ES2711767T3 - Procedimiento de determinación de la glicosilación de un anticuerpo - Google Patents

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Abstract

Procedimiento in vitro de determinación de la unión de un anticuerpo competidor con un receptor de Fc expresado en membranas celulares o células intactas presentes en un medio de medición, mediante competencia con un anticuerpo de referencia, que comprende las siguientes etapas: (i) marcaje directo de dicho receptor de Fc mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET, o bien introducción en el medio de membranas celulares o de células intactas cuyos receptores de Fc se han marcado previamente de manera directa mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET; (ii) adición en el medio de medición del anticuerpo competidor; (iii) adición en el medio de medición de un anticuerpo de referencia, marcado de manera directa mediante el segundo miembro de dicho par de parejas de FRET; (iv) medición de la señal de FRET, siendo una disminución de la señal medida en presencia del anticuerpo competidor con respecto a la medida en su ausencia representativa de la unión de este anticuerpo al receptor de Fc; caracterizado porque el receptor de Fc se marca de manera directa mediante una enzima suicida, a saber, que se expresa en forma de una proteína de fusión que comprende el receptor de Fc y la enzima suicida, y que el marcaje se realiza mediante adición al medio de medición del sustrato de la enzima, conjugado a una de las parejas de FRET.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento de determinacion de la glicosilacion de un anticuerpo
Campo de la invencion:
La invencion se refiere a un procedimiento de deteccion de la union de un anticuerpo a un receptor de fragmented cristalizables Fc (en adelante “receptores de Fc” o FcR) presentes en la superficie de una celula y tambien a un procedimiento de determinacion del nivel de glicosilacion de un anticuerpo.
Estado de la tecnica
Los anticuerpos monoclonales recombinantes han permitido, desde hace algunos anos, una revolucion terapeutica. Aunque ya no hace falta demostrar su eficacia clmica, sigue conociendose poco su modo de accion en los pacientes. El efecto terapeutico de los anticuerpos que seleccionan como diana antigenos de membrana pasa concretamente por el reclutamiento de celulas efectoras que expresan receptores para el fragmento cristalizable de los anticuerpos (en adelante, “receptores de Fc”).
Los receptores de Fc son protemas presentes en la superficie de determinadas celulas que contribuyen a las funciones del sistema inmunitario, en particular, de las celulas NK (“natural killer’, linfocitos citolfticos naturales), de los macrofagos, de los neutrofilos y de los mastocitos. Su nombre proviene de su capacidad para unirse a la region Fc (fragmento cristalizable) de los anticuerpos. Existen varios tipos, que se clasifican en funcion del tipo de anticuerpo que reconocen: los receptores de Fc gamma (FcyR) se unen a IgG, el receptor de Fc alfa (FcaR) se une a IgA y los receptores de Fc epsilon (FceR) se unen a IgE.
La union del receptor de Fc con un anticuerpo desencadena diferentes mecanismos en funcion de la naturaleza de la celula en la que se expresa ese receptor. La tabla 1 es un resumen de la distribucion celular de los diferentes receptores de Fc y de los mecanismos desencadenados por la union del receptor a un anticuerpo.
Tabla 1
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Con respecto a la importancia de los mecanismos asociados con la union de los receptores de Fc a los anticuerpos, sena particularmente ventajoso poder detectar esta union cuando estos receptores estan en un contexto celular, en particular en el contexto del desarrollo de anticuerpos o de fragmentos Fc con fines de diagnostico o terapeuticos. Actualmente se comercializan anticuerpos terapeuticos que desencadenan el mecanismo ADCC (Herceptin®, Cetuximab®) y que estan indicados en el tratamiento de determinados canceres: el fragmento Fc de estos anticuerpos se une a un receptor de Fc presente en las celulas NK, mientras que los dominios variables de estos anticuerpos reconocen un antfgeno presente en celulas tumorales (Herceptin: Her2, Cetuximab: Her1). La union de estos anticuerpos a la vez a una celula NK y a una celula cancerosa conlleva concretamente la destruccion de esta ultima mediante la activacion del mecanismo ADCC.
Por otro lado, se sabe que la glicosilacion del fragmento Fc de los anticuerpos influye en la afinidad de estos anticuerpos por los FcR, y por tanto en su capacidad para reclutar celulas efectoras. En particular, anticuerpos terapeuticos modificados que no comprenden o que comprenden pocos residuos fucosos a nivel de los grupos N-glicano del fragmento Fc provocan una fuerte respuesta ADCC a bajas concentraciones y con una eficacia mucho mejor en comparacion con sus equivalentes fucosilados (Shields et al, J Biol Chem. 26 de julio de 2002; 277(30):26733-40, Suzuki et al Clin Cancer Res. 15 de marzo de 2007; 13(6): 1875-82). La union de los anticuerpos a los FcR se ha medido en estos estudios mediante una valoracion de tipo ELISA (acronimo de “enzyme linked immunosorbent assay’, ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas), o bien de manera funcional, mediante la medicion de la respuesta ADCC.
De manera general, un metodo de deteccion de la union de anticuerpos potencialmente terapeuticos a los receptores de Fc expresados por una celula intacta sena una herramienta valiosa para el desarrollo de anticuerpos terapeuticos, o incluso para el estudio de mecanismos del sistema inmunitario mediados por los receptores de Fc. Las tecnicas actualmente disponibles para estudiar la union de anticuerpos a los receptores de Fc son relativamente tediosas.
El sistema comercializado con el nombre Biacore® permite la deteccion de interacciones entre dos parejas de union y se basa en el fenomeno de la resonancia de plasmon superficial. Este sistema se ha usado para estudiar el efecto de la glicosilacion de fragmentos Fc de anticuerpos sobre su union al receptor de FcyRIII. Necesita la inmovilizacion del receptor de Fc o bien de un fragmento del dominio Fc del anticuerpo sometido a prueba con un microchip, capaz de generar una senal que depende del mdice de refraccion en su superficie (Biacore Journal Number 1, 2009, 15­ 17). Este enfoque presenta varios inconvenientes, concretamente una etapa cntica de fijacion de una de las parejas de union a la superficie del microchip, la necesidad de un equipo costoso que requiere una determinada practica, y el hecho de que la tecnica no permite trabajar con celulas vivas que expresan el receptor de Fc estudiado. Por otro lado, este enfoque tampoco proporciona informacion en cuanto a la eventual union del anticuerpo sometido a prueba con su antfgeno en su conformacion celular.
La solicitud de patente francesa FR2844521 describe un enfoque segun el cual se pone un anticuerpo en contacto con celulas que expresan el receptor CD16 en presencia del antfgeno de dicho anticuerpo, y se mide al menos una citocina producida por las celulas, siendo un aumento de la cantidad de citocina representativo de la activacion de dichas celulas. Esta tecnica no permite la medicion directa de la union del anticuerpo al FcR. Tambien necesita una etapa de centrifugacion del sobrenadante para detectar las citocinas secretadas por las celulas.
La solicitud de patente europea EP 1298219 describe un metodo de valoracion del efecto del fragmento Fc de un anticuerpo sobre una celula que expresa un FcR, que consiste en inmovilizar dicho anticuerpo sobre un soporte solido, en cultivar celulas que expresan dicho receptor en presencia de dicho anticuerpo, y en medir el eventual efecto del FcR en presencia del anticuerpo. En este metodo, la activacion del FcR tambien se mide de manera indirecta detectando la produccion de citocinas por la celula. Esta tecnica presenta los mismos inconvenientes que la descrita en la solicitud FR2844521, concretamente una etapa de centrifugacion.
