씨즈
Publication of KR20020092343A publication Critical patent/KR20020092343A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100905450B1 publication Critical patent/KR100905450B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/544—Mucosal route to the airways
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18541—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18543—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18561—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

키메릭 인간-소 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV)는 인간 및 다른 동물에서 감염성이고, 약독화되고, 항-RSV 면역 반응 유발 백신 제제에 유용하다. 또한, 상이한 RSV 균주의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)과 결합 또는 통합된 부분적 또는 완전한 인간 또는 소 RSV "배경" 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 혼입한 벡터 및 단리된 폴리뉴클레오티드 분자가 제공된다. 본 발명의 키메릭 인간-소 RSV는 상이한 RSV 균주 또는 아군 바이러스의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)과 결합된 인간 또는 소 RSV 균주 또는 아군 바이러스로부터 유도되거나, 상기 RSV 균주 또는 아군 바이러스 후에 패턴화된 부분적 또는 완전한 "배경" RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하여 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 키메릭 RSV는 인간 RSV 유래의 1 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)과 결합된 부분적 또는 완전한 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈을 혼입한다. 관심 유전자는 그 단백질 또는 일부를 포함하는 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 유전자 또는 게놈 분절을 포함한다. 다양한 추가 돌연변이 및 뉴클레오티드 변형이 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV 내에 제공되어 요망되는 표현형 또는 구조적 효과를 일으킨다.
Figure R1020027000318
호흡기 신시티움 바이러스, 키메릭 RSV

Description

약독화된 인간-소 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스 백신의 제조 방법{Production of Attenuated, Human-Bovine Chimeric Respiratory Syncytial Virus Vaccines}
인간 호흡기 신시티움 바이러스(HRSV)는 전세계적으로 심각한 소아 호흡기 질환의 주된 바이러스이다 (Collins et al., Fields Virology 2:1313-1352, 1996). RSV는 1살 이하의 유아에서 폐렴 및 세기관지염의 원인으로서 모든 다른 미생물 병원체를 능가한다. 사실상 모든 아이들은 2살까지 감염되고, 재감염은 더 큰 아이들 및 젊은 성인에서 상당한 빈도로 발생한다 (Chanock et al., Viral Infections of Humans, 3rd ed., A.S. Evans, ed., Plenum Press, N.Y. (1989)). 호흡기계 질환에 의해 소아 병원에 입원하는 5개 경우 중 1개 이상이 RSV 때문이고, RSV는 미국에서만 1년에 100,000건의 입원과 4,500건의 사망을 일으키는 것으로 평가된다. (Heilman, J. Infect Dis., 161:402-6, 1990). 또한, 유아기의 심각한 호흡기 감염은 천식을 유발 또는 악화시킬 수 있다는 증거가 있다 (Sigurs, et al., Pediatrics 95:500-5, 1995).
인간 RSV는 통상적으로 소아 집단과 연관하여 생각되지만, 노인들에서도 심각한 질병의 중요 물질로 여겨진다 (Falsey et al., J. Infect. Dis. 172:389-394, 1995). 인간 RSV는 또한 골수 이식 수령자와 같이 특정 면역기능저하 개체에서 생 명을 위협하는 질병을 유발한다 (Fouillard, et al., Bone Marrow Transplant 9:97-100, 1992).
인간 RSV 치료용으로 리바비린(ribavirin)이라는 1 종의 화학요법제가 입수가능하다. 그러나, 이 효능 및 용도는 논의 여지가 있다. 또한, 풀링된(pooled) 공여체 IgG (Groothuis, et al., N Eng J Med 329:1524-30, 1993) 또는 인간화 RSV-특이적 모노클로날 항체를 포함하는 RSV 중재용으로 허가받은 제품이 있다. 이들은 고 위험도의 개체에 수동 면역예방제로 투여된다. 이들 제품이 유용하기는 하지만, 이들은 고비용 및 장기 효능 결여와 같은 다른 인자로 인하여 널리 사용되기에는 부적합하다. 다른 단점으로는 혈액 매개 바이러스 전파의 가능성 및 제조 및 저장의 어려움 및 비용을 들 수 있다. 게다가, 감염성 질병, 특히 바이러스 기원의 질병의 제어 역사는 백신의 1차적 중요성을 지적한다.
RSV에 대해 효과적인 백신제제를 개발하기 위한 수십년 간의 연구에도 불구하고, RSV 감염과 관련된 심각한 이환율 및 현저한 사망율을 억제하기 위한 안전하고 효과적인 백신이 아직 개발되지 않았다. 성공적인 백신 개발의 실패는 부분적으로 어린 유아들이 RSV 항원에 대한 혈청 및 분비 항체 반응을 감소시킨다는 사실에 관련된다. 그러므로, 이들 유아들이 RSV로부터 더 심각한 감염을 당하게는 되지만, 누적적인 면역성이 더욱 심각한 바이러스의 충격에 대해 더 큰 아이들 및 성인을 방어하는 듯하다.
최근 RSV 감염에서의 면역 기전에 관심이 집중되고 있다. 분비 항체는 상기도를 방어하는 데 가장 중요한 것으로 보이지만, 높은 수준의 혈청 항체는 하기도 에서의 RSV 감염에 대한 내성에 주요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. RSV-특이성 세포독성 T 세포 및 유도된 면역성의 또다른 에펙터 암 (effector arm)은 또한 RSV 감염을 해결하는 데 중요하다. 그러나, 상기 후자의 에펙터가 이전의 면역화에 의해 강화되어 바이러스 감염에 대한 증가된 내성을 일으킬 수 있으나, 효과는 오래가지 않는다. F 및 G 표면 당단백질은 RSV의 2개의 주요한 방어 항원이고, RSV를 중화시키는 항원을 유도하고 감염에 대한 장기간 내성을 갖는 오직 2개의 RSV 단백질이다 (Collins et al., Fields Virology, Fields et al., eds., 2:1313-1352. Lippincott-Raven, Philadelphia. (1996); Connors et al., J. Virol. 65(3):1634-7 (1991)). 제3 RSV 표면 단백질, SH는 RSV를 중화시키는 항체 또는 RSV 감염에 대한 현저한 내성을 유도하지 않는다.
생 RSV 백신 개발에 대한 하나의 장애는 부분적으로 일부 약독화 바이러스의 유전적 불안정성, 세포 배양에서 RSV의 상대적으로 불충분한 성장 및 바이러스 입자의 불안정성으로 인한 약독화와 면역원성 사이의 적당한 균형을 이루는 데 어려움이 있다는 것이다. 자연 감염에 의해 유발되는 면역 외에는 후속 감염에 대해 완전히 방어되지 않는다. 아마도 호흡기도의 내강 표면 상의 바이러스 감염을 억제하는 데 있어서 면역계의 상대적 비효율성, 오래가지 않는 국소적 점막 면역성, 신속하고 강력한 바이러스 복제, 면역학적 비성숙에 의한 아이들의 감소된 면역 반응, 태반을 통해 모체로부터 유도된 혈청 항체에 의한 면역 억제, 및 G 단백질의 높은 수준의 글리코실화와 같은 바이러스의 특정한 성질을 포함한 수많은 인자가 여기에 기여할 것이다. 또한, 하기에 기술되겠지만, 인간 RSV는 2개의 항원 아군 A 및 B로서 존재하고, 하나의 아군에 대한 면역성은 다른 아군에 대해 그 효과가 감소한다.
죽을 때까지 RSV는 수회 재감염될 수 있지만, 재감염은 통상적으로 이전의 감염에 의해 유도된 방어적 면역성에 의해 심각성이 감소되고, 그로 인해 면역학적 예방이 가능하다. 생 약독화된 RSV 백신은 비강으로 투여되어 온화한 면역화 감염을 시작할 것이다. 이는 비경구 경로와 비교해서 간결하고 안전한 잇점을 갖는다. 이는 또한 국소적 호흡기 면역성을 직접적으로 자극하고, RSV에 대한 내성에 주요한 역할을 한다. 이는 또한 전형적으로 매우 젊은 사람에게서 나타나는 RSV-특이적 모체로부터 유도된 혈청 항체의 면역 억제 효과를 제거한다. 또한, RSV 항원을 비경구 투여하면 때때로 면역병리학적 합병증을 일으킬 수 있으나 (Murphy et al., Vaccine 8(5):497-502 (1990)), 이는 생 바이러스로는 나타나지 않았다.
포르말린 불활성화 바이러스 백신을 1960년대 중반에 RSV에 대하여 시험하였으나, RSV 감염 또는 질병을 방어하는 데는 실패했고, 사실 바이러스에 의한 이후 감염에 의한 증상을 악화시켰다. (Kim et al., Am. J. Epidemiol., 89:422-434 (1969); Chen et al., Am. J. Epidemiol., 89:449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol., 89:405-421 (1969)).
더욱 최근에, RSV 백신 개발은 약독화된 RSV 돌연변이에 집중되었다. 문헌 [Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968)]은 충분히 약독화된 것으로 보이는 RSV의 저온 계대 배양된 (cold passaged) 돌연변이 (cpRSV)가 백신 후보물임을 보고하였다. 이 돌연변이는 야생형 (wt) 부모 바이러스와 비교하여 26oC에서 약간 증가된 성장 효율을 나타냈지만, 그의 복제는 온도 민감성도 아니고 현저하게 저온 적응되지도 않았다. 그러나, 저온 계대 배양된 돌연변이는 성인에 대해 약독화되었다. RSV로 이전에 감염되었던 유아 및 아이들에 대해 만족스럽게 약독화되고 면역원성이라 하더라도 (즉, 혈청 양성 개체들), cpRSV 돌연변이는 혈청 음성 유아의 상기도에 대해 낮은 독성을 가졌다.
유사하게는, 문헌 [Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969)]은 유망한 백신 후보이기도 한 온도 민감성 RSV (tsRSV) 돌연변이의 분리를 보고하였다. 하나의 돌연변이체인 ts-1을 실험실에서 그리고 지원자들에서 집중적으로 평가하였다. 돌연변이체는 성인 지원자에게 무증상 감염을 일으켰고, 면역화시키고 45일 후에 야생형 바이러스의 감염에 대해 내성이 생겼다. 또한, 혈청 양성 유아 및 아이들은 무증상 감염되었으나, 혈청 음성 유아는 비염 및 다른 경미한 증상의 징후를 나타내었다. 또한, ts 표현형의 불안정성이 검출되었다. 부분적 또는 완전한 온도 민감성 상실을 나타내는 바이러스가 백신 접종자로부터 회수가능한 바이러스 일부를 나타낼지라도, 이는 경미한 비염 이외의 질병의 신호와 연관되지 않았다.
이들 및 다른 연구는 특정한 저온 계대 배양되고 온도 민감성인 RSV 균주가 불충분하게 약독화되어 몇몇 백신을 맞은 개체들, 특히 혈청 음성 유아에서 경미한 증상의 질병을 일으켰지만, 다른 균주들은 과도하게 약독화되어 방어적 면역 반응을 유도하기 위해 충분히 복제하는 데 실패하였음을 보여 주었다 (Wright et al., Infect. Immun., 37:397-400 (1982)). 또한, 후보 백신 돌연변이체의 유전적 불안 정성은 그들의 온도 민감성 표현형의 손실을 초래하였고, 나아가 효과적인 RSV 백신의 개발을 방해하였다. 일반적으로 문헌 [Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 145:1158-1164 (1974), McIntosh et al., Pediatr. Res. 8:689-696 (1974), 및 Belshe et al., J. Med. Virol., 3:101-110 (1978)] 참조.
생-약독화된 RSV 백신 대신에, 연구자들은 정제된 RSV 외피 (envelope) 당단백질을 사용하여 서브단위 백신 후보를 시험하였다. 당단백질은 코튼 랫트 (cotton rats)의 폐에서 RS 바이러스 감염에 대해 내성을 유도하였으나 (Walsh et al., J. Infect. Dis. 155:1198-1204 (1987), 항체는 매우 약한 중화 활성을 가지고 정제된 서브단위 백신으로 설치류를 면역화시키면 질병이 악화되었다 (Murphy et al., Vaccine 8:497-502 (1990)).
F 및 G 외피 당단백질을 발현시키는 재조합 우두 바이러스 백신이 또한 시험되었다. 이들 재조합체는 원래 바이러스 대응물과 구별할 수 없는 RSV 당단백질을 발현시키고, 우두-RSV F 및 G 재조합체로 피내 감염된 설치류는 바이러스 감염성을 중화시키는 높은 수준의 특이 항체를 발생시켰다. 사실, 우두-F 재조합체로 코튼 랫트를 감염시키면 하기도에서 RSV의 복제에 대해 거의 완전한 내성 및 상기도에서 현저한 내성이 자극되었다. (Olmsted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7462-7466 (1986)). 그러나, 우두-F 및 G 재조합체로 침팬지를 면역화시키면 상기도에서는 RSV 감염에 대해 거의 방어를 거의 나타내지 않았고 (Collins et al., Vaccine 8:164-168 (1990)) 하기도에서는 방어가 일관성이 없었다 (Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993)).
효과적인 RSV 백신을 개발하기 위한 상기 다양한 노력에도 불구하고, RSV에 대해서는 아직 허가받은 백신이 없다. 선행 접근법의 만족스럽지 않은 전망은 RSV 백신 개발을 위한 신규 전략, 특히 생존가능한 약독화된 RSV 재조합체에 신규 표현형 성질을 얻는 유전적 변화를 도입하기 위해 재조합 RSV를 조작하는 방법을 강조한다. 그러나, RSV 및 다른 비분적 음성 센스 RNA 바이러스의 게놈 RNA 조작은 이제까지 어려운 것으로 증명되었다. 이러한 점에서 주요한 장애는 이들 바이러스의 나출된 (naked) 게놈 RNA의 비감염성, 조직 배양에서의 열악한 성장, 긴 복제 주기, 바이러스 입자 불안정성, 복합체 게놈, 및 유전자 생성물의 불응성 조직화 등이다.
재조합 DNA 기술은 cDNA로부터 감염성 비분절 음성 가닥 DNA 바이러스를 회수하고, 바이러스 클론을 유전학적으로 조작하여 신규한 백신 후보물질을 구성하고, 약독화 및 표현형 안정성의 수준을 신속하게 평가하는 것을 가능하게 하였다 (Conzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-58 (1996) 참조). 이와 관련하여, 재조합 레스큐 (rescue)는 필수 바이러스 단백질의 존재 하에서 cDNA-코딩된 안티게놈 RNA로부터 감염성 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV), 파라인플루엔자 바이러스 (PIV), 광견병 바이러스 (RaV), 소포성 구내염 바이러스 (VSV), 홍역 바이러스 (MeV), 우역(rinderpest) 및 센다이 바이러스 (SeV)에 대해 보고되었다 (예를 들면, Garcin et al., EMBO J. 14:6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14:5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13:4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:8388-92 (1995); Hoffman et al., J Virol. 71:4272-4277 (1997); Pecters et al., J. Virol. 73:5001-5009 (1999); Kato et al., Genes to Cells 1:569-579 (1996); Roberts et al., Virology 247(1), 1-6 (1998); Baron et al., J Virol. 71:1265-1271 (1997); 국제 공개 WO 제97/06270호; 1995년 9월 27일 출원된 미국 가특허 출원 제60/007,083호; 1996년 9월 27일 출원된 미국 특허 출원 제08/720,132호; 1996년 7월 15일 출원된 미국 가특허 출원 제60/021,773호; 1997년 5월 9일 출원된 미국 가특허 출원 제60/046,141호; 1997년 5월 23일 출원된 미국 가특허 출원 제60/047,634호; 1999년 11월 30일 출원된 미국 특허 제5,993,824호 (국제 공개 WO 제98/02530호에 상응함); 1999년 4월 13일 콜린스(Collins) 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 제09/291,894호; 1999년 4월 13일 머피(Murphy) 등에 의해 출원된 미국 가특허 출원 제60/129,006호; Collins, et al., Proc Nat. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; Bukreyev, et al., J. Virol 70:6634-41, 1996; Juhasz et al., J. Virol. 71(8):5814-5819 (1997); Durbin et al., Virology 235:323-332 91997); He et al., Virology 237:249-260 (1997); Baron et al., J. Virol. 71:1265-1271 (1997); Buchholz et al., J. Virol. 73:251-9 (1999); Whitehead et al., Virology 247(2):232-9 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 72(5):4467-4471 (1998b); Jin et al., Virolory 251:206-214 (1998); 및 Whitehead et al., J. Virol. 73:(4)3438-3442 (1999) 및 Bukreyev, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 2367-72 (1999) 참조, 각 문헌은 본원에 참고로 삽입됨).
인간 RSV (HRSV)와 항원적으로 관련된 소 RSV (BRSV)는 HRSV에 대한 생 약독화된 바이러스 백식의 개발에 대한 대안적 접근법을 제공한다. 인간에 사용된 최초의 백신인 소 기원이라 믿어지는 생 우두 백신은 천연두 제어용으로 위해 약 200 년 전에 제너(Jenner)에 의해 개발되었다. 확실히 2 세기 동안, 우두 바이러스는 이 질병의 제어에 성공적이었고, 천연두 최종 박멸에 필수적인 역할을 수행하였다. 백색 개발에 대한 상기 "제너식" 접근법에서, 항원적으로 관련된 동물 바이러스가 인간에 대한 백신으로 사용된다. 천연 숙주에 잘 적응되는 동물 바이러스는 종종 인간에서 효율적으로 복제되지 않고, 따라서 약독화된다. 현재는, 상기 유형의 숙주 범위 제한에 대한 유전적 기초에 대한 완전이 이해하지 못하고 있다. 동물 또는 조류 숙주에서의 바이러스의 진화는 관련된 인간 바이러스에서의 상응하는 서열의 것과 뉴클레오티드 (nt) 및 아미노산 서열의 상당한 디버전스(divergence)를 일으킨다. 많은 서열 차이로 이루어지는 이러한 디버전트(divergent) 서열은 숙주 범위 약독화 표현형을 규정한다. 인간에서 복제된 후 동물 바이러스의 약독화 표현형의 안정성에 공헌해야 하므로, 다수의 서열 차이에 기초한 약독화 표현형을 갖는 것은 백신 바이러스에서 요망되는 성질이다.
근래 승인된 4가 로타바이러스(quadrivalent rotavirus)는 백신 개발에 대한 제너식 접근법의 예로서, 여기서 비인간 로타바이러스 균주인 원숭이(rhesus) 로타바이러스 (RRV)는 인간에서 약독화되고, 항원적으로 크게 관련된 인간 혈청형 3에 대해 방어됨을 발견하였다 (Kapikian et al., Adv. Exp. Med. Biol. 327:59-69, 1992, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 4 가지 주요 인간 로타바이러스 혈청형 각각 에 대해 내성을 유발할 수 있는 다가 백신에 대한 필요성이 있었으므로, 조직 배양 중의 유전자 재편성의 통상의 유전적 기술을 사용하여 3 종의 재편성 바이러스를 구성하는 것에 의해 제너식 접근법을 변형하였다. 각 단일 유전자 재편성 바이러스는 10 RRV 유전자 및 혈청형 1, 2 또는 4의 주요 중화 항원 (VP7)에 대해 코딩하는 단일 인간 로타바이러스 유전자를 포함한다. 목적은 상기 조류 바이러스의 약독화 특성 및 인간 로타바이러스 혈청형 1, 2 또는 4의 중화 특이성을 갖는 단일 유전자 치환 RRV 재편성을 만드는 것이었다. 인간에서 조류 RRV의 숙주 범위 제한에 기초한 4가 백신은 유아 및 소아에서 인간 로타바이러스 감염에 대해 높은 수준의 효능을 제공하였다 (Perez-Schael et al., N. Engl. J. Med. 337:1181-7, 1997, 본원에 참고문헌으로 삽입됨).
그러나, 허가된 백신은 모체 항체가 결핍된 더 나이든 혈청 음성 유아에서 가벼운 반응유전성(reactogenicity)를 유지하고, 따라서 소 로타바이러스의 UK 균주에 기초한 2세대 제너식 백신을 개발하여 RRV 백신을 대체하고 있다. 제너식 접근법을 탐구하여 또한 제1형 파라인플루엔자 바이러스 및 A형 간염 바이러스에 대한 백신을 개발하고 있다 (Emerson et al., J. Infect. Dis. 173:592-7, 1996; Hurwitz et al., Vaccine 15, 533-40, 1997, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 제너식 접근법을 A형 인플루엔자 바이러스에 대한 생 약독화 백신을 개발하기 위해 사용하였으나, 인간에 사용하기 위한 일관된 약독화 백신을 제조하는데는 실패하였다 (Steinhoff et al., Journal of Infectious Diseases 163:1023-1028, 1991, 본원에 참고문헌으로 삽입됨).
상기 개발에 기초하여, cDNA로부터 감염성 RSV를 회수하고, RSV 클론에 다양한 유전적 조작을 설계하고 이행하여 신규 백신 후보물을 구성하는 것이 가능하여 졌다. 그 후, 다른 요망되는 표현형의 특성 중에서 표현형 안정성 및 약독화의 수준을 평가하고 조정할 수 있다. 따라서, 남아있는 과제는 단독으로 또는 다른 유형의 유전적 조작과 함께 적용할 수 있는 광범위하고 다양한 유전적 조작의 메뉴를 개발하여 광범위한 백신 용도에 유용한 감염성 약독화 RSV 백신을 구성하는 것이다. 이러한 관계에 있어서, 당업계에는 RSV에 기인하는 심각한 건강 문제를 완화하는 안전하고 효과적인 백신의 엔지니어링을 가능하게할 수 있는 추가 도구 및 방법에 대한 긴급한 요구가 남아있다. 놀랍게도, 본 발명은 감염성 약독화 RSV 백신 후보물을 구성하기 위한 추가 도구를 제공하여 이러한 요구를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 감염성이고 인간 또는 다른 포유 동물에서 약독화된 인간-소 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV)를 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 RSV 감염에 대해 감수성인 숙주에서 RSV에 대해 요망되는 면역 반응을 발생시키는 다양한 조성물에 유용한 약독화된 인간-소 키메릭 RSV를 설계하고 제조하는 신규한 방법을 제공한다. 본 발명에는 상이한 RSV 균주 또는 아군 바이러스의 1개 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)과 결합 또는 통합된 부분적 또는 완전한 인간 또는 소 RSV "배경(background)" 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 키메릭 RSV 게놈 또는 안타게놈을 포함하는, 신규한 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 이러한 분자 를 혼입시킨 벡터가 포함된다. 본 발명에 따른 인간-소 키메릭 RSV는 특정 RSV 아군 또는 균주에 대한 면역 반응, 또는 다수 RSV 아군 또는 균주에 대한 다중특이성 반응을 유발할 수 있다. 본 발명은 다른 병원체의 항원 결정기를 혼입하여 상이한 목적 병원체에 대해 요망되는 면역 반응을 생성하기 위해 벡터로서 약독화된 인간-소 키메릭 RSV를 설계 및 제조하는 추가 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 RSV 및 다른 병원체에 의해 유발되는 감염 및 질병을 예방 및 치료하기 위해 인간-소 키메릭 RSV를 혼입시킨 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 키메릭 인간-소 RSV는 인간 및 소 RSV 균주 모두로부터의 뉴클레오티드 서열을 혼입하도록 재조합적으로 제조되고, 이로부터 감염성 키메릭 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 제조한다. 이 방법에서, 후보 백신 바이러스는 인간 및 비인간 영장류를 포함한, 관심 병원체에 감염되기 쉬운 포유류 숙주에서 RSV 또는 다른 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 재조합적으로 제조되었다.
본 발명의 예시적 인간-소 키메릭 RSV는 인간 및 소 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭 RSV 게놈 또는 항원 뿐만 아니라 주 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 중합효소 단백질 (L) 및 RNA 중합효소 신장 인자를 혼입시킨다. 추가의 RSV 단백질이 다양한 조합에 포함되어 일련의 감염성 서브 바이러스 입자, 보충 단백질, 항원 결정기 또는 다른 추가 성분을 포함하는 바이러스 입자 또는 완전한 바이러스 입자를 제공한다.
본 발명의 키메릭 인간-소 RSV는 상이한 RSV 균주 또는 아군 바이러스의 1개 이상의 이형유전자(들) 또는 게놈 분절(들)과 결합된 인간 또는 소 RSV 균주 또는 아군 바이러스로부터 유래하거나, 이를 모방한 부분적 또는 완전한 "배경" RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하여 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성한다. 본 발명의 어떤 면에서, 키메릭 RSV는 인간 RSV로부터의 1개 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)과 결합된 부분적 또는 완전한 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈을 혼입한다. 본 발명의 다른 측면에서, 키메릭 RSV는 소 RSV로부터의 1개 이상의 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)과 결합된 부분적 또는 완전한 인간 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈을 혼입한다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 주 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 중합효소 단백질 (L), RNA 중합효소 신장 인자, 및 상이한 RSV 유래의 1 이상의 이형 유전자(들) 및(또는) 게놈 분절(들)과 결합하여 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성하는 인간 또는 소 RSV의 부분적 또는 완전한 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 감염성 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스 (RSVs)에 관한 것이다. 본 발명에 유용한 이형 유전자(들) 및(또는) 게놈 분절(들)은 RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 유전자(들) 또는 게놈 분절(들) 1 이상을 포함한다. 별법으로, 인간-소 키메릭 RSV 내에 혼입하기 위한 이형 유전자들 및 게놈 분절들은 RSV 게놈, 또는 그 분절의 리더, 트레일러 또는 유전자간 영역을 포함할 수 있다.
더욱 상세한 실시태양에서, 본 발명은 인간-소 키메릭 RSV는 RSV F, G 및(또는) SH 당단백질 또는 면역원성 도메인 또는 그의 에피토프를 코딩하는 1 이상의 이형 유전자 및(또는) 게놈 분절을 혼입한다. 별법으로, 인간-소 키메릭 RSV는 인 간 및 소 모두의 당단백질 도메인 또는 면역원성 에피토프를 갖는 키메릭 당당백질을 혼입할 수 있다. 예를 들면, 키메라의 나중 유형은 소 게놈 또는 안티게놈에서 상응하는 당단백질의 기능적 잔존 부분을 코딩하는 게놈 분절과 적당한 리딩 프레임에서 당단백질 엑토도메인(ectodomain)을 코딩하는 이형 게놈 분절을 소 배경 게놈 또는 안티게놈 내로 혼입하여 구성할 수 있고, 얻은 키메릭 바이러스는 기능적 키메릭 당단백질을 발현한다.
본 발명의 다른 별법의 실시태양에서, 선택된 소 유전자, 게놈 분절 또는 다수의 유전자 또는 게놈 분절을 혼입하는 것에 의해 인간 RSV가 약독화된 인간-소 키메릭 RSV가 제공된다. 어떤 실시태양에서는, BRSV에서 유래한 선택된 이형유전자 세트는 HRSV 배경 게놈 또는 안티게놈으로 대등하게 전달된다. 개별 또는 대등 전달 군의 유전자가 선택될 수 있는 예시적 RSV 유전자는 RSV N, P, NS1, NS2, M2-1 및 M 유전자를 포함하고, 이는 소 RSV로부터의 1개 이상의 이형 유전자(들)에 의해 인간 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈에서 임의의 조합으로 또는 단독으로 대체되어 약독화 키메릭 유도체를 얻을 수 있다. 더욱 상세한 측면에서, 인간 RSV의 N 및 P 유전자 모두 소 RSV 유래의 대응 N 및 P 유전자에 의해 대등하게 대체된다. 상기 대등 유전자 대체는 게놈 중에서 인접하는 유전자쌍의 경우에 종종 발생하는 RSV 게놈에서의 어떠한 유전자 간의 기능적 대등성에 의해 촉진된다. 따라서, 다른 별도 실시태양에서, 인간 RSV의 NS1 및 NS2 유전자 모두는 소 RSV 유래의 대응 NS1 및 NS2 유전자에 의해 대체된다. 또 다른 실시태양에서, HRSV의 M2-1, M2-2 및 L 유전자 중 2개 이상이 소 RSV 유래의 대응 유전자에 의해 대체된다. 고수준 의 숙주 범위 제한이 요망되는 본 발명 내의 어떠한 백신 후보물에 대해서는, 인간 RSV의 N, P, NS1, NS2, M2-1 및 M 유전자 각각이 소 RSV 유래의 대응 N, P, NS1, NS2, M2-1 및 M 유전자에 의해 대체된다.
본 발명의 다른 측면에서, 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 인간 RSV 유래의 1 이상의 이형 유전자(들) 및(또는) 게놈 분절(들)과 결합된 부분적 또는 완전한 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈을 포함하는, 인간-소 키메릭 RSV가 구성된다. 어떠한 실시태양에서, F, G 및 SH로부터 선택되는 1 이상의 인간 RSV 당단백질 유전자, 또는 F, G 및(또는) SH의 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인(ectodomain) 또는 면역원성 에피토프 부분(들)을 코딩하는 1 이상의 게놈 분절(들)이 부분적 또는 완전한 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가 또는 치환된다. 예를 들면, 인간 RSV 당단백질 유전자 F 및 G 중 1 종 또는 모두는 치환되어 부분적 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈에서 대응 F 및 G 당단백질 유전자 중 1 종 또는 모두를 대체할 수 있다. 이들 및 관련된 실시태양 내에서, 인간-소 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 아군 A 및 아군 B 인간 RSV 중 1 종 또는 모두로부터 유래한 항원 결정기를 혼입할 수 있다. 더욱 상세한 측면에서, 인간 RSV 당단백질 유전자 F 및 G 모두는 치환되어 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈에서 대응 F 및 G 당단백질을 대체한다. 하기 실시예에 기술된 이들 특색을 갖는 예시적인 인간-소 키메릭 RSV는 rBRSV/A2이다.
본 발명의 또 다른 인간-소 키메릭 RSV는 부분적 또는 완전한 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 분절의 야생형 유전자 순서 위치 와 비교하여 더욱 프로모터에 인접한 위치에 첨가 또는 치환된 F, G 및 SH로부터 선택되는 1 이상의 인간 RSV 당단백질 유전자를 혼입한다. 상기 일 실시태양에서, 인간 RSV 당단백질 유전자 G 및 F 모두는 각각 유전자 순서 위치 1 및 2에서 치환되어 부분적 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈에서 각각 야생형 위치 7 및 8에서 결손된 대응 G 및 F 당단백질을 대체한다. 실시예에 기술된 이들 특색을 갖는 예시적인 인간-소 키메릭 RSV는 rBRSV/A2-G1F2이다.
인간-소 키메릭 RSV 내의 대등 유전자 전달은 또한 소 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 인간 항원 유전자의 도입에 관한 것이다. 어떤 실시태양에서, F, G, SH 및 M으로부터 선택되는 1 이상의 인간 RSV 외피 연관 유전자는 부분적 또는 완전한 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가 또는 치환된다. 예를 들면, F, G, SH 및 M으로부터 선택되는 1 이상의 인간 RSV 외피 연관 유전자는 F, G, SH 및 M으로부터 선택되는 1 이상의 외피 연관 유전자 결손된 부분적 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가 또는 치환될 수 있다. 더욱 상세한 측면에서, 인간 RSV 외피 연관 유전자 F, G 및 M으로 정의된 유전자 세트 유래의 1 이상의 유전자는 외피 연관 유전자 F, G, SH 및 M이 결손된 부분적 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가된다. 하기 실시예에 기술된 이들 특색을 갖는 예시적인 인간-소 키메릭 RSV는 rBRSV/A2-MGF이다.
본원에서 사용한 "RSV 유전자"는 일반적으로 mRNA를 코딩하는 RSV 게놈의 일부를 지칭하고, 전형적으로 10-뉴클레오티드 유전자 개시 (GS) 신호로 상류 말단에서 시작하고, 12 내지 13-뉴클레오티드 유전자-종결 (GE) 신호로 하류 말단에서 종 결된다. RSV에 대해 알려진 본 발명에 사용되기 위한 이러한 유전자 10종은 NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 및 L이다. "유전자"라는 용어는 또한 본원에서 "해독 오픈 리딩 프레임" (ORF)를 지칭하기 위해 사용된다. ORF는 더욱 구체적으로는 중요한 RSV 단백질을 코딩하는 해독 오픈 리딩 프레임으로 정의되고, 이 중 11 개는 현재 NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2-1 (별도로, M2(ORF1)), M2-2 (별도로, M2(ORF2)) 및 L로 인식된다. 따라서, "유전자"라는 용어는 교환가능하게는 서브게놈 RNA를 코딩하는 게놈 RNA 서열, 및 ORF를 지칭한다 (후자의 용어는 특히 단일 mRNA가 별개의 단백질을 코딩하는 2 개의 오버래핑 ORFs를 포함하는 RSV M2 유전자의 경우와 같은 상황에 적용된다). 문헌 [Collins et al., J. Gen. Virol. 71:3015-3020, 1990; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11259-11264, 1999; Ahmadian et al., EMBO J. 19:2681-2689, 2000; Jin et al., J. Virol. 74:74-82, 2000 (각각은 본원에 참고문헌으로 삽입됨)]. "유전자"라는 용어를 프로모터 위치에 대하여 유전자 위치를 결정하는 경우에 사용할 때에는, 상기 용어는 보통 전사 유전자-개시 및 유전자-종결 신호 모티프에 접한 mRNA 코딩 서열을 엄격하게 지칭한다 (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4594-4598, 1986; Kuo et al., J. Virol. 70:6892-6901, 1996, 본원에 참고문헌으로 삽입됨).
"게놈 분절"은 ORF의 일부, 유전자 또는 유전자외 영역 또는 이의 조합일 수 있는 RSV 게놈 유래의 모든 길이의 연속적 뉴클레오티드를 의미한다.
부분적 또는 완전한 배경 게놈 또는 안티게놈은 전형적으로 대응 인간 또는 소 RSV의 이형 유전자 또는 게놈 분절을 가져오는 수용체 골격 또는 벡터로 작용할 수 있다. 대응 인간 또는 소 RSV 유래의 이형 유전자 또는 게놈 분절은 배경 게놈 또는 안티게놈과 결합, 첨가 또는 치환되어 기여 RSVs 중 1 또는 모두와 비교하여 신규한 표현형 특성을 나타내는 키메릭 RSV를 생성하는 "공여체" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 예를 들면, 선택된 수용체 RSV 균주 내의 이형 유전자 또는 게놈 분절의 첨가 또는 치환은 비변형 수용체 및(또는) 공여체의 상응하는 표현형(들)과 비교하여 약독화의 감소, 성장 변화, 면역원성 변경, 또는 다른 요망되는 표현형 변화를 유발할 수 있다.
본 발명내에 이형 삽입 또는 첨가용으로 사용되도록 선택될 수 있는 유전자 및 게놈 분절은 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 유전자 또는 게놈 분절을 포함한다. 유전자외 리더 또는 트레일러 영역과 같은 조절 영역 또한 고려될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 키메릭 RSV는 RSV F, G 또는 SH 당단백질을 코딩하는 1 이상의 이형 유전자(들)을 혼입한다. 별법으로, 키메릭 RSV는 RSV F, G 또는 SH 당단백질의 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 게놈 분절을 혼입할 수 있다. 이들 면역원성 단백질, 도메인 및 에피토프는 이들이 면역화된 숙주에서 신규 면역 반응을 발생시키므로 인간-소 키메릭 RSV에 특히 유용하다. 특히, G 및 F 단백질, 및 그 중의 면역원성 도메인 및 에피토프는 주요 중화 및 방어 항원을 제공한다. 또한, 비-RSV 단백질 (예를 들면, 유행성 이하선염 및 SV5 바이러스에서 발견되는 것과 같은 SH 단백질)을 코딩하는 유전자 및 게놈 분절은 본 발명의 인간-소 PIV 내에 혼입될 수 있다. 세포외 3' 리더 또는 5' 트레일러 영역, 및 유전자-개시, 유전자-종결, 유전자간 영역, 또는 3' 또는 5' 비코딩 영역과 같은 조절 영역 또한 이형 치환 또는 첨가로서 유용하다.
예를 들면, 소 수용체 게놈 또는 안티게놈에 대한 또는 이들 내의 인간 RSV 아군 또는 균주 유래의 1 이상의 면역원성 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)의 첨가 또는 치환은 1 이상의 특이적 인간 RSV 아군 또는 균주를 포함하는 인간 공여체 바이러스에 대한 면역 반응을 야기시킬 수 있는 재조합 키메릭 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생성하는 반면, 소 골격은 키메라를 백신 개발에 유용한 후보물로 만드는 약독화된 표현형을 수여한다. 이러한 일 예시적 실시태양, 인간 RSV 당단백질 유전자 F, SH 및 (또는) G 1 이상을 부분적 또는 완전한 소 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 치환되어 민감성 숙주에서 항-인간 RSV 면역 반응을 유발하는 약독화된 감염성 인간-소 키메라를 생성한다. 별도의 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV는 추가로 다수 인간 RSV 균주 유래의 면역원성 단백질, 단백질 도메인 또는 에피토프, 예를 들면 RSV 아군 A 및 B 모두로부터 유래하는 2 개의 F 또는 G 단백질 또는 이의 면역원성 일부를 코딩하는 유전자 또는 게놈 분절을 혼입한다. 또 다른 추가 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈은 인간 및 소 당단백질 도메인 또는 면역원성 에피토프 모두를 갖는 재조합 바이러스 또는 서브바이러스 입자 중의 키메릭 당단백질을 코딩한다. 예를 들면, 인간 RSV F, SH 또는 G 당단백질 유래의 당단백질 엑토도메인을 코딩하는 이형 게놈 분절은 배경 소 게놈 또는 안티게놈에서 상응하는 소 F, SH 또는 G 당단백질 세포질 및 엑토도메인을 코딩 하는 게놈 분절과 결합될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 인간-소 키메릭 RSV는 부분적 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈에서 대응 유전자 또는 게놈 분절에 대한 이형 유전자 또는 게놈 분절을 치환하는 것에 의해 구성할 수 있다. 별법으로, 이형 유전자 또는 게놈 분절은 완전한 (또는 다른 유전자 또는 게놈 분절이 결손된다면 부분적) RSV 배경 게놈 또는 안티게놈과 함께 여분의 유전자 또는 게놈 분절으로 첨가될 수 있다. 예를 들면, RSV 아군 A 및 B로부터 각각 유래하는 2개의 인간 RSV G 또는 F 유전자 또는 게놈 분절이 포함될 수 있다.
종종, 이형 유전자 또는 게놈 분절은 부분적 또는 완전한 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 유전자간 위치에 첨가된다. 별법으로, 유전자 또는 게놈 분절은 예를 들면, 5' 또는 3' 비코딩 영역과 같은 게놈의 다른 비코딩 영역, 또는 부분적 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈 내에 비코딩 뉴클레오티드가 발생되는 다른 위치에 위치할 수 있다. 한 측면에서, 비코딩 조절 영역은 효과적인 복제, 전사 및 해독에 요구되는 시스-작용 신호를 포함하고, 따라서 본원에 개시된 대로 이형 유전자 또는 게놈 분절 또는 다른 돌연변이를 도입하는 것에 의해 이들 기능을 변형하기 위한 표적 부위를 나타낸다. 본 발명의 더욱 상세한 측면에서, 약독화 돌연변이가 시스-작용 조절 영역에 도입되어 예를 들면, (1) 조직 특이적 약독화 (Gromeier et al., J. Virol. 73:958-64, 1999; Zimmermann et al., J. Virol. 71:4145-9, 1997), (2) 인터페론에 대한 감수성의 증가 (Zimmermann et al., J. Virol. 71:4145-9, 1997), (3) 온도 민감성 (Whitehead et al., Virology 247:232- 9, 1998), (4) 복제 수준의 일반적 제한 (Men et al., J. Virol. 70:3930-7, 1996, Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5177-5181, 1991), 및(또는) (5) 복제의 숙주 특이적 제한 (Cahour et al., Virology 207:68-76, 1995)를 가져온다. 이들 약독화 돌연변이는 예를 들면 점 돌연변이, 관련 바이러스 간의 서열 교환 또는 결손에 의한 것과 같은 다양한 방법으로 수행되어 본 발명의 약독화된 인간-소 키메릭 RSV를 제조할 수 있다.
본원에서 제공하는 또 다른 별도의 실시태양에서, 이형 유전자 또는 게놈 분절은 부분적 또는 완전한 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 분절의 야생형 유전자 순서 위치에 상응하는 위치에 첨가 또는 치환될 수 있다. 다른 실시태양에서, 이형 유전자 또는 게놈 분절은 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 분절의 야생형 순서 위치와 비교하여 더욱 프로모터에 인접 또는 프로모터에 먼쪽의 위치에 첨가 또는 치환되어 각각 이형 유전자 또는 게놈 분절의 발현을 증강 또는 감소시킨다.
