ES2714216T3 - Composiciones y métodos para caracterizar afecciones artríticas - Google Patents

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Abstract

Un método para evaluar una afección artrítica en un sujeto mamífero, que comprende: a) proporcionar una muestra de un sujeto mamífero del que se sospecha tiene una afección artrítica; b) detectar en dicha muestra la presencia de un autoanticuerpo contra por lo menos una proteína eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epítopo eta 14-3-3; en el que la presencia de dicho autoanticuerpo es indicativa de una afección artrítica que implica dicho autoanticuerpo en el sujeto en el que la etapa de detección comprende poner en contacto la muestra biológica con por lo menos una proteína eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epítopo eta 14-3-3, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre, fluido sinovial, plasma, suero o tejido.

Description

DESCRIPCION
Composiciones y metodos para caracterizar afecciones artnticas
Campo
Se describen en este documento metodos para evaluar una afeccion artntica en un sujeto, y kits que comprenden autoanticuerpos para la protema eta 14-3-3 para evaluar afecciones artnticas.
Antecedentes
La artritis, o artralgia, generalmente se refiere a trastornos inflamatorios de las articulaciones del cuerpo, y usualmente se acompana de dolor, hinchazon y rigidez. La artritis se puede deber a cualquiera de las diversas causas, que incluyen infecciones, traumas, trastornos degenerativos, trastornos o alteraciones metabolicos u otras etiologfas desconocidas. La osteoartritis (OA) es una forma comun de artritis no inflamatoria que puede ocurrir despues de un traumatismo en una articulacion, despues de una infeccion de una articulacion o simplemente como resultado del envejecimiento. La osteoartritis tambien se conoce como enfermedad articular degenerativa. La artritis reumatoide (RA) se considera tradicionalmente un trastorno autoinmunitario inflamatorio cronico que hace que el sistema inmunitario ataque las articulaciones. Es una afeccion inflamatoria incapacitante y dolorosa que puede llevar a una perdida sustancial de movilidad debido al dolor y la destruccion de las articulaciones. La espondilitis anquilosante (AS) es una artritis inflamatoria, degenerativa, cronica y dolorosa que afecta principalmente a la columna vertebral y las articulaciones sacroilfacas, que provoca la fusion final de la columna vertebral.
Las articulaciones del cuerpo se denominan articulaciones sinoviales, y cada articulacion sinovial generalmente comprende los extremos opuestos de dos huesos adyacentes. Los extremos de los huesos estan encerrados en tejido de carrtlago, mientras que toda el area de la articulacion esta encerrada en un tejido blando protector llamado sinovio que comprende una membrana sinovial. La membrana sinovial produce y libera un lfquido sinovial lubricante en cavidades dentro de la articulacion. En las articulaciones normales, el volumen de lfquido sinovial es bastante pequeno. Ademas de su funcion lubricante, el lfquido sinovial tambien actua como un reservorio para los solutos y unas pocas celulas mononucleares y sinoviales en reposo.
El sinovio se puede irritar y engrosar en respuesta a muchas lesionas que se considera promueven la artritis, que incluyen el traumatismo de la articulacion y/o el mal funcionamiento del sistema inmunologico del cuerpo. Las consecuencias de dichas lesiones incluyen la produccion excesiva y la liberacion de lfquido sinovial en la articulacion, provocando de esta manera hinchazon dentro y alrededor del area de la articulacion. El aumento de los volumenes normalmente se acompana de un aumento de las concentraciones en el lfquido sinovial de las celulas sinoviodticas similares a los fibroblastos (celulas FLS), las citoquinas proinflamatorias tales como la interleuquina 1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral (TNF-alfa), las protemas de histamina y peptidos, y enzimas degradativas tales como metaloproteasas de matriz (MMP). Las celulas FLS comprenden aproximadamente dos tercios de las celulas sinoviales en el lfquido sinovial normal, tienen sistemas secretores bien definidos y bajo condiciones de trauma o inflamacion comunmente segregan grandes cantidades de MMP en el lfquido sinovial, espedficamente MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 y 13. Se considera que MMP-1 y MMP-3 tienen funciones significativas en el dano estructural progresivo del cartflago y los tejidos oseos subyacentes que comprenden las articulaciones. Los factores conocidos que activan las celulas fLs para producir MMP-1 y MMP-3 incluyen IL-1 y TNF-alfa.
Los agentes causales para RA, AS y OA actualmente no estan bien definidos. Sin embargo, se conocen los eventos fisiologicos asociados con la progresion de la enfermedad, desde penodos prolongados de hinchazon e inflamacion causados por una acumulacion excesiva de lfquido sinovial en las articulaciones, a traves de la degradacion y deterioro del cartflago y de los tejidos oseos subyacentes por las actividades enzimaticas degradativas, y las celulas FLS que lo acompanan en huesos que resulta en dano estructural permanente. Si se detecta lo suficientemente temprano, los posibles efectos perjudiciales a largo plazo de la enfermedad pueden revertirse, o al menos minimizarse, con terapias ffsicas y medicas apropiadas. De acuerdo con lo anterior, se han realizado considerables esfuerzos en la identificacion de biomarcadores adecuados para la identificacion temprana de la artritis. Con este fin, Kilani et al. (2007, J. Rheum. 34: 1650-1657; WO 2007/128132) han informado que dos miembros de la familia de protemas 14-3-3, particularmente eta 14-3-3 y gamma 14-3-3, estan presentes dentro del lfquido sinovial y el suero de pacientes con artritis, y estas isoformas estan directamente relacionadas con los niveles de MMP-1 y Mm P-3 en el lfquido sinovial y el suero.
Resumen
La presente invencion se refiere al hallazgo de que la presencia de autoanticuerpos se dirige contra la protema(s) eta 14-3-3 en las muestras biologicas se correlaciona con diagnostico y/o pronostico de una afeccion artntica. La correlacion fuerte entre dichos autoanticuerpos y una afeccion artntica permite el diagnostico y/o pronostico de la afeccion artntica al ensayar para autoanticuerpos contra, o hacer complejos inmunitarios con por lo menos una protema 14-3-3 o un fragmento de la misma en una muestra biologica de un sujeto.
La invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con lo anterior, se describe en este documento un metodo para evaluar una afeccion artntica en un sujeto mairftfero, que comprende: a) proporcionar una muestra de un sujeto mairftfero del que se sospecha tiene una afeccion artntica; b) detectar en dicha muestra la presencia de un autoanticuerpo contra por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3; en el que la presencia de dicho autoanticuerpo es indicativa de una afeccion artntica que implica dicho autoanticuerpo en el sujeto
en el que la etapa de deteccion comprende poner en contacto la muestra biologica con por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3,
en el que la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste de sangre, fluido sinovial, plasma, suero o tejido. Tambien se proporciona un metodo para evaluar una afeccion artntica en un sujeto mairftfero, que comprende: a) proporcionar una muestra de un sujeto mairftfero del que se sospecha tiene una afeccion artntica; b) detectar en dicha muestra la presencia de un complejo inmunitario que comprende i) un autoanticuerpo contra por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 y ii) por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3; en el que la presencia de dicho complejo inmunitario es indicativo de una afeccion artntica que implica dicho autoanticuerpo en el sujeto
en el que la etapa de deteccion comprende poner en contacto la muestra biologica con una molecula de union unida a un soporte solido para la deteccion de dicho complejo inmunitario
en el que la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste de sangre, fluido sinovial, plasma, suero o tejido. La protema 14-3-3 o fragmento de la misma comprende un epftopo eta 14-3-3. En una realizacion, la protema 14-3-3 o fragmento de la misma comprende un epftopo eta 14-3-3 compartido por al menos otra isoforma 14-3-3, por ejemplo, gamma 14-3-3. En otra realizacion, el epftopo eta 14-3-3 es unico para eta 14-3-3.
En una realizacion, la etapa de deteccion comprende medir la cantidad de dicho complejo de autoanticuerpo o inmunitario y compararlo contra la cantidad de complejo de autoanticuerpo o inmunitario en una muestra de control, una muestra de control artntica, o en una muestra previa del mismo sujeto.
De acuerdo con lo anterior, los metodos actualmente reivindicados para evaluar una afeccion artntica en un sujeto pueden proporcionar determinaciones de pronostico, asf como tambien de diagnostico.
