ES2709190T3 - Composiciones de vacuna contra el virus de la diarrea viral bovina tipo 1B y procedimientos - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende: un virus de la diarrea viral bovina de tipo 1b (BVDV1b), atenuado, vivo, modificado, en la que el BVDV1b vivo, modificado es una cepa depositada bajo el número de acceso de la ATCC PTA-11553.

Description

DESCRIPCION

Composiciones de vacuna contra el virus de la diarrea viral bovina tipo 1B y procedimientos

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a los campos de la medicina veterinaria y vacunas para animales. Mas particularmente, se refiere a composiciones inmunogenicas, procedimientos para elaboracion de tales composiciones y procedimientos para prevenir, tratar, mejorar y/o manejar infecciones microbianas o virales, o un smtoma de las mismas, y particularmente infecciones respiratorias en ganado mairnfero, incluyendo enfermedades multifactoriales tales como complejo de enfermedades respiratorias bovinas (BRDC). Se divulgan composiciones antigenicas y procedimientos para su uso en la formulacion y administracion de agentes profilacticos y terapeuticos para prevenir, tratar y/o aliviar uno o mas smtomas de la infeccion por pestivirus, y en particular los pestivirus responsables o implicados en la fiebre del embarque, BRDC y diarrea viral bovina en animales susceptibles o infectados.

Descripcion del estado de la tecnica relacionado

BRDC es un complejo de enfermedad multifactorial que afecta con frecuencia a los terneros para carne/leche en los canales de comercializacion y en los pastos o corrales de engorde de destino. Los principales agentes etiologicos bacterianos de esta enfermedad son Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni (anteriormente Haemophilus somnus) y Micoplasma bovis. Los agentes virales que se han asociado con la fiebre del embarque son herpesvirus bovino tipo 1 (BHV-1), parainfluenza III, (PI3) Virus sincitial respiratorio bovino (BRSV) y Virus de la diarrea viral bovina (BVDV).

Virus de la diarrea viral bovina (BVDV)

El BVDV se reconoce ahora como un agente etiologico importante en el complejo de enfermedades respiratorias bovinas (BRDC), (a menudo conocido como "fiebre del embarque"). La enfermedad, que infecta al ganado de todas las edades (incluidos los terneros lactantes), se caracteriza por la respiracion rapida, la tos, la depresion, la perdida de apetito, la descarga ocular y nasal y las temperaturas elevadas. En un brote agudo, la muerte puede sobrevenir dentro de las 24 horas posteriores al inicio de los smtomas. El tratamiento del BVDV es problematico debido a la ausencia de terapias antivirales y la tasa de mortalidad por infeccion de pestivirus es alta. Ademas, el tratamiento de los patogenos bacterianos involucrados en BRDC tambien se complica en muchos casos por la resistencia antimicrobiana a los farmacos terapeuticos.

Los virus de la diarrea viral bovina son un grupo dispar de virus que se pueden clasificar fenotfpicamente (vease, por ejemplo, Baker, 1995) (citopatico o no citopatico) y genotfpicamente (vease, por ejemplo, Ridpath et al., 1994; Vilcek et al., 2001 y Flores et al., 2002). El establecimiento de una inmunidad protectora contra el BVDV en el ganado ha sido problematico por varias razones. Al igual que en otras enfermedades mediadas por virus, los niveles de anticuerpos sericos contra el BVDV no se correlacionan necesariamente con la proteccion contra la enfermedad. El establecimiento de inmunidad protectora en los terneros lactantes presenta obstaculos adicionales, ya que los anticuerpos maternos contra el BVDV pueden agotar el inmunogeno inyectado y neutralizar efectivamente la vacuna. Un estudio de Fulton et al., (2006) evaluo 21.743 terneros que ingresaron en los lotes de engorde de los Estados Unidos y determino que 88 terneros se infectaron persistentemente (PI) con el BVDV. De los 88 terneros con PI, 77,9% estaban infectados con BVDV-1b; solo el 11,6% estaba infectado con BVDV-1a, y solo el 10,5% estaba infectado con BVDV-2a. Desafortunadamente, si bien estos datos demostraron claramente que el BVDV-1b es el subtipo predominante del ganado con PI que ingresa a los lotes de engorde domesticos, actualmente no existen vacunas con licencia del USDA que sean espedficas para la infeccion por BVDV-1b. Fulton et al., (Can J Vet Res: Vol. 66, 181-109; 2002) tambien divulgo que BVDV-1b es el subtipo de BVDV predominante en terneros con enfermedad respiratoria.

Por lo tanto, por estas y otras razones inherentes a la tecnica anterior, existe la necesidad de formulaciones de vacuna para el BVDV que provoquen una respuesta inmunitaria vigorosa y multifacetica, y particularmente aquellas que provoquen una respuesta inmunitaria contra la forma Tipo 1b del BVDV. .

Debido a la posibilidad de una gran perdida economica en hatos no vacunados, existe la necesidad de vacunas rentables (y preferiblemente de una sola dosis) que contengan el virus BVDV-1b vivo, modificado, que induzca profilaxis contra las infecciones por BVDV en poblaciones de ganado de mai^eras.

Asimismo, debido a que las vacunas polivalentes contemporaneas contra enfermedades multifactoriales tales como BRDC y las enfermedades relacionadas con la fiebre del embarque son en gran medida ineficaces para prevenir la infeccion por BVDV-1b, tambien existe la necesidad de mejorar las modalidades de vacunacion para mejorar la profilaxis y el control del brote de la enfermedad en ganado susceptible al BVDV-1b.

Breve sumario de la invencion

La presente invencion abarca composiciones nuevas y utiles, asf como procedimientos para su empleo que pueden mejorar ventajosamente la administracion de agentes profilacticos y/o terapeuticos a un animal que lo necesite. La invencion proporciona composiciones de vacunas que ofrecen ventajas sobre las formulaciones convencionales, y espedficamente proporcionan formas de prevenir o controlar enfermedades causadas por uno o mas pestivirus, y en particular, aquellas causadas por virus BVDV, incluidas las del subgenotipo Tipo 1b (es decir, BVDV-1b). El alcance de la invencion esta de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.

En un sentido global y general, la presente invencion abarca composiciones y procedimientos para su uso en la prevencion, tratamiento y/o manejo de infecciones virales y/o microbianas, patogenesis y enfermedades. Las composiciones inmunogenicas divulgadas en el presente documento, asf como los procedimientos que las emplean, encuentran un uso particular en la prevencion, tratamiento y/o mejona de uno o mas smtomas de la fiebre del embarque/BRDC en mairnferos susceptibles utilizando las composiciones de vacunas de la invencion y los procedimientos que las emplean que son superior para la prevencion/tratamiento convencional de la fiebre del embarque actualmente disponibles en las artes medicas veterinarias.

En realizaciones particulares, la presente invencion proporciona composiciones inmunogenicas que comprenden virus BVDV-1b vivos modificados, asf como formulaciones farmaceuticas que los contienen, y procedimientos para usar tales vacunas en una variedad de regfmenes profilacticos. Dichas composiciones y procedimientos encuentran uso particular en la prevencion de enfermedades vmcas y multifactoriales en animales tales como ganado mamffero que son susceptibles a la infeccion por el BVDV.

En realizaciones relacionadas, la invencion tambien proporciona procedimientos para usar las composiciones de vacuna divulgadas para provocar una respuesta inmunologica espedfica al virus en un animal.

En un sentido global y general, tales procedimientos generalmente implican proporcionar a un animal seleccionado una o mas de las composiciones inmunogenicas divulgadas en este documento en cantidad o cantidades y durante un tiempo efectivo para provocar una respuesta inmunologica espedfica al virus en un animal, y, en particular, una respuesta inmunologica espedfica al BVDV. En tales realizaciones, el animal es preferiblemente un mamffero de pezuna hendida, y mas preferiblemente, un miembro de la familia Bovidae.

La invencion tambien proporciona un procedimiento para prevenir o controlar un brote de infeccion o infecciones virales y/o microbianas (e infecciones pestivirales causadas por el BVDV y especies relacionadas en particular) en una o mas poblaciones de marnfferos seleccionados. El procedimiento generalmente implica proporcionar a un miembro susceptible o en riesgo de tal poblacion, una cantidad efectiva de una o mas de las composiciones inmunogenicas o de vacuna divulgadas, durante un tiempo suficiente para retrasar, disminuir, reducir, inhibir y/o prevenir el brote de tal infeccion en la poblacion general. Los ejemplos de poblaciones de mamfferos incluyen, sin limitacion, miembros de los Bovinae y Caprinae, y en particular los de los generos Bison, Bos, Bubalus, Capra, Oreamnos, Ovibos, Ovis, Syncerus y similares. En realizaciones ilustrativas, estos procedimientos son particularmente deseables en el tratamiento de ganado comercial en los generos Bison, Bos, Capra y Ovis, incluyendo, sin limitacion, Bison bison, Bos taurus, Capra hircus y Ovis aries.

En otro aspecto, la invencion proporciona un procedimiento para estimular el sistema inmune de un animal para producir una respuesta inmune protectora contra una infeccion viral, y en particular, una infeccion virulenta de pestivirus para Bovidae. Dicho procedimiento generalmente implica al menos administrar a un animal que lo necesite, una cantidad inmunologicamente y profilacticamente efectiva de una o mas de las composiciones de vacuna divulgadas en una cantidad y durante un tiempo suficiente para estimular el sistema inmunologico del animal. En la practica convencional de este procedimiento en una realizacion, la administracion de una o mas de las composiciones de vacuna inmunologica y profilacticamente activas divulgadas preferiblemente inducen al menos una primera cantidad detectable de anticuerpos antipestivirus en el animal, y mas preferiblemente aun, induce al menos una primera cantidad detectable de anticuerpos anti-BVDV-lb en el animal. En realizaciones preferidas, la administracion de la composicion preferiblemente inmuniza al animal contra una infeccion inicial, posterior y/o recurrente por el virus BVDV-1b, y en deltas realizaciones, tambien inmuniza preferiblemente al animal contra una infeccion inicial, posterior y/o recurrente por uno o mas virus geneticamente similares o epitopicamente relacionados, incluidos, por ejemplo, uno o mas tipos, cepas y subtipos del virus BVDV (incluidos, sin limitacion, BVDV-1a, BVDV-2 y otros pestivirus geneticamente similares).

En otra realizacion mas, la invencion proporciona un procedimiento para producir una respuesta inmune protectora contra pestivirus en un animal. Dicho procedimiento generalmente incluye proporcionar a un animal que lo necesite una cantidad inmunologica y profilacticamente eficaz de una o mas de las composiciones inmunogenicas de BVDV-1b divulgadas en condiciones y durante un tiempo suficiente para producir dicha respuesta inmune protectora contra una o mas especies, subespecies o cepas de pestivirus, y preferiblemente, contra una o mas especies, cepas, subtipos o serotipos del BVDV.

Asimismo, la invencion tambien divulga un procedimiento para proporcionar una composicion profilactica o terapeutica a una primera celula en un huesped mamnfero. Este procedimiento generalmente implica proporcionar a un mamftero que lo necesite una cantidad profilactica o terapeuticamente eficaz de una o mas de las composiciones inmunogenicas espedficas del BVDV divulgadas en este documento, bajo condiciones y durante un tiempo efectivo para proporcionar la composicion a al menos una primera celula, tejido, organo u sistema de organos en tal mairnfero.

La presente invencion tambien divulga un procedimiento para prevenir, tratar y/o mejorar uno o mas smtomas de infeccion por el BVDV en un mamftero. Dicho procedimiento generalmente incluye proporcionar al mamftero que lo necesite una cantidad inmunologica y profilacticamente eficaz de una o mas de las composiciones inmunogenicas del BVDV-1b divulgadas en condiciones y durante un tiempo suficiente para prevenir, tratar y/o mejorar uno o mas smtomas de la infeccion por BVDV en el mamftero.

Asimismo, la presente invencion tambien divulga procedimientos para prevenir, tratar y/o mejorar uno o mas smtomas de una enfermedad multifactorial tal como BRDC en un mamftero, y particularmente en aquellas enfermedades en las cuales la infeccion por al menos un primer BVDV esta implicada como un agente causal o contribuyente de la enfermedad. Dichos procedimientos generalmente implican administrar a un mamftero seleccionado al menos una primera cantidad inmunologica o profilacticamente eficaz de al menos una primera composicion de vacuna anti-BVDV-lb en condiciones y durante un tiempo suficiente para prevenir, tratar y/o mejorar uno o mas smtomas de la enfermedad en el mamftero.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona un procedimiento para prevenir, tratar y/o mejorar uno o mas smtomas de fiebre del embarque en un miembro de la familia Bovidae. Tal procedimiento generalmente incluye proporcionar al bovido al menos una primera cantidad inmunologica o profilacticamente efectiva de una primera composicion que comprende una poblacion de virus BVDV-1b vivos modificados en condiciones y durante un tiempo suficiente para prevenir, tratar y/o mejorar uno o mas smtomas de la fiebre del embarque en el bovido.

Composiciones inmunogenicas

Con el fin de proporcionar una proteccion mas amplia contra uno o mas pestivirus, y en particular, uno o mas de los agentes virales implicados en el BRDC y fiebre del embarque en miembros de la familia Bovidae, los inventores han desarrollado formulaciones de vacunas seguras y eficaces que incluyen uno o mas antfgenos espedficos para el BVDV-1b. Se han descrito formulaciones de vacunas tanto monovalentes como polivalentes, incluidas aquellas que contienen, en el caso de vacunas monovalentes, uno o mas antfgenos, epftopos o virus vivos modificados que provocan una respuesta inmunitaria espedfica para el BVDV solo o, en casos de vacunas polivalentes, uno o mas antfgenos, epftopos o virus vivos modificados que provocan respuestas inmunitarias espedficas no solo para el BVDV, sino tambien para uno o mas patogenos adicionales.

En realizaciones ilustrativas, se ha desarrollado una composicion inmunogenica monovalente que comprende al BVDV-1b vivo modificado para proteger al ganado de la infeccion por BVDV-1b. Ademas, la presente invencion tambien ha proporcionado composiciones inmunogenicas multivalentes espedficas para BRDC y fiebre del embarque relacionadas, que incluyen una formulacion ejemplar viral bovina viva modificada de seis vfas (es decir, "hexavalente") que incluye componentes antigenicos para inducir espedficamente una respuesta inmunitaria contra uno o mas, preferiblemente dos o mas, y mas preferiblemente tres o mas del BHV-1, PI3, BRSV, dos subgenotipos del BVDV tipo 1 (1a y 1b), y BVDV tipo 2 en un animal. En una realizacion mas preferida, la formulacion induce una respuesta inmune contra cada uno de los anteriores, tfpicamente a niveles variables.

En otras realizaciones, la invencion proporciona formulaciones de vacunas que contienen los inmunogenos mencionados anteriormente, y procedimientos para su uso en la profilaxis, terapia y/o mejona de uno o mas smtomas de una infeccion por pestivirus en un animal, y en particular, una Infeccion por BVDV-1b en ganado mamftero. La invencion abarca ademas formulaciones de vacunas y procedimientos que las emplean en la prevencion, tratamiento y/o mejona de uno o mas smtomas de una fiebre del embarque, tal como BRDC, en bovidos y otras especies de marnfferos relacionadas.

Formulaciones de vacunas

La presente invencion proporciona composiciones inmunogenicas y formulaciones de vacunas de las mismas para uso en la profilaxis de una o mas infecciones virales, asf como composiciones para uso en la prevencion o terapia de uno o mas complejos de enfermedades multifactoriales en un mamftero seleccionado. En particular, la invencion proporciona el uso de una o mas de las composiciones inmunogenicas divulgadas en la fabricacion de medicamentos de vacuna para la profilaxis, prevencion o terapia, y en particular para el uso en la fabricacion de medicamentos aceptables para uso veterinario para prevenir, controlar, mejorar y/o el tratamiento de una o mas enfermedades, o uno o mas smtomas de dichas enfermedades, en mamferos tales como infecciones por BVDV en ganado.

Las vacunas de la presente invencion pueden administrate por cualquier via de administracion adecuada para el mairnfero seleccionado, disponible para un experto en la tecnica, preferiblemente mediante inyeccion intramuscular o subcutanea o administracion intranasal, oral, cutanea, percutanea o intracutanea. Preferiblemente, para vacunas contra el BVDV-1b, las vacunas se administran por via subcutanea, o por via intramuscular o intranasal, siendo la administracion subcutanea la mas preferida. Las vacunas se administran generalmente antes del destete, durante el destete o al momento de la entrada al pasto o al corral de engorde. Como parte de una operacion de ganado adulto en curso, tambien se pueden emplear rutinariamente una o mas dosis "de refuerzo" de dichas vacunas, incluso, por ejemplo, como parte de un programa de revacunacion/mantenimiento anual.

Aunque las formulaciones farmaceuticas y las vacunas de la presente invencion pueden prepararse en cualquier formulacion adecuada, aceptable para uso veterinario, en realizaciones particulares, la invencion proporciona vacunas que estan en forma de una solucion o suspension lista para administrar, en una solucion madre concentrada adecuada para la dilucion antes de la administracion, o en una forma reconstituible tal como una preparacion liofilizada, secado por congelacion o congelada, como es conocido por los expertos en la tecnica medica veterinaria.

Tanto la preparacion de las composiciones de pestivirus vivos modificadas como la formulacion de las composiciones y vacunas de la invencion con otros inmunogenos (con o sin uno o mas adyuvantes), son convencionales en base a la grna de este documento, e incluyen la mezcla de pestivirus vivo atenuado, con un vehuculo o diluyente farmaceuticamente aceptable, opcionalmente con otros inmunogenos y opcionalmente con un adyuvante.

Los portadores, diluyentes u otros componentes inertes o inactivos de las formulaciones farmaceuticas y vacunas pueden comprender uno o mas estabilizantes, conservantes y/o reguladores, como pueden emplearse en las tecnicas de medicina veterinaria. Los estabilizadores ejemplares incluyen, sin limitacion, SPGA y uno o mas de los siguientes: carbohidratos (incluidos, entre otros, sorbitol, manitol, almidon, sacarosa, dextrano, glutamato o glucosa), protemas (incluidas, entre otras, leche seca, albumina serica, casema o protemas de otras fuentes como plantas o microorganismos), o similares. Los reguladores adecuados incluyen, sin limitacion, uno o mas fosfatos de metales alcalinos. Los conservantes ejemplares utiles en la formulacion de las composiciones farmaceuticas y vacunas divulgadas incluyen, sin limitacion, timerosal, mertiolate, gentamicina, neomicina, nistatina, anfotericina B, tetraciclina, penicilina, estreptomicina, polimixina B, y cualquier combinacion de los mismos. Los diluyentes ejemplares incluyen, sin limitacion, agua esteril, uno o mas reguladores acuosos (tales como solucion salina regulada y similares), uno o mas alcoholes (incluyendo un poliol, por ejemplo, glicerol o similares), y cualquier combinacion de los mismos.

Cuando se desee, las composiciones de vacuna de la presente invencion tambien pueden incluir ademas opcionalmente uno o mas adyuvantes. Los ejemplos no limitantes de compuestos y composiciones adecuados que tienen actividad adyuvante incluyen hidroxido de aluminio, fosfato u oxido, aceite en agua, agua en aceite, agua en aceite en agua, emulsiones basadas en, por ejemplo, un aceite mineral, tal como, sin limitacion, Drakeol®, Bayol® o Marcol®; un aceite vegetal, tal como sin limitacion, aceite de semilla de algodon, aceite de cacahuete o aceite de mafz; acetato de vitamina E; saponinas; un aceite de pescado, tal como, sin limitacion, escualeno o escualano; o cualquier combinacion de los mismos.

Las formulaciones de vacunas espedficas del BVDV de acuerdo con la presente invencion tambien pueden contener adicionalmente opcionalmente uno o mas inmunogenos espedficos para uno o mas virus y/o microorganismos adicionales que tambien son potencialmente patogenos para el animal que se esta inmunizando. Por ejemplo, en ganado y bovinos relacionados, los inmunogenos adicionales que pueden estar presentes en la composicion pueden derivarse de una o mas especies de virus patogenos bovinos, incluidos, entre otros, rotavirus, virus sincitiales respiratorios bovinos, herpesvirus bovino (incluido el tipo 1), coronavirus bovino, virus de parainfluenza (incluido el tipo 3), paramixovirus bovino o similares, o alternativamente, los que se derivan de una o mas especies de microbios patogenos bovinos tales como, sin limitacion, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica (anteriormente Pasteurella haemolytica) Histophilus somni (anteriormente Haemophilus somnus), Mycoplasma bovis y similares, o una combinacion de cualquiera de los anteriores.

En algunas realizaciones, cuando sea relevante, como entendena un experto en la tecnica, las composiciones inmunogenicas y vacunas de la presente invencion pueden incluir la administracion de una dosis unica a un animal, o alternativamente, pueden incluir la administracion de dosis multiples, y/o sucesivas al animal a lo largo del tiempo. Alternativamente, las composiciones inmunogenicas de la presente invencion tambien pueden coadministrarse con uno o mas compuestos antivirales o antimicrobianos, ya sea solos o en combinacion con la administracion de uno o mas inmunogenos o formulaciones de vacunas microbianas espedficas.

Otro aspecto importante de la presente invencion se refiere a procedimientos para usar las composiciones inmunogenicas divulgadas para administrar uno o mas agentes terapeuticos para tratar o mejorar uno o mas smtomas de una infeccion o enfermedad en un mamffero. Dichos procedimientos generalmente implican la administracion a un mamffero que lo necesite, una o mas de las composiciones inmunogenicas divulgadas, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar, mejorar o disminuir la gravedad, la duracion o el alcance de dicha enfermedad o infeccion en tal mam^era.

Los procedimientos y composiciones de la invencion tambien se pueden usar en la prevencion, profilaxis y/o vacunacion de un animal que tiene, se sospecha que tiene, esta en riesgo de desarrollar o se le ha diagnosticado una o mas infecciones y/o enfermedades, ya sea antes, durante o despues del diagnostico o la aparicion de uno o mas smtomas clmicos de la enfermedad, o la aparicion de uno o mas smtomas de la misma.

Procedimientos para inducir una respuesta inmune

La presente invencion incluye ademas procedimientos para inducir una respuesta inmune detectable contra uno o mas patogenos virales en un animal susceptible. Un procedimiento preferido incluye administrar a un animal que lo necesite, o potencialmente necesitarlo en funcion de, por ejemplo, factores de riesgo conocidos para una enfermedad o infeccion dada, una cantidad de una composicion de vacuna como se divulga en este documento, suficiente para inducir una respuesta inmune detectable en el animal.

En algunas realizaciones, la invencion abarca procedimientos de vacunacion de un sujeto contra una infeccion pestiviral, tal como BVDV, o contra una enfermedad multifactorial, tal como BRDC, en la que una infeccion pestiviral esta o bien implicada o es causal. Dichos procedimientos generalmente implican administrar a un animal que lo necesite, una cantidad profilactica y/o terapeuticamente efectiva de una composicion de vacuna espedfica contra el pestiviral, y uno o mas portadores, reguladores, diluyentes, veldculos, o productos farmaceuticamente o veterinarios aceptables, para proporcionar una respuesta inmune detectable en el animal contra una infeccion pestiviral, o una enfermedad causada o exacerbada por tal infeccion pestiviral.

Para este fin, la presente invencion proporciona procedimientos para usar las composiciones inmunogenicas y formulaciones de vacunas divulgadas para la profilaxis, tratamiento, mejora o manejo de una o mas enfermedades o infecciones virales o microbianas en un animal, o uno o mas de sus smtomas.

La presente invencion tambien proporciona el uso de una o mas de las composiciones inmunogenicas divulgadas en la fabricacion de un medicamento o vacuna veterinaria para la profilaxis o prevencion de enfermedades, incluyendo, en la preparacion de una o mas vacunas adecuadas para administracion profilactica para prevenir o mejorar uno o mas smtomas de una infeccion pestiviral, incluido, por ejemplo, el BVDV, en un animal.

La invencion tambien proporciona procedimientos para suministrar un compuesto inmunogenico terapeutico o profilactico a una primera celula en un mamffero, y el procedimiento generalmente incluye proporcionar a un marnffero que lo necesite, una cantidad eficaz de una composicion inmunogenica del BVDV como se divulga en el presente documento que incluye una pluralidad de partmulas virales vivas modificadas como ingrediente activo, durante un tiempo efectivo para proporcionar la terapia y/o profilaxis deseadas en el mamffero inmunizado o tratado.

Kits terapeuticos y profilacticos

Los Kits incluyen una o mas de las composiciones inmunogenicas o formulaciones farmaceuticas divulgadas que las incluyen; y las instrucciones para usar el kit en uno o mas regfmenes profilacticos o terapeuticos tambien representan aspectos ilustrativos de la presente divulgacion. Dichos kits incluyen preferiblemente una o mas de las composiciones o vacunas inmunogenicas divulgadas, ya sea solas o en combinacion con uno o mas compuestos terapeuticos adicionales, productos farmaceuticos y similares, e instrucciones para el uso de los componentes en la prevencion o tratamiento de enfermedades en un animal. Los kits de acuerdo con la invencion pueden envasarse para su distribucion comercial, y tambien pueden incluir ademas opcionalmente uno o mas dispositivos de administracion (por ejemplo, jeringas, viales, inyectables o similares) para administrar la composicion o composiciones al animal seleccionado.