본 발명의 일반적인 측면에서, 소 유전자 또는 게놈 분절은 인간 RSV 배경 내에 첨가 또는 치환되어 약독화된 인간-소 키메릭 RSV를 형성할 수 있다. 별법으로, 키메라는 소 RSV 배경에 첨가 또는 치환된 1 이상의 인간 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)을 포함하여 약독화된 RSV 백신 후보물을 형성할 수 있다. 이와 관련하여, 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈은 인간 RSV 유래의 이형 유전자 또는 게놈 분절과 결합된 부분적 또는 완전한 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈으로 형성된다. 따라서, 형성된 키메릭 RSV는 아군 A 또는 아군 B 인간 RSV 유래, 또는 특이적 인 간 RSV 균주 유래의 이형 유전자 또는 게놈 분절을 혼입할 수 있다. 바람직한 측면에서, 인간 RSV 당단백질 유전자의 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 1 이상의 인간 RSV 당단백질 유전자 F, G 및 SH 또는 게놈 분절은 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 분절을 치환한다.
예시적 실시태양에서, 인간 RSV 당단백질 유전자 F 및 G 중 1개 또는 이들 모두는 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈에서의 대응 F 및 G 당단백질 중 1개 또는 이들 모두를 치환시켜 이를 대체한다. 하기에 기술된 구체적 실시예에서, 인간 RSV 당단백질 유전자 F 및 G 모두는 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 F 및 G 당단백질 유전자를 치환시켜 이를 대체한다. 유사한 방식으로, 본 발명의 키메릭 인간-소 RSV는 1 보다 많은 RSV 균주 또는 아군, 예를 들면 인간 RSV 아군 A 및 아군 B 모두로부터 유래하는 항원 결정기를 혼입하도록 쉽게 고안될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 얻은 바이러스 또는 서브바이러스 입자 중의 약독화된 표현형을 규정하는 1 이상의 약독화 돌연변이를 도입하는 것에 의해 더 변형된, 약독화된 인간-소 키메릭 RSV를 제조한다. 약독화 돌연변이는 드 노보로 생성될 수 있고, 합리적인 설계의 돌연변이유발 전략에 따라서 효과를 약화시키기 위해 시험될 수 있다. 별법으로, 약독화 돌연변이는 존재하는 생물학적으로 유래된 돌연변이체 RSV에서 동정될 수 있고, 따라서 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV로 혼입될 수 있다.
본 발명은 약독화가 일부 숙주 범위 효과에 기초한 것인 RSV 및 다른 병원체 에 대한 생 바이러스 백신의 약독화에 대한 새로운 근거를 제공한다. 선행 연구들은 BRSV (45 뉴클레오티드)의 유전자외 리더 영역을 HRSV (44 뉴클레오티드) 유래의 상응하는 서열로 교환하는 것을 포함하였다 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999). 서열 중 어느 것도 단백질을 코딩하지 않고, 중요한 표현형 효과는 관찰되지 않았다. 본 개시사항은 HRSV 및 BRSV 간의 게놈 분절, 전체 유전자 또는 다수 유전자의 도입에 의해 약독화된 키메릭 RSV를 제공한다.
HRSV 및 BRSV 간의 숙주 범위 차이는 침팬지에서 BRSV의 겨우 검출가능하거나 검출할 수 없는 성장과 비교하여 동일 동물에서 HRSV의 고허용성 성장에 의해 예증된다. 침팬지는 인간에 필적하는 바이러스 복제 및 질병을 나타내는, 널리 수용되고, 인간에서의 RSV 감염 및 면역원성 활성의 신뢰할만한 모델이다. 본원에서 하기 설명하는 바와 같이, 침팬지에서 관찰되는 키메릭 RSV의 숙주 범위 차이는 편리한 예비적 검정을 제공하는 세포 배양에서 관찰되는 숙주 범위 차이와 연관된다.
본 발명의 키메릭 인간-소 RSV에서 관찰되는 숙주 범위 효과는 일반적으로 HRSV 및 BRSV 간에 관찰되는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 차이와 관련된다. 예를 들면, 단백질 각각에 대한 HRSV 및 BRSV 간의 퍼센트 아미노산 동일성은 NS1 (69％), NS2 (84％), N (93％), P (81％), M (89％), SH (38％), G (30％), F (81％), M2-1 (80％), L (77％)이다. HRSV 및 BRSV간의 광범위한 유전적 차이로 인하여 (HRSV의 N 유전자를 BRSV의 것으로 대체하는 것은 예를 들면, 약 26 아미노산 차이를 포함함), 본 발명의 키메릭 소-인간 RSV는 특신 백신 후보물로 유용하다. 본원에 하기 예시되는 바와 같이, BRSV G 및 G 당단백질을 HRSV의 것으로 대체하는 것은 재조합 BRSV의 침팬지에서 복제 허용성을 증가시킨다. 각각 다수 아미노산 또는 뉴클레오티드 차이를 가져오는 다수 유전자 및 게놈 분절의 관여는 복귀변이(reversion)에 대해 매우 안정한 약독화에 대한 광범위한 근거를 제공한다. 이러한 방식의 약독화는 개별 돌연변이의 복귀변이가 중요한 또는 완전한 독성의 재획득을 가져올 수 있는 것인, 1 이상의 점 돌연변이에 의해 약독화된 HRSV 바이러스와 크게 대조적이다. 또한, HRSV에서의 공지된 약독화 점 돌연변이는 전형적으로 온도 민감성 표현형을 생성한다. 이는 온도 민감성 표현형이 구체적으로 제1 스크린으로 사용되어 HRSV의 돌연변이원에 대한 노출 후의 변화된 후손(progeny)를 확인하기 때문이다. 온도 민감성과 연관된 약독화의 한가지 문제점은 바이러스가 상기도에서는 약독화되는 반면 하기도에서는 복제가 몹시 제한될 수 있다는 것이다. 이는 기도내에 온도가 하기도에서는 더 높고 (더욱 제한적이고), 상기도에서는 더 낮은 (덜 제한적인) 온도 구배가 있기 때문이다. 약독화 바이러스가 상기도에서 복제되는 능력은 충혈, 비염, 열 및 중이염을 포함한 합병증을 일으킬 수 있다. 따라서, 온도 민감성 돌연변이에 의해 단독으로 이루어진 약독화는 이상절이지 않을 것이다. 반대로, 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV에 존재하는 숙주 범위 돌연변이는 대부분의 경우 온도 민감성을 제공하지 않을 수 있다. 따라서, 약독화의 이러한 신규 방법은 (i) 유전적으로 및 표현형적으로 더욱 안정하며, (ii) 다른 생 백신 접근법보다 상기도에서의 잔류 독성과 연관성이 덜 할 수 있다.
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV에서 제공되는 숙주 범위 표현형 효과와 함께, 키메릭 바이러스의 약독화를 증가 또는 감소시키는 추가 돌연변이를 도입하는 것에 의해 약독화 표현형을 조정하는 것이 종종 요망된다. 따라서, 후보 백신 균주는 예를 들면, 공지의 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV 균주의 패널로부터 확인된 돌연변이와 같은 1 이상, 바람직하게는 2 이상의 약독화 돌연변이의 혼입에 의해 더 약독화될 수 있다. 바람직한 인간 돌연변이 RSV 균주는 저온 계대 배양 (cp) 및(또는) 온도 민감성 (ts) 돌연변이체, 예를 들면, "cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSB B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542), 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)"로 표시되는 돌연변이체이다 (각각은 미국 20110-2209 버지니아주, 마나싸스, 유니버시티 블루바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 부다페스트 조약으로 기탁되고, 상기 확인된 수탁 번호를 부여받음). 생물학적으로 유도된 돌연변이체의 이 예시적 패널로부터, 백신 용도를 위한 재조합, 인간-소 키메릭 RSV에서의 약독화 수준의 보정(calibrating)을 위한 패널 내 임의의 다른 돌연변이(들)과 각각 결합될 수 있는 다양한 "메뉴"의 약독화 돌연변이가 제공된다. 추가의 돌연변이는 예를 들면, 작은 플라크 (sp), 저온 적응되거나 (ca) 또는 숙주 범위 제한된 (hr) 돌연변이체 균주에서 동정된 바대로 비-ts 및 비-cp 약독화 돌연변이를 갖는 RSV로부터 유래될 수 있다. 돌연변이는 인간 또는 소 안티게놈 서열에 혼입될 수 있으며, 인간, 소 또는 다른 RSV 돌연변이체에서 확인된 약독화 돌연변이는 돌연변이를 수용체 게놈의 상응하는 동종 부위에 매핑하고, 본원에 참 고문헌으로 삽입된 머피(Murphy) 등의 1999년 4월 13일자 미국 가특허 출원 제60/129,006호에 기술된 바와 같이 수용체의 천연서열을 돌연변이체 유전자형에 돌연변이 (동일 또는 보존적 돌연변이에 의해)시키는 것에 의해 이형 RSV 수용체 (예를 들면, 각각 소 또는 인간 RSV)에 전달될 수 있다.
백신용으로 설계되고 선택된 인간-소 키메릭 RSV는 종종 2 이상, 때로는 3 이상의 약독화 돌연변이를 지녀서 광범위한 임상 용도의 만족스러운 약독화 수준을 달성한다. 한 실시태양에서, 1 이상의 약독화 돌연변이가 RSV 중합효소 유전자 L (공여체 또는 수용체 유전자 중)에서 발생하고, 온도-민감성 (ts) 표현형을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있는 약독화 표현형을 규정하는 중합효소 단백질에서의 아미노산 변화를 규정하는 1 이상의 뉴클레오티드 치환(들)을 포함한다. 본 발명의 키메릭 RSV는 L외에도 임의의 추가 RSV 유전자 중에 (예를 들면, M2 유전자 중에) 약독화 돌연변이를 혼입할 수 있다. 그러나, 이와 관련하여 바람직한 인간-소 키메릭 RSV는 Asn43을 Ile로, Phe521을 Leu로, Gln831을 Leu로, Met1169를 Val로, Tyr1321을 Asn으로 변화시키는 것과 같은 RSV 중합효소 유전자 L 중의 아미노산 Asn43, Cys319, Phe521, Gln831, Met1169, Tyr1321 및(또는) His1690에서의 아미노산 변화를 유발하는 큰 중합효소 유전자 L중의 1 이상의 뉴클레오티드 치환을 혼입한다. 또한, 이들 위치에서의 다른 별도의 아미노산 변화, 특히 확인된 돌연변이체 잔기에 관한 보존적 변화를 일으켜 확인된 돌연변이체 치환과 유사한 효과를 가져올 수 있다. 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV에 혼입하기 위한 추가 요망되는 돌연변이는 RSV N 유전자의 Val267, RSV F 유전자의 Glu218 및(또는) Thr523에서의 아미노산 치환, 및 유전자 M2의 유전자-개시 서열에서의 뉴클레오티드 치환을 규정하는 약독화 돌연변이를 포함한다. 이들 돌연변이 충분한 수를 포함하여 및 그 이하의 본원에 확인된 1 이상의 약독화 돌연변이의 모든 조합은 인간-소 키메릭 RSV에 혼입되어 백신 수용체의 선택된 군 또는 광범위한 집단에 사용되기 위한 적당하게 약독화된 재조합 바이러스를 생성할 수 있다.
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV에 혼입하기 위한 약독화 돌연변이는 공여체 또는 수용체 RSV 유전자의 코딩 부분 또는 시스-조절 서열과 같은 비코딩 영역에서 선택될 수 있다. 비코딩 돌연변이의 예로는 뉴클레오티드 7605 (재조합 서열 중 뉴클레오티드 7606)에서의 M2 유전자 개시 서열 중의 단일 또는 다수 염기 치환에 의해 예시되는 바와 같은 유전자 개시 서열 중의 단일 또는 다수 염기 변화를 들 수 있다.
본 발명에 따른 감염성 키메릭 RSV는 모든 RSV 또는 RSV 유사 바이러스 유래 (예를 들면, 인간, 소, 생쥐 (생쥐의 폐렴 바이러스), 또는 조류 (칠면조 비기관염 바이러스) 폐렴바이러스) 또는 다른 외피 바이러스 유래(예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스 (PIV))의 이형 코딩 또는 비코딩 뉴클레오티드 서열을 혼입할 수 있다. 이형 서열의 예로는 인간-소 키메릭 RSV 중의 상이한 인간 RSV 균주 유래의 서열과 결합된 한 가지 인간 RSV 균주 유래의 RSV 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 키메릭 RSV는 2 이상의 야생형 또는 돌연변이 RSV 균주, 예를 들면, cpts RSV 248, cpts 248/404, cpts 248/955, cpts RSV 530, cpts 530/1009, 또는 cpts 530/1030으로부터 선택되는 돌연변이 균주 유래의 서열을 혼입할 수 있다. 별법으로, 인간-소 키메릭 RSV는 2 이상의 야생형 또는 돌연변이 인간 RSV 아군, 예를 들면, 인간 RSV 아군 A 및 아군 B 서열으 조합 유래의 서열을 혼입할 수 있다. 또 다른 측면에서, 1 이상의 인간 RSV 코딩 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드는 이형 RSV 또는 비-RSV 바이러스 유래의 대응 서열로 단독으로 또는 1 이상의 선택된 약독화 돌연변이 (예를 들면, cp 및(또는) ts 돌연변이)와 함께 치환되어 신규 약독화된 백신 균주를 생성할 수 있다.
본 발명의 키메릭 cDNAs, 벡터 및 바이러스 입자 내에 혼입된 돌연변이는 개별적으로 또는 전장 인간-소 키메릭 RSV cDNA와 함께 혼입될 수 있으며, 도입된 돌연변이를 포함하는 구조(rescued) 바이러스의 표현형은 쉽게 확인될 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 약독화된 생물학적으로 유도된 바이러스 대 야생형 RSV에 의해 표시되는 아미노산 변화, 예를 들면 cpRSV 또는 tsRSV에 의해 나타나는 변화는 재조합 인간-소 키메릭 RSV 내로 함께 혼입되어 요망되는 수준의 약독화를 얻는다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 키메릭 인간-소 RSV는 손쉽게 "벡터"로 설계되어 1 이상의 RSV 균주 또는 군 (예를 들면, 인간 RSV A 및 RSV B 아군 모두)를 포함하는 상이한 병원체, HPIV3, HPIV2 및 HPIV1을 포함하는 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 홍역 바이러스 및 다른 병원체 (예를 들면, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 미국 가특허 출원 제60/170,195호, 동 제09/458,813호, 및 동 제09/459,062호를 참조)로부터의 항원 결정기를 혼입할 수 있다. 다양한 실시태양 내에서, 인간-소 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 1 이상의 이형 병원체의 항원 결정기 1 이상을 코딩하는 1 이상의 이형 유전자 또는 게놈 분절과 결합된 부분적 또는 완전한 RSV "벡터 게놈 또는 안티게놈"을 포함한다. 이형 병원체는 이형 RSV (즉, 상이한 균주 또는 아군의 RSV)일 수 있으며, 이형 유전자 또는 게놈 분절은 RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(PRF2), L, F 또는 G 단백질 또는 이의 단편 (예를 들면, 면역원성 도메인 또는 에피토프)을 코딩할 수 있다. 예를 들면, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 RSV A 게놈 또는 안티게놈일 수 있으며, 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)은 RSV B 아군 바이러스의 항원 결정기(들)을 코딩할 수 있다.
별도의 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 BRSV 게놈 또는 안티게놈이며, 항원 결정기(들)을 코딩하는 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)은 1 이상의 HRSV(s)의 것이다. 예를 들면, 부분적 또는 완전한 BRSV 게놈 또는 안티게놈은 F, G 및 SH로부터 선택되는 1 이상의 HRSV 당단백질 유전자를 코딩하는 1 이상의 유전자(들) 또는 게놈 분절(들), 또는 HRSV의 F, G 및(또는) SH의 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프 부분(들)을 코딩하는 1 이상의 게놈 분절(들)을 혼입할 수 있다.
다른 별도의 실시태양에서, 이형 항원 결정기를 운반하도록 "벡터"로 설계된 인간-소 키메릭 RSV는 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV)와 같은 비-RSV 병원체의 1 이상의 항원 결정기를 혼입한다. 일 예시적 실시태양에서, 1 이상의 HN 및(또는) F 당단백질(들) 또는 항원성 도메인(들), 이의 단편(들) 또는 에피토프(들)을 코딩하는 1 이상의 HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)은 부분적 또는 완전한 HRSV 벡터 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 혼입된다. 더욱 상세한 실시태양에서, HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3 HN 또는 F 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 전사 단위는 키메릭 HRSV 벡터 게놈 또는 안티게놈으로 첨가 또는 혼입된다.
또 다른 별도의 실시태양에서, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 HRSV 또는 BRSV 게놈을 포함하고, 이형 병원체는 홍역 바이러스, 아군 A 및 아군 B 호흡기 신시티움 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 인간 유두종(papilloma) 바이러스, 제1형 및 제2형 인간 면역결핍 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 필로바이러스 (filovirus), 분야바이러스 (bunyavirus), 플라비바이러스 (flavivirus), 알파바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택된다. 후보 병원체의 예시적 리스트에 기초하여, 선택된 이형 항원 결정기(들)은 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질, 아군 A 또는 아군 B 호흡기 신시티움 바이러스 F, G, SH 및 M2 단백질, 유행성 이하선염 바이러스 HN 및 F 단백질, 인간 유두종 바이러스 L1 단백질, 제1형 또는 제2형 인간 면역결핍 바이러스 gp160 단백질, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 사이토메갈로바이러스 gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL 및 gM 단백질, 광견병 바이러스 G 단백질, 엡스타인 바 바이러스 gp350 단백질; 필로바이러스 G 단백질, 분야바이러스 G 단백질, 플라비바이러스 E 및 NS1 단백질, 및 알파바이러스 E 단백질 및 이의 항원성 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 이형 병원체는 홍역 바이러스이고, 이형 항원 결정기(들)은 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질 및 항원성 도메인, 이의 단편 및 에피토프로부터 선택된 다. 상기 키메릭 구성을 달성하기 위하여, 홍역 바이러스 HA 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 전사 단위는 HRSV 벡터 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 혼입될 수 있다.
따라서, 본 발명은 선택된 조합으로 다수 표현형-특이적 돌연변이를 키메릭 게놈 또는 안티게놈에 도입하여 약독화된 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 제조할 수 있는 인간-소 키메릭 RSV 클론, 폴리뉴클레오티드 발현 구조물 (또한 벡터로 지칭됨) 및 입자를 제공한다. 통상의 표현형 평가와 연결된 이 과정은 약독화, 온도 민감성, 변경된 면역원성, 냉각 적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한과 같은 요망되는 특성을 갖는 인간-소 키메릭 RSV를 제공한다. 따라서, 확인된 돌연변이는 "메뉴"로 편집되고 다양한 조합으로 도입되어 선택된 수준의 약독화, 면역원성 및 안정도로 백신 바이러스를 보정한다.
본 발명의 다른 추가 측면에서, 약독화 돌연변이가 있거나 없는 인간-소 키메릭 RSV는 뉴클레오티드 변형을 갖도록 구성되어 요망되는 표현형, 구조적 또는 기능적 변화를 생성한다. 전형적으로, 선택된 뉴클레오티드 변형은 예를 들면, 성장 특성, 약독화, 온도 민감성, 냉각 적응, 플라크 크기, 숙주 범위 제한 또는 면역원성의 변화와 같은 표현형 변화를 규정할 수 있다. 이러한 견지에서의 구조적 변화는 조작 및 동정의 용이를 위해 cDNAs를 코딩하는 RSV로의 제한 부위의 도입 또는 제거를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV 내의 뉴클레오티드 변화는 유전자의 결손, 또는 그 발현의 제거에 의한 바이러스 유전자의 변형을 포함한다. 이 와 관련하여 돌연변이에 대한 표적 유전자는 부착 (G) 단백질, 융합 (F) 단백질, 작은 소수성 (SH), RNA 결합 단백질 (N), 인단백질 (P), 큰 중합효소 단백질 (L), 전사 연장 인자 (M2 ORF1), RNA 조절 인자 M2 ORF2, 매트릭스 (M) 단백질 및 2 개의 비구조적 단백질, NS1 및 NS2를 포함한다. 이들 단백질 각각은 완전히 또는 부분적으로, 단독으로 또는 다른 요망되는 변경과 함께 결손, 치환 또는 재배열되어 신규 키메릭 RSV 재조합체를 이룰 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, SH, NS1, NS2, G 또는 M2-2 유전자는 인간-소 키메릭 RSV에서 변형된다. 예를 들면, 이들 유전자 각각이 결손되거나, 그 발현이 제거되어 (예를 들면, 종결 코돈의 도입에 의해) 얻어진 인간-소 키메릭 RSV 클론의 표현형을 변화시켜 성장, 약독화, 면역원성 또는 다른 요망되는 표현형 특성을 개선할 수 있다. 예를 들면, 재조합 게놈 또는 안티게놈의 배경 또는 이형 (즉, 각각 수용체 또는 공여체) 부분 중의 SH 유전자의 결손은 증가된 시험관내 성장 및(또는) 생체내 약독화와 같은 신규 표현형 특성을 갖는 키메릭 RSV를 생성할 수 있다. 관련된 측면에서, SH 유전자 결손, 또는 NS1, NS2, G 또는 M2-2 유전자 결손과 같은 다른 선택된 비필수적 유전자 또는 게놈 분절의 결손이 인간-소 키메릭 RSV에서 단독으로 또는 생물학적으로 유도된 약독화된 RSV 돌연변이체로부터의 직접 채택된 점 돌연변이와 같은 약독화된 표현형을 규정하는 1 이상의 상이한 돌연변이와 함께 (또는 예를 들면, 돌연변이를 명시하는 코돈에 다수 뉴클레오티드 변화를 도입하는 것에 의해 변형된 형태로) 구성된다. 예를 들면, SH, NS1, NS2, G 또는 M2-2 유전자는 cpts248/404, cpts530/1009, cpts530/1030 또는 다른 선택된 돌연변이 RSV 균주로부터 채택된 1 이상의 cp 및(또는) ts 돌연변이와 함께 결손되어 상이한 돌연변이의 연합 효과로 인하여 바이러스 수율의 증가, 약독화 증강, 면역원성 개선 및 및 약독화 표현형으로부터의 복귀변이에 대한 유전적 저항성을 갖는 키메릭 RSV를 생성한다.
별도 뉴클레오티드 변형은 인간-소 키메라 중의 선택된 유전자에 대한 시스 작용 조절 서열의 결손, 삽입, 첨가 또는 재배열을 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 1개의 RSV 유전자의 시스 작용 조절 서열은 변화되어 상이한 RSV 중의 동일 유전자의 대응 시스 작용 조절 서열 또는 상이한 RSV 유전자의 시스 작용 조절 서열일 수 있는 이형 조절 서열에 상응한다. 예를 들면, 유전자 종결 신호는 동일 RSV 균주 중의 상이한 유전자의 유전자 종결 신호에 대한 전환 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 다른 실시태양에서, 뉴클레오티드 변형은 키메릭 게놈 또는 안티게놈 내의 해독 개시 부위의 삽입, 결손, 치환 또는 재배열을 포함하여 예를 들면, 단백질의 선택된 형태에 대한 별도 해독 개시 부위를 제거한다. 한 실시예에서, RSV G 단백질의 분비 형태에 대한 해독 개시 부위가 제거되어 이러한 형태의 G 단백질의 발현을 변경하고, 따라서 요망되는 생체내 효과를 생성한다.
또한, 다양한 다른 유전적 변경은 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 단독으로 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV로부터 채택된 1 이상의 약독화 돌연변이와 함께 생성될 수 있다. 예를 들면, 비-RSV 원천에서 유래하는 유전자 또는 게놈 분절은 전체로 또는 부분적으로 삽입될 수 있다. 별법으로, 유전자의 순서가 변화되거나, 유전자 오버래핑이 삭제되거나, 또는 RSV 게놈 프로모터 가 안티게놈 대응부로 대체될 수 있다. 키메릭 게놈 또는 안티게놈에서 상이한 또는 추가 변형을 일으켜 다양한 유전자간 영역 (에를 들면, G 및 F 유전자 간의 독특한 StuI 부위) 또는 다른 경우의 독특한 제한 부위의 삽입과 같은 조작을 촉진할 수 있다. 비해독 유전자 서열을 제거하여 외래 서열 삽입에 대한 용량을 증가시킬 수 있다. 다른 추가 측면에서, 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터를 비-RSV 서열, 예를 들면 사이토카인, T-보조 에피토프, 제한 부위 마커, 또는 의도하는 숙주에서의 보호적 면역 반응을 유발할 가능성이 있는 미생물 병원체 (예를 들면, 바이러스, 세균 또는 곰팡이)의 단백질을 코딩하도록 변형할 수 있다. 이러한 일 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV는 PIV HN 또는 F 당단백질 또는 이의 면역원성 도메인 또는 에피토프와 같은 파라인플루엔자 바이러스 (PIV)로부터의 유전자 또는 게놈 분절을 혼입하여 구성된다.
점 돌연변이, 위치 지향성(site-specific) 뉴클레오티드 변화 및 전체 유전자 또는 게놈 분절을 포함하는 변화를 일으키는 뉴클레오티드 삽입, 재배열, 결손 또는 치환을 포함하여, 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 상기 변형 모두는 이형 공여체 유전자 또는 게놈 분절, 또는 수용체, 배경 게놈 또는 안티게놈에 일으킬 수 있다. 각 경우에, 이들 변화는 바람직하게는 약독화, 온도 민감성, 냉각 적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한, 유전자 발현의 변경, 또는 면역원성 에피토프에서의 변화와 같은 얻은 재조합 RSV 중의 1 이상의 표현형 변화(들)을 규정할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 단리된 감염성 인간-소 키메릭 RSV를 제조하기 위 한 조성물 (예를 들면, 단리된 폴리뉴클레오티드 및 RSV 코딩 cDNA를 혼입한 벡터) 및 방법이 제공된다. 이들 조성물 및 방법을 사용하여, 감염성 키메릭 RSV 입자 또는 서브바이러스 입자는 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 (L) 중합효소 단백질 및 RNA 중합효소 신장 인자와 공동발현되는 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 생성된다. 본 발명의 관련 측면에서, 상기 언급한 구조적 및 표현형 변화를 재조합 인간-소 키메릭 RSV에 도입하여 감염성 약독화된 백신 바이러스를 생성하는 조성물 및 방법이 제공된다.
한 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 또한, N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 동일 또는 상이한 발현 벡터가 제공된다. 단백질은 또한 게놈 또는 안티게놈 cDNA로부터 직접 발현될 수 있다. 벡터(들)은 바람직하게는 세포 또는 무세포 용균물에서 발현 또는 공동발현되고, 이에 의해 감염성 인간-소 키메릭 RSV 입자 또는 서브바이러스 입자를 제조한다.
RSV 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 (바람직하게는 RSV의 M2(ORF1)의 생성물) 단백질은 동일 또는 상이한 발현 벡터에 의해 공동 발현될 수 있다. 일부 경우, N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질은 각각 상이한 발현 벡터에 의해 코딩된다. 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 이로부터 감염성 바이러스 또는 바이러스 입자의 생산을 가능하도록 작동가능하게 연결된 인간 및 소 폴리뉴클레오티드 서열의 키메 라이다. 본 발명의 별도의 측면에서, 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈은 다수 인간 RSV 균주 또는 아군 (A 및 B) 유래의 서열 뿐만 아니라 다른 비인간 (예를 들면, 생쥐) RSV 서열을 포함할 수 있다. 다른 별도의 측면에서, 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈은 비-RSV 서열, 예를 들면 PIV 또는 다른 음성 가닥 RNA 바이러스의 점 돌연변이, 단백질, 단백질 도메인 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 인간 및 소 RSV 유래의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 혼입할 수 있다.
인간-소 키메릭 RSV를 제조하기 위한 상기 방법 및 조성물은 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자, 또는 이의 유도체를 생성한다. 감염성 바이러스는 진정 RSV 바이러스 입자에 필적하고, 이와 같이 감염성이다. 이는 직접적으로 신선한 세포를 감염시킬 수 있다. 감염성 서브바이러스 입자는 통상적으로 적합한 조건하에서 감염을 시작할 수 있는 바이러스 입자의 아성분(subcomponent)이다. 예를 들면, 게놈 또는 안티게놈 RNA 및 N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 포함하는 뉴클레오캡시드는 세포의 세포질에 도입된다면 감염을 시작할 수 있는 서브바이러스 입자의 예이다. 본 발명에서 제공되는 서브바이러스 입자는 감염성에 필수적이지 않은 1 이상의 단백질(들), 단백질 분절(들), 또는 다른 바이러스 성분(들)을 결한 바이러스 입자를 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 RSV의 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 코딩하는 1 이상의 단 리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터 (동일 또는 상이한 벡터)를 포함하는 세포 또는 세포 용균물을 제공한다. 이들 단백질 중 1 이상은 게놈 또는 안티게놈 cDNA로부터 발현될 수 있다. 발현시 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질은 결합되어 감염성 인간-소 키메릭 RSV 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 제조한다.
본 발명의 약독화 인간-소 키메릭 RSV는 감염된 인간 숙주에서 방어적 면역 반응을 유발할 수 있고, 면역화 숙주에서는 심각한 호흡기 질환의 허용할 수 없는 증상을 유발하지 않을 만큼 이미 충분히 약독화되어 있다. 약독화 키메릭 바이러스 또는 서브바이러스 입자는 세포 배양 상층액에 존재하고, 배양으로부터 단리하거나, 부분적 또는 완전히 정제될 수 있다. 바이러스는 또한 동결건조될 수 있으며, 기술된 대로 저장 또는 숙주로 송달하기 위하여 다양한 다른 성분과 결합될 수 있다.
본 발명은 생리학적으로 허용가능한 담체 및(또는) 아주반트(adjuvant) 및 단리된 약독화 인간-소 키메릭 RSV를 포함하는 신규 백신을 제공한다. 한 실시태양에서, 백신은 1 이상, 바람직하게는 2 이상의 약독화 돌연변이 또는 상기 기술된 바와 같은 다른 뉴클레오티드 변형을 갖는 인간-소 키메릭 RSV를 포함한다. 백신은 약독화 바이러스 103 내지 106 PFU의 용량으로 제제화될 수 있다. 백신은 단일 RSV 균주 또는 항원성 아군 (예를 들면, A 또는 B)에 대하여, 또는 다수 RSV 균주 또는 아군에 대하여 면역 반응을 유발하는 약독화 키메릭 바이러스를 포함할 수 있 다. 이와 관련하여, 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV는 다수 RSV 균주 또는 아군에 대해 단일특이성 면역 반응 또는 다중특이성 면역 반응을 개별적으로 유발할 수 있다. 인간-소 키메릭 RSV는 하나 또는 다수 RSV 균주 또는 아군에 대해 더욱 효과적인 방어를 위한 상이한 면역원성 특성을 갖는 비-키메릭 RSV 또는 다른 키메릭 RSV와 백신 제제에서 결합될 수 있다.
관련된 측면에서, 본 발명은 포유류 대상에서 RSV의 균주 또는 아군 1 이상에 대해 면역 반응을 유발하는 개체의 면역 시스템을 자극하는 방법을 제공한다. 본 방법은 생리학적으로 허용가능한 담체 및(또는) 아주반트 중의 면역학적으로 충분한 양의 약독화된 인간-소 키메릭 RSV의 제제를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 면역원성 조성물은 1 이상, 바람직하게는 2 이상의 약독화 돌연변이 또는 상기 기술된 바와 같은 요망되는 표현형을 규정하는 다른 뉴클레오티드 변형을 갖는 인간-소 키메릭 RSV를 포함하는 백신이다. 백신은 약독화 바이러스 103 내지 106 PFU의 용량으로 제제화될 수 있다. 백신은 단일 RSV 균주 또는 항원성 아군 (예를 들면, A 또는 B)에 대하여, 또는 다수 RSV 균주 도는 아군에 대하여 면역 반응을 유발하는 약독화된 인간-소 키메릭 RSV 바이러스를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 인간-소 키메릭 RSV는 다수 RSV 균주 또는 아군에 대해 단일특이성 면역 반응 또는 다중특이적 면역 반응을 유발할 수 있다. 별법으로, 상이한 면역원성 특성을 갖는 인간-소 키메릭 RSV는 백신 혼합물로 결합되거나, 대등 치료 프로토콜로 개별적으로 투여되어 1개의 RSV 균주에 대하여, 또는 다수 RSV 균주 또는 아군 에 대한 더욱 효과적인 방어를 유발할 수 있다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 예를 들면, 분무, 액적(droplet) 또는 에어로솔에 의해 상기도에 투여된다. 종종, 조성물은 RSV에 대한 항체에 혈청음성이거나, 또는 RSV에 대한 태반을 통하여 획득된 모체 항체를 소유하는 개체에 투여될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1A 및 1B는 재조합체 (r) 소 RSV (BRSV) 균주 ATue51908의 G 및 F 유전자를 인간 RSV (HRSV) 균주 A2의 G 및 F 유전자로 대체하여 재조합체 키메릭 바이러스 rBRSV/A2를 만드는 것을 설명한다.
도 1A는 F 및 G 유전자를 HRSV의 것으로 대체하는 것을 설명하는 rBRSV 게놈의 도면이다. 오픈 리딩 프레임 (ORFs)의 위치는 음영 (BRSV) 또는 빈 (HRSV)직사각형으로 나타내었다. G 및 F 유전자는 유전자 종결/폴리아데닐화 신호를 막대로 표시하여 확대하여 나타내었으며, 유전자 개시 신호는 검은색 삼각형으로 나타내었고, 유전적 마커, 또는 교환된 제한 단편의 경계로 작용하는 합성 제한 부위의 위치는 아래에 나타낸 완전한 안티게놈 서열의 위치에 화살표로 표시하였다. 마커 제한 부위에 의해 프레임된 단편의 크기는 괄호 안에 표시하였다. 재조합 바이러스의 게놈 길이는 좌측에 표시하였다. 로마 숫자 (I, II 및 III)은 도 1B에서 확대시킨 유전자간 영역을 지칭한다.
도 1B는 생물학적으로 유도된 BRSV 균주 ATue51908 (제1행); 재조합 버전 rBRSV ATue51908 (제2행), 재조합 키메릭 바이러스 rBRSV/A2 (제3행) 및 생물학적 으로 유도된 HRSV 균주 A2 (마지막행)의 SH/G (I), G/F (II) 및 F/M2 (III) 유전자간 영역의 정렬을 설명한다. 도 1B, 패널 I: SH/G 유전자간 영역: ATue51908 (제1행) (SEQ ID NO. 1); rBRSV (제2행) (SEQ ID NO. 2); rBRSV/A2 (제3행) (SEQ ID NO. 3); HRSV 균주 A2 (마지막행) (SEQ ID NO. 4). 도 1B, 패널 II: G/F 유전자간 영역: ATue 51908 (제1행) (SEQ ID NO. 5); rBRSV (제2행) (SEQ ID NO. 6); rBRSV/A2 (제3행) (SEQ ID NO. 7); HRSV A2 (마지막행) (SEQ ID NO. 8). 도 1B, 패널 3: F/M2 유전자간 영역: ATue51908 (제1행) (SEQ ID NO. 9); rBRSV (제2행) (SEQ ID NO. 10); rBRSV/A2 (제3행) (SEQ ID NO. 11); HRSV A2 (SEQ ID NO. 12). 서열은 DNA 양성 가닥으로 나타낸다. 갭은 점으로 표시하고, 유전자 개시 및 유전자 종결 신호는 음영으로하고, 해독 개시 코돈은 굵게 한다. 반복 표시는 뉴클레오티드 동일성을 나타낸다. 제한 부위는 인식 서열을 음영으로 하여 나타낸다. Orf는 오픈 리딩 프레임이다. 번호는 게놈 위치를 지칭한다 (BRSV에 대해서는, 균주 ATue51908: 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 AF092942; HRSV에 대해서는, 균주 A2: 진뱅크 수탁 번호 M74568).
도 2A-2C는 생물학적으로 유도된 BRSV (ATue51908)의 게놈; 그 재조합 버전 rBRSV 및 재조합 키메라 rBRSV-A2 중의 마커 제한 부위를 나타낸다. RT-PCT을 표시한 바이러스로 감염시킨 BSR T7/5 세포의 총 RNA에 대해 수행하였다. PCR 생성물을 제한 분석하고, 2％ (도 2A, 2B) 또는 3％ 아가로스 겔 (도 2C) 상에서 분석하였다. 뉴클레오티드 길이는 계산된 크기에 기초하여 추정하였다. 모든 경우, PCR 생성물은 RT 단계가 빠졌을 때는 검출되지 않았다. M, 1 kb DNA 래더 (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland). 일부 마커 단편의 크기는 우측에 나타내었다.
도 2A는 재조합 바이러스 단리물의 SH/G 유전자간 영역에 포함되는 SalI 부위 (위치 4673)을 포함하는, 위치 3612 내지 4885 (rBRSV/A2) 또는 위치 3612 내지 4886 (ATue51908 및 rBRSV)에 상응하는 RT-PCR 생성물의 분석을 보여준다. 약 1273-1274 bp의 예측된 크기에 상응하는 PCR 생성물은 SalI로 소화시켰다. 이는 이 도입된 부위가 결여된 생물학적으로 유도된 ATue51908을 절단하지 않는 반면, 재조합 바이러스에 대해서는 이는 1061 bp (2개의 바이러스 모두) 및 213 bp (rBRSV) 또는 212 bp (rBRSV/A2)의 밴드가 생기게 한다.
도 2B는 재조합 바이러스에서 각각의 마커 제한 부위 (rBRSV 위치 5539에서의 SphI 부위 또는 rBRSV-A2 위치 5619 중의 StuI 부위) 및 G/F 유전자간 영역을 포함하는 위치 5452 내지 6062 (rBRSV/A2) 또는 위치 5372 내지 5964 (ATue51908 및 rBRSV)에 상응하는 RT-PCR 생성물의 분석을 보여준다. PCR 생성물은 약 592 (ATue51908 및 rBRSV) 또는 610 (rBRSV/A2)의 예측된 크기였다. SphI는 예측한 바와 같이 rBRSV 만을 소화시켜 425 bp 및 167 bp의 단편을 생기게 하였다. StuI는 예측한 바와 같이 rBRSV/A2 만을 소화시켜 443 bp 및 167 bp의 단편을 생기게 하였다.
도 2C는 F/M2 유전자간 영역을 포함하는 RT-PCR 생성물 스패닝 위치 7218 내지 7852 (ATue51908 및 rBRSV) 또는 7316 내지 7939 (rBRSV/A2)의 분석을 보여준다. 예측한 바와 같이, XhoI로 소화시킨 것은 ATue51908을 절단하지 않았으나, rBRSV 및 rBRSV/A2의 경우는 395 bp (2개 바이러스 모두) 및 267 bp (rBRSV) 또는 256 bp (rBRSV/A2)의 단편이 생기게 한다. 이는 재조합 바이러스의 게놈 중의 도입된 XhoI 부위 (rBRSV 위치 7471, rBRSV-A2 위치 7558)의 존재를 밝혔다.
도 3은 인간 HEp-2 세포 (패널 A) 및 소 MDBK 세포 (패널 B) 중의 rBRSV, rBRSV/A2 및 HRSV 균주 Long의 성장의 비교를 보여준다. 24-웰 접시 중의 복제 세포 단층을 각 바이러스 0.1 MOI로 감염시켰다. 상층액 분취량을 표시한 시간에 취하고, -70℃에서 동결시켰으며, 복제물 중에서 후에 적정하였다. 각 값은 감염된 세포의 2 웰로부터의 물질의 평균 역가이다.
도 4A는 글루타르알데이드로 고정시키고, 이어서 면역금 라벨링 및 음성 염색 후의 재조합 BRSV의 비리온(virion)의 전자 현미경 검사를 제공한다 (전체 및 확대). 도 4B는 초박편 중에서 검출된 비리온의 전자 현미경 검사를 제공한다. 비리온 표면 상의 항원성 에피토프 뿐만 아니라 긴 사상(filamentous) 비리온 형상은 제조 기술에 의해 보존된다 (도 4A 바: 2 μ, 확대: 바: 100 nm, 도 4B 바: 150 nm.)
도 5는 HRSV F 및 BRSV F 단백질 (패널 A, C 및 E) 모두와 반응하거나, 또는 오직 HRSV F 단백질 (패널 B, D 및 F)와만 반응한 모노클로날 항체를 사용한 면역금 라벨링을 보여준다. rBRSV (패널 A 및 B), rBRSV/A2 (패널 C 및 D), 및 HRSV, 염색 Long (패널 E 및 F)의 제제의 라벨링. 바: 150 nm.
도 6은 BRSV G 단백질 (패널 A, C 및 E)와 반응하거나, HRSV G 단백질 (패널 B, D 및 F)와 반응하는 모노클로날 항체를 사용한 면역금 라벨링을 보여준다. rBRSV (패널 A 및 B), rBRSV/A2 (패널 C 및 D), 및 HRSV 염색 Long(패널 E, F)의 제제의 라벨링. 바: 150 nm.