La muestra de control puede ser un control normal, y la comparacion es indicativa de un diagnostico de artritis. En una realizacion, un nivel en aumento de autoanticuerpo contra, o complejos inmunitarios con, la protema eta 14-3-3 o un fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en dicha muestra biologica en comparacion con una muestra de control normal (por ejemplo, de otro sujeto que no tiene una afeccion artntica) es un indicador diagnostico de una afeccion artntica en dicho sujeto.
De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, la presencia de autoanticuerpos para la protema eta 14-3-3 o complejos inmunitarios de la misma en la muestra biologica del sujeto y/o la presencia de un nivel en aumento de dichos autoanticuerpos o complejos inmunitarios en la muestra biologica del sujeto con relacion a un nivel de dichos autoanticuerpos o complejos inmunitarios en una muestra de control normal (es decir no artntica) proporciona un diagnostico de que el sujeto tiene una afeccion artntica.
La muestra de control puede ser una muestra biologica previa del sujeto mairftfero, y la comparacion es indicativa de la progresion de la enfermedad y/o eficacia de un regimen terapeutico. En una realizacion, un nivel reducido de autoanticuerpos para la protema eta 14-3-3 o complejos inmunitarios en circulacion de la misma en dicha muestra en comparacion con la muestra previa (por ejemplo, una muestra biologica de referencia de dicho sujeto) es indicativo de la eficacia de un regimen terapeutico en curso.
De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, el nivel relativo de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, la protema eta 14-3-3 o un fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta detectado en la muestra biologica del sujeto en comparacion con el nivel de dichos autoanticuerpos o complejos presentes en una muestra biologica de referencia del mismo sujeto proporcionan un pronostico de la afeccion artntica, o son indicativos de la eficacia de un regimen terapeutico.
La muestra de control puede ser un control artrftico, y la comparacion es indicativa de pronostico de enfermedad. En una realizacion, el nivel relativo de autoanticuerpos para la protema eta 14-3-3 o complejos inmunitarios de la misma en comparacion con una muestra de control artntica (por ejemplo, de otro sujeto con una afeccion artntica bien definida) es un indicador pronostico de artritis.
De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, los sujetos con diferente estado artrftico tienen diferencias detectables en los niveles de autoanticuerpos para por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta, y/o complejos inmunitarios en circulacion de dichas, y estas diferencias son de relevancia pronostica. En un ejemplo, se divulgan en este documento metodos que se pueden utilizar para determinar una etapa de enfermedad espedfica o el fenotipo histopatologico de una afeccion artntica con base en el nivel relativo de autoanticuerpo detectado en un sujeto en comparacion con los niveles previamente determinados para existir a lo largo del curso de la afeccion artntica, por ejemplo, antes de tratamiento, durante tratamiento, despues de tratamiento, en otro paciente, etc. En otro ejemplo, los metodos divulgados en este documento se pueden utilizar para clasificar una muestra biologica que es de un sujeto en alto riesgo de manifestacion de una afeccion artntica con base en el nivel relativo de autoanticuerpos detectados en la muestra biologica en comparacion con una muestra de control, que puede ser, por ejemplo, almacenada en una base de datos.
Los metodos divulgados en este documento se pueden utilizar para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto en un regimen terapeutico con base en el nivel relativo de autoanticuerpos detectados en una muestra biologica del sujeto en comparacion con una muestra de control, por ejemplo, de una segunda muestra biologica de un segundo sujeto que fue tratado con exito con el regimen terapeutico.
De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, se conoce el nivel relativo de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en la muestra biologica del primer sujeto esta en comparacion con el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, 14-3-3 en las muestras biologicas de sujetos cuyas capacidades responden a un tratamiento, en el que dicha comparacion determina la respuesta potencial del primer sujeto al tratamiento. La determinacion de la sensibilidad del sujeto a un regimen terapeutico luego se puede utilizar para reportar los metodos para tratar un sujeto con una afeccion artntica. Por ejemplo, se describen en este documento metodos para tratar un sujeto con una afeccion artntica que comprende medir el nivel de autoanticuerpo contra eta 14-3-3 en una muestra biologica del sujeto (por ejemplo, al medir el nivel de la formacion del complejo inmunitario de autoanticuerpo/eta 14-3-3), correlacionar el nivel de autoanticuerpo contra o complejo inmunitario con eta 14-3-3 con la sensibilidad del sujeto a un regimen terapeutico, y proporcionar el regimen terapeutico al sujeto. En un aspecto, la invencion proporciona metodos para monitorizar el tratamiento de una afeccion artntica, que comprender determinar el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en muestras de pacientes y monitorizar el nivel de complejos de autoanticuerpos/inmunitarios que involucran eta 14-3-3 en un paciente que experimenta el tratamiento.
La presente invencion puede ser util en determinar y/o diferenciar los subtipos de artritis en un paciente. En este aspecto, el nivel relativo de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema eta 14­ 3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en la muestra biologica del primer sujeto se compara con el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, 14-3-3 en las muestras biologicas de uno o mas sujetos cuyo subtipo de artritis se conoce y/o se establece previamente, en el que dicha comparacion determina el subtipo de artritis para el primer sujeto.
La determinacion de que los niveles de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en la muestra biologica del primer sujeto son similares a los niveles de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en la muestra biologica a partir de la muestra biologica de otro sujeto cuyo subtipo de artritis que se conoce y/o se establece previamente puede indicar que el primer sujeto tiene el mismo subtipo de artritis como el otro sujeto. Por ejemplo, niveles similares de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en la muestra biologica del primer sujeto y en la muestra biologica de otro sujeto conocido por tener artritis inflamatoria, por ejemplo, artritis reumatoide, puede determinar que el primer sujeto tambien tiene artritis inflamatoria, por ejemplo, artritis reumatoide.
Adicionalmente, la determinacion de que los niveles de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en la muestra biologica del primer sujeto son diferentes a los niveles de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en la muestra biologica a partir de de la muestra biologica de otro sujeto cuyo subtipo de artritis que se conoce y/o se establece previamente puede indicar que el primer sujeto tiene un subtipo de artritis diferente que aquel del otro sujeto. Por ejemplo, niveles distintos de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en la muestra biologica del primer sujeto y en la muestra biologica de otro sujeto del que se sabe tiene artritis no inflamatoria, por ejemplo, osteoartritis, puede determinar que el primer sujeto tiene una artritis inflamatoria, por ejemplo, artritis reumatoide.
En una realizacion, la etapa de deteccion comprende una tecnica de base inmunologica, por ejemplo, inmunoprecipitacion, ELISA, analisis de transferencia Western, inmunohistoqmmica, inmunofluorescencia, inmunoensayos “intercalado”, ensayos inmunorradiometricos, reacciones de precipitacion por difusion de gel, ensayos de inmunodifusion, inmunoensayos in situ, reacciones de precipitacion , ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion de complemento, ensayos de protema A, ensayos de inmunoelectroforesis, analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), radioinmunoensayo y similares.
La deteccion y/o medicion de autoanticuerpos contra una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta de acuerdo con los metodos descritos en este documento de esta manera se pueden realizar al observar la formacion de un complejo inmunitario entre el autoanticuerpo y protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta en una muestra, o alternativamente determinar la presencia de un complejo de autoanticuerpo/eta 14-3-3 existente en una muestra. En una realizacion, la formacion se puede detectar por medio de protemas 14-3-3 marcadas detectablemente o fragmentos de las mismas. En otra realizacion, se puede detectar el complejo al formar un segundo complejo inmunitario entre el complejo de autoanticuerpo/eta 14-3-3 y un anticuerpo secundario marcado detectablemente que une la inmunoglobulina, por ejemplo, la estructura principal de inmunoglobulina del autoanticuerpo.
En una realizacion, los metodos implican detectar autoanticuerpos contra 14-3-3 o complejos inmunitarios en circulacion de los mismos en la sangre, fluido sinovial, plasma, suero, o tejido (por ejemplo, articulacion sinovial, tejido de articulacion danado, etc.) de un paciente. En una realizacion, se realiza deteccion mediante inmunoprecipitacion de autoanticuerpos contra eta 14-3-3 de sangre, fluido sinovial, plasma, suero o tejido utilizando la protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta. En una realizacion, la deteccion implica el uso de ELISA. En una realizacion, la deteccion implica analisis de transferencia Western de una muestra que comprende fluido sinovial, plasma, o suero de un paciente. En una realizacion, la deteccion implica el uso de radioinmunoensayo. En una realizacion, la deteccion implica el uso de una prueba de tira. En una realizacion, la deteccion implica el uso de un punto de prueba de cuidado. En una realizacion, la deteccion de autoanticuerpos contra eta 14-3-3 o complejos en circulacion de los mismos se combina con la deteccion de otro marcador de artritis (por ejemplo, MMP, anti-cCp, anti-RF y/o CRP).
