BR112015003124B1 - variantes de glicoamilase de trichoderma reesei, composição enzimática e método de processamento de amido - Google Patents

Abstract

VARIANTES DE GLICOAMILASE DE TRICHODERMA REESEI RESISTENTES À PERDA DE ATIVIDADE RELACIONADA À OXIDAÇÃO E USO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se à descrição de variantes de glicoamilase de Trichoderma reesei (TrGA) que têm propriedades aprimoradas (por exemplo, termoestabilidade aprimorada, atividade específica aprimorada e/ou resistência à perda de atividade relacionada à oxidação). Também são fornecidas composições que compreendem as glicoamilases variantes. Essas composições são úteis em várias aplicações de processo de amido.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[0001] Este pedido reivindica o benefício sobre o pedido de patente provisório US 61/683.007, depositado em 14 de agosto de 2012, cujo conteúdo está aqui incorporado, a título de referência em sua totalidade. Listagem de Sequência

[0002] Uma listagem de sequência que compreende as SEQ ID N°s: 1 a 19 é anexa e aqui incorporada na íntegra, a título de referência.

Campo

[0003] As variantes de glicoamilase de Trichoderma reesei (TrGA) são úteis no processamento do amido, por exemplo, na produção de álcool como um produto final através de um processo simultâneo de sacarificação e fermentação (SSF). As composições que compreendem as variantes TrGA e métodos de uso das variantes TrGA no processamento do amido são fornecidos.

Antecedentes

[0004] As fermentações industriais usam predominantemente a glicose como matéria-prima para a produção de uma grande quantidade de proteínas, enzimas, álcoois, e outros produtos químicos finais. Tipicamente, a glicose é o produto do processamento do amido, que é um processo enzimático realizado convencionalmente em duas etapas que catalisa a quebra de amido, envolvendo liquefação e sacarificação. Durante a liquefação, o amido granular insolúvel é transformado em uma pasta fluida pela adição de água, gelatinizado por calor e hidrolisado por uma alfa-amilase termoestável. Durante a sacarificação as dextrinas solúveis produzidas na liquefação são adicionalmente hi- drolisadas por glicoamilases para produzir açúcares.

[0005] As enzimas glícoamilase (glucano 1,4-a-glico-hidrolases, EC 3.2.1.3) são carboidrases hidrolíticas de ação externa que catalisam a remoção de unidades sucessivas de glicose das extremidades não re- dutoras do amido ou moléculas relacionadas de oligo e polissacarídeos. As glicoamilases podem hidrolisar ligações glicosídicas lineares e rami- ficadas de amido (por exemplo, amilose e amilopectina). As glicoamila- ses são enzimas comercialmente importantes e têm sido usadas em uma ampla variedade de aplicações que requerem a hidrólise do amido. Por exemplo, as glicoamilases são tipicamente usadas para produzir açúcares fermentáveis a partir do substrato amido liquidificado por en- zima. Os açúcares fermentáveis, por exemplo, açúcares de baixo peso molecular, como a glicose, podem então 1) ser convertidos em frutose por outras enzimas (por exemplo, glicose isomerases); 2) cristalizados; ou 3) usados em fermentações para produzir numerosos produtos finais (por exemplo, álcoois, glutamato monossódico, ácido succínico, vitami- nas, aminoácidos, 1,3-propanodiol e ácido láctico). A fermentação e a sacarificação podem ser conduzidas simultaneamente (isto é, um pro- cesso SSF) para se obter mais economia e eficiência.

[0006] As glicoamilases têm sido usadas com sucesso em aplica- ções comerciais há muitos anos. Adicionalmente, várias mutações fo- ram introduzidas nas glicoamilases fúngicas, por exemplo, na glicoami- lase de Thchoderma reesei (TrGA), para acentuar a estabilidade tér- mica e a atividade específica. Ver, por exemplo, WO 2008/045489; WO 2009/048487; WO 2009/048488; e patente US n° 8.058.033. Ain- da existe a necessidade de obtenção de novas variantes de glicoami- lases com mais propriedades desejáveis.

Sumário

[0007] CS4, uma variante de glícoamilase de Tríchoderma reesei (TrGA) que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 5, foi ante- riormente descrita na patente US n° 8.058.033. A CS4 foi obtida pela introdução de cinco substituições (L417V, T430A, Q511H, A539R e N563I) na TrGA que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2. Comparado com a TrGA parental, a CS4 exibe propriedades apri- moradas, por exemplo, termoestabilidade elevada e atividade específi- ca elevada. No entanto, foi demonstrado que tanto a TrGA quanto a CS4 têm uma atividade reduzida após armazenamento a longo prazo. Em alguns casos, essa perda de atividade foi atribuída, entre outras coisas, à oxidação do resíduo M50 das enzimas. A substituição do re- síduo de metionina na posição 50 (M50) da CS4 por glicina (G), fenila- lanina (F), lisina (K) ou tirosina (Y) resulta em variantes resistentes à perda de atividade relacionada à oxidação. Entre essas variantes, aquela carregando a substituição M50Y exibe desempenho equivalen- te à CS4 na produtividade de produto final de SSF e na eficiência da hidrólise DP4+. Consequentemente, essa variante da TrGA, que en- globa as substituições de M50Y, L417V, T430A, Q511H, A539R e N563I da SEQ ID N°: 2, seria vantajosamente útil em várias aplicações de processamento amido.

[0008] A presente descrição está relacionada a uma variante de glicoamilase (1) que tem ao menos 90%, 95%, 97% ou 99% de identi- dade de sequência com a SEQ ID N°: 2, e (2) que compreende substi- tuições de aminoácidos que correspondem às posições: 50, 417, 430, 511, 539 e 563 da SEQ ID N°: 2, ou posições correspondentes em uma glicoamilase parental. Em um aspecto, a variante de glicoamilase tem a substituição de aminoácidos de M50Y, G, F ou K na posição 50 da SEQ ID N°: 2, ou a posição correspondente em uma glicoamilase parental. Em um outro aspecto, a variante de glicoamilase tem a subs- tituição de aminoácidos de M50Y na posição 50 da SEQ ID N°: 2, ou a posição correspondente em uma glicoamilase parental. Em ainda um outro aspecto, as substituições de aminoácidos nas posições 417, 430, 511, 539 e 563 da variante de glicoamilase são: L417V, T430A, Q511H, A539R e N563I, respectivamente.

[0009] Em uma modalidade, a variante de glicoamilase compreen- de a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 6. Em uma outra moda- lidade, a variante de glicoamilase consiste da sequência de aminoáci- dos da SEQ ID N°: 6.

[00010] Em uma modalidade, a variante de glicoamilase pode com- preender adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais que correspondem às posições: 43, 44, 61, 73, 294, 431, 503 ou 535 da SEQ ID N°: 2, ou uma posição correspondente na gli- coamilase parental. Em uma outra modalidade, a variante de glicoami- lase pode compreender uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: I43Q/R, D44C/R, N61I, G73F, G294C, A431L7Q, E503A/V e/ou A535R da SEQ ID N°: 2, ou uma posição equivalente na glicoamilase parental.

[00011] Em um aspecto, a variante de glicoamilase pode exibir ter- moestabilidade elevada ou atividade específica elevada em compara- ção com a glicoamilase parental. Em um outro aspecto, a glicoamilase perde menos atividade na oxidação, quando comparada a uma segun- da variante de glicoamilase que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID N°: 5 sob as mesmas condições.

[00012] Uma composição enzimática que compreende a variante de glicoamilase é fornecida. Uma composição enzimática pode compre- ender adicionalmente uma hexoquinase, uma xilanase, uma glicose isomerase, uma xilose isomerase, uma fosfatase, uma fitase, uma pu- lulanase, uma β-amilase, uma a-amilase, uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, uma trealase, uma iso- amilase, uma enzima redox, uma esterase, uma transferase, uma pec- tinase, uma liase, uma a-glicosidase, uma β-glicosidase, outras hidro- lases, ou uma combinação das mesmas.

[00013] É também fornecido um método de processamento de ami- do que compreende colocar um substrato de amido em contato com a variante de glícoamilase para produzir uma composição que compre- ende glicose. O método pode compreender adicionalmente adicionar uma hexoquinase, uma xilanase, uma glicose isomerase, uma xilose isomerase, uma fosfatase, uma fitase, uma pululanase, uma β- amilase, uma a-amilase, uma protease, uma celulase, uma hemicelu- lase, uma lipase, uma cutinase, uma trealase, uma isoamilase, uma enzima redox, uma esterase, uma transferase, uma pectinase, uma al- fa-glicosidase, uma beta-glicosidase, outras hidrolases, ou uma com- binação das mesmas com o substrato de amido.

[00014] Em um aspecto, o substrato de amido é de trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelo, mandioca, milo, painço, batata, ba- tata-doce, tapioca e qualquer combinação dos mesmos. Em um outro aspecto, o substrato de amido é amido liquefeito, amido gelatinizado ou amido granular. Em um aspecto adicional, o substrato de amido tem cerca de 15% a 50%, cerca de 15% a 30% ou cerca de 15% a 25%.

[00015] Em uma modalidade, a sacarificação do substrato de amido resulta em um xarope de alta glicose. Em uma outra modalidade, o método compreende adicionalmente a fermentação dos açúcares fer- mentáveis em um produto final. O produto final pode ser álcool, ou op- cionalmente etanol. O produto final pode também ser ácidos orgâni- cos, aminoácidos, biocombustíveis e outras substâncias bioquímicas, incluindo, mas não se limitando a, etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glicônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, ácido itacônico e ou- tros ácidos carboxílicos, glucona delta-lactona, eritorbato de sódio, lisi- na, ácidos graxos ômega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol e biodi- esel. Em outra modalidade, a sacarificação e a fermentação são reali- zadas como um processo simultâneo de sacarificação e fermentação (SSF).

[00016] Em uma modalidade, a variante de glicoamilase contem- plada é dosada a uma faixa de cerca de 0,1 a cerca de 2,0, de cerca de 0,2 a cerca de 1,0, ou cerca de 0,2 a cerca de 0,5, ou de cerca de 0,325 GAU por grama de sólidos secos. Em uma outra modalidade, a sacarificação compreende adicionalmente adicionar uma hexoquinase, uma xilanase, uma glicose isomerase, uma xilose isomerase, uma fos- fatase, uma fitase, uma pululanase, uma β-amilase, uma a-amilase, uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cuti- nase, uma trealase, uma isoamilase, uma enzima redox, uma estera- se, uma transferase, uma pectinase, uma alfa-glicosidase, uma beta- glicosidase ou uma combinação das mesmas.

Breve Descrição dos Desenhos

[00017] Os desenhos anexos são incorporados no relatório descriti- vo e fornecem ilustrações não limitadoras das várias modalidades. Nos desenhos:

[00018] As Figuras 1A-1F mostram uma alinhamento por ClustalW da TrGA madura (SEQ ID N°: 2) com as glicoamilases de comprimento total de vários membros do grupo das famílias Trichoderma / Hypo- crea. As glicoamilases de comprimento total são Hypocrea citrine var. americana (SEQ ID N°: 7; ver também SEQ ID N°: 6 da patente US n° 7.413.879); Hypocrea vinosa (SEQ ID N°: 8; ver também SEQ ID N°: 8 da patente US n° 7.413.879); Trichoderma sp. (SEQ ID N°: 9; ver tam- bém SEQ ID N°: 10 da patente US n° 7.413.879); Hypocrea gelatinosa (SEQ ID N°: 10; ver também SEQ ID N°: 12 da patente US n° 7.413.879); Hypocrea orientalis (SEQ ID N°: 11; ver também SEQ ID N°: 14 da patente US nQ 7.413.879); Trichoderma konilangbra (SEQ ID N°: 12; ver também SEQ ID N°: 16 da patente US n° 7.413.879); Tri- choderma sp. (SEQ ID N°: 13; ver também SEQ ID N°: 29 da patente US n° 7.413.879); Trichoderma harzianum (SEQ ID N°: 14; ver tam- bém SEQ ID N°: 31 da patente US n° 7.413.879); Trichoderma longi- brachiatum (SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 33 da patente US n° 7.413.879); Trichoderma asperellum (SEQ ID N°: 16; ver também SEQ ID N°: 35 da patente US nD 7.413.879); Trichoderma strictipilis (SEQ ID N°: 17; ver também SEQ ID N°: 37 da patente US n° 7.413.879); Tri- choderma virens Gv29-8 (SEQ ID N°: 18; ver também Gebank, n° de acesso EHK25059.1); e Trichoderma atroviride IMI 206040 (SEQ ID N°: 19; ver também Gebank, n° de acesso EHK49034.1). Resíduos designados por um asterisco na Figura 1 são resíduos de TrGA que correspondem aos resíduos conservados na SEQ ID NoS: 7-19. Os re- síduos de aminoácidos contemplados para substituições estão em ne- gro. O domínio catalítico da TrGA, a região do ligante e o domínio de ligação ao amido são indicados com várias barras.

[00019] A Figura 2 mostra a atividade preservada da pNPG para TrGA (WT) e a variante CS4 em vários intervalos de tempos do trata- mento com peróxido de hidrogênio. Os experimentos foram realizados, como descrito no Exemplo 1, em pH 4,3.

[00020] A Figura 3 mostra a atividade remanescente da TrGA (WT) e da variante CS4 com tratamento com peróxido de hidrogênio durante 7 horas. Os experimentos foram realizados conforme descrito no Exemplo 1. Os substratos testados incluem pNPG, amilopectina (AP) e amido de batata (referência).

[00021] A Figura 4 mostra a análise por SDS-Page da TrGA (WT) e a variante CS4 no tratamento com peróxido de hidrogênio. Os experi- mentos foram realizados conforme descrito no Exemplo 1.

[00022] As Figuras 5A-B mostram a análise MALDI-TOF/MS na di- gestão em solução (Asp-N) da TrGA (Figura 5A) e CS4 (Figura 5B), com ou sem tratamento com peróxido de hidrogênio. Os experimentos foram realizados conforme descrito no Exemplo 2. Somente a análise da faixa de massa de 1001-2000 Daltons é mostrada, porque a dife- rença não foi identificada dentro de outras faixas. As setas indicam pi- cos mostrando mudanças nas amostras tratadas com peróxido de hi- drogênio.

[00023] As Figuras 6A-B mostram o desempenho total de SSF para TrGA e a variante CS4 com vários graus de oxidação (0%, 50% e 100%).

Descrição Detalhada

[00024] A presente descrição está relacionada a uma variante de glícoamilase que tem uma identidade de sequência de aminoácidos de ao menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% para TrGA (SEQ ID N°: 2). A variante de glícoamilase compreende substituições de aminoácidos que correspondem às posições: 50, 417, 430, 511, 539 e 563 da SEQ ID N°: 2, ou posições correspondentes em uma glícoamilase parental. A substituição de aminoácido na posi- ção 50 é M50Y, G, F ou K, enquanto as substituições de aminoácidos nas posições 417, 430, 511, 539 e 563 são L417V, T430A, Q511H, A539R e N563I. A variante de glícoamilase pode exibir termoestabili- dade elevada e/ou atividade específica elevada em comparação com a glícoamilase parental. A variante de glícoamilase, quando comparada a uma segunda variante de glícoamilase que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 5, pode perder menos atividade na oxi- dação. A variante de glícoamilase pode ser incluída em uma mistura de enzimas para várias aplicações de processamento de amido. Apli- cações exemplificadoras da variante de glícoamilase estão em um processo de sacarificação do amido, por exemplo, a produção de um xarope de alta glicose e a produção de um produto final através da fermentação ou SSF.

[00025] Em alguns aspectos, as modalidades da presente descrição baseiam-se em técnicas e métodos de rotina usados no campo da en- genharia genética e biologia molecular. As fontes bibliográficas a se- guir incluem descrições de metodologia geral útil de acordo com as modalidades: Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a Ed., 1989); Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL (1990) e Ausubel et al., Eds. CURRENT PROTO- COLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994). Exceto onde definido em contrário no presente documento, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado comumente compre- endido pelo versado na técnica à qual pertence esta invenção. Single- ton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a ED., John Wiley e Sons, New York (1994), e Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y., EUA (1991) fornecem um dicionário geral com muitos termos usados nesta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equiva- lentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente descrição, são descritos os métodos e materiais represen- tativos. As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. O títulos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspectos das modalidades, que podem ser compreendidos por referência ao re- latório descritivo com um todo.

Definições e Abreviações

[00026] De acordo com esta descrição detalhada, aplicam-se as seguintes abreviações e definições. Deve-se notar que para uso na presente invenção, as formas em singular "um", "uma", e "o" incluem referências no plural, exceto quando o contexto determinar claramente de outro modo. Dessa forma, por exemplo, a referência a "uma enzi- ma" inclui uma pluralidade de tais enzimas e a referência à "dosagem" inclui a referência a uma ou mais dosagens e equivalentes das mes- mas conhecidas pelos versados na técnica, e assim por diante.

[00027] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técni- cos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significa- do conforme é compreendido pelo versado na técnica. Os seguintes termos são fornecidos abaixo.

Definições

[00028] Para uso na presente invenção, "sequência de aminoáci- dos" é sinônimo de "polipeptídeo" e/ou o termo "proteína". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "pep- tídeo". em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinô- nimo do termo "enzima".

[00029] Para uso na presente invenção, "sequência de nucleotí- deos" ou "sequência de ácidos nucleicos" refere-se a uma sequência de origem genômica, sintética, ou recombinante e pode ser de filamen- to duplo ou filamento único, seja representando o filamento senso ou ou o filamento antissenso. Para uso na presente invenção, o termo "ácido nucleico" pode referir-se a DNA genômico, cDNA, DNA sintéti- co, ou RNA. Os resíduos de um ácido nucleico podem conter qualquer uma das modificações químicas comumente conhecidas e usadas na técnica.

[00030] "Isolado" significa que o material é pelo menos substanci- almente isento de pelo menos um outro componente ao qual o material é naturalmente associado.

[00031] "Purificado" significa que o material está em um estado re- lativamente puro, por exemplo, pelo menos cerca de 80% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, pelo me- nos cerca de 98% puro, ou até pelo menos cerca de 99% puro.

[00032] "Oligossacarídeo" significa uma molécula de carboidrato composta por 3 a 20 monossacarídeos.

[00033] Para uso na presente invenção, "célula transformada" inclui células que foram transformadas pelo uso de técnicas de DNA recom- binante. A transformação ocorre tipicamente pela inserção de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma célula. A sequência de nu- cleotide© inserida pode ser uma sequência de nucleotídeos heterólo- ga, isto é, uma sequência que não é natural à célula que vai ser trans- formada, como uma sequência de nucleotídeos que codifica uma pro- teína de fusão.

