ES2710384T3 - Procedures for the prevention or treatment of certain disorders by inhibiting the binding of IL-4 and / or IL-13 to their respective receptors - Google Patents
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Abstract
Composición que comprende una muteína de lipocalina lacrimal humana o un fragmento de la misma o una proteína de fusión o un conjugado de la misma que es capaz de inhibir la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos, para uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o prevención de un trastorno en un sujeto, en donde dicha muteína de lipocalina o fragmento es capaz de exhibir una actividad terapéutica in vivo en el sujeto y es capaz de inhibir in vivo el tránscrito Ccl11 inducido por IL-13 humana Ccl11 (eotaxina), en donde dicha muteína de lipocalina o fragmento tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde dicha muteína de lipocalina o fragmento tiene los mismos aminoácidos que se exponen en SEQ ID NO: 6 en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), y en donde el fragmento de la muteína de lipocalina carece de al menos uno de los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales en comparación con dicha muteína de lipocalina.Composition comprising a human lacrimal lipocalin mutein or a fragment thereof or a fusion protein or conjugate thereof that is capable of inhibiting the binding of IL-4 and / or IL-13 to their respective receptors, for use. in a method of treatment, improvement or prevention of a disorder in a subject, wherein said lipocalin mutein or fragment is capable of exhibiting a therapeutic activity in vivo in the subject and is capable of inhibiting in vivo the IL-induced Ccl11 transcript 13 human Ccl11 (eotaxin), wherein said lipocalin mutein or fragment has at least 75% sequence identity with the amino acid sequence of mature human tear lipocalin (SEQ ID NO: 1), wherein said lipocalin mutein or fragment has the same amino acids as set forth in SEQ ID NO: 6 at the amino acid positions corresponding to positions 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 and 108 d e the linear polypeptide sequence of mature human tear lipocalin (SEQ ID NO: 1), and wherein the lipocalin mutein fragment lacks at least one of the N-terminal and / or C-terminal amino acids compared to said lipocalin mutein.
Description
DESCRIPCIONDESCRIPTION
Procedimientos para la prevencion o el tratamiento de determinados trastornos mediante la inhibicion de la union de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptoresProcedures for the prevention or treatment of certain disorders by inhibiting the binding of IL-4 and / or IL-13 to their respective receptors
Campo de la invencionField of the invention
La presente invencion se refiere a una composicion que comprende una mutelna de lipocalina lacrimal humana o un fragmento de la misma o una protelna de fusion o un conjugado de la misma que es capaz de inhibir la union de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos, para su uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o prevencion de un trastorno en un sujeto, en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento es capaz de mostrar una actividad terapeutica in vivo en el sujeto y es capaz de inhibir el transcrito Ccl 11 inducido por IL-13 humana (eotaxina) in vivo , en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene al menos 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene los mismos aminoacidos que se exponen en SEQ ID NO: 6 en posiciones de aminoacidos correspondientes a las posiciones 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), y en la que el fragmento de la mutelna de lipocalina carece de al menos uno de los aminoacidos N-terminales y/o C-terminales en comparacion con dicha mutelna de lipocalina.The present invention relates to a composition comprising a human tear lipocalin mutein or a fragment thereof or a fusion protein or a conjugate thereof which is capable of inhibiting the binding of IL-4 and / or IL-13 to their respective receptors, for use in a method of treating, ameliorating or preventing a disorder in a subject, wherein said lipocalin mutein or fragment is capable of exhibiting a therapeutic activity in vivo in the subject and is capable of inhibiting the Ccl 11 transcript induced by human IL-13 (eotaxin) in vivo , wherein said lipocalin mutein or fragment has at least 75% sequence identity with the amino acid sequence of mature human tear lipocalin (SEQ ID NO: 1), wherein said lipocalin mutein or fragment has the same amino acids as set forth in SEQ ID NO: 6 at amino acid positions corresponding to positions 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53 , 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 and 108 of the linear polypeptide sequence of mature human tear lipocalin (SEQ ID NO: 1), and wherein the fragment of the lipocalin mutelne lacks at least one of the N-terminal amino acids and / or C-terminals in comparison with said lipocalin mutelna.
En algunas realizaciones, el trastorno se asocia preferiblemente a un aumento de la respuesta inmune Th2. En algunas realizaciones, la administracion es preferiblemente de manera local al pulmon para tratar, mejorar o prevenir el asma alergica, la rinitis, la conjuntivitis, la fibrosis pulmonar, la fibrosis qulstica, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica, la proteinosis alveolar pulmonar o el slndrome de dificultad respiratoria del adulto.In some embodiments, the disorder is preferably associated with an increase in the Th2 immune response. In some embodiments, administration is preferably local to the lung to treat, ameliorate or prevent allergic asthma, rhinitis, conjunctivitis, pulmonary fibrosis, fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary alveolar proteinosis or the syndrome of respiratory distress in adults.
AntecedentesBackground
Las protelnas que se unen selectivamente a objetivos seleccionados por medio de una interaccion no covalente desempenan un papel crucial como reactivos en la biotecnologla, la medicina, la bioanalltica, as! como en las ciencias biologicas y de la vida en general. Los anticuerpos, es decir, las inmunoglobulinas, son un ejemplo destacado de esta clase de protelnas. A pesar de las multiples necesidades de tales protelnas junto con el reconocimiento, la union y/o la separacion de ligandos/objetivos, en la actualidad se usan casi exclusivamente inmunoglobulinas.The proteins that bind selectively to selected targets through a non-covalent interaction play a crucial role as reagents in biotechnology, medicine, bioanalytics, and so on. as in the biological sciences and life in general. Antibodies, that is, immunoglobulins, are a prominent example of this class of proteins. In spite of the multiple needs of such proteins together with the recognition, binding and / or separation of ligands / targets, almost exclusively immunoglobulins are currently used.
Otras moleculas de union proteica que tienen funciones similares a las de los anticuerpos son los miembros de la familia de las lipocalinas, que han evolucionado naturalmente para unirse a ligandos. Las lipocalinas se encuentran en muchos organismos, incluyendo vertebrados, insectos, plantas y bacterias. Los miembros de la familia de las protelnas de la lipocalina (Pervaiz, S. y Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214) son generalmente protelnas secretadas pequenas y tienen una unica cadena polipeptldica. Se caracterizan por un rango de diferentes propiedades de reconocimiento molecular: su capacidad para unirse a varias moleculas, principalmente hidrofobas (tales como retinoides, acidos grasos, colesteroles, prostaglandinas, biliverdinas, feromonas, saborizantes y odorantes), su union a receptores especlficos de la superficie celular y su formacion de complejos macromoleculares. Aunque en el pasado se clasificaban principalmente como protelnas de transporte, ahora esta claro que las lipocalinas cumplen varias funciones fisiologicas. Estas incluyen roles en el transporte de retinol, la olfaccion, la senalizacion de feromonas y la slntesis de prostaglandinas. Las lipocalinas tambien se han implicado en la regulation de la respuesta inmune y en la mediation de la homeostasis celular (revisada, por ejemplo, en Flower, D.R. (1996) Biochem. J. 318, 1-14 y Flower, D.R. y col. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 9-24). Lofblom y col. Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22: 843-848 divulga andamios proteicos no basados en inmunoglobulina como alternativas potenciales para los anticuerpos.Other protein binding molecules that have functions similar to those of antibodies are members of the lipocalin family, which have evolved naturally to bind ligands. Lipocalins are found in many organisms, including vertebrates, insects, plants and bacteria. The family members of the lipocalin proteins (Pervaiz, S. and Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214) are generally small secreted proteins and have a single polypeptide chain. They are characterized by a range of different molecular recognition properties: their ability to bind to several molecules, mainly hydrophobic (such as retinoids, fatty acids, cholesterols, prostaglandins, biliverdins, pheromones, flavorings and odorants), their binding to specific receptors of the cell surface and its formation of macromolecular complexes. Although in the past they were classified primarily as transport proteins, it is now clear that lipocalins fulfill several physiological functions. These include roles in retinol transport, olfaction, pheromone signaling and prostaglandin synthesis. Lipocalins have also been implicated in the regulation of the immune response and in the mediation of cellular homeostasis (reviewed, for example, in Flower, DR (1996) Biochem. J. 318, 1-14 and Flower, DR et al. (2000) Biochim, Biophys, Acta 1482, 9-24). Lofblom et al. Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22: 843-848 discloses non-immunoglobulin-based protein scaffolds as potential alternatives for antibodies.
Las lipocalinas comparten niveles inusualmente bajos de conservation de secuencia global, a menudo con identidades de secuencia de menos del 20 %. En fuerte contraste, su patron de plegado general es altamente conservado. La parte central de la estructura de la lipocalina consiste en una unica lamina p antiparalela de ocho cadenas cerrada sobre si misma para formar un barril p continuamente unido por hidrogeno. Este barril p forma una cavidad central. Un extremo del barril esta bloqueado estericamente por el segmento peptldico N-terminal que se ejecuta en su parte inferior, as! como por tres bucles peptldicos que conectan las cadenas p. El otro extremo del barril p esta abierto al disolvente y abarca un sitio de union al objetivo, que esta formado por cuatro bucles peptldicos flexibles. Es esta diversidad de bucles en el andamio, por lo demas rlgido, de lipocalina lo que da lugar a varios modos de union diferentes, cada uno capaz de acomodar objetivos de diferente tamano, forma y caracter qulmico (revisado, por ejemplo, en Flower, D.R. (1996), supra; Flower, D.R. y col. (2000), supra, o Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350).Lipocalins share unusually low levels of global sequence conservation, often with sequence identities of less than 20%. In sharp contrast, its general folding pattern is highly conserved. The central part of the structure of the lipocalin consists of a single eight-chain antiparallel sheet p closed on itself to form a barrel p continuously bound by hydrogen. This barrel p forms a central cavity. One end of the barrel is blocked sterically by the N-terminal peptide segment that runs in its lower part, thus! as for three peptide loops that connect the chains p. The other end of the barrel p is open to the solvent and spans a target binding site, which is formed by four flexible peptide loops. It is this diversity of loops in the scaffold, otherwise rigid, of lipocalin which gives rise to several different modes of union, each capable of accommodating objectives of different size, shape, and chemical character (reviewed, for example, in Flower, DR (1996), supra; Flower, DR et al (2000), supra, or Skerra, A. (2000) Biochim, Biophys, Acta 1482, 337-350).
Varias publicaciones de patentes del PCT (por ejemplo, los documentos WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029463, WO 03/029471 y WO 2005/19256) divulgan como pueden construirse las mutelnas de varias lipocalinas (por ejemplo, lipocalina lacrimal y lipocalina hNGAL) para exhibir una alta afinidad y especificidad contra un objetivo que es diferente a un ligando natural de una lipocalina de tipo salvaje. Esto se puede hacer, por ejemplo, mutando una o mas posiciones de aminoacidos de al menos uno de los cuatro bucles peptldicos. Ademas, la publicacion de patente del PCT n.° WO 2008/015239 ensena mutelnas de lipocalina que se unen al receptor alfa de IL-4. Ademas, la publicacion de patente del PCT n.° WO 2011/154420 ensena uno o mas procedimientos de produccion de mutelnas de lipocalina, que se unen a la subunidad alfa del receptor de IL-4. Ademas, Holbaum y col., Inflammation Research, 2011 vol. 60, n.° Supl. 1, paginas 82-83, describe una mutelna de lipocalina lacrimal humana que se une a IL-4Ra.Several PCT patent publications (for example, WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029463, WO 03/029471 and WO 2005/19256) disclose how mutelnas of various lipocalins can be constructed (e.g. lacrimal lipocalin and lipocalin hNGAL) to exhibit high affinity and specificity against an objective that is different from a natural ligand of a wild-type lipocalin. This can be done, for example, by mutating one or more amino acid positions of at least one of the four peptide loops. In addition, PCT Patent Publication No. WO 2008/015239 teaches lipocalin mutexes that bind to the IL-4 alpha receptor. In addition, PCT Patent Publication No. WO 2011/154420 teaches one or more methods of production of lipocalin mutelins, which bind to the alpha subunit of the IL-4 receptor. In addition, Holbaum et al., Inflammation Research, 2011 vol. 60, n. ° Suppl. 1, pages 82-83, describes a human tear lipocalin mutelna that binds to IL-4Ra.
Las citocinas Th2 IL-4 (oficialmente conocidas como Interleucina-4, Uniprot #P05112) e IL-13 (oficialmente conocidas como Interleucina-13, Uniprot #P35225) tienen funciones que se superponen en gran medida y promueven directamente varias caracterlsticas clave del asma, incluyendo la eosinofilia, la metaplasia de celulas caliciformes, la hiperrespuesta de las vlas respiratorias, el interruptor de inmunoglobulina IgE, la activacion de macrofagos alternativa, la remodelacion de celulas musculares lisas y la fibrosis subepitelial. Ademas, el polimorfismo genetico en los genes de IL-4, IL-13, IL-4RA (oficialmente conocida como subunidad alfa del receptor de Interleucina-4, Uniprot #P24394, SEQ ID NO: 12) y Stat6 estan relacionados con el asma. Esto es particularmente relevante, ya que la combination de la variante alelica de IL-4, IL-13, IL-4RA y Stat6 parece sinergica y el polimorfismo descrito en IL-4, IL-13 e IL-4RA mejora la produccion, funcion o actividad de serialization de las citocinas Th2 o la subunidad comun del receptor IL-4/IL-13 (Finkelman y col. JI, 2010, 184:1663-74). Recientemente, se han definido los endotipos o subfenotipos del asma por un mecanismo molecular o una respuesta al tratamiento. Woodruff y col., por ejemplo, definieron los fenotipos del asma en Th2-alto y Th2-bajo en funcion de la expresion epitelial pulmonar de los genes inducibles por IL-13 POSTN (periostin), CLCA1 (gob5) y SERPINB2 (Wooddruff PG y col. Genome-wide profiling identifies epithelial cell genes associated with asthma and with treatment response to corticosteroids PNAS, 2007, 104: 15858-63; Prescott G. Woodruff) (T-helper Type 2-driven inflammation defines major subphenotypes of Asthma, Am.J. Respir.Crti.Care Med., 2009, 180:388-395). Moore y col., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002, 282:L847-L835 divulgan que IL-13 e IL-4 causan la liberation de eotaxina en las celulas musculares lisas de las vlas respiratorias humanas. Fiset y col., J allergy Clin Immunol, 2003, 111 (3):580-586 divulgan la modulation de la respuesta alergica en la mucosa nasal por oligodesoxinucleotidos antisentido para IL-4. Walker y col., Immunology, 2009, 127:256-266, divulgan que el ARN de interferencia de STAT6 atenua los eventos en curso mediados por interleucina-13 en celulas epiteliales de pulmon. Terada y col., PNAS, 2006, 103(23):8816-8821 divulgan que IL-18 contribuye a la inflamacion de la piel tipo dermatitis atopica inducida por el producto Staphylococcus aureus en ratones. Cowden y col., Respiratory Research, 2010, 11:86 divulgan que el antagonismo del receptor de histamina H4 disminuye la inflamacion y disfuncion de las vlas respiratorias existentes a traves de la modulacion de las citoquinas Th2.Th2 IL-4 cytokines (officially known as Interleukin-4, Uniprot # P05112) and IL-13 (officially known as Interleukin-13, Uniprot # P35225) have functions that overlap to a large extent and directly promote several key features of asthma , including eosinophilia, goblet cell metaplasia, hyperresponsiveness of respiratory lines, IgE immunoglobulin switch, alternative macrophage activation, smooth muscle cell remodeling and subepithelial fibrosis. In addition, the genetic polymorphism in the genes of IL-4, IL-13, IL-4RA (officially known as the alpha subunit of the Interleukin-4 receptor, Uniprot # P24394, SEQ ID NO: 12) and Stat6 are related to asthma. . This is particularly relevant, since the combination of the allelic variant of IL-4, IL-13, IL-4RA and Stat6 seems synergistic and the polymorphism described in IL-4, IL-13 and IL-4RA improves production, function or serialization activity of the Th2 cytokines or the common subunit of the IL-4 / IL-13 receptor (Finkelman et al., JI, 2010, 184: 1663-74). Recently, the endotypes or subfenotypes of asthma have been defined by a molecular mechanism or a response to treatment. Woodruff et al., For example, defined the asthma phenotypes in Th2-high and Th2-low as a function of the pulmonary epithelial expression of the genes inducible by IL-13 POSTN (periostin), CLCA1 (gob5) and SERPINB2 (Wooddruff PG Genome-wide profiling identifies epithelial cell genes associated with asthma and with treatment response to corticosteroids PNAS, 2007, 104: 15858-63; Prescott G. Woodruff) (T-helper Type 2-driven inflammation defines major subphenotypes of Asthma, Am.J. Respir.Crti.Care Med., 2009, 180: 388-395). Moore et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002, 282: L847-L835 disclose that IL-13 and IL-4 cause the release of eotaxin in the smooth muscle cells of human respiratory viruses. Fiset et al., J allergy Clin Immunol, 2003, 111 (3): 580-586 disclose the modulation of the allergic response in the nasal mucosa by antisense oligodeoxynucleotides for IL-4. Walker et al., Immunology, 2009, 127: 256-266, disclose that STAT6 interference RNA attenuates ongoing events mediated by interleukin-13 in lung epithelial cells. Terada et al., PNAS, 2006, 103 (23): 8816-8821 disclose that IL-18 contributes to atopic dermatitis-like skin inflammation induced by the product Staphylococcus aureus in mice. Cowden et al., Respiratory Research, 2010, 11:86 disclose that antagonism of the histamine H4 receptor decreases inflammation and dysfunction of existing respiratory pathways through the modulation of Th2 cytokines.
Por lo tanto, serla deseable contar con procedimientos terapeuticos mejorados que involucren una cantidad terapeuticamente eficaz de una composition que comprenda mutelnas de lipocalina lacrimal humana, que se unan a IL-4RA con una alta afinidad de union y, por lo tanto, inhiban la union de IL-4 y/o la IL-13 a sus receptores respectivos, que exhiban actividades terapeuticas in vivo en un sujeto que lo necesite. Cuando se usa en la presente solicitud, un sujeto que lo necesite puede ser un mamlfero, tal como un ser humano, un perro, un raton, una rata, un cerdo, un simio como un cinomolgo, por citar solo algunos ejemplos ilustrativos, que necesiten un tratamiento o la prevention de un trastorno.Therefore, it would be desirable to have improved therapeutic procedures involving a therapeutically effective amount of a composition comprising mucoplas of human tear lipocalin, which bind to IL-4RA with a high binding affinity and, therefore, inhibit binding of IL-4 and / or IL-13 to their respective receptors , which exhibit therapeutic activities in vivo in a subject in need thereof. When used in the present application, a subject in need thereof may be a mammal, such as a human being, a dog, a mouse, a rat, a pig, an ape such as a cynomolgus, to name but a few illustrative examples, which they need a treatment or the prevention of a disorder.
Sumario de la divulgacionSummary of the disclosure
La presente divulgacion se refiere a una composicion que comprende una mutelna de lipocalina lacrimal humana o un fragmento de la misma o una protelna de fusion o un conjugado de la misma que es capaz de inhibir la union de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos, para su uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o prevencion de un trastorno en un sujeto, en el que dicha mutelna o fragmento de lipocalina es capaz de mostrar una actividad terapeutica in vivo en el sujeto y es capaz de inhibir el transcrito Ccl 11 inducido por IL-13 humana (eotaxina) in vivo , en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene los mismos aminoacidos que se exponen en la SEQ ID NO: 6 en posiciones de aminoacidos correspondientes a las posiciones 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ. ID NO: 1), y en el que el fragmento de la mutelna de lipocalina carece de al menos uno de los aminoacidos N-terminales y/o C-terminales en comparacion con dicha mutelna de lipocalina.The present disclosure relates to a composition comprising a human tear lipocalin mutein or a fragment thereof or a fusion protein or a conjugate thereof which is capable of inhibiting the binding of IL-4 and / or IL-13 to their respective receptors, for use in a method of treating, ameliorating or preventing a disorder in a subject, wherein said mutelna or lipocalin fragment is capable of exhibiting a therapeutic activity in vivo in the subject and is capable of inhibiting the Ccl 11 transcript induced by human IL-13 (eotaxin) in vivo , wherein said lipocalin mutein or fragment has at least 75% sequence identity with the amino acid sequence of mature human tear lipocalin (SEQ ID NO. : 1), wherein said lipocalin mutein or fragment has the same amino acids as set forth in SEQ ID NO: 6 at amino acid positions corresponding to positions 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34 , 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 and 108 of the linear polypeptide sequence of mature human tear lipocalin (SEQ. ID NO: 1), and wherein the fragment of the lipocalin mutelne lacks at least one of the N-terminal and / or C-terminal amino acids compared to said lipocalin mutein.