El contenedor o contenedores para tales kits pueden incluir tfpicamente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro contenedor, en el cual se pueden colocar la composicion o composiciones inmunogenicas o formulacion o formulaciones de vacuna, y, preferiblemente, adecuadamente dispensadas en una o mas almuotas para su administracion a un animal. Cuando tambien se desea una segunda composicion inmunogenica o un primer compuesto antiviral o antimicrobiano, el kit tambien puede contener la segunda composicion inmunogenica o el primer compuesto antiviral o antimicrobiano en un segundo contenedor distinto, o en un solo contenedor con una barrera rompible o irrompible para aislar los dos componentes hasta la preparacion para administracion. Alternativamente, se puede preparar una pluralidad de composicion o composiciones inmunogenicas distintas y/o compuesto o compuestos antivirales o antimicrobianos distintos en una sola formulacion y se pueden empacar en un solo contenedor, vial, matraz, jeringa, cateter, canula, botella, tubo de ensayo, ampolla u otro contenedor adecuado. El kit tambien puede incluir un contenedor mas grande, tal como un estuche, que incluye los contenedores mencionados anteriormente, junto con otros equipos y similares. Si se desea, pueden incluirse multiples dosis en un recipiente adecuado dentro del contenedor, preferiblemente junto con cualquier dispositivo de medicion volumetrica o de peso adecuado para medir una dosis preseleccionada segun sea necesario.

Composiciones para uso en la preparacion de medicamentos

Otro aspecto importante de la presente invencion se refiere a procedimientos para usar las composiciones inmunogenicas divulgadas (as ^ como formulaciones que las incluyen) en la preparacion de medicamentos para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad, o los smtomas de la misma, en un animal, tal como un mairnfero vertebrado. El uso de las composiciones inmunogenicas divulgadas tambien se contempla en la terapia y/o la profilaxis de una o mas enfermedades de origen microbiano o viral.

Dicho uso generalmente implica la administracion a un animal que lo necesite, de una o mas de las composiciones inmunogenicas divulgadas en una cantidad y durante un tiempo suficiente para prevenir, tratar o controlar una o mas enfermedades o smtomas de las mismas en el animal afectado. Las composiciones que incluyen una o mas de las formulaciones inmunogenicas divulgadas tambien forman parte de la presente invencion, y particularmente aquellas composiciones que incluyen ademas al menos un primer excipiente farmaceuticamente aceptable para uso en la terapia o profilaxis de una o mas enfermedades de origen viral y/o microbiana.

Las composiciones inmunogenicas de la presente invencion pueden prepararse como vacunas univalentes (es decir, monovalentes), o alternativamente, como vacunas bivalentes, trivalentes o incluso multivalentes (es decir, polivalentes). Por ejemplo, una vacuna monovalente incluira preferiblemente una composicion inmunogenica unica de la presente invencion (por ejemplo, una poblacion de virus BVDV-1b vivos modificados) que sea capaz de provocar una respuesta inmune anti-BVDV espedfica cuando se introduce en el cuerpo de un mamffero receptor seleccionado, y particularmente mamfferos que son susceptibles a la infeccion por BVDV.

De manera similar, una composicion de vacuna bivalente incluira preferiblemente al menos una primera composicion espedfica de BVDV-1b, y al menos un segundo inmunogeno espedfico de virus o microbios, cada uno capaz de provocar una respuesta inmune espedfica en un mamffero. Las composiciones de vacunas multivalentes (incluyendo trivalentes o polivalentes) preferiblemente incluiran tres o mas inmunogenos espedficos virales o microbianos, respectivamente. En una realizacion ilustrada en este documento, los inventores desarrollaron una sorprendente, e inesperadamente ventajosa formulacion de vacuna viva hexavalente (de seis vfas) que comprende inmunogenos espedficos para BVDV-1b, BVDV Tipo 1a (BVDV-1a), BVDV Tipo 2 (BVDV-2), PI3, virus sincitial respiratorio bovino (BRSV), y BHV-1, el agente causal de la rinotraqueitis bovina infecciosa (IBR), para controlar la infeccion por BRDC en poblaciones de mamfferos, y particularmente en el ganado domestico.

Descripcion de realizaciones ilustrativas

Las realizaciones ilustrativas de la invencion se describen a continuacion. En aras de la claridad, no todas las caractensticas de una implementacion real se describen en esta memoria descriptiva. Por supuesto, se apreciara que en el desarrollo de cualquier realizacion real, deben tomarse numerosas decisiones espedficas de implementacion para lograr los objetivos espedficos de los desarrolladores, como el cumplimiento de restricciones relacionadas con el sistema y relacionadas con el negocio, que variaran de una implementacion a otra. Ademas, se apreciara que tal esfuerzo de desarrollo podna ser complejo y requerir mucho tiempo, pero sena una tarea rutinaria para los expertos en la tecnica que tienen el beneficio de esta divulgacion.

"Fiebre del embarque"

"Fiebre del embarque" es un termino dado a un smdrome septicemico agudo y altamente contagioso en bovinos y ovinos que se caracteriza clmicamente por fiebre, inflamacion aguda de las vfas respiratorias, secrecion nasal, anorexia, depresion, neumoma fibrinosa y necrosis de los tejidos infectados. Lo mas frecuentemente encontrado en los lotes de engorde despues del traslado es la fiebre del embarque que es la principal causa de muerte entre el ganado joven, y es responsable de una perdida anual estimada en la industria de mas de 500 millones de dolares. Solo en 1991, se estimo que la fiebre del embarque costo a la industria ganadera de los Estados Unidos casi $ 624 millones, debido principalmente a los costos del tratamiento, la perdida de produccion y la muerte.

En general, se considera que la patogenia de la fiebre del embarque involucra influencias externas adversas que predisponen al animal a una infeccion respiratoria viral inicial, que, a su vez, produce condiciones favorables para la proliferacion de una o mas infecciones bacterianas secundarias.

Complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRD) (BRDC)

El agente causal principal de la fiebre del embarque es una afeccion multifactorial conocida como enfermedad respiratoria bovina (BRD) o complejo de enfermedad respiratoria bovina (BRDC). El BRDC, una de las principales causas de perdidas economicas en la industria del ganado de carne, se caracteriza por la infeccion simultanea o secuencial por patogenos virales y bacterianos. Los patogenos virales implicados en BRDC incluyen el virus del herpes bovino 1 (BHV-1), la PI3 bovina, el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) y el virus sincitial respiratorio bovino (BRSV).

Despues de la infeccion viral, los animales afectados desarrollan una o mas infecciones bacterianas subsiguientes (por ejemplo, Mannheimia [anteriormente Pasteurella] haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni /anteriormente Haemophilus somnus], Actinomyces pyogenes, y Mycoplasma spp. diversos) que a menudo se manifiestan en neumoma aguda.

El signo clmico mas comun y mas temprano reconocible de neumoma es la depresion. Los terneros que presenten depresion tendran orejas câ das, una cabeza extendida, una espalda inclinada y/o a menudo se aislaran de otros bovinos. A medida que la salud de los terneros se deteriora progresivamente, dejan de alimentarse, presentan una mayor frecuencia respiratoria y desarrollan una fiebre pronunciada (generalmente en el intervalo de 40°-42,2°C). Pestivirus

Los pestivirus causan enfermedades economicamente importantes en animales de todo el mundo. El genero pestivirus, dentro de la familia Flaviviridae, comprende tres especies de virus de ARN de sentido positivo monocatenario: virus de la diarrea viral bovina (BVDV), virus de la fiebre porcina clasica (CSFV), virus de la enfermedad fronteriza (BDV). Recientemente, se identifico un cuarto grupo distinto de pestivirus que esta relacionado geneticamente con el BVDV, y se menciona en la literatura como virus de la diarrea viral bovina tipo 2 (BVDV-2) (vease, por ejemplo, Thiel et al., 1996; y Becher et al., 1995; cada uno de los cuales se incorpora espedficamente en el presente documento en su totalidad por referencia expresa al mismo). En consecuencia, los textos contemporaneos ahora se refieren a las especies originales de BVDV como "BVDV-1" para distinguir entre las dos especies.

Virus de la diarrea viral bovina (BVDV)

La especie de tipo Pestivirus es BVDV Tipo 1 (BDVD-1), cuyo genoma tiene una longitud de aproximadamente 12,5 kb y contiene un gran marco de lectura abierto (ORF) (Collett et al., 1988, espedficamente incorporado aqu en su totalidad por expresa referencia al mismo). El ORF codifica una poliprotema grande de aproximadamente 450 kDa que se procesa de forma conjunta y posterior a la traduccion por el huesped o proteasas virales. El extremo N-terminal de la poliprotema estandar del BVDV da como resultado una protema no estructural p20 (Npro), protema p14 de la capside (C); glicoprotemas de la envoltura gp48 (E0), gp25 (E1), gp53 (E2); protemas no estructurales p125 (NS23), p10 (NS4A), p32 (NS4B), p58 (NS5A) y p75 (NS5B) (vease, por ejemplo, Tautz et al., 1997; Xu et al., 1997; Elbers et al., 1996 y Wiskerchen et al., 1991, cada uno de los cuales se incorpora espedficamente en el presente documento en su totalidad por referencia expresa a los mismos). BVDV-1 existe en dos biotipos, citopatico (designado "cp") o no citopatico ("ncp"), que difieren en la produccion de un solo polipeptido de 80 kDa (protema no estructural p8o, NS3) en la variante citopatica (Vease, por ejemplo, Gillespie et al., 1960, espedficamente incorporado en este documento en su totalidad por referencia expresa al mismo).

Segun el analisis filogenetico de varios aislados de BVDV, se ha demostrado que BVDV-1 comprende al menos 13 subgenotipos distintos (designados BVDV-1a hasta BVDV-1I), mientras que dos subgenotipos (BVDV-2a y BVDV-2b) se han identificado para el BVDV-2 (vease, por ejemplo, Pellerin et al., 1994; Ridpath et al., 1994, y Xue et al., 2010; cada uno de los cuales se incorpora espedficamente en este documento en su totalidad por referencia expresa a los mismos).

El BVDV-1 y el BVDV-2 causan infecciones agudas en el ganado (diarrea, fiebre, smdrome hemorragico) y, si la infeccion ocurre durante el embarazo, aborto, malformacion del feto e infeccion persistente de los terneros. Los animales infectados persistentemente representan el reservorio principal del virus, y estos animales pueden sufrir la enfermedad mortal de la mucosa (DM).

El BVDV esta estrechamente relacionado con los virus que causan enfermedades fronterizas en ovinos y la fiebre porcina clasica en porcinos. El ganado infectado presenta tfpicamente una "enfermedad de la mucosa" generalizada que se caracteriza por elevadas temperaturas, diarrea, tos y ulceraciones de la mucosa alimentaria (veanse, Olafson et al., 1946 y Ramsey et al., 1953, cada una de las cuales Incorporado espedficamente en el presente documento en su totalidad por referencia expresa a los mismos).

El virus BVD es capaz de atravesar la placenta de las vacas prenadas y puede dar lugar al nacimiento de terneros infectados persistentemente (PI) que son inmunotolerantes al virus y persistentemente viremicos por el resto de sus vidas. Estos ganado con PI, que estan altamente predispuestos a la infeccion con microorganismos que causan neumoma o enfermedad enterica, proporcionan los reservorios virales necesarios para los brotes de enfermedad por DM en el ganado (vease, por ejemplo, Liess et al., 1974; Barber et al., 1985; Malmquist, 1968 y Ross et al., 1986, cada uno de los cuales se incorpora espedficamente en el presente documento en su totalidad por referencia expresa a los mismos).

El BVDV se propaga a traves de un hato de manera oral y fecal, y las estrategias para el control del virus van desde practicas de manejo mas estrictas en un esfuerzo por simplemente reducir la perdida economica, para elaborar procedimientos de prueba para identificar animales infectados que, aunque son efectivos, normalmente conllevan un nivel de costo inaceptable.

En los ultimos treinta anos, casi ciento cincuenta vacunas para BVDV, tanto virus vivos modificados (MLV) como virus o partmulas virales atenuadas inactivadas, se han comercializado para la industria ganadera con diversos grados de exito; los brotes de BVDV todav^a se informan anualmente a pesar de la disponibilidad y el uso generalizados de formulaciones de vacunas comerciales. Los enfoques actuales para el manejo de la enfermedad implican una inoculacion anual repetida con la vacuna para el ganado, y generalmente se toman medidas adicionales para asegurar que no nazcan los terneros como portadores de PI. Se han desarrollado varios procedimientos de prueba diferentes para la deteccion de BVDV y/o la deteccion de animales infectados con BVDV, que incluyen la reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR), el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) y las tecnicas estandar de aislamiento de virus y varios ensayos inmunohistoqmmicos.

Definiciones ejemplares

Los terminos "alrededor de" y "aproximadamente" como se usan en este documento, son intercambiables, y en general se debe entender que se refieren a un intervalo de numeros alrededor de un numero dado, asf como a todos los numeros en un intervalo mencionado de numeros (por ejemplo, "aproximadamente 5 a 15" significa "aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15" a menos que se indique lo contrario). Ademas, debe entenderse que todos los intervalos numericos en este documento incluyen todos los numeros enteros dentro del intervalo. Como se usa en este documento, el termino "antigeno" o "inmunogeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmune espedfica en un animal huesped. El antfgeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porcion de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogenicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune tras la presentacion a un animal huesped; una protema, un polipeptido, un peptido, un epftopo, un hapteno, o cualquier combinacion de los mismos. Alternativamente, el inmunogeno o antfgeno puede comprender una toxina o antitoxina. Un antfgeno generalmente abarca cualquier sustancia inmunogenica, es decir, cualquier sustancia que provoque una respuesta inmune (por ejemplo, la produccion de moleculas de anticuerpos espedficos) cuando se introduce en los tejidos de un animal susceptible, y que es capaz de unirse espedficamente a un anticuerpo que se produce en respuesta a la introduccion del antfgeno. Un antfgeno es capaz de ser reconocido por el sistema inmune, induciendo una respuesta inmune humoral, y/o induciendo una respuesta inmune celular que conduce a la activacion de los linfocitos B y/o T. Un antfgeno puede incluir un solo epftopo, o dos o mas epftopos.

Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo" se refiere a una protema que se une a otras moleculas (antfgenos) a traves de los dominios variables de la cadena ligera y pesada, V^h y V^l, respectivamente. El termino "anticuerpo" se refiere a cualquier molecula de inmunoglobulina, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, y cualquier subclase de las mismos o una combinacion de las mismos. El termino "anticuerpo" tambien significa un fragmento funcional de moleculas de inmunoglobulina, que incluye, por ejemplo, pero no se limita a fragmentos, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, Fd, scFv y sdFv, a menos que se indique expresamente lo contrario.

Como se usa en este documento, un "polipeptido antigenico" o un "polipeptido inmunogenico" es un polipeptido que, cuando se introduce en un vertebrado, reacciona con las moleculas del sistema inmunitario del vertebrado, es decir, es antigenico, y/o induce una respuesta inmune en el vertebrado, es decir, es inmunogenico. Los polipeptidos antigenicos e inmunogenicos aislados de la presente invencion, ademas de los codificados por los polinucleotidos de la invencion, pueden proporcionarse como una protema recombinante, una subunidad purificada, un vector viral que expresa la protema, o pueden proporcionarse en forma de un vacuna de virus inactivado, por ejemplo, una vacuna de virus vivo atenuado, una vacuna de virus destruido por calor, etc.

Como se usa en el presente documento, una "vacuna viva modificada" es una vacuna que comprende un virus que se ha alterado, generalmente mediante el pasaje en celulas de cultivo de tejidos, para atenuar su capacidad de causar enfermedad, pero que conserva su capacidad de proteger contra la enfermedad o infeccion cuando posteriormente se administra a un animal.

Como se usa en este documento, un "adyuvante" significa una composicion que comprende una o mas sustancias que aumenta la inmunogenicidad y la eficacia de un virus o antfgeno vivo modificado, cuando esta presente en una composicion de vacuna que contiene una poblacion de tales virus, o una pluralidad de tales antfgenos.

Como se usa en este documento, una "unidad infecciosa" de un virus se define como una TCID50, o la cantidad requerida para infectar o matar el 50% de un cultivo tisular de celulas susceptibles.

Como se usa en el presente documento, el termino "portador" pretende incluir cualquier disolvente o disolventes, medio de dispersion, recubrimiento o recubrimientos, diluyente o diluyentes, regulador o reguladores, agente o agentes isotonicos, solucion o soluciones, suspension o suspensiones), coloide o coloides, inerte o inertes o similares, o una combinacion de los mismos que sea farmaceuticamente aceptable para la administracion al animal relevante. El uso de uno o mas vetftculos de administracion para compuestos qmmicos en general, e inmunogenos en particular, es bien conocido por los expertos en la tecnica farmaceutica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones diagnosticas, profilacticas y terapeuticas. Uno o mas ingrediente o ingredientes activos suplementarios tambien pueden incorporarse, o administrate en asociacion con, uno o mas de las composiciones inmunogenicas divulgadas y las formulaciones de vacunas de los mismos.

Como se usa en el presente documento, los terminos "inmunizar" o "inmunizacion" o terminos similares se refieren a conferir la capacidad de montar una respuesta inmune detectable, o preferiblemente, sustancial contra un epttopo o inmunogeno antigenico espedfico. Estos terminos no necesariamente infieren inmunidad completa, sino que se produce una respuesta inmune que es sustancialmente mayor que la lmea base, por ejemplo, cuando no se administran composiciones inmunogenicas de la invencion o cuando se administra una vacuna convencional. Por ejemplo, se considera que un mairnfero esta inmunizado contra uno o mas inmunogenos objetivo, si se produce una respuesta inmune celular y/o humoral al inmunogeno o inmunogenos objetivo (y preferiblemente una respuesta inmune sustancial) despues de la administracion de las composiciones de vacunas divulgadas en este documento. Como se usa en el presente documento, el termino "respuesta inmunologica" a una composicion o vacuna denota el desarrollo de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos en el animal huesped. En general, una respuesta inmunologica incluye (pero no se limita a) uno o mas de los siguientes efectos: (a) la produccion de anticuerpos; (b) la produccion de celulas B; (c) la produccion de celulas T auxiliares; y/o (d) la produccion de celulas T citotoxicas, que se dirigen espedficamente a un antfgeno o hapteno dado.

Como se usa en el presente documento, el termino "inmunogenico" tambien se refiere a una sustancia, tal como una secuencia de aminoacidos, una porcion de una secuencia de aminoacidos dentro de una protema, polipeptido o peptido, o un virus vivo o muerto modificado o atenuado que provoca una respuesta inmunologica en un animal huesped. Como se usa en el presente documento, el termino "protema inmunogenica", "peptido inmunogenico" o "polipeptido inmunogenico" se refiere a protemas, peptidos y polipeptidos que son inmunologicamente activos en el sentido de que una vez administrado al huesped, es capaz de provocar una respuesta inmune del tipo humoral y/o celular dirigida contra la protema. El termino epftopo se refiere a un sitio de protema capaz de inducir una reaccion inmune de tipo humoral (celulas B) y/o de tipo celular (celulas T).

El termino "patogeno" se define en el presente documento como cualquier tipo de agente infeccioso, incluyendo, por ejemplo, virus, priones, protozoos, parasitos, asf como microbios tales como bacterias, levaduras, mohos, hongos y similares.

Como se usa en este documento, el termino "individuo" (tambien denominado indistintamente "huesped", "sujeto", "receptor", "paciente", etc.) se refiere a cualquier animal que pueda recibir uno o mas de las composiciones farmaceuticos o formulaciones de vacunas divulgadas en el presente documento. Preferiblemente, el sujeto es un animal vertebrado, que pretende denotar cualquier especie animal (y preferiblemente, una especie de mamffero). En ciertas realizaciones, el individuo es preferiblemente cualquier huesped mamffero, que incluye, entre otros, primates no humanos, bovinos, caninos, caprinos, cavinos, corvinas, epinos, equinos, felinos, hircinos, lapinas, leporinas, altramuces, ovinos, porcinos , racinos, vulpinos y similares, incluyendo ganado, espedmenes zoologicos, exoticos, asf como animales de comparMa, mascotas y cualquier animal al cuidado de un veterinario.

Las frases "veterinariamente aceptable" y "farmaceuticamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion alergica o adversa similar cuando se administran a un mai^ero. Como se usa en este documento, "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biologica deseada del compuesto original y no imparte ningun efecto toxicologico no deseado. Los ejemplos de tales sales incluyen, pero no se limitan a, sales de adicion de acido formadas con acidos inorganicos, por ejemplo, acido clorddrico, acido bromddrico, acido sulfurico, acido fosforico, acido rntrico y similares; y sales formadas con acidos organicos tales como, por ejemplo, acido acetico, acido oxalico, acido tartarico, acido succmico, acido maleico, acido fumarico, acido gluconico, acido dtrico, acido malico, acido ascorbico, acido benzoico, acido tanico, acido pamoico, embonico), acido algmico, acido naftoico, acido poliglutamico, acidos naftalensulfonicos, acidos naftalenodisulfonicos, acido poligalacturonico; sales con cationes de metales polivalentes tales como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, rnquel, cadmio y similares; sales formadas con un cation organico formado a partir de N,N'-dibenciletilendiamina o etilendiamina; y combinaciones de los mismos.

Como se usa en este documento, una "respuesta inmune protectora" o "respuesta inmune terapeutica" se refiere a una respuesta CTL y/o HTL a un antfgeno, que de alguna manera previene o al menos detiene parcialmente la enfermedad, o los smtomas, efectos secundarios o progresion de los mismos. La respuesta inmune tambien puede incluir una respuesta de anticuerpos que ha sido facilitada por la estimulacion de las celulas T auxiliares.

Como se usa en el presente documento, el termino "vacuna" se refiere a una composicion o formulacion que contiene una composicion inmunogenica de la presente invencion en una forma que puede administrarse a un vertebrado, y preferiblemente a un animal tal como un mamffero. Tfpicamente, las vacunas de la presente invencion incluiran una o mas de las composiciones inmunogenicas (que incluyen una o mas partfculas vmcas modificadas, vivas o una pluralidad de las mismas) divulgadas en este documento, formuladas para la administracion a un animal que las necesite. Dichas composiciones pueden ser de cualquier formulacion adecuada, incluyendo, sin limitacion, las preparadas en un vehmulo acuoso, asf como aquellas en forma congelada, secadas por congelacion liofilizadas, o deshidratadas que luego se rehidratan o suspenden posteriormente en un vehfculo farmaceuticamente aceptable convencional (por ejemplo, solucion salina esteril o una solucion acuosa regulada similar) antes de la administracion. En tales formas, las composiciones de vacuna de la presente invencion pueden fabricarse en alfcuotas de dosis unicas o multiples convenientes que pueden emplearse facilmente en uno o mas de los procedimientos o regfmenes de vacunacion divulgados en el presente documento para prevenir, gestionar o bien tratar una o mas afecciones o uno o mas smtomas de infeccion viral y/o microbiana en un animal susceptible.

Tras la introduccion en el huesped animal, las composiciones inmunogenicas y las vacunas que las comprenden pueden provocar una respuesta inmune, y preferiblemente una respuesta inmune que es espedfica para el antfgeno o antfgenos introducidos, de modo que la respuesta inmunitaria resultante sea facilmente detectable utilizando ensayos convencionales conocidos por los expertos en la tecnica inmunologica, incluidos, entre otros, los ensayos que detectan la produccion de anticuerpos espedficos, citoquinas y/o la activacion de celulas T citotoxicas, celulas presentadoras de antigenos, celulas T auxiliares, celulas dendnticas y/u otras respuestas celulares dentro de las celulas y tejidos del animal vacunado. Las composiciones de vacuna de la presente invencion pueden incluir, o administrarse concomitantemente en o con, uno o mas adyuvantes solos, o en combinacion con uno o mas antigenos adicionales o similares.

Las vacunas y composiciones inmunogenicas de la presente invencion confieren una respuesta inmune a un animal despues de la inmunizacion. Como se usa en el presente documento, el termino "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que conduce a la activacion o proliferacion de linfocitos B y/o T. Sin embargo, en algunos casos, las respuestas inmunes pueden ser de baja intensidad y ser detectables solo cuando se usa al menos una sustancia de acuerdo con la invencion, mientras que otras pueden requerir la administracion repetida, un adyuvante, un segundo o agente activo adicional, o una o mas combinaciones de los mismos. El termino "adyuvante" se refiere a un agente utilizado para estimular el sistema inmunologico de un organismo vivo, de modo que una o mas funciones del sistema inmunitario se incrementan y se dirigen hacia el agente inmunogenico.

Como se usa en el presente documento, los terminos "tratamiento", "tratar", "tratado (a)" o "que trata" se refieren a la terapia o la mejora de uno o mas smtomas de una enfermedad, o la reduccion en el grado o la gravedad de la enfermedad, o un smtoma de la misma, ya sea antes o despues de que su desarrollo, aflija a un animal susceptible. Cuando se usa con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, los terminos se refieren a un tratamiento o regimen de tratamiento que disminuye la gravedad de la infeccion o disminuye o aminora o retrasa uno o mas smtomas de la enfermedad atribuibles a la infeccion, asf como el aumento de la capacidad del animal infectado para combatir la infeccion, incluyendo, por ejemplo, la reduccion y/o eliminacion de la infeccion del cuerpo del individuo tratado, o para disminuir o prevenir que la enfermedad empeore o se propague a otros animales que entren en contacto con el animal afectado.

El termino "cantidad inmunogenicamente eficaz" tiene su significado habitual en la tecnica, es decir, una cantidad de un inmunogeno que es capaz de inducir una respuesta inmune que se une significativamente con agentes patogenos que comparten caractensticas inmunologicas con el inmunogeno. Este termino tambien puede abarcar cantidades terapeuticas o profilacticamente eficaces, o ambas.

Como se usa en este documento, los terminos "prevencion", "prevenir", "previene", "que previene", "vacunar" y "vacunacion" se refieren a la profilaxis o a la inhibicion parcial o completa de la infeccion, o a la reduccion o retraso en el inicio de una o mas enfermedades, o uno o mas smtomas de la misma, en un animal que puede estar predispuesto a ella, pero que aun no ha sido expuesto a ella o se le ha diagnosticado que la tiene. Cuando se usa con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, los terminos se refieren a la administracion profilactica de una o mas de las composiciones inmunogenicas de la invencion, que tiende a aumentar la resistencia de un animal a la infeccion con uno o mas patogenos virales o microbianos o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto se infecte con el patogeno o patogenos o, si esta infectado, retrasara los smtomas, disminuira la gravedad de la infeccion o disminuira los smtomas de enfermedad atribuibles a la infeccion, o cualquier combinacion de los mismos en el animal infectado.

