JP2018007693A - Fusion protein comprising interleukin 4 and interleukin - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide, at first, a single molecule that can be clinically developed, can be used for prevention or treatment of OA and chronic pain, and can be used for prevention or treatment of pathological conditions characterized by local or systemic inflammation, immune activation and/or lymphocyte proliferation.SOLUTION: According to the present invention, there are provided: a fusion protein comprising interleukin 10 and interleukin 4; a nucleic acid molecule encoding such a fusion protein; a vector comprising such a nucleic acid molecule; a host cell comprising such a nucleic acid molecule or such a vector; a method for producing such a fusion protein. The fusion protein or gene therapy vector encoding the fusion protein can be used for the prevention or treatment of pathological conditions characterized by osteoarthritis, chronic pain, local or systemic inflammation, immune activation, and/or lymphoproliferation.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、特に、変形性関節症、慢性疼痛、炎症性の疾患または障害、ならびに関連する疾患および障害の治療のための、免疫学および薬理学の分野におけるものである。本発明は、詳細には、場合により、リンカーにより物理的に一緒に融合された、インターロイキン4(IL4)およびインターロイキン10(IL10)を含む新規な融合タンパク質に関する。詳細には、本発明は、個々のサイトカインの組み合わせを上回る生物活性を備えるIL4-IL10融合タンパク質を提供する。本発明は、IL4-IL10融合タンパク質をコードする核酸配列、このような核酸配列を含む発現ベクター、IL4-IL10融合タンパク質をコードする核酸配列を抱くように改変された宿主細胞または宿主生物ならびにIL4-IL10融合タンパク質それ自体を、さらに提供する。本発明は、このような核酸配列を抱く細胞または生物を使用する、IL4-IL10融合タンパク質の作製方法をさらに提供する。本発明の核酸配列を含むトランスジェニック生物もまた提供する。本発明はさらに、IL4-IL10融合タンパク質を含む医薬組成物にも関する。最終的に、医薬品としてのIL4-IL10融合タンパク質の使用、特に、変形性関節症ならびに局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化、リンパ球増殖および/または慢性疼痛により特徴付けられる病態の予防および/または治療を、本明細書において教示する。   The present invention is in the field of immunology and pharmacology, particularly for the treatment of osteoarthritis, chronic pain, inflammatory diseases or disorders, and related diseases and disorders. The present invention particularly relates to novel fusion proteins comprising interleukin 4 (IL4) and interleukin 10 (IL10), optionally physically fused together by a linker. Specifically, the present invention provides IL4-IL10 fusion proteins with biological activity that exceeds the combination of individual cytokines. The present invention relates to a nucleic acid sequence encoding an IL4-IL10 fusion protein, an expression vector comprising such a nucleic acid sequence, a host cell or host organism modified to harbor a nucleic acid sequence encoding an IL4-IL10 fusion protein, and IL4- Further provided is the IL10 fusion protein itself. The present invention further provides a method for producing an IL4-IL10 fusion protein using a cell or organism harboring such a nucleic acid sequence. Also provided are transgenic organisms comprising the nucleic acid sequences of the invention. The present invention further relates to pharmaceutical compositions comprising IL4-IL10 fusion proteins. Finally, the use of IL4-IL10 fusion proteins as pharmaceuticals, in particular the prevention of osteoarthritis and pathological conditions characterized by local or systemic inflammation, immune activation, lymphocyte proliferation and / or chronic pain and Treatment is taught herein.

炎症性疾患およびそれらの関連する病態、例えば、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化および/またはリンパ球増殖は、敗血症、成人性呼吸促迫症候群、同種および異種移植、皮膚炎、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、アレルギー、乾癬、強直性脊椎関節炎、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチなどの自己免疫疾患、糸球体腎炎、免疫複合体誘導性および他の型の脈管炎、多発性硬化症、シェーグレン病、痛風、非ホジキンリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病などのリンパ球増殖性疾患、熱傷、多発性損傷、脳卒中、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、糖尿病、体外透析および血液酸素化、虚血性再灌流障害、サイトカインもしくは治療用モノクローナル抗体のin vivo投与により誘導される毒性、慢性疼痛症候群ならびに神経障害性および/または炎症性の疼痛からなる群から選択され、臨床診療において観察される最も多い衰弱性病態である。炎症過程がこれらの医学的状態の中核をなし、炎症促進性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が、炎症過程のメディエーターとしての重要な役割を果たす。   Inflammatory diseases and their associated pathologies, such as local or systemic inflammation, immune activation and / or lymphocyte proliferation may cause sepsis, adult respiratory distress syndrome, allogeneic and xenografts, dermatitis, inflammatory bowel Diseases, sarcoidosis, allergies, psoriasis, ankylosing spondyloarthritis, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, immune complex-induced and other types of vasculitis, multiple sclerosis, Sjogren's disease Lymphoproliferative diseases such as gout, non-Hodgkin lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia, burns, multiple injury, stroke, myocardial infarction, atherosclerosis, diabetes, in vitro dialysis and blood oxygenation, ischemic resuscitation Perfusion injury, toxicity induced by in vivo administration of cytokines or therapeutic monoclonal antibodies, chronic pain syndrome and It is selected from the group consisting of neuropathic and / or inflammatory pain, the most common debilitating condition which is observed in clinical practice. The inflammatory process is central to these medical conditions, and both pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines play an important role as mediators of the inflammatory process.

炎症促進性サイトカインは、局所および全身性の炎症を促進する。炎症促進性サイトカインの大群の中で、2種、すなわち腫瘍壊死因子(TNFα)およびインターロイキン1(IL1β)が特に著名である。多くの努力が、TNFαおよびIL1βの阻害を目的とする治療戦略の開発に対して注がれている。具体的には、TNFαおよびIL1βの生物活性の低下は、いくつかの戦略、例えば、中和抗体、可溶性受容体、受容体拮抗薬および不活性前駆体を活性分子に変換するプロテアーゼの阻害剤により達成されている。例えば、TNFαの阻害剤、例えば、Infliximab(登録商標)(抗-TNFα抗体)、Humira(登録商標)(完全ヒト抗-TNFα抗体)、Enbrel(登録商標)(TNF-受容体-Fc-融合タンパク質)およびAnakinra(Kineret(登録商標); インターロイキン-1受容体拮抗薬、IL1ra)は、臨床試験において試験されている。TNFαおよび/またはIL1βの遮断は、関節リウマチおよび炎症性腸疾患を患う多くの患者において成功しているが、このようなタイプの治療的介入に対してすべての患者が良好に応答するものではない。したがって、炎症性疾患、慢性疼痛および関連する病態の治療に関する代替かつ有効な治療戦略の大きな必要性が依然としてある。   Pro-inflammatory cytokines promote local and systemic inflammation. Of the large group of pro-inflammatory cytokines, two are particularly prominent: tumor necrosis factor (TNFα) and interleukin 1 (IL1β). Much effort is devoted to the development of therapeutic strategies aimed at inhibiting TNFα and IL1β. Specifically, the reduction of TNFα and IL1β biological activity is due to several strategies such as neutralizing antibodies, soluble receptors, receptor antagonists and inhibitors of proteases that convert inactive precursors into active molecules. Has been achieved. For example, inhibitors of TNFα, such as Infliximab® (anti-TNFα antibody), Humira® (fully human anti-TNFα antibody), Enbrel® (TNF-receptor-Fc-fusion protein ) And Anakinra (Kineret®; interleukin-1 receptor antagonist, IL1ra) have been tested in clinical trials. Blocking TNFα and / or IL1β has been successful in many patients with rheumatoid arthritis and inflammatory bowel disease, but not all patients respond well to this type of therapeutic intervention . Thus, there remains a great need for alternative and effective treatment strategies for the treatment of inflammatory diseases, chronic pain and related conditions.

変形性関節症(OA)は、最も一般的な関節疾患であり、年齢65を超える個人の大多数が、OAのX線的および/または臨床的証拠を有するという証拠が存在する。最も頻度の高い患部は、手、膝、股関節部および脊椎である。重要なことは、症状が、多くの場合、著しい機能障害ならびに疼痛、硬直を含む炎症の徴候および症状ならびに可動性の喪失を伴うことである。OAにおける特徴的な構造変化は、関節軟骨の進行性喪失、軟骨下板の厚みの増加、関節縁における新しい骨の形成(骨棘)および軟骨下骨の嚢胞の発達を含む。加えて、関節の硝子軟骨と隣接する軟骨下骨との接合部、いわゆる石灰化線の領域において、石灰化した軟骨の残遺物が存在する。OAが進行すると、血管への侵入およびこのゾーンの石灰化した軟骨が関節軟骨へ前進することの証拠が存在し、これがさらに関節軟骨の厚みの減少に寄与する。関節軟骨および関節周囲の骨におけるこれらの構造的改変は、隣接する関節表面の輪郭の変形につながり得る。これらの変化および付随する軟骨下骨のリモデリングおよび弾性率改変は、有害な生体力学的環境の発生にさらに寄与し、関節軟骨低下の進行を強化すると思われる。OAの進行に影響を与える多数の因子が示されており、多関節性疾患の存在、加齢、付随する関節内の結晶析出、肥満、関節の不安定性および/またはズレ、筋力低下および末梢神経障害を含む。これらの因子は、遺伝的寄与、機械的因子および加齢効果を含むカテゴリーに分けることができる。非常に限られた治療的介入しかOAの治療に対して提唱されず、利用可能ないくつかの治療的介入は、疼痛処理を目的としたものであり、機能障害の治療を目的としたものではない。   Osteoarthritis (OA) is the most common joint disease, and there is evidence that the majority of individuals over age 65 have X-ray and / or clinical evidence of OA. The most common affected areas are the hands, knees, hips and spine. Importantly, the symptoms are often accompanied by significant dysfunction and signs and symptoms of inflammation, including pain, stiffness, and loss of mobility. Characteristic structural changes in OA include progressive loss of articular cartilage, increased subchondral plate thickness, formation of new bone at the joint margin (osteophytes) and development of subchondral bone cysts. In addition, there is a remnant of calcified cartilage at the joint between the hyaline cartilage of the joint and the adjacent subchondral bone, the so-called calcified line area. As OA progresses, there is evidence that vascular invasion and calcified cartilage in this zone advance to articular cartilage, which further contributes to the reduction of articular cartilage thickness. These structural alterations in articular cartilage and periarticular bone can lead to deformation of the contours of adjacent joint surfaces. These changes and concomitant subchondral bone remodeling and modulus modification appear to contribute further to the development of a detrimental biomechanical environment and enhance the progression of articular cartilage reduction. Numerous factors affecting OA progression have been shown, including the presence of polyarticular disease, aging, concomitant intra-joint crystal deposition, obesity, joint instability and / or displacement, muscle weakness and peripheral nerves Including obstacles. These factors can be divided into categories including genetic contributions, mechanical factors and aging effects. Only very limited therapeutic interventions have been advocated for the treatment of OA, and some of the available therapeutic interventions are aimed at treating pain and not for treating dysfunction Absent.

Henikoff & Henikoff、1992年、PNAS89、915-919頁Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, pages 915-919 DieffenbachおよびDveksler(1995年) PCR Primer: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory PressDieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press McPhersonら(2000年) PCR-Basics: From Background to Bench、第1版、Springer Verlag、GermanyMcPherson et al. (2000) PCR-Basics: From Background to Bench, 1st edition, Springer Verlag, Germany Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1995年Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, edited by Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J.R. Robinson編、Marcel Dekker、Inc.、New York、1978年Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, edited by J.R.Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 Y Derocherら、Nucleic Acids Research 2002年、30巻、2、e9Y Derocher et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 30 Zdanovら、Stucture 1995年、3:591-601頁Zdanov et al., Stucture 1995, 3: 591-601

したがって、臨床開発が実行可能であり、OAおよび慢性疼痛の予防または治療に使用可能であり、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化および/またはリンパ球増殖により特徴付けられる病態の予防または治療に使用可能な単一分子の提供が必要である。これは、大きく異なる病因による多数の疾患または障害のための、単一分子の臨床開発を可能にするものである。   Therefore, clinical development is feasible, can be used for the prevention or treatment of OA and chronic pain, prevention or treatment of pathological conditions characterized by local or systemic inflammation, immune activation and / or lymphocyte proliferation There is a need to provide a single molecule that can be used for This allows for single molecule clinical development for a number of diseases or disorders with very different etiologies.

第一の態様において、本発明は、インターロイキン4(IL4)およびインターロイキン10(IL10)を含む融合タンパク質に関する。   In a first aspect, the present invention relates to a fusion protein comprising interleukin 4 (IL4) and interleukin 10 (IL10).

ある実施形態において、前記IL4と前記IL10とは、リンカーによって連結される。   In one embodiment, IL4 and IL10 are linked by a linker.

ある実施形態において、IL4は、IL10のN末端に融合される。   In certain embodiments, IL4 is fused to the N-terminus of IL10.

ある実施形態において、IL10は、IL4のN末端に融合される。   In certain embodiments, IL10 is fused to the N-terminus of IL4.

ある実施形態において、前記融合タンパク質は、1または複数の化学的修飾をさらに含む。前記化学的修飾は、グリコシル化、フコシル化、シアリル化およびペグ化からなる群から選択することができる。   In certain embodiments, the fusion protein further comprises one or more chemical modifications. Said chemical modification may be selected from the group consisting of glycosylation, fucosylation, sialylation and pegylation.

ある実施形態において、前記IL10はヒトIL10である。   In one embodiment, the IL10 is human IL10.

ある実施形態において、前記IL4はヒトIL4である。   In one embodiment, the IL4 is human IL4.

第2の態様において、本発明は、本明細書において教示される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子に関する。   In a second aspect, the invention relates to a nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding a fusion protein taught herein.

別の態様において、本発明は、本明細書において教示される核酸分子を含むベクターを対象とする。   In another aspect, the present invention is directed to a vector comprising a nucleic acid molecule taught herein.

ある態様において、本発明は、本明細書において教示される核酸分子または本明細書において教示されるベクターを含む宿主細胞に関する。   In certain embodiments, the present invention relates to a host cell comprising a nucleic acid molecule taught herein or a vector taught herein.

ある態様において、本発明は、本明細書において教示される融合タンパク質の作製方法を提供し、前記方法は、本明細書において教示される宿主細胞を、本明細書において教示される融合タンパク質の産生を可能とする条件下で培養するステップ、および、場合により、該融合タンパク質を回収するステップを含む。   In certain embodiments, the present invention provides a method of making a fusion protein as taught herein, said method comprising producing a host cell as taught herein for producing the fusion protein as taught herein. Culturing under conditions that allow the fusion protein, and optionally recovering the fusion protein.

さらに別の態様において、本発明は、本明細書において教示される融合タンパク質および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。   In yet another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the fusion protein taught herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明は、医薬品として使用される、例えば、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化、リンパ球増殖および/または疼痛により特徴付けられる病態の予防または治療のために使用される、本明細書において教示される融合タンパク質に関する。   The present invention is used herein as a medicament, eg for the prevention or treatment of pathological conditions characterized by local or systemic inflammation, immune activation, lymphocyte proliferation and / or pain. Relates to the fusion protein taught in.

局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化、リンパ球増殖および/または慢性疼痛により特徴付けられる前記病態は、敗血症、成人性呼吸促迫症候群、同種および異種移植、皮膚炎、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、アレルギー、乾癬、変形性関節症、強直性脊椎関節炎、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチなどの自己免疫疾患、糸球体腎炎、免疫複合体誘導性および他の型の脈管炎、多発性硬化症、シェーグレン病、痛風、非ホジキンリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病などのリンパ球増殖性疾患、熱傷、多発性損傷、脳卒中、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、糖尿病、体外透析および血液酸素化、虚血性再灌流障害、抹消神経障害、サイトカインもしくは治療用モノクローナル抗体のin vivo投与により誘導される毒性、慢性疼痛症候群ならびに神経障害性および/または炎症性の疼痛からなる群から選択することができる。   Said pathological conditions characterized by local or systemic inflammation, immune activation, lymphocyte proliferation and / or chronic pain are sepsis, adult respiratory distress syndrome, allogeneic and xenografts, dermatitis, inflammatory bowel disease, sarcoidosis , Allergies, psoriasis, osteoarthritis, ankylosing spondyloarthritis, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, immune complex-induced and other types of vasculitis, multiple sclerosis, Lymphoproliferative diseases such as Sjogren's disease, gout, non-Hodgkin lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia, burns, multiple injuries, stroke, myocardial infarction, atherosclerosis, diabetes, extracorporeal dialysis and blood oxygenation, false Blood reperfusion injury, peripheral neuropathy, toxicity induced by in vivo administration of cytokines or therapeutic monoclonal antibodies, It can be selected from sexual pain syndrome and the group consisting of neuropathic and / or inflammatory pain.

ある態様において、本発明は、哺乳動物、例えばヒトにおける、IL10が適応となる臨床状態の予防または治療における使用のための、本明細書において教示される融合タンパクに関する。   In certain embodiments, the present invention relates to the fusion proteins taught herein for use in the prevention or treatment of clinical conditions to which IL10 is indicated in mammals, eg, humans.

本発明は、哺乳動物、例えばヒトにおける、IL4が適応となる臨床状態の予防または治療における使用のための、本明細書において教示される融合タンパクにもさらに関する。   The present invention further relates to the fusion proteins taught herein for use in the prevention or treatment of clinical conditions to which IL4 is indicated in mammals such as humans.

最終的に、本発明は、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化、リンパ球増殖および/または慢性疼痛により特徴付けられる病態の予防または治療における使用のための、本明細書において教示されるベクターを教示し、この病態は、敗血症、成人性呼吸促迫症候群、同種および異種移植、皮膚炎、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、アレルギー、乾癬、変形性関節症、強直性脊椎関節炎、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチなどの自己免疫疾患、糸球体腎炎、免疫複合体誘導性および他の型の脈管炎、多発性硬化症、シェーグレン、痛風、非ホジキンリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病などのリンパ球増殖性疾患、熱傷、多発性損傷、脳卒中、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、糖尿病、体外透析および血液酸素化、虚血性再灌流障害、サイトカインもしくは治療用モノクローナル抗体のin vivo投与により誘導される毒性、慢性疼痛症候群ならびに神経障害性および/または炎症性の疼痛からなる群から選択することができる。   Finally, the present invention is taught herein for use in the prevention or treatment of pathological conditions characterized by local or systemic inflammation, immune activation, lymphocyte proliferation and / or chronic pain. Teaching vectors, this pathology is sepsis, adult respiratory distress syndrome, allo- and xenografts, dermatitis, inflammatory bowel disease, sarcoidosis, allergy, psoriasis, osteoarthritis, ankylosing spondyloarthritis, systemic lupus erythematosus and Lymphocytes such as autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, immune complex-induced and other types of vasculitis, multiple sclerosis, Sjogren, gout, non-Hodgkin lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia Proliferative disease, burns, multiple injuries, stroke, myocardial infarction, atherosclerosis, diabetes, extracorporeal dialysis and blood oxygenation, ischemia It can be selected reperfusion injury, toxicity induced by the in vivo administration of cytokines or therapeutic monoclonal antibodies, from the group consisting of chronic pain syndromes and neuropathic and / or inflammatory pain.

一般的定義
「核酸分子」(または「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」もしくは「ヌクレオチド配列」)という用語は、一本鎖もしくは二本鎖の形態のDNAもしくはRNA分子、特に本発明に従ったタンパク質をコードするDNAを指す。「単離核酸配列」は、核酸配列が単離された天然環境にはない核酸配列、例えば、細菌宿主細胞または植物の細胞核またはプラスチドゲノム中の核酸配列を指す。 GENERAL DEFINITIONS The term “nucleic acid molecule” (or “nucleic acid sequence”, “polynucleotide” or “nucleotide sequence”) refers to a DNA or RNA molecule in single or double stranded form, in particular a protein according to the invention. Refers to DNA encoding An “isolated nucleic acid sequence” refers to a nucleic acid sequence that is not in the natural environment from which the nucleic acid sequence was isolated, eg, in a bacterial host cell or plant nucleus or plastid genome.

「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、特定の作用方式、サイズ、3次元構造または起源に関わらず、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。「単離タンパク質」は、その天然環境にはない、例えばin vitroまたは組み換えの細菌または植物宿主細胞中にあるタンパク質を指すように使用される。   The terms “protein” or “polypeptide” are used interchangeably and refer to a molecule consisting of a chain of amino acids, regardless of the particular mode of action, size, three-dimensional structure or origin. “Isolated protein” is used to refer to a protein that is not in its natural environment, eg, in vitro or in a recombinant bacterial or plant host cell.

「融合タンパク質」という用語は、2以上のタンパク質に由来するアミノ酸配列を有する、タンパク質またはポリペプチドを指す。融合タンパク質は、別々のタンパク質に由来するアミノ酸部分の間の、アミノ酸の連結領域またはリンカーもまた含んでもよい。   The term “fusion protein” refers to a protein or polypeptide having an amino acid sequence derived from two or more proteins. A fusion protein may also include amino acid linking regions or linkers between amino acid moieties derived from separate proteins.

「IL4-IL10融合タンパク質」という用語は、場合により、リンカーによって互いにカップリングされた、少なくともIL4およびIL10を含む融合ポリペプチドを指す。融合タンパク質は、追加のポリペプチド配列、例えばシグナル配列、His-タグ、抗体Fc断片などを含んでもよい。   The term “IL4-IL10 fusion protein” refers to a fusion polypeptide comprising at least IL4 and IL10, optionally coupled together by a linker. The fusion protein may include additional polypeptide sequences, such as signal sequences, His-tags, antibody Fc fragments, and the like.

本明細書において使用する場合、「リンカー」は、2つのタンパク質またはポリペプチド、この場合にはIL4とIL10とをカップリングするために使用されるポリペプチドを意味する。リンカーは通常、アミノ酸、例えば、主にグリシンおよび/またはセリンのストレッチである。ある実施形態において、リンカーは、100ヌクレオチドまで、例えば、約2、5、7、10、15アミノ酸から、約15、20、25、30、35、50、75または100アミノ酸までの長さを有する、好ましくは主にセリンおよびグリシン残基を含む、アミノ酸のストレッチである。   As used herein, “linker” means a polypeptide used to couple two proteins or polypeptides, in this case IL4 and IL10. The linker is usually a stretch of amino acids, eg mainly glycine and / or serine. In certain embodiments, the linker has a length of up to 100 nucleotides, e.g., from about 2, 5, 7, 10, 15 amino acids to about 15, 20, 25, 30, 35, 50, 75 or 100 amino acids. A stretch of amino acids, preferably mainly comprising serine and glycine residues.

本明細書において使用する場合、「インターロイキン10」(IL10)は、任意の哺乳動物IL10、例えば、ヒトIL10、マウスIL10またはこれらの活性種もしくは対立遺伝子変異体、断片もしくは誘導体を指す。   As used herein, “interleukin 10” (IL10) refers to any mammalian IL10, eg, human IL10, mouse IL10, or active species or allelic variants, fragments or derivatives thereof.

本明細書において使用する場合、「インターロイキン4」(IL4)は、任意の哺乳動物IL4、例えば、ヒトIL4、マウスIL4またはこれらの活性種もしくは対立遺伝子変異体、断片もしくは誘導体を指す。   As used herein, “interleukin 4” (IL4) refers to any mammalian IL4, eg, human IL4, mouse IL4, or active species or allelic variants, fragments or derivatives thereof.

本明細書において使用する場合、「二量体」という用語は、2つのポリペプチドが、共有結合もしくは非共有結合の相互作用を介して安定に会合した分子を指す。「ホモ二量体」という用語は、2つの同一のポリペプチドが、共有結合もしくは非共有結合の相互作用を介して安定に会合した分子を指す。適切な実施形態において、これらは、非共有結合相互作用を介して安定に会合している。   As used herein, the term “dimer” refers to a molecule in which two polypeptides are stably associated through covalent or non-covalent interactions. The term “homodimer” refers to a molecule in which two identical polypeptides are stably associated through covalent or non-covalent interactions. In suitable embodiments, they are stably associated via non-covalent interactions.

本発明の融合タンパク質(またはこれらの変異体もしくは断片)に関して、「機能性」は、IL4およびIL10の両方の機能性を提示する能力を指す。IL4およびIL10に関する機能性アッセイは、全血におけるリポ多糖類(LPS)により誘導されるサイトカインの放出(IL1、IL6、IL8、TNFα)である。   “Functionality” with respect to the fusion proteins of the present invention (or variants or fragments thereof) refers to the ability to display both IL4 and IL10 functionality. A functional assay for IL4 and IL10 is the release of cytokines (IL1, IL6, IL8, TNFα) induced by lipopolysaccharide (LPS) in whole blood.

「遺伝子」という用語は、細胞中のRNA分子(例えばmRNA)に転写される領域(転写領域)を含む、適切な制御領域(例えばプロモーター)に動作可能に連結されたDNA配列を意味する。したがって、遺伝子は、いくつかの動作可能に連結された配列、例えばプロモーター、例えば、翻訳開始に関係する配列を含む5'リーダー配列、(タンパク質)コード領域(cDNAまたはゲノムDNA)、イントロンおよび例えば、転写終結部位を含む3'非翻訳配列を含んでよい。   The term “gene” refers to a DNA sequence operably linked to an appropriate regulatory region (eg, promoter), including a region (transcription region) that is transcribed into an RNA molecule (eg, mRNA) in a cell. Thus, a gene comprises several operably linked sequences, such as a promoter, e.g., a 5 'leader sequence containing sequences involved in translation initiation, a (protein) coding region (cDNA or genomic DNA), an intron and, for example, It may contain a 3 ′ untranslated sequence containing a transcription termination site.

