ES2714355T3 - Nuevas dianas para el tratamiento y prevención de la diabetes - Google Patents

Abstract

Una molécula que evita la unión de αPKC (Proteína Cinasa C tipo alfa) a ALMS1 (proteína 1 del síndrome de Alström) para su uso en el tratamiento o retraso de la evolución o aparición de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatía diabética, neuropatía diabética, nefropatía diabética, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia.

Description

DESCRIPCION

Nuevas dianas para el tratamiento y prevencion de la diabetes

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de la medicina. Mas concretamente se refiere a la diabetes.

Antecedentes de la invencion

La diabetes mellitus o diabetes es un grupo de enfermedades metabolicas en las que una persona tiene alta concentracion de azucar en sangre, ya sea porque el pancreas no produce suficiente insulina o porque las celulas no responden a la insulina que se produce.

Hay tres tipos principales de diabetes:

- El tipo 1 se debe a la incapacidad del cuerpo para producir insulina, y actualmente requiere que la persona se inyecte insulina o use una bomba de insulina.

- El tipo 2 se debe a la resistencia a la insulina, una enfermedad en la cual las celulas no pueden utilizar la insulina adecuadamente.

- El tercero se denomina diabetes gravfdica y ocurre en las mujeres embarazadas.

Los indices de diabetes tipo 2 han aumentado notablemente desde 1960 en paralelo con la obesidad: a partir de 2010 hay aproximadamente 285 millones de personas con la enfermedad en comparacion con alrededor de 30 millones en 1985. Las complicaciones de larga duracion por un alto nivel de azucar en la sangre pueden incluir enfermedades cardfacas, accidentes cerebrovasculares, retinopatfa diabetica, insuficiencia renal cronica que puede requerir dialisis y mala circulacion en las extremidades, lo que lleva a amputaciones. Puede producirse un coma hiperosmolar no cetosico.

Se ha publicado que la hiperglucemia participa en el deterioro inicial y progresivo de la diabetes mellitus, es decir, la teona de la toxicidad de la glucosa. Es decir, la hiperglucemia cronica conduce a disminuir la secrecion de insulina y ademas a disminuir la sensibilidad a la insulina, y como resultado, la concentracion de glucosa en la sangre aumenta de modo que la diabetes mellitus empeora por sf sola. Por lo tanto, al tratar la hiperglucemia, el ciclo de autoempeoramiento mencionado anteriormente se interrumpe de modo que la profilaxis o el tratamiento de la diabetes mellitus es posible.

Desgraciadamente, los tratamientos existentes no logran restaurar la normoglucemia a largo plazo, ya que la funcion de las celulas beta disminuye con el tiempo. Ademas, actualmente no hay un solo farmaco capaz de revertir todos los aspectos de la enfermedad.

La naturaleza progresiva de la diabetes tipo 2 significa que muchos pacientes finalmente requeriran una medicacion hipoglucemica oral, posiblemente junto con inyecciones de insulina y/o exenatida. Se han desarrollado agentes antidiabeticos para contrarrestar los principales mecanismos involucrados en la diabetes tipo 2: resistencia a la insulina (biguanidas y tiazolidinedionas) y secrecion de insulina (sulfonilureas, glinidas, inhibidores de la dipeptidilpeptidasa-4, agonistas del receptor del peptido 1 glucagonoide), agentes que retrasan la absorcion de glucosa por el aparato digestivo o favorecen la perdida de peso y nuevos agentes que favorecen la excrecion renal de glucosa. Sin embargo, se ha demostrado que la mayona de estos medicamentos tienen efectos secundarios perjudiciales, como el aumento de peso, edema periferico o insuficiencia cardfaca congestiva y hay un problema importante con la perdida de eficacia de estos agentes en el uso a largo plazo. Por lo tanto, a pesar del numero creciente de opciones terapeuticas para el control glucemico hay necesidad de medicamentos alternativos y mejorados para el tratamiento de la diabetes y afecciones relacionadas.

Compendio de la invencion

Los inventores identificaron una nueva diana para el tratamiento de la diabetes, en particular la diabetes tipo 2. Hicieron el novedoso descubrimiento de que ALMS1 (protema 1 del smdrome de Alstrom) esta involucrada en la regulacion por la insulina de la absorcion de glucosa por adipocitos maduros mediante sus interacciones de union con moleculas clave involucradas en la regulacion de la glucosa. En resumen, cuando la insulina se une a su receptor, mostraba que se forma un complejo proteico alrededor de Alms1 (ALMSome) y se activa, lo que lleva a la activacion de la bomba de H+, la translocacion del receptor GLUT4 y la absorcion de glucosa por los adipocitos. Tambien mostraron que, en ausencia de Alms1 y, por lo tanto, prevencion del ensamblaje del ALMSome, la glucosa no puede transportarse a las celulas debido a un fallo de la fusion de GLUT4 con la membrana celular. Por lo tanto, mostraban que la modulacion de la formacion del complejo LMS1 puede usarse para regular el transporte de glucosa y por lo tanto puede usarse para enganar la resistencia a la insulina, y tratar la diabetes tipo 2. Mas particularmente, los inventores identificaron dos protemas implicadas en la regulacion del transporte de glucosa por ALMS1, a saber, TBC1D4 (miembro 4 de la familia del dominio TBC1) y aPKC (tipo PKCa o protema Cinasa C tipo alfa). Mas especialmente, los puntos de union de estas dos protemas reguladoras de glucosa en ALMS1 estan tan cerca que la union simultanea de ambas protemas no es posible debido al impedimento esterico. TBC1D4, a troves de su interaccion con protemas (es dedr, Rab10, Rab14, etc.) y ALMS1, regula la translocacion de los receptores GLUT4 a la membrana celular. Por otra parte, aPKC, cuando se une a ALMS1, bloquea el punto de union a TBC1D4 y, por lo tanto, regula a la baja la translocacion de los receptores GLUT4 a la membrana celular, reduciendo la absorcion de glucosa celular. Ademas, demostraron que apuntando a de la interaccion de ALMS1 y aPKC es suficiente para desencadenar la absorcion de glucosa en los adipocitos independientemente de la presencia de INS. Por consiguiente, una nueva estrategia terapeutica puesta de manifiesto en esta invencion es mejorar la absorcion de glucosa celular y reducir la hiperglucemia mediante el bloqueo de la union de aPKC en ALMS1. Mas preferiblemente, la union de aPKC en ALMS1 se inhibe de tal manera que la union de TBC1D4 en ALMS1 no se ve afectada o incluso mejoro.

Por consiguiente, la presente invencion se refiere a una molecula capaz de evitar la union de aPKC a ALMS1 para su uso en el tratamiento o retraso de la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatia diabetica, resistencia a la insulina, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia. Tambien se refiere al uso de dicha molecula para la preparacion de un medicamento para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatia diabetica, resistencia a la insulina, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia. Tambien se refiere a un metodo para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, resistencia a la insulina, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia, en un sujeto que lo necesite, en donde se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula capaz de evitar la union de aPKC a ALMS1, aumentando asf la absorcion de glucosa inducida por la insulina. En una realizacion preferida, la molecula no interfiere con la union de TBC1D4 a ALMS1. Preferiblemente, la molecula se selecciona del grupo que consiste en peptidos o polipeptidos o peptidomimeticos, anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos, aptameros, Spiegelmers y compuestos qmmicos. Mas preferiblemente, la molecula es un peptido de menos de 50 aminoacidos, preferiblemente de menos de 20 aminoacidos.

En una primera realizacion preferida, la molecula es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de ALMS1 (SEC ID. n° 1). Preferiblemente, la molecula es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de ALMS1 que incluye uno o varios de los restos que se proven que median en la interaccion con aPKC, en particular uno o varios de los restos seleccionados en la lista que consiste en E17, D58, S59, G62, H65, L66, Q736, T737, E738, D828, S829, T1088, D1089, A1169, Q1170, F2882, L2883 y E2884. En una realizacion muy particular, la molecula es un peptido que comprende o consiste en una de las siguientes secuencias:

- LDSDSHYGPQHLESIDD (SEC ID. n° 5);

- DSHQTEETL (SEC ID. n° 6);

- QQTLPESHLP (SEC ID. n° 7);

- QALLDSHLPE (SEC ID. n° 8);

- PADQMTDTP (SEC ID. n° 9);

- HIPEEAQKVSAV (SEC ID. n° 10);

- SCIFLEQ (SEC ID. n°11), y

- un fragmento de la misma que comprende 6 aminoacidos contiguos.

En una segunda realizacion preferida, la molecula es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de aPKC (SEC ID. n° 4). Preferiblemente, la molecula es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de aPKC que incluye uno o varios de los restos que se prove que median en la interaccion con ALMS1, en concreto uno o varios de los restos seleccionados en la lista que consiste en F114, D116, C118, L121, N138, Q142, I145, P148, G433, E545, S562, S566, F597, D601, W602, K604, E606, G620, T631, V664 e I667.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para identificar moleculas adecuadas para su uso para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia, en donde la capacidad de la molecula para evitar la union de aPKC a ALMS1 se analiza y se seleccionan las moleculas capaces de evitar esta union. El metodo puede comprender ademas una etapa en la que se prueba la capacidad de la molecula seleccionada para interferir con la union de TBC1D4 a ALMS1 y en donde se seleccionan las moleculas que no interfieren. Preferiblemente, la union se determina en un sistema celular que responde a la insulina. Opcionalmente, la union se determina en presencia y/o ausencia de insulina.

Una estrategia terapeutica adicional dada a conocer en esta invencion es mejorar la absorcion de glucosa celular mediante la mejora de la union de TBC1D4 en ALMS1. Una estrategia terapeutica adicional dada a conocer en esta invencion es potenciar la absorcion de glucosa celular al aumentar la expresion de ALMS1.

En consecuencia, la presente invencion se refiere ademas a una molecula capaz de mejorar la union de TBC1D4 en ALMS1 o aumentar la expresion de ALMS1 para su uso en el tratamiento o retraso de la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia, en particular de la diabetes tipo 2. Tambien se refiere al uso de dicha molecula para la preparacion de un medicamento para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatia diabetica, resistencia a la insulina, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia, en particular la diabetes tipo 2. Tambien se refiere a un metodo para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de la diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia, en particular de la diabetes tipo 2, en un sujeto que lo necesite, en donde se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula capaz de mejorar la union de TBC1D4 en ALMS1 o aumentar la expresion de ALMS1, lo que aumenta la absorcion de glucosa inducida por la insulina. En una realizacion preferida, la molecula tambien inhibe la union de aPKC en ALMS1.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para identificar moleculas adecuadas para su uso en el tratamiento de la diabetes, en el que se ensaya la capacidad de la molecula para aumentar la expresion de ALMS1 y se seleccionan las moleculas capaces de regular aumentar ALMS1. Ademas, se refiere al metodo para identificar moleculas adecuadas para su uso en el tratamiento de la diabetes, en el que se ensaya la capacidad de la molecula para aumentar la union de TBC1D4 a ALMS1 y se seleccionan las moleculas capaces de aumentar esta union. Opcionalmente, el metodo comprende ademas determinar la capacidad de la molecula para evitar que la union de aPKC a ALMS1 se ensaye y seleccionar las moleculas capaces de evitar esta union.

Descripcion detallada de la invencion

Los inventores identificaron ALMS1 como la pieza clave que falta involucrada en la regulacion de la absorcion de glucosa mediada por insulina por las vesmulas de clasificacion GLUT4 en adipocitos.

Ahora se ha reconocido que, incluso si el tejido adiposo es responsable de aproximadamente el 20% de la absorcion de glucosa, una disfuncion en este tejido puede provocar la aparicion de diabetes. Por lo tanto, cualquier medio capaz de regular la absorcion de glucosa mediada por la insulina en los adipocitos debena poder retrasar, revertir o evitar la aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad, e hiperinsulinemia.

La actividad ALMS1 disminuye por la union de aPKC mientras que se activa por la union de TBC1D4. Tambien se ha demostrado que los puntos de union de estas dos protemas en ALMS1 estan tan cerca que no se permite la union simultanea de ambas protemas debido al impedimento esterico. Por lo tanto, este mecanismo de regulacion es un nuevo objetivo para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia y los inventores proponen utilizar una molecula capaz de evitar la union de aPKC a ALMS1 para estas indicaciones terapeuticas. Definiciones

ALMS1, protema 1 del smdrome de Alstrom, es una protema codificada por el gen ALMS1. Se ha descubierto que las mutaciones en el gen ALMS1 son causantes del smdrome de Alstrom. Se describe en varias bases de datos, a saber, UniProt ID. n° Q8TCU4; ID. gen n° 7840, HGNG ID. n° 428. Las secuencias de referencia se describen en Genbank bajo NM_015120.4 para ARNm y NP_055935.4 para protema. La secuencia de protemas de ALMS1 humano se describe en la SEC ID. n° 1.

Se supone que TBC1D4 (miembro 4 de la familia de dominios TBC1), tambien llamado actualmente As160, actua como una protema activadora de GTPasa para RAB2A, RAB8A, RAB10 y RAB14. Se describe en varias bases de datos, a saber, UniProt ID. n° 060343, Gen ID. n° 9882, HGNG ID. n° 19165. Las secuencias de referencia se describen en Genbank bajo NM_014832.3 para el ARNm y NP_055647.2 para la protema (para la isoforma 1, elegida como secuencias canonicas). La isoforma 2, que difiere de la isoforma por la falta de los aminoacidos en las posiciones 678-740 y referenciada en UniProt con el n° 060343-2, favorece la translocacion del transportador de glucosa SLC2A4/GLUT4 inducida por la insulina en la membrana plasmatica, aumentando asf la absorcion de glucosa. La secuencia de protemas de TBC1D4 humano (isoforma 1) se describe en la SEC ID. N° 2. La secuencia de protemas de TBC1D4 humano (isoforma 2) se describe en la SEC ID. n° 3.

La protema cinasa C tipo alfa, tambien llamada aPKC, PKC-A o PKC-alfa, pertenece a una familia de protemas cinasas espedficas de serina y treonina que pueden ser activadas por el calcio y el segundo mensajero diacilglicerol. Se describe en varias bases de datos, a saber, UniProt ID. n° P17252, gen ID. n° 9393, HGNG ID. n° 5578. Las secuencias de referencia se describen en Genbank bajo NM_02737.2 para ARNm y NP_002728.1 para protemas. La secuencia proteica del aPKC humano se describe en la SEC ID. n° 4.