Cada uno de "prevencion" y "tratamiento" incluyen el manejo de una infeccion, enfermedad, afeccion o smtoma particular del mismo en un animal, asf como cualquier modificacion beneficiosa del estado del candidato o el curso de la enfermedad o afeccion, o cualquiera smtoma de los mismos. El manejo puede abordar algunos o todos los smtomas del mismo con o sin afectar realmente la infeccion subyacente o cualquier enfermedad o afeccion que resulte de la misma.

El termino "por ejemplo", tal como se usa en el presente documento, se usa meramente a modo de ejemplo, sin la limitacion prevista, y no debe interpretarse como que se refiera solo a aquellos elementos enumerados explfcitamente en la memoria descriptiva.

De acuerdo con la antigua convencion de la ley de patentes, las palabras "un" y "uno, una" cuando se usan en esta solicitud, incluidas las reivindicaciones, denotan "uno o mas".

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones ilustrativas de la invencion. Los expertos en la tecnica deberan apreciar que las tecnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan tecnicas descubiertas que funcionan bien en la practica de la invencion y, por lo tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la tecnica deben, a la luz de la presente divulgacion, apreciar que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones espedficas que se divulgan y seguir obteniendo un resultado parecido o similar sin apartarse del espmtu y alcance de la invencion.

Ejemplo 1 - Produccion de virus BVDV vivos modificados

El presente Ejemplo proporciona un procedimiento ilustrativo para la produccion a gran escala de BVDV-1b virus vivos modificados (MLV).

Materiales y procedimientos

Virus y microorganismos

La cepa TGAC de BVDV-1b se obtuvo del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), del Servicio de Inspeccion de Sanidad Animal y Vegetal (APHIS), del Centro para el Laboratorio de Productos Biologicos Veterinarios (CVB-L) (Ames, IA, ^e E. UU.). La semilla maestra (MS) se denomino posteriormente como "TVL-BVDV1b MS 04/27/2007 DW3-095", y como se indica en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos pendiente junto con la presente de los mismos solicitantes No. 61/427.404, presentada actualmente en este documento, ha sido depositada bajo condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos estara disponible durante el penodo de espera de esta solicitud de patente para alguien determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas que tiene derecho al mismo bajo el tttulo 37 del C.F.R. parrafo § 1.14 y tttulo 35 del U.S.C. parrafo § 122. El deposito esta disponible segun lo exigen las leyes de patentes extranjeras en los pafses donde se presentan las contrapartes de la solicitud en cuestion, o su progenie. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un deposito no constituye una licencia para practicar la invencion en cuestion, en detrimento de los derechos de patente otorgados por accion gubernamental. El deposito del cultivo en cuestion se almacenara y se pondra a disposicion del publico de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest para el Deposito de Microorganismos, es decir, se almacenara con toda el cuidado necesario para mantenerlo viable y no contaminado durante un penodo de por lo menos cinco anos despues de la solicitud mas reciente para completar la muestra del deposito, y en cualquier caso, por un penodo de al menos 30 (treinta) anos despues de la fecha del deposito o por la vigencia de vida de cualquier patente que pueda divulgar el cultivo depositado. El depositante reconoce el deber de reemplazar el deposito en caso de que el depositario no pueda proporcionar una muestra cuando se le solicite, debido a la condicion del deposito. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al publico del deposito del cultivo en cuestion se eliminara irrevocablemente en el momento de la concesion de una patente que lo divulgue. Un deposito del virus TVL BVDV1b MS 04/27/2007 DW3-095 se ingreso en la coleccion permanente del Patents Depository of the American Type Culture Laboratory, ubicado en 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209, EE.UU., el 21 de diciembre de 2010, bajo los terminos del Tratado de Budapest, se le asigno el numero de acceso ATCC PTA-11553 por parte del repositorio.

La identidad del virus MS (MSV) se realizo mediante un ensayo de reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR) para identificar positivamente el virus MS como BVDV-1b. El protocolo para la diferenciacion del BVDV por PCR fue desarrollado por Ridpath y Bolin, 1998 (incorporado espedficamente en este documento en su totalidad por referencia expresa al mismo). La identificacion positiva se realizo utilizando un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) (McNulty et al., 1984). La replicacion de estos virus en celulas de rinon bovino en el laboratorio veterinario de Texas (TVL-BK) produjo cambios citopatologicos facilmente reconocibles.

Frecuencia de identificacion de microorganismos

Antes de la inoculacion de celulas TVL-BK con virus semilla de produccion, las celulas se visualizaron microscopicamente para confirmar que las celulas estan mostrando la morfologfa descrita anteriormente. Antes de recolectar cada lote de virus de produccion, se observa que las celulas TVL-BK confirman que estan exhibiendo los efectos citopatologicos (CPE) tfpicos asociados con el virus.

Virulencia, mantenimiento y gama de cultivos o subcultivos

La consistencia de la virulencia, potencia y antigenicidad del BVDV-1b utilizado en esta vacuna se fomento mediante el almacenamiento en estado liofilizado o congelado, y restricciones en el numero de pases o subcultivos.

Intervalo: Virus de produccion = MSV 10 (eficacia de pases en serie), pero puede ser cualquier pase entre 5 y 10. Patron de celulas de produccion = MCS 20 (eficacia de pases en serie), pero tambien puede ser cualquier pase por debajo de 20.

Composicion y reaccion del medio utilizado en cultivos de semillas y produccion

La composicion y la reaccion del medio utilizado en los cultivos de semilla y produccion fueron las siguientes: inoculos de virus de trabajo (MSV 1 a MSV 8) e inoculo de virus de produccion (que fue tfpicamente, pero no exclusivamente, en MSV 9), fueron propagados en celulas TVL-BK; siempre que el numero de pases de las celulas TVL-BK para la propagacion del virus no exceda los 20 pases de MCS. El medio de crecimiento (tanto para preparaciones de trabajo como para celulas de produccion) fue el medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM). El MSV resultante puede almacenarse liofilizado, en medio de crioconservacion almacenado en nitrogeno lfquido, o en medio de crioconservacion almacenado a una temperature de -70 a -85°C. El MCS se puede almacenar en medio de crioconservacion (en nitrogeno lfquido), o en medio de crioconservacion almacenado a una temperatura de -70 a -85°C.

Procedimientos de preparacion de suspensiones para siembra e inoculacion

Los crioviales que conternan celulas congeladas TVL-BK se descongelaron rapidamente. Los matraces de cultivo se llenaron hasta la capacidad recomendada con medio y las celulas suspendidas se transfirieron asepticamente desde los crioviales al matraz de cultivo. Los recipientes de cultivo tambien se sembraron mediante la division de cultivos de propagacion activa en una proporcion que oscila entre 1:3 a 1:6 (cm2: cm2). La TVL-BK en frascos o botellas de rodillos, que estaban destinadas a subcultivos, se liberaron de la superficie de cultivo mediante la eliminacion aseptica del medio de crecimiento y la adicion de una solucion de tripsina-EDTA 1X. Despues de la incubacion (5 min, de 35 a 39°C), la monocapa se disperso. La tripsina se inactivo agregando las celulas dispersadas en un recipiente de cultivo con medio de crecimiento. Las alfcuotas congeladas del virus se descongelaron rapidamente o se resuspendieron en medio si la semilla se liofilizo. Las celulas TVL-BK (+20 o menos) se inocularon con virus. El virus que se estaba replicando en matraces o botellas de rodillos, que estaba destinado para el subcultivo, se recolecto despues de que se observara el tiempo de incubacion apropiado y/o el CPE. Los fluidos virales se almacenaron a una temperatura de 6 a -80°C o se usaron inmediatamente para inocular otros recipientes de cultivo. Se usaron tecnicas estandar de cultivo celular para inocular tanto los medios de produccion como los de semilla. Se inocularon celulas TVL-BK en el pase 20 o menos. El inoculo del virus de produccion congelado, que tipicamente estaba en el MSV 9, se descongelo rapidamente. El volumen de inoculo del virus vario de 1 a 25 ml por 1600 cm2 de area de cultivo para lograr una multiplicidad de infeccion que oscila entre 0,01 y 1,0 virus por celula. El tttulo mrnimo de inoculo fue el siguiente: 1050TCID50 por ml para BVDV-1b. Los cultivos inoculados se incubaron a 37 ± 2°C y 5 ± 1% de CO2 durante 2 a 4 dfas.

Recoleccion

En el dfa de la recoleccion, se examinaron los cultivos para determinar el CPE espedfico del virus y la esterilidad. El tiempo mrnimo de incubacion tfpico fue 2 dfas despues de la inoculacion con BVDV-1b. El tiempo maximo de incubacion tfpico fue de 4 dfas despues de la inoculacion con BVDV-1b. Las suspensiones de virus se recolectaron asepticamente de los recipientes de produccion. Se recolectaron muestras para determinar el TCID50 de la recoleccion. El material de recoleccion fue almacenado de 6 a -80°C. El material de recoleccion se puede almacenar por encima de la congelacion hasta por un mes y congelado por hasta seis meses antes de la fabricacion del producto final.

Se descartaron los fluidos de recoleccion que exhibfan un CPE atfpico o evidencia de contaminacion. Solo los fluidos de recoleccion que presentaban CPE tfpico y libres de contaminacion eran elegibles para un uso adicional en la produccion. El tttulo de virus de recoleccion mrnimo aceptable fue 106 TCID50/ml. La pureza de los fluidos de recoleccion se confirmo de la siguiente manera: se anadio asepticamente una muestra de 2 ml de fluido de recoleccion a 38 ml de SCDB y se incubo a una temperatura de 35 a 39°C junto con controles negativos (medio solo) y positivos durante 46 a 50 horas. La ausencia de crecimiento macroscopico en los cultivos, asf como el control negativo, establecieron que los fluidos de recoleccion eran puros y satisfactorios para un uso adicional en la produccion. Se descartaron los fluidos de recoleccion que no se encontraron puros.

Formulacion ejemplar de un virus vivo modificado, BVDV

Todas las manipulaciones se realizaron utilizando una tecnica aseptica. Se agregaron antibioticos adecuados, como neomicina y nistatina (micostatina) durante el ensamblaje de una serie o subserie de vacuna a una tasa de 15 |jg y 15 Unidades/dosis, respectivamente. Los fluidos de recoleccion se diluyeron en DMEM segun fue necesario para ajustar la concentracion, y se estabilizaron mediante la adicion de una solucion de sacarosa filtrada por 0,2 jm, lo que dio como resultado una concentracion final de sacarosa de 20 ± 1%.

Los fluidos de recoleccion de virus se concentraron opcionalmente mediante ultrafiltracion esteril usando un filtro de corte de peso molecular de 10 kDa. El grado de concentracion tfpicamente no excedio 50 veces.

Se analizo cada lote de fluidos virales recogidos para determinar la TCID50. Brevemente, se utilizaron diluciones logantmicas (10‘1 hasta 10'8) del material de recoleccion para inocular celulas TVL-BK en una placa de 96 pozos. Las placas se incubaron a 37 ± 2°C y 5 ± 1% de CO2 durante 96 ± 6 horas. Despues se leen las placas de incubacion a 100 aumentos y se examinan para CPE. Los tttulos se determinaron mediante el procedimiento de Spearman-Karber, modificado por Finney (1978). Los recipientes finales, que habfan sido esterilizados previamente, se llenaron de manera aseptica. Los recipientes finales se taparon parcialmente con un tapon de sello interno esteril.

Los viales del producto final se transfirieron a un liofilizador y se desecaron. El tiempo del ciclo de secado oscilo entre 24 y 72 horas, con una temperature maxima del producto de 22°C. El contenido de humedad del producto final desecado tfpicamente no supero el 5%, y la cantidad minima de material antigenico por dosis en el recipiente final fue preferiblemente de aproximadamente 8 * 103 TCID50 por dosis.

Ejemplo 2 - Estudio de la exposicion de terneros a la vacuna monovalente BVDV-1B

El presente ejemplo demuestra la eficacia de una vacuna monovalente BVDV-1b para prevenir la infeccion en animales vacunados.

Materiales y procedimientos

Animales

Se adquirieron terneros sanos de raza mixta de cuatro a cinco meses de edad de una fuente comercial, se identificaron mediante etiquetas de orejas al azar y se examinaron serologicamente para determinar su susceptibilidad al BVDV. Todos los terneros recibieron una dosis de acido libre de cristales de Ceftiofur (Excede®, Pfizer Animal Health, Nueva York, NY, EE.UU.) a su llegada. Los terneros ternan acceso libre al agua, al heno y a una racion de alimento granulada.

Vacuna

La vacuna BVDV-1b, virus vivo modificado, se preparo como se describio anteriormente. Brevemente, el virus de la semilla maestra BVDV-1b se propago en la lmea celular TVL-BK (vigesimo pase), se recogio en el pase 10, se estabilizo de acuerdo con el esquema de produccion, se lleno en botellas y se liofilizo. La concentracion de BVDV era de 8 * 103 TCID50 por dosis segun lo determinado por el procedimiento de Spearman-Karber (vease, por ejemplo, Finney, 1978). Se uso agua esteril como diluyente para rehidratar la vacuna.

Vacunacion y exposicion de los terneros

Se mezclaron diecinueve (19) terneros negativos para BVDV en un callejon de clasificacion. Cada ternero se coloco en uno de dos grupos (vacunados o controles no vacunados) mediante el uso de un esquema de distribucion aleatoria de grupos emparejados (Tabla 1) proporcionado por CVB-Biometrics (Ames, IA, EE.UU.).

Tabla 1. Tabla de distribucion aleatoria de coincidencia por pares

Sujeto de prueba Grupo Ternero

1 A 53

2 B 12

3 A 54

4 B 2

5 A 50

6 A 74

7 B 32

8 A 77

9 B 3

10 A 67

11 B 22

12 A 72

13 B 71

14 B 1

15 A 69

16 B 58

(continuacion)

Sujeto de prueba Grupo Ternero

17 A 39

18 A 65

19 B 68

Grupo A = Vacunados; Grupo B= Controles no vacunados

Se vacunaron diez de los terneros serologicamente negativos con una dosis de vacuna BVDV-1b. A cada vacunado se le administro una dosis de 2 ml del producto mediante inyeccion subcutanea en el lado izquierdo del cuello el D^ a 0. El resto de los terneros no recibio ninguna vacuna viral. Despues de la vacunacion, los dos grupos de terneros se mantuvieron en corrales separados pero equivalentes hasta dos dfas antes de la exposicion.

Se recogieron muestras de sangre el d^ a de llegada y se analizaron los tttulos de BVDV. Tambien se recogieron muestras de sangre el dfa de la vacunacion y el dfa de la exposicion. Los tttulos de anticuerpos de BVDV-1b se determinaron mediante el procedimiento de neutralizacion del suero que disminuye constantemente el virus (Schefers et al., 2008). Dos dfas antes de la exposicion, los grupos de control vacunados y no vacunados se mezclaron con el proposito de la observacion clmica previa a la exposicion. Catorce (14) dfas despues de la vacunacion, los terneros vacunados y de control se expusieron a un aislado virulento de BVDV-1b obtenido de los pulmones de un ternero muerto. El virus se habfa pasado in vitro en celulas TVL-BK utilizando DMEM que contema 10% de suero equino. Se administro una dosis de prueba de 8 * 107 TCID50 en 4 ml a cada ternero, 2 ml en cada pasa nasal durante la inspiracion.

Las temperaturas rectales se registraron diariamente para cada ternero durante dos dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Los recuentos de globulos blancos (WBC) se determinaron para cada ternero durante dos dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion. Las muestras se recolectaron en tubos Vacutainer® con EDTA y los recuentos se realizaron utilizando un contador diferencial de globulos blancos Hemavet 950MR de Drew Scientific (Waterbury, CT, EE.UU.).

Se recogieron frotis nasales y capas leucocitarias de cada ternero dos dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion a los efectos del aislamiento del BVDV. Los frotis nasales se recolectaron utilizando frotis de cultivo BBL con medio Stuart lfquido(Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EE.UU.). El medio de las muestras se filtro de forma esteril y se uso para inocular celulas TVL-BK 80% confluentes en cultivo.

Se recogieron las capas leucocitarias de los tubos Vacutainer con EDTA y se usaron para inocular de celulas TVL-BK 80% confluentes en cultivo. La capa leucocitaria se retiro despues de incubar durante una hora. Los cultivos se incubaron durante 4 a 5 dfas en 5 ± 2% de CO2 a 37 ± 3°C. Los sobrenadantes de todas las muestras de cultivo se analizaron para determinar la presencia de BVDV-1b mediante RT-PCR utilizando un grupo de cebadores espedficos para BVDV-1b (BVDV-1b (primero)) desarrollado por los inventores con una sonda de deteccion adecuada:

BVDV-1b (primero):

Cebador directo: 5-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3' (SEQ ID NO: 1);

Cebador inverso: 5'-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3' (SEQ ID NO: 2); y

Sonda de deteccion de BVDV-1b 5'-TCACCTGGACGACCC-3' (SEQ ID NO: 3).

BVDV-1b (segundo):

Segundo cebador directo: 5-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 19);

Segundo cebador inverso: 5-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 20); y Segunda sonda de deteccion de BVDV-1b: 5-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 21).

Aunque BVDV-1b (primero) proporciona resultados aceptables, BVDV-1b (segundo) muestra mejores resultados. Todas las observaciones clmicas se realizaron de forma independiente, y los observadores actuaron en forma ciega debido a que tanto los grupos de control vacunados como no vacunados se mezclaron con la unica caractenstica diferenciadora que es el numero de etiqueta de oreja. En ningun momento a lo largo del estudio, los observadores tuvieron conocimiento del estado de vacunacion de un animal de prueba individual hasta que se concluyeron las evaluaciones clmicas.

Analisis estadistico

Leucopenia: se calculo una media de leucocitos antes de la exposicion para cada animal al promediar los recuentos de leucocitos de los d^as -2 a 0. Se calculo la relacion de los recuentos diarios de leucocitos en relacion con la media de la exposicion previa (el recuento de leucocitos como una proporcion de la exposicion previa) para cada exposicion posterior del 1 al 14. Se analizaron estos datos de proporcion para determinar si los animales individuales desarrollaron una leucopenia como se define por una disminucion del 25% en los recuentos desde el inicio. La fraccion prevenible se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993) para determinar si la vacunacion previno el desarrollo de leucopenia en este estudio.

Secrecion nasal: los datos de aislamiento del virus del analisis de hisopo nasal se basan en la proporcion de vacunados de los cuales se aislo el BVDV en comparacion con la proporcion de controles en los que se aislo el BVDV despues de la exposicion. La fraccion prevenible para la eliminacion de BVDV-1b se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993).

Viremia: se analizaron los datos de aislamiento del virus de las capas leucocitarias de muestras de sangre en funcion de la proporcion de vacunados de los cuales se aislo BVDV-1b en comparacion con la proporcion de controles que se aislaron de BVDV-1b despues de la exposicion. La fraccion prevenible se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993).

Tftulos de anticuerpos: las comparaciones de grupo de los tftulos a escala ordinaria se analizaron con la prueba U de Mann-Whitney.

Temperatura rectal: Se determino una temperatura rectal promedio antes de la exposicion para cada animal. Este promedio se uso como covariable en un analisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas que incluyo terminos para las interacciones de Grupo, Dfa y Grupo*Dfa. Todos los analisis estadfsticos se realizaron utilizando SAS Learning Edition v2.0 para Microsoft Windows® (SAS Institute, Inc., Cary, NC, EE.UU.).

Resultados

Se detecto leucopenia en uno de los diez vacunados y en ocho de los nueve controles, lo que dio como resultado una fraccion prevenible del 87%. Los datos de leucocitos en bruto se registran en la Tabla 2.

Tabla 2. Conteo de Leucocitos

V d

Tabla 2 (continuacion)

(continuacion)

Se aislo BVDV-1b a partir de secreciones nasales de uno de diez vacunados y ocho de nueve controles, dando como resultado una fraccion prevenible de 90%. Estos datos se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Aislamiento de BVDV-1b de frotis nasales

(continuacion)

p ; g

Se aislo BVDV-1b a partir de capas leucocitarias de dos terneros vacunados y todos los nueve terneros de control resultaron en una fraccion prevenible del 80%. Estos datos se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Aislamiento de BVDV-1b de capas leucocitarias

Tabla 5. (continuacion)

La vacunacion indujo un aumento estad^sticalTlente significativo (P <0,05) en los tttulos de anticuerpos SN de BVDV-1b. La vacuna no causo un aumento significativo en los tftulos SN de BVDV-1a o BVDV-2. Los tftulos de anticuerpos SN individuales se presentan en la Tabla 6.

Tabla 6. Tftulo de anticuerpos neutralizantes en suero

El analisis de los datos de temperatura rectal no revelo ningun efecto estad^sticamente significativo de la vacunacion. Los datos de temperatura rectal se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Temperatures rectales

Vacunados

Tabla 7 (continuacion)

No hubo signos clmicos de infeccion por BVDV observados en ninguno de los terneros durante el curso de este estudio.

La vacunacion de terneros de raza mixta sanos de cuatro a cinco meses de edad con una dosis de vacuna BVBV-1b (virus vivo modificado) produjo una estimacion ajustada de la eficacia de la vacuna del 87% contra la leucopenia, del 90% contra secrecion nasal de BVDV-1b y 80% contra la viremia. El analisis serologico tambien revelo una respuesta antigenica en los terneros vacunados.

Ejemplo 3 - Evaluacion del nuevo pase viral de BVDV-1B

Los presentes ejemplos evaluan la estabilidad del MSV TVL-BVDV-lb, asegurandose de que no volviera a la virulencia cuando se administro a los animales.

Una ampolla del virus se descongela y se usa para inocular celulas TVL-BK para producir TVL-BVDV-lb 1 (5x107 TCIDso/ml). Este virus se usa para inocular por via intranasal el primer grupo de diez terneros con privacion de calostro a una tasa de 1 * 106 TCID50 por ternero.

Los terneros de los grupos 2 a 5 se inoculan intranasalmente con las secreciones nasales agrupadas del grupo anterior de terneros.

El grupo uno consta de diez terneros, con el numero de terneros en grupos de dos a cinco que van de dos a cinco terneros, dependiendo del numero de terneros que eliminan el virus del primer grupo de 10 terneros. Cada ternero permanece en un corral aislado, y los resultados primarios del estudio son la falta de signos clmicos de VDVB en los terneros y la estabilidad genetica de la MS a traves de al menos cinco pases sucesivos in vivo.

Las unidades experimentales se excluyen del estudio si tienen un tttulo de BVDV-1a, BVDV-1b o BVDV-2 de >2 en el momento de la seleccion, segun lo determina el procedimiento de neutralizacion del suero que disminuye constantemente el virus.

Las muestras de sangre para serologfa se recogen de terneros durante el proceso de seleccion, el d^ a de la inoculacion ^ a 0) y al final del estudio. Las secreciones nasales se recolectan de cada ternero individual en el grupo uno en los dfas dos a ocho despues de la inoculacion.

Las partes almuotas de las secreciones nasales de cada ternero individual para cada uno de estos dfas se analizan para el aislamiento del virus y se almacenan congeladas. Se determina el dfa con el mayor numero de terneros individuales que secretan BVDV-1b (es decir, el dfa de maxima secrecion) y todas las muestras de secrecion nasal de ese dfa se agrupan y se usan para inocular a los terneros en el grupo dos. Las secreciones nasales se recolectan de los terneros en grupos subsiguientes en este dfa predeterminado de secrecion maxima. Estas muestras luego se analizan para determinar el aislamiento del virus y se almacenan congeladas hasta que se confirma la presencia del virus y se combinan las muestras y se usan para inocular el siguiente grupo de terneros o no se afsla ningun otro virus.

Los terneros se identifican por el numero de etiqueta de oreja y se colocan en el sustituto de la leche durante seis a ocho semanas utilizando las practicas generales de manejo y cuidado para la raza.

Las variables del resultado incluyen signos clmicos de BVDV, eliminacion del virus a partir de muestras nasales y estabilidad genetica del virus a traves de cinco pases sucesivos in vivo. En todos los terneros se observan signos clmicos de infeccion por BVDV, y el ultimo grupo de nuevo pase se observa durante 21 dfas despues de la administracion del virus recuperado. Todos los signos clmicos se registran y se determina la etiologfa de la enfermedad clmica.

Las muestras de secrecion nasal se toman de terneros; almuotas individuales de cada muestra se mantienen para el aislamiento y analisis de virus. Las muestras se procesan por filtracion esteril a traves de un filtro de 0,2 pm. Cada pozo de una placa de 12 pozos que contiene TVL-MDBK (aproximadamente 80% de confluencia) se inocula con una muestra. Un pozo por placa permanece sin inocular y sirve como control negativo. Un pozo de la placa se inocula con una dilucion de la M^s y sirve como control positivo. Las placas se incuban a 3-7% de CO2 a una temperatura de 35-39°C durante 5 a 7 dfas. Las muestras se subcultivan en una placa secundaria durante 5 a 7 dfas adicionales. Los medios de los pozos que exhiben la morfologfa citopatica tfpica de BVDV-1b se procesan adicionalmente para determinar la identidad del agente infeccioso mediante un ensayo de PCR.

La estabilidad genetica de la Semilla Maestra se analiza comparando el pase mas alto de BVDV recuperado de un ternero con la Semilla Maestra. La falta de secrecion de los diez terneros en el grupo del estudio, o el aislamiento del virus que no se ha convertido en virulencia (como lo demuestra la falta de signos clmicos definitivos de BVDV) es indicativo de un estudio exitoso de nuevo pase, y estabilidad genetica de la MS.