「3'UTR」または「3'非翻訳配列」(多くの場合、3'非翻訳領域または3'末端とも称される)は、遺伝子のコード配列の下流に見出される核酸配列を指し、例えば、転写終結部位および(ほとんどであるがすべてではない真核性mRNAにおいて)ポリアデニル化シグナル(例えば、AAUAAAまたはこれらの変異体など)を含む。転写の終結後、mRNA転写産物は、ポリアデニル化シグナルの下流で切断され、mRNAの(翻訳が起こる場所である)細胞質への輸送に関連するポリ(A)尾部が付加される。   “3′UTR” or “3 ′ untranslated sequence” (often referred to as the 3 ′ untranslated region or 3 ′ end) refers to a nucleic acid sequence found downstream of the coding sequence of a gene, for example Includes a transcription termination site and a polyadenylation signal (such as in AAUAAA or variants thereof) (in most but not all eukaryotic mRNAs). After termination of transcription, the mRNA transcript is cleaved downstream of the polyadenylation signal and a poly (A) tail is added that is associated with the transport of the mRNA into the cytoplasm (where translation takes place).

「遺伝子の発現」は、適切な制御領域、特にプロモーターに動作可能に連結されたDNA領域が、生物学的に活性な、すなわち、生物学的に活性なタンパク質またはペプチド(または活性ペプチド断片)に翻訳され得るRNAに転写される過程を指す。「ポリペプチドの発現」は、mRNAが、分泌可能な、または分泌不可能なタンパク質産物に翻訳される過程を、さらに指す。   `` Gene expression '' refers to a protein or peptide (or active peptide fragment) in which appropriate regulatory regions, particularly DNA regions operably linked to a promoter, are biologically active, i.e. biologically active. It refers to the process of being transcribed into RNA that can be translated. “Polypeptide expression” further refers to the process by which mRNA is translated into a secretable or non-secretable protein product.

「転写制御配列」は、転写制御配列に動作可能に連結された(コード)配列の転写速度を制御できる核酸配列として、本明細書において定義される。したがって、本明細書において定義される転写制御配列は、転写の開始、例えば、アテニュエーターまたはエンハンサーを含む、転写の維持および制御に必要なすべての配列要素(プロモーター要素)を含むと思われる。コード配列の上流の(5')転写制御配列を主に指すが、コード配列の下流(3')に見出される制御配列もまた、この定義に包含される。   A “transcription control sequence” is defined herein as a nucleic acid sequence capable of controlling the rate of transcription of a (coding) sequence operably linked to the transcription control sequence. Thus, a transcription control sequence as defined herein appears to include all sequence elements (promoter elements) necessary for transcription initiation, eg, maintenance and control of transcription, including attenuators or enhancers. Although primarily referring to the (5 ′) transcription control sequence upstream of the coding sequence, control sequences found downstream (3 ′) of the coding sequence are also encompassed by this definition.

本明細書において使用する場合、「プロモーター」という用語は、1つまたは複数の遺伝子の転写を調節するために機能し、遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置し、DNA依存性RNAポリメラーゼに対する結合部位、転写開始部位ならびに限定するものではないが、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位ならびにプロモーターからの転写の量を、直接または間接的に制御するように作用する、当業者に公知のヌクレオチドの任意の他の配列を含む任意の他のDNA配列の存在により構造的に同定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、大部分の組織において、大部分の生理学的および発達的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、(例えば、特定の化合物の外用により)生理学的にまたは発達的に制御されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの組織または細胞においてのみ活性である。   As used herein, the term “promoter” functions to regulate transcription of one or more genes, is located upstream with respect to the transcription direction of the transcription start site of the gene, and is DNA-dependent Acts to directly or indirectly control the amount of transcription from the binding site to RNA polymerase, transcription initiation site and, but not limited to, transcription factor binding site, repressor and activator protein binding sites and promoters. Refers to a nucleic acid fragment that is structurally identified by the presence of any other DNA sequence, including any other sequence of nucleotides known to those of skill in the art. A “constitutive” promoter is a promoter that is active in most tissues under most physiological and developmental conditions. An “inducible” promoter is a promoter that is physiologically or developmentally regulated (eg, by external application of a particular compound). A “tissue specific” promoter is only active in certain types of tissues or cells.

本明細書において使用する場合、「動作可能に連結された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸は、機能的関係で別の核酸配列に配置された場合、「動作可能に連結」される。例えば、プロモーター、より正確に言えば転写制御配列が、コード配列の転写に影響を与える場合、転写制御配列はコード配列に動作可能に連結される。動作可能に連結されるは、連結されるDNA配列が、通常隣接されることを意味する。   As used herein, the term “operably linked” refers to the linkage of polynucleotide elements in a functional relationship. Nucleic acids are “operably linked” when placed into another nucleic acid sequence in a functional relationship. For example, a transcription control sequence is operably linked to a coding sequence if a promoter, or more precisely, the transcription control sequence, affects the transcription of the coding sequence. Operably linked means that the DNA sequences to be linked are usually contiguous.

「核酸構築体」または「ベクター」は、組み換えDNA技術の使用によりもたらされ、外因性DNAを宿主細胞に送達するために使用される人工の核酸分子を意味すると、本明細書において理解される。ベクターは、通常、それらを使用することにより分子クローニングが容易になるさらなる遺伝要素、例えば、選択可能なマーカー、多重クローニング部位などを含む(下記を参照されたい)。   “Nucleic acid construct” or “vector” is understood herein to mean an artificial nucleic acid molecule resulting from the use of recombinant DNA technology and used to deliver exogenous DNA to a host cell. . Vectors usually contain additional genetic elements that facilitate molecular cloning, such as selectable markers, multiple cloning sites, etc. (see below).

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定するために使用できる。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる状況においては異なると思われる。概して、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱溶融点(Tm)より約5℃低く選択される。Tmは、(規定のイオン強度およびpHの下で)標的配列の50%が、完全に一致するプローブにハイブリダイズされる温度である。通常は、塩濃度が、pH7において約0.02モルであり、温度が少なくとも60℃であるストリンジェント条件が選択される。塩濃度の低下および/または温度の上昇はストリンジェント性を上昇させる。RNA-DNAのハイブリダイゼーション(例えば100ntのプローブを使用するノーザンブロット)に関するストリンジェント条件は、例えば、0.2×SSCで少なくとも1回、63℃において20分間の洗浄および同等の条件を含む条件である。DNA-DNAハイブリダイゼーション(例えば100ntのプローブを使用するサザンブロット)に関するストリンジェント条件は、例えば、0.2×SSCで少なくとも1回(通常2回)、少なくとも50℃、通常は約55℃の温度において20分間の洗浄および同等の条件を含む条件である。Sambrookら(1989年)ならびにSambrookおよびRussell(2001年)も参照されたい。 “Stringent hybridization conditions” can be used to identify nucleotide sequences that are substantially identical to a given nucleotide sequence. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting point (T m ) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. T m is the temperature at which 50% of the target sequence (under a defined ionic strength and pH) is hybridized to a perfectly matched probe. Usually, stringent conditions are selected wherein the salt concentration is about 0.02 mol at pH 7 and the temperature is at least 60 ° C. A decrease in salt concentration and / or an increase in temperature increases stringency. Stringent conditions for RNA-DNA hybridization (eg, Northern blot using a 100 nt probe) are, for example, conditions that include at least one wash in 0.2 × SSC, 20 minutes at 63 ° C., and equivalent conditions. Stringent conditions for DNA-DNA hybridization (e.g., Southern blot using a 100 nt probe) are, for example, at least once with 0.2 x SSC (usually twice), 20 at a temperature of at least 50 ° C, usually about 55 ° C. Conditions including minute washing and equivalent conditions. See also Sambrook et al. (1989) and Sambrook and Russell (2001).

「配列同一性」および「配列類似性」は、グローバルおよびローカルなアライメントアルゴリズムを使用する、2つのペプチドまたは2つのヌクレオチド配列のアライメントにより決定することができる。配列が、(例えば、デフォルトパラメーターを使用して、GAPまたはBESTFITのプログラムにより最適にアライメントした場合)少なくとも特定の最小百分率の配列同一性(下記に規定)を共有するときに、その場合、配列は、「実質的に同一」または「本質的に類似」と称される。GAPは、NeedlemanおよびWunschのグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、2つの配列を、それらの全長にわたって、一致した数を最大化し、ギャップの数を最小化してアライメントする。概して、GAPのデフォルトパラメーターは、ギャップ挿入ペナルティ(gap creation penalty)=50(ヌクレオチド)/8(タンパク質)およびギャップ伸長ペナルティ(gap extension penalty)=3(ヌクレオチド)/2(タンパク質)で使用する。ヌクレオチドに関しては、使用したデフォルトスコア行列はnwsgapdnaであり、タンパク質に関しては、デフォルトスコア行列はBlosum62(Henikoff & Henikoff、1992年、PNAS89、915-919頁)である。配列アライメントおよび配列同一性の百分率に対するスコアは、コンピュータプログラム、例えば、GCG Wisconsin Package、Version 10.3、Accelrys Inc.、9685 Scranton Road、San Diego、CA 92121-3752 USAより入手可能、またはEmbossWin version 2.10.0(「needle」プログラムを使用)を使用して決定することができる。代替的には、類似性または同一性のパーセントは、FASTA、BLASTなどのアルゴリズムを使用して、データベースを検索することによって決定することができる。好ましくは、配列同一性は、配列の全長にわたった配列同一性を指す。   “Sequence identity” and “sequence similarity” can be determined by alignment of two peptides or two nucleotide sequences using global and local alignment algorithms. When a sequence shares at least a certain minimum percentage of sequence identity (as defined below) (e.g., when optimally aligned using the GAP or BESTFIT program using default parameters), then the sequence is , “Substantially identical” or “essentially similar”. GAP uses the Needleman and Wunsch global alignment algorithm to align two sequences over their entire length, maximizing the number of matches and minimizing the number of gaps. Generally, the default parameters for GAP are used with a gap creation penalty = 50 (nucleotide) / 8 (protein) and a gap extension penalty = 3 (nucleotide) / 2 (protein). For nucleotides, the default score matrix used is nwsgapdna, and for proteins, the default score matrix is Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, pages 915-919). Scores for sequence alignment and percent sequence identity are available from computer programs such as GCG Wisconsin Package, Version 10.3, Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA, or EmbossWin version 2.10.0 (Using the “needle” program). Alternatively, the percent similarity or identity can be determined by searching the database using algorithms such as FASTA, BLAST, etc. Preferably, sequence identity refers to sequence identity over the entire length of the sequence.

「宿主細胞」または「組み換え宿主細胞」または「形質転換細胞」は、少なくとも1つの核酸分子の結果として生じる、特に所望のタンパク質をコードする核酸分子を含む新しい個別細胞(または生物)を指す用語である。宿主細胞は、好ましくは植物細胞または細菌細胞である。宿主細胞は、本発明の核酸分子またはベクターを、染色体外(エピソーム性)複製子として含有でき、またはより好ましくは、宿主細胞のゲノムに統合された本発明の核酸分子またはベクターを含む。   A “host cell” or “recombinant host cell” or “transformed cell” is a term that refers to a new individual cell (or organism) that contains a nucleic acid molecule, particularly a nucleic acid molecule encoding a desired protein, resulting from at least one nucleic acid molecule. is there. The host cell is preferably a plant cell or a bacterial cell. A host cell can contain a nucleic acid molecule or vector of the invention as an extrachromosomal (episomal) replicator, or more preferably comprises a nucleic acid molecule or vector of the invention integrated into the genome of the host cell.

「選択可能なマーカー」という用語は、当業者にはよく知られた用語であり、発現した場合、選択可能なマーカーを含有する細胞(単数または複数)を選択するために使用可能な、任意の遺伝的存在を説明するために、本明細書において使用される。選択可能なマーカーの遺伝子産物は、例えば抗生物質耐性または栄養要求性をもたらす。   The term `` selectable marker '' is a term well known to those skilled in the art and, when expressed, can be any arbitrary one that can be used to select cells or cells that contain the selectable marker. Used herein to describe genetic presence. The gene product of the selectable marker provides, for example, antibiotic resistance or auxotrophy.

「生物学的半減期」という用語は、ある物質、例えばタンパク質の量が、生物系、例えば、動物またはヒトの体内の循環において、生物学的過程、例えば、腎クリアランスおよび分解により、その値の半分に減少するために必要とされる時間を指す。   The term “biological half-life” means that the amount of a substance, for example a protein, is reduced in its value due to biological processes such as renal clearance and degradation in the circulation in a biological system, such as an animal or human body. Refers to the time required to reduce by half.

本文書およびその特許請求の範囲において、動詞「含む(to comprise)」およびその活用形は、その非限定的意味で使用され、この単語の後に続く項目を含むが、具体的に述べられていない項目を排除しないことを意味する。「含む」はより限定的な動詞「からなる(to consist of)もまた包含する。加えて、不定冠詞「a」または「an」による要素への言及は、文脈が、唯一の要素が存在することを明らかに要求していない限り、1より多い要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞詞「a」または「an」は、通常は、「少なくとも1つ」を意味する。本明細書において「配列」についての言及する場合、概して、特定の配列のサブユニット(例えばアミノ酸)を有する実際の物理的分子について言及している。   In this document and in the claims, the verb “to include” and its conjugations are used in their non-limiting sense and include the item that follows this word, but are not specifically stated. It means not to exclude the item. “Contains” also encompasses the more restrictive verb “to consist of. In addition, reference to an element by the indefinite article“ a ”or“ an ”is contextual and there is only one element. Unless explicitly required, this does not exclude the possibility of more than one element. Thus, the indefinite article “a” or “an” usually means “at least one”. References herein to “sequences” generally refer to actual physical molecules having specific sequence subunits (eg, amino acids).

本発明のタンパク質、核酸配列、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、新規な「単一分子療法」を現在までに考案した。詳細には、本発明者らは、場合により、リンカーにより物理的に一緒に融合された、IL4タンパク質およびIL10タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。特に、本発明の融合タンパク質は、その個々の対応物、すなわち、それぞれIL4およびIL10を越えた優れた生物活性(例えば、TNFαおよびIL1βを阻害する)を有することが見出された。詳細には、本発明の融合タンパク質は、個々のサイトカイン(両方とも<20kD)より有意に大きい(約35kD)ことが見出された。本発明者らは、さらに、融合タンパク質それ自体が、(融合タンパク質のIL10部分によって)二量体を形成し、したがって、さらに大きい分子量(約70kD)を有する融合タンパク質を提供することを、予期せず見出した。このような分子量の増加および結果として、分子半径の増加は、循環におけるIL4-IL10融合タンパク質の生物学的半減期を、個々のサイトカインと比較して有意に延長するだけでなく、炎症部位におけるそのバイオアベイラビリティを、前例のないレベルに増加する。本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質が両方のサイトカインを炎症部位に送達し、そこで、それらのサイトカインは両方とも互いの存在下で同じ量の時間それらの作用を発揮できるので、IL4とIL10との間の相乗作用が起こる治療の時間窓をさらに大幅に伸ばす。さらに、本発明の融合タンパク質は、二重の治療作用を発揮することが、予期せずに見出された。詳細には、IL4-IL10融合タンパク質は、全身性に投与した場合は抗炎症剤として作用し、一方、髄腔内に投与した場合は、抗痛覚過敏剤として作用することを示した。 Proteins, nucleic acid sequences, vectors and host cells of the invention The present invention has devised a novel "single molecule therapy" to date. In particular, we provide fusion proteins comprising IL4 and IL10 proteins, optionally physically fused together by a linker. In particular, the fusion proteins of the present invention have been found to have superior biological activity (eg, inhibits TNFα and IL1β) over their individual counterparts, ie, IL4 and IL10, respectively. Specifically, the fusion proteins of the present invention were found to be significantly larger (about 35 kD) than individual cytokines (both <20 kD). The inventors further anticipated that the fusion protein itself forms a dimer (by the IL10 portion of the fusion protein), thus providing a fusion protein with a higher molecular weight (approximately 70 kD). I found it. Such an increase in molecular weight and, as a consequence, an increase in molecular radius not only significantly increases the biological half-life of the IL4-IL10 fusion protein in the circulation compared to individual cytokines, but also at the site of inflammation. Increase bioavailability to unprecedented levels. The fusion proteins of the present invention deliver IL4 and IL10 since the fusion protein delivers both cytokines to the site of inflammation, where both cytokines can exert their actions for the same amount of time in the presence of each other. The treatment time window during which synergies occur will be further extended. Furthermore, it has been unexpectedly found that the fusion proteins of the present invention exert a dual therapeutic effect. Specifically, the IL4-IL10 fusion protein has been shown to act as an anti-inflammatory agent when administered systemically, while acting as an anti-hyperalgesic agent when administered intrathecally.

本発明の一実施形態において、IL4-IL10融合タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列(これらの変異体および断片を含む)を提供する。IL4-IL10融合タンパク質ならびにこれらの機能性断片および変異体は、IL4活性およびIL10活性を提示する。   In one embodiment of the invention, the nucleic acid and amino acid sequences (including variants and fragments thereof) of IL4-IL10 fusion proteins are provided. IL4-IL10 fusion proteins and functional fragments and variants thereof display IL4 activity and IL10 activity.

一態様において、IL4およびIL10を含む融合タンパク質を提供する。該融合タンパク質は、IL4タンパク質またはこれらの変異体もしくは断片を含む。IL4タンパク質は、好ましくは、哺乳動物IL4タンパク質、例えばヒトIL4またはマウスIL4である。IL4の1つのアミノ酸配列は、配列番号1で示される。IL4の変異体は、例えば、配列番号1に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える、例えば100%のアミノ酸配列の同一性を、好ましくは全長にわたって有するタンパク質を含む。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、上記のNeedlemanおよびWunschのアルゴリズムならびにGAPデフォルトパラメーターを使用して、ペアワイズアライメントにより決定される。変異体はまた、IL4活性を有するタンパク質を含み、このタンパク質は、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入により、配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来する。好ましくは、このようなタンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多くから約100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15までのアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む。   In one embodiment, a fusion protein comprising IL4 and IL10 is provided. The fusion protein comprises an IL4 protein or a variant or fragment thereof. The IL4 protein is preferably a mammalian IL4 protein, such as human IL4 or mouse IL4. One amino acid sequence of IL4 is shown in SEQ ID NO: 1. A variant of IL4 is, for example, at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% relative to SEQ ID NO: 1 or Proteins having greater than, for example, 100% amino acid sequence identity, preferably over the entire length are included. Amino acid sequence identity is preferably determined by pair-wise alignment using the Needleman and Wunsch algorithm described above and the GAP default parameters. Variants also include proteins having IL4 activity, which are derived from a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by substitution, deletion or insertion of one or more amino acids. Preferably, such proteins are 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more to about 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, Including 35, 30, 25, 20, 15 amino acid substitutions, deletions or insertions.

融合タンパク質は、IL10タンパク質またはこれらの変異体もしくは断片をさらに含む。IL10タンパク質は、好ましくは、哺乳動物IL10タンパク質、例えばヒトIL10またはマウスIL10である。IL10を表す1つのアミノ酸配列は、配列番号2で示される。IL4の変異体は、例えば、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える、例えば100%のアミノ酸配列の同一性を、好ましくは全長にわたって有するタンパク質を含む。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、上記のNeedlemanおよびWunschのアルゴリズムならびにGAPデフォルトパラメーターを使用して、ペアワイズアライメントにより決定される。変異体はまた、IL10活性を有するタンパク質を含み、このタンパク質は、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入により、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来する。好ましくは、このようなタンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多くから約100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15までのアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む。   The fusion protein further comprises an IL10 protein or a variant or fragment thereof. The IL10 protein is preferably a mammalian IL10 protein, such as human IL10 or mouse IL10. One amino acid sequence representing IL10 is shown in SEQ ID NO: 2. A variant of IL4 is, for example, at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% relative to SEQ ID NO: 2 Proteins having greater than, for example, 100% amino acid sequence identity, preferably over the entire length are included. Amino acid sequence identity is preferably determined by pair-wise alignment using the Needleman and Wunsch algorithm described above and the GAP default parameters. Variants also include proteins having IL10 activity, which are derived from a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 by one or more amino acid substitutions, deletions or insertions. Preferably, such proteins are 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more to about 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, Including 35, 30, 25, 20, 15 amino acid substitutions, deletions or insertions.

融合タンパク質中のIL4およびIL10は、リンカーによって連結されていても、また連結されていなくてもよい。追加のアミノ酸配列は、本発明の融合タンパク質のNおよび/またはC末端に、例えば、精製を容易にするために存在してもよい。例えば、ヒスチジン-タグが、CまたはN末端に、精製を容易にするために存在してもよい。代替的には、本発明のIL4-IL10融合タンパク質は、追加のタンパク質部分、例えば標的化が可能な部分、例えば、1または複数の抗体Fc領域を含むタンパク質部分を、場合により含んでもよい。   IL4 and IL10 in the fusion protein may or may not be linked by a linker. Additional amino acid sequences may be present at the N and / or C terminus of the fusion proteins of the invention, for example, to facilitate purification. For example, a histidine-tag may be present at the C or N terminus to facilitate purification. Alternatively, an IL4-IL10 fusion protein of the invention may optionally include additional protein moieties, such as targetable moieties, such as protein moieties that include one or more antibody Fc regions.

IL4は、IL10のN末端に位置してもよく、またはIL10のC末端に位置してもよい。好ましい実施形態において、IL4分子は、IL10分子のN末端に位置する。後者の融合タンパク質は、IL4分子が、IL10分子のC末端に位置するIL4-IL10融合タンパク質と比較して、高い特異的活性を示すことが見出された(データ記載せず)。   IL4 may be located at the N-terminus of IL10 or at the C-terminus of IL10. In a preferred embodiment, the IL4 molecule is located at the N-terminus of the IL10 molecule. The latter fusion protein was found to show high specific activity of the IL4 molecule compared to the IL4-IL10 fusion protein located at the C-terminus of the IL10 molecule (data not shown).

IL4-IL10融合タンパク質は、単量体型で存在してもよく、この場合、IL4-IL10融合タンパク質は、約35kDaのkDaを有し、または二量体IL4-IL10融合タンパク質、すなわち、2つのIL4-IL10融合タンパク質が、非共有結合的に互いに会合していてもよく、この場合、IL4-IL10融合タンパク質は、約70kDaのkDaを有する。   The IL4-IL10 fusion protein may exist in monomeric form, in which case the IL4-IL10 fusion protein has a kDa of about 35 kDa, or a dimeric IL4-IL10 fusion protein, ie two IL4 -IL10 fusion proteins may be non-covalently associated with each other, in which case the IL4-IL10 fusion protein has a kDa of about 70 kDa.

ある実施形態において、本発明の融合タンパク質は、場合によりリンカーにより連結された、IL4およびIL10から本質的になる。   In certain embodiments, the fusion protein of the invention consists essentially of IL4 and IL10, optionally linked by a linker.

ある実施形態において、本発明の融合タンパク質内のIL4およびIL10部分は両方とも活性であり、少なくとも1つの炎症性サイトカインまたはメディエーター、例えばIL1、IL6、IL8、TNFαの産生を下方制御するように細胞にシグナル伝達することができる。好ましくは、少なくともTNFα、IL6およびIL8が下方制御される。   In certain embodiments, the IL4 and IL10 moieties in the fusion proteins of the invention are both active and direct the cell to down regulate the production of at least one inflammatory cytokine or mediator, such as IL1, IL6, IL8, TNFα. Can signal. Preferably, at least TNFα, IL6 and IL8 are downregulated.

ある実施形態において、融合タンパク質は、サイトカイン、例えばTNFα、ΙL1β、IL6および他の炎症性サイトカインの産生を阻害するが、一方で、炎症細胞ならびにエンドトキシン、他のToll様受容体(TLR)作動薬または他の刺激により刺激された他の細胞による、阻害性分子、例えばIL1受容体拮抗薬および可溶性TNF受容体の分泌を誘導する。ある実施形態において、本発明の融合タンパク質は、エンドトキシン、他のTLR作動薬などを含む作動薬により刺激された炎症細胞、内皮細胞および他の細胞による接着分子の発現を阻害する。   In certain embodiments, the fusion protein inhibits the production of cytokines such as TNFα, ΙL1β, IL6 and other inflammatory cytokines, while inflammatory cells and endotoxins, other Toll-like receptor (TLR) agonists or It induces the secretion of inhibitory molecules, such as IL1 receptor antagonists and soluble TNF receptors, by other cells stimulated by other stimuli. In certain embodiments, the fusion proteins of the invention inhibit the expression of adhesion molecules by inflammatory cells, endothelial cells and other cells stimulated by agonists including endotoxins, other TLR agonists, and the like.

ある実施形態において、融合タンパク質は、内皮細胞、炎症細胞ならびにエンドトキシン、他のTLR作動薬または他の刺激により刺激された他の細胞による、組織因子の発現を阻害する。   In certain embodiments, the fusion protein inhibits the expression of tissue factor by endothelial cells, inflammatory cells and other cells stimulated by endotoxins, other TLR agonists or other stimuli.

ある実施形態において、本発明の融合タンパク質は、炎症細胞およびエンドトキシン、他のTLR作動薬または他の刺激により刺激された他の細胞による、酸素ラジカルの産生を阻害する。   In certain embodiments, the fusion proteins of the invention inhibit the production of oxygen radicals by inflammatory cells and other cells stimulated by endotoxins, other TLR agonists or other stimuli.

ある実施形態において、融合タンパク質は、IFNγ-およびIL17を分泌するTh1およびTh17細胞の活性を阻害し、自己抗原または非自己抗原、ブドウ球菌エンテロトキシンB(Staphylococcus enterotoxin B (SEB))または有糸***促進因子、例えばCD3、CD28、フィトヘマグルチニン(PHA)またはポリボールミリステートアセテート(PMA)を含む超抗原により刺激された、抗原提示細胞の存在下または不在下で、in vitroで作製されたFoxP3-発現抑制T細胞(CD25+)、TGFβ分泌性のTh2、Tr1およびTh3細胞を誘導または維持する。   In certain embodiments, the fusion protein inhibits the activity of Th1 and Th17 cells that secrete IFNγ- and IL17, and is a self-antigen or non-self antigen, Staphylococcus enterotoxin B (SEB) or mitogenic FoxP3-expression generated in vitro in the presence or absence of antigen presenting cells, stimulated by superantigens containing factors such as CD3, CD28, phytohemagglutinin (PHA) or polyball myristate acetate (PMA) Induces or maintains suppressor T cells (CD25 +), TGFβ secreting Th2, Tr1 and Th3 cells.