[00034] Um ácido nucleico está "ligado de maneira funcional" quan- do ele é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA que codifica um líder secretório (isto é, um peptídeo de sinalização) é ligado de maneira funcional ao DNA que codifica um polipeptídeo, se ele é expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo. Em geral, "ligado de maneira funcional" significa que as sequências de DNA que são li- gadas são contíguas, e, no caso de um líder secretório, contíguas e em quadro de leitura.

[00035] Para uso na presente invenção, "amido" refere-se a qual- quer material que compreende carboidratos de polissacarídeos com- plexos de plantas, compreendidos por amilose e amilopectina com a fórmula (C6H10O5)Xt em que "X" pode ser qualquer número. O termo inclui materiais com base vegetal, como grãos, gramíneas, tubérculos e raízes, e mais especifica mente materiais obtidos a partir de trigo, ce- vada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelos, mandioca, milo, painço, ba- tata, batata-doce e tapioca. O termo "amido" inclui amido granular. O termo "amido granular" refere-se a amido em bruto, isto é, cru, por exemplo, amido que não tenha sido submetido a gelatinização.

[00036] Para uso na presente invenção, "gelatinização do amido" significa solubilização de uma molécula de amido para formar uma suspensão viscosa.

[00037] Para uso na presente invenção, "temperatura de gelatiniza- ção" refere-se à temperatura mais baixa em que ocorre a gelatinização de um substrato de amido. A temperatura exata depende do substrato de amido específico e adicionaimente pode depender de uma varieda- de particular e condições de crescimento de espécies de plantas das quais o amido é obtido.

[00038] "DE" ou "equivalente de dextrose" é um padrão da indústria para medir a concentração de açúcares redutores totais, calculada como a porcentagem dos sólidos totais que foram convertidos em açú- cares redutores. O amido granular que não foi hidrolisado tem um DE que é de cerca de zero (0), e a D-glicose tem um DE de cerca de 100.

[00039] Para uso na presente invenção, "substrato de amido" refe- re-se a um amido granular ou liquefeito obtido com o uso de amido re- finado, grãos integrais ou grãos fracionados.

[00040] Para uso na presente invenção, "amido liquefeito" refere-se a amido que passou através de um processo de solubilização, por exemplo, o processo de liquefação de amido convencional.

[00041] Para uso na presente invenção, "xarope de glicose" refere- se a uma composição aquosa contendo sólidos de glicose. O xarope de glicose terá um DE de pelo menos cerca de 20. Em algumas moda- lidades, o xarope de glicose pode conter não mais que cerca de 21% de água, embora pelo menos cerca de 25% de açúcar redutor calcula- do como dextrose. Em uma modalidade, o xarope de glicose pode in- cluir pelo menos cerca de 90% de D-giicose, e em outra modalidade, o xarope de glicose pode incluir pelo menos cerca de 95% de D-glicose. Em algumas modalidades, os termos "glicose" e "xarope de" glicose são usados de maneira intercambiável.

[00042] "Grau de polimerização (DP)" refere-se ao número de (n) unidades de anidroglucopiranose em um dado sacarídeo. Exemplos de DP1 são os monossacarídeos, como glicose e frutose. Exemplos de DP2 são os dissacarídeos, como a maltose e sacarose.

[00043] Para uso na presente invenção, "açúcares fermentáveis" referem-se a sacarídeos capazes de serem metabolizados sob condi- ções de fermentação. Esses açúcares referem-se tipicamente a glico- se, maltose, e maltotriose (DP1, DP2 e DP3).

[00044] Para uso na presente invenção, "conteúdo total de açúcar" refere-se ao conteúdo total de açúcar presente em uma composição de amido.

[00045] Para uso na presente invenção, "teor de sólidos secos" (DS ou ds) refere-se aos sólidos totais de uma pasta aquosa em uma base de percentagem de sólido seco. O termo "pasta fluida" refere-se a uma mistura aquosa contendo sólidos insolúveis.

[00046] Para uso na presente invenção, "enzima liquefaciente de amido" refere-se a uma enzima que catalisa a hidrólise ou quebra de um polímero de amido. Enzimas liquefacientes exemplificadoras inclu- em alfa-amilases (EC 3.2.1.1).

[00047] "Amilase" significa uma enzima que é, entre outras coisas, capaz de catalisar a degradação de amido.

[00048] O termo "alfa-amilases (EC 3.2.1.1)" refere-se a enzimas endo-ativas que clivam ligações a-D-(1^4) O-giicosídicas dentro da molécula de amido de maneira aleatória. Ao contrário, as enzimas ami- lolíticas com ação exo, como as beta-amilases (EC 3.2.1.2; α-D- (1—>4)-glucano malto-hidrolase) e algumas amilases especificas a cer- tos produtos como a alfa-amilase maltogênica (EC 3.2.1.133) clivam a molécula de amido a partir da extremidade não redutora do substrato. Essas enzimas também foram descritas como aquelas que resultam na exo- ou endo-hidrólise de ligações D-glicosídicas 1,4-a em polissa- carídeos contendo unidades de D-glicose ligadas a 1,4-a. Outro termo usado para descrever essas enzimas é glicogenase. Enzimas exempli- ficadoras incluem a alfa-1,4-glucano 4-glucano hidrolase.

[00049] Para uso na presente invenção, as "glicoamilases" referem- se à classe de amiloglicosidase de enzimas (EC 3.2.1.3, glicoamilase, urn glicohidrolase α-1, 4-D-glucano). Essas são enzimas exo-ativas que liberam resíduos de glicosila das extremidades não redutoras de molé- culas de amilose e/ou amilopectina. As enzimas também são capazes de hidrolisar as ligações a-1, 6 e a-1,3, entretanto, em velocidades bem mais lentas que a hidrólise das ligações α -1,4.

[00050] Para uso na presente invenção, "atividade máxima" refere- se à atividade enzimática medida sob as condições mais favoráveis, por exemplo, em um pH ótimo. Para uso na presente invenção, "pH ótimo" refere-se a um valor de pH, sob o qual a enzima exibe a mais alta atividade com as outras condições permanecendo iguais.

[00051] Para uso na presente invenção, "pró-sequência" refere-se à sequência de aminoácidos entre a sequência de sinais e a proteína madura que é necessária para a secreção da proteína. A clivagem da pró-sequência vai resultar em uma proteína ativa madura.

[00052] A frase "forma madura" de uma proteína ou polipeptídeo refere-se à forma final funcional da proteína ou polipeptídeo derivada do seu precursor. Por exemplo, uma forma madura de uma glicoamila- se tem seu peptídeo de sinalização clivado. Uma forma madura de gli- coamilase pode ser produzida a partir de seu hospedeiro nativo, por exemplo, expressão endógena. Alternativamente, uma forma madura de uma glícoamilase pode ser produzida a partir de um hospedeiro não nativo, por exemplo, por expressão exógena. Uma glícoamilase ex- pressa exogenamente, enquanto mantém a atividade de glícoamilase, pode ter um padrão de glicosilação variado em comparação com a contraparte endógena expressa.

[00053] O termo "parental" ou "sequência parental" refere-se a uma sequência que é nativa ou de ocorrência natural em uma célula hos- pedeira.

[00054] O termo "grupo de família Trichoderma / Hypocrea" refere- se a um membro da família Hypocreaceae incluindo vários anamorfos, como Trichoderma e Gliocladium da ordem Hypocreales, filo As- comycota. Ver o capítulo 12, Alexopoulos, C.J., et al., in INTRODUCTION MYCOLOGY 4a Edição, John Wiley & Sons, NY 1996.

[00055] Como usado aqui, o termo "variante" é usado em referência a glicoamilases que têm algum grau de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de glicoamilase progenitora. Uma variante é similar à sequência progenitora, mas tem pelo menos uma substituição, deleção ou inserção em sua sequência de aminoácidos que as torna diferentes na sequência de uma glicoamilase parental. Em alguns casos, as variantes foram manipuladas ou projetadas para incluir pelo menos uma substituição, deleção, ou inserção em sua se- quência de aminoácidos que as torna diferentes na sequência de uma progenitora. Adicionalmente, uma variante de glicoamilase pode reter características funcionais da glicoamilase progenitora, por exemplo, mantendo uma atividade de glicoamilase que tem pelo menos 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, ou cerca de 90% daquela de glicoamilase progenitora.

[00056] Os termos "termoestável" e "termoestabilidade", com refe- rência a uma enzima, se referem à habilidade da enzima para prender atividade após exposição a uma temperatura elevada. A termoestabili- dade de uma enzima, como de uma enzima amilase, pode ser medida por sua meia-vida (t1/2) determinada em minutos, horas ou dias, duran- te os quais metade da atividade de enzima é perdida sob condições definidas. A meia-vida pode ser calculada mediante a medição de ati- vidade residual de a-amilase após a exposição a (isto é, desafiada por) temperatura elevada.

[00057] Para uso na presente invenção, "hidrólise de amido" refere- se à clivagem de ligações glicosídicas com a adição de moléculas de água.

[00058] Para uso na presente invenção, "sem cozimento" refere-se a um processo de conversão de um substrato de amido granular, por exemplo, amido em bruto, a açúcares fermentáveis sem o processo de liquefação de amido em alta temperatura convencional.

[00059] Para uso na presente invenção, "produto final" ou "produto final desejado" refere-se a uma molécula ou composto no qual um substrato de amido é convertido, por uma enzima e/ou micro- organismo.

[00060] Para uso na presente invenção, "entrar em contato" ou "mesclar" refere-se à colocação da(s) enzima(s) respectiva(s) em es- treita proximidade com o substrato respectivo para permitir que a(s) enzima(s) converta(m) o substrato no produto final. O versado na téc- nica reconhecerá que a mistura das soluções da enzima com os res- pectivos substratos pode afetar o contato ou a mescla.

[00061] "Porcentagem de identidade de sequência" significa que uma variante tem ao menos uma porcentagem determinada de resí- duos de aminoácidos idênticos aos de uma sequência de referência, quando alinhadas com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâme- tros padrão. Ver Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673- 4680. Os parâmetros padrão do algoritmo CLUSTAL W são: Penalidade para abertura de vão: 10,0 Penalidade por extensão da lacuna: 0,05 Matriz do peso da proteína: série BLOSUM Matriz do peso do DNA: IUB Sequências divergentes de retardo %: 40 Distância de separação do vão: 8

[00062] Peso das transições de DNA: 0,50 Lista de resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR

[00063] Uso de matriz negativa: DESLIGADO Alternar penalidades específicas de resíduo: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO Alternar penalidade para separação de vão final DESLIGADO.

[00064] Deleções são contadas como resíduos não idênticos, em comparação com uma sequência de referência. Deleções ocorrendo em quaisquer terminações são incluídas. Por exemplo, uma variante com cinco deleções de aminoácidos na extremidade C-terminal do polipeptí- deo TrGA maduro da SEQ ID N°: 2 teria uma percentagem de identidade de sequência de 99% (594/599 resíduos idênticos * 100, arredondados para o número inteiro mais próximo) em relação ao polipeptídeo maduro. Tal variante seria englobada por uma variante tendo "ao menos 99% de identidade de sequência" com um polipeptídeo TrGA maduro.

[00065] A frase "sacarificação e fermentação simultâneas (SSF)" refere-se a um processo na produção de bioquímicos em que um or- ganismo microbiano, como um micro-organismo etanologênico, e ao menos uma enzima, como uma variante de glícoamilase aqui contem- plada, estão presentes durante a mesma etapa de processo. SSF in- clui a hidrólise contemporânea dos substratos de amido (granulares, tratados a uma temperatura abaixo da gelatinização, liquefeitos ou so- lubilizados) em sacarídeos, incluindo glicose e a fermentação dos sa- carídeos em álcool ou outra substância bioquímica ou biomaterial no mesmo vaso reator.

[00066] O termo "bebida fermentada" refere-se a qualquer bebida produzida por um método compreendendo um processo de fermenta- ção, como uma fermentação microbiana, por exemplo, uma fermenta- ção bacteriana e/ou de levedura.

[00067] "Cerveja" é um exemplo dessa bebida fermentada, e o ter- mo "cerveja" compreende qualquer mosto fermentado produzido por fermentação de um material de origem vegetal contendo amido. Com frequência, a cerveja é produzida exclusivamente a partir de malte ou composto auxiliar, ou qualquer combinação de malte e composto auxi- liar. Exemplos de cervejas incluem: cerveja maltada completa, cerveja fermentada de acordo com a "Reinheitsgebot" (Lei da Pureza da Cer- veja), ale, IPA, lager, amarga, Happoshu (segunda cerveja), terceira cerveja, "dry beer, "near beef', cerveja light, cerveja com baixo teor de álcool, cerveja de baixa caloria, porter, bock, stout, licor de malte, cer- veja não alcoólica, licor de malte não alcoólico e similares, mas tam- bém bebidas alternativas de cereal e malte, como bebidas de malte com sabor de frutas, por exemplo, bebidas de malte com sabor de cí- tricos, como limão, laranja, lima ou de frutas vermelhas, bebidas de malte com sabor de destilados, por exemplo, licor de malte com sabor de vodca, rum ou tequila ou bebidas de malte com sabor de café, co- mo bebidas de malte com sabor de cafeína e similares.

[00068] O termo "malte" refere-se a qualquer grão de cereal malta- do, como cevada ou trigo maltado.

[00069] O termo "composto auxiliar" refere-se a qualquer material de origem vegetal contendo amido e/ou açúcar que não seja malte, como malte de cevada ou de trigo. Exemplos de compostos auxiliares incluem grãos de milho comuns, grãos de milho refinados, levedura tri- turada de cervejaria, arroz, sorgo, amido de milho refinado, cevada, amido de cevada, cevada descascada, trigo, amido de trigo, cereal tor- rado, flocos de cereais, centeio, aveia, batata, tapioca, mandioca e xa- ropes, como xarope de milho, xarope de cana de açúcar, xarope de açúcar invertido, xarope de cevada e/ou de trigo e similares.

[00070] O termo "mingau" refere-se a uma pasta fluida aquosa de qualquer amido e/ou açúcar contendo material de origem vegetal, co- mo grãos para moagem, por exemplo, compreendendo malte de ceva- da moída, cevada moída e/ou outro composto auxiliar ou uma combi- nação dos mesmos, misturado com água posteriormente para ser se- parado em mosto e grãos gastos.

[00071] O termo "mosto" refere-se ao licor não fermentado escorri- do em seguida à extração dos grãos para moagem durante o processo de mistura. Abreviações

[00072] As abreviações seguintes são aplicadas exceto onde indi- cado em contrário: ABTS 2,2'-Azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazoiina-6-sulfônico) sal diamônio AkAA alfa-amilase deAspergilIus kawachii AmyE AmyL AmyR AmyS AnGA alfa-amilase de Bacillus subtilis alfa-amilase deBacillus licheniformis amilase SPEZYME® XTRA alfa-amilase deGeobacillus stearothermophilus glícoamilase deAspergilIus niger BAA alfa-amilase bacteriana cDNA DNA complementar CHCA ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico DE equivalente de dextrose Dl destilado, desionizado DNA ácido desoxirribonucleico DPn grau de polimerização com n subunidades ds ou DS sólidos secos DTT ditiotreitol EC comissão de enzima durante classificação enzimática ESI/MS Ionização por Eletrospray/Espectrometria de Massa FA ácido fórmico g GAU grama unidades de glícoamilase HPLC cromatografia líquida de alta pressão IAA iodoacetamida kg LC/MS quilograma Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa MALDI- ionização dessorção a laser assistida por matriz -  TOF tempo de voo MOPS ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico MRM Monitoramento de Reação Múltipla MT tonelada métrica MtP placa de microtitulação MW peso molecular NCBI Centro Nacional para Informação de Biotecnologia nm nanômetro OD densidade óptica PCR reação em cadeia de polimerase PEG polietileno glicol PI índice de desempenho ppm RNA partes por milhão ácido ribonucleico RO osmose reversa RP fase reversa rpm SSF revoluções por minuto sacarificação e fermentação simultâneas TCA ácido tricloroacético TrGA glicoamilase de Trichoderma reesei w/v peso/volume w/w peso/peso wt tipo selvagem μl microlitro Enzimas em Processamento de Amido Glicoamilase de Trichoderma reesei (TrGA) e Variantes da Mesma

[00073] Comercialmente, as glicoamilases são enzimas muito im- portantes e têm sido usadas em uma ampla variedade de aplicações que exigem a hidrólise de amido (por exemplo, para produzir glicose e outros monossacarídeos a partir do amido). As glicoamilases são usa- das para produzir adoçantes de milho com alto teor de frutose, que compreendem mais de 50% do mercado de adoçantes nos Estados Unidos. Em geral, as glicoamilases podem ser, e comumente são, usadas com alfa-amilases em processos de hidrólise de amido para hidrolisar o amido em dextrinas e então glicose. A glicose pode ser convertida então em frutose por outras enzimas (por exemplo, glicose isomerases); cristalizada; ou usada em fermentações para produzir numerosos produtos finais (por exemplo, ácidos orgânicos, aminoáci- dos, biocombustíveis e outras substâncias bioquímicas, incluindo, mas não se limitando a, etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glicônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, ácido itacônico e outros ácidos car- boxílicos, glucona delta-lactona, eritorbato de sódio, lisina, ácido graxo ômega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol e biodiesel).

[00074] As glicoamilases são produzidas por várias cepas de bacté- rias, fungos, levedura e plantas. Muitas glicoamilases fúngicas são en- zimas fúngicas que são produzidas pelos hospedeiros de maneira ex- tracelular, por exemplo, a partir de cepas de Aspergillus (Svensson et al., Carlsberg Res. Commun., 48: 529-544 (1983); Boel et al., EMBO J. 3: 1097-1102 (1984); Hayashida et al., Agric. Biol. Chem. 53: 923-929 (1989); patente US n° 5.024.941; patente US n° 4.794.175 e WO 1988/09795); Talaromyces (patente US n° 4.247.637; patente US n° 6.255.084; e patente US n° 6.620.924); Rhizopus (Ashikari et al., Agric. Biol. Chem. 50: 957-964 (1986); Ashikari et al., App. Microbio. Bio- tech., 32: páginas 129 a 133 (1989) e patente US n° 4.863.864); Humi- cola (WO 2005/052148 e patente US n° 4.618.579); e Mucor (Houghton-Larsen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 62: 210-217 (2003)). Muitos dos genes que codificam essas enzimas foram clona- dos e expressos em leveduras, fungos e/ou células bacterianas.