Ejemplo 4 - Preparacion de una vacuna de BRDC hexavalente (virus vivo modificado)

El presente Ejemplo divulga la preparacion de una vacuna de BRDC multivalente (6 vfas) que incorpora la MS de BVDV-1b descrita anteriormente.

Materiales y Procedimientos

Microorganismos utilizados

BHV-1: el aislado de Cooper (Colorado) de BHV se aislo en 1956 de pulmones de un bovido que tema una enfermedad del tracto respiratorio superior (York et al., 1957). Este Virus de Semilla Maestra fue identificado como TVL-BHV (Cooper) PO, agosto 5,1997 DW-1-21-W.

BVDV-1a: La cepa Singer de BVDV-1a se obtuvo de APHIS. Esta Semilla Maestra se identifico como TVL-BVD (Singer) P0, diciembre de 1998 DW4-29.

BVDV-1b: la cepa TGAC de BVDV-1b se obtuvo de APHIS. Esta Semilla Maestra se identifico como TVL-BVDV 1b MS 04/27/2007 DW3-095.

BVDV-2: la cepa 125 de BVDV-2 se obtuvo de APHIS. Esta Semilla Maestra se identifico como TVL-BVDV 2 Cepa 125 P011/01/01 DW3-90.

PI3: la cepa Reisinger SF4 de PI3 se obtuvo de APHIS. Esta Semilla Maestra se identifico como TVL-PI ³ Reisinger SF-4P0, 2 de abril de 2001 (SM-83).

BRSV: la cepa N375 de BRSV se obtuvo de APHIS. Esta Semilla Maestra fue identificada como TVL-BRSV P0 julio 20 de 2001 DW3-87.

Protocolo

Antes de la inoculacion de celulas TVL-BK con virus de siembra de produccion, las celulas se visualizaron microscopicamente para confirmar que las celulas presentaban la morfologfa descrita anteriormente. Antes de recolectar cada lote de virus de produccion, se observo que las celulas TVL-BK confirmaban que estaban exhibiendo los efectos citopatologicos tipicos (CPE) asociados con el virus.

La consistencia de la virulencia, potencia y antigenicidad del BHV-1, BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, PI3 y BRSV utilizados en esta vacuna se fomentaron mediante el almacenamiento en estado liofilizado o congelado, y restricciones en el numero de pases o subcultivos.

Virus de produccion = MSV 10 (eficacia del pase serial), pero puede ser cualquier pase entre 5 y 10. Patron de celulas de produccion = MCS 20 (eficacia del pase serial), pero tambien puede ser cualquier pase por debajo de 20.

Los inoculos del virus de trabajo (MSV 1 a MSV 8) y el inoculo del virus de produccion (que fue tipicamente, pero no exclusivamente, en MSV 9), se propagaron tfpicamente en celulas TVL-BK; siempre que el numero de pases de las celulas TVL-BK para la propagacion del virus no exceda de unos 20 pases de MCS.

El medio de crecimiento para las preparaciones celulares de trabajo y produccion era DMEM que contema 5-10% de suero equino. El MSV se preparo y almaceno como se describio anteriormente.

Los recipientes de cultivo se sembraron mediante la division de cultivos de propagacion activa en una proporcion que oscila entre 1:3 a 1:6 (cm2:cm2). Se liberaron TVL-BK en matraces o botellas rotativas (destinadas a subcultivo) de la superficie de cultivo mediante la eliminacion aseptica del medio de crecimiento y la adicion de una solucion de tripsina-EDTA 1X como se describe en el Ejemplo 1. Despues de la incubacion durante aproximadamente 5 minutos a una temperatura de 35 a 39°C, se disperso la monocapa. La tripsina se inactivo agregando las celulas dispersadas en un recipiente de cultivo con medio de crecimiento.

Las alfcuotas congeladas del virus se descongelaron rapidamente o se suspendieron en medio si la semilla se liofiliza. Las celulas TVL-BK (+20 o menos) se inocularon con virus.

El virus que se replicaba en matraces o botellas de rodillos, que estaba destinado para el subcultivo, se recogio despues de que se hubiera observado el tiempo de incubacion apropiado y/o el CPE. Los fluidos virales podnan almacenarse de 6°C a -80°C o usarse inmediatamente para inocular otros recipientes de cultivo. Se utilizaron tecnicas estandar de cultivo celular para inocular tanto la semilla como los medios de produccion. Se inocularon celulas TVL-BK en el pase 20 o menos. El inoculo del virus de produccion congelado, que tfpicamente estaba en el MSV 9, se descongelo rapidamente. El volumen de inoculo del virus vario tfpicamente de 1 a 25 ml por 1600 cm2 de area de cultivo para lograr una multiplicidad de infeccion que vana de 0,01 a 1 virus por celula.

Los tftulos mmimos de inoculos fueron los siguientes: 1055 TCID50 por ml para BHV, 1050 TCID50 por ml por BVDV-1a, 1050 TCID50 por ml por BVDV-1b, 1050 TCID50 por ml por B^v D^v -2, 1060 TCID50 por ml para el virus de PI3, y 1045 TCID50 por ml para BRSV. Los cultivos inoculados se incubaron a 37 ± 2°C y 5 ± 1% de CO2. BHV y PI3 se incubaron durante 2 a 4 dfas, BVDV-1a, BVDV-1b y BVDV-2 durante 4 a 6 dfas, y b RsV durante 5 a 8 dfas.

Recoleccion

En el dfa de la recoleccion, se examino el cultivo para determinar el CPE espedfico del virus y la esterilidad. El tiempo mmimo de incubacion fue 2 dfas despues de la inoculacion con BHV o PI3, 4 dfas despues de la inoculacion con BVDV-1a, BVDV-1b o BVDV-2 y 5 dfas despues de la inoculacion con BRSV. El tiempo maximo de incubacion fue de 4 dfas despues de la inoculacion con BHV o PI3, 6 dfas despues de la inoculacion con BVDV-1a, BVDV-1b o BVDV-2, y 8 dfas despues de la inoculacion con BRSV.

Las suspensiones de virus se recogieron asepticamente de los recipientes de produccion. Se recolectaron muestras para determinar el TCID50 de la recoleccion. El material de recoleccion se almaceno a una temperatura de 6°C a -80°C. El material de recoleccion se puede almacenar por encima de la congelacion hasta por un mes y congelarse hasta por seis meses antes de la fabricacion del producto final.

Todas las manipulaciones se realizaron utilizando tecnicas asepticas estandar. Se agregaron neomicina y nistatina (Mycostatin®, Bristol-Myers Squibb, Nueva York, NY, EE.UU.) durante el ensamblaje de una vacuna serial o subserial a una tasa de 15 |jg y 15 Unidades/dosis, respectivamente.

Los fluidos de recoleccion se diluyeron en DMEM y se estabilizaron mediante la adicion de una solucion de sacarosa filtrada por 0,2 jm , lo que resulta en una concentracion final de sacarosa de 10 ± 1%. Los fluidos de recoleccion del virus se pueden concentrar mediante ultrafiltracion esteril utilizando un filtro de corte de peso molecular de 10 kDa. El grado de concentracion tfpicamente no excedio 50 veces.

Se analizaron lotes de fluidos virales recolectados para determinar la TCID50 (por ejemplo, Procedimiento de Spearman-Karber).

Ejemplo 5 - Estudios de eficacia para la vacuna BRDC hexavalente (virus vivo modificado)

Los Ejemplos 5 a 10 demuestran la efectividad de la vacuna viva, modificada del BRDC hexavalente, en la prevencion de la enfermedad causada por cada uno de los virus que contiene. En este primer ejemplo, se muestra que la vacuna es efectiva en la prevencion de enfermedades causadas por BVDV-1b.

Materiales

La vacuna hexavalente (virus vivo modificado) se preparo de acuerdo con el procedimiento de produccion descrito anteriormente. En resumen, BHV-1 (cepa Cooper), BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (cepa TgAc ), BVDV-2 (125), PI3 (Reisinger SF-4) y BRSV (N375) se propagaron en el lmea celular TVL-BK (vigesimo pase). Las fracciones individuales se recolectaron en el pase 10 y se combinaron en el producto de seis vfas.

Los placebos de eliminacion se realizaron junto con cada uno de los seriales de eficacia. Por ejemplo, el placebo sin BVDV contema los mismos lotes de recoleccion de BRSV, BHV y PI3 que el serial de eficacia correspondiente. El medio de cultivo se sustituyo por el componente de BVDV para mantener un volumen equivalente entre el serial de eficacia y el placebo sin BVDV.

Se construyeron placebos de eliminacion similares para cada componente del MLV de la vacuna hexavalente.

Procedimientos Experimentales

Para cada estudio, se adquirieron, terneros para carne/leche comerciales de aproximadamente 3-4 meses de edad en forma aleatoria y se identificaron mediante etiquetas de oreja. Estos terneros fueron desparasitados y vacunados contra pasteurelosis, micoplasmosis y carbunco sintomatico. Los terneros en los grupos vacunados y de control se mantuvieron en corrales separados, no adyacentes pero equivalentes hasta dos dfas antes de la exposicion (Dfa -2), momento en el que se mezclaron en un solo corral.

Todos los terneros fueron expuestos en el Dfa 0 con un aislado virulento del virus de interes. Por ejemplo, se paso in vitro el BVDV-1b virulento (obtenido de los pulmones de un ternero muerto en el corral en Poky Feeders [Scott City, KS, EE. UU.]) a celulas TVL-BK utilizando DMEM con un 10% de suero equino. Se administro una dosis para exposicion de aproximadamente 8 * 107 TCID50 en 4 ml a cada ternero, 2 ml en cada pasaje nasal durante la inspiracion. Los terneros tuvieron acceso libre al agua, al heno costero de las Bermudas y a una racion de alimento mixto que contema un coccidiostatico, pero no antibioticos.

Distribucion aleatoria

Se uso un esquema de distribucion aleatoria por parejas para asignar terneros en dos grupos de tratamiento (vacunado o control vacunado con placebo) usando una tabla de distribucion aleatoria proporcionada por CVB-Biometrics (Vease Tabla 1). Se distribuyo aleatoriamente una secuencia de tres terneros que ingresaron al callejon. Los dos grupos de tratamiento en una proporcion de 2:1. Las etiquetas de oreja, extrafdas al azar de un cubo en el momento de la extraccion de sangre inicial para la evaluacion serologica, identifican a los terneros. Los dos grupos de terneros se mantuvieron en corrales separados pero equivalentes antes de la exposicion. Los terneros se mezclaron en un corral, dos dfas antes de la exposicion (dfa -2).

Prueba ciega

El personal no tema conocimiento de la identidad de los controles o de los vacunados. Todo el personal de campo y de laboratorio, con excepcion del encargado del registro, trabajo en forma ciega para el estudio.

Resultado

El resultado primario seleccionado fue leucopenia despues de la exposicion. La leucopenia se definio como una disminucion del 25% con respecto a los recuentos basales de globulos blancos. Otros resultados que apoyaron la eficacia de la vacuna incluyeron secrecion nasal, viremia, pirexia, produccion de anticuerpos y signos clmicos de infeccion viral.

Estimador

Los recuentos individuales de globulos blancos (WBC) se convirtieron en un porcentaje del promedio previo a la exposicion y se midieron en una escala de intervalo continuo. Estos porcentajes de recuento de WBC convertidos se determinaron diariamente durante al menos 14 dfas despues de la exposicion y sirven como el criterio principal para la evaluacion. La deteccion de leucopenia sirvio como criterio principal para determinar la resistencia (no afectada) o la susceptibilidad (afectada) a la exposicion.

El grupo afectado y no afectado se comparo para determinar si la vacunacion previno la leucopenia despues de exposicion al virus. Los signos clmicos de la enfermedad respiratoria y la deteccion de virus de las muestras de las nasal/capa leucocitaria sirvieron como criterios secundarios para determinar la susceptibilidad a la exposicion. La duracion de la leucopenia y la duracion de la secrecion (numero de dfas en que se detecto el virus en un ternero individual) se analizo para determinar si la vacunacion tema un efecto mitigante sobre estos parametros. Todas las temperaturas rectales diarias individuales se analizaron utilizando la temperatura promedio previa a la exposicion (lmea base) como una covariable. Las unidades experimentales se excluyeron del estudio si teman un tttulo viral >2 al inicio del estudio.

Estructuras y procedimientos de muestreo.

Se recogieron muestras de sangre de terneros inmediatamente antes de la vacunacion (dfa -28 a -21) con eficacia serial o el correspondiente placebo de eliminacion. Las muestras de sangre tambien se recolectaron inmediatamente antes de la exposicion (Dfa 0) y nuevamente 14 dfas despues de la exposicion (Dfa 14). Las muestras de sangre para los recuentos diferenciales de WBC y el aislamiento del virus se recolectaron desde el dfa -2 hasta al menos el Dfa 14. Las muestras se recolectaron en tubos Vacutainer® con EDTA (Becton-Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, EE.UU.), y los conteos se realizaron utilizando un contador diferencial de WBC Hemavet 950 de Drew Scientific. Se tomaron frotis nasales para el aislamiento del virus desde el dfa -2 hasta al menos el Dfa 14.

Observaciones y recopilacion de datos

Se recogieron muestras nasales y muestras de sangre y se observaron terneros en busca de signos clmicos de infeccion viral en los dfas 2 a 14. Las temperaturas rectales se determinaron para cada ternero desde el dfa -2 hasta el Dfa 14.

Los datos del recuento de WBC se analizaron para determinar las reducciones en el recuento posterior a la exposicion. Se calculo una media previa a la exposicion para cada animal promediando los recuentos de WBC. Dfa -2 a Dfa 0. Se calculo la proporcion de recuentos diarios de WBC en relacion con la media previa a la exposicion (recuento de WBC como proporcion de la fase previa a la exposicion) para cada dfa 1-14 despues a la exposicion o mas a discrecion de los observadores. Si la proporcion disminma en un 25%, el individuo se clasificaba como leucopenico. Los frotis nasales se tomaron de cada ternero el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion frotando ambas narinas con un BBL Culture Swab® con medio Stuart lfquido. El dfa de la recoleccion, las muestras se procesaron por filtracion esteril a traves de un filtro de 0,2 pm. Cada pozo de una placa de 12 pozos que contema TVL-MDBK (aproximadamente 80% de confluencia) se inoculo luego con una muestra. Un pozo por placa permanecio sin inocular y sirvio como control negativo. Un pozo de la placa se inoculo con una dilucion del virus expuesto y sirvio como control positivo.

Las placas se incubaron a 3-7% de CO2 a una temperatura de 35-39°C durante 2 a 4 dfas. Los medios de cada pozo se recolectaron y almacenaron a una temperatura de -18°C a -22°C. Los medios de todos los pozos se analizaron mediante RT-PCR (Ridpath y Bolin 1998) para determinar si un virus en particular estaba presente en el cultivo. Los individuos que fueron positivos al cultivo para el virus se clasificaron como "secretores".

Se usaron capas leucocitarias de muestras de sangre para inocular cada pozo de una placa de 12 pozos que contema TVL-MDBK (aproximadamente 80% de confluencia). Un pozo por placa permanecio sin inocular y sirvio como control negativo. Un pozo de la placa se inoculo con una dilucion del virus de exposicion y sirvio como control positivo. Las placas se incubaron a 3-7% de CO2 a una temperatura de 35-39°C durante 2 a 4 dfas. Los medios de cada pozo se recolectaron y almacenaron a una temperatura de -18 a -22°C. Los medios de todos los pozos se analizaron por RT-PCR (Ridpath y Bolin, 1998) para determinar si el virus estaba presente en el cultivo. Los individuos que dieron positivo para un virus en particular se clasificaron como "viremicos".

Las temperaturas rectales diarias para cada animal se registraron entre el Dfa -2 y el Dfa 14 (2 dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y 14 dfas despues de la exposicion) del estudio.

Se calculo una media antes de la exposicion para cada animal promediando los valores de temperatura desde el Dfa -2 hasta el Dfa 0. Las temperaturas diarias se analizaron utilizando el valor inicial como una covariable.

Tftulos de anticuerpos de BVDV-1b: en el caso de la eficacia de BVDV-1b, los tftulos de anticuerpos de neutralizacion de suero contra BVDV-1b se determinaron mediante el procedimiento en suero de disminucion constante del virus para cada animal el dfa de la vacunacion inicial (dfa -21), El dfa de la exposicion (Dfa 0) y al final del estudio. Los tftulos de anticuerpos se determinaron utilizando una modificacion del esquema especial A-17, valoracion del anticuerpo neutralizador de virus de la diarrea viral bovina tipo 1. El ensayo modificado uso un aislado de BVDV-1b citopatico como el virus indicador en lugar de un aislado de BVDV-1a. Los animales que desarrollaron un tftulo de anticuerpos >8 se consideraron como sero-convertidos a BVDV-1b.

Se estimaron las diferencias en la duracion de la leucopenia, la secrecion y la viremia entre el grupo vacunado y el grupo de control (fraccion mitigada). Las temperaturas rectales se analizaron utilizando la temperatura promedio antes de la exposicion (lmea base) como covariable. El intervalo de confianza seleccionado fue del 95%.

Leucopenia: el analisis de los datos de leucopenia se baso en la proporcion de vacunados que fueron leucopenicos en comparacion con la proporcion de controles vacunados con placebo que fueron leucopenicos despues de la exposicion viral. Esto se evaluo determinando la fraccion prevenible segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993).

Secrecion y viremia: los analisis de los datos de secrecion y viremia se basan en la proporcion de vacunados que secretan el virus o son viremicos en comparacion con la proporcion de controles vacunados con placebo que se secretan o son viremicos despues de la exposicion viral. Estos se evaluaron determinando la fraccion prevenible segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993).

La diferencia de la mediana en la duracion de la leucopenia entre los dos grupos se estimo y la fraccion mitigada se calculo de acuerdo con Fergen (2004). La diferencia de la mediana en la duracion de la secrecion y la diferencia de la mediana en la duracion de la viremia entre los dos grupos se estiman y las fracciones mitigadas se calculan segun Fergen (2004).

Observaciones clinicas: El analisis de las temperaturas rectales para los dfas 1-14 se realizo con un analisis de mediciones repetidas de la varianza (ANOVA) que incluye los terminos para las interacciones de Grupo, Dfa y Grupo *Dfa utilizando la lmea base como covariable. Cuando las interacciones de Grupo*Dfa fueron significativas (p <0,5), el grupo vacunado se comparo con el control mediante el simple efecto de Group para cada punto de tiempo. Estas simples comparaciones de efectos se obtuvieron a partir de las interacciones Grupo*Dfa.

Analisis estadistico: las comparaciones de grupo de los tftulos de anticuerpos se analizaron con la prueba U de Mann-Whitney. Todos los analisis estadfsticos se realizaron utilizando SAS Learning Edition v2.0 para MS-Windows® como se describio anteriormente.

Ejemplo 5A - Estudios de eficacia para la vacuna de BRDC hexavalente

Los resultados de este estudio demuestran que el virus vivo modificado de diarrea viral bovina tipo 1b (BVDV1b), la rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenzas, Vacuna contra virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado, es antigenico y eficaz como auxiliar en la prevencion de las enfermedades causadas por BVDV1b. Se administro una dosis de la vacuna a veintiun terneros sero-negativos con BVDV. Se vacunaron diez terneros de control seronegativos con una dosis de una vacuna placebo comparable con el producto coincidente. Todos los terneros fueron expuestos intranasalmente con BVDV1b. La vacunacion dio como resultado un aumento del tftulo de anticuerpos de BVDV1b y previno o redujo la viremia inducida por BVDV1b, la secrecion nasal, pirexia, signos clmicos de la enfermedad y leucopenia. En consecuencia, se ha establecido un mmimo de BVDV1b-TCID50 de 2 X 103 por dosis para la fraccion de BVDV1b de esta vacuna. Esta vacuna contiene BHV-1, PI3, BRSV, dos subgenotipos de BVDV tipo 1 (1a y 1b) y BVDV tipo 2.

Vacunacion, exposicion y recoleccion de muestras: treinta un (31) terneros negativos para BVDV se mezclaron en un callejon de clasificacion. Cada ternero se separo con una puerta, ya que se arrearon al azar, tres terneros a la vez, a traves del callejon en uno de los dos grupos (Grupo A, vacunados o Grupo B, controles vacunados con placebo) mediante el uso de un esquema de distribucion aleatoria de grupos pareados.

Se vacunaron 21 terneros con una dosis de rinotraqueitis bovina, Diarrea viral, Parainfluenza3 - Vacuna sincitial respiratoria, virus vivo modificado. A cada vacunado se le administro una dosis de 2 ml del producto mediante inyeccion subcutanea en el lado izquierdo del cuello en el Dfa 0. Se vacunaron diez terneros con una vacuna placebo combinada con el producto (sin BVDV). Dos dfas antes de la exposicion, tanto los grupos vacunados como los grupos de control se mezclaron con el proposito de realizar una observacion clrnica previa a la exposicion y adquirir la temperatura corporal basal y las lecturas de WBC. Los terneros vacunados y de control se expusieron 21 dfas despues de la vacunacion con un aislado virulento de BVDV1b obtenido de los pulmones de un ternero muerto. El virus se habfa pasado in vitro en celulas TVL-BK utilizando Medio de Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de sueros equinos. Se administro una dosis para exposicion de 4X107 TCID50 en 4 ml a cada ternero, 2 ml en cada pasaje nasal durante la inspiracion.

Se recogieron muestras de sangre para determinar los tftulos de anticuerpos antes de la vacunacion, el dfa de la exposicion (21 dfas despues de la vacunacion) y 14 dfas despues de la exposicion. Los tftulos de anticuerpos contra el virus de la diarrea viral bovina se determinaron mediante el procedimiento de neutralizacion del suero que disminuye constantemente el virus.

Los frotis nasales para el aislamiento del virus se recolectaron de los terneros frotando ambas narinas con un BBL Culture Swab® en medio ftquido de Stuart el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Las muestras de sangre para el aislamiento del virus de la capa leucocitaria se recogieron de cada ternero mediante puncion venosa en un tubo Vacutainer con EDTA el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Las temperatures rectales se registraron diariamente para cada ternero durante dos dfas consecutivos antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Se realizaron y registraron observaciones clmicas para cada ternero. Los observadores actuaron en forma ciega debido a que tanto los grupos vacunados como los grupos de control se mezclaron con la unica caractenstica diferenciadora que es el numero de etiqueta de oreja. En ningun momento a lo largo del estudio, los observadores tuvieron conocimiento del estado de vacunacion de un animal de prueba individual. El personal de laboratorio no terna conocimiento del estado de vacunacion de los terneros.

Las muestras de sangre para determinar los recuentos diferenciales de WBC se recolectaron durante dos dfas consecutivos antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y 14 dfas consecutivos despues de la exposicion. Las muestras se recolectaron en tubos Vacutainer con EDTA y los recuentos se realizaron utilizando un contador diferencial de globulos blancos Hemavet 950 de Drew Scientific.

Deteccion de BVDV: Se utilizaron tecnicas de PCR mejoradas en cultivo celular para detectar BVDVIb en muestras recogidas. Brevemente, las muestras nasales se procesaron mediante filtracion esteril (0,2 pm) en celulas TVL-BK en cultivo. Las capas leucocitarias se colocaron directamente en celulas TVL-BK en cultivo durante 45-75 minutos antes de ser lavadas de las celulas. Los cultivos se incubaron durante 4 dfas a 37°C ± 2°C y 5 ± 1% de CO2. El sobrenadante de todas las muestras de cultivo se analizo individualmente para determinar la presencia/ausencia de BVDV1b utilizando la metodologfa de RT-qPCR convencional y el siguiente grupo de sondas/cebadores:

Cebador directo: CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC (SEQ ID NO: 1)

Cebador inverso: TGCCCACAGCACATCTTAACC (SEQ ID NO: 2)

Sonda TaqMan MGB: TCACCTGGACGACCC (SEQ ID NO: 3)

Este procedimiento se desarrollo con base en la diferenciacion de los virus de la diarrea viral bovina (BVDV) de los tipos 1a, 1b y 2 por PCR (Julia F. Ridpath y Steven R. Bolin, Molecular and Cellular probes, Journal of Virological Methods, 130 (2005) 145-148). Este procedimiento tambien se basa en el Protocolo de Prueba del Centro para Compuestos Biologicos Veterinarios y los Laboratorios Nacionales de Servicios Veterinarios - Genotipado del Virus de la Diarrea Viral Bovina, Numero BPPR02010.01. Ambos procedimientos de diferenciacion de genotipos y subgenotipos de BVDV explotan las diferencias geneticas que existen en la region 5' no traducida (UTR) del genoma. Este grupo de sonda/cebador se diseno espedficamente para amplificar una seccion de la UTR 5' en la que la sonda altamente espedfica puede detectar una unica secuencia de BVDV1b. La especificidad del grupo de sonda/cebador se confirmo internamente y no reacciono de forma cruzada con BHV, PI3, BRSV, BVDV1a o BVDV2. Los ensayos de RT qPCR se realizaron utilizando ensayos basados en Taqman® en un Applied Biosystems 7500.

Analisis estadistico: tttulos de anticuerpos: las comparaciones de grupo de los tftulos escalados de forma ordinaria se analizaron con la prueba U de Mann-Whitney.

Viremia: se analizaron los datos de aislamiento del virus de las capas leucocitarias de muestras de sangre en funcion de la proporcion de vacunados de los cuales se aislo BVDV1b en comparacion con la proporcion de controles en los que se aislo BVDV1b despues de la exposicion. La fraccion prevenible para la viremia por BVDV1b se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993).

Secrecion nasal: los datos de aislamiento del virus del analisis de hisopo nasal se basan en la proporcion de vacunados de los cuales se aislo BVDV1b en comparacion con la proporcion de controles en los que se aislo BVDV1b despues de la exposicion. La fraccion prevenible para la secrecion de BVDV1b se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993).

Temperatura rectal: se determino una temperatura rectal promedio antes de la exposicion para cada animal. Este promedio se uso como covariable en un analisis de mediciones repetidas de varianza (ANOVA) que incluyo terminos para las interacciones de Grupo, Dfa y Grupo*Dfa.

Signos clinicos de la enfermedad: los signos clfnicos de la enfermedad se registraron diariamente por cada observador de forma independiente. Cualquier ternero que muestre signos durante al menos un dfa de observacion despues de la exposicion se considero "afectado". La fraccion prevenible para los signos clfnicos se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993).

Leucopenia: se calculo una media de leucocitos antes de la exposicion para cada animal al promediar los recuentos de leucocitos de los dfas -2 a 0. Se calculo la relacion de los recuentos diarios de leucocitos en relacion con la media previa a la exposicion (el recuento de leucocitos como una proporcion de exposicion previa) para cada d^ a 1-14 despues de la exposicion. Esta proporcion de datos se analizo para determinar si los animales individuales desarrollaron una leucopenia como se define por una disminucion del 40% en los recuentos desde el inicio. La fraccion prevenible se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993) para determinar si la vacunacion previno el desarrollo de leucopenia en este estudio.

Todos los analisis estadfsticos se realizaron utilizando SPSS version 16 para Windows.

Resultados

Tftulos de anticuerpos de neutralizacion de suero: Todos los terneros en este estudio teman un tftulo de anticuerpos de neutralizacion de suero BVDV (BVDV1a, BVDV1b y BVDV2) antes de la vacunacion de <1:2. El dfa de la exposicion (dfa 21), el grupo vacunado tema un tftulo de BVDV1b promedio de 1:83 que fue significativamente mayor (p< 0,05) que aquel del grupo de control <1:2. Los tftulos de anticuerpos de BVDV1b aumentaron 14 dfas despues de la exposicion tanto en terneros de control como en vacunados, lo que indica que los terneros habfan sido expuestos con BVDV1b.

Aislamiento de BVDVIb de capas leucocitarias: todos los diez terneros de control en este estudio fueron viremicos durante la fase posterior a la exposicion de este estudio. Sin embargo, siete de los terneros de control fueron viremicos durante el penodo de tiempo crftico en el que se observa tfpicamente la viremia posterior a la exposicion a BVDV. Tres terneros de control (1, 14, 30) fueron viremicos el dfa de la exposicion. Estos mismos tres terneros junto con el ternero 26 fueron viremicos al dfa siguiente a la exposicion. Esta observacion, junto con los datos serologicos, el aislamiento con hisopo nasal y la temperatura rectal sugieren que estos terneros se infectaron de forma natural al final de la fase de vacunacion del estudio, se volvieron viremicos y comenzaron a secretar temprano en la fase de exposicion de este estudio. Uno de estos cuatro terneros (ternero 30) se volvio viremico y elimino el virus durante el penodo tfpico de viremia/secrecion posterior a la exposicion. Ninguno de los 21 vacunados fue viremico durante el penodo posterior a la exposicion. Se calculo una fraccion prevenida utilizando una proporcion de 3/10 controles protegidos naturalmente y 21/21 vacunados protegidos. Esto resulta en una fraccion prevenible de 1.0.

Aislamiento de BVDVIb a partir de frotis nasales: los diez terneros de control en este estudio eliminaron el BVDV1b durante la fase posterior a la exposicion de este estudio. Sin embargo, siete de los terneros de control secretaron durante el penodo de tiempo crftico en el que normalmente se observa secrecion posterior a la exposicion de BVDV. Dos terneros de control (26 y 30) secretaron el dfa de la exposicion. Tres terneros de control (1, 14 y 30) secretaron el dfa siguiente a la exposicion.

Esta observacion, junto con los datos serologicos, aislamiento de la capa leucocitaria y temperatura rectal, sugiere que estos terneros se infectaron de forma natural al final de la fase de vacunacion del estudio, se volvieron viremicos y comenzaron a secretar temprano en la fase de exposicion de este estudio. Uno de estos cuatro terneros (ternero 30) se volvio viremico y elimino el virus durante el penodo tfpico de viremia/secrecion posterior a la exposicion. Solo 1 de los 21 vacunados elimino el BVDV1b durante el penodo posterior a la exposicion. Se calculo una fraccion prevenida utilizando una proporcion de 3/10 controles protegidos naturalmente y 20/21 vacunados protegidos. Esto resulta en una fraccion prevenible de 0.93.

Temperaturas rectales: el analisis de los datos indico una interaccion significativa Grupo*Dfa (p = 0,034). El analisis por dfa indico que las temperaturas en el grupo de control fueron significativamente mayores (p <0,05) que aquellas del grupo vacunado en los dfas 1,4,7 y 8 despues de la exposicion. En el dfa 12, las temperaturas rectales del grupo de control disminuyeron y fueron significativamente menores (p <0,05) que aquellas del grupo vacunado.

Signos clrnicos de BVDVIb: Ocho de diez terneros (8/10 afectados) en el grupo de control demostraron signos clrnicos que podnan contribuir a la infeccion por BVDV1b. Los signos clrnicos incluyeron diarrea, cantidades copiosas de secrecion nasal clara, respiracion rapida y secrecion ocular. Ninguno (0/21 afectado) de los terneros en el grupo de vacunados demostro alguno de estos signos clrnicos durante la fase posterior a la exposicion del estudio. Se calculo una fraccion prevenida utilizando una proporcion de 2/10 controles protegidos naturalmente y 21/21 vacunados protegidos. Esto resulta en una fraccion prevenible de 1.0. No se observaron reacciones adversas posteriores a la vacunacion en ninguno de los terneros.

Leucopenia: se detecto leucopenia en cuatro de los 21 vacunados y en cinco de los diez controles, lo que resulto en una fraccion prevenible del 62%.

Conclusiones

Lo anterior demuestra la antigenicidad y la eficacia de la fraccion del BVDV1b de la rinotraqueitis bovina, Diarrea viral, Parainfluenzas, Vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado como ayuda en la prevencion de la enfermedad causada por BVDV1b.

La antigenicidad y la eficacia de la fraccion del BVDVIb de este producto combinado se confirma por lo siguiente: 1) Un aumento significativo en los tttulos de anticuerpos para BVDV1b en el grupo de vacunados en comparacion con el grupo de control. Todos los terneros en el grupo vacunado desarrollaron tttulos de BVDVIb > 1:8 despues de la administracion de una dosis de 2 ml, que cumplen con los requisitos definidos en el tftulo 9 del CFR 113.311 (c) (5).

2) Los estudios de aislamiento de virus revelaron que la administracion de una dosis resulto en una disminucion significativa de la viremia y la secrecion nasal inducidas por BVDV1b posterior a la exposicion.

3) Los terneros vacunados mostraron significativamente menos fiebre en comparacion con los terneros de control y no mostraron signos clmicos de enfermedad.

4) La vacunacion tambien disminuyo la probabilidad de desarrollar una leucopenia inducida por BVDV1b. Este estudio se vio afectado marginalmente por el hecho de que al menos tres de los terneros en el grupo de control se infectaron con BVDV1b poco antes de la exposicion. Debido al hecho de que todos los terneros de control, incluidos los que estaban infectados, todavfa eran seronegativos en el momento de la exposicion, se concluyo que la exposicion natural se produjo al final de la fase de vacunacion del estudio. No hubo evidencia clmica de exposicion natural en el grupo vacunado, probablemente debido a que se mantuvieron separados del grupo de control hasta 2 dfas antes de la exposicion. La exposicion natural es una posibilidad inherente cuando se realizan estudios de exposicion en un entorno tfpico del ternero para carne/leche. Segun Tanner y Morgan, la estimacion de la eficacia de la vacuna determinada por la fraccion prevenible considera la relacion entre la proteccion observada y la efectividad de la vacuna para varios niveles de inmunidad natural.

Los hallazgos del estudio son estadfsticamente significativos y clmicamente relevantes, por lo que demuestran la eficacia de la fraccion del BVDV1b contenida en la vacuna.

Ejemplo 6 - Protocolo de eficacia de BRSV

Este ejemplo demuestra que la fraccion del virus sincitial respiratorio bovino (BRSV) de la vacuna de MLV hexavalente ayuda en la prevencion de la enfermedad causada por BRSV.

Materiales y procedimientos

Se prepara un placebo sin BRSV y se usa junto con la eficacia serial de una manera analoga a la descrita en el Ejemplo 5 para BVDV-1b. Este placebo sin BRSV contiene los mismos lotes de recoleccion de BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, BHV y PI3 que la eficacia serial, con medios de cultivo que sustituyen al componente BRSV para mantener un volumen equivalente entre la eficacia serial y el placebo sin BRSV. El diluyente esteril se usa para rehidratar tanto la vacuna MLV hexavalente como el placebo sin BRSV como se describe en este documento.

Procedimientos experimentales

Se utilizan terneros comerciales de carne/leche aproximadamente 3-4 meses a partir de una poblacion relativamente homogenea que tiene aproximadamente el mismo origen, tipo, peso y edad. Los terneros son desparasitados y vacunados contra pasteurelosis, micoplasmosis y carbunco sintomatico. En el protocolo se utilizan numeros iguales de terneros vacunados y de control; los dos grupos de terneros se mantienen en corrales separados, no adyacentes pero equivalentes antes de la exposicion, y se mezclan en un corral, dos dfas antes de la exposicion (dfa -2). Los terneros tienen acceso libre al agua, heno costero de las Bermudas y una racion de alimento mixto que contiene un coccidiostatico, pero no antibioticos.

Distribucion aleatoria

Se utiliza un esquema de distribucion aleatoria pareado para asignar terneros a dos grupos de tratamiento (vacunado o de control vacunado con placebo) usando una tabla de distribucion aleatoria CVB-Biometrics, en la cual una secuencia de tres terneros que ingresan al callejon se distribuyen aleatoriamente en los dos grupos de tratamiento en una relacion de 2:1. Las etiquetas de oreja, extrafdas al azar de un cubo en el momento de la extraccion de sangre inicial para la evaluacion serologica, identifican a los terneros.

Prueba ciega

Todo el personal actua en forma ciega para el estudio (con la excepcion del encargado del registro), y no tiene conocimiento de la identidad de los controles o vacunados.

Resultado

El resultado primario es la prevencion de la secrecion nasal del virus BRSV despues de la exposicion, que se determina por la presencia o ausencia de BRSV en muestras nasales recolectadas diariamente de las narinas de todos los terneros durante el protocolo. Otros resultados secundarios pueden incluir uno o mas signos clmicos disminuidos de infeccion por BRSV, reduccion de la pirexia y/o reduccion de la duracion de la secrecion en los terneros que secretan BRSv .

La secrecion de BRSV por los grupos vacunados y de control se determina diariamente durante 14 d^as despues de la exposicion, con deteccion de BRSV que sirve como el criterio primario para determinar la resistencia (no afectada) o la susceptibilidad (afectada) a la exposicion. Los grupos afectados y no afectados se comparan para determinar si la vacunacion previno la secrecion del BRSV despues de una exposicion al BRSV. Los signos clmicos de la enfermedad respiratoria sirven como un criterio secundario para determinar la susceptibilidad o la resistencia a la exposicion. Se analiza la duracion de la secrecion (numero de dfas en que se detecto BRSV en un ternero individual) para determinar si la vacunacion tuvo un efecto atenuante en este parametro. Todas las temperaturas rectales diarias individuales se analizan frente a la covariable de temperatura promedio previa a la exposicion (lmea base). Las unidades experimentales se excluyen si tienen un tttulo SN de BRSV > 2 al inicio del estudio.

Estructuras y procedimiento de muestreo

Se recogen muestras de sangre de terneros inmediatamente antes de la vacunacion (dfa -28 a dfa -21) con eficacia serial o placebo sin BRSV, y nuevamente inmediatamente antes de la exposicion (Dfa 0) y nuevamente 14 dfas despues de la exposicion ( Dfa 14).

Observaciones y recopilacion de datos.

Los frotis nasales se toman de cada ternero el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion frotando ambas narinas con un BBL Culture Swab® con medio lfquido de Stuart. Los medios de las muestras se analizan para determinar la presencia de BRSV mediante PCR en tiempo real utilizando un grupo de sonda/cebador espedficamente para detectar BRSV.

Cebador directo: 5'-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3 '(SEQ ID NO: 4);

Cebador inverso: 5-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3 '(SEQ ID NO: 5); y

Sonda TaqMan® MGB para BRSV: 5'-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3 '(SEQ ID NO: 6).

Los datos de duracion se analizan para demostrar que la vacunacion tuvo un efecto mitigador sobre la duracion del tiempo en que se detecto BRSV en muestras nasales.

Observaciones clmicas: las temperaturas rectales diarias para cada animal se registran entre el Dfa -2 y el Dfa 14 (2 dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y 14 dfas despues de la exposicion), y se calcula una media antes de la exposicion para cada animal promediando los valores de temperatura desde el Dfa -2 hasta el Dfa 0. Las temperaturas diarias se analizan luego utilizando la lmea de base como covariable.

Los tftulos de anticuerpos de neutralizacion de suero se determinan mediante el procedimiento de suero que disminuye constantemente el virus para cada animal el dfa de la vacunacion, el Dfa 0 y el Dfa 14 del estudio (Schefers et al., 2008).

Los signos clmicos de BRSV en terneros para carne han sido descritos previamente por Baker (1986). Los signos clmicos incluyen, entre otros, secrecion nasal y lagrimal, aumento de la frecuencia respiratoria, temperatura rectal elevada, depresion leve, disminucion de la ingesta de alimento, hipersalivacion y disnea. Los signos clmicos de infeccion por BRSV son menos obvios en los modelos de exposicion tradicionales porque el virus utilizado para la exposicion se ha atenuado por la propagacion in vitro, y el unico parametro importante para evaluar estos modelos es la secrecion del virus (Wren, 2001). En consecuencia, los signos clmicos se registran dos dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante los catorce dfas posteriores a la exposicion. La observacion de los signos clmicos de BRSV se toma en cuenta durante el analisis de los datos, pero no se considera como un resultado primario porque estos signos pueden ser indicativos de muchas enfermedades respiratorias que se encuentran comunmente en el ganado comercial.

La proporcion de controles vacunados y vacunados con placebo que se clasifican como afectados o no afectados se estima (fraccion prevenida), al igual que la diferencia en la duracion de la secrecion entre el grupo vacunado y el grupo de control (fraccion mitigada).

La eficacia de la fraccion de virus BRSV de la vacuna de MLV hexavalente se puede evaluar facilmente determinando la fraccion prevenible segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993). Este analisis se basa en la proporcion de vacunados que son resistentes a la exposicion al BRSV en comparacion con la proporcion de controles vacunados con placebo que son resistentes.

Analisis estadisticos: la diferencia media en la duracion de la secrecion entre los dos grupos puede estimarse y la fraccion mitigada puede calcularse segun el procedimiento de Fergen (2004). Las comparaciones de grupos de los tftulos de anticuerpos pueden analizarse con la prueba U de Mann-Whitney. Todos los analisis estadfsticos se realizaron utilizando SAS Learning Edition 2.0 para Microsoft Windows® como se describio anteriormente.

Ejemplo 6A - Estudio de eficacia de BRSV

Los resultados de este estudio demuestran que la fraccion del virus sincitial respiratorio bovino (BRSV) vivo modificado de rinotraqueitis bovina, diarrea viral, Parainfluenzas, vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado, es antigenica y eficaz como una ayuda en la prevencion de la secrecion del virus sincitial respiratorio bovino en terneros para carne/leche. Se administro una dosis de la vacuna a veintidos terneros seronegativos para BRSV. Se vacunaron once terneros de control sero negativo con una dosis de una vacuna placebo comparable con el producto. Todos los terneros fueron expuestos en forma intranasal con BRSV. La vacunacion dio como resultado un aumento del tttulo de anticuerpos de BRSV e impidio la secrecion de BRSV despues de la exposicion. En consecuencia, se ha establecido un BRSV-TCID50 mmimo de 7x102 por dosis para la fraccion del BRSV de esta vacuna.

Materiales y procedimientos

Vacunacion y exposicion de los terneros: Treinta y tres (33) terneros BRSV negativos se mezclaron en un callejon de clasificacion. Cada ternero se separo con una puerta, ya que fueron arreados al azar, tres terneros a la vez, a traves del callejon en uno de los dos grupos (Grupo A, vacunados o Grupo B, controles vacunados con placebo) mediante el uso de un esquema de distribucion aleatoria de grupos pareados proporcionado por CVB Biometrics

Veintidos de los terneros serologicamente negativos fueron vacunados con una dosis de rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenzas, vacuna sincitial respiratoria, vacuna contra el virus vivo modificado. A cada vacunado se le administro una dosis de 2 ml del producto mediante inyeccion subcutanea en el lado izquierdo del cuello en el Dfa 0. Se vacuno a once de los terneros con una vacuna placebo comparable con el producto (sin BRSV). Se recogieron frotis nasales, se sangraron los terneros y se examinaron serologicamente para confirmar la susceptibilidad al BRSV mediante un ensayo de neutralizacion del suero que disminuye constantemente el virus. Dos dfas antes de la exposicion, los grupos de vacunacion y control se mezclaron con el proposito de hacer una observacion clmica previa a la exposicion. Los terneros vacunados y de control se expusieron 32 dfas despues de la vacunacion con 4 ml (2 ml por narina) de TVL-BRSV, aislado de N375. El virus de exposicion se titulo inmediatamente antes de la exposicion (TCID50 de 1066/ml) y de nuevo inmediatamente despues de la exposicion (TCID50 de 1062/ml). El virus para la exposicion se mantuvo refrigerado durante todo el proceso de exposicion.

Se recogieron muestras de sangre el dfa de la vacunacion, el dfa de la exposicion y 14 dfas despues de la exposicion. Los tttulos de anticuerpos del virus sincitial respiratorio bovino se determinaron mediante el procedimiento de neutralizacion del suero que disminuye constantemente el virus.

Se recogieron frotis nasales el dfa de la vacunacion, el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Las temperaturas rectales se registraron diariamente para cada ternero durante dos dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Se realizaron observaciones clmicas. Los observadores actuaron de forma ciega debido a que los grupos de vacunacion y control se mezclaron siendo la unica caractenstica diferenciadora el numero de etiqueta de oreja. En ningun momento a lo largo del estudio, los observadores tuvieron conocimiento del estado de vacunacion de un animal de prueba individual. El personal de laboratorio no tema conocimiento del estado de vacunacion de los terneros.

Deteccion del BRSV: se recogieron frotis nasales de terneros frotando ambas narinas con un BBL Culture Swab® en medio lfquido de Stuart. La observacion visual del CPE espedfico del BRSV junto con las tecnicas de PCR mejoradas en cultivo celular se utilizaron para detectar el BRSV en las muestras recolectadas. Brevemente, las muestras se procesaron por filtracion esteril (0,2 pm) en celulas TVL-BK en cultivo. Los cultivos se incubaron durante 5 dfas a 37°C ± 2°C y 5 ± 1% de CO2. Los cultivos se observaron para CPE espedfico de BRSV y se registraron los resultados. El sobrenadante de todas las muestras de cultivo (tanto el CPE+ como -) se analizaron individualmente para determinar la presencia/ausencia de BRSV utilizando el grupo de sonda/cebador descrito por M. Boxus et al., (Real Time RT-PCR for the detection and quantitation of bovine respiratory syncytial virus, M. Boxus, C. Letellier, P. Kerkhofs, Journal of Virological Methods, 125 (2005) 125-130 ).

La especificidad del grupo sonda/cebador se confirmo internamente y no reacciono de forma cruzada con BHV, Ph, BVDV1a, BVDV1b o BVDV2. Los ensayos de RT qPCR se realizaron utilizando ensayos basados en Taqman® en un Applied Biosystems 7500.

Todas las muestras que eran positivas para CPE espedficas para BRSV tambien eran positivas para PCR. Hubo 10 muestras que fueron negativas para el CPE espedfico de BRS^v y positivas para BRSV mediante el ensayo de PCR. Esto es coherente con los estudios internos que indican que los ensayos basados en PCR son mas sensibles que los ensayos basados en la observacion del CPE espedfico del BRSV. Las muestras que fueron negativas para BRSV despues del cultivo primario se subcultivaron y el sobrenadante de los fluidos subcultivados se analizo para determinar la presencia/ausencia de BRSV de acuerdo con el mismo procedimiento.

Analisis estadistico: la eficacia de la fraccion del BRSV de esta vacuna se baso principalmente en la proporcion de vacunados que secretaron BRSV en comparacion con la proporcion de controles que secretaron BRSV despues de la exposicion. La fraccion prevenible se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993). Se evaluo el numero de dfas posteriores a la exposicion en que se aislo el BRSV de terneros individuales en el estudio. Los grupos se compararon para determinar si la frecuencia del aislamiento de BRSV (secrecion) se redujo significativamente en el grupo de vacunados en comparacion con el grupo de control despues de la exposicion al BRSV.

Las comparaciones de grupo de los datos de tftulos escalados de manera ordinaria se compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney. Las temperaturas rectales se analizaron utilizando el promedio de temperatura antes de la exposicion como covariable. El analisis de la temperatura posterior a la exposicion para el dfa 1-14 se realizo con un analisis de varianza de mediciones repetidas (ANOVA). Todos los analisis estadfsticos se realizaron utilizando SAS para Windows.

Resultados

Tftulos de anticuerpos de neutralizacion de suero: Todos los terneros en este estudio tuvieron un tftulo de anticuerpos de neutralizacion de suero antes de la vacunacion <1:2. Los tftulos de anticuerpos de neutralizacion en suero despues de la vacunacion fueron significativamente mayores (p< 0,05) en el grupo vacunado en comparacion con los del grupo de control. Veintiuno de los 22 terneros vacunados mostraron un aumento en los tftulos de BRSV despues de la vacunacion, mientras que, los once controles vacunados con placebo permanecieron negativos durante todo el penodo de vacunacion antes de la exposicion. El tftulo promedio de anticuerpos del grupo vacunado fue de 8,5, mientras que el tftulo promedio del grupo de control fue <2.

Aislamiento de BRSV: todos los once terneros de control en este estudio secretaron BRSV durante la fase posterior a la exposicion de este estudio. Solo 3 de los 22 vacunados secretaron BRSV durante este tiempo. Esto resulta en una fraccion prevenible de 0,8636. Tambien hubo una diferencia significativa (p <0,05) en la frecuencia de secrecion. El grupo de control secreto BRSV durante un promedio de 6,00 dfas, mientras que los vacunados secretaron solo durante 0,227 dfas. Esta es una diferencia de 5,773 dfas.

Temperaturas rectales: el analisis de temperatura rectal posterior a la exposicion utilizando la temperatura promedio antes de la exposicion como covariable no revelo diferencias estadfsticamente significativas entre los grupos. No se realizo ningun analisis adicional de estos datos.

Signos clrnicos de BRSV: se examino a cada animal para detectar signos clrnicos de enfermedad respiratoria durante dos dfas consecutivos antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante catorce dfas consecutivos despues de la exposicion. No se observaron signos clrnicos que pudieran atribuirse definitivamente a la infeccion por BRSV. Sin embargo, se registro una descarga nasal excesiva clara como un signo clrnico para 7 de los 11 controles durante el mismo penodo de tiempo en que los terneros secretaron activamente BRSV. No se registraron signos clrnicos para el grupo vacunado durante el estudio. No se observaron reacciones adversas posteriores a la vacunacion en ninguno de los terneros.

Conclusiones

El informe anterior demuestra la eficacia de la fraccion de BRSV del rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenza3, vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado, como una ayuda en la prevencion de secrecion de BRSV en terneros para carne/leche.

La eficacia y la antigenicidad de la fraccion del BRSV de este producto combinado se comprueba por lo siguiente:

1) Los estudios de aislamiento de virus (BRSV) revelaron que la administracion de una dosis de vacuna proporciono un 86% (19/22) de proteccion en terneros vacunados en comparacion con el 100% (11/11) de susceptibilidad en los controles (fraccion prevenible = 0,8636).

2) Una disminucion significativa en la frecuencia de secrecion entre el grupo vacunado en comparacion con el grupo de control. Los terneros de control secretaron e BRSV durante 5,773 dfas mas que los vacunados.

3) Un aumento significativo en los tftulos de anticuerpos para BRSV del grupo vacunado en comparacion con el grupo de control.

Ejemplo 7 - Protocolo de eficacia para IBR (HBV-1)

Este ejemplo demuestra que la fraccion viral BHV-1 de la vacuna MLV hexavalente ayuda en la prevencion de IBR.

Materiales y procedimientos

La vacuna con el virus vivo modificado hexavalente se prepara como se describio anteriormente. Brevemente, BHV-1 (cepa Cooper), BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (Cepa TGAC), BVDV-2 (125), PI3 (Reisinger SF-4) y BRSV (N375) se propagan en la lmea celular TVL-BK (vigesimo pase). Las fracciones individuales se recolectan en decimo pase y se mezclan en el producto de seis v^as.

Se elabora un placebo sin BHV-1 junto con el serial de eficacia. El placebo sin BHV-1 contiene los mismos lotes de recoleccion de BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, PI3 y BRSV que el serial de eficacia. El medio de cultivo se sustituye por el componente BHV-1 para mantener un volumen equivalente entre el serial de eficacia y el placebo sin BHV-1. El diluyente esteril se usa para rehidratar tanto la vacuna como el placebo sin BHV-1.

Se distribuyen al azar los terneros para carne/leche comerciales de aproximadamente 3-4 meses de edad como se describio anteriormente, luego se desparasitan y se vacunan contra la pasteurelosis, la micoplasmosis y el carbunco sintomatico. A todos los terneros se les da acceso al agua, al heno costero de las Bermudas y a una racion de alimento mixto que contiene un coccidiostatico, pero no antibioticos. La disponibilidad de heno puede ser posteriormente restringida despues de que los terneros esten alimentados

En este estudio de un solo nivel se utilizan aproximadamente veinte o mas vacunas y diez o mas terneros de control. Los dos grupos de terneros se mantienen en corrales separados pero equivalentes antes de la exposicion. Los terneros se mezclan en un corral, dos dfas antes de la exposicion (dfa -2).

Distribucion aleatoria

Se puede usar un esquema de distribucion aleatoria pareado de los terneros para asignar a los terneros en dos grupos de tratamiento (vacunado o control vacunado con placebo). Por ejemplo, una secuencia de tres terneros que ingresan al callejon puede ser distribuida aleatoriamente en los dos grupos de tratamiento en una relacion de 2:1. Las etiquetas de oreja, extrafdas al azar de un cubo en el momento de la extraccion de sangre inicial para la evaluacion serologica, se utilizan para identificar a los terneros.

Prueba ciega

El personal que actua a ciegas no tiene conocimiento de la identidad de los controles o vacunados, y todo el personal de campo y de laboratorio (con la excepcion del encargado del registro), actuan en forma ciega durante todo el estudio.

Resultado

El resultado primario para este estudio es una diferencia en las lesiones nasales asociadas con IBR.

Esto se define como la presencia o ausencia de lesiones nasales. Otros signos clmicos de IBR, que incluyen la duracion y la gravedad de las lesiones nasales, el aislamiento de BHV-1 de las narinas y la temperatura corporal, se consideran resultados secundarios.

Los puntajes mismos de las lesiones nasales se estiman como categonas ordinales. La duracion y severidad de las lesiones en la mucosa nasal visible caractenstica de IBR sirven como criterios para la evaluacion. Los signos clmicos de enfermedad respiratoria y secrecion nasal tambien pueden usarse como criterios para determinar la resistencia (no afectada) o la susceptibilidad (afectada) a la exposicion. Las temperaturas rectales diarias individuales se analizan de forma rutinaria utilizando la temperatura promedio previa a la exposicion (lmea base) como covariable. Las unidades experimentales se excluyen del estudio si tienen un tttulo SN de BHV-1 >2 al inicio del estudio.

Se recogen muestras de sangre de terneros inmediatamente antes de la vacunacion (dfa -28 a dfa -21) con serial de eficacia o con placebo sin BHV-1. Las muestras de sangre tambien se toman inmediatamente antes de la exposicion (Dfa 0) y nuevamente 14 dfas despues de la exposicion (Dfa 14).

Estructuras de muestreo, recopilacion de datos y observaciones clmicas

Se recogen muestras nasales y se observan terneros para detectar lesiones visibles en la mucosa nasal y signos clmicos de IBR desde el Dfa 0 hasta el Dfa 14. Las temperaturas rectales se determinan para cada ternero desde el dfa -2 hasta el Dfa 14.

Las variables de resultado incluyen lesiones visibles de la mucosa nasal compatibles con IBR, temperaturas rectales, aislamiento del virus, tftulos de anticuerpos y signos clmicos de IBR.

Las lesiones nasales graves de IBR han sido descritas por Rosner (1968). Las lesiones tfpicas observadas incluyen inflamacion y edema de las fosas nasales con hemorragias y exudado fibronecrotico adherido a la mucosa. Rosner ha informado que el exudado necrotico a veces es tan extenso en las fosas nasales que forma un exudado seudomembranoso que se separa del tejido subyacente. Rosner tambien informa que estos hallazgos patologicos proporcionan un alto grado de confianza para realizar un diagnostico presuntivo de IBR. Los puntajes de la lesion nasal pueden asignarse de acuerdo con los criterios establecidos, y los datos de duracion analizados para demostrar si la vacunacion tuvo un efecto atenuante sobre la duracion en que se observaron las lesiones.

La evaluacion de la temperatura rectal, el aislamiento del virus, los tttulos de anticuerpos y los procedimientos estadfsticos son como se describen en los ejemplos anteriores. Los signos clmicos de iBr han sido descritos por Rosner (1968) e incluyen, entre otros, respiracion rapida, anorexia, pirexia, tos, secrecion nasal, perdida de peso y condicion. Los signos clmicos se registran dos dfas antes de la exposicion, el d^ a de la exposicion y durante los catorce dfas posteriores a la exposicion. La observacion de los signos clmicos de IBR puede tomarse en consideracion durante el analisis de los datos, pero no se considera como un resultado primario, ya que estos signos tambien pueden ser indicativos de muchas otras enfermedades respiratorias que comunmente se encuentran en el ganado comercial.

Analisis estadistico: las comparaciones de grupo de los tttulos de anticuerpos se analizaron con la prueba U de Mann-Whitney. Todos los analisis estadfsticos se realizaron utilizando SAS Learning Edicion v2.0 para MS-Windows® como se describio anteriormente.

Ejemplo 7a - Estudio de eficacia para IBR (HBV-1)

Los resultados de este estudio demuestran que la fraccion del virus del herpesvirus bovino vivo modificado 1 (BHV-1) de la rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenza3, virus del virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado, es antigenica y eficaz como ayuda en la reduccion de la rinotraqueitis bovina infecciosa (IBR). Se administraron dos dosis de la vacuna a veintidos terneros seronegativos para BHV-1. Doce terneros de control seronegativos fueron vacunados con dos dosis de una vacuna placebo comparable con el producto. Todos los terneros fueron expuestos intranasalmente con BHV-1. La vacunacion dio como resultado un aumento del tftulo de anticuerpos de BHV-1 y una reduccion tanto en la duracion como en la gravedad de las lesiones nasales asociadas con IBR. La vacunacion tambien disminuyo la duracion de la secrecion y la respuesta febril que generalmente sigue a una exposicion al BHV en terneros. En consecuencia, se ha establecido un TCID50 mmimo de BHV-1 o de 5 X 103 por dosis para la fraccion de BHV-1 de esta vacuna.

Materiales y procedimientos

Vacunacion y exposicion de los terneros: Treinta y cuatro terneros negativos para BHV-1 se mezclaron en un callejon de clasificacion. Cada ternero se separo con una puerta, ya que se arrearon al azar, tres terneros a la vez, a traves del callejon en uno de los dos grupos (Grupo A, vacunados o Grupo B, controles vacunados con placebo) mediante el uso de un esquema de distribucion aleatoria de grupos pareados proporcionado por CVB Biometrics. Se vacunaron veintidos terneros con una dosis de rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenza3, vacuna sincitial respiratoria, virus vivo modificado. A cada vacunado se le administro una dosis de 2 ml del producto mediante inyeccion subcutanea en el lado izquierdo del cuello en el Dfa 0. Se vacunaron doce terneros con una vacuna placebo comparable con el producto (sin BHV-1). Se recogieron frotis nasales para el aislamiento del virus BHV-1 y se extrajo sangre de todos los terneros para la confirmacion serologica de la susceptibilidad al BHV-1. El dfa 13, los terneros vacunados y de control recibieron una segunda dosis de 2 ml de serial de eficacia y el producto se comparo con el placebo, subcutaneamente, en el lado derecho del cuello. Dos dfas antes de la exposicion, los grupos de vacunacion y control se mezclaron con el proposito de la observacion clmica previa a la exposicion y para obtener lecturas de la temperatura corporal de referencia.

Los terneros vacunados y de control se expusieron 15 dfas despues de la segunda vacunacion con 4 ml (2 ml por narina) del virus para exposicion al BHV-1 proporcionado por el USDA-APHIS-CVB, cepa Coopers, numero de lote 05-08, fecha de llenado, 26 de octubre de 2O05.

El tftulo del virus para la exposicion se determino por CVB como 1082 TCID50/2 ml. El virus para la exposicion se titulo inmediatamente antes de la exposicion y se determino que era 1080 TCID50/4 ml y de nuevo inmediatamente despues de la exposicion y se determino que era 1074 TCID50/4 ml. El virus para la exposicion se mantuvo refrigerado durante todo el proceso de exposicion.

Se recogieron muestras de sangre el dfa de la vacunacion, el dfa de la exposicion y 14 dfas despues de la exposicion. Los tttulos de anticuerpos contra el herpesvirus bovino se determinaron mediante el procedimiento de neutralizacion de suero que disminuye constantemente el virus.

Se recogieron los frotis nasales el dfa de la vacunacion, el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Las temperatures rectales se registraron diariamente para cada ternero durante dos dfas antes de la exposicion, el d^ a de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Se realizaron observaciones clmicas y se asignaron puntuaciones de lesion nasal. Lesiones nasales graves causadas por BHV han sido divulgadas por S.F. Rosner, en JAVMA Vol. 153, No. 12, diciembre de 1968, paginas 1631-1638. Las lesiones tipicas observadas incluyen inflamacion y edema de las fosas nasales con hemorragias y exudado fibronectrotico adherido al revestimiento del moco. Rosner ha informado que el exudado necrotico a veces es tan extenso en las fosas nasales que forma un exudado seudomembranoso que se separa del tejido subyacente. Rosner tambien informa que estos hallazgos patologicos proporcionan un alto grado de confianza para realizar un diagnostico presuntivo de IBR.

Las puntuaciones de lesion nasal se asignaron de acuerdo con los criterios enumerados a continuacion:

Puntuacion Descripcion

0. Ausencia de lesiones definitivas de la enfermedad por el virus de la IBR.

1. La presencia de lesiones caractensticas de la enfermedad IBR no excede el 10% de la membrana mucosa nasal visible.

2. La presencia de lesiones caractensticas de la enfermedad IBR que afectan al 11-25% de la membrana mucosa nasal visible.

3. La presencia de lesiones caractensticas de la enfermedad IBR que afectan al 26-50% de la membrana mucosa nasal visible.

4. La presencia de lesiones caractensticas de la enfermedad IBR que afectan a mas del 50% de la membrana mucosa nasal visible.

Los observadores actuaron de forma ciega debido a que los grupos de vacunacion y control se mezclaron siendo la unica caractenstica diferenciadora el numero de etiqueta de oreja. En ningun momento a lo largo del estudio, los observadores tuvieron conocimiento del estado de vacunacion de un animal de prueba individual. El personal de laboratorio no tema conocimiento del estado de vacunacion de los terneros.

Deteccion de BHV-1: se recogieron frotis nasales de terneros frotando ambas narinas con un BBL Culture Swab® en medio lfquido de Stuart. La observacion visual del CPE espedfico de BHV-1 junto con las tecnicas de PCR mejoradas en cultivo celular se utilizaron para detectar BHV-1 en las muestras recolectadas. Brevemente, las muestras se procesaron por filtracion esteril (0,2 pm) en celulas TVL-BK en cultivo. Los cultivos se incubaron durante 4 dfas a 37°C ± 2°C y 5 ± 1% de CO2. Los cultivos se observaron para CPE espedfico de BHV-1 y se registraron los resultados. El sobrenadante de todas las muestras de cultivo (tanto CPE como -) se analizo individualmente para determinar la presencia/ausencia de BHV-1 utilizando la metodologfa de RT qPCR convencional y el siguiente grupo de sondas/cebadores:

Cebador directo: CCATGTTAGCGCTCTGGAACC (SEQ ID NO: 16)

Cebador inverso: CGTCTTTACGGTCGACGACTCC (SEQ ID NO: 17)

Sonda TaqMan MGB: ACGGACGTGCGCGAA (SEQ ID NO: 18)

La especificidad del grupo de sonda/cebador se confirmo internamente y no reacciono de forma cruzada con PI3, BRSV, BVDV1a, BVDV1b o BVDV2. Los ensayos de RT qPCR se realizaron utilizando ensayos basados en Taqman® en un Applied Biosystems 7500. Todas las muestras que eran positivas para CPE espedficas de BHV-1 tambien fueron positivas para PCR. Hubo 8 muestras que fueron negativas para el CPE espedfico para BHV-1 y positivas para BHV mediante el ensayo de PCR. Esto es coherente con los estudios internos que indican que los ensayos basados en PCR son ligeramente mas sensibles que los ensayos basados en la observacion del CPE espedfico para BHV-1. Las muestras que resultaron negativas para BHV-1 despues del cultivo inicial se subcultivaron y se observaron para CPE.

El sobrenadante de fluidos subcultivados se analizo para determinar la presencia/ausencia de BHV-1 de acuerdo con el mismo procedimiento.

Lesiones nasales: el resultado primario del estudio fueron las diferencias en las lesiones nasales asociadas con BHV-1. La fraccion prevenida se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993) con base en la presencia o ausencia de lesiones en un ternero individual. Una fraccion mitigada condicional estimada de la gravedad de las lesiones en los terneros afectados se determino de acuerdo con B.J. Fergen, Estimating an Intervention Effect on Outcome Severity, USDA, CVB. La duracion de las lesiones (el numero de dfas desde el primer hasta el ultimo dfa en que se observaron las lesiones) se determino para cada ternero afectado y se estimo la diferencia en la duracion de las lesiones entre los dos grupos.

T e m p e ra tu ra c o rp o ra l: un resultado secundario del estudio fueron las diferencias en la temperatura corporal entre los terneros del grupo vacunado y de control. El analisis de las temperaturas rectales para los dfas 1-14 se realizo con un analisis de medidas repetidas de varianza (ANOVA) que incluye los terminos para las interacciones de Grupo, Dfa y Grupo*Dfa y utilizando las temperaturas de referencia como covariable. Dado que las interacciones Grupo*Dfa fueron significativas (p <0,5), el grupo vacunado se comparo con el control a traves del simple efecto de Grupo para cada punto de tiempo. Estas simples comparaciones de efectos se obtuvieron a partir de las interacciones Grupo*Dfa.

S e cre c io n de v iru s : otro resultado secundario del estudio fue la diferencia en la secrecion de BHV posterior a la exposicion entre los terneros vacunados y los de control. La fraccion prevenida se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993) basandose en el aislamiento y la identificacion de BHV en muestras nasales de un ternero individual. La duracion de la secrecion (la cantidad de dfas desde la primera hasta la ultima fecha en que se detecto BHV-1) se determino para cada ternero afectado y se estimo la diferencia en la duracion de la secrecion entre los dos grupos.

Todos los analisis estadfsticos se realizaron utilizando SPSS version 17 para Windows.

R e su lta d o s

T ftu lo s de a n tic u e rp o s de n e u tra liz a c io n de s u e ro : Todos los terneros en este estudio tuvieron un tftulo de anticuerpos de neutralizacion de suero de BHV-1 antes de la vacunacion de < 1:2. Los 12 terneros en el grupo de control aun eran seronegativos el dfa de la exposicion (tftulo de anticuerpos de <1:2 ). Veintiuno de los 22 terneros en el grupo de vacunados fueron sero convirtieron con tftulos de > 1:2 al dfa de la exposicion (tftulo de la mediana del grupo de 1:4). A los 14 dfas despues de la exposicion, todos los terneros se habfan sero convertido a BHV-1 (mediana del tftulo de vacunado > 256, mediana del tftulo del control 128).

L e s io n e s nasa les : se observaron lesiones nasales en los 12 terneros de control (100%) y en 20 de los 22 terneros vacunados (91%). La fraccion estimada evitada para las lesiones nasales observadas es del 9%. Una fraccion mitigada estimada sobre la gravedad de los terneros afectados fue del 90% (CI 95%: 72%, 100%). Las lesiones entre los controles afectados fueron mas graves que entre los vacunados afectados. La mediana de duracion en que se observaron las lesiones nasales fue de 6 dfas para los vacunados y de 10,5 dfas para los controles. El cambio estimado en la duracion entre los dos grupos fue de 4,5 dfas.

T e m p e ra tu ra s rec ta les : el analisis de la temperatura rectal posterior a la exposicion utilizando la temperatura promedio antes de la exposicion como covariable revelo un grupo estadfsticamente significativo (p <0,05) y un grupo por efecto dfa. El analisis revelo que la temperatura del grupo de control fue significativamente mayor (p <0,05) desde el inicio en comparacion con el grupo vacunado en los dfas 3 a 9 y el dfa 11 despues de la exposicion.

A is la m ie n to de BHV-1: todos los terneros de control y vacunados secretaron BHV-1 durante la fase posterior a la exposicion de este estudio. La duracion media del aislamiento de BHV-1 del grupo vacunado fue de 6 dfas y 10,5 dfas para los controles. El cambio estimado en la duracion de la secrecion fue de 4,5 dfas. Todas las muestras que exhiben CPE espedfico de BHV se confirmaron mediante PCR. Sin embargo, hubo 8 muestras en las que no se observo el CPE, pero teman senales de PCR positivas debiles. Estas 8 muestras no fueron incluidas como positivas para este analisis.

S ig n o s c lrn ic o s de BHV-1: Se examino a cada animal para detectar signos clrnicos de enfermedad respiratoria durante dos dfas consecutivos antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante catorce dfas consecutivos despues de la exposicion. Se observaron y registraron los signos clrnicos que podnan atribuirse a la infeccion por BHV-1. No se observaron reacciones adversas posteriores a la vacunacion en ninguno de los terneros.

Conclusiones

El informe anterior demuestra la eficacia de la fraccion del BHV-1 de rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenza3, vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado como ayuda en la reduccion de la enfermedad debida al BHV-1 en terneros para carne/leche. La eficacia y la antigenicidad de la fraccion del BHV-1 de este producto combinado se demuestra a traves de lo siguiente:

1) Una disminucion en la gravedad y la duracion de las lesiones nasales en el grupo de vacunados en comparacion con el grupo de control.

2) Una disminucion de la pirexia en el grupo vacunado en comparacion con el grupo de control.

3) Sero conversion a BHV-1 del grupo vacunado en comparacion con el grupo de control.

E je m p lo 8 - p ro to c o lo de e fic a c ia de PI³

Este ejemplo demuestra que la fraccion de PI3 de la vacuna del MLV hexavalente ayuda en la prevencion de la enfermedad causada por PI3.

Materiales y procedimientos

La vacuna de virus vivo modificado hexavalente se prepara como se describio anteriormente. Se elabora un placebo sin PI3 junto con el serial de eficacia. El placebo sin PI3 contiene los mismos lotes de recoleccion de BHV-1, BVDV-1b, BVDV-2, BVDV-1a y BRSV que el serial de eficacia. El medio de cultivo se sustituye por el componente de PI3 para mantener un volumen equivalente entre el serial de eficacia y el placebo sin PI3. Se utiliza un diluyente esteril para rehidratar tanto la vacuna como el placebo sin PI3.

Se distribuyen aleatoriamente a los terneros para carne/leche comerciales de aproximadamente 3-4 meses de edad como se describio anteriormente, luego se desparasitan y se vacunan contra la pasteurelosis, la micoplasmosis y el carbunco sintomatico. A todos los terneros se les da acceso libre al agua, al heno costero de las Bermudas y a una racion de alimento mixto que contiene un coccidiostatico, pero no antibioticos. La disponibilidad de heno puede ser posteriormente restringida despues de que los terneros esten alimentados.

Aproximadamente veinte o mas terneros vacunados y diez o mas terneros de control se utilizan en este estudio de un solo nivel. Los dos grupos de terneros se mantienen en corrales separados pero equivalentes antes de la exposicion. Los terneros se mezclan en un corral, dos dfas antes de la exposicion (dfa -2).

Distribucion aleatoria

Se puede usar un esquema de distribucion aleatoria pareado de los terneros para asignar a los terneros en dos grupos de tratamiento (vacunado o control vacunado con placebo). Por ejemplo, una secuencia de tres terneros que ingresan al callejon puede ser distribuida aleatoriamente en los dos grupos de tratamiento en una proporcion de 2:1. Las etiquetas de oreja, extrafdas al azar de un cubo en el momento de la extraccion de sangre inicial para la evaluacion serologica, se utilizan para identificar a los terneros.

Prueba ciega

El personal no tema conocimiento de la identidad de los controles o de los vacunados. Todo el personal de campo y de laboratorio, con excepcion del encargado del registro, trabajo en forma ciega para el estudio.

Resultado

El resultado primario de este estudio es la prevencion de la secrecion nasal del virus PI3 despues de la exposicion. Esto se determina por la presencia o ausencia de PI3 en muestras nasales recolectadas diariamente de las narinas de todos los terneros durante el curso del estudio. Otros resultados secundarios anticipados incluyen la disminucion de los signos clmicos de la infeccion por PI3, la reduccion de la pirexia y la reduccion de la duracion del secrecion de los terneros que secretan PI3. Las unidades experimentales se excluyen del estudio si tienen un tttulo de PI3 de >2 al inicio del estudio.

Estructuras de muestreo, recopilacion de datos y observaciones clmicas

Se recogen muestras de sangre de terneros inmediatamente antes de la vacunacion (dfas -28 a -21) con serial de eficacia o placebo sin PI3. Las muestras de sangre tambien se recogen inmediatamente antes de la exposicion (Dfa 0) y nuevamente 14 dfas despues de la exposicion (Dfa 14). Las muestras de sangre para los recuentos diferenciales de WBC se recogen desde el dfa -2 hasta el Dfa 14. Todas las muestras se recogen en tubos Vacutainer® con EDTA, y los recuentos se realizan utilizando un contador diferencial de WBC Hemavet 950 de Drew Scientific. Se toman frotis nasales para el aislamiento del virus desde el dfa -2 hasta al menos el Dfa 14.

La secrecion de PI3 por los grupos vacunado y de control se determina diariamente durante 14 dfas despues de la exposicion. La deteccion de PI3 sirve como el criterio principal para determinar la resistencia (no afectada) o la susceptibilidad (afectada) a la exposicion. Los grupos afectados y no afectados se comparan para determinar si la vacunacion previno la secrecion de PI3 despues de la exposicion a PI3. Los signos clmicos de la enfermedad respiratoria sirven como un criterio secundario para determinar la susceptibilidad o la resistencia a la exposicion. La duracion de la secrecion (numero de dfas en que se detecto PI3 de un ternero individual) se analiza para determinar si la vacunacion tuvo un efecto atenuante en este parametro. Todas las temperaturas rectales diarias individuales se analizan utilizando la temperatura promedio previa a la exposicion (lmea de base) como covariable.

Deteccion de PI ³ : Los frotis nasales se toman de cada ternero el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion frotando ambos orificios nasales con un BBL Culture Swab® con medio lfquido de Stuart. El medio de las muestras se analiza para determinar la presencia de PI3 mediante PCR en tiempo real utilizando el grupo de sonda/cebador espedfico de PI3 descrito en el presente documento.

Duracion de la secrecion: La duracion de la secrecion se define como el numero de dfas que se detecto PI3 en los frotis nasales de un ternero individual. Los datos de duracion recopilados se analizan para determinar si la vacunacion tuvo un efecto mitigador sobre el tiempo en que se detecto PI3 en muestras nasales.

Temperatura rectal: Las temperaturas rectales diarias de cada animal se registran entre el Dfa -2 y el Dfa 14 (2 dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y 14 dfas despues de la exposicion). Se calcula una media antes de la exposicion para cada animal promediando los valores de temperatura de los Dfas -2 a Dfa 0. Las temperaturas diarias se analizan utilizando la lmea de base como covariable.

Tftulos de anticuerpos: Los tftulos de anticuerpos de neutralizacion del suero se determinan mediante el procedimiento del suero que disminuye constantemente el virus para cada animal el dfa de la vacunacion, el Dfa 0 y el Dfa 14 del estudio.

Signos clmicos: Los signos clmicos de PI3 han sido descritos por Brysonet et al. (1989). Los signos clmicos incluyen, entre otros, embotamiento, respiracion rapida, pirexia, tos, los sonidos adventicios y/o estridentes de los pulmones. Los signos clmicos se registran dos dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante los catorce dfas posteriores a la exposicion. La observacion de los signos clmicos de PI3 se tiene en cuenta durante el analisis de los datos, pero no se considera un resultado primario debido al hecho de que estos signos pueden ser indicativos de muchas enfermedades respiratorias que se encuentran comunmente en el ganado comercial.

Ejemplo 8a - Estudio de eficacia de PI ³

Los resultados de este estudio demuestran que la fraccion del virus de paraifluenza3 (PI3) bovina vivo modificado de la rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenza3, vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado, es antigenica y eficaz como ayuda en la prevencion de secreciones del virus de parainfluenza3 bovina en terneros para carne/leche. Se administraron dos dosis de vacuna a veinte terneros seronegativos para PI3. Se vacunaron diez terneros de control seronegativo con dos dosis de una vacuna placebo comparable con el producto. Todos los terneros fueron expuestos en forma intranasal con PI3. La vacunacion dio como resultado un aumento del tftulo de anticuerpos de PI3 e impidio la secrecion de PI3 despues de la exposicion. En consecuencia, se ha establecido un PI3-TCID50 mmimo de 6 X 104 por dosis para la fraccion de PI3 de esta vacuna.

Materiales y procedimientos

Vacunacion y exposicion de los terneros: Treinta (30) terneros negativos para PI3 se mezclaron en un callejon de clasificacion. Cada ternero se separo con una puerta, ya que se arrearon al azar, tres terneros a la vez, a traves del callejon en uno de los dos grupos (Grupo A, vacunados o Grupo B, controles vacunados con placebo) mediante el uso de un esquema de distribucion aleatoria de grupos pareados proporcionado por CVB-Biometrics.

Se vacunaron veinte terneros con una dosis de rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenza3, vacuna sincitial respiratoria, virus vivo modificado. A cada vacunado se le administro una dosis de 2 ml del producto mediante inyeccion subcutanea en el lado izquierdo del cuello en el dfa 0. Se vacunaron diez terneros con una vacuna placebo comparable con el producto (sin PI3). Se recogieron frotis nasales para el aislamiento del virus PI3 y se extrajo sangre de todos los terneros para la confirmacion serologica de la susceptibilidad a PI3. En el dfa 25, los terneros vacunados y de control recibieron una segunda dosis de 2 ml de serial de eficacia y el placebo comparable con el producto, por via subcutanea, en el lado derecho del cuello. Dos dfas antes de la exposicion, los grupos de vacunacion y control se mezclaron para la observacion clmica previa a la exposicion y para obtener lecturas de la temperatura corporal de referencia. Los terneros vacunados y de control fueron expuestos 15 dfas despues de la segunda vacunacion con 4 ml (2 ml por cada orificio nasal) del virus para exposicion PI3 proporcionado por el USDA-APHIS-CVB, cepa Reisinger, Numero de lote 05-07, Fecha de llenado: 26 de julio de 2005. El tftulo del virus para la exposicion se determino por CVB en 1082 TCID50/2 ml. El virus para la exposicion se titulo inmediatamente antes de la exposicion y se determino que era 1083 TCID50/4 ml y de nuevo inmediatamente despues de la exposicion y se determino que era 1082 TCID50/4 ml. El virus para la exposicion se mantuvo frio durante todo el proceso de exposicion.

Se recogieron muestras de sangre el dfa de la vacunacion, seis dfas despues de la vacunacion, el dfa de la exposicion, seis dfas despues de la exposicion y 14 dfas despues de la exposicion. Los tftulos de anticuerpos del virus de parainfluenza3 bovina se determinaron mediante el procedimiento de neutralizacion del suero que disminuye constantemente el virus.

Se recogieron frotis nasales el dfa de la vacunacion, el dfa de la exposicion y durante 10 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Las temperaturas rectales se registraron diariamente para cada ternero durante dos dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Se realizaron observaciones clm icas. Los observadores actuaron en form a ciega debido a que tanto los grupos vacunados como los grupos de contro l se m ezclaron con la unica caractenstica diferenciadora que es el num ero de etiqueta de oreja. En ningun m om ento a lo largo del estudio, los observadores tuvieron conocim iento del estado de vacunacion de un animal de prueba individual. El personal de laboratorio no tem a conocim iento del estado de vacunacion de los terneros.

Deteccion de PI ³ : Se recogieron frotis nasales de terneros frotando ambos orificios nasales con un BBL culture Swab® en medio ftquido de Stuart. La observacion visual del CPE esped fico de PI3 junto con tecn icas de PCR m ejoradas en cultivo celu lar se utilizaron para detectar PI3 en las m uestras recolectadas. Brevem ente, las muestras se procesaron por filtracion esteril (0,2 pm) en celulas TV L-B K en cultivo. Los cultivos se incubaron durante 4 dfas a 37°C ± 2°C y 5 ± 1% de CO2. Se observaron los cultivos para CPE esp ed fico de PI3 y se registraron los resultados. El sobrenadante de todas las muestras de cultivo (tanto CPE y -) se analizo individualm ente para determ inar la presencia/ausencia de PI3 utilizando la m etodologfa de RT qPCR convencional y el siguiente grupo de sondas/cebadores:

Cebador directo: G G AG ACC AAG ACCAAG G AG ATG (SEQ ID NO: 13)

Cebador inverso: C G TCTG C CCATG CATAAG G (SEQ ID NO: 14)

Sonda TaqM an MGB: AC C TC G G TC ATC C ATAG (SEQ ID NO: 15)

Este procedim iento se desarro llo basandose en el traba jo de A. Hu et al., (Developm ent o f a real-tim e RT-PCR assay fo r detection and quantita tion o f parainfluenza virus 3. A. Hu, M. Colella, P. Zhao, F. Li, JS Tam, R. Rappaport, s M Cheng. Journal o f V iro logical Methods, 130 (2005) 145-148). La especificidad del grupo sonda/cebador se confirm o internam ente y no reacciono de form a cruzada con BHV, BRSV, BVDV1a, BVDV1b o BVDV2. Los ensayos de RT qPCR se realizaron utilizando ensayos basados en Taqm an® en un Applied B iosystem s 7500.

Todas las m uestras que eran positivas para CP3 esped ficas para PI3 tam bien eran positivas para PCR. Hubo 17 m uestras que fueron negativas para el CPE esped fico de PI3 y positivas para PI3 m ediante el ensayo de PCR.

Esto es consistente con los estudios internos que indican que los ensayos basados en PCR son mas sensib les que los ensayos basados en la observacion de un CPE esped fico de PI3. Las m uestras que resultaron negativas para PI3 despues del cultivo inicial se subcultivaron y se observaron para CPE. El sobrenadante de fluidos subcultivados se analizo para determ inar la presencia/ausencia de PI3 de acuerdo con el m ismo procedim iento.

Analisis estadistico: la eficacia de la fraccion de PI3 de esta vacuna se baso principalm ente en la proporcion de vacunados que secretaron PI3 en com paracion con la proporcion de contro les que secretaron PI3 despues de la exposicion. La fraccion prevenible se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993). Las com paraciones de grupo de los datos de tftu los escalados de m anera ord inaria se com pararon m ediante la prueba U de Mann-W hitney. Las tem peraturas rectales se analizaron utilizando el prom edio de tem peratura antes de la exposicion como covariable. El analisis de la tem peratura posterior a la exposicion para el dfa 1-14 se realizo con un analisis de varianza de m edidas repetidas (ANOVA). Todos los analisis estadfsticos se realizaron utilizando SAS para W indows.

Resultados

Tftulos de anticuerpos de neutralizacion de suero: Todos los terneros en este estudio tuvieron un tftu lo de anticuerpos de neutralizacion de suero PI3 antes de la vacunacion de <1:2. N inguno de los terneros vacunados dem ostro una respuesta inmune anam nesica a la vacuna. El dfa de la exposicion, el grupo vacunado tem a un tftulo de PI3 prom edio de 1:16, que fue significativam ente m ayor que (p < 0,05) el del grupo control en 1:3. Un ternero en el grupo de control, ternero 7, desarro llo un tftu lo de 1:16 durante el curso del estudio. Este ternero tam bien dem ostro una respuesta anam nesica a la exposicion y tuvo un tftu lo de 1:128 seis dfas despues de la exposicion. Los otros nueve terneros de control fueron seronegativos el dfa de la exposicion y no dem ostraron una respuesta anam nesica a la exposicion.

Aislamiento de PI ³ : Los diez terneros de control en este estudio secretaron PI3 durante la fase posterior a la exposicion de este estudio. Solo 4 de los 20 vacunados secretaron PI3 durante este tiem po. Esto resulta en una fraccion prevenible de 0,80. Todas las m uestras que exhiben CPE esped fico de PI3 se confirm aron m ediante PCR. Sin embargo, hubo 17 m uestras en las que no se observo el CPE, pero tem an senales de PCR positivas debiles. Estas 17 m uestras se han incluido com o positivo para PI3 para este analisis.

Temperaturas rectales: el analisis de la tem peratura rectal posterior a la exposicion utilizando la tem peratura prom edio antes de la exposicion como covariable no revelo d iferencias estadfsticam ente significativas entre los grupos. No se realizo ningun analisis adicional de estos datos.

Signos clmicos de PI ³ : se exam ino a cada anim al para detectar s ignos clm icos de enferm edad respiratoria durante dos dfas consecutivos antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante catorce dfas consecutivos despues de la exposicion. No se observaron signos clm icos que pudieran atribuirse definitivam ente a la infeccion por PI3. No se observaron reacciones adversas posteriores a la vacunacion en ninguno de los terneros.

Conclusiones

El informe anterior demuestra la eficacia de la fraccion de PI3, de rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenza3, vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado como ayuda en la prevencion de la secrecion de PI3 en terneros para carne/leche

La eficacia y la antigenicidad de la fraccion de PI3 de este producto combinado se comprueba por lo siguiente:

1) Los estudios de aislamiento de virus (PI3) revelaron que la administracion de dos dosis de vacuna proporciono una proteccion del 80% (16/20) en terneros vacunados en comparacion con una susceptibilidad del 100% (10/10) en los controles (fraccion prevenible = 0,80).

2) Un aumento significativo en los tttulos de anticuerpos para PI3 del grupo vacunado en comparacion con el grupo de control.

Ejemplo 9: Protocolo de eficacia de BVDV-2

Este ejemplo demuestra que la fraccion de BVDV tipo 2 de la vacuna de MLV hexavalente ayuda en la prevencion de la enfermedad causada por BVDV-2.

Materiales y procedimientos

La vacuna de virus vivo modificada hexavalente se prepara como se describio anteriormente. Se elabora un placebo sin BVDV-2 junto con el serial de eficacia. El placebo sin BVDV-2 contiene los mismos lotes de recoleccion de BHV-1, BVDV-1b, BVDV-1a, PI3 y BRSV que el serial de eficacia. El medio de cultivo se sustituye por el componente de BVDV-2 para mantener un volumen equivalente entre el serial de eficacia y el placebo sin BVDV-2. El diluyente esteril se usa para rehidratar tanto la vacuna como el placebo sin BVDV-2.

Se distribuyen al azar los terneros para carne/leche comerciales de aproximadamente 3-4 meses de edad como se divulgo anteriormente, luego se desparasitan y se vacunan contra la pasteurelosis, la micoplasmosis y carbunco sintomatico. A todos los terneros se les da libre acceso al agua, al heno costero de las Bermudas y a una racion de alimento mixto que contiene un coccidiostatico, pero no antibioticos. La disponibilidad de heno puede ser posteriormente restringida despues de que los terneros esten alimentados.

Aproximadamente veinte o mas terneros vacunados y diez o mas terneros de control se utilizan en este estudio de un solo nivel. Los dos grupos de terneros se mantienen en corrales separados pero equivalentes antes de la exposicion. Los terneros se mezclan en un corral, dos dfas antes de la exposicion (dfa -2).

Distribucion aleatoria, prueba ciega y resultados

La distribucion aleatoria, prueba ciega y resultados, son como se divulga en el Ejemplo 10.

Estructuras de muestreo, recopilacion de datos y observaciones clinicas

Se recogen muestras de sangre de terneros inmediatamente antes de la vacunacion (dfas -28 a -21) con serial de eficacia o con placebo sin BVDV-2. Las muestras de sangre tambien se recogen inmediatamente antes de la exposicion (Dfa 0) y nuevamente 14 dfas despues de la exposicion (Dfa 14).

Las muestras de sangre para los recuentos diferenciales de WBC se recogen desde el dfa -2 hasta al menos el dfa 14. Todas las muestras se recogen en tubos Vacutainer® con EDTA, y los recuentos se realizan utilizando un contador diferencial de WBC Hemavet 950 de Drew Scientific. Se toman frotis nasales para el aislamiento del virus desde el dfa -2 hasta al menos el Dfa 14.

Las variables de resultado incluyen leucopenia, pirexia, secrecion nasal del virus, viremia, produccion de anticuerpos neutralizantes y signos clmicos. El resultado primario es la prevencion de leucopenia inducida por BVDV-2 en el grupo vacunado en comparacion con el grupo de control despues de la exposicion a BVDV-2.

Leucopenia: los datos de recuento de WBC se analizan para determinar si hay una reduccion en el recuento posterior a la exposicion. Se calcula una media antes de la exposicion para cada animal promediando los recuentos de WBC de los Dfas -2 a 0. Se calcula la proporcion de recuentos diarios de WBC con respecto a la media antes de la exposicion (recuento de WBC como una proporcion de la exposicion previa) para cada dfa 1-14 posterior a la exposicion o mas a discrecion de los observadores. Si la proporcion disminuye en un 25%, el individuo se clasifica como leucopenico.

Secrecion: se toman frotis nasales de cada ternero el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion frotando ambos orificios nasales con un BBL Culture Swab® con medio lfquido de Stuart. El dfa de la recoleccion, las muestras se procesan por filtracion esteril a traves de un filtro de 0,2 pm. Cada pozo de una placa de 12 pozos que contiene TVL-MDBK (aproximadamente con 80% de confluencia) se inocula luego con una muestra. Un pozo por placa permanece sin inocular y sirve como control negativo. Un pozo de la placa se inocula con una dilucion del virus para exposicion y sirve como control positivo. Las placas se incuban a 3-7% de CO2 a una temperature de 35-39°C durante 2 a 4 dfas. Los medios de cada pozo se recolectan y almacenan de -18 a -22°C. Los medios de los pozos que exhiben la morfologfa citopatica tfpica de BVDV-1a se procesan para determinar la identidad del agente infeccioso. Los individuos que tienen un cultivo positivo se clasifican como "secretores".

Viremia: se utilizan capas leucocitarias de muestras de sangre para inocular cada pozo de una placa de 12 pozos que contiene TVL-MDBk (~ 80% de confluencia). Un pozo por placa permanece sin inocular y sirve como control negativo. Un pozo de la placa se inocula con una dilucion del virus para exposicion y sirve como control positivo. Las placas se incuban a 3-7% de CO2 a una temperatura de 35-39°C durante 2 a 4 dfas. Los medios de cada pozo se recolectan y almacenan de -18 a -22°C. Los medios de los pozos que exhiben la morfologfa citopatica tfpica de BVDV-2 se procesan para determinar la identidad del agente infeccioso. Los individuos que tienen un cultivo positivo para BVDV-2 se consideran "viremicos".

Tftulos de anticuerpos: los tftulos de anticuerpos de neutralizacion de suero contra BVDV-2 se determinan mediante el procedimiento de suero que disminuye constantemente el virus para cada animal el dfa de la vacunacion inicial (dfa -21), el dfa de la exposicion (Dfa 0) y al final del estudio. Los tftulos de anticuerpos se determinan de acuerdo con el esquema especial A-17, valoracion del anticuerpo neutralizador del virus de la diarrea vftica bovina tipo 2. Los animales que desarrollan un tftulo de anticuerpos >8 se consideran sero-convertidos a BVDV-2.

Signos clmicos: los signos clmicos de BVDV-2 pueden incluir, entre otros, pirexia, leucopenia, disnea, secrecion nasal y deposiciones sueltas. Todos los signos clmicos relevantes de la infeccion por BVD^v se registran dos dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante los 14 dfas posteriores a la exposicion. La observacion de los signos clmicos de BVDV-2 se tiene en cuenta durante el analisis de los datos, pero no se considera como un resultado primario porque estos signos pueden ser indicativos de otras enfermedades que comunmente se encuentran en esta clase de ganado.

Ejemplo 9A: Estudio de eficacia BVDV-2

Los resultados de este estudio demuestran que la fraccion del virus de la diarrea viral bovina viva tipo 2 (BVDV2) de la rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenza3, vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado, es antigenica y eficaz como ayuda en la prevencion de las enfermedades causadas por BVDV2. Se administro una dosis a veinte terneros seronegativos con BVDV. Se vacunaron diez terneros de control seronegativos con una dosis de una vacuna placebo comparable con el producto. Todos los terneros fueron expuestos intranasalmente con BVDV2 (cepa 1373). La vacunacion dio como resultado un aumento en el tftulo de anticuerpos contra BVDV2 (de un promedio de <2 a 24), una reduccion en la tasa de muerte despues de la exposicion (7/10 controles muertos, 0/20 vacunados muertos). En consecuencia, se ha establecido una dosis minima de BVDV2-TCID50 de 3 X 103 TCID50 por dosis para la fraccion de BVDV2 de esta vacuna.

Ejemplo 10: Protocolo de eficacia BVDV-1A

Este ejemplo demuestra que la fraccion de BVDV Tipo 1a de la vacuna de MLV hexavalente ayuda en la prevencion de la enfermedad causada por BVDV-1a.

Materiales y procedimientos

La vacuna con virus vivo modificado con hexavalente se prepara como se describio anteriormente.

Se elaboro un placebo sin BVDV-1a junto con el serial de eficacia. El placebo sin BVDV-1a contiene los mismos lotes de recoleccion de BHV-1, BVDV-1b, BVDV-2, PI3 y BRSV que el serial de eficacia. El medio de cultivo se sustituye por el componente BVDV-1a para mantener un volumen equivalente entre el serial de eficacia y el placebo sin BVDV-1a. El diluyente esteril se usa para rehidratar tanto la vacuna como el placebo sin BVDV-1a.

Se distribuyen aleatoriamente los terneros para carne/leche comerciales que tienen aproximadamente 3-4 meses de edad como se describio anteriormente, luego se desparasitan y se vacunan contra la pasteurelosis, la micoplasmosis y carbunco sintomatico. A todos los terneros se les da libre acceso al agua, al heno costero de las Bermudas y a una racion de alimento mixto que contiene coccidiostatico, pero no antibioticos. La disponibilidad de heno puede ser posteriormente restringida despues de que los terneros esten alimentados

En este estudio de un solo nivel se usan aproximadamente veinte o mas vacunas y diez o mas terneros de control. Los dos grupos de terneros se mantienen en corrales separados pero equivalentes antes de la exposicion. Los terneros se mezclan en un corral, dos dfas antes de la exposicion (dfa -2).

Distribucion aleatoria

Se puede usar un esquema de distribucion aleatoria pareado de los terneros para asignar a los terneros en dos grupos de tratamiento (vacunados o de control vacunados con placebo). Por ejemplo, una secuencia de tres terneros que ingresan al callejon puede ser distribuida aleatoriamente en los dos grupos de tratamiento en una proporcion de 2:1. Las etiquetas de oreja, extrafdas al azar de un cubo en el momento de la extraccion de sangre inicial para la evaluacion serologica, se utilizan para identificar a los terneros.

Prueba ciega

El personal no tema conocimiento de la identidad de los controles o de los vacunados; todo el personal de campo y de laboratorio (con excepcion del encargado del registro), trabajo en forma ciega para el estudio.

Resultado

El resultado primario es la leucopenia despues de la exposicion. La leucopenia se define como una disminucion del 25% con respecto a los recuentos basicos de WBC. Otros resultados que respaldanan aun mas la eficacia de la vacuna incluyen la secrecion nasal, viremia, pirexia, produccion de anticuerpos y signos clmicos de BVDV.

Las unidades experimentales se excluyen del estudio si tienen un tttulo de BVDV-1 de >2 al inicio del estudio.

Estructuras de muestreo, recopilacion de datos y observaciones clinicas

Las muestras de sangre se recogen de terneros inmediatamente antes de la vacunacion (dfas -28 a -21) con serial de eficacia o placebo sin BVDV. Las muestras de sangre tambien se recogen inmediatamente antes de la exposicion (Dfa 0) y nuevamente 14 dfas despues de la exposicion (Dfa 14). Las muestras de sangre para los recuentos diferenciales de WBC se recogen desde el dfa -2 hasta al menos el Dfa 14. Todas las muestras se recogen en tubos Vacutainer® con EDTA, y los recuentos se realizan utilizando un contador diferencial de WBC Hemavet 950 de Drew Scientific. Se toman frotis nasales para el aislamiento del virus desde el dfa -2 hasta al menos el Dfa 14.

Las variables de resultado incluyen leucopenia, pirexia, secrecion nasal del virus, viremia, produccion de anticuerpos neutralizantes y signos clmicos. El resultado primario es la prevencion de la leucopenia inducida por BVDV en el grupo vacunado en comparacion con el grupo de control despues de la exposicion a BVDV-1a.

Leucopenia, secrecion y viremia: los datos del recuento de WBC se analizan como se describe en el Ejemplo 9; los frotis nasales se toman de cada ternero el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion frotando ambos orificios nasales con un BBL Culture Swab® con medio lfquido de Stuart para determinar la secrecion, tambien como se describe en el Ejemplo 9. Las capas leucocitarias de muestras de sangre se utilizan para inocular cada pozo de una placa de 12 pozos que contiene TVL-MDBK (aproximadamente 80% de confluencia) y se analizan como se describe en el Ejemplo 9.

Tftulos de anticuerpos: los tftulos de anticuerpos de neutralizacion de suero contra BVDV-1a se determinan mediante el procedimiento de "suero que disminuye constantemente el virus" para cada animal el dfa de vacunacion inicial (dfa -21), el dfa de la exposicion (Dfa 0) y a al final del estudio. Los tftulos de anticuerpos se determinan de acuerdo con el esquema especial A-17, valoracion del anticuerpo neutralizador del virus de la diarrea viral bovina tipo 1a. Los animales que desarrollan un tftulo de anticuerpos >8 se consideran sero-convertidos a BVDV-1a.

Signos clmicos: los signos clmicos de BVDV-1a pueden incluir, entre otros, pirexia, leucopenia, disnea, secrecion nasal y deposiciones sueltas. Todos los signos clmicos relevantes de la infeccion por BVDV se registran dos dfas antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante los 14 dfas posteriores a la exposicion. La observacion de los signos clmicos de BVDV-1 se toma en consideracion durante el analisis de los datos, pero no se considera como un resultado primario porque estos signos pueden ser indicativos de otras enfermedades comunes que se encuentran en esta clase de ganado.

Ejemplo 10A: Estudio de la eficacia de BVDV-1a

Los resultados de este estudio demuestran que la fraccion del virus de la diarrea viral bovina viva tipo 1a (BVDV1a) de la rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenzas, vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado, es antigenica y eficaz como una ayuda en la prevencion de la infeccion causada por BVDV1a. Se administro una dosis de vacuna a veinte terneros seronegativos para BVDV. Se vacunaron diez terneros de control seronegativos con una dosis de una vacuna placebo comparable con el producto. Todos los terneros fueron expuestos intranasalmente con BVDV1a. La vacunacion dio como resultado un aumento del tftulo de anticuerpos contra BVDV1a y previno o redujo la viremia inducida por BVDV1a, secrecion nasal, pirexia, linfopenia y leucopenia. En consecuencia, se ha establecido una dosis minima de BVDV1a-TCID50 de 5 X 103 TCID50 por dosis para la fraccion del BVDV1a de esta vacuna.

Materiales y procedimientos

Vacunacion, exposicion y recoleccion de muestras: Se mezclaron treinta terneros negativos para BVDV en un callejon de clasificacion. Cada ternero se separo con una puerta, ya que se arrearon al azar, tres terneros a la vez, a traves del callejon en uno de los dos grupos (Grupo A, vacunados o Grupo B, controles vacunados con placebo) mediante el uso de un esquema de distribucion aleatoria de grupos pareados proporcionado por CVB Biometrics Se vacunaron 20 terneros con una dosis de rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenzas, vacuna sincitial respiratoria, virus vivo modificado. A cada vacunado se le administro una dosis de 2 ml del producto mediante inyeccion subcutanea en el lado izquierdo del cuello en el Dfa 0. Se vacunaron diez terneros con una vacuna placebo comparable con el producto (sin BVDV). Dos dfas antes de la exposicion, tanto los grupos vacunados como los grupos de control se mezclaron con el proposito de realizar una observacion clmica previa a la exposicion y adquirir la temperatura corporal basal y las lecturas de WBC. Los terneros vacunados y de control se expusieron 21 dfas despues de la vacunacion con un aislado virulento de BVDVIa obtenido de los pulmones de un ternero muerto en el corral Ruff Farms en Hanston, Kansas. El virus se habfa pasado in vitro a celulas TVL-BK utilizando el medio Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de suero equino. El virus para la exposicion se titulo inmediatamente antes de la exposicion y se determino que era 1078 TCID50/4 ml e inmediatamente despues de la exposicion y se determino que era de 1073 TCID50/4 ml. Se administraron dos ml de virus para la exposicion en cada fosa nasal durante la inspiracion.

El virus para exposicion se mantuvo refrigerado durante todo el proceso de exposicion.

Se recogieron muestras de sangre para determinar los tttulos de anticuerpos antes de la vacunacion, el dfa de la exposicion (21 dfas despues de la vacunacion) y 14 dfas despues de la exposicion. Los tttulos de anticuerpos contra el virus de la diarrea viral bovina se determinaron mediante el procedimiento de neutralizacion del suero que disminuye constantemente el virus.

Los frotis nasales para el aislamiento del virus se recogieron de terneros frotando ambas orificios nasales con un BBL Culture Swab® en medio lfquido de Stuart el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Las muestras de sangre para el aislamiento del virus de la capa leucocitaria se recogieron de cada ternero mediante puncion venosa en un tubo Vacutainer con EDTA el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Las temperaturas rectales se registraron diariamente para cada ternero durante dos dfas consecutivos antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y durante 14 dfas consecutivos despues de la exposicion.

Se realizaron y registraron observaciones clmicas para cada ternero. Los observadores actuaron en forma ciega debido a que tanto los grupos vacunados como los grupos de control se mezclaron con la unica caractenstica diferenciadora que es el numero de etiqueta de la oreja. En ningun momento a lo largo del estudio, los observadores tuvieron conocimiento del estado de vacunacion de un animal de prueba individual. El personal de laboratorio no tema conocimiento del estado de vacunacion de los terneros.

Las muestras de sangre para determinar los recuentos diferenciales de WBC se recolectaron durante dos dfas consecutivos antes de la exposicion, el dfa de la exposicion y 14 dfas consecutivos despues de la exposicion. Las muestras se recolectaron en tubos Vacutainer® con EDTA y los recuentos se realizaron utilizando un contador diferencial de WBC Hemavet 950 de Drew Scientific.

Deteccion de BVDV: se utilizaron la observacion de CPE y tecnicas de PCR mejoradas en cultivo celular para detectar BVDV1a en muestras recolectadas. Brevemente, las muestras nasales se procesaron mediante filtracion esteril (0,2 pm) en celulas TVL-BK en cultivo. Las capas leucocitarias se colocaron directamente en celulas TVL-BK en cultivo durante 45-75 minutos antes de ser lavadas de las celulas. Los cultivos se incubaron durante 4 dfas a 37°C ± 2°C y 5 ± 1% de CO2. Cada cultivo se observo para detectar la presencia/ausencia de CPE espedfico de BVDV y el sobrenadante de cada cultivo se analizo individualmente para determinar la presencia/ausencia de BVDV1a utilizando la metodologfa de RT qPCR convencional y el siguiente grupo de sonda/cebador:

Cebador directo: GGTCGCCCAGGTAAAAGCA (SEQ ID NO: 7)

Cebador inverso: GCCTCTGCAGCACCCTATCA (SEQ ID NO: 8)

Sonda TaqMan MGB: AACCGACTGTTACGAATAC (SEQ ID NO: 9).

Este procedimiento fue desarrollado con base en (Differentiation of types 1a, 1b and 2 bovine viral diarrhea virus (BVDV) by PCR, Julia F. Ridpath y Steven R. Bolin, Molecular and Cellular probes, Journal of Virological Methods, 130 (2005) 145-148). Este procedimiento tambien se basa en el Protocolo de Prueba del Centro para Compuestos Biologicos Veterinarios y los Laboratorios Nacionales de Servicios Veterinarios - Genotipado del Virus de la Diarrea Viral Bovina, Numero BPPR02010.01. Ambos procedimientos de diferenciacion de genotipos y subgenotipos de BVDV explotan las diferencias geneticas que existen en la region 5' no traducida (UTR) del genoma. Este grupo de sonda/cebador se diseno espedficamente para amplificar una seccion de la UTR 5' en la que la sonda altamente espedfica puede detectar una unica secuencia de BVDV1b. La especificidad del grupo de sonda/cebador se confirmo internamente y no reacciono de forma cruzada con BHV, PI3, BRSV, BVDVIa o BVDV2. Los ensayos de RT qPCR se realizaron utilizando ensayos basados en Taqman® en un Applied Biosystems 7500.

Analisis estadistico: tftulos de anticuerpos: las comparaciones de grupo de los tftulos escalados de forma ordinaria se analizaron con la prueba U de Mann-Whitney.

Secrecion nasal: los datos de aislamiento del virus del analisis de frotis nasal se basan en la proporcion de vacunados de los cuales se aislo BVDVIa en comparacion con la proporcion de controles en los que se aislo BVDVIa despues de la exposicion. Las fracciones prevenibles se calcularon con base en la observacion del CPE y la deteccion por PCR de forma independiente. La fraccion prevenible para la secrecion de BVDVIa se calculo de acuerdo a lo descrito por Tanner y Morgan (1993).

Viremia: los datos de aislamiento del virus de las capas leucocitarias de las muestras de sangre se analizaron en funcion de la proporcion de vacunados de los cuales se aislo BVDVIa en comparacion con la proporcion de controles en los que se aislo BVDVIa despues de la exposicion. Las fracciones prevenibles se calcularon con base en la observacion del CPE y la deteccion por PCR de forma independiente. La fraccion prevenible para la viremia por BVDVIa se calculo de acuerdo a lo descrito por Tanner y Morgan (1993).

Temperatura rectal: Se determino una temperatura rectal promedio antes de la exposicion para cada animal. Este promedio se uso como covariable en un analisis de varianza de mediciones repetidas (ANOVA) que incluyo terminos para las interacciones de Grupo, Dfa y Grupo*Dfa.

Signos clmicos de la enfermedad: los signos clmicos de la enfermedad se registraron diariamente por cada observador de forma independiente.

Linfopenia: se calculo una media de linfocitos previos a la exposicion para cada animal promediando los recuentos de linfocitos de los Dfas -2 a 0. Se calculo la proporcion de recuentos de linfocitos diarios en relacion con la media previa a la exposicion (recuento de linfocitos como una proporcion previa a la exposicion) para cada dfa 1-14 posterior a la exposicion. Esta proporcion de datos se analizo para determinar si los animales individuales desarrollaron una linfopenia como se define por una disminucion del 25% en los recuentos desde el inicio. La fraccion prevenible se calculo de acuerdo a lo descrito por Tanner y Morgan (1993) para determinar si la vacunacion previno el desarrollo de linfopenia en este estudio

Leucopenia: se calculo una media de leucocitos antes de la exposicion para cada animal promediando los recuentos de leucocitos de los Dfas -2 a 0. Se calculo la relacion de recuentos diarios de leucocitos en relacion con respecto a la media previa a la exposicion (recuento de leucocitos como una proporcion previa a la exposicion) para cada dfa 1-14 posterior a la exposicion. Esta proporcion de datos se analizo para determinar si los animales individuales desarrollaron una leucopenia como se define por una disminucion del 25% en los recuentos desde el inicio. La fraccion prevenible se calculo segun lo descrito por Tanner y Morgan (1993) para determinar si la vacunacion previno el desarrollo de leucopenia en este estudio.

Todos los analisis estadfsticos se realizaron utilizando SPSS version 16 para Windows.

Resultados

Tftulos de anticuerpos de neutralizacion de suero: Todos los terneros en este estudio teman un tftulo de anticuerpos de neutralizacion de suero de BVDV (BVDV1a, BVDV1b y BVDV2) antes de la vacunacion de <1:2. El dfa de la exposicion (dfa 21), el grupo vacunado tema un tftulo de BVDV1a promedio de 1:21 que fue significativamente mayor (p < 0,05) que el del grupo de control <1:2. Los tftulos de anticuerpos contra BVDV1a aumentaron 14 dfas despues de la exposicion tanto en los terneros de control como en los vacunados, lo que indica que los terneros hadan sido expuestos con BVDV1a.

Aislamiento de BVDVIa a partir de frotis nasales: con base en la observacion del CPE espedfico del BVDV, los diez terneros de control en este estudio secretaron BVDV1a durante la fase posterior a la exposicion de este estudio. Solo 3 de los 20 vacunados secretaron BVDV 1a durante el penodo posterior a la exposicion. Se calculo una fraccion prevenible utilizando una proporcion de 0/10 controles naturalmente protegidos y 17/20 vacunados protegidos. Esto da lugar a una fraccion prevenible de 0,85.

En funcion de la deteccion por PCR mejorada del cultivo celular de BVDV1a, los diez terneros de control en este estudio secretaron BVDV1b durante la fase posterior a la exposicion de este estudio. Solo 5 de los 20 vacunados secretaron BVDV1a durante el penodo posterior a la exposicion. Se calculo una fraccion prevenible utilizando una proporcion de 0/10 controles protegidos naturalmente y 15/20 vacunados protegidos. Esto resulta en una fraccion prevenible de 0,75.

Aislamiento de BVDVIa de capas leucocitarias: basado en la observacion del CPE espedfico de BVDV, seis de los diez terneros de control en este estudio fueron viremicos durante la fase posterior a la exposicion de este estudio. Ninguno de los 20 vacunados fue viremico durante el penodo posterior a la exposicion. Se calculo una fraccion prevenible utilizando una proporcion de 4/10 controles protegidos naturalmente y 20/20 vacunados protegidos. Esto resulta en una fraccion prevenible de 1,0.

Sobre la base de la deteccion por PCR mejorada del cultivo celular de BVDVIa, siete de los diez controles en este estudio fueron viremicos durante la fase posterior a la exposicion de este estudio. Dos de los 20 vacunados fueron viremicos durante el penodo posterior a la exposicion. Se calculo una fraccion prevenible utilizando una proporcion de 3/10 controles protegidos naturalmente y 18/20 vacunados protegidos. Esto resulta en una fraccion prevenible de 0,86.

Temperaturas rectales: el analisis de temperatura rectal posterior a la prueba utilizando la temperatura promedio antes de la prueba como covariable revelo un grupo estadfsticamente significativo (p <0,05) y efectos de grupo por dfa. El analisis revelo que la temperatura del grupo de control fue significativamente mayor que la del grupo vacunado en los dfas 6, 8 y 14 y alcanzo significancia en los dfas 5 y 11.

Signos clmicos de BVDVIa: un ternero en el grupo de control demostro signos clmicos que podnan contribuir a la infeccion por BVDV1a. El signo clmico observado en el ternero 21 fue una cantidad abundante de secrecion nasal mucopurulenta. Ninguno de los terneros en el grupo de vacunados demostro signos clmicos de infeccion por BVDV1a durante la fase posterior a la exposicion del estudio. No se observaron reacciones adversas posteriores a la vacunacion en ninguno de los terneros.

Linfopenia: se detecto linfopenia en dos de los 20 vacunados y en cinco de los diez controles, lo que resulto en una fraccion prevenible del 80%. Los promedios diarios de los datos de proporcion revelan una respuesta tfpica de los terneros de control a la exposicion por BVDV (linfopenia seguida de un pico de rebote). Los terneros vacunados no respondieron de la misma manera.

Leucopenia: se detecto leucopenia en cinco de los 20 vacunados y cuatro de los diez controles, lo que dio como resultado una fraccion prevenible del 37%. Los promedios diarios de los datos de proporcion se representan graficamente en la Figura 3.

Conclusiones

El informe anterior demuestra la antigenicidad y la eficacia de la fraccion del BVDV1a de rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenzas, vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado como ayuda en la prevencion de la infeccion causada por BVDV1a.

La antigenicidad y la eficacia de la fraccion del BVDV1a de este producto combinado se atestiguan por lo siguiente:

1) Un aumento significativo en los tftulos de anticuerpos para BVDV1a en el grupo de vacunados en comparacion con el grupo de control. Diecinueve de los 20 terneros en el grupo de vacunados desarrollaron tftulos de BVDV1a > 1:8 despues de la administracion de una dosis de 2 ml de vacuna, cumpliendo con los requisitos definidos en 9CFR 113.311 (c) (5).

2) Los estudios de aislamiento de virus revelaron que la administracion de una dosis disminuyo la secrecion nasal inducida por BVDV1a y la viremia en los terneros despues de la exposicion.

3) Los terneros vacunados exhibieron significativamente menos fiebre en comparacion con los terneros de control.

4) La vacunacion tambien disminuyo la linfopenia inducida por BVDV1a y la leucopenia en los terneros despues de la exposicion.

Los hallazgos del estudio son estadfsticamente significativos y clmicamente relevantes, por lo tanto, demuestran la eficacia de la fraccion del BVDV1a contenida en rinotraqueitis bovina, diarrea viral, parainfluenza3, vacuna contra el virus sincitial respiratorio, virus vivo modificado.

Ejemplo 11: Protocolo de ensayo de potencia para vacunas por fiebre del embarque

En la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos, pendiente de tramitacion junto con la presente, numero 61/427.404, titulada "Compositions and Methods for Identifying and Differentiating Viral Components of Multivalent Shipping Fever Vaccines" (presentadas al mismo tiempo el 27 de diciembre de 2010, e incorporadas espedficamente en el presente documento en su totalidad por referencia expresa a la misma), los presentes inventores informaron sobre el desarrollo de un protocolo de ensayo genetico modificado util para obtener la cuantificacion viral directa (es decir, la "potencia") de cada componente viral individual en una vacuna multivalente. La invencion reemplaza los ensayos de FA/IFA convencionales (como los descritos en el ensayo SAM 101 actual) con un ensayo RT-qPCR para determinar la presencia o ausencia de especies, tipos o subtipos de virus particulares en los pozos de ensayo individuales (es decir, diluciones).

Las pruebas de potencia para los componentes individuals de una vacuna multivalente, como la vacuna de MLV hexavalente descrita en el presente documento tambien se pueden hacer mas objetiva sustituyendo el analisis RT-qPCR/qPCR de los pozos individuales para la observacion visual de CPE. Por ejemplo, la observacion de CPE en los ensayos de titulacion viral puede ser bastante subjetiva y, a menudo, se considera que es la fuente de diferencias en los tttulos de vacunas de MLV entre las instalaciones de prueba. Sin embargo, al aumentar la objetividad del ensayo, la reproducibilidad entre laboratorios tambien debena aumentar.

La prueba de potencia para PI3 se puede realizar utilizando un procedimiento de ensayo suplementario modificado para la valoracion de vacunas contra el virus de la parainfluenza 3 (MVSAM102.01). La prueba de potencia para el BRSV se puede realizar utilizando un procedimiento de ensayo suplementario modificado para la valoracion del virus sincitial respiratorio bovino en vacunas (MVSAM0129.01). Estos ensayos se modifican sustituyendo el analisis de qPCR en tiempo real de los pozos individuales para la observacion visual del CPE. La valoracion de la fraccion de BHV se realiza utilizando un procedimiento de ensayo suplementario modificado para la valoracion del virus infeccioso de la rinotraqueitis bovina en vacunas (MVSAM0105.01). En este ensayo, se puede utilizar un formato de 96 pozos en lugar del formato estandar de 6 pozos, para estandarizar los ensayos para el analisis de vacunas multivalentes. Es importante destacar que este protocolo incluye la sustitucion del analisis de qPCR de los pozos individuales para la observacion visual y el recuento de las placas de BHV para proporcionar un ensayo mas preciso y robusto.

El presente ejemplo demuestra el uso de las tecnicas cuantitativas (en tiempo real) de la reaccion en cadena de la polimerasa (qPCR) expuestas en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos pendiente junto con la presente de los inventores No. 61/427.404, para determinar con exito la potencia de cada uno de los seis componentes virales individuales de la vacuna de MLV hexavalente descrita en el presente documento. Los inventores muestran que el ensayo es particularmente ventajoso sobre las metodologfas existentes para determinar las potencias individuales de cepas relacionadas geneticamente en un ejemplo multivalente. Utilizando la vacuna contra BRDC de MLV hexavalente como modelo, se demuestra que el ensayo cuantifica eficazmente las potencias individuales de los tres subgenotipos geneticos de BVDV-1a, BVDV-1b y BVDV-2 contenidos en ellos.

Materiales y procedimientos

Cultivo de celular

Todos los cultivos se preparan utilizando tecnicas y suministros convencionales, como lo describe Freshney (1987). La lmea celular de rinon bovino TVL, que exhibe un epitelio tfpico como la morfologfa en cultivo, se usa para todos los ensayos de cultivo.

Especificidad de los grupos de cebador/sonda

El ARN se extrae de los fluidos virales de cada una de las siguientes semillas virales aprobadas por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA): BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (cepa TGAC), BVDV-2 (125), PI3 (Reisinger SF-4) y BRSV (N375) (no se realiza ningun proceso de extraccion en BHV-1 [cepa Cooper] ya que es un virus de ADN). Las extracciones se realizan utilizando RNAqueous®-4PCR (Ambion; Austin, TX, EE.u U.).

Cada una de las muestras de ARN viral se usa como plantilla (muestra) en reacciones de RT-qPCR separadas para cada uno de los seis grupos de cebador/sonda que utilizan Qrnmica TaqMan® para RT-PCR de una etapa. El virus de ADN (BHV-1) tambien se usa como plantilla (muestra) en reacciones de qPCR separadas con cada uno de los seis grupos de cebador/sonda descritos anteriormente. El analisis del grupo de cebador/sonda para BRSV contra las seis fracciones virales de la vacuna hexavalente indica que no hay reactividad cruzada para cada uno de los grupos de cebador/sonda con cualquiera de las otras fracciones virales.

Ensayos de qPCR

Los ensayos de qPCR se llevan a cabo utilizando un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500. Cebadores de oligonucleotidos y sondas moleculares marcadas

Las siguientes sondas TaqMan® personalizadas y los pares de cebadores directo e inverso espedficos del virus fueron fabricados por Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.).

BVDV-1b (primero):

Cebador directo: 5-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3' (SEQ ID NO: 1);

Cebador inverso: 5-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3' (SEQ ID NO: 2); y

Sonda TaqMan® MGB para BVDV-1b: 5-TCACCTGGACGACCC-3' (SEQ ID NO: 3).

BVDV-1b (segundo):

Segundo cebador directo: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 19);

Segundo cebador inverso: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 20); y

Segunda sonda de deteccion para BVDV-1b: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEQ ID NO: 21).

BRSV:

Cebador directo: 5'-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3' (SEQ ID NO: 4);

Cebador inverso: 5'-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3' (SEQ ID NO: 5); y

Sonda BRSV TaqMan® MGB: 5'-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3' (SEQ ID NO: 6).

BVDV-1a:

Cebador directo: 5'-GGTCGCCCAGGTAAAAGCA-3' (SEQ ID NO: 7);

Cebador inverso: 5'-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3' (SEQ ID NO: 8); y

Sonda TaqMan® MGB para BVDV-1a: 5'-AACCGACTGTTACGAATAC-3' (SEQ ID NO: 9).

BVDV-2:

Cebador directo: 5'-GCTAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3' (SEQ ID NO: 10);

Cebador inverso: 5'-GACGAGTCCCCTGTACTCAGG-3' (SEQ ID NO: 11); y

Sonda TaqMan® MGB para BVDV-2: 5'-CAGTGAGTCCATTGGATGG-3' (SEQ ID NO: 12).

Cebador directo: 5'-GGAGACCAAGACCAAGGAGATG-3' (SEQ ID NO: 13);

Cebador inverso: 5'-CGTCTGCCCATGCATAAGG-3' (SEQ ID NO: 14); y

Sonda TaqMan® MGB para PI3: 5'-ACCTCGGTCATCCATAG-3' (SEQ ID NO: 15).

BHV-1:

Cebador directo: 5'-CCATGTTAGCGCTCTGGAACC-3' (SEQ ID NO: 16);

Cebador inverso: 5'-CGTCTTTACGGTCGACGACTCC-3' (SEQ ID NO: 17); y

Sonda TaqMan® MGB para BHV-1: 5'-ACGGACGTGCGCGAA-3' (SEQ ID NO: 18).

Ensayo de potencia para vacunas monovalentes

Los protocolos para cada uno de los siguientes ensayos utilizan la metodologfa del ciclo de umbral comparativo (C^t ) de Applied Biosystems 7500 para determinar si un pozo individual de una placa de titulacion contiene una cantidad mayor de virus que el pozo de referencia equivalente. La mayona de las muestras virales contienen algunas partmulas virales no viables que podnan ser detectadas por el ensayo de PCR, dando asf resultados potencialmente falsos positivos. Este problema se resuelve mediante el uso de una placa de referencia sin celulas. La muestra se diluye en la placa de referencia exactamente como esta en la placa de ensayo pero sin celulas para eliminar la posibilidad de replicacion viral. La placa de referencia se utiliza para generar un valor C^t de lmea base o fondo para cada uno de los pozos en cada ensayo. Si un pozo en la placa de ensayo tiene un valor de C^t mas alto que el pozo de fondo correspondiente, se ha producido una replicacion viral y el pozo se considera positivo. Si no se determina un valor C^t para un pozo, o si el valor C^t es equivalente al valor C^t de fondo, entonces el pozo se considera negativo.

Ensayo de potencia para vacunas multivalentes

Se preparo una serie piloto de la vacuna hexavalente IBR/BVDV-1a, IBR/BVDV-1b, IBR/BVDV-2/PI3/RSV, virus vivo modificado, como se describe en el presente documento. Brevemente, se propagaron BHV-1 (cepa Cooper), BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (cepa TGAC), BVDV-2 (125), PI3 (Reisinger SF-4) y BRSV (N375) en la lmea celular TVL-BK (vigesimo pase). Las fracciones individuales se recolectaron en el decimo pase y se combinaron en el producto de seis vfas. Se puede realizar una prueba de potencia para cada fraccion de la vacuna de 6 vfas como se describe en este documento con la adicion de antisueros neutralizantes apropiados. El TCID50 de cada fraccion viral se determina en funcion de los resultados de CPE/FA/IFA y se compara con los basados en RT-qPCR/qPCR.

Pruebas de potencia de BVDV-1a, BVDV-1b y BVDV-2

Las muestras de BVDV-1a, BVDV-1b y BVDV-2 monovalentes se pueden valorar por separado de acuerdo con el procedimiento de ensayo suplementario para la valoracion del virus de la diarrea viral bovina en la vacuna (SAM 101). Brevemente, el ensayo se realiza por duplicado con una de las placas que se utiliza para el calculo del tftulo en funcion del CPE y/o FA/iFa como se describio. La otra placa se utiliza para determinar un tftulo basado en RT q P C R . S e in c lu y e u n a p la c a d e re fe re n c ia d e f ic ie n te en c e lu la s c o m o se d e s c r ib io a n te r io rm e n te p a ra c a d a u n o de lo s v iru s .

P rueba de p o te n c ia de PI³

^{L a p ru e b a d e p o te n c ia p a ra P I}3 ^{se re a liz a p o r d u p lic a d o c o n u n a d e la s p la c a s q u e s e u t iliz a p a ra e l c a lc u lo d e l t f tu lo b a s a d o e n e l C P E . L a o tra p la c a s e u t iliz a p a ra d e te rm in a r un t f tu lo b a s a d o e n lo s v a lo re s d e C t c o m p a ra t iv o s d e P I}3 d e a c u e rd o a lo d e te rm in a d o p o r R T -q P C R . U n a p la c a d e re fe re n c ia d e f ic ie n te en c e lu la s se in c lu y e c o m o se d e s c r ib io a n te r io rm e n te .

P rueba de p o te n c ia de BRSV

L a p ru e b a d e p o te n c ia p a ra B R S V se re a liz a p o r d u p lic a d o c o n u n a d e la s p la c a s q u e se u t iliz a p a ra e l c a lc u lo de l t f tu lo b a s a d o en e l C P E c o m o se d e s c r ib io a n te r io rm e n te , u s a n d o la p la c a re s ta n te p a ra d e te rm in a r un t f tu lo co n b a s e en lo s v a lo re s C t c o m p a ra t iv o s d e B R S V d e a c u e rd o a lo d e te rm in a d o p o r R T q P C R . C o m o se d is c u tio a n te r io rm e n te , u n a p la c a d e re fe re n c ia d e f ic ie n te en c e lu la s ta m b ie n s e in c lu y e e n e l e n s a y o .

P rueba de p o te n c ia de BHV

L a p ru e b a d e p o te n c ia p a ra B H V se lle v a a c a b o en un fo rm a to d e 96 p o z o s , s u s t itu y e n d o e l a n a lis is d e q P C R de p o z o s in d iv id u a le s p o r o b s e rv a c io n v is u a l c o n v e n c io n a l y e l re c u e n to d e la s p la c a s . E l e n s a y o se re a liz a p o r d u p lic a d o , y u n a d e la s p la c a s s e u t iliz a p a ra e l c a lc u lo d e l t f tu lo e n fu n c io n d e la p re s e n c ia o a u s e n c ia d e C P E e n un p o z o in d iv id u a l (d i lu c io n ) , m ie n tra s q u e la p la c a re s ta n te s e u t iliz a p a ra c a lc u la r un t f tu lo e n fu n c io n d e lo s v a lo re s C t c o m p a ra t iv o s d e B H V c o m o se d e te rm in a p o r q P C R . U n a p la c a d e re fe re n c ia d e f ic ie n te en c e lu la s se in c lu y e c o m o se d e s c r ib io a n te r io rm e n te .

R e fe ren c ias

L a s s ig u ie n te s re fe re n c ia s , en la m e d id a en q u e p ro p o rc io n a n e je m p lo s d e p ro c e d im ie n to u o tro s d e ta l le s c o m p le m e n ta r io s a lo s q u e se e x p o n e n en e l p re s e n te d o c u m e n to , se in c o rp o ra n e s p e d f ic a m e n te en e s te d o c u m e n to e n su to ta lid a d p o r re fe re n c ia e x p re s a a la s m is m a s :

P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N o .4.415.732 d e C a ru th e rs e t al.

P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N o .4.458.066 d e C a ru th e rs e t al.

P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N o .4.683.195 d e M u llis e t al.

P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N o .4.683.202 d e M u llis e t al.

P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N o .4.725.677 d e K o s te r e t al.

P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N o .4.973.679 d e C a ru th e rs e t al.

P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N o .4.980.460 d e M o lk o e t al.

P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N o .5.614.388 d e P ic o n e e t al.

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composicion inmunogenica que comprende: un virus de la diarrea viral bovina de tipo 1b (BVDVIb), atenuado, vivo, modificado, en la que el BVDV1b vivo, modificado es una cepa depositada bajo el numero de acceso de la ATCC PTA-11553.

2. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 1, que comprende ademas una cantidad inmunologicamente eficaz de al menos un antfgeno adicional.

3. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 2, en la que al menos un antfgeno adicional es espedfico para un organismo seleccionado del grupo que consiste en Actinobacillus, Actinomyces, Bacillus, Bordetella, Brachyspira, Campylobacter, Clostridium, Ehrlichia, Erysipelothrix, Escherichia, Histophilus, Leptospira, Listeria, Mannheimia, Moraxella, Mycobacterium, Mycoplasma, Pasteurella, Salmonella y Streptococcus, o una combinacion de los mismos.

4. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 2, en la que al menos un antfgeno adicional esta inactivado.

5. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 1, que comprende ademas uno o mas de:

un virus de parainfluenza tipo 33 (PI3), vivo modificado,

un virus sincitial respiratorio bovino (BRSV) vivo, modificado,

un virus del herpes bovino (BHV-1) vivo, modificado,

un virus de la diarrea viral bovina, tipo 1a (BVDV1a), vivo, modificado, o

un virus de la diarrea viral bovina, tipo 2 (BVDV2) vivo, modificado.

6. Una vacuna que comprende una cantidad profilacticamente eficaz de la composicion inmunogenica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un adyuvante.

7. La vacuna de la reivindicacion 6, que comprende ademas una cantidad inmunologicamente eficaz de al menos un antfgeno espedfico de un patogeno microbiano.

8. Una cantidad profilacticamente eficaz de una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en la prevencion de la fiebre del embarque, el complejo de enfermedad respiratoria bovina o la diarrea viral bovina, en un animal.

9. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que el animal esta infectado por, o es susceptible a la infeccion de, un Pestivirus.

10. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, en la que el animal es un bovido.

11. Una vacuna que comprende la composicion inmunogenica de la reivindicacion 1 y un adyuvante; en la que la composicion inmunogenica comprende al menos 2x103 TCID50 del BVDV1b vivo, modificado por dosis.

12. La vacuna de la reivindicacion 11, que comprende ademas uno o mas de:

al menos 5 x 103 TCID50 de un BHV-1 vivo, modificado por dosis;

al menos 5 x 103 TCID50 de un BVDV1a vivo, modificado por dosis;

al menos 3 x 103 TCID50 de un BVDV2 vivo, modificado por dosis;

al menos 6 x 104 TCID50 de un PI3 vivo, modificado por dosis; y

al menos 7 x 102 TCID50 de un BRSV vivo, modificado por dosis.