ある実施形態において、融合タンパク質は、活性化Fcγ受容体の発現を阻害し、一方で、融合タンパク質は、IgG含有免疫複合体による、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの細胞の活性化を防止する抑制性Fcγ受容体の発現を誘導する。   In certain embodiments, the fusion protein inhibits expression of activated Fcγ receptor, while the fusion protein prevents activation of cells such as monocytes, macrophages and dendritic cells by IgG-containing immune complexes. Induces the expression of inhibitory Fcγ receptors.

適切な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ホモ二量体型で存在する。   In a suitable embodiment, the fusion protein of the invention exists in a homodimeric form.

一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、60kDaを超える分子量を有する。   In one embodiment, the fusion protein of the invention has a molecular weight greater than 60 kDa.

本発明の融合タンパク質は、当業者には日常的な技術により調製可能である。例えば、本発明の融合タンパク質は、連続細胞系の培養による、組換え融合タンパク質の作製を提供する技術を使用して調製可能である。例えば、本発明の融合タンパク質は、組換えDNA技術と、遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生可能である。   The fusion protein of the present invention can be prepared by one skilled in the art by routine techniques. For example, the fusion proteins of the invention can be prepared using techniques that provide for the production of recombinant fusion proteins by continuous cell line culture. For example, the fusion proteins of the present invention can be produced in host cell transfectomas using a combination of recombinant DNA technology and gene transfection methods.

例えば、本発明の融合タンパク質を発現させるために、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を、標準的分子生物学技術により調製できる。本発明の核酸分子は、好ましくは、転写制御配列、例えばプロモーターおよび場合により、3'非翻訳領域に、動作可能に連結される。本発明の核酸分子は、ベクター、例えば発現ベクターに、遺伝子が、転写および翻訳の調節配列に動作可能に連結されるように挿入することができる。発現ベクターおよび転写制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子は、発現ベクター内に、日常的な方法により挿入可能である。本発明の核酸分子またはベクターは、宿主細胞からの融合タンパク質の分泌を容易にすることができるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を、さらに含んでもよい。シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、本発明の核酸分子に動作可能に連結することができる。好ましくは、前記シグナルペプチドは、本発明の融合タンパク質のアミノ末端に位置し、したがって、前記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子の5'に位置してよい。シグナルペプチドは、サイトカインシグナルペプチドであっても、または非サイトカインタンパク質由来のシグナルペプチドであってもよい。プロモーターは、構成的であっても、または誘導性であってもよい。ベクターは、ベクター担持宿主細胞の選択のための選択可能なマーカーを含んでもよい。ベクターは、該ベクターが複製可能ベクターである場合、複製開始点を含んでもよい。   For example, to express the fusion protein of the invention, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein of the invention can be prepared by standard molecular biology techniques. The nucleic acid molecules of the invention are preferably operably linked to transcriptional control sequences, such as a promoter and optionally a 3 ′ untranslated region. The nucleic acid molecules of the invention can be inserted into vectors, such as expression vectors, such that the gene is operably linked to transcriptional and translational regulatory sequences. The expression vector and transcription control sequences are chosen to be compatible with the expression host cell used. The nucleic acid molecule encoding the fusion protein of the present invention can be inserted into the expression vector by routine methods. The nucleic acid molecules or vectors of the present invention may further comprise a nucleotide sequence encoding a signal peptide that can facilitate secretion of the fusion protein from the host cell. The nucleotide sequence encoding a signal peptide can be operably linked to a nucleic acid molecule of the invention. Preferably, the signal peptide is located at the amino terminus of the fusion protein of the invention, and thus the nucleotide sequence encoding the signal peptide may be located 5 ′ of the nucleic acid molecule encoding the fusion protein of the invention. . The signal peptide may be a cytokine signal peptide or a signal peptide derived from a non-cytokine protein. The promoter may be constitutive or inducible. The vector may include a selectable marker for selection of the vector-carrying host cell. A vector may include an origin of replication when the vector is a replicable vector.

本発明に従った融合タンパク質は、(例えば、Applied Biosystemsなどにより供給されるペプチドシンセサイザーを使用して)化学的合成により最初から合成されても、または融合タンパク質、断片または変異体をコードする核酸配列の発現により、組換え宿主細胞により産生されてもよい。変異体および断片は、好ましくは機能性、すなわち、IL4および/またはIL10の活性、好ましくはIL4およびIL10の活性を有する。   A fusion protein according to the present invention may be synthesized from scratch by chemical synthesis (eg, using a peptide synthesizer supplied by Applied Biosystems, etc.) or a nucleic acid sequence encoding a fusion protein, fragment or variant May be produced by a recombinant host cell. Variants and fragments preferably have functionality, ie IL4 and / or IL10 activity, preferably IL4 and IL10 activity.

IL4およびIL10ならびにIL4-IL10融合タンパク質の抗炎症活性、したがって機能性は、日常的な方法を使用して決定することができる。例えば、IL4およびIL10ならびにIL4-IL10融合タンパク質の機能性に関する適切なアッセイは、例えば実施例5において説明する、全血におけるリポ多糖類(LPS)誘導性サイトカイン放出(IL1、IL6、IL8、TNFα)である。   The anti-inflammatory activity and thus functionality of IL4 and IL10 and IL4-IL10 fusion proteins can be determined using routine methods. For example, suitable assays for functionality of IL4 and IL10 and IL4-IL10 fusion proteins are described in, for example, Example 5, lipopolysaccharide (LPS) -induced cytokine release (IL1, IL6, IL8, TNFα) in whole blood It is.

別の態様において、上記の融合タンパク質のいずれかをコードする単離核酸配列、例えば、cDNA、ゲノムDNAおよびRNA配列を提供する。遺伝コードの縮重のために、さまざまな核酸配列が同じアミノ酸配列をコードすることができる。本発明の融合タンパク質をコードする任意の核酸配列は、本明細書において「IL4-IL10融合タンパク質コード核酸配列」と称される。提供される核酸配列は、組換え、人工または合成の核酸配列を含む。配列がDNA配列を表しているが、RNAについて言及している場合、RNA分子の実際の塩基配列は、チミン(T)がウラシル(U)に置き換えられる違いがあるが、同一であることは理解されている。本発明の核酸配列は、本発明のIL4-IL10融合タンパク質の発現にとって、これらのタンパク質の産生または遺伝子療法目的のいずれかにとって、特に有用である。   In another embodiment, isolated nucleic acid sequences encoding any of the fusion proteins described above are provided, such as cDNA, genomic DNA and RNA sequences. Because of the degeneracy of the genetic code, various nucleic acid sequences can encode the same amino acid sequence. Any nucleic acid sequence that encodes a fusion protein of the invention is referred to herein as an “IL4-IL10 fusion protein-encoding nucleic acid sequence”. Nucleic acid sequences provided include recombinant, artificial or synthetic nucleic acid sequences. The sequence represents a DNA sequence, but when referring to RNA, it is understood that the actual base sequence of the RNA molecule is the same, with the difference that thymine (T) is replaced by uracil (U) Has been. The nucleic acid sequences of the present invention are particularly useful for expression of the IL4-IL10 fusion proteins of the present invention, either for the production of these proteins or for gene therapy purposes.

本発明のIL4-IL10融合タンパク質をコードする核酸配列、特にDNA配列は、発現ベクターに挿入され、(大量の)IL4-IL10融合タンパク質を産生することができる。適切なベクターとしては、限定するものではないが、線形の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、RNAベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターの限定されない例としては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。   The nucleic acid sequence encoding the IL4-IL10 fusion protein of the present invention, in particular the DNA sequence, can be inserted into an expression vector to produce a (large amount) IL4-IL10 fusion protein. Suitable vectors include but are not limited to linear nucleic acids, plasmids, phagemids, cosmids, RNA vectors, viral vectors, and the like. Non-limiting examples of viral vectors include retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses.

哺乳動物宿主細胞の発現に関する好ましい制御配列としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を対象とするウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーが挙げられる。代替的には、非ウイルス制御配列、例えばユビキチンプロモーターが使用できる。   Preferred regulatory sequences for expression of mammalian host cells include viral elements directed to high levels of protein expression in mammalian cells, such as cytomegalovirus (CMV), simian virus 40 (SV40), adenovirus (e.g., Adenovirus major late promoter (AdMLP)) and promoters and / or enhancers derived from polyoma. Alternatively, non-viral regulatory sequences such as the ubiquitin promoter can be used.

IL4-IL10融合タンパク質および制御配列をコードする核酸分子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列、(例えば複製開始点)および選択可能なマーカー遺伝子を担持してよい。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする(例えば、US 4,399,216、US 4,634,665およびUS 5,179,017、すべてAxelらによる、を参照されたい)。例えば、通常、選択可能なマーカー遺伝子は、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサーなどの薬剤に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞にもたらす。好ましい選択可能なマーカー遺伝子としては、ジヒドロホレートレダクターゼ(DHFR)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅を有するdhfr-宿主細胞に使用)およびneo遺伝子(G418選択用)が挙げられる。最終的に、組換え発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列に加えて含有することができる。   In addition to the nucleic acid molecules encoding the IL4-IL10 fusion protein and control sequences, the recombinant expression vectors of the invention comprise additional sequences, such as sequences that control replication of the vector in host cells (e.g., origins of replication) and It may carry a selectable marker gene. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced (see, eg, US 4,399,216, US 4,634,665 and US 5,179,017, all by Axel et al.). For example, typically a selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexer, on a host cell into which the vector has been introduced. Preferred selectable marker genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (used for dhfr-host cells with methotrexate selection / amplification) and the neo gene (for G418 selection). Finally, the recombinant expression vector can contain a gene encoding a glycosyltransferase in addition to the nucleic acid sequence encoding the fusion protein of the invention.

別の態様において、本発明は、本発明の核酸配列を含む宿主細胞または本発明の核酸配列を含む核酸構築体もしくはベクターに関する。宿主細胞は、任意の宿主細胞であってよい。宿主細胞は、原核細胞および真核細胞から選択することができる。宿主細胞はまた、原核細胞系または真核細胞系などの細胞系であってもよい。宿主細胞は、好ましくは、動物の細胞または細胞系、例えば、哺乳動物の細胞または細胞系である。   In another aspect, the invention relates to a host cell comprising a nucleic acid sequence of the invention or a nucleic acid construct or vector comprising a nucleic acid sequence of the invention. The host cell can be any host cell. The host cell can be selected from prokaryotic cells and eukaryotic cells. The host cell may also be a cell line such as a prokaryotic or eukaryotic cell line. The host cell is preferably an animal cell or cell line, eg, a mammalian cell or cell line.

一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、真核細胞、例えば哺乳動物宿主細胞において発現される。本発明の組換えIL4-IL10融合タンパク質の発現にとって好ましい哺乳動物宿主細胞としては、CHO細胞(dhfr-CHO細胞を含む、(Urlaubら、1980年)に記載、DHFR選択可能マーカーと共に使用される、NS/0骨髄腫細胞、COS細胞、HEK293細胞およびSP2.0細胞が挙げられる。IL4-IL10融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入される場合、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞において融合タンパク質を発現させるために十分な期間、またはより好ましくは、融合タンパク質が、宿主細胞が成長する培養培地へ分泌されるために十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生され得る。本発明の融合タンパク質は、宿主細胞が成長する培養培地から回収できる、および/または培養培地から、標準的なタンパク質精製方法を使用して精製することができる。   In one embodiment, the fusion proteins of the invention are expressed in eukaryotic cells, such as mammalian host cells. Preferred mammalian host cells for expression of the recombinant IL4-IL10 fusion protein of the present invention include CHO cells (including dhfr-CHO cells (Urlaub et al., 1980), used in conjunction with a DHFR selectable marker, NS / 0 myeloma cells, COS cells, HEK293 cells, and SP2.0 cells, and when a recombinant expression vector containing a nucleic acid sequence encoding an IL4-IL10 fusion protein is introduced into a mammalian host cell, The fusion protein of the invention is cultured in the host cell for a period of time sufficient to express the fusion protein in the host cell, or more preferably for a period of time sufficient for the fusion protein to be secreted into the culture medium in which the host cell is grown. The fusion protein of the invention can be recovered from the culture medium in which the host cells are grown and / or from the culture medium using standard protein purification Law can be purified using.

代替的には、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列は、例えばE.coliなどの微生物を含む原核細胞、藻類ならびに昆虫細胞を含む、他の発現系において発現可能である。さらに、本発明の融合タンパク質は、トランスジェニックの非ヒト動物、例えばヒツジおよびウサギの乳もしくはメンドリの卵またはトランスジェニック植物において産生可能である。   Alternatively, the nucleic acid sequence encoding the fusion protein of the invention can be expressed in other expression systems including, for example, prokaryotic cells including microorganisms such as E. coli, algae and insect cells. Furthermore, the fusion proteins of the invention can be produced in transgenic non-human animals such as sheep and rabbit milk or hen's eggs or transgenic plants.

本発明の核酸配列の宿主細胞への導入は、当分野において公知の、任意の標準的な技術により実施できる。本発明の融合タンパク質の発現に関して、融合タンパク質をコードする発現ベクター(複数可)は、標準的技術により、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。「トランスフェクション」という用語のさまざまな型は、外因性DNAを原核性または真核性の宿主細胞に導入するために一般的に使用される広範囲の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクションおよびフリーズドライ法トランスフェクションなどを包含することが意図される。本発明の融合タンパク質を分泌する細胞系は、培養液上清を、融合タンパク質の存在に関してアッセイすることによって、同定することができる。好ましいスクリーニング手順は、2つの連続ステップを含み、第1は、融合タンパク質を分泌する細胞系の同定であり、第2は、LPSまたは他のToll様受容体作動薬、グリコシル化パターンなどにより刺激された血液細胞による、サイトカインの産生を阻害する融合タンパク質の能力などの融合タンパク質の質の決定である。   Introduction of a nucleic acid sequence of the invention into a host cell can be performed by any standard technique known in the art. For expression of the fusion protein of the invention, the expression vector (s) encoding the fusion protein can be transfected into host cells by standard techniques. Various forms of the term “transfection” include a wide range of techniques commonly used to introduce exogenous DNA into prokaryotic or eukaryotic host cells, eg, electroporation, calcium phosphate precipitation, DEAE -It is intended to encompass dextran transfection, lipofectamine transfection, freeze-dry transfection and the like. A cell line secreting the fusion protein of the invention can be identified by assaying the culture supernatant for the presence of the fusion protein. A preferred screening procedure involves two sequential steps, the first is the identification of cell lines that secrete the fusion protein, and the second is stimulated by LPS or other Toll-like receptor agonists, glycosylation patterns, etc. The determination of the quality of the fusion protein, such as the ability of the fusion protein to inhibit cytokine production by blood cells.

宿主細胞における最適な発現のために、IL4-IL10融合タンパク質コードDNA配列は、宿主細胞遺伝子において最も好ましいコドン使用を適合させることにより、コドンを最適化できる。宿主細胞に好ましいものにコドン使用を改変するためのいくつかの技術は、特許および化学の文献に見出すことができる。コドン使用改変の厳密な方法は、本発明にとって重要ではない。   For optimal expression in a host cell, the IL4-IL10 fusion protein-encoding DNA sequence can be codon optimized by adapting the most preferred codon usage in the host cell gene. Several techniques for modifying codon usage to be preferred for host cells can be found in the patent and chemistry literature. The exact method of codon usage modification is not critical to the present invention.

本発明の別の実施形態において、PCRのプライマーおよび/またはプローブならびにIL4-IL10融合タンパク質をコードするDNAまたはRNA配列を検出するためのキットを提供する。IL4-IL10融合タンパク質コードDNAを試料から増幅するために、縮重プライマーペアまたは特異的PCRプライマーペアを合成することができる(DieffenbachおよびDveksler(1995年) PCR Primer: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory PressならびにMcPhersonら(2000年) PCR-Basics: From Background to Bench、第1版、Springer Verlag、Germanyを参照されたい)。例えば、IL4-IL10融合タンパク質コード核酸配列の、9、10、11、12、13、14、15、16、18またはそれを超える隣接するヌクレオチドの任意のストレッチ(または相補鎖)を、プライマーまたはプローブとして使用できる。同様に、IL4-IL10融合タンパク質コード核酸配列のDNA断片を、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用できる。IL4-IL10融合タンパク質コード核酸配列の検出キットは、IL4-IL10融合タンパク質コード核酸配列に特異的なプライマーおよび/またはIL4-IL10融合タンパク質コード核酸配列に特異的なプローブならびにプライマーまたはプローブを使用して、試料中のIL4-IL10融合タンパク質コード核酸配列を特異的に検出するための関連プロトコルを含むことができる。このような検出キットは、例えば、宿主細胞が、本発明の核酸配列をコードする特異的IL4-IL10融合タンパク質により形質転換されていてもいなくても、決定に使用することができる。遺伝コードの縮重のため、いくつかのアミノ酸コドンは、タンパク質のアミノ酸配列を変化させずに、他と置き換えることが可能である。   In another embodiment of the invention, kits for detecting PCR primers and / or probes and DNA or RNA sequences encoding IL4-IL10 fusion proteins are provided. Degenerate primer pairs or specific PCR primer pairs can be synthesized to amplify IL4-IL10 fusion protein-encoding DNA from a sample (Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press and McPherson et al. (2000) PCR-Basics: From Background to Bench, 1st edition, Springer Verlag, Germany). For example, any stretch (or complementary strand) of 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18 or more contiguous nucleotides of the IL4-IL10 fusion protein-encoding nucleic acid sequence, primer or probe Can be used as Similarly, DNA fragments of IL4-IL10 fusion protein-encoding nucleic acid sequences can be used as hybridization probes. IL4-IL10 fusion protein-encoding nucleic acid sequence detection kit uses primers specific for IL4-IL10 fusion protein-encoding nucleic acid sequences and / or probes specific for IL4-IL10 fusion protein-encoding nucleic acid sequences and primers or probes A related protocol for specifically detecting an IL4-IL10 fusion protein-encoding nucleic acid sequence in a sample can be included. Such a detection kit can be used for determination, for example, whether or not the host cell is transformed with a specific IL4-IL10 fusion protein encoding the nucleic acid sequence of the present invention. Because of the degeneracy of the genetic code, some amino acid codons can be replaced with others without changing the amino acid sequence of the protein.

ある態様において、本発明は、IL4-IL10融合タンパク質の作製方法に関係し、前記方法は、本発明の宿主細胞を、IL4-IL10融合タンパク質の産生を可能とする条件下で培養するステップ、および場合により、該融合タンパク質を回収するステップを含む。当業者は、IL4-IL10融合タンパク質の産生を可能とする条件を、日常的に選択できるであろう。さらに、当業者は、日常的な方法を使用して、産生された融合タンパク質を回収でき、この方法は、限定するものではないが、クロマトグラフィー法(限定するものではないが、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イムノアフィニティクロマトグラフィー、金属結合などを含む)、免疫沈降法、HPLC、超遠心分離、沈降法および示差的可溶化ならびに抽出を含む。上述のように、融合タンパク質の回収または精製は、例えば、His-タグを融合タンパク質に付加することにより容易にすることができる。   In certain embodiments, the invention relates to a method of making an IL4-IL10 fusion protein, the method comprising culturing a host cell of the invention under conditions that permit production of the IL4-IL10 fusion protein; and Optionally, recovering the fusion protein. One of ordinary skill in the art will be able to routinely select conditions that permit production of the IL4-IL10 fusion protein. Furthermore, those skilled in the art can recover the produced fusion protein using routine methods, including but not limited to chromatographic methods (including but not limited to size exclusion chromatography). , Including hydrophobic interaction chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, immunoaffinity chromatography, metal binding, etc.), immunoprecipitation, HPLC, ultracentrifugation, sedimentation and differential solubilization and extraction . As described above, recovery or purification of the fusion protein can be facilitated, for example, by adding a His-tag to the fusion protein.

医薬組成物
ある態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質および医薬として許容される担体を含む医薬組成物に関する。 Pharmaceutical Compositions In certain embodiments, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the fusion protein of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

医薬組成物は、医薬として許容される担体または希釈剤ならびに従来型技術(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1995年に記載)に従った、任意の他の公知のアジュバントおよび賦形剤と共に製剤化することができる。   Pharmaceutical compositions are described in pharmaceutically acceptable carriers or diluents and conventional techniques (e.g., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, edited by Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995). And can be formulated with any other known adjuvants and excipients.

「医薬として許容される担体」という用語は、本質的に非毒性かつ非治療性である担体または賦形剤に関する。このような賦形剤の例は、限定するものではないが、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース液およびハンクス液である。非水性賦形剤、例えば、不揮発性油およびオレイン酸エチルもまた使用可能である。好ましい賦形剤は、生理食塩水中5%デキストロースである。賦形剤は、少量の添加剤、例えば、バッファーおよび保存剤を含む等張性および化学的安定性を強化する物質を含有してもよい。   The term “pharmaceutically acceptable carrier” relates to a carrier or excipient that is essentially non-toxic and non-therapeutic. Examples of such excipients include, but are not limited to, saline, Ringer's solution, dextrose solution, and Hank's solution. Nonaqueous excipients such as fixed oils and ethyl oleate can also be used. A preferred excipient is 5% dextrose in saline. Excipients may contain minor amounts of additives such as substances that enhance isotonicity and chemical stability, including buffers and preservatives.

医薬組成物は、任意の適切な経路および方式で投与することができる。当業者には明らかであろうように、投与の経路および/または方式は、所望の結果に依存して変動するものである。   The pharmaceutical composition can be administered by any suitable route and manner. As will be apparent to those skilled in the art, the route and / or mode of administration will vary depending on the desired result.

本発明に従った医薬組成物は、経口、局所、非経口、舌下、経皮などの任意の経路による、または吸入による投与のための、日常的な手順に従って製剤化することができる。組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、口内錠、クリームまたは液体調製剤、例えば、経口または滅菌非経口の溶液もしくは懸濁液の形態であってよく、またはスプレー、エアロゾルの形態もしくは吸入用の、他の従来型の方法であってよい。   The pharmaceutical compositions according to the invention can be formulated according to routine procedures for administration by any route, such as oral, topical, parenteral, sublingual, transdermal or by inhalation. The composition may be in the form of tablets, capsules, powders, granules, lozenges, creams or liquid preparations such as oral or sterile parenteral solutions or suspensions, or for sprays, aerosol forms or for inhalation Other conventional methods may be used.

本発明の医薬組成物は、経口、経鼻、局所(頬側および舌下を含む)、直腸、膣および/または非経口投与に適切な組成物を含む。   The pharmaceutical compositions of the present invention include those suitable for oral, nasal, topical (including buccal and sublingual), rectal, vaginal and / or parenteral administration.

ある実施形態において、医薬組成物は、非経口的に投与される。   In certain embodiments, the pharmaceutical composition is administered parenterally.

「非経口投与」および「非経口的に投与される」という用語は、本明細書において使用する場合、腸内投与および局所投与以外の投与方式を意味し、通常は注射により、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含む。   The terms “parenteral administration” and “administered parenterally”, as used herein, refer to modes of administration other than enteral and topical administration, usually by injection and are not intended to be limiting. Intravenous, intramuscular, intraarterial, intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, epidermal, intraarticular, subcapsular, subarachnoid, intrathecal Including epidural and intrasternal injections and infusions.

ある実施形態において、医薬組成物は、静脈内または皮下の注射または注入により投与される。   In certain embodiments, the pharmaceutical composition is administered by intravenous or subcutaneous injection or infusion.

ある実施形態において、本発明の融合タンパク質は、結晶形で、皮下注射により投与される。   In certain embodiments, the fusion proteins of the invention are administered in crystalline form by subcutaneous injection.

本明細書において使用する場合、「医薬として許容される担体」は、生理学的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤、酸化防止剤および吸収遅延剤などを含む。   As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” refers to any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, antioxidants and the like that are physiologically compatible. Contains absorption retardants, etc.

医薬として許容される担体は、滅菌の水溶液または分散液および滅菌の注射可能溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末を含む。医薬的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野において周知である。従来型の媒体または薬剤のいずれかが、活性化合物と非相溶性である場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるこれらの使用が企図される。好ましくは、担体は、非経口投与、例えば静脈内または皮下の注射または注入に適切である。   Pharmaceutically acceptable carriers include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art. Their use in the pharmaceutical compositions of the present invention is contemplated unless either conventional media or drugs are incompatible with the active compound. Preferably, the carrier is suitable for parenteral administration, eg intravenous or subcutaneous injection or infusion.

医薬組成物は、通常、滅菌であり、製造および保存の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適切な他の秩序構造として製剤化できる。本発明の医薬組成物に採用可能な、適切な水性または非水性の担体の例としては、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、など)およびこれらの適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合、必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤の使用により維持することができる。   Pharmaceutical compositions are usually sterile and must be stable under the conditions of manufacture and storage. The composition can be formulated as a solution, microemulsion, liposome, or other ordered structure suitable to high drug concentration. Examples of suitable aqueous or non-aqueous carriers that can be employed in the pharmaceutical compositions of the present invention include water, ethanol, polyols (eg, glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof, olives Vegetable oils such as oils, and injectable organic esters such as ethyl oleate. The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating material such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants.

注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば一ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによりもたらすことができる。   Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by including in the composition an agent that delays absorption, for example, monostearate salts and gelatin.