Tambien se describe en este documento el uso de un kit para detectar la presencia en una muestra de un autoanticuerpo para por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3, para evaluar una afeccion artrftica en un sujeto mairftfero, en el que el kit comprende por lo menos dicha protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 y un reactivo secundario, en el que el reactivo secundario se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo secundario marcado, un reactivo cromogenico o fluourogenico, y un agente de polimerizacion. El reactivo secundario puede ser un anticuerpo secundario marcado para la deteccion de un autoanticuerpo para dicha protema 14-3-3. El anticuerpo secundario marcado puede ser un anticuerpo antihumano.
El metodo de la invencion puede comprender adicionalmente la deteccion de por lo menos un marcador de artritis adicional en dicha muestra biologica, en el que dicho por lo menos un marcador de artritis adicional se selecciona del grupo que consiste de protema eta 14-3-3, matriz de metaloproteinasa-1 (MMP-1), MMP-3, peptido citrulinado antidclico (CCP), factor reumatoide (RF), protema reactiva c (CRP), amiloide A en suero (SAA), interleuquina 6 (IL-6), protema de union a calcio S100, osteopontina, acido hialuronico, agrupacion soluble de diferenciacion 14 (sCD14), telopeptido de entrecruzamiento de terminal c de tipo I (CTX-I) y colageno tipo II (CTX-II).
La protema 14-3-3 o fragmento de la misma comprende un epftopo eta 14-3-3. En una realizacion, la protema 14-3-3 o fragmento de la misma comprende un epftopo eta 14-3-3 compartido por a menos otra isoforma 14-3-3, por ejemplo, gamma 14-3-3. En otra realizacion, el epftopo eta 14-3-3 es unico para eta 14-3-3.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra una transferencia western de eta 14-3-3 recombinante utilizando dilucion serial de suero de un paciente diagnosticado con artritis reumatoide (Muestra 3323).
La Figura 2 muestra una transferencia western de eta 14-3-3 recombinante utilizando dilucion serial de suero de un paciente diagnosticado con artritis reumatoide (Muestra 3365).
La Figura 3 muestra una transferencia western de eta 14-3-3 recombinante utilizando dilucion serial de suero de un paciente no diagnosticado con artritis reumatoide (Muestra 40).
La Figura 4 muestra una transferencia western de eta 14-3-3 recombinante utilizando dilucion serial de suero de un paciente no diagnosticado con artritis reumatoide (Muestra 39).
Descripcion detallada
“Sujeto” y “paciente” se utilizan de manera intercambiable y se refieren a, excepto cuando se indique, mairftferos tales como humanos y primates no humanos, asf como conejos, ratas, ratones, cabras, cerdos y otras especies de mairftferos.
La “afeccion artrftica”, “artritis” y “artralgia” se utilizan de manera intercambiable, y generalmente se refieren a, excepto cuando se indica, un trastorno inflamatorio de las articulaciones del cuerpo. El dolor, hinchazon, rigidez y dificultad para moverse se asocian frecuentemente con afecciones artrfticas. La artritis se compone de mas de 100 condiciones diferentes. Pueden ser desde formas relativamente leves hasta formas sistemicas paralizantes, vease, por ejemplo, www.arthritis.ca/types%20of%20arthritis/default.asp?s=1. Una afeccion artrftica se puede deber a cualquiera de varias causas, que incluyen infecciones, traumatismos, trastornos degenerativos, trastornos o alteraciones metabolicas u otras etiologfas desconocidas. Una afeccion artrftica se puede describir mas espedficamente de acuerdo con el subtipo, por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad mixta del tejido conjuntivo (MCTD), artritis inducida por cristales, artritis reactiva, espondiloartropatia, artrosis, sarcoidosis, reumatismo palindromico, artritis post traumatica, artritis relacionada con tumores malignos, artritis septica, artritis de Lyme, artrosis, bacteriana, artritis infecciosa, etc. La artritis puede acompanar otros trastornos identificados, que incluye gota, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistemico, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, etc. Una afeccion artntica bien definida se refiere al conocimiento sobre el tipo de artritis y su etapa, por ejemplo, inicio, remision, recafda, etc.
Los “autoanticuerpos” son anticuerpos endogenos que se unen espedficamente a los antigenos propios, es decir, un componente de tejido normal. Un autoanticuerpo se produce en respuesta a un antigeno natural del mismo cuerpo que produce el autoanticuerpo.
La “union inmunologica” y la “formacion de un complejo inmunitario” se utilizan de manera intercambiable y, como se utiliza en este contexto, generalmente se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que ocurren entre un anticuerpo, por ejemplo, un autoanticuerpo y un antigeno para el cual El anticuerpo es espedfico. La fuerza o afinidad de las interacciones de union inmunologica se pueden expresar en terminos de la constante de disociacion (Kd) de la interaccion, en la que una Kd mas pequena representa una afinidad mayor. Las propiedades de union inmunologica se pueden cuantificar utilizando metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, vease Davies et al. (1990) Rev. Anual Biochem. 59:439-473. Se dice que un anticuerpo, o fragmento del mismo de union a antigeno, se “une espedficamente”, “se une inmunologicamente” y/o es “inmunologicamente reactivo” si reacciona a un nivel detectable (dentro, por ejemplo, de un ensayo ELISA) con un ligando, y no reacciona de forma detectable con ligandos no relacionados bajo condiciones similares.
“Anticuerpo” se refiere a una composicion que comprende una protema que se une espedficamente a un antfgeno correspondiente y tiene una estructura general comun de inmunoglobulinas. El termino anticuerpo cubre espedficamente anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, dfmeros, multfmeros, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos biespedficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biologica deseada. Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quimericos o derivados de otras especies. Normalmente, un anticuerpo comprendera por lo menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras interconectadas por enlaces disulfuro, que cuando se combinan forman un dominio de union que interactua con un antfgeno. Cada cadena pesada se compone de una region variable de cadena pesada (VH) y una region constante de cadena pesada (CH). La region constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3, y puede ser del isotipo mu, delta, gamma, alfa o epsilon. De manera similar, la cadena ligera esta compuesta por una region variable de cadena ligera (VL) y una region constante de cadena ligera (CL). La region constante de cadena ligera comprende un dominio, CL, que puede ser del isotipo kappa o lambda. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones qie estan mas conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interactua con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la union de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del anfitrion, que incluyen varias celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clasico. La region constante de cadena pesada media la union de la inmunoglobulina al tejido del anfitrion o factores del anfitrion, particularmente a traves de receptores celulares tales como los receptores Fc (por ejemplo, FcyRI, FcyRII, FcyRIII, etc.). Como se utiliza en este documento, el anticuerpo tambien incluye una porcion de union a antigeno de una inmunoglobulina que retiene la capacidad de unirse al antfgeno. Estos incluyen, como ejemplos, F(ab), un fragmento monovalente de dominios de anticuerpos VL CL y VH CH; y el fragmento F(ab')2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra. El termino anticuerpo tambien se refiere a fragmentos Fv de una sola cadena recombinantes (scFv) y moleculas biespedficas tales como, por ejemplo, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No.
5,844,094).
El “antfgeno” se debe interpretar de manera amplia y se refiere a cualquier molecula, composicion o partmula que pueda unirse espedficamente a un anticuerpo. Un antfgeno puede tener uno o mas epftopos que interactuan con el anticuerpo, aunque no necesariamente induce la produccion de ese anticuerpo.
De acuerdo con lo anterior, los terminos “autoanticuerpos contra 14-3-3” y “autoanticuerpos con 14-3-3” se utilizan indistintamente y se refieren a anticuerpos endogenos producidos por un sujeto marnffero que se une espedficamente a una protema 14-3-3 o un fragmento de la misma de dicho anfitrion.
