MXPA06010631A - Metodo de vacunacion contra la infeccion testicular por el virus de la diarrea virica bovina - Google Patents
Metodo de vacunacion contra la infeccion testicular por el virus de la diarrea virica bovinaInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a métodos para prevenir la infección testicular por el virus de la diarrea vírica bovina mediante la inmunización de animales macho susceptibles contra la infección.
Description
MÉTODO DE VACUNACIÓN CONTRA LA INFECCIÓN TESTICULAR POR EL VIRUS DE LA DIARREA VÍRICA BOVINA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Los métodos de la invención se refieren a métodos para prevenir la infección testicular por el virus de la diarrea vírica bovina mediante la inmunización de animales macho susceptibles contra la infección.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) es un patógeno económicamente significativo del ganado vacuno y otros animales susceptibles que puede trasmitirse en el semen de los toros y otros animales macho susceptibles infectados de forma persistente y aguda. Este patógeno provoca enfermedad gastrointestinal, respiratoria y reproductora en los animales susceptibles. Aunque la enfermedad gastrointestinal y respiratoria debida a cepas altamente patógenas de BVDV son más dramáticas clínicamente, las pérdidas reproductoras debidas al BVDV pueden ser mucho más significativas económicamente. La bibliografía sobre la transmisión de BVDV ha establecido que el virus en el semen de los toros puede infectar a las vacas susceptibles inseminadas, provocando tasas reducidas de preñez, muerte embrionaria temprana, abortos y nacimiento de terneros infectados persistentemente con el BVDV.1"3 Los toros infectados persistentemente, infectan a las vacas inseminadas susceptibles de la forma más consistente, debido a que su semen contiene una concentración elevada de virus (107'6 dosis infecciosas de cultivos celulares (50%)/ml) (CCID50/ml).3 Por comparación, los testículos infectados de los toros inmunocompetentes infectados de forma aguda trasmiten concentraciones menores de virus (5 a 75 CCID50/ml) en el semen, pero son también capaces de trasmitir BVDV.4 Un estudio informó de que 25 a 50 CCID50/ml de virus en semen infectaba al 5% de las novillas inseminadas y la subsiguiente transmisión horizontal de BVDV de las novillas infectadas a las compañeras de hato preñadas, provocó la infección persistente de sus fetos.5
Dos equipos de investigadores han informado también de que la infección aguda de los toros pospúberes puede provocar la infección persistente por BVDV que se localiza en los testículos.6,7 Un caso único se produjo en un toro seropositivo no virémico que se mantenía en una estación de inseminación artificial de Nueva Zelanda. El toro había sido admitido en el centro de inseminación artificial después de que los intentos de aislar el BVDV de la sangre fueran negativos. A pesar de la presencia de anticuerpos neutralizadores contra el BVDV, el toro transmitió virus en el semen a niveles bajos (2 x 103 CCID5Q/ml) de forma continua durante 11 meses hasta que se sacrificó al animal. La fuente de la infección aguda era desconocida. En el examen post mortem, el virus se aisló únicamente de los testículos del toro.6 El virus del semen de este toro provocó la infección y seroconversión subsiguiente de 1 de 3 novillas seronegativas inseminadas.8 En una segunda infección inducida artificialmente, se detectó el BVDV mediante reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-nPCR) en el semen de 2 de 3 toros pospúberes no virémicos durante hasta 7 meses, pero el virus no pudo aislarse mediante métodos de cultivo tisular estándar. El semen recogido 5 meses después de la exposición inicial provocó la infección por BVDV en una novilla seronegativa tras la administración intravenosa. El semen recogido el día de la exposición y 7 meses después de la exposición no provocó infección en dos novillas seronegativas adicionales.7 Dos estudios han observado que los toros infectados de forma aguda pueden transmitir BVDV en el semen con espermatozoides con una concentración, motilidad y morfología aceptables.4,5 Otro estudio encontró un descenso en la motilidad, un aumento en los defectos de la diadema, cabezas de espermatozoides pequeñas y gotículas proximales en los toros infectados de forma aguda.9 Independientemente de cualquier incertidumbre sobre los detalles en lo que se refiere a capacidad de transmisión mediante la cría natural y el efecto sobre la fertilidad de los toros, está claro que la infección testicular de los animales macho susceptibles por BVDV tiene un impacto económico significativo en virtud de las pérdidas reproductoras debidas a la transmisión de BVDV a las vacas.