滅菌注射可能溶液は、適切な溶媒中の所要量の活性化合物と、例えば上に列挙した原料の1つまたは組み合わせとを、必要に応じて組み込み、続いて滅菌精密ろ過を行うことによって調製できる。概して、分散液は、活性化合物を、ベースとなる分散媒および必要な他の原料、例えば上に列挙する原料を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製用の、滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性原料と、任意の追加の所望の原料の粉末とを、これらのあらかじめ滅菌ろ過された溶液から生じさせる、真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。   Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the required amount of the active compound in a suitable solvent and, for example, one or a combination of the above-listed ingredients as required, followed by sterile microfiltration. Generally, dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients, such as those listed above. For sterile powders, for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred method of preparation is to dry the active ingredient and any additional desired ingredient powders from these pre-sterilized filtered solutions. And freeze-drying (freeze-drying).

投与の経路に依存して、活性化合物、すなわちIL4-IL10融合タンパク質は、これを、酸の作用および化合物を不活性化できる他の天然条件から保護する材料でコーティングされてもよい。例えば、化合物は、適切な担体、例えばリポソームの中で、対象に投与されてもよい。リポソームは、水中油中水型CGFエマルジョンおよび従来型のリポソーム(Strejanら、1984年)を含む。   Depending on the route of administration, the active compound, ie the IL4-IL10 fusion protein, may be coated with a material that protects it from the action of acids and other natural conditions that can inactivate the compound. For example, the compound may be administered to the subject in a suitable carrier, such as a liposome. Liposomes include water-in-oil-in-water CGF emulsions and conventional liposomes (Strejan et al., 1984).

本発明の融合タンパク質は、急速な放出から保護する担体と一緒に、例えば、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤として調製することができる。生分解性、生体適合性のポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用可能である。このような製剤の調製方法は、一般に、当業者には公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J.R. Robinson編、Marcel Dekker、Inc.、New York、1978年を参照されたい。   The fusion proteins of the invention can be prepared as a controlled release formulation, including, for example, implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems, with carriers that protect against rapid release. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. Methods for preparing such formulations are generally known to those skilled in the art. See, for example, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, edited by J.R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

投薬計画は、最適な所望の応答(例えば治療応答)を提供するように調整可能である。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかに分割された用量を、時間をかけて投与してもよく、または用量を、治療状況の緊急性により示されるように、比例的に減少または増加してもよい。これは、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形に製剤化することが特に有用である。単位剤形は、本明細書において使用する場合、治療される対象に対して単位投薬量として適した、物理的に個別の単位を指し、個々の単位が、所望の治療効果を生み出すために計算された、あらかじめ決められた量の活性化合物を、必要な医薬担体を伴って含有する。本発明の単位剤形の仕様は、(a)活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに(b)このような活性化合物を個体における感受性の治療のために配合する場合の、当分野において固有の制限、に影響され、直接依存する。   Dosage regimens can be adjusted to provide the optimum desired response (eg, a therapeutic response). For example, a single bolus may be administered, a divided dose may be administered over time, or the dose may be reduced proportionally as indicated by the urgency of the treatment situation Or it may increase. It is particularly useful to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Unit dosage form, as used herein, refers to a physically discrete unit suitable as a unit dosage for the subject being treated, with each unit being calculated to produce the desired therapeutic effect. Containing a predetermined amount of the active compound together with the required pharmaceutical carrier. The specifications for the unit dosage forms of the present invention include: (a) the specific characteristics of the active compound and the specific therapeutic effect to be achieved, and (b) when such an active compound is formulated for the treatment of susceptibility in an individual. Affected by and directly dependent on the limitations inherent in the field.

本発明の医薬組成物中のIL4-IL10融合タンパク質の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物および投与方式に対する所望の治療応答を達成するために有効であり、患者にとって毒性でない、IL4-IL10融合タンパク質の量(「有効量」)を得るために変動してよい。選択された投薬量レベルは、用いる特定の本発明の組成物の活性、投与経路、投与時間、排出速度、治療期間、用いる特定の組成物と併用する他の薬物、化合物および/または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、一般的健康および既往病歴ならびに医療分野において周知の因子などを含む、さまざまな薬物動態因子に依存するものと思われる。   The actual dosage level of IL4-IL10 fusion protein in the pharmaceutical composition of the invention is effective to achieve the desired therapeutic response for the particular patient, composition and mode of administration, and is not toxic to the patient. -It may be varied to obtain an amount of IL10 fusion protein ("effective amount"). The selected dosage level will depend on the activity, route of administration, time of administration, rate of elimination, duration of treatment, other drugs, compounds and / or materials used in combination with the particular composition used, treatment It is likely to depend on a variety of pharmacokinetic factors, including the age, sex, weight, condition, general health and medical history of the patient being treated, and factors well known in the medical field.

一実施形態において、本発明のIL4-IL10融合タンパク質は、静脈内注射または短期注入として与えることができ、別の実施形態において、本発明のIL4-IL10融合タンパク質は、毒性の副作用を低減するために、長期にわたる、例えば24時間を超える緩慢な連続注入により投与される。   In one embodiment, the IL4-IL10 fusion protein of the invention can be given as intravenous injection or short-term infusion, and in another embodiment, the IL4-IL10 fusion protein of the invention reduces toxic side effects. And administered by slow continuous infusion over a long period of time, for example over 24 hours.

さらに別の実施形態において、本発明のIL4-IL10融合タンパク質は、維持療法として、例えば、6カ月以上の期間、週に1回投与することもできる。   In yet another embodiment, the IL4-IL10 fusion protein of the invention can be administered as a maintenance therapy, eg, once a week for a period of 6 months or longer.

治療的使用
さらなる態様において、本発明は、医薬品としての使用のための、本発明の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。 Therapeutic Use In a further aspect, the present invention relates to a fusion protein of the invention or a pharmaceutical composition comprising said fusion protein for use as a medicament.

ある態様において、本発明は、変形性関節症の予防または治療における使用のための、本発明の融合タンパク質はまたは該融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。特に、本発明の融合タンパク質は、軟骨保護活性を有することが見出された。したがって、融合タンパク質は、軟骨破壊、特に変形性関節症の予防および治療に使用することができる。さらに、イヌ変形性関節症モデルにおいて、本発明の融合タンパク質を与えた犬が、本発明の融合タンパク質を与えなかった犬と比較して、痛みが有意に少なくなったことが見出された。したがって、本発明の融合タンパク質は、変形性関節症およびその付随する慢性疼痛の予防または治療(軟骨破壊の予防または治療)に特に有用であると思われる。   In certain embodiments, the invention relates to a fusion protein of the invention or a pharmaceutical composition comprising the fusion protein for use in the prevention or treatment of osteoarthritis. In particular, the fusion protein of the present invention has been found to have cartilage protective activity. Thus, the fusion protein can be used for the prevention and treatment of cartilage destruction, especially osteoarthritis. Furthermore, it was found that in dog osteoarthritis models, dogs given the fusion protein of the invention had significantly less pain compared to dogs not given the fusion protein of the invention. Therefore, the fusion protein of the present invention seems to be particularly useful for the prevention or treatment of osteoarthritis and its associated chronic pain (prevention or treatment of cartilage destruction).

さらなる態様において、本発明は、変形性関節症、慢性疼痛、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化、および/またはリンパ球増殖により特徴付けられる病態の予防または治療における使用のための、本発明の融合タンパク質または該融合タンパクを含む医薬組成物に関する。   In a further aspect, the present invention relates to a method for use in the prevention or treatment of a pathological condition characterized by osteoarthritis, chronic pain, local or systemic inflammation, immune activation, and / or lymphocyte proliferation. The invention relates to a fusion protein of the invention or a pharmaceutical composition comprising the fusion protein.

ある実施形態において、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化および/またはリンパ球増殖により特徴付けられる前記病態は、敗血症、成人性呼吸促迫症候群、同種および異種移植、皮膚炎、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、アレルギー、乾癬、強直性脊椎関節炎、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチなどの自己免疫疾患、糸球体腎炎、免疫複合体誘導性および他の型の脈管炎、多発性硬化症、シェーグレン病、痛風、非ホジキンリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病などのリンパ球増殖性疾患、熱傷、多発性損傷、脳卒中、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、糖尿病、体外透析および血液酸素化、虚血性再灌流障害、サイトカインもしくは治療用モノクローナル抗体のin vivo投与により誘導される毒性、慢性疼痛症候群ならびに神経障害性および/または炎症性の疼痛からなる群から選択される。   In certain embodiments, the pathological condition characterized by local or systemic inflammation, immune activation and / or lymphocyte proliferation is sepsis, adult respiratory distress syndrome, allogeneic and xenograft, dermatitis, inflammatory bowel disease , Sarcoidosis, allergies, psoriasis, ankylosing spondyloarthritis, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, immune complex-induced and other types of vasculitis, multiple sclerosis, Sjogren's disease, Lymphoproliferative diseases such as gout, non-Hodgkin lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia, burns, multiple injuries, stroke, myocardial infarction, atherosclerosis, diabetes, in vitro dialysis and blood oxygenation, ischemic reperfusion Injury, toxicity induced by in vivo administration of cytokines or therapeutic monoclonal antibodies, chronic pain syndrome It is selected from the group consisting of neuropathic and / or inflammatory pain each time.

ある実施形態において、前記病態は、疼痛により特徴付けられ、炎症性疼痛および神経障害性疼痛から選択することができる。   In certain embodiments, the condition is characterized by pain and can be selected from inflammatory pain and neuropathic pain.

別の態様において、本発明は、哺乳動物、例えばヒトにおける、IL10が適応となる臨床状態の予防または治療における使用のための、本発明の融合タンパク質を対象とする。   In another embodiment, the present invention is directed to a fusion protein of the present invention for use in the prevention or treatment of a clinical condition to which IL10 is indicated in a mammal, eg, a human.

さらなる態様において、本発明は、哺乳動物、例えばヒトにおける、IL4が適応となる臨床状態の予防または治療における使用のための、本発明の融合タンパク質を対象とする。   In a further aspect, the present invention is directed to a fusion protein of the present invention for use in the prevention or treatment of a clinical condition to which IL4 is indicated in a mammal, eg, a human.

本発明のある実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、炎症促進性サイトカインおよび他の炎症性メディエーターの産生阻害が有益である疾患または障害の、予防または治療に使用される。   In certain embodiments of the invention, the fusion polypeptides of the invention are used for the prevention or treatment of diseases or disorders in which production inhibition of pro-inflammatory cytokines and other inflammatory mediators is beneficial.

さらに別の態様において、本発明は、炎症促進性サイトカインおよび他の炎症性メディエーターの産生阻害が有益な効果を有する疾患または障害を予防または治療する、本発明の融合タンパク質を、該疾患または障害の治療または予防に有効な量で、それらを必要とする対象に投与するステップを含む方法に関する。   In yet another aspect, the present invention provides a fusion protein of the invention for preventing or treating a disease or disorder in which production inhibition of pro-inflammatory cytokines and other inflammatory mediators has a beneficial effect, It relates to a method comprising the step of administering to a subject in need thereof a therapeutically or prophylactically effective amount.

一実施形態において、このような疾患または障害は、炎症促進性サイトカイン、例えばTNF、IL1、IL6など、ケモカイン、例えばIL8など、ならびに他の炎症性メディエーターの産生により媒介される炎症性疾患である。   In one embodiment, such a disease or disorder is an inflammatory disease mediated by the production of pro-inflammatory cytokines such as TNF, IL1, IL6, chemokines such as IL8, and other inflammatory mediators.

一実施形態に従って、本明細書において教示される融合タンパク質は、マクロファージ、単球、T-リンパ球および他の細胞などの細胞による、サイトカインおよび他の炎症性メディエーターの産生および放出を阻害するために使用できる。結果として、本発明の融合タンパク質は、これらの細胞によるin vivoのサイトカインおよび他の炎症性メディエーターの放出を阻害することにより、炎症反応を抑える医薬品の調製に使用することができる。本発明の融合タンパク質は、独立型の薬物としてまたは他の薬物と組み合わせて使用できる。   According to one embodiment, the fusion proteins taught herein are for inhibiting the production and release of cytokines and other inflammatory mediators by cells such as macrophages, monocytes, T-lymphocytes and other cells. Can be used. As a result, the fusion proteins of the present invention can be used in the preparation of pharmaceuticals that suppress the inflammatory response by inhibiting the release of cytokines and other inflammatory mediators in vivo by these cells. The fusion proteins of the invention can be used as stand-alone drugs or in combination with other drugs.

治療(予防的または治療的)は、本発明の融合タンパク質を、非経口に、好ましくは静脈内、筋肉内、髄腔内、硬膜外、脊髄内または皮下に投与するステップからなってよい。しかし、上に引用した融合タンパク質を含む医薬組成物に関して上述の他の投与経路もまた、採用可能である。用量および投与計画は、目的とする炎症性サイトカインの産生および放出の阻害の程度に依存し得る。通常、与える融合タンパク質の量は、0.5μgから1 mg /kg体重の範囲であろう。投薬量は、生体試料における投与に対する、循環するサイトカイン(IL10、IL4)の量を測定することにより決定または調整できる。   Treatment (prophylactic or therapeutic) may consist of administering the fusion protein of the invention parenterally, preferably intravenously, intramuscularly, intrathecally, epidurally, intrathecally or subcutaneously. However, other routes of administration as described above for pharmaceutical compositions comprising the fusion protein cited above can also be employed. The dose and dosing regimen may depend on the degree of inhibition of production and release of the desired inflammatory cytokine. Usually, the amount of fusion protein given will range from 0.5 μg to 1 mg / kg body weight. The dosage can be determined or adjusted by measuring the amount of circulating cytokines (IL10, IL4) relative to administration in a biological sample.

非経口投与に関して、融合タンパク質は、好ましくは、医薬として許容される非経口ビヒクルと組み合わせた、注射可能な形態で製剤化される。このようなビヒクルは当分野において周知であり、例としては、生理食塩水、デキストロース溶液、リンゲル液および少量のヒト血清アルブミンを含有する溶液が挙げられる。通常、本発明の融合タンパク質は、このようなビヒクル中で、約50μgから約100mg/mlの濃度で製剤化することができる。本発明の一実施形態において、融合タンパク質は、静脈内注射により投与される。   For parenteral administration, the fusion protein is preferably formulated in an injectable form in combination with a pharmaceutically acceptable parenteral vehicle. Such vehicles are well known in the art and examples include saline, dextrose solution, Ringer's solution and a solution containing a small amount of human serum albumin. In general, the fusion proteins of the invention can be formulated in such vehicles at a concentration of about 50 μg to about 100 mg / ml. In one embodiment of the invention, the fusion protein is administered by intravenous injection.

さらなる投与の詳細は、上の本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物に関する項で説明している。   Further administration details are described above in the section relating to pharmaceutical compositions comprising the fusion protein of the invention.

遺伝子療法
本発明の核酸構築体またはベクターは、上記の病態の治療のための、遺伝子療法薬として使用することができる。本発明の一実施形態において、アデノ随伴ウイルスが、遺伝子療法ベクターとして使用される。 Gene Therapy The nucleic acid construct or vector of the present invention can be used as a gene therapy drug for the treatment of the above-mentioned pathological conditions. In one embodiment of the invention, adeno-associated virus is used as a gene therapy vector.

したがって、ある態様において、本発明は、変形性関節症、慢性疼痛、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化、および/またはリンパ球増殖により特徴付けられる病態の予防または治療における使用のための、上記の遺伝子療法ベクターを対象とし、好ましくは、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化および/またはリンパ球増殖により特徴付けられる前記病態は、敗血症、成人性呼吸促迫症候群、同種および異種移植、皮膚炎、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、アレルギー、乾癬、強直性脊椎関節炎、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチなどの自己免疫疾患、糸球体腎炎、免疫複合体誘導性および他の型の脈管炎、多発性硬化症、シェーグレン病、痛風、非ホジキンリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病などのリンパ球増殖性疾患、熱傷、多発性損傷、脳卒中、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、糖尿病、体外透析および血液酸素化、虚血性再灌流障害、サイトカインもしくは治療用モノクローナル抗体のin vivo投与により誘導される毒性、慢性疼痛症候群ならびに神経障害性および/または炎症性の疼痛からなる群から選択される。   Thus, in certain embodiments, the present invention is for use in the prevention or treatment of pathological conditions characterized by osteoarthritis, chronic pain, local or systemic inflammation, immune activation, and / or lymphocyte proliferation. , Directed to the gene therapy vectors described above, preferably characterized by local or systemic inflammation, immune activation and / or lymphocyte proliferation are sepsis, adult respiratory distress syndrome, allogeneic and xenotransplantation , Dermatitis, inflammatory bowel disease, sarcoidosis, allergy, psoriasis, ankylosing spondyloarthritis, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, immune complex-induced and other types of vasculitis, Lymphs such as multiple sclerosis, Sjogren's disease, gout, non-Hodgkin lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia Toxicity induced by in vivo administration of proliferative disease, burns, multiple injuries, stroke, myocardial infarction, atherosclerosis, diabetes, extracorporeal dialysis and blood oxygenation, ischemic reperfusion injury, cytokines or therapeutic monoclonal antibodies Selected from the group consisting of chronic pain syndrome and neuropathic and / or inflammatory pain.

次に、本発明を、下記の実施例を参照しながら例示する、下記の実施例は特に有利な実施形態を説明している。しかし、これらの実施形態は例示であり、本発明を限定するものとして解釈するべきではないことに留意しなければならない。   The invention will now be illustrated with reference to the following examples, which illustrate particularly advantageous embodiments. However, it should be noted that these embodiments are illustrative and should not be construed as limiting the invention.

配列リスト
配列番号1-IL4のアミノ酸配列
Amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-IL4

配列番号2-IL10のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 2-IL10 amino acid sequence

配列番号:3-リンカーのアミノ酸配列
SEQ ID NO: 3-amino acid sequence of linker

配列番号:4-IL4-IL10融合タンパク質のアミノ酸配列(リンカー配列は下線を引いてあり、IL4は、IL10のN末端に位置する)
SEQ ID NO: 4-IL4-IL10 fusion protein amino acid sequence (linker sequence is underlined, IL4 is located at the N-terminus of IL10)