[00075] As glicoamilases fúngicas consistem em até três domínios estruturais distintos: um domínio catalítico que é estruturalmente con- servado em todas as glicoamilases, geralmente, seguido de uma regi- ão do ligante que é conectada a um domínio de ligação ao amido. A glicoamilase de Trichoderma reesei QM6a (ATCC, n° de acesso 13631) (TrGA) é conhecida e já foi caracterizada. TrGA compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, que é descrita na patente US n° 7.413.879, por exemplo. A sequência de cDNA que codifica a TrGA de Trichoderma reesei QM6a é apresentada como SEQ ID N°: 4. A TrGA nativa tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1, que inclui (1) um peptídeo de sinalização contendo 20 resíduos de aminoá- cidos (SEQ ID N°: 3, posições de 1 a 20 da SEQ ID N°: 1), e (2) uma pró-sequência contendo 13 resíduos de aminoácidos (posições 21-33 da SEQ ID N°: 1). A clivagem do peptídeo de sinalização e da pró- sequência resultam na clivagem da TrGA madura tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2. Conforme mostrado na Figura 1, o domínio catalítico da TrGA inclui os resíduos 1-453 da SEQ ID N°: 2, o domínio do ligante da TrGA abrange os resíduos 454-490 da SEQ ID N°: 2, e o domínio de ligação ao amido da TrGA abrange os resíduos 491-599 da SEQ ID N°: 2.

[00076] A estrutura da TrGA foi determinada com resolução de 1,8 Angstrom. Ver WO 2009/048488 e WO 2009/048487. Com o uso de coordenadas determinadas, a estrutura foi alinhada com as coordena- das do domínio catalítico da glicoamilase de cepa de Aspergillus awa- mori X100 que foi determinada anteriormente (Aleshin, A.E., Hoffman, C., Firsov, L.M., e Honzatko, R.B. Refined crystal structures of gluco- amylase from Aspergillus awamori var. X100. J. Mol. Biol. 238:, pági- nas 575 a 591 (1994). Ver id. As estruturas dos domínios catalíticos dessas duas glicoamilases sobrepõem-se muito proximamente, e é possível identificar resíduos equivalentes com base nessa sobreposi- ção estrutural. Ver id. Acredita-se, ainda, que todas as glicoamilases compartilham uma estrutura básica. Ver id.

[00077] Conforme descrito na patente US n° 8.058.033, uma ou mais substituições de aminoácido nas seguintes posições da TrGA (SEQ ID N°: 2) pode resultar em variantes tendo termoestabilidade aprimorada e/ou atividade específica aprimorada: 4, 5, 12, 24, 29, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51,61, 70, 73, 75, 76, 94, 100, 108, 114, 116, 119, 122, 124, 125, 137, 143, 146, 148, 169, 171, 172, 175, 178, 180, 181, 208, 211, 228, 242, 243, 245, 292, 294, 297, 309, 310, 313, 314, 315, 316, 317, 321, 340, 341, 350, 353, 356, 363, 368, 369, 375, 376, 395, 398, 401, 408, 409, 412, 415, 417, 418, 421, 430, 431, 433, 436, 451, 503, 511, 535, 539, e/ou 563. As substituições podem ser, por exem- plo, D4L/E/R/S/C/A/Q/W, F5C/M/N/R/S/T/V/W, I12L/R, D24E/L/Y/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S/Q, D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C, Y47W.Y49N, N61D/I/UQ/V/W, Q70R/K/M/P/G/L/F, G73F/C/L/W, Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P, P94L, D100W/I/Q/M/P/A/N, N119P/T/Y/D/E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M, Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T, Y169D/F, Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V, F175H/A/G/R/S/T/C/W/Y, W178A/C/D/E/F/G/H/K/N/R/S/T/V/Y, E180A/C/G/H/I/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y/, V181 E/C/D/G/H/l/P/T/Y/S/L/K/F/A, Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211 C/R/E/A/Y/W/M/H/L/l/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L, R245A/E/M/I/P/V, I292D/H/P/R/T/NA//F/L, G294C/D/E/T/Q/I/A, K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/S/R/W, R309A/C/G/H/I/N/P/Q/S/T/W/Y/L, Y310E/G/L/P/S/W/R/Q, D313Q, V314A/R/N/D/C/E/Q/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y, Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, K341F/D/P/V/G/S, T350S/E/A/N, Q356H/D/E, T363L/R/C/H/W, S368W/D/F/L, S369F, N376Q7T/H/S/V, Y395Q/R/S, A398S/I/T, S401C/V, R408S, N409W/T/K, T412A/H/K/G, L417A/D/E/F/G/I/K/Q/R/S/T/V/W/Y, T430A/E/F/G/H/I/K/M/N/Q/R/V, A431C/E/H/I/L/M/Q/R/S/W/Y, R433H/Q, I436A/T, S451M/T/H, E503A/C/D/H/S/V/W, Q511C/G/H/I/K/TA/, A535E/F/G/K/L/N/P/R/S/TA//W/Y, A539E/H/M/R/S/W e/ou N563/A/C/E/I/K/L/Q/T/V. Entre as posições acima, as posições 43, 44, 61, 73, 294, 417, 430, 431, 503, 511, 535, 539, e 563 parecem mais atraentes porque a maioria delas foram identificadas por triagem em um hospedeiro Trichoderma reesei. Uma das variantes da TrGA des- critas na patente US n° 8.058.033 é CS4 (L417V + T430A + Q511H + A539R + N563I). A CS4 mostra tanto termoestabilidade aprimorada (tendo um PI de 1,95 sobre TrGA) quanto atividade específica aprimo- rada (tendo um PI de pelo menos 1,21 sobre TrGA).

[00078] As variantes de glicoamilase aqui contempladas podem ter uma identidade de sequência de aminoácidos de ao menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com TrGA (SEQ ID N°: 2). A variante de glicoamilase contemplada compreende substituições de aminoácidos que correspondem às posições: 50, 417, 430, 511, 539 e 563 da SEQ ID N°: 2, ou posições correspondentes em uma gli- coamilase parental. A substituição de aminoácidos na posição 50 é M50Y, G, F ou K, enquanto as substituições de aminoácidos nas posi- ções 417, 430, 511, 539 e 563 são L417V, T430A, Q511H, A539R e N563I. A variante de glicoamilase pode exibir termoestabilidade eleva- da e/ou atividade especifica aprimorada em comparação com a glico- amilase parental. A variante de glicoamilase pode perder menos ativi- dade na oxidação, quando comparada a uma segunda variante de gli- coamilase que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 5 sob as mesmas condições.

[00079] A Figura 1 mostra um alinhamento por ClustalW da TrGA madura (SEQ ID N°: 2) com as glicoamilases de comprimento total de vários membros do grupo das famílias Trichoderma / Hypocrea. Essas glicoamilases de comprimento total incluem as da Hypocrea citrine var. americana (SEQ ID N°: 7); Hypocrea vinosa (SEQ ID N°: 8); Trichoderma sp. (SEQ ID N°: 9); Hypocrea gelatinosa (SEQ ID N°: 10); Hypocrea orientalis (SEQ ID N°: 11); Trichoderma konilangbra (SEQ ID N°: 12); Trichoderma sp. (SEQ ID N°: 13); Trichoderma harzianum (SEQ ID N°: 14); Trichoderma longibrachiatum (SEQ ID N°: 15); Trichoderma asperellum (SEQ ID N°: 16); Trichoderma strictipilis (SEQ ID N°: 17); Trichoderma virens Gv29-8 (SEQ ID N°: 18); e Trichoderma atroviride IMI 206040 (SEQ ID N°: 19);

[00080] cada uma das quais tem ao menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 2. Os alinhamentos mostrados na Figura 1 e as relações estruturais determinadas a partir das estruturas de cristal da TrGA e da glicoamilase de A. awamori, por exemplo, podem guiar a construção das variantes de glicoamilase aqui contempladas. Variantes das glicoamilases incluem, mas não se limitam a, aquelas com modificação em um aminoácido selecionada dentre uma substi- tuição, inserção ou deleção de um aminoácido correspondente na SEQ ID N°: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e/ou 19, em adi- ção às substituições contempladas nas posições 50, 417, 430, 511, 539 e 563 da SEQ ID N°: 2, ou posições correspondentes em uma gli- coamilase parental. A correspondência entre as posições na TrGA e nas glicoamilases da SEQ ID N°: 7-19 é determinada com referência ao alinhamento mostrado na Figura 1. As variantes de glicoamilase contempladas podem também incluir, mas não se limitam a, aquelas com 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 modificações em aminoácidos selecionados ale- atoriamente. As modificações em aminoácidos podem ser produzidas com o uso de metodologias bem conhecidas, como mutagênese oligo- dirigida. Produção de Glicoamilase

[00081] As variantes de glicoamilase contempladas podem ser pro- duzidas com o uso da tecnologia do DNA recombinante em várias cé- lulas hospedeiras. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são selecionadas a partir de células bacterianas, fúngicas, vegetais e de leveduras. O termo "célula hospedeira" inclui as células, a progénie das células e os protoplastos criados a partir de células que são usa- das para produzir uma glicoamilase variante de acordo com a descri- ção. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células fúngicas e tipicamente células hospedeiras fúngicas filamentosas. O termo "fungos filamentosos" refere-se a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina (Ver Alexopoulos, C. J. (1962), INTRODUC- TORY MYCOLOGY, Wiley, New York, EUA). Esses fungos são caracteri- zados por um micélio vegetative com uma parede celular composta de quitina, celulose, e outros polissacarídeos complexos. Os fungos fila- mentosos da presente descrição são morfologicamente, fisiologica- mente, e geneticamente distintos de leveduras. O crescimento vegeta- tive por fungos filamentosos ocorre por alongamento da hifa e o cata- bolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Nas modalidades da presente descrição, a célula progenitora fúngica filamentosa pode ser uma célula de uma espécie de, mas não se limitando a, Trichoderma, (por exemplo, Trichoderma reesei, a transformação assexuada de Hypocrea jecorina, anteriormente classificada como T. longíbrachia- tum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzia- num) (Sheir-Neirs et al., (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol, volume 20, páginas 46 a 53; ATCC n° 56765 e ATCC n° 26921); Penicillium sp., Humicola sp. (por exemplo., H. insolens, H. lanuginosa e H. grisea); Chrysosporium sp. (por exemplo., C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por exemplo., A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japoni- cus, A. nidulans, e A. awamori) (Ward et al., (1993) Appl. Microbiol. Bi- otechnol., 39:738-743 e Goedegebuur et al., (2002) Genet 41:89-98), Fusarium sp. (por exemplo, F. roseum, F. graminum, F. cerealis, F. oxysporuim e F. venenatum), Neurospora sp. (N. crassa), Hypocrea sp., Mucor sp. (M miehei), Rhizopus sp. e Emericella sp. (ver também Innis et al., (1985) Sci. 228:21-26). O termo "Trichoderma'' ou ‘'Tricho- derma sp." ou "Trichoderma spp". refere-se a qualquer gênero fúngico anteriormente ou presentemente classificado como Trichoderma. Em outras modalidades, a célula hospedeira será uma célula hospedeira geneticamente manipulada em que os genes nativos foram inativados, por exemplo, por deleção em células fúngicas. Onde é desejado obter uma célula hospedeira fúngica tendo um ou mais genes inativados po- dem ser usados métodos conhecidos (por exemplo, os métodos des- critos nas patentes US noS 5.246.853 e 5.475.101, e WO 1992/06209). A inativação do gene pode ser realizada por deleção completa ou par- cial, pela inativação insercional ou por quaisquer outros meios que apresentem um gene não funcional para o propósito ao qual se destina (de modo que a expressão de uma proteína funcional pelo gene é evi- tada). Em algumas modalidades, quando a célula hospedeira é uma célula de Trichoderma e particularmente um célula hospedeira de T. reesei, os genes cb/?1, cbh2, egll e eg!2 podem ser inativados e/ou tipicamente deletados. Tipicamente, células hospedeiras de Tricho- derma reesei que têm proteínas de deleção quádrupla são apresenta- das e descritas na patente US n° 5.847.276 e WO 2005/001036. Em outras modalidades, a célula é uma protease deficiente ou protease desprovida de cepa.

[00082] Para produzir variantes de glicoamilase contempladas usando a tecnologia de DNA recombinante, um construto de DNA que compreende ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da glicoamilase designada pode ser construído e transferido para, por exemplo, uma célula hospedeira de Trichoderma reesei. O vetor pode ser qualquer vetor que, quando introduzido em uma célula hospedeira de Trichoderma reesei, pode ser integrado no genoma da célula hos- pedeira e pode ser replicada. Faz-se referência ao Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, <www.fgsc.net>) para obter uma lista de vetores. Exemplo adicionais de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook et al., (1989) su- pra, e Ausubel (1987) supra, e van den Hondel et al. (1991) em Ben- nett and Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press páginas 396 428 e patente US n° 5.874.276. O ácido nucleico que codifica a glicoamilase pode estar ligado de maneira funcional a um promotor adequado, que mostra atividade transcricional em célula hospedeira de Trichoderma reesei. O promotor pode ser derivado de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira. Exemplos não limitadores adequados incluem cbh1, cbh2, egl1, egl2. Em uma modalidade, o promotor pode ser um promotor deT. reesei nativo. Tipicamente, o promotor pode ser T reesei cbh1, que é um promotor induzível e encontra-se depositado no GenBank sob o Número de acesso D86235. Um "promotor induzível" pode se referir a um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de de- senvolvimento. Em outra modalidade, o promotor pode ser heterólogo a uma célula hospedeira de T. reesei. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores de genes de glicoamilase de A. awamori e de A. niger(ver, por exemplo, Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol, vo- lume 4, páginas 2306 a 2315 e Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1581- 1585). Também, os promotores do gene xln1 de T reesei e o gene da celobio-hidrolase 1 (cbh1) podem ser usados (EP 137280).

[00083] Em algumas modalidades, a sequência de codificação da glicoamilase pode estar ligada de maneira funcional à sequência de sinais. A sequência de sinalização pode ser o peptídeo de sinalização nativo da glicoamilase (SEQ ID N°: 3, que representa os resíduos 1-20 da SEQ ID N°: 1, a TrGA original de comprimento total, por exemplo). Alternativamente, a sequência de sinais pode ter uma identidade de sequência de pelo menos 90% ou pelo menos 95% com a sequência de sinais nativa. Em modalidades adicionais, uma sequência de sinais e uma sequência de promotor que compreende um construto de DNA ou vetor a ser introduzido na célula hospedeira de T. reesei são deri- vadas da mesma fonte. Por exemplo, em algumas modalidades, a se- quência de sinais pode ser a sequência de sinais de cbhl que está li- gada de maneira funcional ao promotor do cbhl.

[00084] Em algumas modalidades, o vetor de expressão pode tam- bém incluir uma sequência terminadora. Em uma modalidade, a se- quência terminadora e a sequência promotora podem ser derivadas da mesma fonte. Em outra modalidades, a sequência terminadora pode ser homóloga à célula hospedeira. Uma sequência terminadora parti- cularmente adequada pode ser cbhl derivada de T. reesei. Outras terminadoras fúngicas exemplares incluem o terminador de A. niger ou gene da glicoamilase de A. awamori.

[00085] Em algumas modalidades, um vetor de expressão pode in- cluir um marcador selecionável. Exemplos de marcadores selecioná- veis representativos incluem os que conferem resistência antimicrobi- ana (por exemplo, higromicina e fleomicina). Marcadores seletivos nu- tricionais também encontram uso na presente invenção incluindo aqueles marcadores conhecidos na técnica como amdS, argB, e pyr4. Marcadores úteis em sistemas de vetor para a transformação de Tri- choderma são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Finkelstein, capítulo 6 em BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, Mass. (1992), Chap. 6.; e Kinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILA- MENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, Londres, Inglaterra). Em uma modalidade representativa, o mar- cador seletivo pode ser o gene amdS, que codifica a enzima acetami- dase, permitindo que as células transformadas cresçam em acetamida como fonte de nitrogênio. O uso do gene de A. nidulans amdS como marcador seletivo é descrito por exemplo em Kelley et al., (1985) EM- BO J. 4: 475 a 479 e Penttila et al. (1987) Gene 61: 155 a 164).

[00086] Um vetor de expressão de compreende um construto de DNA com um polinucleotídeo que codifica a glicoamilase pode ser qualquer vetor capaz de replicar-se autonomamente em um determi- nado organismo hospedeiro fúngico ou de integrar-se ao DNA do hos- pedeiro. Em algumas modalidades, o vetor de expressão pode ser um plasm ideo. Em modalidades típicas, dois tipos de vetores de expres- são para obtenção da expressão dos genes também são contempla- dos.

[00087] O primeiro vetor de expressão pode compreender sequên- cias de DNA em que o promotor, região de codificação da glicoamila- se, e terminador todos se originam do gene a ser expresso. Em algu- mas modalidades, o truncamento do gene pode ser obtido pela dele- ção das sequências de DNA não desejadas (por exemplo, a codifica- ção de DNA para domínios não desejados) para deixar que o domínio seja expresso sob controle de suas próprias sequências reguladoras da transcrição e tradução.

[00088] O segundo tipo de vetor de expressão é pré-montado e contém sequências necessárias para transcrição de alto nível e um marcador selecionável. Em algumas modalidades, a região de codifi- cação para o gene da glicoamilase ou parte da mesma pode ser inse- rida neste vetor de expressão de propósito geral de modo que esteja sob controle transcricional do promotor do construto de expressão e sequências terminadoras. Em algumas modalidades, os genes ou par- te dos mesmos podem ser inseridos a jusante de um promotor forte, como o promotor cbh1 forte.

[00089] Os métodos usados para ligar o construto de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica a glicoamilase, um pro- motor, um terminador e outras sequências e para inserir os mesmos em um vetor adequado são bem conhecidos na técnica. A ligação po- de ser realizada em geral por ligação em sítios de restrição convenien- tes. Se esses sítios não existirem, ligantes de oligonucleotídeos sinté- ticos são usados de acordo com a prática convencional (ver, Sambro- ok (1989) supra, e Bennett and Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego (1991) páginas 70 a 76.). Adicio- nalmente, vetores podem ser construídos com o uso de técnicas de recombinação conhecidas (por exemplo, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).

[00090] A introdução de um construto de DNA em uma célula hos- pedeira inclui técnicas como a transformação; eletroporação; microin- jeção nuclear; transdução; transfecção, (por exemplo, lipofecção me- diada e transfecção mediada por DEAE-Dextrina); incubação com pre- cipitado de DNA com fosfato de cálcio; bombardeamento de alta velo- cidade com microprojéteis revestidos com DNA; e fusão de protoplas- to. As técnicas de transformação geral são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al., (1987), supra, capítulo 9; e Sambrook (1989) supra, e Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16.53-56). A ex- pressão de proteína heteróloga em Trichoderma é descrita nas paten- tes US n°s 6.022.725; 6.268.328; Harkki et al. (1991); Enzyme Microb. Techno!, volume 13, páginas 227 a 233; Harkki et al., (1989) Bío Tech- nol. volume 7, páginas 596 a 603; EP 244.234; EP 215.594; e Neva- lainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes," em MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong e Berka, Marcel Dek- ker Inc., NY, EUA (1992) páginas 129 a 148).