도 7A 및 7B는 rBRSV 염색 ATue51908의 F 유전자를 HRSV 염색 Long으로 대체하여 재조합 키메릭 바이러스 rBRSV/LongF를 생성하는 것을 설명한다.
도 7A는 F 유전자를 HRSV 염색 Long의 것으로 대체하는 것을 설명하는 rBRSV 게놈의 도면이다. 오픈 리딩 프레임 (ORFs)의 위치는 음영 (BRSV) 또는 빈 (HRSV) 직사각형으로 나타내었다. F 유전자는 유전자 종결/폴리아데닐화 신호를 바로 나타내어 확대시켜 보였으며, 유전자 개시 신호는 검은 삼각형으로 나타내고, 유전적 마커 또는 교환된 제한 단편의 경계로 작용하는 합성 제한 부위의 위치는 아래에 나타낸 완전한 안티게놈 서열의 위치에 화살표로 표시하였다. 마커 제한 부위에 의해 프레임된 단편의 크기는 (괄호 안에) 표시하였다. 재조합 바이러스의 게놈 길이는 좌측에 표시하였다. 로마 숫자 (I, II 및 III)은 도 7B에 확대시킨 유전자간 영역을 지칭한다.
도 7B는 생물학적으로 유도된 BRSV 균주 ATue51908 (제1행); 재조합 버전 rBRSV ATue51908 (제2행), 및 재조합 키메릭 바이러스 rBRSV/LongF (마지막행)의 SH/G (I), G/F (II) 및 F/M2 (III) 유전자간 영역의 정렬을 보여준다. 주석은 도 1과 같다. 도 7B, 패널 I: SH/G 유전자간 영역: ATue51908 (제1행) (SEQ ID NO. 1); rBRSV (제2행) (SEQ ID NO. 2); rBRSV/LongF (제3행) (SEQ ID NO. 2). 도 7B, 패널 II: G/F 유전자간 영역: ATue51908 (제1행) (SEQ ID NO. 5); rBRSV (제2행) (SEQ ID NO. 6); rBRSV/LongF (마지막행) (SEQ ID NO. 13). 도 7B, 패널 3: F/M2 유전자간 영역: ATue51908 (제1행) (SEQ ID NO. 9); rBRSV (제2행) (SEQ ID NO. 10); rBRSV/A2 (마지막행) (SEQ ID NO. 11).
도 8은 재조합 바이러스 단리물 rBRSV/LongF의 동일성을 확인하는 RT-PCR 및 제한 분석을 제공한다. 표시한 바이러스 단리물로 감염시킨 세포로부터의 총 RNA를 사용하여 2회의 RT-PCRs를 수행하였다. PCR 생성물을 0.8％ 아가로스 겔 상에서 분석하였다. RT 단계가 빠진다면 PCR 생성물은 얻어지지 않았다. 뉴클레오티드 길이는 계산된 크기에 기초하여 추정된다. M, 1 kb DNA 래더 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). 일부 마커 단편의 크기는 좌측에 나타낸다. PCR 1은 BRSV 골격의 서열 (ATue 51908 nt 5380-5397 (BRSV G 유전자), 및 ATue51908 nt 7567-7550 (BRSV M2 유전자)), F 유전자의 상류 및 하류와 혼성화한 프라이머쌍을 사용하여 수행되었다. PCR 1은 BRSV 균주 ATue51908에 대한 2,187 nt 및 재조합 아날로그 rBRSV, 및 rBRSV/LongF에 대한 2,161 nt (이들 밴드는 이들 조건하에서 전기영동 이동에 의해 구별되지 않는다). 예측한 바와 같이, 상기 BRSV 프라이머쌍을 사용한 HRSV 염색 Long RNA로부터 PCR 생성물은 얻어지지 않았다. PCR 1로부터의 생성물은 제한 분석하였다. 예측한 바와 같이, 재조합 바이러스는 SphI에 의해 절단되나, 표준 BRSV 균주 ATue51908은 절단되지 않았고 (rBRSV에 대해서는 2,028 bp 및 159 bp, 및 rBRSV/LongF에 대해서는 2,002 bp 및 159 bp를 얻음), 이는 합성 SphI 마커 제한 부위 (rBRSV 및 rBRSV/LongF 게놈 pos. 5539)의 존재를 증명한다. EcoRI은 BRSV ATue51908 및 rBRSV F 유전자 (게놈 pos. 6233)의 천연 발생적 EcoRI 부위에서 절단되어 1,334 nt 및 853 nt의 2개의 단편을 생성하는 반면, rBRSV/LongF로부터 기원하는 단편은 예측한 바와 같이 EcoRI에 의해 절단되지 않는다. PstI에 의해 소화시켰을 때, 예측한 바와 같이 BRSV F 유전자를 포함하는 단편은 절단되지 않고 남아있고, rBRSV/LongF 생성물은 1,351 bp, 586 bp 및 224 bp의 3개의 단편으로 절단되고, 이는 HRSV Long F 유전자에 포함되는 2 개의 천연 발생적 PstI 부위 (pos. 63 및 649)의 존재를 밝혀준다. PCR 2은 HRSV 균주 Long F 유전자 (프라이머 FL, 3'-GGGGCAAATAACAATGGAGTTGCCAATC-5' (SEQ ID NO. 19), HRSV 균주 Long F 유전자 서열의 nt 1-28, 및 프라이머 FLr, 5'-TTTTTATATAACTATAAACTAGGAATCTAC-3' (SEQ ID NO. 20), HRSV 균주 Long F 유전자 nt 1903-1874에 혼성화시킨 프라이머쌍을 사용하여 수행하여, rBRSV/LongF 및 HRSV 염색 Long 부모형 바이러스의 PCR 생성물을 생성하였다. 예측된 바와 같이, rBRSV로부터는 생성물이 얻어지지 않았다. EcoRI 및 PstI로 소화시킨 것은 예측된 절단 패턴을 생성하였다.
도 9는 rBRSV/LongF의 표면 단백질의 면역전자 현미경 분석을 제공한다. 패널 A, mab G66 내지 BRSV G 단백질; 패널 B: mab 021/21G 내지 HRSV G 단백질; 패널 C: mab 2F, HRSV 및 BRSV 모두의 F 단백질과 반응성임; 및 패널 D: mab 44F, HRSV F 단백질에 대해 특이적임. 바: 150 nm.
도 10은 BRSV G 및 F 유전자가 결손되고, HRSV의 G 및 F 유전자가 프로모터 인접 위치에 위치하는 키메릭 rBRSV/HRSV 게놈의 구성을 상술한다. BRSV 유전자는 음영 부분이고, HRSV 유전자는 밝은 부분이다. 뉴클레오티드 서열 위치 번호는 완전한 rBRSV 안티게놈과 관련이 있으며 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995의 진뱅크 수탁 번호 AF092942 또는 완전한 rHRSV 안티게놈; 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨); HRSV 서열을 지칭하는 서열 위치 번호는 밑줄을 그었다. 도 10, 패널 A는 선행 작업 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000)에서 첨가된 NotI, SalI 및 XhoI 부위를 포함하는 rBRSV의 구조를 상술한다. 도 10, 패널 B는 rBRSV를 변형하여 rBRSV/A2-G1F2를 생성하는 것을 서술한다. BRSV G 및 F 유전자는 SalI 및 XhoI으로 소화시키고, 얻은 호환성의 접착성 말단의 재리게이션에 의해 결손시켰다. G 및 F 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 4692 내지 7557로부터의 HRSV의 게놈의 영역은 요망되는 변화를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켜 cDNA의 각 말단으로 혼입하였다. 증폭된 PCR 생성물은 (상류로부터 하류쪽 순서로) 다음을 포함하였다: NotI 부위, BlpI 부위, 완전한 HRSV G ORF, 그 하류 비코딩 및 GE 신호, HRSV G-F IG 서열, 완전한 HRSV F 유전자, HRSV F-M2 IG 서열로부터의 6 뉴클레오티드 (CACAAT), NS1 GS 신호, BlpI 부위 및 NotI 부위. 상기 cDNA는 rBRSV의 위치 67에서 독특한 NotI 부위로 클로닝하였다. 도 10, 패널 C는 rBRSV/A2-G1 F2의 게놈 RNA의 구조를 설명한다.
도 11은 HEp-2 인간 (좌측 패널) 및 MDBK 소 (우측 패널) 세포 중의 RBRSV, rHRSV(rA2), rBRSV/A2 및 rBRSV/A2-G1 F2의 다중사이클 성장을 설명한다. 복제 세포 단층을 0.1의 MOI로 표시한 바이러스로 감염시켰고, 37℃에서 배양하였으며, 중간 분취량을 표시한 시간에 수확하고, 순간 동결시키고, -70℃에서 저장하였으며, 복제물 중에서 후에 적정하였다. 각 값은 2 웰의 평균 역가이다.
도 12는 rBRSV/A2-G1F2, rBRSV/A2 또는 rA2로 감염시킨 HEp-2 세포의 간접 면역형광을 나타낸다. 세포는 0.1의 MOI로 감염시키고, 37℃에서 96시간 동안 배양하고, 아세톤으로 고정시키고, 투과시키고, HRSV의 G 단백질에 특이적인 모노클로날 항체 021/1G, 또는 HRSV의 F 단백질에 특이적인 모노클로날 항체 44F와 반응시켰다. 항체 결합은 생쥐 IgG에 특이적인 태그된(tagged) 항체와 반응시키는 것에 의해 가시화하였다.
도 13은 HRSV의 M, G 및 F 유전자를 포함하는 키메릭 rBRSV/HRSV의 구성을 상술한다. BRSV 유전자는 음영 부분이고, HRSV 유전자는 밝은 부분이다. HRSV 유전자를 지칭하는 서열 위치 번호는 밑줄을 그었다. 도 13A는 P 및 M 유전자 사이의 유전자간 영역 (P-M IG) 내에 위치 3204에서 독특한 MluI 부위를 포함하도록 rBRSV/A2를 변형하는 것을 설명한다. IG의 서열은 최초의 뉴클레오티드 할당을 나타내는 작은 케이스 문자로 나타내어진다. 밑줄 그은 문자는 5 뉴클레오티드 치환에 의해 생성된 MluI 부위를 표시한다. 뉴클레오티드 서열 위치 번호는 완전한 rBRSV 안티게놈에 관한 것이고 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995 중의 진뱅크 수탁 번호 AF092942 또는 완전한 rHRSV 안티게놈); HRSV 서열을 지칭하는 서열 위치 번호는 밑줄을 그었다. 도 13B는 rBRSV/A2를 변형하여 rBRSV/A2-MGF를 생성하는 것을 설명한다. BRSV M 및 SH 유전자를 포함하는 MluI-SalI 단편을 절제하고 HRSV M 유전자를 포함하는 MluI- SalI 단편으로 대체하였다. HRSV M 유전자를 포함하는 MluI-SalI 단편은 상자 안에 나타낸다. 또한 나타낸 것은 BRSV P 유전자 말단 서열을 포함하는 MluI 부위의 바로 상류 서열 (SEQ ID NO. 17), M 및 G 유전자 간의 유전자간 서열 (M-G IG), HRSV G 유전자 개시 신호 및 G ORF를시작하는 ATG (굵은 글씨, 기울임꼴)를 포함하는 SalI 부위의 바로 하류 서열 (SEQ ID No. 18)이다. 도 13C는 rBRSV/A2-MGF의 게놈의 구조를 설명한다.
구체적인 실시태양의 설명
본 발명은 인간-소 키메릭 RSV를 얻기 위한 인간 및 소 RSV 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라로 클로닝된 재조합 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV)를 제공한다. 인간-소 RSV의 키메릭 구성은 포유류, 특히 인간에서 감염성이고, 임상적 용도의 면역원성 조성물을 생성하는데 유용한 바이러스 입자 또는 서브바이러스 입자를 생성한다. 또한, 본 발명 내에 제공되는 것은 약독화된 인간-소 키메릭 RSV를 설계 및 제조하기 위한 신규 방법 및 조성물 뿐만 아니라 RSV 감염의 예방 및 치료를 위한 방법 및 조성물이다. 본 발명에 따른 인간-소 키메릭 RSV 및 면역원성 조성물은 특이적 RSV 아군 또는 균주에 대해 면역 반응을 유발할 수 있고, 이들은 다수 RSV 아군 또는 균주에 대해 다중특이적 반응을 유발할 수 있다.
RSV는 일반적으로 파라믹소바이러스 군의 외피 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스로 특성화된다 (Collins et al., Fields Virology 2:1313-1352, 1996). 공지된 균주 A2에 대하여 15,222 뉴클레오티드 (nt) 길이의 그 게놈은 11개의 단백질을 코 딩하는 10 개의 메신저 RNAs로 전사된다 (Collins, et al., Fields Virology 2:1313-1352, 1996; Atreya, et al., J. Virol. 72:1452-61, 1998; Bukreyev, et al., J. Virol. 71:8973-82, 1997; Collins, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-5, 1996; Teng and Collins, J. Virol. 72:5707-16, 1998; Teng and Collins, J. Virol. 73:466-473, 1999; Whitehead, et al., J. Virol. 73:3438-42, 1999, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입되). 이들 중 4개는 뉴클레오캡시드/중합효소 단백질, 즉 주 뉴클레오캡시드 N 단백질, 인단백질 P, 및 중합효소 단백질 L, 및 전사 항종결 단백질 M2-1이다. 이들은 표면 당단백질, 즉 부착 G 단백질, 투과 및 합포체(syncytium) 형성 능력이 있는 융합 F 당단백질 , 및 미지의 기능의 작은 소수성 SH 단백질이다. 매트릭스 M 단백질은 비리온 형성에 포함되는 내부 비리온 단백질이다. 미지의 기능의 2개의 비구조 단백질 NS1 및 NS2가 있다. 마지막으로, RNA 조절 인자 M2-2를 코딩하는 M2 mRNA 중의 2차 오픈 리딩 프레임 (ORF)가 있다.
G 및 F 단백질은 주 중화 및 방어 항원이다 (Collins et al., Fields Virology 2:1313-1352, 1996; Connors, et al., J. Virol. 66:1277-81, 1992). RSV에 의해 재감염에 대한 내성은 이들 단백질에 특이적인 혈청 및 점액 항체에 의해 많이 매개된다. RSV-특이적 세포독성 T 세포는 또한 RSV 감염에 의해 유도되고, 많은 상이한 단백질에 대한 것일 수 있으나, 이 에펙터 재감염에 대한 장기 내성에 중요한 기여자임을 보여주지 않았다. 그러나, CD8+ 및 CD4+ 세포 모두는 면역 반응을 조절하는데 중요할 수 있으며, 이들 모두는 바이러스 발병기전에 포함될 수 있다 (Johnson et al., J. Virol. 72:2871-80, 1998; Srikiatkhachorn and Braciale, J. Exp. Med. 186:421-32, 1997). 따라서, F 및 G는 가장 중요한 항원 결정기이나, 다른 단백질은 또한 면역 반응에서 중요한 역할을 수행할 수 있다.
RSV 단리물은 모노클로날 항체와의 반응에 의해 2개의 항원성 아군 A 및 B로 분리될 수 있다 (Anderson, et al., J. Infect. Dis. 151:626-33, 1985, Mufson, et al., J. Gen. Virol. 66:2111-24, 1985). 2개의 아군은 게놈에 대해 차이를 보여주나, 퍼센트 아미노산 서열 디버전스(divergence)가 50％를 초과할 수 있고, 항원성 디버전스가 단일특이성 폴리클로날 항혈청의 반응성에 기초하여 95％인, G 단백질의 엑토도메인에서 가장 디버전스트하다 (Johnson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5625-9, 1987; Johnson, et al., J. Virol. 61:3163-6, 1987). F 단백질은 아미노산 서열에 의해 약 10％ 디버전트하고, RSV A 및 B 아군 간에 50％ 항원적으로 디버전트하다 (Johnson, et al., J. Virol. 61:3163-6, 1987; Johnson and Collins, J. Gen. Virol. 69:2623-8, 1988). 따라서, 아군 모두는 백신에 표현되어야만 한다.
소 RSV (BRSV)는 인간 RSV (HRSV)와 연관되어 있고, 소의 호흡기 질병의 보편적인 시판되는 중요한 물질이다 (Mohanty, et al., Am. J. Vet. Res. 36:417-9, 1975; Van der Poel, et al., J. Infect. 29:215-28, 1994). BRSV 및 HRSV 간의 서열 디버전스의 양은 상기 언급한 HRSV A 및 B 아군 간의 것보다 약 2 배이다. 따라서, F 단백질은 BRSV 및 HRSV 간에 약 20％ 아미노산 디버전스를 가지며, G 단백질은 약 70％ 디버전스를 갖는다 (Lerch, et al., J. Virol. 64:5559-69, 1990; Lerch, et al., Virology 181:118-31, 1991; Mallipeddi and Samal, J. Gen. Virol. 74:2001-4, 1993; Mallipeddi and Samal, Vet. Microbiol. 36:359-67, 1993; Samal et al., Virology 180:453-456, 1991; Samal and Zamora, J. Gen. Virol. 72:1717-1720, 1991; Zamora and Samal, Virus Res. 24;115-121, 1992; ibid, J. Gen, Virol. 73:737-741, 1992; Mallipeddi and Samal, J. Gen. Virol. 73:2441-2444, 1992, Pastey and Samal, J. Gen. Virol. 76:193-197, 1995; Walravens et al., J. Gen. Virol. 71:3009-3014, 1990; Yunnus et al., J. Gen. Virol. 79:2231-2338, 1998, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨). cDNA로부터 감염성 HRSV를 제조하는 능력은 확장되어 BRSV의 재조합 제조를 가능하게하며, 따라서 감염성 재조합 바이러스를 제조하였다 (Buchholz, et al., J. Virol. 73:251-9, 1999).
BRSV는 코튼 랫트 (Piazza, et al., J. Virol. 67:1503-10, 1993), 올빼미 원숭이 (owl monkey) 및 침팬지 (Prince, et al., Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infections, 1990)에서 HRSV에 대한 백신으로 평가되었다. BRSV는 3 실험 동물 모두에서 고도로 제한되었고, 면역 반응을 매우 낮았다. 래트에서, HRSV 유발(challenge)에 대한 상당한 저항이 1 연구에서 관찰되었으나, 이 보호적 효과의 기초는 명확하지 않게 남아있다. 원숭이에서, BRSV 백신에 대한 항체 반응은 9 마리 중 2 마리 동물에서만 검출되었다. HRSV로의 후속적 유발시, 발산(shedding) 지속은 약간 감소하였으나, 발산의 강도와 질병 증상은 영향받지 않았다. BRSV의 고 접종물을 투여한 2 마리 침팬지의 병행 연구에서, 1 마리 동물 에서만 복제의 증가가 있었고, HRSV로의 후속 유발시 발산 지속은 약간 감소하였으나, HRSV의 역가 및 임상적 증상의 강도는 감소하지 않았다. 이들 연구는 천연에서 발견되는 BRSV 단리물은 직접적 백신 용도에 적합하지 않음을 나타낸다.
본 발명은 HRSV 및 BRSV 간의 키메라 기재의 생-약독화 RSV 백신 후보물의 개발하는 것을 제공한다. 키메라는 cDNA 중간체 및 cDNA-기재 회수 시스템을 통하여 구성된다. cDNA로부터 만든 재조합 바이러스는 독립적으로 복제되고, 이들이 생물학적으로 유도된다면 동일한 방식으로 증식되며, 실제로는 특이적으로 삽입된 돌연변이의 존재에 의해 생물학적으로 유도된 바이러스로부터 구분될 수 있다. 키메릭 HRSV/BRSV 백신 후보물은 바람직하게는 1 이상의 BRSV 유전자의 존재에 의해 약독화된 배경 중에 HRSV의 주요한 항원 결정기 1 이상을 지닌다. 또한, 본 발명에 따른 인간-소 키메릭 RSV는 더 변형되어 특이적 약독화 돌연변이 뿐만 아니라 다양한 다른 돌연변이 및 뉴클레오티드 변형을 혼입하여 요망되는 구조적 또는 표현형 영향을 가져온다.
본 발명의 보충적 측면으로 본원에 개시된 cDNA로부터 재조합 RSV를 제조하고, 돌연변이 및 뉴클레오티드 변형의 전체 범위를 제조하고 시험하기 위한 물질 및 방법의 상세한 설명은 예를 들면 다음 문헌에 설명되어 있다: 1995년 9월 27일 출원된 미국 가출원 제60/007,083호; 1996년 9월 27일 출원된 미국 가출원 제08/720,132호; 1996년 7월 15일 출원된 미국 가출원 제60/021,773호 1997년 5월 9일 출원된 미국 가출원 제60/046,141호; 1997년 5월 23일 출원된 미국 가출원 제60/047,634호; 1999년 11월 30일 공고된 미국 특허 제5,993,824호 (국제 특허 공 개 WO 제98/02530호에 상응함); 1999년 4월 13일 콜린스(Collins) 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 제09/291,894호; 1999년 4월 13일 머피(Murphy) 등에 의해 출원된 미국 가특허 출원 제60/129,006호; Crowe et al., Vaccine 12:691-699, 1994; 및 Crowe et al., Vaccine 12:783-790, 1994; Collins et al., Proc Nat Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; Bukreyev, et al., J. Virol. 70:6634-41, 1996, Juhasz et al., J. Virol 71(8):5814-5819, 1997; Durbin et al., Virology 235;323-332, 1997, Karron et al., J. Infect. Dis. 176:1428-1436, 1997); He et al., Virology 237:249-260, 1997; Baron et al., J. Virol. 71:1265-1271, 1997; Whitehead et al., Virology 247(2):232-9, 1998a; Whitehead et al., J. Virol. 72(5):4467-4471, 1998b; Jin et al., Virology 251:206-214, 1998; Bukreyev, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2367-2372, 1999; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11259-11264, 1999; Juhasz et al., Vaccine 17:1416-1424, 1999; Juhasz et al., J. Virol. 73:5176-5180, 1999; Teng and Collins, J. Virol. 73:466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:9773-9780, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:871-877, 1999; 및 Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999. cDNA로부터 재조합 RSV를 제조하는 예시적 방법은 RSV 안티게놈 RNA 및 RSV N, P, M2-1 및 L 단백질의 조직 배양 세포 내로 공동 감염된 플라스미드로부터 전형적으로 세포내 공동발현하는 것을 포함한다. 재조합 바이러스로 부르는 감염성 cDNA 유도된 바이러스가 생성되게 하는 생산성 감염을 시작한다. 일단 생성되면, 재조합 RSV는 생물학적으로 유도된 바이러스와 동일한 방식으로 쉽게 증식되고, 재조합 바이러스는 대응 생물학적으로 유도된 바이러스는 전자가 1 이상의 도입된 변화를 마커로 포함하지 않는 한 구별될 수 없다.
더욱 상세한 측면에서, 상기 삽입된 문헌들은 RSV를 돌연변이, 단리 및 특성화하여 약독화 돌연변이체 균주 (예를 들면, 온도 민감성 (ts), 저온 계대 배양 (cp) 냉각 적응 (ca), 작은 플라크 (sp) 및 숙주 범위 제한 (hr) 돌연변이체 균주)를 얻는기 위한 것, 및 약독화 표현형을 규정하는 유전전 변화를 확인하기 위한 본 발명에 유용한 방법 및 과정을 기술한다. 이들 방법과 함께, 상기 문헌들은 생쥐 및 비인간 영장류 모델 시스템을 포함하여 허용되는 모델 시스템에서 인간 RSV A 및 B 아군을 포함하는 생물학적으로 유도되고, 재조합적으로 제조된 약독화 인간 RSV의 복제, 면역원성, 유전적 안정성 및 보호 효과를 결정하는 과정을 상술한다. 또한, 이들 문헌은 RSV 감염의 예방 및 치료용 일가 및 이가 백신을 포함하는 면역원성 조성물을 개발 및 시험하는 일반적 방법을 상술한다.
cDNA로부터 감염성 RSV를 생성하는 능력은 cDNA 중간체를 통하여 감염성 바이러스로 미리 확인된 변화를 도입하는 방법을 제공한다. 이 방법은 예를 들면, 바이러스 단백질에 1 이상의 아미노산 치환, 1 이상의 유전자 결손 또는 유전자 발현의 제거 및(또는) 바이러스 표현형에 요망되는 효과를 발생시키는 시스 작용 RNA 신호 중의 1 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 재조합 백신 후보물과 같은 넓은 범위의 RSV의 감염성 약독화된 유도체를 제조하는 것을 설명한다 (예를 들면, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 Bukreyev et al., J. Virol. 71:8973-8982, 1997; Whitehead et al., J. Virol. 72:4467-4471, 1998; Whitehead et al., Virology 247:232-239, 1998; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11259-11264, 1999; Juhasz et al., Vaccine 17:1416-1424, 1999; Juhasz et al., J. Virol. 73:5176-5180, 1999; Teng and Collins, J. Virol. 73:466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:871-877, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999; 및 Collins et al., Adv. Virus Res. 54:423-451, 1999 참조).
상기 교시사항의 예는 예를 들면, 생물학적으로 유도된 지정된 cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCc VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2452), 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)로부터의 재조합 RSV 중에 채택된 cp 및 ts 돌연변이와 같은 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이체 중에 확인된 표현형 특이적 돌연변이를 혼입하도록 변형된 감염성 재조합 RSV를 구성하고 평가하는 방법이다. 이들 방법은 본 발명의 재조합 인간-소 키메릭 RSV의 구성에 쉽게 적응된다. 따라서, 제공되는 재조합 RSV는 예를 들면, 248/404, 248/955, 530/1009 또는 530/1030 생물학적 돌연변이체와 같은 동일 또는 상이한 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이체(들)로부터의 2 이상의 ts 돌연변이를 혼입할 수 있다. 후자와 관련하여, 다중 약독화 재조합체는 2개, 3개 또는 그 이상의 생물학적 돌연변이체로부터의 약독화 돌연변이의 조합, 예를 들면 RSV 돌연변이체 530/1009/404, 248/404/1009, 248/404/1030 또는 248/404/1009/1030 돌연변이체로부터의 약독화 돌연변이체의 조합을 가질 수 있다. 예시적 실시태양에서, 1 이상의 약독화 돌연변이체는 RSV 중합효소 유전자 중 아미노산 Asn43, Phe521, Gln831, Met1169 또는 Tyr1321에서 온도 민감성 치환, 또는 유전자 M2의 유전자 개시 서열 중 온도 민감성 뉴클레오티드 치환을 규정한다. 바람직하게는, 이들 돌연변이는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV에서 확인되는 다음의 변화로 동일 또는 보존적 변화, 예를 들면, Asn43은 Ile, Phe521은 Leu, Gln831은 Leu, Met1169는 Val 및 Tyr1321은 Asn으로의 L 중합효소 유전자에서 확인된 보존적 변화를 포함한다.
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV 중에 혼입될 수 있는 또 다른 돌연변이는 이형 RSV 또는 더욱 멀리 관련된 음성 가닥 RNA 바이러스에서 확인되는 돌연변이 (예를 들면, 약독화 돌연변이)이다. 특히, 음성 가닥 RNA 바이러스에서 확인되는 약독화 및 다른 요망되는 돌연변이는 각각 인간-소 키메릭 RSV내에 있는, 인간 또는 소 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 상응하는 위치로 "전달" (예를 들면, 복사)되거나, 인간-소 키메릭 RSV를 구성하는 수단일 수 있다. 간략하게, 1개의 이형 음성 가닥 RNA 바이러스 중의 요망되는 돌연변이는 RSV 수용체 (예를 들면, 각각 소 또는 인간 RSV)로 전달된다. 이는 본원에 참고문헌으로 삽입된 1999년 4월 13일 머피 등에 의해 출원된 미국 가출원 제60/129,006호에 기술된 바와 같이 이형 바이러스 중의 돌연변이를 매핑하고, 따라서 서열 정렬에 의해 인간 또는 소 RSV 중의 상응하는 위치를 확인하고, RSV 수용체 중의 천연 서열을 돌연변이 유전형 (동일 또는 보존적 돌연변이에 의해) 돌연변이시키는 것을 포함한다. 상기 개시사항이 교 시하는 바와 같이, 이형 돌연변이체 바이러스에서 확인되는 변화와 보존적으로 상응하는 돌연변이의 대상 부위에서의 변화를 코딩하도록 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 변형하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 아미노산 치환이 상응하는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이체 바이러스 중의 돌연변이 부위를 표시한다면, 유사한 치환은 재조합 바이러스에서 상응하는 잔기(들)에 엔지니어링되어야 한다. 바람직하게는, 치환은 돌연변이체 바이러스 단백질에 존재하는 치환 잔기와 동일 또는 보존적 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, 돌연변이체 단백질 중의 치환 잔기와 관련하여 비보존적 돌연변이 위치에서 천연 아미노산을 변화시키는 것 또한 가능하다 (예를 들면, 야생형 잔기의 기능을 혼란 또는 손상시키는 임의의 다른 아미노산 치환을 사용하여). 확인되고 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV로 전달되는 예시적 돌연변이로 음성 가닥 RNA 바이러스는 다른 RSVs (예를 들면, 생쥐), PIV, 센다이 바이러스 (SeV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 조류 바이러스 5 (SV5), 홍역 바이러스 (MeV), 우역 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스 (CDV), 광견병 바이러스 (RaV) 및 소포성 구내염 바이러스 (VSV)를 포함한다. RSV L 단백질의 위치 521에서의 페닐알라닌의 아미노산 치환 (HPIV3 L 단백질의 위치 456에서의 페닐알라닌의 치환에 상응함)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 돌연변이의 예가 개시되어 있다. 결손 또는 삽입에 의해 표시되는 돌연변이의 경우에, 이들은 재조합 바이러스 내로 상응하여 결손 또는 삽입으로 도입될 수 있으나, 결손 또는 삽입되는 단백질 단편의 입자 크기 및 아미노산 서열은 달라질 수 있다.
다양한 추가 유형의 돌연변이 또한 상기 삽입된 문헌에 개시되어 있으며, 본 발명의 재조합 인간-소 키메릭 RSV로 쉽게 엔지니어링되어 약독화, 면역원성을 보정하거나, 다른 이로운 구조적 및(또는) 표현형 효과를 제공할 수 있다. 예를 들면, 제한 부위 마커는 인간-소 키메릭 게놈 또는 안티게놈 내로 통상적으로 도입되어 cDNA 구성 및 조작을 촉진한다. 삽입된 문헌에 또한 기술되어 있는 것은 본 발명에 유용한 점 또는 위치 지향성 돌연변이 외의 넓은 범위의 뉴클레오티드 변형이다. 예를 들면, 추가 외래 유전자 (예를 들면, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT) 또는 루시페라제 유전자)를 발현하는 재조합 RSV를 제조하는 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 이러한 재조합체는 일반적으로 삽입된 유전자와 연관된 성장 감소를 나타낸다. 이러한 약독화는 삽입된 유전자의 길이 증가와 함께 증가되는 것으로 나타난다. 외래 유전자를 재조합 RSV로 삽입하는 것이 복제 수준을 감소시키고, 시험관내 통과 동안 안정하다는 발견은 백신용의 RSV를 약독화하는 다른 효과적인 방법을 제공한다. 따라서, 유사 또는 개선된 효과는 다른 요망되는 유전자 (예를 들면, 인터페론-
Figure 112002000618146-pct00001
, 인터루킨-2, 인터루킨-4 및 GM-CSF 등과 같은 사이토카인)의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 재조합 인간-소 키메릭 RSV 내에 혼입되는 상기 참고문헌에 개시된 추가 뉴클레오티드 변형은 선택된 RSV 유전자의 부분적 또는 완전한 결손 또는 제거를 포함한다. 따라서, RSV NS1, NS2, N, P, M, G, F, SH, M2(ORF1), M2(ORF2) 및(또는) L 유전자의 오픈 리딩 프레임 및(또는) 시스 작용 조절 서열의 부분적 또는 완전한 결손을 포함하여, RSV 유전자 또는 게놈 분절은 결손될 수 있다. 한 실시태양에서, SH mRNA 및 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 제거에 의해 SH 유전자의 발현이 제거된 재조합 RSV가 생성되었다. SH 유전자의 결손은 회수가능한 감염성 RSV 뿐만 아니라 감염성 바이러스 및 플라크 크기 수율 모두에 기초하여 조직 배양에서 실질적으로 성장이 개선된 것을 생성한다. SH 결손에 의해 규정된 조직 배양 중의 성장 증가는 배양 중 불량한 RSV 수율의 문제를 극복하는 것에 의한 것과 같이 인간-소 키메릭 RSV 백신을 개발하는 유용한 도구를 제공한다. 게다가, 이들 결손은 유전적 복귀변이에 대해 매우 안정적이고, 이로부터 유도된 RSV 클론이 특히 백신 물질로 유용하게 해준다.
SH-마이너스 RSV 재조합체 또한 생쥐의 상기도에서 위치 지향성 약독화를 나타내고, 이는 백신 개발에 신규 잇점을 나타낸다. 예를 들면, cp 돌연변이체와 같은 생 바이러스 백신으로 평가하여 현재의 RSV 균주는 조직 배양에서 상당한 성장 변화를 보이지 않는다. 숙주 범위 돌연변이가 있고, 이들은 하기도에서 약 100 배 침팬지 및 인간의 기도에서의 복제를 제한한다. 다른 돌연변이 유형의 예인 ts 돌연변이는 상기도에서 하기도로 체온 상승의 기울기로 인하여 하기도에서 우선적으로 바이러스 복제를 제한하는 경향이 있다. 이들 cp 및 ts 돌연변이체와 반대로, SH-마이너스 RSV 돌연변이체는 상기도에서 크게 제한되는 별개의 표현형을 갖는다. 이는 상기도에서의 복제의 제한이 주로 코를 통하여 호흡하는 취약한 연령대에 투여하는 백신의 안정성을 보장하기 위해 요구되므로, 매우 어린 유아에 사용하는 백신 바이러스에 특히 요망된다 게다가, 모든 연령군에서 상기도에서의 복제의 감소는 중이염으로부터의 이환을 감소시킬 수 있다. 이들 잇점 이외에, 예를 들면 거의 400 nt 및 전체 mRNA의 제거를 포함하는 SH 결손 돌연변이의 성질은 복귀변이에 크게 저항할 수 있는 유형의 돌연변이를 나타낸다.
또한, SH 유전자 변형과 관련하여 논의되는 것은 유용한 RSV 재조합 바이러스를 생성하기 위한 추가 방법 및 도구를 제공하기 위해 인간 및 소 RSVs, 및 다른 폐렴바이러스를 포함하는 상이한 RSVs 중의 SH 유전자를 비교하는 것이다. 예를 들면, 2개의 RSV 항원성 아군 A 및 B는 어떠한 SH 도메인에서 상대적으로 높은 수준의 보존을 나타낸다. 이러한 도메인 2개에서, RNV A 및 B의 추정적 막-스패닝 도메인 및 N-말단 영역은 아미노산 수준에서 84％ 동일성을 보이는 반면, C-말단 추정 엑토도메인은 더욱 디버전트하다 (약 50％ 동일성). 2개의 RSV 아군 B 균주인 8/60 및 18537을 비교하는 것은 단지 단일 아미노산 차이를 확인하였다 (Anderson et al., 상기 문헌). 인간 대 소 RSV의 SH 단백질은 약 40％ 동일하고, (i) 보존되는 잔기의 비대칭 분포; (ii) 매우 유사한 소수성 프로파일; (iii) 한 부위가 소수성 영역의 각 측면에 있는 2개의 N-연결 글리코실화 부위의 존재; 및 (iv) 각 SH 단백질의 중심 소수성 영역의 카르복시말단 측 상의 단일 시스테인 잔기를 포함하는 주요한 구조적 성질을 공유한다 (Anderson et al., 상기 문헌). 이들 및 다른 서열 유사성 및 차이를 평가하여, 감염성 인간-소 키메릭 RSV 클론 내에 치환 또는 삽입될 수 있는 이형 서열(들)을 선택하여 예를 들면, 다중 특이적 면역원성 효과, 또는, 별도로 또는 추가로, 약독화와 같은 요망되는 효과를 갖는 백신을 얻을 수 있다.
유전자 결손과 관련하여 또한 개시되는 것은 유전자 위치의 변화의 효과이다. 예를 들면, SH 유전자가 결손되면 하류 유전자 위치에서 더욱 프로모터 인접 한 위치로 효과적인 변화가 일어난다. 이는 재조합 바이러스에서 하류 유전자의 전사 증가와 연관될 수 있다. 따라서, 게놈 또는 안티게놈에서 유전자 순서 또는 위치를 변화시키는 것에 의해 RSV 유전자 발현의 수준을 변경하는 방법이 제공된다. 하류 유전자 발현 수준 감소는 약독화 표현형을 규정하리라 예상되는 반면, 발현 증가는 허용성 숙주 (예를 들면, 침팬지 및 인간)에서의 재조합 RSV에서 반대의 효과를 달성할 수 있다.
상기 삽입된 참고문헌에서 기술된 다른 실시예에서, NS2 유전자의 발현은 해독 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내로 정지 코돈을 도입하는 것에 의해 제거된다. 감염 바이러스의 방출 속도는 야생형과 비교하여 상기 NS2 녹-아웃 바이러스에서 감소된다. 또한, 돌연변이체 및 야생형 바이러스의 플라크의 비교는 NS2 녹-아웃의 플라크는 크기가 크게 감소했음을 보여주었다. 따라서, 이 유형의 돌연변이는 생존가능한 재조합 인간-소 키메릭 RSV 내로 혼입되어 변화된 표현형이 생기게 할 수 있고, 이 경우 바이러스 성장 속도는 감소되었고, 시험관내 플라크 크기는 감소하였다. 이들 및 다른 녹-아웃 방법 및 돌연변이체는 따라서 시험관내 플라크 크기 감소 및 생체내 약독화 간의 공지된 관련성에 기초하여 또 다른 추가 재조합 RSV 백신 물질을 제공한다. NS2 유전자의 발현은 또한 NS2 유전자의 완전한 제거에 의해 제거되었고, 이는 유사한 표현형의 바이러스를 생기게 하였다.
성공적으로 결손되는 다른 RSV 유전자는 NS1 및 M2-2 유전자를 포함한다. 전자는 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 제거에 의해 결손되었고, 후자는 프레임-이동 또는 해독 개시 부위의 변경 및 정지 코돈의 도입에 의해 결손되었다. 흥미롭게도, 회수된 NS1-마이너스 바이러스는 NS2 결손 바이러스의 경우 만큼 작지 않기는 하지만, 조직 배양 중 작은 플라크를 생성한다. NS1-마이너스 바이러스가 효능이 감소되기는 하지만 성장할 수 있다는 사실은 NS1 단백질이 보조적 단백질임을 확인시키고, 이들 하나는 바이러스 성장에 없어도 된다. NS1-마이너스 바이러스의 플라크 크기는 NS2 단백질의 발현이 그 코딩 서열 내로 해독 종결 코돈을 도입하는 것에 제거된 NS2 녹-아웃 바이러스의 경우와 유사하였다. 작은 플라크 표현형은 통상적으로 약독화 바이러스와 연관된다. 따라서, 이러한 유형의 돌연변이는 생존가능한 재조합 RSV 내로 혼입되어 표현형 변화가 생기게 한다. 이들 및 다른 녹=아웃 방법 및 돌연변이체는 따라서 시험관내 플라크 크기 및 생체내 약독화 간의 알려진 관련성에 기초하여 다른 추가 재조합 인간-소 키메릭 RSV 백신 물질을 제공한다. NS2 녹-아웃 돌연변이체는 천연 침팬지에서 상기도에서 적당히 약독화된 표현형을, 하기도에서 상당히 약독화된 표현형을 나타내었다. 이 돌연변이체는 또한 침팬지에서 질병 증상을 상당히 감소시키는 반면, 야생형 바이러스에 의한 유발에 대해 상당한 내성을 자극하였다 (Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999, 본원에 참고문헌으로 삽입됨).