En alguna realization adicional, la mutelna de lipocalina es capaz de interrumpir la senalizacion descendente y/o las respuestas celulares inducidas por IL-4 y/o IL-13. En diversas realizaciones, el trastorno es un trastorno en el que la via de IL4/IL13 contribuye a la patogenesis de la enfermedad. En varias realizaciones adicionales, la composicion puede administrarse localmente al pulmon. En diversas realizaciones preferidas, la composicion puede administrarse mediante inhalation de un aerosol. En algunas realizaciones preferidas, la composicion se administra a un sujeto que la necesita con una frecuencia seleccionada del grupo que consiste en: hasta cuatro veces al dla, hasta tres veces al dla, hasta dos veces al dla, hasta una vez al dla, hasta una vez cada dos dlas, hasta una vez cada tres dlas, hasta una vez cada semana y hasta una vez cada dos semanas. In some additional embodiment, the lipocalin mutein is able to interrupt downstream signaling and / or cellular responses induced by IL-4 and / or IL-13. In various embodiments, the disorder is a disorder in which the IL4 / IL13 pathway contributes to the pathogenesis of the disease. In several additional embodiments, the composition can be administered locally to the lung. In various preferred embodiments, the composition can be administered by inhalation of an aerosol. In some preferred embodiments, the composition is administered to a subject who needs it at a frequency selected from the group consisting of: up to four times a day, up to three times a day, up to twice a day, up to once a day, until once every two days, once every three days, once a week and once every two weeks.
En algunas realizaciones, cuando se usa en la presente solicitud, un sujeto que necesita tal composicion padece un trastorno en el que la expresion de IL-4 y/o la expresion de IL-13 contribuyen o estan relacionadas con la patogenesis o el empeoramiento de la enfermedad. En algunas realizaciones, el sujeto, que necesita tal composicion, sufre de un trastorno que puede aliviarse, mejorarse o inhibirse mediante la eliminacion, inhibition o reduction de la actividad de IL-4 y/o la actividad de IL-13. En algunas realizaciones adicionales, un sujeto que necesita tal composicion puede padecer uno o mas trastornos que incluyen, por ejemplo, inflamacion alergica, asma alergica, rinitis, conjuntivitis, fibrosis pulmonar, fibrosis qulstica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, proteinosis alveolar pulmonar o slndrome de dificultad respiratoria en adultos. Tambien se preve que la mutelna de lipocalina de la divulgation, en algunas realizaciones, se aplique para el tratamiento, la mejora o la prevention de la fibrosis tisular (vease Chiaramonte y col. (1999), J. Clin. Invest. 104(6), 777-785). La fibrosis puede resultar preferiblemente de la curacion de una herida, por ejemplo, una herida de una incision quirurgica. La fibrosis tisular afecta, por ejemplo, a un tejido seleccionado del grupo que consiste en hlgado, epidermis cutanea, endodermis cutanea, musculo, tendon, cartllago, tejido cardlaco, tejido pancreatico, tejido pulmonar, tejido uterino, tejido neural, testlculo, ovario, glandula suprarrenal, arteria, vena, colon, intestino delgado, tracto biliar y vlsceras, en particular, el tejido se selecciona de pulmon e hlgado.In some embodiments, when used in the present application, a subject in need of such a composition suffers from a disorder in which the expression of IL-4 and / or the expression of IL-13 contribute or are related to the pathogenesis or the worsening of the illness. In some embodiments, the subject, in need of such a composition, suffers from a disorder that can be alleviated, improved or inhibited by the elimination, inhibition or reduction of IL-4 activity and / or IL-13 activity. In some additional embodiments, a subject in need of such a composition may suffer from one or more disorders including, for example, allergic inflammation, allergic asthma, rhinitis, conjunctivitis, pulmonary fibrosis, chronic fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary alveolar proteinosis or respiratory syndrome. respiratory distress in adults. It is also envisaged that the lipocalin mutelna of the disclosure, in some embodiments, be applied for the treatment, improvement or prevention of tissue fibrosis (see Chiaramonte et al (1999), J. Clin. Invest. 104 (6). ), 777-785). Fibrosis can preferably result from the healing of a wound, for example, a wound from a surgical incision. Tissue fibrosis affects, for example, a tissue selected from the group consisting of liver, skin epidermis, cutaneous endodermis, muscle, tendon, cartilage, cardiac tissue, pancreatic tissue, lung tissue, uterine tissue, neural tissue, testicle, ovary, adrenal gland, artery, vein, colon, small intestine, biliary tract and vlasceras, in particular, the tissue is selected from lung and liver.
Por ejemplo, un trastorno que puede tratarse, mejorarse o prevenirse preferiblemente mediante un procedimiento de la divulgacion esta asociado a un aumento de la respuesta inmune Th2.For example, a disorder that can be treated, improved or prevented preferably by a method of disclosure is associated with an increase in the Th2 immune response.
En algunas realizaciones, el trastorno puede estar asociado a una reaction alergica o una inflamacion alergica, preferiblemente, la reaccion alergica es una alergia alimentaria, y preferiblemente, la inflamacion alergica esta asociada a asma alergica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis. En diversas realizaciones preferidas, el asma alergica puede ser una inflamacion de las vlas respiratorias en la que la via IL4/IL13 contribuye a la patogenesis de la enfermedad.In some embodiments, the disorder may be associated with an allergic reaction or an allergic inflammation, preferably, the allergic reaction is a food allergy, and preferably, the allergic inflammation is associated with allergic asthma, rhinitis, conjunctivitis or dermatitis. In various preferred embodiments, allergic asthma may be an inflammation of the respiratory tract in which the IL4 / IL13 pathway contributes to the pathogenesis of the disease.
En otras realizaciones preferidas, la composicion de la divulgacion comprende ademas un medicamento antialergico y/o un medicamento antialergico antiinflamatorio.In other preferred embodiments, the composition of the disclosure further comprises an anti-allergic medicament and / or anti-inflammatory anti-allergic medicament.
Otro trastorno, a modo de ejemplo, que puede tratarse, mejorarse o prevenirse preferiblemente mediante un procedimiento de la divulgacion se asocia a una production de moco o una secretion de moco.Another disorder, by way of example, which can be treated, improved or prevented preferably by a method of disclosure is associated with a production of mucus or a secretion of mucus.
En diversas realizaciones preferidas, el trastorno puede ser un trastorno pulmonar, y preferiblemente una enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) o fibrosis qulstica (FQ).In various preferred embodiments, the disorder may be a pulmonary disorder, and preferably a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or chewing fibrosis (CF).
Segun se describe en el presente documento, tal composicion se puede usar como un agente de terapia genica para diversos trastornos descritos.As described herein, such a composition can be used as a gene therapy agent for various described disorders.
Una mutelna de lipocalina de la divulgacion puede ser una mutelna de lipocalina lacrimal humana que tiene uno o mas aminoacidos en una position correspondiente a la position 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104 106 y 108 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura en un aminoacido mutado. Sin embargo, la mutelna de lipocalina de la divulgacion tambien puede ser una mutelna de una lipocalina distinta de la lipocalina lacrimal humana, tal como la lipocalina NGAL humana u otras lipocalinas descritas en el presente documento.A lipocalin mutelna of the disclosure can be a human tear lipocalin mutelna having one or more amino acids in a position corresponding to position 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104, 106 and 108 of the linear polypeptide sequence of mature human tear lipocalin in a mutated amino acid. However, the lipocalin mutelna of the disclosure may also be a mutelna of a lipocalin distinct from human tear lipocalin, such as the human NGAL lipocalin or other lipocalins described herein.
En varios ejemplos, la mutelna de lipocalina descrita en el presente documento tiene, en cualquiera de dos o mas aminoacidos en una posicion correspondiente a las posiciones 26, 32, 34, 55, 56, 58 y 63 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura, un aminoacido mutado.In several examples, the lipocalin mutelna described herein has, in any of two or more amino acids in a position corresponding to positions 26, 32, 34, 55, 56, 58 and 63 of the linear polypeptide sequence of lipocalin mature human lacrimal, a mutated amino acid.
La mutelna de lipocalina descrita en el presente documento tiene en una realization particularmente preferida una identidad de al menos un 75 % de la secuencia de lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1).The lipocalin mutelna described herein has in a particularly preferred embodiment an identity of at least 75% of the mature human tear lipocalin sequence (SEQ ID NO: 1).
Una mutelna de lipocalina aplicada en los procedimientos de la presente divulgacion tiene preferiblemente reactividad cruzada con otras especies, por ejemplo, el IL-4RA de titl, que permite la prueba de la mutelna de lipocalina entonces candidata en monos titles que se parecen al organismo humano. La mutelna de lipocalina puede o no tener reactividad cruzada con IL-4RA de otras especies no humanas, tales como el IL-4RA de raton y/o IL-4RA de cinomolgo.A lipocalin mutelna applied in the methods of the present disclosure preferably has cross-reactivity with other species, for example, titl IL-4RA, which allows testing of the lipocalin mutein then candidate in monkeys titles that resemble the human organism . The lipocalin mutelna may or may not have cross-reactivity with IL-4RA of other non-human species, such as mouse IL-4RA and / or cynomolgus IL-4RA.
En general, se prefiere que la mutelna de lipocalina no tenga reactividad cruzada con una protelna relacionada o una protelna no relacionada. Dicha protelna relacionada es, por ejemplo, una cadena alfa del receptor IL-23 y/o un receptor de citoquinas tipo I con dominio de fibronectina tipo III, mientras que dicha protelna no relacionada es, por ejemplo, una cadena alfa de un receptor IL-6 y/o IL-18.In general, it is preferred that the lipocalin mutelin does not cross-react with a related protein or an unrelated protein. Said related protein is, for example, an alpha chain of the IL-23 receptor and / or a type I cytokine receptor with fibronectin type III domain, while said unrelated protein is, for example, an alpha chain of an IL receptor. -6 and / or IL-18.
Descripcion de las figurasDescription of the figures
La Figura 1 muestra la inhibicion de la fosforilacion de STAT 6 inducida por IL-4 e IL-13 humana (ensayo basado en FACS) en celulas TF-1 por una mutelna de lipocalina de la divulgacion. Figure 1 shows the inhibition of STAT 6 phosphorylation induced by IL-4 and human IL-13 (FACS-based assay) in TF-1 cells by a lipocalin mutelna of the disclosure.
La Figura 2 muestra la inhibicion de la fosforilacion de STAT 6 inducida por IL-4 humana (ensayo basado en FACS) en ratones doble knock-in de la cadena de IL-4RA/IL-13RA1 humana (conocida oficialmente como la subunidad alfa-1 del receptor de Interleucina-13, Uniprot # 78552, SEQ ID NO: 13) por una mutelna de lipocalina de la divulgacion.Figure 2 shows the inhibition of STAT 6 phosphorylation induced by human IL-4 (FACS-based assay) in double-knock-in mice of the human IL-4RA / IL-13RA1 chain (officially known as the alpha subunit). 1 of the Interleukin-13 receptor, Uniprot # 78552, SEQ ID NO: 13) by a lipocalin mutelna of the disclosure.
La Figura 3 muestra la inhibicion de la eotaxina inducida por IL-13 humana en tejido pulmonar de ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana por una mutelna de lipocalina de la divulgacion.Figure 3 shows the inhibition of eotaxin induced by human IL-13 in lung tissue from double knock-in mice of the human IL-4 receptor / human IL-4 receptor 1 alpha chain by a lipocalin mutelin of the divulgation.
La Figura 4 muestra la inhibicion de la transcripcion de eotaxina inducida por IL-13 humana en ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/IL-13 humana por una mutelna de lipocalina de la divulgacion cuando se administra a diferentes intervalos de tiempo (Figura 4a) o diferentes dosis (Figura 4b), antes de la administracion de IL-13 humana, as! como en comparacion con un mutante de IL-4 a diferentes niveles de dosis (Figura 4c).Figure 4 shows the inhibition of eotaxin transcription induced by human IL-13 in double-knock-in mice of the human IL-4 receptor 1-alpha chain / human IL-13 by a lipocalin mutelin of the disclosure when administered at different time intervals (Figure 4a) or different doses (Figure 4b), before the administration of human IL-13, as! as compared to an IL-4 mutant at different dose levels (Figure 4c).
La Figura 5 muestra el analisis de una mutelna de lipocalina nebulizada por cromatografla de exclusion por tamano y difraccion laser.Figure 5 shows the analysis of a nebulized lipocalin mutelna by exclusion chromatography by size and laser diffraction.
La Figura 6 representa las propiedades farmacocineticas y la biodistribucion de una mutelna de lipocalina de la divulgacion en ratones doble knock-in de IL-4RA humana/receptor de IL-13 humana despues de la instilacion intratraqueal.Figure 6 depicts the pharmacokinetic properties and biodistribution of a lipocalin mutelin of the knock-in knock-in mice of human IL-4RA / human IL-13 receptor after intratracheal instillation.
La Figura 7 muestra la inhibicion de la metaplasia de celulas caliciformes inducida por IL-13 en el sistema de cultivo de interfaz aire-llquido del epitelio de las vlas respiratorias humanas mediante una mutelna de lipocalina de la divulgacion.Figure 7 shows the inhibition of goblet cell metaplasia induced by IL-13 in the air-liquid interface culture system of the epithelium of human respiratory viruses by means of a lipocalin mutelna of the disclosure.
Descripcion detalladaDetailed description
La presente divulgacion proporciona una composition que comprende una mutelna de lipocalina lacrimal humana o un fragmento de la misma o una protelna de fusion o un conjugado de la misma que es capaz de inhibir la union de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos, para su uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o prevention de un trastorno en un sujeto, en la que tal mutelna de lipocalina es capaz de exhibir una actividad terapeutica in vivo en el sujeto y es capaz de inhibir el transcrito Ccl11 inducido por IL-13 humana (eotaxina) in vivo, en la que dicha mutelna de lipocalina tiene al menos el 75 % de la secuencia de aminoacidos de la lipocalina (SEQ ID NO: 1), en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene los mismos aminoacidos que la SEQ ID NO: 6 en posiciones de aminoacidos correspondientes a las posiciones 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), y en la que el fragmento de la lipocalina es al menos uno de los aminoacidos N-terminales y/o C-terminales en comparacion con dicha mutelna de lipocalina.The present disclosure provides a composition comprising a human tear lipocalin mutein or a fragment thereof or a fusion protein or a conjugate thereof which is capable of inhibiting the binding of IL-4 and / or IL-13 to its respective receptors, for use in a method of treating, ameliorating or preventing a disorder in a subject, wherein said lipocalin mutein is capable of exhibiting a therapeutic activity in vivo in the subject and is capable of inhibiting the induced Ccl11 transcript by human IL-13 (eotaxin) in vivo, wherein said lipocalin mutelin has at least 75% of the amino acid sequence of lipocalin (SEQ ID NO: 1), wherein said lipocalin mutein or fragment has the same amino acids as SEQ ID NO: 6 in amino acid positions corresponding to positions 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 and 108 of the linear polypeptide sequence of the lipocalin lacrimal hum ana matures (SEQ ID NO: 1), and wherein the lipocalin fragment is at least one of the N-terminal and / or C-terminal amino acids compared to said lipocalin mutelin.
Una mutelna de lipocalina para uso de acuerdo con la presente divulgacion puede unirse especlficamente a la cadena alfa del receptor de IL-4. Ventajosamente, estas mutelnas de lipocalina tienen una alta afinidad de union por la cadena alfa del receptor de IL-4. Tambien se ha demostrado que estas mutelnas de lipocalina proporcionan propiedades de union para el receptor alfa de IL-4 en relation con las mutelnas de lipocalina proporcionadas en el documento WO 2008/015239; en particular, tienen una mayor afinidad de union.A lipocalin mutelna for use according to the present disclosure can bind specifically to the alpha chain of the IL-4 receptor. Advantageously, these lipocalin mutenas have a high binding affinity for the alpha chain of the IL-4 receptor. It has also been shown that these lipocalin mutellins provide binding properties for the alpha receptor of IL-4 in relation to the lipocalin mutelins provided in WO 2008/015239; in particular, they have a greater union affinity.
Los presentes inventores han demostrado que las mutelnas de lipocalina de la presente divulgacion, debido a su union de la cadena alfa del receptor de IL-4, interfieren con la interaction de los receptores de ligando afines, es decir, la(s) citoquina(s) IL-4 y/o IL-13, de una forma tal que provocan una respuesta terapeutica in vivo. Por ejemplo, datos de un modelo de raton transgenico, que se uso para investigar los efectos que las mutelnas de lipocalina de la invention pueden tener en la serialization mediada por IL-4 y/o IL-13, demuestran una interruption de la serialization descendente mediada por IL-4 e IL-13. El raton transgenico, que se asemeja a un humano en que los ratones portan genes que codifican la cadena alfa del receptor de IL-4 humana y la cadena alfa 1 del receptor de IL-13, son representativos del potencial terapeutico en humanos. Con este fin, los genes humanos se ubican en el locus correspondiente del cromosoma respectivo del raton, lo que hace que el raton sea un raton doble knock-in que expresa tanto el receptor tipo I como el receptor tipo II. Por lo tanto, cuando se usa en el presente documento, “cantidad terapeuticamente eficaz” es preferiblemente una cantidad de una mutelna de lipocalina de la presente divulgacion que es terapeuticamente eficaz en un ser humano.The present inventors have demonstrated that the lipocalin mutelnas of the present disclosure, due to their binding of the alpha chain of the IL-4 receptor, interfere with the interaction of the cognate ligand receptors, ie, the cytokine (s). s) IL-4 and / or IL-13, in such a way as to elicit a therapeutic response in vivo. For example, data from a transgenic mouse model, which was used to investigate the effects that the lipocalin mutelnas of the invention may have on IL-4 and / or IL-13 mediated serialization, demonstrate an interruption of descending serialization. mediated by IL-4 and IL-13. The transgenic mouse, which resembles a human in that the mice carry genes coding for the alpha chain of the human IL-4 receptor and the alpha 1 chain of the IL-13 receptor, are representative of the therapeutic potential in humans. To this end, the human genes are located in the corresponding locus of the respective chromosome of the mouse, which makes the mouse a double knock-in mouse that expresses both the type I receptor and the type II receptor. Therefore, when used herein, "therapeutically effective amount" is preferably an amount of a lipocalin mutein of the present disclosure that is therapeutically effective in a human.
En contraste con los Ejemplos de la divulgacion, el estado de la tecnica no ensena al experto en la materia si una mutelna de lipocalina de la divulgacion es capaz de interrumpir la senalizacion descendente o las respuestas celulares inducidas por IL-4 y/o IL-13 en sujetos, y/o que puedan presentar actividad terapeuticas in vivo en sujetos que padezcan uno o mas trastornos, tales como inflamacion alergica, asma alergica, rinitis, conjuntivitis, fibrosis pulmonar, fibrosis qulstica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, proteinosis alveolar pulmonar y slndrome de dificultad respiratoria en adultos. Tampoco se puede derivar del estado de la tecnica ninguna information sobre la eficacia de las mutelnas de lipocalina. En ausencia de evidencia de un efecto terapeutico de una mutelna de lipocalina contra trastornos, por ejemplo, asociados a un aumento de la respuesta inmune Th2 y/o con una reaccion alergica o una inflamacion alergica, no cabrla haber esperado de manera razonable tal efecto terapeutico ni los correspondientes procedimientos de tratamiento, prevencion o mejora.In contrast to the Examples of the disclosure, the state of the art does not teach a person skilled in the art whether a lipocalin mutein of the disclosure is capable of interrupting downward signaling or cellular responses induced by IL-4 and / or IL- 13 in subjects, and / or who may present therapeutic activity in vivo in subjects suffering from one or more disorders, such as allergic inflammation, allergic asthma, rhinitis, conjunctivitis, pulmonary fibrosis, fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary alveolar proteinosis and Respiratory distress syndrome in adults. Nor can any information on the efficacy of lipocalin mutelnas be derived from the state of the art. In the absence of evidence of a therapeutic effect of a mutelna of lipocalin against disorders, for example, associated with an increase in the Th2 immune response and / or with an allergic reaction or an allergic inflammation, it would not have been reasonable to expect such a therapeutic effect nor the corresponding procedures of treatment, prevention or improvement.