Las infecciones víricas testiculares plantean un reto significativo para el tratamiento o prevención mediante la inmunización porque se sabe que los testículos están inmunológicamente secuestrados. Sorprendentemente, los inventores han demostrado que la inmunización es un medio eficaz de controlar la infección testicular por BVDV entre los animales susceptibles.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra un porcentaje de muestras de biopsias testiculares positivas para BVDV tras la exposición a BVDV tipo 2. Leyenda: VI = aislamiento de virus, PCR = reacción en cadena de la polimerasa, IHC = inmunohistoquímica, a' b los porcentajes con diferentes letras minúsculas en superíndice son significativamente diferentes (P < 0.05).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención comprende un método para prevenir o tratar la infección testicular por BVDV en un animal macho susceptible que comprende la administración al animal de una cantidad eficaz de una vacuna que se selecciona del grupo que consiste en una vacuna con BVDV tipo 1 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 2 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado y una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado.
La invención comprende también una vacuna que se selecciona del grupo que consiste en una vacuna con BVDV tipo 1 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 2 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado y una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado para usar como medicamento para prevenir la infección testicular por BVDV en un animal macho susceptible. La invención comprende además el uso de una vacuna que se selecciona del grupo que consiste en una vacuna con BVDV tipo 1 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 2 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado y una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado para fabricar un medicamento para prevenir la infección testicular por BVDV en un animal macho susceptible. La invención comprende además un método para prevenir la infección testicular por BVDV en un animal macho susceptible que comprende identificar un animal con un riesgo aumentado de infección testicular por BVDV; y administrar al animal una cantidad eficaz de una vacuna que se selecciona del grupo que consiste en una vacuna con BVDV tipo 1 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 2 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado y una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado. La invención comprende también una vacuna que se selecciona del grupo que consiste en una vacuna con BVDV tipo 1 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 2 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado y una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado para usar como medicamento para prevenir la infección testicular por BVDV en un animal macho susceptible con riesgo aumentado de infección testicular por BVDV. La invención comprende además el uso de una vacuna que se selecciona del grupo que consiste en una vacuna con BVDV tipo 1 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 2 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado y una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado para fabricar un medicamento para prevenir la infección testicular por BVDV en un animal macho susceptible con riesgo aumentado de infección testicular por BVDV. La ¡nvención comprende también un artículo manufacturado que comprende un recipiente o recipientes que contienen una vacuna de BVDV que se selecciona del grupo que consiste en una vacuna con BVDV tipo 1 ¡nactivado, una vacuna con BVDV tipo 2 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado y una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado; e instrucciones para el uso de la vacuna de BVDV para prevenir la infección testicular por BVDV en un animal macho susceptible. Los animales macho susceptibles pueden incluir toros, carneros y verracos. En una modalidad preferida el animal es un toro. Las vacunas y artículos de fabricación pueden comprender tanto una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado como una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado. Las vacunas pueden derivarse de un virus citopatógeno o no citopatógeno.
Opcionalmente las vacunas y artículos manufacturados de la invención pueden comprender al menos un antígeno adicional que se selecciona del grupo que consiste en virus del herpes bovino (BHV-1); virus paragripal tipo 3 (PIV3); virus sincitial respiratorio bovino (BRSV); Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno,
Leptospira icterohaemmorrhagia, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava, Campylobacter fetus,
Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida, Mycobacterium bovis y Mycobacterium dispar. En una modalidad preferida las vacunas y artículos manufacturados de la invención pueden comprender al menos un antígeno adicional que se selecciona del grupo que consiste en virus del herpes bovino
(BHV-1), virus paragripal tipo 3 (P1V3) y virus sincitial respiratorio bovino
(BRSV).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método para tratar o prevenir la infección testicular por los virus BVDV, y la transmisión resultante por el semen, en un animal macho susceptible. El método de la presente invención es efectivo para prevenir o reducir las infecciones testiculares provocadas por infecciones provocadas por BVDV tipos 1 y 2.
Definiciones y abreviaturas El "virus de la diarrea vírica bovina" ("BVDV") es un virus de ARN monocatenario, de sentido positivo, pequeño de la familia Flaviviridae y el género Pestivirus. Se han descrito dos biotipos de BVDV, citopático (CP) y no citopático (NC) basándose en la presencia o ausencia de un efecto citopático visible in vitro cuando se infectan monocapas de células susceptibles. El biotipo no citopático se aisla de brotes en el campo en una gran mayoría de los casos. Las cepas del virus de la diarrea vírica bovina pueden clasificarse también en 2 especies separadas (es decir, genotipos), tipo 1 y tipo 2, basándose en diferencias sustanciales en el ARN vírico. El término "animal susceptible" se refiere a cualquier animal que es susceptible de padecer infecciones por BVDV por ejemplo el ganado vacuno, ovino y porcino. El término "animal macho susceptible" quiere decir cualquier animal macho que es susceptible a infecciones testiculares por BVDV, por ejemplo ganado vacuno, ovino y porcino macho. El ganado vacuno macho sin castrar se denomina "toros". El ganado ovino macho sin castrar se denomina
"carneros". El ganado porcino macho sin castrar se denomina "verracos". El término "prevenir" o "controlar" con respecto a la infección testicular quiere decir reducir o eliminar el riesgo de infección por BVDV tipos
1 y 2 virulentos de los testículos de un animal macho susceptible; mejorar o aliviar los síntomas de una infección o acelerar la recuperación de una infección. La vacunación se considera terapéutica si existe una reducción de la carga vírica o bacteriana evaluada mediante biopsia testicular o presencia de virus en el semen. El término "infección" puede significar infección aguda o persistente con BVDV. La infección "aguda" o "transitoria" con BVDV se produce cuando un animal susceptible inmunocompetente está expuesto a una cepa citopática o no citopática de BVDV. Aunque la infección subclínica es la más común, pueden observarse señales tales como depresión, inapetencia, erosiones y ulceraciones orales, diarrea y muerte. Un animal inmunocompetente infectado de forma aguda puede trasmitir el virus a los animales susceptibles, pero de una forma mucho menos eficiente que los animales infectados de forma persistente. Una infección testicular aguda se refiere a una infección aguda o transitoria de los testículos de un animal macho susceptible como resultado de una infección sistémica transitoria. Algunos informes indican que un toro infectado de forma aguda puede trasmitir virus en el semen con concentración, motilidad y morfología aceptables de los espermatozoides. Sin embargo, en otros informes, los autores han observado un descenso en la motilidad de los espermatozoides y un aumento en los defectos de la diadema, cabezas de espermatozoides pequeñas y gotículas proximales coincidiendo con la infección aguda. Una infección persistente con BVDV se produce cuando un animal susceptible se infecta con una cepa no citopática de BVDV antes del desarrollo de la inmunocompetencia aproximadamente a los 125 días de la gestación. Los animales infectados de forma persistente desarrollan inmunotolerancia a la cepa con la que han sido infectados, actúan como reservorio del patógeno y comúnmente transmiten grandes cantidades de virus en la orina, heces, semen, saliva, lágrimas y moco nasal durante toda la vida. Una infección testicular persistente se refiere a una infección persistente de los testículos de un animal macho susceptible como resultado de una infección sistémica aguda o persistente.
Vacunas usadas en la invención Una vacuna usada en la ¡nvención comprende BVDV tipos 1 y/o 2 y un vehículo veterinariamente aceptable. Tradicionalmente, las vacunas víricas pertenecen a dos clases: Las vacunas que contienen patógenos vivos contienen virus vivos que han sido tratados o cultivados de tal forma que son menos patógenos (atenuados) y las vacunas que contienen partículas de virus muertos (inactivados). En el contexto del BVDV, los mismos virus pueden ser citopatógenos o no citopatógenos. Las cepas del virus de la diarrea vírica bovina pueden clasificarse también en 2 especies separadas (es decir, genotipos), tipo 1 y tipo 2, basándose en diferencias sustanciales en el ARN vírico. De este modo, en principio, podrían existir ocho clases principales de vacuna contra el BVDV, aunque la gran mayoría de las vacunas comerciales están basadas en virus citopatógenos. Entre las vacunas de BVDV que están disponibles actualmente comercialmente están aquellas en las que el virus ha sido inactivado químicamente (McCIurkin y cois., Arch. Virol. 58: 119 (1978); Fernelius, y cois., Am. J. Vet. Res. 33: 1421-1431 (1972); y Kolar y cois., Am. J. Vet. Res.