삽입된 참고문헌에 제공되고, 본 발명에 유용한 추가 방법 및 조성물은 키메릭 게놈 또는 안티게놈 내의 시스-작용 조절 서열을 변화시키는 인간-소 키메릭 RSV 내의 상이한 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 예를 들면, RSV G 당단백질의 분비 형에 대한 해독 개시 부위가 결손되어 이러한 형태의 G 당단백질의 발현을 혼란시킬 수 있다. RSV G 단백질은 다음의 2가지 형태로 합성된다: 정착된 제II 완전 한 막 단백질 형태 및 막 정착의 전부를 필수적으로 결하고, 분비되는 N-말단 절단 형태 (Hendricks et al., J. Virol. 62:2228-2233, 1988). 2가지 형태는 다음의 2 가지 상이한 개시 부위에서의 해독 개시에 의해 유도됨을 보였다: G ORF의 최초 AUG에서의 더 긴 형태 개시물, 및 코돈 48에서 ORF의 2번재 AUG에서의 2차 개시물이고, 이는 단백분해에 의해 더 가공된다 (Roberts et al., J. Virol. 68:4538-4546, 1994). 상기 2차 개시 부위의 존재는 고도로 보존되어, 오늘날까지 인간, 소 및 양 RSV의 모든 균주에서 나타난다. G 단백질의 수용성 형태는 중화 항체를 트래핑하기 위한 유인물로 작용하여 숙주 면역을 완화하여야 함이 제안되었다. 또한, 수용성 G는 Th2-바이어스된 반응의 우선 자극에 포함되고, 이는 차례로 후속적 RSV에의 노출에의 면역병리 증가과 연관됨이 나타났다. RSV 백신 바이러스와 관련하여, 항체 트래핑 또는 면역계의 불균형적 자극을 최소화하는 것이 매우 바람직하고, G 단백질의 분비 형태의 발현을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 재조합 바이러스에서 달성된다. 따라서, 이 돌연변이는 특히 바이러스를 직접 약독화시키기 보다 재조합 바이러스에 의해 유발되는 숙주 변역 반응을 정성적으로 및(또는) 정량적으로 변화시키는데 특히 유용하다.
삽입된 참고문헌은 또한 예시적인 유전자 (예를 들면, NS1 및 NS2)의 시스 작용 전사 신호를 변화시키는 것에 의해 재조합 RSV의 표현형을 조정하는 것을 기술하고 잇다. 이들 뉴클레오티드 변형의 결과는 시스 조절 요소를 변화시키는 것에 의한 유전자 발현의 변형과 일치되어 예를 들면, mRNA를 통한 해독 수준을 감소시키고, 하류 유전자로부터의 단백질의 발현을 증가시킨다. 얻어진 재조합 바이러 스는 바람직하게는 성장 속도의 증가 및 플라크 크기의 증가를 나타낼 수 있다. 시스 작용 조절 서열에 대한 예시적 변형은 RSV 유전자와 연관된 유전자 종결 (GE) 및 유전자 개시 (GS) 신호에 대한 변형을 포함한다. 이와 관련하여, 예시적 변화는 이들 신호가 RSV N 유전자의 천연 발생적 GE 신호와 동일하게 되게 하는 NS1 및 NS2 유전자의 GE 신호의 변화를 포함한다. 얻어진 재조합 바이러스는 성장 운동 및 플라크 크기의 증가를 나타내고, 따라서 인간-소 키메릭 RSV 백신 후보물의 표현형을 유익하게 변형하는 또 다른 방법을 제공한다.
부분적 또는 완전한 BRSV 배경 게놈 또는 안티게놈 및 HRSV 유래의 이형 유전자 또는 게놈 분절로 형성되는 키메릭 소-인간 RSV는 아군 A 또는 아군 B HRSV 유래 (아군 A 및 B HRSV 모두로부터 유래), 또는 1 이상의 특이적 HRSV 균주로부터 유래하는 이형 유전자 또는 게놈 분절을 혼입할 수 있다. 이와 관련한 예시적 HRSV 균주는 공지된 RSV A2 및 Long를 포함한다. 바람직한 측면에서, HRSV 당단백질 유전자의 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 1 이상의 HRSV 당단백질 유전자 F, G 및 SH 또는 게놈 분절은 BRSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 분절을 치환한다. 별도 실시태양에서, HRSV 당단백질 유전자 F 및 G 중 1개 또는 모두는 BRSV 배경 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 F 및 G 당단백질 1개 또는 모두를 치환하여 이를 대체한다. 본원에서 하기 기술하는 하나의 구체적 실시예에서, HRSV Long 유래의 F 유전자는 대응 BRSV F 유전자 대신에 rBRSV 균주 ATue51908내로 치환된다. 다른 실시예에서, HRSV 균주 A2의 HRSV 당단백질 유전자 F 및 G 모두는 BRSV ATue51908 균주 배경 게 놈 또는 안티게놈 중의 대응 F 및 G 당단백질 유전자를 치환하여 이를 대체한다. 별도의 실시태양에서, 본 발명의 키메릭 인간-소 RSV는 1 보다 많은 RSV 균주 또는 아군 (예를 들면, 인간 RSV 아군 A 및 아군 B 모두) 유래의 항원 결정기를 혼입한다.
따라서, 상기 삽입된 참고문헌에서 제공하는 방법 및 조성물은 RSV 아군 A 및 B 모두로부터의 서열을 포함하여 약독화된 인간-소 키메릭 RSV 백신 바이러스의 제조를 가능하게 하여 예를 들면, RSV A 또는 B 백신 또는 2가 RSV A/B 백신을 얻는다 (예를 들면, 본원에 참고문헌으로 삽입된 1999년 4월 13일 콜린스 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 제09/291,894호 참조). 이와 관련하여, 인간-소 키메릭 RSV는 HRSV A 및 HRSV B 아군 유래의 항원 결정기를 코딩하는 다수 HRSV 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)을 혼입한 BRSV를 포함할 수 있다. 이어서, 이 바이러스는 상기 기술된 바와 같이 약독화 바이러스의 조직적 혼입에 의해 요망되는 수준으로 약독화될 수 있다. 예를 들면, 키메릭 RSV A/B 바이러스 내로 혼입되는 구체적 약독화 돌연변이는 다음을 포함한다: (i) 5개 cp 돌연변이 중 3개, 즉 N (V2671)의 돌연변이, L (C319Y 및 H1690Y)의 2개 돌연변이, 그러나 F의 2개 돌연변이는 이들이 B1 F 유전자로 치환에 의해 제거되었으므로 아님; (ii) 248 (Q831L), 1030 (Y1321N) 및 임의로는, 약독화 균주 A2 바이러스에서 확인되는 404-L (D1183E) 돌연변이; (iii) M2 유전자의 유전자 개시 신호 중 위치 9에서의 단일 뉴클레오티드 치환, 및 (iv) SH 유전자의 결손. RSV A 및(또는) RSV B 유전자 또는 게놈 분절을 수반하는 인간-소 키메릭 RSV에서의 즉시 입수가능한 돌연변이는 NS1, NS2, G 또는 M2-2 유전자 결손, 및 530 및 1009 돌연변이 단독 또는 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 상세한 측면에서, 인간-소 키메릭 RSV는 다른 RSVs 및 비-RSV 바이러스 및 비-바이러스 병원체를 포함하여 이형 병원체의 보호적 항원에 대한 "벡터"로 이용된다. 이러한 측면에서, 인간-소 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 1 이상의 이형 병원체의 항원 결정기 1 이상을 코딩하는 1 이상의 이형 유전자 또는 게놈 분절과 결합된 부분적 또는 완전한 "벡터 게놈 또는 안티게놈"을 포함한다 (예를 들면, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 미국 가출원 제60/170,195호; 미국 특허 출원 제09/458,813호; 및 미국 특허 출원 제09/459,062호를 참조). 이와 관련한 이형 병원체는 상기 확인한 RSV 단백질 뿐만 아니라 단백질 도메인, 단편 및 이의 면역원성 영역 또는 에피토프를 코딩하도록 선택될 수 있는 이형 RSV (예를 들면, 상이한 RSV 균주 또는 아군) 및 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절일 수 있다. 따라서, 구성되는 RSV 벡터 백신은 다중특이적 면역 반응을 유발할 수 있고, 다른 백신 물질과 동시에 또는 대등 투여 프로토콜로 투여될 수 있다.
다른 병원체에 대한 벡터로 엔지니어링된 인간-소 키메릭 RSV는 HRSV A 또는 HRSV B로부터 선택되는 이형 HRSVs를 포함하는 1 이상의 이형 RSV(s)의 항원 결정기(들)을 코딩하는 1 이상의 이형 유전자 또는 게놈 분절을 혼입하도록 변형 또는 결합된 부분적 또는 완전한 HRSV 게놈 또는 안티게놈인 벡터 게놈 또는 안티게놈을 포함할 수 있다. 별도의 측면에서, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 HRSV 게놈 또는 안티게놈이고, 항원 결정기(들)을 코딩하는 이형 유전자(들) 또 는 게놈 분절(들)은 1 이상의 비-RSV 병원체의 것이다. 전형적으로, 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 약독화를 규정하는 BRSV의 1 이상의 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)을 혼입한다. 별법으로, 벡터 바이러스는 1 이상의 HRSV 유전자 또는 게놈 분절을 혼입한 부분적 또는 완전한 BRSV 배경 게놈 또는 안티게놈을 포함할 수 있고, 여기서 인간-소 키메릭 RSV 벡터 바이러스는 비-RSV 병원체의 항원 결정기를 코딩하는 1 이상의 공여체 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)을 포함하도록 변형된다.
따라서, 본 발명의 어떠한 상세한 측면에서 인간-소 키메릭 RSV는 일정 범위의 비-RSV 병원체에 대한 벡터로서 제공된다 (예를 들면, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 미국 가출원 제60/170,195호; 미국 특허 출원 제09/458,813호; 및 미국 특허 출원 제09/459,062호를 참조). 본 발명의 이들 측면에 사용되는 벡터 게놈 또는 안티게놈은 각각 이형 HRSV 또는 BRSV 유전자 또는 게놈 분절을 혼입한 부분적 또는 완전한 BRSV 또는 HRSV 게놈 또는 안티게놈을 포함할 수 있고, 이형 병원체는 홍역 바이러스, 아군 A 및 아군 B 호흡기 신시티움 바이러스, HPIV1, HPIV2, HPIV3, 유행성 이하선염 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 제1형 및 제2형 인간 면역결핍 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 필로바이러스, 분야바이러스, 플라비바이러스, 알파바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV를 구성하기 위한 HRSV 또는 BRSV 벡터 게놈 또는 안티게놈은 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질, 또는 이의 항원성 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택되는 이형 항원 결정기(들)을 혼입할 수 있다. 예시적 실시태양에서, 홍역 바이러스 HA 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)를 포함하는 전사 단위는 BRSV 또는 HRSV3 벡터 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 혼입된다. 별법으로, 본 발명의 소-인간 키메릭 RSV는 예를 들면, HPIV1, HPIV2 도는 HPIV3 HN 또는 F 당단백질 또는 이의 면역원성 도메인(들) 또는 에피토프(들)을 코딩하는 1 이상의 유전자 또는 게놈 분절을 혼입하는 것에 의해 파라인플루엔자 바이러스 (PIV) 유래의 이형 항원 결정기(들)을 혼입하기 위한 벡터로 사용될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 예시적 실시태양은 부분적 또는 완전한 배경 소 또는 인간 RSV 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 그 내에 치환되어 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 제조하는, 인간 또는 소 RSV의 이형 유전자(들), 게놈 분절(들), 또는 단일 또는 복수 뉴클레오티드의 대체 또는 치환을 특징으로 한다. 본 발명의 한 측면에서, 인간-소 키메릭 RSV는 1 이상의 인간 RSV 아군(들) 또는 균주(들) 유래의 1 이상의 이형 유전자 또는 게놈 분절과 결합된 부분적 또는 완전한 소 배경 RSV 게놈 또는 안티게놈을 혼입한다. 별법으로, 인간-소 키메릭 RSV는 1 이상의 소 RSV 유래의 이형 유전자 또는 게놈 분절과 결합된 부분적 또는 완전한 인간 배경 RSV 게놈 또는 안티게놈을 혼입할 수 있다. 배경 게놈 또는 안티게놈으로 이형 삽입 또는 첨가되도록 사용하기 위해 선택된 유전자 및 게놈 분절은 RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 단백질을 코딩하는 모든 야생형 또는 돌연변이체 유전자 또는 게놈 분절, 또는 이의 일부 또는 모든 추가 게놈 분절을 포함한다. 바람직하게는, 이형 인간 유전자(들)은 RSV F, G 또는 SH 당단백질을 코딩하여 요망되는 면역원성 효과를 제공한다. 한 예시적인 실시태양에서, 인간 RSV 당단백질 유전자 F, SH 및(또는) G 1 이상이 부분적 또는 완전한 소 게놈 또는 안티게놈으로 첨가 또는 그 내에 치환되어 감수성 숙주에서 항-인간 RSV 면역 반응을 유발하는 약독화된 감염성 인간-소 키메라를 생성한다. 별법으로, 인간-소 키메릭 RSV는 인간 RSV F, G 또는 SH 당단백질의 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토포를 코딩하는 1 이상의 게놈 분절(들)을 혼입할 수 있다. 이들 면역원성 단백질, 도메인 및 에피토프는 또한 면역화된 숙주에서 신규 면역 반응을 발생시킨다. 예를 들면, 인간 RSV 아군 또는 균주 유래의 1 이상의 면역원성 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)을 소 배경 게놈 또는 안티게놈에 첨가하거나 또는 그 내에 치환하는 것은 1 이상의 특이적 인간 RSV "공여체" 아군 또는 균주에 대해 직접 면역 반응을 발생시킬 수 있는 재조합 키메릭 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생성하는 반면, 소 골격은 백신 개발에 대한 유용한 후보물인 키메라를 제조하는 약독화된 표현형을 수여한다. 따라서, 하나의 RSV 균주 또는 아군 유래의 이형 공여체 유전자 또는 게놈 분절은 공여체 유전자 또는 게놈 분절에 대한 배경으로 작용하는 수용체 RSV 게놈 또는 안티게놈과 결합하거나 또는 그 내에 치환된다. 수용체 게놈 또는 안티게놈은 상이한 바이러스의 1 이상의 항원 결정기를 코딩하는 이형 유전자 또는 게놈 분절을 가져오고 발현하기 위한 "벡터"로 작용하여 신규 구조 및(또는) 표현형, 특히 면역원성 특성을 나타내는 키메릭 RSV를 생성할 수 있다. 별법으로, 선택된 배경 RSV 내의 이형 유전자 또는 게놈 분절의 첨가 또는 치환은 비변형 수용체 및(또는) 공여체의 상응하 는 표현형과 비교하여 약독화, 성장 변화 또는 다른 요망되는 표현형 변화를 가져온다.
키메릭 RSV를 제조하기 위하여 이형 면역원성 단백질, 도메인 및 에피토프를 도입하는 것은 면역화된 숙주에서 신규 면역 반응을 일으키는데 특히 유용한다. 상이한 RSV 아군 또는 균주의 수용체 게놈 또는 안티게놈 내의 1개의 공여체 RSV 아군 또는 균주 유래의 면역원성 유전자 또는 게놈 분절의 첨가 또는 치환은 공여체 아군 또는 균주, 수용체 아군 또는 균주에 대하여, 또는 공여체 및 수용체 아군 또는 균주 모두에 대하여 직접 면역 반응을 일으킬 수 있다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 인간-소 키메릭 RSV는 또한 상이한 RSV의 엑토도메인에 융합된 1개의 RSV에 특이적인 세포질 테일 및(또는) 막통과 도메인을 갖는 키메릭 단백질 (예를 들면, 면역원성 당단백질)을 발현하는 구성으로 하여 예를 들면, 인간-소 융합 단백질 또는 2 개의 상이한 인간 RSV 아군 또는 균주 유래의 도메인을 혼입한 융합 단백질을 제공할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈은 인간 및 소 모두의 당단백질 도메인 또는 면역원성 에피토프를 갖는 재조합 바이러스 또는 서브바이러스 입자에서 키메릭 당단백질을 코딩한다. 예를 들면, 인간 RSV F, SH 또는 G 당단백질로부터의 당단백질 엑토도메인을 코딩하는 이형 게놈 분절은 상응하는 소 F, SH 또는 G 당단백질 세포질 및 엔도 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (즉, 게놈 분절)과 결합되어 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다.
한 실시태양에서, 백신 제제에 유용한 인간-소 키메릭 RSV는 편리하게 변형 되어 순환 바이러스에 항원 드리프트를 수용할 수 있다. 전형적으로 변형은 G 및(또는) F 단백질에 존재할 수 있다. 1개의 RSV 균주 유래, 특히 그 면역원성 영역을 코딩하는 전체 G 또는 F 유전자, 또는 게놈 분절은 다수의 항원 형태를 대표하도록, 상이한 RSV 균주 또는 아군의 수용체 클론 중의 상응하는 영역의 대체에 의하여, 또는 유전자의 1 이상의 카피를 첨가하는 것에 의해 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈 cDNA로 혼입된다. 이어서, 변형된 RSV로부터 제조되는 후손 바이러스는 드러난 RSV 균주에 대한 예방접종 프로토콜에 사용될 수 있다.
본 발명의 여러 추가 실시태양은 목적하는 공여체 유전자의 일부만을 수용체 게놈 또는 안티게놈으로 첨가 또는 치환하는 것을 포함한다. 통상적으로, 시스-작용 조절 요소 및 유전자간 서열과 같은 비코딩 뉴클레오티드는 공여체 유전자 코딩 영역으로 전달되는 것을 요하지 않는다. 따라서, 특정 유전자의 코딩 서열 (예를 들면, 부분적 또는 완전한 오픈 리딩 프레임 (ORF))는 공여체 서열과 비교하여 대응 유전자 또는 상이한 유전자의 이형 프로모터 (예를 들면, 배경 게놈 또는 안티게놈에 존재하는 프로모터)의 조절하에 부분적 또는 완전한 배경 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 치환될 수 있다. 다양한 추가 게놈 분절이 키메릭 게놈 또는 안티게놈 내에 함유되기 위한 유용한 공여체 폴리뉴클레오티드를 제공하여 신규하고 유용한 성질을 갖는 키메릭 RSV를 발현한다. 예를 들면, 이형 게놈 분절은 인간 또는 소 RSV 유래의 선택된 단백질의 당단백질 세포질 테일 영역, 막통과 도메인 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 영역, 결합 부위 또는 결합 부위를 포함하는 영역, 활성 부위 또는 활성 부위를 포함하는 영역 부분 또는 모두를 코딩할 수 있 다. 이들 및 다른 게놈 분절은 대응 게놈 분절에 대하여 완전한 배경 게놈 또는 안티게놈 또는 그 중 치환된 것에 첨가되어 신규 키메릭 RSV 재조합체를 얻을 수 있다. 어떤 재조합체는 키메릭 단백질, 예를 들면 다른 RSV의 엑토도메인에 융합된 1개의 RSV의 세포질 테일 및(또는) 막통과 도메인을 갖는 단백질을 발현할 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 인간-소 키메릭 RSV는 부분적 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 유전자 또는 게놈 분절을 이형 유전자 또는 게놈 분절로 치환하는 것에 의해 구성된다. 별법으로, 이형 유전자 또는 게놈 분절은 완전한 (또는 다른 유전자 또는 게놈 분절이 결손된다면, 부분적) RSV 배경 게놈 또는 안티게놈과 함께 과잉 유전자 또는 게놈 분절로 첨가될 수 있다. 이형 유전자 또는 게놈 분절은 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 오픈 리딩 프레임을 혼란시키지 않도록 부분적 또는 완전한 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 유전자간 위치에 첨가될 수 있다.
이형 유전자 또는 게놈 분절은 대응 유전자 또는 게놈 분절이 이에 의해 대체되거나 교환되는 (예를 들면, 더욱 프로모터에서 먼 위치로), 부분적 또는 완전한 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 분절의 야생형 유전자 순서 위치에 상응하는 위치에 첨가 또는 치환될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 이형 유전자 또는 게놈 분절은 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 분절의 야생형 유전자 순서 위치와 비교하여 더욱 프로모터에 인접하거나, 프로모터에서 먼 위치에 첨가 또는 치환되고, 이는 각각 이형 유전자 또는 게노 ㅁ 분절의 발현을 증강 또는 감소시킨다.
유전자 순서와 관련하여, 다수의 상기 삽입된 참고문헌들은 RSV 및 다른 바이러스에서의 천연 발생 순서의 변형에 초점을 맞추었다. 예를 들면, RSV에서 NS1, NS2, SH 및 G 유전자는 개별적으로 결손되고, NS1 및 NS2 유전자는 함께 결손되어, 각 하류 유전자의 위치를 바이러스 프로모터에 대하여 이동시킨다. 예를 들면, NS1 및 NS2가 함께 결손될 때, N은 위치3 에서 위치1로, P는 위치4에서 위치 2로 등으로 이동된다. 별법으로, 유전자 순서 내의 모든 다른 유전자의 결손은 단지 더 하류에 위치하는 유전자만의 위치에 영향 (프로모터에 대하여)줄 수 있다. 예를 들면, SH는 야생형 바이러스에서 위치 6을 점유하고, 그 결손은 위치 5의 M (또는 모든 다른 상류 유전자)에 영향을 주지않으나 G를 프로모터에 대하여 위치7에서 6으로 이동시킨다. 유전자 결손이 또한 생물학적으로 유도된 돌연변이 바이러스에서 (드물게) 발생할 수 있음을 주목하여야 한다. 예를 들면, 세포 배양에서 광범위하게 배양되는 아군 B RSV는 자발적으로 SH 및 G 유전자가 결손된다 (Karron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13961-13966, 1997; 본원에 참고문헌으로 삽입됨). "상류" 및 "하류"는 각각 프로모터에 인접한 방향 및 프로모터에서 먼 방향을 지칭함을 주목 (프로모터는 음성 센스 게놈 RNA의 3' 리더 말단에 있음).
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV의 유전자 순서 이동 변형 (즉, 재조합 바이러스 게놈에서 1 이상의 유전자를 더욱 프로모터에 인접하거나, 프로모터에서 먼 위치로 움직이는 위치 변형)은 생물학적 성질이 변경된 바이러스가 생기게 한다. 예를 들면, NS1, NS2, SH, G, NS1 및 NS2가 함께, 또는 SH 및 G가 함께 결여된 RSV는 시험관내, 생체내 또는 이들 모두에서 약독화되는 것으로 나타났다. 이러한 표현형은 일차적으로 특정 바이러스 단백질의 발현 손실로 인한 것인 듯 하다. 그러나, 변경된 유전자 지도 또한 관찰되는 표현형에 기여하는 듯 하다. 이 효과는 아마 유전자 결손으로 인하고, 유전자 순서 및 가능한 게놈 크기 변화를 일으키는 전사, 복제 또는 이들 모두의 효율의 증가로 인해, 일부 세포 유형에서 야생형보다 더욱 효과적으로 성장되는 SH-결손 바이러스에 의해 잘 설명된다. NS1 및(또는) NS2가 결손된 RSV와 같은 다른 바이러스에서, 유전자 순서의 변화로 인해 발생할 수 있는 성장 변경을 RSV 단백질(들)의 발현 손실로 인한 더욱 우세한 표현형에 의해 가려진다.
생 약독화 백신으로서의 그 성질을 개선하기 위한 노력으로 RSV의 유전자 순서를 변화하기 위한 다른 추가 변화가 도입되었다 (예를 들면, 본원에 참고문헌으로 삽입된 2000년 6월 23일 크렘플(Krempl) 등이 출원하고, 대리인의 참조 번호 제015280-424000US로 확인되는 "프로모터에 근접한 유전자로부터의 보호적 항원을 발현하는 호흡기 신시티움 바이러스 백신(RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES EXPRESSING PROTECTIVE ANTIGENS FROM PROMOTOR-PROXIMAL GENES)"를 표제로하는 미국 가출원 참조). 특히, G 및 F 유전자는 단일적으로 및 직렬하여 야생형 유저자 순서에 비하여 더욱 프로모터에 인접한 위치로 이동되었다. 이들 2개의 단백질은 통상적으로 RSV 유전자 순서 (NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)에서 위치 7 (G) 및 8 (F)를 차지한다. 성공적인 회수 가능성을 증가시키기 위하여, SH 유전자가 결손된 RSV 버전에서 조작을 수행하였다 (Whitehead et al., J. Virol., 73:3438-42 (1999), 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 이는 이 바이러스가 시험관내에서 더 큰 플라크를 만드므로 회수를 촉진한다 (Bukreyev et al., J. Virol., 71:8973-82 (1997), 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 이어서, G 및 F는 개별적으로 위치 1로 이동되었거나, 또는 함께 각각 위치1 및 2로 이동되었다.
놀랍게도, 재조합 RSV는 G 또는 F가 위치1로 이동되었거나, G 및 F가 각각 위치 1 및 2로 이동된 것에서 쉽게 회수되었다. 이러한 결과는 단지 2개의 위치에 의한 단일 VSV 당단백질 유전자의 이동이 바이러스 성장에 매우 해로웠던 VSV를 사용한 이전의 연구와 크게 달랐다. 이들 변화된 바이러스를 회수하는 능력은 또한 RSV가 불충분하게 복제되고, RSV가 복합 유전자 위치를 가지며, 당단백질 유전자의 이동이 많은 숫자의 위치 변화를 포함하기 때문에 놀라운 것이었다. 실제로, 재배열된 RSV는 적어도 야생형 유전자 순서를 갖는 직전 부모 만큼 성장하였다. 상기한 바와 같이, 야생형 바이러스가 세포 배양에서 불충분하게 성장하고, 시험관내 복제의 추가 감소는 백신 제제를 실시불가능하게 할 수 있으므로, 이는 RSV에서 특히 중요하다. 따라서, NS1-NS2-N-P-M 단백질 모두가 성장 적합성의 심각한 감소 없이 프로모터에 대하여 1 또는 2 위치에 의해 나타날 수 있다. 또한, G 당단백질의 발현 검사는 그 부모형 바이러스의 경우보다 수배 까지 증가되었음을 나타내었다. 이는 최초 위치에 G 및(또는) F를 포함하는 백신 바이러스가 다른 바이러스 단백질과 비교하여 더 큰 몰량의 방어 항원을 발현하고, 따라서 요망되는 백신 성질을 갖는 바이러스를 나타냄을 보였다.
유전자 순서의 유사하게 광범위한 변형은 또한 NS 유전자가 그 자신에서 결 손되거나, 또는 NS1 및 NS2 유전자가 함께 결손된 2개의 크게 약독화된 백신 후보물로 달성되었다. 이들 2 백신 후보물에서, G 및 F 당단백질은 함께 각각 위치 1 및 2로 이동되었고, G, F 및 SH 당단백질은 최초 하류 위치로부터 결손되었다. 따라서, 회수된 바이러스 G1F2ΔNS2ΔSH 및 G1F2/ΔNS1ΔNS2ΔSH는 G 및 F 유전자의 이동 외에도 각각 결손된 2개 및 3개 유전자를 갖는다. 포함되는 변화의 정도를 설명하기 위하여, 야생형 RSV (NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L 및 G1F2/ΔNS2ΔSH 바이러스 (G-F-NS1-N-P-M-M2-L) 또는 ΔNS1ΔNS2ΔSH (G-F-N-P-M-M2-L)의 유전자 위치가 비교될 수 있다. 이는 프로모터에 비하여 유전자 대부분 또는 모두의 위치가 변화되었음을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 이들 고도로 약독화된 유도체는 세포 배양에서 성장하는 능력을 유지한다.
하기 실시예는 HRSV G 및 F 유전자가 재조합 소 RSV (rBRSV) 배경 내로 치환된 감염성 재조합 인간-소 키메릭 RSV (rBRSV/HRSV)의 예시적 구성을 제공한다. 얻어진 인간-소 키메라는 HRSV의 2개 유전자 (즉, G 및 F) 및 BRSV 유래의 8개 유전자 (즉, NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 및 L)을 포함한다.
상기 기초적 치환된 당단백질 구성 이외에, HRSV G 및 F 유전자는 rBRSV 골격에서 더욱 프로모터에 인접한 위치로, 즉 RSV 게놈에서 F 및 G 유전자의 야생형 순서 위치에 대하여 이동된다. 더욱 구체적으로, F 및 G 유전자는 프로모터에 대하여 통상의 위치, 즉 각각 유전자 위치 7 및 8로부터 각각 위치 1 및 2로 이동되었다.
얻은 키메릭 재조합 바이러스 rBRSV/A2-G1F2는 wt HRSV의 것과 면역형광에 의해 검출하여 F 및 G 단백질 발현의 수준이 매우 유사하였고, 이 결과는 유전자의 프로모터 인접 이동에 의한 G 및 F 당단백질의 발현 증가와 일치한다. 본 rBRSV/A2-G1F2 바이러스는 그 유전적 배경에서 BRSV 유전자의 동일한 배열을 지니므로, 상기 강력한 숙주 범위 제한 표현형을 공유하는 듯 하다. 이와 관련하여, 생체내 2개의 방어 항원의 발현 증가는 이 바이러스의 면역원성을 증가시켜 더욱 바람직한 백신 성질을 생성할 수 있다.
키메릭 RSV를 구성하기 위하여, 이형 유전자는 전체 또는 부분적으로 배경 게놈 또는 안티게놈으로 첨가 또는 치환될 수 있다. 치환에 의해 생성된 키메라의 경우에, 인간 또는 소 RSV 유래의 단백질 또는 단백질 영역 (예를 들면, 세포질 테일, 막통과 도메인 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 영역, 결합 부위 또는 영역, 활성 부위 또는 활성 부위를 포함하는 영역)을 코딩하는 선택된 유전자 또는 게놈 분절은 배경 RSV 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 유전자 또는 게놈 분절을 치환하여 각각의 야생형 (또는 돌연변이체 부모형) RSV 균주 1개 또는 모두와 비교하여 요망되는 표현형 변화를 갖는 신규 재조합체를 생성한다. 본원에서 사용된, "대응" 유전자 또는 게놈 분절은 동형 또는 등가 단백질 또는 단백질 도메인, 에피토프 또는 아미노산 잔기를 코딩하거나, 상이한 RSV 아군 또는 균주 중의 종 및 대립 유전자 변이체를 포함하나 이에 제한되지 않을 수 있는 동형 또는 등가 시스-작용 신호를 나타내는 상이한 RSV 원천으로부터의 대응 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
인간 및 소 균주는 동일 유전자 지도를 가지며, 실질적으로 동일한 배열의 mRNA 및 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 각각은 NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2-1, M2-2 및 L 단백질을 코딩하는 ORFs를 갖는다. 선택된 소 및 인간 단백질 간의 퍼센트 아미노산 동일성은 NS1 (69％), NS2 (84％), N (93％), P (81％), M (89％), SH (38％), G (30％), F (18％), M2-1 (80％), L (77％)이다. 따라서, 일반적으로 2 바이러스의 유전자 및 게놈 분절 간에 명확히 인식가능한 일치가 있으며, 치환, 전달 및 삽입 설계는 수월하다.
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV에 사용되기 위한 대응 유전자 및 게놈 분절은 일정 범위의 크기 및 서열 변이를 갖는 교대 폴리뉴클레오티드의 집합을 포함한다. 이와 관련하여 유용한 게놈 분절은 단백질의 작은 기능적 도메인 (예를 들면, 에피토프 부위)를 코딩하는 게놈 분절의 경우 약 15-35 뉴클레오티드 내지 더 큰 도메인 또는 단백질 영역을 코딩하는 게놈 분절에 대한 약 50, 75, 100, 200-500 및 500-1,500 이상의 뉴클레오티드의 범위이다. 대응 유전자 및 게놈 분절의 선택은 대상 대응물 간의 게놈에서 서열 동일성 또는 선형 상응성에 의존한다. 이와 관련하여, 선택된 인간 또는 소 폴리뉴클레오티드 "참고 서열"은 공여체 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈 중에 존재하는 서열 또는 그 일부로 정의된다. 이 참고 서열은 정의된 서열로 사용되어 대응 이형 서열과의 서열 비교에 대한 이론적 기초를 제공한다. 예를 들면, 참고 서열은 cDNA 또는 유전자의 분절, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열로 정의될 수 있다. 일반적으로, 대응 유전자 및 게놈 분절을 정의하는데 사용되는 참고 서열은 길이가 20 뉴클레오티드 이상, 종종 길이가 25 뉴클레오티드 이상, 흔히 길이가 50 뉴클레오티드 이상이다. 2 폴리뉴클레오티드가 각각 (1) 2 뉴클레오티드 간에 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)를 포함할 수 있고, (2) 2 폴리뉴클레오티드 간에 디버전트한 서열을 더 포함할 수 있으므로, 2 (이상) 폴리뉴클레오티드 간의 서열 비교는 통상적으로 "비교 윈도" 에 대하여 2 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하여 수행되어 국소적 영역의 서열 유사성을 확인 및 비교한다. 본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 폴리뉴클레오티드 서열이 20 이상의 연속 뉴클레오티드의 참고 서열과 비교될 수 있고, 비교 윈도우에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부가 2 서열의 최적 정렬에 대하여 (첨가 또는 결손을 포함하지 않는) 참고 서열과 비교하여 20 퍼센트 이하의 첨가 또는 결손 (즉, 갭)을 포함할 수 있는 20 이상의 연속적 뉴클레오티드 위치의 개념적 분절을 지칭한다. 비교 윈도우를 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 국소적 상동성 알고리즘에 의해서 (Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981), 상동성 정렬 알고리즘에 의해서 (Needleman & Wunsh, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), 유사법 검색에 의해서 (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1998) (각각은 본원에 참고문헌으로 삽입됨), 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해서 (본원에 참고로 삽입된 Wisconsin Genetic Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 검열에 의해서 수행될 수 있으며, 다양한 방법에 의해 생성되는 최적 정렬 (즉, 비교 윈도우에 의해서 가장 높은 퍼센트의 서열 유사성이 얻어지는 것)이 선택된다. "서열 동일성"이라는 용어는 2 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 윈도우에 의해 동일 (즉, 뉴클레오티드-뉴클레오티드 기초 상에서)함을 의미한다. " 서열 동일성의 퍼센트"라는 용어는 비교 윈도우에 대하여 2개의 최적 정렬 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예를 들면, A, T, C, G, U 또는 I)가 양 서열에서 발생하는 위치의 수를 확인하여 일치되는 위치의 수를 산출하고, 일치되는 위치의 수를 비교 윈도우의 총 위치 수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 산출하는 것에 의해 계산된다.
소 및 인간 RSV 간의 상응하는 잔기 위치는 디버전트하거나, 동일할 수 있거나, 보존적 아미노산 치환에 의해 달라질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 보존적 군은 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군은 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 20 개의 본존적 아미노산의 입체이성질체 (예를 들면, D-아미노산), α,α-이치환된 아미노산과 같은 비천연 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산 및 다른 비통상적인 아미노산 또한 본 발명의 폴리펩티드에 적당한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 4-히드록시프롤린,
Figure 112002000618146-pct00002
-카르복시글루타메이트,
Figure 112002000618146-pct00003
-N,N,N-트리메틸리신,
Figure 112002000618146-pct00004
-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티 딘, 5-히드록시리신,
Figure 112002000618146-pct00005
-N-메틸아르기닌 및 다른 아미노 및 이미노산 (예를 들면, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 게다가, 아미노산은 글리코실화, 포스포릴화 등에 의해 변형될 수 있다.
본 발명은 cDNA에 기초한 방법을 사용하여 다양한 재조합 인간-소 키메릭 RSV 바이러스 및 서브바이러스 입자를 구성한다. 이들 재조합 RSV는 백신 물질로 사용을 위한 약독화 및 면역원성의 개선된 특성을 제공한다. 인간-소 키메릭 RSV 내로 엔지니어링한 요망되는 표현형 변화는 배양에서 또는 선택된 숙주 환경에서의 약독화, 약독화 표현형으로부터의 복귀변이에 대한 내성, 증강된 면역원성 특성 (예를 들면, 유발되는 면역 반응의 증강 또는 감소에 의해 확인되는 것과 같은 것), 선택된 바이러스 생성물의 전사 및(또는) 해독의 상향조절 또는 하향조절 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 약독화된 인간-소 키메릭 RSV는 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 약독화 표현형을 규정하는 1 이상의 약독화 돌연변이를 도입하는 것에 의해 더 변형되어 제조된다. 이들 돌연변이는 드 노보로 발생되고, 상기 삽입된 참고문헌에 기술된 바와 같이 합리적인 설계의 돌연변이발생 전략에 다라서 약독화 효과를 시험할 수 있다. 별법으로, 약독화 돌연변이는 생물학적으로 유도된 RSV에서 확인되고, 그 후 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV 내로 혼입될 수 있다.
인간-소 키메릭 RSV 백신 균주 내로 혼입되기 위한 생물학적으로 유도된 RSV의 약독화 돌연변이는 천연적으로 발생할 수 있거나, 또는 공지된 돌연변이발생 과정에 의해 야생형 RSV 균주로 도입될 수 있다. 예를 들면, 불완전하게 약독화된 부모 RSV 균주는 화학적 돌연변이원을 첨가하는 세포 배양에서의 바이러스 성장 도중에 화학적 돌연변이유발에 의해서, 성장 제한 돌연변이를 도입하기 위한 하부최적(suboptimal) 온도에서 계대 배양시키는 바이러스의 선택에 의해서, 또는 세포 배양에서 작은 플라크 (sp)를 생성하는 돌연변이된 바이러스의 선택에 의하여 제조될 수 있다 (본원에 참고문헌으로 삽입된 1999년 7월 13일 공고된 미국 특허 제5,922,326호 및 본원에 일반적으로 개시된 바와 같음).
"생물학적으로 유도된 RSV"는 재조합적 방법에 의해 제조된 것 외의 모든 RSV를 의미한다. 따라서, 생물학적으로 유도된 RSV는 예를 들면, 야생형 게놈 서열을 갖는 천연 발생 RSV 및 참고 야생형 RSV 서열로부터의 게놈 변이를 갖는 RSV, 예를 들면 약독화된 표현형을 규정하는 돌연변이를 갖는 RSV를 포함하는 모든 아군 및 균주의 천연 발생 RSV를 포함한다. 마찬가지로, 생물학적으로 유도된 RSV는 그 중에서도 특히 인공적 돌연변이발생 및 선택 과정에 의해 부모 RSV 균주로부터 유도되는 RSV 돌연변이체를 포함한다.
생물학적으로 유도된 균주로부터 만족하게 약독화된 RSV를 제조하기 위해서, 공지된 ts-1 또는 ts-1NG 또는 RSV 아군 A의 cpRSV 돌연변이체, 또는 이의 유도체 또는 서브클론과 같은 불충분하게 또는 부분적으로 약독화된 부모 균주내로 돌연변이가 바람직하게 도입된다. 이들 및 다른 부분적으로 약독화된 균주를 사용하여, 예를 들면 포유류 숙주에서 요망되는 수준의 복제 제한까지 균주를 더 약독화시키는반면, 백신 접종자에 보호를 제공할만큼 충분한 면역원성을 유지하는 추가 돌연변이를 발생시킬 수 있다.
아군 A 또는 B의 부분적으로 약독화된 돌연변이체는 공지된 방법의 허용가능한 세포 기질에서 야생형 바이러스의 생물학적 클로닝 및 개발 (예를 들면, 이의 저온 계대 배양 돌연변이체), 바이러스를 화학적 돌연변이유발시켜 ts 돌연변이체를 제조하기 또는 작은 플라크 또는 유사한 표현형 돌연변이체의 선택 (예를 들면, 본원에 참고문헌으로 삽입된 머피 등의 국제 특허 공개 제93/21310호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 아군 B의 바이러스에 대하여, 예시적인 부분적으로 약독화된 부모 바이러스는 아군 B의 B1 균주의 돌연변이체의 cp23이다.
다양한 공지된 선택 기술이 결합되어 비-약독화된 아군 A 또는 B 균주로부터 부분적으로 약독화된 돌연변이체를 제조할 수 있고, 이는 본원에 기술된 바와 같이 추가 유도화에 유용하다. 또한, 약독화된 표현형을 규정하는 돌연변이는 불충분하게 약독화된 아군 A 또는 B 바이러스에서 개별적으로 또는 함께 도입되어 요망되는 수준의 약독화 및 면역원성을 백신 접종자에게 부여하는 다중 한정 약독화 돌연변이를 갖는 백신 바이러스를 제조할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 충분히 약독화된 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이체의 제조는 다수의 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 과정 한가지는 부분적으로 약독화된 바이러스를 점전직으로 낮은 약독화 온도에서 세포 배양에서 계대 배양하는 것을 포함한다. 예를 들면, 야생형 바이러스가 통상적으로 약 34-37℃에서 배양되는 반면, 부분적으로 약독화된 돌연변이체는 하부최적 온도 (예를 들면, 20-26℃)에서 세포 배양 (예를 들면, 일차 소 신장 세포)에서 계대 배양하는 것에 의해 제조된다. 따라서, cp 돌연변이체 또는 다른 부분적으로 약독화된 균주 (예를 들면, ts-1 또는 spRSV)는 약 20-24℃, 바람직하게는 20-22℃의 온도까지 하강되어서, MRC-5 또는 Vero 세포에서 계대 배양하는 것에 의해 더 낮은 온도에서 효과적으로 성장되도록 적응된다. 저온 계대 배양 도중의 이러한 돌연변이체 RSV의 선택은 부분적으로 약독화된 부모형과 비교하여 유도체 균주에서 모든 잔류 독성을 실질적으로 감소시킨다.