De hecho, la presente divulgacion proporciona datos in vivo que muestran un efecto terapeutico de las mutelnas de lipocalina descritas en el presente documento que ilustran, por ejemplo, el efecto antiinflamatorio de las mutelnas de lipocalina de la presente divulgacion. A este respecto, la presente divulgacion muestra, por primera vez, que una mutelna de lipocalina de la divulgacion (SEQ ID NO: 6) es capaz de inhibir con eficacia el transcrito Ccl 11 inducido por IL-13 humana (eotaxina) in vivo y es mas potente que un mutante de IL-4 (la IL-4 (R121D, Y124D) en la Figura 4c), segun medido por una prueba esencialmente descrita en el Ejemplo 5: In fact, the present disclosure provides in vivo data showing a therapeutic effect of the lipocalin mutellins described herein illustrating, for example, the anti-inflammatory effect of the lipocalin mutelins of the present disclosure. In this regard, the present disclosure shows, for the first time, that a lipocalin mutelna of the disclosure (SEQ ID NO: 6) is capable of effectively inhibiting the Ccl 11 transcript induced by human IL-13 (eotaxin) in vivo and is more potent than an IL-4 mutant (IL-4 (R121D, Y124D) in Figure 4c), as measured by a test essentially described in Example 5:
- preparar varios ratones knock-in de doble cadena del receptor alfa de IL-4 humana/receptor alfa 1 de IL-13 humana como se describe en el Ejemplo 4, con la excepcion de que se administraron 30 pl de IL-13 (Peprotech, 1 pg) por instilacion intratraqueal solo una vez,- preparing several double chain knock-in mice of the human IL-4 alpha receptor / human IL-13 alpha 1 receptor as described in Example 4, with the exception that 30 μl of IL-13 was administered (Peprotech , 1 pg) by intratracheal instillation only once,
- opcionalmente, establecer los parametros de prueba como se describe en el Ejemplo 5 y agrupar los ratones en consecuencia,- optionally, set the test parameters as described in Example 5 and group the mice accordingly,
- aplicar la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) mediante instilacion intratraqueal con un volumen de 30 pl a una dosis constante de 98 pg en diferentes momentos antes de la dosis de IL-13 o en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13,- applying the lipocalin mutelna (SEQ ID NO: 6) by intratracheal instillation with a volume of 30 μl at a constant dose of 98 pg at different times before the dose of IL-13 or in different amounts 30 minutes before the dose of IL-13,
- aplicar el mutante IL-4 (R121D, Y124D) tambien por instilacion intratraqueal con un volumen de 30 pl en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13,- apply the mutant IL-4 (R121D, Y124D) also by intratracheal instillation with a volume of 30 μl in different amounts 30 minutes before the dose of IL-13,
- usar el modelo abreviado de inflamacion de las vlas respiratorias inducida por IL-13 (administracion intratraqueal con IL-13 unica) para evaluar la duracion de la respuesta farmacologica, la dependencia de la dosis y la potencia comparable.- use the abbreviated model of airway inflammation induced by IL-13 (intratracheal administration with single IL-13) to assess the duration of the pharmacological response, dose dependence and comparable potency.
El efecto terapeutico observado en el modelo animal murino aplicado en la presente divulgacion proporciona, por lo tanto, pruebas suficientes de una aplicacion terapeutica, dada la presencia de ortologos humanos y la ausencia de ortologos murinos. Sobre la base de este principio, es mas que razonable que, en ausencia de datos sobre pacientes humanos, el experimento in vivo sea lo suficientemente predictivo de la actividad in vivo, por ejemplo, la actividad antiinflamatoria in vivo de las mutelnas de lipocalina descritas en el presente documento en humanos. Ademas, la presente divulgacion demuestra que una mutelna de lipocalina de la divulgacion (SEQ ID NO: 6) es capaz de exhibir una actividad funcional tan buena como un anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA (el mAb anti-IL4R en la Figura 7; la region variable de la cadena ligera y pesada que se muestra en SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente) descrita en el Ejemplo 8, segun medida por una prueba esencialmente descrita en el Ejemplo 8: - tratar MucilAir™ (un sistema de cultivo de interfaz aire-llquido con epitelio de las vlas respiratorias humanas reconstituido in vitro utilizando celulas humanas primarias) cada dos dlas con IL-13 humana a aproximadamente de 0,3 a 30 ng/ml,The therapeutic effect observed in the murine animal model applied in the present disclosure therefore provides sufficient evidence of a therapeutic application, given the presence of human orthologs and the absence of murine orthologs. On the basis of this principle, it is more than reasonable that, in the absence of data on human patients, the in vivo experiment is sufficiently predictive of in vivo activity , for example, the in vivo antiinflammatory activity of the lipocalin mutellins described in the present document in humans. In addition, the present disclosure demonstrates that a lipocalin mutelna of the disclosure (SEQ ID NO: 6) is capable of exhibiting a functional activity as good as an anti-IL-4RA monoclonal antibody (the anti-IL4R mAb in Figure 7; the variable region of the light and heavy chain shown in SEQ ID NO: 14 and 15, respectively) described in Example 8, as measured by a test essentially described in Example 8: - treating MucilAir ™ (a culture system) of air-liquid interface with human respiratory epithelium reconstituted in vitro using primary human cells) every two days with human IL-13 at approximately 0.3 to 30 ng / ml,
- opcionalmente, realizar una tincion con azul Alcian in situ (tine mucopolisacaridos acidos y glicosaminoglicanos de azul a verde azulado) y/o realizar un analisis histologico, con el fin de demostrar que MucilAir ™ exhibe una mayor densidad de celulas caliciformes despues de aproximadamente 14 dlas de tratamiento, - optionally, perform a stain with Alcian blue in situ (tine mucopolysaccharides acids and glycosaminoglycans from blue to bluish green) and / or perform a histological analysis, in order to demonstrate that MucilAir ™ exhibits a higher density of goblet cells after approximately 14 days. days of treatment,
- probar el efecto inhibitorio de una mutelna de lipocalina en la metaplasia de las celulas caliciformes comparando la exposicion continua de MucilAir™ con aproximadamente 10 ng/ml de IL-13 humana durante 14 dlas como control positivo, con IL-13 mas diferentes concentraciones de una mutelna de lipocalina, con IL-13 mas diferentes concentraciones de dicho anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA (las regiones variables de las cadenas ligera y pesada se muestran en SEQ ID NO: 14 y 15), y con MucilAir™ cultivado durante 14 dlas sin IL-13 como control negativo.- test the inhibitory effect of a lipocalin mutelna on the goblet cell metaplasia by comparing the continuous exposure of MucilAir ™ with approximately 10 ng / ml of human IL-13 for 14 days as a positive control, with IL-13 plus different concentrations of a lipocalin mutelna, with IL-13 plus different concentrations of said anti-IL-4RA monoclonal antibody (the variable regions of the light and heavy chains are shown in SEQ ID NO: 14 and 15), and with MucilAir ™ grown for 14 days without IL-13 as a negative control.
- realizar una tincion con azul de Alcian, por ejemplo, tincion con azul Alcian dd en la superficie apical para una tincion in situ y tomar imagenes de celulas tenidas bajo un microscopio de contraste de fase para el analisis de imagenes,- make a stain with Alcian blue, for example, staining with Alcian dd blue on the apical surface for in situ staining and taking images of cells held under a phase contrast microscope for image analysis ,
- cuantificar el porcentaje de celulas positivas de azul de Alcian por medio del programa de procesamiento de imagenes Java de dominio publico ImageJ y expresar su numero como relacion de area del area azul de Alcian/area de imagen total,- quantify the percentage of Alcian blue positive cells by means of the public image Java image processing program ImageJ and express its number as area ratio of the Alcian blue area / total image area,
- opcionalmente, medir la eotaxina-3 (una quimiocina inducida por IL-13) en el medio basal en el dla 14 usando un kit de eotaxina-3 ultrasensible disponible comercialmente, por ejemplo, Meso Scale Discovery. optionally, measuring eotaxin-3 (a chemokine induced by IL-13) in the basal medium on day 14 using a commercially available ultrasensitive eotaxin-3 kit, for example, Meso Scale Discovery.
Dicho anticuerpo anti-IL-4RA tiene las regiones variables de cadena ligera y pesada de SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente, y fue desarrollado por Amgen (anteriormente Immunex) y se denomina AMG 317. Es un anticuerpo monoclonal completamente humano que estaba bajo investigacion por su capacidad para bloquear las acciones de la interleucina-4 y la interleucina-13 que desempenan un papel en el asma (en 2008, se completo un estudio de rango de dosis de fase 2 en asma moderada a grave). Un analisis intermedio mostro evidencia de actividad biologica; sin embargo, la eficacia cllnica general no cumplio con las expectativas. Por lo tanto, la mutelna de lipocalina de SEQ ID NO: 6 es capaz de inhibir la metaplasia de celulas caliciformes inducida por IL-13 tan bien como el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA descrito en el presente documento, cuando la comparacion de la mutelna de lipocalina con dicho anticuerpo anti-IL-4RA se realizo como se describe anteriormente. Por lo tanto, se prefiere en algunas realizaciones adicionales que una mutelna de lipocalina de la divulgacion tenga en las pruebas descritas anteriormente las mismas propiedades que la mutelna de lipocalina de SEQ ID NO: 6 con respecto a la inhibicion de la metaplasia de las celulas caliciformes.Said anti-IL-4RA antibody has the light and heavy chain variable regions of SEQ ID NO: 14 and 15, respectively, and was developed by Amgen (formerly Immunex) and is referred to as AMG 317. It is a fully human monoclonal antibody that was under investigation for its ability to block the actions of interleukin-4 and interleukin-13 that play a role in asthma (in 2008, a dose-range study of phase 2 in moderate to severe asthma was completed). An intermediate analysis showed evidence of biological activity; however, the overall clinical efficacy did not meet expectations. Therefore, the lipocalin mutelna of SEQ ID NO: 6 is capable of inhibiting the goblet cell metaplasia induced by IL-13 as well as the anti-IL-4RA monoclonal antibody described herein, when the comparison of the Lipocalin mutelna with said anti-IL-4RA antibody was performed as described above. Therefore, it is preferred in some additional embodiments that a lipocalin mutelna of the disclosure have in the tests described above the same properties as the lipocalin mutein of SEQ ID NO: 6 with respect to the inhibition of goblet cell metaplasia. .
El complejo IL-4/IL-4Ra puede dimerizarse con la cadena gamma comun (yc, CD132) o la subunidad IL-13Ralpha1 (IL-13Ra1), a traves de dominios en IL-4, para crear dos complejos de senalizacion diferentes, comunmente denominados receptores Tipo I y Tipo II, respectivamente. De manera alternativa, IL-13 puede unirse a IL-13Ra1 para formar un complejo IL-13/IL-13Ra1 que recluta a la subunidad IL-4Ra para formar un complejo receptor de Tipo Ii. Por lo tanto, IL-4Ra media las actividades biologicas de IL-4 e IL-13 (revisado por Gessner y col., Immunobiology, 201:285, 2000). Las mutelnas de lipocalina de la presente divulgacion interfieren ventajosamente con y/o bloquean la senalizacion a traves de los receptores de Tipo I y/o Tipo II, ya que estas mutelnas de lipocalina son capaces de unirse a la cadena alfa del receptor de IL-4.The IL-4 / IL-4Ra complex can be dimerized with the common gamma chain (yc, CD132) or the IL-13Ralpha1 subunit (IL-13Ra1), through domains in IL-4, to create two different signaling complexes, commonly referred to as Type I and Type II receivers, respectively. Alternatively, IL-13 can bind to IL-13Ra1 to form an IL-13 / IL-13Ra1 complex that recruits the IL-4Ra subunit to form a Type Ii receptor complex. Therefore, IL-4Ra mediates the biological activities of IL-4 and IL-13 (reviewed by Gessner et al., Immunobiology, 201: 285, 2000). The lipocalin mutenes of the present disclosure advantageously interfere with and / or block signaling through Type I and / or Type II receptors, since these lipocalin mutellins are capable of binding to the alpha chain of the IL- receptor. Four.
Los estudios in vitro han demostrado que IL-4 e IL-13 activan las funciones efectoras en varios tipos de celulas, por ejemplo, en celulas T, celulas B, eosinofilos, mastocitos, basofilos, celulas del musculo liso de las vlas respiratorias, celulas epiteliales respiratorias, fibroblastos de pulmon y celulas endoteliales (revisado por Steinke y col, Resp Res, 2:66, 2001, y por Willis-Karp, Immunol Rev, 202: 175, 2004). IL-4Ra se expresa en numeros bajos (100-5000 moleculas/celula) en varios tipos de celulas (Lowenthal y col., J Immunol, 140:456, 1988), por ejemplo, celulas T de sangre periferica, monocitos, celulas epiteliales de las vlas respiratorias, celulas B y fibroblastos de pulmon. El receptor tipo I predomina en las celulas hematopoyeticas, mientras que el receptor tipo II se expresa tanto en celulas hematopoyeticas como en celulas no hematopoyeticas. In vitro studies have shown that IL-4 and IL-13 activate effector functions in several cell types, for example, in T cells, B cells, eosinophils, mast cells, basophils, smooth muscle cells of respiratory lines, cells respiratory epithelial cells, lung fibroblasts and endothelial cells (reviewed by Steinke et al, Resp Res, 2:66, 2001, and by Willis-Karp, Immunol Rev, 202: 175, 2004). IL-4Ra is expressed in low numbers (100-5000 molecules / cell) in various cell types (Lowenthal et al., J Immunol, 140: 456, 1988), for example, peripheral blood T cells, monocytes, epithelial cells of respiratory vlas, B cells and lung fibroblasts. The type I receptor predominates in the hematopoietic cells, while the type II receptor is expressed in both hematopoietic and non-hematopoietic cells.
Los receptores de la superficie celular y los complejos de receptores se unen a IL-4 y/o IL-13 con diferentes afinidades. Los componentes principales de los receptores y complejos de receptores que se unen a IL-4 y/o IL-13 son IL-4Ra, IL-13Ra1 e IL-13Ra2. Estas cadenas se expresan en la superficie de las celulas como monomeros o heterodlmeros de IL-4Ra/IL-13Ra1 o IL-4Ra/IL-13Ra2. El monomero de IL-4ra se une a IL-4, pero no a IL-13. Los monomeros de IL-13Ra1 e IL-13Ra2 se unen a IL-13, pero no se unen a IL-4. Los heterodlmeros de IL-4Ra/IL-13RaI e IL-4Ra/IL-13Ra2 se unen tanto a IL-4 como a IL-13. Dado el hecho de que el receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Ralpha2) se une a IL-13 con alta afinidad, pero es un receptor sin senalizacion que se considera un receptor senuelo para IL-13, se preve que las mutelnas de lipocalina de la presente divulgacion no se unen preferiblemente al receptor alfa 2 de IL-13.Cell surface receptors and receptor complexes bind to IL-4 and / or IL-13 with different affinities. The major components of the receptors and receptor complexes that bind to IL-4 and / or IL-13 are IL-4Ra, IL-13Ra1 and IL-13Ra2. These chains are expressed on the surface of the cells as monomers or heterodimers of IL-4Ra / IL-13Ra1 or IL-4Ra / IL-13Ra2. The monomer of IL-4ra binds to IL-4, but not to IL-13. The monomers of IL-13Ra1 and IL-13Ra2 bind to IL-13, but do not bind to IL-4. The heterodimers of IL-4Ra / IL-13RaI and IL-4Ra / IL-13Ra2 bind to both IL-4 and IL-13. Given the fact that the alpha-2 receptor of IL-13 (IL-13Ralpha2) binds to IL-13 with high affinity, but is a non-signaling receptor that is considered a decoy receptor for IL-13, it is anticipated that the mutelnas of lipocalin of the present disclosure do not bind preferably to the alpha-2 receptor of IL-13.
Tal como se explico, tanto IL-4 como IL-13 envlan senales a traves de IL-4Ra, un componente de los receptores de tipo I (IL-4Ra y yc) y tipo II (IL-4Ra e IL-13Ra1). IL-4 emite senales a traves de las vlas de los receptores de tipo I y II, mientras que la IL-13 solo emite senales a traves del IL-4R tipo II. IL-13 tambien se une a la cadena IL-13Ra2, que no contiene un dominio de senalizacion transmembrana y se cree que actua como un receptor senuelo. yc activa la janus quinasa (JAK)3, mientras que IL-13Ra1 activa la 2 tirosina quinasa (TYK2) y JAK2. Las JAK activadas luego fosforilan STAT-6. El STAT-6 fosforilado se dimeriza, migra al nucleo y se une a los promotores de los genes que responden a IL-4 e IL-13, como aquellos asociados a la diferenciacion de celulas T-helper tipo 2 (Th2), la inflamacion de las vlas respiratorias, la hiperreactividad de las vlas respiratorias (AHR) y la produccion de moco. As discussed, both IL-4 and IL-13 send signals through IL-4Ra, a component of type I (IL-4Ra and yc ) and type II (IL-4Ra and IL-13Ra1) receptors. IL-4 emits signals through the vials of type I and II receptors, while IL-13 only emits signals through type II IL-4R. IL-13 also binds to the IL-13Ra2 chain, which does not contain a transmembrane signaling domain and is thought to act as a decoy receptor. and c activates janus kinase (JAK) 3, while IL-13Ra1 activates 2 tyrosine kinase (TYK2) and JAK2. Activated JAKs then phosphorylate STAT-6. Phosphorylated STAT-6 dimerizes, migrates to the nucleus and binds to the promoters of genes that respond to IL-4 and IL-13, such as those associated with the differentiation of T-helper type 2 (Th2) cells, inflammation of the respiratory vlas, the hyperreactivity of the respiratory vlas (AHR) and the production of mucus.
Las respuestas inmunitarias de tipo Th2 promueven la produccion de anticuerpos y la inmunidad humoral, y se elaboran para combatir los patogenos extracelulares. Las celulas Th2 son mediadores de la produccion de Ig (inmunidad humoral) y producen IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13 (Tanaka y col., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251-272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1996)). Las respuestas inmunitarias de tipo Th2 se caracterizan por la generacion de ciertas citoquinas (por ejemplo, IL-4, IL-13) y tipos especlficos de anticuerpos (IgE, IgG4) y son tlpicas de reacciones alergicas, que pueden provocar ojos llorosos y slntomas asmaticos, tales como la inflamacion de las vlas respiratorias y la contraccion de las celulas musculares de las vlas respiratorias en los pulmones.Th2-type immune responses promote the production of antibodies and humoral immunity, and are elaborated to combat extracellular pathogens. Th2 cells are mediators of Ig production (humoral immunity) and produce IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 and IL-13 (Tanaka et al., Cytokine Regulation of Humoral Immunity , 251-272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)). Th2-type immune responses are characterized by the generation of certain cytokines (eg, IL-4, IL-13) and specific types of antibodies (IgE, IgG4) and are typical of allergic reactions, which can cause watery eyes and symptoms asthmatics, such as the inflammation of the respiratory vlas and the contraction of the muscular cells of the respiratory vlas in the lungs.
Ademas, el trastorno que se trata, mejora o previene preferiblemente por los procedimientos de la presente divulgacion mediante la aplicacion de las lipocalinas tal como se describe en el presente documento, puede estar asociado a una reaccion alergica o inflamacion alergica.Furthermore, the disorder that is treated, preferably improved or prevented by the methods of the present disclosure through the application of lipocalins as described herein, may be associated with an allergic reaction or allergic inflammation.
En algunas realizaciones preferidas, el trastorno puede ser asma alergica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis. In some preferred embodiments, the disorder may be allergic asthma, rhinitis, conjunctivitis or dermatitis.
El asma es una enfermedad inflamatoria compleja y persistente caracterizada por la hipersensibilidad de las vlas respiratorias en asociacion con la inflamacion de las vlas respiratorias. Los estudios sugieren que el uso regular de corticosteroides inhalados en dosis altas y broncodilatadores de accion prolongada u omalizumab (un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a la inmunoglobulina E y se usa a menudo como terapia de proximo paso) puede no ser suficiente para proporcionar un control del asma en todos los pacientes, lo que pone de manifiesto una importante necesidad no satisfecha. La interleucina-4, la interleucina-13 y el transductor de senales y el activador del factor de transcripcion 6 son componentes clave en el desarrollo de la inflamacion de las vlas respiratorias, la produccion de moco y la hipersensibilidad de las vlas respiratorias en el asma. Los compuestos biologicos dirigidos a estas moleculas pueden proporcionar una nueva modalidad terapeutica para pacientes con asma no controlada de moderada a grave. La presente divulgacion proporciona estos compuestos biologicos por medio de las mutelnas de lipocalina, tal como se describe en el presente documento.Asthma is a complex and persistent inflammatory disease characterized by the hypersensitivity of respiratory vlas in association with the inflammation of the respiratory vlas. Studies suggest that the regular use of inhaled corticosteroids in high doses and long-acting bronchodilators or omalizumab (a humanized monoclonal antibody that binds to immunoglobulin E and is often used as a next step therapy) may not be sufficient to provide a control of asthma in all patients, which reveals an important need not met. Interleukin-4, interleukin-13 and signal transducer and activator of transcription factor 6 are key components in the development of respiratory pathway inflammation, mucus production and hypersensitivity of respiratory viruses in asthma . Biological compounds directed to these molecules can provide a new therapeutic modality for patients with uncontrolled moderate to severe asthma. The present disclosure provides these biological compounds by means of the lipocalin mutelnas, as described herein.