[00091] Em algumas modalidades, transformantes estáveis geneti- camente podem ser construídos com sistemas de vetor pelos quais o ácido nucleico que codifica a glícoamilase é integrado de maneira es- tável ao cromossomo da cepa hospedeira. Os transformantes podem então ser purificados por técnicas conhecidas.

[00092] Em um exemplo não limitador, os transformantes estáveis incluindo um marcador amdS são distinguidos de transformantes ins- táveis por seu crescimento mais rápido e a formação de colônias circu- lares com um contorno liso, em vez de irregular, em meio de cultura sólido contendo acetamida. Adicionalmente, em alguns casos um teste de estabilidade adicional pode ser feito pelo crescimento dos transfor- mantes e meio não seletivo sólido (isto é, meio sem acetamida), cole- tando esporos deste meio de cultura e determinando a porcentagem desses esporos que germinarão subsequentemente e crescerão em meio seletivo contendo acetamida. Alternativamente, outros métodos conhecidos na técnica podem ser usados para selecionar os transfor- mantes.

[00093] A absorção de DNA na cepa hospedeira de Trichoderma sp. é dependente da concentração do íon cálcio. Em geral, pode ser usado entre cerca de 10 mM de CaCI2e 50 mM de CaCI2em uma solu- ção de absorção. Além da necessidade do íon de cálcio na solução de absorção, outros compostos em geral incluídos estão em um sistema de tamponagem como tampão TE (Tris 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) ou MOPS 10 mM, tampão pH 6,0 (ácido morfolinopropanosulfônico) e polietileno glicol (PEG). Acredita-se que o polietileno glicol atue para fundir as membranas celulares, permitindo assim que os conteúdos do meio sejam liberados dentro do citoplasma da cepa de Trichoderma sp. e o DNA do plasmideo seja transferido para o núcleo. Essa fusão, em geral, deixa cópias múltiplas do DNA do plasmideo integradas den- tro do cromossomo do hospedeiro.

[00094] Usualmente, uma suspensão contendo protoplastos ou cé- lulas de Trichoderma sp. que foram submetidas a um tratamento de permeabilidade em uma densidade de 105 a 107/ml tipicamente, 2 x 106/ml é usada na transformação. Um volume de 100 μl desses proto- plastos ou células em uma solução adequada (por exemplo, 1,2 M de sorbitol; 50 mM CaCI2) são misturados com o DNA desejado. Em ge- ral, uma alta concentração de PEG pode ser adicionada à solução de absorção. Um volume de 0,1 a 1 de 25% de PEG 4000 pode ser adici- onado à suspensão de protoplasto. Também é típico adicionar cerca de 0,25 volumes à suspensão de protoplastos. Aditivos como sulfóxido de dimetila, heparina, espermidina, cloreto de potássio e similares po- dem também ser adicionados à solução de absorção em auxiliar na transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas. Ver, por exemplo, as patentes US noS 6.022.725 e 6.268.328.

[00095] Em geral, a mistura é então incubada a aproximadamente 0°C durante um período de cerca de 10 a 30 minutos. PEG adicional pode então ser adicionado à mistura para acentuar ainda mais a ab- sorção do gene desejado ou da sequência de DNA. Os 25% de PEG 4000 podem ser adicionados em geral em volumes de 5 a 15 vezes o volume da mistura de transformação; Entretanto, volumes maiores e menores podem também ser adequados. 25% de PEG 4000 pode ser tipicamente cerca de 10 vezes o volume da mistura de transformação. Após a adição de PEG, a mistura de transformação pode ser então in- cubada à temperatura ambiente ou em gelo antes da adição de uma solução de sorbitol e CaCI2. A suspensão de protoplastos é então acrescentada adicionalmente em alíquotas derretidas de um meio de crescimento. Este meio de crescimento permite o crescimento de transformantes apenas.

[00096] Em geral, as células são cultivadas em um meio padrão contendo sais e nutrientes fisiológicos (ver, por exemplo, Pourquie, J. et al,, BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, páginas 71 86, 1988 e Ilmen, M. et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306). Um meio comum comercialmente preparado (por exemplo, caldo de Extrato de Malte de Levedura (YM), caldo de Luria Bertani (LB) e caldo de Dextrose Sa- bouraud (SD)) pode também ser útil nas modalidades presentes.

[00097] As condições de cultura também são padrão (por exemplo, as culturas são incubadas a aproximadamente 28°C em meio adequa- do em culturas agitadas ou fermentadores até que sejam alcançados os níveis desejados de expressão da glicoamilase). Depois que o crescimento fúngico foi estabelecido, as células são expostas a condi- ções efetivas para causar ou permitir a expressão da glicoamilase. Nos casos em que a sequência de codificação da glicoamilase está sob o controle de um promotor induzível, o agente indutor (por exem- plo, um açúcar, sal metálico ou microbiano) pode ser adicionado ao meio de cultura a uma concentração efetiva para induzir a expressão da glicoamilase.

[00098] Em geral, a glicoamilase produzida em cultura celular pode ser secretada no meio e pode ser purificada ou isolada, por exemplo, pela remoção de componentes não desejados do meio de cultura celu- lar. Em alguns casos, a glicoamilase pode ser produzida em uma for- ma intracelular, necessitando de recuperação a partir de um lisado de células. Em tais casos, a enzima pode ser purificada a partir das célu- las em que ela foi produzida com o uso de técnicas empregadas roti- neiramente pelos versados na técnica. Exemplos dessas técnicas in- cluem, mas não se limitam a, cromatografia por afinidade (Tilbeurgh et a., (1984) FEBS Lett. 16: 215), métodos cromatográficos de troca de íons (Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36: 37; Fliess et al., (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 314; Bhikhabhai et al, (1984) J. Appl. Biochem. 6: 336; e Ellouz et al., (1987) Chromatography 396: 307), incluindo materiais de troca de íon com alto poder de resolução (Medve et al.» (1998) J. Chromatography A 808: 153), cromatografia de interação hidrofóbica (ver Tomaz and Queiroz, (1999) J. Chromatogra- phy A 865: 123; partição em duas fases (ver Brumbauer, et al., (1999) Bioseparation 7: 287); precipitação com etanol; HPLC em fase reversa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca de cátion, como DEAE, cromatofocalização, SDS-PAGE, precipitação por sulfato de amónio e filtração em gel (por exemplo, Sephadex G-75). Outras Enzimas

[00099] Em modalidades da presente descrição, outra(s) enzima(s) pode(m) estar incluída(s) em uma composição enzimática que compre- ende a variante de glícoamilase contemplada. Adicionalmente, outra(s) enzima(s) pode(m) ser suplementada(s) para a variante de glícoamilase contemplada no processamento de amido, por exemplo, durante sacari- ficação e/ou fermentação. Essas enzimas suplementares podem incluir uma outra glícoamilase, hexoquinase, xilanase, glicose isomerase, xilo- se isomerase, fosfatase, fitase, pululanase, β-amilase, α-amilase, pro- tease, celulase, hemicelulase, lipase, cutinase, trealase, isoamilase, en- zima redox, esterase, transferase, pectinase, alfa-glicosidase, beta- glicosidase, liase ou outras hidrolases. Ver, por exemplo, o documento WO 2009/099783. Os versados na técnica conhecem bem os métodos para obter e/ou usar as enzimas listadas acima. Por exemplo, a variante de glícoamilase contemplada e outra(s) enzima(s) podem ser coexpres- sas, misturadas ou adicionadas separadamente em uma aplicação. A variante de glícoamilase contemplada pode também funcionar de modo sinérgico com as enzimas vegetais que são produzidas endogenamente ou geneticamente modificadas. Adicionalmente, a variante de glicoami- lase contemplada pode funcionar de modo sinérgico com enzimas en- dógenas, manipuladas, secretadas ou não secretadas de um hospedei- ro produzindo o produto final desejado (por exemplo, ácidos orgânicos, aminoácidos, biocombustíveis e outras substâncias bioquímicas, inclu- indo, mas não se limitando a, etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glicônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, ácido itacônico e outros áci- dos carboxílicos, glucona delta-lactona, eritorbato de sódio, lisina, áci- dos graxos ômega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol e biodiesel). Ademais, as células hospedeiras expressando a variante de glicoamila- se contemplada podem produzir substânciasbioquímicas além das en- zimas usadas para digerir as várias matérias-primas. Tais células hos- pedeiras podem ser úteis para processos de fermentação ou sacarifica- ção e fermentação simultâneas para reduzir ou eliminar a necessidade de adicionar enzimas. Alfa-amilases

[000100] As alfa-amilases constituem um grupo de enzimas presen- tes em micro-organismos e tecidos de animais e plantas. Elas são ca- pazes de hidrolisar as ligações alfa-1,4-glicosídicas de glicogênio, amido, polissacarideos relacionados, e alguns oligossacarídeos. Em- bora as alfa-amilases possuam a mesma função catalítica, suas se- quências de aminoácidos variam consideravelmente. A identidade de sequência entre amilases diferentes pode ser virtualmente não exis- tente, por exemplo, caindo abaixo de cerca de 25%. Apesar da varia- ção considerável na sequência de aminoácidos, as alfa-amilases com- partilham um esquema topológico comum como um todo, que foi iden- tificado após as estruturas tridimensionais das alfa-amilases de espé- cies diferentes serem determinadas. A estrutura tridimensional comum revela três domínios: (1) um cilindro "TIM" conhecido como domínio A, (2) uma região de laço longo conhecida como domínio B que é inseri- da dentro do domínio A, e (3) uma região próxima ao C-terminal co- nhecida como domínio C que contém uma beta-estrutura característica com um motivo de Chave-Grega.

[000101] As alfa-amilases comumente usadas para aplicações indus- triais incluem um grupo de alfa-amilases homólogas produzidas por Bacillus spp., incluindo Bacillus licheniformis, Geobacillus stearother- mophilus (conhecido anteriormente como Bacillus stearothermophiíus), Bacillus amyloíiquefaciens, Bacillus sp. NCIB 12289, Bacillus sp. NCIB 12512, Bacillus sp NCIB 12513 e Bacillus sp. DSM 9375, todos os quais são descritos em detalhes nas patentes US n° 6.440.716 e WO 1995/26397. Alfa-amilases úteis também incluem AmyE, uma amilase de Bacillus subtilis, assim como alfa-amilases fúngicas obtidas a partir de cepas de fungos filamentosos, como Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. clavatus, A. kawachi e A. oryzaey Trichoderma sp., Rhizopus sp., Mucor sp., Penicillium sp., Lactobacilli sp. e Streptomuces sp. Beta-amilases

[000102] β-amilases (EC 3.2.1.2) são amilases maltogênicas exoati- vas, que catalisam a hidrólise das ligações 1,4-a-glucosídicas em ami- lopectina e polímeros de glicose relacionados, liberando assim a mal- tose. As β-amilases foram isoladas de várias plantas e micro- organismos. Ver Fogarty et al. (1979) em PROGRESS IN INDUSTRIAL MI- CROBIOLOGY, Vol. 15, páginas 112 a 115. Essas β-amilases têm tem- peraturas ideais na faixa de 40°C a 65°C e pH ideal na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 7,0. β-amilases contempladas incluem, mas não se limitam a, β-amilases da Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Opti- malt™ ME, Optimalt™ BBA (Danisco US Inc.); e Novozym™ WBA (Novozymes A/S). Processamento de Amido Substratos e Matérias-primas de Amido

[000103] Os versados na técnica conhecem bem os métodos dispo- níveis que podem ser usados para preparar substratos de amido para uso nos processos descritos na presente invenção. Por exemplo, um substrato de amido útil pode ser obtido a partir de tubérculos, raízes, caules, legumes, cereais, ou grãos integrais. Mais especificamente, o amido granular é proveniente de plantas que produzem altas quanti- dades de amido. Por exemplo, o amido granular pode ser obtido a par- tir de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sor- go, arroz, ervilhas, feijão, banana, ou batata. O milho contém cerca de 60-68% de amido; A cevada contém cerca de 55-65% de amido; O painço contém cerca de 75-80% de amido; O trigo contém cerca de 60-65% de amido; O arroz polido contém cerca de 70-72% de amido. Os substratos de amido especificamente contemplados são amido de milho, amido de trigo, amido de centeio, amido de sorgo, amido de mandioca, amido de milo, amido de painço, amido de arroz, amido de farelo, amido de batata, amido de batata-doce, amido de tapioca e amido de cevada. O amido proveniente de um grão pode ser moído ou integral e inclui sólidos de milho, como grãos, fibras e/ou sabugo. Ami- do pode ser amido em bruto altamente refinado ou matéria-prima de processos de refinaria de amido. Vários amidos são também comerci- almente disponíveis. Por exemplo, amido de milho pode ser disponível junto à Cerestar, Sigma, e Katayama Chemical Industry Co. (Japão); o amido de trigo pode ser disponível junto à Sigma; o amido de batata doce por ser disponível junto à Wako Pure Chemical Industry Co. (Ja- pão); o amido de batata pode ser disponível junto a Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japão). Moagem

[000104] O substrato de amido pode ser um amido em bruto do grão integral moído, que contém frações não amido, por exemplo, resíduos de germe e fibras. A moagem pode compreender tanto moagem a úmido como moagem a seco. Na moagem a úmido, o grão integral po- de ser encharcado com água e ácido diluído para separar o grão em suas partes componentes, por exemplo, amido, proteína, germe, óleo, fibras de núcleo. A moagem a úmido separa eficientemente o germe e a farinha (isto é, grânulos de amido e proteína) e pode ser especial- mente adequada para a produção de xaropes. Na moagem a seco, os grãos inteiros são moídos até formar um pó fino e processados sem fracionar o grão em suas partes componentes. O grão moído a seco compreenderrá assim quantidades significativas de compostos de car- boidrato não amido, em adição ao amido. A maior parte do etanol é proveniente da moagem a seco. Alternativamente, o amido a ser pro- cessado pode ser uma qualidade de amido altamente refinado, por exemplo, com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99,5% de pureza. Gelatinização e Liquefação

[000105] Para uso na presente invenção "liquefação" ou "liquefazer" significa um processo pelo qual o amido é convertido em dextrinas menos viscosas e solúveis de cadeia mais curta. Este processo envol- ve gelatinização de amido simultaneamente com ou seguida pela adi- ção de alfa-amilases. Enzimas indutoras de liquefação adicional, por exemplo, uma fitase, podem opcionalmente ser adicionadas.

[000106] Em algumas modalidades, o substrato de amido preparado conforme descrito acima pode ser transformado em uma pasta fluida com água. A pasta fluida de amido pode conter amido como uma por- centagem em peso de sólidos secos de cerca de 10 a 55%, cerca de 20 a 45%, cerca de 30 a 45%, cerca 30 a 40%, ou cerca de 30 a 35%. Para otimizar a estabilidade e atividade de alfa-amilase, o pH da pasta fluida pode ser ajustado para o pH ótimo para as alfa-amilases. As al- fa-amilases que permanecem na pasta fluida após a liquefação podem ser desativadas pela diminuição do pH em uma etapa de reação sub- sequente ou pela remoção de cálcio da pasta fluida.

[000107] A pasta fluida de amido mais as alfa-amilases podem ser bombeadas continuamente através de um cozedor a jato, que pode ser aquecido por vapor d'agua a cerca de 85°C até cerca de 105°C. A gelatinização ocorre muito rapidamente sob essas condições, e a ati- vidade enzimática, combinada com forças de cisalhamento significati- vas, iniciam a hidrólise do substrato de amido. O tempo de residência no cozedor a jato é muito breve. O amido parcialmente gelatinizado pode passar por uma série de tubos de retenção mantidos a cerca de 85-105°C e retidos durante cerca de 5 minutos para completar o pro- cesso de gelatinização. Esses tanques podem conter defletores para desencorajar a retro-mistura. Para uso na presente invenção, o termo "liquefação secundária" refere-se à etapa de liquefação subsequente à liquefação primária, quando a pasta fluida é deixada resfriar até a tem- peratura ambiente. Essa etapa de resfriamento pode ser de cerca de 30 minutos a cerca de 180 minutos, por exemplocerca de 90 minutos a cerca de 120 minutos. O grão moído e liquefeito é também conhecido como mistura. Sacarificação

[000108] Após a liquefação, a mistura pode ser adicionalmente hidro- lisada através da sacarificação para produzir açúcares fermentáveis que podem ser usados prontamente em aplicações mais adiante. A sacarifi- cação das presentes modalidades pode ser realizada pela adição de uma variante de glícoamilase conforme descrito acima. A variante de glícoamilase pode ser dosada em uma faixa de cerca de 0,1 a 2,0 GAU /g ds, de cerca de 0,2 a 1,0 GAU /g ds, de cerca de 0,2 a 0,5 GAU /g ds ou a cerca de 0,325 GAU /g ds. A sacarificação pode ser realizada em cerca de 30 a cerca de 60qC, ou cerca de 40 a cerca de 60°C.

[000109] Uma etapa de sacarificação completa pode situar-se tipi- camente na faixa de 24 a 96 horas, 24 a 72 horas, ou 24 a 48 horas. Em algumas modalidades, a etapa de sacarificação e a etapa de fer- mentação são combinadas e o processo é chamado de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[000110] Em algumas modalidades, a etapa de cozinhar ou expor o substrato contendo amido a temperaturas acima da gelatinização tem- perada do amido no substrato podem ser eliminadas. Esses processos de fermentação podem incluir moagem de um grão de cereal ou grão fracionado e a combinação do grão de cereal moído com líquido para formar uma pasta aquosa que é, então, misturada em um único recipi- ente com a variante de glicoamilase aqui contemplada e opcionalmen- te outras enzimas como, mas não se limitando a, alfa amilases, outras glicoamilases e enzimas tendo atividade de hidrólise de amido granu- lar ou atividade intensificadora, e levedura para produzir etanol e ou- tros coprodutos ou produzir outras substâncias bioquímicas usando levedura ou outros hospedeiros de produção. Por exemplo, existem enzimas ou proteínas que parecem intensificar a atividade das celula- ses na celulose (por exemplo, oxidando a celulose). Em alguns casos, a levedura ou outros hospedeiros de produção podem também produ- zir a glicoamilase e/ou outras enzimas. Ver, por exemplo, patente US n° 4.514.496, WO 2004/081193 e WO 2004/080923. Fermentação

[000111] Em algumas modalidades da presente descrição, os açúca- res fermentáveis podem estar sujeitos a condições de fermentação contínua ou por lote. Uma fermentação em batelada clássica é um sis- tema fechado, em que a composição do meio é ajustada no início da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fer- mentação. Dessa forma, no início da fermentação o meio pode ser inoculado com o(s) organismo(s) desejado(s). Nesse método, pode ser permitido que a fermentação ocorra sem a adição de quaisquer com- ponentes no sistema. Tipicamente, uma fermentação em batelada se qualifica como uma "batelada" no que diz respeito à adição da fonte de carbono e com frequência são feitas tentativas de controle de fatores como pH e concentração de oxigênio. As composições de metabólito e biomassa do sistema em batelada alteram-se constantemente até o momento em que a fermentação é interrompida. Dentro das culturas em batelada, as células progridem através um um fase de atraso está- tico para uma fase de crescimento logarítmico, e finalmente para uma fase estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou interrom- pida. Se não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morrem. Em geral, as células na fase logarítmica são responsáveis pe- lo volume de produção do produto final.