“14-3-3” y “protema 14-3-3” se utilizan de manera intercambiable y se refieren a por lo menos un miembro de la familia 14-3-3 de moleculas reguladoras intracelulares conservadas que se expresan de forma ubicua en eucariotas. Las protemas 14-3-3 tienen la capacidad de unirse a una multitud de protemas de senalizacion funcionalmente diversas, que incluyen quinasas, fosfatasas y receptores de transmembrana. De hecho, mas de 100 protemas de senalizacion han sido reportadas como ligandos 14-3-3. Las protemas 14-3-3 se pueden considerar miembros evolucionados de la superfamilia de Repeticion de Peptidos Tetratricos. Generalmente tienen 9 o 10 helices alfa, y forman en general interacciones homo y/o heterodfmero a lo largo de sus helices amino terminales. Estas protemas contienen una serie de dominios conocidos, que incluyen regiones para la interaccion de cationes divalentes, fosforilacion y acetilacion y division proteolftica, entre otros. Hay siete isoformas distintas codificadas geneticamente de las protemas 14-3-3 que se sabe que se expresan en mamnferos, con cada isoforma que comprende entre 242­ 255 aminoacidos. Las siete isoformas de la protema 14-3-3 se designan como a/p (alfa/beta)14-3-3, (delta/zeta) 8/^ 14-3-3, £ (epsilon) 14-3-3, y (gamma) 14-3-3, n (eta) 14-3-3, t/0 (tau/theta) 14-3-3 y a (sigma/estratifina) 14-3-3. Las protemas 14-3-3 tienen un alto grado de similitud de secuencia, y se sabe que se someten a un procesamiento posterior a la traduccion, por ejemplo, fosforilacion, citrulinacion, etc. Vease, por ejemplo, Megidish et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21834-45. En consecuencia, los autoanticuerpos anti-14-3-3 pueden unirse espedficamente y/o reconocer mas de una isoforma de la protema 14-3-3, o pueden unirse y/o reconocer espedficamente una sola isoforma (por ejemplo, eta 14-3-3). Adicionalmente, los anticuerpos anti-14-3-3 pueden unirse y/o reconocer una protema 14-3-3- que se ha modificado, por ejemplo, por procesos naturales (por ejemplo, post-traduccional) o químicos.
Los terminos “union espedfica” o “unir espedficamente” cuando se utilizan en referencia a la interaccion de un anticuerpo y una protema o peptido significa que la interaccion depende de la presencia de una estructura particular (es decir, un epftopo) sobre la protema; en otras palabras, el anticuerpo es reconocer y unirse a una estructura de protema espedfica en lugar de a protemas en general.
Los epftopos son caractensticas qmmicas generalmente presentes sobre las superficies de las moleculas y accesibles a la interaccion con un anticuerpo. Las caractensticas qmmicas tfpicas son fracciones de aminoacidos y de azucar, que tienen caractensticas estructurales tridimensionales, asf como propiedades qmmicas que incluyen carga, hidrofilicidad y lipofilicidad. Los epftopos conformacionales se distinguen de los epftopos no conformacionales por la perdida de reactividad con un anticuerpo despues de un cambio en los elementos espaciales de la molecula sin ningun cambio en la estructura qmmica subyacente. De acuerdo con lo anterior, el termino “epftopo” cuando se utiliza en referencia a protemas 14-3-3 o isomeros espedficos generalmente se refiere a un determinante de la protema, que incluye una protema 14-3-3 modificada, que es capaz de unirse a un anticuerpo, por ejemplo, un autoanticuerpo. En este documento se describen los epftopos 14-3-3 que se reconocen por los autoanticuerpos en un paciente diagnosticado con artritis, en particular artritis reumatoide, los metodos para utilizar dichos epftopos para evaluar y/o caracterizar una afeccion artrftica en un sujeto, y los kits que comprenden dichos epftopos.
La protema 14-3-3 o fragmento de la misma puede comprender un epftopo compartido entre una pluralidad de isoformas de protema 14-3-3, o puede comprender un epftopo unico para uno o un subconjunto de isoformas de protema 14-3-3. “Compartido” como se utiliza en este documento se refiere a un fragmento o epftopo en comun entre dos o mas isoformas de protema 14-3-3. En realizaciones preferidas, la protema 14-3-3 o fragmento de la misma comprende un epftopo eta y/o gamma 14-3-3. En una realizacion, la protema 14-3-3 o fragmento de la misma comprende un epftopo eta 14-3-3 compartido por al menos otra isoforma 14-3-3, por ejemplo, gamma 14-3-3. En otra realizacion, el epftopo eta 14-3-3 es unico para eta 14-3-3. Los epftopos comunmente reconocidos para eta 14-3-3 se incluyen en la Tabla 1 a continuacion.
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Metodos de diagnostico, pronostico y terapeuticos, y monitorizacion del tratamiento
En general, la presencia o ausencia de una afeccion artntica, o pronostico de paciente, se puede determinar al: a) proporcionar una muestra de un sujeto mairnfero del que se sospecha tiene una afeccion artntica; b) detectar en dicha muestra la presencia de un autoanticuerpo contra por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3; en el que la presencia de dicho autoanticuerpo es indicativa de una afeccion artntica que implica dicho autoanticuerpo en el sujeto
en el que la etapa de deteccion comprende poner en contacto la muestra biologica con por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3,
en el que la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste de sangre, fluido sinovial, plasma, suero o tejido. En general, la presencia o ausencia de una afeccion artntica, o pronostico de paciente, se puede determinar al: a) proporcionar una muestra de un sujeto marnffero del que se sospecha tiene una afeccion artntica; b) detectar en dicha muestra la presencia de un complejo inmunitario que comprende i) un autoanticuerpo contra por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 y ii) por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3;
en el que la presencia de dicho complejo inmunitario es indicativa de una afeccion artntica que implica dicho autoanticuerpo en el sujeto en el que la etapa de deteccion comprende poner en contacto la muestra biologica con una molecula de union unida a un soporte solido para la deteccion de dicho complejo inmunitario
en el que la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste de sangre, fluido sinovial, plasma, suero o tejido.
Los metodos comprenden utilizar por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 para detectar autoanticuerpos contra la protema. Existe una variedad de formatos de ensayo conocidos por aquellos expertos en la tecnica para utilizar una protema para detectar anticuerpos en una muestra. Vease, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Como ejemplos no limitantes, la deteccion de autoanticuerpos contra 14-3-3 se puede realizar utilizando metodos o ensayos bien conocidos, por ejemplo. inmunoprecipitacion, ELISA, analisis de transferencia Western, inmunohistoqmmica, inmunofluorescencia, inmunoensayos “intercalados”, ensayos inmunoradiometricos, reacciones de precipitacion por difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, inmunoensayos in situ, reacciones de precipitacion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion de complemento, ensayos de protema A, ensayos de inmunoelectroforesis analisis de clasificacion de celulas activadas (FACS), radioinmunoensayo, prueba de tira, prueba en el punto de cuidado y similares. El experto habitual en la tecnica reconocera que estos metodos tambien se pueden utilizar para medir el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, protemas eta 14-3-3 en la muestra biologica. En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo de deteccion automatizado. Los metodos para la automatizacion de inmunoensayos incluyen aquellos descritos en las patentes de EE.UU. 5,885,530, 4,981,785, 6,159,750, y 5,358,691.
En algunas realizaciones, el analisis y la presentacion de los resultados tambien son automatizados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se utiliza un software que genera un pronostico basado en la presencia o ausencia de una serie de protemas correspondientes a afecciones artrfticas, que incluyen las protemas 14-3-3.
En una realizacion, los ensayos implican el uso de por lo menos una protema eta 14-3-3 o un fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 inmovilizado sobre un soporte solido para unirse y capturar autoanticuerpos que se unen espedficamente a la(s) protema(s) eta 14-3-3 del resto de la muestra. Los autoanticuerpos unidos se pueden luego detectar utilizando un reactivo de deteccion que contiene un grupo indicador y se une espedficamente al complejo anticuerpo/protema. Dichos reactivos de deteccion pueden comprender, por ejemplo, un agente de union que se une espedficamente al autoanticuerpo tal como un anticuerpo antihumano.