En algunas realizaciones preferidas, el asma alergica es una inflamacion de las vlas respiratorias en la que la via IL4/IL13 contribuye a la patogenesis de la enfermedad.In some preferred embodiments, allergic asthma is an inflammation of the respiratory tract in which the IL4 / IL13 pathway contributes to the pathogenesis of the disease.
Ademas, el trastorno que se trata, mejora o previene preferiblemente por los procedimientos de la presente divulgacion mediante la aplicacion de las lipocalinas tal como se describe en el presente documento, tambien puede ser trastornos pulmonares, por ejemplo, trastornos pulmonares en los que la via IL4/IL13 contribuye a la patogenia de la enfermedad. Dichos trastornos pulmonares incluyen, pero no se limitan a, fibrosis pulmonar, incluyendo la enfermedad pulmonar fibrotica cronica, otras afecciones caracterizadas por la proliferacion de fibroblastos inducida por IL-4 o la acumulacion de colageno en los pulmones, afecciones pulmonares en las que desempena un papel la respuesta inmune Th2, afecciones caracterizadas por la disminucion de la funcion de barrera en el pulmon (por ejemplo, como resultado del dano inducido por la IL-4 al epitelio), o las afecciones en las que la IL-4 desempena un papel en la respuesta inflamatoria.In addition, the disorder that is treated, preferably improved or prevented by the methods of the present disclosure by the application of lipocalins as described herein, may also be pulmonary disorders, for example, pulmonary disorders in which the IL4 / IL13 contributes to the pathogenesis of the disease. Such pulmonary disorders include, but are not limited to, pulmonary fibrosis, including chronic fibrotic pulmonary disease, other conditions characterized by fibroblast proliferation induced by IL-4 or collagen accumulation in the lungs, pulmonary conditions in which it performs a role of the Th2 immune response, conditions characterized by decreased barrier function in the lung (for example, as a result of damage induced by IL-4 to the epithelium), or conditions in which IL-4 plays a role in the inflammatory response.
De manera similar, la fibrosis qulstica (FQ) se caracteriza por la sobreproduccion de moco y el desarrollo de infecciones cronicas. La inhibicion de IL-4RA y la respuesta Th2 reduciran la produccion de moco y ayudaran a controlar infecciones tales como la aspergilosis broncopulmonar alergica (ABPA). La micosis broncopulmonar alergica se presenta principalmente en pacientes con fibrosis qulstica o asma, donde la respuesta inmune Th2 es dominante. La inhibicion de IL-4RA y la respuesta Th2 ayudaran a eliminar y controlar estas infecciones.Similarly, qulstic fibrosis (CF) is characterized by overproduction of mucus and the development of chronic infections. Inhibition of IL-4RA and the Th2 response will reduce mucus production and help control infections such as allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA). Allergic bronchopulmonary mycosis occurs mainly in patients with qulstic fibrosis or asthma, where the Th2 immune response is dominant. The inhibition of IL-4RA and the Th2 response will help eliminate and control these infections.
De manera similar, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) se asocia a hipersecrecion de moco y fibrosis. La inhibicion de IL-4RA y la respuesta Th2 reduciran la produccion de moco y el desarrollo de fibrosis, mejorando as! la funcion respiratoria y retrasando la progresion de la enfermedad. La neumopatla y la fibrosis inducidas por bleomicina y la fibrosis pulmonar inducida por radiacion son trastornos caracterizados por fibrosis pulmonar que se manifiesta por la afluencia de celulas Th2, CD4.sup.+ y macrofagos, que producen IL-4 e IL-13 que, a su vez, median el desarrollo de la fibrosis. La inhibicion de IL-4RA y la respuesta Th2 reduciran o impediran el desarrollo de estos trastornos.Similarly, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is associated with mucus hypersecretion and fibrosis. The inhibition of IL-4RA and the Th2 response will reduce the production of mucus and the development of fibrosis, thus improving! respiratory function and delaying the progression of the disease. Pneumopathy and fibrosis induced by bleomycin and radiation-induced pulmonary fibrosis are disorders characterized by pulmonary fibrosis manifested by the influx of Th2 cells, CD4.sup. + And macrophages, which produce IL-4 and IL-13 which, in turn, they mediate the development of fibrosis. The inhibition of IL-4RA and the Th2 response will reduce or prevent the development of these disorders.
Ademas, IL-4 e IL-13 inducen la diferenciacion de las celulas epiteliales de pulmon en celulas caliciformes productoras de moco. Por lo tanto, IL-4 e IL-13 pueden contribuir a una mayor produccion de moco en subpoblaciones o en algunas situaciones. La produccion y secrecion de moco contribuye a la patogenesis de la enfermedad en la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) y la fibrosis qulstica (FQ). Por lo tanto, el trastorno, asociado a una produccion de moco o una secrecion de moco (por ejemplo, sobreproduccion o hipersecrecion), puede tratarse, mejorarse o prevenirse preferiblemente por los procedimientos de la presente divulgacion aplicando una mutelna de lipocalina tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones preferidas, el trastorno, asociado a una produccion de moco o una secrecion de moco, es preferiblemente una enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) o una fibrosis qulstica (FQ). En otras realizaciones preferidas, la composicion de la divulgacion comprende ademas un medicamento mucolltico.In addition, IL-4 and IL-13 induce the differentiation of lung epithelial cells into goblet-producing goblet cells. Therefore, IL-4 and IL-13 may contribute to increased mucus production in subpopulations or in some situations. The production and secretion of mucus contributes to the pathogenesis of the disease in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and qulstic fibrosis (CF). Therefore, the disorder, associated with a production of mucus or a mucus secretion (eg, overproduction or hypersecretion), can be treated, improved or prevented preferably by the methods of the present disclosure by applying a lipocalin mutelna as described in the present document. In some preferred embodiments, the disorder, associated with a mucus production or a mucus secretion, is preferably a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or a fibrosis qulstica (CF). In other preferred embodiments, the composition of the disclosure further comprises a mucolytic medicament.
La proteinosis alveolar pulmonar se caracteriza por la interrupcion del aclaramiento de surfactante. IL-4 aumenta el producto surfactante. En algunas realizaciones adicionales, el uso de un antagonista de IL-4RA tal como una mutelna de lipocalina de la divulgacion para disminuir la produccion de surfactante y disminuir la necesidad de lavado de pulmon completo, tambien se contempla en el presente documento.Pulmonary alveolar proteinosis is characterized by interruption of surfactant clearance. IL-4 increases the surfactant product. In some additional embodiments, the use of an IL-4RA antagonist such as a lipocalin mutein for the disclosure to decrease the production of surfactant and decrease the need for complete lung lavage, is also contemplated herein.
El slndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA) puede atribuirse a una serie de factores, uno de los cuales es la exposicion a sustancias qulmicas toxicas. Por lo tanto, como ejemplo preferido, pero no limitativo, una poblacion de pacientes susceptibles al SDRA son los pacientes crlticamente enfermos que usan ventiladores, ya que el SDRA es una complicacion frecuente en tales pacientes. En algunas realizaciones adicionales, un antagonista de IL-4RA, tal como una mutelna de lipocalina de la divulgacion, se puede usar para aliviar, prevenir o tratar el SDRA reduciendo la inflamacion y las moleculas de adhesion.The syndrome of respiratory distress in adults (ARDS) can be attributed to a series of factors, one of which is exposure to toxic chemical substances. Therefore, as a preferred but not limiting example, a population of patients susceptible to ARDS are critically ill patients who use ventilators, since ARDS is a frequent complication in such patients. In some additional embodiments, an IL-4RA antagonist, such as a lipocalin mutelna of the disclosure, can be used to alleviate, prevent or treat ARDS by reducing inflammation and adhesion molecules.
La sarcoidosis se caracteriza por lesiones granulomatosas. En algunas realizaciones adicionales, el uso de un antagonista de IL-4RA tal como una mutelna de lipocalina de la divulgacion para tratar la sarcoidosis, particularmente la sarcoidosis pulmonar, tambien se contempla en el presente documento. Sarcoidosis is characterized by granulomatous lesions. In some additional embodiments, the use of an IL-4RA antagonist such as a lipocalin mutelin of the disclosure for treating sarcoidosis, particularly pulmonary sarcoidosis, is also contemplated herein.
Las afecciones en las que la ruptura de la barrera inducida por IL-4 desempena un papel (por ejemplo, afecciones caracterizadas por una disminucion de la funcion de la barrera epitelial en el pulmon) pueden tratarse con antagonistas de IL-4RA. El dano a la barrera epitelial en los pulmones puede ser inducido por IL-4 y/o IL-13 directa o indirectamente. El epitelio en el pulmon funciona como una barrera selectiva que impide que los contenidos del lumen pulmonar entren en la submucosa. Una barrera danada o "permeable" permite que los antlgenos crucen la barrera, lo que a su vez provoca una respuesta inmune que puede causar un dano adicional al tejido pulmonar. Dicha respuesta inmune puede incluir el reclutamiento de eosinofilos o mastocitos, por ejemplo. Se puede administrar un antagonista de IL-4RA para inhibir dicha estimulacion indeseable de una respuesta inmune.Conditions in which the disruption of the barrier induced by IL-4 plays a role (for example, conditions characterized by a decrease in the function of the epithelial barrier in the lung) can be treated with IL-4RA antagonists. The damage to the epithelial barrier in the lungs can be induced by IL-4 and / or IL-13 directly or indirectly. The epithelium in the lung functions as a selective barrier that prevents the contents of the pulmonary lumen from entering the submucosa. A damaged or "permeable" barrier allows antigens to cross the barrier, which in turn elicits an immune response that can cause additional damage to the lung tissue. Said immune response may include the recruitment of eosinophils or mast cells, for example. An IL-4RA antagonist can be administered to inhibit said undesirable stimulation of an immune response.
En este sentido, se puede emplear un antagonista de IL-4RA tal como una mutelna de lipocalina de la divulgacion para promover la curacion del epitelio pulmonar, por ejemplo, en asmaticos, restaurando as! la funcion de barrera, o alternativamente, administrada con fines profilacticos, para prevenir el dano inducido por IL-4 y/o IL-13 al epitelio pulmonar.In this regard, an IL-4RA antagonist such as a lipocalin mutelna of the disclosure can be employed to promote the healing of pulmonary epithelium, for example, in asthmatics, thereby restoring! the barrier function, or alternatively, administered for prophylactic purposes, to prevent the damage induced by IL-4 and / or IL-13 to the pulmonary epithelium.
Debe observarse que los procedimientos para tratar una enfermedad o trastorno de acuerdo con la presente divulgacion no estan limitados por un mecanismo de accion particular. Por ejemplo, en algunas realizaciones adicionales, la mutelna de lipocalina de la divulgacion se puede utilizar como agentes de terapia genica en procedimientos descritos.It should be noted that the methods for treating a disease or disorder in accordance with the present disclosure are not limited by a particular mechanism of action. For example, in some additional embodiments, the lipocalin mutein of the disclosure can be used as gene therapy agents in described procedures.
Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervencion cllnica en un intento de alterar el curso natural del sujeto o de la celula que se esta tratando, y puede realizarse antes o durante el curso de la patologla cllnica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevencion de la aparicion o de la recurrencia de una enfermedad o una afeccion o de un slntoma de la misma, el alivio de una afeccion o de un slntoma de la enfermedad, la disminucion de cualquier consecuencia patologica directa o indirecta de la enfermedad, la disminucion de la tasa de progresion de la enfermedad, la mejora o el paliativo del estado de la enfermedad y el logro de la remision o de un mejor pronostico. En algunas realizaciones, los procedimientos y las composiciones de la divulgacion son utiles en intentos de retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno. El tratamiento es aplicable tanto a la terapia humana como a las aplicaciones veterinarias.As used herein, "treatment" refers to clinical intervention in an attempt to alter the natural course of the subject or cell being treated, and may be performed before or during the course of the clinical pathology. Desirable effects of treatment include the prevention of the onset or recurrence of a disease or condition or a condition thereof, the alleviation of a condition or a disease symptom, the reduction of any direct pathological consequence or indirect of the disease, the reduction of the rate of progression of the disease, the improvement or the palliative of the state of the disease and the achievement of the remission or of a better prognosis. In some embodiments, the methods and compositions of the disclosure are useful in attempts to delay the development of a disease or disorder. The treatment is applicable to both human therapy and veterinary applications.
El termino “prevencion” indica que los trastornos (o los slntomas asociados a ellos) descritos en el presente documento pueden evitarse antes de que ocurran y/o que los trastornos no se repitan.The term "prevention" indicates that the disorders (or the symptoms associated with them) described herein can be avoided before they occur and / or that the disorders do not recur.
El termino “mejora” indica que los trastornos (o slntomas asociados a los mismos) descritos en el presente documento se alivian, disminuyen, aminoran y/o palian.The term "improvement" indicates that the disorders (or symptoms associated therewith) described herein are alleviated, diminished, lessened and / or mitigated.
El termino "administrado" o "administrar" en todas sus formas gramaticales significa la administracion de una dosis terapeuticamente eficaz de la mutelna de lipocalina como unico agente terapeutico o en combinacion con otro agente terapeutico, tal como se describe en el presente documento, a un sujeto. Por lo tanto, se preve que una mutelna de lipocalina de la presente divulgacion este preferiblemente en forma de una composition, preferiblemente una composicion farmaceutica, que se pueda emplear preferiblemente en enfoques de terapia conjunta, es decir, en administracion conjunta con otros medicamentos o farmacos, por ejemplo, otros medicamentos para el tratamiento de un trastorno tal como se describe en el presente documento y/o cualquier otro agente terapeutico que podrla ser beneficioso en el contexto de los procedimientos de la presente divulgacion. Por lo tanto, se prefiere que una composicion que comprenda las mutelnas de lipocalina descritas en el presente documento comprenda ademas un medicamento antialergico y/o un medicamento antialergico antiinflamatorio.The term "administered" or "administering" in all its grammatical forms means the administration of a therapeutically effective dose of the lipocalin mutein as the sole therapeutic agent or in combination with another therapeutic agent, as described herein, to a subject. Therefore, it is envisioned that a lipocalin mutein of the present disclosure is preferably in the form of a composition, preferably a pharmaceutical composition, which can be preferably employed in co-therapy approaches, ie, in co-administration with other drugs or drugs. , for example, other medicaments for the treatment of a disorder as described herein and / or any other therapeutic agent that could be beneficial in the context of the methods of the present disclosure. Therefore, it is preferred that a composition comprising the lipocalin mutelins described herein also comprises an anti-allergic medicament and / or anti-inflammatory anti-allergic medicament.
La expresion "cantidad eficaz", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y por perlodos de tiempo necesarios de una mutelna de lipocalina tal como se describe en el presente documento, para lograr el resultado terapeutico o profilactico deseado. La dosis exacta dependera del proposito del tratamiento, y un experto en la materia la podra determinar utilizando tecnicas conocidas.The term "effective amount", as used herein, refers to an amount effective, in doses and per times of time necessary of a lipocalin mutelna as described herein, to achieve the therapeutic result. or desired prophylactic. The exact dose will depend on the purpose of the treatment, and a person skilled in the art will be able to determine it using known techniques.
Por "cantidad terapeuticamente eficaz" se entiende una dosis que produce los efectos para los que se administra. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" de una mutelna de lipocalina tal como se describe en el presente documento puede variar de acuerdo con factores tales como la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de la administracion, la interaction con otros farmacos y la gravedad de la afeccion, y se podra determinar con la experimentation de rutina por parte de los expertos en la materia. A veces, el termino "cantidad terapeuticamente eficaz" puede usarse indistintamente en el presente documento con el termino "cantidad farmaceuticamente eficaz":By "therapeutically effective amount" is meant a dose that produces the effects for which it is administered. A "therapeutically effective amount" of a lipocalin mutelna as described herein may vary according to factors such as age, body weight, general health, sex, diet, time of administration, the interaction with other drugs and the severity of the condition, and may be determined with routine experimentation by experts in the field. Sometimes, the term "therapeutically effective amount" may be used interchangeably herein with the term "pharmaceutically effective amount":
Una cantidad terapeuticamente eficaz, cuando se usa en la presente solicitud, es tambien aquella en la que cualquier efecto toxico o perjudicial de la mutelna de lipocalina es superado por los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y durante los perlodos de tiempo necesarios de una mutelna de lipocalina tal como se describe en el presente documento, para lograr el resultado profilactico deseado. Generalmente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profilactica en sujetos antes de la enfermedad o en una etapa mas temprana de la misma, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz. La mutelna de lipocalina descrita en el presente documento que tiene la actividad terapeutica deseada puede administrarse en un vehlcuio fisiologicamente aceptable a un paciente, tal como se describe en el presente documento.A therapeutically effective amount, when used in the present application, is also that in which any toxic or deleterious effect of the lipocalin mutein is overcome by the therapeutically beneficial effects. A "prophylactically effective amount" refers to an amount effective, in doses and for the necessary periods of time of a lipocalin mutein such as described herein, to achieve the desired prophylactic result. Generally, but not necessarily, since a prophylactic dose is used in subjects before or at an earlier stage of the disease, the prophylactically effective amount will be less than the therapeutically effective amount. The lipocalin mutelna described in present document having the desired therapeutic activity can be administered in a physiologically acceptable vehicle to a patient, as described herein.
En algunas realizaciones, un "sujeto", cuando se usa en la presente solicitud, es un vertebrado. En ciertas realizaciones particulares, el vertebrado es un mamlfero. Los mamlferos incluyen, pero no se limitan a, primates (incluyendo primates humanos y no humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas realizaciones particulares, un sujeto mamlfero es un ser humano. En algunas realizaciones adicionales, un sujeto humano, sinonimo de un individuo, es un sujeto particularmente preferido. En algunas realizaciones adicionales, un sujeto humano que lo necesite, cuando se usa en la presente solicitud, es un paciente.In some embodiments, a "subject", when used in the present application, is a vertebrate. In certain particular embodiments, the vertebrate is a mammal. Mammals include, but are not limited to, primates (including human and non-human primates) and rodents (eg, mice and rats). In certain particular embodiments, a mammalian subject is a human being. In some additional embodiments, a human subject, synonymous with an individual, is a particularly preferred subject. In some additional embodiments, a human subject in need, when used in the present application, is a patient.
Una protelna de la divulgacion puede ser una mutelna de una lipocalina, preferiblemente una lipocalina seleccionada del grupo que consiste en protelna de union a retinol (RBP), protelna de union a bilina (BBP), apolipoprotelna D (APO D), lipocalina asociada a gelatinasa de neutrofilos (NGAL), lipocalina lacrimal (TLPC), protelna relacionada con la microglobulina a2 (A2m), 24p3/uterocalina (24p3), protelna 1 de la glandula de von Ebners (VEGP 1), protelna 2 de la glandula de von Ebners (VEGP 2) y precursor del alergeno mayoritario Can f1 (ALL-1), siendo NGAL humana la lipocalina preferida y la lipocalina lacrimal humana la lipocalina mas preferida. Tal como se usa en el presente documento, una "lipocalina" se define como una protelna monomerica de aproximadamente 18-20 kDA de peso, que tiene una region estructural supersecundaria de lamina plegada en forma cillndrica que comprende una pluralidad de (preferiblemente ocho) cadenas p conectadas por pares por una pluralidad de (preferiblemente cuatro) bucles en un extremo para definir as! un bolsillo de union. Es la diversidad de los bucles en el andamio rlgido de lipocalina lo que da lugar a varios modos de union diferentes entre los miembros de la familia de las lipocalinas, cada uno capaz de acomodar objetivos de diferente tamano, forma y caracter qulmico (revisado, por ejemplo, en Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350). De hecho, la familia de protelnas de la lipocalina ha evolucionado naturalmente para unirse a un amplio espectro de ligandos, compartiendo niveles inusualmente bajos de conservacion de la secuencia global (a menudo con identidades de secuencia de menos del 20 %) pero conservando un patron de plegado general altamente conservado. La correspondencia entre las posiciones en diversas lipocalinas es bien conocida por los expertos la materia. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 7.250.297.One protein of the disclosure may be a mutein of a lipocalin, preferably a lipocalin selected from the group consisting of retinol binding protein (RBP), biline binding protein (BBP), apolipoprotein D (APO D), lipocalin associated with neutrophil gelatinase (NGAL), lacrimal lipocalin (TLPC), protein related to microglobulin a2 (A2m), 24p3 / uterocalin (24p3), protein 1 of the von Ebners gland (VEGP 1), protein 2 of the von gland Ebners (VEGP 2) and precursor of the major allergen Can f1 (ALL-1), with human NGAL being the preferred lipocalin and the human tear lipocalin the most preferred lipocalin. As used herein, a "lipocalin" is defined as a monomeric protein of about 18-20 kDa in weight, having a supersecundarial structural region of cylindrically folded sheet comprising a plurality of (preferably eight) chains p connected in pairs by a plurality of (preferably four) loops at one end to define as! a union pocket. It is the diversity of the loops in the rigid lipocalin scaffold that gives rise to several different modes of union between members of the lipocalin family, each capable of accommodating objectives of different size, shape and chemical character (reviewed, by example, in Skerra, A. (2000) Biochim, Biophys, Acta 1482, 337-350). In fact, the lipocalin family of proteins has evolved naturally to bind to a broad spectrum of ligands, sharing unusually low levels of overall sequence conservation (often with sequence identities of less than 20%) but retaining a pattern of General folding highly conserved. The correspondence between the positions in different lipocalinas is well known by the experts the matter. See, for example, U.S. Pat. No. 7,250,297.