図1は、IL4-IL10融合タンパク質をトランスフェクトしたHEK293細胞から得たIL4-IL10融合タンパク質のレベルを示す図である。IL4-IL10融合タンパク質に関するトランス遺伝子を担持するpUPE発現ベクターをトランスフェクトしたHEK293細胞の上清を、サンドイッチELISAアッセイで、IL4(A)およびIL10(B)に関して、製造業者の取扱説明書に従って試験した。結果は、光学密度(OD)対培養上清の希釈として表した。FIG. 1 shows the level of IL4-IL10 fusion protein obtained from HEK293 cells transfected with IL4-IL10 fusion protein. The supernatant of HEK293 cells transfected with a pUPE expression vector carrying a transgene for IL4-IL10 fusion protein was tested in a sandwich ELISA assay for IL4 (A) and IL10 (B) according to the manufacturer's instructions. . Results were expressed as optical density (OD) versus dilution of culture supernatant. 図2は、cross-ELISAによるIL4-IL10融合タンパク質の免疫化学的同定を示す図である。IL4-IL10融合タンパク質に関するトランス遺伝子を担持するpUPE発現ベクターをトランスフェクトしたHEK293細胞の上清を、cross-ELISAにおいて、抗IL4(A)または抗IL10モノクローナル抗体(捕捉抗体(capture antibodies)として使用)(B)およびビオチン化抗IL10(A)または抗IL4(B)モノクローナル抗体(検出抗体として使用)を用いて試験した。組換えIL10を、陰性対照として試験した。FIG. 2 shows immunochemical identification of IL4-IL10 fusion protein by cross-ELISA. The supernatant of HEK293 cells transfected with pUPE expression vector carrying the transgene for IL4-IL10 fusion protein was used as anti-IL4 (A) or anti-IL10 monoclonal antibody (used as capture antibody) in cross-ELISA Tested with (B) and biotinylated anti-IL10 (A) or anti-IL4 (B) monoclonal antibody (used as detection antibody). Recombinant IL10 was tested as a negative control. 図3は、HEK293細胞の上清中のIL4-IL10融合タンパク質を同定するウエスタンブロットを示す図である。IL4-IL10融合タンパク質をコードするcDNAをトランスフェクトしたHEK293細胞から得られた、10マイクロミリリットルの量の上清を、SDS-PAGEにおいて泳動させた。ブロットを、標識された抗IL4抗体(A)または標識された抗IL10抗体(B)を用いて発色させた。対照として、組換えIL4およびIL10を使用した。レーン1=分子マーカー、レーン2=未処理IL4-IL10融合タンパク質、レーン3=脱グリコシル化IL4-IL10融合タンパク質、レーン4=IL4およびレーン5=IL10。FIG. 3 shows a Western blot identifying the IL4-IL10 fusion protein in the supernatant of HEK293 cells. An amount of 10 microml supernatant obtained from HEK293 cells transfected with cDNA encoding IL4-IL10 fusion protein was run on SDS-PAGE. Blots were developed with labeled anti-IL4 antibody (A) or labeled anti-IL10 antibody (B). As controls, recombinant IL4 and IL10 were used. Lane 1 = molecular marker, lane 2 = untreated IL4-IL10 fusion protein, lane 3 = deglycosylated IL4-IL10 fusion protein, lane 4 = IL4 and lane 5 = IL10. 図4はIL4-IL10融合タンパク質の重合を同定するHigh Performance Size Exclusion Chromatographyアッセイの結果を表示する図である。IL4-IL10融合タンパク質、組換えIL4および組換えIL10の試料を、High Performance Liquid Chromatographyシステムにおいて泳動させた。カラムを、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン(66KD、左から1番目の点線)、カルボニックアンヒドラーゼ(30KD、左から2番目の点線)、ミオグロブリン(18KD、左から3番目の点線)およびリボヌクレアーゼ(13.7KD、左から4番目の点線)のタンパク質混合物を使用して較正した。これらのマーカーを使用して、分画中のタンパク質の分子量を、保持時間の比較により推定した。さまざまな泳動の分画中のIL4およびIL10の含有量を、ELISAを用いて測定し、ng/mlで表した。IL4は明らかな単量体として溶出され、IL10は明らかな二量体として溶出され、一方、IL4-IL10融合タンパク質の溶出パターンは明らかな二量体であることを明らかにした。FIG. 4 shows the results of a High Performance Size Exclusion Chromatography assay that identifies the polymerization of IL4-IL10 fusion protein. Samples of IL4-IL10 fusion protein, recombinant IL4 and recombinant IL10 were run in a High Performance Liquid Chromatography system. Columns were thyroglobulin, bovine serum albumin (66 KD, first dotted line from the left), carbonic anhydrase (30 KD, second dotted line from the left), myoglobulin (18 KD, third dotted line from the left) and ribonuclease (13.7 The protein mixture was calibrated using the KD (fourth dotted line from the left) protein mixture. Using these markers, the molecular weight of the protein in the fraction was estimated by comparison of retention times. The content of IL4 and IL10 in the various electrophoretic fractions was measured using ELISA and expressed in ng / ml. IL4 was eluted as a clear monomer and IL10 was eluted as a clear dimer, while the elution pattern of the IL4-IL10 fusion protein revealed a clear dimer. 図5は、IL4-IL10融合タンパク質が、全血培養液におけるLPS-誘導性サイトカイン放出を阻害することを示す図である。健康なボランティア由来のヘパリン添加血を、培養培地で1:10に希釈し、10ng/mlの濃度のLPSと一緒に、さまざまな濃度のIL4-IL10融合タンパク質の存在下でインキュベートした。上清中のTNFαを、ELISAを用いて測定した。パネルAは、IL4-IL10融合タンパク質の、TNFの産生を阻害する能力を示す(結果を阻害%として表した)。IL4-IL10融合タンパク質を欠いた、同様の体積の培養培地を試験した場合、TNF産生阻害が見られなかったことに留意されたい。パネルBは、LPS-誘導性のTNFα(左のグラフ)、IL6(中央のグラフ)およびIL8(右のグラフ)の産生阻害を示す(上清から測定したTNFα、IL6およびIL8の濃度を、Y軸に示す)。IL4-IL10融合タンパク質を100ng/mlで試験し、それぞれ最終濃度50ng/mlの組換えIL4およびIL10の混合物の効果と比較した。パネルCは、IL4-IL10融合タンパク質のIL6LPS誘導性産生に対する効果が、IL4受容体に対する受容体遮断抗体(抗IL4R)およびIL10受容体に対する受容体遮断抗体(抗IL10R)を、両方とも加えた場合、培地のみを加えた場合(抗体を欠く)と比較して完全に無効化されたことを示す。IL4受容体に対する受容体遮断抗体(抗IL4R)またはIL10受容体対する受容体遮断抗体(抗IL10R)のいずれかを加え、両方を加えなかった場合、IL4-IL10融合タンパク質の効果は部分的に無効化されたことに留意されたい。FIG. 5 shows that IL4-IL10 fusion protein inhibits LPS-induced cytokine release in whole blood cultures. Heparinized blood from healthy volunteers was diluted 1:10 in culture media and incubated with LPS at a concentration of 10 ng / ml in the presence of various concentrations of IL4-IL10 fusion protein. TNFα in the supernatant was measured using ELISA. Panel A shows the ability of the IL4-IL10 fusion protein to inhibit TNF production (results expressed as% inhibition). Note that when similar volumes of culture medium lacking the IL4-IL10 fusion protein were tested, no inhibition of TNF production was seen. Panel B shows inhibition of LPS-induced production of TNFα (left graph), IL6 (middle graph) and IL8 (right graph) (concentration of TNFα, IL6 and IL8 measured from the supernatant Shown on the axis). IL4-IL10 fusion protein was tested at 100 ng / ml and compared to the effect of a mixture of recombinant IL4 and IL10 at a final concentration of 50 ng / ml respectively. Panel C shows the effect of IL4-IL10 fusion protein on IL6LPS-induced production when both a receptor blocking antibody against IL4 receptor (anti-IL4R) and a receptor blocking antibody against IL10 receptor (anti-IL10R) are added. , Showing complete inactivation compared to the case where only medium was added (absence of antibody). The effect of the IL4-IL10 fusion protein is partially ineffective if either a receptor blocking antibody to the IL4 receptor (anti-IL4R) or a receptor blocking antibody to the IL10 receptor (anti-IL10R) is added, but not both Please note that 図6は、IL4-IL10融合タンパク質によるTh1およびTh17サイトカイン産生の強力な阻害が、超抗原であるブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)活性化単核細胞培養液中の持続性の制御性(FoxP3+)T細胞の百分率と関連していることを示す図である。骨髄細胞およびB細胞の活性化は、炎症促進性Th1およびTh17と制御性FoxP3-発現CD4T細胞とのバランスに決定的に依存する。T細胞活性に対するIL4-IL10融合タンパク質の効果を評価するために、健康なドナーの末梢血由来単核細胞(PBMC)を単離した。T細胞活性化は、PBMC(5.105/ml)を3日間、SEB(1ng/ml)および/またはIL4-IL10融合タンパク質の存在下または不在下で処理することによって誘導された。この培養期間後の増殖(パネルA)、FoxP3の発現および炎症促進性T細胞サイトカインの産生(パネルB)を測定した。SEBは、FoxP3発現の上方制御(パネルB)に関連する有意な増殖(パネルA)を誘導した。増殖(パネルA)およびFoxP3発現(パネルB)の両方とも、IL4-10融合タンパク質によりほとんど影響されなかった。それに反して、Th1およびTh17サイトカインのIFNγ(左のグラフ、パネルC)、IL17(中央のグラフ、パネルC)およびTNFα(右のグラフ、パネルC)は、IL4-IL10融合タンパク質によりすべて強力に減少した。まとめると、これは、IL4-IL10融合タンパク質が、抑制制御性CD4T細胞と炎症促進性Th1およびTh17細胞との間のバランスを強く改変することを実証している。Figure 6 shows that potent inhibition of Th1 and Th17 cytokine production by IL4-IL10 fusion protein is a long-lasting regulatory (FoxP3 +) T in superantigen staphylococcal enterotoxin B (SEB) activated mononuclear cell cultures FIG. 6 is a graph showing that the percentage of cells is related. Bone marrow and B cell activation is critically dependent on the balance between pro-inflammatory Th1 and Th17 and regulatory FoxP3-expressing CD4 T cells. To evaluate the effect of IL4-IL10 fusion protein on T cell activity, peripheral blood-derived mononuclear cells (PBMC) from healthy donors were isolated. T cell activation was induced by treating PBMC (5.10 5 / ml) for 3 days in the presence or absence of SEB (1 ng / ml) and / or IL4-IL10 fusion protein. Proliferation after this culture period (panel A), FoxP3 expression and pro-inflammatory T cell cytokine production (panel B) were measured. SEB induced significant proliferation (panel A) associated with upregulation of FoxP3 expression (panel B). Both proliferation (panel A) and FoxP3 expression (panel B) were hardly affected by the IL4-10 fusion protein. In contrast, the Th1 and Th17 cytokines IFNγ (left graph, panel C), IL17 (middle graph, panel C) and TNFα (right graph, panel C) are all strongly reduced by the IL4-IL10 fusion protein. did. Taken together, this demonstrates that the IL4-IL10 fusion protein strongly alters the balance between suppressive regulatory CD4 T cells and pro-inflammatory Th1 and Th17 cells. 図7は、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)活性化単核細胞培養液において、IL4-IL10融合タンパク質により、単球のIgGに対する受容体の発現が安定したことを示す図である。IgG(FcγR)に対する活性化および阻害性の受容体間のバランスは、免疫複合体により媒介される骨髄細胞およびリンパ系細胞の活性化において極めて重要な役割を果たす。単球におけるFcγRの発現に対するIL4-IL10融合タンパク質の効果を評価するために、末梢血由来単核細胞(PBMC)を、健康なドナーから単離した。T細胞依存性単球の活性化を、PBMC(5.105/ml)を2日間、超抗原SEB(0.1ng/ml)および/またはIL4-IL10融合タンパク質の存在下または不在下で処理することにより、誘導した。この培養期間後、FcγRの発現を測定した。IL10は、FcγRI、FcγRIlaおよびFcγRIIIの発現を上方制御した。IL4単独は、サイトカインの不在下で培養された細胞と比較して、これらの活性化FcγRの発現においてわずかな減少を示した。IL4とIL10との組み合わせならびにIL4-IL10融合タンパク質は、FcγRIおよびFcRyIIaの発現を正規化した。IL4とIL10との組み合わせ、またはIL4-IL10融合タンパク質による、FcγRIIIの発現のわずかな増加を測定したが、IL10単独により誘導されるこの受容体の上方制御と比較して取るに足らないものであった。IL4単独は、FcγRIIbの発現のわずかな減少を示した。IL4とIL10との組み合わせ、およびIL4-IL10融合タンパク質は、阻害性FcγRIIbの発現を改変しなかった。まとめると、これは、IL4-IL10融合タンパク質が活性化FcγRの発現を安定化し、結果としてこれは、免疫複合体誘導性免疫活性化を阻害できることを実証している。FIG. 7 is a diagram showing that the expression of a receptor for monocyte IgG was stabilized by IL4-IL10 fusion protein in a staphylococcal enterotoxin B (SEB) -activated mononuclear cell culture medium. The balance between activating and inhibitory receptors for IgG (FcγR) plays a pivotal role in the activation of bone marrow and lymphoid cells mediated by immune complexes. To evaluate the effect of IL4-IL10 fusion protein on the expression of FcγR in monocytes, peripheral blood derived mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy donors. T cell-dependent monocyte activation by treating PBMC (5.10 5 / ml) for 2 days in the presence or absence of superantigen SEB (0.1 ng / ml) and / or IL4-IL10 fusion protein Induced. After this culture period, the expression of FcγR was measured. IL10 upregulated the expression of FcγRI, FcγRIla and FcγRIII. IL4 alone showed a slight decrease in the expression of these activated FcγRs compared to cells cultured in the absence of cytokines. The combination of IL4 and IL10 and IL4-IL10 fusion protein normalized FcγRI and FcRyIIa expression. A slight increase in FcγRIII expression was measured by the combination of IL4 and IL10, or by the IL4-IL10 fusion protein, but was insignificant compared to the up-regulation of this receptor induced by IL10 alone. It was. IL4 alone showed a slight decrease in the expression of FcγRIIb. The combination of IL4 and IL10 and IL4-IL10 fusion protein did not alter the expression of inhibitory FcγRIIb. Taken together, this demonstrates that the IL4-IL10 fusion protein stabilizes the expression of activated FcγR, which in turn can inhibit immune complex-induced immune activation. 図8は、IL4-IL10融合タンパク質の、軟骨プロテオグリカンの代謝回転に対する用量依存的効果を示す図である。5人のドナーの軟骨外植片を、4日間、5人のドナー(n=5)の50%v/vの血液に曝露した。血液曝露の間に、IL4-IL10融合タンパク質を、0.0001から100ng/mLの濃度で加えた。プロテオグリカン合成速度(A)、放出(B)および含有量(C)を、12日間の回復期間後に決定した。プロテオグリカン合成速度および含有量は、対照軟骨と比較して、血液曝露により有意に減少し、一方、プロテオグリカン放出は増加した(アスタリスクで示す;p<0.05)。ハッシュタグは、50% v/v血液(p<0.05)と比較して統計的有意差を示し、一方、AおよびBにおける点線は、用量応答のS字状の出現を強調する。中央値±四分位範囲を表す。IL4-IL10融合タンパク質を軟骨培養液に加えることによって、プロテオグリカン合成速度の用量依存的回復、プロテオグリカン放出の正規化がもたらされ、含有量の減少が相殺された。FIG. 8 shows the dose-dependent effect of IL4-IL10 fusion protein on cartilage proteoglycan turnover. Five donor cartilage explants were exposed to 50% v / v blood from five donors (n = 5) for 4 days. During blood exposure, IL4-IL10 fusion protein was added at a concentration of 0.0001 to 100 ng / mL. Proteoglycan synthesis rate (A), release (B) and content (C) were determined after a 12-day recovery period. Proteoglycan synthesis rate and content were significantly decreased with blood exposure compared to control cartilage, while proteoglycan release increased (indicated by asterisks; p <0.05). Hashtags show statistical significance compared to 50% v / v blood (p <0.05), while the dotted lines in A and B highlight the sigmoidal appearance of the dose response. Median ± quartile range. Addition of IL4-IL10 fusion protein to the cartilage culture resulted in a dose-dependent recovery of proteoglycan synthesis rate, normalization of proteoglycan release, offsetting the decrease in content. 図9は、IL4-IL10融合タンパク質が、血液誘導性軟骨損傷を防止することを示す図である。8人のドナーの軟骨外植片を、4日間、8人のドナーの50% v/v血液に曝露した。血液曝露の間に、IL4-IL10融合タンパク質ならびにIL4、IL10およびIL4とIL10との組み合わせを加えた(すべて10ng/mL)。軟骨外植片のプロテオグリカン合成速度は、血液曝露により76%低下した(A、p=0.012)。IL4-IL10融合タンパク質は、プロテオグリカン合成速度を、血液曝露単独と比較して241%上昇させた。血液曝露軟骨は、プロテオグリカン放出(B、p=0.017)の59%の増加を示した。IL4-IL10融合タンパク質の添加により、プロテオグリカンの血液誘導性放出は減少し(p=0.012)、対照値に戻った。血液に曝露された軟骨は、プロテオグリカン含有量が、対照と比較して10%の減少を示した(C、p=0.012)。IL4-IL10融合タンパク質は、プロテオグリカン含有量を、血液曝露単独と比較して有意に増加した(p=0.012)。記号*は、対象と比較した統計的有意差を示す。記号#は、50% v/v血液と比較した統計的有意差を示す(p<0.05)。中央値±四分位範囲を表す。FIG. 9 shows that IL4-IL10 fusion protein prevents blood-induced cartilage damage. Eight donor cartilage explants were exposed to 50% v / v blood of eight donors for 4 days. During the blood exposure, IL4-IL10 fusion protein and IL4, IL10 and a combination of IL4 and IL10 were added (all 10 ng / mL). The rate of proteoglycan synthesis in cartilage explants was reduced by 76% with blood exposure (A, p = 0.012). The IL4-IL10 fusion protein increased the rate of proteoglycan synthesis by 241% compared to blood exposure alone. Blood-exposed cartilage showed a 59% increase in proteoglycan release (B, p = 0.017). Addition of IL4-IL10 fusion protein decreased blood-induced release of proteoglycans (p = 0.012) and returned to control values. Cartilage exposed to blood showed a 10% decrease in proteoglycan content compared to controls (C, p = 0.012). IL4-IL10 fusion protein significantly increased proteoglycan content compared to blood exposure alone (p = 0.012). The symbol * indicates a statistically significant difference compared to the subject. The symbol # indicates a statistically significant difference compared to 50% v / v blood (p <0.05). Median ± quartile range. 図10は、IL4-IL10融合タンパク質が、変形性関節症のイヌGrooveモデル(Groove-model)において疼痛を減少させることを示す図である。変形性関節症(OA)を4匹の犬に誘導し、1mlのIL4-IL10融合タンパク質の関節内注射を、OA誘導後5週目(1μg/ml)および7週目(10μg/ml)に与えた(矢印を参照されたい)。歩行板分析(FPA)を、誘導前3週間に開始して2週間ごとに実施し、誘導後8週に終了し、L4-IL10融合タンパク質注射後は追加で毎日実施した。OA関節の負荷(実験関節対対側の対照関節)は、注射直前の、立つ力におけるスパイクにより示されるレベルと比較してほぼ正常化された(それぞれOA前の負荷と比較して2%対9%の阻害)。疼痛緩和の指標である負荷に対するこの効果を、負荷が再度低下した後数日にわたって得た。7週目の第2回目の注射後、負荷軽減の変化は、(OA負荷前と比較して)-7%から、OA負荷前と比較して-2%まで到達した。したがって、罹患OA関節の負荷パターンに対するIL4-IL10融合タンパク質の再度の正の効果およびほぼ完全な正常化が確立された。記号*は、注射前の値と比較してp=0.05を示し、一方、記号#は、ベースライン値と比較してp<0.05を示す。湾曲した点線は、処置しない場合のOA疼痛(負荷軽減)の自然な過程を示した。FIG. 10 shows that IL4-IL10 fusion protein reduces pain in a canine Groove model of osteoarthritis. Osteoarthritis (OA) was induced in 4 dogs and intra-articular injection of 1 ml of IL4-IL10 fusion protein was performed at 5 weeks (1 μg / ml) and 7 weeks (10 μg / ml) after OA induction. Given (see arrow). A gait board analysis (FPA) was performed every 2 weeks starting 3 weeks before induction, ending 8 weeks after induction, and additional daily after L4-IL10 fusion protein injection. The load on the OA joint (experimental joint versus the contralateral control joint) was almost normalized compared to the level indicated by the spike in standing force just before injection (each 2% compared to the pre-OA load). 9% inhibition). This effect on load, an indicator of pain relief, was obtained over several days after the load decreased again. After the second injection at week 7, the change in load reduction reached -7% (compared to before OA loading) to -2% compared to before OA loading. Thus, a re-positive effect and almost complete normalization of the IL4-IL10 fusion protein on the diseased OA joint loading pattern was established. The symbol * indicates p = 0.05 compared to the pre-injection value, while the symbol # indicates p <0.05 compared to the baseline value. The curved dotted line showed the natural process of OA pain (load reduction) without treatment. 図11は、IL4-IL10融合タンパク質を用いて処置したマウスにおける、カラギーナン誘導性熱痛覚過敏の過程を示す図である。熱逃避潜時を、Hargreaves試験を使用して決定した。マウスにカラギーナンの足底内注射を与え(左から1番目の矢印を参照されたい)、熱逃避潜時の減少を決定した。IL4-IL10融合タンパク質の髄腔内注射(左から2番目の矢印を参照されたい)は、足底内カラギーナン投与に対する痛覚過敏反応を有意に低下させた。IL4-IL10融合タンパク質の効果は、2日で不明確となるが、IL4-IL10融合タンパク質により処置したマウスにより示された、熱逃避潜時の減少は、生理食塩水により処置したマウスの48時間後と比較してさらに有意に小さかった。データは、平均±SEMとして表した。記号*はp<0.05を示し、記号**はp<0.001を示す。FIG. 11 shows the process of carrageenan-induced thermal hyperalgesia in mice treated with IL4-IL10 fusion protein. Thermal escape latency was determined using the Hargreaves test. Mice were given an intraplantar injection of carrageenan (see first arrow from the left) to determine the decrease in heat escape latency. Intrathecal injection of IL4-IL10 fusion protein (see second arrow from the left) significantly reduced hyperalgesia response to intracarpal carrageenan administration. The effect of IL4-IL10 fusion protein is unclear at 2 days, but the decrease in heat escape latency shown by mice treated with IL4-IL10 fusion protein is 48 hours in mice treated with saline. It was even significantly smaller than after. Data were expressed as mean ± SEM. The symbol * indicates p <0.05, and the symbol ** indicates p <0.001. 図12は、Hargreaves試験を使用して決定された熱逃避潜時を示す図である。マウスにカラギーナンの足底内注射を与え、熱逃避潜時の減少を決定した。IL4もしくはIL10のいずれか(A)またはIL4-IL10融合タンパク質(B)の髄腔内注射(矢印を参照されたい)を、痛覚過敏の誘導6日目に与えた。IL4およびIL10は両方とも、足底のカラギーナン疼痛反応に対する痛覚過敏反応がわずかに減少したが、この効果は、IL4-IL10融合タンパク質の効果と比較して取るに足らないものである。個々のIL4またはIL10の効果は1日続き、一方、IL4-IL10融合タンパク質の効果はより長期間、4日まで間続いた。データは、平均±SEMとして表した。記号*はp<0.05を示し、記号**はp<0.001を示す。FIG. 12 is a diagram showing the thermal escape latency determined using the Hargreaves test. Mice were given an intraplantar injection of carrageenan to determine a decrease in heat escape latency. Intrathecal injection of either IL4 or IL10 (A) or IL4-IL10 fusion protein (B) (see arrow) was given on day 6 of induction of hyperalgesia. Both IL4 and IL10 have a slightly reduced hyperalgesic response to plantar carrageenan pain response, but this effect is insignificant compared to the effect of the IL4-IL10 fusion protein. Individual IL4 or IL10 effects lasted for 1 day, while the effects of IL4-IL10 fusion proteins lasted longer, up to 4 days. Data were expressed as mean ± SEM. The symbol * indicates p <0.05, and the symbol ** indicates p <0.001. 図13は、IL4-IL10融合タンパク質が、全血培養液におけるLPS誘導性サイトカイン放出を阻害することを示す図である。健康なボランティア由来のヘパリン添加血を、培養培地で1:1に希釈し、10ng/mlの濃度のLPSと一緒に、IL4-IL10融合タンパク質の異なる構築体を含有する、さまざまな濃度のプールの存在下でインキュベートした。上清中のTNFαを、ELISAを用いて測定した。結果を、阻害%として表した。IL4-IL10融合タンパク質の不在下のTNF産生は、0%の阻害をもたらした。IL4のc末端がIL10のn末端に連結されたプール2および4は、IL10のc末端がIL4のn末端に連結されたプール1および3と比較して、同様の濃度で、TNFα産生の最も高い阻害を示した。これは、IL4-IL10融合タンパク質の機能性が、個々のサイトカインがIL4-IL10融合タンパク質内で連結される様式に依存することを示している。FIG. 13 shows that IL4-IL10 fusion protein inhibits LPS-induced cytokine release in whole blood cultures. Heparinized blood from healthy volunteers was diluted 1: 1 in culture medium and pooled at various concentrations containing different constructs of IL4-IL10 fusion protein together with LPS at a concentration of 10 ng / ml. Incubated in the presence. TNFα in the supernatant was measured using ELISA. Results were expressed as% inhibition. TNF production in the absence of IL4-IL10 fusion protein resulted in 0% inhibition. Pools 2 and 4 with the IL4 c-terminus linked to the n-terminus of IL10 are most likely to produce TNFα at similar concentrations compared to pools 1 and 3 with the IL10 c-terminus linked to the n-terminus of IL4. High inhibition was shown. This indicates that the functionality of the IL4-IL10 fusion protein depends on the manner in which individual cytokines are linked within the IL4-IL10 fusion protein.

(実施例)
(実施例1)
HEK293細胞のトランスフェクション
方法:HEK293細胞に、標準的手順に従って、トランス遺伝子を含有するベクターを一時的にトランスフェクトした(Y Derocherら、Nucleic Acids Research 2002年、30巻、2、e9)。簡潔には、IL4-IL10融合タンパク質インサートを、システインシグナル配列を含有するpUPE発現ベクターにおいてクローン化した。HEK293E細胞に、その後、本発明のIL4-IL10融合タンパク質を含有するpUPE発現ベクターをトランスフェクトした。同時に、細胞に、ベータ-ガラクトシドアルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼ5(SIAT9)ホモサピエンスに関するトランス遺伝子を担持するベクターを同時トランスフェクトし、シアル酸によるグリカンのキャッピングを最適にした。細胞を、0.9%のプリマトン(primatone)および約0.04%、v/vのウシ胎児血清を含むFreeStyle medium(Invitrogen)において培養した。トランスフェクト5日後、馴化培地を低速遠心分離により回収し、その後、馴化培地を10kDaのQuixStand中空繊維カートリッジ(GE Healthcare)を通して濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に対して透析ろ過した。 (Example)
(Example 1)
Transfection of HEK293 cells Methods: HEK293 cells were transiently transfected with vectors containing the transgene according to standard procedures (Y Derocher et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, Vol. 2, e9). Briefly, the IL4-IL10 fusion protein insert was cloned in a pUPE expression vector containing a cysteine signal sequence. HEK293E cells were then transfected with a pUPE expression vector containing the IL4-IL10 fusion protein of the present invention. At the same time, cells were co-transfected with a vector carrying a transgene for beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 5 (SIAT9) homosapiens to optimize glycan capping by sialic acid. Cells were cultured in FreeStyle medium (Invitrogen) containing 0.9% primatone and about 0.04% v / v fetal calf serum. Five days after transfection, the conditioned medium was collected by low speed centrifugation, after which the conditioned medium was concentrated through a 10 kDa QuixStand hollow fiber cartridge (GE Healthcare) and diafiltered against phosphate buffered saline (PBS).

(実施例2)
IL4-IL10融合タンパク質、IL4およびIL10の免疫化学的検出に関するELISAアッセイ。
方法:培養液上清またはクロマトグラフィー分画中のIL4およびIL10含有量を、ELISA(IL4 PeliPair ELISA Kit; Sanquin、Amsterdam、the Netherlands; Cat# M9314またはIL10 PeliPair ELISA Kit; Sanquin; Cat# M9310)により、製造業者の取扱説明書に従って測定した。簡潔には、IL4またはIL10に対する捕捉抗体(catching antibodies)を、リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4(PBS)で1:200に希釈し、ELISAプレートを一晩コーティングした。これ以降のステップは全て、0.1%、w/vのTween-20を添加したPBS(PBS-T)中で実施した。100から2pg/mlの範囲の組換えIL4またはIL10をもたらす段階希釈からなる、用量応答曲線を試験した。結合抗体を、ストレプトアビジン-ポリ-HRP(Sanquin)を用いて検出し、次いで、TMB(3,3',5,5"-テトラメチルベンジジン; Invitrogen、Carlsbad、CA、USA;Cat# SB02)と一緒にインキュベートした。反応を、1Mの硫酸(Chem Lab; Cat# CL05-2658-1000)で停止させた。ELISAの結果を、製造業者により提供された、組換えIL4およびIL10の希釈基準曲線の結果と比較した。 (Example 2)
ELISA assay for immunochemical detection of IL4-IL10 fusion protein, IL4 and IL10.
Method: IL4 and IL10 content in culture supernatants or chromatographic fractions were determined by ELISA (IL4 PeliPair ELISA Kit; Sanquin, Amsterdam, the Netherlands; Cat # M9314 or IL10 PeliPair ELISA Kit; Sanquin; Cat # M9310) Measured according to manufacturer's instructions. Briefly, catching antibodies against IL4 or IL10 were diluted 1: 200 with phosphate buffered saline, pH 7.4 (PBS), and ELISA plates were coated overnight. All subsequent steps were performed in PBS (PBS-T) supplemented with 0.1%, w / v Tween-20. Dose response curves were tested, consisting of serial dilutions resulting in recombinant IL4 or IL10 ranging from 100 to 2 pg / ml. Bound antibody is detected using streptavidin-poly-HRP (Sanquin) and then TMB (3,3 ', 5,5 "-tetramethylbenzidine; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Cat # SB02) and The reaction was stopped with 1 M sulfuric acid (Chem Lab; Cat # CL05-2658-1000) ELISA results were obtained from a dilution standard curve of recombinant IL4 and IL10 provided by the manufacturer. Compared with the results.

IL4-IL10融合タンパク質を特異的に検出するcross-ELISAを、抗IL4コーティングプレートおよびビオチン化抗IL10モノクローナル抗体を検出用に使用して作製した。cross-ELISAを、抗IL4コーティングプレートを、抗IL10コーティングプレートの代わりに使用したことを除き、IL10に関するELISAと厳密に同じに実施した。抗IL4コーティングプレートを、IL4 ELISAに関して記載したように厳密に調製した。このアッセイに関しては基準が存在しないので、結果をODとして示す。75pg/mlの対照組換えIL10およびIL4-IL10融合タンパク質と同等である上清の固定量を、このIL4-IL10融合タンパク質特異的cross-ELISAで試験した。   A cross-ELISA that specifically detects IL4-IL10 fusion protein was generated using anti-IL4 coated plates and biotinylated anti-IL10 monoclonal antibodies for detection. The cross-ELISA was performed exactly the same as the ELISA for IL10, except that anti-IL4 coated plates were used instead of anti-IL10 coated plates. Anti-IL4 coated plates were prepared exactly as described for the IL4 ELISA. Since there is no standard for this assay, the results are given as OD. A fixed amount of supernatant equivalent to 75 pg / ml of control recombinant IL10 and IL4-IL10 fusion protein was tested in this IL4-IL10 fusion protein specific cross-ELISA.

結果:IL4-IL10融合タンパク質の検出。ELISAアッセイ(図1および2を参照されたい)は両方ともトランスフェクトしたHEK293細胞の培養液上清の用量応答曲線をもたらし、ELISAに使用したモノクローナル抗体により認識される構造を有するIL4およびIL10タンパク質の存在を示した(図1)。ELISA(cross-ELISA)を、その後IL4-IL10融合タンパク質を特異的に測定し、組換え野生型サイトカイン分子は測定しないように改変した(図2のAおよびBを参照されたい)。75pg/mlの組換えIL10およびIL4-IL10融合タンパク質と同等量を、このcross-ELISAで試験した場合、IL4-IL10融合タンパク質だけがシグナルを示し、IL10はシグナルを示さなかった(図2のAおよびB)。したがって、これらの結果は、本発明のIL4-IL10融合タンパク質の配列をトランスフェクトしたHEK293細胞から得られた上清だけが、IL4およびIL10配列が互いに連結されたタンパク質を含有したことを実証している。   Results: Detection of IL4-IL10 fusion protein. The ELISA assay (see FIGS. 1 and 2) both resulted in a dose response curve of the culture supernatant of transfected HEK293 cells, and for IL4 and IL10 proteins with structures recognized by the monoclonal antibodies used in the ELISA. It was present (Figure 1). ELISA (cross-ELISA) was then modified to specifically measure IL4-IL10 fusion protein and not recombinant wild type cytokine molecules (see A and B in FIG. 2). When the equivalent amount of 75 pg / ml recombinant IL10 and IL4-IL10 fusion protein was tested in this cross-ELISA, only the IL4-IL10 fusion protein showed a signal and IL10 showed no signal (Fig. And B). Thus, these results demonstrate that only supernatants obtained from HEK293 cells transfected with the sequences of the IL4-IL10 fusion protein of the present invention contained proteins with IL4 and IL10 sequences linked to each other. Yes.