Metodos de deteccion

La presente invencion se refiere a un metodo in vitro o ex vivo para identificar, detectar o seleccionar una molecula capaz de evitar la union de aPKC a ALMS1. El metodo comprende determinar el efecto de la(s) molecula(s) sobre la union de aPKC a ALMS1, y seleccionar la(s) molecula(s) si la union de aPKC a ALMS1 disminuye o se evita. Preferiblemente, el metodo comprende ademas determinar el efecto de la(s) molecula(s) sobre la union de TBC1D4 a ALMS1, y eliminar la(s) molecula(s) si la union de TBClD4 a ALMSl disminuye o se evita. Opcionalmente, el metodo puede comprender una etapa de seleccion de la(s) molecula(s) si la union de TBC1D4 a ALMS1 aumenta o mejora.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo in vitro o ex vivo para identificar, detectar o seleccionar una molecula capaz de mejorar o aumentar la union de TBC1D4 a ALMS1. El metodo comprende determinar el efecto de la(s) molecula(s) sobre la union de TBC1D4 a ALMS1, y seleccionar la molecula(s) si la union de TBC1D4 a ALMS1 aumenta o mejora. Opcionalmente, el metodo comprende ademas determinar el efecto de la(s) molecula(s) sobre la union de aPKC a ALMS1, y seleccionar la molecula(s) si la union de aPKC a ALMS1 se reduce o evita.

Con el fin de determinar el efecto de una molecula en la union de aPKC y/o TBC1D4 a ALMS1, se puede llevar a cabo cualquier tecnologfa conocida por los expertos en la tecnica, en particular cualquier metodo adecuado para determinar interacciones de protemas. Por ejemplo, ALMS1 o aPKC biotecnologicas o naturales purificadas se pueden unir a un chip de resonancia de plasmon de superficie y la otra molecula circular sobre el chip para evaluar la afinidad de union, por ejemplo, en una maquina Biacore (General Electric, EE. UU.). La misma estrategia se puede utilizar para medir la afinidad de union de ALMS1 y TBC1D4 o de ALMS1 y aPKC.

El efecto de la(s) molecula(s) en la union de aPKC y/o TBC1D4 a ALMS1 es determinante midiendo la union de aPKC y/o TBC1D4 a ALMS1 en ausencia y en presencia de la molecula analizada y comparando los enlaces de aPKC y/o TBC1D4 a ALMS1.

Ademas, el metodo de deteccion puede comprender una etapa preliminar para seleccionar la(s) molecula(s) capaces de unirse a ALMS1. De hecho, podna ser ventajoso que la molecula que evita la interaccion entre ALMS1 y aPKC actue directamente en el punto de union a ALMS1 para aPKC. Alternativamente, el metodo de deteccion puede comprender una etapa preliminar para seleccionar la(s) molecula(s) capaz de unirse a aPKC. De hecho, tambien podna ser ventajoso que la molecula que evita la interaccion entre ALMS1 y aPKC actue directamente en el punto de union a aPKC para ALMS1.

Ademas, el metodo de deteccion puede comprender una etapa preliminar para seleccionar la(s) molecula(s) capaces de unirse a TBC1D4.

En una realizacion preferida para identificar, detectar o seleccionar una molecula capaz de evitar la union de aPKC a ALMS1, el metodo de deteccion de la presente invencion comprende ademas determinar el efecto de la(s) molecula(s), en particular la(s) molecula(s) seleccionada(s), en la union de TBC1D4 a ALMS1 y seleccionar la(s) molecula(s) si la(s) molecula(s) no disminuyen o evitan la union de TBC1D4 a ALMS1. Aun mas, el metodo puede comprender una etapa de seleccion de la molecula(s) si la(s) molecula(s) aumenta(n) o mejora(n) la union de TBC1D4 a ALMS1.

En una realizacion preferida para identificar, detectar o seleccionar una molecula capaz de mejorar la union de TBC1D4 a ALMS1, el metodo de seleccion de la presente invencion comprende ademas determinar el efecto de la(s) molecula(s), en particular la(s) molecula(s) seleccionada(s) en la union de aPKC a ALMS1 y seleccionar la(s) molecula(s) si la(s) molecula(s) disminuye(n) o evita(n) la union de aPKC a ALMS1.

Debido al gran tamano de los companeros de union, en particular ALMS1 y TBC1D4, los inventores prefieren usar sistemas celulares para los metodos de deteccion. Preferiblemente, el sistema celular es un sistema celular sensible a la insulina. Por ejemplo, el sistema celular podna seleccionarse entre una estirpe celular mesenquimatosa, una celula madre mesenquimatosa, una celula madre adiposa mesenquimatosa, un pre-adipocito y un adipocito. Preferiblemente, la celula es una celula humana.

Ademas, las determinaciones de union pueden realizarse en ausencia o presencia de insulina, preferiblemente en presencia de insulina para la union de aPKC a ALMS1 y en presencia de insulina para la union de TBC1D4 a ALMS1.

En un primer aspecto, se puede realizar un ensayo de inmunoprecipitacion utilizando ALMS1 como cebo, en particular como se detalla en el apartado experimental. Por ejemplo, el ensayo puede llevarse a cabo con celulas, en particular adipocitos, cultivadas en ausencia y/o presencia de insulina, preferiblemente en ausencia de insulina. Las moleculas a analizar se anaden en el medio de cultivo. A continuacion, aPKC se inmunodetecta. Opcionalmente, TBC1D4 tambien puede inmunodetectarse. Este metodo se describe con detalle en el apartado Ejemplos.

En una realizacion preferida, la cantidad de aPKC unida a ALMS1 se determina y compara con la cantidad en ausencia de moleculas ensayadas, en particular en ausencia de insulina. Si la cantidad de aPKC unida a ALMS1 disminuye en presencia de la molecula probada, entonces se selecciona la molecula.

La cantidad de TBC1D4 unida a ALMS1 se determina y se compara con la cantidad en ausencia de moleculas probadas, en particular en presencia de insulina o ambas en presencia y ausencia de insulina. Si la cantidad de TBC1D4 unida a ALMS1 disminuye en presencia de la molecula probada, entonces la molecula se rechaza. Si la cantidad de TBC1D4 unida a ALMS1 aumenta en presencia de la molecula probada, entonces se selecciona la molecula.

En un segundo aspecto, la purificacion por afinidad acoplada a la espectrometna de masas puede llevarse a cabo, en particular despues de la reticulacion química. Por ejemplo, las celulas pueden cultivarse en un medio desprovisto de metionina y leucina, pero que comprenden metionina y leucina fotoactivables. A continuacion, las celulas se irradian con UV para estabilizar los complejos de protemas y los complejos de protemas se analizan por espectrometna de masas.

Otros metodos estan disponibles para los expertos en la tecnica, p. ej., complementacion de fluorescencia bimolecular, purificacion por afinidad en tandem y similares. En concreto, el documento WO2012/117245 describe un metodo para identificar moleculas capaces de evitar la interaccion entre dos protemas: WO2012/117245 (es decir, para identificar moleculas pequenas). El documento WO12174489 tambien describe metodos para desarrollar moleculas adecuadas para evitar la interaccion entre dos protemas.

Ademas, tambien pueden disenarse moleculas adecuadas por modelado molecular. Dichos metodos se detallan, por ejemplo, en el apartado Ejemplos.

En un aspecto concreto, la presente invencion se refiere a un modelo de homologfa estructural de ALMS1 y a su uso en un metodo por simulacion informatica para identificar moleculas capaces de inhibir o estimular la funcion ALMSome, en particular para inhibir la interaccion entre ALMS1 y aPKC y/o aumentar la interaccion entre ALMS1 y TBC1D4.

Tambien se refiere a un modelo de homologfa estructural de TBC1D4 y a su uso en un metodo por simulacion informatica para identificar moleculas capaces de inhibir o estimular la funcion ALMSome, en concreto para aumentar la interaccion entre ALMS1 y TBClD4.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para identificar, detectar o seleccionar una molecula capaz de aumentar ALMS1 al nivel de genes y protemas. El metodo comprende determinar el efecto de la(s) molecula(s) sobre la expresion de ALMS1 y seleccionar la(s) molecula(s) si la expresion de ALMS1 aumenta. Con el fin de determinar el efecto de una molecula en la expresion de ALMS1, puede llevarse a cabo cualquier tecnologfa conocida por el experto en la tecnica. Se pueden usar diversas tecnicas conocidas para detectar o cuantificar la expresion de ALMS1, incluida la secuenciacion, hibridacion, amplificacion y/o union a ligandos espedficos (como los anticuerpos). Los metodos adecuados incluyen transferencia Southern (para los ADN), transferencia Northern (para los ARN), hibridacion fluorescente in situ (FISH), migracion en gel, ELISA, radio-inmunoanalisis (RIA) y analisis inmunoenzimaticos (IEMA).

Por "aumentado", "aumento" o "mejorar" se refiere a una union aumentada en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% en comparacion con el enlace medido en ausencia de la molecula probada en las mismas condiciones. Por "disminuido" o "disminucion" se pretende referirse a una union disminuida en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% en comparacion con la union medida en ausencia de la molecula analizada en las mismas condiciones. Ademas, los metodos de deteccion de la presente invencion pueden comprender ensayos con modelos animales. Las moleculas a probar pueden administrarse a los modelos animales y se puede evaluar el efecto de las moleculas en la absorcion de glucosa o la diabetes. Por ejemplo, los modelos animales podnan ser ratones o ratas con resistencia a la insulina, diabetes o hiperglucemia. El efecto de la molecula se puede evaluar midiendo la concentracion de glucosa en la sangre.

Moleculas

Las moleculas capaces de evitar o bloquear la union de aPKC a ALMS1 pueden ser cualquier ligando capaz de unirse a aPKC o ALMS1 y, de ese modo, evitar o bloquear la union de aPKC a ALMS1.

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una molecula que evita o bloquea la union de aPKC a ALMS1 interactuando con uno o mas de los restos de ALMS1 seleccionados en la lista que consiste en E17, D58, S59, G62, H65, L66, Q736, T737, E738, D828, S829, T1088, D1089, A1169, Q1170, F2882, L2883 y E2884. En un aspecto alternativo, la presente invencion se refiere a una molecula que evita o bloquea la union de aPKC a ALMS1 al interactuar con uno o mas de los restos de aPKC seleccionados en la lista que consiste en F114, D116, C118, L121, N138, Q142, I145, P148, G433, E545, S562, S566, F597, D601, W602, K604, E606, G620, T631, V664 y 1667.

Las moleculas capaces de mejorar o aumentar la union de TBC1D4 a ALMS1 pueden ser cualquier ligando capaz de unirse a TBC1D4 o ALMS1 y, de este modo, mejorar o aumentar la union de TBC1D4 a ALMS1.

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una molecula que mejora o aumenta la union de TBC1D4 a ALMS1 interactuando con uno o mas de los restos de ALMS1 seleccionados en la lista que consiste en H65, L66 y S2879. En un aspecto alternativo, presente invencion se refiere a una molecula que mejora o aumenta la union de TBC1D4 a ALMS1 interactuando con uno o mas de los restos de TBC1D4 seleccionados en la lista que consiste en G75, A76, P77, A78, R80, E81, V82 e I83.

La presente invencion se refiere a dichas moleculas, a una composicion farmaceutica que comprende dichas moleculas, y al uso de dichas moleculas como un farmaco o para la preparacion de un farmaco.

Las moleculas pueden ser peptidos o polipeptidos o peptidomimeticos, anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos, aptameros, Spiegelmers o compuestos qmmicos. Las moleculas pueden seleccionarse mediante los metodos de seleccion conocidos en la tecnica o como se detallo anteriormente y pueden disenarse por cualquier metodo conveniente de modelado por simulacion informatica.

En una realizacion preferida, la molecula es un peptido o polipeptido. Preferiblemente, el peptido puede tener entre 5 y 50 aminoacidos. Mas preferiblemente, tiene entre 5 y 20 aminoacidos. Mas preferiblemente, el peptido o polipeptido comprende menos de 50 aminoacidos, mas preferiblemente menos de 40, 30, 20, 15 o 10 aminoacidos. En un primer aspecto, la molecula es un peptido o polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de ALMS1 (SEC ID. n° 1). En una realizacion preferida, la molecula es un peptido o polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de ALMS1 que incluye uno o varios de los restos que se preve que median la interaccion con aPKC. En particular, estos restos se seleccionan en la lista que consiste en E17, D58, S59, G62, H65, L66, Q736, T737, E738, D828, S829, T1088, D1089, A1169, Q1170, F2882, L2883 y E2884. Mas preferiblemente, estos restos se seleccionan en la lista que consiste en D58, S59, G62, H65, L66, Q736, T737, E738, D828, S829, T1088, D1089, A1169, Q1170, F2882, L2883 y E2884. D58, S59, G62, H65 y L66 definen un primer segmento de interaccion. T737 y E738 definen un segundo segmento de interaccion. D828 y S829 definen un tercer segmento de interaccion. T1088 y D1089 definen un cuarto segmento de interaccion. A1169 y Q1170 definen un quinto segmento de interaccion. F2882, L2883 y E2884 definen un sexto segmento de interaccion. En un aspecto muy particular, el peptido o polipeptido comprende o consiste en una de las siguientes secuencias:

- LDSDSHYGPQHLESIDD (SEC ID. n° 5), dirigida al primer segmento de interaccion;

- DSHQTEETL (SEC ID. n° 6), dirigida al segundo segmento de interaccion;

- QQTLPESHLP (SEC ID. N° 7);

- QALLDSHLPE (SEC ID. n° 8), dirigida al tercer segmento de interaccion;

- PADQMTDTP (SEC ID. n° 9), dirigida al cuarto segmento de interaccion;

- HIPEEAQKVSAV (SEC ID. n° 10), dirigida al quinto segmento de interaccion;

- SCIFLEQ (SEC ID. n° 11), dirigida al sexto segmento de interaccion, y

- un fragmento del mismo que comprende 6 aminoacidos contiguos.