En general, cuando se hace referencia en el presente documento de la divulgacion a una mutelna de lipocalina de la divulgacion, preferiblemente, es diferente de su contraparte de lipocalina natural en el sentido de que se diferencia en al menos un aminoacido de su contraparte de lipocalina natural. La diferencia podrla ser una sustitucion, eliminacion y/o adicion de aminoacidos, siendo preferida una sustitucion. Una "mutelna de una lipocalina" o "mutelna de lipocalina" puede ser, en particular, una "mutelna de lipocalina lacrimal humana" o "mutelna Tlc".In general, when reference is made herein to the disclosure to a lipocalin mutelna of the disclosure, it is preferably different from its natural lipocalin counterpart in the sense that it differs in at least one amino acid from its lipocalin counterpart. natural. The difference could be a substitution, elimination and / or addition of amino acids, a substitution being preferred. A "mutelna of a lipocalin" or "lipocalin mutelna" can be, in particular, a "human tear lipocalin mutelna" or "mutelna Tlc".
Una protelna de la divulgacion es una mutelna de lipocalina lacrimal humana (Tlc). El termino "lipocalina lacrimal humana", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la lipocalina lacrimal humana madura con el numero de acceso al banco de datos SWISS-PROT P31025. La lipocalina lacrimal humana madura (aminoacidos 19-176 de la secuencia acida del numero de acceso P31025 de SWISS-PROT) (SEQ ID NO: 1) no incluye el peptido de senal N-terminal (aminoacidos 1-18) que se incluye en la secuencia de numero de acceso de SWISS-PROT de la secuencia acida P31025 utilizada como "referencia" o "secuencia de referencia" en diversas realizaciones descritas en el presente documento.A protelna of the disclosure is a mutelna of human tear lipocalina (Tlc). The term "human tear lipocalin", as used herein, refers to mature human tear lipocalin with the accession number to the SWISS-PROT P31025 data bank. Mature human lacrimal lipocalin (amino acids 19-176 of the acid sequence of accession number P31025 of SWISS-PROT) (SEQ ID NO: 1) does not include the N-terminal signal peptide (amino acids 1-18) which is included in the SWISS-PROT access number sequence of the acid sequence P31025 used as "reference" or "reference sequence" in various embodiments described herein.
La prealbumina lacrimal humana, ahora llamada lipocalina lacrimal (TLPC o Tlc), se describio originalmente como una protelna principal del fluido lacrimal humano (aproximadamente un tercio del contenido total de protelna), pero recientemente tambien se ha identificado en varios otros tejidos secretores, incluyendo la prostata, la mucosa nasal y la mucosa traqueal. Se han encontrado protelnas homologas en ratas, cerdos, perros y caballos. La lipocalina lacrimal es un miembro inusual de la lipocalina debido a su alta promiscuidad para los llpidos insolubles relativos y a sus caracterlsticas de union que difieren de otros miembros de esta familia de protelnas (revisado en Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 241-248). Un numero notable de compuestos lipofilos de diferentes clases qulmicas, tales como acidos grasos, alcoholes grasos, fosfollpidos, glicollpidos y colesterol, son ligandos endogenos de esta protelna. Curiosamente, a diferencia de otras lipocalinas, la fuerza de la union del ligando (objetivo) se correlaciona con la longitud de la cola del hidrocarburo tanto para las amidas de alquilo como para los acidos grasos. Por lo tanto, la lipocalina lacrimal se une mas fuertemente a los llpidos menos solubles (Glasgow, BJ. y col. (1995) Curr. Eye Res.Human lacrimal prealbumin, now called lacrimal lipocalin (TLPC or Tlc), was originally described as a major protein of human tear fluid (approximately one third of the total protein content), but recently it has also been identified in several other secretory tissues, including the prostate, the nasal mucosa and the tracheal mucosa. Homologous proteins have been found in rats, pigs, dogs and horses. Lacrimal lipocalin is an unusual member of lipocalin due to its high promiscuity for relative insoluble lipids and its binding characteristics that differ from other members of this family of proteins (reviewed in Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. 1482, 241-248). A remarkable number of lipophilic compounds of different chemical classes, such as fatty acids, fatty alcohols, phospholpides, glycolide and cholesterol, are endogenous ligands of this protein. Interestingly, unlike other lipocalins, the binding strength of the ligand (target) correlates with the length of the hydrocarbon tail for both the alkyl amides and the fatty acids. Therefore, lacrimal lipocalin binds more strongly to less soluble lipids (Glasgow, BJ, et al (1995) Curr. Eye Res.
14, 363-372; Gasymov, O.K. y col. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1433, 307-320)14, 363-372; Gasymov, O.K. and col. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1433, 307-320)
Las mutelnas de lipocalina particularmente adecuadas para un uso terapeutico tal como se describe en el presente documento incluyen las lipocalinas establecidas en SEQ ID NO: 2-11. Estas moleculas exhiben una especificidad y una alta afinidad por IL4Ra humano, pero antes de la presente descripcion no se han caracterizado con datos in vivo terapeuticamente relevantes. Otras mutelnas de lipocalina que tambien son adecuadas para un uso terapeutico tal como se describe en el presente documento incluyen las lipocalinas establecidas en SEQ ID NO: 2-8 del documento WO 2008/015239. Otras mutelnas de lipocalina que tambien pueden ser adecuadas para un uso terapeutico tal como se describe en el presente documento incluyen las lipocalinas establecidas en SEQ ID NO: 2-11 del documento WO 2011/154420. Lipocalin mutelins particularly suitable for therapeutic use as described herein include the lipocalines set forth in SEQ ID NO: 2-11. These molecules exhibit a specificity and a high affinity for human IL4Ra, but before the present description they have not been characterized with therapeutically relevant in vivo data . Other lipocalin mutenes that are also suitable for therapeutic use as described herein include the lipocalines set forth in SEQ ID NO: 2-8 of WO 2008/015239. Other lipocalin mutenes that may also be suitable for therapeutic use as described herein include the lipocalines set forth in SEQ ID NO: 2-11 of WO 2011/154420.
Tal como se usa en el presente documento, una "mutelna", una entidad "mutada" (ya sea protelna o acido nucleico) o "mutante" se refiere al intercambio (sustitucion), eliminacion o insercion de uno o mas nucleotidos o aminoacidos, respectivamente, en comparacion con el andamio de tipo natural (tipo salvaje) de acido nucleico o protelna "referenda". Se prefiere una sustitucion de un aminoacido del acido nucleico o protelna de origen natural (tipo salvaje). Los terminos "referenda", "secuencia de referenda" y "secuencia de tipo salvaje" se usan indistintamente en el presente documento.As used herein, a "mutelna", a "mutated" entity (either protelna or nucleic acid) or "mutant" refers to the exchange (substitution), elimination or insertion of one or more nucleotides or amino acids, respectively, compared to the wild type (wild type) scaffold of nucleic acid or "referenda" protein. A substitution of an amino acid of the nucleic acid or protein of natural origin (wild type) is preferred. The terms "referenda", "referenda sequence" and "wild type sequence" are used interchangeably herein.
La presente divulgacion tambien contempla variantes optimizadas de las mutelnas de lipocalina descritas especlficamente en el presente documento. Una vez que se ha seleccionado una mutelna de lipocalina con afinidad por un objetivo dado, es posible someter la mutelna a mutagenesis adicional para luego seleccionar variantes de afinidad aun mayor o variantes con propiedades mejoradas, tales como mayor termoestabilidad, mejor estabilidad del suero, mejor estabilidad termodinamica, solubilidad mejorada, comportamiento monomerico mejorado, resistencia mejorada contra la desnaturalizacion termica, desnaturalizacion qulmica, proteolisis o detergentes, etc. Esta mutagenesis adicional, que en caso de apuntar a una afinidad mas alta puede considerarse como "maduracion de afinidad" in vitro, puede lograrse mediante una mutacion especlfica del sitio basada en un diseno racional o una mutacion aleatoria. Otro posible enfoque para obtener una afinidad mas alta o propiedades mejoradas es el uso de PCR propensa a errores, que da lugar a mutaciones puntuales en un rango seleccionado de posiciones de secuencia de la mutelna de lipocalina. La PCR propensa a errores puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier protocolo conocido como el descrito por Zaccolo y col. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603. Otros procedimientos de mutagenesis aleatoria adecuados para tales fines incluyen la mutagenesis de insercion/eliminacion aleatoria (RID), tal como se describe por Murakami, H y col. (2002) Nat. Biotecnol. 20, 76-81 o recombinacion aleatoria no homologa (NRR) segun lo descrito por Bittker, J. A y col. (2002) Nat. Biotecnol. 20,1024-1029. Si se desea, la maduracion de afinidad tambien puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 00/75308 o en Schlehuber, S. y col., (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120, en los que se obtuvieron mutelnas de la protelna de union a la bilina con alta afinidad a la digoxigenina.The present disclosure also contemplates optimized variants of the lipocalin mutelnas described specifically herein. Once a lipocalin mutein has been selected with affinity for a given objective, it is possible to subject the mutein to additional mutagenesis and then to select variants of even greater affinity or variants with improved properties, such as increased thermostability, better serum stability, better thermodynamic stability, improved solubility, improved monomeric behavior, improved resistance against thermal denaturation, chemical denaturation, proteolysis or detergents, etc. This additional mutagenesis, which in case of targeting a higher affinity can be considered as " affinity maturation " in vitro, can be achieved by a site-specific mutation based on a rational design or a random mutation. Another possible approach to obtain a higher affinity or improved properties is the use of error-prone PCR, which results in point mutations in a selected range of positions of the lipocalin mutein sequence. Error-prone PCR can be carried out according to any protocol known as that described by Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603. Other methods of random mutagenesis suitable for such purposes include insertion / random deletion mutagenesis (RID), as described by Murakami, H et al. (2002) Nat. Biotecnol. 20, 76-81 or random homologous recombination (NRR) as described by Bittker, J. A et al. (2002) Nat. Biotecnol. 20,1024-1029. If desired, affinity maturation can also be carried out according to the procedure described in WO 00/75308 or Schlehuber, S. et al., (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120, in which mutelnas were obtained from the biline binding protein with high affinity to digoxigenin.
Se puede usar una mutelna de lipocalina lacrimal para la formacion de complejos con el receptor alfa de IL 4. La mutelna tambien puede unirse a un fragmento inmunogenico del receptor alfa de IL 4. Un fragmento inmunogenico del receptor alfa de IL-4 es un fragmento que tiene uno o mas epltopos, mimotopos u otros determinantes antigenicos, y por lo tanto es capaz de inducir una respuesta inmune o contra la cual se puede producir un anticuerpo. El fragmento inmunogenico puede incluir un solo epltopo o puede tener una pluralidad de epltopos. Dado que un sistema de presentacion de antlgeno, por ejemplo, una protelna portadora, se puede usar para proporcionar el tamano requerido para el reconocimiento por parte de un sistema inmune, no se aplica ninguna limitacion de tamano particular al fragmento inmunogenico. Por lo tanto, el fragmento inmunogenico tambien puede ser un "hapteno", es decir, un fragmento que no necesita ser antigenico per se o que puede tener baja inmunogenicidad, en particular debido a su pequeno peso molecular y, por consiguiente, a su tamano. Generalmente, un fragmento inmunogenico puede, solo o cuando se presenta en un portador, estar unido por una inmunoglobulina o por un receptor de celulas T (TCR) si se presenta por moleculas MHC. Un fragmento inmunogenico es generalmente, solo o cuando se presenta en forma de sistema de presentacion de antlgeno, capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune celular que conduce, por ejemplo, a la activacion de linfocitos B y/o T.A lacrimal lipocalin mutelna can be used for the formation of complexes with the IL 4 alpha receptor. The mutelna can also be attached to an immunogenic fragment of the IL 4 alpha receptor. An immunogenic fragment of the IL-4 alpha receptor is a fragment which has one or more epltopes, mimotopes or other antigenic determinants, and therefore is capable of inducing an immune response or against which an antibody can be produced. The immunogenic fragment may include a single epltope or may have a plurality of epltopos. Since an antigen presenting system, eg, a carrier protein, can be used to provide the size required for recognition by an immune system, no particular size limitation is applied to the immunogenic fragment. Therefore, the immunogenic fragment can also be a "hapten", i.e., a fragment that does not need to be antigenic per se or that can have low immunogenicity, in particular due to its small molecular weight and, consequently, its size . Generally, an immunogenic fragment can, alone or when presented in a carrier, be linked by an immunoglobulin or by a T cell receptor (TCR) if it is presented by MHC molecules. An immunogenic fragment is generally, either alone or when presented in the form of an antigen presenting system, capable of inducing a humoral immune response and / or a cellular immune response that leads, for example, to the activation of B and / or T lymphocytes. .
Uno de los objetivos de la mutelna de lipocalina usada en la presente divulgacion es la cadena alfa del receptor de interleucina-4 (oficialmente conocida como subunidad alfa del receptor de interleucina-4, Uniprot # P24394, SEQ ID NO: 12), una protelna transmembrana, que contiene un dominio extracelular de 207 aminoacidos. Existe una forma secretada del dominio extracelular, el alfa sIL-4R, que tambien se conoce como CD124 y es capaz de bloquear las actividades de IL-4. Una mutelna de lipocalina de la divulgacion puede unirse al receptor alfa de sIL-4, as! como a cualquier parte del dominio extracelular del receptor alfa de IL-4.One of the targets of the lipocalin mutelna used in the present disclosure is the alpha chain of the interleukin-4 receptor (officially known as the alpha subunit of the interleukin-4 receptor, Uniprot # P24394, SEQ ID NO: 12), a protein transmembrane, which contains an extracellular domain of 207 amino acids. There is a secreted form of the extracellular domain, alpha sIL-4R, which is also known as CD124 and is capable of blocking the activities of IL-4. A lipocalin mutelna of the disclosure can bind to the alpha receptor of sIL-4, as! as to any part of the extracellular domain of the IL-4 alpha receptor.
La presente divulgacion tambien se refiere a moleculas de acido nucleico (ADN y ARN) que incluyen secuencias de nucleotidos que codifican mutelnas de lipocalina tal como se describe en el presente documento. Dado que la degeneracion del codigo genetico permite sustituciones de ciertos codones por otros codones que especifican el mismo aminoacido, la divulgacion no se limita a una molecula de acido nucleico especlfica que codifica una mutelna de lipocalina de la divulgacion, sino que abarca todas las moleculas de acido nucleico que incluyen secuencias de nucleotidos que codifican una mutelna funcional.The present disclosure also relates to nucleic acid (DNA and RNA) molecules that include nucleotide sequences that encode lipocalin mutelins as described herein. Since the degeneracy of the genetic code allows substitutions of certain codons by other codons that specify the same amino acid, the disclosure is not limited to a specific nucleic acid molecule that encodes a lipocalin mutelna of the disclosure, but encompasses all the molecules of nucleic acid that include nucleotide sequences that encode a functional mutelna.
Las moleculas de acido nucleico divulgadas tambien pueden formar parte de un vector o de cualquier otro tipo de vehlculo de clonacion, tal como un plasmido, un fagemido, un fago, un baculovirus, un cosmido o un cromosoma artificial. En un ejemplo, la molecula de acido nucleico se incluye en un fasmido.The disclosed nucleic acid molecules can also be part of a vector or of any other type of cloning vehicle, such as a plasmid, a phagemid, a phage, a baculovirus, a cosmid or an artificial chromosome. In one example, the nucleic acid molecule is included in a fasmid.
En algunas mutelnas de lipocalina lacrimal descritas, se elimina el enlace disulfuro que se produce naturalmente entre Cys 61 y Cys 153. Por consiguiente, tales mutelnas (o cualquier otra mutelna de lipocalina lacrimal que no incluya un enlace disulfuro intramolecular) se pueden producir en un compartimento celular que tenga un medio redox reductor, por ejemplo, en el citoplasma de bacterias gramnegativas. En caso de que la mutelna de lipocalina de la divulgacion incluya enlaces disulfuro intramoleculares, puede desearse dirigir el polipeptido naciente a un compartimento celular que tenga un medio redox oxidante usando una secuencia de senales apropiada. Un periplasma de bacterias gramnegativas tales como E. coli puede proporcionar un ambiente oxidante de este tipo, en el medio extracelular de las bacterias grampositivas o en el lumen del retlcuio endoplasmatico de las celulas eucariotas y generalmente favorece la formacion de enlaces disulfuro estructurales. Sin embargo, tambien es posible producir una mutelna de lipocalina de la divulgacion en el citosol de una celula huesped, tal como E. coli. En este caso, el polipeptido puede obtenerse directamente en un estado soluble y plegado o recuperarse en forma de cuerpos de inclusion, seguido de renaturalizacion in vitro. Otra opcion es el uso de cepas huesped especlficas que tengan un medio intracelular oxidante, lo que puede permitir la formacion de enlaces disulfuro en el citosol (Venturi M, y col. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8).In some described tear lipocalin mutelnas, the naturally occurring disulfide bond between Cys 61 and Cys 153. is eliminated. Therefore, such mutelnas (or any other lacrimal lipocalin mutelna not including an intramolecular disulfide bond) can be produced in a cell compartment having a reducing redox medium, for example, in the cytoplasm of gram-negative bacteria. In case the lipocalin mutein of the disclosure includes intramolecular disulfide bonds, it may be desired to direct the nascent polypeptide to a cell compartment having an oxidizing redox medium using an appropriate signal sequence. A periplasm of gram-negative bacteria such as E. coli can provide an oxidative environment of this type, in the extracellular medium of gram-positive bacteria or in the lumen of the endoplasmic reticulum of eukaryotic cells and generally favors the formation of structural disulfide bonds. However, it is also possible to produce a lipocalin mutelna from the cytosol disclosure of a host cell, such as E. coli. In this case, the polypeptide can be obtained directly in a soluble and folded state or recovered in the form of inclusion bodies, followed by in vitro renaturation . Another option is the use of specific host strains having an intracellular oxidizing medium, which may allow the formation of disulfide bonds in the cytosol (Venturi M, et al (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8) .
La divulgacion tambien se refiere a una composicion, que incluye al menos una mutelna de lipocalina de la divulgacion o un fragmento o variante de la misma o una protelna de fusion o un conjugado de la misma, y a una formulacion farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, combination de tampon/sal/excipiente), en la que dicha composicion puede administrarse a un sujeto que lo necesite a un nivel de dosificacion seleccionado del grupo que consiste en: 0,06-600 mg, 0,06-100 mg, 0,3-10 mg, 1-3 mg.The disclosure also relates to a composition, which includes at least one lipocalin mutelna of the disclosure or a fragment or variant thereof or a fusion protein or a conjugate thereof, and to a pharmaceutically acceptable formulation (e.g. of buffer / salt / excipient), wherein said composition can be administered to a subject in need thereof at a dosage level selected from the group consisting of: 0.06-600 mg, 0.06-100 mg, 0.3 -10 mg, 1-3 mg.