El soporte solido puede ser cualquier material conocido por aquellos expertos en la tecnica. Por ejemplo, el soporte solido puede ser un pozo de prueba en una placa de microtitulacion o una nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, latex o un material plastico tal como poliestireno o cloruro de polivinilo. El soporte tambien puede ser una partroula magnetica o un sensor de fibra optica, tales como aquellos descritos, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. No. 5,359,681. La protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta se puede inmovilizar sobre el soporte solido utilizando una variedad de tecnicas conocidas por aquellos expertos en la tecnica, que se describen ampliamente en la bibliograffa de patentes y cientffica. En el contexto de la presente invencion, el termino “inmovilizacion” se refiere tanto a la asociacion no covalente, como la adsorcion, y la union covalente (que puede ser un enlace directo entre el anticuerpo y los grupos funcionales sobre el soporte o puede ser un enlace por medio de un agente de entrecruzamiento). Se prefiere la inmovilizacion por adsorcion en un pozo en una placa de microtitulacion o en una membrana. En dichos casos, la adsorcion se puede lograr al poner en contacto el anticuerpo, en un tampon adecuado, con el soporte solido durante un tiempo adecuado. El tiempo de contacto vana con la temperatura, pero por lo general se encuentra entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 dfa. En una realizacion, una placa de microtitulacion recubierta con estreptavidina se utiliza junto con una protema eta 14-3-3 biotinilada o un fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta.
La union covalente de la protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta a un soporte solido generalmente se puede lograr al hacer reaccionar primero el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionara tanto con el soporte como con la protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma. El autoanticuerpo capturado luego se puede detectar utilizando la tecnica “intercalada” no competitiva en la que el ligando marcado para el autoanticuerpo se expone a la fase solida lavada. Alternativamente, los formatos competitivos se basan en la introduccion previa de un anticuerpo marcado para la muestra, de modo que las formas marcadas y no marcadas compitan por la union a la fase solida. Dichas tecnicas de ensayo son bien conocidas y estan bien descritas tanto en la bibliograffa de patentes como en la cientffica. Vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 3,791, 932; 3,817,837; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901 ,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; y 4,098,876. Los metodos de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se describen en detalle en la patente de EE.UU. Nos. 3,791,932; 3.839.153; 3.850.752; 3.879.262; y 4.034.074. Los ensayos ELISA detectan tftulos muy bajos de autoanticuerpos.
Los autoanticuerpos tambien se pueden detectar mediante radioinmunoensayo en fase solida (RIA). La fase solida se expone a la muestra de suero en presencia de anticuerpos radiomarcados que compiten por la union al ligando inmovilizado. En este ensayo, la cantidad de radiomarcador unido a la fase solida esta inversamente relacionada con la cantidad de autoanticuerpos inicialmente presentes en la muestra de suero. Despues de la separacion de la fase solida, la radiomarcacion unida no espedficamente se elimina mediante al lavar, y se determina la cantidad de radiomarcdo unida a la fase solida. La cantidad de radiomarcador unido esta, a su vez, relacionada con la cantidad de autoanticuerpos inicialmente presentes en la muestra.
En una realizacion, el ensayo se realiza en un formato de prueba de flujo o de tira, en el que la protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 se inmoviliza sobre una membrana, tal como nitrocelulosa. En la prueba de flujo, los autoanticuerpos para protemas eta 14-3-3 dentro de la muestra se unen a la protema eta 14-3-3 inmovilizada o un fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 cuando la muestra contacta con la membrana. Un segundo agente de union marcado se une al complejo inmunitario cuando una solucion que contiene el segundo agente de union entra en contacto con la membrana. La deteccion del segundo agente de union unido se puede realizar entonces como se describio anteriormente. En el formato de prueba de tira, un extremo de la membrana al que se une la protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 se sumerge en una solucion que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a traves de una region que contiene un segundo agente de union, por ejemplo, a los autoanticuerpos, y al area de la protema eta 14-3-3 inmovilizada o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3. La concentracion del segundo agente de union en el area de la protema eta 14-3-3 inmovilizada o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 indica la presencia de una afeccion artrftica, o pronostico del paciente, etc. Normalmente, la concentracion del segundo agente de union en ese sitio genera un patron, tal como una ftnea, que se puede leer visualmente. La ausencia de dicho patron indica un resultado negativo. En general, la cantidad de agente de union inmovilizado sobre la membrana se selecciona para generar un patron visualmente discernible cuando la muestra biologica contiene un nivel del autoanticuerpo que sena suficiente para generar una senal positiva en el ensayo, en el formato discutido anteriormente. Los agentes de union preferidos para uso en dichos ensayos son las protemas eta 14-3-3 y fragmentos de las mismas que comprenden por lo menos un epftopo eta 14-3-3. Dichas pruebas se pueden realizar normalmente con una cantidad muy pequena de muestra biologica y en el punto de atencion, que tambien puede ser cuantificable.
Ademas de detectar la presencia de autoanticuerpos en una muestra, se pueden utilizar muchos metodos para medir cuantitativamente los niveles de los autoanticuerpos. En algunos metodos, el antfgeno reacciona con el autoanticuerpo en una fase ftquida, y los autoanticuerpos se miden cuantitativamente mediante una tecnica de inmunoprecipitacion. Por ejemplo, una protema eta 14-3-3 o un fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 (es decir, un isomero de longitud completa o fragmentos antigenicos) puede marcarse de forma detectable (por ejemplo, con un isotopo o una enzima). Los polipeptidos se pueden marcar durante la smtesis (por ejemplo, al agregar 35S-metionina a un sistema de traduccion in vitro o sistema de expresion celular) o despues de la smtesis. El antfgeno detectable se agrega directamente a una muestra biologica ftquida (por ejemplo, un suero) para formar complejos inmunitarios. Los complejos inmunitarios se pueden precipitar con polietilenglicol. Los complejos inmunitarios tambien se pueden aislar con un anticuerpo secundario (por ejemplo, inmunoglobulina antihumana de cabra) u otro tipo de moleculas de union (por ejemplo, protema A o protema G) que se une a un soporte solido (por ejemplo, perlas de agarosa o sefarosa). Los inmunoprecipitados se lavan varias veces despues de separarse de la muestra ftquida y se examinan para determinar la intensidad de la marca detectable (por ejemplo, radioactividad). Cualquier autoanticuerpo presente en la muestra de esta manera se puede detectar y cuantificar. Opcionalmente, tambien se puede agregar un polipeptido no marcado para competir con el polipeptido marcado para union a autoanticuerpos.
Los metodos de diagnostico de la presente invencion tambien se dirigen a detectar en un sujeto, complejos inmunitarios en circulacion formados entre protemas 14-3-3 y un autoanticuerpo. Los metodos discutidos anteriormente se pueden modificar facilmente para la deteccion de dichos complejos inmunitarios. Por ejemplo, se puede agregar una molecula de union inmovilizada (por ejemplo, protema A o protema G unida a una perla) a una muestra biologica ftquida. Despues de la separacion de la fase ftquida, los complejos inmunitarios capturados por las moleculas de union se pueden analizar con SDS-PAGE y sondear con diversos anticuerpos contra protemas 14-3-3. Los antfgenos capturados tambien se pueden someter a un analisis directo de la secuencia de aminoacidos. La identidad de los complejos inmunitarios puede de esta manera ser revelada. Se practican rutinariamente varios ensayos para detectar complejos inmunitarios en circulacion en un sujeto, por ejemplo, como se describe en Tomimori-Yamashita et al., Lepr Rev, 70 (3): 261-71, 1999 (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas con base en anticuerpo); Krapf et al., J Clin Lab Immunol, 21 (4): 183-7, 1986 (ensayo de inmunoabsorcion ligado a fluorescencia); Kazeem et al., East Afr Med J, 67 (6): 396-403, 1990 (inmunonefelometna laser); y Rodrick et al., J Clin Lab Immunol, 7 (3): 193-8, 1982 (ensayo de filtro de fibra de vidrio de protema A, PA-GFF y ensayo de insolubilizacion de polietilenglicol). Cada uno de estos ensayos bien conocidos se puede emplear para detectar complejos inmunitarios en circulacion para los metodos de la presente invencion.
Para mejorar la sensibilidad cftnica, se pueden ensayar multiples marcadores dentro de una muestra dada. En particular, uno o mas marcadores de artritis, o indicadores de pronostico, etc., se pueden ensayar en combinacion con autoanticuerpos para la protema 14-3-3. Estos otros marcadores pueden ser protemas o acidos nucleicos. En una realizacion preferida, uno o mas de los otros marcadores son protemas MMP o acidos nucleicos u otros factores que se utilizan comunmente como indicadores para la artritis, por ejemplo, anti-CCP, anti-RF, CRP, SAA, IL-6, SIOO, osteopontina, RF, MMP-I, MMP-3, acido hialuronico, sCD14, marcadores de angiogenesis y productos del metabolismo del hueso, cartftago o sinovio (por ejemplo, CTX-I y CTX-II), etc. Los metodos para aislar y ensayar acidos nucleicos basados en secuencias de referencia son bien conocidos en la tecnica, ya que son metodos para detectar protemas de interes dentro de una muestra de paciente.