별법으로, 부분적으로 약독화된 부모 바이러스를 예를 들면 ts 돌연변이를 도입하기 위한 화학적 돌연변이유발시키는 것에 의해서, 또는 이미 ts가 있는 바이러스의 경우에는 약독화된 유도체의 ts 표현형에 증가된 약독화 및(또는) 안정도를 부여하기에 충분한 추가 ts 돌연변이에 의해 생물학적으로 유도된 RSV로 특이적 돌연변이를 도입할 수 있다. ts 돌연변이를 RSV로 도입하는 방법은 약 10-3 내지 10-5 M, 바람직하게는 약 10-4 M 농도의 5-플루오로우리딘 또는 5-플루오로우라실과 같은 돌연변이원의 존재하에서의 바이러스 복제, 바이러스를 예를 들면, 문헌[Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421, 1969 및 Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100, 1978)에 기술된 일반적 과정에 따라서 약 100 ㎍/ml의 농도로 니트로소구아니딘에 노출, 또는 특이적 ts 돌연변이를 유전적 도입하는 것을 포함한다. 다른 화학적 돌연변이원 또한 사용될 수 있다. 약독화는 거의 모든 RSV 유전자 중의 ts 돌연변이로부터 유래할 수 있지만, 이러한 목적으로 특히 수용가능한 표적은 중합효소 (L) 유전자임을 발견하였다.
본 발명에 사용하기 위한 예시적 약독화된 RSV에서의 복제의 온도 민감성 수 준은 다수의 제한적 온도에서의 경우와 허용적 온도에서의 복제를 비교하는 것에 의해 결정된다. 허용적 온도에서의 복제와 비교하여 100 배 이상 바이러스의 복제를 감소시키는 가장 낮은 온도는 셧오프(shutoff) 온도라 지칭된다. 실험 동물 및 인간에서, RSV의 복제 및 독성은 모두 돌연변이체의 셧오프 온도와 관련이 있다. 39℃의 셧오프 온도를 갖는 돌연변이체의 복제는 적당히 제한되는 반면, 38℃의 셧오프를 갖는 돌연변이체는 상당히 적게 복제되고, 질병 증상은 상기도에 주로 한정된다. 35℃ 내지 37℃의 셧오프 온도를 갖는 바이러스는 전형적으로 침팬지에서 충분히 약독화되고, 인간에서 실질적으로 약독화될 수 있다. 따라서, ts인 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV 및 약독화된 생물학적으로 유도된 돌연변이체는 약 35℃ 내지 39℃, 바람직하게는 35℃ 내지 38℃의 셧오프 온도를 가질 수 있다. ts 돌연변이를 부분적으로 약독화된 균주에 첨가하는 것은 본 발명의 백신 조성물에 유용한 다중 약독화 바이러스를 생성한다.
비강내 투여용 후보 백신인 다수의 약독화된 RSV 균주는 화학적 돌연변이유발을 다수회 사용하여 개발하여 저온 계대 배양 도중에 이미 약독화된 바이러스 내로 다중 돌연변이를 도입하였다 (예를 들면, Connors et al., Virology 208:478-484, 1995; Crowe et al., Vaccine 12:691-699, 1994; 및 Crowe et al., Vaccine 12:783-790, 1994, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 설치류, 침팬지, 성인 및 소아에서의 평가는 어떠한 이들 후보 백신 균주는 상대적으로 유전적으로 안정하며, 매우 면역원성이고, 만족스럽게 약독화될 수 있음을 보여준다. 이들 약독화 바이러스 일부의 뉴클레오티드 서열 분석은 증가된 약독화의 각 수준이 구체적 뉴클레오 티드 및 아미노산 치환과 연관되어 있음을 보여준다. 상기 삽입된 참고문헌은 또한 감염성 RSV 클론의 게놈 또는 안티게놈 내로 개별적으로 및 다양한 조합으로 돌연변이를 도입하는 것에 의해 표현형 차이의 원인인 것과 사일런트(silent) 우연적 돌연변이를 통상적으로 어떻게 구분하는지를 개시한다. 부모형 및 유도체 바이러스의 표현형 특성의 평가와 결합된 상기 과정은 약독화, 온도 민감성, 냉각 적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한 등과 같은 이러한 요망되는 특성의 원인인 돌연변이를 확인한다.
따라서, 확인된 돌연변이는 "메뉴"로 편집되고, 이어서 인간-소 키메릭 RSV 백신 바이러스를 적합한 수준의 약독화, 면역원성, 약독화된 표현형으로부터의 복귀변이에 대한 유전적 저항 등으로 보정하기 위해 요망되게는 단일적으로 또는 함께 도입된다. 바람직하게는, 본 발명의 키메릭 RSV는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV 균주의 패널 내의 공지된 돌연변이의 군으로 규정될 수 있는 이러한 메뉴로부터 확인되는 1 이상, 더욱 바람직하게는 2 이상의 약독화 돌연변이의 도입에 의해 약독화된다. 본원에 기술되는 돌연변이체 RSV 균주의 바람직한 패널은 저온 계대 배양 (cp) 및(또는) 온도 민감성 (ts) 돌연변이체, 에를 들면, cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579) (이들 각각은 미국 20110-2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 블러바드의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 부다페스트 조약의 규정하에 기탁되 고, 상기 확인된 수탁 번호를 부여받았다)로 지정된 RSV 돌연변이체를 포함하는 패널이다.
생물학적으로 유도되는 돌연변이체의 이러한 예시적 패널로부터, 백신용의 재조합 인간-소 키메릭 RSV에서 약독화 수준을 보정하기 위한 패널 내의 모든 다른 돌연변이(들)과 각각이 결합될 수 있는 많은 메뉴의 약독화 돌연변이가 제공된다. 추가 돌연변이는 예를 들면, 작은 플라크 (sp), 냉각 적응 (ca) 또는 숙주 범위 제한 (hr) 돌연변이체 균주에서 확인되는 바와 같은 비-ts 및 비-cp 약독화 돌연변이를 갖는 RSV 로부터 유도될 수 있다. 약독화 돌연변이는 공여체 또는 수용체 RSV 유전자의 코딩 부분, 또는 시스-조절 서열과 같은 비코딩 영역에서 선택될 수 있다. 예를 들면, 약독화 돌연변이는 뉴클레오티드 7605에서의 M2 유전자 개시 서열 중의 단일 또는 다수 염기 치환에 의해 예시되는 바와 같은 유전자 개시 서열에서의 단일 또는 다수 염기 변화를 포함한다.
백신용으로 설계되고 선택된 인간-소 키메릭 RSV는 종종 2 이상, 때로는 3 이상의 약독화 돌연변이를 가져서 광범위한 임상적 용도에 대해 만족스러운 수준의 약독화를 달성한다. 한 실시태양에서, 1 이상의 약독화 돌연변이가 RSV 중합효소 유전자 (공여체 또는 수용체 유전자)에서 발생하고, 온도 민감성 (ts) 표현형을 규정하는 중합효소 단배질에서의 아미노산 변화를 규정하는 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 이와 관련된 예시적 인간-소 키메릭 RSV는 Phe521을 Leu로, Gln831을 Leu로, Met1169를 Val로, Tyr1321을 Asn으로 변화시키는 것에 의해 예시되는 바와 같은 아미노산 Asn43, Phe521, Gln831, Met1169 또는 Tyr1321에서 아미노산 변화를 일으키는 큰 중합효소 유전자 중의 1 이상의 뉴클레오티드 치환을 혼입한다. 별법으로 또는 추가적으로, 본 발명의 키메릭 RSV는 상이한 RSV 유전자 (예를 들면, M2 유전자) 중에 ts 돌연변이를 혼입할 수 있다. 바람직하게는, 2 이상의 뉴클레오티드 변화가 약독화 돌연변이를 규정하는 코돈 (예를 들면, ts 돌연변이를 규정하는 코돈) 중에 혼입되어, 약독화 표현형으로부터의 복귀변이의 가능성을 감소시킨다.
본 발명의 방법에 따르면, 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV 균주의 패널 내에 존재하는 약독화 돌연변이의 전체 보체 1 이상 및 그 이하를 혼입하는 인간-소 키메릭 RSV는 쉽게 구성되고, 특성화된다. 따라서, 돌연변이는 선택된 돌연변이의 패널, 예를 들면 cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)로부터의 임의의 조합으로 조립될 수 있다. 상기 방법에서, 키메릭 백신 후보물의 약독화는 혈청 음성 유아를 포함하여 1 이상의 군의 환자에 사용되기 위해 세밀하게 보정될 수 있다.
더욱 상세한 실시태양에서, 백신용 인간-소 키메릭 RSV는 RSV 중합효소 유전자 L 중에 Asn43, Phe521, Gln831, Met1169 또는 Tyr1321에서 온도 민감성 및(또는) 약독화 아미노산 치환, 또는 유전자 M2의 유전자 개시 서열 중에 온도 민감성 뉴클레오티드 치환을 규정하는 약독화 돌연변이 1 이상 및 충분한 수 이하를 혼입한다. 별법으로 또는 추가적으로, 본원 청구항의 키메릭 RSV는 예를 들면, RSV N 유전자 중의 Val267, RSV F 유전자 웅의 Glu218 또는 Thr523, RSV 중합효소 유전자 L 중의 Cys319 또는 His1690에서 아미노산 치환을 규정하는 1 이상의 돌연변이와 같은 저온 계대 배양 약독화 RSV 유래의 돌연변이 배양 및 충분한 수 이하를 혼입한다.
다른 상세한 실시태양에서, 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV는 더 변형되어 (i) RSV 중합효소 유전자 L 중에 Gln831을 Leu로, 및 Tyr1321을 Asn으로의 온도 민감성 아미노산 치환을 규정하는 돌연변이의 패널; (ii) 유전자 M2의 유전자 개시 서열 중의 온도 민감성 뉴클레오티드 치환; (iii) RSV N 유전자 중의 Val267, 및 RSV 중합효소 유전자 L 중의 Cys319 Tyr 및 His1690 아미노산 치환을 규정하는 저온 계대 배양 RSV로부터 채택되는 돌연변이의 약독화 패널; 또는 (iv) RSV SH, NS1, NS2, G 및 M2-2 유전자의 1 이상의 발현의 결손 또는 제거로부터 선택되는 약독화 돌연변이를 혼입한다. 바람직하게는, 인간-소 키메릭 RSV의 이들 및 다른 예들은 동일 또는 상이한 생물학적으로 유도된 돌연변이 RSV 균주로부터 유도될 수 있는 생물학적으로 유도된 돌연변이 RSV로부터 채택되는 2 이상의 약독화 돌연변이를 혼입한다. 또한 바람직하게는, 이들 예시적 돌연변이는 돌연변이를 규정하는 코돈 중의 다수 뉴클레오티드 변화에 의해 안정화되는 약독화 돌연변이 중 1 이상을 갖는다.
상기 기술에 따르면, cDNA로부터 감염성 RSV를 제조하는 능력은 인간-소 키메릭 RSV 내에 구체적 엔지니어링된 변화의 도입을 허용한다. 특히, 감염성 재조합 RSV는 생물학적으로 유도된 약독화 RSV 균주 중에 구체적 돌연변이(들), 예를 들면 ts, ca, att 및 다른 표현형을 규정하는 돌연변이의 확인을 위해 이용된다. 따라서, 바람직한 돌연변이는 확인되고, 재조합 인간-소 키메릭 RSV 백신 균주로 도입된다. cDNA로부터 바이러스를 제조하는 능력은 이들 돌연변이를 개별적으로 또는 다양한 선택된 조합으로 전장 cDNA 클론으로 통상적으로 혼입가능하게 하여, 도입된 돌연변이를 포함하는 구해진 재조합 바이러스의 표현형이 쉽게 결정된다.
원하는 표현형 (예를 들면, cp 또는 ts 표현형)과 연관된 구체적 생물학적으로 유도된 돌연변이를 확인하고 감염성 키메릭 RSV 클론으로 혼입하는 것에 의하여, 본 발명은 확인된 돌연변이에, 또는 이에 매우 근접한 범위 내에 다른 위치 지향성 변형을 제공한다. 생물학적으로 유도된 RSV에서 제조되는 대부분의 약독화 돌연변이가 단일 뉴클레오티드 변화인 반면, 다른 "위치 지향성" 돌연변이는 또한 재조합 기술에 의해 생물학적으로 유도 또는 재조합 RSV로 혼입될 수 있다. 본원에서 사용된 위치 지향성 돌연변이는 1 내지 3개, 약 5-10 이하, 또는 그 이상의 변화된 뉴클레오티드 (야생형 rSV 서열로부터, 선택된 돌연변이 RSV 균주의 서열로부터, 또는 부모 재조합 RSV 클론으로부터 변화되어 돌연변이유발됨)의 삽입, 치환, 결손 또는 재배열을 포함한다. 이러한 위치 지향성 돌연변이는 선택된 생물학적으로 유도된 돌연변이의 영역에 또는 영역 내에 혼입될 수 있다. 별법으로, 돌연변이는 RSV 클론 내의 다양한 다른 환경, 예를 들면 단백질 활성 부위, 결합 부위, 면역원성 에피토프 등을 코딩하는 시스 작용 조절 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 또는 그 근방에 도입될 수 있다. 위치 지향성 RSV 돌연변이체는 전형적으로 요망되는 약독화 표현형을 유지한, 약독화와 연관되지 않은 변화된 표현형 특성, 예를 들면 면역원성의 증강 또는 확장, 및(또는) 성장 증가를 추가적으로 나타낼 수 있다. 요망되는 위치 지향성 돌연변이체의 추가 예는 약독화 돌연변이를 규정하는 코돈에서 추가 안정화 뉴클레오티드 돌연변이를 혼입하도록 설계된 재조합 RSV를 포함한다. 가능한 경우, 2 이상의 뉴클레오티드 치환이 부모형 돌연변이체 또는 재조합 RSV 클론에서의 약독화 아미노산 변화를 규정하는 코돈에 도입되어, 약독화된 표현형으로부터의 복귀변이에 유전적 저항성을 갖는 생물학적으로 유도되거나 재조합 RSV를 생성한다. 다른 실시태양에서, 위치 지향성 뉴클레오티드 치환, 첨가, 결손 또는 재배열은 상류 (N-말단 방향) 또는 하류 (C-말단 방향), 예를 들면 목표 뉴클레오티드 위치에 비하여 1 내지 3, 5-10 및 15 뉴클레오티드 이하, 또는 그 이상 5' 또는 3'에 도입되어 예를 들면 존재하는 시스 작용 조절 요소를 구성 또는 제거한다.
단일 및 다수 점 돌연변이 및 위치 지향성 돌연변이 이외에, 본원에 개시된 인간-소 키메릭 RSV에 대한 변화는 전체 유전자 또는 게놈 분절의 결손, 삽입, 치환 또는 재배열을 포함한다. 이들 돌연변이는 변화의 성질에 따라서 (즉, 작은 수의 염기는 변화되어 면역원성 에피토프를 삽입 또는 제거, 또는 작은 게놈 분절을 변화시키는 반면, 큰 블럭(들)의 염기는 유전자 또는 큰 게놈 분절이 첨가, 치환 , 결손 또는 재배열될 때 포함됨), 공여체 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈 중에 작은 수의 염기 (예를 들면, 15-30 염기, 35-50 염기 이하, 또는 그 이상), 큰 블럭의 뉴클레오티드 (예를 들면, 50-100, 100-300, 300-500, 500-1000 염기), 또는 거의 완전 또는 완전한 유전자 (예를 들면, 1000-1500 뉴클레오티드, 1500-2500 뉴클레오티드, 2500-5000 뉴클레오티드, 5000-6500 뉴클레오티드 이상)를 변화시킬 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 더 변형된 키메릭 RSV 클론에서 동일 또는 상이한 유전자를 포함하는 추가 유형의 돌연변이와 함께 생물학적으로 유도된 RSV (예를 들면, cp 및 ts 돌연변이)로부터 키메릭 RSV 클론 내로의 채택된 돌연변이의 보충을 제공한다. RSV는 10 개의 mRNAs 및 10 또는 11 단백질을 코딩한다. 이들 중 3 개는 막통과 표면 단백질, 즉 부착 G 단백질, 투과에 포함되는 융합 F 단백질, 및 작은 소수성 SH 단백질이다. G 및 F는 주요한 바이러스 중화 및 방어 항원이다. 4 개의 추가 단백질, 즉 RNA 결합 단백질 N, 인단백질 P, 큰 중합효소 단백질 L, 및 전사 신장 인자 M2 ORF1이 바이러스 뉴클레오캡시드와 연관되어 있다. M2 중의 2차 ORF인 M2-2 ORF는 중요한 RNA 조절 인자를 코딩한다. 매트릭스 M 단백질은 내부 비리온의 일부이고, 아마도 뉴클레오캡시드와 외피 간의 연관을 매개한다. 마지막으로, 미지의 비구조 단백질인 미지 기능의 NS1 및 NS2가 있다. 이들 단백질 각각은 발현 수준의 점에서 선택적으로 변화될 수 있거나, 전체 또는 부분적으로, 단독으로 또는 다른 요망되는 변형과 함께 첨가, 결손, 치환 또는 재배열되어 신규 백신 특성을 나타내는 인간-소 키메릭 RSV를 생성한다.
따라서, 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이체로부터 채택되는 약독화 돌연변이 이외에, 또는 이와 함께, 본 발명은 또한 감염성 RSV 클론의 재조합 엔지니어링에 기초하여 인간-소 키메릭 RSV의 표현형을 약독화 또는 달리 변형하는 일정 범위의 추가 방법을 제공한다. 다양한 변화가 감염성 클론으로 혼입되기 위하여 공여체 유전자 또는 게놈 분절 또는 배경 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리 뉴클레오티드 서열에서 만들어질 수 있다. 더욱 구체적으로, 키메릭 RSV에서 요망되는 구조적 및 표현형 변화를 달성하기 위하여 본 발명은 부모형 키메릭 게놈 또는 안티게놈으로부터의 선택된 뉴클레오티드 또는 다수의 뉴클레오티드를 결손, 치환, 도입 또는 재배열하는 변형 뿐만 아니라 인간-소 키메릭 RSV 클론 내의 전체 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)을 결손, 치환, 도입 또는 재배열하는 돌연변이의 도입을 허용한다.
감염성 인간-소 키메릭 RSV의 요망되는 변형은 전형적으로 요망되는 표현형 변화, 예를 들면 바이러스 성장의 변화, 온도 민감성, 숙주 면역 반응을 유발하는 능력, 약독화 등을 규정하도록 선택된다. 이들 변화는 특이적 유전자(들) 또는 게놈 영역(들) (예를 들면, 세포질, 막통과 또는 세포외 도메인, 면역원성 에피토프, 결합 영역, 활성 부위 등과 같은 단백질 구조 도메인 또는 시스 작용 신호를 코딩하는 게놈 분절)을 제거, 도입 도는 재배열하는 부모형 RSV 클론의 돌연변이유발에 의하여서와 같이 공여체 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈에 이들 변화를 야기시킬 수 있다. 이와 관련한 관심 유전자는 RSV 게놈 (3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M21/M2-2-L-5')의 유전자 모두 뿐만 아니라 다른 RSV로부터의 이형 유전자 및 본원에 나타낸 바와 같은 다양한 다른 비-RSV 원천을 포함한다.
또한 제공되는 것은 예를 들면, 선택된 RSV 코딩 서열 내에 종결 코돈의 도입, 작용가능하게 연결된 프로모터에 대하여 RSV 유전자의 위치의 변화, 발현 속도를 변화시키기 위한 상류 개시 코돈의 도입, 표현형 (예를 들면, 성장, 온도 민감성 또는 전사 등)을 변화시키기 위한 GS 및(또는) GE 전사 신호의 변형 (예를 들 면, 위치 변화, 존재하는 서열의 변화, 또는 존재하는 서열을 이형 서열로 치환하는 것에 의함)에 의한 선택된 유전자의 발현을 단순히 변화 또는 제거하는 인간-소 키메릭 RSV에서의 변형, 및 바이러스 복제, 선택된 유전자(들)의 전사 또는 선택된 단백질의 해독에서의 정량적 또는 정성적 변화를 규정하는 다양한 다른 결손, 치환, 첨가 및 재배열이다.
백신 개발을 위하여 다른 유형의 약독화 돌연변이를 분석하고, 이를 인간-소 키메릭 RSV로 혼입하는 능력은 RSV 클론 중의 목표하는 변화의 광범위한 조립을 확장한다. 예를 들면, SH 유전자의 결손은 성장의 증강을 포함하여 신규 표현형 특성을 갖는 재조합 RSV를 생성한다. 본 발명에서, SH, NS1 또는 NS2 유전자 (또는 다른 선택된, 비필수적 유전자 또는 게놈 분절)는 약독화 표현형, 예를 들면 생물학적으로 유도된 약독화된 RSV 돌연변이체로부터 채택되는 1 이상의 돌연변이(들)을 규정하는 1 이상의 추가 돌연변이를 가질 수 있는 키메릭 RSV에서 결손된다. 예시적인 실시태양에서, SH, NS1 또는 NS2 유전자는 cpts248/404, cpts530/1009, cpts530/1030으로부터 채택되는 1 이상의 cp 및(또는) ts 돌연변이와 함께 결손되어 상이한 돌연변이의 결합 효과로 인하여 바이러스 수율의 증가, 약독화의 증강 및 표현형 복귀변이에 대한 저항을 갖는 재조합 RSV를 생성한다.
성장에 필수적이지 않은 모든 RSV 유전자, 예를 들면 SH, NS1, NS2 또는 M2-2 유전자는 키메릭 RSV에서 제거 또는 달리 변형되어 독성, 병원성, 면역원성 및 다른 표현형 특성 상에 요망되는 효과가 생기게 할 수 있다. 예를 들면, SH와 같은 비필수적 유전자의 결손에 의한 제거는 배양에서 바이러스 성장의 증가를 가져 온다. 이론에 얽매이는 것을 원하지 않으면서, 이 효과는 부분적으로 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 길이의 감소로 인한 것으로 보인다. 한 예시적 SH-마이너스 클론의 경우에, 변형된 바이러스 게놈은 14,825 nt 길이로서, 야생형보다 398 뉴클레오티드 짧다. 예를 들면, P, M, F 및 M2 유전자와 같은 RSV 게놈중의 다른 코딩 또는 비코딩 영역 중에 유사한 돌연변이를 엔지니어링하는 것에 의해서, 본 발명은 키메릭 RSV 성장을 증가시키기 위한 여러가지 쉽게 입수가능한 방법 및 물질을 제공한다.
또한, 여러가지 다른 유전적 변화가 단독으로 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이 RSV로부터 채택되는 1 이상의 약독화 돌연변이와 함께 감염성 인간-소 키메릭 RSV로 혼입하기 위하여 RSV 게놈 또는 안티게놈 중에 만들어질 수 있다. 추가 이형 유전자 및 게놈 분절 (예를 들면, 상이한 RSV 유전자, 상이한 RSV 균주 또는 유현, 또는 비-RSV 소스로부터 유래)은 전체 또는 부분적으로 삽입될 수 있고, 유전자의 순서가 변화되고, 유전자 오버래핑이 제거되고, RSV 게놈 프로모터가 안티게놈 대응물로 대체되고, 유전자 일부가 제거 또는 치환되며, 전체 유전자가 결손될 수도 있다. 서열에서 다른 또는 추가적 변형을 일으켜 다양항 유전자간 영역 또는 다른 곳에 독특한 제한 부위를 삽입하는 것과 같은 조작을 촉진할 수 있다. 비해독 유전자 서열을 제거하여 외래 서열을 삽입하기 위한 용량을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한 키메릭 RSV 클론으로부터 유전자 또는 게놈 분절을 제거함이 없이 선택된 유전자 또는 게놈 분절의 발현을 변화 또는 제거하는 인간-소 키메릭 RSV에서의 유전적 변형을 제공한다. 예를 들면, 이는 선택된 코딩 서열 내에 프레임 이동 돌연변이 또는 종결 코돈 도입, 유전자의 위치 변화, 또는 발현 속도 변화를 위한 상류 개시 코돈 도입, 또는 표현형 (예를 들면, 성장, 온도 민감성 또는 전사 등)을 변화시키기 위한 GS 및(또는) GE 전사 신호의 변화에 의해 달성될 수 있다. 이러한 예 하나에서, M2-2 ORF의 발현이 녹-아웃 되어, 성장 운동의 변화, RNA 복제의 감소 및 전사의 증가를 포함하여 백신 바이러스의 개발을 위해 크게 요망되는 표현형 변화를 일으킨다. 따라서, M2-2 녹-아웃은 항원 발현 감소보다는 부수적 증가로 중요한 약독화를 나타낸다.
본 발명의 더욱 상세한 측면에서, 예를 들면 2개의 직렬 해독 종결 코돈을 해독 오픈 리딩 프레임 (ORF)로 도입하는 것에 의하여 유전자 또는 이의 분절의 결손 없이 해독 수준에서 NS2 유전자의 발현이 제거된, 인간-소 키메릭 RSV가 제공된다. 이는 유전자를 결손시킴이 없이 해독 수준에서 선택된 유전자가 사일런트된 생존가능한 바이러스를 가져온다. 이들 형태의 녹-아웃 바이러스는 종종 조직 배양에서 성장 속도의 감소 및 작은 플라크 크기를 나타낸다. 따라서, 이들 방법은 주요한 바이러스 방어 항원 중 하나가 아닌 바이러스 유전자의 발현이 제거된 다른 추가, 신규 유형의 약독화 돌연변이를 제공한다. 이와 관련하여, 유전자 또는 게놈 분절의 결손없이 제조된 녹-아웃 바이러스 표현형은 본원에 기술된 바와 같이 결손 돌연변이유발에 의해 별도로 제조되어 표적 단백질의 합성을 복구시킬 수 있는 교정 돌연변이를 효과적으로 방지한다. 인간-소 키메릭 RSV에 대한 여러가지 다른 유전자 녹-아웃을 당업계에 공지된 다른 설계 및 방법을 사용하여 만들 수 있 다 (예를 들며, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된, Kretschmer et al., Virology 216:309-316, 1996; Radicle et al., Virology 217:418-412, 1996; 및 Kato et al., EMBOSS J. 16;178-587, 1987; 및 Schneider et al., Virology 277:314-322, 1996 에 기술된 바와 같음).
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV로 혼입되는 다른 돌연변이는 예를 들면, RSV 미니게놈(minigenome)의 돌연변이 분석에 의해 확인될 수 있는 시스 작용 신호에 대한 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 리더 및 트레일러 및 플랭킹(flanking) 서열의 삽입 및 결손 분석은 바이러스 프로모터 및 전사 신호를 확인하고, 다양한 정도의 RNA 복제 또는 전사의 감소와 연관된 일련의 돌연변이를 제공한다. 이들 시스 작용 신호의 포화 돌연변이유발 (이에 의해 각각의 위치는 차례로 각각의 뉴클레오티드 대안으로 변형됨)은 또한 RNA 복제 또는 전사를 감소 (또는 1 경우 증가)시키는 많은 돌연변이가 확인되었다. 완전한 안티게놈 cDNA를 사용한 트란스 작용 단백질 및 시스-작용 RNA 서열의 평가 및 조작은 헬퍼 의존 상태가 매우 억제적이어서 복제 비의존적 감염성 바이러스에서 회수되지 않는 돌연변이체의 특성화에 유용한 RSV 미니게놈 (예를 들면, 본원에 참고문헌으로 삽입된 Grosfeld et al., J. Virol. 69:5677-5686, 1995 참조)의 사용에 의해 보조된다.
인간-소 키메릭 RSV 내의 추가 돌연변이는 RNA 복제 및 전사의 변화와 연관된, 안티게놈 유래의 대응물로 게놈의 3' 말단이 대체되는 것을 포함한다. 또한, 유전자간 영역 (본원에 참고문헌으로 삽입된. Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4594-4598, 1986)은 서열 내용에서 단축 또는 연장 또는 변화될 수 있 으며, 천연 발생 유전자 오버래핑 (본원에 참고문헌으로 삽입된, Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5134-5138, 1987 참조)은 본원에 기술된 방법에 의해 상이한 유전자간 영역으로 변화 또는 제거될 수 있다. 한 예시적 실시태양에서, 방어 F 및 G 안티유전자와 같은 특이적 RSV 단백질의 발현 수준은 합성적으로 제조되고 천연 서열을 효율적 해독과 일치하도록 설계된 것으로 치환하는 것에 의해 증가될 수 있다. 이와 관련하여, 코돈 용도는 포유류 바이러스 단백질의 해독 수준에 주요한 인자일 수 있다 (본원에 참고문헌으로 삽입된 Haas et al., Current Biol. 6;315-324, 1996). 주요한 방어 항원인 RSV의 F 및 G 단백질을 코딩하는 mRNA의 코돈 용도의 검사는 용도가 발현 불량과 일치됨을 보여준다. 따라서, 코돈 용도는 본 발명의 재조합법에 의해 개선되어 선택된 유전자의 발현 개선을 달성할 수 있다. 다른 예시적인 실시태양에서, 선택된 RSV 유전자의 해독 개시 부위 (바람직하게는, -3 위치에 뉴클레오티드를 포함) 주위의 서열은 단독으로 또는 상류 개시 코돈의 도입과 함께 변형되어 해독의 상승 또는 하강 조절을 규정하여 키메릭 RSV 유저자 발현을 조정한다.
별법으로, 또는 본원에 개시된 다른 RSV 변형과 함께, 인간-소 키메릭 RSV 유전자 발현은 바이러스의 선택된 유전자(들)의 전사 GS 신호를 변형하는 것에 의해 조정될 수 있다. 한 예시적인 실시태양에서, NS2의 GS 신호가 한정된 돌연변이 (예를 들면, 하기 본원에 기술된 404(M2) 돌연변이)를 포함하도록 변형되어 바이러스 복제 상에 ts 제한을 첨가한다.
별도 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV에서의 유전자 발현의 수준은 전사 수준에서 변형된다. 한 측면에서, RSV 유전자 지도 중의 선택된 유전자의 위치는 더욱 프로모터에 인접 또는 프로모터에서 먼 위치로 변화될 수 있고, 이에 의해 유전자는 각각 더욱 또는 덜 효과적으로 발현될 수 있다. 상기 측면에 따르면, 구체적 유저자에 대한 발현의 조정은 상호적으로 위치적 치환 유전자에 대한 발현 수준의 적당한 감소에 의해 종종 동반되는 야생형 수준에 비하여 2배, 더욱 통상적으로는 4 배부터 10 배 이상까지 유전자 발현의 감소 또는 증가를 일으키는 것이 달성될 수 있다. 한 예에서, NS2 유전자 (RSV 게놈 지도에서 순서상 2번째)는 SH 유전자 (순서상 6번째) 에 대한 위치에서 치환되어, NS2 유전자의 예측된 감소를 일으킨다. 한 예시적 실시태양에서, F 및 G 유전자는 키메릭 RSV 유전자 지도 내에서 더욱 프로모터에 인접 또는 프로모터에서 먼 위치로 단독으로 또는 함깨 트랜스포지션되어 각각 더 높은 또는 더 낮은 수준의 유전자 발현을 달성한다. 이들 및 다른 트랜스포지션 변화는 예를 들면, RNA 복제에 포함되는 선택된 바이러스 단백질의 발현 감소로 인하여 약독화된 표현형을 갖거나, 또는 증가된 항원 발현과 같은 다른 요망되는 성질을 갖는 신규 키메릭 RSV 클론을 생성한다.
본 발명의 감염성 인간-소 키메릭 RSV는 또한 본원에 개시된 방법 및 조성물에 따라서 엔지니어링되어 면역원성을 증강시키고, 야생형 RSV 또는 부모형 키메릭 RSV로 감염시키는 것에 의해 제공되는 것보다 높은 방어 수준을 유도할 수 있다. 예를 들면, 이형 RSV 균주 또는 유형 유래, 또는 PIV와 같은 비-RSV 원천 유래의 면역원성 에피토프는 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 적합한 뉴클레오티드 변화에 의해 키메릭 클론에 첨가될 수 있다. 별법 으로, 키메릭 RSV는 면역원성 단백질, 단백질 도메인 또는 요망되거나 요망되지 않은 면역학적 반응과 연관된 구체적 단백질의 형태 (예를 들면, G의 분비형)를 첨가 또는 제거하기 위해 엔지니어링될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 추가 유전자 또는 게놈 분절이 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈으로 삽입되거나 근접할 수 있다. 이들 유전자는 수용체 유전자의 통상적 제어하에 있을 수 있거나, 또는 전사 신호의 독립적 세트의 제어하에 있을 수 있다. 관심 유전자는 상기 확인된 RSV 유전자 뿐만 아니라 비-RSV 유전자를 포함한다. 관심 비-RSV 유전자는 사이토카인 (예를 들면, IL-2 내지 IL-18, 특히 IL-2, IL-6 및 IL-12, IL-18 등), 감마-인터페론 및 T 헬퍼 세포 에피토프에 풍부한 단백질을 코딩하는 것들을 포함한다. 이들 추가 단백질은 별개 단백질로, 또는 SH와 같은 RSV 단백질 1개의 2차 카피로부터 엔지니어링된 키메라로 발현될 수 있다. 이는 정량적 및 정성적으로 RSV에 대한 면역 반응을 조정 및 개선하는 능력을 제공한다.
본 발명의 예시적 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV 게놈 내의 외래 유전자 또는 게놈 분절의 삽입, 및 비코딩 뉴클레오티드 서열의 일부 경우에는 다른 추가의 요망되는 표현형 효과를 유발하는 게놈 길이의 요망되는 증가를 가져온다. 게놈 길이의 증가는 삽입물의 길이에 일부 의존하여 얻은 RSV의 약독화를 초래한다. 또한, 인간-소 키메릭 RSV에 삽입된 비-RSV 유전자 유래의 어떤 단백질 (예를 들면, 사이토카인)의 발현은 단백질의 작용으로 인하여 바이러스의 약독화를 초래할 수 있다. 감염성 약독화 바이러스 표현형 및 RSV 감염 세포 유래의 고수준 사이토 카인 발현을 야기하는 예시적인 사이토카인은 인터루킨-2 (IL-2), IL-4, GM-CSF 및
Figure 112002000618146-pct00006
-인터페론을 포함한다. 세포 및(또는) 체액 면역 반응의 증대를 포함하는 추가 효과는 또한 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV로의 사이토카인의 도입을 수반할 수 있다.
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV 내의 결손, 삽입, 치환 및 전체 바이러스 유전자 또는 게놈 분절의 변화를 포함하는 다른 돌연변이는 면역억제된 개체의 경우 특히 중요한 매우 안정한 백신 후보물을 야기한다. 많은 이들 변화는 얻은 백신 균주의 약독화를 가져오는 반면, 다른 것은 다른 유형의 요망되는 표현형 변화를 규정할 수 있다. 예를 들면, 악세서리 (즉, 시험관내 성장에 필수적이지 않은) 유전자는 특이적으로 숙주 면역 반응을 방해하는 단백질을 코딩하기 위한 우수한 후보물이다 (예를 들면, 본원에 참고문헌으로 삽입된 문헌[Kato et al., EMBO. J. 16:578-87, 1997] 참조). 키메릭 백신 바이러스 중의 이러한 유전자의 제거는 독성 및 병원성을 감소 및(또는) 면역원성을 개선하리라 예측된다.
본 발명의 별도 측면에서, cDNA 발현 게놈 또는 안티게놈으로부터 제조되는 감염성 인간-소 키메릭 RSV는 모든 RSV 또는 RSV 유사 균주 (예를 들면, 인간, 소, 생쥐 등), 또는 모든 폐렴바이러스 (예를 들면, (예전에는 칠면조 비기관염 바이러스로 불렸던) 조류 페렴바이러스, 생쥐의 폐렴 바이러스)일 수 있다. 방어 면역 반응을 생기게하기 위하여, RSV 균주는 인간을 면역화하기 위해 사용되는 인간 RSV와 같이 면역화되는 대상에 내생인 것일 수 있다. 내생 RSV의 게놈 또는 안티게놈은 상이한 RSV 종, 아군 또는 균주 유래, 또는 RSV 및 PIV와 같은 다른 호흡기 병 원체 유래의 유전자 또는 게놈 분절의 조합과 같이 상이한 원천의 조합으로부터의 RSV 유전자 또는 게놈 분절을 발현하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 어떤 실시태양에서, 인간 또는 소 (예를 들면, 인간 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈) 내의 유전자 또는 게놈 분절이 비인간, 비소 RSV (예를 들면, 생쥐 RSV) 유래의 대응 이형 유전자 또는 게놈 분절로 대체된 인간-소 키메릭 RSV가 제공된다. 이와 관련하여 RSV 유전자 또는 게놈 분절의 치환, 결손 및 첨가는 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2) 및 L 유전자 중 1 이상의 일부 또는 모두, 또는 바람직하게는 주요한 중화 및 방어 에피토프 외부에 있는 G 및 F 유전자의 일부를 포함할 수 있다. 또한, 프로모터 또는 전사 신호와 같은 인간 또는 소 RSV 시스 작용 서열은 비인간, 비소 대응 서열로 대체될 수 있다. 따라서, 인간에 투여되는 것이 의도되는 감염성 인간-소 키메릭 RSV는 소 RSV 외에도 생쥐 RSV 유래의 유전자를 포함하도록 변형된 인간 RSV일 수 있다.
(예를 들면, NS1, NS2, SH, G, M2-2의) 인간 RSV 코딩 서열, 또는 비코딩 서열 (예를 들면, 프로모터, 유전자 종결, 유전자 개시, 유전자간 또는 다른 시스 작용 요소)를 대응 소 또는 생쥐 RSV로 대체하는 것은 다양한 가능한 약독화 및 다른 표현형 효과를 갖는 키메릭 RSV를 생성한다. 특히, 숙주 범위 및 다른 요망되는 효과는 인간 RSV 배경 내에 도입된 소 또는 생쥐 RSV 유전자 치환으로부터 발생하고, 여기서 소 또는 생쥐 유전자는 생물학적으로 상호작용하는 인간 RSV 서열 또는 단백질 (즉, 바이러스 전사, 해독, 조립 등에 대한 치환된 서열 또는 단백질과 통상적으로 협동하는 서열 또는 단백질)과, 또는 더욱 전형적으로 숙주 범위 제한에 서는, 수용성 및 덜 수용적인 숙주간에 차이가 있는 세포 단백질 또는 세포 환경의 일부 다른 측면과 이형 서열 또는 단백질과의 비혼화성으로부터 인간 세포에서 효과적으로 기능하지 않는다. 이러한 한 실시태양에서, 키메릭 소-인간 RSV는 인간 RSV NP 유전자 또는 게놈 분절을 대응 소 NP 유전자 또는 게놈 분절의 치환을 혼입하고, 키메라는 임의로 추가 유전적 변화 (예를 들면, 점 돌연변이 또는 유전자 결손)을 혼입하도록 구성될 수 있다. 이형 유전자 또는 시스 작용 요소를 갖는 키메릭 인간-소 RSV는 숙주 범위 제한 또는 백신용으로 유리한 다른 요망되는 표현형에 대해 선택된다. 예시적인 실시태양에서, 소 RSV 서열은 예를 들면, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 문헌[Pastey et al., J. Gen. Viol. 76:193-197, 1993; Pastey et al., Virus Res. 29:195-202, 1993; Zamora et al., J. Gen. Virol. 73:737-741, 1992; Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 74:2001-2004. 1993; Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 73:2441-2444, 1992; 및 Zamora et al., Virus Res. 24:115-121, 1992]에서 제공되는 바와 같이, 및 본원에 개시된 교시사항에 따라서 공지된 측면의 소 RSV 구조 및 기능에 기초하여 인간 RSV로 도입되도록 선택된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV 내에 도입을 위한 관심 돌연변이는 G 단백질의 세포질 테일을 결한 (Randhawa et al., Virology 207:240-245, 1995) 생쥐의 폐렴 바이러스의 조직 배양 적응된 비병원성 균주 (인간 RSV의 생쥐 대응부) 후에 모델링된다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서 인간 RSV 당단백질 중 1 이상의 세포질 및(또는) 막통과 도메인, F, G 및 SH는 이형 대응 서열 (예 를 들면, 생쥐 폐렴 바이러스의 F, G 또는 SH 단백질의 세포질 또는 막통과 도메인 유래의 서열)을 사용하여 키메릭 RSV 내에 첨가, 결손, 변형 또는 치환되어 요망되는 약독화를 달성한다. 다른 예에서, F 단백질의 절단 부위, 또는 G 단백질의 추정 부착 도메인, 또는 그 근방의 뉴클레오티드 서열은 점 돌연변이, 위치 지향성 변화에 의해서, 또는 총 유전자 또는 게놈 분절을 포함하는 변화에 의해 변형되어 조직 배양 및(또는) 감염 및 병원성에서 바이러스 성장 상에 신규 효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 더욱 상세한 측면에서, 인간-소 키메릭 RSV는 다른 병원체, 특히 파라인플루엔자 바이러스 (PIV)와 같은 호흡기 병원체의 방어 항원에 대한 벡터로 이용된다. 예를 들면, 키메릭 RSV는 감염성 약독화 백신 바이러스를 생성하기 위해 PIV로부터의 방어 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 키메릭 RSV를 설계할 수 있다. 각각 본원에 참고로 인용된 미국 특허 출원 제09/083,793호 (국제 특허 공개 WO 제98/53078호에 대응0 및 그의 우선권인 미국 가출원 제60/047,575호, 미국 특허 출원 제09/350,821호; 및 미국 특허 출원 제09/586,479호 및 그 우선권인 미국 가출원 제60/143,134호에서 이들 본원 발명의 다른 더욱 상세한 측면을 실시하기 위한 PIV cDNA의 클로닝 및 다른 기재가 제공된다. 이 기재는 감염성 PIV 바이러스 클론을 생성하기 위해 사용될 수 있는 하기의 플라스미드에 관한 기술을 포함한다: p3/7(131) (ATCC 97990); p3/7(131)2G (ATCC 97889); 및 p218(131) (ATCC 97991) (각각 미국 버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시티 볼리버드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)와 부다페스트 조약의 규정하에 기탁되었으 며, 상기 수탁 번호가 부여됨).