En algunas realizaciones, una composicion de la presente divulgacion se puede administrar a traves de cualquier via parenteral o no parenteral (enteral) que sea terapeuticamente eficaz para farmacos proteicos. Los procedimientos de aplicacion parenteral incluyen, por ejemplo, tecnicas de inyeccion e infusion intracutanea, subcutanea, intramuscular, intratraqueal, intranasal, intravltrea o intravenosa, por ejemplo, en forma de soluciones de inyeccion, soluciones de infusion o tinturas, as! como la instalacion e inhalation de aerosoles, por ejemplo, en forma de mezclas de aerosoles, pulverizadores, neblinas o polvos.In some embodiments, a composition of the present disclosure can be administered through any parenteral or non-parenteral (enteral) route that is therapeutically effective for protein drugs. Methods of parenteral application include, for example, injection techniques and infusion intracutaneous, subcutaneous, intramuscular, intratracheal, intranasal, intravltrea or intravenous, for example, in the form of injection solutions, infusion solutions or tinctures, as! as the installation and inhalation of aerosols, for example, in the form of mixtures of aerosols, sprays, mists or powders.
En algunas realizaciones, se prefiere la administration local de la composicion al pulmon. Una via preferida de administration local al pulmon es mediante inhalacion de aerosol. Patton, J.S., y col. (2004) Proc. Amer. Thoracic Soc., 1, 338-344, proporciona, por ejemplo, una description general sobre la administracion pulmonar de farmacos, es decir, mediante la inhalacion de aerosoles (que tambien se puede usar en la administracion intranasal) o la instilacion intratraqueal. Los modos de administracion no parenteral son, por ejemplo, orales, por ejemplo, en forma de plldoras, comprimidos, capsulas, soluciones o suspensiones, o por via rectal, por ejemplo, en forma de supositorios. En algunas realizaciones, una mutelna de lipocalina de la divulgacion tambien puede administrarse por via sistemica o topica en formulaciones que contienen excipientes o vehlculos, aditivos y vehlculos farmaceuticamente aceptables no toxicos convencionales, segun se desee. Para la administracion de una mutelna de lipocalina de la divulgacion por inhalacion, la mutelna puede estar presente en una formulacion en polvo junto con una fase adicional. El polvo micronizado de la mutelna de lipocalina se puede mezclar con un material portador, por ejemplo, lactosa, dextrosa, maltosa, trehalosa, tal como se describe en la especificacion de patente n.° WO96/02231, o el artlculo de P. Lucas, K. Anderson, JN Staniforth, Protein deposition from dry powder inhalers, Pharmaceutical Research, vol. 15 de abril de 1988, paginas 562-569. Alternativamente, para fines de inhalacion, se pueden usar preparaciones farmaceuticas solidas tal como se describe en las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 2005/0014677 y n.° 2009/0142407.In some embodiments, local administration of the composition to the lung is preferred. A preferred route of local administration to the lung is by aerosol inhalation. Patton, J.S., et al. (2004) Proc. Amer. Thoracic Soc., 1, 338-344, provides, for example, a general description on the pulmonary administration of drugs, that is, by inhalation of aerosols (which can also be used in intranasal administration) or intratracheal instillation. The modes of non-parenteral administration are, for example, oral, for example, in the form of pills, tablets, capsules, solutions or suspensions, or rectally, for example, in the form of suppositories. In some embodiments, a lipocalin mutelna of the disclosure may also be administered systemically or topically in formulations containing conventional excipients or vehicles, additives and pharmaceutically acceptable non-toxic vehicles, as desired. For the administration of a lipocalin mutelna of the inhalation disclosure, the mutein may be present in a powder formulation together with an additional phase. The micronized powder of the lipocalin mutene can be mixed with a carrier material, for example, lactose, dextrose, maltose, trehalose, as described in patent specification No. WO96 / 02231, or the article by P. Lucas , K. Anderson, JN Staniforth, Protein deposition from dry powder inhalers, Pharmaceutical Research, vol. April 15, 1988, pages 562-569. Alternatively, for inhalation purposes, solid pharmaceutical preparations can be used as described in US Pat. No. 2005/0014677 and No. 2009/0142407.
Por lo tanto, una composicion de la divulgacion puede comprender una mutelna de lipocalina de la divulgacion, as! como una de las formulaciones descritas.Therefore, a composition of the disclosure may comprise a lipocalin mutelna of the disclosure, as! as one of the formulations described.
La dosis de la composicion aplicada puede variar dentro de amplios llmites para lograr el efecto preventivo o la respuesta terapeutica deseada. Dependera, por ejemplo, de la afinidad de la mutelna de lipocalina en su interior por un ligando elegido, as! como de la vida media del complejo entre la mutelna de lipocalina y el ligando in vivo. Ademas, la dosis optima dependera de la biodistribucion de la mutelna de lipocalina o un fragmento o variante de la misma o su protelna de fusion o su conjugado, el modo de administracion, la gravedad de la enfermedad/trastorno que se este tratando, as! como de la condition medica del paciente.The dose of the applied composition can vary within wide limits to achieve the preventive effect or the desired therapeutic response. It will depend, for example, on the affinity of the lipocalin mutelna in its interior for a chosen ligand, so! as of the half-life of the complex between the lipocalin mutelna and the ligand in vivo. In addition, the optimal dose will depend on the biodistribution of the lipocalin mutelna or a fragment or variant thereof or its fusion protein or its conjugate, the mode of administration, the severity of the disease / disorder being treated, thus! as of the patient's medical condition.
La presente divulgacion tambien proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica mediante nebulizacion, en el que la composicion farmaceutica comprende al menos un antagonista de IL-4RA, o un fragmento o variante del mismo. una protelna de fusion o conjugado de la misma y una solution adecuada.The present disclosure also provides a method for treating a subject in need thereof, which comprises administering to said subject a pharmaceutical composition by nebulization, wherein the pharmaceutical composition comprises at least one IL-4RA antagonist, or a fragment or variant of the invention. same. a fusion or conjugate protein of the same and a suitable solution.
En diversas divulgaciones preferidas, una formulacion farmaceuticamente aceptable de la divulgacion puede ser una formulacion para nebulizacion, por ejemplo, una solucion que pueda mantener la integridad funcional y estructural del antagonista, o un fragmento o variante del mismo o una protelna de fusion o conjugado de la misma, en el momento de la nebulizacion y despues de la misma (por ejemplo, que se mantenga monomerica y completamente activa de manera funcional) y/o que, en combinacion con el nebulizador empleado, pueda generar gotas del rango de tamano deseado. A este respecto, como ejemplo ilustrativo, la presente divulgacion ensena: el antagonista, por ejemplo, una mutelna de lipocalina de la divulgacion, puede formularse como una solucion que comprende, por ejemplo, 0,01 mg a 100 mg del antagonista o un fragmento o variante del mismo o de una protelna de fusion o un conjugado del mismo por 1 ml de solucion salina con un pH ajustado entre 5,5 y 8,0, un valor de osmolalidad entre aproximadamente 150 y 550 mOsm/kg, una concentration de iones entre aproximadamente 31 y 300 mM de cloruro como anion permeante, y/o una viscosidad inferior a 1,5 cp. Preferiblemente, la solucion formulada tiene una concentracion del antagonista o un fragmento o variante del mismo o una protelna de fusion o un conjugado del mismo a un nivel seleccionado del grupo que consiste en: 0,05 mg/ml a 50 mg/ml, 0,1 mg/ml a 50 mg/ml, 0,05 mg/ml a 25 mg/ml, 0,1 mg/ml a 25 mg/ml, 0,05 mg/ml a 15 mg/ml, 0,1 mg/ml a 15 mg/ml, 0,05 mg/ml a 10 mg/ml y 0,1 mg/ml a 10 mg/ml. En una descripcion preferida adicional, la solucion salina descrita tiene un pH ajustado seleccionado del grupo que consiste de entre 5,5 y 8,0, entre 6,0 y 8,0, entre 6,0 y 7,5, entre 5,5 y 7,5, entre 6,0 y 7,0 y entre 6,5 y 7,5; y/o un valor de osmolalidad seleccionado del grupo que consiste en: entre aproximadamente 150 y 550 mOsm/L, entre aproximadamente 150 y 500 mOsm/L, entre aproximadamente 200 y 550 mOsm/L, entre aproximadamente 200 y 500 mOsm/L, entre aproximadamente 200 y 450 mOsm L y entre aproximadamente 150 y 450 mOsm/L, la osmolaridad es la medida de la concentracion de soluto, definida como el numero de osmoles (Osm) de soluto por litro (L) de solucion, por ejemplo osmol/L u Osm/L; y/o una concentracion ionica de cloruro como anion permeante del grupo que consiste de entre 31 y 300 mM, entre 50 y 200 mM, entre 50 y 300 mM, entre 50 y 150 mM, 100 y 200 mM, entre 100 y 300 mM, entre 100 y 250 mM, entre 150 y 250 mM, entre 150 y 300 mM y entre 200 y 300 mM.In various preferred disclosures, a pharmaceutically acceptable formulation of the disclosure may be a formulation for nebulization, for example, a solution that can maintain the functional and structural integrity of the antagonist, or a fragment or variant thereof or a fusion or conjugate protein of the same, at the time of nebulization and after it (for example, that it remains monomeric and fully functional in a functional way) and / or that, in combination with the nebulizer used, can generate drops of the desired size range. In this regard, as an illustrative example, the present disclosure teaches: the antagonist, for example, a lipocalin mutein of the disclosure, may be formulated as a solution comprising, for example, 0.01 mg to 100 mg of the antagonist or a fragment or variant thereof or a fusion protein or a conjugate thereof by 1 ml of saline solution with a pH adjusted between 5.5 and 8.0, an osmolality value between about 150 and 550 mOsm / kg, a concentration of ions between about 31 and 300 mM chloride as permeating anion, and / or a viscosity less than 1.5 cp. Preferably, the formulated solution has a concentration of the antagonist or a fragment or variant thereof or a fusion protein or a conjugate thereof at a level selected from the group consisting of: 0.05 mg / ml to 50 mg / ml, , 1 mg / ml to 50 mg / ml, 0.05 mg / ml at 25 mg / ml, 0.1 mg / ml at 25 mg / ml, 0.05 mg / ml at 15 mg / ml, 0.1 mg / ml at 15 mg / ml, 0.05 mg / ml at 10 mg / ml and 0.1 mg / ml to 10 mg / ml. In a further preferred description, the salt solution described has an adjusted pH selected from the group consisting of between 5.5 and 8.0, between 6.0 and 8.0, between 6.0 and 7.5, between 5, 5 and 7.5, between 6.0 and 7.0 and between 6.5 and 7.5; and / or an osmolality value selected from the group consisting of: between about 150 and 550 mOsm / L, between about 150 and 500 mOsm / L, between about 200 and 550 mOsm / L, between about 200 and 500 mOsm / L, between approximately 200 and 450 mOsm L and between approximately 150 and 450 mOsm / L, osmolarity is the measure of the concentration of solute, defined as the number of osmols (Osm) of solute per liter (L) of solution, for example osmol / L u Osm / L; and / or an ionic chloride concentration as a permeating anion of the group consisting of between 31 and 300 mM, between 50 and 200 mM, between 50 and 300 mM, between 50 and 150 mM, 100 and 200 mM, between 100 and 300 mM , between 100 and 250 mM, between 150 and 250 mM, between 150 and 300 mM and between 200 and 300 mM.
Ademas, preferiblemente, la solucion salina descrita tiene una viscosidad seleccionada del grupo que consiste de entre 0 y 1,5 cp, entre 0 y 1,0 cp, 0 y 0,5 cp, entre 0,5 y 1,0 cp, entre 0,5 y 1,5 cp y entre 1,0 y 1,5 cp.Furthermore, preferably, the saline solution described has a viscosity selected from the group consisting of between 0 and 1.5 cp, between 0 and 1.0 cp, 0 and 0.5 cp, between 0.5 and 1.0 cp, between 0.5 and 1.5 cp and between 1.0 and 1.5 cp.
En algunas divulgaciones adicionales, la solucion acuosa del antagonista, por ejemplo, una mutelna de lipocalina de la divulgacion, puede ser nebulizada con un nebulizador electronico, de chorro, ultrasonico o de membrana perforada vibrante, por ejemplo, el nebulizador de malla vibrante PARI eFlow o Aeroneb. En una divulgacion preferida, la solucion se nebuliza en un aerosol que tiene un diametro aerodinamico medio de masa (MMAD) entre 1 pm y 10 pm, para un nebulizador electronico, de chorro, ultrasonico o de membrana perforada vibrante, 2 veces al dla, y dicho nebulizador es capaz de aerosolizar la solucion resultante en partlculas de tamanos requeridos (los aerosoles) en un perlodo de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos. En algunas divulgaciones adicionales, cualquiera de dichos aerosoles puede tener un diametro aerodinamico medio de masa (MMAD) seleccionado del grupo que consiste en entre 1 pm a 10 pm, entre 2 pm a 8 pm, entre 2 pm y 5 pm, entre 1,5 pm a 4 pm, entre 3 pm a 4,5 pm y entre 2,5 pm a 3,5 pm.In some further disclosures, the aqueous solution of the antagonist, for example, a lipocalin mutein of the disclosure, can be nebulized with an electronic, jet, ultrasonic or vibrating perforated membrane nebulizer, for example, the vibrating mesh nebulizer PARI eFlow or Aeroneb. In a preferred disclosure, the solution is nebulized in an aerosol having a mean mass aerodynamic diameter (MMAD) between 1 pm and 10 pm, for an electronic, jet, ultrasonic or vibrating perforated membrane nebulizer, 2 times a day, and said nebulizer is capable of aerosolizing the resulting solution into particles of required sizes (the aerosols) in a period of about 1 to about 5 minutes. In some additional disclosures, any such aerosol can have a mean mass aerodynamic diameter (MMAD) selected from the group consisting of between 1 pm to 10 pm, between 2 pm to 8 pm, between 2 pm and 5 pm, between 1, 5 pm to 4 pm, between 3 pm to 4.5 pm and between 2.5 pm to 3.5 pm.
En algunas revelaciones, la divulgacion proporciona un procedimiento de administracion por inhalacion, en 1-3 minutos, preferiblemente 1-2 minutos, de una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica de la divulgacion, que comprende una formulacion de nebulizacion descrita, a un sujeto que la necesita. En algunas descripciones adicionales, dicho suministro por inhalacion se realiza de manera local en el pulmon.In some disclosures, the disclosure provides a method of administering by inhalation, in 1-3 minutes, preferably 1-2 minutes, of an effective amount of a pharmaceutical composition of the disclosure, comprising a described nebulization formulation, to a subject that he needs it. In some additional descriptions, said delivery by inhalation is performed locally in the lung.
Por lo tanto, en algunas otras revelaciones, la divulgacion proporciona una solucion eficaz, segura, no irritante, fisiologicamente aceptable y compatible adecuada para su uso en un procedimiento de la divulgacion que comprende administrar una composicion farmaceutica descrita a un sujeto que lo necesite.Therefore, in some other disclosures, the disclosure provides an effective, safe, non-irritating, physiologically acceptable and compatible solution suitable for use in a disclosure method which comprises administering a described pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
La divulgacion proporciona el uso de la solucion para administrar una composicion farmaceutica de la divulgacion a un sujeto que lo necesite como un aerosol, por ejemplo, por inhalacion.The disclosure provides the use of the solution for administering a pharmaceutical composition of the disclosure to a subject in need thereof as an aerosol, eg, by inhalation.
Cuando se usa en el presente documento, la expresion “antagonista de IL-4RA" significa un polipeptido o protelna que se une a IL-4RA con afinidad de union detectable y/o que es capaz de inhibir la union de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos. Tal como se usa en el presente documento, "afinidad detectable" significa la capacidad de unirse a un objetivo seleccionado con una constante de afinidad generalmente de al menos aproximadamente 10"5 M. Las afinidades mas bajas generalmente ya no se pueden medir por procedimientos comunes como ELISA y, por lo tanto, son de importancia secundaria. Por ejemplo, las afinidades de union de las mutelnas de acuerdo con la divulgacion pueden ser de un Kd inferior 800 nM, pueden ser de un Kd inferior a 30 nM y pueden ser de aproximadamente 50 picomolar (pM) o inferiores.When used herein, the term "IL-4RA antagonist" means a polypeptide or protein that binds IL-4RA with detectable binding affinity and / or that is capable of inhibiting the binding of IL-4 and / or IL-13 to their respective receptors As used herein, "detectable affinity" means the ability to bind to a selected target with an affinity constant generally of at least about 10 "5 M. The lowest affinities generally they can no longer be measured by common procedures such as ELISA and, therefore, are of secondary importance. For example, binding affinities of mutelnas according to the disclosure can be a K d less than 800 nM, may be a K d less than 30 nM and may be about 50 picomolar (pM) or lower.
En algunas realizaciones, se puede usar una mutelna de lipocalina tal como se define en las reivindicaciones para tratar cualquier enfermedad o trastorno en el que la expresion de IL-4 y/o la expresion de IL-13 contribuyan o esten relacionadas con la patogenesis o la agravacion de la enfermedad. En algunas realizaciones, una mutelna de lipocalina tal como se define en las reivindicaciones puede usarse para tratar cualquier enfermedad o trastorno que se mejore, alivie o inhiba mediante la eliminacion, inhibicion o reduction de la actividad de IL-4 y/o la actividad de IL-13. Como ejemplo ilustrativo, la mutelna o composicion farmaceutica que contiene la misma puede usarse en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a un aumento de la respuesta inmune Th2. Dicha enfermedad o trastorno puede, por ejemplo, tambien estar asociado a una reaction alergica o una inflamacion alergica. En otras realizaciones, dicha enfermedad o trastorno puede ser asma alergica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis (vease Hage y col. (1999) Cell, 97, 271-281, o Mueller y col. (2002) Biochemica et Biophysica Acta, 237 250).In some embodiments, a lipocalin mutelna can be used as defined in the claims to treat any disease or disorder in which the expression of IL-4 and / or the expression of IL-13 contribute or are related to pathogenesis or the aggravation of the disease. In some embodiments, a lipocalin mutelna as defined in the claims can be used to treat any disease or disorder that is improved, alleviated or inhibited by the elimination, inhibition or reduction of IL-4 activity and / or activity of IL-13. As an illustrative example, the mutelna or pharmaceutical composition containing the same can be used in a method of treating a disease or disorder associated with an increase in the Th2 immune response. Said disease or disorder may, for example, also be associated with an allergic reaction or an allergic inflammation. In other embodiments, said disease or disorder may be allergic asthma, rhinitis, conjunctivitis or dermatitis (see Hage et al (1999) Cell, 97, 271-281, or Mueller et al (2002) Biochemica et Biophysica Acta, 237 250 ).
El termino "fragmento", tal como se utiliza en la presente divulgacion en relation con las mutelnas de lipocalina lacrimal de la divulgacion, se refiere a protelnas o peptidos derivados de lipocalina lacrimal humana de longitud completa que se acortan en el extremo N y/o en el extremo C, es decir, que carecen de al menos uno de los aminoacidos N-terminales y/o C-terminales. Dichos fragmentos comprenden preferiblemente al menos 10, mas preferiblemente 20, mas preferiblemente 30 o mas aminoacidos consecutivos de la secuencia primaria de lipocalina lacrimal humana madura y normalmente son detectables en un inmunoensayo de lipocalina lacrimal humana madura. The term "fragment", as used in the present disclosure in connection with the lacrimal lipocalin mutelnas of the disclosure, refers to proteins or peptides derived from full length human tear lipocalin which shorten at the N-terminus and / or at the C-terminus, that is, they lack at least one of the N-terminal and / or C-terminal amino acids. Said fragments preferably comprise at least 10, more preferably 20, more preferably 30 or more consecutive amino acids of the primary sequence of mature human tear lipocalin and are usually detectable in a mature human tear lipocalin immunoassay.
El termino "variante", tal como se utiliza en la presente divulgacion, se refiere a derivados de una protelna o peptido (por ejemplo, una mutelna de lipocalina lacrimal de la divulgacion) que comprenden modificaciones de la secuencia de aminoacidos, por ejemplo, por sustitucion, eliminacion, insercion o modificacion qulmica. Preferiblemente, tales modificaciones no reducen la funcionalidad de la protelna o del peptido. Dichas variantes incluyen protelnas, en las que uno o mas aminoacidos han sido reemplazados por sus respectivos estereoisomeros D o por aminoacidos distintos a los 20 aminoacidos naturales, como, por ejemplo, ornitina, hidroxiprolina, citrulina, homoserina, hidroxilisina, norvalina. Sin embargo, tales sustituciones tambien pueden ser conservativas, es decir, un residuo de aminoacido se reemplaza con un residuo de aminoacido qulmicamente similar. Ejemplos de sustituciones conservativas son los reemplazos entre los miembros de los siguientes grupos: 1) alanina, serina y treonina; 2) acido aspartico y acido glutamico; 3) asparagina y glutamina; 4) arginina y lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina y valina; y 6) fenilalanina, tirosina y triptofano.The term "variant", as used in the present disclosure, refers to derivatives of a protein or peptide (e.g., a lacrimal lipocalin mutelna of the disclosure) comprising amino acid sequence modifications, for example, by substitution, elimination, insertion or modification qulmica. Preferably, such modifications do not reduce the functionality of the protein or peptide. Said variants include proteins, in which one or more amino acids have been replaced by their respective stereoisomers D or by amino acids other than the 20 natural amino acids, such as, for example, ornithine, hydroxyproline, citrulline, homoserine, hydroxylysine, norvaline. However, such substitutions may also be conservative, ie, an amino acid residue is replaced with a chemically similar amino acid residue. Examples of conservative substitutions are replacements among members of the following groups: 1) alanine, serine and threonine; 2) aspartic acid and glutamic acid; 3) asparagine and glutamine; 4) arginine and lysine; 5) isoleucine, leucine, methionine and valine; and 6) phenylalanine, tyrosine and tryptophan.