[000112] Uma variação do sistema em batelada padrão é o sistema de "fermentação em batelada alimentada", que pode ser usado em al- gumas modalidades da presente descrição. Nesta variação de um sis- tema em batelada típico, o substrato pode ser adicionado em incre- mentos à medida que a fermentação progride. Os sistemas em batela- da alimentados são particularmente úteis quando a repressão de cata- bólitos é apta a inibir o metabolismo das células e onde é desejável ter quantidades limitadas de substrato no meio. A medição da concentra- ção de substrato real nos sistemas em batelada alimentados pode ser difícil e portanto estimada com base nas alterações de fatores mensu- ráveis como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases de resíduos como CO2. Tanto as fermentações em batelada como em ba- telada alimentada são comuns e bem conhecidas na técnica.

[000113] Por outro lado, a fermentação contínua é um sistema aber- to onde um meio de fermentação definido pode ser adicionado conti- nuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicio- nado pode ser removido simultaneamente para processamento. A fermentação contínua em geral mantém as culturas em uma alta den- sidade constante onde as células estão primeiramente em crescimen- to de fase logarítmica. A fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração de produto final. Por exemplo, em uma modalidade, um nutriente limitador como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio pode ser mantido em uma taxa fixa enquanto é permiti- do que todos os outros parâmetros sejam moderados. Em outros sis- temas, vários fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente enquanto a concentração celular, medida pela turbi- dez do meio, pode ser mantida constante. Os sistemas contínuos ten- tam manter condições de crescimento em estado estacionário. Dessa forma, a perda celular devida à remoção do meio precisa ser equili- brada contra a taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modular nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínuos e também técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

[000114] Em outras modalidades, usando os micro-organismos fer- mentadores adequados conforme conhecido na técnica, o produto final da fermentação pode incluir sem limitação álcool, intermediários do ácido ascórbico (por exemplo, gluconato; ácido 2-ceto-L-gulônico; 5- cetogluconato; e 2,5-dicetogluconato); 1,3-propanodiol; aminoácidos aromáticos (por exemplo, tirosina, fenilalanina e triptofano); ácidos or- gânicos (por exemplo, lactato, piruvato, succinato, isocitrato e oxaloa- cetato); aminoácidos (por exemplo, senna e glicina); antibióticos; mi- crobicidas; enzimas; vitaminas; e hormônios. Ver, por exemplo, WO 2008/086811 (fermentação com metanol, etanol, propanol e butanol); WO 2003/066816, patente US π°s 5.254.467 e 6.303.352 (fermentação com 1,3-propanodiol); patentes US n°s RE 37.393, 6.265.190, e 6.596.521 (fermentação com ácido succínico); patente US n° 5.464.760, WO 2003/095659, Mercier et al., J. Chem. Tech. Biotech- nol., 55: 111 a 121, Zhang and Cheryan, Biotechnol. Lett. 13: 733 a 738 (1991), Linko e Javanainen, Enzyme Microb. Technol. 19: 118 a 123 (1996), e Tsai e Moon, Appl. Biochem. Biotechnol. 70 a 72: 417 a 428 (1998) (fermentação por ácido láctico); patentes US n°s 7.320.882, 7.332.309, 7.666.634, e Zhang et al., Appl. Microbiol. Bio- techno!. 77: 355 a 366 (2007) (fermentação de vários aminoácidos). A lista enumerada acima mostra apenas exemplos e o versado na técni- ca estará ciente de um número de micro-organismos de fermentação que pode ser adequadamente usado para obter um produto final dese- jado. Sacarificação e Fermentação Simultâneas (SSF)

[000115] Durante a SSF, as enzimas hidrolisantes são adicionadas junto com o produtor do produto final, comumente um micro- organismo. As enzimas liberam açúcares de baixo peso molecular, isto é, açúcares fermentáveis DP1-3, a partir do substrato de amido, en- quanto o micro-organismo usa simultaneamente açúcares fermentá- veis para crescimento e produção do produto final. Tipicamente, as condições de fermentação são selecionadas para fornecer um pH e temperatura ótimos para favorecer a melhor cinética de crescimento da cepa de células hospedeiras produtoras e condições catalíticas pa- ra as enzimas produzidas pela cultura. Ver, por exemplo, Doran et al., Biotechnol. Progress 9: 533-538 (1993).

[000116] Em modalidades adicionais, o uso de micro-organismos de fermentação adequados conforme conhecido na técnica para produzir o produto final desejado, permite aos versados na técnica serem ca- pazes de ajustar satisfatoriamente as condições de SSF, por exemplo, temperatura, composição de nutrientes, condições de luz, disponibili- dade de oxigênio, etc. Composições que Compreendem as Variantes de Glicoamilase e o Uso das Mesmas

[000117] As variantes de glicoamilase, como contempladas na pre- sente invenção, podem ser usadas nas composições enzimáticas in- cluindo, mas não se limitando a, composições de hidrólise e sacarifi- cação de amido, composições de limpeza e detergente (por exemplo, detergentes de lavanderia, detergentes para lavar louça e composi- ções para limpeza de superfícies duras), composições de fermentação do álcool e composições de ração para animais, por exemplo. Adicio- nalmente, essas glicoamilases podem ser usadas em aplicações de assamento, como na produção de pão e bolo, fermentação, assistên- cia médica, processos de conversão de resíduos têxteis e ambientais, processamento de Biopulp e aplicações de conversão de biomassa.

[000118] Em algumas modalidades, uma composição enzimática que compreende uma glicoamilase como contemplada na presente inven- ção será usada opcionalmente em combinação com qualquer uma ou em qualquer combinação com as seguintes enzimas: hexoquinases, xilanases, glicose isomerases, xilose isomerases, outras isomerases, fosfatases, fitases, pululanases, β-amilases, α-amilases, treaiases, proteases, celulases, hemicelulases, lipases, cutinases, isoamilases, enzimas redox, esterases, transferases, pectinases, alfa-glicosidases, beta-glicosidases, liases, outras glicoamilases e outras hidrolases.

[000119] Em algumas modalidades, a composição enzimática inclui- rá uma alfa-amilase, como alfa-amilases fúngicas (por exemplo, As- pergillus sp.), ou alfa-amilases bacterianas (por exemplo, Bacillus sp. como B. stearothermophilus, B. amyloliquefaciens, B. subtilis e B. li- cheniformis) e variantes e híbridos das mesmas. Em algumas modali- dades, a alfa-amilase é uma alfa-amilase estável em relação a ácidos. Em algumas modalidades, a alfa-amilase é a alfa-amilase de Asper- gillus kawachi (AkAA), ver a patente US n° 7.037.704. Alfa-amilases disponíveis para comercialização contempladas para uso nas compo- sições da descrição são conhecidas e incluem GZYME G997, SPEZYME FRED, SPEZYME XTRA (Danisco US, Inc, Genencor Divi- sion), TERMAMYL 120-L e SUPRA (Novozymes, Biotech.).

[000120] Em algumas modalidades, a composição enzimática inclui- rá uma protease ácida fúngica. Em uma outra modalidade, a protease ácida fúngica é derivada de uma Trichoderma sp e pode ser qualquer uma das proteases descritas em US 2006/0154353, publicada em 13 de julho de 2006, aqui incorporada, a título de referência. Em uma ou- tra modalidade, a composição enzimática incluirá uma fitase de Butti- auxiella spp. (por exemplo, BP-17, ver também variantes descritas na publicação de patente PCT WO 2006/043178).

[000121] Em outras modalidades, as glicoamilases, como contem- pladas na presente invenção podem ser combinadas com outras glico- amilases. Em algumas modalidades, essas glicoamilases serão com- binadas com uma ou mais glicoamilases derivadas de outras cepas de Trichoderma ou variantes de Monascus kaoliang ou de Aspergillus, ou variantes das mesmas, como A. oryzae, A. niger, A. kawachi, A. fumi- gatus, A. terreus e A. awamorí; glicoamilases derivadas de cepas de Humicola ou variantes das mesmas; glicoamilases derivadas de cepas de Talaromyces ou variantes das mesmas, como T. emersonii', glicoa- milases derivadas de cepas de Athelia, como A. rolfsii; ou glicoamila- ses derivadas de cepas de Penicillium, como P. chrysogenum, por exemplo.

[000122] Em particular, as glicoamilases, como contempladas na presente invenção, podem ser usadas para processos de conversão de amido, e particularmente na produção de dextrose para xaropes de frutose, açúcares especiais e em álcool e outros produtos finais (por exemplo, ácidos orgânicos, aminoácidos, biocombustíveis e outras substâncias bioquímicas) a partir da fermentação de substratos con- tendo amido (por exemplo, G.M.A. van Beynum et al., Eds. (1985) STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Marcel Dekker Inc. NY, EUA; ver também patente US n° 8.178.326). Dextrinas produzidas com o uso de composições de glicoamilase variante da descrição podem resultar em produtividade de glicose de ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90% e ao menos 95%. A produção de álcool a partir da fermentação de substratos de amido usando glicoamilases como contempladas na presente invenção pode incluir a produção de álcool combustível ou álcool potável.

[000123] Em algumas modalidades, as variantes de glícoamilase como contempladas na presente invenção terão uso na hidrólise do amido de vários substratos com base vegetal, que são usados para a produção de álcool. Em algumas modalidades, os substratos com ba- se vegetal incluirão milho, trigo, cevada, centeio, milo, arroz, cana de açúcar, batata e combinações dos mesmos. Em algumas modalida- des, os substratos com base vegetal serão material de origem vegetal fracionado, por exemplo, um grão de cereal como milho, que é fracio- nado em componentes como fibra, germe, proteína e amido (endos- perma) (patente US n° 6.254.914 e patente US n° 6.899.910). Métodos de fermentação de álcool são descritos em THE ALCOHOL TEXTBO- OK, A REFERENCE FOR THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES, 3a Ed., Eds. K.A. Jacques et al., 1999, Not- tingham University Press, Reino Unido. Em certas modalidades, o ál- cool será etanol. Em particular, processos de produção de fermenta- ção do álcool são caracterizados como processos de moagem a úmido ou a seco. Em algumas modalidades, a glícoamilase pode ser usada em um processo de fermentação de moagem a úmido e, em outras modalidades, a glícoamilase terá uso em um processo de moagem a seco.

[000124] A moagem de grãos a seco envolve inúmeras etapas bási- cas, que em geral incluem: trituração, cozimento, liquefação, sacarifi- cação, fermentação e separação de líquidos e sólidos para produzir álcool e outros coprodutos. O material de origem vegetal e particular- mente grãos de cereal integral, como milho, trigo ou centeio são moí- dos. Em alguns casos, os grãos podem ser primeiro fracionados em suas partes componentes. O material de origem vegetal moído pode ser triturado para obter uma partícula grossa ou fina. O material de ori- gem vegetal moído pode ser misturado com líquido (por exemplo, água e/ou resíduos de grãos finos) em um tanque. A pasta aquosa é submetida a temperaturas altas (por exemplo, de 90°C a 105°C ou mais) em um cozinhador a jato juntamente com enzimas liquefacientes (por exemplo, alfa-amilases) para solubilizar e hidrolisar o amido em grão em dextrinas. A mistura pode ser resfriada e adicionalmente tra- tada com enzimas de sacarificação, como as glicoamilases menciona- das nesta descrição, para produzir glicose. A mistura contendo glicose pode, então, ser fermentada durante 24 a 120 horas na presença de micro-organismos de fermentação, como micro-organismos que pro- duzem etanol e particularmente levedura (Saccharomyces spp). Os só- lidos na mistura são separados da fase líquida e álcool como etanol e coprodutos úteis, como grãos de destiladores são obtidos.

[000125] A variante de glicoamilase contemplada pode ser um com- ponente de uma composição de fermentação usado em um processo de fermentação, isto é, fabricação de uma bebida de malte fermenta- da. Carboidratos não fermentáveis formam a maior parte dos sólidos dissolvidos na cerveja final. Esse resíduo permanece por causa da in- capacidade das amilases de malte de hidrolisar as alfa-1,6-ligações do amido. Os carboidratos não fermentáveis contribuem com cerca de 50 calorias por 0,35 litro (12 onças) de cerveja. A variante de glicoamilase em combinação com uma glicoamilase e opcionalmente uma pulula- nase e/ou isoamilase, ajuda a converter o amido em dextrinas e açú- cares fermentáveis, reduzindo os carboidratos não fermentáveis resi- duais na cerveja final.

[000126] As principais matérias-primas usadas na fabricação dessas bebidas são água, lúpulo e malte. Além disso, compostos auxiliares como grãos de milho comuns, grãos de milho refinados, levedura tritu- rada de cervejaria, arroz, sorgo, amido de milho refinado, cevada, amido de cevada, cevada descascada, trigo, amido de trigo, cereal tor- rado, flocos de cereais, centeio, aveia, batata, tapioca, mandioca e xa- ropes, como xarope de milho, xarope de cana de açúcar, xarope de açúcar invertido, xarope de cevada e/ou de trigo e similares que pos- sam ser usados como uma fonte de amido.

[000127] Por várias razões, o malte, que é produzido principalmente a partir de variedades selecionadas de cevada, tem o maior efeito so- bre o caráter geral e qualidade da cerveja. Primeiro, o malte é o agen- te flavonzante primário da cerveja. Segundo, o malte fornece a maior porção de açúcar fermentável. Terceiro, o malte fornece as proteínas, que contribuirão para o estrutura e caráter da espuma da cerveja. Quarto, o malte fornece a atividade enzimática necessária durante a maceração. O lúpulo também contribui significativamente para a quali- dade da cerveja, incluindo especiarias. Em particular, lúpulo (ou consti- tuintes de lúpulo) adicionam as substâncias amargas necessárias para a cerveja. Além disso, o lúpulo age como precipitante de proteína, es- tabelece agentes preservativos e auxilia na formação e estabilização de espuma.

[000128] Grãos, tais como cevada, aveia, trigo, assim como compo- nentes de plantas como milho, lúpulo e arroz, também são usados pa- ra fermentação, tanto na indústria como na produção caseira. Os com- ponentes usados na fermentação podem ser maltados ou não, isto é, parcialmente germinados, resultando em um aumento dos níveis de enzimas, incluindo a-amilase. Para uma fermentação bem sucedida, níveis adequados de atividade enzimática da a-amilase são necessá- rios para garantir os teores adequados de açúcares para fermentação. A variante de glícoamilase contemplada, isolada ou em combinação com uma outra a-amilase(s), consequentemente pode ser adicionada aos componentes usados para fermentação.

[000129] Como usado aqui, o termo "solução estoque" significa grãos e componentes de plantas que são esmagados ou rompidos. Por exemplo, a cevada usada na produção de cerveja é um grão que foi grosseiramente moído ou esmagado para produzir uma consistên- cia adequada para produção de um mingau para fermentação. Como usado aqui, o termo "solução estoque" inclui qualquer um dos tipos de plantas e grãos supracitados na forma esmagada ou grosseiramente moída. Os métodos da presente invenção aqui descritos podem ser usados para determinar os níveis de atividade de a-amilase tanto em farinha como em solução estoque.

[000130] Processos para fabricação de cerveja são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Wolfgang Kunze (2004) "Technology Brewing and Malting," Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 3a edição. Resumidamente, o processo envolve: (a) pre- parar um mingau, (b) filtrar o mingau para preparar um mosto e (c) fermentar o mosto para obter uma bebida fermentada, como cerveja. Tipicamente, malte moído ou esmagado é misturado com água e man- tido durante um período de tempo sob temperaturas controladas para permitir que as enzimas presentes no malte convertam o amido pre- sente no malte em açúcares fermentáveis. O mingau é então transferi- do para um filtro de mingau onde o liquido é separado do resíduo de grãos. Esse líquido doce é chamado de "mosto", e o resíduo de grãos que sobra é chamado de "grão gasto". O mingau é tipicamente subme- tido a uma extração, que envolve adicionar água ao mingau para recu- perar o extrato residual solúvel do grão gasto. O mosto é então vigoro- samente fervido para ser esterilizado e ajudar a desenvolver a cor, sa- bor e aroma. O lúpulo é adicionado em algum momento durante a fer- vura. O mosto é resfriado e transferido para um fermentador.

[000131] O mosto é então posto em contato com levedura em um fermentador. O fermentador pode ser resfriado para parar a fermenta- ção. A levedura flocula e é removida. Finalmente, a cerveja é resfriada e armazenada durante um período de tempo, durante o qual a cerveja clarifica e seu sabor se desenvolve, e qualquer material que possa prejudicar a aparência, o sabor e a vida útil da cerveja se sedimenta. A cerveja normalmente contém de cerca de 2% a cerca de 10% v/v álco- ol, embora possa ser obtida cerveja com um teor mais alto de álcool, por exemplo, 18% v/v. Antes da embalagem, a cerveja é carbonatada e, opcionalmente, filtrada e pasteurizada.

[000132] A composição da fermentação que compreende a variante de glicoamilase contemplada, em combinação com uma outra glicoa- milase e opcionalmente uma alfa-amilase, uma pululanase e/ou isoa- milase, pode ser adicionada à mistura da etapa (a) acima, isto é, du- rante a preparação da mistura. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição de fermentação pode ser adicionada à mistura da etapa (b) acima, isto é, durante a filtração da mistura. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição de fermentação pode ser adicionada ao mosto da etapa (c) acima, isto é, durante a fermentação do mosto.