La solicitud de patente estadounidense US 2009/0176220 presenta una variante de los enfoques anteriores que consiste en poner en contacto celulas que expresan FcR con anticuerpos que han sido objeto de una agregacion previa. Como en las tecnicas anteriores, la activacion de las celulas se determina mediante la medicion de citocinas secretadas por la celula.
La comparMa Cisbio Bioassays comercializa una gama de productos con la denominacion Tag-lite®, que permite el marcaje de protemas expresadas por celulas mediante compuestos fluorescentes, asf como compuestos fluorescentes parejas de FRET (HTRF®). Dado que el fenomeno de FRET entre un compuesto donador de energfa y un compuesto aceptor depende de la distancia entre estos dos compuestos, los productos de la gama Tag-lite® permiten estudiar interacciones moleculares en un contexto celular. Una de las aplicaciones de esta tecnica es el estudio de la interaccion entre un receptor acoplado a las protemas G (RCPG) marcado mediante una pareja de FRET, con su ligando marcado mediante una segunda pareja de FRET. Este enfoque permite, por ejemplo, efectuar valoraciones mediante competencia para evaluar la union de nuevos ligandos potenciales de estos RCPG. Otro ejemplo de aplicacion de estos productos es el estudio de la dimerizacion de RCPG marcados mediante compuestos parejas de FRET.
En la actualidad no existe ningun metodo que permita medir directamente la union de un anticuerpo a un receptor de Fc expresado en la superficie de una celula intacta. Las tecnicas existentes presentan varios inconvenientes: valoraciones indirectas de citocinas secretadas por las celulas, etapas de centrifugacion poco adaptadas a una puesta en practica automatizada, o incluso el uso de enfoques que necesitan etapas preliminares tediosas y cuya puesta en practica es relativamente larga. Estas tecnicas tampoco permiten obtener de manera facil y rapida informacion sobre el nivel de glicosilacion de un anticuerpo dado y su efecto sobre la union a los receptores de Fc. Los inventores han puesto a punto un metodo que permite resolver estos problemas.
Descripcion
La solicitud describe un procedimiento in vitro de determinacion de la union de un anticuerpo con un receptor de Fc expresado en membranas celulares o celulas intactas presentes en un medio de medicion, que comprende las siguientes etapas:
(i) marcaje directo o indirecto de dicho receptor de Fc mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET, o bien introduccion en el medio de membranas celulares o de celulas intactas cuyos receptores de Fc se han marcado previamente de manera directa mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET;
(ii) adicion en el medio de medicion de dicho anticuerpo, marcado de manera directa o indirecta mediante el segundo miembro de dicho par de parejas de FRET;
(iii) medicion de la serial de FRET, siendo la existencia de una serial de FRET representativa de la union del anticuerpo al receptor de Fc.
Este procedimiento puede usarse concretamente para determinar la constante de disociacion de un complejo receptor de Fc-anticuerpo. En este caso, se repite con diferentes concentraciones de anticuerpo, en particular concentraciones crecientes de anticuerpo, con el fin de establecer una curva de saturacion, que representa la evolucion de la serial de FRET en funcion de la concentracion de anticuerpo. Esta curva permite determinar la constante de disociacion (“Kd”), correspondiente a la concentracion de anticuerpo al 50% de la saturacion del receptor de Fc.
La invencion se refiere a un formato de valoracion mediante competencia. Por tanto, la invencion consiste en un procedimiento in vitro de determinacion de la union de un anticuerpo (en adelante “anticuerpo competidor”) con un receptor de Fc expresado en membranas celulares o celulas intactas presentes en un medio de medicion, mediante competencia con un anticuerpo de referencia, que comprende las siguientes etapas:
(i) marcaje directo de dicho receptor de Fc mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET, o bien introduccion en el medio de membranas celulares o de celulas intactas cuyos receptores de Fc se han marcado previamente de manera directa mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET;
(ii) adicion en el medio de medicion del anticuerpo competidor;
(iii) adicion en el medio de medicion de un anticuerpo de referencia, marcado de manera directa mediante el segundo miembro de dicho par de parejas de FRET;
(iv) medicion de la serial de FRET, siendo una disminucion de la serial medida en presencia del anticuerpo competidor con respecto a la medida en su ausencia representativa de la union de este anticuerpo al receptor de Fc; caracterizado porque el receptor de Fc se marca de manera directa mediante una enzima suicida, a saber, que se expresa en forma de una protema de fusion que comprende el receptor de Fc y la enzima suicida, y que el marcaje se realiza mediante adicion al medio de medicion del sustrato de la enzima, conjugado a una de las parejas de FRET.
Las etapas (i) (ii) y (iii) se ponen en practica preferiblemente en este orden, pero es posible poner en contacto los diferentes elementos en un orden diferente (por ejemplo ((i), (iii), (ii)), o incluso simultaneamente.
La etapa (iv) se pone en practica tras un tiempo de incubacion que puede ir de algunos minutos (por ejemplo 3, 4, 5 minutos) a varias horas (por ejemplo, de 1 a 20 horas).
Si se conoce la concentracion del anticuerpo competidor, entonces puede compararse la senal obtenida en la etapa (iv) con la senal medida cuando se pone en practica el procedimiento con un anticuerpo de referencia no marcado en lugar del anticuerpo competidor, y concluir en cuanto a la afinidad de este ultimo por el receptor de Fc. En particular, a igual concentracion, si la senal de FRET medida en presencia del anticuerpo competidor es inferior a la medida en presencia del anticuerpo de referencia no marcado, entonces el anticuerpo competidor tiene una afinidad mejor que este ultimo, y a la inversa. El anticuerpo de referencia no marcado puede ser el mismo que el de la etapa (iii), o bien otro anticuerpo con el que se desea comparar el anticuerpo competidor.
Por otro lado, cuando el procedimiento de valoracion mediante competencia anterior se repite en presencia de diferentes cantidades de anticuerpo que van a someterse a prueba y de una cantidad fija de anticuerpo de referencia, los resultados obtenidos permiten determinar la CE50 del anticuerpo competidor. La CE50 del anticuerpo puede compararse con la del anticuerpo de referencia, siendo el anticuerpo que tiene la CE50 mas baja el que tiene una mejor afinidad por el receptor de Fc. Por “CE50” se entiende la concentracion que permite alcanzar el 50% de un efecto dado. En este caso, la CE50 de un anticuerpo competidor corresponded a la concentracion de este anticuerpo que inhibe el 50% de la union del anticuerpo de referencia al receptor de Fc. El experto en la tecnica esta familiarizado con esta nocion y hay programas informaticos disponibles para calcular automaticamente las CE50 a partir de los resultados obtenidos en el contexto de la puesta en practica anterior.
Debe observarse que el procedimiento segun la invencion no necesita que el anticuerpo competidor se use de forma purificada: puede estar incluido en una mezcla, por ejemplo, un sobrenadante de cultivo de celulas que producen este anticuerpo. Una de las ventajas del procedimiento de la invencion es poder estudiar anticuerpos no purificados, ya que no necesita etapas tediosas de preparacion de los anticuerpos que van a someterse a prueba.