En un segundo aspecto, la molecula es un peptido o polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de aPKC (SEC ID. n° 4). En una realizacion preferida, la molecula es un peptido o polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de aPKC que incluye uno o varios de los restos que se preve que median la interaccion con ALMS1. En concreto, estos restos se seleccionan en la lista que consiste en F114, D116, C118, L121, N138, Q142, I145, P148, G433, E545, S562, S566, F597, D601, W602, K604, E606, G620, T631, V664 e I667. F114, D116, C118 y L121 pueden definir un primer segmento de interaccion. N138, Q142, I145 y P148 pueden definir un segundo segmento de interaccion. E545, S562 y S566 pueden definir un tercer segmento de interaccion. F597, D601, W602, K604 y E606 definen un cuarto segmento de interaccion. V664 e I667 pueden definir un quinto segmento de interaccion.

Opcionalmente, el peptido o polipeptido puede comprender una sustitucion de uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoacidos en comparacion con la secuencia de referencia, es decir, la SEC ID. n° 1 para peptidos procedentes de ALMS1, la SEC ID. n° 4 para peptidos procedentes de aPKC, y la SEC ID. n° 2 o 3 para peptidos procedentes de TBC1D4.

El peptido o polipeptido puede comprender ademas un resto que facilita su absorcion celular o entrada, en particular un DTP (dominio de transduccion de protemas). El DTP generalmente comprende una determinada secuencia de aminoacidos de 10 a 20 aminoacidos (Matsushita y Matsui, (2005), J. Mol. Med. 83, 324-328; Vives et al., Biochimic et Biophysica Acta, 2008, 1786, 126-138). El DTP se compone principalmente de aminoacidos basicos como la arginina o la lisina, y los ejemplos representativos del DTP incluyen peptidos ricos en arginina como el poli Re (RRRRRRRR) o (RRPRRPRRPRRPRRP), antennapedia o peptidos penetrantes tales como (RQIKIWFQNRRMKWKK) o HIV-Tat (YGRKKRRQRRR).

En un aspecto concreto, la molecula es un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo.

El peptido o polipeptido puede estar hecho de aminoacidos naturales y/o aminoacidos no naturales. Por "aminoacidos no naturales" se entiende un analogo o derivado de un aminoacido natural (es decir, Ala, Val, Gly, Leu, Ile, Lys, Arg, Glu, Gln, Asp, Asn, His, Tyr, Phe, Trp, Ser, Pro, Thr, Cys, Met). Presentan una cadena lateral modificada, p. ej., mas corta, mas larga o con diferentes grupos funcionales. Se contemplan los isomeros D y L, en particular porque los isomeros D no son sensibles a las proteasas. Ademas, tambien se contemplan modificaciones en algunos o en todos los enlaces peptfdicos para aumentar la resistencia a la proteolisis, en particular por (-CO-NH-) por (-CH2-NH-), (-NH-CO-), (-CH2-O-), (-CH2-S-), (-CH2-CH2-), (-CO-CH2-), (-CHOH-CH2-), (-N=N-) y/o (-CH=CH-). El peptido puede presentar un extremo terminal C carboxflico (-COO-) y uno de amida (-CONH2). El peptido tambien puede ser una secuencia D retro-inversa de un peptido como se describe en la presente memoria. El terminal N puede modificarse, especialmente con un radical acetilo. Opcionalmente, el peptido o polipeptido puede PEGilarse para aumentar la estabilidad. Alternativamente, el peptido puede modificarse para convertirse en un peptido grapado. La expresion "peptido grapado" como se emplea en la presente memoria se refiere a un peptido modificado artificialmente en el que la estructura se estabiliza con uno o mas puentes moleculares artificiales (enlaces cruzados) que conectan espiras adyacentes de helices a en el peptido. Las modalidades para preparar peptidos grapados se han estudiado ampliamente, por ejemplo, en Verdine & Hilinski (2012, Methods Enzymol., 503, 3-33), documentos WO10033617 y WO10011313.

La presente invencion se refiere ademas a una composicion farmaceutica que comprende un peptido como se ha definido anteriormente y un vehftculo/excipiente farmaceuticamente aceptable. Tambien se refiere a un peptido como se ha definido anteriormente para su uso como farmaco o para el uso de un peptido como se ha definido anteriormente para la preparacion de un medicamento.

En una realizacion alternativa, la molecula es un anticuerpo, un fragmento del mismo o un derivado del mismo. Como se emplea en la presente memoria, los terminos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” tienen el mismo significado y se usan indistintamente en la presente invencion. El termino "anticuerpo" se refiere a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un punto de union al antfgeno que se une de manera inmunoespedfica a un antfgeno. Los anticuerpos incluyen cualquier tipo de anticuerpos, preferiblemente monoclonales. Pueden ser, por ejemplo, IgG (inmunoglobulina G) o VHH (anticuerpo de dominio variable de cadena pesada de camelidos). Los fragmentos de anticuerpos o sus derivados incluyen Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, fragmentos de la region determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos lineales, moleculas de anticuerpos monocatenarios, minicuerpos, diacuerpos y anticuerpos multiespedficos formados por fragmentos de anticuerpos.

Los anticuerpos, fragmentos o derivados pueden bloquear la interaccion entre ALMS1 y aPKC. Preferiblemente, no tienen efecto en la interaccion entre ALMS1 y TBC1D4 o tienen un efecto de mejora en la interaccion.

En una primera realizacion, el anticuerpo es espedfico para ALMS1. En concreto, el epftopo del anticuerpo comprende uno o varios de los restos de ALMS1 involucrados en la interaccion con aPKC, en concreto uno o varios restos seleccionados en la lista que consta de E17, D58, S59, G62, H65, L66, Q736, T737, E738, D828, S829, T1088, D1089, A1169, Q1170, F2882, L2883, y E2884.

Alternativamente, el anticuerpo es espedfico para aPKC. En particular, el epftopo del anticuerpo comprende uno o varios de los restos de aPKC involucrados en la interaccion con ALMS1, en particular uno o varios restos seleccionados en la lista que consiste en F114, D116, C118, L121, N138, Q142, I145, P148, G433, E545, S562, S566, F597, D601, W602, K604, E606, G620, T631, V664 e I667.

Dichos anticuerpos pueden producirse inmunizando mairnferos no humanos con peptidos o proternas inmunogenicas que comprenden uno o varios restos identificados como implicados en la interaccion entre ALMS1 y aPKC. Alternativamente, se puede proporcionar y explorar una biblioteca de anticuerpos. Los anticuerpos, fragmentos o derivados producidos se identifican por su capacidad para unirse a uno de los companeros que interaction y/o su capacidad para evitar, inhibir o bloquear la interaccion entre ALMS1 y aPKC. Ademas, como se especifico anteriormente, los anticuerpos, fragmentos o derivados pueden identificarse aun mas por su capacidad para modular la interaccion entre TBC1D4 y ALMS1, y seleccionarse si aumentan o mejoran la interaccion.

Los anticuerpos, fragmentos o derivados pueden mejorar la interaccion entre ALMS1 y TBC1D4. Preferiblemente, tienen un efecto de bloqueo en la interaccion entre ALMS1 y aPKC.

En una primera realizacion, el anticuerpo es espedfico para ALMS1. En concreto, el epftopo del anticuerpo comprende uno o varios de los restos de ALMS1 involucrados en la interaccion con TBC1D4, en concreto uno o varios restos seleccionados en la lista que consiste en H65, L66 y S2879.

Alternativamente, el anticuerpo es espedfico para TBC1D4. En particular, el epftopo del anticuerpo comprende uno o varios de los restos de TBC1D4 involucrados en la interaccion con ALMS1, en particular uno o varios restos seleccionados en la lista que consiste en G75, A76, P77, A78, R80, E81, V82 e I83.

Dichos anticuerpos pueden producirse inmunizando mairnferos no humanos con peptidos o protemas inmunogenos que comprenden uno o varios restos identificados como implicados en la interaccion entre ALMS1 y TBC1D4. Alternativamente, se puede proporcionar y explorar una biblioteca de anticuerpos. Los anticuerpos, fragmentos o derivados producidos se identifican por su capacidad para unirse a uno de los companeros que interaction y/o su capacidad para mejorar o aumentar la interaccion entre ALMS1 y TBC1D4. Ademas, como se especifico anteriormente, los anticuerpos, fragmentos o derivados pueden identificarse aun mas para determinar su capacidad para modular la interaccion entre aPKC y ALMS1, y seleccionarse si disminuyen o bloquean la interaccion.

La preparacion de anticuerpos monoclonales o policlonales es bien conocida en la tecnica, y se puede usar cualquiera de las numerosas tecnicas disponibles (vease, p. ej., Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pags. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Las tecnicas para la produccion de anticuerpos monocatenarios (patente de Estados Unidos n° 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos contra los polipeptidos deseados. Ademas, pueden usarse ratones transgenicos u otros organismos, como otros mai^eras, para expresar anticuerpos humanizados, hforidos o modificados de manera similar. Alternativamente, puede usarse la tecnologfa de presentacion de fagos para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteromeros que se unen espedficamente a antfgenos seleccionados (vease, p. ej., McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)).

Para aptameros y Spiegelmers, se pueden utilizar metodos similares para seleccionar aptameros y Spiegelmers. Estos metodos son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Como se emplea aqm, el termino "aptamero" significa una molecula de acido nucleico o un peptido capaz de unirse a ALMS1, aPKC o TBC1D4. Se refiere a una clase de molecula que representa una alternativa a los anticuerpos en terminos de reconocimiento molecular. Los aptameros son oligonucleotidos u secuencias de oligopeptidos con capacidad de reconocer virtualmente cualquier clase de moleculas diana con gran afinidad y especificidad.

Dichos ligandos pueden aislarse por evolucion sistematica de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatorias, como se describe en Tuerk C. y Gold L., Science, 1990, 249 (4968): 505­ 10. La biblioteca de secuencias aleatorias se puede obtener por srntesis química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es un oligomero lineal, eventualmente modificado químicamente, de una secuencia unica. Las posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moleculas se han revisado en Jayasena S. D., Clin. Chem., 1999, 45 (9):1628-50. Los aptameros peptfdicos consisten en una region variable de anticuerpo restringida por configuracion mostrada por una proterna de plataforma, como la tiorredoxina A de E. coli que se selecciona de bibliotecas combinatorias mediante dos metodos hforidos (Colas et al., Nature, 1996, 380, 548-50). Se han descrito spiegelmers, por ejemplo, en el documento WO 98/08856. Son moleculas similares a los aptameros. Sin embargo, los spiegelmers consisten completamente o en su mayona en L-nucleotidos en lugar de D-nucleotidos a diferencia de los aptameros. De otra manera, concretamente con respecto a las posibles longitudes de los spiegelmers, se aplica lo mismo a los spiegelmers como se describe en relacion con los aptameros.

Compuestos qmmicos se refiere a una molecula de menos de aproximadamente 1.500 Dalton, 1.000 Dalton, 800 Dalton, o incluso menos de aproximadamente 500 Dalton, en concreto compuestos organicos o inorganicos. El diseno estructural en química debena ayudar a encontrar dicha molecula. La molecula puede haber sido identificada por un metodo de deteccion descrito en la presente invencion.

Las bibliotecas de compuestos sinteticos estan disponibles en el mercado en varias compares, entre ellas Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, Reino Unido), Comgenex (Princeton, N. J.), Brandon Associates (Merrimack, N. H.) y Microsource (New Milford, Conn.). Las bibliotecas combinatorias estan disponibles o pueden prepararse segun tecnicas sinteticas conocidas. Alternativamente, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fungicos, vegetales y animales estan disponibles, p. ej., en Pan Laboratories (Bothell, Wash.) Y MycoSearch (NC), o se pueden producir facilmente por metodos bien conocidos en la tecnica.

Ademas, las bibliotecas y los compuestos producidos de forma natural y sintetica pueden modificarse aun mas a traves de tecnicas químicas y bioquímicas convencionales.

La molecula puede estar unida, por enlaces covalentes o no, a un resto que se dirige a tejidos apropiados, preferiblemente el tejido adiposo o a un resto que facilita la entrada de la molecula en las celulas.

Indicaciones terapeuticas

Los inventores proponen usar las moleculas como se describe en la presente memoria para aumentar la absorcion de glucosa, en concreto por los adipocitos, regulando o controlando asf la concentracion de glucosa en sangre. Entonces, las moleculas son adecuadas para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia.

La diabetes mellitus se caracteriza por hiperglucemia. Mas particularmente, la diabetes tipo 2 se caracteriza por hiperglucemia y resistencia a la insulina. Se cree que la obesidad es la causa principal de la diabetes tipo 2 en personas geneticamente predispuestas a la enfermedad. La retinopatfa diabetica, la neuropatia diabetica, la nefropatfa diabetica son trastornos bien conocidos relacionados con la diabetes y la resistencia a la insulina.

Ademas, disminuir la glucemia al aumentar la absorcion de glucosa podna tratar o retrasar la evolucion o la aparicion de estas enfermedades.

La presente invencion tambien se refiere a las moleculas segun la invencion para su uso para reducir la dosis de insulina o detener el tratamiento con insulina cuando se usa para tratar la diabetes en un sujeto, al uso de las moleculas segun la invencion para la preparacion de un medicamento destinado a reducir la dosis de insulina o interrumpir el tratamiento con insulina cuando se usa para tratar la diabetes en un sujeto, o para un metodo para tratar la diabetes en un sujeto, en donde se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula segun la invencion a un sujeto con una dosis disminuida de insulina o en ausencia de tratamiento con insulina. Mas generalmente, se puede usar para disminuir las dosis de medicamentos antidiabeticos.

Por "tratar" o "tratamiento" se entiende que la enfermedad se cura, alivia o retarda. Incluye el tratamiento preventivo o curativo. El termino tratamiento designa en particular la correccion, el retraso o la reduccion de una homeostasis alterada de la glucosa. El termino "tratamiento" tambien designa una mejora en la absorcion de glucosa (p. ej., la captura de glucosa por los adipocitos). En el contexto de la invencion, las expresiones "controlar la concentracion de glucosa en sangre" o "el control de la concentracion de glucosa en sangre" se refieren a la normalizacion o la regulacion de la concentracion de glucosa en sangre o plasma en un marnffero con concentraciones anormales (es decir, concentraciones que estan por debajo o por encima de un valor de referencia, medio o promedio conocido para un mairnfero correspondiente con una homeostasis de glucosa normal).