33: 1415-1420 (1972)). Estas vacunas típicamente han necesitado la administración de dosis múltiples para lograr una inmunización primaria, proporcionan una inmunidad de corta duración y no protegen contra la transmisión fetal (Bolin, Vet. Clin. North. Am. Food Anim. Pract. 11 : 615-625
(1995)). En las ovejas, se ha comunicado una vacuna de subunidades basada en una proteína E2 purificada (Bruschke y cois., Vaccine 15: 1940-1945
(1997)). Desgraciadamente, sólo una de tales vacunas parece proteger a los fetos de la infección y esta protección se limita a una cepa de virus homólogos. Además, se han producido vacunas con virus vivos modificados (MLV) usando virus de la BVD que ha sido atenuado mediante pases repetidos en células bovinas o porcinas (Coggins y cois., Cornell Vet. 51 : 539 (1961); y Phillips y cois., Am. J. Vet Res. 36: 135 (1975)) o mediante mutaciones inducidas químicamente que confieren al virus un fenotipo sensible a la temperatura (Lobmann y cois., Am. J. Vet. Res. 45: 2498 (1984); y Lobmann y cois., Am. J. Vet. Res 47: 557-561 (1986)). Se ha demostrado que una dosis única de vacuna de MLV es suficiente para la inmunización y la duración de la inmunidad puede extenderse durante años en el ganado vacuno vacunado (Coria y cois., Can. J. Con. Med. 42: 239 (1978)). Además, se ha reseñado protección cruzada en terneros vacunados con vacunas de tipo MLV (Martin y cois., In Proceedings of the Conference Res. Workers' Anim. Dis., 75: 183 (1994)). Sin embargo, las consideraciones sobre seguridad, tales como la posible transmisión fetal del virus han sido una preocupación principal con respecto al uso de estas vacunas (Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11 : 615-625 (1995)). ' " En una modalidad preferida, el componente de BVDV tipo 1 es citopátogeno vivo modificado (cepa cpBVD-1 NADL-National Animal Disease Center, Estados Unidos, Dep. de Agricultura, Ames, lowa, ATCC VR-534). En otra modalidad preferida el componente de BVDV tipo 2 es citopático vivo modificado (cepa cp BVD-2 53637, ATCC No. PTA-4859). Tal como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos No. 60/490,834 en tramitación con la presente, presentada el 29/7/03, ambos aislamientos contienen una inserción en la región NS2-3. El cpBVDV-1 atenuado contiene una inserción de una secuencia codificante DnaJ1 de Bos taurus en posición 3' de la timidina en la posición de nucleótido No. 4993 (numeración de secuencia de NADL), que es el tercer nucleótido del codón que codifica el resto de glicina en la posición del aminoácido 1536. El cp BVDV-2 atenuado contiene una inserción de una secuencia codificante DnaJ1 de Bos taurus en el mismo sitio del genoma. En otra modalidad preferida, los antígenos vivos modificados están desecados, liofilizados o vitrificados.
En una modalidad, las composiciones de vacunas de la presente invención incluyen una cantidad eficaz de uno o más de los virus de la BVD descritos anteriormente, preferiblemente la cepa cpBVD-1 NADL (cepa cpBVD-1 NADL-National Animal Disease Center, Estados Unidos Departamento de Agricultura, Ames, lowa, ATCC VR-534); la cepa de cpBVD- 2 53637 (ATCC No. PTA-4859), la cepa de IBRV C-13 (Cutter Laboratories); la cepa de PIV3 Reisinger (Univ. Nebraska); la cepa de BRSV 375 (Veterinary Medical Research Institute, Ames, lowa). Los virus de la BVD purificados pueden usarse directamente en una composición de vacuna, o preferiblemente, los virus de la BVD pueden modificarse adicionalmente mediante pases en serie in vitro. Típicamente una vacuna contiene entre aproximadamente 1 x 102 y aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de placas o TCID50 de virus, con un vehículo veterinariamente aceptable y opcionalmente un adyuvante, en un volumen entre 0.1 y 5 ml y preferiblemente aproximadamente 2 ml. La cantidad precisa de un virus en una composición de vacuna eficaz para proporcionar un efecto protector puede ser determinada por un veterinario experto. Los vehículos veterinaria mente aceptables adecuados para usar en composiciones de vacunas pueden ser cualesquiera de los que se describen más adelante. Típicamente, una vacuna contiene entre aproximadamente 1 x
102 y aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de placas o colonias de virus, con un vehículo veterinariamente aceptable y un adyuvante, en un volumen entre 0.1 y 5 ml y preferiblemente aproximadamente 2 ml. La cantidad precisa de un virus en una composición de vacuna eficaz para proporcionar un efecto protector puede ser determinada por un veterinario experto. Los vehículos veterinariamente aceptables adecuados para usar en composiciones de vacunas pueden ser cualesquiera de los que se describen más adelante. La vía típica de administración será la inyección intramuscular o subcutánea de entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 5 ml de vacuna. Las composiciones de vacunas de la presente invención pueden incluir también ingredientes activos adicionales tales como otras composiciones de vacunas contra BVDV, por ejemplo las que se describen en los documentos WO 95/12682, WO 99/55366, la patente de Estados Unidos