본 발명의 이러한 측면에 따르면, 소 및 인간 RSV 게놈 또는 안티게놈 서열 및 1 이상의 PIV의 키메라, 예를 들면 소 및 인간 RSV 모두로부터의 서열, 및 PIV1, PIV2, PIV3 또는 소 PIV를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 인간-소 키메릭 RSV가 제공된다. 예를 들면, RSV의 각 유전자는 PIV1, PIV2 또는 PIV3의 HN 및(또는) F 당단백질 유전자와 같은 인간 PIV로부터의 대응 유전자로 대체될 수 있다. 별법으로, HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3의 HN 또는 F의 세포질 테일, 막통과 도메인 또는 엑토도메인과 같은 선택된 이종 유전자 단편을 예를 들면, RSV의 동일 유전자, RSV의 상이한 유전자내 또는 RSV 게놈 또는 안티게놈의 비코딩 서열에 있는 대응 유전자 단편으로 치환할 수 있다. 한 실시태양에서는, 신규한 약독화 바이러스 및(또는) PIV 및 RSV에 대한 다가의 백신 면역원성을 얻기 위해, HPIV3의 HN 또는 F로부터의 유전자 단편을 RSV 타입 A의 대응 유전자 단편으로 치환하여 키메릭 단백질, 예를 들면, RSV의 엑토도메인과 융합된 RSV의 세포질 테일 및(또는) 막통과 도메인을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 구조체를 생성한다. PIV cDNA의 클로닝 및 이들 및 본 발명의 더욱 상세한 측면을 실시하기 위한 다른 개시사항은 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 미국 특허 출원 제09/083,793호 (국제 특허 공개 WO 제98/53078호 대응) 및 그 우선권 가출원 제60/047,575호; 미국 특허 출원 제09/350,821호; 및 미국 특허 출원 제09/586,479호, 및 그 우선권 가출원 제60/143,134호에서 제공된다.
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV는 매우 다양한 다른 병원체의 항원 결정기를 발현하기 위한 벡터로 사용될 수 있다. 전형적으로, 소-인간 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 RSV 벡터 게놈 또는 안티게놈으로 사용된다. 벡터 게놈 또는 안티게놈 내에 혼입되는 것은 1 이상의 이형 병원체의 항원 결정기(들)을 코딩하는 1 이상의 이형 유전자 또는 게놈 분절이다. 어떤 실시태양에서, 이형 병원체는 이형 RSV이고, 인간-소 키메릭 RSV 벡터 게놈 또는 안티게놈에 혼입된 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)은 1 이상의 RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 단백질(들) 또는 이의 단편(들)을 코딩한다. 예를 들면, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 RSV A 게놈 또는 안티게놈을 포함할 수 있으며, 항원 결정기를 코딩하는 이형 유전자 또는 게놈 분절은 RSV B 아군 바이러스의 것일 수 있다.
다른 별도 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV는 비-RSV 병원체의 1 이상의 항원 결정기를 발현하기 위한 벡터로 사용된다. 따라서, 구성된 키메릭 벡터 바이러스는 RSV 뿐만 아니라 비-RSV 병원체의 항원 결정기를 발현할 수 있거나, 또는 비-RSV 병원체에 대해 단일-특이적 면역 반응을 유발할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간-소 키메릭 RSV는 HN 및(또는) F 당단백질(들) 또는 이의 항원성 도메인(들), 단편(들) 또는 에피토프(들) 1 이상을 코딩하는 HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3 유전자(들) 또는 게놈 분절(들) 1 이상을 혼입한다. 더욱 상세한 측면에서, HPIV2 HN 또는 F 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)를 포함하는 전사 단위가 키메릭 HBRSV 벡터 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 혼입된다.
벡터로 사용되는 인간-소 키메릭 RSV는 벡터 게놈 또는 안티게놈이 부분적 또는 완전한 BRSV 게놈 또는 안티게놈이고, 항원 결정기(들)을 코딩하는 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)이 1 이상의 HRSV(s)의 것인 키메릭 RSV를 포함한다. 예를 들면, 부분적 또는 완전한 BRSV 게놈 또는 안티게놈은 F, G 및 SH로부터 선택되는 HRSV 당단백질 유전자 1 이상을 코딩하는 1 이상의 유전자(들) 또는 게놈 분절(들), 또는 HRSV의 F, G 및(또는) SH의 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프 부분(들)을 코딩하는 1 이상의 게놈 분절(들)을 혼입할 수 있다.
본 발명의 다른 추가 벡터 구성에서, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 HRSV 또는 BRSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하고, 이형 병원체는 홍역 바이러스, 아군 A 및 아군 B 호흡기 신시티움 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 제1형 및 제2형 인간 면역결핍 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 필로바이러스, 분야바이러스, 플라비바이러스, 알파바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택된다. 이들 및 다른 병원체로부터, 인간-소 키메릭 RSV 내에 혼입되기에 유용한 이형 항원 결정기(들)은 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질, 아군 A 또는 아군 B 호흡기 신시티움 바이러스 F, G, SH 및 M2 단백질, 유행성 이하선염 바이러스 HN 및 F 단백질, 인간 유두종 바이러스 L1 단백질, 제1형 또는 제2형 인간 면역결핍 바이러스 gp160 단백질, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 사이토메갈로바이러스 gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL 및 gM 단백질, 광견병 바이러스 G 단백질, 엡스타인 바 바이러스 gp350 단백질, 필로바이러스 G 단백질, 분야바이러스 G 단백질, 플라비바이러스 E 및 NS1 단백질, 및 알파바이러스 E 단백질, 및 이의 항원성 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV는 이형 병원체가 홍역 바이러스이고, 이형 항원 결정기(들)이 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질 및 이의 항원성 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택되는 것인, 벡터로 사용될 수 있다. 이러한 재조합체를 구성하기 위해서, 홍역 바이러스 HA 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)를 포함하는 전자 단위가 HRSV 벡터 게놈 또는 안티게놈으로 첨가 또는 혼입된다. 유사한 제조합체가 본원에 개시된 교시사항에 따라서 다른 비-RSV 병원체에 대해 쉽게 구성된다.
인간-소 키메릭 RSV에 대한 상기 기술한 변형 외에도, RSV 클론에 다른 또는 추가적 변형을 일으켜 다양항 유전자간 영역 (예를 들면, G 및 F 유전자 간의 독특한 StuI 부위) 또는 다른 곳에 독특한 제한 부위의 삽입과 같은 조작을 촉진할 수 있다. 비해독 유전자 서열을 제거하여 외래 서열을 삽입하기 위한 용적을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 조성물 (예를 들면, 인간-소 키메릭 RSV-코딩 cDNA를 혼입시킨 단리된 폴리뉴클레오티드 및 벡터) 및 방법이 단리된 감염성 키메릭 RSV를 제조하기 위해 제공된다. 이들 조성물 및 방법을 사용하여, 감염성 키메릭 RSV는 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈, 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 (L) 중합효소 단백질 및 RNA 중합효소 신장 인자로부터 생성된다. 본 발명의 관련된 측면에서, 조성물 및 방법이 감염성 약독화 백신 바이러스를 얻기 위해 재조합 키메릭 RSV로 상기 언급된 구조 및 표현형 변화를 도입시 키기 위해 제공된다.
다양한 공지의 방법에 의해 상기 정의한 돌연변이를 감염성 인간-소 키메릭 RSV 클론에 도입할 수 있다. DNA와 관련하여 "감염성 클론"은 cDNA, 또는 주형으로 작용할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA로 전사되어 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 게놈을 생성할 수 있는 합성 또는 기타의 생성물을 의미한다. 따라서, 통상의 기술(예, 위치 지향성 돌연변이)에 의해 정의된 돌연변이를 게놈 또는 안티게놈의 cDNA 카피에 도입할 수 있다. 본원에 기술한 바와 같이, 안티게놈 또는 게놈 cDNA 서브단편을 사용하여 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA를 조합하는 것은 각 영역을 별도로 조작하여(더 작은 cDNA가 큰 것보다 조작하기에 더 용이하다) 완전한 cDNA로 쉽게 조합할 수 있는 장점을 갖는다. 따라서, 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 이의 어떠한 서브단편도 올리고뉴클레오티드 방향성 돌연변이를 위한 주형으로 사용될 수 있다. 이것은 예를 들면, 뮤타-진 키트(Muta-gene(등록상표) kit, 캘리포니아주 리치몬드 소재의 Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 단일 가닥 파아지미드 형태의 중간체를 경유하거나, 또는 카멜레온(Chameleon) 돌연변이유발 키트(캘리포니아주 라 졸라 소재의 Stratagene)와 같이 이중 가닥 플라스미드를 직접 주형으로 사용하는 방법을 통해서일 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 관심있는 돌연변이를 함유하는 주형을 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의할 수 있다. 이어서, 돌연변이 서브단편을 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA로 조합할 수 있다. 다양한 다른 돌연변이유발 기술이 공지되어 있고, RSV 안티게놈 또는 게놈 cDNA에서 관심있는 돌연변이를 생성하는데 사용하기 위해 입수 가능하다. 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화에서부터 하나 이상의 유전자 또는 유전자 영역을 함유하는 큰 cDNA 부분의 치환에 이르기까지 다양할 수 있다.
따라서, 한 예시적 실시태양에서는, 뮤타-진 파아지미드 시험관내 돌연변이유발 키트(Bio-Rad로부터 입수가능)를 사용함으로써 돌연변이를 도입한다. 즉, RSV 게놈 또는 안티게놈의 일부를 코딩하는 cDNA를 플라스미드 pTZ18U로 클로닝하고, CJ236 세포를 형질전환하는데 사용한다 (Life Technologies). 파아지미드는 제조자가 제시하는 바와 같이 제조한다. 게놈 또는 안티게놈의 목적하는 위치에 변화된 뉴클레오티드를 도입함으로써 돌연변이유발을 위한 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 이어서, 유전적으로 변화된 게놈 또는 안티게놈 단편을 함유하는 플라스미드를 증폭시킨 다음, 돌연변이된 부분을 전체 길이의 게놈 또는 안티게놈 클론에 재도입한다.
정의된 돌연변이를 감염성 RSV에 도입할 수 있는 능력은 RSV 분자 생물학 및 병원론의 분석을 포함하여 다수의 적용분야를 갖는다. 예를 들면, 발현 수준을 제거 또는 감소시키거나, 또는 돌연변이체 단백질을 생성하는 돌연변이를 도입함으로써, RSV 단백질의 기능을 검토하고 조작할 수 있다. 하기의 한 예시적 실시태양에서는, mRNA 코딩 서열 및 플랭킹 전사 신호의 결실에 의해 바이러스 유전자, 즉, SH 유전자의 발현이 제거되는 재조합 RSV가 구성된다. 놀랍게도, 이 바이러스는 회수가능할 뿐만 아니라, 조직 배양에서 효과적으로 성장한다. 실제로, 감염성 바이러스의 수율 및 플라크 크기에 기초할 때, 이의 성장은 야생형에 비하여 실질적으로 증가하였다. SH 결손 및 본 발명의 다른 RSV 유도체로부터 기인한 조직 배양 에서 이러한 개선된 성장은 다른 시스템에서 백신 바이러스의 생성을 곤란하게 하였던 조직 배양에서의 RSV의 불량한 수율의 문제점을 극복하는 RSV 백신을 개발하는데 유용한 도구를 제공한다. 이들 결손은 유전적 복귀에 대하여 매우 안정하고, 이로부터 유래된 RSV 클론은 백신으로서 특히 유용하다
다른 예시적 실시태양에서, M2 유전자 (M2ORF2)를 결손 (Collins and Wertz, J. Virol. 54:65-71, 1985; Collins et al., J. Gen. Virol. 71:3015-3020, 1990, Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85, 1996, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨), 또는 M2 ORF2의 발현을 감소 또는 제거하여 신규 RSV 백신 후보물을 얻는 (본원에 참고문헌으로 삽입된 1999년 7월 9일 콜린스(Collins) 등에 의해 출원된 미국 가출원 제60/143,097호를 참조) 돌연변이를 혼입한 키메릭 RSV가 제공된다. 바람직한 측면에서, M2 ORF2의 발현은 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 변형하는 것에 의해 감소 또는 제거되어 "녹 아웃" 바이러스 클론을 얻는 M2 ORF2에 프레임 이동 돌연변이 또는 정지 코돈을 혼입된다. 별법으로, M2 ORF2는 전체 또는 부분적으로 결손되어 M2-2 단백질이 부분적으로 또는 완전히 비기능적이 되게하거나, 또는 함께 그 발현을 혼란시켜 M2 ORF2 "결손 돌연변이체" 키메릭 RSV를 얻는다. 별법으로, M2-2 ORF는 M2-2 유전자의 천연 유전자 순서 위치와 비교하여 더욱 프로모터에 인접 또는 프로모터에서 먼 위치로 게놈 또는 안티게놈에서 트랜스포지션되어 M2-2 ORF의 발현을 상승 조절 또는 하강 조절한다. 추가 실시태양에서, M2-2 ORF는 유전자 개시 및 유전자 종결 신호를 갖는 별개 유전자로 게놈 또는 안티게놈에 혼입되고, 이 변형은 M2-2 ORF의 상승 조절을 가져온다.
M2 ORF2에 돌연변이를 혼입하기 위해 더 변형된 본 발명의 키메릭 RSV는 백신 개발에 매우 요망되는 표현형 특성을 보유한다. 키메릭 게놈 또는 안티게놈에서 상기 확인된 변형은 얻어진 바이러스 또는 서브바이러스 입자에서 1 이상의 요망되는 표현형 변화를 규정한다. 따라서, (i) mRNA 전사의 변화, (ii) 바이러스 단백질 발현 수준의 변화; (iii) 게놈 또는 안티게놈 RNA 복제의 변화, (iv) 바이러스 성장 특성의 변화, (v) 바이러스 플라크 크기의 변화, 및(또는) (vi) 세포병원성의 변화로 확인되는 1 이상의 특성을 나타내는 백신 후보물이 생성된다.
M2 ORF 2 결손 또는 녹 아웃 돌연변이를 혼입시킨 예시적 RSV 키메라에서, 요망되는 표현형 변화는 상응하는 야생형 또는 돌연변이체 부모형 RSV 균주의 성장과 비교하여 바이러스 성장의 약독화를 포함한다. 더욱 상세한 측면에서, 세포 배양에서의 바이러스 성장은 M2 ORF2에서의 돌연변이에 기인하여 약 10 배 이상 약독화될 수 있다. 바이러스 성장 속도론 또한 백신 개발에 유익한 방식으로 변형되었음을 보여준다.
본 발명은 또한 상응하는 야생형 또는 돌연변이체 부모형 RSV 균주의 mRNA 합성 속도와 비교하여 바이러스 mRNA 합성의 속도가 지연되어 나타나는 키메릭 M2-ORF 2 결손 및 녹 아웃 돌연변이 RSV를 포함한다. 이러한 지연된 전사 속도에도 불구하고, 이들 신규 백신 후보물은 부모 바이러스와 비교하여 누적적 mRNA 합성에서의 증가를 나타낸다. 이들 표현형 변화는 통상적으로 야생형 또는 다른 부모 RSV 균주로 감염시킨 세포에서의 단백질 축적과 비교하여 감염된 세포에서 바이러스 단백질 축적의 증가돠 연관된다. 동시에, 바이러스 RNA 복제는 정상 M2 ORF2 기능을 갖는 부모 RSV 균주의 것과 비교하여 M2 ORF2 키메릭 RSV에서 감소되는 반면, 게놈 또는 안티게놈 RNA의 축적은 감소한다.
본발명의 바람직한 측면에서, 키메릭 M2 ORF2 결손 및 "녹 아웃" RSV는 또한 약독화된 표현형을 나타내는 한편 감소되지 않은, 또는 더욱 전형적으로는 증가된 수준의 바이러스 항원(들)을 발현하도록 엔지니어링된다. 따라서, 감소되지 않은 또는 증가된 mRNA 전사 및 항원 발현으로 인하여 면역원성 단백질이 보존되는 한편, 약독화는 이형 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)의 혼입 및 수반되는 RNA 복제 및 M2-ORF 2 결손 및 녹 아웃 돌연변이에 기인한 바이러스 성장의 감소를 통해 달성된다. M2 ORF2 결손 및 녹 아웃 키메릭 RSV에서 관찰되는 다른 유용한 표현형 변화는 큰 플라크 표현형 및 상응하는 야생형 또는 돌연변이 부모 RSV 균주와 비교하여 변화된 세포병원성을 포함한다.
본 발명은 또한 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 1 이상의 cDNA로부터 감염성 인간-소 키메릭 RSV를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 감염성 RSV를 형성하는데 필수적인 바이러스 단백질과 세포내 또는 시험관내에서의 공동발현을 위한 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA가 구성된다. "RSV 안티게놈"은 후손 RSV 게놈의 합성을 위한 주형으로 작용하는 단리된 정방향 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 바람직하게는, 전사하고 복제하는 뉴클레오캡시드를 생성하는데 필수적인 단백질을 코딩하는 상보 서열, 즉, N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 코딩하는 서열의 정방향 전사체와 혼성화할 가능성을 최소화하기 위해, 복제 중간체 RNA 또는 안티게놈에 대응하는, RSV 게놈의 정방향 형태인 cDNA가 구성된다. RSV 미니게놈 시스템에서, RSV에 의해 보충되거나 또는 플라스미드에 의해 보충되는, 구조에서 게놈 및 안티게놈의 활성은 동등하였고, 이것은 게놈 또는 안티게놈을 사용할 수 있고, 따라서 선택은 방법론적 또는 다른 근거에 달려있다는 것을 지적한다.
실질적으로 문헌[Mink 등, Virology 185: 615-624 (1991); Stec 등, Virology 183: 273-287 (1991); 및 Conners 등, Virol. 208: 478-484 (1995), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기술된 바와 같이, 천연 RSV 게놈은 전형적으로 상보적 바이러스 mRNA를 통해 11 종의 바이러스 단백질, 즉, 비구조적 종인 NS1 및 NS2, N, P, 매트릭스(M), 작은 소수성(SH), 당단백질(G), 융합(F), M2(ORF1), M2(ORF2) 및 L을 코딩하는 역방향 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 본 발명을 위해, 본 발명의 재조합 RSV의 게놈 또는 안티게놈은 코딩된 바이러스 또는 서브바이러스 입자가 감염성이게 하는데 필수적인 유전자 또는 이의 일부를 함유하는 것만을 필요로 한다. 나아가, 상기 유전자 또는 이의 일부는 하나를 초과하는 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 제공될 수 있다. 즉, 유전자는 상보 등에 의해 별도의 뉴클레오티드 분자로부터 제공될 수 있거나, 또는 유전자 또는 이의 일부는 게놈 또는 안티게놈 cDNA로부터 직접 발현될 수 있다.
재조합 RSV는 재조합 발현 시스템으로부터 직접 또는 간접적으로 유래되었거나, 또는 이로부터 생성된 바이러스 또는 서브바이러스 입자로부터 발생된 RSV 또는 RSV 유사 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 의미한다. 재조합 발현 시스템은 적어도 유전적 인자 또는 RSV 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 인자, 예를 들면, 프로모터, RSV RNA로 전사되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 적당한 전사 개시 및 종결 서열의 조합을 포함하는 작동가능하게 연결된 전사 단위를 포함하는 재조합 발현 벡터를 사용할 것이다.
cDNA 발현 게놈 또는 안티게놈으로부터 감염성 RSV를 생성하기 위해, 게놈 또는 안티게놈을, (i) RNA 복제가능한 뉴클레오캡시드를 생산하고 (ii) 후손 뉴클레오캡시드를 RNA 복제 및 전사에 알맞게 하는데 필수적인 RNA 단백질과 공동발현시킨다. 게놈 뉴클레오티드에 의한 전사는 다른 RSV 단백질을 제공하고, 생산적인 감염을 개시한다. 별법으로, 공동발현에 의해 생산적인 감염에 요구되는 부가의 RSV 단백질을 공급할 수 있다.
클로닝한 cDNA 단편을 조합하고 집합체의 완전한 안티게놈을 제공하거나, 또는 RSV mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사 카피의 중합효소 연쇄 반응 (PCR; 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호, 및 PCR Protocol: A Guide to Method and Application, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990), 본원에 참고로 인용됨)에 의해 본 발명에서의 사용을 위한 RSV 안티게놈을 구성할 수 있다. 예를 들면, 적당한 프로모터(예, T7 RNA 중합효소 프로모터) 및 리더 영역 보체로부터 SH 유전자에까지 미치는, 안티게놈의 좌측 말단을 함유하는 cDNA를 적당한 발현 벡터, 예를 들면, 플라스미드(예, pBR322) 또는 다양한 입수가능한 코스미드, 파아지 또는 DNA 바이러스 벡터에서 조합할 수 있다. 벡터는 돌연변이유발 및(또는) 조합을 용이하게 할 수 있도록 설계된 독특한 제한 부위를 함유하는 합성 폴리링커의 삽입에 의해 변화될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 기술한 플라스미드 벡터는 PstI-EcoR1 단편을 통상의 제한 효소 부위를 함유하는 합성 DNA로 대체함으로써 pBR322로부터 유도되었다. pBR322를 벡터로 사용하여 뉴클레오티드 결손 또는 삽입이 유지되었을 RSV 서열의 3716 내지 3732 뉴클레오티드를 안정화시켰고, DH10B 균주에서 플라스미드를 증식시켜서 4499 뉴클레오티드의 근처에서 일어났을 인공 복제 및 삽입을 회피하였다. 제조의 용이를 위해, L 및 트레일러 서열처럼, G, F 및 M2 유전자를 별개의 벡터에서 조합할 수 있다. 안티게놈 플라스미드의 우측 말단(예, L 및 트레일러 서열)은 목적하는 경우, 플랭킹 리보자임 및 직렬 T7 전사 종결자와 같은 부가의 서열을 함유할 수 있다. 리보자임은 단일 비바이러스 뉴클레오티드를 함유하는 3' 말단을 발생시키는 해머헤드(hammerhead) 유형(예, Grosfeld 등, J. Virol. 69: 5677-5686 (1995))일 수 있거나, 또는 비RSV 뉴클레오티드가 없는 3' 말단을 발생시키는 간염 델타 바이러스(Perrotta 등, Nature 350: 434-436 (1991))와 같은 다른 적합한 리보자임일 수 있다. 중간 단편(예, G 내지 M2 부분)이 리더 내지 SH 플라스미드의 적당한 제한 부위에 삽입되면, 이것이 L-트레일러-리보자임-종결자 부분에 대한 수용체가 되어, 완전한 안티게놈을 발생시킨다. 본원에 기술한 한 예에서는, 리더 서열을 최적의 활성을 위해 세 개의 전사 G 잔기를 포함한 T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터에 인접하도록 구성하였고, 전사는 이들 세 개의 비바이러스 G 잔기를 안티게놈의 5' 말단에 부여한다. 이들 세 개의 비바이러스 G 잔기를 생략하여 비바이러스 뉴클레오티드가 없는 5' 말단을 생성할 수 있다. 거의 정확한 3' 말단을 생성하기 위해, 트레일러 말단을 해머헤드 리보자임에 인접하게 구성하였고, 이것은 절단시 단일 3' 인산화 U 잔기를 코딩된 RNA 의 3' 말단에 부여할 것이다.
본 발명의 일부 실시태양에서는, 하나 이상의 보조 바이러스에 의해 전사 및 복제 RSV 뉴클레오티드를 생성하는데 필수적인 단백질을 코딩하는 보충 서열이 제공된다. 이러한 헬퍼 바이러스는 야생형 또는 돌연변이체일 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 바이러스는 RSV cDNA에 의해 코딩된 바이러스와 표현형적으로 구별될 수 있다. 예를 들면, RSV cDNA에 의해 코딩된 바이러스가 아닌 헬퍼 바이러스와 면역학적으로 반응하는 단일클론 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 중화 항체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 항체를 헬퍼 바이러스 배경을 중화하기 위해 사용하여 재조합 바아러스의 확인 및 회수를 촉진할 수 있거나, 친화 크로마토그래피에 항체를 사용하여 헬퍼 바이러스와 재조합 바이러스를 분리할 수 있다. 재조합 RSV가 비반응성 또는 상기 항체로의 중화에 내성이 되게하는 돌연변이를 RSV cDNA로 도입할 수 있다.
인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 다양한 뉴클레오티드 삽입 및 결손을 일으켜 적당히 약독화된 클론을 생성할 수 있다. 야생형 사람 RSV의 게놈 뉴클레오티드 길이(15,222 뉴클레오티드)는 6의 배수이고, 파라믹소바이러스 및 모빌리바이러스의 구성원은 전형적으로 "6의 규칙"을 따른다. 즉, 게놈(또는 미니게놈)은 뉴클레오티드 길이가 6의 배수인 경우에만 효율적으로 복제한다 (캡시드화 NP 단백질에 대한 뉴클레오티드 잔기의 정확한 간격을 위한 요구로 생각됨). 단일 잔기 증가에 위한 RSV 게놈 길이의 변화는 복제의 효율에 영향을 미치지 않았고, 계대배양 후 여러 개의 상이한 미니게놈 돌연변이체의 서열 분석으로부터 길이의 차는 보완적 변화없이 유지되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, RSV에는 게놈 길이가 6의 배수이어야 한다는 엄격한 요구가 결여되어 있고, 본 발명의 재조합 RSV의 복제를 좌절시키지 않고 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 뉴클레오티드 삽입 및 결실이 일어날 수 있다.
인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 구성하는 별법으로는 서브유닛 cDNA 성분의 수를 하나 또는 두 개의 단편으로 줄이는 예를 들면, 문헌[Cheng 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699 (1994); Samal 등, J. Virol. 70: 5075-5082 (1996), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기술된 바와 같은 개선된 PCR 조건을 사용하는 역전사 PCR이 포함된다. 다른 실시태양에서는, 상이한 프로모터(예, T3, SP6) 또는 상이한 리보자임(예, 간염 델타 바이러스의 리보자임)을 사용할 수 있다. 큰 게놈 또는 안티게놈을 더 잘 수용하기 위해 상이한 DNA 벡터(예, 코스미드)를 사용할 수 있다.
RNA 복제에 필수적인 N, P 및 L 단백질은 복제의 진행을 위해 M2(ORF1) 단백질과 같은 RNA 중합효소 신장 인자를 요구한다. 따라서, 음성 가닥 RNA 바이러스에 있어서 M2(ORF1) 또는 실질적으로 이와 동등한 전사 신장 인자가 요구되고, 생산적 감염 중 기능적 뉴클레오티드의 필수 성분이다.
M2(ORF1) 단백질의 요구는 전사 신장 인자로서의 역할과 일치한다. 음성 가닥 RNA 바이러스에 있어서 RNA 중합효소 신장 인자 단백질의 발현의 요구는 본 발명의 특징이다. M2(ORF1)은 키메릭 게놈 또는 안티게놈, 또는 그것과의 공동발현에 의해, 완전 M2 유전자의 발현에 의해 제공될 수 있으나, 이러한 경우에 제2 ORF2가 또한 발현될 수 있고, RNA 복제에 억제적 영향을 미친다. 따라서, 완전 M2 유전자를 사용하여 감염성 바이러스를 생성하는 경우에는, M(ORF1)이 전사 신장 활성을 제공하기에 충분하나 너무 많은 M(ORF2)가 RNA 복제를 억제하지 않는 정도로 발현되도록 두 개의 ORF의 활성이 균형을 이루어야 한다. 별법으로, ORF2가 결여되어 있거나 또는 결손 ORF2를 코딩하도록 설계된 cDNA로부터 ORF1 단백질을 제공한다. 또한, 외피 구성성분을 코딩하는 것(즉, SH, M, G, F 단백질)과 같은 부가의 바이러스 단백질 유전자의 공동 발현에 의해 바이러스 생성의 효율을 개선할 수 있다.
트랜스팩션, 전기천공법, 기계적 삽입, 형질도입 등에 의해, RSV 게놈 또는 안티게놈, 및 별도로 또는 시스(cis)로 N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(cDNA)를 생산적 RSV 감염을 지지할 수 있는 세포, 예를 들면, HEp-2, FRhL-DBS2, MRC 및 베로(Vero) 세포에 삽입한다. 단리된 뉴클레오티드 서열의 트랜스팩션은 예를 들면, 칼슘 포스페이트 매개 트랜스팩션 (Wigler 등, Cell 14: 725 (1978); Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham 및 Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)), 전기천공법 (Neumann 등, EMBO J. 1: 841-845 (1982)), DEAE-덱스트란 매개 트랜스팩션 (Ausubel 등, 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., 뉴욕 (1987)), 양이온성 지질 매개 트랜스팩션 (Hawley-Nelson 등, Focus 15: 73-79 (1993) 또는 상업적으로 입수가능한 트랜스팩션제 (예, LipofectACE (등록상표), Life Technologies)에 의해 배양 세포에 도입될 수 있다 (각각의 상기 문헌은 본원에 참 고로 인용됨).
N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질은 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것과 동일 하거나 또는 별도일 수 있는 하나 이상의 발현 벡터, 및 이들의 다양한 조합에 의해 코딩된다. 목적하는 경우, 자신의 벡터 또는 N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질 및(또는) 완전 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해 코딩된 부가의 단백질을 포함할 수 있다. 게놈 또는 안티게놈 및 트랜스팩션된 플라스미드로부터의 단백질의 발현은 예를 들면, 각각의 cDNA를 T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터의 조절하에 두고, 감염, 트랜스팩션 또는 형질도입에 의해 T7 RNA 중합효소에 대한 발현 시스템, 예를 들면, T7 RNA 중합효소를 발현하는 우두 바이러스 MVA 균주 재조합체를 공급함으로써 달성할 수 있다 (Wyatt 등, Virology, 210: 202-205 (1995), 본원에 참고로 인용됨). 바이러스 단백질 및(또는) T7 RNA 중합효소는 또한 트랜스팩션된 포유류 세포로부터, 또는 예비형성된 mRNA 또는 단백질의 감염에 의해 공급될 수 있다.
별법으로, 안티게놈 또는 게놈의 합성을 시험관내(세포의 부존재)에서 전사-번역 결합 반응으로 수행한 후, 세포를 트랜스팩션시킬 수 있다. 또는, 시험관내에서 안티게놈 또는 게놈 RNA를 합성하고, RSV 단백질을 발현하는 세포를 트랜스팩션시킬 수 있다.
본 발명에 따른 후보 키메릭 백신 바이러스를 선별하기 위해, 널리 공지된 방법에 따라 생존도, 약독화 및 면역원성의 기준을 결정한다. 본 발명의 백신에서 가장 바람직한 바이러스는 생존도를 유지해야 하고, 안정한 약독화 표현형을 가져 야 하고, 면역화 숙주에서 복제(낮은 수준이라 할지라도)를 나타내어야 하고, 접종자에게서 야생형 바이러스로부터의 후속적 감염에 의해 유발된 심각한 질병에 대한 방어를 부여하기에 충분한 면역 반응을 효율적으로 일으켜야 한다. 분명하게는, 이제까지 공지되고 보고된 RS 바이러스 돌연변이체는 이러한 모든 기준을 만족시키지 못한다. 실제로, 공지의 약독화 RSV에 대해 보고된 결과에 기초한 예상과 달리, 본 발명의 바이러스는 생육할 수 있고 이전의 돌연변이체보다 더 약독화될 뿐만 아니라, 이전에 연구된 돌연변이체보다 생체내에서 유전적으로 더 안정하고, 방어적 면역 반응을 촉진하는 능력, 어떤 경우에서는 다수의 변화에 의해 제공된 방어의 확대, 즉, 상이한 바이러스 균주 또는 아군에 대한 방어, 또는 상이한 면역학적 기초(예, 분비 대 혈청 면역글로불린, 세포성 면역 등)에 의한 방어를 유발하는 능력을 보유한다. 본 발명의 이전에, 생체내 복제 후 ts 표현형의 유전적 불안정성은 ts 바이러스에 있어서 통칙이었다 (Murphy 등, Infect. Immun. 37: 235-242 (1982)).
백신 및 다른 목적의 인간-소 키메릭 RSV 바이러스를 증식시키기 위해, RSV 성장을 허용하는 다수의 세포주를 사용할 수 있다. RSV는 다양한 사람 및 동물 세포에서 성장한다. 백신용 약독화 RS 바이러스를 증식시키기 위한 바람직한 세포주는 DBS-FRhL-2, MRC-5 및 베로 세포를 포함한다. 일반적으로 베로 세포와 같은 상피세포를 사용하여 가장 높은 바이러스 수율을 얻는다. 전형적으로 약 0.001 내지 1.0 이상 범위의 감염 다중도에서 바이러스를 사용하여 세포를 접종하고, 바이러스의 복제를 위해 허용된 조건, 예를 들면, 약 30 내지 37 ℃에서 약 3 내지 5일 동 안, 또는 바이러스가 적당한 역가에 도달하기에 필요한 만큼 배양한다. 바이러스를 세포 배양으로부터 회수하고, 전형적으로 널리 공지된 정화 방법, 예를 들면, 원심분리에 의해 세포 성분으로부터 분리하고, 목적하는 경우 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있다.
본원에 기술된 대로 약독화시키고 달리 변형시킨 인간-소 키메릭 RSV를 다양한 공지되고 일반적으로 허용되는 시험관내 및 생체내 모델에서 시험하여 적합한 약독화, 표현형 복귀변이에 대한 저항 및 백신용 면역원성을 확인할 수 있다. 시험관내 분석에서, 변화된 바이러스(예, 다양하게 약독화된 생물학적 유래 또는 재조합 RSV)를 바이러스 복제의 온도 민감성, 즉, ts 표현형, 및 작은 플라크 표현형에 대해 시험한다. 변화된 바이러스를 RSV 감염의 동물 모델에서 추가로 시험한다. 다양한 동물 모델이 기재되어 있고, 문헌[Meignier 등, 판, Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991), 본원에 참고로 인용됨]에 요약되어 있다. RS 감염의 코튼 랫트 모델이 미국 제4,800,078호 및 문헌[Prince 등, Virus Res. 3: 193-206 (1985), 본원에 참고로 인용됨]에 기재되어 있고, 사람 및 비사람 영장류에서의 약독화 및 효율에 대한 예측으로 고려된다. 뿐만 아니라, 문헌[Richardson 등, J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978); Wright 등, Infect. Immun. 37: 397-400 (1982); Crowe 등, Vaccine 11: 1395-1404 (1993), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 상세히 기재된 바와 같이, 침팬지를 사용하는 RSV 감염의 영장류 모델로부터 사람에서의 약독화 및 효율을 예측한다.
RSV 백신 후보물의 약독화 및 감염도를 평가하기 위하여 설치류 및 침팬지를 포함하는 RSV 모델 시스템은 당업게에서 널리 허용되는 것이고, 이로부터 얻은 데이타는 RSV 감염 및 약독화와 충분히 관련된다. 생쥐 및 코트 랫트 모델이 후보 RSV 바이러스가 예를 들면 RSV 아군 B 바이러스의 경우에 침팬지에서 부적합한 성장을 나타내는 경우에 특히 유용하다.
상기 및 하기의 실시예에 따르면, 본 발명은 또한 백신 용도의 단리된 감염성 인간-소 키메릭 RSV 조성물을 제공한다. 백신의 한 성분인 약독화 키메릭 바이러스는 단리되고 전형적으로 정제된 형태이다. 단리되었다는 것은 야생형 바이러스의 선천성 환경, 예를 들면, 감염된 개체의 비인강 이외에 있는 RSV를 지칭한다. 더 일반적으로, 단리되었다는 것은 약독화 바이러스를 세포 배양 또는 다른 인공 배지의 성분으로 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 약독화 RSV를 감염된 세포 배양에 의해 생산하고, 세포 배양으로부터 분리하고, 안정화제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 키메릭 RSV 백신은 활성 성분으로서 본원에서 기술한 바와 같이 생성된 RSV의 면역학적 유효량을 함유한다. 생물학적 유래 또는 재조합체 RSV는 백신 조성물에 직접 사용되거나, 또는 동결건조될 수 있다. 동결건조 바이러스는 전형적으로 약 4 ℃에서 유지될 것이다. 하기에 더 기술하는 바와 같이, 사용하기에 앞서 동결건조 바이러스는 아주반트와 함께 또는 아주반트 없이 예를 들면, 식염수 또는 SPG, MG++ 및 HEPES를 포함하는 안정화 용액에서 재구성된다. 생물학적 유래 또는 재조합으로 변경된 바이러스는 생리학적으로 허용가능한 담체 및(또는) 아주반트와 함께 숙주에 도입될 수 있다. 유용한 담체는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 물, 완충수, 0.4％ 식염수, 0.3％ 글리신, 히알루론산 등이 포함된다. 생성된 수용액은 사용을 위해 자체로 또는 동결건조되어 포장되고, 동결건조 제제는 상기한 바와 같이 투여 전에 멸균액과 결합될 수 있다. 조성물은 pH 조절제, 완충제, 등장화제, 습윤제 등과 같은 생리적 조건과 가깝게 하기 위해 요구되는 약제학적으로 허용가능한 보조제 성분, 예를 들면, 아세트산 나트륨, 젖산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 모노라우린산 소르비탄, 올레산 트리에탄올아민 등을 함유할 수 있다. 허용가능한 아주반트로는 당업계에 널리 공지된 물질인 불완전 프로인트 아주반트, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄 또는 백반이 포함된다. 또한, 바람직한 아주반트로는 스티뮤론 QS-21 (Stimulon(등록 상표) QS-21, 메사츄세츠주 파밍엄 소재의 Aquila Biopharmaceuticals, Inc.), 엠피엘 (MPL(등록 상표), 3-0-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; 몬타나주 해밀톤 소재의 RIBI ImmunoChem Research, Inc.) 및 인터루킨-12 (메사츄세츠주 캠브리지 소재의 Genetics Institute)가 포함된다.
에어로졸, 액적, 경구, 국소 또는 다른 경로를 경유하여 본원에 기술한 키메릭 RSV 백신 조성물을 사용하여 면역화할 때, 숙주의 면역 시스템은 하나 이상의 RSV 바이러스 단백질, 예를 들면, F 및(또는) G 당단백질에 특이적인 항체를 생성함으로써 백신에 반응한다. 예방접종의 결과로서, 숙주는 적어도 부분적으로 또는 완전히 RSV 감염에 면역화되거나, 또는 특히 하기도의 완만하거나 또는 심한 RSV 질병에 내성이 된다.
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV 백신은 단일 RSV 균주 또는 항원성 아군(예, A 또는 B), 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 면역 반응을 일으키는 약독화 키메릭 바이러스를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 키메릭 RSV는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대하여 단일특이적 면역 반응 또는 다중특이적 면역 반응을 일으킬 수 있다. 별법으로, 상이한 면역원성 특성을 갖는 키메릭 RSV를 백신 혼합물로 결합하거나, 또는 대등 치료 프로토콜로 별도로 투여하여 하나의 RSV 균주, 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대하여 더 효과적인 방어를 일으킬 수 있다.