La presente invencion se refiere al uso farmaceutico o veterinario de la molecula. Por consiguiente, el sujeto puede ser cualquier mamffero, preferiblemente un ser humano, tal como un adulto o un nino. En una realizacion concreta, el sujeto sufre de obesidad. Opcionalmente, el sujeto no tiene anticuerpos anti-islotes detectables, y la ecograffa no puso de manifiesto anomalfas pancreaticas. En el contexto de una aplicacion veterinaria, el sujeto puede ser un animal, preferiblemente un mamnfero, en particular un animal domestico tal como un perro, un gato o un caballo. Las moleculas segun la invencion pueden usarse en combinacion con uno o mas farmacos activos adicionales, preferiblemente farmacos antidiabeticos, en particular para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia.

Por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una molecula segun la presente invencion y uno o mas farmacos activos adicionales, preferiblemente un farmaco antidiabetico. Ademas, se refiere a un producto o botiqurn que contiene una molecula segun la invencion y uno o mas farmacos activos adicionales, preferiblemente farmacos antidiabeticos, como un preparado combinado para uso simultaneo, independiente o secuencial, o un preparado combinado que comprende una molecula segun la invencion y uno o mas farmacos activos adicionales, preferiblemente farmacos antidiabeticos, para uso simultaneo, independiente o secuencial, en particular para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia.

Se refiere a una molecula segun la invencion para el uso o tratamiento de la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia en combinacion con una o mas farmacos activos adicionales, preferiblemente farmacos antidiabeticos.

Tambien se refiere al uso de una molecula segun la invencion y a uno o mas farmacos activos adicionales, preferiblemente farmacos antidiabeticos, para la preparacion de un medicamento, en concreto al tratamiento o retraso de la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia.

Por ultimo, se refiere a un metodo para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia, en donde una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula segun la invencion se administra en combinacion con una cantidad terapeutica o subterapeutica eficaz de uno o mas farmacos activos adicionales, preferiblemente farmacos antidiabeticos. Por "sub-terapeutica" se entiende que se refiere a una cantidad que puede ser, por ejemplo, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10% de la dosis terapeutica convencional (en concreto para la misma indicacion y la misma via de administracion).

En concreto, el farmaco activo adicional es un farmaco utilizado para tratar o retrasar la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia. Por ejemplo, el medicamento adicional puede ser un medicamento antidiabetico como un agente hipoglucemiante o un agente antihiperglucemico. Puede seleccionarse en la lista no exhaustiva que comprende insulina, metformina, sulfonilureas, como tolbutamida, acetohexamida, tolazamida, clorpropamida, gliburida (tambien llamada glibenclamida), glimepirida, glipizida, glicazida, glicopiramida y gliquidona, inhibidores de alfa-glucosidasa como acarbosa, miglitol y voglibosa, tiazolidindionas como pioglitazona y rosiglitazona, una meglitinida como repaglinida y nateglinida, mimeticos de incretina, analogos y antagonistas peptidicos glucagonoides tales como exenotida, taspoglutida y liraglutida, inhibidores de dipeptidil-peptidasa-4 tales como vildagliptina, sitagliptina, saxagliptina, linagliptina, alogliptina y septagliptina, analogos de amilina tal como pamlintida, glicouricos tales como canaglifozina y dapaglifozina o cualquiera de sus combinaciones.

La forma de las composiciones farmaceuticas, la via de administracion, la dosis y el regimen dependen naturalmente de la afeccion a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmaceuticas o terapeuticas de la invencion pueden formularse para administracion topica, bucal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutanea o intraocular y similares.

La molecula utilizada en la composicion farmaceutica de la invencion esta presente en una cantidad terapeuticamente eficaz. La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" como se usa en la presente solicitud se refiere a una cantidad de agente terapeutico, administrada a un paciente que es suficiente para constituir un tratamiento de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia como se definio anteriormente.

La composicion farmaceutica que comprende la molecula se formula segun la practica farmaceutica habitual (Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York) conocida por un experto en la tecnica.

Para la administracion oral, la composicion puede formularse en formas galenicas orales convencionales tales como comprimidos, capsulas, polvos, granulos y preparados lfquidos tales como jarabes, elixires y gotas concentradas. Se pueden usar vehfculos o diluyentes solidos atoxicos que incluyen, por ejemplo, calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, magnesio, carbonato y similares. Para comprimidos, tambien son necesarios los aglutinantes, que son agentes que dan cualidades cohesivas a los materiales en polvo. Por ejemplo, se pueden usar como aglutinantes almidon, gelatina, azucares como lactosa o dextrosa, y gomas naturales o sinteticas. Los disgregadores tambien son necesarios en los disgregadores para facilitar la ruptura del comprimido. Los disgregadores incluyen almidones, arcillas, celulosas, alginas, gomas y polfmeros reticulados. Ademas, tambien se incluyen lubricantes y fluidificantes en los comprimidos para evitar la adhesion al material del comprimido a las superficies en el proceso de preparacion y para mejorar las caractensticas de fluidez del material en polvo durante la preparacion. El dioxido de silicio coloidal se usa mas frecuentemente como fluidificante y los compuestos como el talco o los acidos estearicos se usan mas frecuentemente como lubricantes.

Para la administracion transdermica, la composicion puede formularse en forma de pomada, crema o gel y pueden usarse penetrantes o detergentes apropiados para facilitar la penetracion, como dimetilsulfoxido, dimetilacetamida y dimetilformamida.

Para la administracion a traves de las mucosas, se pueden usar aerosoles nasales, supositorios rectales o vaginales. El compuesto activo puede incorporarse en cualquiera de las bases de supositorio conocidas mediante metodos conocidos en la tecnica. Los ejemplos de dichas bases incluyen manteca de cacao, polietilenglicoles (carboceras), monoestearato de polietileno sorbitan y mezclas de estos con otros materiales compatibles para modificar el punto de fusion o la velocidad de disolucion.

Las composiciones farmaceuticas segun la invencion pueden formularse para liberar el farmaco activo sustancialmente inmediatamente despues de la administracion o en cualquier momento predeterminado o penodo de tiempo despues de la administracion.

Las composiciones farmaceuticas segun la invencion pueden comprender una o mas moleculas de la presente invencion asociadas con excipientes y/o vehfculos farmaceuticamente aceptables.

Estos excipientes y/o vehfculos se eligen segun la forma de administracion descrita anteriormente.

En una realizacion concreta, la composicion farmaceutica segun la invencion comprende 0,001 mg a 10 g de la molecula de la invencion. Preferiblemente, la composicion farmaceutica segun la invencion comprende 0,01 mg a 1 g de la molecula de la invencion.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Caracterizacion metabolica de los ratones Almsfoz/foz.

(A) Peso corporal medio de ratones macho WT y Almsfoz/foz (n = 6-8 ratones por genotipo). (B) Fotograffa de tejido adiposo visceral de WT y Almsfoz/foz. Barra de escala: 25 |jM. (C) Prueba de tolerancia a la insulina (P.T.I.) realizada en ratones WT y Almsfoz/fozy el histograma correspondiente que muestra el area bajo la curva (A.B.C.) para cada genotipo (n = 6-8 ratones por grupo, p <0,001). (D) Peso corporal medio de ratones macho WT y Almsfoz/foz (n = 6-8 ratones por genotipo). (E) Fotograffa del tejido adiposo visceral de los correspondientes WT y Almsfoz/foz. Barra de escala: 25 |jM. (F) Prueba de tolerancia a la insulina realizada en ratones WT y Almsfoz/foz y el histograma correspondiente que muestra el A.B.C. para cada genotipo (n = 6-8 ratones por grupo). *** representa el valor p <0,001. (G) Inmunotransferencias para las protemas indicadas en tejidos sensibles a la insulina de ratones WT y Almsfoz/foz no obesos. (H) Resultados de recuentos radiactivos en diferentes tejidos diana despues de la inyeccion de desoxiglucosa radiactiva en ratones WT y Almsfoz/foz (n = 5 ratones por genotipo). * representa el valor p = 0,05. Figura 2. Efecto asintomatico de ALMS1 en adipocitos maduros humanos

(A) Fotograffas que muestran la falta de absorcion de 2-NBDG (verde) en adipocitos de referencia (shCTRL shARN) o privados de ALMS1 (ALMS1 shARN) adipocitos maduros asintomaticos en ausencia de INS. (B) Fotograffas que representan la falta de absorcion de 2-NBDG en shARN ALMS1 en comparacion con CTRLshARN. Los nucleos se tineron por contraste con DAPI, DIC: Imagenes de contraste por interferencia diferencial. (C) Imagenes 3D de adipocitos maduros con CTRLshARN o ALMSIshARN tenidos para trigliceridos intracelulares (TG), membrana plasmatica (MP) en rojo y nucleos en azul (DAPI). (D) Mediciones de los niveles de fluorescencia que se correlacionan con las cantidades de trigliceridos TG intracelulares en adipocitos maduros (n = 16 pocillos por condicion medida) * valor p = 0,05. (E-F) Inmunodeteccion de AKT y pS473-AKT en adipocitos maduros tratados con CTRLshARN y ALMS1 shARN en presencia y ausencia de INS. (G) Imagenes en 3D de adipocitos maduros con CTRLshARN y ALMSIshARN que muestran la localizacion celular del receptor de insulina (RI en rojo) y GLUT4 (en verde) en ausencia de Ins. Imagenes con vista en corte que muestran la dinamica de la localizacion GLUT4 en ausencia de Ins. (H), despues de 30 min. de estimulacion de INS. (I) y con 30 min de estimulacion de INS. seguida de 2 horas de ausencia de INS. (J) en adipocitos maduros con CTRLshARN y ALMSIshARN. Barras de escala: 25 jm en A, B, C y 5 jm en G-J.

Figura 3. Puntos de interaccion previstos en la protema ALMS1 y modelado de su companera TBC1D4. (A) Estructura 3D prevista de la protema ALMS1 con helices y bucles. (B) Estructura 3D prevista de la protema ALMS1 con los puntos interactivos potenciales representados por puntos rojos. (C) Secuencia primaria de la protema TBC1D4 con la localizacion indicada de los puntos de union o dominios que interactuan. (D) Estructura 3D predicha de la protema TBC1D4.

Figura 4. Se requiere ALMS1 para el trafico celular de TBC1D4

(A) Estructura 3D prevista por simulacion informatica que muestra la interaccion espacial entre ALMS1 y TBC1D4 con una vista ampliada del punto de interaccion que resalta los restos de aminoacidos interactivos predichos (L66, Y61 y S2879) de la protema ALMS1. (B) Imagen 3D de adipocitos maduros inmunotenidos que representan la colocalizacion de TBC1D4 (verde) y ALMS1 (rojo). Los nucleos se tineron por contraste con DAPI (azul). (C-D) Inmunotransferencias para las protemas indicadas en los lisados celulares (50 jg de protema cargada por carril) para los adipocitos maduros con CTRLshARN y ALMSIshARN tratados con o sin insulina. Imagenes 3D de experimentos de inmunofluorescencia realizados en adipocitos maduros con CTRLshARN o ALMSIshARN o TBC1D4shARN que representan la localizacion celular de GLUT4 en ausencia de insulina (-INS) (E) o en presencia de INS. (F). MP: membrana plasmatica y nucleos contrastados con DAPI. Imagenes 3D de experimentos de inmunofluorescencia realizados en adipocitos con CTRLshARN o ALMSIshARN que muestran la localizacion celular de GLUT4 (verde) y TBC1D4 en ausencia de INS (G) o cuando se tratan 30 min. con el INS. (H). Barras de escala: 10 jm.

Figura 5. TBC1D4 no es el unico companero de ALMS1 que interactua que desempena un papel en la biologfa de los adipocitos

(A-C) Fotograffas que muestran la absorcion de 2-NBDG en adipocitos privados de CTRLshARN o ALMS1shARN o TBC1D4shARN despues de 30 min estimulacion con Ins. (D-F) Imagenes en 3D obtenidas utilizando adipocitos maduros fijados no permeabilizados estimulados con INS. despues de la inmunodeteccion de GLUT4 unida a la membrana (verde). La membrana plasmatica (MP) se tino con Image-iT (rojo) y los nucleos se tineron por contraste con DAPI. (G) Inmunotransferencias de 2 subunidades de bombas de protones (ATP6V0D1 y ATP6V1A) identificadas por espectrometna de masas en los experimentos de IP que utilizan ALMS1 como cebo (Fig. S4), aPKC, GLUT4 y p-Tubulina en extractos celulares de tejido adiposo blanco (TAB) y rinon. 50 jg de protema completa cargada por carril. (H) Fotograffa de la senal positiva de Duolink detectada en adipocitos utilizando anticuerpos contra ALMS1 y ATP6. (I) Imagenes de inmunofluorescencia que muestran localizaciones celulares de ATP6V0D1 y ALMS1 y se fusionadas en adipocitos maduros tras la estimulacion con INS. (J) La simulacion informatica predijo los puntos de union de TBC1D4 (rojo) y PKC (amarillo) que estan a solo 20 Angstroms de distancia entre sf en la estructura 3D de ALMS1. (K-L) Inmunodetecciones de aPKC, TBC1D4 y a-actinina en inmunoprecipitados utilizando ALMS1 como cebo en adipocitos cultivados en ausencia o presencia de INS.

Figura 6. La restauracion de la acidificacion en los adipocitos privados de ALMS1 restablece la absorcion de glucosa (A-B) Se realizaron imagenes de transcurso de tiempo en adipocitos tenidos con acridina naranja de referencia o privados de ALMS1 estimulados con INS. (C-D) Las imagenes de transcurso de tiempo se realizaron en adipocitos tenidos con acridina naranja de referencia o privados de ALMS1 estimulados con un ionoforo de intercambio K+/H+ electroneutro, nigericina (NIG.). (E) De arriba a abajo: Imagenes de microscopia electronica de barrido (SEM) de adipocitos de referencia estimulados sin Ins. o con INS. o con NIG. Las flechas blancas muestran vesmulas hinchadas. (F) Imagenes de microscop^a electronica transmitida (TEM) correspondientes mostradas en (E) que muestran la fusion de vesmulas con la membrana plasmatica en presencia de INS. y NIG. (G) De arriba a abajo: Imagenes de SEM de adipocitos privados de ALMS1 estimulados sin INS o con INS. o con NIG. (H) Las imagenes de TEM correspondientes se muestran en (G) que muestran la fusion de las vesmulas con la membrana plasmatica solo en presencia de NIG. (I) Fotograffas que muestran el contenido intracelular de 2-NBDG (verde) en los adipocitos maduros de referencia, en ausencia de INS. (recuadro superior) o despues de 30 minutos de estimulacion con INS. (recuadro del medio) o despues de 30 min. de estimulacion con NIG. (recuadro inferior). (J) Fotograffas que muestran el contenido intracelular de 2-NBDG (verde) en adipocitos maduros privados de ALMS1, en ausencia de INS. (recuadro superior) o despues de 30 minutos de estimulacion con INS. (recuadro del medio) o despues de 30 min. de estimulacion con NIG. (recuadro inferior). Barras de escala: 20 pm excepto para F y H: 500 nm.

Figura 7. El trafico de GLUT4 requiere un complejo de protemas ALMSome

(A) Imagenes 3D obtenidas utilizando adipocitos maduros fijados no permeabilizados estimulados con NIG. despues de inmunodeteccion de GLUT4 unida a la membrana (verde). La membrana plasmatica (MP) se tino con Image-iT (rojo) y los nucleos se tineron por contraste con DAPI. (B) Fotograffas que muestran contenido de TG intracelular 24 hr. despues de tratamiento con NIG. (C) Representacion esquematica de la localizacion celular de ALMS1 y la protema asociada en ausencia de estimulacion con INS. en adipocitos maduros. (D) Representacion esquematica de la dinamica de ALMS1 y las protemas asociadas despues de la estimulacion con INS. en adipocitos maduros. Figura 8. La absorcion de glucosa se activa en ausencia de INS por interferencia espedfica del punto de union a aPKC en el ALMSome

(A) Fotograffas que muestran la absorcion de 2-NBDG en presencia o ausencia de INS en adipocitos infectados con parffculas lentivfficas CTRL o dominios aPKC que llevan parffculas lentivfficas. (B) Cuantificacion del analogo 2-NB de glucosa intracelular en presencia o ausencia de INS en adipocitos infectados con parffculas lentivfficas CTRL o dominios aPKC que llevan parffculas lentivfficas. (n = 8 por grupo).

Figura 9. Caracterizacion del montaje min-aPKC-FLAG en adipocitos

Recuadro superior: Inmunodeteccion de min-aPKC-FLAG utilizando un anticuerpo anti-FLAG en adipocitos maduros 48 horas despues de la infeccion lentivffica. 2° y 3er recuadros: Imagen en 3D del adipocito que muestra la localizacion perinuclear de min-aPKC-FLAG. Ultimo recuadro: Representacion esquematica de los enfoques metodos utilizados para evaluar el efecto de min-aPKC-FLAG en la absorcion de glucosa.

Ejemplos

El smdrome de Alstrom (ALMS) es un raro trastorno autosomico recesivo caracterizado por varias caracteffsticas clmicas que incluyen obesidad y diabetes de aparicion precoz. Se origina debido a mutaciones en el gen ALMS1 que codifica una protema de 460 kDa.

La funcion del gen ALMS1 y como causa el fenotipo del smdrome de Alstrom ha sido desconocida hasta ahora, y los estudios sobre su funcion se ven obstaculizados por el tamano extremadamente grande de la protema codificada y sus bajos niveles de expresion.

El smdrome de Alstrom (ALMS) es un smdrome de obesidad infantil monogenica poco comun para el cual existe un solo gen causante mutado identificado hasta la fecha, el gen ALMS1. ALMS esta clasificado como un miembro de los trastornos de la ciliopaffa que incluye el smdrome de Bardet Biedl, un grupo de trastornos sindromicos que se originan a partir de mutaciones en la gran cantidad de protemas diferentes que juntas juegan un papel cfftico en la funcion ciliar primaria. Almsl codifica la protema ALMS1 de 461 kDa que originalmente se describio por llevar una localizacion puramente centriolar, aunque datos mas recientes tambien han sugerido una localizacion citoplasmica de ALMS1.

ALMS se identifica clmicamente por un fenotipo multisistemico colectivo que se piensa que refleja la expresion ubicua del tejido de ALMS1, imitando aproximadamente muchas de las caracteffsticas fenoffpicas de BBS. Las caracteffsticas clmicas comunes de ALMS incluyen la degeneracion de la retina, la perdida de audicion, la obesidad infantil, la diabetes mellitus tipo 2 de inicio precoz (T2DM), la miocardiopaffa dilatada, la disfuncion renal y hepatica, el hipotiroidismo, la baja estatura, la hiperlipidemia y la fibrosis de organos. Los ninos con ALMS desarrollan obesidad en la primera infancia que se asocia con el inicio precoz de T2DM alrededor de los 16 anos de edad, con una prevalencia general mucho mayor de T2DM de inicio precoz en ALMS que la vista con otros smdromes de obesidad infantil que dan como resultado un mdice de masa corporal similar (IMC) incluido BBS. La razon para esta predileccion por T2DM en ninos con ALMS que es desproporcionada para su grado de obesidad sigue siendo inalcanzable.

Los inventores investigaron el papel de la protema ALMS1 durante el proceso de diferenciacion adipogenica y encontraron que los niveles de expresion de la protema ALMS1 aumentaron durante la adipogenia. La supresion de ALMS1, en celulas madre mesenquimatosas diferenciadoras adipogenas, inhibio las cascadas antiadipogenas, pero sorprendentemente no favorecio la adipogenia.

Ademas, los inventores demostraron que el complejo proteico ALMS1 tambien se requiere en adipocitos maduros para una retencion eficiente de GLUT4 en su compartimento sensible a la insulina y su capacidad para fusionarse con la membrana plasmatica en respuesta a la estimulacion con insulina. La inactivacion de ALMS1 disminuyo la cantidad de glucosa capaz de ser absorbida por los adipocitos maduros tras la estimulacion de la insulina, contribuyendo asf a la hiperglucemia y al inicio de la diabetes.

Estudios previos en el mutante espontaneo Almsfoz/foz y los modelos de ALMS murinos transgenicos geneticamente atrapados de Almsl confirmaron que estos ratones, al igual que los ninos humanos afectados, desarrollan obesidad en la adolescencia temprana debido a la hiperfagia, y tambien presentan tolerancia a la glucosa alterada, hiperinsulinemia e hipertrofia de islotes, coherente con una resistencia grave a la insulina, aunque el origen del tejido o el mecanismo para esta resistencia a la insulina no ha sido previamente caracterizado. Estudios previamente publicados de estudios in vitro en la estirpe celular de fibroblastos 3T3-L1 murinos demostraron que la inhibicion de la expresion del gen ALMS1 dio como resultado un deterioro leve de la adipogenia, pero se senalo que no terna ningun efecto sobre la via de senalizacion de la insulina en los adipocitos maduros resultantes, medida por la fosforilacion de AKT mediada por la insulina. Estos datos llevan directamente lejos de la invencion presentada en la presente memoria que Almsl de hecho desempena un papel cntico no reconocido hasta ahora en la ruta de senalizacion de insulina y en el transporte de glucosa mediado por GLUT4.

De hecho, a pesar de los datos contrarios publicados anteriormente, los inventores, al estudiar cuidadosamente el fenotipo del modelo ALMS murino de Fat Aussie (Alms1foz/foz), identificaron que la resistencia a la insulina en este modelo precedio mas que siguio el desarrollo de la obesidad. Ademas, identificaron el tejido adiposo como la zona espedfica que impulsa la resistencia a la insulina y el posterior desarrollo de intolerancia a la glucosa y T2DM en ALMS. Confirmaron que la senalizacion de insulina en adipocitos Alms1foz/foz estuvo intacta a lo largo de la bajada a la fosforilacion de TBC1D4, el ultimo miembro conocido de la via de absorcion de glucosa mediada por insulina, pero luego, mediante una serie de investigaciones posteriores, identificaron un complejo de protemas denominado Almsome, compuesto de varias protemas clave que se asocian con ALMS1 y que juntos son necesarios para el anclaje y la fusion de las vesmulas de GLUT4 a la membrana plasmatica de adipocitos (MP) en respuesta a la senalizacion de la insulina. Por lo tanto, Almsome representa el ultimo paso hasta ahora no identificado en la absorcion de glucosa mediada por la insulina en los adipocitos, con resistencia a la insulina en ALMS debido a la interrupcion de la funcion de Almsome que conduce al fracaso de la fusion de la membrana de GLUT4 y, por lo tanto, a un bloqueo para el transporte de glucosa de los adipocitos.

Ejemplo 1

Los ratones Alms1foz/foz presentan una resistencia severa espedfica a la insulina en el tejido adiposo incluso en ausencia de obesidad

Cna de animales

Los ratones Alms1foz/foz y las cnas de la misma camada Almsl /+ (WT) se mantuvieron en un ambiente C57BL/6J en la instalacion animal en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los ratones tuvieron acceso libre y a discrecion al agua y una comida normal que contema un 5,4% de grasa, un contenido energetico de 12 Mj/kg (granulos de mantenimiento de ratas y ratones de Gordon, piensos de la especialidad de Gordon, Australia) o una dieta alta en grasas (HFD) con un 23% de grasa, alta en carbohidratos simples, 0,19% de colesterol, contenido energetico 20 MJ/kg (SF03-020, Speciality feeds, Australia). Se utilizaron cebadores que flanquean la mutacion foz para genotipado por PCR: directo ACA ACT TTT CAT GGC TCC AGT (SEC ID. n° 13); inverso TTG GCT CAG AGA CAG TTG AAA (SEC ID. N° 14).

Se usaron ratones Alms1foz/foz obesos de seis meses de edad y jovenes (<60 dfas de edad) no obesos y ratones de la misma camada salvajes (WT) para investigar que deterioro metabolico primario hace que los ratones Alms1foz/foz desarrollen T2DM. Los ratones Almsfoz/foz de seis meses de edad eran obesos con un peso corporal medio de 45,5 g ± 1,7 g en comparacion con 26,4 g ± 1,3 g para los ratones de la misma camada WT (Fig. 1A) y, como se mostro anteriormente, ternan hiperglucemia en ayunas y tolerancia a la glucosa alterada con puntuaciones HOMA elevadas. Una prueba de tolerancia a la insulina (PTI) demostro que, a diferencia de los WT (Fig. 1B) y los ratones de la misma camada heterocigotos, la glucemia en ratones Alms1foz/foz obesos no responde a la administracion de insulina (Fig. 1B), incluso cuando se administraron dosis de insulina tan altas como 20 U/kg. (Fig. 1C). Obesidad de los ratones Alms1foz/foz debida a hipertrofia grave de los adipocitos (Fig. 1B) en lugar de a la hiperplasia de los adipocitos normalmente mas observada en los ratones obesos con BBS. Para determinar lo que el defecto primario era que estaba causando la intolerancia a la glucosa en ratones ALMS1foz/foz, se estudiaron ratones ALMS1foz/foz jovenes delgados para eliminar el efecto de confusion de la obesidad en el grado de respuesta a la insulina. A los 2 meses de edad, los machos WT y Alms1foz/foz ternan un peso corporal promedio similar de ~ 24 g (Fig. 1D). La PTI en estos ratones demostro que, sin embargo, los machos Alms1foz/foz jovenes no obesos ya mostraban una respuesta a la insulina significativamente reducida (Fig. 1E), coherente con la resistencia a la insulina que precede a la obesidad en este modelo. La inmunodeteccion de IRAP, Akt, p-AKT, GLUT4, C/EBP-a y GAPDH realizada en tejidos sensibles a la insulina, a saber, el corazon, el Idgado, musculos esqueleticos y tejido adiposo blanco (TAB) de ratones Alms1foz/foz de 6 meses de edad no ayunados y WT no mostraron diferencias importantes en las concentraciones de protema excepto por un aumento constante en la relacion p-AKT a AKT total en TAB, coherente con un aumento paradojico en lugar de una reduccion en la activacion de los miembros anteriores de la ruta de senalizacion de la insulina en ratones Alms1foz/foz intolerantes a la glucosa (Fig. 1G). Para identificar que tejidos solos o juntos pueden ser la fuente principal de la resistencia a la insulina observada en ratones Alms1foz/foz, se comparo la distribucion tisular de la absorcion de desoxiglucosa (DOG) mediada por insulina en ratones WT y Alms1foz/foz. Esto confirmo que la absorcion de DOG gravemente danada se limitaba al TAB de ratones Alms1foz/foz con un aumento compensatorio en la absorcion de DOG en los musculos gemelos y soleo sensibles a la insulina en comparacion con los ratones WT.

Estos estudios demuestran que aunque los ratones Alms1foz/foz se vuelven obesos y desarrollan T2DM progresiva con la edad, el principal defecto inicial que contribuye a la resistencia a la insulina y la hiperglucemia es un fallo en la ausencia si ALMS1 funcional de la absorcion de glucosa en el tejido adiposo en respuesta a la senalizacion de la insulina, precediendo este defecto al desarrollo de la obesidad.

Ejemplo 2

La ausencia de smtomas de Almsl en adipocitos humanos bloquea la absorcion de glucosa mediante la clasificacion celular de GLUT4 alterada

Materiales. De Molecular Probes, Invitrogen: Naranja de acridina, Image-iT® LIVE Plasma Membrane y equipo de marcaje de tincion nuclear, 2-NBDG (2-(N-7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-il) amino) -2-desoxiglucosa), Hoechst 33258 y Cell Light™ Early Endosomes-RFP* BacMam 2.0*; n° en catalogo: A3568, I34406, N13195, H3569 y C10587. De Lonza: reactivo analttico AdipoRed™ (numero en catalogo: PT-7009). Partmulas lentivmcas de Santa Cruz Biotechnology, INC.: ALMS1 shRNA (h) Partmulas lentivmcas, TBC1D4 shRNA (h) Partmulas lentivmcas y Partmulas lentivmcas-A shRNA de referencia; n° en catalogo: sc-72345-V, sc-61654-V y sc-108080 respectivamente. De Tocris Biosciences: sal sodica de Nigericina (n° en catalogo: 4312).

Pruebas bioquímicas. Se examino la resistencia a la insulina en ratones mediante la prueba de tolerancia a la insulina (PTI) y la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (PTGIP). Para la PTI, los ratones se mantuvieron 4 horas en ayunas sin acceso a los alimentos, pero libre acceso al agua. Se pesaron los ratones y se inyecto ip insulina (Humulin R, Eli Lilly, EE. UU.) a razon de 0,75 U/kg de peso corporal en solucion salina al 0,9% para inyeccion (Pfizer, EE. UU.). Se extrajo sangre de la cola y se determino la glucosa en el plasma para cada raton con un glucometro (Optium Xceed, Abbott, EE. UU.) y tiras reactivas de glucosa en sangre (punto de atencion de Optium, Abbott, EE. UU.) a los 0, 15, 30 y 60 min despues de la inyeccion de insulina. Para la PTGIP, los ratones se mantuvieron 18 horas en ayunas y se les inyectaron a razon de 2 mg/g de peso corporal de D-glucosa (Analar, VWR, EE. UU.) en solucion salina al 0,9% para inyectables. Se determino la glucosa plasmatica para cada raton usando un glucometro con muestreo por la vena de la cola a 0, 15, 30, 60 y 120 min despues de la inyeccion de glucosa. Para la medicion de la insulina en el plasma, se extrajo sangre en animales conscientes mediante sangrado de las mejillas. Despues de la extraccion, las muestras de sangre se mantuvieron en hielo y se centrifugaron a 17.000 g, 10 min a 4°C. Se analizaron las concentraciones de insulina utilizando un equipo ELISA ultrasensible comercial para insulina de raton (Crystal Chem Inc., EE. UU.). La evaluacion del modelo de homeostasis de mdice de resistencia a la insulina (HOMA-RI) se calculo utilizando la insulina en ayunas de cada raton y las concentraciones de glucosa en ayunas. Se utilizo la formula siguiente: HOMA - RI = [glucosa en ayunas (mg/dl) * insulina en ayunas (pU/ml)]/405.

Cultivo celular. Se adquirieron preadipocitos viscerales blancos humanos (n° en catalogo: C-12732; PromoCell) y celulas madre mesenquimatosas humanas (n° en catalogo: C-12974; PromoCell) procedentes de medula osea sana. Los preadipocitos se sembraron segun el protocolo del fabricante y se cultivaron en medio de crecimiento de preadipocitos (n° en catalogo: C-27410; PromoCell) hasta confluencia. Un dfa antes de inducir adipogenia terminal, las celulas se infectaron con partmulas lentivmcas espedficas que consisten en un conjunto de 3 montajes espedficos para las dianas shARNs adquiridos en Santa Cruz Biotechnology y al dfa siguiente, se indujo diferenciacion adipogenica cambiando el medio por el medio de diferenciacion de preadipocitos. (n° en catalogo: C-27436; PromoCell) durante 2 dfas. Despues de la fase de diferenciacion, el medio finalmente se cambio por el medio Adipocyte Nutrition (n° en catalogo: C-27438; PromoCell). Para el cultivo sin insulina, Adipocyte Basal Medium (n° en catalogo: C-2431; PromoCell) sin insulina se enriquecio con 5 g/l de desoxiglucosa, 8 |jg/ml de d-Biotina, 400 ng/ml de Dexametasona. Para las hMSC, se cultivaron en medio de crecimiento de celulas madre mesenquimatosas (n° en catalogo: C-28010; PromoCell) hasta confluencia. Las hMSC se transfectaron con ARNsi espedficos como se describio anteriormente y al dfa siguiente se indujo la diferenciacion adipogenica cambiando el medio por el Medio de diferenciacion adipogeno MSC (n° en catalogo: C28011; Promocell).

Extraccion de ARN, sntesis de ADNc, q-PCR y Taqman. Se preparo ARN total a partir de diferentes tejidos y celulas utilizando un equipo RiboPure ™ (n° en catalogo: AM1924; Ambion), seguido de un tratamiento con ADNasa con TURBO DNA-Free™ (n° en catalogo: AM1907; Ambion). La integridad del ARN se evaluo por electroforesis en gel y la concentracion de ARN por Eppendorf Biophotometer Plus con la Hellma® Tray Cell (n° en catalogo: 105.810-uvs; Hellma). La transcripcion inversa de 1 |jg de ARN completo a cDNA se realizo con el kit de smtesis de cDNA BioRad iScript ™ (n° en catalogo: 170-8891; BioRad). La amplificacion de la reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real se realizo en un sistema en tiempo real CFX96™ de BioRad utilizando el iQ™ SYBR® Green Supermix (n° en catalogo: 170-8886; BioRAd) y conjuntos de cebadores optimizados para dianas probadas para PCR en tiempo real basada en SYBR® Green para la PCR en tiempo real. El analisis Taqman se llevo a cabo con el ensayo genetico espedfico con la Fast Advanced Master Mix de Taqman® (n° en catalogo: 4444557; Applied Biosystems). La expresion de pliegues normalizada del gen diana se calculo utilizando el metodo del umbral del ciclo (Ct) comparativo al normalizar Ct del ARNm diana para los de GAPDH que utilizan el CFX Manager Software version 1.5 y se verifico con el programa Lin-Reg.

Inmunotransferencias Western y microscopia de inmunofluorescencia. Se anestesiaron ratones Alms1foz/foz y ratones de la misma camada WT. Se recogieron los siguientes tejidos sensibles a la insulina: tugado, corazon, musculo y tejido adiposo y se colocaron directamente en amortiguador RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, SDS al 0,1%, Triton-X100 al 1%) enriquecido con mezcla Completa inhibidora de mini proteasa y mezcla PhosSTOP inhibidora de fosfatasa (Roche, Suiza). Las muestras se sometieron a ultrasonidos y se centrifugaron durante 30 minutos a 17.000 g, a 4°C durante 30 minutos. Concentracion de protemas analizada con analisis BCA (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Las protemas celulares de las celulas se obtuvieron por precipitacion con acido tricloroacetico y se realizaron analisis de inmunotransferencia utilizando 30-50 jg de protema completa. La union espedfica de anticuerpos se visualizo utilizando el Sustrato de Sensibilidad Maxima West Femto de SuperSignal® (n° en catalogo: Lf145954, Pierce) en un Versadoc™ Imaging System de BioRad o un generador de imagenes ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Reino Unido). Como controles de carga se utilizaron protemas no espedficas tenidas con Ponceau S para normalizar la senal obtenida despues de la inmunodeteccion espedfica de la protema de interes utilizando el programa Bio-Rad Quantity One. Para experimentos de inmunofluorescencia, las celulas se sembraron en permanox de 8 pocillos Lab-Tek II Chamber Slide (n° en catalogo: 177445; NUNC). Las celulas se trataron como se indica. Luego se procesaron tanto las celulas como las criosecciones de tejidos para la deteccion de protemas despues de la fijacion con metanol y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1%. Se montaron portaobjetos de microscopia para deteccion con medio de montaje Vectashield (n° en catalogo: H-1200; Vector Laboratories). Para ver las protemas asociadas a la membrana, las celulas se fijaron con formalina durante 15 minutos y se bloquearon directamente. seguido de inmunotincion y adquisicion utilizando un microscopio vertical Axiolmager Z2 de Zeiss. El analisis de diagnostico por la imagen, los experimentos de reconstitucion en 3D y de transcurso de tiempo y los experimentos de seguimiento de endosomas se realizaron utilizando el programa AxioVision de Zeiss con los modulos 3D y Tracking Zeiss correspondientes o la plataforma de diagnostico por la imagen Zeiss Zen 2012.

Medicion de fluorescencia. Los preadipocitos se cultivaron en una placa de 96 pocillos y 12 pocillos infectados con partmulas lentivmcas de shARN ALMS1 o partmulas lentivmcas de shARN CTRL y se diferenciaron al dfa siguiente en adipocitos maduros. Tres semanas despues, los trigliceridos intracelulares se tineron con tincion AdipoRed siguiendo el procedimiento del fabricante y se midio la fluorescencia en un monocromador Tecan Infinite 200 quad4 (Tecan, Lyon, Francia) a una longitud de onda de 520 nm. Los datos generados se analizaron a continuacion utilizando el programa informatico de analisis de datos Magellan de Tecan utilizando como blanco adipocitos sin tenir.

Experimentos de coinmunoprecipitacion. Para los experimentos de coinmunoprecipitacion, los inventores utilizaron el kit de Acoplamiento de Anticuerpos Dynabeads® (n° en catalogo: 143.11D, Invitrogen) en combinacion con el kit de co-inmunoprecipitacion Dynabeads® (n° en catalogo: 143.21D, Invitrogen). Los hMSC se cultivaron hasta confluencia y se desencadeno la diferenciacion adipogenica por cambio de medio. 7 dfas despues se inicio la diferenciacion adipogena por cambio de medio, los adipocitos, cultivados con nuestro sin Ins. 24 horas antes de la lisis, se lisaron en condiciones naturales y se usaron segun el kit. Despues de la inmunoprecipitacion y la liberacion de las perlas, las muestras se cargaron en un gel NuPage TrisAcetate al 3-8% (n° en catalogo: EA0375BOX, Invitrogen) con un patron de protemas HMW tenido previamente Hi Mark ™ (n° en catalogo: LC5699, Invitrogen).

Preparacion e identificacion de protemas por espectrometria de masas. En la digestion en gel: El procedimiento de digestion en gel se llevo a cabo segun lo descrito por Rabilloud et al. (ref.). La preparacion de las piezas de gel antes de la digestion con tripsina se realizo con un robot de manipulador de lfquidos (QuadZ215, Gilson International, Francia). Resumiendo, las bandas de gel se lavaron alternativamente con 100 j l de NH4HCO325 mM y a continuacion 100 j l de acetonitrilo (ACN) al 50% (3 min de lavado con agitacion y el lfquido se desecho antes de la adicion del siguiente disolvente). Este ciclo de hidratacion/deshidratacion se repitio dos veces y se secaron las piezas de gel durante 20 min antes de la reduccion (DTT 10 mM/amortiguador NH4HCO325 mM a 56°C durante 45 min) y alquilacion (yodoacetamida 25 mM /amortiguador NH4HCO3 25 mM durante 45 min, temperatura ambiente). Despues, los puntos de gel se lavaron de nuevo con 3 ciclos de NH4HCO3 25 mM/ACN alternativamente. Despues de la etapa de secado de 20 min, las piezas de gel se rehidrataron con tres volumenes de tripsina (Promega, V5111), 12,5 ng/pl en amortiguador NH4HCO325 mM (recien diluido) y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Los peptidos tnpticos se extrajeron del gel con agitacion vigorosa durante 30 minutos en un volumen adaptado de 35% de H2O/60% de ACN/5% de HCOOH y una etapa de exposicion a ultrasonidos de 15 minutos.

Espectrometria de masas MALDI-TOF (/ TOF) y busqueda en bases de datos. La medicion de masas MALDI se llevo a cabo en un espectrometro de masas de tiempo de vuelo con desorcion/ionizacion asistida por matriz Autoflex III Smartbeam (MALDI-TOF TOF) (Bruker-Daltonik GmbH, Bremen, Alemania) utilizado en el modo positivo de reflector. Se uso un objetivo de anclaje predefinido (sistema PAC de Bruker Daltonik, nota tecnica TN011) con matriz de HCCA para analizar los productos tnpticos de la digestion. Los datos resultantes de la huella digital de la masa de peptidos (PMF) y los datos de la huella del fragmento de peptido (PFF) se combinaron mediante el programa informatico Biotools 3.2 (Bruker Daltonik) y se transfirieron a una version de intranet del buscador MASCOT (Matrix Science, Londres, Reino Unido). Se tuvieron en cuenta las modificaciones variables (acetilacion de la protema en el terminal N, oxidacion de metionina y carbamidometilacion de cistema) y una escision tnptica perdida y el error en la masa del peptido se limito a 50 ppm. Las protemas se identificaron buscando datos en una base de datos de secuencias de protemas no redundantes del NCBI y luego se enviaron a la base de datos restringida a seres humanos. En todos los resultados, las puntuaciones de probabilidad fueron mayores que la puntuacion fijada como significativa con un valor de p de 0,05. Espectrometria de masas NanoLC-MSMs y busqueda en la base de datos: Para el analisis nanoLC-MS/MS, los peptidos se transfirieron en inserciones de vidrio, compatibles con el sistema automuestreador automatico LC (nanoLC-U3000, Dionex, EE. UU.). El sistema LC se acoplo a un espectrometro de masas ESI-Q-TOF (MicroTOFQ-II, Bruker, Alemania). El metodo consistio en una fase de 60 minutos a un caudal de 300 nl/min utilizando un gradiente de dos disolventes: A (99,9% de agua: 0,1% de acido formico) y B (99,92% de acetonitrilo: 0,08% de acido formico). El sistema incluye: un PepMap C18 de 300 pm x 5 mm utilizado para la concentracion previa de peptidos y una columna C18 de 75 pm x 150 mm utilizada para la elucion de peptidos. El analizador TOF se calibro cada dfa: los datos se consiguieron y procesaron automaticamente utilizando los programas informaticos Hystar 2.8 y DataAnalysis 2.6. Se realizaron busquedas consecutivas contra la base de datos NCBInr en primer lugar y luego contra la sub-base de datos humana para cada muestra utilizando versiones locales de Mascot 2.2 (MatrixScience, Reino Unido) y Proteinscape 2.0 (Bruker, Alemania). Se estimo la tasa de falsos positivos (TFP) para la identificacion de protemas utilizando una base de datos de senuelo inverso: la validacion de protemas se realizo utilizando un TFP inferior al 1%. Ademas, las protemas identificadas por solo 1 peptido se verificaron manualmente: los espectros de MS/MS se inspeccionaron segun las reglas de fragmentacion convencionales.