Los procedimientos anteriores se ponen en practica con receptores de Fc expresados en membranas celulares o celulas intactas. Estas membranas pueden prepararse de manera clasica a partir de celulas sometidas a un tratamiento qmmico o mecanico. El termino “membranas celulares” incluye las membranas de celulas intactas, y la puesta en practica de la invencion con celulas intactas es particularmente ventajosa y preferida ya que el procedimiento se realiza entonces en un contexto relativamente proximo a la realidad biologica.
Por “anticuerpo de referencia” se entiende un anticuerpo del que se sabe con seguridad que se fija al receptor de Fc. Por tanto, si el receptor de Fc es un receptor de Fc gamma (FcyR), el anticuerpo de referencia podra ser cualquier anticuerpo de la clase de las IgG, independientemente de su especificidad epitopica. Asimismo, si el receptor de Fc es un receptor de Fc alfa o epsilon, el anticuerpo de referencia podra ser cualquier anticuerpo de la clase de las IgA o de las IgE, respectivamente.
De manera inesperada, el procedimiento segun la invencion es lo suficientemente sensible como para permitir la observacion de variaciones de afinidad cuando se realizan determinadas modificaciones en los anticuerpos. Mas precisamente, los inventores han descubierto que las modificaciones conocidas para aumentar o disminuir la afinidad de un anticuerpo con un receptor de Fc estaban correlacionadas con variaciones de CE50 medidas con el procedimiento segun la invencion.
Por tanto, en una realizacion particular, el anticuerpo de referencia y el anticuerpo competidor difieren concretamente en que este ultimo se ha preparado segun un procedimiento, o bien ha sido objeto de un tratamiento, destinado a alterar el nivel de glicosilacion de su fragmento Fc.
En particular y en una realizacion preferida, el anticuerpo que va a someterse a prueba se ha preparado segun un procedimiento, o bien ha sido objeto de un tratamiento, destinado a alterar la fucosilacion de su fragmento Fc. Tales procedimientos y tratamientos los conoce el experto en la tecnica y se usan para mejorar la eficacia de determinados anticuerpos terapeuticos. Estos tratamientos, descritos entre otros por Yamane-Ohnuki et al. (MAbs. mayo-junio de 2009; 1(3):230-6) son de tres tipos:
- Procedimiento de produccion de anticuerpos mediante ingeniena genetica en organismos eucariotas (levaduras) o celulas vegetales en los que las vfas de N-glicosilacion se han modificado para hacer que sean mas proximas a las de los mairnferos: este enfoque consiste en desactivar determinados genes implicados en los mecanismos de N-glicosilacion de estos organismos y en introducir otros genes que son espedficos de las vfas de N-glicosilacion de los marnfferos.
- Procedimiento de produccion de anticuerpos mediante ingeniena genetica en celulas de mairnferos (1) que tienen de manera natural una actividad intrmseca de fucosilacion a-1,6 limitada, o (2) en las que los mecanismos de fucosilacion a-1,6 se han inhibido mediante la introduccion de pequenas cadenas de ARN de interferencia (conocidos con el acronimo ARNip), o incluso (3) en las que se ha introducido el ADN que codifica para la p-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa (GnTIII) y codificando este para la a-manosidasa II (ManII) del Golgi, o finalmente (4) cuya funcion de fucosilacion a-1,6 se ha inhibido a nivel del locus genomico responsable de esta via de glicosilacion. - Control de la fucosilacion de anticuerpos in vitro, mediante tratamiento con enzimas que catalizan la fucosilacion de protemas no fucosiladas o bien fucosilasas capaces de escindir los residuos de azucar de protemas fucosiladas. La invencion permite someter facilmente a prueba los anticuerpos asf obtenidos para determinar su capacidad a unirse a los receptores de Fc, lo cual constituye una informacion muy valiosa ya que es indicativa de la potencial eficacia terapeutica de estos anticuerpos.
Una variante de la invencion permite determinar el nivel de glicosilacion de un anticuerpo que va a someterse a prueba. Se caracteriza porque comprende las siguientes etapas:
- puesta en practica del procedimiento de valoracion mediante competencia con varios anticuerpos competidores que tienen niveles conocidos de glicosilacion o de desglicosilacion, repitiendose este procedimiento en presencia de diferentes cantidades de cada anticuerpo competidory de una cantidad fija de anticuerpo de referencia, despues - puesta en practica del procedimiento de valoracion mediante competencia, pero esta vez con el anticuerpo que va a someterse a prueba como anticuerpo competidor, repitiendose este procedimiento en presencia de diferentes cantidades de anticuerpo que va a someterse a prueba y de una cantidad fija de anticuerpo de referencia, y - determinacion del nivel de glicosilacion del anticuerpo sometido a prueba mediante comparacion de su CE50 con la de cada uno de los anticuerpos competidores cuyos los niveles de glicosilacion o de desglicosilacion se conocen. Este procedimiento permite en particular determinar el nivel de fucosilacion de un anticuerpo.
Estas ultimas puestas en practica que permiten el estudio de anticuerpos cuya glicosilacion o fucosilacion se ha limitado de una manera u otra, estan particularmente adaptadas al caso en el que el receptor de Fc es un receptor de Fc gamma y en particular el receptor CD16a o una de sus variantes, cuya union a los fragmentos Fc de los anticuerpos de la clase de las IgG1 se sabe que esta asociada al nivel de fucosilacion de estos anticuerpos. En la medida en que el nivel de fucosilacion de los anticuerpos esta directamente correlacionado con la intensidad de la respuesta de la celula efectora, por ejemplo, con la intensidad de la respuesta ADCC, este procedimiento permite predecir la capacidad del anticuerpo para desencadenar una respuesta mediante la celula efectora.
En las puestas en practica anteriores, tambien pueden usarse membranas celulares cuyos receptores se han marcado previamente (y las membranas celulares eventualmente congeladas), y la etapa (i) consiste en la introduccion en el medio de medicion de membranas celulares cuyos receptores de Fc se han marcado previamente de manera directa mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET. En el caso en el que se usan celulas marcadas congeladas, habran sido objeto de un lavado tras su descongelacion y previamente a su adicion en el medio de medicion.
Los terminos usados anteriormente tienen los siguientes significados:
“Par de parejas de FRET”: esta expresion designa un par constituido por un compuesto fluorescente donador de energfa (en adelante “compuesto fluorescente donador”) y por un compuesto aceptor de energfa (en adelante “compuesto aceptor”); cuando se encuentran en proximidad uno de otro y cuando se excitan a la longitud de onda de excitacion del compuesto fluorescente donador, estos compuestos emiten una senal de FRET. Se sabe que para que dos compuestos fluorescentes sean parejas de FRET, el espectro de emision del compuesto fluorescente donador debe recubrir parcialmente el espectro de excitacion del compuesto aceptor.
“Senal de FRET”: designa cualquier senal medible representativa de un FRET entre un compuesto fluorescente donador y un compuesto aceptor. Por tanto, una senal de FRET puede ser una variacion de la intensidad o del tiempo de vida de luminiscencia del compuesto fluorescente donador o del compuesto aceptor cuando este ultimo es fluorescente.