[000133] Uma bebida fermentada, como uma cerveja, pode ser pro- duzida por um dos métodos acima. A bebida fermentada pode ser uma cerveja, como cerveja maltada completa, cerveja fermentada de acor- do com a "Reinheitsgebot" (Lei da Pureza da Cerveja), ale, IPA, lager, bitter, Happoshu (segunda cerveja), terceira cerveja, "dry beer11, "near beer1', cerveja light, cerveja com baixo teor de álcool, cerveja de baixas calorias, porter, bock, stout, licor de malte, cerveja não alcoólica, licor de malte não alcoólico e similares, mas também bebidas alternativas de cereal e malte, como bebidas de malte com sabor de frutas, por exemplo, bebidas de malte com sabor de cítricos, como limão, laranja, lima ou de frutas vermelhas, bebidas de malte com sabor de destila- dos, por exemplo, licor de malte com sabor de vodka, rum ou tequila, ou bebidas de malte com sabor de café, como bebidas de malte com sabor de cafeína e similares.

[000134] Em algumas modalidades, a descrição refere-se a um mé- todo de sacarificação de uma solução líquida de amido, que compre- ende uma etapa de sacarificação enzimática usando uma ou mais gli- coamilases, conforme contemplado na presente invenção.

[000135] A presente descrição também fornece uma composição de ração animal ou formulação que compreende ao menos uma glicoami- lase conforme contemplado na presente invenção. Métodos para usar uma enzima glícoamilase na produção de rações que compreendem amido são fornecidos em por exemplo WO 2003/049550 (aqui incorpo- rada a título de referência, em sua totalidade). Brevemente, a glicoami- lase pode ser misturada a uma ração que compreende amido. A glico- amilase é capaz de degradar o amido resistente para ser usado pelo animal, in vitro ou in vivo. Outros objetivos e vantagens da presente descrição são evidentes a partir do presente relatório descritivo. Métodos Usados nos Exemplos

[000136] Os seguintes materiais, ensaios, e métodos são usados nos exemplos fornecidos abaixo: Método de HPLC para medir a composição de sacarídeos. a produtivi- dade do etanol e a redução de DP4+

[000137] A composição dos produtos da reação de oligossacarí- deos foi medida por um sistema de HPLC (Beckman System Gold 32 Karat Fullerton, California, EUA). O sistema, mantido a 50°C, foi equipado com uma coluna para Monossacarídeos H Rezex 8 u8% e um detector de índice de refração (IR) (ERC-7515A, Anspec Com- pany, Inc.). Ácido sulfúrico diluído (0,01 N) foi aplicado como a fase móvel em uma vazão de 0,6 ml/min. 20 μl de solução a 4,0% da mis- tura de reação foram injetados na coluna. A coluna separa os saca- rídeos com base em seus pesos moleculares. A distribuição de sa- carídeos e a quantidade de cada sacarídeo foram determinadas por um padrão anteriormente estabelecido.

[000138] Para determinar a produtividade do etanol e a redução de DP4+, amostras pontuais foram descongeladas a 4°C e centrifugadas durante 2 min a 15.000 rpm. 100 μl dos sobrenadantes das amostras foram misturados em tubos de microcentrífuga individuais com 10 μl de 1,1 N ácido sulfúrico e incubados durante 5 min à temp, ambiente 1 ml de água foi adicionado a cada tubo, e os tubos foram centrifugados durante 1 minuto a 15.000 rpm. 200 μl foram filtrados em uma placa de HPLC. A placa foi analisada em um HPLC Agilent usando uma coluna Rezex Fast Fruit RFQ com 8 minutos de eluição. As curvas de calibra- ção dos componentes acima foram preparadas com o uso de etanol combustível da Supelco (Sigma cat. n°. 48468-U). As concentrações de DP1, DP2, DP4+, glicerol, ácido acético, ácido láctico e etanol (g/L) foram determinadas com o uso do software ChemStation. A produção de etanol foi convertida em porcentagem v/v da mistura de reação. Ensaio da Atividade da Glicoamilase pNPG

[000139] Soluções de reagentes: Tampão de NaAc (200 mM de tampão de acetato de sódio pH 4,5); Substrato (50 mM p-nitrofenila-a- D-glicopiranosídeo (Sigma N-1377) em tampão NaAc (0,3 g/20 ml) e solução bloqueadora (800 mM tampão glicina-NaOH pH 10). 30 μl do sobrenadante filtrado da enzima foi colocado em uma placa de microti- tulação (MTP) de 96 poços com fundo plano nova. Em cada poço 50 μl de tampão NaAc e 120 μl de substrato foram adicionados e incubados durante 30 minutos a 50°C (incubadora/agitador HT Thermolab sys- tems iEMS). A reação foi interrompida pela adição de 100 μl de solu- ção bloqueadora. A absorbância foi medida a 405 nrn em um espectro- fotômetro de microplaca (Molecular Devices Spectramax 384 plus) e a atividade foi calculada com o uso de um coeficiente de extinção molar de 0,011 μM/cm. Ensaio da Atividade da Amilopectina

[000140] Reagentes: ABTS (2,2'-Azina-bis(30etilbenzotiazolina-6- ácido sulfônico) sal diamônio (Sigma #A1888); Peroxidase Tipo VI de raiz-forte (Sigma #P8375) preparada como solução de 2500 U/ml; Gli- cose Oxidase (Genencor OxyGO HP L5000); solução de cloreto de cálcio (100 mM em água desionizada); tampão de acetato de sódio (1 M, pH 4,3); água desionizada contendo 0,005% v/v Tween 80 (Polis- sorbato 80); e amilopectina de amido batata (Fluka/Sigma #10118).

[000141] [00136]0 coquetel reagente HRP-ABTS (contendo 63 mg ABTS, 92 μl HRP (peroxidase de raiz-forte) (2500 U/ml), 107 μl OxyGO, 230 μl CaCI2 (100 mM), 1,15 ml de tampão de acetato de só- dio, 9,42 ml água/Tween) foi preparado no dia do ensaio, armazenado refrigerado e protegido da luz.

[000142] Substrato: uma solução de 2% em peso de amilopectina foi preparada colocando-se a pasta de amilopectina em água/0,005% tween até ferver rapidamente. A solução do substrato de amilopectina foi deixada resfriar até a temperatura ambiente antes de ser usada.

[000143] Em um cadinho de reação, 110 μl do coquetel reagente HRP-ABTS foram incubados durante 120 segundos a 30°C. 5 μl da amostra diluída da enzima foram adicionados, misturados e incubados durante 60 s. 115 μl da solução do substrato de amilopectina foram adicionados, misturados e incubados durante 60 segundos. A absor- bância a 405 nm foi medida em intervalos de 30 segundos durante 300 segundos,

[000144] No ensaio da amilopectina, GAUs são medidas como a ca- pacidade da enzima de catalisar a hidrólise da amilopectina para libe- rar glicose. A glicose liberada é convertida em quantidades estequio- métricas de ácido glicônico e peróxido de hidrogênio pela glicose oxi- dase. A peróxido de hidrogênio oxida o ABTS (catalisado pela HRP) para formar uma cor verde que é medida espectrofotometricamente a 405 nm. A quantidade de cor verde é proporcional à atividade da gli- coamilase.

Ensaio de Referência do Amido

[000145] O ensaio tem por base uma hidrólise de 60 minutos de um substrato de amido solúvel (amido de batata) em pH 4,2 e 60qC. Os açúcares redutores resultantes são determinados pelo método de Schoorl e calculados como glicose. O método de Schoorl é um método de redução de cobre usando solução de Fehling. O cobre reduzido é determinado indiretamente por titulação iodométrica do sal de cobre não reduzido que resta após a oxidação do açúcar. Uma Unidade de Glícoamilase (GAU) é a quantidade de enzima que é capaz de liberar uma grama de açúcar redutor como glicose por hora sob as condições do ensaio. Determinação de Unidades de Atividade de Glícoamilase (GAU)

[000146] As unidades de atividade de glícoamilase (GAU) foram de- terminadas com base na capacidade de uma enzima glícoamilase ca- talisar a hidrólise de p-nitrofenil-alfa-D-glicopiranosídeo (pNPG) em gli- cose e p-nitrofenol. Em um pH alcalino, p-nitrofenol forma uma cor amarela que é medida por meios espectrofotométricos a 405 nm. A quantidade de p-nitrofenol liberado correlaciona com a atividade da glícoamilase. Determinação da Concentração de Proteína

[000147] A concentração de proteína em uma amostra foi determina- da com o uso do reagente corante Bradford, QuickStart™ (Bio-Rad, Califórnia, EUA). Por exemplo, uma amostra de 10 μl da enzima foi combinada com 200 μl de reagente corante Bradford QuickStart™. Após misturar completamente, a mistura de reação foi incubada duran- te pelo menos 10 minutos à temperatura ambiente. As bolhas de ar fo- ram removidas e a densidade óptica (DO) foi medida em 595 nm. A concentração de proteína foi então calculada com o uso de uma curva padrão gerada a partir de quantidades conhecidas de albumina sérica bovina. Determinação da Concentração de Glicose

[000148} A concentração de glicose em uma mistura de reação de sacarificação foi determinada com o ensaio ABTS. Amostras ou pa- drões de glicose em 5 μl foram colocadas em cavidades de uma placa de microtitulação de 96 cavidades (MTP). As reações foram iniciadas com a adição de 95 μl do reagente contendo 2,74 mg/ml de 2,2'-azino- bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico), sal diamônio (ABTS) (Sigma P1888), 0,1 U/ml de peroxidase de raiz-forte tipo VI (Sigma P8375), e 1 U/ml de glicose oxidase (Sigma G7141). DO405 nm foi imediatamente monitorada em um intervalo de 9 segundos durante 300 segundos usando um espectrofotômetro de microplaca (Molecular Devices Spec- tramax). Devido ao fato da taxa de aumento de DO405 nm de ser propor- cional à concentração de glicose, a concentração de glicose da amos- tra foi determinada por comparação com o padrão de glicose, e foi re- latada como mg/ml.

Exemplos

[000149] Os exemplos a seguir são fornecidos para demonstrar e adicionalmente ilustrar determinadas modalidades representativas e aspecto da presente descrição e não devem ser interpretados como limitadores do escopo dos mesmos.

Exemplo 1: Efeito da oxidação sobre a TrGA e a variante CS4

[000150] Estudos de estabilidade de formulação revelaram que as misturas do produto TrGA perdem 15-20% da atividade da glicoamila- se após 1 mês de armazenamento a 37°C (dados não mostrados). Ao mesmo tempo, uma redução significativa na atividade do pNPG (apro- ximadamente 50%) foi observada em amostras mantidas a 4°C durante vários meses (dados não mostrados). Uma perda de atividade similar também foi observada em misturas de enzimas contendo a variante CS4 da TrGA (variante da TrGA tendo L417V, T430A, Q511H, A539R e N563I da SEQ ID N°: 2). O mecanismo da perda de atividade nessas amostras não ficou claro. Entre várias hipóteses plausíveis, a oxidação da proteína como um mecanismo de perda de atividade foi investigado. Para isso, foi usado o tratamento da enzima purificada com peróxido de hidrogênio para caracterizar as consequências funcionais e estruturais da oxidação do aminoácido na atividade enzimática. Uma abordagem similar foi usada com sucesso em estudos anteriores da serino protease subtilisina. Ver Estell et al., (1985) J. Biol. Chem. 260: 6518-6521; ver também Bott et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 7895-7906.

[000151] Experimentos foram conduzidos para determinar (1) se o tratamento com peróxido de hidrogênio é responsável pela perda da atividade do pNPG e da atividade da amilopectina da TrGA (tipo sel- vagem) e a variante CS4, e (2) se essa perda de atividade é provoca- da por uma deficiência na proteína ou uma alteração na atividade es- pecífica devido à oxidação.

[000152] Materiais: CS4 48 purificada (+/- 5) mg/ml; TrGA 44 selva- gem purificada (+/- 6) mg/ml; 0,1 M acetato de sódio pH 4,3; 50% pe- róxido de hidrogênio; Catalase Oxy-Gone (para inativar o peróxido de hidrogênio); e colunas para cromatografia descartáveis Econo-pac 10 DG (BioRad).

[000153] Procedimento: Diluir a Catalase Oxy-Gone 10 vezes com água destilada; Diluir cada amostra de enzima 1:10 com 0,1 M acetato de sódio pH 4,3; 0,6 ml de TrGA purificada em 5,4 ml de 0,1 M acetato de sódio pH 4,3 0,6 ml de CS4 purificada em 5,4 ml de 0,1 M acetato de só- dio pH 4,3 3) Dividir em duas frações e adicionar peróxido de hidrogê- nio a uma fração e água à outra; Por 3 ml de fração 90 μl de 50% peróxido de hidrogênio (0,5 M concentração final) Por 3 ml de fração 90 μl de água MilliQ (controle) 4) Incubar essas 4 misturas à temperatura ambiente e reti- rar alíquotas de 90 μl em diferentes intervalos de tempo; 5) Em cada intervalo de tempo (os intervalos podem variar), a 90 μl da mistura, adicionar 10 μl da catalase diluída às amostras con- tendo peróxido de hidrogênio, ou adicionar 10 μl de água MilliQ às amostras do controle 6) Diluir as amostras de enzima em uma placa de diluição sem aderência (poliestireno com fundo redondo branco da Corning® 3605); Fileira A: 80 μl de amostra de enzima Fileiras B-D: 1:2 diluições em série usando 0,1 M acetato de sódio, pH 4,3 Incluir 2 controles com água e catalase 7) Transferir as amostras diluídas para a placa de ensaio e determinar a atividade enzimática residual com o ensaio de placa de pNPG; 8) Depois que as amostras oxidadas perderem 70-80% da sua atividade, prosseguir para as etapas 9-15 para remover o peróxido de hidrogênio do material restante para testes adicionais; 9) Obter uma coluna de cromatografia Econo-pac; 10) Equilibrar a coluna com 20 ml de 0,1 M de tampão de acetato de sódio pH 4,3; 11) Deixar o tampão correr até o gel; 12) Adicionar 3 ml da mistura da amostra; 13) Deixar a amostra correr até o gel; 14) Adicionar 3 ml de tampão pH 4,3; e 15) Coletar todos os 3 ml da amostra em um tubo marcado.

[000154] Conforme mostrado na figura 2, o tratamento da TrGA (WT) e da variante CS4 com 0,5 M de peróxido de hidrogênio à temperatura ambiente durante 7 horas resultou em uma redução de 70% a 80% da atividade do pNPG. Entretanto, as formas oxidadas da TrGA e da vari- ante CS4 mostraram diferentes alterações na atividade quando amilo- pectina (AP) foi usada como substrato. Conforme indicado na Tabela 1 abaixo, a TrGA tratada com hidrogênio peróxido manteve sua ativida- de total, enquanto a CS4 tratada com peróxido de hidrogênio perdeu cerca de 22% da sua atividade. Tabela 1. Comparação entre a perda de atividade entre TrGA e CS4 usando vários substratos.

[000155] Os dados são também mostrados na Figura 3, que mostra uma redução da atividade de referência do amido (usando amido de batata como substrato) de cerca de 20-30%, para TrGA e CS4 trata- das com peróxido de hidrogênio.

[000156] A análise do gel SDS-PAGE (Figura 4) mostra que as glico- amilases tratadas com peróxido de hidrogênio (TrGA e CS4) permane- ceram intactas, com ou sem a presença da Endoglicosidase H (Endo H). A partir desses resultados, parece que uma alteração na atividade específica da glicoamilase, ao invés de degradação da proteína, pode ser responsável pela perda de atividade observada relacionada com a oxidação. Exemplo 2: Mapeamento da oxidação da proteína baseado em MS

[000157] Para caracterizar com mais detalhes a perda de atividade observada decorrente do tratamento com peróxido de hidrogênio, par- ticularmente o perfil distinto da CS4, foi conduzida uma análise de es- pectrometria de massa (MS). Todas as amostras de glicoamilase fo- ram precipitadas com 10% TCA seguido da reação de redução com 20 mM DTT a 50°C durante 15-20 min. A reação de alquilação também foi realizada com 55 mM lodoacetamida (IAA). A reação de alquilação foi conduzida no escuro durante 45 min à temperatura ambiente. A diges- tão proteolítica foi realizada através de incubação com a Asp-N pro- tease em 25 mM bicarbonato de amónio de um dia para o outro a 37°C (a razão de Asp-N para TrGA ou CS4 foi ajustada para 1:20, em peso). Todas as proteínas digeridas foram analisadas por MALDi-TOF/MS e LC-MS/MS para estudo de MRM.

[000158] Para a análise MALDI-TOF/MS, as amostras dessalinizadas foram preparadas pela cocristalização dos volumes iguais (1 μl) da amos- tra com CHCA (ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico, saturado em 70% ace- tonitrila com 0,1% ácido fórmico) usando o método de gotícula seca. Os espectros de massa dos peptídeos foram obtidos com o uso de um es- pectrômetro de massa Voyager DE-STR MALDI-TOF (Applied Biosys- tems, Foster City, CA, EUA). As configurações do instrumento para a fai- xa de 700-2500 m/z foram: modo de operação refletor, modo de extração atrasado, polaridade positiva, voltagem de aceleração de 20 kV, tensão da grade 68% e tempo de retardo de extração de 175 ns. Para cada es- pectro, 300 tiros de laser foram realizados, e a mistura de calibração 1 (Sigma, Saint Louis, MO, EUA) foi usada como calibre externo.

[000159] Para a análise de MRM/MS, todas as amostras digeridas fo- ram analisadas por ESI LC/MS/MS em um espectrômetro de massa de captura de ions triplo-quádruplo (TSQ Quantum Access, Thermo Scienti- fic). A amostra digerida primeiro foi testada em um LC-MS/MS (modo de- pendente de dados) para determinar e selecionar os peptídeos-alvo não oxidados e oxidados) para estudo de MRM subsequente. Além disso, o software do MRM (software Pinpoint™, Thermo Scientific) foi usado para prever possíveis peptideos e escolher ions de fragmentos múltiplos para o desenho do ensaio de MRM, para construir um método de instrumento e um arquivo de sequência, e também para processamento de dados quantitativos. A detecção de alta confiança dos peptídeos-alvo foi obtida com o uso de alinhamento de acordo com o tempo de íons de fragmen- tos múltiplos específicos (b ou y) de cada peptídeo. O instrumento foi configurado para fazer um ciclo com cada conjunto de transição do MRM (tipicamente 3 íons de fragmento primário/peptídeo-alvo) em um determi- nado método, durante um tempo de ciclo total de 60 ms.