백신이 투여되는 숙주는 RSV 또는 밀접하게 관련된 바이러스에 감염되기 쉽고 예방접종 바이러스의 항원에 대한 방어적 면역 반응을 일으킬 수 있는 어떠한 포유류일 수 있다. 따라서, 적합한 숙주로는 인간, 비인간, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 라가모프(lagamorph), 설치류 등이 포함된다. 따라서, 본 발명은 다양한 사람 및 가축 용도의 백신을 생성하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 약독화 인간-소 키메릭 RSV를 함유하는 백신 조성물을 RSV에 대한 개체의 면역 반응 역량을 유발하거나 또는 증진시키기에 충분한 "면역학적 유효량"으로 RS 바이러스 감염에 걸리기 쉽거나 위험성이 있는 환자에 투여한다. 사람의 경우에, 본 발명의 약독화 바이러스를 문헌[Wright 등, Infect Immun. 37: 397-400 (1982); Kim 등, Pediatrics 52: 56-63 (1973); 및 Wright 등, J. Pediatr. 88: 931-936 (1976), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기재된 바와 같이, 잘 확립된 사람 RSV 백신 프로토콜에 따라 투여한다. 즉, 전형적으로 생리학적으로 허용가능한 희 석제 또는 담체 0.5 ml 중에 면역학적 유효량의 RSV 백신을 사용하여 액적으로 성인 또는 어린이를 비강내 접종한다. 이것은 비복제 백신을 사용한 비경구 면역화와 비교하여 간단하고 안전하다는 장점을 갖는다. 이것은 또한 RSV에 대한 내성에서 주요한 역할을 하는 국소 기도 면역의 직접적인 자극을 제공한다. 나아가, 이러한 형태의 예방접종은 전형적으로 매우 어린 사람에게서 발견되는 RSV 특이성 모계 유래의 혈청 항체의 면역억제 효과를 효과적으로 우회한다. 또한, RSV 항원의 비경구 투여가 때때로 면역병리학적 합병증과 관련될 수 있는 반면, 생바이러스를 사용한 경우에는 이것이 조금도 관찰되지 않았다.
모든 대상에서, 투여된 인간-소 키메릭 RSV 백신의 정확한 양, 및 투여의 시간조절 및 반복은 환자의 건강 상태 및 증량, 투여 방식, 조성물의 성질 등을 기초하여 결정할 수 있을 것이다. 투여량은 일반적으로 환자 당 약 103 내지 약 106 플라크 형성 단위(PFU) 이상의 바이러스, 더 일반적으로는 환자 당 104 내지 105 PFU 바이러스의 범위일 것이다. 어느 경우에서도, 백신 제제는 예를 들면, 다른 방법 중에서 보체 결합, 플라크 중화, 및(또는) 효소 관련 면역흡착 분석에 의해 측정할 수 있는 바와 같이, 항RSV 면역 반응을 효과적으로 자극 또는 유발하기에 충분한 양의 본 발명의 약독화 RSV를 제공해야 한다. 이와 관련하여, 또한 개체에서 상기도 질환의 증상 및 징후를 모니터한다. 침팬지에의 투여에 있어서, 백신 중의 약독화 바이러스는 피접종자의 비인강에서 야생형 바이러스보다 약 10 배 이상 더 낮은 수준으로, 또는 불완전하게 약독화된 RSV의 수준과 비교시 약 10 배 이상 더 낮 은 수준으로 성장한다.
신생아 및 유아에 있어서, 충분한 수준의 면역화를 일으키기 위해 중복 투여가 요구될 수 있다. 투여는 생후 1개월 내에 시작되어야 하고, 유년기를 통해 선천성(야생형) RSV 감염에 대한 충분한 수준의 방어를 유지하기에 필요한 간격으로, 예를 들면, 2개월, 6개월, 1년 및 2년으로 투여되어야 한다. 마찬가지로, 반복되거나 또는 심한 RSV 감염에 특히 걸리기 쉬운 성인, 예를 들면, 건강 보호 근로자, 일일 근로자, 어린 아이의 가족 구성원, 노인, 손상된 심폐 기능을 갖는 개체는 방어적 면역 반응을 확립 및(또는) 유지하기 위해 다중 면역화를 요구할 수 있다. 유발된 면역화의 수준은 중화 분비 및 혈청 항체의 양 및 목적하는 수준의 방어를 유지하기 위해 필요한 조절된 투여량 또는 예방접종을 측정함으로써 모니터할 수 있다. 나아가, 상이한 백신 바이러스를 상이한 수용체 군에 투여할 수 있다. 예를 들면, 사이토킨 또는 T 세포 에피토프가 풍부한 부가의 단백질을 발현는 엔지니어링 키메릭 RSV 균주는 유아보다는 성인에게 특히 유리할 수 있다. 본 발명에 따라 생성된 RSV 백신은 또다른 RSV 아군 또는 균주의 항원을 발현하는 바이러스와 결합하여 다수의 RSV 아군 또는 균주에 대한 방어를 달성할 수 있다. 별법으로, 백신 바이러스는 본원에 기술한 하나의 RSV로 설계된 다수의 RSV 균주 또는 아군의 방어 에피토프를 포함할 수 있다.
전형적으로 상이한 백신 바이러스를 사용할 때, 이들을 혼합물로 동시에 투여할 것이나, 별도로 투여할 수도 있다. 예를 들면, 두 개의 RSV 아군의 F 당단백질은 아미노산 서열이 약 10％ 차이가 나므로, 이러한 유사성은, RSV 또는 F 항원 으로 면역화하고 이종 균주로 유발시킨 한 동물에서 관찰되는 바와 같이, 교차 방어적 면역 반응에 대한 기초가 된다. 따라서, 한 균주를 사용한 면역화는 동일 또는 상이한 아군의 상이한 균주에 대하여 방어할 수 있다.
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV 백신은 개체가 후속적으로 야생형 RSV에 감염될 때, 폐렴 및 기관지염과 같은 심한 하기도 질환에 대해 방어적인 면역 반응의 생성을 일으킬 수 있다. 자연적으로 순환하는 바이러스는 특히 상기도에서 여전히 감염을 일으킬 수 있는 반면, 예방접종 및 가능하게는 야생형 바이러스에 의한 후속적인 감염에 의한 내성의 상승의 결과로서 비염의 가능성은 크게 감소된다. 예방접종 후, 시험관내 및 생체내에서 상동(동일 아군의) 야생형 바이러스를 중화할 수 있는 혈청 및 분비 항체를 발생시킨 검출가능한 수준의 숙주가 존재하였다. 많은 경우에서, 숙주 항체는 또한 상이한 비백신 아군의 야생형 바이러스를 중화할 것이다.
본 발명의 바람직한 인간-소 키메릭 RSV는 사람에게서 자연적으로 순환하는 야생형 바이러스와 비교할 때, 매우 실질적인 독성의 감소를 나타낸다. 키메릭 바이러스는 충분히 약독화되어 대부분의 면역화된 개체에서 감염의 징후가 일어나지 않을 것이다. 어떤 경우에서, 약독화 바이러스는 예방접종되지 않은 개체에 여전히 유포될 수 있다. 그러나, 그 독성은 충분히 제거되어서 예방접종하였거나 또는 부수적인 숙주에서 심한 하기도 감염은 일어나지 않는다.
인간-소 키메릭 RSV 백신 바이러스의 약독화의 수준은 예를 들면, 면역화된 숙주의 기도에 존재하는 바이러스의 양을 정량하고, 그 양을 야생형 RSV 또는 후보 백신 균주로 평가된 다른 약독화 RSV에 의해 생성된 것과 비교함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약독화 키메릭 바이러스는 야생형 바이러스의 복제 수준과 비교하여, 매우 감수성인 숙주(예, 침팬지)의 상기도에서의 복제가 예를 들면, 10 내지 1000 배 미만으로 더 크게 제한될 것이다. 또한, 침팬지의 상기도에서 약독화 RSV 백신 균주의 복제 수준은 이전에 혈청반응음성인 유아에서 불완전하게 약독화된 것으로 입증된 RSV A2 ts-1 돌연변이체보다 적어야 한다. 상기도에서 바이러스의 복제와 관련된 비루의 발생을 더 감소시키기 위해, 이상적인 후보 백신 바이러스는 상기도 및 하기도에서 제한된 수준의 복제를 나타내야 한다. 그러나, 본 발명의 약독화 바이러스는 예방접종된 개체에 방어를 부여할 수 있을 정도로 충분히 감염성이고 면역원성이어야 한다. 감염된 숙주의 비인강에서 RS 마이러스의 수준을 결정하는 방법은 문헌에 널리 공지되어 있다. 비인강 분비물을 흡인하거나 또는 세척하여 표본을 얻고, 조직 배양 등에서 실험실적 방법에 의해 바이러스를 정량한다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용된 문헌[Belshe 등, J. Med, Virology 1: 157-162 (1977); Friedewald 등, J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968); Gharpure 등, J. Virol. 3: 414-421 (1969); 및 Wright 등, Arch. Ges. Virusforsch. 41: 238-247 (1973)]을 참조한다. 바이러스는 편의상 침팬지와 같은 숙주 동물의 비인강에서 측정될 수 있다.
어떤 경우에서는, 본 발명의 키메릭 RSV 백신을 다른 물질, 특히 다른 유년기 바이러스에 대한 방어적 반응을 유발하는 백신과 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 키메릭 RSV 백신을 본원에 참고로 인용된 문헌[Clements 등, J. Clin. Microbiol. 29: 1175-1182 (1991)]에 기재된 바와 같이, 파라인플루엔자 바이러스와 동시에 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 키메릭 RSV는 본원에 기술한 바와 같이, 파라인플루엔자와 같은 다른 기도 병원균의 방어 항원을 코딩하는 서열을 감염성 키메릭 RSV를 생성하는데 사용되는 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈에 포함시킴으로써, 상기 방어 항원에 대한 벡터로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 키메릭 RSV는 기도의 일시적 유전자 요법을 위한 벡터로 사용된다. 이 태양에 따르면, 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 관심있는 유전자 생성물을 코딩할 수 있는 서열을 포함한다. 관심있는 유전자 생성물은 RSV 발현을 조절하는 것과 동일하거나 또는 상이한 프로모터의 조절을 받는다. 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 N, P, L 및 M2(ORF1)과 공동발현시킴으로써 생성되었으며 관심있는 유전자 생성물을 코딩하는 서열을 함유하는 감염성 RSV를 환자에 투여한다. 이는 완전히 감염성 (즉, 배양된 세포를 감염시키고, 감염성 후손을 제조하기 충분함)인 재조합 RSV를 포함할 수 있거나, 또는 예를 들면 G, F 및 SH 표면 당단백질 유전자 중 1 이상이 결여되고, 안정 또는 일시적 발현에 의해 트랜스에 이들 단백질 1 이상을 제공하는 세포에서 증식되는 재조합 RSV일 수 있다. 이러한 경우, 제조된 재조합 바이러스는 효과적인 감염에 충분할 수 있으나, 감염성 입자를 제조하는데는 매우 비효과적일 수 있다. 발현된 세포 표면 당단백질이 없다는 것은 또한 감염된 세포를 제거하는 숙주 면역 시스템의 효율을 감소시킬 수 있다. 이들 성질은 외래 유전자의 발현의 내구성 및 안전성을 증가시킬 수 있다.
투여는 전형적으로 에어로졸, 분무기, 또는 치료될 환자의 기도로의 다른 국소 적용에 의한다. 인간-소 키메릭 RSV는 목적하는 유전자 생성물의 치료적 또는 예방적 수준의 발현을 야기하기에 충분한 양으로 투여된다. 이 방법으로 투여된 대표적 유전자 생성물은 예를 들면, 일시 발현에 특히 적합한 것, 예를 들면, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마-인터페론, GM-CSF, G-CSF, 에리트로포이에틴, 및 다른 사이토킨, 글루코세레브로시다제, 페닐알라닌 히드록시3라제, 시스틱 피브로시스 경막 전도 조절제 (CFTR), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스페라제, 사이토톡신, 종양 억제 유전자, 안티센스 RNA 및 백신 항원을 코딩하는 것 등이다.
하기 실시예는 설명을 위해 제공되고 본 발명의 제한하지 않는다.
실시예 I
키메릭 BRSV/HRSV 안티게놈을 코딩하는 cDNA의 구성 및 감염성 rBRSV/A2 키메릭 바이러스의 회수
감염성 rBRSV는 HRSV에 대해 기술된 것과 유사한 전략을 사용하여 (각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 문헌[Collins et al., J. Virol. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11259-11264, 1999; Bukreyev et al., J. Virol. 70:6634-6641, 1996; Bukreyev et al., J. Virol. 71:8973-8972, 1997; Whitehead et al., J. Virol. 72:4467-4471, 1998; Whitehead et al., Virology 247:232-239, 1998; Collins et al., Virology 259:251-225, 1999; Bukreyev et al al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2367-2372, 1999; Juhasz et al., Vaccine 17:1416-1424, 1999; Juhasz et al., J. Virol. 73:5176-5180, 1999; Teng and Collins, J. Virol. 73:466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:9773-9780, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:871-877, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999; Murphy et al., 미국 특허 제5,993,824호]), 바이러스 안티게놈 RNA 및 N, P, M2-1 및 L 지지 단백질 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999)를 코딩하는 클로닝된 cDNAs로부터 회수할 수 있다. 그러나, T7 RNA 중합효소는 효소를 발현하는 우두 바이러스 재조합체로 감염에 의한 것 (Buchholz et al., J. Virol 73:251-259, 1999) 보다는, 이 효소를 안정하게 발현하는 세포주의 사용을 통하여 지지되었다.
rBRSV에 대한 cDNA는 추가 이형 종결 뉴클레오티드 없이 진정 3' 및 5' 말단을 갖는 완전한 rBRSV 안티게놈 RNA를 코딩하도록 설계되었다. 이 cDNA는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 의해 제공되는 A51908 균주로부터 차례로 유도되는 생물학적 부모 ATue51908 균주 (id.)의 것과 본질적으로 구별할 수 없는 시험관내 성장 성질을 갖는 감염성 rBRSV를 코딩한다.
본 발명에 사용하기 위하여, 상기 플라스미드는 다음과 같은 표준 방법 (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382, 1987; 본원에 참고문헌으로 삽입됨)에 따라서 위치 지향성 돌연변이유발에 의해 변형하였다: 먼저, NS1 비코딩 영역 중의 독특한 합성 NotI 부위 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251=9, 1999, 본원에 참고문헌으로 삽입됨)을 제거하여 ATue51908 야생형 서열 (진뱅크 수탁 번호 AF 092942)를 얻었다. 두번째로, 합성 마커 제한 부위를 SH/G (SalI, ATue51908 nt 4,673), G/F (SphI, Atue51908 nt 5,539) 및 F/M2 (XhoI, ATue51908 nt 7,471 및 ClaI, ATue51908 nt 7,485) 유전자간 영역 (도 1B)로 도입하였다. 얻은 플라스미드를 pBRSV18 (pBRSV18에서 BRSV cDNA에 대한 진뱅크 수탁 번호는 AF092942)로 하였다. 이 cDNA는 BRSV/HRSV 키메라를 구성하기 위한 부모로 사용하였다. 이 부모 cDNA로부터 회수된 rBRSV는 시험관내 성장 특성의 면에서 생물학적으로 유도된 ATue51908로부터 본질적으로 구별할 수 없었고, 따라서 야생형 성장 표현형을 나타내는 것으로 여겨진다.
HRSV 균주 A2의 상기 보고한 재조합 버전의 G 및 F 유전자 (nt 4,674 내지 7,551) (1995년 9월 27일 출원된 미국 가출원 제60/007,083호; 1996년 9월 27일 출원된 미국 특허 출원 제08/720,132호; 1996년 7월 15일 출원된 미국 가출원 제60/021,773호; 1997년 5월 9일 출원된 미국 가출원 제60/046,141호; 1997년 5월 23일 출원된 미국 가출원 제60/047,634호; 1999년 11월 30일 공고된 미국 특허 제5,993,824호; 국제 공개 WO 제98/02530호; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨)은 G 유전자의 직전 상류 SalI 부위 및 F 유전자의 직전 하류 XhoI 부위 (도 1B)를 도입한 올리고뉴클레오티드 프라이머로 증폭하였다. PCR 생성물을 클로닝하고, 삽입 서열은 그 전체로 확인하였다. 이어서, 이들 SalI 및 XhoI 제한 부위를 사용하여 유전자 개시 및 유전자 종결/폴리아데닐화 신호를 포함하여 약 2,885 bp 단편 스패닝 HRSV G 및 F 유전자를 pBRSV 18로 전달하여 각각의 BRSV 유전자를 대체하였다. HRSV A2로부터 유도된 당단백질 유전자를 갖는 키메릭 BRSV 게놈을 코딩하는 얻은 플라스미 드는 pBRSV/A2-10이라 하였다. 도 1A는 pBRSV 18 및 pBRSV/A2-10으로부터 발현되는 재조합 바이러스 (rBRSV 및 rBRSV/A2)의 게놈 구성의 총괄도를 나타낸다. 플라스미드로부터 합성되는 키메릭 안티게놈은 부모 rBRSV의 것보다 87 nt 긴 15,227 nt 길이이다.
본질적으로 재조합 RSVs는 본원 여타 부분 및 상기 삽입된 참고문헌에 기술된 바와 같은 cDNA로부터 회수하였다. 32 mm 디쉬의 파지 T7 RNA 중합효소를 발현하는 서브합류(subconfluent) BSR T7/5 세포를 BRSV N, P, L 및 M2 단백질이 발현되는 4 개의 지지 플라스미드 세트 (2.5 g pH, 2.5 ㎍ pP, 0.5 ㎍ pL 및 0.5 ㎍ pM2) 및 각각의 전장 플라스미드 (pBRSV 18 또는 pBRSV/A2-10) 5 ㎍로 트랜스펙션하였다. 모든 cDNA 구성물은 T7 프로모터의 제어하에 클로닝하였다. 발현 플라스미드는 EMCV IRES 서열을 포함하여, 캡 비의존적 해독을 가능케한다. 트랜스펙션은 슈퍼펙트(Superfect) (Qiagen, Valencia, Califonia) 트랜스펙션 시약을 사용하여 수행하였다. 트랜스펙션 2 시간 후, 상층액을 제거하였으며, 세포를 세척하고, 3％ 우태아 혈청 (FCS)으로 보충한 최소 필수적 배지에서 유지하였다. 트랜스펙션 3 일 후, 세포를 1 내지 3의 비율로 분열시켰다. 세포 및 상층액을 트랜스펙션 7일 후에 수확하였다. 복제 트랜스펙션물을 메틸셀룰로오스로 씌우고, 분열 없이 5 일 동안 인큐베이션하였으며, 면역화학 염색으로 검사하였다. 이는 pBRSV 18 및 pBRSV/A2-10이 32 mm 디쉬 당 약 100 foci의 유사한 수준의 회수 바이러스를 얻음을 보여주었다. 상기 기준에 의하여, rBRSV/A2 바이러스는 rBRSV 부모형과 본질적으로 동일한 생종성을 나타내었다.
회수된 바이러스의 동일성을 확인하기 위하여, 바이러스 RNA을 감염된 세포로부터 회수하고, 역 전사 (RT)PCR에 의해 분석하였다. 반응은 ATue51908, rBRSV 및 rBRSV/A2 간을 구분할 수 있는 도 1B에 나타낸 마커 제한 부위를 포함하는 게놈 RNA의 3 영역을 복제 및 증폭하도록 설게된 프라이머로 수행하였다. RT에 사용한 프라이머는 BRSV (균주 ATue51908) M 유전자 (Atue51908 nt 3612 내지 3635)의 영역, BRSV G 유전자 (Atue51908 nt 5372 내지 5392) 또는 HRSV A2 G 유전자 (HRSV A2 nt 5442-5463), 및 BRSV F 유전자 (Atue51908 nt 7218 내지 7240) 또는 HRSV A2 F 유전자 (A2 nt 7309 내지 7329)에 상보성인 안티게놈 센스였다. RT 생성물 분취량을 각각의 유전자간 영역의 하류 게놈 서열 (SH/G 유전자간 영역의 하류 역 프라이머 ATue51908 nt 4886 내지 4862 및 HRSV A2 4878 내지 4856; G/F 유전자가 영역의 하류 역 프라이머 ATue51908 nt 5964 내지 5941 및 HRSV A2 nt 6055 내지 6033, 및 F/M2 유전자간 영역으 하류 역 프라이머 ATue51908 nt 7852 내지 7832)에 상응하는 상기 언급한 각각의 제1 가닥 프라이머 및 역 프라이머를 사용하여 PCR에 사용하였다.
도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, RT-PCR 반응은 각각 각 경우의 전기영동 이동이 계산한 예측정도와 일치되는 단일 cDNA를 생성하였다. RT 단계가 빠지면 PCR 생성물이 검출되지 않았으며, 이는 생성물이 오염 DNA로부터 보다는 RNA로부터 유래함을 입증한다. RT-PCR 생성물을 소화 제한 효소 (SalI, StuI, SphI 및 XhoI)로 소화시켰으며, 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 모든 경우에서, 예측한 제한 패턴을 얻었으며, 이는 각 바이러스가 예측한 제한 부위 마커를 포함함을 나타내는 것이다. 구체적으로, ATue51908 생물학적으로 유도된 바이러스는 검사한 영역 내에 4 개 부위 모두가 결여되었으며, 모든 재조합체는 SH/G 유전자간 영역에 위치하는 단일 SolI 및 F/M2 영역 내에 단일 XhoI 부위를 포함하고, rBRSV는 G/F 유전자간 영역 내에 단일 SphI 부위를 포함하며, rBRSV/A2는 상기 후자의 영역 내에 단일 StuI 부위를 포함하였다. 또한, RT-PCR 생성물을 자동화 서열분석기 (LI-COR, MWG)를 사용하여 서열분석하여, 예측한 서열을 확인하였다. 따라서, 키메릭 rBRSV/A2 바이러스는 예측한 구조를 가지며, 회수 동안 서열 변화는없었다.
실시예 II
재조합 키메릭 rBRSV/A2 바이러스의 시험관내 분석
추가 분석용 바이러스 원액을 제조하기 위하여, 단층의 소 MDBK 세포을 rBRSV 또는 rBRSV/A2로 0.1의 감염 다중도 (MOI)로 감염시켰다. 흡착 90 분 후, 접종물을 제거하고, 세포를 3％ 우태아 혈청 (FBS)로 보충한 최소 필수 배지에서 유지하였다. 전형적으로 접종 후 4 내지 7일 후, 세포 병변 효과 (CPE)가 판정될 때, 배지를 바이러스를 안정화하기 위하여 10 mM MgSO4 및 50 mM HEPES (pH 7.5)로 조정하였으며 (Fernie and Gerin, Virology 106:141-4, 1980, 본원에 참고문헌으로 삽입됨), 세포 및 배지를 바이러스를 방출하기 위하여 -70℃로 3회 급속 냉각시키고 급속 해동하였다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. 생물학적으로 유 도된 HRSV 균주 Long을 동일한 방법으로 HEp-2 세포에서 증식히켰다. 균주 Long은 서열 분석 및 대부분의 모노클로날 항체와의 반응성에 대해서 균주 A2와 매우 유사하고, 따라서 이들 특별한 검정에서 균주 A2에 대한 대리물로 사용된다 (Johnson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5625-9, 1987; Johnson and Collins, J. Gen. Virol. 70:1539-47, 1989; Lopez, et al., Virus Res. 10:249-61, 1988, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨). ATue51908 생물학적으로 유도된 부모형은 시험관내 성장 성질이 재조합 유도체 rBRSV와 실질적으로 동일하므로 동시에 분석되지 않으며 따라서 BRSV 대조로 사용되었다. 바이러스 적정은 상기 기술된 대로 수행하였다 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-9, 1999, 본원에 참고문헌으로 삽입됨).
rBRSV, rBRSV/A2 및 HRSV 균주 Long에 의한 인간 HEp-2 세포에서의 G 단백질의 발현은 직접 면역형광에 의해 검사하였다. HEp-2 세포는 0.1의 MOI로 감염시켰고, 감염 36 시간 후 80％ 아세톤으로 고정시켰고, BRSV G (1:1000 희석) (Furze, et al., J. Gen. Virol. 75:363-70, 1994; Langedijk, et al., J. Virol. 71:4055-61, 1997, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨)에 관한 생쥐 모노클로날 항체 (mab) G66, 또는 HRSV G (1:40 희석)에 관한 mab 021/01G (Garcia-Barreno et al., J. Virol. 63:925-32, 1989; Martinez and Melero, J. Gen. Virol. 79:2215-20, 1998, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨)와 30 분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트 컨쥬게이션된 염소 항-생쥐 IgG (Dianova, Hamburg)로 염색하고, 0.01％ 에반스 블루로 대응염색하였다.
예측한 바와 같이, BRSV-특이적 mab는 rBRSV와 반응하였으나, rBRSV/A2 또는 HRSV와는 반응하지 않았다 (표 1). 반대로, HRSV-특이적 mab는 rBRSV/A2 및 HRSV와는 반응하였으나, rBRSV와는 반응하지 않았다. rBRSV 및 HRSV의 반응성의 패턴은 각각 그 소 및 인간 특이성과 일치하였고, rBRSV/A2의 반응성의 패턴은 이것이 소 기원의 것 보다는 인간의 G 단백질을 발현함을 확인하였다. 한편으로, 키메릭 rBRSV/A2 바이러스는 HEp-2 세포에서 세포병변 효과 (CPE)를 유도하였고, 이는 HRSV 보다는 rBRSV의 것과 더욱 유사하였다. 예를 들면, HRSV로 감염시킨 배양물에서, rBRSV로 감염시킨 경우 20％ 및 rBRSV/A2로 감염시킨 경우 20-30％와 비교하여 거의 100％의 세포가 양성 면역형광을 나타내었다. 또한, HRSV는 큰 신시티움의 형성과 함께 판단된 CPE를 유발하는 반면, rBRSV 및 rBRSV/A2는 감소된 수준의 CPE 및 더 작은 신시티움의 형성을 일으킨다. 따라서, 인간 세포주에서의 키메릭 rBRSV/A2의 감염성 및 CPE는 rBRSV 부모의 것과 더욱 밀접히 닮아있다. 이는 표면 당단백질 G 및 F를 단독으로 rBRSV로 전달하는 것은 인간 세포에서의 성장에 대한 HRSV의 충분한 허용성을 수여하지 않음을 나타내고, 이는 추가 HRSV 유전자 보조가 HEp-2 세포에서의 성장 특성을 결정함을 암시한다.
rBRSV/A2 및 rBRSV/LongF 재조합 바이러스에서의 적합한 F 및 G 당단백질의 존재의 모노클로날 항체a와의 반응성에 의한 확인
mab 특이성 rBRSVa rBRSV/A2a rBRSV/LongFa HRSVa
G66 BRSV G + - + -
021/1G HRSV G - + - +
2F RSV F + + + +
44F HRSV F - + + +
a. 직접 면역형광 검정 및 면역전자 현미경에서의 반응성
rBRSV, rBRSV/A2 및 HRSV 균주 Long의 다주기 성장을 MDBK 및 HEp-2 세포에서 비교하였다 (도 3). 24 웰 디쉬 중의 동등한 숫자의 서브합류 MDBK 세포 및 HEp-2 세포를 0.1의 MOI로 바이러스로 감염시켰다. 흡착 90 분 후, 접종물을 제거하고, 세포를 3％ FBS를 포함하는 배지로 2회 세척하였다. 감염 후 여러 시간에서, 복제 웰을 수확하고, 배지를 100 mM MgSO4 및 50 mM HEPES (pH 7.5)로 조정하였으며, 세포 및 배지를 3회 급속 냉동 및 해동하였다. 배지를 원심분리에 의해 맑게하였으며, 바이러스를 적정하였다. HEp-2 세포에서는, HRSV는 rBRSV 보다 약 10 배의 바이러스를 생산한 반면 (도 3A), MDBK 세포에서는 상황이 반대였다 (도 3B). MDBK 세포에서는, HRSV는 2 일 후에 최대 역가에 도달한 반면, rBRSV는 계속 성장하여 4 내지 5 일 후에 최대에 도달하였다. 이들 결과는 소 세포주에서의 HRSV의 부분적 성장 제한과 일치한다. 흥미롭게도, 키메릭 rBRSV/A2는 인간 및 소 세포주 모두에서 약 2 배 rBRSV보다 잘 복제되었고, 소 세포에서는 성장 곡선은 HRSV 보다는 rBRSV의 것과 흡사하였다. 상기 결과는 키메릭 바이러스의 성장 특성이 부모형과 동일하고, 키메릭 성질과 일치하지 않음을 보여준다. 다주기 성장 실험에서 효과적으로 복제되는 능력은 HRSV G 및 F 단백질이 rBRSV 배경에서 기능적임을 나타낸다. 가장 중요하게는, 상기 결과는 키메릭 바이러스가 하나는 인간 기원이고, 하나는 소 기원인 2 개의 세포주에서 성장하기 충분하다는 것이다.
면역전자 현미경을 사용하여 적합한 특이성의 G 단백질의 존재에 대하여 비리온을 검사하였다. MDBK 세포는 0.1 MOI의 rBRSV, rBRSV/A2 또는 HRSV로 감염시켰다. 감염 72 시간 후, CPE를 판단하고, 물질을 완충시킨 0.05％ 글루타르알데히드로 15 분 동안 고정하여 비리온 구조를 안정화시켰다. 단층을 플레이트에서 제거하고, 저속 원심분리 후 펠렛을 소량의 완충액에 재현탁하였다. 포름바(formvar) 코팅한 300 메시(mesh) 구리 그리드 방출, 탄소로 안정화 글로우(glow)는 세포 현탁액 방울 상에 띄웠다. 항체의 비특이적 흡착은 1％ 소 혈청 알부민 (PBS-BSA)를 포함하는 표준 인산 완충 식염수 (PBS) 중의 1％ 냉수 피시 젤라틴 (Sigma, Deisenhofen, Germany)로 그리드를 처리하여 봉쇄하였다. 이어서, 그리드를 모노클로날 항체의 방울 상에 45 분 동안 띄웠고 (2F, HRSV 및 BRSV F에 특이적, 44F, HRSV F에 특이적, 021/1G, HRSV G에 특이적, 및 66G, BRSV G에 특이적 (Garcia-Barreno et al., J. Virol. 63:925-932, 1989; Martinez et al., J. Gen. Virol. 79:2215-2220, 1998)), PBS-BSA에 희석하였다. PBsS-BSA 세척을 수회 한 후, 결합 항체를 콜로이드성 금 (10 nm)로 라벨링한 염소 항-생쥐 면역글로불린 Fav (FAF10, BioCell Int., Cardiff, United Kingdom)으로 검출하고, 포스포텅스텐산 (PTA), pH 6.0으로 음성 염색하였다. 그리드를 400 T 주사 전자 현미경 (Philips, The Netherlands)를 사용하여 검사하였다. 이 과정은 비리온 구조를 완전하게 남겨두고, 외부 표면 항원의 검출을 가능하게 한다.
전자 현미경 분석은 rBRSV (도 4A), rBRSV/A2 및 HRSV 균주 Long의 제조에서 길이 수 ㎛이고, 직경 100 내지 200 nm의 섬유상 입자 다량을 밝혔다. 초박 부분 후 및 글루타르알데히드 고정 후 물질의 비교는 비리온의 형상이 글루타르알데히드 고정 후 유지되었음을 증명하였다. 글루타르알데히드 고정 후에 관찰되는 비리온 직경의 변이는 고정화 과정 도중의 입자의 탈수로 인한 것일 것이다 (도 4A 및 4B). 게다가, 항원 구조 및 모노클로날 항체의 반응성은 영향받지 않았다 (도 4A, 삽입물).
바이러스 제제는 BRSV 및 HRSV G 및 F 단백질에 대한 항체의 세트를 사용하여 면역전자 현미경 검사를 받고 (표 1), 이어서 금 컨쥬게이션된 염소 항-생쥐 면역글로불린으로 라벨링하며, 음성 염색하였다. HRSV F에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 (도 5B, 5D 및 5F), rBRSV/A2 비리온 표면의 조밀한 면역금 라벨링을 HRSV 비리온 표면의 라벨링 강도와 비교하여 (도 5F) 관찰할 수 있는 반면 (도 5D), rBRSV 비리온은 특이적 라벨링이 검출되지 않았다 (도 5B). BRSV 및 HRSV F 단백질 모두와 반응하는 항체 2F (도 5A, 5C 및 5E)를 대조로 사용하여 BRSV 제제를 포함하여 모든 바이러스 제제의 손상되지 않은 항원 구조를 증명하였다. 이는 rBRSV/A2 키메릭 바이러스 및 HRSV 양성 대조 바이러스가 HRSV F 단백질을 포함하는 반면, rBRSV 음성 대조 바이러스는 예측한 대로 이를 포함하지 않음을 확인하였다.
HRSV G 단백질에 관한 모노클로날 항체는 rBRSV/A2 (도 6D) 뿐만 아니라 HRSV 입자 (도 6F)와 반응하였으며, rBRSV 비리온 표면과 반응하지 않았다 (도 6B). BRSV G에 대한 항체를 대조로 사용하였을 때, 단지 rBRSV 비리온 표면만이 면역금 라벨링되었으나 (도 6A), 키메릭 비리온 (rBRSV/A2, 도 6C) 또는 HRSV (도 6E)의 비리온 표면은 그러하지 않았다. 이 결과는 rBRSV/A2 키메릭 바이러스 및 HRSV 대조 바이러스는 BRSV G 단백질을 포함하나 HRSV의 것은 포함하지 않는 반면, rBRSV 대조 바이러스는 BRSV G 단백질을 포함하나 HRSV의 것은 포함하지 않음을 확인하였다. 따라서, rBRSV/A2 키메릭 바이러스는 표면 당단백질로 HRSV G 및 F 단백질을 실제로 가지고, 생물학적으로 유도된 바이러스의 것에 필적하는 양으로 존재한다.
실시예 III
상이한 HRSV 아군 A 바이러스를 포함하는 단일 유전자 대체를 포함하는 키메릭 BRSV/HRSV 바이러스를 코딩하는 cDNA의 구성
상기 기술된 키메릭 rBRSV/A2 바이러스는 2개의 표면 당단백질 G 및 F의 동시적 치환을 포함하였다. 2개의 당단백질 중 단지 하나만을 포함하게 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 제조할 수 있는지, 및 상이한 아군 A 균주, 즉 Long 균주로 치환을 만들 수 있는지를 결정하는 것에 흥미가 있었다. BRSV F 유전자 대신에 HRSV 균주 Long F 유전자를 포함하는 2차 BRSV 안티게놈 cDNA을 구성하였다 (도 7A 및 7B). 총 RNA는 HRSV 균주 Long으로 감염시킨 HEp-2 세포로부터 만들었다. 이어서, 프라이머 FLa (밑줄 친 EcoRI/SphI 어댑터를 포함하는 HRSV 균주 Long F 유전자 서열의 nt 1 내지 28인 5'-AGGAATTCGCATGCGGGGCAAATAACAATGGAGTTGCCAATC-3' (SEQ ID NO.:21)) 및 FLRa (EcoRI/XhoI 어댑터를 밑줄친, HRSV 균주 Long F 유전자 nt 1903 내지 1874인 5'-AGGAATTCTCGAGTTTTTATATAACTATAAACTAGGAATCTAC-3' (SEQ ID NO.:22))를 사용하여 RT-PCR을 수행하여, 1,930 bp의 PCR 생성물을 얻었다. EcoRI 어댑터는 PCR 생성물을 사용하여 p블루스크립트 SK(pBluescript SK) (Stratagene, La Jolla, CA)로 클로닝하였다. PCR 생성물을 서열분석하였고, 1,906 bp 단편을 SphI 및 XhoI로 절제하고, pBRSV18의 SphI-XhoI 윈도우로 전달하여 pBRSV/LongF-12를 얻었다. 이는 15,114 nt의 키메릭 RSV 안티게놈을 코딩한다.
플라스미드 pBRSV/LongF-12은 상기 기술한 바와 같이 T7 RNA 중합효소를 안정하게 발현하는 BSR T7/5 세포 상으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 5일 후, 전형적으로 RSV에 대한 주위 세포의 세포병변 효과가 모든 트랜스펙션 디쉬에서 관찰할 수 있었다. rBRSV, rBRSV/A2 및 rBRSV/LongF의 회수율은 동등하게 높았으며, 전형적으로 32 mm 디쉬당 약 100 foci를 얻었다. 바이러스 원액은 MDBK 세포 상의 트랜스펙션으로부터의 상층액의 2회 계대 배양에 의해 제조하였다.
BRSV F 유전자 서열 대신에 HRSV 균주 LongF 유전자를 포함하는 재조합 BRSV의 동일성을 시험하기 위하여, RT-PCRs를 2회 수행하였다 (도 8). F 유전자의 상류 및 하류에 BRSV 골격의 서열로 혼성화한 프라이머쌍을 사용하여 1차 RT-PCR을 수행하여 (도 8, PCR1), BRSV 균주 ATue51908에 및 재조합 유사체 rBRSV, 및 rBRSV/LongF에 대한 2,161 nt의 생성물을 얻었다. 예측한 바와 같이, 상기 BRSV 프라이머 쌍을 사용하여 HRSV 균주 Long RNA로부터는 PCR 생성물이 얻어지지 않았다. 제한 분석할 때, 표준 BRSV 균주 Atue51908이 아닌 재조합 바이러스는 SphI에 의해 절단되었고 (rBRSV에 대한 2,028 bp 및 159 bp, 및 rBRSV/LongF에 대한 2,002 bp 및 159 bp의 밴드), 이는 합성 SphI 마커 제한 부위 (rBRSV 및 rBRSV/LongF pos. 5539)의 존재를 확인시킨다. EcoRI은 BRSV ATue51908 및 rBRSV F 유전자 (게놈 pos. 6233)의 천연 발생 EcoRI 부위를 절단하여 1,334 nt 및 853 nt의 2개의 단편을 얻는 반면, rBRSV/LongF로부터 기원하는 단편은 예측한 바와 같이 EcoRI에 의해 절단되지 않는다. PstI에 의해 소화시켰을 때, BRSV F 유전자를 포함하는 단편은 절단되지 않고 남아있는 반면 rBRSV/LongF 생성물은 1,351 bp, 586 bp 및 224 bp의 3개의 단편으로 절단되고, 이는 HRSV Long F 유전자 서열에 포함되는 2개의 천연 발생 PstI 부위 (pos. 63 및 649)의 존재를 확인시킨다 (Long 서열은 완전한 게놈 서열이 입수가능하지 않으므로 개별 유전자에 대해 나타내었음을 주목). HRSV 균주 Long F 유전자에 대해 혼성화한 프라이머쌍을 사용하여 2 차 RT-PCR을 수행하여 (도 8, PCR2), rBRSV/LongF 및 HRSV 균주 Long 부모 바이러스에 대한 1,093 bp의 PCR 생성물을 얻었다. 예측한 바와 같이, rBRSV로부터는 생성물이 얻어지지 않았다. PstI 및 EcoRI으로 소화시킨 것은 예측한 절단 패턴을 얻었다 (도시하지 않음). 또한, RT-PCR 생성물은 자동화 서열분석기 (LI-COR, MWG)를 사용하여 서열분석하여, 예측한 서열을 확인하였다. 따라서, 키메릭 재조합 rBRSV/LongF 바이러스를 예측한 구조를 가졌고, 회수 및 통과 도중에 서열 변화는 없었다.
rBRSV/LongF 키메릭 바이러스는 rBRSV/A2 바이러스에 대해 상기 기술한 바와 같이 면역전자 현미경에 의해 분석하였다. BRSV G 단백질에 대해 특이성인 mab G66으로 rBRSV/LongF를 분석한 것은 강한 반응성을 나타낸 반면 (도 9A), HRSV G 단백질에 특이성인 mab 021/21G로는 관찰되지 않았다 (도 9B). 또한, rBRSV/LongF는 HRSV F에 특이성인 mab 44F (도 9D) 뿐만 아니라 HRSV 및 BRSV F 단백질에 특이 성인 mab 2F (도 9C)와 강한 반응성이 있었다. 이는 상기 키메릭 바이러스가 부모 BRSV G 단백질을 HRSV 균주 Long 유래의 이형 F 당단백질과 함께 포함한다는 것을 보여주었다.
실시예 IV
혈청 음성 어린 침팬지에서의 rBRSv/A2 키메릭 바이러스의 성장
HRSV에 대해 혈청음성으로 확인된 어린 침팬지를 각 부위에 rBRSV 또는 rBRSV/A2 ml 당 107 pfu의 용량으로 비강내 및 기관내 경로 모두로 접종하였다. 각 바이러스는 2 마리 침팬지에 투여하였다. 바이러스의 접종 후, 비인두 면봉 샘플은 1-10 및 12일에 매일 취하였고, 기관 세척 샘플은 2, 5, 6, 8 및 12일에 취하였다. 검체는 냉동시키고, RSV 역가를 HEp-2 세포 상의 플라크 검정에 의해 후에 측정하였다. 상기도병의 척도인 비루의 양을 매일 평가하고, 0-4의 스코어를 할당하였다 (0=없음, 1=매우 약함, 2=약함, 3=보통, 4=심함). 결과를 동일한 경로로 투여한 (i) 재조합 HRSV 균주 A2 야생형 바이러스를 부위당 104 pfu (Whitehead, et al., J. Virol. 72:4467-4471, 1998, 본원에 참고문헌으로 삽입됨) 또는 생 약독화된 rA2cp28/404 균주 A2 백신 후보물을 부위당 105 pfu (Whitehead, et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999, 본원에 참고문헌으로 삽입됨) 투여받은 동물의 이전 기록 대조와 비교하였다.