“Medio de medicion”: designa el contenido del pocillo de una placa, de un tubo de ensayo o de cualquier otro recipiente apropiado para el mezclado de celulas o de membranas celulares con los reactivos necesarios para la puesta en practica de la invencion.
El receptor de Fc se elige de los receptores de la tabla 1, y de manera preferida es el receptor CD16a (FcyRIMa) o una de sus variantes. Se conocen varias variantes de este receptor, en particular las variantes naturales L66H, L66R, G147D, Y158H, F203S, F176V (o F158V en determinadas publicaciones). En una realizacion preferida, es la variante V158 (o V176) la que se usa. En otra realizacion es la variante F158 (o F176).
A continuacion, se describen los diferentes medios de marcaje del receptor de Fc, pero segun la invencion el receptor de Fc se marca de manera directa mediante una enzima suicida, pudiendo esta enzima elegirse en particular de: los mutantes de la deshalogenasa, o un fragmento de la protema de transporte de acilos, los mutantes de la O6-alquilguanina ADN alquiltransferasa, prefiriendose estos ultimos. Tal como se indica por otro lado, este metodo de marcaje del receptor de Fc implica que las celulas hayan sido objeto de un tratamiento previo que permite la expresion de una protema de fusion que comprende el receptor de Fc y la enzima suicida. El marcaje se realizara mediante adicion del sustrato de la enzima, conjugado a uno de los miembros del par de parejas de FRET.
Asimismo, a continuacion, se describen los medios de marcaje del anticuerpo marcado mediante fluoroforo, pero de manera preferida este anticuerpo se marca de manera directa mediante union covalente con una de las parejas de FRET.
En una realizacion particular, el receptor de Fc se marca mediante el compuesto aceptor y el anticuerpo mediante el compuesto donador. En otra realizacion, el receptor de Fc se marca mediante el compuesto donador y el anticuerpo mediante el compuesto aceptor. Se prefiere esta ultima realizacion.
Marcaje del receptor de Fc
(a) Acoplamiento del receptor de Fc con un donador o un aceptor de manera indirecta (no covalente), acoplamiento no comprendido en la presente invencion
El donador o el aceptor pueden acoplarse con el receptor de Fc mediante una protema capaz de asociarse al receptor de Fc, marcandose esta propia protema de manera directa o indirecta mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET. Por ejemplo, se conoce que el receptor de FcyRIMA (CD16a) se asocia en la membrana celular a la cadena gamma del receptor de FceRI o a la subunidad zeta de CD3; el receptor CD16a puede marcarse por tanto de manera indirecta a traves de estas cadenas gamma o zeta, a su vez marcadas directamente mediante un compuesto fluorescente.
El donador o el aceptor puede acoplarse con el receptor de Fc por medio de un par de parejas de union del que al menos una es de naturaleza proteica. En este enfoque, el receptor de Fc se fusiona con la pareja de union de naturaleza proteica mediante las tecnicas clasicas de biologfa molecular (construccion de un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica para el receptor de Fc, fusionada con la que codifica para la pareja de union proteica, e introduccion del vector de expresion en la celula). El donador o el aceptor se conjuga de manera covalente a la otra pareja de union, que en este caso se denomina agente de acoplamiento, que a continuacion se anadira al medio extracelular. El reconocimiento de las parejas de union permite el marcaje indirecto del receptor de Fc mediante el donador o el aceptor.
A modo de ejemplo no limitativo de este tipo de parejas de union, pueden mencionarse:
• El par constituido por un anticuerpo espedfico para un epttopo presente de manera natural en el receptor de Fc, marcado mediante un compuesto fluorescente, y este epftopo. Cuando se usa este metodo de marcaje, conviene verificar que la union de este anticuerpo a este epftopo no entorpece la union del receptor de Fc a los fragmentos Fc de anticuerpo. Por otro lado, en esta realizacion, conviene evitar usar un anticuerpo cuyo fragmento constante pueda reconocerse por el receptor de Fc de interes.
• El par constituido por la secuencia cistema-cistema-X-X-cistema-cistema (SEQ ID NO. 1) en la que X es un aminoacido cualquiera y un compuesto de biarsenico. Estos compuestos de biarsenico pueden marcarse facilmente con una molecula organica del tipo fluorescema o rodamina (vease B. A. Griffin et al. (1998) Science. 1998, 281, 269-271 y S.A. Adams et al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6063-6076 para detalles sobre la tecnologfa). • El peptido BTX (bungarotoxina), compuesto por 13 aminoacidos que se reconoce por la bungarotoxine (BTX), puede acoplarse a una molecula fluorescente (vease C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952).
• El par estreptavidina (o avidina) / biotina: la secuencia de union de la estreptavidina (SBP-Tag) es una secuencia formada por 38 aminoacidos que presenta una alta afinidad por la biotina que puede marcarse previamente con un donador o un aceptor (vease C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952).
• La secuencia de la enzima dihidrofolato reductasa de E. coli (eDHFR) que se une de manera espedfica y con una alta afinidad a ligandos, tales como la trimetoprima, en los que pueden injertarse el donador o el aceptor segun la tecnologfa denominada “Ligand link Universal labelling technology” (tecnologfa de marcaje universal de union a ligandos) de la comparua Active Motif.
• Los pares etiquetas/antietiquetas son parejas de union frecuentemente usadas para marcar protemas. El termino “etiqueta” designa una pequena “etiqueta” proteica constituida por una secuencia de aminoacidos, generalmente, pero no obligatoriamente, bastante corta (menos de 15 aminoacidos), que se fusiona al receptor de Fc. El termino “antietiqueta” designa un anticuerpo que se une de manera espedfica a dicha “etiqueta”. En esta realizacion, el anticuerpo “antietiqueta” se une de manera covalente al donador o al aceptor. Cuando el anticuerpo asf marcado se anade al medio extracelular, se une a la “etiqueta” conjugada al receptor de Fc y la interaccion “etiqueta/antietiqueta” permite el marcaje indirecto de esta protema mediante el donador o el aceptor. A modo de ejemplo no limitativo de pares “etiquetas/antietiquetas”, pueden mencionarse los siguientes pares cuyos miembros estan comercialmente disponibles: GST/anticuerpo anti-GST en el que GST representa la glutation S-transferasa o uno de sus fragmentos; 6HIS/anticuerpo anti-6HIS en el que 6HIS es un peptido constituido por 6 histidinas; Myc/anticuerpo anti-Myc en el que Myc es un peptido constituido por los aminoacidos 410-419 de la protema Myc humana; FLAG/anticuerpo anti­ FlAG en el que FLAG es un peptido que tiene los 8 aminoacidos DYKDDDDK (Se Q ID NO. 2); HA/anticuerpo anti HA en el que HA es un epttopo de la hemaglutinina de influenza, constituido por los 9 aminoacidos YPYDVPFYA (SEQ ID NO. 3). Queda claro que la naturaleza exacta de la etiqueta no es cntica para la puesta en practica del procedimiento.
(b) Acoplamiento del receptor de Fc con un donador o un aceptor de manera covalente, acoplamiento no comprendido en la presente invencion
En este enfoque, el donador o el aceptor se acopla al receptor de Fc mediante una union covalente; se han descrito varias tecnicas y los reactivos necesarios para sus puestas en practica estan comercialmente disponibles. Para este acoplamiento, podra usarse una de las siguientes tecnicas:
• Formacion de una union covalente a nivel de un grupo reactivo presente en el receptor de Fc, en particular a nivel de uno de los siguientes grupos: el grupo amino terminal, los grupos carboxilato de los acidos asparticos y glutamicos, los grupos amina de las lisinas, los grupos guanidina de las argininas, los grupos tiol de las cistemas, los grupos fenol de las tirosinas, los ciclos indol de los triptofanos, los grupos tioeter de las metioninas, los grupos imidazol de las histidinas.
Estos grupos presentes en el receptor de Fc pueden formar una union covalente con un grupo reactivo portado por el donador o el aceptor. Los grupos reactivos apropiados los conoce el experto en la materia: un donador o el aceptor funcionalizado mediante un grupo maleimida sera capaz de, por ejemplo, unirse de manera covalente con los grupos tiol portados por las cistemas de la protema. Asf mismo, un donador/aceptor que porta un ester de N-hidroxisuccinimida sera capaz de fijarse de manera covalente a una amina del receptor de membrana.
(c) Acoplamiento del receptor de Fc con un donador o un aceptor de manera covalente usando una enzima suicida, acoplamiento segun la invencion
Por enzima suicida se entienden protemas que tienen una actividad enzimatica modificada mediante mutaciones espedficas que les confieren la capacidad de unirse rapidamente y de manera covalente a un sustrato. Estas enzimas se denominan “suicidas” porque cada una solo puede unirse a una unica molecula fluorescente, bloqueandose la actividad de la enzima mediante la fijacion del sustrato. Estas enzimas constituyen por consiguiente una herramienta de eleccion para marcar de manera espedfica receptores de interes con una razon de una molecula fluorescente con respecto a una protema. En este enfoque, se fusiona una enzima suicida, mediante las tecnicas clasicas de biologfa molecular, con el receptor de Fc (preferiblemente en su parte N-terminal) y se introduce el sustrato de la enzima unido de manera covalente a un donador/aceptor en el medio extracelular. La reaccion enzimatica tiene como consecuencia la union covalente del sustrato marcado a la enzima, y por tanto el marcaje del receptor de Fc mediante el donador o el aceptor.
Pueden mencionarse a modo de ejemplo no limitativo las siguientes enzimas:
- los mutantes de la O6-alquilguanina ADN alquiltransferasa (AGT). Las enzimas SNAP-tag (Juillerat et al, Chemistry & biology, vol. 10, 313-317, abril de 2003) y CLIP-tag (Gautier et al, Chemistry and Biology, 15, 128-136, febrero de 2008) comercializadas por la comparMa Cisbio Bioassays son mutantes de la AGT humana cuyos sustratos son, respectivamente, la O6-bencilguanina (abreviada en adelante como BG) y la O2-bencilcitosina (abreviada en adelante como BC). La enzima N-AGT (Gronemeyer et al. (Protein engineering, design & selection, vol. 19, n.° 7, pags. 309-3016, 2006)) es otro mutante de esta enzima cuya reactividad con la O6-bencilguanina es mejor que la de la enzima SNAP-tag.
- los mutantes de una deshalogenasa (tal como la enzima HaloTag comercializada por Promega) que tambien genera una reaccion enzimatica del tipo suicida (vease el documento WO2004/072232), de la que algunos de los sustratos son compuestos de la familia de los cloroalcanos, en particular los cloroalcanos que comprenden el motivo -NH-CH2CH2-OCH2CH2-O-(CH2)6-Cl. En este caso, el donador/aceptor se conjugara a este tipo de motivo.
- La protema ACP (“Acyl Carrier Protein’’), protema portadora de acilo, en la que se transfiere, en presencia de fosfopantetema transferasa, el residuo 4’-fosfopantetema de la coenzima A en una serina de la ACP (N. George et al, Journal of the American Chemical society 126 (2004) pags. 8896-8897). Cuando se usa este enfoque para marcar el receptor de Fc mediante el donador o el aceptor, es necesario anadir al medio de reaccion fosfopantetema transferasa. La compar M a NEB comercializa un fragmento de la ACP con el nombre comercial “ACP-Tag” para el marcaje de protemas.
Cuando se usa este enfoque para marcar el receptor de interes, las celulas se transfectan con un plasmido de expresion que comprende el ADN que codifica para una protema de fusion que comprende la enzima suicida y el receptor de interes. Este plasmido tambien puede comprender, en sentido del ADN que codifica para estas protemas, el ADN que codifica para una etiqueta tal como por ejemplo el epftopo FLAG, el epttopo myc o incluso el de la hemaglutinina de influenza (HA). Estas etiquetas no son esenciales, pero facilitan la manipulacion de la protema de fusion con fines de control o de purificacion. La transfeccion se realiza mediante las tecnicas clasicas, tales como la electroporacion.
Para garantizar que la protema de fusion se expresara en la membrana celular, puede resultar util incluir en el plasmido de expresion, en sentido de la secuencia que codifica para el receptor de interes y de la enzima suicida, la que codifica para un peptido de direccionamiento a la membrana, tal como el peptido senal T8 o el peptido senal del receptor mGluR5, cuyo uso para este efecto conoce el experto en la materia. Finalmente, tambien puede ser deseable garantizar que la secuencia que codifica para el receptor de interes no comprende ninguna secuencia de direccionamiento a la membrana nativa que pueda ser objeto de una escision postraduccional de la union entre el receptor de interes y la enzima suicida: si es asf, es preferible no introducir este dominio en el plasmido de expresion.
Finalmente, cuando se usa una enzima suicida para marcar el receptor de Fc con la pareja de FRET, la invencion comprende una etapa preliminar de transfeccion de las celulas mediante un vector de expresion que comprende la secuencia de ADN que codifica para una protema de fusion correspondiente al receptor de Fc, fusionada en su parte N-terminal con una enzima suicida. El experto en la materia conoce las tecnicas de transfeccion tales como la electroporacion o el uso de Lipofectamine.
La introduccion en el medio extracelular del sustrato de la enzima conjugado a una pareja de FRET tendra como consecuencia el marcaje del receptor de interes mediante esta pareja de FRET.
La compar M a Cisbio Bioassays comercializa plasmidos Tag-Lite® que permiten la expresion de protemas de fusion con las enzimas suicidas conocidas con los nombres comerciales de SNAP-tag®, CLIP-tag® y Halotag®. Las secuencias de ADN que codifican para los receptores de Fc de la tabla 1 se conocen y estan disponibles en las bases de datos tales como Genbank.
Marcaje del anticuerpo
El anticuerpo tambien puede marcarse de manera directa o indirecta. Segun la invencion, el anticuerpo se marca de manera directa.
El marcaje directo del anticuerpo mediante un compuesto fluorescente puede realizarse mediante los metodos clasicos conocidos por el experto en la materia, que se basan en la presencia de grupos reactivos en el anticuerpo, en particular los siguientes grupos: el grupo amino terminal, los grupos carboxilato de los acidos asparticos y glutamicos, los grupos amina de las lisinas, los grupos guanidina de las argininas, los grupos tiol de las cistemas, los grupos fenol de las tirosinas, los ciclos indol de los triptofanos, los grupos tioeteres de las metioninas, los grupos imidazol de las histidinas.