Prueba de ligadura de proximidad in situ (PLP). El equipo de PLP in situ Duolink con la sonda PLUS anti-raton y la sonda MINUS anti-conejo (numeros de catalogo: 90701 y 90602; OLINK Bioscience) se usaron en combinacion con los anticuerpos primarios apropiados segun el procedimiento del fabricante. Los preadipocitos primarios humanos y los adipocitos maduros se cultivaron en un portaobjetos con camara Lab-Tek II de 8 pocillos (Nunc) y se trataron como para microscopfa de inmunofluorescencia hasta la etapa primaria de incubacion de anticuerpos. Despues del lavado, las celulas se decoraron con sondas PLP PLUS y MINUS (dilucion 1:20) durante 2 horas a 37°C. La hibridacion y la ligadura de las sondas, la amplificacion y el lavado final con SSC se realizaron segun el procedimiento del fabricante. La transferencia de fluorescencia basada en la interaccion protema-protema se visualizo utilizando el equipo 613 de deteccion Duolink (OLINK Bioscience) y se obtuvieron imagenes.

Estad^stica. se realizaron analisis estadfsticos con el programa informatico GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., EE. UU.). Los resultados se muestran como medias ± desviacion tfpica. La significacion de los resultados se determino mediante pruebas de la t para datos emparejados o la prueba de U no parametrica de Mann-Whitney se utilizo para la comparacion estadfstica de los datos de IMC y ABC. Se considero que un valor de P <0,05 indica significacion estadfstica y se marco con un asterisco.

Usando preadipocitos humanos primarios como modelo in vitro, los inventores localizaron ALMS1 principalmente en un citoplasmico en lugar de la agrupacion centrosomica descrita previamente. ALMS1 fue asintomatico durante la adipogenia y aunque se observo una disminucion significativa en el factor antiadipogeno Pref-1, no se pudieron detectar diferencias importantes en los niveles de expresion de los factores de transcripcion pro-adipogenos como los cEBP y PPARy.

Tras la carencia de smtomas de ALMS1 en adipocitos maduros de 2 semanas, se evaluo la capacidad de absorcion de glucosa utilizando un analogo de glucosa marcado (2-NBDG). En ausencia de estimulacion con insulina, no se pudo detectar la absorcion de 2-NBDG en adipocitos maduros de referencia con ALMS1 (Fig. 2A). Por otra parte, la estimulacion con insulina produjo una mayor absorcion de 2-NBDG en los adipocitos maduros humanos de referencia (Fig. 2B, recuadro superior) pero no en celulas carentes de smtomas con ALMS1 (Fig. 2B, recuadro inferior). Ademas de la absorcion de glucosa reducida en adipocitos carentes de smtomas de ALMS1, los inventores observaron una reduccion en los trigliceridos (TG) intracelulares en estas celulas una semana despues (Fig. 2C-D). A destacar que esta reduccion en la absorcion de glucosa en adipocitos carentes en ALMS1 no estaba relacionada con una disminucion de la fosforilacion de AKT, la diana de senalizacion de la insulina aguas arriba, ya que las concentraciones de pS473-AKT despues de 30 minutos de incubacion con insulina eran similares tanto en adipocitos humanos de referencia como carentes de smtomas por ALMS1 (Fig. 2E-F), lo que es coherente con los niveles normales a aumentados de fosforilacion de AKT previamente observados en adipocitos murinos con AlmsIfoz/foz (Fig. 1G).

Los inventores investigaron a continuacion la dinamica de GLUT4 en adipocitos humanos en ausencia de ALMS1. La localizacion celular del receptor de insulina (RI) en la membrana plasmatica no se vio afectada una vez se detecto la carencia de smtomas por ALMS1 cerca de la membrana plasmatica (MP) en ausencia de insulina. (FIG. 2G, recuadro superior). Por el contrario, en los adipocitos carentes de ALMS1, en ausencia de insulina, GLUT4 perdio su localizacion perinuclear y se detecto dispersada en todo el citoplasma celular en lugar de asumir su localizacion perinuclear habitual. (Fig. 2g , recuadros medio e inferior y 2H). Tras la estimulacion con insulina, se observo que GLUT4 se movfa a la MP dentro de la malla de actina (Fig. 2I) tanto en los adipocitos de referencia como en los carentes de smtomas por ALMS1. Dos horas despues de la estimulacion con insulina en ausencia de insulina, todavfa se detecto GLUT4 dispersada en todo el citoplasma de los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1, mientras que los adipocitos de referencia teman su GLUT4 reubicado adecuadamente en la region perinuclear (Fig. 2J). Como existe un equilibrio entre la exocitosis y la endocitosis de las vesmulas de GLUT4 hacia y desde la MP, los inventores comprobaron que el deterioro de la clasificacion de GLUT4 en adipocitos carentes de smtomas por Almsl no se debfa a una endocitosis defectuosa de GLUT4. El examen de dinamina, una molecula clave en la endocitosis, no demostro diferencias en las concentraciones de protemas ni en la localizacion celular tras la carencia de smtomas por ALMS1 en los adipocitos. Ademas, las velocidades medias de los endosomas marcados fueron similares entre los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 y de referencia, argumentando que un defecto en la endocitosis es la causa de la presencia reducida de GLUT4 en la MP en respuesta a la senalizacion de la insulina.

Ejemplo 3

Se requiere ALMS1 para dirigir TBC1D4 a la MP en respuesta a la senalizacion de insulina

Para comprender el mecanismo molecular que subyace al efecto de la inactivacion de ALMS1 en la localizacion de GLUT4, los inventores identificaron companeros interactivos de ALMS1 en adipocitos humanos. La inmunoprecipitacion (IP) utilizando ALMS1 como cebo se realizo con adipocitos humanos maduros jovenes (4 dfas despues del desencadenante de diferenciacion) seguido de la identificacion de los companeros que interaction con ALMS1 por espectrometna de masas. Entre las protemas que se inmunoprecipitaron con ALMS1, estaba TBC1D4, una conocida GTPasa sustrato de AKT requerida para la retencion adecuada de GLUT4 en las vesmulas de clasificacion de GLUT4 (GSV) y para la translocacion de GLUT4 a la membrana celular para la absorcion intracelular de glucosa.

Ejemplo 4

Desarrollo de modelos de homologfa estructural de ALMS1, TBC1D4 y aPKC.

Como la estructura cristalina de Almsl aun no se ha resuelto, se utilizo un modelo de homologfa estructural por simulacion informatica para predecir la estructura en 3D de ALMS1 e identificar motivos estructurales que podnan unirse a ligandos de posible interactuacion (Fig. 3A-C).

Modelo estructural de ALMS1. El modelo de ALMS1 se construyo utilizando el metodo de modelado de fragmentos con el programa de modelado de homologfa, Modeller. La secuencia de aminoacidos para cada exon de ALMS1 se sometio a un algoritmo de subprocesamiento basado en el perfil disponible en el servidor PISRED y se identificaron las plantillas adecuadas. Luego, las protemas de la plantilla identificadas se alinearon con las respectivas secuencias de exones y cada exon se modelo por separado utilizando Modeller. La optimizacion de la energfa y la seleccion de los modelos se realizaron en base a una puntuacion de energfa de las protemas optimizada y discreta. Por ultimo, los modelos se ensamblaron para construir la estructura de ALMS1 completa y la protema completa se relajo y minimizo utilizando el programa de simulacion de dinamica molecular NAMD.

Modelo estructural del dominio de union PTP de TBCID4. El dominio de union PTP de TBC1D4 se encuentra dentro de los primeros 160 restos. No se identifico ninguna estructura homologa fiable para modelar la estructura entre el dominio de union PTP y el dominio de union Rab. La estructura cristalina del dominio PTP de Disabled-1 murino (Dab-1), 1NU2 (valor E = 5,2e-17), que se identifico mediante la busqueda de plantillas basada en HMM en el modelo Swiss, se uso como plantilla para construir el dominio de union PTP de TBC1D4.

El dominio PTP de TBCID4 que interactua con ALMS-1. El acoplamiento macromolecular se realizo utilizando el algoritmo ClusPro 2.0. Los restos ubicados en la superficie de interaccion con superposicion > 0,4 angstrom se consideraron como restos interactuantes. Interproscan puso de manifiesto que ALMS-1 contema un dominio similar a WD40 dentro de los primeros 3.871 restos. Las protemas que contienen el dominio WD40 son una familia de protemas que funcionan como estructuras para las interacciones macromoleculares.

El dominio de union a PTP de TBCID4 que interactua con ALMS1. Al principio, el dominio de union a PTP y el dominio de union a RabGTP de TBC1D4 se acoplaron al modelo ALMS1 utilizando el servidor Cluspro 2 para determinar el punto mas probable de interaccion. Luego, ambos dominios se acoplaron a sus respectivos puntos de interaccion en ALMS1 utilizando Autodock 4.2 y se calcularon sus afinidades de enlace. Basandose en las afinidades, el dominio de union a PTP de TBC1D4 se une a ALMS1 con una afinidad de aproximadamente 100 veces mayor en comparacion con el dominio de union a RabGTP. Por lo tanto, los inventores preven que el dominio de union a PTP puede tener una mayor probabilidad de interactuar con la molecula ALMS1 en comparacion con el dominio de union a RabGTP.

Modelando el dominio a PTP de TBCID4. El dominio de union a fosfo-tirosina de TBC1D4 se modelo despues de identificar una plantilla adecuada del algoritmo de identificacion de la plantilla del modelo Swiss.

Acoplar el dominio a PTP de TBCID4 y el dominio de union a RabGTP a ALMS1. Al principio, el dominio de union a PTP y el dominio de union a RabGTP de TBC1D4 se acoplaron a ALMS1 utilizando el servidor Cluspro 2 y se identifico el punto de interaccion. Luego, ambos dominios se acoplaron a sus respectivos puntos interactuantes utilizando Autodock 4.2 y se calcularon sus afinidades de union.

El modelo de homologfa puso de manifiesto que Almsl adopta una estructura de tipo corazon de manzana con un gran numero en puntos de union de posibles ligandos centrados alrededor del nucleo. La estructura cristalina de TBC1D4 tampoco se resolvio y, por lo tanto, los inventores utilizaron un metodo de modelado de homologfa para predecir la estructura del dominio de union a PTP de TBC1D4 (Fig. 3C-D). Posteriormente, se realizaron estudios de acoplamiento por simulacion informatica que predijeron una union de gran afinidad de TBC1D4 con ALMS1 mediante enlaces de hidrogeno de restos de TBC1D4, G75, A76, P77, A78, R80, E81, V82, I83 con restos interactivos H65, L66, S2879 en Almsl (FIG. 4A). La localizacion conjunta de ALMS1 y TBC1D4 se confirmo a continuacion en adipocitos humanos mediante estudios de inmunofluorescencia (Fig. 4B). Los niveles de expresion de GLUT4, TBC1D4, y RAP se probaron a continuacion en adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 con o sin estimulacion con insulina, pero no se encontraron diferencias significativas (Fig. 4C). Tras la fosforilacion por AKT activado, el TBC1D4 fosforilado (p-TBC1D4) en adipocitos se dirige a protemas Ra B como RAB14 y RABlo antes de que los GSV se dirijan a la MP. Sin embargo, tras la estimulacion con insulina de adipocitos carentes de smtomas por Almsl, no se pudo detectar ninguna diferencia en los niveles de TBC1D4, p-TBClD4, RAB14 y RAB10 (Fig. 4D). Los inventores luego se centraron en la localizacion celular de GLUT4. En ausencia de estimulacion con insulina, la carencia de smtomas de TBC1D4 reprodujo el efecto de carencia de smtomas por ALMS1 observado en adipocitos maduros, es decir, una mala localizacion de GLUT4 en todo el citoplasma (Fig. 4E). En respuesta a la estimulacion de la insulina, GLUT4 se libero de la region perinuclear en los adipocitos de referencia que se extienden por todo el citoplasma del adipocito (FIG. 4F), reproduciendo asf el patron de distribucion de GLUT4 que se observa en los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 y TBC1D4 en ausencia (FIG. 4E) y presencia (FIG.

4F), de insulina. Los inventores investigaron posteriormente el efecto de la carencia de smtomas por ALMS1 en la dinamica celular de TBC1D4 en respuesta a la insulina. En ausencia de insulina, el TBC1D4 se localizo en la region perinuclear tanto en la referencia como en los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 (Fig. 4G) pero, en particular, en respuesta a la insulina, el TBC1D4 solo se transporto a la MP en la referencia pero no en los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 (Figura 4H).

Ejemplo 5

ALMS1 forma un complejo dinamico de protemas, el ALMSome, necesario para el transporte de glucosa estimulada por insulina en adipocitos maduros humanos

Aunque los inventores demostraron que la carencia de smtomas por ALMS1 impidio que el TBC1D4 se dirigiera a la MP, quedaba por ver si esta alteracion explicaba por sf misma la mayor reduccion en la absorcion de glucosa observada en los adipocitos carentes de ALMS1. Por lo tanto, los inventores compararon la absorcion celular de 2-NBDG tras la estimulacion con insulina en ALMS1 o adipocitos carentes de smtomas por TBC1D4 o de referencia y no encontraron casi 2-NBDG absorbido en los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 en comparacion con los adipocitos de referencia (Fig. 5A-B), mientras que aunque reducido en comparacion con las referencias, una cantidad sustancial de 2-NBDG aun era absorbida por adipocitos carentes de smtomas con TBC1D4 (Fig. 5C). Ensayos posteriores de union de GLUT4-anticuerpo en ALMS1 o adipocitos carentes de smtomas por TBC1D4 o de referencia despues de 30 minutos de estimulacion con insulina mostraron una alta proporcion de GLUT4 en la MP en adipocitos de referencia y carentes de smtomas por TBC1D4 pero no en celulas carentes de smtomas por ALMS1 (FIG. 5D-F ), lo que indica que el defecto secundario en TBC1D4 dirigido a la MP en celulas carencia de smtomas por Almsl no explica, por sf mismo, el defecto muy grave en el transporte de glucosa y la expresion de GLUT4 MP en celulas carentes en ALMS1. Un examen posterior de los datos IP de Almsl puso de manifiesto varias subunidades de bombas de protones (H+) ATPasa tipo V (A, B, D1 y G2) que los inventores luego demostraron que seexpresa en adipocitos maduros (Fig. 5G) junto con aPKC, la cinasa activadora de las bombas de H bajo control de insulina. Los inventores confirmaron que ALMS1 estaba muy cerca de las bombas de H+. V-ATPasa en adipocitos maduros en presencia de insulina, tanto por un metodo PLP Duolink in situ que apunta a ALMS1 como a las subunidades A1 y D1 de las bombas de protones (Fig. 5H) y tambien por inmunotincion conjunta de ALMS1, VATPasa A1 y D1 y aPKC (Fig. 5H, I). ALMS1 co-localizado con la subunidad V0D1 de la bomba de protones (FIG.