(実施例3)
SDS-Pageおよびウエスタンブロット
方法:試料を、710mMの2-メルカプトエタノールを含有するサンプルバッファー(Tris-HCl pH6.8、25%,w/vのグリセロール、2%、w/vのSDS、0.01%、w/vのブロモフェノールブルー; BioRad、Richmond、VA、USA、Cat# 161-0737)で1:1に希釈し、10分間、100℃においてインキュベートした。続いて、試料を、7.5%、w/vのポリアクリルアミド-トリス/グリシンゲル(Mini-PROTEAN TGX Precast Gels without SDS; BioRad、Cat# 456-1023)に負荷した。分子量マーカー(WesternC Standard、250-10kD; BioRad; Cat# 161-0376)を、別のレーンで泳動させた。電気泳動を、還元条件下で、トリス/グリシン/SDSバッファー(BioRad; Cat# 161-0732)を使用して実施した。IL4-IL10融合タンパク質を同定するために、免疫ブロッティングを、抗IL4または抗IL10抗体を用いて実施した。タンパク質を、上記のようにSDS-PAGEにおいて分離させ、その後、PVDF-膜(BioRad; Cat# 161-0277)に、ウェスタンブロッティングにより、トリス/グリシンバッファー(BioRad; Cat# 161-0734)を使用して100Vで1時間転写した。 (Example 3)
SDS-Page and Western blot Method: Samples were sample buffer containing 710 mM 2-mercaptoethanol (Tris-HCl pH6.8, 25%, w / v glycerol, 2%, w / v SDS, 0.01% , W / v bromophenol blue; BioRad, Richmond, VA, USA, Cat # 161-0737), diluted 1: 1 and incubated at 100 ° C. for 10 minutes. Subsequently, the samples were loaded on 7.5%, w / v polyacrylamide-Tris / Glycine gel (Mini-PROTEAN TGX Precast Gels without SDS; BioRad, Cat # 456-1023). Molecular weight markers (WesternC Standard, 250-10 kD; BioRad; Cat # 161-0376) were run in separate lanes. Electrophoresis was performed using Tris / Glycine / SDS buffer (BioRad; Cat # 161-0732) under reducing conditions. In order to identify IL4-IL10 fusion proteins, immunoblotting was performed using anti-IL4 or anti-IL10 antibodies. Proteins are separated on SDS-PAGE as described above and then used on a PVDF-membrane (BioRad; Cat # 161-0277) by Western blotting using Tris / Glycine buffer (BioRad; Cat # 161-0734). And transferred at 100V for 1 hour.

ブロッティング後、膜を、4%、w/vの粉ミルク(Elk milk powder; Campina、Zaltbommel、the Netherlands)を含有するPBS-Tと一緒にインキュベートし、残りの結合部位を遮断した。PVDF膜を、その後、3回、PBS-Tで洗浄し、一次抗体(マウスIgG1抗ヒトIL4; Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA; Cat# SC80093またはマウスIgG1抗ヒトIL10; Santa Cruz; Cat#SC32815)と一緒に、1%、w/vのミルク(PBSTに溶解)中で1時間インキュベートした。さらに1回の洗浄ステップ後、ブロットを、1時間、二次抗体(ホースラッディシュペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG; Santa Cruz; Cat SC2005)およびWesternC Marker検出抗体(StrepTactin-HRP; BioRad; Cat# 161-0382)と一緒に、PBST-1%ミルク中でインキュベートた。ECL溶液(GE Healthcare、Diegem、Belgium、Cat# RPN2132)を洗浄した膜に加え、膜をカセットに移した後で、15分まで、Kodak Imagerを使用して発色させた。IL4-IL10融合タンパク質をさらに特徴付けるために、培養液上清を、PNGaseF(Sigma Aldrich、cat# G5166)を用いて、製造業者の取り扱い説明書に従って、さらに処理し、IL4-IL10融合タンパク質を脱グリコシル化(deglysolate)し、その後、上記のように、SDS-PAGEおよび免疫ブロットにおいて分析した。   After blotting, membranes were incubated with PBS-T containing 4% w / v milk powder (Elk milk powder; Campina, Zaltbommel, the Netherlands) to block the remaining binding sites. The PVDF membrane was then washed 3 times with PBS-T and the primary antibody (mouse IgG1 anti-human IL4; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; Cat # SC80093 or mouse IgG1 anti-human IL10; Santa Cruz; Cat # SC32815) and incubated in 1% w / v milk (dissolved in PBST) for 1 hour. After one additional washing step, the blots were washed for 1 hour with secondary antibodies (horseradish peroxidase (HRP) -conjugated goat anti-mouse IgG; Santa Cruz; Cat SC2005) and WesternC Marker detection antibody (StrepTactin-HRP; BioRad; Cat # 161-0382) and incubated in PBST-1% milk. ECL solution (GE Healthcare, Diegem, Belgium, Cat # RPN2132) was added to the washed membrane and the color was developed using a Kodak Imager for up to 15 minutes after the membrane was transferred to a cassette. To further characterize the IL4-IL10 fusion protein, the culture supernatant was further processed using PNGaseF (Sigma Aldrich, cat # G5166) according to the manufacturer's instructions to deglycosylate the IL4-IL10 fusion protein. Degrees were then analyzed in SDS-PAGE and immunoblots as described above.

結果:野生型IL4およびIL10は、両方とも、MW<20kDと一致する相対移動(Mr)で移動した(図3AおよびBに示したブロットのレーン4および5)。トランスフェクトされたHEK293から得られた上清から、IL4-IL10融合タンパク質は、二重のバンドとして、MW約30-35kDに対応するMrで移動した。両方のバンドは、抗IL4(図3A)および抗IL10モノクローナル抗体(図3B)により認識され、したがって、両方とも、IL4-IL10融合タンパク質の変異体、おそらく異なるグリコフォームを表している。とりわけ、組換え野生型IL4またはIL10の範囲のMrに相当するバンドは検出されなかった(図3Aおよび3Bのレーン2)。これらの結果は、IL4-IL10融合タンパク質だけが、トランスフェクトされたHEK293細胞の上清において検出され、個々のサイトカイン(すなわち、IL4およびIL10)が検出されなかったことの確認である。パネル3Aおよび3Bのレーン2に記載の二重バンドがグリコフォームであることを確認するために、IL4-IL10融合タンパク質を含有する上清を、PNGaseFを用いて、脱グリコシル化のために処理し、免疫ブロットにより、未処理の上清と比較した。結果は、1つのバンドだけが脱グリコシル化後に検出されたことを示し(図3Aおよび3Bに示した両方のブロットのレーン3を参照されたい)、これにより、両方のブロット(図2AおよびB)のレーン2に示された二重バンドが、実際には本発明のIL4-IL10融合タンパク質であるが、グリコシル化型であったことが確認された。   Results: Wild type IL4 and IL10 both migrated with a relative migration (Mr) consistent with MW <20 kD (lanes 4 and 5 of the blot shown in FIGS. 3A and B). From the supernatant obtained from transfected HEK293, the IL4-IL10 fusion protein migrated as a double band with Mr corresponding to MW approximately 30-35 kD. Both bands are recognized by anti-IL4 (FIG. 3A) and anti-IL10 monoclonal antibodies (FIG. 3B) and thus both represent variants of the IL4-IL10 fusion protein, possibly different glycoforms. In particular, no band corresponding to Mr in the range of recombinant wild type IL4 or IL10 was detected (lane 2 in FIGS. 3A and 3B). These results are confirmation that only the IL4-IL10 fusion protein was detected in the supernatant of the transfected HEK293 cells and no individual cytokines (ie IL4 and IL10) were detected. To confirm that the double band described in lane 2 of panels 3A and 3B is a glycoform, the supernatant containing the IL4-IL10 fusion protein was processed for deglycosylation using PNGaseF. Comparison with untreated supernatant by immunoblotting. The results show that only one band was detected after deglycosylation (see lane 3 of both blots shown in FIGS. 3A and 3B), which resulted in both blots (FIGS. 2A and B). The double band shown in lane 2 was actually the IL4-IL10 fusion protein of the present invention, but was confirmed to be glycosylated.

(実施例4)
IL4-IL10融合タンパク質高速サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)のゲルろ過。
方法:IL4-IL10融合タンパク質の分子量を決定するために、高速サイズ排除クロマトグラフィー(HP-SEC)アッセイを実施した。ゲルろ過(BioSuite 125 4 μm UHR SEC Column; Waters; Cat# 186002161)を、高速液体クロマトグラフィーシステム(Shimadzu)において、0.5M NaClを含有する50mMのリン酸バッファーを移動相として用いて実施した。流す前に、カラムを、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、ミオグロブリンおよびリボヌクレアーゼのタンパク質混合物を使用して較正した。カチオン交換により精製したIL4-IL10融合タンパク質を、最も高いIL4-IL10融合タンパク質含有量を有するクロマトグラフィー分画をプールし、濃縮することによって得た(2mlのプール分画を、100μlに濃縮し、これが2μgのIL4-IL10融合タンパク質を含有した)。50μlの20μg/mlのプールしたIL4-IL10融合タンパク質をカラムに注入し、流速0.35ml/分で圧力35barの下でカラムの中を流した。175μlの分画を回収し、IL4およびIL10の含有量を、上記のIL4およびIL10のELISA(1/500希釈)において測定した。組換えヒトIL4(Sigma、Cat# 14269)および組換えヒトIL10(Sigma、Cat# 19276)を用いて、同様の流しを実施し、IL4-IL10融合タンパク質の分子サイズと、野生型サイトカインの分子サイズとを比較した。 (Example 4)
Gel filtration of IL4-IL10 fusion protein high-speed size exclusion chromatography (SEC).
Method: A high-speed size exclusion chromatography (HP-SEC) assay was performed to determine the molecular weight of the IL4-IL10 fusion protein. Gel filtration (BioSuite 125 4 μm UHR SEC Column; Waters; Cat # 186002161) was performed in a high performance liquid chromatography system (Shimadzu) using 50 mM phosphate buffer containing 0.5 M NaCl as the mobile phase. Prior to running, the column was calibrated using a protein mixture of thyroglobulin, bovine serum albumin, carbonic anhydrase, myoglobulin and ribonuclease. IL4-IL10 fusion protein purified by cation exchange was obtained by pooling and concentrating the chromatographic fractions with the highest IL4-IL10 fusion protein content (2 ml pool fractions were concentrated to 100 μl, This contained 2 μg of IL4-IL10 fusion protein). 50 μl of 20 μg / ml pooled IL4-IL10 fusion protein was injected onto the column and allowed to flow through the column under a pressure of 35 bar at a flow rate of 0.35 ml / min. 175 μl fractions were collected and the content of IL4 and IL10 was measured in the above-described IL4 and IL10 ELISA (1/500 dilution). A similar run was performed using recombinant human IL4 (Sigma, Cat # 14269) and recombinant human IL10 (Sigma, Cat # 19276) to determine the molecular size of the IL4-IL10 fusion protein and that of the wild-type cytokine. And compared.

結果: IL4のHP-SECの溶出パターンは、IL4が単量体(約15kD)として存在することを示している。IL10の溶出パターンは、このサイトカインが二量体型(約40kD)として存在しており、これはIL10の天然型である(Zdanovら、Stucture 1995年、3:591-601頁)。IL4-IL10融合タンパクの溶出パターンは、大部分が二量体型(約70kD)で存在することを示している(図4)。   Results: The HP-SEC elution pattern of IL4 indicates that IL4 exists as a monomer (approximately 15 kD). The elution pattern of IL10 is that this cytokine exists as a dimeric form (approximately 40 kD), which is the natural form of IL10 (Zdanov et al., Stucture 1995, 3: 591-601). The elution pattern of IL4-IL10 fusion protein indicates that it is mostly present in dimeric form (approximately 70 kD) (FIG. 4).

(実施例5)
炎症促進性サイトカインを測定するアッセイ。
方法:TNFαの産生を、市販のELISA(TNFα Pelipair ELISA Kit; Sanquin、Amsterdam、the Netherlands; Cat# M9323)を使用して、製造業者の取り扱い説明書に従って測定した。簡潔には、プレートを、炭酸塩/重炭酸塩バッファー、pH9.6で1:150に希釈した抗TNFα捕捉抗体(catching antibody)でコーティングし、PBS-Tで3回洗浄し、2.5%、w/vのウシ血清アルブミン(BSA; Roche Applied Science、Mannheim、Germany、Cat# 10735108001)と一緒にPBS中でインキュベートし、プレートの残りの結合部位をいずれも遮断した。さらに1回の洗浄ステップ後、ウェルを、PBS-Tで希釈した試料と一緒にインキュベートした。PBS-T中200〜1.56pg/mlの濃度の組換えTNFαの標準曲線を、参照のために試験した。組換えTNFαは、キットに供給されていた。最終的に、結合TNFαを、PBS-T中のビオチン化抗TNFαおよびストレプトアビジン-ポリ-HRP(Sanquin; Cat# 2032)と一緒にインキュベートすることにより、それぞれ検出した。結合したHRPを、TMB(3,3'5,5"テトラメチルベンジジン; Invitrogen; Cat# SB02)を用いて可視化した。ELISAを完了させるために、1Mの硫酸(Chem Lab; Cat# CL05-2658-1000)を加えた。結果は、組換えTNFαの標準曲線の結果を参照し、pg/mlとして表した。同様のELISA手順を使用して、IL6およびIL8(Sanquinから購入)ならびにIFNγおよびIL17(Biosourceから購入)を測定した。 (Example 5)
Assay to measure pro-inflammatory cytokines.
Method: TNFα production was measured using a commercial ELISA (TNFα Pelipair ELISA Kit; Sanquin, Amsterdam, the Netherlands; Cat # M9323) according to the manufacturer's instructions. Briefly, plates are coated with anti-TNFα catching antibody diluted 1: 150 in carbonate / bicarbonate buffer, pH 9.6, washed 3 times with PBS-T, 2.5%, w. Incubated in PBS with / v bovine serum albumin (BSA; Roche Applied Science, Mannheim, Germany, Cat # 10735108001) to block any remaining binding sites on the plate. After an additional washing step, the wells were incubated with samples diluted with PBS-T. A standard curve of recombinant TNFα at a concentration of 200-1.56 pg / ml in PBS-T was tested for reference. Recombinant TNFα was supplied in the kit. Finally, bound TNFα was detected by incubating with biotinylated anti-TNFα and streptavidin-poly-HRP (Sanquin; Cat # 2032) in PBS-T, respectively. Bound HRP was visualized using TMB (3,3'5,5 "tetramethylbenzidine;Invitrogen; Cat # SB02). To complete the ELISA, 1 M sulfuric acid (Chem Lab; Cat # CL05-2658 The results were expressed as pg / ml with reference to the standard curve results for recombinant TNFα and using similar ELISA procedures, IL6 and IL8 (purchased from Sanquin) and IFNγ and IL17 (Purchased from Biosource).

(実施例6)
IL4-IL10融合タンパク質、IL4およびIL10の活性を測定するためのアッセイ。
方法:全血におけるリポ多糖類(LPS)誘導性サイトカイン放出(IL6、IL8、TNFα)を、IL4およびIL10の機能性アッセイとして使用した。ヘパリン添加ヒト血液を健康なボランティアから得、Pen/Strep(PAA Laboratories、Pasching、Austria; Cat# P11-013)を添加したRPMI 1640培養培地(Glutamax; Invitrogen、Cat# 61870010)で1:10に希釈した。LPS(リポ多糖類; Sigma; Cat# L4391)を加え、最終濃度10ng/mlを得た。IL4-IL10融合タンパク質を、最終濃度100ng/mlで加えた。対照として、組換えヒトIL4(Sigma、Cat# I4269)および組換えヒトIL10(Sigma、Cat# I9276)を、それぞれ最終濃度50ng/mlで加えた。IL10およびIL4の活性を検証するために、ヒトIL4受容体(a-hlL4-R; R&D Systems; Minneapolis、MN、USA、Cat# MAB230)およびヒトL10受容体(a-IL10-R、BioLegend、San Diego、CA、USA、Cat# 308807)に対する受容体遮断抗体を、それぞれ最終濃度10μg/mlおよび20μg/mlで加えた。全血培養液を、その後、18時間、37℃においてインキュベートし、上清を回収後、-80℃でサイトカインの試験まで保存した。 (Example 6)
Assay to measure the activity of IL4-IL10 fusion protein, IL4 and IL10.
Methods: Lipopolysaccharide (LPS) -induced cytokine release (IL6, IL8, TNFα) in whole blood was used as a functional assay for IL4 and IL10. Heparinized human blood was obtained from healthy volunteers and diluted 1:10 in RPMI 1640 culture medium (Glutamax; Invitrogen, Cat # 61870010) supplemented with Pen / Strep (PAA Laboratories, Pasching, Austria; Cat # P11-013) did. LPS (lipopolysaccharide; Sigma; Cat # L4391) was added to obtain a final concentration of 10 ng / ml. IL4-IL10 fusion protein was added at a final concentration of 100 ng / ml. As controls, recombinant human IL4 (Sigma, Cat # I4269) and recombinant human IL10 (Sigma, Cat # I9276) were each added at a final concentration of 50 ng / ml. To verify the activity of IL10 and IL4, the human IL4 receptor (a-hlL4-R; R & D Systems; Minneapolis, MN, USA, Cat # MAB230) and the human L10 receptor (a-IL10-R, BioLegend, San Receptor blocking antibodies against Diego, CA, USA, Cat # 308807) were added at final concentrations of 10 μg / ml and 20 μg / ml, respectively. The whole blood culture was then incubated for 18 hours at 37 ° C., and the supernatant was collected and stored at −80 ° C. until cytokine testing.

結果:上清中に存在するTNFαのレベルを、ELISAを用いて測定し、TNFαの阻害%として表した(図5A)。結果は、IL4-IL10融合タンパク質の不在下のTNFα産生は、0%の阻害をもたらしたことを示している(図5A)。IL4-IL10融合タンパク質を欠いた、同様の体積のバッファーを試験した場合、TNFαの産生阻害は見られなかった(図5A)。IL4-IL10融合タンパク質またはIL4とIL10との組み合わせによる、LPS誘導性のTNFα、IL6およびIL8の産生もまた、ELISAアッセイを使用して測定した(図5B)。上清中に存在するTNFα、IL6およびIL8の濃度を、Y軸に示した。IL4-IL10融合タンパク質を、50ng/mlで試験し、組換えヒトIL4およびIL10のそれぞれ最終濃度25ng/mlの混合物の効果と比較した。結果は、IL4-IL10融合タンパク質およびIL4とIL10との組み合わせの両方とも、TNF、IL6およびIL8のLPS誘導性の産生を、対照(すなわち、サイトカインを含まない培地)と比較して有意に阻害したことを示す。IL6のLPS誘導性の産生に対するIL4-IL10融合タンパク質の効果は、ヒトIL4受容体(a-hlL4-R)およびヒトIL10受容体(a-IL10-R)に対する受容体遮断抗体を両方とも加えた場合、対照の状況(例えば、培地のみ)と比較して完全に無効化された。しかし、IL6のLPS誘導性産生に対するIL4-IL10融合タンパク質の効果は、2つの部分(すなわちIL4またはIL10)のいずれか1つを、ヒトIL4-受容体(a-hlL4-R)またはIL10受容体(a-IL10-R)に対する受容体遮断抗体により遮断した場合、対照の状況(例えば、培地のみ)と比較して部分的に無効化された。   Results: The level of TNFα present in the supernatant was measured using ELISA and expressed as% inhibition of TNFα (FIG. 5A). The results show that TNFα production in the absence of IL4-IL10 fusion protein resulted in 0% inhibition (FIG. 5A). When a similar volume of buffer lacking the IL4-IL10 fusion protein was tested, no inhibition of TNFα production was seen (FIG. 5A). LPS-induced production of TNFα, IL6 and IL8 by IL4-IL10 fusion protein or a combination of IL4 and IL10 was also measured using an ELISA assay (FIG. 5B). The concentrations of TNFα, IL6 and IL8 present in the supernatant are shown on the Y axis. The IL4-IL10 fusion protein was tested at 50 ng / ml and compared to the effect of a mixture of recombinant human IL4 and IL10 each at a final concentration of 25 ng / ml. The results showed that both IL4-IL10 fusion protein and the combination of IL4 and IL10 significantly inhibited LPS-induced production of TNF, IL6 and IL8 compared to control (i.e., medium without cytokines). It shows that. The effect of IL4-IL10 fusion protein on LPS-induced production of IL6 added both receptor blocking antibodies to human IL4 receptor (a-hlL4-R) and human IL10 receptor (a-IL10-R) In some cases, it was completely invalidated compared to the control situation (eg medium only). However, the effect of the IL4-IL10 fusion protein on the LPS-induced production of IL6 is that either one of two parts (i.e. Blocking with a receptor blocking antibody to (a-IL10-R) was partially abolished compared to the control situation (eg medium only).

(実施例7)
炎症促進性(Th1およびTh17サイトカイン発現細胞)と、制御性T細胞活性(FoxP3発現CD4 T細胞)とのバランスに対する、IL4-IL10融合タンパク質の効果。
方法:骨髄細胞およびB細胞の活性化は、炎症促進性Th1およびTh17と、制御性FoxP3発現CD4 T細胞とのT細胞のバランスに非常に依存している。T細胞のサイトカイン産生に対するIL4-IL10融合タンパク質の効果を評価するために、末梢血由来単核細胞(PBMC)を、健康なドナーから単離した。簡潔には、血液を、ペニシリン(100U/ml、Yamanouchi、Leiderdorp、The Netherlands)、ストレプトマイシン(100mg/ml、Fisiopharma、Milano、Italy)およびグルタミン(2mM、Gibco BRL)を含有するRPMI 1640培地(Gibco BRL、Life Technologies、Merelbeke、Belgium)で1:1に希釈した。PBMCを、Ficoll-Paque密度勾配遠心分離(Pharmacia、Uppsala、Sweden)により単離した。PBMC(5.105/ml)を、3日間、37℃において、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100mg/ml)および10%のプールしたウシ胎児血清(FCS、Gibco BRL)を加えたRPMI/glutamax(Gibco BRL)中で培養した。PBMCを、超抗原のブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB、1ng/ml)および/またはIL4-IL10融合タンパク質の存在下または不在下で培養した。この培養期間後、上清を回収し、無細胞にし、-80℃において、IFNγ、IL17およびTNFαに関してELISAにより試験するまで保存した。加えて、細胞増殖を、3H-チミジン取込みにより測定した。3H-チミジン(5mCi/ml、NEN Life Science Products、Amsterdam、The Netherlands)を、3日間の細胞培養の最後の18時間の間に各ウェルに加えた。この培養期間後、細胞を収穫し、3H-チミジンの取込みを、液体シンチレーション計数法で測定し、総数/分で表した(CPM)。さらに、細胞内FoxP3染色を、APC結合ラット抗ヒトFoxP3染色セット(eBioscience、San Diego、USA)を使用して実施した。細胞内染色のために、APC標識ラットアイソタイプ対照抗体(eBioscience)を使用した。陽性/陰性細胞の百分率を、アイソタイプ対照を使用して設定したマーカーに基づき決定した。細胞の取得を、FACScanフローサイトメーターを使用して実施し、データを、FlowJoソフトウェア、バージョン7.5(Tree Star Inc.、Oregon、USA)を用いて分析した。 (Example 7)
Effect of IL4-IL10 fusion protein on the balance between pro-inflammatory (Th1 and Th17 cytokine expressing cells) and regulatory T cell activity (FoxP3 expressing CD4 T cells).
Methods: Bone marrow and B cell activation is highly dependent on the balance of T cells between pro-inflammatory Th1 and Th17 and regulatory FoxP3-expressing CD4 T cells. To assess the effect of IL4-IL10 fusion protein on T cell cytokine production, peripheral blood-derived mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy donors. Briefly, blood was removed from RPMI 1640 medium (Gibco BRL) containing penicillin (100 U / ml, Yamanouchi, Leiderdorp, The Netherlands), streptomycin (100 mg / ml, Fisiopharma, Milano, Italy) and glutamine (2 mM, Gibco BRL). Life Technologies, Merelbeke, Belgium). PBMC were isolated by Ficoll-Paque density gradient centrifugation (Pharmacia, Uppsala, Sweden). RPMI / glutamax with PBMC (5.10 5 / ml) added for 3 days at 37 ° C with penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 mg / ml) and 10% pooled fetal calf serum (FCS, Gibco BRL) Cultured in (Gibco BRL). PBMC were cultured in the presence or absence of the superantigen staphylococcal enterotoxin B (SEB, 1 ng / ml) and / or IL4-IL10 fusion protein. After this culture period, the supernatant was collected, cell free and stored at -80 ° C. until tested by ELISA for IFNγ, IL17 and TNFα. In addition, cell proliferation was measured by 3H-thymidine incorporation. 3H-thymidine (5 mCi / ml, NEN Life Science Products, Amsterdam, The Netherlands) was added to each well during the last 18 hours of 3 days of cell culture. After this incubation period, the cells were harvested and 3H-thymidine incorporation was measured by liquid scintillation counting and expressed in total counts / minute (CPM). In addition, intracellular FoxP3 staining was performed using an APC-conjugated rat anti-human FoxP3 staining set (eBioscience, San Diego, USA). APC labeled rat isotype control antibody (eBioscience) was used for intracellular staining. The percentage of positive / negative cells was determined based on markers set using isotype controls. Cell acquisition was performed using a FACScan flow cytometer and data was analyzed using FlowJo software, version 7.5 (Tree Star Inc., Oregon, USA).