El termino "posicion" cuando se usa de acuerdo con la divulgacion significa la posicion de un aminoacido dentro de una secuencia de aminoacidos representada en el presente documento o la posicion de un nucleotido dentro de una secuencia de acido nucleico representada en el presente documento. El termino "correspondiente" tal como se usa en el presente documento tambien incluye que una posicion no solo esta determinada por el numero de los nucleotidos/aminoacidos anteriores. Por consiguiente, la posicion de un aminoacido dado de acuerdo con la divulgacion que puede estar sustituida puede variar debido a la eliminacion o adicion de aminoacidos en cualquier otra parte de una lipocalina (mutante o de tipo salvaje). De manera similar, la posicion de un nucleotido dado de acuerdo con la presente divulgacion que puede estar sustituida puede variar debido a deleciones o nucleotidos adicionales en otra parte de una mutelna o region no traducida 5' (UTR) de lipocalina de tipo salvaje, incluyendo el promotor y/o cualquier otra secuencia reguladora o gen (incluyendo exones e intrones). Por lo tanto, en una "posicion correspondiente" de acuerdo con la divulgacion, debe entenderse preferiblemente en el sentido de que los nucleotidos/aminoacidos pueden diferir en el numero indicado, pero todavla pueden tener nucleotidos/aminoacidos vecinos similares. Dichos nucleotidos/aminoacidos que pueden intercambiarse, eliminarse o anadirse tambien estan comprendidos por el termino "posicion correspondiente". Especlficamente, para determinar si un residuo de aminoacido de la secuencia de aminoacidos de una lipocalina (mutelna) diferente de una lipocalina de tipo salvaje corresponde a una posicion determinada en la secuencia de aminoacidos de una lipocalina de tipo salvaje, un experto en la materia puede utilizar medios y procedimientos bien conocidos, por ejemplo, alineaciones, ya sea manualmente o usando programas informaticos como BLAST2.0, que significa Basic Local Alignment Search Tool, o ClustalW o cualquier otro programa adecuado para generar alineaciones de secuencias. Por consiguiente, una lipocalina de tipo salvaje puede servir como "secuencia de sujeto" o "secuencia de referenda", mientras que la secuencia de aminoacidos de una lipocalina diferente de la lipocalina de tipo salvaje descrita en el presente documento sirve como "secuencia de consulta". Los terminos "secuencia de referenda" y "secuencia de tipo salvaje" se usan indistintamente en el presente documento.The term "position" when used in accordance with the disclosure means the position of an amino acid within an amino acid sequence represented herein or the position of a nucleotide within a nucleic acid sequence depicted herein. The term "corresponding" as used herein also includes that a position is not only determined by the number of the above nucleotides / amino acids. Accordingly, the position of a given amino acid according to the disclosure that may be substituted may vary due to the removal or addition of amino acids elsewhere in a lipocalin (mutant or wild type). Similarly, the position of a given nucleotide according to the present disclosure which may be substituted may vary due to additional deletions or nucleotides elsewhere in a 5 'untranslated mutein or region (UTR) of wild-type lipocalin, including the promoter and / or any other regulatory sequence or gene (including exons and introns). Therefore, in a "corresponding position" according to the disclosure, it should preferably be understood in the sense that the nucleotides / amino acids may differ in the indicated number, but still may have similar neighboring nucleotides / amino acids. Said nucleotides / amino acids that can be exchanged, deleted or added are also comprised by the term "corresponding position". Specifically, to determine if an amino acid residue of the amino acid sequence of a lipocalin (mutelna) different from a wild-type lipocalin corresponds to a certain position in the amino acid sequence of a wild-type lipocalin, a person skilled in the art can use well-known means and procedures, for example, alignments, either manually or using computer programs such as BLAST2.0, which means Basic Local Alignment Search Tool, or ClustalW or any other suitable program to generate sequence alignments. Accordingly, a wild type lipocalin can serve as "subject sequence" or "reference sequence", while the amino acid sequence of a lipocalin different from the wild-type lipocalin described herein serves as a "query sequence". " The terms "reference sequence" and "wild-type sequence" are used interchangeably herein.
Tal como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “uno”, “una” y “el”, “la”, incluyen referencias s plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asl, por ejemplo, la referencia a "una mutelna de lipocalina" incluye una o mas mutelnas de lipocalina.As used herein, the singular forms "a", "an", "an", and "the" include plural references unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, the reference to "a lipocalin mutelna" includes one or more lipocalin mutelnas.
Salvo que se indique lo contrario, se entendera que el termino "al menos" que precede a una serie de elementos se refiere a cada elemento de la serie.Unless indicated otherwise, it will be understood that the term "at least" that precedes a series of elements refers to each element of the series.
A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto exija otra cosa, se entendera que la palabra "comprende" y las variaciones tales como "que comprende" y "comprendiendo" implican la inclusion de un numero entero o paso citado o grupo de numeros enteros o pasos, pero no la exclusion de ningun otro numero entero o paso o grupo de numeros enteros o pasos. Cuando se usa en el presente documento, el termino "que comprende" puede sustituirse por el termino "que contiene" o "que tiene". Throughout the present specification and the claims that follow, unless the context requires otherwise, it will be understood that the word "comprises" and variations such as "comprising" and "comprising" imply the inclusion of a whole number or step cited or group of whole numbers or steps, but not the exclusion of any other whole number or step or group of whole numbers or steps. When used in this document, the term "comprising" may be substituted by the term "containing" or "having".
Cuando se usa en el presente documento, "que consiste en" excluye cualquier elemento, paso o ingrediente no especificado en el elemento reivindicado. Cuando se usa en este documento, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o pasos que no afecten materialmente a las caracterlsticas basicas y novedosas de la reivindicacion.When used herein, "consisting of" excludes any element, step or ingredient not specified in the claimed element. When used in this document, "consisting essentially of" does not exclude materials or steps that do not materially affect the basic and novel features of the claim.
Tal como se usa en el presente documento, el termino conjuntivo "y/o" entre multiples elementos citados se entiende que abarca tanto las opciones individuales como las combinadas. Por ejemplo, cuando dos elementos estan unidos por "y/o", una primera opcion se refiere a la aplicabilidad del primer elemento sin el segundo. Una segunda opcion se refiere a la aplicabilidad del segundo elemento sin el primero. Una tercera opcion se refiere a la aplicabilidad del primer y segundo elementos juntos. Se entiende que cualquiera de estas opciones esta dentro del significado y, por lo tanto, satisface el requisito del termino “y/o” tal como se usa en el presente documento. Tambien se entiende que la aplicabilidad concurrente de mas de una de las opciones esta comprendida en el significado y, por lo tanto, satisface el requisito del termino "y/o" tal como se usa en el presente documento.As used herein, the conjunctive term "and / or" among multiple elements recited is understood to encompass both individual and combined options. For example, when two elements are linked by "and / or", a first option refers to the applicability of the first element without the second. A second option refers to the applicability of the second element without the first. A third option refers to the applicability of the first and second elements together. It is understood that any of these options is within the meaning and, therefore, satisfies the requirement of the term "and / or" as used in this document. It is also understood that the concurrent applicability of more than one of the options is comprised in the meaning and, therefore, satisfies the requirement of the term "and / or" as used in this document.
Se citan varios documentos a lo largo del texto de la presente memoria descriptiva. Nada de lo expuesto en el presente documento debe interpretarse como una admision de que la divulgacion no tiene derecho preceder a dicha divulgacion en virtud de una divulgacion previa. Various documents are cited throughout the text of the present specification. Nothing in this document should be construed as an admission that the disclosure is not entitled to precede such disclosure by virtue of prior disclosures.
EjemplosExamples
Ejemplo 1: Inhibicion de la fosforilacion de Stat6 inducida por IL-4 e IL-13 en celulas TF-1 por un antagonista alfa del receptor de IL-4.Example 1: Inhibition of Stat6 phosphorylation induced by IL-4 and IL-13 in TF-1 cells by an alpha antagonist of the IL-4 receptor.
Se incubaron celulas TF-1 a 37 °C durante 30 minutos con un antagonista alfa del receptor de IL-4, una mutelna de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humana (SEQ ID NO: 6), antes de anadir IL-13 10 nM (Figura 1a) o IL-4 0,1 nM (Figura 1b). Las celulas se fijaron despues de la incubacion durante 15 min a 37 °C con PFA al 1,6 % y se permeabilizaron con metanol al 100 % antes de la tincion intracelular de STAT6 con PE Mouse Anti-STAT6 (pY641) - BD 612701. El anticuerpo especlfico de IL-4RA MAB230 (sistemas R&D) y la IL-4 doble mutante de iL-4 (r 121D, Y124D) tal como se describe en Andrews y col. JI 2006 176:7456-7461 se utilizo como control positivo. Ademas, la lipocalina lacrimal humana (SEQ ID NO: 1) y un anticuerpo IgG2a de raton (mlgG2a, Ancell 281-010; Lot#171605) se usaron como controles negativos. Los resultados del ensayo de fosforilacion de Stat-6 de TF-1 se representan en la Figura 1 y muestran que la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) es un potente antagonista de IL-4, as! como de IL-13, ya que se relaciona con la senalizacion descendente de IL-4RA. El anticuerpo especlfico contra IL-4RA MAB230 (R&D Systems) funciona igualmente bien. De manera sorprendente, el mutante de IL-4 es significativamente menos eficaz en la inhibicion de la fosforilacion de Stat6 inducida tanto por IL-4 como por IL-13 en celulas TF-1 aunque el antagonismo funcional se ha descrito previamente. La constante de velocidad de disociacion rapida (koff) del mutante IL-4 (R121D, Y124D) en comparacion con la mutelna de lipocalina (Tabla 1) puede ser la razon de esta diferencia funcional.TF-1 cells were incubated at 37 ° C for 30 minutes with an alpha antagonist of the IL-4 receptor, a lipocalin mutein directed against the alpha chain of the human IL-4 receptor (SEQ ID NO: 6), before add 10 nM IL-13 (Figure 1a) or 0.1 nM IL-4 (Figure 1b). Cells were fixed after incubation for 15 min at 37 ° C with 1.6% PFA and permeabilized with 100% methanol before intracellular staining of STAT6 with PE Mouse Anti-STAT6 (pY641) - BD 612701. The IL-4RA specific antibody MAB230 (R & D systems) and the IL-4 double mutant of iL-4 (r 121D, Y124D) as described in Andrews et al. JI 2006 176: 7456-7461 was used as a positive control. In addition, human tear lipocalin (SEQ ID NO: 1) and a mouse IgG2a antibody (mlgG2a, Ancell 281-010; Lot # 171605) were used as negative controls. The results of the TF-1 Stat-6 phosphorylation assay are depicted in FIG. 1 and show that the lipocalin mutelin (SEQ ID NO: 6) is a potent IL-4 antagonist, as! as of IL-13, since it is related to the descending signaling of IL-4RA. The specific antibody against IL-4RA MAB230 (R & D Systems) works equally well. Surprisingly, the mutant of IL-4 is significantly less effective in the inhibition of Stat6 phosphorylation induced by both IL-4 and IL-13 in TF-1 cells, although functional antagonism has been previously described. The fast dissociation rate constant (koff) of the IL-4 mutant (R121D, Y124D) as compared to the lipocalin mutein (Table 1) may be the reason for this functional difference.
Tabla 1Table 1
Ejemplo 2: Construction de raton doble knock-inExample 2: Construction of double knock-in mouse
Se generaron ratones knock-in de la cadena alfa del receptor de IL-4 humana y de la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 reemplazando el gen de la cadena alfa del receptor de IL-4 y el gen de la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 de raton por el ortologo humano respectivo. Por consiguiente, los ratones generados se denominan ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana que albergan los genes humanos en vez de los de raton de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 y del receptor de IL-13 en el locus del gen ortologo de raton.Knock-in mice were generated from the alpha chain of the human IL-4 receptor and the alpha 1 chain of the IL-13 receptor, replacing the alpha chain gene of the IL-4 receptor and the alpha 1 chain gene of the mouse IL-13 receptor by the respective human orthogogue. Accordingly, the mice generated are called double knock-in mice of the 1 alpha chain of the human IL-4 receptor / human IL-13 receptor harboring the human genes instead of the mouse ones of the receptor 1 alpha chain of IL-4 and the IL-13 receptor in the locus of the mouse orthologous gene.
Los ratones se generaron de la siguiente manera: se elimino el gen IL-13RA1 de raton de 70 kb en el cromosoma X, lo que genero un alelo nulo en celulas madre embrionarias de raton. Se introdujo un segmento de ADN que portaba el gen IL-13RA1 humano en el locus eliminado. El gen humano consiste en un fragmento de 95,7 kb del cromosoma X humano que contiene no solo el gen IL13RA completo, sino tambien ~11 kb de ADN intergenico 5' y ~7 kb de ADN 3' de la 3'UTR. Impllcito en esto esta el conocimiento de que este fragmento de ADN dirigira la expresion del receptor humano. Los ratones portadores de esta alteration se generaron a partir de las celulas ES modificadas. En un experimento separado, el segmento de 39 kb de ADN que porta el gen IL-4RA de raton se intercambio con el segmento correspondiente de 63 kb de ADN que codifica el IL-4R humano, que se compone de IL-4R alfa y la cadena gamma comun, y de nuevo utilizando una llnea de raton generada a partir de las celulas modificadas. Las dos llneas de raton knock-in se entrecruzaron para establecer una llnea de raton homocigotica para el locus humanizado tanto en el locus IL-4R como en el locus IL-13RA. Los ratones expresan las protelnas humanas en ausencia de las protelnas de raton. La expresion adecuada de los receptores humanos de Tipo I y Tipo II se verifico demostrando la respuesta de las celulas inmunes a la IL4 humana y la respuesta de las celulas epiteliales de las vlas respiratorias a la IL-13.The mice were generated in the following manner: the mouse IL-13RA1 gene of 70 kb was deleted in the X chromosome, which generated a null allele in mouse embryonic stem cells. A DNA segment carrying the human IL-13RA1 gene was introduced into the deleted locus. The human gene consists of a 95.7 kb fragment of the human X chromosome that contains not only the complete IL13RA gene, but also ~ 11 kb of 5 'intergenic DNA and ~ 7 kb of 3' DNA of the 3'UTR. Implicit in this is the knowledge that this DNA fragment will direct the expression of the human receptor. The mice carrying this alteration were generated from the modified ES cells. In a separate experiment, the 39 kb DNA segment carrying the mouse IL-4RA gene is exchanged with the corresponding 63 kb segment of DNA encoding human IL-4R, which is composed of IL-4R alpha and the common gamma chain, and again using a mouse line generated from the modified cells. The two lines of mouse knock-in were cross-linked to establish a homozygous mouse line for the humanized locus at both the IL-4R locus and the IL-13RA locus. Mice express human proteins in the absence of mouse proteins. Adequate expression of human Type I and Type II receptors was verified by demonstrating the response of immune cells to human IL4 and the response of respiratory epithelial cells to IL-13.
Ejemplo 3: Analisis ex vivo de esplenocitos de raton doble knock-in para verificar la funcion de un antagonista alfa del receptor de IL-4 en el receptor de IL-4 tipo I Example 3: Ex vivo analysis of mouse double-knock-in splenocytes to verify the function of an alpha -receptor antagonist of IL-4 in the IL-4 receptor type I
Se aislaron esplenocitos a partir de ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana por medios y procedimientos comunmente conocidos en la tecnica. Estos esplenocitos se estimularon con concentraciones crecientes de IL-4 humana, bien en ausencia o en presencia de un antagonista alfa del receptor de IL-4, una mutelna de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humana (SEQ ID NO: 6). IL-4 efectua la fosforilacion de STAT6 a traves del complejo receptor de IL-4. Por lo tanto, la fosforilacion de STAT6 es una lectura de la union de IL-4 a su receptor. La lipocalina lacrimal humana (SEQ ID NO: 1) sirve como control negativo.Splenocytes were isolated from double knock-in mice of the human IL-4 receptor / human IL-13 receptor 1 alpha chain by means and procedures commonly known in the art. These splenocytes were stimulated with increasing concentrations of human IL-4, either in the absence or in the presence of an alpha antagonist of the IL-4 receptor, a lipocalin mutein directed against the alpha chain of the human IL-4 receptor (SEQ ID NO. : 6). IL-4 effects the phosphorylation of STAT6 through the IL-4 receptor complex. Therefore, the phosphorylation of STAT6 is a reading of the binding of IL-4 to its receptor. Human tear lipocalin (SEQ ID NO: 1) serves as a negative control.
En la Figura 2, se muestra que la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) disminuye y, por lo tanto, neutraliza, la action de la IL-4 sobre el receptor de IL-4 tipo I expresado en los esplenocitos, ya que la fosforilacion de STAT 6 en los esplenocitos estimulados con IL-4 fue igual al nivel de esplenocitos no estimulados. In Figure 2, it is shown that the lipocalin mutelna (SEQ ID NO: 6) decreases and, therefore, neutralizes, the action of IL-4 on the type I IL-4 receptor expressed in the splenocytes, and that the phosphorylation of STAT 6 in the splenocytes stimulated with IL-4 was equal to the level of unstimulated splenocytes.
Ejemplo 4: Administracion de un antagonista alfa del receptor de IL-4 para raton transgenico doble knock-in y analisis de los niveles de eotaxinaExample 4: Administration of an alpha IL-4 receptor antagonist for double-knock-in transgenic mice and analysis of eotaxin levels
El modelo de inflamacion de las vlas respiratorias inducida por IL-13 proporcionado por Blanchard y col. (Clin Exp Allergy 2005, 35(8):1096-1103) se uso para investigar el efecto de un antagonista alfa del receptor IL-4, una mutelna de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humana. En el modelo, 1 pg de IL-13 se administra tres veces cada 48 horas por instilacion intratraqueal.The model of inflammation of the respiratory vlasts induced by IL-13 provided by Blanchard et al. (Clin Exp Allergy 2005, 35 (8): 1096-1103) was used to investigate the effect of an IL-4 receptor alpha antagonist, a lipocalin mutein directed against the alpha chain of the human IL-4 receptor. In the model, 1 pg of IL-13 is administered three times every 48 hours by intratracheal instillation.
Por consiguiente, tal como se muestra en la Figura 3, se administro un vehlculo (solucion salina tamponada con fosfato, posteriormente denominada "PBS") o IL-13 (hIL-13) a ratones transgenicos de doble knock-in, como grupo 1 (PBS) y grupo 2 (hIL-13), respectivamente, mientras que el grupo 3 (SEQ ID NO: 6/hIL-13) y el grupo 4 (TLPC/hIL-13) recibieron la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en una dosis de 57 pg o la lipocalina lacrimal humana (SEQ ID NO: 1) como control negativo a una dosis de 57 pg, respectivamente, ademas de haber recibido hIL-13.Accordingly, as shown in Figure 3, a vehicle (phosphate-buffered saline, subsequently referred to as "PBS") or IL-13 (hIL-13) was administered to double knock-in transgenic mice, as group 1 (PBS) and group 2 (hIL-13), respectively, while group 3 (SEQ ID NO: 6 / hIL-13) and group 4 (TLPC / hIL-13) received the lipocalin mutelna (SEQ ID NO : 6) in a dose of 57 pg or human tear lipocalin (SEQ ID NO: 1) as a negative control at a dose of 57 pg, respectively, in addition to having received hIL-13.
Los grupos 2 y 3 contenlan 3 ratones, mientras que los grupos 1 y 4 contenlan 2 ratones. La dosificacion intratraqueal se realizo a 30 pl. IL-13, la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) y el control negativo se administraron por via intratraqueal y se obtuvo homogeneizado de tejido pulmonar con el objetivo de medir los niveles de eotaxina. Cabe senalar que la mutelna de lipocalina y el control negativo se administraron 30 minutos antes de la administracion de IL-13.Groups 2 and 3 contain 3 mice, while groups 1 and 4 contain 2 mice. Intratracheal dosing was performed at 30 pl. IL-13, the lipocalin mutelna (SEQ ID NO: 6) and the negative control were administered intratracheally and pulmonary tissue homogenate was obtained in order to measure eotaxin levels. It should be noted that the lipocalin mutelna and the negative control were administered 30 minutes before the administration of IL-13.