5I) que esta integrada en la membrana de GSV, lo que indica que ALMS1 se transporta en el adipocito junto con las bombas de protones localizadas dentro de los GSV. Usando su modelo estructural basado en simulacion por ordenador de companeros que interactuan con ALMS1, los inventores identificaron un motivo de union para PKC en Almsl. Los puntos de union para TBC1D4 y aPKC en Almsl estaban tan cerca que el modelo demostro que el acoplamiento simultaneo de ambas protemas a Almsl no era posible debido al impedimento esterico (Fig. 5J). Los inventores asf plantearon la hipotesis. Para probar su hipotesis de que la union de ALMS1 a aPKC o alternativamente TBC1D4 estaba bajo el control redproco de la senalizacion de insulina en los adipocitos, los inventores realizaron nuevamente IPs utilizando ALMS1 como cebo, pero esta vez utilizando adipocitos maduros humanos cultivados en presencia o ausencia de insulina estando los IP inmunotransferidos tanto para aPKC como TBC1D4. Los resultados pusieron de manifiesto que aPKC solo podfa ser destruido por Almsl y detectado por inmunotransferencia en extractos de adipocitos incubados en ausencia de insulina (Fig. 5K), mientras que TBC1D4 solo fue destruido por ALMS1 y detectado en extractos de adipocitos incubados en presencia de insulina, lo que es coherente con el modelo de inventores de la union redproca de Almsl regulada por insulina (FIG. 5L).

Ejemplo 6

El ALMSome se necesita para la acidificacion de GSV antes de la entrega de GLUT4 a la membrana plasmatica

Si bien se sabe que la fosforilacion por AKT de TBC1D4 conduce de alguna manera al trafico de GLUT4, la etapa final de la fusion GSV-MP es un evento independiente de AKT regulado por la insulina que requiere la inflamacion osmotica de los GSV bajo la accion de la bomba de H+vATPasa. Sin embargo, faltaba el conocimiento de la senal real y el mecanismo para la activacion de la bomba de H+ por insulina. Los inventores probaron si la inactivacion de ALMS1 podna evitar la acidificacion de los GSV y, por lo tanto, la liberacion mediada por quimio-osmoticos de GLUT4 a la MP utilizando el colorante acidotrofico, naranja de acridina, que emite una fluorescencia verde a baja concentracion y una fluorescencia roja anaranjada a altas concentraciones en los lisosomas en los que el naranja de acridina esta protonado y secuestrado. En ausencia de insulina, no se detecto fluorescencia roja anaranjada en los adipocitos. Por el contrario, la insulina produjo una rapida aparicion de color rojo en los adipocitos maduros humanos de referencia (Fig. 6A) pero no en los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 (Fig. 6B), lo que indica una perdida de la acidificacion mediada por insulina de los lisosomas en los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1.

Los inventores probaron a continuacion si se acidificando los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 usando Nigericina (NIG.), un ionoforo electroneutro de intercambio K+/H que se sabe causa inflamacion osmotica de los GSV evitana el defecto asociado a Almsl en la fusion de GLUT4 y la absorcion de glucosa. El tratamiento con NIG.dio lugar a una rapida acidificacion tanto de los adipocitos de referencia como de los carentes de smtomas por ALMS1 (Fig. 6C-D), activando asf la inflamacion y la fusion de las vesmulas intracelulares. En paralelo, el analisis por microscopfa electronica mostro vesmulas que estaban situadas junto a la MP sin fusion en ausencia de insulina tanto en los adipocitos de referencia como en los carentes de smtomas por ALMS1 (FIG. 6E-F, recuadros superiores). El tratamiento con insulina produjo una hinchazon de las vesmulas (Fig. 6E, recuadros intermedios) asociada a la fusion de las vesmulas con la Mp para la absorcion de glucosa solo en los adipocitos de referencia (FIG. 6E, recuadros intermedios) pero no en los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 (FIG. 6F, recuadros centrales). Sin embargo, NIG. Produjo hinchamiento vesicular y fusion con la MP tanto en la referencia como en los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 (Fig. 6E-F, recuadros inferiores). El tratamiento con NIG restauro la absorcion de glucosa en adipocitos carentes de smtomas por ALMS1. Mientras que la insulina tuvo poco efecto en provocar la absorcion de 2-NBDG en adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 (Fig. 6G-H, recuadros superior y medio), NIG no solo restauro la fusion de vesmulas, sino que tambien pudo demostrarse que restaura la absorcion de 2-NBDG en los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 a niveles observados en celulas de referencia (Fig. 6G-H, recuadros inferiores). Este transporte restaurado de glucosa en adipocitos carentes de smtomas con ALMS1 tratados con NIG se correlaciono con la fusion restaurada de GLUT4 con la MP (FIG. 7A) pero no con TBC1D4 dirigido a la MP (Fig. 7B); y condujo a la restauracion del llenado por TG de los adipocitos carentes de smtomas por ALMS1 24 horas despues del tratamiento con NIG.

Ejemplo 7

Identificacion de inhibidores de peptidos de la union de PKC a Almsl

Una vez que se conoce el punto de interaccion de la union entre dos protemas, como se conoce en la tecnica, es posible usar el conocimiento de la configuracion y los aminoacidos de cada protema involucrada en la mediacion de la interaccion, usar modelos informaticos para disenar peptidos o farmacos de moleculas pequenas que, por la union en la region del punto de interaccion son capaces de impedir estericamente o de otro modo la interaccion de union. Los inventores, por lo tanto, buscaron identificar los peptidos que inhibinan la interaccion de ALMS1 y aPKC o TBC1D4 utilizando sus modelos estructurales ALMS1, TBC1D4 y aPKC descritos en el ejemplo 4. Los peptidos predichos que usan este metodo para bloquear la interaccion entre aPKC y ALMS1 incluyeron las secuencias LDSDSHYGPQHLESIDD (SEC ID. n° 5), DSHQTEETL (SEC ID. n° 6), QQTLPESHLP (SEC ID. n° 7), QALLDSHLPE (SEC ID. n° 8). PADQMTDTP (SEC ID. n° 9), HIPEEAQKVSAV (SEC ID. n° 10) o SCIFLEQ (SEC ID. n° 11). Un peptido identificado mediante este metodo para bloquear la interaccion entre TBC1D4 y ALMS1 fue la secuencia GCGAPAAREVILVL (SEC ID. n° 12).

Ejemplo 8

La expresion del dominio interactivo aPKC que interactua con ALMS1 en adipocitos maduros desencadena la absorcion de glucosa en ausencia de insulina

A continuacion, los inventores verificaron la hipotesis de que la insulina media la liberacion de aPKC del complejo ALMSome para provocar la absorcion de glucosa. Para ello, clonaron el dominio de interaccion de aPKC (SEC ID. n° 14 y n° 15) en un vector lentivmco junto con una etiqueta Flag. La secuencia seleccionada fue la secuencia minima de aPKC (min-aPKC-FLAG) lo que evita el impedimento esterico con el punto de interaccion TBC1D4 en ALMS1. El min-aPKC-FLAG expresado en los adipocitos compite con el aPKC endogeno para evitar que se una a Almsome y, por lo tanto, favorece la union de TBC1D4 mediada por insulina a Almsome. Los adipocitos maduros se infectaron luego con partmulas lentivmcas de referencia o min-aPKC para evaluar el impacto de min-aPKC-FLAG en la absorcion de glucosa. 48 horas despues de la infeccion, se realizo una inmunodeteccion de min-aPKC-FLAG utilizando un anticuerpo contra la etiqueta FLAG (Fig. 9). Para la prueba de concepto in vitro, los inventores trataron adipocitos maduros como se describe (Fig. 9) y a continuacion incubaron los adipocitos maduros tratados con 2-NBDG para evaluar el efecto de min-aPKC-FLAG sobre la absorcion de glucosa. De interes, el 2-NBDG se absorbio en los adipocitos tratados con min-aPKC-FLAG en ausencia de INS (Fig. 8A, columna izquierda) que correspondfa a un aumento de 3,5 veces en comparacion con la referencia (Fig. 8B). Por otra parte, no se observaron diferencias significativas en presencia de INS (Fig. 8A, columna derecha y 8B). Estos datos demuestran que dirigir la interaccion de ALMS1 y aPKC es suficiente para desencadenar la absorcion de glucosa en los adipocitos independientemente de la presencia de INS.

Produccion de vector lentivmco que lleva el dominio aPKC

El dominio que interactua con ALMS1 de PKCa humano se amplifico a partir del ADNc de celulas HEK293 humanas con etiqueta FLAG en el terminal N usando cebadores directo 5'-gtacGAATTCGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGCTCACGGACTTCAATTTCCTC-3' (SEC. ID. n° 16) e inverso 5'-tagcGGATCCTCATACTGCACTCTGTAAGATGGG-3' (SEC. ID. n° 17) y se clono en el vector lentivmco pCDH-EF1-MCS-IRES-puro (System Biosciences). Para la produccion de virus, los vectores lentivmcos PKCa se transfectaron en celulas 293TN (System Biosciences) junto con los plasmidos de encapsulacion psPAX2 y pMD2.G (Addgene) con una relacion en peso de 3:2:1, respectivamente, utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, el sobrenadante del cultivo se recogio por centrifugacion a 500 xg durante 10 min, seguido de filtracion a traves de un filtro de jeringuilla de 0,45 pm con membrana de PES (Sartorius). La solucion de virus se concentro a continuacion agregando A volumen de PEG6000 al 30% fno (p/vol) disuelto en NaCl 0,5 M y se incubo durante la noche a 4°C con mezclado ocasional. La mezcla se centrifugo a continuacion a 3.000 xg durante 15 minutos a 4°C. Luego, el sedimento que contema partmulas lentivmcas se volvio a poner en suspension en 1 ml de medio DMEM y se almaceno a -80°C antes de la infeccion de las celulas diana.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una molecula que evita la union de aPKC (Protema Cinasa C tipo alfa) a ALMS1 (protema 1 del smdrome de Alstrom) para su uso en el tratamiento o retraso de la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatia diabetica, nefropatia diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia.

2. La molecula para su uso segun la reivindicacion 1, en donde la molecula es para su uso en el tratamiento o retardo de la evolucion o aparicion de la diabetes mellitus tipo 2.

3. La molecula para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en donde la molecula no interfiere con la union de TBC1D4 a ALMS1.

4. La molecula para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molecula se selecciona del grupo que consiste en peptidos o polipeptidos o peptidomimeticos, anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos, aptameros, Spiegelmers y compuestos qmmicos.

5. La molecula para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la molecula es un peptido de menos de 50 aminoacidos, preferiblemente de menos de 20 aminoacidos.

6. La molecula para su uso segun la reivindicacion 5, en donde la molecula es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de ALMS1 (SEC. ID. n° 1).

7. La molecula para su uso segun la reivindicacion 6, en donde la molecula es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de ALMS1 que incluye uno o varios de los restos que se preve que median en la interaccion con aPKC, en particular uno o varios de los restos seleccionados en la lista que consiste en E17, D58, S59, G62, H65, L66, Q736, T737, E738, D828, S829, T1088, D1089, A1169, Q1170, F2882, L2883 y E2884.

8. La molecula para su uso segun la reivindicacion 6 o 7, en donde la molecula es un peptido que comprende o consiste en una de las siguientes secuencias:

- LDSDSHYGPQHLESIDD (SEC ID. n° 5);

- DSHQTEETL (SEC ID. n° 6);

- QQTLPESHLP (SEC ID. n° 7);

- QALLDSHLPE (SEC ID. n° 8);

- PADQMTDTP (SEC ID. n° 9);

- HIPEEAQKVSAV (SEC ID. n° 10);

- SCIFLEQ (SEC ID. n° 11), y

- un fragmento de la misma que comprende 6 aminoacidos contiguos.

9. La molecula para su uso segun la reivindicacion 5, en donde la molecula es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de aPKC (SEC ID. n° 4).

10. La molecula para su uso segun la reivindicacion 9, en donde la molecula es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un fragmento de aPKC que incluye uno o varios de los restos que se preve que median en la interaccion con ALMS1, en concreto uno o varios de los restos seleccionados en la lista que consiste en F114, D116, C118, L121, N138, Q142, I145, P148, G433, E545, S562, S566, F597, D601, W602, K604, E606, G620, T631, V664 e I667.

11. Un metodo in vitro o ex vivo para identificar moleculas adecuadas para su uso en el tratamiento o retardo de la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia, en donde se ensaya la capacidad de la molecula para evitar la union de aPKC a ALMS1 y se seleccionan las moleculas capaces de evitar esta union.

12. El metodo de la reivindicacion 11, en donde el metodo comprende ademas una etapa en la que se prueba la capacidad de la molecula seleccionada para interferir con la union de TBC1D4 a ALMS1 y en donde se seleccionan las moleculas que no interfieren.

13. El metodo de la reivindicacion 11 o 12, en donde la union se determina en un sistema celular sensible a la insulina.

14. El metodo de la reivindicacion 11 a 13, en donde la union se determina en presencia y/o ausencia de insulina.

15. Una molecula como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y 10 para su uso como farmaco.

16. Una molecula que aumenta la expresion de ALMS1 o que mejora la union de TBC1D4 a ALMS1 para su uso en el tratamiento o retardo de la evolucion o aparicion de diabetes mellitus, resistencia a la insulina, retinopatfa diabetica, neuropatfa diabetica, nefropatfa diabetica, hiperglucemia, obesidad e hiperinsulinemia.