単球における、阻害性Fcγ受容体(FcγRIIb)の発現に対するIL4-IL10融合タンパク質の相乗活性を試験した。これを、活性化FcγRIおよびFcγRIIIの制御と比較した。PBMC (1.106/mlを、4日間、37℃において、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100mg/ml)および10%のプールしたヒトAB血清(Gibco BRL)を加えたRPMI/glutamax(Gibco BRL)中で培養した。PBMCを、超抗原のSEB(1ng/ml)および/またはIL4-IL10融合タンパク質の存在下または不在下で培養した。この培養期間後、FcγRの発現を、FACS分析により評価した。FACS分析のために、単球を、APC標識CD14mAb、FITC-標識抗FcγRIおよび抗FcgRIIImab(Pharmingen)ならびにFITC-標識抗-FcgRllb mab(2B6、Genmab、Utrecht、Netherlands)と一緒にインキュベートした。細胞の取得を、FACScanフローサイトメーターを使用して実施し、データを、FlowJoソフトウェア、バージョン7.5(Tree Star Inc.、Oregon、USA)を用いて分析した。 The synergistic activity of IL4-IL10 fusion protein on the expression of inhibitory Fcγ receptor (FcγRIIb) in monocytes was tested. This was compared with the control of activated FcγRI and FcγRIII. PBMC (1.10 6 / ml, RPMI / glutamax (Gibco BRL) with penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 mg / ml) and 10% pooled human AB serum (Gibco BRL) at 37 ° C. for 4 days PBMC were cultured in the presence or absence of the superantigen SEB (1 ng / ml) and / or IL4-IL10 fusion protein, after which time FcγR expression was assessed by FACS analysis For FACS analysis, monocytes were incubated with APC-labeled CD14 mAb, FITC-labeled anti-FcγRI and anti-FcgRIIImab (Pharmingen) and FITC-labeled anti-FcgRllb mab (2B6, Genmab, Utrecht, Netherlands). Cell acquisition was performed using a FACScan flow cytometer and data was analyzed using FlowJo software, version 7.5 (Tree Star Inc., Oregon, USA).

結果:SEBは、FoxP3発現の上方制御と関連する有意な増殖を誘導した。増殖およびFoxP3発現は両方とも、IL4-IL10融合タンパク質によりほとんど影響されなかった(それぞれ図6AおよびB)。対照的に、Th1およびTh17サイトカインIFNγ(左のグラフ)、IL-17(中央のグラフ)およびTNFα(右のグラフ)は、IL4-IL10融合タンパク質およびIL4とIL10との組み合わせにより、すべて強力に減少した(図6C)。まとめると、これは、IL4-10融合タンパク質が、抑制制御性CD4T細胞と、炎症促進性Th1およびTh17細胞との間のバランスを強力に改変することを実証している。   Results: SEB induced significant proliferation associated with up-regulation of FoxP3 expression. Both proliferation and FoxP3 expression were hardly affected by the IL4-IL10 fusion protein (FIGS. 6A and B, respectively). In contrast, the Th1 and Th17 cytokines IFNγ (left graph), IL-17 (middle graph) and TNFα (right graph) are all strongly reduced by the IL4-IL10 fusion protein and the combination of IL4 and IL10. (FIG. 6C). Taken together, this demonstrates that the IL4-10 fusion protein strongly alters the balance between suppressor-regulating CD4 T cells and pro-inflammatory Th1 and Th17 cells.

(実施例8)
IL4-IL10融合タンパク質、IL4、IL10およびIL4とL10との組み合わせによる、活性化Fcγ受容体IおよびIIIと、阻害性FcγRllbとの間のバランスに対するIL4-IL10融合タンパク質の効果。
方法:IgG(FcγR)に対する活性化および阻害性受容体の間のバランスは、免疫複合体により媒介される骨髄細胞およびリンパ系細胞の活性化において極めて重要な役割を果たす。単球におけるFcγRの発現に対するIL4-IL10融合タンパク質の効果を評価するために、末梢血由来単核細胞(PBMC)を、健康なドナーから単離した。T細胞依存性単球活性化を、PBMC(5.105/ml)を2日間、超抗原のブドウ球菌エンテロトキシン(SEB)(0.1ng/ml)および/またはIL4-IL10融合タンパク質の存在下または不在下で処理することにより誘導した。この培養期間後、FcγRの発現を測定した。 (Example 8)
Effect of IL4-IL10 fusion protein on the balance between activated Fcγ receptors I and III and inhibitory FcγRllb by IL4-IL10 fusion protein, IL4, IL10 and combinations of IL4 and L10.
Methods: The balance between activating and inhibitory receptors for IgG (FcγR) plays a pivotal role in the activation of bone marrow and lymphoid cells mediated by immune complexes. To evaluate the effect of IL4-IL10 fusion protein on the expression of FcγR in monocytes, peripheral blood derived mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy donors. T cell-dependent monocyte activation with PBMC (5.10 5 / ml) for 2 days in the presence or absence of superantigens staphylococcal enterotoxin (SEB) (0.1 ng / ml) and / or IL4-IL10 fusion protein Induced by treatment with. After this culture period, the expression of FcγR was measured.

結果:IL10は、FcγRI、FcγRIIaおよびFcγRIIIの発現を上方制御し(図7)、一方、IL4は、これらの条件下で、サイトカイン不在下で培養された細胞と比較して、これらの活性化FcγRの発現においてわずかな減少を示した。IL4とIL10との組み合わせおよびIL4-IL10融合タンパク質は、FcγRIおよびFcRyllaの発現を正規化した。FcγRIIIにおけるわずかな増加が、IL4とIL10との組み合わせおよびIL4-IL10融合タンパク質によりみられるが、IL10単独により誘導されるこの受容体の上方制御と比較して取るに足らないものであった。IL10単独は、阻害性FcγRIIbの発現のわずかな減少を示しているが、一方、IL4単独は、この受容体の発現のわずかな減少を示した。IL4とIL10との組み合わせ、およびIL4-IL10融合タンパク質は、阻害性FcγRIIbの発現を改変しなかった(図7)。まとめると、これは、IL4-IL10融合タンパク質が活性化FcγRの発現を安定化し、結果としてこれは、免疫複合体誘導性免疫活性化を阻害できることを実証している。   Results: IL10 upregulated the expression of FcγRI, FcγRIIa and FcγRIII (FIG. 7), while IL4, compared to cells cultured in the absence of cytokines under these conditions, There was a slight decrease in the expression of. The combination of IL4 and IL10 and IL4-IL10 fusion protein normalized FcγRI and FcRylla expression. A slight increase in FcγRIII was seen with the combination of IL4 and IL10 and the IL4-IL10 fusion protein, but insignificant compared to the upregulation of this receptor induced by IL10 alone. IL10 alone showed a slight decrease in expression of inhibitory FcγRIIb, whereas IL4 alone showed a slight decrease in expression of this receptor. The combination of IL4 and IL10 and the IL4-IL10 fusion protein did not alter the expression of inhibitory FcγRIIb (FIG. 7). Taken together, this demonstrates that the IL4-IL10 fusion protein stabilizes the expression of activated FcγR, which in turn can inhibit immune complex-induced immune activation.

(実施例9)
血液誘導性軟骨損傷のための軟骨の培養。
方法:健康なヒト関節軟骨組織を、University Medical Centre Utrechtの医学倫理規制により承認された、ドナーの死後24時間以内に上腕骨頭から得た。ドナー(n=8; 平均年齢69.8±8.7歳、3人が男性および5人が女性)は、関節障害の既知の病歴は無かった。軟骨の全層切片を、下層骨を除く上腕骨頭から無菌で切断し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)中で保存した。切離1時間以内に、切片を、小型の全層立方体外植片に切断し、無菌で秤量した(5〜15mgの範囲、精度±0.1mg)。外植片を、96ウェルの丸底マイクロタイタープレートにおいて個別に培養した(空気中5%CO2、pH7.4、37℃および湿度95%において)。培養培地は、グルタミン(2mM)、ペニシリン(100IU/mL)、硫酸ストレプトマイシン(100μg/mL; すべてPAA)、アスコルビン酸(85μΜ; Sigma)および10%熱不活性化プールヒト男性AB+血清(Gemini Bioproducts)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM; Invitrogen)で構成された。 (Example 9)
Culture of cartilage for blood-induced cartilage damage.
Methods: Healthy human articular cartilage tissue was obtained from the humeral head within 24 hours after the death of the donor, as approved by the Medical Ethics Regulations of the University Medical Center Utrecht. Donors (n = 8; mean age 69.8 ± 8.7 years, 3 men and 5 women) had no known history of joint disorders. All layer slices of cartilage were aseptically cut from the humeral head excluding the underlying bone and stored in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4). Within 1 hour of dissection, sections were cut into small full-thickness cube explants and weighed aseptically (range 5-15 mg, accuracy ± 0.1 mg). Explants were cultured individually in 96-well round bottom microtiter plates (5% CO 2 in air, pH 7.4, 37 ° C. and 95% humidity). The culture medium consists of glutamine (2 mM), penicillin (100 IU / mL), streptomycin sulfate (100 μg / mL; all PAA), ascorbic acid (85 μΜ; Sigma) and 10% heat-inactivated pooled male male AB + serum (Gemini Bioproducts) Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Invitrogen) supplemented with

各実験のために、新鮮な血液を、健康なドナー(n=8、平均年齢28.0±5.0歳、2人の男性および6人の女性)からバキュテナーチューブ(nr. 367895; Becton Dickinson)に採血した。ヒト関節出血を模倣するために、軟骨を、50% v/v全血に4日間曝露し、4日間は、関節腔からの血液の自然な排出時間であると考えられる。血液曝露後、軟骨外植片を、2回、培養条件下で45分洗浄し、すべての添加物を除去し、さらに12日間培養した。培地は4日ごとに新しくした。ドナー8人のうち5人の軟骨および血液を使用した最初の実験準備において、IL4-IL10融合タンパク質の用量応答曲線を、血液曝露期間に、0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30および100ng/mLの濃度でIL4-IL10融合タンパク質を加えることによって作成した(n=5)。別の実験において、最適濃度の10ng/mLのIL4-IL10融合タンパク質を、同様の濃度のIL10とIL4との組み合わせおよび個々の成分と比較した(それぞれ10ng/mL、n=8)。   For each experiment, fresh blood was collected from healthy donors (n = 8, mean age 28.0 ± 5.0 years, 2 men and 6 women) into vacutainer tubes (nr. 367895; Becton Dickinson) . To mimic human joint bleeding, cartilage is exposed to 50% v / v whole blood for 4 days, which is considered to be the natural drainage time of blood from the joint cavity. After blood exposure, cartilage explants were washed twice for 45 minutes under culture conditions to remove all additives and cultured for an additional 12 days. The medium was renewed every 4 days. In the initial experimental setup using cartilage and blood of 5 out of 8 donors, the dose response curve of IL4-IL10 fusion protein was 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, during the blood exposure period. It was made by adding IL4-IL10 fusion protein at concentrations of 0.3, 1, 3, 10, 30 and 100 ng / mL (n = 5). In another experiment, an optimal concentration of 10 ng / mL IL4-IL10 fusion protein was compared to similar concentrations of IL10 and IL4 combinations and individual components (10 ng / mL, n = 8, respectively).

主要な軟骨基質成分の1つであるプロテオグリカン合成速度の尺度として、硫酸塩のグリコサミノグリカン(GAG)への取込み速度を決定した。各実験の終わりに、74kBq Na2 35SO4 (NEX-041-H担体非含有; DuPont)を、各ウェルに加えた。新たに形成された硫酸化GAGのパルス標識の4時間後、軟骨試料を、冷PBSで2回洗浄し、-20℃において保存した。解凍試料を、2時間、65℃において2%パパイン(Sigma)を用いて消化した。プロテオグリカン合成速度を、0.2M NaCl中0.3Mヘキサデシルピリジニウムクロリドモノハイドレート(CPC; Sigma)によるGAGの沈殿反応により決定した。この沈殿を、3M NaClに溶解し、放射能の量を、液体シンチレーション分析により測定した。放射能カウントを、培地、標識時間および軟骨の湿重量の比放射能に対して正規化した。結果を、取り込まれた硫酸塩のナノモル/グラム軟骨組織の湿重量(nmol/h*g)として表した。 As a measure of the rate of proteoglycan synthesis, one of the major cartilage matrix components, the rate of sulfate incorporation into glycosaminoglycan (GAG) was determined. At the end of each experiment, 74 kBq Na 2 35 SO 4 (NEX-041-H carrier free; DuPont) was added to each well. Four hours after pulse labeling of newly formed sulfated GAG, cartilage samples were washed twice with cold PBS and stored at -20 ° C. The thawed sample was digested with 2% papain (Sigma) for 2 hours at 65 ° C. Proteoglycan synthesis rate was determined by precipitation reaction of GAG with 0.3M hexadecylpyridinium chloride monohydrate (CPC; Sigma) in 0.2M NaCl. This precipitate was dissolved in 3M NaCl and the amount of radioactivity was measured by liquid scintillation analysis. Radioactivity counts were normalized to the specific activity of medium, labeling time and cartilage wet weight. The results were expressed as the wet weight (nmol / h * g) of nanomole / gram cartilage tissue incorporated sulfate.

各軟骨外植片のプロテオグリカン含有量および培養培地へのプロテオグリカンの放出を、それぞれ、Alcian Blue(Sigma)を用いたGAGの染色および沈殿反応によって、軟骨試料のパパイン消化物および培養培地において達成した。染色を、620nmにおける吸光光度法により、コンドロイチン硫酸(Sigma)を参照として定量化した。結果を、mg GAG/軟骨組織の湿重量(mg/g)および4日間に放出されたmg GAG/組織の湿重量(mg/g)として、それぞれ含有量および放出に対して表した。軟骨の組成と生物活性との限局的差のため、プロテオグリカンの代謝回転パラメーターを、ランダムに得られ、個別に処理された、同じドナーの10個の軟骨外植片に対して決定した。これら10個の試料の平均を、その軟骨ドナーに関する代表的値として採用した。   Proteoglycan content of each cartilage explant and release of proteoglycan into the culture medium was achieved in papain digests and culture medium of cartilage samples by staining and precipitation reaction of GAG with Alcian Blue (Sigma), respectively. Staining was quantified by spectrophotometry at 620 nm with reference to chondroitin sulfate (Sigma). The results were expressed for content and release as mg GAG / wet weight of cartilage tissue (mg / g) and mg GAG / tissue wet weight released in 4 days (mg / g), respectively. Due to the limited differences between cartilage composition and biological activity, proteoglycan turnover parameters were determined for 10 cartilage explants of the same donor, obtained randomly and treated individually. The average of these 10 samples was taken as a representative value for that cartilage donor.

結果:50% v/vの血液に対する4日間の軟骨の曝露は、プロテオグリカン合成速度を74%強力に減少させた(図8A; p=0.043)。IL4-IL10融合タンパクの添加は、プロテオグリカン合成速度の用量依存的回復をもたらし、すなわち、0.1 ng/mLおよびそれを超えるIL4-IL10融合タンパク質において、IL4-IL10融合タンパク質を含まない血液曝露と比較して、プロテオグリカン合成速度における有意な増加が観察された(すべてp=0.043)。血液曝露によるプロテオグリカン放出の62%の増加は、0.1ng/mLおよびそれを超えるIL4-IL10融合タンパクを加えることによって(統計的に)有意に反転した(対照レベルまで復元)(図8B、すべてp=0.043、1ng/mLがp=0.080であることを除く)。これは、対照培養液とはもはや異なるプロテオグリカン放出の正常化をもたらした。合計プロテオグリカン含有量は、軟骨外植片を血液に曝露した場合、11%減少した(図8C; p=0.043)。血液曝露による含有量の減少は、IL4-IL10融合タンパク質を0.3ng/mLおよびそれを超える濃度で加えることによって相殺される(すべてp=0.043、1および100ng/mlが両方ともp=0.080であることを除く)。   Results: Exposure of cartilage for 4 days to 50% v / v blood significantly reduced the rate of proteoglycan synthesis by 74% (FIG. 8A; p = 0.043). The addition of IL4-IL10 fusion protein resulted in a dose-dependent recovery of the rate of proteoglycan synthesis, i.e. at 0.1 ng / mL and above IL4-IL10 fusion protein compared to blood exposure without IL4-IL10 fusion protein. Thus, a significant increase in the rate of proteoglycan synthesis was observed (all p = 0.043). The 62% increase in proteoglycan release with blood exposure was significantly (statistically) reversed by adding 0.1 ng / mL and above of IL4-IL10 fusion protein (recovered to control levels) (Figure 8B, all p) = 0.043, except that 1 ng / mL is p = 0.080). This resulted in normalization of proteoglycan release that was no longer different from the control culture. Total proteoglycan content was reduced by 11% when cartilage explants were exposed to blood (FIG. 8C; p = 0.043). The decrease in content due to blood exposure is offset by adding IL4-IL10 fusion protein at concentrations of 0.3 ng / mL and above (all p = 0.043, 1 and 100 ng / ml are both p = 0.080) Except that).

IL4-IL10融合タンパク質の効果を、サイトカインの組み合わせおよび個々の成分と比較するために、IL4-IL10融合タンパク質、IL4、IL10および両方の組み合わせ(各10ng/mL)を、同じアッセイにおいて試験した。プロテオグリカン合成速度は、血液曝露により76%減少した(図9A; p=0.012)。IL10およびIL4は両方とも、血液と比較した場合、合成速度が、統計的に有意に上昇した(それぞれp=0.017およびp=0.012)。同じ濃度で使用したIL4-IL10融合タンパク質もまた、プロテオグリカン合成速度を上昇させ、したがって、2種の個々のサイトカインの組み合わせと同等に有効であった(それぞれ、血液曝露と比較して241%および245%)。さらに、IL4-IL10融合タンパク質の効果は、IL10単独の効果より、統計的に有意に優れていた(p=0.025)。IL4-IL10融合タンパク質、両方のサイトカインの組み合わせおよびIL4単独を含む培養液のプロテオグリカン合成速度は、これ以上対照と統計的に有意には異ならなかった。プロテオグリカン合成の血液誘導性阻害からの完全な回復、すなわち、正常化が得られた。軟骨の血液曝露は、プロテオグリカン放出を59%増加した(図9B; p=0.017)。IL10の添加は、この放出の強化を減少させた(血液と比較してp=0.012)。IL4、IL4とIL10との組み合わせおよびIL4-IL10融合タンパク質は、血液曝露と比較した場合、放出を大幅に減少させた(すべてp=0.012)。IL4-IL10融合タンパク質は、IL10単独(p=0.012)と比較した場合より強力であり、個々のサイトカインの組み合わせと同等に有効であった(p=0.611)。   In order to compare the effects of IL4-IL10 fusion protein with cytokine combinations and individual components, IL4-IL10 fusion protein, IL4, IL10 and both combinations (10 ng / mL each) were tested in the same assay. Proteoglycan synthesis rate decreased by 76% with blood exposure (FIG. 9A; p = 0.012). Both IL10 and IL4 had a statistically significant increase in synthesis rate when compared to blood (p = 0.017 and p = 0.012 respectively). The IL4-IL10 fusion protein used at the same concentration also increased the rate of proteoglycan synthesis and was therefore as effective as the combination of the two individual cytokines (241% and 245% compared to blood exposure, respectively). %). Furthermore, the effect of the IL4-IL10 fusion protein was statistically significantly better than the effect of IL10 alone (p = 0.025). The rate of proteoglycan synthesis in cultures containing IL4-IL10 fusion protein, a combination of both cytokines and IL4 alone was not statistically significantly different from controls. Complete recovery from blood-induced inhibition of proteoglycan synthesis, ie normalization, was obtained. Cartilage blood exposure increased proteoglycan release by 59% (FIG. 9B; p = 0.017). The addition of IL10 reduced this enhanced release (p = 0.012 compared to blood). IL4, a combination of IL4 and IL10 and IL4-IL10 fusion protein significantly reduced release when compared to blood exposure (all p = 0.012). The IL4-IL10 fusion protein was more potent when compared to IL10 alone (p = 0.012) and was as effective as the individual cytokine combination (p = 0.611).

血液に曝露した軟骨は、プロテオグリカン含有量の10%の減少を示した(図9C; p=0.012)。個々のサイトカインのIL4およびIL10は、含有量のこの減少を防止しなかった(血液曝露と比較して、それぞれ、p=0.093およびp=0.327)。しかし、IL4-IL10融合タンパク質は、添加しない血液曝露と比較して、プロテオグリカン含有量を(統計的に)有意に増加させた(p=0.012)。   Cartilage exposed to blood showed a 10% decrease in proteoglycan content (FIG. 9C; p = 0.012). Individual cytokines IL4 and IL10 did not prevent this decrease in content (p = 0.093 and p = 0.327, respectively, compared to blood exposure). However, the IL4-IL10 fusion protein significantly (statistically) increased the proteoglycan content (p = 0.012) compared to blood exposure without addition.

(実施例10)
疼痛および変形性関節症に関するイヌGrooveモデル。
方法:変形性関節症に関するイヌGrooveモデルにおける疼痛および機能性能力に対するIL4-IL10融合タンパク質の効果。Grooveモデルの特徴は、ヒト変形性関節症(OA)の特徴を反映しており、ヒトOAを研究するための適切なモデルである。Grooveモデルは、変性軟骨の変化が進行しており、究極的には変形性関節症(OA)をもたらすが、滑膜炎症は時間と共に縮小するという点で独特である。このため、軟骨変性および疼痛に対する薬物治療の直接効果の評価は、炎症に対する間接的効果の可能性によりあまり影響されない。さらに、関節の損傷を引き起こし、モデルを処置に対してより感受性にする永続的な誘発は存在しないので、このモデルは独特である。OAの他の(イヌ)モデルに使用した、関節の不安定性などの関節損傷の永続的な誘発は、治療の有益な効果の可能性を相殺するものと思われる。全体的に見て、Grooveモデルは、OAによる障害が引き起こす軟骨損傷および疼痛に対するIL4-IL10融合タンパク質の治療効果を試験するために適切である。構造的変化ではなく、疼痛および機能性能力は、患者に医学的配慮を求めさせるので、これらのパラメーターは、臨床的な変形性関節症調査において非常に重要なパラメーターであると認められる。イヌモデルにおいて、疼痛および機能性能力の指標である制動、直立姿勢および推進床反力の変化を、歩行板分析(FPA)により評価することができる。関節の負荷は、関節変性の過程の段階に依存して、疼痛および機能性能力に影響を受けるものである。OA誘導後最初の2週間において、手術に関連する疼痛により引き起こされる可能性が高い、負荷軽減の明らかな減少が見出される。しかし、3週間後、OA関連疼痛の結果として、影響のある肢の確固とした負荷軽減が存在する。 (Example 10)
Canine Groove model for pain and osteoarthritis.
Methods: Effect of IL4-IL10 fusion protein on pain and functional ability in a canine Groove model for osteoarthritis. The characteristics of the Groove model reflect the characteristics of human osteoarthritis (OA) and are appropriate models for studying human OA. The Groove model is unique in that degenerative cartilage changes are progressive and ultimately result in osteoarthritis (OA), but synovial inflammation decreases with time. For this reason, the assessment of the direct effect of drug treatment on cartilage degeneration and pain is less affected by the potential for indirect effects on inflammation. Furthermore, this model is unique because there is no permanent trigger that causes joint damage and makes the model more sensitive to treatment. Permanent induction of joint damage, such as joint instability, used in other (canine) models of OA appears to offset the potential beneficial effects of treatment. Overall, the Groove model is suitable for testing the therapeutic effects of IL4-IL10 fusion proteins on cartilage damage and pain caused by OA damage. These parameters are recognized as very important parameters in clinical osteoarthritis investigations because pain and functional capacity, not structural changes, cause patients to seek medical attention. In dog models, changes in braking, standing posture and propulsive floor reaction force, which are indicators of pain and functional ability, can be evaluated by gait board analysis (FPA). Joint loading is affected by pain and functional ability, depending on the stage of the joint degeneration process. In the first two weeks after OA induction, a clear reduction in stress relief is found that is likely to be caused by surgery-related pain. However, after 3 weeks, there is a firm load reduction of the affected limb as a result of OA-related pain.

変形性関節症(OA)を、4匹の雑種犬(Mixed Breed、骨格的に成熟)の右膝に、Groove modelに従って誘導した。10の縦方向および斜め方向の溝を、深さ0.5mmで、大腿顆の体重を支える部分に作製した。出血および軟組織の損傷は可能な限り防止して、炎症性駆動モデルおよび特定の関節炎モデルとは対照的に、炎症性成分の優勢を防止した。手術後、滑膜、筋膜および皮膚を縫合した。対側の未手術の膝は、対照として機能した。1mlのIL4-IL10融合タンパク質(1ug/ml)の関節内注射を、OA誘導5週間後に与えた。(左から一番目の矢印を参照されたい)。最初の注射から2週後(7週目)、より投薬量の多い(10ug/ml)2番目の注射を与えた(左から2番目の矢印を参照されたい)。   Osteoarthritis (OA) was induced in the right knee of four mixed breed dogs (Mixed Breed, skeletally mature) according to the Groove model. Ten longitudinal and diagonal grooves were made at the depth of 0.5 mm in the part that supported the weight of the femoral condyle. Bleeding and soft tissue damage were prevented as much as possible to prevent predominance of the inflammatory component, in contrast to the inflammatory drive model and certain arthritis models. After surgery, the synovium, fascia and skin were sutured. The contralateral unoperated knee served as a control. Intra-articular injection of 1 ml IL4-IL10 fusion protein (1 ug / ml) was given 5 weeks after OA induction. (See the first arrow from the left). Two weeks after the first injection (week 7), a higher dose (10 ug / ml) of the second injection was given (see second arrow from the left).