Figure 112002000618146-pct00007
야생형 HRSV는 혈청 음성 침팬지에서 매우 허용적이고, 상기 실습에서 코 면봉 또는 기관 세척 시료 ml 당 4.5 log10 pfu 이상의 피크 평균 역가로 복제되었다 (표 2). 피크 비루 스코어는 2.5였다. 생 약독화 백신 후보물 rA2cp248/404 (예를 들면, 1999년 11월 30일 공고된 미국 특허 제5,993,824호; 국제 공개 WO 제98/02530호; Collins, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; Whitehead, et al., Virology 247:232-239, 1998, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨)은 각각 상기도 및 하기도에서 면봉/세척 ml 당 2.5 및 1.4 log10 pfu의 평균 피크 역가로 복제되었고, 0.8의 피크 비루 스코어를 가졌다. 반대로, 상기도 또는 하기도에서 rBRSV는 검출가능하게 복제되지 않았고, 질병의 증거는 없었다. 따라서, HRSV 용량 100-1000 배로 투여되었을 때도, rBRSV는 침팬지에서 복제가 크게 제한되었다. rBRSV/A2 키메라는 상기도 및 하기도 모두에서 수일에 걸쳐 복제를 나타내었다. 발산(shedding)이 3 또는 5일 동안 검출되지 않았다는 것은 긴 시간에 걸쳐 바이러스가 회수되는 것과 같이 접종물로부터 이월되지 않음을 나타낸다. 역가는 야생형 HRSV에서 관찰되는 것보다 매우 낮았고, rA2cp248/404 백신 후보물에 대해 관찰되는 것보다 적당히 낮았다. 이 결과는 키메릭 바이러스가 크게 약독화되었음을 나타낸다. 따라서, rBRSV의 G 및 F 당단백질 유전자를 주요한 항원 결정기를 전달하는 HRSV 대응부로 대체하는 것은 침팬지에서 성장을 개선시키는 반면, 다른 BRSV 유전자는 크게 약독화된 표현형에 기여한다.
rBRSV 또는 rBRSV/A2 바이러스를 받은 동물은 비강내 및 기관내 투여한 야생 형 HRSV를 부위 당 104 pfu로 30일 째에 접종하였다 (표 3). 비인두 면봉 및 기관 세척물은 접종 후 3, 5, 7 및 10일이 되는 날에 취하였고, 발산 바이러스는 플라크 검정에 의해 검정하였다. 각 바이러스로 미리 면역화한 것은 접종 도중에 질병 증상을 적당히 감소시켰다. 키메릭 바이러스가 인간 RSV 서열의 혼입으로 인하여 BRSV에 대해 침팬지에서 성장 개선을 나타낼지라도, 키메릭 바이러스의 크게 제한된 복제 성질은 이 백신 후보물의 미세 조정이 영장류이 약독화를 감소시키는 것을 포함할 수 있음을 나타낸다.
Figure 112002000618146-pct00008
실시예 V
프로모터에 인접 이동된 위치에 HRSV G 및 F 유전자를 포함하는 키메릭 BRSV/HRSV의 구성
본 실시예는 HRSV G 및 F 유전자가 재조합 소 RSV (rBRSV) 배경으로 치환된 감염성 rBRSV/HRSV 키메라의 구성을 기술한다. 얻은 인간-소 키메라는 HRSV 유전자 2 개 (즉, G 및 F), 및 BRSV 유래의 유전자 8개 (즉, NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 및 L)을 포함한다. 상기 기본적 치환된 당단백질 구성 외에도, HRSV G 및 F 유전자는 또한 rBRSV 골격에서 더욱 프로모터에 인접한 위치, 즉 RSV 게놈 중의 F 및 G 유전자의 야생형 유전자 순서 위치에 대하여 이동하였다. 더욱 구체적으로는, F 및 G 유전자는 프로모터에 대하여 통상의 위치, 즉 각각 유전자 위치 7 및 8로부터 각각 위치 1 및 2로 이동하였다.
뉴클레오티드 치환을 만들어 각각 위치 67, 4673 및 7471에 독특한 NotI, SalI 및 XhoI 부위를 생성한 완전한 감염성 rBRSV를 상기와 같이 제조하였다 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). NotI 위치는 BRSV NS1 유저자의 상류 비해독 영역 내에 포함되고, SalI 및 XhoI 부위는 유전자간 영역에 있다. rBRSV 안티게놈 cDNA를 SalI 및XhoI로 소화시킨 것은 전체에서 BRSV G 및 F 유전자를 절단하였고, 리게이션되는 혼화성 점착 말단을 생성하였다. G 및 F 유전자가 없고, 다음의 서열 내에 64-뉴클레오티드 SH-M2 유전자간 영역을 포함하는 rBRSV 안티게놈 cDNA가 생기게 하였다: TTAAACTTAAAAATGGTTTATGtcgaGGAATAAAATCGATTAACAACCAATCATTCAAAAAGAT (SEQ ID NO. 23) (최초 절단된 SalI 및 XhoI 부위의 4뉴클레오티드 점착 말단을 소문자로 나타냄). 비교하자면, 천연 발생 BRSV F-M2 유전자간 서열은 길이가 55 뉴클레오티드 이다.
HRSV G 및 F 유전자를 포함하는 cDNA는 cDNA 말단을 변형하기 위해 사용되는 돌연변이유발 프라이머로 PCR에 의해 제조하였다. 구체적으로, PCR을 사용하여 완전한 HRSV 안티게놈 cDNA (G ORF의 ATG로부터 F 유전자 종결 신호의 말단까지 스패닝)의 뉴클레오티드 4692-7551을 증폭하였고, 프라이머는 F 유전자 종결 신호 직후에 F-M2 IG의 최초 6 뉴클레오티드에 이어서 NS1 유전자 개시 신호의 복사본을 첨가하기 위해 설계하였다. PCR 프라이머는 또한 cDNA의 양 말단 상에 BlpI 부위 및 NotI 부위를 첨가하기 위해 설계하였다. PCR하는 cDNA 단편의 서열은 디데옥시뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인하였다. 이어서, 이 cDNA는 상기 기술한 바와 같이 G 및 F 유전자가 없는 rBRSV 안티게놈 cDNA의 독특한 NotI 부위로 NotI 단편으로 삽입하였다. 올바른 재조합체는 제한 단편 매핑으로 확인하였고, rBRSV/A2-G1 F2로 지정하였다. 코딩되는 게놈 RNA의 구조는 도 10C에 도시한다. 도시한 바와 같이, cDNA에서 G 및 F 유전자를 프로모터에 대하여 위치 7 및 8에서 위치 1 및 2로 이동하였다.
rBRSV/A2-G1 F2의 안티게놈 RNA를 코딩하는 플라스미드는 N, P, M2-1 및 L 지지 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 상기 기술한 바와 같이 T7 RNA 중합효소를 안정적으로 발현하는 BSR T7/5 세포로 트랜스펙션하였고 (또한, 본원에 참고문헌으로 삽입한 문헌[Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000] 참조), 감염성 바이러스를 회수하였다. 회수한 rBRSV/A2-G1F2 바이러스는 인간 HEp-2 세포 및 소 MDBK 세포에서 다주기 성장의 효능에 대하여 rBRSV, rHRSV (또한 rA2로 지칭함) 및 rBRSV/A2와 비교하였다. 상기 기술한 바와 같이 (또한, 본원에 참고문헌으로 삽입한[Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000] 참조), rHRSV는 HEp-2 세포에서 rBRSV 보다 더욱 효과적으로 성장하고, rBRSV/A2 바이러스는 각 부모의 중간 효율로 성장한다. 도 11에 나타낸 바와 같이, rBRSV/A2-G1F2의 복제 효율은 rbRSV/A2의 것과 구별할 수 없었다. 따라서, 뜻밖에도 G 및 F 유전자의 위치에서의 변화는 시험관내 성장의 효율을 감소시키지 않았고, 이 신규 결과는 RSV 백신 바이러스의 효율적인 제조를 가능케한다.
면역형광을 wt HRSV 또는 키메릭 바이러스 rBRSV/A2 또는 rBRSV/A2-G1F2로 감염시킨 HEp-2 세포 상에서 수행하였다. 이는 HRSV G 또는 F 단백질에 특이적인 2 개의 모노클로날 항체 (즉, 각각 021/01G 및 44F)를 사용하여 수행하였다 (Lopez et al., J. Virol. 72:6922-6928, 1998; Melero et al., J. Gen. Virol. 78:2411-2418, 1997). 각 모노클로날 항체를 개별적으로 염색하였다. 상기 검정이 반 정량적일지라도, 검정이 wt rBRSV 및 rBRSV/A2 간에 신뢰가능하게 구분되는 것을 선행 측정하였다 (후자의 것은 BRSV 골격 중 정상 게놈 위치에 HRSV G 및 F 유전자를 가짐). 특히, wt HRSV는 효율적이고 광범위한 항원 발현을 지시하는 면역형광의 매우 강력하고 광범위한 패턴을 나타내는 반면, rBRSV/A2는 더욱 약하고, 더 분산되고, 덜 광범위한 패턴을 나타낸다 (Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). rBRSV/A2-GIF2에 대해 수행한 유사한 검정은 이 프로모터 이동 키메릭 바이러스의 면역형광 패턴이 wt HRSV의 것과 매우 유사함 을 보여준다. 이 결과는 G 및 F 당단백질의 발현 증가와 일치한다. 동시에, rBRSV/A2-G1F2와 연관된 세포병변 효과는 wt HRSV에 필적하게 감소하였고, 상기 기술된 바와 같은 rBRSV/A2의 것과 더욱 밀접히 닮았다 (Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입함). 구체적으로, rBRSV/A2 및 rBRSV/A2-G1F2는 더 적고 작은 신시티움을 유도하였다.
따라서,본 실시예는 영장류의 기관에서 복제가 강력히 약독화된 BRSV의 배경 중에 HRSV의 주요한 방어 항원 (G 및 F 단백질)에 대한 유전자를 포함하는 rBRSV/A2 바이러스의 변형을 제공한다. 상기 실시예에서 보인 바와 같이, rBRSV/A2 바이러스는 영장류에서 크게 약독화되게 하는 강력한 숙주 범위 제한을 갖는다. 본 rBRSV/A2-G1F2 바이러스가 유전적 배경에 BRSV 유전자의 동일 배열을 지니므로, 이러한 강력한 숙주 범위 제한 표현형을 공유하고, 이에 의해 2 개의 주요한 방어 항원의 발현을 증가시키는 듯 하다. 이들 2 방어 항원의 생체내 발현 증가는 바이러스의 면역원성을 증가시키리라 예측된다. 따라서, 본 실시예는 HRSV 유전자를 프로모터에 인접한 위치로 이동하는 것에 의해 rBRSV/A2 바이러스를 변형하고 개선하는 것을 제공한다. 이 강도의 위치 이동, 즉 G 및 F 유전자가 프로모터 위치에 대하여 야생형 위치 7 및 8에서 신규 위치 1 및 2로 이동하는 것은 이전에 기술되지 않았다.
실시예 VI
HRSV로부터 유래하는 외피 연관 M, G 및 F 단백질을 갖는 키메릭 BRSV/HRSV의 구성
본 실시예는 상기 기술된 바와 같은 rBRSV/A2 (BRSV 숙주 범위 약독화 배경에 HRSV G 및 F 보호적 항원을 갖는 것)을 닮은 항원성 키메라 바이러스의 변형을 포함하는 또 다른 인간-소 키메릭 RSV를 설명한다. BRSV 및 HRSV 모두는 4 개의 다음의 외피 연관 단백질을 갖는다: 주요한 방어 항원인 G 및 F 당단백질, HRSV의 중화 또는 방어 항원임이 나타나지 않는 미지의 기능의 작은 소수성 SH 단백질 (Whitehead et al., J. Virol. 73;3438-3442, 1999; Connors et al., J. Virol. 65:1634-1637, 1991, 본원에 참고문헌으로 삽입됨); 및 방어 항원은 아니나 비리온 조합에 중요한 비글리코실화 내부 매트릭스 M 단백질 (Teng and Collins, J. Virol. 72:5707-16, 1998, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 본 실시예에서, 모든 4개의 BRSV 외피 연관 단백질 유전자 (즉, BRSV M, SH, G 및 F)가 결손되고, 3개의 HRSV 외피 연관 단백질 유전자 (즉, M, G 및 F)가 대신 삽입된 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 제조하였다. HRSV SH 유전자가 이 특별한 재조합체에 포함되지 않았지만, 본 실시예에서 기술한 구성은 SH가 정상 게놈 위치 또는 다른 위치에 쉽게 첨가될 수 있도록 설계하였다.
이전에 기술된 rBRSV/A2 구성 (Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입됨)은 P 및 M 유전자 간의 유전자간 영역 내에 위치 3204 에서 독특한 MluI 위치를 포함하도록 변형하였다 (도 13A,; P-M IG). 이는 5 뉴클레오티드 치환의 도입을 포함한다. 뉴클레오티드 서열 위치 번호는 완전한 rBRSV 안티게놈와 관련되고 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000; 진뱅크 수탁 번호 AF092942 또는 문헌[Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995]의 완전한 rHRSV 안티게놈; 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨), HRSV 서열을 지칭하는 서열 위치 번호는 밑줄을 그었다. MluI-SalI 단편을 절단하고, M 유전자를 갖는 MluI-SalI 단편에 의해 대체하였다.
도 13B를 참고하면, HRSV M 유전자를 포함하는 cDNA를 cDNAs의 말단에 변화를 도입하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하고 변형하였다. 구체적으로, M cDNA를 그 상류 말단이 MluI 위치, 이어서 P-M 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오티드 (HRSV 및 BRSV에서 동일한 것), 이어서 완전한 HRSV M 유전자, 이어서 HRSV SH-G 유전자간 영역의 최초 4 뉴클레오티드, 이어서 SalI 위치를 포함하도록 변형하였다. 이 cDNA의 서열은 전체로 정확함을 확인하였다. 이를 MluI 및 SalI로 소화시키고, rBRSV 안티게놈의 MluI-SalI 윈도우로 클로닝하였다. 이는 rBRSV/A2-MGF를 생성하였다. 도 13C에 도시한 바와 같이, 이 키메라는 6 개의 BRSV 유전자 (즉, NS1, N52, N, P, M2 및 L) 및 3 개의 HRSV 외피 연관 단백질 유전자 (즉, M, G 및 F)를 포함하였다.
이 안티게놈 플라스미드는 N, P, M2-1 및 L 지지 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 이전에 상세히 기술된 바와 같이 T7 RNA 중합효소를 안정하게 발현하는 BSR T7/5 세포 내로 트랜스펙션하였고 (Buchholz et al., J. Virol. 73;251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입됨), 감염성 바이러스를 회수하였다.
상기 실시예는 적합한 성장, 약독화 및 면역원성 특성, 및 감수성 숙주에서 특이적 또는 다중 특이적 보호적 면역 반응을 유발하는 능력을 갖는 인간-소 키메릭 RSV를 제조하는 신규 방법 및 조성물을을 설명한다. 더욱 상세한 측면에서, 상기 실시예는 주 HRSV 항원 결정기인 G 및 F 단백질을 지니는 키메릭 인간-소 RSV의 약독화에 관한 2 가지 극단을 설명한다. 한 가지는 인간 및 침팬지에서 허용되게 성장하고, 독성인 wt HRSV이다. 다른 것은 또한 HRSV G 및 F 항원 결정기를 지니는 rBRSV/A2이다. 신규 키메릭 바이러스는 본 발명의 방법에 따라서 구성하였고, 침팬지에서 생존하고, 안정하며 크게 약독화됨을 보였다.
wt HRSV 및 rBRSV/A2 간의 차이는 9 개의 유전자에 의해 확인된다. 본원의 교시사항에 따르면, HRSV 유전자로의 BRSV 유전자의 단계적 대체 (예를 들면, rBRSV/A2 골격으로)는 다양한 수준의 약독화를 갖는 후보 백신 바이러스를 생성할 수 있다. 본 발명의 결정적 측면은 주 HRSV 항원 결정기가 백신 개발에 대한 생존가능한 균주를 생성함을 보였다는 것이다. HRSV 및 BRSV 간의 밀접한 대응 및 본 실시예에 설명한 바와 같은 전사 신호의 호환성은 유전자 교환을 간단하게 하여 본 발명의 추가 측면을 실행하고, 요망되는 수준의 약독화를 갖는 백신 균주를 개발한다. 이 방법을 간단히하기 위해서, 교환은 한 번에 유전자 쌍으로 행할 수 있다.
본원의 실시예에 의해 나타나는 바와 같이, 인간-소 키메릭 RSV에서 대체되는 유전자는 RSV 구조/기능의 입수가능한 지식에 기초하여 기능적 또는 구조적으로 작용할 것 같은 것을 선택할 수 있다. 인간-소 키메릭 RSV 내의 이 변화 및 다른 변형은 예를 들면 N 및 P 뉴클레오캡시드 단백질, M, SH, F 및 G 외피 단백질, 및 M2-1, M2-2 및 L 중합효소 성분과 같이 상호작용하는 단백질은 게놈 중에 병렬한다 는 사실에 의해 더 단순화된다. 따라서, 본 발명에 따른 추가 후보 백신 균주는 예를 들면 N 및 P; M, SH, F 및 G 외피 유전자 중 2 이상; 또는 M2-1, M2-2 및 L 유전자 중 2 이상으로부터 선택되는 병렬 유전자 2 이상을 수용체 또는 배경 게놈 또는 안티게놈 중에 이형 삽입물 또는 치환으로 함깨 혼입하는 것에 의해 달성될 수 있다.
예를 들면, M 및 SH 유전자는 HRSV 대응부와 rBRSV/A2에서 함께 대체될 수 있다. 이는 바이러스 외피 단백질 (G, F, SH 및 M)이 모두 HRSV의 것인 반면, 내부 단백질은 BRSV의 것인 바이러스를 생성할 수 있다. 이는 이어서 요구되는 바와 같이 인간 대응부, 예를 들면 다른 쌍으로 및 P, 다른 것을 NS1 및 NS1, 및 다른 군으로 M2-1, M2-2 및 L로 추가 BRSV 유전자의 대체할 수 있다. 각 유전자 쌍의 병렬은 치환을 단순화할 수 있다. 동시에, 개별 BRSV 유전자의 HRSV로의 삽입의 역 접근법, 비분산 HRSV G 및 F 항원 결정기의 제거는 또한 본 발명의 요망되는 백신 후보물을 얻을 수 있다. 예를 들면, 인간 RSV의 N, P, M2-1 및 M 유전자 1 이상은 이들의 소 대응부로 개별적으로 대체될 수 있다. 이어서, 회수된 재조합 바이러스는 본원에서 예시하는 바와 같이 세포 배양, 설치류 및 비인간 영장류에서 약독화 표현형에 대해 평가한다. 이 방법에서, 본 발명은 요망되는 수준의 약독화 및 다양한 대상에서 RSV의 치료 및 에방에 대한 보호적 효능을 갖는 후보 인간-소 키메릭 RSV 백신의 확인 방법을 제공한다.
미생물 기탁 정보
하기 물질이 부타페스트 조약의 조건하에 미국 20110-2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 블러바드 10801 소재 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다.
플라스미드 수탁 번호 기탁일
cpts RSV 248 ATCC VR 2450 1994년 3월 22일
cpts RSV 248/404 ATCC VR 2454 1994년 3월 22일
cpts RSV 248/955 ATCC VR 2453 1994년 3월 22일
cpts RSV 530 ATCC VR 2452 1994년 3월 22일
cpts RSV 530/1009 ATCC VR 2451 1994년 3월 22일
cpts RSV 530/1030 ATCC VR 2455 1994년 3월 22일
RSV B-1 cp52/2B5 ATCC VR 2542 1996년 9월 26일
RSV B-1 cp-23 ATCC VR 2579 1997년 7월 15일
p3/7(131) ATCC 97990 1997년 4월 18일
p3/7(131)2G ATCC 97989 1997년 4월 18일
p218(131) ATCC 97991 1997년 4월 18일

서열 목록
Figure 112002000618146-pct00041
Figure 112002000618146-pct00042
Figure 112002000618146-pct00043
Figure 112002000618146-pct00044
Figure 112002000618146-pct00045
Figure 112002000618146-pct00046
Figure 112002000618146-pct00047
SEQUENCE LISTING <110> The Government Of The United States Of America <120> Production Of Attenuated, Human-Bovine Chimeric Respiratory Syncytial Virus Vaccines <130> Nih-0374 <150> 60/143,132 <151> 1999-07-09 <160> 23 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 80 <212> DNA <213> Bovine respiratory syncytial virus <400> 1 agttatttaa aattaaactt aaaaatggtt tatggttaca tacagatgtt ggggcaaata 60 caagtatgtc caaccatacc 80 <210> 2 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bovine RSV <400> 2 agttatttaa aattaaactt aaaaatggtt tatgtcgaca tacagatgtt ggggcaaata 60 caagtatgtc caaccatacc 80 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic human and bovine RSV <400> 3 agttatttaa aattaaactt aaaaatggtt tatgtcgact ggggcaaatg caaacatgtc 60 caaaaacaag 70 <210> 4 <211> 87 <212> DNA <213> Human respiratory syncytial virus <400> 4 agttaattaa aaatagtcat aacaatgaac taggatatca agactaacaa taacattggg 60 gcaaatgcaa acatgtccaa aaacaag 87 <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213> Bovine respiratory syncytial virus <400> 5 agttatttaa aaagatatgt ataattcact aattaaaact ggggcaaata aggatggcga 60 ca 62 <210> 6 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bovine RSV <400> 6 agttatttaa aaagatatgc atgcttcact aattaaaact ggggcaaata aggatggcga 60 ca 62 <210> 7 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic human and bovine RSV <400> 7 agttacttaa aaacatatta tcacaaaagg ccttgaccaa cttaaacaga atcaaaataa 60 actctggggc aaataacaat ggagttg 87 <210> 8 <211> 87 <212> DNA <213> Human respiratory syncytial virus <400> 8 agttacttaa aaacatatta tcacaaaaag ccatgaccaa cttaaacaga atcaaaataa 60 actctggggc aaataacaat ggagttg 87 <210> 9 <211> 87 <212> DNA <213> Bovine respiratory syncytial virus <400> 9 ccatgttgat agttatataa aaatattata ttagtctcaa agaataaaat tatttaacaa 60 ccaatcattc aaaaagatgg ggcaaat 87 <210> 10 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bovine RSV <400> 10 ccatgttgat agttatataa aaatattata ttagtctcga ggaataaaat cgattaacaa 60 ccaatcattc aaaaagatgg ggcaaat 87 <210> 11 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic human and bovine RSV <400> 11 cctagtttat agttatataa aactcgagga ataaaatcga ttaacaacca atcattcaaa 60 aagatggggc aaat 74 <210> 12 <211> 77 <212> DNA <213> Human respiratory syncytial virus <400> 12 cctagtttat agttatataa aacacaattg aatgccagat taacttacca tctgtaaaaa 60 tgaaaactgg ggcaaat 77 <210> 13 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic human bovine RSV <400> 13 agttatttaa aaagatatgc atgcggggca aataacaatg gagttg 46 <210> 14 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 14 ggggcaaata caagttaatt cgcggccgcc ccctctcttc tttctacaga aaatg 55 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 15 gcggccgcta aatttaactc ccttgcttag cgatg 35 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 16 cacaatgggg caaataagct tagcggccg 29 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 17 agttagtaaa aataaagacg cgtt 24 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 18 ttatgtcgac tggggcaaat gcaaacatg 29 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 19 ggggcaaata acaatggagt tgccaatc 28 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 20 tttttatata actataaact aggaatcta 29 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 21 aggaattcgc atgcggggca aataacaatg gagttgccaa tc 42 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 22 aggaattctc gagtttttat ataactataa actaggaatc tac 43 <210> 23 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic respiratory syncytial virus <400> 23 ttaaacttaa aaatggttta tgtcgaggaa taaaatcgat taacaaccaa tcattcaaaa 60 agat 64

Claims (153)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 부분적 또는 완전한 소(bovine) 호흡기 신시티움 바이러스(RSV) 백그라운드(background) 게놈 또는 안티게놈내 하나 이상의 유전자 또는 게놈 분절이 인간 RSV G 유전자, F 유전자 또는 G 및 F 유전자로부터 선택되는 대응(counterpart) 인간 RSV 유전자 또는 그의 게놈 분절로 치환되어 인간-소 키메릭(chimeric) RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성하고,
    상기 대응 유전자 또는 게놈 분절은 상기 부분적 또는 완전한 소 RSV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 분절의 야생형 유전자 순서 위치와 비교하여 더 프로모터에 근접한(promoter-proximal) 위치 또는 프로모터에서 먼(promoter-distal) 위치에서 치환된 것을 특징으로 하는, 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  103. 제102항에 있어서, 대응 인간 RSV 유전자 또는 게놈 분절이 추가로 하나 이상의 인간 RSV NS1, NS2, M 또는 SH 유전자 또는 그의 게놈 분절을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  104. 제103항에 있어서, 대응 인간 RSV 유전자 또는 게놈 분절이 인간 RSV F 및 G 유전자 또는 그의 게놈 분절, 및 SH 유전자 및 M 유전자 또는 그의 게놈 분절인, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  105. 제103항에 있어서, 대응 인간 RSV 유전자 또는 게놈 분절이 인간 RSV F 및 G 유전자 또는 그의 게놈 분절, 및 NS1 및 NS2 유전자 또는 그의 게놈 분절인, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  106. 제102항에 있어서, 대응 인간 RSV 유전자 또는 게놈 분절이 인간 RSV F 유전자이고, 인간 RSV G 유전자 또는 게놈 분절이 면역원성 에피토프를 코딩하는 게놈 분절인, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  107. 제102항에 있어서, 대응 인간 RSV 유전자 또는 게놈 분절이 인간 RSV G 유전자이고, 인간 RSV F 유전자 또는 게놈 분절이 면역원성 에피토프를 코딩하는 게놈 분절인, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  108. 제102항에 있어서, 인간 RSV F, G 및 SH 유전자 또는 그의 게놈 분절이 부분적 또는 완전한 소 RSV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 분절의 야생형 유전자 순서 위치와 비교하여 더 프로모터에 근접한 위치에서 치환된, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  109. 제108항에 있어서, 인간 RSV G 및 F 유전자가 각각 유전자 순서 위치 1 및 2에서 치환되어, 부분적 소 RSV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 각각 야생형 유전자 순서 위치 7 및 8에서 결손된 대응 G 및 F 당단백질을 대체하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  110. 삭제
  111. 삭제
  112. 삭제
  113. 삭제
  114. 삭제
  115. 삭제
  116. 제102항에 있어서, 인간-소 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 서브그룹 A 및 서브그룹 B 인간 RSV 중 1종 또는 이들 모두로부터의 항원 결정기를 혼입한, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  117. 제116항에 있어서, 인간 RSV 당단백질 유전자 F 및 G 모두가 소 RSV 백그라운드 게놈 또는 안티게놈 중의 대응 F 및 G 당단백질 유전자를 대체하여 치환된, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  118. 제102항에 있어서, 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 1종 이상의 약독화 돌연변이를 혼입한, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  119. 삭제
  120. 삭제
  121. 삭제
  122. 제118항에 있어서, 상기 약독화 돌연변이가 cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)를 포함하는 돌연변이 인간 RSV 균주의 패널 내에 존재하는 약독화 돌연변이 중 1종 이상 내지 전부를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  123. 제118항에 있어서, 상기 약독화 돌연변이가 상이한 돌연변이 RSV 균주로부터 채택된 것인, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  124. 제118항에 있어서, 상기 약독화 돌연변이가 RSV N 유전자 중의 Val267, RSV F 유전자 중의 Glu218 또는 Thr523, RSV 중합효소 유전자 L 중의 Asn43, Cys319, Phe521, Gln831, Met1169, Tyr1321 또는 His1690에서의 아미노산 치환, 및 유전자 M2의 유전자 개시 서열 중의 뉴클레오티드 치환을 특정하는 약독화 돌연변이 중 1종 이상 내지 전부를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  125. 삭제
  126. 제118항에 있어서, 상기 약독화 돌연변이가 상기 돌연변이를 특정하는 코돈 내의 다수의 뉴클레오티드 변화에 의해 안정화된, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  127. 삭제
  128. 삭제
  129. 삭제
  130. 삭제
  131. 삭제
  132. 삭제
  133. 삭제
  134. 삭제
  135. 삭제
  136. 삭제
  137. 삭제
  138. 삭제
  139. 삭제
  140. 삭제
  141. 삭제
  142. 삭제
  143. 삭제
  144. 삭제
  145. 주 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 중합효소 단백질 (L), RNA 중합효소 신장 인자, 및 제102항 내지 제109항, 제116항 내지 제118항, 제122항 내지 제124항 및 제126항 중 어느 한 항에 따라 정의된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 감염성 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스(RSV).
  146. 제145항에 있어서, 서브바이러스 입자인 키메릭 RSV.
  147. 생리학적으로 허용되는 담체에 제145항의 키메릭 RSV를 포함하는, RSV에 대해 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
  148. 제147항에 있어서, 103 내지 106 PFU의 용량으로 제제화된 면역원성 조성물.
  149. 제147항에 있어서, 분무, 액적 또는 에어로솔에 의해 상부 기도에 투여되도록 제제화된 면역원성 조성물.
  150. 제147항에 있어서, 키메릭 RSV가 인간 RSV A 또는 인간 RSV B에 대해 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
  151. 제147항에 있어서, 키메릭 RSV가 인간 RSV A 또는 RSV B에 대해 면역 반응을 유발하고, 인간 RSV A 또는 RSV B에 대해 면역 반응을 유발시킬 수 있는 제2 약독화된 RSV를 추가로 포함함으로써 인간 RSV A 및 RSV B 모두에 대해 면역 반응을 유발시키는 면역원성 조성물.
  152. 세포 또는 무세포 용균물(lysate) 중에서 제102항 내지 제109항, 제116항 내지 제118항, 제122항 내지 제124항 및 제126항 중 어느 한 항에 따라 정의된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 및 RSV N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 포함하는 발현 벡터를 발현시키는 것을 포함하는,
    키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 1종 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 감염성 약독화된 키메릭 RSV 입자를 제조하는 방법.
  153. 제152항에 있어서, 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질이 2종 이상의 상이한 발현 벡터에 의해 발현되는 방법.
KR1020027000318A 1999-07-09 2000-06-23 약독화된 인간-소 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스백신의 제조 방법 KR100905450B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14313299P 1999-07-09 1999-07-09
US60/143,132 1999-07-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020092343A KR20020092343A (ko) 2002-12-11
KR100905450B1 true KR100905450B1 (ko) 2009-07-02

Family

ID=22502738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027000318A KR100905450B1 (ko) 1999-07-09 2000-06-23 약독화된 인간-소 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스백신의 제조 방법

Country Status (13)

Country Link
US (2) US7829102B2 (ko)
EP (1) EP1287152B1 (ko)
JP (1) JP2003530073A (ko)
KR (1) KR100905450B1 (ko)
CN (2) CN100354425C (ko)
AT (1) ATE419369T1 (ko)
AU (2) AU784216B2 (ko)
BR (1) BR0013195A (ko)
CA (1) CA2378552A1 (ko)
DE (1) DE60041280D1 (ko)
IL (2) IL147447A0 (ko)
MX (1) MXPA02000220A (ko)
WO (1) WO2001004335A2 (ko)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7485440B2 (en) 1995-09-27 2009-02-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2
US7632508B2 (en) 1997-05-23 2009-12-15 The United States Of America Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines
US7201907B1 (en) 1997-05-23 2007-04-10 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus(PIV) vaccines
US7951383B2 (en) 1997-05-23 2011-05-31 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Attenuated parainfluenza virus (PIV) vaccines
US20030082209A1 (en) 2000-07-05 2003-05-01 Skiadopoulos Mario H. Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines
US20040005542A1 (en) 2001-06-22 2004-01-08 Krempl Christine D Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promotor- proximal genes
US7662397B2 (en) 1997-07-15 2010-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promoter-proximal genes
MXPA02000490A (es) * 1999-07-13 2004-09-27 Us Gov Health & Human Serv Produccion de virus sincitiales respiratorios recombinantes, que expresan moleculas inmunomoduladoras.
WO2004027037A2 (en) 2002-09-18 2004-04-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services RECOVERY OF RECOMBINANT HUMAN PARAINFLUENZA VIRUS TYPE 2 (HPIV2) FROM cDNA AND USE OF RECOMBINANT HPIV2 IN IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND AS VECTORS TO ELICIT IMMUNE RESPONSES AGAINST PIV AND OTHER HUMAN PATHOGENS
WO2005014626A2 (en) 2003-02-28 2005-02-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Recombinant human metapneumovirus and its use
CA2528002A1 (en) 2003-06-09 2004-12-29 Wyeth Improved method for the recovery of non-segmented, negative-stranded rna viruses from cdna
EP1713824A2 (en) * 2003-12-10 2006-10-25 The Uab Research Foundation Recombinant viruses with heterologous envelope proteins
WO2007060725A1 (ja) * 2005-11-24 2007-05-31 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University 組換え多価ワクチン
CA2703066A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 University Of Rochester Respiratory syncytial virus vaccine based on chimeric papillomavirus virus-like particles or capsomeres
WO2010003032A2 (en) * 2008-07-01 2010-01-07 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health A Recombinant human parainfluenza type 1 viruses (hpiv1s) containing mutations in or deletion of the c protein are attenuated in african green monkeys and in ciliated human airway epithelial cells and are potential vaccine candidates for hpiv1
EP2346990B1 (en) 2008-11-05 2016-01-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Live, attentuated respiratory syncytial virus
GB201019240D0 (en) * 2010-11-15 2010-12-29 Vib Vzw Respiratory syncytical virus vaccine
WO2012085936A2 (en) * 2010-12-20 2012-06-28 Panacea Biotech Ltd Recombinant respiratory syncytial virus plasmids and vaccines
CN102210859B (zh) * 2011-05-31 2012-11-21 昆明理工大学 一种结核分枝杆菌esat-6-f2融合蛋白亚单位疫苗及其制备方法
ES2863477T3 (es) 2012-04-13 2021-10-11 Us Health Vacuna genéticamente estable viva atenuada contra el virus respiratorio sincitial y su producción
JP2014236748A (ja) * 2014-08-26 2014-12-18 一般財団法人阪大微生物病研究会 組換え多価ワクチン
CN107406835A (zh) 2015-01-20 2017-11-28 ***合众国,由健康及人类服务部部长代表 表达嵌合rsv/bpiv3f蛋白的重组人/牛副流感病毒3(b/hpiv3)及其用途
AU2018241252A1 (en) * 2017-03-30 2019-10-03 The University Of Queensland Chimeric molecules and uses thereof
US20210189425A1 (en) * 2018-04-23 2021-06-24 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Chimeric vectors
BR112021006970A2 (pt) * 2018-10-12 2021-07-27 Sk Bioscience Co., Ltd. cepa de vacina viva de rsv recombinante e método para produzir a mesma
CN110229219B (zh) * 2019-06-21 2021-03-30 中国科学院武汉病毒研究所 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途
WO2023183700A2 (en) * 2022-03-22 2023-09-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Morreton viruses and methods of use
CN116676275B (zh) * 2023-03-17 2024-06-07 北京赛尔富森生物科技有限公司 A基因型嵌合腮腺炎病毒株和制备方法及用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998002530A1 (en) * 1996-07-15 1998-01-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800078A (en) 1987-05-28 1989-01-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Immunotherapeutic method of treating respiratory disease by intranasal administration of Igb
AU7007491A (en) 1990-02-02 1991-08-08 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses
GB9200117D0 (en) 1992-01-06 1992-02-26 Connaught Lab Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use
IL105456A (en) 1992-04-21 1996-12-05 American Home Prod Vaccines of attenuated respiratory syncytial virus
WO1994017105A1 (en) 1993-01-29 1994-08-04 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
DE69532369T3 (de) 1994-07-18 2010-11-04 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Rekombinantes infektiöses nicht-in-Segmente-geteiltes, negativ-Strange-RNS-Virus
US20030054505A1 (en) * 1997-09-26 2003-03-20 Hong Jin Recombinant rsv expression systems and vaccines
US5716821A (en) 1994-09-30 1998-02-10 Uab Research Foundation Prevention and treatment of respiratory tract disease
WO1996010400A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 The Uab Research Foundation Gene therapy vectors and vaccines based on non-segmented negatives stranded rna viruses
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
AU712213B2 (en) 1995-09-22 1999-11-04 Connaught Laboratories Limited Parainfluenza virus glycoproteins and vaccines
US6923971B2 (en) 1995-09-27 2005-08-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promoter-proximal genes
US6713066B1 (en) 1996-07-15 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2
AU727923B2 (en) 1995-09-27 2001-01-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
US6689367B1 (en) 1995-09-27 2004-02-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
US5869036A (en) 1995-12-08 1999-02-09 St. Louis University Live attenuated vaccines based on CP45 HPIV-3 strain and method to ensure attenuation in such vaccine
US6077514A (en) 1996-04-04 2000-06-20 The Regents Of The University Of Michigan Attenuated respiratory syncytial virus
US6699476B1 (en) 1996-07-15 2004-03-02 Peter L. Collins Production of recombinant respiratory syncytial viruses expressing immune modulatory molecules
ATE501259T1 (de) 1997-05-23 2011-03-15 Us Of America As Represented By The Secretary Of The Dept Of Health And Human Services Herstellung attenuierter parainfluenza-virus impfstoffe aus klonierten nukleotidsequenzen
JP4434478B2 (ja) 1997-07-11 2010-03-17 イエール ユニバーシティー リエンジニアリングされた外被を有するラブドウイルス
WO1999024564A1 (en) * 1997-11-10 1999-05-20 University Of Maryland PRODUCTION OF NOVEL BOVINE RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUSES FROM cDNAs
CA2369200A1 (en) 1999-04-13 2000-10-19 Peter L. Collins Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
BR0011159A (pt) 1999-04-13 2002-07-23 Government Of The Us Dept Of H Método para produzir vacinas de vìrus rna de fita negativa atenuado a partir de sequências de nucleotìdeos clonados
AU5918100A (en) 1999-07-09 2001-01-30 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2
MXPA02000490A (es) 1999-07-13 2004-09-27 Us Gov Health & Human Serv Produccion de virus sincitiales respiratorios recombinantes, que expresan moleculas inmunomoduladoras.
ATE416251T1 (de) * 2000-06-23 2008-12-15 Us Gov Health & Human Serv Respiratorische synzytialvirus impfstoffe, welche schützende antigene von promotor-proximalen genen exprimieren

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998002530A1 (en) * 1996-07-15 1998-01-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003530073A (ja) 2003-10-14
MXPA02000220A (es) 2005-08-16
EP1287152B1 (en) 2008-12-31
AU784216B2 (en) 2006-02-23
IL147447A (en) 2010-05-31
AU5641500A (en) 2001-01-30
AU2006202170B2 (en) 2009-10-08
US7842798B2 (en) 2010-11-30
CN100354425C (zh) 2007-12-12
BR0013195A (pt) 2002-07-23
EP1287152A2 (en) 2003-03-05
WO2001004335A3 (en) 2002-12-19
US20070184069A1 (en) 2007-08-09
AU2006202170A1 (en) 2006-06-15
IL147447A0 (en) 2002-08-14
CA2378552A1 (en) 2001-01-18
US20060057158A1 (en) 2006-03-16
US7829102B2 (en) 2010-11-09
KR20020092343A (ko) 2002-12-11
ATE419369T1 (de) 2009-01-15
WO2001004335A8 (en) 2003-02-06
WO2001004335A2 (en) 2001-01-18
CN1402792A (zh) 2003-03-12
CN101260386A (zh) 2008-09-10
DE60041280D1 (de) 2009-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100905450B1 (ko) 약독화된 인간-소 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스백신의 제조 방법
EP2112220A2 (en) Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
US7744902B2 (en) Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promotor-proximal genes
US7846455B2 (en) Attenuated chimeric respiratory syncytial virus
EP1690940A1 (en) Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
US6923971B2 (en) Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promoter-proximal genes
AU2006252238A1 (en) Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens ffrom promotor proximal genes
US7662397B2 (en) Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promoter-proximal genes
US7820182B2 (en) Production of attenuated, human-bovine chimeric respiratory syncytial viruses for use in immunogenic compositions
AU2001268709A1 (en) Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promotor-proximal genes
US7485440B2 (en) Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2
COLLINS et al. Patent 2378552 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee