ES2712635T3 - Proceso para producir etanol a partir de almidón usando una xilanasa GH5 - Google Patents

Abstract

Proceso para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón que incluye las etapas de: a) licuefacción del material que contiene almidón usando una alfa-amilasa; b) sacarificación del material licuado usando una glucoamilasa; c) fermentación usando un organismo fermentador, donde la sacarificación se realiza en presencia de una xilanasa GH5, donde la xilanasa GH5 se selecciona de la subfamilia 35.

Description

DESCRIPCION

Proceso para producir etanol a partir de almidon usando una xilanasa GH5

Referencia a un listado de secuencias

[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en una forma legible por ordenador.

Antecedentes de la invencion

Campo de la invencion

[0002] La presente invencion se refiere a un proceso para producir un producto de fermentacion a partir de material que contiene almidon.

Descripcion de las tecnicas relacionadas

[0003] Los xilanos son hemicelulosas que se encuentran en todas las plantas terrestres (Popper y Tuohy, Plant Physiology, 2010, 153: 373-383). Son especialmente abundantes en las paredes celulares secundarias y las celulas de xilema. En las hierbas, con paredes celulares de tipo II, los glucurono arabinoxilanos son la hemicelulosa principal y estan presentes como fibra alimentaria soluble o insoluble en muchos alimentos y piensos a base de hierbas.

[0004] Los xilanos de las plantas tienen un esqueleto de xilopiranosa unido en p-1,4 que se puede sustituir en la posicion O2 u O3 con arabinosa, acido glucuronico y acido acetico de una manera especffica de especie y de tejido. Las semillas ricas en almidon de la Panicoideae con especies economicamente importantes tales como mafz y sorgo tienen tipos especiales de xilanos altamente sustituidos en sus paredes celulares. En comparacion con la harina de trigo, donde mas del 60% de las unidades de xilosilo en el esqueleto de arabinoxilano no estan sustituidas. En el xilano de los granos de mafz, el porcentaje correspondiente de xilosilos del esqueleto no sustituidos es 20-30%, y en el sorgo es 35-40% (Huismann et al. Carbohydrate Polymers, 2000, 42: 269-279). Ademas, en el mafz y el sorgo, las cadenas laterales de xilano pueden ser mas largas que una unica sustitucion de arabinosa o acido glucuronico, lo que es comun en otros xilanos. Esta complejidad anadida de cadenas laterales es a menudo debida a azucares L- y D-galactosa y D-xilosa unidos a la cadena lateral arabinosa o acido glucuronico. Aproximadamente cada decima arabinosa en el xilano del grano de mafz se esterifica tambien con un acido ferulico y aproximadamente cada cuarta xilosa lleva una acetilacion (Agger et al. J. Agric. Food Chem, 2010, 58: 6141-6148). Todos estos factores combinados hacen que los xilanos altamente sustituidos en el mafz y el sorgo sean resistentes a la degradacion por las xilanasas tradicionales.

[0005] Las enzimas conocidas responsables de la hidrolisis del esqueleto de xilano se clasifican en familias de enzimas basadas en la similitud de secuencia (www.cazy.org). Las enzimas con, principalmente, actividad endoxilanasa se han descrito previamente en la familia glicosido hidrolasa (GH) 5, 8, 10, 11 y 30. Las enzimas dentro de una familia comparten algunas caracterfsticas, tal como el plegamiento 3D, y comparten normalmente el mismo mecanismo de reaccion. Algunas familias de GH tienen especificidades de sustrato estrechas o monoespecfficas, mientras que otras familias tienen especificidades de sustrato amplias.

[0006] Las xilanasas GH10 y GH11 disponibles comercialmente se usan a menudo para descomponer el esqueleto de xilosa del arabinoxilano. Sin embargo, tales xilanasas son sensibles al impedimento esterico de la cadena lateral y, aunque son eficaces en la degradacion del arabinoxilano del trigo, no son muy eficaces en el xilano que se encuentra en las semillas de las especies de Panicoideae, tales como mafz o sorgo. El mafz se usa en todo el mundo, por ejemplo, en piensos y para producir bioetanol, y por tanto hay una necesidad de descubrir polipeptidos nuevos con actividad xilanasa que sean capaces de descomponer el esqueleto de xilano altamente ramificado en la pared celular para liberar mas almidon que esta atrapado dentro de la pared celular.

Resumen de la invencion

[0007] Segun la invencion, se ha demostrado que varias xilanasas pertenecientes a la familia GH5 son eficaces en la hidrolizacion de los esqueletos de xilano altamente ramificados y, por tanto, estas xilanasas GH5 se pueden aplicar ventajosamente en procesos de almidon a etanol. La presente invencion se refiere, por lo tanto, a un proceso para producir productos de fermentacion a partir de material que contiene almidon que incluye las etapas de:

a) licuefaccion de material que contiene almidon usando una alfa-amilasa;

b) sacarificacion del material licuado usando una glucoamilasa;

c) fermentacion usando un organismo fermentador, donde la sacarificacion se realiza en presencia de una xilanasa GH5, donde la xilanasa GH5 se selecciona de la subfamilia 35.

Breve descripcion de las figuras

[0008] La figura 1 muestra el efecto en el rendimiento de etanol al anadir una xilanasa GH5 durante la sacarificacion. Un mosto licuado se dividio en tres partes y se realizo una sacarificacion y una fermentacion simultaneas. La fermentacion se siguio por una perdida de peso medida dos veces al dfa y por HPLC al final de la fermentacion.

Definiciones

[0009] Material que contiene arabinoxilano: el termino "material que contiene arabinoxilano" se refiere a cualquier material que contiene arabinoxilano. El arabinoxilano es una hemicelulosa que se encuentra en las paredes celulares primarias y secundarias de las plantas, incluidas las maderas y los granos de cereales, que consiste en copolfmeros de dos azucares pentosa, arabinosa y xilosa. La cadena de arabinoxilano contiene un gran numero de unidades de xilosa con enlaces 1,4. Muchas unidades de xilosa estan sustituidas con residuos de arabinosa sustituida en 2-, 3- o 2,3.

[0010] Ejemplos de material que contiene arabinoxilano son forraje, forraje basto, semillas y granos (bien enteros o preparados por trituracion, molienda, etc., por ejemplo, de mafz, avena, centeno, cebada, trigo), arboles o maderas duras (tales como alamo, sauce, eucalipto, palma, arce, abedul), bambu, cultivos energeticos herbaceos y/o lenosos, cultivos agrfcolas alimentarios y forrajeros, productos de pienso, cascaras de mandioca, vainas de cacao, cana de azucar, remolacha azucarera, pulpa de algarroba, bagazos de verduras o frutas, residuos de madera, corteza, virutas, serrfn, pulpa de madera, licor de fabricacion de pasta, residuos de papel, carton, residuos de madera de construccion y demolicion, solidos o lodos de aguas residuales industriales o municipales, estiercol, subproducto de procesos de la elaboracion de cerveza y/o fermentacion, residuos de destilerfa humedos, residuos de destilerfa secos, grano agotado, vinaza y bagazo.

[0011] El forraje tal y como se define en la presente incluye tambien forraje basto. El forraje es material vegetal fresco tal como heno y ensilaje de plantas forrajeras, hierbas y otras plantas forrajeras, hierbas y otras plantas forrajeras, algas, granos germinados y legumbres, o cualquier combinacion de los mismos. Ejemplos de plantas forrajeras son alfalfa (mielga), cuernecillo, crucfferas (por ejemplo, col, colza (canola), naba (colinabo), nabo), treboles (por ejemplo, trebol hfbrido, trebol rojo, trebol subterraneo, trebol blanco), hierbas (por ejemplo, grama, bromo, hierba triguera, festuca, triguillo del agua, poas, Miscanthus, pasto ovillo, raigras, pasto varilla, fleo de los prados), mafz, canamo, mijo, cebada, avena, centeno, sorgo, soja y trigo y verduras tales como las remolachas. Plantas de cultivo adecuadas para ensilaje son las hierbas ordinarias, los treboles, la alfalfa, las algarrobas, la avena, el centeno y el mafz. El forraje ademas incluye residuos de cultivos de la produccion de grano (tal como rastrojos de mafz; paja de trigo, cebada, avena, centeno y otros granos); residuos de verduras como hojas de remolacha; residuos de la produccion de semillas oleaginosas como tallos y hojas de soja, colza y otras legumbres; y fracciones de la refinacion de granos para consumo animal o humano o de la produccion de combustible u otras industrias.

[0012] El forraje basto es material vegetal generalmente seco con altos niveles de fibra, tal como fibra, salvado, cascaras de semillas y granos y residuos de cultivos (tales como rastrojos, copra, paja, cascarillas, residuos de remolacha azucarera).

[0013] Las fuentes preferidas de materiales que contienen arabinoxilano son forraje, forraje basto, semillas y granos, cana de azucar, remolacha azucarera y pulpa de madera.

[0014] ADNc: el termino "ADNc" se refiere a una molecula de ADN que se puede preparar por transcripcion inversa a partir de una molecula de ARNm empalmado maduro obtenida de una celula eucariotica o procariotica. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genomico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a traves de una serie de etapas, incluido el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.

[0015] Secuencia codificante: el termino "secuencia codificante" se refiere a un polinucleotido, que especifica directamente la secuencia de aminoacidos de un polipeptido. Los lfmites de la secuencia codificante estan determinados generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza con un codon de inicio tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codon de parada tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genomico, ADNc, ADN sintetico o una combinacion de los mismos.

[0016] Secuencias de control: el termino "secuencias de control" se refiere a secuencias de acidos nucleicos necesarias para la expresion de un polinucleotido que codifica un polipeptido maduro de la presente invencion. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o exogena (es decir, de un gen diferente) al polinucleotido que codifica el polipeptido o nativa o exogena entre si. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia lfder, secuencia de poliadenilacion, secuencia de propeptido, promotor, secuencia de peptido senal y terminador de la transcripcion. Como mfnimo, las secuencias de control incluyen un promotor y senales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden proporcionarse con conectores con el fin de introducir sitios de restriccion especfficos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la region codificante del polinucleotido que codifica un polipeptido.

[0017] Expresion: el termino "expresion" incluye cualquier etapa implicada en la produccion de un polipeptido que incluye, pero no se limita a, transcripcion, modificacion postranscripcional, traduccion, modificacion postraduccional y secrecion.

[0018] Vector de expresion: el termino "vector de expresion" se refiere a una molecula lineal o circular de ADN que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido y esta unido operativamente a secuencias de control que proveen a su expresion.

[0019] Xilano altamente ramificado: el termino "xilano altamente ramificado" se refiere a que mas del 50% de las unidades de xilosilo en el esqueleto de arabinoxilano estan sustituidas. Esto se calcula preferiblemente a partir de un analisis de ligamiento como el realizado en Huismann et al. Carbohydrate Polymers, 2000, 42: 269-279.

[0020] Celula huesped: el termino "celula huesped" se refiere a cualquier tipo celular que es susceptible a la transformacion, transfeccion, transduccion o similar con una construccion de acido nucleico o vector de expresion que comprende un polinucleotido de la presente invencion. El termino "celula huesped" abarca cualquier descendiente de una celula parental que no sea identica a la celula parental debido a mutaciones que se producen durante la replicacion.

[0021] Aislado: el termino "aislado" se refiere a una sustancia en una forma o entorno que no ocurre en la naturaleza. Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen 1) cualquier sustancia que no ocurre de forma natural, 2) cualquier sustancia que incluye, pero no se limita a, cualquier enzima, variante, acido nucleico, protefna, peptido o cofactor, que se extrae al menos parcialmente de uno o mas o todos los constituyentes de origen natural con los cuales esta asociado en la naturaleza; 3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a esa sustancia encontrada en la naturaleza; o 4) cualquier sustancia modificada aumentando la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los cuales esta asociada naturalmente (por ejemplo, produccion recombinante en una celula huesped; copias multiples de un gen que codifica la sustancia; y uso de un promotor mas fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen que codifica la sustancia).

[0022] Polipeptido maduro: el termino "polipeptido maduro" se refiere a un polipeptido en su forma final despues de la traduccion y cualquier modificacion postraduccional, tal como el procesamiento N-terminal, el truncamiento C-terminal, la glicosilacion, la fosforilacion, etc. En un aspecto, el polipeptido maduro esta constituido por los aminoacidos 37 a 573 de la SEQ ID N.°: 2. Los aminoacidos 1 a 27 de la SEQ ID N.°: 2 son un peptido senal. Los aminoacidos 28 a 36 de la SEQ ID N.°: 2 son una etiqueta de polihistidina. En otro aspecto, el polipeptido maduro esta constituido por los aminoacidos 36 a 582 de la SEQ ID N.°: 4. Los aminoacidos 1 a 27 de la SEQ ID N.°: 4 esta constituido por un peptido senal. Los aminoacidos 28 a 35 de la SEQ ID N.°: 4 son una etiqueta de polihistidina.

[0023] Se conoce en la tecnica que una celula huesped puede producir una mezcla de dos o mas polipeptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoacido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresado por el mismo polinucleotido. Tambien se conoce en la tecnica que diferentes celulas huesped procesan los polipeptidos de manera diferente, y asf, una celula huesped que expresa un polinucleotido puede producir un polipeptido maduro diferente (por ejemplo, con un aminoacido C-terminal y/o N-terminal diferente) en comparacion con otra celula huesped que expresa el mismo polinucleotido.

[0024] Secuencia codificante del polipeptido maduro: el termino "secuencia codificante del polipeptido maduro" se refiere a un polinucleotido que codifica un polipeptido maduro que tiene actividad xilanasa. En un aspecto, la secuencia codificante del polipeptido maduro esta constituida por los nucleotidos 109 a 1719 de la SEQ ID N.°: 1. Los nucleotidos 1 a 81 de la S^eQ ID N.°: 1 codifican un peptido senal. Los nucleotidos 82 a 108 de la SEQ ID N.°: 1 codifican una etiqueta de polihistidina. En un aspecto, la secuencia codificante del polipeptido maduro esta constituida por los nucleotidos 106 a 1746 de la SEQ ID N.°: 3. Los nucleotidos 1 a 81 de la SEQ ID N.°: 3 codifican un peptido senal. Los nucleotidos 82 a 105 de la SEQ ID N.°: 3 codifican una etiqueta de polihistidina.

[0025] Composicion de oligosacaridos: el termino "composicion de oligosacaridos" se refiere a oligo- y polisacaridos, pero no incluye mono- y disacaridos (GP1 y GP2).

[0026] Construccion de acidos nucleicos: el termino "construccion de acidos nucleicos" se refiere a una molecula de acido nucleico, bien mono- o bicatenaria, que se aisla de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de acidos nucleicos de manera que de otro modo no existirfa en la naturaleza o que es sintetica, que comprende una o mas secuencias de control.

[0027] Unido operativamente: el termino "unido operativamente" se refiere a una configuracion donde una secuencia de control se coloca en una posicion apropiada respecto a la secuencia codificante de un polinucleotido de manera que la secuencia de control dirige la expresion de la secuencia codificante.

[0028] Porcentaje de xilosa solubilizada: el termino "porcentaje de xilosa solubilizada" se refiere a la cantidad de xilosa medida en el sobrenadante tras la incubacion con una enzima en comparacion con la cantidad total de xilosa presente en el sustrato antes de la incubacion con la enzima. El porcentaje de xilosa solubilizada de mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA) se puede calcular como se describe en la presente en el ejemplo 3.

[0029] Identidad de secuencia: la relacion entre dos secuencias de aminoacidos o entre dos secuencias de nucleotidos se describe mediante el parametro "identidad de secuencia".

[0030] Para fines de la presente invencion, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoacidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48: 443-453) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la version 3.0.0 o posterior. Se uso la version 6.1.0. Los parametros opcionales usados son una penalizacion por apertura de espacio de 10, una penalizacion por extension de espacio de 0,5 y la matriz de sustitucion EBLOSUM62 (version de EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad mas larga" (obtenido usando la opcion -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos identicos x 100)/(Longitud del alineamiento - Numero total de espacios en el alineamiento)

[0031] Para fines de la presente invencion, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleotidas se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente la version 3.0.0 o posterior. Se uso la version 6.1.0. Los parametros opcionales usados son una penalizacion por apertura de espacio de 10, una penalizacion por extension de espacio de 0,5 y la matriz de sustitucion EDNAFULL (version de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado como "identidad mas larga" (obtenido usando la opcion -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleotidos identicos x 100)/(Longitud del alineamiento - Numero total de espacios en el alineamiento).

[0032] Xilanasa: el termino "xilanasa" se refiere a una 1,4-beta-D-xilan-xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.8) que cataliza la endohidrolisis de enlaces 1,4-beta-D-xilosfdicos en los xilanos. La actividad xilanasa se puede determinar con AZCL-arabinoxilano al 0,2% como sustrato en TRITON® X-100 al 0,01% y 200 mM de fosfato sodico pH 6 a 37 °C. Una unidad de actividad xilanasa se define como 1,0 pmol de azurina producida por minuto a 37 °C, pH 6 de AZCL-arabinoxilano al 0,2% como sustrato en 200 mM de fosfato sodico pH 6.

[0033] Xilanasa GH5: las xilanasas descritas en esta invencion pertenecen a GH5, una familia GH con una amplia variedad de especificidades de sustrato. La relacion entre secuencias dentro de GH5 se ha clarificado definiendo subfamilias de secuencias relacionadas (Aspeborg et al. BMC Evolutionary Biology, 2012, 12:186). Subdividir una familia GH en subfamilias ha mejorado significativamente la potencia predictiva para la especificidad de sustrato, no solo para GH5 (Lombard et al. Nucleic Acids Res, 2014, 42: D490-D495). Dos de las subfamilias de GH5, GH5_21 y GH5_34, se han descrito como xilanasas que actuan sobre arabinoxilano. De manera interesante, estas dos subfamilias de xilanasa no estan estrechamente relacionadas y son el resultado de una evolucion convergente. Durante el curso de este trabajo, se ha descubierto que los miembros de la subfamilia GH5_35, una subfamilia de funcion previamente desconocida, tienen actividad xilanasa.

Descripcion detallada de la invencion

[0034] Los inventores han descubierto que determinadas xilanasas de la familia glicosido hidrolasa 5 (en la presente denominada GH5) son sorprendentemente buenas para degradar el esqueleto de xilosa de arabinoxilano estericamente impedido, liberando asf mayores cantidades de xilosa. En particular, las xilanasas GH5 pertenecientes a la subfamilia GH5_35 tienen la capacidad para acceder y degradar xilanos altamente ramificados (que se refiere a que mas del 50% de las unidades de xilosilo en el esqueleto del arabinoxilano estan sustituidas) que son resistentes a la degradacion por xilanasa por xilanasas de otras familias GH. La mayor degradacion, y asf mayor liberacion de xilosa, aumenta la accesibilidad del almidon atrapado en la estructura de xilosa. Por tanto, la presente invencion se refiere a un proceso para producir productos de fermentacion a partir de material que contiene almidon que incluye las etapas de:

a) licuefaccion del material que contiene almidon usando una alfa-amilasa;

b) sacarificacion del material licuado usando una glucoamilasa;

c) fermentacion usando un organismo fermentador, donde la sacarificacion se realiza en presencia de una xilanasa GH5, donde la xilanasa GH5 se selecciona de la subfamilia 35.

Xilanasas GH5

[0035] Las xilanasas GH5 aplicadas en el proceso de la invencion se seleccionan, en una forma de realizacion, de la subfamilia 35.

[0036] En una forma de realizacion especffica, la xilanasa GH5 de la subfamilia 35 se selecciona de la xilanasa representada por los aminoacidos 37 a 573 de la SEQ ID N.°: 2, o una xilanasa GH5 que tiene al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% de identidad con los aminoacidos 37 a 573 de la SEQ ID N.°: 2.

[0037] En otra forma de realizacion especffica, la xilanasa GH5 de la subfamilia 35 se selecciona de la xilanasa representada por los aminoacidos 36 a 582 de la SEQ ID N.°: 4, o una xilanasa GH5 que tiene al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% de identidad con los aminoacidos 36 a 582 de la SEQ ID N.°: 4.

Produccion de productos de fermentacion a partir de materiales que contienen almidon

[0038] Procesos para producir productos de fermentacion a partir de material que contiene almidon gelatinizado. En este aspecto, la presente invencion se refiere a un proceso para producir un producto de fermentacion, especialmente etanol, a partir de material que contiene almidon, proceso que incluye una etapa de licuefaccion y etapas de sacarificacion y fermentacion realizadas consecutiva o simultaneamente.

[0039] La invencion se refiere a procesos para producir productos de fermentacion a partir de material que contiene almidon que incluye las etapas de:

i) licuefaccion del material que contiene almidon usando una alfa-amilasa:

ii) sacarificacion del material licuado usando una enzima generadora de fuente de carbohidratos;

iii) fermentacion usando un organismo fermentador, donde la sacarificacion se realiza en presencia de una xilanasa GH5, donde la xilanasa GH5 se selecciona de la subfamilia 35.

[0040] El producto de fermentacion, tal como especialmente etanol, puede recuperarse opcionalmente despues de la fermentacion, por ejemplo, por destilacion. Los materiales de partida que contienen almidon adecuados se enumeran en la seccion "materiales que contienen almidon" mas adelante. En una forma de realizacion, los materiales que contienen almidon son mafz o trigo. Las enzimas contempladas se enumeran en la seccion de "enzimas" mas adelante. La licuefaccion se realiza en presencia de una alfa-amilasa, preferiblemente una alfaamilasa bacteriana, especialmente una alfa-amilasa de Bacillus, tal como una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus. El organismo fermentador es preferiblemente levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces, especialmente una cepa de Saccharomyces cerevisae. Los organismos fermentadores adecuados se enumeran en la seccion "organismos fermentadores" mas adelante. En una forma de realizacion preferida, las etapas ii) y iii) se realizan consecutiva o simultaneamente (es decir, como proceso de SSF).

[0041] La suspension acuosa puede contener 10-55% en peso de solidos secos, preferiblemente 25-45% en peso de solidos secos, mas preferiblemente 30-40% en peso de solidos secos de material que contiene almidon. La suspension se calienta por encima de la temperatura de gelatinizacion inicial. Se puede anadir alfa-amilasa, alfaamilasa preferiblemente bacteriana, a la suspension. En una forma de realizacion, la suspension tambien se cuece con vapor a presion para gelatinizar adicionalmente la suspension antes de ser sometida a una alfaamilasa en la etapa i) de licuefaccion.

[0042] La temperatura durante la etapa i) esta por encima de la temperatura de gelatinizacion inicial, tal como entre 80-90 °C, tal como alrededor de 85 °C.

[0043] En una forma de realizacion, la licuefaccion se realiza como un proceso de suspension en caliente de tres etapas. La suspension se calienta entre 60-95 °C, preferiblemente entre 80-90 °C, y se anade alfa-amilasa para iniciar la licuefaccion (disolucion). Luego, la suspension se cuece con vapor a presion a una temperatura de entre 95 y 140 °C, preferiblemente 105-125 °C, durante 1-15 minutos, preferiblemente durante 3-10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos. La suspension se enfrfa a 60-95 °C, preferiblemente 80-90 °C, y se anade mas alfa-amilasa para finalizar la hidrolisis (licuefaccion secundaria). El proceso de licuefaccion se realiza normalmente a pH 4,5-6,5, en particular a un pH entre 5 y 6. El almidon molido y licuado se conoce como "mosto".

[0044] La sacarificacion de la etapa ii) se puede realizar usando condiciones bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, un proceso de sacarificacion completa puede durar hasta de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas. En una forma de realizacion, se realiza una etapa de presacarificacion de 40-90 minutos a una temperatura de entre 30 y 65 °C, tfpicamente a alrededor de 60 °C, seguida de una sacarificacion completa durante la fermentacion en una etapa de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF). La sacarificacion se realiza tfpicamente a temperaturas de 30-70 °C, tal como 55-65 °C, tfpicamente alrededor de 60 °C, y a un pH entre 4 y 5, normalmente a alrededor de pH 4,5.

[0045] El proceso mas ampliamente usado en la produccion de producto de fermentacion, especialmente la produccion de etanol, es el proceso de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF), donde no hay fase de retencion para la sacarificacion.

[0046] La SSF puede realizarse tfpicamente a una temperatura de entre 25 °C y 40 °C, tal como entre 28 °C y 36 °C, tal como entre 30 °C y 34 °C, tal como alrededor de 32 °C, cuando el organismo de fermentacion es levadura, tal como una cepa de Saccharomyces cerevisiae, y el producto de fermentacion deseado es etanol. En una forma de realizacion, la fermentacion esta en progreso durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.

[0047] Otros productos de fermentacion se pueden fermentar en condiciones y temperaturas, bien conocidas por la persona experta en la tecnica, adecuadas para el organismo fermentador en cuestion. Segun la invencion, la temperatura se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo durante la fermentacion.

[0048] En una forma de realizacion, se anade una proteasa durante la fermentacion. Se pueden encontrar ejemplos de proteasas en la seccion "proteasas" mas adelante.

[0049] En una forma de realizacion preferida, la etapa ii) y la etapa iii) se realizan como un proceso de sacarificacion y fermentacion simultaneas. En tal forma de realizacion preferida, el proceso se realiza tfpicamente a una temperatura entre 25 °C y 40 °C, tal como entre 28 °C y 36 °C, tal como entre 30 °C y 34 °C, tal como alrededor de 32 °C. Segun la invencion, la temperatura se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo durante la fermentacion.

[0050] En una forma de realizacion, se realiza la sacarificacion y fermentacion simultaneas de modo que el nivel de azucar, tal como el nivel de glucosa, se mantiene en un nivel bajo tal como por debajo del 6% en peso, preferiblemente por debajo de aproximadamente el 3% en peso, preferiblemente por debajo de aproximadamente el 2% en peso, mas preferido por debajo de aproximadamente el 1% en peso, aun mas preferido por debajo de aproximadamente el 0,5%, o aun mas preferido el 0,25% en peso, tal como por debajo de aproximadamente el 0,1% en peso. Se pueden conseguir tales bajos niveles de azucar utilzando sencillamente cantidades ajustadas de enzima y organismo fermentador. Una persona experta en la tecnica puede determinar facilmente que cantidades de enzima y organismo fermentador usar. Las cantidades empleadas de enzima y organismo fermentador tambien se pueden seleccionar para mantener concentraciones bajas de maltosa en el caldo de fermentacion. Por ejemplo, el nivel de maltosa se puede mantener por debajo de aproximadamente el 0,5% en peso o por debajo de aproximadamente el 0,2% en peso.

[0051] El proceso de la invencion se puede realizar a un pH en el intervalo entre 3 y 7, preferiblemente de pH 3,5 a 6, o mas preferiblemente de pH 4 a 5.

[0052] En una forma de realizacion, se anade una proteasa durante la fermentacion. Ejemplos de proteasas se pueden encontrar en la seccion de "proteasas" mas adelante.

Materiales que contienen almidon

[0053] Segun la invencion, los azucares pueden derivarse de materiales que contienen almidon. Cualquier material de partida que contiene almidon adecuado, incluido almidon granulado, se puede usar segun la presente invencion. El material de partida se selecciona generalmente en base al producto de fermentacion deseado. Ejemplos de materiales de partida que contienen almidon, adecuados para usar en un proceso de la presente invencion, incluyen granos enteros, granos de mafz, trigo, cebada, centeno, triticale, sorgo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, alubias y boniatos, o mezclas de los mismos, o cereales, o materias primas que contienen azucar, tal como melaza, materiales de fruta, cana de azucar o remolacha azucarera, patatas. Se contemplan tipos tanto cerosos como no cerosos de mafz y cebada.

[0054] En una forma de realizacion particular, el material que contiene almidon incluye mafz, granos de mafz, trigo, centeno, cebada, triticale, sorgo, pasto varilla, mijo, mijo perla, panizo o en una forma procesada tal como granos de mafz molidos, trigo molido, centeno molido, cebada molida, triticale molido, mafz molido, mafz desgrasado, mafz desgrasado desalmidonado, sorgo molido, pasto varilla molido, mijo molido, panizo molido, mijo perla molido.

[0055] Particularmente, el material a base de almidon incluye mafz, sorgo, trigo, centeno, cebada o triticale.

[0056] El termino "almidon granulado" se refiere a almidon crudo sin cocer, es decir, almidon en su forma natural encontrado en cereales, tuberculos o granos. El almidon se forma dentro de celulas vegetales como pequenos granulos insolubles en agua. Cuando se ponen en agua frfa, los granulos de almidon pueden absorber una pequena cantidad del lfquido e hincharse. A temperaturas de hasta 50 °C a 75 °C, el hinchamiento puede ser reversible. Sin embargo, con temperaturas mas altas empieza un hinchamiento irreversible llamado "gelatinizacion". El almidon granulado que se va a procesar puede, en una forma de realizacion, ser un almidon altamente refinado, preferiblemente al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99,5% puro, o puede ser un material que contiene almidon mas crudo que comprende grano entero molido que incluye fracciones no amilaceas tales como residuos de germen y fibras. La materia prima, tal como grano entero, se muele para abrir la estructura y permitir un procesamiento posterior. Se prefieren dos procesos de molienda segun la invencion: molienda humeda y seca. En la molienda seca, se muelen y se usan granos enteros. La molienda humeda proporciona una buena separacion de germen y harina (granulos de almidon y protefna) y se aplica a menudo en ubicaciones donde el hidrolizado de almidon se usa en la produccion de jarabes. Tanto la molienda seca como la humeda son bien conocidas en la tecnica del procesamiento de almidon y se contempla igualmente para el proceso de la invencion.

[0057] El material que contiene almidon se puede reducir en tamano de partfcula, preferiblemente por molienda seca o humeda, para exponer mas area de superficie. En una forma de realizacion, el tamano de partfcula es de entre 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente 0,1-0,5 mm, o de modo que al menos el 30%, preferiblemente al menos el 50%, mas preferiblemente al menos el 70%, aun mas preferiblemente al menos el 90% del material que contiene almidon se ajuste a traves de un tamiz con un filtro de 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente un filtro de 0,1 -0,5 mm.

Organismos fermentadores

[0058] El termino "organismo fermentador" se refiere a cualquier organismo, incluidos organismos bacterianos y fungicos, incluidos levadura y hongos filamentosos, adecuados para producir un producto de fermentacion deseado. Los organismos fermentadores especialmente adecuados segun la invencion son capaces de fermentar, es decir, convertir azucares, tales como glucosa, fructosa, maltosa, xilosa, manosa y/o arabinosa, directa o indirectamente en el producto de fermentacion deseado. Ejemplos de organismos fermentadores incluyen organismos fungicos, tal como levadura. La levadura preferida incluye cepas del genero Saccharomyces, en particular una cepa de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces uvarum; una cepa de Pichia, en particular Pichia stipitis o Pichia pastoris; una cepa del genero Candida, en particular una cepa de Candida utilis, Candida arabinofermentans, Candida diddensii, Candida sonorensis, Candida shehatae, Candida tropicalis o Candida boidinii. Otras levaduras contempladas incluyen cepas de Hansenula, en particular Hansenula polymorpha o Hansenula anomala; cepas de Kluyveromyces, en particular Kluyveromyces marxianus o Kluyveromyces fagilis, y cepas de Schizosaccharomyces, en particular Schizosaccharomyces pombe.

[0059] En una forma de realizacion, el organismo fermentador es un organismo fermentador de azucar C6 (hexosa), tal como una cepa de, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.

[0060] En relacion especialmente con la fermentacion de materiales derivados de lignocelulosa, tambien se contemplan los organismos fermentadores de azucar C5 (pentosa). La mayorfa de los organismos fermentadores de azucar C5 tambien fermentan azucares C6. Los ejemplos de organismos fermentadores de azucar C5 incluyen cepas de Pichia, tal como de la especie Pichia stipitis. Tambien se conocen bacterias fermentadoras de azucar C5. Tambien algunas cepas de Saccharomyces cerevisae fermentan azucares C5 (y C6). Ejemplos son cepas geneticamente modificadas de Saccharomyces spp que son capaces de fermentar azucares C5 e incluyen aquellas referidas en, por ejemplo, Ho et al., 1998, Applied and Environmental Microbiology, p. 1852-1859 y Karhumaa et al., 2006, Microbial Cell Factories 5:18.

[0061] En una forma de realizacion, el organismo fermentador se anade en la fermentacion de modo que el recuento de organismo fermentador viable, tal como levadura, por ml de medio de fermentacion este en el intervalo de 10 a 10 , preferiblemente de 10 a 10 , especialmente aproximadamente 5x10.

[0062] La levadura disponible comercialmente incluye, por ejemplo, levadura RED STAR™ y ETHANOL RED™ (disponible de Fermentis/Lesaffre, EE.UU.), FALI (disponible de Fleischmann's Yeast, EE.UU.), levadura fresca SUPERSTART y THERMOSACC™ (disponible de Ethanol Technology, WI, EE.UU.), BIOFERM AFT y XR (disponible de NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EE.UU.), GERT STRAND (disponible de Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM Specialties).

[0063] El organismo fermentador capaz de producir un producto de fermentacion deseado de azucares fermentables, incluidos glucosa, fructosa, maltosa, xilosa, manosa y/o arabinosa, se cultiva preferiblemente bajo condiciones precisas a una velocidad de crecimiento particular. Cuando el organismo fermentador se introduce en/se anade al medio de fermentacion, el organismo fermentador inoculado pasa a traves de varias etapas. Inicialmente no se produce crecimiento. Este periodo se denomina la "fase de latencia" y se puede considerar un periodo de adaptacion. Durante la fase siguiente denominada la "fase exponencial", la velocidad de crecimiento aumenta gradualmente. Despues de un periodo de crecimiento maximo, la velocidad cesa y el organismo fermentador entra en la "fase estacionaria". Despues de un periodo de tiempo adicional, el organismo fermentador entra en la "fase de muerte" donde desciende el numero de celulas viables.

Productos de fermentacion

[0064] El termino "producto de fermentacion" se refiere a un producto producido en un proceso que incluye una etapa de fermentacion usando un organismo fermentador. Los productos de fermentacion contemplados segun la invencion incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); acidos organicos (por ejemplo, acido cftrico, acido acetico, acido itaconico, acido lactico, acido gluconico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoacidos (por ejemplo, acido glutamico); gases (por ejemplo, H² y CO²); antibioticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B¹², beta-caroteno); y hormonas.

[0065] En una forma de realizacion preferida, el producto de fermentacion es etanol, por ejemplo, etanol combustible; etanol para beber, es decir, bebidas espirituosas neutrales potables; o etanol industrial o productos usados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), industria lactea (por ejemplo, productos lacteos fermentados), industria del cuero e industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferidos incluyen cerveza ale, cerveza stout, cerveza porter, cerveza lager, biters, licores de malta, cerveza happoushu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza baja en alcohol, cerveza baja en calorias o cerveza ligera.

Fermentacion

[0066] Los azucares derivados de material vegetal usados en la fermentacion en un proceso de la invencion se pueden derivar a partir de material que contiene almidon y/o material que contiene lignocelulosa. Las condiciones de fermentacion se determinan en funcion de, por ejemplo, el tipo de material vegetal, los azucares fermentables, el organismo fermentador y/o el producto de fermentacion deseado. Un experto en la tecnica puede determinar facilmente las condiciones de fermentacion adecuadas. La fermentacion puede, segun la invencion, realizarse en condiciones usadas de forma convencional. Los procesos de fermentacion preferidos son los procesos anaerobicos.

Fermentacion de azucares derivados de materiales que contienen almidon

[0067] Como se ha mencionado anteriormente, se pueden usar tipos diferentes de organismos fermentadores para fermentar azucares derivados a partir de material que contiene almidon. Las fermentaciones se realizan a menudo usando levadura, tal como Saccharomyces cerevisae, como organismo fermentador. Sin embargo, tambien se pueden usar bacterias y hongos filamentosos como organismos fermentadores. Algunas bacterias tienen una temperatura de fermentacion optima mas alta que, por ejemplo, Saccharomyces cerevisae. Por lo tanto, las fermentaciones pueden, en tales casos, realizarse a temperaturas tan altas como 75 °C, por ejemplo, entre 40 y 70 °C, tal como entre 50 y 60 °C. Sin embargo, tambien se conocen bacterias con una temperatura optima significativamente inferior hasta alrededor de temperatura ambiente (alrededor de 20 °C). Se pueden encontrar ejemplos de organismos fermentadores adecuados en la seccion "organismos fermentadores " anterior.

[0068] Para la produccion de etanol usando levadura, la fermentacion puede, en una forma de realizacion, seguir durante 24 a 96 horas, en particular durante 36 a 72 horas. En una forma de realizacion, la fermentacion se realiza a una temperatura de entre 20 a 40 °C, preferiblemente de 28 a 36 °C, en particular alrededor de 32 °C. En una forma de realizacion, el pH es de pH 3 a 6, preferiblemente alrededor de pH 4 a 5.

[0069] Se contempla especialmente la hidrolisis/sacarificacion y fermentacion simultaneas (mencionada como "SSF") donde no hay fase de retencion separada para la hidrolisis/sacarificacion, lo que se refiere a que la(s) enzima(s) hidrolizante(s), el/los organismo(s) de fermentacion y la protefna calmodulina se pueden anadir juntos. Sin embargo, se debe entender que la protefna de calmodulina tambien se puede anadir de forma separada. Cuando la fermentacion se realiza simultaneamente con la sacarificacion (es decir, SSF) la temperatura es preferiblemente de entre 20 y 40 °C, preferiblemente de 28 a 36 °C, en particular alrededor de 32 °C cuando el organismo de fermentacion es una cepa de Saccharomyces cerevisiae y el producto de fermentacion deseado es etanol.

[0070] Otros productos de fermentacion se pueden fermentar a temperaturas conocidas por la persona experta en la tecnica que sean adecuadas para el organismo fermentador en cuestion.

[0071] El proceso de la invencion se puede realizar como un proceso por lotes o como uno continuo. El proceso de fermentacion de la invencion se puede llevar a cabo en un sistema de ultrafiltracion donde la fraccion retenida se mantiene bajo recirculacion en presencia de solidos, agua y el organismo fermentador, y donde el permeato es el producto de fermentacion deseado que contiene lfquido. Se contempla igualmente si el proceso se lleva a cabo en un reactor de membrana continuo con membranas de ultrafiltracion y donde la fraccion retenida se mantiene bajo recirculacion en presencia de solidos, agua, el organismo fermentador y donde el permeado es el producto de fermentacion que contiene lfquido.

[0072] Despues de la fermentacion, el organismo fermentador se puede separar de la suspension fermentada y reciclarse.

[0073] Las fermentaciones se realizan tfpicamente a un pH en el intervalo de entre 3 y 7, preferiblemente de pH 3,5 a 6, tal como alrededor de pH 5. Las fermentaciones estan en progreso tfpicamente durante 24-96 horas.

Metodos y procesos segun la invencion

[0074] El aspecto principal segun la presente invencion se refiere a procesos para hidrolizar material que contiene almidon a azucares y fermentar posteriormente los azucares a alcohol, particularmente etanol, donde una xilanasa GH5 de la subfamilia 35 esta presente durante la hidrolisis. Los diferentes procesos y condiciones del proceso se han descrito anteriormente.

[0075] Un aspecto particular de la invencion se refiere a un proceso para producir productos de fermentacion a partir de material que contiene almidon que incluye las etapas de:

a) licuefaccion del material que contiene almidon usando una alfa-amilasa:

b) sacarificacion del material licuado usando una glucoamilasa;

c) fermentacion usando un organismo fermentador, donde la sacarificacion se realiza en presencia de una xilanasa GH5, donde la xilanasa GH5 se selecciona de la subfamilia 35.

[0076] En una forma de realizacion particular, el material que contiene almidon incluye mafz, granos de mafz, trigo, centeno, cebada, triticale, sorgo, pasto varilla, mijo, mijo perla, panizo o en una forma procesada tal como granos de mafz molidos, trigo molido, centeno molido, cebada molida, triticale molido, mafz molido, mafz desgrasado, mafz desgrasado desalmidonado, sorgo molido, pasto varilla molido, mijo molido, panizo molido, mijo perla molido.

[0077] Particularmente, el material a base de almidon incluye mafz, sorgo, trigo, centeno, cebada o triticale.

[0078] Las xilanasas GH5 son particularmente eficaces sobre xilanos altamente ramificados y asf, en una forma de realizacion, el material que contiene almidon incluye xilano altamente ramificado.

[0079] Las xilanasas GH5 se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en la subfamilia 21, 34 o 35.

[0080] En una forma de realizacion especffica, la xilanasa GH5 de la subfamilia 35 se selecciona de la xilanasa representada por los aminoacidos 37 a 573 de la SEQ ID N.°: 2, o una xilanasa GH5 que tiene al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% de identidad con los aminoacidos 37 a 573 de la SEQ ID N.°: 2.

[0081] En otra forma de realizacion especffica, la xilanasa GH5 de la subfamilia 35 se selecciona de la xilanasa representada por los aminoacidos 36 a 582 de la SEQ ID N.°: 4, o una xilanasa GH5 que tiene al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% de identidad con los aminoacidos 36 a 582 de la SEQ ID N.°: 4.

[0082] El producto de fermentacion es, en una forma de realizacion, un alcohol, particularmente etanol.

[0083] La sacarificacion y la fermentacion se pueden realizar separada o simultaneamente. El organismo fermentador es preferiblemente una Saccharomyces sp., mas particularmente Saccharomyces cerevisiae. Las cepas de levadura comerciales adecuadas disponibles se han descrito en la presente en la seccion "organismos fermentadores".

[0084] La presente invencion se describe adicionalmente mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Medios y soluciones

Preparacion de mafz desalmidonado (MDA)

[0085] Se mezclaron 107 kg de mafz molido (<10 mm) en un tanque con 253 kg de agua del grifo a 53 °C para hacer una suspension. La temperatura de la suspension fue 47 °C y el pH 5,9. El pH se ajusto a 6,15 con 1 l de 1 N de NaOH y el tanque se calento luego a 95 °C. Se anadieron 1,119 kg de alfa-amilasa Termamyl® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) a 52 °C y se incubo durante 80 minutos a 95 °C. El pH medido al final de la incubacion fue 6,17. Se anadio agua del grifo frfa a la suspension y la suspension se centrifugo y decanto 3 veces usando un decantador Westfalia CA-225-110 (4950±10 rpm, flujo ~600 l/h) lo que dio 64,5 kg de residuo. Luego se recogio el residuo, se congelo y se liofilizo para proporcionar 17,1 kg de mafz desalmidonado (MDA).

Preparacion de mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA)

[0086] Se anadieron 500 ml de acetona a 100 gramos de mafz desalmidonado, preparado como se ha descrito anteriormente. La suspension se agito durante 5 minutos y se dejo asentar. La acetona se decanto y el procedimiento se repitio 2 veces. El residuo se seco al aire durante toda la noche para proporcionar mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA) que se almaceno a temperatura ambiente.

Preparacion de sorgo desalmidonado

[0087] Las semillas de sorgo entero se molieron y tamizaron y una fraccion por debajo de 0,5 mm se uso para un procesamiento posterior. La fraccion tamizada se suspendio en 25 mM de NaOAc pH 5,5 al 20% de materia seca y se desalmidono. El desalmidonado implico una primera etapa a 85 °C con 500 ppm de alfa-amilasa Termamyl SC (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) durante 20 min seguida de una incubacion durante toda la noche usando 250 ppm de Attenuzyme Flex (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) a 65 °C. La suspension se centrifugo y se decanto el lfquido. Despues de esto, se realizo otro desalmidonado anadiendo agua MilliQ y 200 ppm de Termamyl SC y 200 ppm de Attenuzyme Flex e incubando durante toda la noche a 65 °C.

[0088] La fibra de sorgo se separo del lfquido por filtracion al vacfo a traves de un filtro de fibra de vidrio Whatman F. La torta de filtracion se lavo luego varias veces con exceso de agua para eliminar azucares solubles. Finalmente, la fibra de sorgo desalmidonado se seco en un horno a 65 °C y la fibra seca se molio rapidamente en un molinillo de cafe de modo que el tamano de partfcula fue en general menos de 1 mm.