Los ensayos de combinacion se pueden realizar de forma concurrente o secuencial. La seleccion de marcadores puede basarse en experimentos de rutina para determinar combinaciones que resulten en una sensibilidad optima.
En una realizacion, la invencion proporciona metodos para diagnosticar una afeccion artntica. En general, una afeccion artntica se puede detectar en un paciente con base en la presencia de autoanticuerpos para eta 14-3-3 en el fluido sinovial, articulacion sinovial, sangre, plasma, o suero de un paciente. En otras palabras, los autoanticuerpos para la protema eta 14-3-3 se pueden utilizar como un marcador para indicar artritis. Adicionalmente, la presencia de autoanticuerpos para eta 14-3-3, o los niveles relativos de autoanticuerpos para eta 14-3-3, segun se determinan a traves del uso de una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un eprtopo eta 14­ 3-3 pueden ser un indicador pronostico de artritis en etapa temprana, antes de que progrese a una forma debilitante. Una ventaja del pronostico o diagnostico temprano es la implementacion temprana de un regimen de tratamiento.
Para determinar la presencia o ausencia de una afeccion artntica en un sujeto, el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, eta 14-3-3 en una muestra biologica del sujeto generalmente se puede comparar con un nivel de complejos de autoanticuerpos/ inmunitarios correspondientes a un control normal. En una realizacion preferida, el control normal se establece a partir del nivel medio promedio de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, 14-3-3 en muestras de pacientes sin artritis. En una realizacion alternativa, el valor de control normal se puede determinar utilizando una curva de operador de receptor, por ejemplo, vease el metodo de Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7. Brevemente, en esta realizacion, el valor de control se puede determinar a partir de un grafico de pares de tasas de verdaderos positivos (es decir, sensibilidad) y de tasas de falsos positivos (100% de especificidad) que corresponden a cada posible valor de corte para el resultado de la prueba de diagnostico. El valor de control en el grafico que esta mas cerca de la esquina superior izquierda (es decir, el valor que encierra el area mas grande) proporciona el valor mas preciso y una muestra que genera una senal que es mas alta que el valor determinado por este metodo se puede considerar positiva. Alternativamente, el valor de control puede desplazarse hacia la izquierda a lo largo de la grafica, para minimizar la tasa de falsos positivos, o hacia la derecha, para minimizar la tasa de falsos negativos. En general, una muestra que genera una senal que es mas alta que el valor de control determinado por este metodo se considera positiva para la artritis.
La invencion puede ser util en un metodo para determinar el subtipo de artritis en un paciente mairnfero, que comprende (a) proporcionar una primera muestra de un sujeto mamffero del que se sospecha tiene una afeccion artntica, (b) detectar la presencia de un autoanticuerpo contra, o un complejo inmunitario con, por lo menos ducha protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un eprtopo eta 14-3-3 en dicha muestra, (c) medir la cantidad de dicho complejo de autoanticuerpo o inmunitario y compararlo contra la cantidad de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una dicha protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un eprtopo eta 14-3-3 en una segunda muestra biologica de un segundo sujeto cuyo subtipo de artritis es conocido y/o previamente establecido, en la que dicha comparacion determina el subtipo de artritis para el primer sujeto.
Se describen en este documento metodos para determinar la respuesta potencial de un paciente a un tratamiento dirigido a la artritis. En una realizacion, los metodos implican determinar el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una protema 14-3-3 o fragmento de la misma en una muestra de paciente. En una realizacion preferida, se conoce el nivel de autoanticuerpos para/complejos inmunitarios con 14-3-3 en la muestra del paciente se compara con el de las muestras de sujetos cuya capacidad para responder al tratamiento. Un nivel relativamente alto de autoanticuerpos contra/complejos inmunitarios con 14-3-3 en una primera muestra de paciente en comparacion con una muestra de un sujeto no inflamatorio y/o una muestra de otro paciente inflamatorio puede indicar que el primer paciente es un candidato preferido para un tratamiento bien conocido, por ejemplo, una terapia con un farmaco antirreumatico modificador de la enfermedad (DMARD), tal como anti-TNF, metotrexato, minociclina, hidroxicloroquina, sulfasalazina, azatiprina, anti-IL-1, anti-IL-6r y me similares. A la inversa, un nivel relativamente bajo de complejos de autoanticuerpos/ inmunitarios a 14-3-3 en una primera muestra de paciente, en comparacion con una muestra de otro paciente inflamatorio, puede indicar que el primer paciente no es un candidato preferido para un tratamiento bien conocido, especialmente si el nivel es mas cercano a aquel de una muestra de un sujeto no inflamatorio.
Los regfmenes de tratamiento para diversos tipos de artritis son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, a un paciente diagnosticado con artritis reumatoide se le pueden recetar medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID) inicialmente, para aliviar el malestar y reducir la inflamacion. Otros regfmenes de tratamiento pueden incluir, por ejemplo, medicamentos antiinflamatorios esteroideos (SAID, por ejemplo, cortisol, prednisona), inhibidores espedficos de la ciclooxigenasa 2 (CSI), glucocorticoides y/o farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad estandar (DMARD) tales como, por ejemplo, agentes neutralizantes anti-TNF-alfa, farmacos inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina, azatioprina, ciclofosfamida), antibioticos, antimalaricos y farmacos citotoxicos (por ejemplo, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida). Los regfmenes de tratamiento tambien pueden incluir ventajosamente aquellos que se dirigen directamente a las protemas 14-3-3, vease, por ejemplo, el documento PCT/CA2008/002154. Aquellos expertos en la tecnica conoceran detalles sobre la dosificacion o ejemplos de farmacos particulares, y se pueden encontrar en, por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine 15th ed. BRAUNWALD et al eds. McGraw-Hill o “The Pharmacological basis of therapeutics”, 10th edition. 5 HARDMAN HG., LIMBIRD LE. editors. McGraw-Hill, New York, y en “Clinical Oncology”, 3rd edition. Churchill Livingstone/ Elsevier Press, 2004. ABELOFF, MD. editor.
La invencion puede ser util para monitorizar tratamiento de artritis. En una realizacion, los metodos implican medir la cantidad de dicho complejo de autoanticuerpo o inmunitario y compararlo contra la cantidad de complejo de autoanticuerpo o inmunitario en una muestra previa del mismo sujeto en el que el nivel relativo de dicho autoanticuerpo contra, o un complejo inmunitario con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma en dicha muestra en comparacion con la muestra previa del mismo sujeto es indicativo de la eficacia de un regimen terapeutico.
La presencia o niveles relativos de autoanticuerpos para/complejos inmunitarios con eta 14-3-3 se puede correlacionar con la presencia o niveles relativos de otras protemas conocidas por estar asociadas con condiciones artnticas en pacientes. Ejemplos no limitantes de protemas bien conocidas por estar asociadas con una afeccion artntica incluyen citoquinas inflamatorias, tales como factor de necrosis de tumor, protema 14-3-3, y matriz de metaloproteinasas (MMPs), tales como MMP-1 o MMP-3, etc. Por lo menos se han identificado 25 diferentes MMPs. La deteccion de autoanticuerpos para 14-3-3 en combinacion con la deteccion de por lo menos una citoquina inflamatoria y/o MMP en una muestra de paciente se puede utilizar para diagnosticar artritis. Adicionalmente, la presencia o niveles relativos de complejos de autoanticuerpos/inmunitarios para eta 14-3-3 en combinacion con por lo menos una isoforma 14-3-3, por lo menos una MMP y/o por lo menos una citoquina inflamatoria en una muestra de paciente se puede utilizar como un indicador pronostico de artritis en etapa temprana, antes de que la artritis progrese a una forma debilitante.
Tambien se describe en este documento el uso de kits para evaluar una afeccion artntica. Dichos kits para detectar la presencia en una muestra de un autoanticuerpo para por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3, para uso en evaluar una afeccion artntica en un sujeto mamftero, comprenden por lo menos una dicha protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 y un reactivo secundario, en el que el reactivo secundario se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo secundario marcado, un reactivo cromogenico o fluourogenico, y un agente de polimerizacion.