[000160] O método MRM foi configurado da seguinte forma: Q1: 0,7 FWHM Q3: 0,7 FWHM Pressão do Gás de Colisão: 1,2 mTorr Energia de Colisão: 35-45 V Tempos de parada: 20 ms

[000161] HPLC para TSQ Quantum Access foi configurada da seguin- te forma: Bomba: Bomba Thermo Scientific Surveyor™ MS com autoamαstrador Coluna: Vydac RP-C18 (2,1 mm «150 mm) Vazão: 200 μl/min Tampão A: 0,1% FA em água DI Tampão B: 0,1% FA em acetonitrila Gradiente: 0% B a 70% B em 50 min Injeção de amostra: 20 μl

[000162] As Figuras 5A e 5B mostram a análise MALDI-TOF/MS (fai- xa de massa de 1001-2000 Dalton) em digestão em solução (Asp-N) para TrGA e CS4, com ou sem tratamento com peróxido de hidrogê- nio. Metionina 50 (M50) foi identificada como o único sítio de oxidação de proteína na TrGA e CS4 tratadas com peróxido de hidrogênio (da- dos não mostrados para outras faixas de massa). O tratamento com 0,5 M peróxido de hidrogênio resultou em 100% de oxidação para M50 na TrGA e na CS4. Dois outros peptídeos (picos 1/3 e 2/4, conforme indicado pelas setas nas Figuras 5A-B) foram confirmados como for- mas carboxiladas e carbamidometiladas do mesmo peptídeo da TrGA (46-53) (dados não mostrados). Essas modificações no peptideo foram provavelmente causadas pela quantidade excessiva de lodoacetamida (IAA) usada nas reações de redução da proteína e de alquilação antes da digestão proteolítica.

Exemplo 3: caracterização do desempenho da aplicação para oxida- ção de M50

[000163] O efeito da oxidação de M50 na TrGA e na CS4 foi caracte- rizado em mais detalhes em processos SSF. O SSF foi conduzida da seguinte forma: Incubar o liquefact congelado a 70oC até descongelar com- pletamente, geralmente, 4-5 horas; Pesar a quantidade adequada de liquefact e adicionar ureia sólida a 600 ppm; Ajustar o pH do liquefact a 4,8 usando 6 N ácido sulfúrico e/ou 28% hidróxido de amónio; Adicionar 0,1 % em peso de levedura seca ao liquefact; Adicionar a quantidade adequada (razão de atividade 1:6 GA:AA) de AkAA ao liquefact; Misturar bem com um misturador; Pesar 100 g +/- 0,2 g de liquefact em frascos Erlenmeyer de 125 ml individualmente marcados em réplicas de dois; Adicionar a quantidade adequada de glicoamilase ao frasco adequado; Adicionar uma barra magnética e um anel de peso verme- lho a cada frasco e cobrir com papel alumínio; Incubar em banho-maria misturando a 320 rpm durante 55 horas a 32°C; Amostras pontuais de aproximadamente 1 ml são obtidas em aproximadamente t=0, 6, 18, 25, 43 e 55 horas e armazenadas congeladas; A amostra de cada intervalo de tempo é descongelada a 4°C e centrifugada durante 2 minutos a 15.000 rpm; Em tubos de microcentrifuga marcados individualmente, misturar 100 μl do sobrenadante da amostra com 10 μl de 1,1 N ácido sulfúrico e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente; Adicionar 1 ml de água a cada tubo e centrifugar durante 1 minuto a 15.000 rpm; 200 μl de cada amostra são colocados nos tubos de HPLC e analisados na HPLC usando uma coluna Aminex HPX-87H; As concentrações de DP1, DP2, DP3+, glicerol, ácido acéti- co, ácido láctico e etanol (% em peso por volume) são determinadas usando o software Waters Empower; e

[000164] As curvas de calibração dos componentes acima são pre- paradas usando um padrão de etanol combustível Supelco (Sigma cat. n° 48468-U).

[000165] Para um liquefact de 35% sólidos secos, a TrGA selvagem foi dosada em 0,325 GAU/g ds (1 x dose), a CS4 foi dosada em 0,016 mg/g de liquefact ou 0,045 mg/g ds (0,7 x dose), e AkAA foi dosada em 1,95 SSU/G ds. TrGA ou CS4 tendo 0% de oxidação, 50% de oxi- dação (misturando-se quantidades iguais da enzima que tem 0% e 100% oxidação) e 100% de oxidação foram usadas nos experimentos de SSF acima. Os níveis de DP3+ foram medidos através do volume morto, e sua redução comumente reflete a eficiência da sacarificação do liquefact. Os dados são apresentados nas Figuras 6A e 6B.

[000166] Combinado aos resultados mostrados no Exemplo 1, foi observado que as propriedades funcionais da TrGA oxidada e da CS4 oxidada diferem significativamente. A hidrólise do pNPG e a atividade no ensaio de referência do amido foram reduzidas com a oxidação da M50 para ambas as enzimas (a atividade pNPG do reduziu em um grau bem maior). A TrGA oxidada manteve a atividade total sobre a amilopectina, enquanto a oxidação da CS4 resultou em uma redução mensurável na atividade sobre a amilopectina. O efeito da oxidação sobre o desempenho da SSF também foi bastante diferente para as duas enzimas. Os níveis da produtividade do etanol, velocidade inicial de DP1, final de DP2 e final DP3+ foram similares para TrGA original e oxidada (Figura 6A). A CS4, por outro lado, exibiu perdas significativas na produtividade do etanol e reduziu os níveis da velocidade inicial de DP1, final de DP2 e final de DP3+ após a oxidação (Figura 6B). De acordo com a estrutura de cristal da TrGA determinada, M50 e duas das cinco substituições em CS4, L417V e A539R, são provavelmente localizadas próximas ao sitio ativo da enzima. A oxidação pode deses- tabilizar a ligação do substrato, o estado de transição ou ambos. Entre- tanto, ainda não ficou claro por que o efeito da oxidação no desempe- nho da SSF é diferente para TrGA e CS4. Exemplo 4: construção e caracterização das variantes CS4 M50

[000167] Com base nos exemplos acima, parece que os produtos comerciais contendo CS4 seriam suscetíveis à perda de desempenho de SSF devido à oxidação. O monitoramento cuidadoso da atividade do pNPG do produto possivelmente pode identificar os lotes de produ- ção tendo possível oxidação. Alternativamente, a oxidação pode ser monitorada por espectrometria de massa. Substituir M50 com um ami- noácido não oxidável, no entanto, seria uma solução a longo prazo pa- ra esse problema.

[000168] Uma pesquisa BLAST do banco de dados NCBI de proteí- nas usando a sequência da TrGA indicou que (1) M50 não é comple- tamente conservada e (2) treonina e histidina são encontradas nesse sítio em sequências homólogas (dados não mostrados). Uma verifi- cação da biblioteca de avaliação de sítios de todas as dezenove substituições foi conduzida para avaliar as variantes da TrGA que são resistentes à perda de atividade relacionada à oxidação enquanto mantêm o beneficio de eficiência de desempenho exibido pela CS4. Após a verificação preliminar (dados não mostrados), as variantes tendo M50 na CS4 substituída por glicina (G), fenilalanina (F), lisina (K) ou tirosina (Y) foram submetidas a uma caracterização adicional para perda de atividade relacionada à oxidação. Conforme mostrado na Tabela 2, as variantes carregando a substituição M50G, M50Y ou M50F, com o tratamento com peróxido de hidrogênio, mantiveram a atividade de pNPG por mais de 285 minutos, mostrando apenas uma perda de atividade máxima de cerca de 10-11%. Quando incubadas em água, essas variantes mostraram uma perda de atividade máxima de cerca de 6-7%. Tabela 2. Caracterização da atividade do pNPG das variantes M50 CS4.

[000169] Após a avaliação de sensibilidade à oxidação, essas varian- tes foram submetidas à avaliação de desempenho no processo SSF conduzido da seguinte forma: Incubar liquefact congelado a 4°C de um dia para o outro, então, incubar a 60°C durante duas horas seguido de incubação a 32°C durante 30 minutos; Pesar o liquefact de milho e adicionar ureia a uma concen- tração final de 600 ppm; Ajustar o pH do liquefact a 4,8 usando 6 N ácido sulfúrico e/ou 28% hidróxido de amónio; Adicionar 0,1% em peso de levedura seca ativa ao lique- fact; Misturar cavidade com um agitador mecânico durante 30 minutos à temperatura ambiente; Pesar 100 g +/- 0,2 g de liquefact em frascos Erlenmeyer de 125 ml individualmente marcados em réplicas de dois; Adicionar o volume adequado de glícoamilase a cada frasco (glícoamilase é dosada como uma fração da dose de TrGA a 0,325 GAU/g de sólidos secos; CS4 ou a variante adicional são dosadas em 0,7 x da dose da proteína selvagem, cerca de 0,015 mg de proteína / g de liquefact); Adicionar o volume adequado de AkAA a cada frasco (AkAA é dosada como uma fração da atividade de AkAA a 1,95 SSU/g de sólidos secos); Misturar e fechar cada frasco com uma rolha de espuma; Incubar em uma incubadora de ar forçado a 32°C misturan- do a 200 rpm durante 55 horas; e

[000170] Amostras pontuais de aproximadamente 1 ml são coletadas em t=0, 4, 12, 16, 24, 30, 40, 44 e 55 horas nas fermentações; as amostras são armazenadas congeladas e submetidas à análise con- forme descrito acima.

[000171] A Tabela 3 mostra as produtividades do etanol para cada das 4 variantes. Ainda que as variantes M50G e M50F tenham produ- zido níveis de etanol no fim da fermentação equivalentes aos níveis produzidos na presença de CS4, suas velocidades de produção de etanol foram significativamente mais lentas que as de CS4, produzindo etanol até 14% mais lentamente que a CS4 nas primeiras 18 horas de fermentação. Ambas as variantes M50Y e M50K mostraram velocida- des de produção de etanol equivalentes à CS4. Entretanto, a variante M50K oxidada produziu 7% rnenos etanol no final da fermentação. M5Q.

[000172] A hidrólise de DP4+ também foi avaliada em SSF para cada das variantes da M50 (Tabela 4). Os níveis de DP4+ foram medidos através do volume morto, e sua redução comumente reflete a eficiên- cia da sacarificação do liquefact. Conforme observado na produção de etanol, as variantes M50G e M50F foram muito mais lentas na hidróli- se de DP4+ com produtividades consistentemente mais altas durante a fermentação que a CS4. A variante M50G também produziu DP4+ sig- nificativamente mais alta no final da fermentação que qualquer outra variante, mantendo 66% mais DP4+ que CS4. Por outro lado, tanto M50Y quando M50K mostraram hidrólise equivalente ou aprimorada de DP4+ em comparação com CS4. CS4 M50.

[000173] Com os dados acima, a variante CS4 M50Y mostrou de- sempenho equivalente à CS4 nas produtividades do etanol e na hidró- lise de DP4+, assim como sensibilidade mínima à oxidação. Embora a variante M50K também tenha mostrado desempenho equivalente à CS4 em seu estado original, a M50K oxidada mostrou produção signi- ficativamente reduzida de etanol, assim como hidrólise menos eficiente de DP4+. Consequentemente, a variante CS4 M50Y foi selecionada para uma avaliação mais detalhada, usando o lote 2 do liquefact. Os resultados estão resumidos na Tabela 5. Tabela 5. Avaliação do desempenho da SSF para a variante CS4 M50.

[000174] Conforme mostrado na Tabela 5, a variante CS4 M50Y mostrou desempenho equivalente à CS4 tanto para a produção de etanol quanto para a hidrólise de DP4+. Embora a variante M50Y te- nha produzido 50% mais DP4+ no final da fermentação, o valor obtido de 1,23% em peso por volume apareceu bem abaixo da produtividade final de DP4+ da variante CS4 M50G ou da variante oxidada CS4 M50K. Dessa forma, a variante CS4 M50Y tendo o aminoácido de SEQ ID N°: 6 pode ser útil para substituir TrGA e CS4 em produtos comerciais para proporcionar uma vida útil mais longa, por exemplo.