Preparacion de goma de fibra de mafz

Desalmidonado de mafz

[0089] Se mezclaron 107 kg de maiz premolido (<1,0 mm) con 253 kg de agua a 53 °C. La mezcla se calento a 95 °C y el pH se ajusto a 6,2 con 1 M de NaOH. Se anadieron 1,12 kg de Termamyl 120 L (una alfa amilasa comercial disponible de Novozymes A/S) y la reaccion se mantuvo a alrededor de 90 °C durante 3 h. Despues de 3 h, se anadio agua fria hasta un peso de reaccion total de 600 kg. La separation de solidos y liquidos se realizo con un decantador Westfalia, CA-225-110, 4950 rpm, flujo 600 l/hora. La fraction de fibra solida se resuspendio y separo dos veces con agua hasta un peso total de 600 kg seguido de una separacion como se ha descrito anteriormente. La fraccion de fibra final se dividio en partes menores y se liofilizo durante 3-4 dias.

[0090] Termamyl 120 L es una alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, sin embargo, tambien se pueden usar otras alfa-amilasas acidas que muestran buena estabilidad a la temperatura. Los ejemplos incluyen alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus, que tienen una deletion doble que corresponde a delta(181-182) y ademas incluyen una sustitucion N193F (tambien denominada I181* G182* N193F) en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la alfa-amilasa BSG de tipo salvaje expuesta en la SEQ ID N.°: 3 descrita en WO 99/19467. Extraction de goma de fibra de maiz

[0091] Se anadieron 20 g de maiz desalmidonado a 200 ml de agua MilliQ™ hirviendo junto con 0,8 g de NaOH y 0,8 g de Ca(OH)2. La mezcla se mantuvo durante 1 hora a 96 °C y luego se centrifugo durante 20 min a 6000 g.

[0092] El sobrenadante tenia un aspecto lechoso y graso y, por lo tanto, las grasas se extrajeron mediante agitation con hexano (1 parte de hexano a 4 partes de goma de fibra de maiz). Despues de un tiempo de reposo, el hexano se elimino mediante pipeteo.

[0093] Se realizo una 2a extraccion (CFG2) disolviendo el granulado en 200 ml de 1 M de NaOH. La mezcla se mantuvo durante 1 hora a 96 °C y luego se centrifugo durante 20 min a 6000 g y el sobrenadante se ajusto a pH 6 con 4 M de HCl.

[0094] Ambas fracciones de CFG se concentraron usando un rotavapor y se precipitaron en EtOH a una concentration final del 90%. El sedimento del NaOH 0,1 M se llamara de ahora en adelante CFG1. Debido al alto pH en un extracto en 1 M de NaOH (CFG2), esta fraccion se dializo en una probeta de 2 l con agua desionizada con el grifo goteando durante toda la noche usando una membrana de dialisis de 3 kDa.

[0095] Antes de las pruebas de aplicacion, tanto CFG1 como CFG2 se centrifugaron a 25000 g durante 25 min y se filtraron a traves de un filtro de jeringa de 0,44 pm. Se determino la materia seca en las fracciones CFG2 con un Mettler Toledo HR73.

Ensayos

Ensayo de xilosa

[0096] Se preparo una curva estandar de xilosa de 0 a 125 pg de xilosa/ml a partir de una solution madre de 2,5 mg de xilosa/ml (preparada disolviendo 0,125 g de xilosa en 50 ml de agua desionizada).

[0097] Principio de ensayo. La interconversion de las formas anomericas a y p de la D-xilosa esta catalizada por la xilosa mutarrotasa (XMR) usando el kit de ensayo de D-xilosa de Megazyme International Ireland. La p-D-xilosa se oxida por NAD+ a acido D-xilonico en presencia de ft-xilosa deshidrogenasa (p-XDH) a pH 7,5. La cantidad de NADH formada en esta reaccion es estequiometrica con la cantidad de D-xilosa y se mide por el aumento de la absorbancia a 340 nm.

Ejemplo 1: clonacion de xilanasas GH5

Cepas donadoras

[0098] La xilanasa de Acetivibrio cellulolyticus CD2 se identified en parte de su secuencia de genoma publico como se publico originalmente bajo el numero de acceso UniProt: E1KC96 (Lucas S., Copeland A., Lapidus A., Cheng J.-F., Bruce D., Goodwin L., Pitluck S., Land M.L., Hauser L., Chang Y.-J., Jeffries C., Mouttaki H., He Z., Zhou J., Hemme C.L., Woyke T.J.; "The draft genome of Acetivibrio cellulolyticus CD2."; enviado (ago-2010) a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ). La xilanasa tambien se ha publicado en Hemme CL, Mouttaki H, Lee YJ, Zhang G, Goodwin L, Lucas S, Copeland A, Lapidus A, Glavina del Rio T, Tice H, et al.: Sequencing of multiple clostridial genomes related to biomass conversion and biofuel production. J Bacteriol 2010, 192(24): 6494-6496. Uniprot: E1KC96 es la SEQ ID N.°: 7 y la SEQ ID N.°: 8 son ambas xilanasas GH5_34.

[0099] La xilanasa de las cepas Paenibacillus sp. 18054 (SEQ ID N.°: 3 y 4) y Paenibacillus illinoisensis (SEQ ID N.°: 1 y 2) se identificaron por secuenciacion aleatoria del genoma. Ambas xilanasas pertenecen a la familia GH5_35. Las cepas se aislaron a partir de una muestra termal de Nueva Zelanda en 1991. P. illionensis esta depositada como DSMZ bajo el numero de acceso DSM16232.

[0100] La xilanasa del metagenoma de estiercol de elefante (SEQ ID N.°: 5 y 6) pertenece a la familia GH5_21 y se obtuvo por secuenciacion profunda de un extracto de metagenoma. Se uso el estiercol de un elefante asiatico hembra de seis anos (de nombre "Kandy") que vivfa en el jardfn zoologico de Hamburgo, Alemania. El aislamiento del ADN se realizo con el kit QIAamp d Na Stool kit de Qiagen (Hilden, Alemania) como se describe en el protocolo del fabricante.

[0101] La secuenciacion del genoma, el ensamblaje posterior de las lecturas y el descubrimiento del gen (es decir, la anotacion de las funciones del gen) las conoce el experto en la tecnica y el servicio se puede comprar comercialmente.

Ejemplos de clonacion

[0102] En base a las secuencias de nucleotidos mencionadas en la seccion/el ejemplo "cepas donadoras", se sintetizo y compro comercialmente un gen sintetico con optimizacion de codones por xilanasa. Se clono una version trimodular truncada de Uniprot: E1KC96 (A31-P650) y se denomina de aquf en adelante SEQ ID N.°: 7.

[0103] El proceso de optimizacion y la clonacion de los genes sinteticos comprados se subclonaron usando los sitios de restriccion Clal y Mlul en un vector de expresion de Bacillus como se describe en WO 12/025577. Las xilanasas se expresaron con una senal de secrecion de Bacillus clausii (BcSP; con la siguiente secuencia de aminoacidos: MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA, originada a partir de la proteasa AprH de B. clausii). La BcSP sustituyo todas las senales de secrecion nativas en todos los genes respectivamente.

[0104] Aguas abajo de la secuencia BcSP se introdujo una secuencia de etiqueta de afinidad para facilitar el proceso de purificacion (etiqueta de polihistidina; con la siguiente secuencia de aminoacidos: HHHHHHPR para la xilanasa del metagenoma de estiercol de elefante, Paenibacillus sp. 18054 y Acetivibrio cellulolyticus y HQHQHQHPR para la xilanasa de Paenibacillus illinoisensis, respectivamente). El gen que se expreso, por lo tanto, comprendfa la secuencia BcSP seguida de la secuencia de la etiqueta de polihistidina seguida de la secuencia de la xilanasa de tipo salvaje madura.

[0105] Los plasmidos de expresion finales (BcSP-etiqueta de polihistidina-xilanasa) se transformaron individualmente en un huesped de expresion de Bacillus subtilis. Los genes de fusion de BcSP y xilanasa se integraron por recombinacion homologa en el genoma de la celula huesped de Bacillus subtilis tras la transformacion.

[0106] La construccion genica se expreso bajo el control de un triple sistema promotor (como se describe en WO 99/43835). El gen que codifica la cloranfenicol acetiltransferasa se uso como productor (como se describe en (Diderichsen et al., 1993, Plasmid 30: 312-315). Los transformantes se seleccionaron en medio agar LB suplementado con 6 microgramos de cloranfenicol por ml. Se selecciono y se cultivo un clon recombinante de Bacillus subtilis con la respectiva construccion de expresion de xilanasa en una mesa vibratoria giratoria en matraces Erlenmeyer con deflectores de 500 ml que contenfa cada uno 100 ml de medios a base de extracto de levadura. Despues de 3-5 dfas de tiempo de cultivo de 30 °C a 37 °C, se recolectaron sobrenadantes que contenfan enzima mediante centrifugacion y las enzimas se purificaron mediante purificacion de etiquetas de polihistidina.

Ejemplo 2: purificacion de xilanasas GH5

[0107] Todas las enzimas marcadas con histidina se purificaron por cromatograffa de metales inmovilizados (IMAC) usando Ni2+ como ion metalico en columnas HisTrap Excel de 5 ml (GE Healthcare Life Sciences). La purificacion se produjo a pH 8 y las protefnas unidas se eluyeron con imidazol. La pureza de las enzimas purificadas se comprobo por SDS-PAGE y la concentracion de cada enzima se determino por absorbancia a 280 nm despues de un intercambio de tampon.

Ejemplo 3: medicion de fibra alimentaria soluble e insoluble en el sustrato de mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA) y correlacion con la xilosa soluble medida despues de la incubacion enzimatica [0108] Se anadieron 400 mg de mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA) a tampon NaOAc (5 ml, pH 5). La mezcla se calento entre 90 y 100 °C, luego se anadio Termamyl 300 DX (100 pl, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y la mezcla se incubo durante 1 hora. Luego se enfrio la mezcla y se anadio amiloglucosidasa de Aspergillus niger (500 pl, numero de catalogo E-AMGDF, para usar en Megazyme Total Starch y Dietary Fiber, Megazyme International Ireland, Wicklow, Irlanda) y las muestras se incubaron durante toda la noche (16 h) a 60 °C. Luego se enfrio la mezcla y se centrifugo a 2500 x g durante 10 min a 5 °C. El sobrenadante se recogio y se anadio tampon NaOAc (5 ml, pH 5) al residuo y se centrifugo a 2500 x g, 10 min, 5 °C. Este procedimiento se repitio dos veces. Luego se recogieron los sobrenadantes, se agruparon y se analizaron para NSP solubles como se describe en A. El residuo se analizo para NSP insolubles como se describe en B.

A: NSP solubles, sobrenadante

[0109] Los sobrenadantes agrupados se diluyeron en un volumen fijo de donde se tomo una alfcuota de 5 ml de sobrenadante. A esta alfcuota se le anadieron 20,1 ml de etanol al 99,9% frfo y la mezcla se mantuvo en hielo durante aprox. 15 min para la precipitacion de los polfmeros con un GP>10. Despues de centrifugar a 2500 x g, 5 °C durante 10 min, el sobrenadante se descarto.

[0110] se anadieron 5 ml de etanol al 80% frfo al sedimento y la mezcla se mantuvo en hielo durante aprox. 15 min. Despues de centrifugar a 2500 x g, 5 °C durante 10 min, el sobrenadante se descarto.

[0111] La hidrolisis acida del precipitado se realizo mediante la adicion de agua MQ (7,9 ml), mioinositol (0,5 ml, estandar interno) y 12M H²SO⁴ (0,3 ml) y autoclavando a 125 °C durante 55 minutos.

B: NSP insolubles, residuo

[0112] El sedimento obtenido despues del tratamiento con AMG se hidrolizo mediante la adicion de agua MQ (74 ml), mioinositol (10 ml, estandar interno) y 12M H²SO⁴ (3 ml) y autoclavando a 125 °C durante 55 minutos.

Analisis por CGL

[0113] Despues de autoclavar, las muestras se redujeron con borohidruro para producir azucares alditol y estos se derivaron mediante acetilacion para volverse volatiles para los analisis por CGL en un instrumento con un detector FID (Pettersson et al, (1995) "Total dietary fiber determined as neutral sugar residues, uronic acid residues, and Klason lignin (the Uppsala method), Collaborative study", J. AOAC Int. 78: 1030-1044). La concentracion de los azucares solubles o insolubles se determino con respecto al mioinositol.

Porcentaje de xilosa solubilizada

[0114] Cuando el MDGDA se incuba con enzima a 40 °C durante 4 horas, la enzima solubiliza el xilano del sustrato y este xilano solubilizado se hidroliza despues aun mas con acido. La xilosa liberada se mide espectrofotometricamente usando un kit de ensayo de D-xilosa (Megazyme, numero de catalogo K-xylose). Esta xilosa (que es en realidad xilano solubilizado por enzimas) se correlaciona entonces con la cantidad de xilosa total del sustrato medida por CGL como se ha descrito anteriormente.

[0115] El MDGDA contiene un 99% de xilosa insoluble y un 1% soluble, en total un 14,81% de xilosa que representa la concentracion de polfmero de xilosa (GP>10) presente en la muestra (MDGDA) segun el analisis. Basandose en la liberacion de xilosa medida por el kit Megazyme que calcula la liberacion en funcion del peso de muestra, la cantidad de xilosa liberada se puede calcular de la siguiente manera: por ejemplo, una liberacion del 1% a partir de 400 mg de muestra equivale a 4 mg de xilosa. En 400 mg de muestra hay 400 mg x 14,81% de xilosa, igual a 59,22 mg de xilosa. La liberacion bruta de xilosa (insoluble soluble) es en ese caso 4 mg/59,22 mg, que representa una liberacion de 6,75 mg de xilosa, pero debe tenerse en cuenta que este valor debe corregirse para la liberacion pasiva obtenida para el control no suplementado con enzima. Este valor corregido se define en la presente como el porcentaje de xilosa solubilizada.

Ejemplo 4: hidrolisis de mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA) con xilanasas GH5

[0116] El mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA, 400 mg) se anadio a una solucion de acetato sodico (0,1 M, 3,9 ml) acuosa que contenfa cloruro de calcio (5 mM) a pH 5 y la mezcla se calento a 40 °C durante 30 minutos. Se anadieron 100 pl de solucion de tampon o de enzima y la muestra se calento a 40 °C durante 4 horas. La muestra se enfrio a 5 °C y se centrifugo (4000 rpm, 5 °C) durante 10 minutos. Se transfirieron 1,7 ml de la muestra a un tubo Eppendorf y la enzima se desactivo calentando a 95 °C durante 10 minutos. Las muestras se congelaron luego hasta que se hidrolizaron.

[0117] El sobrenadante se descongelo y se centrifugo (14000 rpm) durante 5 minutos. El sobrenadante (250 pl) se diluyo con agua MilliQ (250 pl) en tubos de vidrio y se anadio HCl (1,63 M, 2,0 ml). La reaccion se calento a 100 °C durante 1 hora y luego se enfrio en un bano de hielo. Se anadio solucion acuosa de NaOH (1,3 M, 2,5 ml) mientras las muestras se enfriaban en hielo y las muestras se almacenaron a 0-5 °C mientras el contenido de xilosa se analizaba usando el ensayo de xilosa. Los resultados se presentan en las tablas 2, 3 y 4.

Tabla 2: liberacion de xilosa a partir de MDGDA usando xilanasa GH5 de SEQ ID N.°: 2 La tabla 2 muestra la cantidad de xilosa medida despues de la hidrolisis acida de los sobrenadantes (% de materia seca y % de xilosa solubilizada de la xilosa total) cuando se incuba mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA) con la xilanasa GH5 de SEQ ID N.°: 2 a diferentes concentraciones de enzima en comparacion con el blanco y la xilanasa comercial GH11 Ronoxyme WX.

Xilanasa GH5 Conc. [mg Xilosa % de xilosa Significacion2 Desv. Est.

EP/kg] soluble (%) solubilizada1

Blanco 0 0,039 0,3 C 0,004 Ronozyme WX 25 0,101 0,7 C 0,009 (GH11)

SEQ ID N.°: 2 10 0,903 6,2 B 0,116 SEQ ID N.°: 2 25 1,295 9,0 A 0,225 SEQ ID N.°: 2 50 1,200 8,2 A 0,133 1El porcentaje de xilosa solubilizada se calculo como se describe en el ejemplo 3.

2ABC: los valores de mfnimos cuadrados dentro de una columna que no comparten una letra mayuscula difieren significativamente (P<0,05 Tukey-Kramer HSD para todos los pares).

Tabla 3: liberacion de xilosa de MDGDA usando xilanasa GH5 de SEQ ID N.°: 4 La tabla 3 muestra la cantidad de xilosa medida despues de la hidrolisis acida de sobrenadantes (% de materia seca y % de xilosa solubilizada de la xilosa total) cuando se incuba mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA) con la xilanasa GH5 de SEQ ID N.°: 4 a diferentes concentraciones de enzima en comparacion con el blanco y la xilanasa GH11 comercial Ronoxyme WX.

Xilanasa GH5 Conc. [mg Xilosa % de xilosa Significacion2 Desv. Est.

EP/kg] soluble (%) solubilizada1

Blanco 0 0,040 0,3 C 0,001 Ronozyme WX 25 0,101 0,7 C 0,010 (GH11)

SEQ ID N.°: 4 10 0,890 5,9 B 0,018 SEQ ID N.°: 4 25 1,016 7,0 B 0,078 SEQ ID N.°: 4 50 1,340 9,2 A 0,280 1El porcentaje de xilosa solubilizada se calculo como se describe en el ejemplo 3.

2ABC: los valores de mfnimos cuadrados dentro de una columna que no comparten una letra mayuscula difieren significativamente (P<0,05 Tukey-Kramer HSD para todos los pares).

Tabla 4: liberacion de xilosa de MDGDA usando xilanasa GH5 de SEQ ID N.°: 18 La tabla 4 muestra la cantidad de xilosa medida despues de la hidrolisis acida de sobrenadantes (% de materia seca y % de xilosa solubilizada de la xilosa total) cuando se incuba mafz desgrasado desalmidonado (MDGDA) con la xilanasa GH5 de SEQ ID N.°: 6 a diferentes concentraciones de enzima en comparacion con el blanco y la xilanasa GH11 comercial Ronoxyme WX.

[0118] Como se puede observar en las tablas 2, 3 y 4, las xilanasas GH5 son significativamente mejores en la liberacion de xilosa de mafz desgrasado desalmidonado que cualquier blanco de la xilanasa GH11 comercial Ronoxyme WX.

Ejemplo 5: preparacion enzimatica de hidrolizados de goma de fibra de mafz

[0119] Las enzimas purificadas usadas para la hidrolisis fueron SEQ ID N°: 2, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8 (GH5_34 pentamodular de Clostridium thermocellum NzyTech (numero de catalogo (SKU): CR0061, Correia et al. J. Biol. Chem. 2011, 286: 22510-22520)), Pentopan mono, Pulpzyme y Shearzyme. Para los productos comerciales, la xilanasa principal fue producto purificado por cromatograffa de intercambio anionico y se evaluo.

[0120] Todas las reacciones se realizaron con CFG1 con un 3,1% de MS como concentracion final. El ensayo tambien contema 45 mM de tampon MES a pH 6 y las concentraciones de enzima finales evaluadas fueron: 41, 18, 7,3, y 1,8 mg/l durante 2 horas y 41 mg/l durante 24 h a 40 °C para la mayona de las enzimas. La SEQ ID N.°: 7 se evaluo a 30 °C debido a una baja termoestabilidad. Todas las reacciones se detuvieron a 95 °C durante 10 min y se analizaron por HPLC-SEC en un ICS-3000 con deteccion RI (Dionex). Las columnas usadas fueron una precolumna PWXL y una PWXL-3000 y -5000 (Tosoh) conectadas en serie. El eluyente fue 50 mM de NaOAc a pH 5 y el caudal 0,5 ml/min. Los tiempos de retencion se compararon con un estandar de peso molecular de pululano entre 803-1,3 kDa y glucosa, maltotriosa y maltopentosa.

Resultados

[0121] En las siguientes tablas se proporcionan las caractensticas de la goma de fibra de mafz y los respectivos productos producidos por tratamiento enzimatico.

Tabla 5. Caractensticas de la goma de fibra de mafz solubilizada con alcali.

Tabla 6. Caractensticas de los hidrolizados de goma de fibra de mafz producidos usando la actividad principal de la xilanasa GH11 en Pentopan Mono™. Los calculos estan basados en la fraccion por encima de GP2.

Tabla 7. Caractensticas de los hidrolizados de goma de fibra de mafz producidos usando la actividad principal de la xilanasa GH11 en Pulpzyme™. Los calculos estan basados en la fraccion por encima de GP2.

Tabla 8. Caracterfsticas de los hidrolizados de goma de fibra de mafz producidos usando la actividad principal de la xilanasa GH10 en Shearzyme™ 500 L. Los calculos estan basados en la fraccion por encima de GP2.

Tabla 9. Caracterfsticas de los hidrolizados de goma de fibra de mafz producidos usando la xilanasa de la familia GH5_35 de SEQ ID N.°: 2. Los calculos estan basados en la fraccion por encima de GP2.

Tabla 10. Caracterfsticas de los hidrolizados de goma de fibra de mafz producidos usando la xilanasa de la familia GH5_35 de SEQ ID N.°: 4. Los calculos estan basados en la fraccion por encima de GP2.

Tabla 11. Caracterfsticas de los hidrolizados de goma de fibra de mafz producidos usando la xilanasa de la familia GH5_21 de SEQ ID N.°: 6. Los calculos estan basados en la fraccion por encima de GP2.

Tabla 12. Caracterfsticas de los hidrolizados de goma de fibra de mafz producidos usando la xilanasa de la familia GH5_34 de SEQ ID N.°: 7. Los calculos estan basados en la fraccion por encima de GP2.

Tabla 13. Caracterfsticas de los hidrolizados de goma de fibra de mafz producidos usando la arabinoxilanasa pentamodular de la familia GH5_34 de SEQ ID N.°: 8 (disponible de NzyTech). Los calculos estan basados en la fraccion por encima de GP2.

[0122] Los datos de los hidrolizados de goma de fibra de mafz mostraron claramente que todas las xilanasas GH5 evaluadas de las subfamilias GH5_21, GH5_34 y GH5_35 tienen la capacidad de degradar este xilano altamente sustituido. La fraccion GP1-GP2 estaba por debajo del 1% bajo todas las condiciones evaluadas.

[0123] Los dos xilanasas de la familia GH11 evaluadas no degradaron el xilano en absoluto, mientras que la xilanasa GH10 presente en Shearzyme 500 L solo tuvo una capacidad de degradacion de goma de fibra de mafz moderada.

[0124] En base a los resultados anteriores, se evaluaron los efectos de anadir xilanasas GH5 en un proceso de almidon a etanol.

Ejemplo 6: mejora del rendimiento de etanol usando una xilanasa GH5_35 y GH5_21 anadida en la sacarificacion/fermentacion

[0125] La licuefaccion de un mosto de mafz molido se realizo a 85 °C usando una alfa-amilasa comercial, Liquozyme™ SCDS (disponible de Novozymes A/S) segun la tabla a continuacion.

[0126] El mosto licuado se dividio en tres partes y se realizo la sacarificacion y la fermentacion simultaneas segun la tabla a continuacion. Un producto de glucoamilasa comercial, Spirizyme Excel™ (disponible de Novozymes A/S) se uso para la sacarificacion y la levadura fue Ethanol Red™ (disponible de Lallemand). La fermentacion fue seguida por una perdida de peso medida dos veces al dfa y por HPLC al final de la fermentacion. La muestra de control solo contenfa las enzimas glucoamilasas. Ademas, una muestra contenfa glucoamilasa y la xilanasa GH5_35 (U2AGD/SEQ ID N.°: 4) y otra muestra contenfa glucoamilasa y la xilanasa GH5_21 (U2C9W/SEQ ID N.°: 6). El rendimiento de etanol se muestra en la figura 1 y demuestra que la adicion de una xilanasa GH5 aumento el rendimiento de etanol en comparacion con el control. En particular la xilanasa GH5_35 resulto en un aumento de alrededor del 2%.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Proceso para producir productos de fermentacion a partir de material que contiene almidon que incluye las etapas de:

a) licuefaccion del material que contiene almidon usando una alfa-amilasa;

b) sacarificacion del material licuado usando una glucoamilasa;

c) fermentacion usando un organismo fermentador, donde la sacarificacion se realiza en presencia de una xilanasa GH5, donde la xilanasa GH5 se selecciona de la subfamilia 35.

2. Proceso segun la reivindicacion 1, donde el material que contiene almidon incluye mafz, granos de mafz, trigo, centeno, cebada, triticale, sorgo, pasto varilla, mijo, mijo perla, panizo o en una forma procesada tal como granos de mafz molidos, trigo molido, centeno molido, cebada molida, triticale molido, mafz molido, mafz desgrasado, mafz desgrasado desalmidonado, sorgo molido, pasto varilla molido, mijo molido, panizo molido, mijo perla molido.

3. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el material que contiene almidon incluye xilano altamente ramificado.

4. Proceso segun la reivindicacion 1, donde la xilanasa GH5 de la subfamilia 35 se selecciona de las xilanasas representadas por los aminoacidos 37 a 573 de la SEQ ID N.°: 2, los aminoacidos 36 a 582 de la SEQ ID N.°: 4 o una xilanasa que tiene al menos un 75% de identidad con los aminoacidos 37 a 573 de la SEQ ID N.°: 2 o los aminoacidos 36 a 582 de la SEQ ID N.°: 4.

5. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el material vegetal incluye mafz, sorgo, trigo, centeno, cebada o triticale.

6. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el producto de fermentacion es alcohol, particularmente etanol.

7. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el organismo fermentador es levadura, particularmente Saccharomyces sp., mas particularmente Saccharomyces cerevisiae.

8. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las etapas b) y c) se realizan simultaneamente.

9. Utilizacion de una xilanasa GH5 de la subfamilia 35 para producir etanol a partir de material que contiene almidon.

10. Utilizacion segun la reivindicacion 9, donde el material que contiene almidon incluye mafz, sorgo, trigo, centeno, cebada o triticale.