Estos grupos pueden formar una union covalente con un grupo reactivo portado por el compuesto fluorescente. El experto en la materia conoce los grupos reactivos apropiados: un donador o el aceptor funcionalizado mediante un grupo maleimida sera capaz de, por ejemplo, unirse de manera covalente con los grupos tiol portados por las cistemas de la protema. Asf mismo, un donador/aceptor que porta un ester de N-hidroxisuccinimida sera capaz de fijarse de manera covalente a una amina presente en el anticuerpo.
Sin estar comprendido en la presente invencion, el anticuerpo tambien puede marcarse mediante un compuesto fluorescente de manera indirecta, por ejemplo, introduciendo en el medio de medicion otro anticuerpo, a su vez unido de manera covalente a un compuesto fluorescente, reconociendo este segundo anticuerpo de manera espedfica el primer anticuerpo. Cuando se usa este enfoque, conviene elegir un anticuerpo secundario cuyo dominio Fc no se reconozca por el receptor de Fc.
Sin estar comprendido en la presente invencion, otro medio de marcaje indirecto muy clasico consiste en fijar biotina en el anticuerpo que va a marcarse, despues incubar este anticuerpo biotinilado en presencia de estreptavidina marcada mediante un fluoroforo. Hay anticuerpos biotinilados disponibles en el comercio y la compar M a Cisbio Bioassays comercializa por ejemplo estreptavidina marcada con el fluoroforo cuya denominacion comercial es “d2” (ref. 610SADLA).
En la medida en que el anticuerpo del que se desea medir la union al receptor de Fc se une a este receptor mediante su dominio Fc, sus dominios variables siguen estando disponibles para reconocer el antigeno para el que son espedficos. Por tanto, sin que este comprendido en la presente invencion, tambien es posible marcar el anticuerpo de manera indirecta introduciendo en el medio de medicion el antigeno de este anticuerpo, estando este antigeno marcado mediante un compuesto fluorescente.
Pares de parejas de FRET
Segun la invencion, los receptores de Fc y al menos uno de los anticuerpos reconocidos por estos receptores se marcan cada uno mediante un miembro de un par de parejas de FRET, en particular mediante un compuesto fluorescente donador o un compuesto fluorescente aceptor de energfa.
El FRET se define como una transferencia de energfa no radiactiva que resulta de una interaccion dipolo-dipolo entre un donador y un aceptor de energfa. Este fenomeno ffsico necesita una compatibilidad energetica entre estas moleculas. Esto significa que el espectro de emision del donador debe recubrir, al menos parcialmente, el espectro de absorcion del aceptor. De acuerdo con la teona de Forster, el FRET es un proceso que depende de la distancia que separa las dos moleculas, donador y aceptor: cuando estas moleculas estan en proximidad una de otra, se emitira una senal de FRET.
La seleccion del par de fluoroforos donador / aceptor para obtener una senal de FRET se encuentra dentro del alcance del experto en la materia. Se describen pares donador-aceptor que pueden usarse para estudiar los fenomenos de FRET concretamente en la obra de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2a edicion, 338), a la que podra remitirse el experto en la materia.
Los compuestos fluorescentes donadores de energfa de tiempo de vida largo (> 0,1 ms, preferiblemente comprendido entre 0,5 y 6 ms), en particular los quelatos o criptatos de tierras raras, resultan ventajosos ya que permiten efectuar mediciones de resolucion temporal, es decir, medir senales de TR-FRET (en ingles, “Time Resolved FRET’, “FRET de resolucion temporal”) desprendiendose de una gran parte del ruido de fondo emitido por el medio de medicion. Por este motivo y de manera general se prefieren para la puesta en practica del procedimiento segun la invencion. Ventajosamente, estos compuestos son complejos de lantanidos. Estos complejos (tales como quelatos o criptatos) son particularmente apropiados como miembro del par de FRET donador de energfa.
Los complejos de disprosio (Dy3+), de samario (Sm3+), de neodimio (Nd3+), de iterbio (Yb3+) o incluso de erbio (Er3+) son complejos de tierras raras tambien apropiados para los fines de la invencion, pero se prefieren particularmente los complejos de europio (Eu3+) y de terbio (Tb3+).
Se han descrito numerosos complejos de tierras raras y varios se comercializan actualmente por las compares PerkinElmer, Invitrogen y Cisbio Bioassays.
Ejemplos de quelatos o criptatos de tierras raras apropiados para los fines de la invencion son:
• Los criptatos de lantanidos, que comprenden uno o varios motivos de piridina. Tales criptatos de tierras raras se describen por ejemplo en las patentes Ep 0180492, EP 0321353, EP 0601 113 y en la solicitud internacional WO 01/96 877. Los criptatos de terbio (Tb3+) y de europio (Eu3+) son particularmente apropiados para los fines de la presente invencion. Criptatos de lantanidos se comercializan por la comparna Cisbio Bioassays. A modo de ejemplo no limitativo pueden citarse los criptatos de europio de las siguientes formulas (que pueden acoplarse al compuesto que va a marcarse mediante un grupo reactivo, en este caso por ejemplo un grupo NH2):
Figure imgf000011_0001
• Los quelatos de lantanidos descritos concretamente en las patentes US 4761 481, US 5032677, US 5055578, US 5106957, US 5116989, US 4761 481, US 4801 722, US 4794191, US 4637988, US 4670572, US 4837 169, US 4859777. Las patentes EP 0403 593, US 5324825, US 5202423, US 5316909 describen quelatos compuestos por un ligando nonadentado tal como la terpiridina. Quelatos de lantanidos se comercializan por la comparMa PerkinElmer.
• Tambien pueden usarse complejos de lantanidos constituidos por un agente quelante, tal como el tetraazaciclododecano, sustituido con un cromoforo que comprende ciclos aromaticos, tales como los descritos por Poole R. et al. en Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 “Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo”. Tambien pueden usarse los complejos descritos en la solicitud WO 2009/10580.
• Tambien pueden usarse los criptatos de lantanidos descritos en las patentes EP 1154991 y EP 1154990.
• El criptato de terbio de la siguiente formula (que puede acoplarse a un compuesto que va a marcarse mediante un grupo reactivo, en este caso por ejemplo un grupo NH2):
Figure imgf000012_0001
y cuya smtesis se describe en la solicitud internacional WO 2008/063721 (compuesto 6a, pagina 89).
• El criptato de terbio Lumi4-Tb de la compar M a Lumiphore, comercializado por Cisbio Bioassays.
• El quantum dye de la compar M a Research Organics, de la siguiente formula (que puede acoplarse al compuesto que va a marcarse mediante un grupo reactivo, en este caso NCS):
Figure imgf000012_0002
• Los quelatos de rutenio, en particular los complejos constituidos por un ion rutenio y por varias bipiridinas tales como rutenio (II)-tris(2,2'-bipiridina).
• El quelato de terbio DTPA-cs124 Tb, comercializado por la compar M a Life technologies de la siguiente formula (que puede acoplarse al compuesto que va a marcarse mediante un grupo reactivo R) y cuya smtesis se describe en la patente estadounidense US 5622821.
Figure imgf000013_0001
El quelato de terbio de la siguiente formula y descrito por Latva et al (Journal of Luminescence 75: 149-169):
Figure imgf000013_0002
De manera particularmente ventajosa, el compuesto fluorescente donador se elige de: un criptato de europio; un quelato de europio; un quelato de terbio; un criptato de terbio; un quelato de rutenio; y un quantum dye; prefiriendose particularmente los quelatos y los criptatos de europio y de terbio.
Los complejos de disprosio (Dy3+), de samario (Sm3+), de neodimio (Nd3+), de iterbio (Yb3+) o incluso de erbio (Er3+) tambien son complejos de tierras raras apropiados para los fines de la invencion.
Los compuestos fluorescentes aceptores pueden elegirse del siguiente grupo: las aloficocianinas, en particular las conocidas con la denominacion comercial XL665; las moleculas organicas luminiscentes, tales como las rodaminas, los cianinas (tales como por ejemplo Cy5), las escuarainas, las cumarinas, las proflavinas, las acridinas, las fluorescemas, los derivados del boro-dipirrometeno (comercializados con la denominacion “Bodipy”), los fluoroforos conocidos con la denominacion “Atto”, los fluoroforos conocidos con la denominacion “DY”, los compuestos conocidos con la denominacion “Alexa”, el nitrobenzoxadiazol. Ventajosamente, los compuestos fluorescentes aceptores se eligen de las aloficocianinas, las rodaminas, las cianinas, las escuarainas, las cumarinas, las proflavinas, las acridinas, las fluorescemas, los derivados del boro-dipirrometeno, el nitrobenzoxadiazol.
Las expresiones “las cianinas” y “las rodaminas” deben comprenderse respectivamente como “los derivados de cianina” y “los derivados de rodamina”. El experto en la materia conoce estos diferentes fluoroforos, disponibles en el comercio.
Los compuestos “Alexa” se comercializan por la comparMa Invitrogen; los compuestos “Atto” se comercializan por la compar M a Attotec; los compuestos ““DY” se comercializan por la compar M a Dyomics; los compuestos “Cy” se comercializan por la compar M a Amersham Biosciences; los demas compuestos se comercializan por diversos proveedores de reactivos qmmicos, tales como las compares Sigma, Aldrich o Acros.
Tambien pueden usarse las siguientes protemas fluorescentes como compuesto fluorescente aceptor: las protemas fluorescentes cian (AmCyanl, Midori-Ishi Cyan, mTFPI), las protemas fluorescentes verdes (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen), las protemas fluorescentes amarillas (EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellowl, mBanana), las protemas fluorescentes naranjas y rojas (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer, mTangerine, AsRed2, mRFPI, JRed, mCherry, mStrawberry, HcRedl, mRaspberry, HcRed-Tandem, mPlim, AQ143), las protemas fluorescentes en el infrarrojo lejano (mKate, mKate2, tdKatushka2).
Para los fines de la invencion, se prefieren los derivados de cianinas o de la fluorescema como compuestos fluorescentes aceptores.
Estuche de reactivos, celulas
La descripcion tambien se refiere a vectores de expresion, “kits” o estuches de reactivos para la puesta en practica de los procedimientos segun la invencion.
Los vectores de expresion segun la descripcion son plasmidos que permiten la expresion de una protema de fusion que comprende la secuencia de ADN que codifica para el receptor de Fc de interes y la secuencia que codifica para una enzima suicida, en particular elegida de los mutantes de la deshalogenasa, un fragmento de la protema de transporte de acilos o los mutantes de la O6-alquilguanina ADN alquiltransferasa, prefiriendose estos ultimos. Pueden obtenerse integrando la secuencia de ADN que codifica para el receptor de Fc de interes en uno de los plasmidos comercializados por la comparMa Cisbio Bioassays con las denominaciones Tag-Lite® SNAP-tag®, CLIP-tag® y Halo-tag®.
La descripcion tambien se refiere a celulas, concretamente celulas de marnfferos, que se han transfectado de manera estable o transitoria con los vectores de expresion segun la invencion. Las tecnicas de introduccion de vectores de expresion en las celulas, tales como la electroporacion o incluso el uso de Lipofectamine, las conoce el experto en la materia. En un aspecto particularmente ventajoso, se incuban estas celulas en presencia del sustrato de la enzima suicida, conjugado a un miembro de un par de parejas de FRET, y de este modo se marca el receptor de Fc que expresan. Estas celulas pueden condicionarse en forma congelada para facilitar su conservacion y su distribucion a los usuarios.
Los estuches o kits de reactivos segun la invencion comprenden los vectores de expresion o las celulas anteriores, acompariados por uno o los dos miembros de un par de parejas de FRET. Estas parejas de FRET pueden conjugarse al sustrato de la enzima suicida, y/o bien conjugarse a un anticuerpo de referencia cuyo fragmento Fc es capaz de unirse a los receptores de Fc expresados por las celulas.
De manera preferida, en los plasmidos y estuches de reactivos anteriores, el receptor de interes es un receptor de Fc gamma y, en particular, es el receptor CD16a o una de sus variantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Material y metodo
Reactivos usados:
Medio de cultivo: DMEM/Glutamax SVF al 10% estreptomicina (50 |ig/ml), penicilina 50 U/ml, HEPES 2 mM, aminoacidos no esenciales al 1% (InVitrogen)
OptiMEM: medio de cultivo usado para la transfeccion, Invitrogen
Lipofectamine 2000: Invitrogen
Plasmido SNAP-CD16A: preparado insertando la secuencia nucleica (SEQ ID NO. 4) que codifica para el receptor CD16A (variante V158 (o V176) ref. Genbank NM_000569.6, secuencia proteica Np_000560.5) en el plasmido SNAP-tag® pT8-SNAP-neomicina (Cisbio Bioassays), vease la figura 1.
Plasmido de cadena gamma del receptor de FceRI: La secuencia de ADN (SEQ ID NO. 5) que codifica para la cadena gamma del receptor de FceRI se inserto en un plasmido de expresion mediante las tecnicas clasicas. El esquema de este plasmido se representa en la figura 2. Se sabe que el receptor CD16a forma dfmeros con esta cadena gamma, y por tanto se aconseja expresar conjuntamente las dos protemas. No obstante, los inventores han descubierto que esta expresion conjunta no era necesaria para poner en practica el procedimiento segun la invencion.
SVF: suero de ternero fetal, Invitrogen
DMSO: Dimetilsulfoxido, SIGMA
Tag-Lite® SNAP-Lumi4Tb: Compuesto donador, Cisbio Bioassays, ref. SSNPTBX
Tag-Lite®: tampon de marcaje, Cisbio Bioassays, ref. LABMED.
Transfeccion de las celulas:
Se incubaron una mezcla de transfeccion que contema 5 |il de plasmido “SNAP-CD16A” (1 |ig/|il), 15 |il de Lipofectamine y 2,6 ml de medio OptiMEM y una mezcla de 10 |il de plasmido de “cadena gamma” (1 |ig/|il), 30 |il de Lipofectamine y 5,4 ml de medio OptiMEM durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se pusieron celulas HEK293 en cultivo en un matraz T175. Una vez que estas celulas alcanzaron una confluencia del 60 al 70%, se retiro el medio de cultivo y se lavaron las celulas con 10 ml de medio PBS. A continuacion, se anadieron 8 ml de la mezcla de transfeccion a estas celulas, asf como 12 ml de medio de cultivo. A continuacion, se incubaron las celulas durante 1 noche a 37°C.
Marcaje con el compuesto fluorescente donador Lumi4® Tb
Tras la retirada de la mezcla de transfeccion y el lavado con 10 ml de PBS, se anadieron 10 ml de compuesto fluorescente donador Tag-Lite® SNAP-Lumi4-Tb (100 nM) en disolucion en el tampon de marcaje Tag-Lite®.