[000175] Várias modificações e variações dos métodos e sistema descritos da descrição ficarão evidentes aos versados na técnica, sem que desvie do espírito e escopo da descrição. Embora a descrição te- nha sido descrita em conjunto com modalidades representativas espe- cíficas, deve-se compreender que a descrição conforme reivindicada não deve ser indevidamente limitada a essas modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos de realização da descrição descritos que são óbvias para os versados na técnica destinam-se a estar dentro do escopo das reivindicações a seguir. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SEQ IP N°: 1 (comprimento total da TrGA, com peptídeo de sinaliza- ção e pró-sequéncia) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGSSGLSDVTKRSVDDFISTETPIALNNLLCNVGP DGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYMWTRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIE QYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIAL IGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTV ANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEG RTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVWDSFRSIYGVNKGIP AGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTG SITVTATSLAF FQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNS GTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWANSSASTIPSTCSGASWGSYSRP- TATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGQTVKVAGNA AALGNWSTSAAVALDAVNYADNHPLWIGTVNLEAGDWEYKYINVGQDGSVTW ESDPNHTYTVPAVACVTQWKEDTWQS SEQ IP N°: 2 (TrGA madura, sem peptídeo de sinalização e pró- sequência) SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYMWTRDS ALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFEL TLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYV AQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQ VLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQP CSDKALSNLKVWDSFRSIYGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAA EQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYAD GFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPS WANSSASTIPSTCSGASWGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATP TSVAVTFHELVSTQFGQTVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYADNHPLWIG TVNLEAGDWEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACX/TQWKEDTWQS SEQ IP N°: 3 (peptídeo de sinalização da TrGA selvagem) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLG SEQ IP N°: 4 (cDNA da TrGA selvagem) atgcacgtcc tgtcgactgc ggtgctgctc ggctccgttg ccgttcaaaa ggtcctggga 60 agaccaggat caagcggtct gtccgacgtc accaagaggt ctgttgacga cttcatcagc 120 accgagacgc ctattgcact gaacaatctt ctttgcaatg ttggtcctga tggatgccgt 180 gcattcggca catcagctgg tgcggtgatt gcatctccca gcacaattga cccggactac 240 tattacatgt ggacgcgaga tagcgctctt gtcttcaaga acctcatcga ccgcttcacc 300 gaaacgtacg atgcgggcct gcagcgccgc atcgagcagt acattactgc ccaggtcact 360 ctccagggcc tctctaaccc ctcgggctcc ctcgcggacg gctctggtct cggcgagccc 420 aagtttgagt tgaccctgaa gcctttcacc ggcaactggg gtcgaccgca gcgggatggc 480 ccagctctgc gagccattgc cttgattgga tactcaaagt ggctcatcaa caacaactat 540 cagtcgactg tgtccaacgt catctggcct attgtgcgca acgacctcaa ctatgttgcc 600 cagtactgga accaaaccgg ctttgacctc tgggaagaag tcaatgggag ctcattcttt 660 actgttgcca accagcaccg agcacttgtc gagggcgcca ctcttgctgc cactcttggc 720 cagtcgggaa gcgcttattc atctgttgct ccccaggttt tgtgctttct ccaacgattc 780 tgggtgtcgt ctggtggata cgtcgactcc aacatcaaca ccaacgaggg caggactggc 840 aaggatgtca actccgtcct gacttccatc cacaccttcg atcccaacct tggctgtgac 900 gcaggcacct tccagccatg cagtgacaaa gcgctctcca acctcaaggt tgttgtcgac 960 tccttccgct ccatctacgg cgtgaacaag ggcattcctg ccggtgctgc cgtcgccatt 1020 ggccggtatg cagaggatgt gtactacaac ggcaaccctt ggtatcttgc tacatttgct 1080 gctgccgagc agctgtacga tgccatctac gtctggaaga agacgggctc catcacggtg 1140 accgccacct ccctggcctt cttccaggag cttgttcctg gcgtgacggc cgggacctac 1200 tccagcagct cttcgacctt taccaacatc atcaacgccg tctcgacata cgccgatggc 1260 ttcctcagcg aggctgccaa gtacgtcccc gccgacggtt cgctggccga gcagtttgac 1320 cgcaacagcg gcactccgct gtctgcgctt cacctgacgt ggtcgtacgc ctcgttcttg 1380 acagccacgg cccgtcgggc tggcatcgtg cccccctcgt gggccaacag cagcgctagc 1440 acgatcccct cgacgtgctc cggcgcgtcc gtggtcggat cctactcgcg tcccaccgcc 1500 acgtcattcc ctccgtcgca gacgcccaag cctggcgtgc cttccggtac tccctacacg 1560 cccctgccct gcgcgacccc aacctccgtg gccgtcacct tccacgagct cgtgtcgaca 1620 cagtttggcc agacggtcaa ggtggcgggc aacgccgcgg ccctgggcaa ctggagcacg 1680 agcgccgccg tggctctgga cgccgtcaac tatgccgata accaccccct gtggattggg 1740 acggtcaacc tcgaggctgg agacgtcgtg gagtacaagt acatcaatgt gggccaagat 1800 ggctccgtga cctgggagag tgatcccaac cacacttaca cggttcctgc ggtggcttgt 1860 gtgacgcagg ttgtcaagga ggacacctgg cagtcgtaa 1899 SEQ ID N°: 5 (variante CS4 da TrGA madura) SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYMWTRDSALVFKN- LIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGR PQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNG SSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGR TGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGAAVAI GRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAG- TYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSAVHLTWSYASFL TAAARRAGIVPPSWANSSASTIPSTCSGASWGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTP LPCATPTSVAVTFHELVSTQFGHTVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYRDNHPLWIGTV NLEAGDWEYKYIIVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQWKEDTWQS SEQ ID N°: 6 (variante CS4 da TrGA madura com M5QY) SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYYW- TRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGS GLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSN- VIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAA- TLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGR7GKDVNSVLT- SIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKA.LSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGAA- VAIGRYAE DVYYN GNPW Y LAT FAAAEQLY DAIYVWKKTGSITVTATSLAF- FQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLA- EQFDRNSGTPLSAVHLTWSYASFLTAAARRAG∑VPPSWANSSASTIPSTCS- GASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHEL- VSTQFGHTVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYRDNHPLWIGTVNLEAG- DVVEYKYIIVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS SEQ ID N°: 7 (GA de comprimento total de Hypocrea citrine var. ame- ricana', SQN6 de US7413879) MHVLSTAVLLGLVAVQKVLGRPGLNGVPDV7KRSVDDFISNESFZALNNLLCNVGPDGCRAFGASAGTVA AS PS TTDPDYYYMW7R DSALIFKTVVDRFTQNYDAS LQKR∑5QYIAAQATLQGISN PSGS LADGS GLGE ? KFELTLNQFTGHWGRPQRDGFALRAIALIGYSKWLIDNNYQSTVSDIIWPZLRNDLNY'vAQYWiJQTGFDL WEEVEGSSFFTVANQHRALVEGATLAAILGQSGSSYSAVAPQILCFLQKFWVSSGGYVNSNINSDINRTG KDANSLLASIHTFDPSZGCDPATFQPCSDKALSNLKSVVESFRSliGVNQGISAGSAVAIGRYSEDVYFL’ GNPWYLATFAAAEQLYDSLYVWKQTGSITVTAIPLAFFQELVPGVAAGTYLSSQSTFTSIVNAVSAYADG FLNEAAKYVPSDGSLAEQFDKNNGTPLSAVHLTWSYASFLTATARRAGSVPPSWANSNATSIPTACSGTS VVGSYSSPTATSFPPSQTPKVGKPTGTPFTPIPCAT PTSVAVTFEELP7TQFGQTTFLAGSAEALGNWST GAAVGLDAANYASNHPLWFGTLNLQAGDVIEYKYINVGKDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTEVVKEDTWQS SEQ ID N°: 8 (GA de comprimento total de Hypocrea vinosa; SQN8 de US7413879) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGSNGLSGVTKRSVDEFINTQTPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVI ASPSTTDPDYYYMWTRDSALVFKNIVDRFTQQYDAGLQRRIEQYTSAQVTLQGISNPSGSLSDGSGLGEP KFELTLSQFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNIIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDL WEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSTYSSVAPQILCFLQRFWVSGGYIDSN1NTNEGRTGK DANSLLASTHTFDPSLGCDASTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGSAVAIGRYPEDVYFNG NPWYLATFAAAEQLYDSVYVWKKTGSITVTSTSSAFFQELVPGVAAGTYSSSQSTFTSIINAISTYADGF LSEAAKYVPADGSLAEOFDRNTGTPLSAVHLTWSYASFLTAAARRAGVVPPSWASSGANTVPSSCSGASV VGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPFTPIPCATPTSVAVTFHELATTQFGQTIKVAGSAPELGNWSTS AAIALDAVNYATNHPLWIGSVNLEAGDVIEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTEVVKEDTWOS SEQ ID N°: 9 (GA de comprimento total de Trichoderma sp.; SQN10 de US7413879) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGSSGLYDVTKRSVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVI ASPSTTDPRYYYMWTRDSALVFKNLVDRFTEEYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLTNPSGSLSDGSGLGEP KFELTLQPFTGNWGRPGRDGPALRAIALIGYAKWL1NNNYQSTVSSVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDL WEEVDGSSFFTVANQHRALVEGATLVATLGQSGDTYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYIDSNTNTNEGRTG KDANSILTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYSLNKGIPAGAAVAIGRYPEDVYFN GNPWYLATFAAAEQLYDAVYVWKETGSITVTATSLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSSTFTTIINAVSTYAD GFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNNGTALSARHLTWSYASFLTATARRAGVVPPSWANSSASTIPSTCSGA SVVGSYSRPTATSFPPSCTPKPGVPSGTPYTFLPCATPTSVAVTr'HELVSTGFGQT-v’KVAGSAQA.LGNWS TSAAVALDAVNYADNHPLWIGTVNLEAGDWEYKY∑NVGQDGSVTWESCPKHGYTVPAVACVTQVVKEDTWQS SEQ ID N°: 10 (GA de comprimento total de Hypocrea gelatinosa-, SQN12.de US7413879) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGSNGLSGVTKRSVSrFINTQTP∑ALKKLLCNVGPDGCFAFGTSAGAV: ASPSTTDPDYYYMWTRDSALVFKNIVDRFTQQYDAGLQRR.IEÇYISAGVTLQGPSKPSGSLSDGSGLGE? KFELTLSQFTGKWGRPQRDGPALRAIAL∑GYSKWLINNKYQSTVSSI∑WPIVRKOLKYVACYWN2TGFIT WEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGCSGSTYSSVAPQILCFLQAFWVSGGYIDSN∑NSNDGRTGK DANSLLASIHTFDFSLGCDASTFQPCSDKALSNLKVVVSSFRSIYGVNKGISAGSAVA∑GRYPEDVYFKG NPWYLATFAAAEQLYDSVYVWKKTGSITVTSTSLAFFQELVPGVAAGTYSSSQSTFTSIVNAVSTYADGF LSEAAKY’VPADGSLAEQFDRNTGTPLSAVHLTWSYASFFTAAARRSGVVPPSWASSGANSIPATCSGASV VGSYSSPTATSFPPSQTPKPGVPSGTFFTPLPCATPTSVAV7FHELATTQFG3NIKVAGSAPELGNWS7S AAIALDAVNYATNEPLWIGSVNLEAGDV1EYKYIKVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTEVVKEDTWQS SEQ ID N°: 11 (GA de comprimento total de Hypocrea orientalise SQN14deUS7413879) MHVLSTAVLLGSVAVQKVI.GRPGSSGLSDVTKRSVDDFISTETPIALNNLLCNVGFDGCRAFGTSAGAVI ASPSTIDPDYYYMWTRRSALVFKNLVDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLTDGSGLGEP KFELTLQPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDL WEEVKGSSFFTIANQHRALVEGATLAATLGQSGSTYSSVAPQILCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTG KDVNSILTSIHTLDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYFN GNPWYLATFAAAEQLYDAVYVWKKTGSITVTA7SLAFFQELVPGVAAGTYASSSSTFTNIINAVSTYADG FLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWZlNSSASTIPSTCSGAS VVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQLGQTVKVAGNAPALGNWS? SAAVALDAVNYADNEFLWIGTVDLEAGDVVEYKYINVGQ3GSVTWESDPNHTYTVFAVACVTCVVKEDTWQS SEQ ID N°: 12 (GA de comprimento total de Trichoderma konilangbra, SQN16 de US7413879) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGSSGLSDVTKRSVDDFISTQTPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVI ASPSTTDPDYYYMWTRDSALVFKNLVDRFTETYDAGLQRRIEQYIAAQVTLQGLTNPSGSLSDGSGLGEP KFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSSLIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDL WEEVNGSSFFTTANQHRALVEGATLAATLSQPASTYSSVAPQILCFLQRYWVSSGGYVDSNINTNEGRTG KD AN SILAA∑ HT FD PN LGRDAGT FQPC S DKALSNLKVVV DS FR SIYGVNKGIPAGAAAAVGRYPE DVYFN GNPWYLATFAAAEQLYDAIYVKKKTGSITVTA∑SLAFFQELVPGVAAGTYSSSQSTFTN∑INAVSTYADG FISEAAKYVPADGSLAEQFDRNNGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWANSSASSIPSTCSGAS VVGSYSRPTATSFPPSQ7PKPGVPSGTPYTFLPCATPASVAVTFHELVSTQLGQTVKVAGSAPALGNWST SAAVALDAVNYADNHPLWIGSVELEAGDVVEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS SEQ ID N°: 13 (GA de comprimento total de Trichoderma sp.; SQN29 de US7413879) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGASDITKRAVTDFINSETPTALNNLICNVGPDGCRAFGTSIGAVVASP STTDPDYFYMWTRDSALVFKTLVDRFTQKYDAGLQRRIEQYIAAQVTLQGISNFSGSLSDGSGLGEPKFE LTLSQFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLISNN’YQSTVSNiIWP7VRNDLNYVAOYWNQTGFDLWEE VN G S S F FA VAN QH RA LVE G AT L AT 7 LG Q S G S S Y S T V A P QIL C FLQK FW S P S G Y VIS N ∑ N S N DGR T G !< D S K SILTS∑HTF∑-PS∑GCDAATFQPCSDKALSNLKVYVDSFRS∑YGVNSG∑PAG7AVAVGRYPE7VYFNGNPW YLSTFAVAEQLYDALYVWKKTGSTTVTSTSLAFFQELVPSV7AGTYASSSS7FTSIVKAVSTYADGFVSE AAKYVPSÜGSLSEQFDKNTGTPLSAVríLTWSYASFLTA-TRRAGXVPPSWISSGANTVPSSCSGTTVAGS YSSPTATSFPPSQTPKTAATGTSFTPTACATPTSVAVTFHELATTVPGQT∑KVVGNAQALGNWSTSAGVA LNAVNCASNHPLW∑GPVNLKAGDVVEYKYINVGSDGSVTWEADPNHTYTVPAVACVTAVVKE∑JTWOS SEQ ID N°: 14 (GA de comprimento total de Trichoderma harziaπum; SQN31 de US7413879) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGSNGLSGVTKRSVDDSINTQTPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAV∑ ASPSTTDPDYYYMWTRDSALVFKN∑VDRFTEQYDAGLQRR∑EQYISAGVTLQGISNPSGSLSDGSGLGEP KFELTLSQFTGNWGRPQRDGPALRA∑ALIGYSKWL∑NNNYQSTVSN∑∑WP∑VRNDLNYVAQYWNQTGFD∑. WEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGCSGSTYSSVAPG∑LCFLQRFWVSGGY∑DSN∑NTNEGRTGK DANSLLAS’HTFDPSLGCDASTFOPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYSVNKG∑PAGAAVAVGRYPEDVYFNG NPWYLATFAAAEQLYDSVYVWKKTGS∑TVTSTSLAFFQELVPGVZ-iAGTYSSSQSTFTS∑∑NAVSTYADGs’ LSEAAKYVPADGSLAEQFDRNTGTPLSAVHLTWSYASFLTAAARRAGVVFPSWASSGANSVPSSCSGASV VGSYSRPTATSFPPSQTPKPGAPSGAPFTPIPCATPASVAVTFr.ELATTQFGQTIKVAGSAPELGNWSTS AAIALDAVNYATNH PLW T GSVN LEAGDVIEYKYISVGQDG S V7WES DFNHT YTV PAVACVTEWKEDTWQS SEQ ID N°: 15 (GA de comprimento total de Trichoderma lonqibrachia- tum; SQN33 de US7413879) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGSSGLSDVTKRSVDDFISTETPIALNNLLCNVGFDGCRAFGTSAGAVI ASPSTIDPDYYYMWTRDSALVFKKLVDRFTETYDAGLQRRIEQYTTAQVTLQGLSNPSGSLTDGSGLGF.P KFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAVALTGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPTVRNDLKYVAQYWNQTGFDL WEEVNGSSFFTMANQHRALVEGATLAATLGQSGSTYSSVAPQILCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTG KDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAATFQPCSDKALSNLKVWDSFRSIYGVNKGIFAGAAVAIGRYAEDVYFN GNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVAAGTYASSSSTFTN∑INAVSTYADG FLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWANSSASTIPSTCSGAS VVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGQTVKVAGNAPALGNWSA SAAVALDATNYADNHPLWIGTVDLEAGDVVEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS SEQ ID N°: 16 (GA de comprimento total de Trichoderma asperellum; SQN35 de US7413879) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGSNGLSGVTKRSVDDFINTQTPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVI ASPST7DPDYYYMWTRDSALVFKNIVDRFTQQYDAGLQRRIEQYISAQVTLQGISNPSGSLSDGSGLGEP KFELTLSQFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQS7VSNIIWPIVRNDLNYVACYWNQTGFDL WEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSTYSSVAPGILCFLQRFWVSGGYIDSNINTNEGRTGK DANSLI.ASIHTFDPSLGCDASTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGSAVAIGRYPEDVYFNG NPWYLATFAAAEQLYDSVYVWKKTGSTTVTSTSLAFFQELVPGVAAGTYSSSQSTFTSIINAVSTYADGF LSEAAKYVPADGSLAEQFDRNTGTPLSAVHLTWSYASFLTAAARRAGVVPPSWASSGANSVPSSCSGASV VGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPFTPIPCATPTSVAVTFHELATTQFGQTIKVAGSAPELGNWSTS AAIALDAVNYATNHPLWTGSVSLEAGDVJEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTEVVKEDTWQS SEQ ID N°: 17 (GA de comprimento total de Trichoderma strictipilis-, SQN37 de US7413879) MHVLSTAAT/JGSVAVQKVLGR?GSSGLS7:77KRSVCC'F7STQTPIALXNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAV: ASPSTTDPDYYYMWTRDSALVFKl^LVDRFTETYDAGLQRRIEGYITAQVTLQGLTNPSGSLADGSGLGEP KFELTLSPFTGNWGRPQRDGPALRAZALIGYSKWLZNNNYQSTVSNVIWPIVRNDLSYAAQYTiíNQTGFDL KEEVSGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSTYSSVAPQ∑LCFLQRFWVSSGGYVDSN∑N.NEGRTG KDVNSILTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSK"KWArDSFPGIYGVNNG∑PAGAAVAIGRYPEDVYFN GNPWYLATFAAAEQLYDA∑YVW?3<TGSIT\TAISLAFFQELVPGVTAGTYSSSQSTFTNIINAASTYADG FVTEAAKYVPTDGSLAEQFDRNNGTFLSALRL7WSYASFL7ASARRAGWPPSKANSSASSISSTCSGAS WGSYSSPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPY.PLPCATPTSVAVTTHELVSTQFGQTVKAAGSAPALGNWST SAAVGLDAVKYADNHPLWIGTVELEAGDVXT.YK’i’IN’/GQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTEWKEDTWQS SEQ ID N°: 18 (GA de comprimento total de Trichoderma virens Gv29- 8; EHK25059.1) MHVLSTAVLLGSVAVQKVLGRPGSNGLSDITKRSVDSFISAETFIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVI ASPSTVDPDYYYMWTRDSALVFKKIVDRFTQKYDAGL3RRLEQYISAQV7LQGISNPSGSLSDGSGLGEP KFELTLNQFTGKWGRPQRDGFALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSSVIKPIVKNDLNYVAQYWNQTGFDL WEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLATTLGQSGSTYSSVAFQTLCFLQRFWVSGSYIDSN∑NVNEGRTGK DANSLLASIHTFDPSLGCDA5TF2PCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNSGISASSAVATGRYPEDVYFNG NPWYLATFAAAEQLYDALYVWKQAGSITVTSTSLAFFQQLVPGVAAGTYSSSQSTYTSIINAVSAYADGF MNEAAKYVPADGSLAEQFDKNSGTPLSAVHLTWSYASFLTAADRRAGIVPSSWASSGANTVPSSCSGASV VGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPFTPIPCATPTSVAVTFHELATTQFGQTIKVVGSVPELGNWSTN AAVALNAVNYASNHPLWLGSINLAAGEVVQYKYINVGSDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS SEQ ID N°: 19 (GA de comprimento total de Trichoderma atroviride IMI 206040; EHK49034.1) MHVL S TAVLLG SVAVQKVLGRPGASDITKRAVTD FINSET FIALNNLICNVGPDG CRAFGTSIGAWAS P STTDPDYFYMWTRDSALVFKTLVDRFTQNYDAGLQRRZEQYIAAQVTLQGISNPSGSLSDGSGLGEPKFE LTLSQFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLISNNYQSTVSNIIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEE VNGSSFFTVANQHRALVEGA.TLATTLGQSGSSYSTVAPQILCFLQKFWSPSGYVISNINSNDGRTGKDSN SILTSIHTFDPSIGCDAATFQPCSDKALSNLKVYVDSFRSIYGVNSGIPAGTAVAVGRYPEDVYFNGNPW YLSTFAVAEQLYDALYVWKKTGSITVTSTSLAFFQELVPSVTAGTYASSSSTFTSIVNAVSTYADGFVSE AAKYVPSDGSLSEQFDKNTGTPLSAVHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWISSGANTVPSSCSGTTVAGS YSSPTATSFPPSQTPKTAATGTSFTPIACATPTSVAVTFHEJ.ATTVPGQTIKVVGNAQALGNWSTSAGVA LNAVNYASNHPLWIGPVNLKAGDWEYKYINVGSDGSVTWEADPNHTYTVPAVACVTAVVKEDTWQS

Claims (16)

1. Variante de glicoamilase, caracterizada pelo fato de que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, com substituições de aminoácidos nas posições: 50, 417, 430, 511, 539 e 563, em que a substituição de aminoácido na posição 50 é M50Y, G, F ou K.

2. Variante de glicoamilase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácido na posição 50 é M50Y, e/ou em que as substituições de aminoácidos nas posições 417, 430, 511, 539 e 563 são: L417V, T430A, Q511H, A539R e N563I, respectivamente.

3. Variante de glicoamilase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 6.

4. Variante de glicoamilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais substituições adicionais de aminoácidos que correspondem às posições: 43, 44, 61, 73, 294, 431, 503 ou 535 de SEQ ID N°: 2.

5. Variante de glicoamilase, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as substituições de aminoácidos são: I43Q/R, D44C/R, N61I, G73F, G294C, A431L/Q, E503A/V e/ou A535R.

6. Composição enzimática, caracterizada pelo fato de que compreende a variante de glicoamilase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Composição enzimática de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma hexoquinase, uma xilanase, uma glicose isomerase, uma xilose isomerase, uma fosfatase, uma fitase, uma pululanase, uma β-amilase, uma α-amilase, uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, uma trealase, uma isoamilase, uma enzima redox, um esterase, uma transferase, uma pectinase, uma liase, uma α- glicosidase, uma β-glicosidase ou uma combinação das mesmas.

8. Método de processamento de amido, caracterizado pelo fato de que compreende colocar um substrato de amido em contato com a variante de glicoamilase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a composição enzimática como definida na reivindicação 6 ou 7, para produzir uma composição que compreende glicose.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar uma hexoquinase, uma xilanase, uma glicose isomerase, uma xilose isomerase, uma fosfatase, uma fitase, uma pululanase, uma β-amilase, uma α-amilase, uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, uma trealase, uma isoamilase, uma enzima redox, uma esterase, uma transferase, uma pectinase, uma hidrolase, uma alfa-glicosidase, uma beta-glicosidase ou uma combinação das mesmas ao substrato de amido.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o processamento do amido compreende a sacarificação do substrato de amido resultando em um xarope de alta glicose.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a fermentação da composição que compreende glicose em um produto final.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a sacarificação e a fermentação são realizadas como um processo simultâneo de sacarificação e fermentação (SSF).

13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o produto final é: (a) álcool; ou (b) ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glicônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, glucona delta-lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo ômega 3, butanol, lisina, ácido itacônico, 1,3-propanodiol, biodiesel ou isopreno.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o álcool é etanol.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que o substrato de amido: (a) é de 15% a 50% de sólidos secos (DS); e/ou (b) é selecionado dentre trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelo, mandioca, milo, painço, batata, batata-doce, tapioca e qualquer combinação dos mesmos; e/ou (c) compreende amido liquefeito, amido gelatinizado ou amido granular.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que a glicoamilase é dosada a uma faixa de 0,2 a 1,0 unidade de glicoamilase (GAU) por grama de amido sólido seco (dss).

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