Un kit anterior normalmente comprende dos o mas componentes necesarios para realizar un analisis de diagnostico y/o pronostico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, contenedores, instrucciones y/o equipos. Por ejemplo, un contenedor dentro de un kit puede contener una protema eta 14-3-3 o un fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta. Dichos kits tambien pueden contener un reactivo de deteccion como se describio anteriormente que contiene un grupo informador adecuado para la deteccion directa o indirecta de la union del anticuerpo.
De acuerdo con lo anterior, en el presente documento se describen el uso de kits para detectar la presencia de autoanticuerpos para/complejos inmunitarios con eta 14-3-3 y opcionalmente otros marcadores, por ejemplo, MMP, en una muestra de paciente, el kit es util para proporcionar un resultado de diagnostico o pronostico adecuado para diagnosticar o diferenciar diversas afecciones artnticas. Indicaciones adicionales en las que puede estar implicada la presencia de protemas eta 14-3-3 y/o autoanticuerpos tambien incluyen, por ejemplo, trastornos cardiovasculares y/o neurodegenerativos. Un kit puede comprender una protema eta 14-3-3 o un fragmento de la misma, que puede estar opcionalmente marcado, por ejemplo, con una marca radioactiva, una marca luminiscente, una marca fluorescente, una enzima, etc. Los metodos para marcar de forma detectable protemas son bien conocidos en la tecnica. Dicho kit puede incluir ademas reactivos de deteccion espedficos para otros marcadores de artritis, por ejemplo, anti-CCP, anti-RF, CRP, SAA, IL-6, SIOO, osteopontina, RF, MMP-I, MMP-3, acido hialuronico, sCD14 , marcadores de angiogenesis y productos del metabolismo oseo, cartilaginoso o sinovial (por ejemplo, CTX-1 y CTX-II), etc. El kit incluye adicionalmente anticuerpos secundarios marcados (por ejemplo, anticuerpos anti-humanos) El kit tambien pueden incluir reactivos cromogenicos o fluourogenicos, agentes de polimerizacion y similares. Las instrucciones para utilizar el kit con fines de diagnostico o pronostico, incluidos los estandares de comparacion apropiados para cuantificar y/o evaluar el nivel de dichos autoanticuerpos en el contexto de un estado de enfermedad particular, tambien se pueden proporcionar ventajosamente en forma impresa y/o registrarse en un medio adecuado.
Experimentos
Ejemplo 1: Deteccion de eta 14-3-3 recombinante con suero humano
Se cargo una protema eta 14-3-3 recombinante (Augurex, North Vancouver, BC, Canada) sobre un gel de SDS-PAGE y se transfirio a una membrana de nitrocelulosa. Los sueros humanos de sujetos no diagnosticados con artritis reumatoide (Biochemed, Winchester, VA) o sujetos diagnosticados con artritis reumatoide (Biochemed, Suffolk County, NY) se incubaron con la membrana para detectar y caracterizar autoanticuerpos para eta 14-3-3 en sueros. Los autoanticuerpos se detectaron utilizando un anticuerpo secundario antihumano conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) y se visualizaron mediante quimioluminiscencia.
En particular, se cargaron 2 |jg de protema eta 14-3-3 recombinante en tampon de muestra (Tris acido 62.5 mM, SDS al 2%, glicerol al 10%, azul de bromofenol al 0.01%, p-mercaptoetanol al 5%) sobre un gel de SDS-PAGE al 15%. El gel SDS-PAGE se ejecuto con tampon de funcionamiento (base Tris 2.5 mM, glicina 19.2 mM, SDS al 0.1%) a 70 voltios durante 30 minutos, luego 140 voltios hasta que el frente de tinte alcanzo el fondo del gel. La protema se transfirio luego con tampon de transferencia (base Tris 2.5 mM, glicina 19.2 mM, metanol al 20%) sobre hielo durante 400 mAh a una membrana de nitrocelulosa. La eficiencia de transferencia se verifico utilizando el colorante Ponceau S para visualizar las protemas sobre la membrana. Luego se colocaron las membranas en un tampon de bloqueo (leche seca sin grasa al % en TBS-T (Tris 10 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0.05%)) e incubado sobre agitador durante 1 hora a temperatura ambiente. Se elimino el tampon de bloqueo y se agregaron sueros humanos diluidos con tampon de bloqueo (1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, v/v) para cortar las membranas. Las membranas se incubaron en un agitador durante toda la noche a 4°C. Las membranas se lavaron 3 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T. Luego se agrego el anticuerpo HRP antihumano (0.1 |jg/ml) en tampon de bloqueo y se incubo en un agitador durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron 6 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T. Los autoanticuerpos se visualizaron utilizando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, II) y se registraron sobre una peftcula.
Los datos representativos presentados en las Figuras 1 y 2 demuestran que el suero humano tomado de pacientes con artritis posee anticuerpos que se dirigen hacia eta 14-3-3, como se evidencia por la visualizacion de eta 14-3-3 recombinante por analisis de inmunotransferencia.
La presencia de estos autoanticuerpos parece ser un fenomeno espedfico en afecciones inflamatorias como la artritis, ya que estos autoanticuerpos no fueron detectables o fueron detectables a niveles mas bajos en el suero tomado de individuos sanos normales (Figuras 3 y 4).
Como parte del mecanismo de defensa natural, el sistema inmunologico genera anticuerpos como medio para destruir las partmulas /patogenos extranos encontrados. En el caso de la artritis, esta bien establecido que las protemas 14-3-3, principalmente gamma y eta 14-3-3, son detectables en el ftquido sinovial y el suero. Actualmente, se considera que los niveles de protemas 14-3-3 y/o autoanticuerpos para protemas 14-3-3 o fragmentos de las mismas en el ftquido sinovial y el suero se correlacionan directamente con el dano en los tejidos de las articulaciones, y que dicha correlacion se puede utilizar en los metodos descritos en este documento. Por ejemplo, un mayor nivel de autoanticuerpos para 14-3-3 puede llevar a una reduccion en la protema 14-3-3, y por lo tanto se correlaciona con un nivel mas bajo o un riesgo de dano de tejido en las articulaciones.
Este estudio se realizo para determinar si el sistema inmunitario intenta contrarrestar o responder a la presencia de 14-3-3, al generar espedficamente una respuesta de anticuerpos contra el objetivo y eliminandolos del suero. La presencia de estos autoanticuerpos proporcionana evidencia adicional de que estas protemas no existen normalmente en el espacio extracelular, ya que el cuerpo no generana tal respuesta si estuvieran presentes normalmente.
Los datos demuestran claramente que, en el caso de la artritis, los autoanticuerpos dirigidos a 14-3-3 estan presentes en niveles mas altos en comparacion con el suero de individuos sanos normales. De acuerdo con lo anterior, la expresion diferencial de estos anticuerpos en comparacion con individuos sanos normales puede ser util en terminos de diagnostico de artritis. Adicionalmente, la expresion diferencial puede tener utilidad en el pronostico de la enfermedad, ademas de definir que terapia administrar a un paciente, asf como monitorizar la respuesta de un paciente a una terapia determinada.
Ejemplo 2: Desarrollo de un ensayo para medir los tftulos o niveles de anticuerpos anti-14-3-3, con el fin de mapear los epftopos 14-3-3 mas comunmente reconocidos por los autoanticuerpos, los peptidos superpuestos de 15 residuos que representan la secuencia completa del peptido eta 14-3-3 se sintetizaran directamente sobre papel de celulosa utilizando la tecnica de smtesis de manchas. Los residuos de cistema se reemplazaran con serina con el fin de reducir las complicaciones qmmicas causadas por la presencia de cistemas. Las membranas de celulosa modificadas con polietilenglicol y aminoacidos protegidos con Fmoc se compraran de Abimed (Lagenfeld, Alemania). La matriz se definira sobre la membrana mediante el acoplamiento de un separador de p-alanina y los peptidos se sintetizaran utilizando la qmmica de acoplamiento DIC estandar (diisopropilcarbodiimida)/HOBt (hidroxibenzotriazol) como se describio anteriormente (Molina et al. (1996) Peptide Research 9: 151-155; Frank et al. (1992) Tetrahedron 48: 9217-9232).
Los aminoacidos activados se detectaran utilizando un robot Abimed ASP 222. Las etapas de lavado y desproteccion se realizaran manualmente y los peptidos se acetilaran en el extremo N despues del ciclo de smtesis final. Despues de la smtesis de peptidos, la membrana se lavara en metanol durante 10 minutos y en un bloqueador (por ejemplo, TBST (solucion salina tamponada con Tris con Tween al 0.1% (v/v). TM. 20) y 1% (p/v) de casema). Despues del lavado, la membrana se incubara con suero obtenido de un paciente diagnosticado con artritis reumatoide con agitacion suave. Despues de lavar con el bloqueador 3 veces, la membrana se incubara con un anticuerpo secundario marcado con HRP. La membrana se lavara tres veces durante 10 minutos cada una con bloqueador y 2 veces durante 10 minutos cada una con TBST. El anticuerpo unido se visualizara utilizando el reactivo SuperSignal™ West (Pierce) y una camara digital (Alphananotech Fluoromager).
El mapeo de epftopos para un peptido 14-3-3 se realizara con suero de por lo menos tres pacientes diferentes, cada uno diagnosticado con artritis y confirmado con autoanticuerpos anti-14-3-3, para determinar los epftopos comunmente reconocidos. Adicionalmente, el mapeo de epttopos se puede realizar con otra, si no todas, las isoformas 14-3-3 para determinar si el epttopo comunmente reconocido es espedfico de una isoforma, por ejemplo, eta 14-3-3, o compartido con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis otras isoformas 14-3-3.
Los epttopos comunmente reconocidos de por lo menos eta 14-3-3 se sintetizaran y se utilizaran para evaluar la especificidad de los epftopos para evaluar y/o caracterizar una afeccion artntica, particularmente artritis reumatoide en comparacion con otros subtipos artnticos y/o controles saludables. Despues se establece la especificidad para evaluar y/o caracterizar una afeccion artntica, el epftopo comunmente reconocido se desarrollara en un ensayo cuantitativo que mide el nivel de los autoanticuerpos 14-3-3 en una muestra de paciente. El ensayo se puede utilizar para detectar y/o cuantificar los autoanticuerpos de la protema 14-3-3 en una muestra de paciente.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo para evaluar una afeccion artntica en un sujeto mairnfero, que comprende: a) proporcionar una muestra de un sujeto mamftero del que se sospecha tiene una afeccion artntica; b) detectar en dicha muestra la presencia de un autoanticuerpo contra por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3;
en el que la presencia de dicho autoanticuerpo es indicativa de una afeccion artntica que implica dicho autoanticuerpo en el sujeto
en el que la etapa de deteccion comprende poner en contacto la muestra biologica con por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3,
en el que la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste de sangre, fluido sinovial, plasma, suero o tejido.
2. Un metodo para evaluar una afeccion artntica en un sujeto mai^ero, que comprende: a) proporcionar una muestra de un sujeto mamftero del que se sospecha tiene una afeccion artntica; b) detectar en dicha muestra la presencia de un complejo inmunitario que comprende i) un autoanticuerpo contra por lo menos una protema eta 14­ 3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 y ii) por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3; en el que la presencia de dicho complejo inmunitario es indicativa de una afeccion artntica que implica dicho autoanticuerpo en el sujeto en el que la etapa de deteccion comprende poner en contacto la muestra biologica con una molecula de union unida a un soporte solido para la deteccion de dicho complejo inmunitario
en el que la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste de sangre, fluido sinovial, plasma, suero o tejido.
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o reivindicacion 2, en el que dicha etapa de deteccion comprende adicionalmente medir la cantidad de dicho complejo de autoanticuerpo o inmunitario y compararlo contra la cantidad de complejo de autoanticuerpo o inmunitario en una muestra de control, una muestra de control artntica, o en una muestra previa del mismo sujeto.
4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma se marca de forma detectable con una marca seleccionada del grupo que consiste de una marca radioactiva, una marca luminiscente, y una marca fluorescente, y una enzima.
5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, o reivindicaciones 3 y 4 cuando depende de la reivindicacion 1, en el que la protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma se une a un soporte solido.
6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5 en el que el autoanticuerpo se detecta mediante un ensayo ELISA.
7. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha deteccion ocurre mediante quimioluminiscencia.
8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que un nivel en aumento de dicho autoanticuerpo contra, o un complejo inmunitario con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 en dicha muestra en comparacion con la muestra de control normal es un indicador diagnostico de artritis en dicho sujeto.
9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, seleccionado de (i) metodos en los que un nivel relativo de dicho autoanticuerpo contra, o un complejo inmunitario con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 en dicha muestra en comparacion con la muestra de control artntica es un indicador pronostico de artritis en dicho sujeto, y (ii) metodos en los que el nivel relativo de dicho autoanticuerpo contra, o un complejo inmunitario con, por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma en dicha muestra en comparacion con la muestra previa del mismo sujeto es indicativo de la eficacia de un regimen terapeutico.
10. Uso de un kit en el metodo de reivindicaciones 1-9 para detectar la presencia en una muestra de un autoanticuerpo para por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3, para uso en evaluar una afeccion artntica en un sujeto mamftero, en el que el kit comprende por lo menos una dicha protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 y un reactivo secundario, en el que el reactivo secundario se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo secundario marcado, un reactivo cromogenico o fluourogenico, y un agente de polimerizacion.
11. El uso de un kit de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que dicha por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 se une a un soporte solido.
12. El uso de un kit de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicho por lo menos un epftopo eta 14-3-3 se comparte con por lo menos otra isoforma de protema 14-3-3.
13. El uso de un kit de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que dicha otra isoforma de protema 14-3-3 es gamma 14-3-3.
14. El uso de un kit de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicho epftopo eta 14-3-3 es unico para eta 14-3-3.
15. El uso de un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en el que el reactivo secundario es un anticuerpo secundario marcado para la deteccion de un autoanticuerpo para dicha protema 14-3-3.
16. El uso de un kit de acuerdo con la reivindicacion 15 en el que el anticuerpo secundario marcado es un anticuerpo antihumano.
17. El uso de por lo menos una protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 para determinar el subtipo de artritis en un paciente mairftfero que comprende (a) proporcionar una primera muestra de un sujeto mairftfero del que se sospecha tiene una afeccion artrftica, (b) detectar la presencia de un autoanticuerpo contra, o un complejo inmunitario con, por lo menos una dicha protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 en dicha muestra, (c) medir la cantidad de dicho complejo de autoanticuerpo o inmunitario y compararlo contra la cantidad de autoanticuerpos contra, o complejos inmunitarios con, por lo menos una de dicha protema eta 14-3-3 o fragmento de la misma que comprende por lo menos un epftopo eta 14-3-3 en una segunda muestra biologica de un segundo sujeto cuyo subtipo de artritis es conocido y/o previamente establecido, en el que dicha comparacion determina el subtipo de artritis para el primer sujeto.
18. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente la deteccion de por lo menos un marcador de artritis adicional en dicha muestra biologica, en el que dicho por lo menos un marcador de artritis adicional se selecciona del grupo que consiste de protema eta 14-3-3, matriz de metaloproteinasa-1 (MMP-1), MMP-3, peptido citrulinado antidclico (CCP), factor reumatoide (RF), protema reactiva c (CRP), amiloide A en suero (SAA), interleuquina 6 (IL-6), protema de union a calcio S100, osteopontina, acido hialuronico, agrupacion soluble de diferenciacion 14 (sCD14), telopeptido de entrecruzamiento de terminal c de tipo I (CTX-I) y colageno sw tipo II (CTX-II).
19. El metodo de la reivindicacion 2, 5 o 11, en el que dicho soporte solido es un pozo de prueba en una placa de microtftulo o una nitrocelulosa u otra membrana adecuada.
20. El metodo de la reivindicacion 2, 5 o 11, en el que dicho soporte solido es una perla o disco.
21. El metodo de la reivindicacion 20, en el que dicha perla o disco se compone de un material seleccionado del grupo que consiste de vidrio, fibra de vidrio, latex y un material plastico tal como poliestireno o polivinilcloruro.
22. El metodo de la reivindicacion 1, 5 o 11, en el que el fragmento 14-3-3 unido a dicho soporte solido reacciona con el autoanticuerpo en una fase ftquida.
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