Cuando se administra IL-13 en este modelo, los niveles de eotaxina aumentan, por ejemplo, 24 horas despues de la ultima dosis de IL-13 en el grupo 4 en comparacion con el grupo 1. La eotaxina es un potente quimioatrayente de eosinofilos y, por lo tanto, un marcador de inflamacion, en particular la inflamacion alergica. En la Figura 3 se muestra que la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en el grupo 4 neutraliza efectivamente la accion de IL-13 sobre la induccion de eotaxina en comparacion con el control negativo en el grupo 3 (vease tambien el grupo 1 de PBS y el grupo 2 de IL-13 sola).When IL-13 is administered in this model, eotaxin levels increase, for example, 24 hours after the last dose of IL-13 in group 4 compared to group 1. Eotaxin is a potent chemoattractant of eosinophils and , therefore, a marker of inflammation, in particular allergic inflammation. In Figure 3 it is shown that the lipocalin mutelna (SEQ ID NO: 6) in group 4 effectively neutralizes the action of IL-13 on the induction of eotaxin compared to the negative control in group 3 (see also the group 1 of PBS and group 2 of IL-13 alone).
Ejemplo 5: Administracion de un antagonista alfa del receptor de IL-4 para raton transgenico doble knock-in y analisis de la expresion de ARNm de Ccl11 (eotaxina).Example 5: Administration of an IL-4 receptor antagonist for double-knock-in transgenic mouse and analysis of Ccl11 mRNA expression (eotaxin).
La administracion de un antagonista alfa del receptor de IL-4, una mutelna de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humana (SEQ ID NO: 6), a los ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana se realizo tal como se describe en el Ejemplo 4, con la excepcion de que 30 pl de IL-13 (Peprotech, 1 pg) se administraron por instilacion intratraqueal solo una vez. Cada uno de los grupos contenla 3 ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana. El ARN total se aislo de homogeneizados de pulmon 24 horas despues de la dosis de IL-13 y se analizo la expresion de eotaxina de raton mediante RT-PCR. La expresion de ARNm en tejido pulmonar despues de 24 horas se normalizo con ARNr 18S y el valor para 1 pg de ratones hIL13 se establecio en 1. La mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) tambien se aplico por instilacion intratraqueal con un volumen de 30 pl, bien a una dosis constante de 98 pg en diferentes momentos antes de la dosis de IL-13 o en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13. El mutante de IL-4 (R121D, Y124D) tambien se aplico por instilacion intratraqueal con un volumen de 30 pl en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13. Se uso el modelo abreviado de inflamacion de las vlas respiratorias inducida por IL-13 (administracion intratraqueal con IL-13 unica) para evaluar la duracion de la respuesta farmacologica, la dependencia de la dosis y la potencia comparable. En la Figura 4a se puede observar que la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) inhibio el transcrito Ccl11 inducido por IL-13 humana (eotaxina) de manera eficaz durante un perlodo prolongado de tiempo (Figura 4a), mientras que tambien se demostro la dependencia de la dosis de la respuesta farmacologica, tal como se muestra en la Figura 4b. Ademas, como se puede ver en la Figura 4c, se mostro una potencia favorable de la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) cuando se comparo lado a lado con el mutante IL-4 (Figura 4c).The administration of an IL-4 receptor alpha antagonist, a lipocalin mutein directed against the alpha chain of the human IL-4 receptor (SEQ ID NO: 6), to the double-knock-in mice of the 1 alpha chain of the Human IL-4 receptor / human IL-13 receptor was performed as described in Example 4, with the exception that 30 μl of IL-13 (Peprotech, 1 pg) were administered by intratracheal instillation only once. Each of the groups contained 3 double knock-in mice of the 1 alpha chain of the human IL-4 receptor / human IL-13 receptor. The total RNA was isolated from lung homogenates 24 hours after the dose of IL-13 and the expression of mouse eotaxin was analyzed by RT-PCR. The expression of mRNA in lung tissue after 24 hours was normalized with 18S rRNA and the value for 1 pg of hIL13 mice was set to 1. The lipocalin mutelin (SEQ ID NO: 6) was also applied by intratracheal instillation with a volume of 30 pl, either at a constant dose of 98 pg at different times before the dose of IL-13 or in different amounts 30 minutes before the dose of IL-13. The mutant of IL-4 (R121D, Y124D) was also applied by intratracheal instillation with a volume of 30 μl in different amounts 30 minutes before the dose of IL-13. The abbreviated model of airway inflammation induced by IL-13 (intratracheal administration with single IL-13) was used to evaluate the duration of the pharmacological response, dose dependence and comparable potency. In Figure 4a it can be seen that the lipocalin mutelna (SEQ ID NO: 6) inhibited the Ccl11 transcript induced by human IL-13 (eotaxin) effectively during a prolonged period of time (Figure 4a), while also demonstrated the dose dependence of the pharmacological response, as shown in Figure 4b. In addition, as can be seen in Figure 4c, a favorable power of the lipocalin mutein was shown (SEQ ID NO: 6) when compared side by side with the mutant IL-4 (Figure 4c).
Ejemplo 6: Identificacion de formulaciones adecuadas para nebulizar un antagonista alfa del receptor de IL-4 utilizando el nebulizador de malla vibrante Pari eFlow.Example 6: Identification of suitable formulations for nebulizing an alpha antagonist of the IL-4 receptor using the Pari eFlow vibrant mesh nebulizer.
Se nebulizo un antagonista alfa del receptor de IL-4, una mutelna de lipocalina especlfica de IL-4RA (SEQ ID NO: 6) con un dispositivo Pari eFlow a una concentracion de 0,1 mg/ml en p Bs que contenla 0,01 o 0,05 polisorbato 20. El deposito del nebulizador se lleno con 6 ml de la formulacion y se hizo funcionar durante aproximadamente 15 minutos hasta que se nebulizo la mitad del deposito. Tal como se muestra en la Figura 5, la muestra nebulizada se recogio con un vial de vidrio ajustado a la boquilla del nebulizador y analizado por inspeccion visual para monitorear partlculas visibles, por oscurecimiento de la luz para monitorear partlculas subvisibles, por cromatografla de exclusion de tamano de alta presion (HP-SEC) para monitorear agregados solubles, por SEC de fase inversa para monitorear modificaciones qulmicas, por un ELISA de union a IL-4RA para monitorear la actividad funcional y por difraccion laser para medir el tamano de la gota. La nebulizacion de la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en la formulacion elegida no condujo a la generation de partlculas subvisibles y agregados visibles. Tanto la protelna nebulizada como la protelna que quedaba en el reservorio se mantuvieron monomericas y completamente activas de manera funciona. Las gotas con un tamano medio de 5,5 pm se generaron de acuerdo con las especificaciones del dispositivo. La concentracion de polisorbato 20 en la formulacion no parecio influir en la capacidad para nebulizar la mutelna, ya que ninguno de los parametros medidos fue identico en las formulaciones que contenlan 0,01 o 0,05 polisorbato 20.An IL-4 receptor alpha antagonist, a specific lipocalin mutein of IL-4RA (SEQ ID NO: 6) was nebulized with a Pari eFlow device at a concentration of 0.1 mg / ml in p Bs containing 0, 01 or 0.05 polysorbate 20. The tank of the nebulizer was filled with 6 ml of the formulation and operated for approximately 15 minutes until half of the tank was fogged. As shown in Figure 5, the nebulized sample was collected with a glass vial fitted to the nozzle of the nebulizer and analyzed by visual inspection to monitor visible particles, by dimming the light to monitor subvisible particles, by chromatography to exclude high pressure size (HP-SEC) to monitor soluble aggregates, by reverse phase SEC to monitor chemical modifications, by an IL-4RA binding ELISA to monitor the functional activity and by laser diffraction to measure the size of the drop. Nebulization of the lipocalin mutein (SEQ ID NO: 6) in the chosen formulation did not lead to the generation of visible sub-visible particles and aggregates. Both the nebulized protein and the protein that remained in the reservoir remained monomeric and fully active in a functional way. Drops with an average size of 5.5 μm were generated according to the specifications of the device. The concentration of polysorbate 20 in the formulation did not appear to influence the ability to nebulize the mutelna, since none of the parameters measured was identical in formulations containing 0.01 or 0.05 polysorbate 20.
Ejemplo 7: Propiedades farmacocineticas y biodistribucion de un antagonista alfa del receptor de IL-4 en ratones doble knock-in de IL-4RA humana/IL-13 humana despues de la instilacion intratraqueal.Example 7: Pharmacokinetic properties and biodistribution of an IL-4 receptor alpha antagonist in double-knock-in mice of human IL-4RA / human IL-13 after intratracheal instillation.
Un antagonista alfa del receptor de IL-4, la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) se administro por administracion intratraqueal de 30 pl (98 pg) a los ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana. Veinte animales fueron dosificados y se sacrificaron grupos de 4 despues de 1, 4, 8, 16 y 24 horas. En el momento de sacrificarlos, los pulmones se lavaron con 2 x 1 ml de fluido FACSflow, se extrajeron muestras de plasma de heparina-Li y los pulmones se congelaron instantaneamente en nitrogeno llquido. El tejido pulmonar se homogeneizo en 1,5 ml de tampon de lisis (una tableta de comprimidos de cocteles mini inhibidores de la proteasa completos (Roche) / 10 ml de T-PER (Perbio)) utilizando un homogeneizador de tejidos IKA T10 basico Ultra-Turrax (S10N-5G) en 4 °C durante 55 segundos. El homogeneizado se incubo en hielo durante 30-60 minutos y se aclaro por centrifugacion con 10,000 g a 4 ° C durante 10 minutos. La concentracion de protelna total se determino con un kit de BCA (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las muestras se diluyeron con PBS hasta una concentracion de protelna final estandar de 1 mg/ml antes del almacenamiento de allcuotas a -80 °C. Se utilizo un ELISA basado en Meso Scale Discovery ("MSD") cuantitativo para medir las concentraciones activas de union de la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en el llquido de lavado, tejido pulmonar y plasma en los diferentes puntos temporales. En resumen, las placas de MSD se recubrieron con neutravidina, 5 pg/ml en PBS durante la noche a 4 °C, se lavaron con PBS/Tween20 al 0,05 % y se bloquearon con BSA al 3 %. Se anadio IL-4RA humana biotinilada a una concentracion de 2,5 pg/ml en PBS/Tween20 al 0,1 % para capturar la mutelna de lipocalina de las diferentes matrices y la mutelna unida se detecto con un anticuerpo policlonal de conejo especlfico de lipocalina lacrimal (preparacion: TLPC-Mix4666 Ab, Pieris, PL#684) y un anticuerpo IgG anti-conejo Sulfo-Tag (Meso Scale Discovery, 0,5 pg ml) en PBS/Tween20 al 0,5 %/BSA al 0,5 %. El ensayo exhibio en las tres matrices un rango lineal de 75 pg/ml a 6 ng/ml, mientras que las muestras de control de calidad tuvieron una recuperacion de entre 80 120 %. Para los calculos de concentraciones y cantidades totales, se asumio un volumen total de plasma de 900 pl por raton. El factor de dilucion usado para estandarizar el homogeneizado de pulmon a 1 mg/ml de concentracion de protelna total medida por el kit de BCA se tuvo en cuenta cuando la cantidad total de mutelna de lipocalina por pulmon se calculo en funcion de la concentracion medida en el homogeneizado de pulmon total estandarizado y su volumen de 1,5 ml de tampon de lisis y peso medido de los pulmones. La cantidad total de la mutelna de lipocalina en el fluido de lavado broncoalveolar (en adelante “BALF”) se baso en la cantidad recuperada en 2 ml de fluido de lavado.An alpha antagonist of the IL-4 receptor, the lipocalin mutein (SEQ ID NO: 6) was administered by intraplaqueal administration of 30 μl (98 pg) to the double-knock-in mice of the 1 alpha chain of the IL-1 receptor. 4 human / human IL-13 receptor. Twenty animals were dosed and groups of 4 were sacrificed after 1, 4, 8, 16 and 24 hours. At the time of sacrifice, the lungs were washed with 2 x 1 ml of FACSflow fluid, plasma samples were extracted from heparin-Li and the lungs were frozen instantly in liquid nitrogen. Lung tissue was homogenized in 1.5 ml of lysis buffer (one tablet of complete mini-protease inhibitor cocktails (Roche) / 10 ml of T-PER (Perbio)) using a basic IKA T10 tissue homogenizer. -Turrax (S10N-5G) at 4 ° C for 55 seconds. The homogenate was incubated on ice for 30-60 minutes and clarified by centrifugation with 10,000 g at 4 ° C for 10 minutes. The total protein concentration was determined with a BCA kit (Pierce) according to the manufacturer's instructions and the samples were diluted with PBS to a standard final protein concentration of 1 mg / ml before storage of allcuotas at -80 ° C. An ELISA based on quantitative Meso Scale Discovery ("MSD") was used to measure the active binding concentrations of the lipocalin mutein (SEQ ID NO: 6) in the wash fluid, lung tissue and plasma at the different time points. Briefly, the MSD plates were coated with neutravidin, 5 pg / ml in PBS overnight at 4 ° C, washed with PBS / 0.05% Tween20 and blocked with 3% BSA. Biotinylated human IL-4RA was added at a concentration of 2.5 pg / ml in PBS / 0.1% Tween20 to capture the lipocalin mutein of the different matrices and the bound mutene was detected with a rabbit polyclonal antibody specific for lacrimal lipocalin (preparation: TLPC-Mix4666 Ab, Pieris, PL # 684) and an anti-rabbit IgG antibody Sulfo-Tag (Meso Scale Discovery, 0.5 pg ml) in PBS / 0.5% Tween20 / BSA at 0 ,5 %. The test exhibited a linear range of 75 pg / ml to 6 ng / ml in the three matrices, while the quality control samples had a recovery of between 80 120%. For calculations of concentrations and total amounts, a total plasma volume of 900 pl per mouse was assumed. The dilution factor used to standardize the lung homogenate at 1 mg / ml total protein concentration measured by the BCA kit was taken into account when the total amount of lipocalin mutelin per lung was calculated as a function of the concentration measured in the homogenate of standardized total lung and its volume of 1.5 ml of lysis buffer and measured weight of the lungs. The total amount of the lipocalin mutein in the bronchoalveolar lavage fluid (hereinafter "BALF") was based on the amount recovered in 2 ml of wash fluid.
En la Figura 6a se puede observar que el 43 % de la dosis administrada podrla recuperarse en el BALF, el 6 % en el tejido pulmonar y el 0,2 % en plasma 1 hora despues de la administracion intratraqueal. Se determino una vida media terminal de 3,7, 3,9 y 2,7 horas en BALF, tejido pulmonar y plasma, respectivamente. Ademas, se puede ver en la Figura 6b que las concentraciones calculadas de tejido pulmonar en ratones doble knock-in de IL-4RA humana/IL-13 humana se mantuvieron por encima de 0,7 pg/ml despues de la instilacion intratraqueal de 98 pg de la mutelna de lipocalina durante aproximadamente 20 horas, lo que esta en llnea con las observaciones mostradas en la Figura 4a. La concentracion de 0,7 pg/ml corresponde al valor IC90 mas alto de la mutelna de lipocalina observada en diferentes ensayos de potencia in vitro. Ademas, la Figura 6b tambien muestra que las concentraciones plasmaticas y, por lo tanto, la exposicion sistemica, fueron 100 veces mas bajas en comparacion con las concentraciones observadas en el tejido pulmonar.In Figure 6a it can be seen that 43% of the administered dose could be recovered in BALF, 6% in lung tissue and 0.2% in plasma 1 hour after intratracheal administration. A terminal half-life of 3.7, 3.9 and 2.7 hours was determined in BALF, lung tissue and plasma, respectively. Furthermore, it can be seen in Figure 6b that the calculated concentrations of lung tissue in double knock-in mice of human IL-4RA / human IL-13 were maintained above 0.7 pg / ml after intratracheal instillation of 98 pg of the lipocalin mutelna for approximately 20 hours, which is in line with the observations shown in Figure 4a. The concentration of 0.7 pg / ml corresponds to the highest IC90 value of the lipocalin mutelna observed in different in vitro potency assays. In addition, Figure 6b also shows that plasma concentrations and, therefore, systemic exposure, were 100 times lower in comparison with the concentrations observed in lung tissue.
Ejemplo 8: La inhibicion de la metaplasia de celulas caliciformes inducida por IL-13 en el sistema de cultivo de interfaz aire-llquido del epitelio de las vlas respiratorias humanas por un antagonista alfa del receptor de IL-4 Example 8: The inhibition of goblet cell metaplasia induced by IL-13 in the air-liquid interface culture system of the epithelium of human respiratory viruses by an alpha-4 IL-4 receptor antagonist
La metaplasia de celulas caliciformes es una caracterlstica comun de varias enfermedades respiratorias, incluyendo el asma. Por lo tanto, se evaluo la capacidad de un antagonista alfa del receptor de IL-4, la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6), para prevenir la metaplasia de las celulas en un modelo in vitro basado en MucilAir™ (Epithelix). MucilAir™, un sistema de cultivo de interfaz aire-llquido del epitelio de las vlas respiratorias humanas reconstituido en celulas humanas primarias in vitro, se trato cada dos dlas con IL-13 humana a una dosis de 0,3 a 30 ng/ml. Por medio de la tincion con azul de Alcian in situ, as! como el analisis histologico, se demostro que MucilAir™ exhibio un aumento en la densidad de las celulas caliciformes despues de 14 dlas de tratamiento, de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, el efecto inhibitorio de la mutelna de lipocalina en la metaplasia de las celulas caliciformes se probo comparando la exposicion continua de MucilAir ™ a 10 ng/ml de IL-13 humana durante 14 dlas como control positivo y a concentraciones diferentes de IL-13+ (como se muestra en la Figura 7a) de la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6), el mutante de IL-4 (R121D, Y124D) y un anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA (la region variable de las cadenas ligera y pesada se muestra en SEQ ID NO: 14 y 15), respectivamente, y en comparacion con MucilAir™ cultivado durante 14 dlas sin IL-13 como control negativo. La mancha azul de Alcain, que tine mucopolisacaridos acidos y glicosaminoglicanos de azul a verde azulado, se anadio a la superficie apical para una mancha in situ y se tomaron imagenes de celulas tenidas bajo un microscopio de contraste de fase para el analisis de la imagen. El porcentaje de las celulas positivas al azul de Alcain se cuantifico mediante el programa de procesamiento de imagenes Java de dominio publico ImageJ y se expreso como relacion de area del area de azul de Alcain/area de imagen total. El analisis histologico se realizo mediante una plataforma en la Universidad de Goblet cell metaplasia is a common feature of several respiratory diseases, including asthma. Therefore, the ability of an alpha antagonist of the IL-4 receptor, the lipocalin mutelin (SEQ ID NO: 6), to prevent cell metaplasia in an in vitro model based on MucilAir ™ (Epithelix) was evaluated. . MucilAir ™, an air-liquid interface culture system of human respiratory epithelium reconstituted in primary human cells in vitro, was treated every two days with human IL-13 at a dose of 0.3 to 30 ng / ml. By means of the Alcian blue stain in situ, as! As histological analysis, it was shown that MucilAir ™ exhibited an increase in goblet cell density after 14 days of treatment, in a dose-dependent manner. Therefore, the inhibitory effect of the lipocalin mutelin on the goblet cell metaplasia was tested by comparing the continuous exposure of MucilAir ™ to 10 ng / ml of human IL-13 for 14 days as a positive control and at different IL-concentrations. 13+ (as shown in Figure 7a) of the lipocalin mutelna (SEQ ID NO: 6), the mutant of IL-4 (R121D, Y124D) and an anti-IL-4RA monoclonal antibody (the variable region of the light and heavy chains are shown in SEQ ID NO: 14 and 15), respectively, and compared to MucilAir ™ grown for 14 days without IL-13 as a negative control. The blue stain Alcain that tine acid mucopolysaccharides and glycosaminoglycans blue to bluish - green was added to the apical surface to a stain in situ and cell images taken under a phase contrast microscopy for the analysis of the image taken. The percentage of Alcain blue positive cells was quantified by the public image Java image processing program ImageJ and expressed as area ratio of Alcain blue area / total image area. The histological analysis was carried out through a platform at the University of
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