疼痛および機能性能力の尺度とされる平地歩行パターンを、歩行板分析(FPA)により評価した。イヌモデルにおいて、制動、直立姿勢および推進反力(GRF)の縦方向の変化を、各足に関してFPAにより評価することができる。11mの通路を表面と同一平面に埋め込んだ歩行板(FP)(100Hz)により、GRFのピークをサンプリングした。力を、体重および時間により正規化し、N/kgで表した。一人の調教師が、リードによりFPの上を、並足で、一定速度(1±0.2m/秒)で先導した。良好な走りは、それぞれ、右の前足と後足または左の前足と後足の、連続した、異なる足の打ち付けから構成された。10の有効な走りを、犬の両側に関して回収し、GRFを、4本の足のそれぞれに関して平均した。FPAを、誘導入前3週間に開始して2週間ごとに実施し、誘導後8週に終了した。さらに、IL4-IL10融合タンパク質の注射(5週および7週目)後、毎日FPAを実施した。   Flat ground walking patterns, which are a measure of pain and functional ability, were evaluated by gait board analysis (FPA). In the dog model, longitudinal changes in braking, upright posture and propulsion reaction force (GRF) can be assessed by FPA for each foot. The peak of GRF was sampled by a walking board (FP) (100Hz) with an 11m passage embedded in the same plane as the surface. Force was normalized by body weight and time and expressed in N / kg. One trainer led the FP on the FP at a constant speed (1 ± 0.2m / sec) on a regular foot. A good run consisted of consecutive striking of different legs, either on the right forefoot and hind legs or on the left forefoot and hind legs, respectively. Ten valid runs were collected for both sides of the dog and the GRF was averaged for each of the four paws. FPA was started every 3 weeks starting 3 weeks prior to induction and ending 8 weeks after induction. In addition, FPA was performed daily after injection of IL4-IL10 fusion protein (weeks 5 and 7).

結果:結果は、IL4-IL10融合タンパク質注射後、OA関節の負荷(実験関節対対側の対照関節)は、注射直前の、立つ力におけるスパイクにより示されるレベル(OA前の負荷と比較して9%の阻害)と比較して、ほぼ正常化した(OA前の負荷と比較して2%の阻害)(図10)。疼痛緩和の指標である負荷に対する効果を、負荷が再度低下した後数日にわたって得た。7週目の第2回の注射後、IL4-IL10融合タンパク質の正の効果が、罹患OA関節の負荷パターンにおいて再度見られた。これは、-7%(OA前の負荷と比較して)からOA前の負荷と比較して-2%の変化により示され、再度、正常化がほぼ完了した。したがって、IL4-IL10融合タンパク質は、OAに関するこのイヌモデルにおいて疼痛を減少させることができる。   Results: Results show that after IL4-IL10 fusion protein injection, OA joint load (experimental joint vs. contralateral control joint) is at the level indicated by the spike in standing force just before injection (compared to pre-OA load). Compared to 9% inhibition), it was almost normalized (2% inhibition compared to pre-OA loading) (FIG. 10). The effect on the load, an indicator of pain relief, was obtained over several days after the load decreased again. After the second injection at week 7, the positive effect of the IL4-IL10 fusion protein was again seen in the load pattern of the affected OA joint. This was indicated by a change of -7% (compared to the load before OA) to -2% compared to the load before OA, and again normalization was almost complete. Thus, the IL4-IL10 fusion protein can reduce pain in this canine model for OA.

(実施例11)
疼痛および変形性関節症に関するイヌGrooveモデル。
方法:変形性関節症(OA)を、雑種犬(Mixed Breed、骨格的に成熟)の右の膝に、Grooveモデルに従って誘導した。10の縦方向および斜め方向の溝を、深さ0.5mmで、大腿顆の体重を支える部分に作製した。 (Example 11)
Canine Groove model for pain and osteoarthritis.
Methods: Osteoarthritis (OA) was induced in the right knee of a hybrid dog (Mixed Breed, skeletally mature) according to the Groove model. Ten longitudinal and diagonal grooves were made at the depth of 0.5 mm in the part that supported the weight of the femoral condyle.

出血および軟組織の損傷は可能な限り防止して、炎症性駆動モデルおよび特定の関節炎モデルとは対照的に、炎症性成分の優勢を防止した。手術後、滑膜、筋膜および皮膚を縫合した。対側の未手術の膝は、対照として機能した。犬を2つの群に分割した。第1群は、OA導入後5週目に、IL4-IL10融合タンパク質の関節内注射を受ける。第2群は、OA導入後5週目に、IL4およびIL10両方の遊離型の関節内注射を受ける。最初の注射から2週後(7週目)、より多い投薬量の2回目の注射を、第1群(10ug/mlのIL4-IL10融合タンパク質)および第2群(5ug/mlのIL4および5ug/mlのIL10)に与えた。   Bleeding and soft tissue damage were prevented as much as possible to prevent predominance of the inflammatory component, in contrast to the inflammatory drive model and certain arthritis models. After surgery, the synovium, fascia and skin were sutured. The contralateral unoperated knee served as a control. Dogs were divided into two groups. Group 1 receives an intra-articular injection of IL4-IL10 fusion protein 5 weeks after OA introduction. Group 2 receives free intra-articular injections of both IL4 and IL10 at 5 weeks after OA introduction. Two weeks after the first injection (week 7), a second injection of higher dosage was given to group 1 (10 ug / ml IL4-IL10 fusion protein) and group 2 (5 ug / ml IL4 and 5 ug). / ml IL10).

疼痛および機能性能力の尺度とされる平地歩行パターンを、歩行板分析(FPA)により評価した。イヌモデルにおいて、制動、直立姿勢および推進床反力(GRF)の縦方向の変化を、各足に関してFPAにより評価することができる。11mの通路を表面と同一平面に埋め込んだ歩行板(FP)(100Hz)により、GRFのピークをサンプリングした。力を、体重および時間により正規化し、N/kgで表す。一人の調教師が、リードによりFPの上を、並足で、一定速度(1±0.2m/s)で先導した。良好な走りは、それぞれ、右の前足と後足または左の前足と後足の、連続した、異なる足の打ち付けから構成される。10の有効な走りを、犬の両側に関して回収し、GRFを、4本の足のそれぞれに関して平均する。FPAを、誘導前3週間に開始して2週間ごとに実施し、誘導後8週に終了する。両方の群において、5週目および7週目の両方において行った、IL4-IL10融合タンパク質の注射(第1群)ならびにIL4およびIL10の遊離型の注射(第2群)後、追加の毎日のFPAを実施する。   Flat ground walking patterns, which are a measure of pain and functional ability, were evaluated by gait board analysis (FPA). In the dog model, the longitudinal changes in braking, upright posture and propulsive floor reaction force (GRF) can be assessed by FPA for each foot. The peak of GRF was sampled by a walking board (FP) (100Hz) with an 11m passage embedded in the same plane as the surface. Force is normalized by weight and time and expressed in N / kg. One trainer led the FP on the FP at a constant speed (1 ± 0.2m / s). A good run consists of striking consecutive, different legs, either on the right forefoot and hind legs or on the left forefoot and hind legs, respectively. Ten valid runs are collected for both sides of the dog and the GRF is averaged for each of the four paws. FPA begins 3 weeks prior to induction, every 2 weeks, and ends 8 weeks after induction. In both groups, additional daily after IL4-IL10 fusion protein injection (Group 1) and free injection of IL4 and IL10 (Group 2), both at 5 and 7 weeks. Implement FPA.

結果:結果は、両方の注射(5週目および7週目)後、IL4-IL10融合タンパク質(1群)またはIL4とIL10との遊離型の組み合わせ(2群)のいずれかを用いた処置が、罹患OA関節の負荷パターンに正の効果を生み出すことを示す。しかし、罹患OA関節の負荷パターンにおいて、5週目および7週目の両方において行った、IL4-IL10融合タンパク質を用いた処置に対する応答において、IL4とIL10との遊離型組み合わせを用いた処置と比較してより大きな改善が観察される。IL4-IL10融合タンパク質を用いた処置の効果が、IL4とIL10との遊離型の組み合わせを用いた処置の効果より、長い時間持続することがさらに観察された。したがって、本発明のIL4-IL10融合タンパク質は、OAに関するイヌモデルにおいて、IL4とIL10との遊離型の組み合わせにより達成されるものより非常に高い程度で疼痛を減少させることができる。   Results: Results show that after both injections (weeks 5 and 7), treatment with either IL4-IL10 fusion protein (Group 1) or a free combination of IL4 and IL10 (Group 2) Shows that it produces a positive effect on the loading pattern of the affected OA joint. However, compared to treatment with a free combination of IL4 and IL10 in response to treatment with the IL4-IL10 fusion protein, both at 5 and 7 weeks, in the load pattern of the affected OA joint Greater improvements are observed. It was further observed that the effect of treatment with the IL4-IL10 fusion protein lasted longer than the effect of treatment with the free combination of IL4 and IL10. Thus, the IL4-IL10 fusion protein of the present invention can reduce pain in a canine model for OA to a much greater extent than that achieved by the free combination of IL4 and IL10.

(実施例12)
痛覚過敏に関するネズミカラギーナン誘導性モデル。
方法:痛覚過敏を、雌C57BL/6マウスに、生理食塩水で希釈した5μlのλ-カラギーナン(2% w/v; Sigma- Aldrich、St. Louis、MO、USA)を、0日目に後足に足底内注射することによって誘導した(図11の左から1番目の矢印を参照されたい)。生理食塩水単独の足底内注射は、検出可能な痛覚過敏を誘導しなかった。足を逃避させる潜時として測定される、赤外線熱刺激に対する応答を、Hargreaves試験(IITC Life Science、Woodland Hills、CA)を使用して決定した。光線の強度を、およそ8秒の熱逃避潜時時間を誘導するように、ベースラインにおいて選択した。ベースライン逃避潜時を、連続3日間決定した。マウスは、カラギーナン注射後少なくとも10日続く、逃避潜時の減少により裏付けられる痛覚過敏を発症した。6日目に、マウスに、IL4(100ng)、IL10(100ng)もしくはIL4-IL10融合タンパク質(40、100および200ng)またはビヒクル(生理食塩水)のいずれかの単回髄腔内注射を与えた(図11および12の矢印を参照されたい)。 (Example 12)
A murine carrageenan-inducible model for hyperalgesia.
Method: Hyperalgesia was induced in female C57BL / 6 mice with 5 μl of λ-carrageenan (2% w / v; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) diluted in saline on day 0. It was induced by intraplantar injection into the foot (see first arrow from the left in FIG. 11). Intraplantar injection of saline alone did not induce detectable hyperalgesia. Response to infrared thermal stimulation, measured as latency to escape the paw, was determined using the Hargreaves test (IITC Life Science, Woodland Hills, CA). The light intensity was selected at baseline to induce a thermal escape latency of approximately 8 seconds. Baseline escape latency was determined for 3 consecutive days. Mice developed hyperalgesia supported by a decrease in escape latency that lasted at least 10 days after carrageenan injection. On day 6, mice received a single intrathecal injection of either IL4 (100 ng), IL10 (100 ng) or IL4-IL10 fusion protein (40, 100 and 200 ng) or vehicle (saline). (See arrows in FIGS. 11 and 12).

結果:マウスは、カラギーナン注射後6日まで、逃避潜時の減少により示される痛覚過敏を示す(図11)。6日目に、マウスに、100ngのIL4-IL10融合タンパク質(n=4)または対照として生理食塩水(n=4)の単回髄腔内注射を与えた。IL4-IL10融合タンパク質注射後、ベースラインまで戻った足逃避潜時値の減少により裏付けられるように、痛覚過敏が阻害された(図11)。IL4-IL10融合タンパク質の単回投薬量の効果は、2日まで続いた。48時間後、効果は低下したが、対照の生理食塩水処置マウスにおける潜時の減少%とは、未だ有意に異なった。(図11)。   Results: Mice show hyperalgesia indicated by a decrease in escape latency until day 6 after carrageenan injection (Figure 11). On day 6, mice received a single intrathecal injection of 100 ng IL4-IL10 fusion protein (n = 4) or saline (n = 4) as a control. Hyperalgesia was inhibited as evidenced by a decrease in foot escape latency that returned to baseline after IL4-IL10 fusion protein injection (FIG. 11). The effect of a single dose of IL4-IL10 fusion protein lasted until 2 days. After 48 hours, the effect diminished but was still significantly different from the% latency reduction in control saline-treated mice. (Figure 11).

上記の同じ方法論を使用する相補的な実験において、カラギーナン誘導性熱痛覚過敏を、IL4、IL10またはIL4-IL10融合タンパク質を用いて処置したマウスにおいてさらに評価した。詳細には、IL4もしくはIL10のいずれか(A)またはIL4-IL10融合タンパク質(B)の髄腔内注射を、痛覚過敏誘導6日後に与えた(図12)。IL4およびIL10は両方とも、足底内カラギーナン疼痛応答に対する痛覚過敏応答をわずかに減少させたが、この効果は、IL4-IL10融合タンパク質の効果と比較して取るに足らないものであった(図12)。IL4またはIL10個別の効果は1日続いたが、一方、IL4-IL10融合タンパク質の効果ははるかにより長期間、すなわち4日まで続いた(図12B)。   In complementary experiments using the same methodology described above, carrageenan-induced thermal hyperalgesia was further evaluated in mice treated with IL4, IL10 or IL4-IL10 fusion proteins. Specifically, intrathecal injection of either IL4 or IL10 (A) or IL4-IL10 fusion protein (B) was given 6 days after hyperalgesia induction (FIG. 12). Both IL4 and IL10 slightly reduced the hyperalgesic response to the incarpal carrageenan pain response, but this effect was insignificant compared to the effect of the IL4-IL10 fusion protein (Fig. 12). The individual effects of IL4 or IL10 lasted for 1 day, while the effects of IL4-IL10 fusion protein lasted much longer, ie up to 4 days (FIG. 12B).

(実施例13)
痛覚過敏に関するネズミカラギーナン誘導性モデル。
方法:痛覚過敏を、雌C57BL/6マウスに、生理食塩水で希釈した5μlのλ-カラギーナン(2% w/v; Sigma- Aldrich、St. Louis、MO、USA)を、0日目に後足に足底内注射することによって誘導する。生理食塩水単独の足底内注射は、検出可能な痛覚過敏を誘導しない。足を逃避させる潜時として測定される、赤外線熱刺激に対する応答を、Hargreaves試験(IITC Life Science、Woodland Hills、CA)を使用して決定する。光線の強度を、およそ8秒の熱逃避潜時時間を誘導するように、ベースラインにおいて選択する。ベースライン逃避潜時を、連続3日間決定する。マウスは、カラギーナン注射後少なくとも10日続く、逃避潜時の減少により裏付けられる痛覚過敏を発症する。6日目に、マウスに、IL4-IL10融合タンパク質(40、100および200ng)もしくはIL4(100ng)とIL10(100ng)との遊離型の組み合わせを含有する溶液またはビヒクル(生理食塩水)の単回髄腔内注射を与える。 (Example 13)
A murine carrageenan-inducible model for hyperalgesia.
Method: Hyperalgesia was induced in female C57BL / 6 mice with 5 μl of λ-carrageenan (2% w / v; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) diluted in saline on day 0. Induced by intraplantar injection into the foot. Intraplantar injection of saline alone does not induce detectable hyperalgesia. Response to infrared thermal stimulation, measured as latency to escape the paw, is determined using the Hargreaves test (IITC Life Science, Woodland Hills, CA). The light intensity is selected at baseline to induce a thermal escape latency of approximately 8 seconds. Baseline escape latency is determined for 3 consecutive days. Mice develop hyperalgesia supported by a decrease in escape latency that lasts at least 10 days after carrageenan injection. On day 6, mice were given a single dose of a solution or vehicle (saline) containing IL4-IL10 fusion protein (40, 100 and 200 ng) or a free combination of IL4 (100 ng) and IL10 (100 ng). Give an intrathecal injection.

結果:結果は、対照状況(ビヒクル処置)と比較して、IL4-IL10融合タンパク質またはIL4とIL10との遊離型の組み合わせのいずれかによる処置が、痛覚過敏の有意な減少を生み出すことを示す。しかし、IL4-IL10融合タンパク質を用いた処置が、IL4とIL10との遊離型の組み合わせに基づく処置より、痛覚過敏に対するより大きな阻害効果を発揮することが観察されている。IL4-IL10融合タンパク質の単回投薬量の痛覚過敏に対する効果が、個々のサイトカイン(すなわち、IL4とIL10との遊離型の組み合わせ)の等価な投薬量の効果より、はるかにより長期間持続することが、さらに観察される。   Results: The results show that treatment with either IL4-IL10 fusion protein or a free combination of IL4 and IL10 produces a significant reduction in hyperalgesia compared to the control situation (vehicle treatment). However, it has been observed that treatment with IL4-IL10 fusion protein exerts a greater inhibitory effect on hyperalgesia than treatment based on the free combination of IL4 and IL10. The effect of a single dose of IL4-IL10 fusion protein on hyperalgesia may last much longer than the effect of an equivalent dose of an individual cytokine (i.e., a free combination of IL4 and IL10) Further observed.

(実施例14)
全血培養液におけるLPS誘導性TNF産生に対するIL4-IL10融合タンパク質の活性。
方法:全血におけるリポ多糖類(LPS)により誘導されるサイトカインの放出(TNFα)をIL4-IL10融合タンパク質の活性のための機能性アッセイとして使用した。ヘパリン添加ヒト血液を健康なボランティアから得、Pen/Strep(PAA Laboratories、Pasching、Austria; Cat# P11-013)を添加したRPMI 1640培養培地(Glutamax; Invitrogen、Cat# 61870010)で1:10に希釈した。LPS(リポ多糖類; Sigma; Cat# L4391)を加え、最終濃度10ng/mlを得た。異なるIL4-IL10融合タンパク質構築体を含有する4種の異なるプールを試験した。プールの間の差は、IL4がIL10に連結された様式に存在する(例えば、IL4のc末端がIL10のn末端に連結された、またはその逆)。異なる構築体を、最終濃度2、10、20、30、40および50ng/mlで加えた。全血培養液を、その後、18時間、37℃においてインキュベートし、上清を回収後、-80℃でTNFα含有量に関する試験まで保存した。上清中のTNFαレベルを、ELISAアッセイを使用して測定した(上の実施例2および5に記載)。 (Example 14)
Activity of IL4-IL10 fusion protein on LPS-induced TNF production in whole blood cultures.
Methods: Lipopolysaccharide (LPS) -induced cytokine release (TNFα) in whole blood was used as a functional assay for the activity of IL4-IL10 fusion protein. Heparinized human blood was obtained from healthy volunteers and diluted 1:10 in RPMI 1640 culture medium (Glutamax; Invitrogen, Cat # 61870010) supplemented with Pen / Strep (PAA Laboratories, Pasching, Austria; Cat # P11-013) did. LPS (lipopolysaccharide; Sigma; Cat # L4391) was added to obtain a final concentration of 10 ng / ml. Four different pools containing different IL4-IL10 fusion protein constructs were tested. Differences between pools exist in a manner in which IL4 is linked to IL10 (eg, the c-terminus of IL4 is linked to the n-terminus of IL10, or vice versa). Different constructs were added at final concentrations of 2, 10, 20, 30, 40 and 50 ng / ml. Whole blood cultures were then incubated for 18 hours at 37 ° C., and supernatants were collected and stored at −80 ° C. until testing for TNFα content. TNFα levels in the supernatant were measured using an ELISA assay (described in Examples 2 and 5 above).

結果:結果は、TNFα産生の阻害%として示す。IL4-IL10融合タンパク質の不在下において、TNFα産生の阻害は観察されなかった。IL4のc末端がIL10のn末端に連結される、プール2および4は、IL10のc末端がIL4のn末端に連結される(同じ濃度で使用した)プール1および3と比較して、TNFα産生の最も高い阻害を示した。これらの結果は、IL4-IL10融合タンパク質の機能性が、個々のサイトカインがIL4-IL10融合タンパク質内で連結される様式に依存することを示している。   Results: Results are expressed as% inhibition of TNFα production. In the absence of IL4-IL10 fusion protein, no inhibition of TNFα production was observed. Pools 2 and 4, in which the c-terminus of IL4 is linked to the n-terminus of IL10, are compared to pools 1 and 3, in which the c-terminus of IL10 is linked to the n-terminus of IL4 (used at the same concentration). It showed the highest inhibition of production. These results indicate that the functionality of the IL4-IL10 fusion protein depends on the manner in which individual cytokines are linked within the IL4-IL10 fusion protein.

Claims (12)

インターロイキン4およびインターロイキン10を含む融合タンパク質であって、変形性関節症、慢性疼痛、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化および/またはリンパ球増殖により特徴付けられる病態の予防または治療における使用のための、融合タンパク質。   A fusion protein comprising interleukin 4 and interleukin 10 in the prevention or treatment of pathological conditions characterized by osteoarthritis, chronic pain, local or systemic inflammation, immune activation and / or lymphocyte proliferation A fusion protein for use. 局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化、リンパ球増殖および/または慢性疼痛により特徴付けられる前記病態が、敗血症、成人性呼吸促迫症候群、同種および異種移植、皮膚炎、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、アレルギー、乾癬、強直性脊椎関節炎、自己免疫疾患、糸球体腎炎、免疫複合体誘導性および他の型の脈管炎、多発性硬化症、シェーグレン病、痛風、リンパ球増殖性疾患、非ホジキンリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病、熱傷、多発性損傷、脳卒中、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、糖尿病、体外透析および血液酸素化、虚血性再灌流障害、サイトカインもしくは治療用モノクローナル抗体のin vivo投与により誘導される毒性、慢性疼痛症候群ならびに神経障害性および/または炎症性の疼痛からなる群から選択される、請求項1に記載の使用のための融合タンパク質。   The pathological conditions characterized by local or systemic inflammation, immune activation, lymphocyte proliferation and / or chronic pain are sepsis, adult respiratory distress syndrome, allogeneic and xenografts, dermatitis, inflammatory bowel disease, sarcoidosis , Allergy, psoriasis, ankylosing spondyloarthritis, autoimmune disease, glomerulonephritis, immune complex-induced and other types of vasculitis, multiple sclerosis, Sjogren's disease, gout, lymphoproliferative disease, non-Hodgkin Lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia, burns, multiple injuries, stroke, myocardial infarction, atherosclerosis, diabetes, in vitro dialysis and blood oxygenation, ischemic reperfusion injury, cytokines or therapeutic monoclonal antibodies in vivo Selected from the group consisting of administration-induced toxicity, chronic pain syndrome and neuropathic and / or inflammatory pain A fusion protein for use according to claim 1. 前記インターロイキン4および前記インターロイキン10が、リンカー配列により連結される、請求項1または2に記載の使用のための融合タンパク質。   The fusion protein for use according to claim 1 or 2, wherein the interleukin 4 and the interleukin 10 are linked by a linker sequence. 前記インターロイキン4が、前記インターロイキン10のN末端に融合される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。   The fusion protein for use according to any one of claims 1 to 3, wherein the interleukin 4 is fused to the N-terminus of the interleukin 10. 前記インターロイキン10が、前記インターロイキン4のN末端に融合される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。   The fusion protein for use according to any one of claims 1 to 3, wherein the interleukin 10 is fused to the N-terminus of the interleukin 4. 1または複数の化学的修飾をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。   6. A fusion protein for use according to any one of claims 1 to 5, further comprising one or more chemical modifications. 前記化学的修飾が、グリコシル化、フコシル化、シアリル化およびペグ化からなる群から選択される、請求項6に記載の使用のための融合タンパク質。   7. A fusion protein for use according to claim 6, wherein the chemical modification is selected from the group consisting of glycosylation, fucosylation, sialylation and pegylation. 前記インターロイキン10がヒトインターロイキン10である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。   The fusion protein for use according to any one of claims 1 to 7, wherein the interleukin 10 is human interleukin 10. 前記インターロイキン4がヒトインターロイキン4である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。   The fusion protein for use according to any one of claims 1 to 8, wherein the interleukin 4 is human interleukin 4. 前記融合タンパク質が、前記融合タンパク質および医薬として許容される担体を含む医薬組成物に含まれる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。   The fusion protein for use according to any one of claims 1 to 9, wherein the fusion protein is comprised in a pharmaceutical composition comprising the fusion protein and a pharmaceutically acceptable carrier. 変形性関節症、慢性疼痛、局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化および/またはリンパ球増殖により特徴付けられる病態の予防または治療における使用のための、請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクター。   11. Any one of claims 1 to 10 for use in the prevention or treatment of a pathological condition characterized by osteoarthritis, chronic pain, local or systemic inflammation, immune activation and / or lymphocyte proliferation. A gene therapy vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein described in 1. 局所性もしくは全身性の炎症、免疫活性化および/またはリンパ球増殖により特徴付けられる前記病態が、敗血症、成人性呼吸促迫症候群、同種および異種移植、皮膚炎、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、アレルギー、乾癬、強直性脊椎関節炎、自己免疫疾患、糸球体腎炎、免疫複合体誘導性および他の型の脈管炎、多発性硬化症、シェーグレン病、痛風、リンパ球増殖性疾患、非ホジキンリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病、熱傷、多発性損傷、脳卒中、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、糖尿病、体外透析および血液酸素化、虚血性再灌流障害、サイトカインもしくは治療用モノクローナル抗体のin vivo投与により誘導される毒性、慢性疼痛症候群ならびに神経障害性および/または炎症性の疼痛からなる群から選択される、請求項11に記載の使用のための遺伝子療法ベクター。   Said pathological condition characterized by local or systemic inflammation, immune activation and / or lymphocyte proliferation is sepsis, adult respiratory distress syndrome, allogeneic and xenograft, dermatitis, inflammatory bowel disease, sarcoidosis, allergy, Psoriasis, ankylosing spondyloarthritis, autoimmune disease, glomerulonephritis, immune complex-induced and other types of vasculitis, multiple sclerosis, Sjogren's disease, gout, lymphoproliferative disease, non-Hodgkin's lymphoma and B Induced by in vivo administration of cellular chronic lymphocytic leukemia, burns, multiple injuries, stroke, myocardial infarction, atherosclerosis, diabetes, extracorporeal dialysis and blood oxygenation, ischemic reperfusion injury, cytokines or therapeutic monoclonal antibodies Selected from the group consisting of toxicity, chronic pain syndrome and neuropathic and / or inflammatory pain A gene therapy vector for use according to 11.
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