Tras la incubacion de 1 h a 37°C, se lavo la mezcla 4 veces con el tampon de marcaje Tag-Lite®, despues se anadieron 5 ml de tampon “cell dissociation buffer” (tampon de disociacion celular) (Sigma) para disociar las celulas y 5 ml de medio OptiMEM. Se centrifugaron las celulas asf obtenidas durante 5 min a 1200 rpm. A continuacion, se resuspendio el residuo con 1 ml 1 ml de tampon de marcaje Tag-Lite® con el fin de poder contar las celulas.
Volvio a centrifugarse esta suspension 5 min a 1200 rpm y se llevo el residuo al medio de cultivo que contema SVF al 10% y DMSO al 10% para obtener una suspension de celulas marcadas a la concentracion de 1 millon de celulas / ml.
Se extrajeron alfcuotas de esta suspension en tubos a razon de 1 ml por tubo, y se colocaron los tubos en una caja Nalgene a -80°C.
Medicion de las senales de FRET
En los siguientes ejemplos, se midieron las senales de FRET de resolucion temporal en un aparato compatible con HTRF, el PHERAstarFS (BMG Labtech) con un retardo de 60 |is y un tiempo de integracion de 400 |is.
Ejemplo 2
Se descongelaron a 37°C las celulas preparadas segun el metodo descrito en el ejemplo 1 y se mezclaron rapidamente con 15 ml de PBS. Se centrifugo la suspension obtenida 5 min a 1200 rpm y se retiro el sobrenadante. Volvio a suspenderse el residuo en tampon Tag-Lite® para obtener una suspension que permitfa la distribucion de celulas HEK-CD16a-Tb en pocillos de una placa de multiples pocillos 384 lV a la concentracion de 10.000 celulas por pocillo en 10 |il.
Se anadio un anticuerpo humano de isotipo IgG1 (no importa su especificidad epitopica) no marcado a diferentes concentraciones finales de 0,3 nM a 5 |iM en 5 |il.
Se anadio el mismo anticuerpo, marcado mediante el fluoroforo aceptor d2 (kit de marcaje d2 Cisbio Bioassays, ref.
62D2DPEA), a 200 nM en 5 |il para una concentracion final de 50 nM.
Se midieron inmediatamente las senales de FRET emitidas por la placa 384, despues tras 30 min, 1 h, 2 h 30, 3 h 40, 5 h y 6 h.
Los resultados presentados en la figura 3 muestran que el procedimiento segun la invencion permite realizar un seguimiento eficaz de la cinetica de union del fragmento Fc de un anticuerpo a los receptores CD16a.
Ejemplo 3

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento in vitro de determinacion de la union de un anticuerpo competidor con un receptor de Fc expresado en membranas celulares o celulas intactas presentes en un medio de medicion, mediante competencia con un anticuerpo de referencia, que comprende las siguientes etapas:
(i) marcaje directo de dicho receptor de Fc mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET, o bien introduccion en el medio de membranas celulares o de celulas intactas cuyos receptores de Fc se han marcado previamente de manera directa mediante el primer miembro de un par de parejas de FRET;
(ii) adicion en el medio de medicion del anticuerpo competidor;
(iii) adicion en el medio de medicion de un anticuerpo de referencia, marcado de manera directa mediante el segundo miembro de dicho par de parejas de FRET;
(iv) medicion de la senal de FRET, siendo una disminucion de la senal medida en presencia del anticuerpo competidor con respecto a la medida en su ausencia representativa de la union de este anticuerpo al receptor de Fc;
caracterizado porque el receptor de Fc se marca de manera directa mediante una enzima suicida, a saber, que se expresa en forma de una protema de fusion que comprende el receptor de Fc y la enzima suicida, y que el marcaje se realiza mediante adicion al medio de medicion del sustrato de la enzima, conjugado a una de las parejas de FRET.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque se repite la etapa (ii) con diferentes cantidades de anticuerpo competidor, siendo fija la cantidad de anticuerpo de referencia anadido a la etapa (iii), y porque comprende una etapa adicional (v) de determinacion de la CE50 del anticuerpo competidor y de comparacion con la CE50 del anticuerpo de referencia.
3. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el anticuerpo de referencia y el anticuerpo competidor difieren concretamente en que este ultimo se ha preparado segun un procedimiento, o bien ha sido objeto de un tratamiento, destinado a alterar el nivel de glicosilacion de su fragmento Fc.
4. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el anticuerpo de referencia y el anticuerpo que va a someterse a prueba difieren concretamente en que este ultimo se ha preparado segun un procedimiento, o bien ha sido objeto de un tratamiento, destinado a alterar el nivel de fucosilacion de su fragmento Fc.
5. Procedimiento de determinacion del nivel de glicosilacion de un anticuerpo que comprende las siguientes etapas:
- puesta en practica del procedimiento segun la reivindicacion 2 usando en la etapa (ii) varios anticuerpos competidores que tienen niveles conocidos de glicosilacion o de desglicosilacion, despues
- puesta en practica del procedimiento segun la reivindicacion 2 usando en la etapa (ii) el anticuerpo del que se desea determinar el nivel de glicosilacion, y
- determinacion del nivel de glicosilacion del anticuerpo estudiado mediante comparacion de su CE50 con la de los anticuerpos competidores cuyos los niveles de glicosilacion o de desglicosilacion se conocen.
6. Procedimiento de determinacion del nivel de fucosilacion de un anticuerpo que comprende las siguientes etapas:
- puesta en practica del procedimiento segun la reivindicacion 2 usando en la etapa (ii) varios anticuerpos competidores que tienen niveles conocidos de fucosilacion o de desfucosilacion, despues
- puesta en practica del procedimiento segun la reivindicacion 4 usando en la etapa (ii) un anticuerpo del que se desea determinar el nivel de fucosilacion o de desfucosilacion, y
- determinacion del nivel de fucosilacion del anticuerpo estudiado mediante comparacion de su CE50 con la de los anticuerpos competidores cuyos los niveles de fucosilacion o de desfucosilacion se conocen.
7. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el receptor de Fc es un receptor de Fc gamma.
8. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el receptor de Fc es el receptor CD16a o una de sus variantes.
9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la enzima suicida se elige de:
los mutantes de la O6-alquilguanina ADN alquiltransferasa, los mutantes de la deshalogenasa, o un fragmento de la protema de transporte de acilos.
10. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se pone en practica con celulas intactas.
11. Kits de reactivos para la puesta en practica del procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizados porque comprenden un vector de expresion que comprende la secuencia de ADN que codifica para un receptor de Fc y la secuencia de ADN que codifica para una enzima suicida o bien celulas que comprenden dicho vector de expresion, asf como al menos un miembro de un par de parejas de FRET.
12. Kits de reactivos segun la reivindicacion 11, caracterizados porque la enzima suicida se elige de los mutantes de la deshalogenasa, un fragmento de la protema de transporte de acilos o los mutantes de la O6-alquilguanina ADN alquiltransferasa.
Kits de reactivos segun la reivindicacion 11 o 12, caracterizados porque el receptor de Fc es el receptor CD16a.
14. Kits de reactivos segun una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizados porque las celulas estan en forma congelada.
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