No. 6,060,457, la patente de Estados Unidos No. 6,015,795, la patente de
Estados Unidos No. 6,001 ,613 y la patente de Estados Unidos No. 5,593,873. La vacunación se logrará mediante una única inoculación o mediante inoculaciones múltiples. Si se desea, puede recogerse suero de los animales inoculados y analizarlo para determinar la presencia de anticuerpos contra el virus de la BVD. En otra modalidad de la presente invención, las composiciones de vacunas se usan para tratar infecciones testiculares de BVDV. En consecuencia, la presente ¡nvención proporciona métodos para controlar o prevenir infecciones en sujetos animales provocadas por los virus de la BVD tipos 1 ó 2, o una combinación del tipo 1 y el tipo 2, administrando al animal una cantidad eficaz de un virus BVDV de la presente invención. En otra modalidad, las composiciones de vacunas de la presente ¡nvención son eficaces para mejorar la fertilidad del hato y para reducir el riesgo de infecciones testiculares entre animales macho susceptibles. En la práctica de los presentes métodos, una composición de vacuna de la presente invención se administra a ganado vacuno, preferiblemente por vía intramuscular o subcutánea, aunque también pueden usarse otras vías de administración, tales como por ejemplo la vía oral, intranasal (por ejemplo aerosol u otras formas de administración sin agujas), en los nodulos linfáticos, intradérmica, intraperitoneal, administración rectal o vaginal o mediante una combinación de vías. Se prefiere la administración intramuscular en la región del cuello del animal. Pueden ser necesarios refuerzos y la posología puede ajustarse para proporcionar una inmunización óptima. Por "inmunógeno" se quiere decir la capacidad de un virus de la BVD de provocar una respuesta inmunitaria en una animal contra los virus de la BVD tipo 1 o fipo 2 o contra ambos virus de la BVD tipo 1 y tipo 2. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular mediada principalmente por linfocitos T citotóxicos o una respuesta inmunitaria humoral mediada principalmente por linfocitos T colaboradores, que a su vez activa los linfocitos B que provocan la producción de anticuerpos. De acuerdo con la presente invención, los virus están preferiblemente atenuados mediante pases en serie en el cultivo celular antes de usar en una composición inmunógena. Los métodos de modificación son notorios para los expertos en la técnica.
Las composiciones de vacunas que se usan en los métodos de la presente invención pueden incluir también ingredientes activos adicionales tales como otras composiciones inmunógenas contra BVDV, por ejemplo las que se describen en la solicitud de patente con el No. de serie 08/107,908 en tramitación con la presente, los documentos WO 95/12682, WO 99/55366, la patente de Estados Unidos No. 6,060,457, la patente de Estados Unidos No. 6,015,795, la patente de Estados Unidos No. 6,001 ,613 y la patente de Estados Unidos No. 5,593,873. Además, los objetivos de la presente ¡nvención pueden lograrse administrando otros antígenos distintos a los BVDV tipos 1 y/o 2 (una "vacuna combinada"). Tales antígenos incluyen, pero sin limitación, BRSV, BHV-1 , PIV3, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno, Leptospira icterohaemmorrhagia, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava, Campylobacter fetus, Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida, Mycobacterium bovis y Mycobacterium dispar. En varias modalidades preferidas, la fuente de la vacuna combinada es Bovi-Shield® GOLD™ IBR-BVD, Bovi-Shield® GOLD™ 3, Bovi-Shield® GOLD™ 5, Bovi-Shield® GOLD™ IBR-BVD-BRSV-LP, Bovi-Shield® GOLD™ FP 5 L5, Bovi-Shield® GOLD™ FP 5 VL5 o Preguard® GOLD FP 10 (Pfizer, Inc.). Además, las composiciones inmunógenas y de vacunas que se emplean en los métodos de la presente invención pueden incluir uno o más vehículos veterinariamente aceptables. Tal como se usa en la presente memoria, "un vehículo veterinariamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la adsorción y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina, entre otros. Los adyuvantes ¡ncluyen, pero sin limitación, el sistema de adyuvantes RIBI (Ribi Inc.), alumbre, gel de hidróxido de aluminio, colesterol, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, tales como, por ejemplo adyuvantes completo e incompleto de Freund, copolímero de bloque (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) u otras fracciones de saponinas, monofosforil-lípido A, adyuvante Avridina lípido-amina, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante o no), toxina del cólera o dipéptido muramilo, entre muchos otros. Las composiciones de las vacunas, pueden incluir además uno o más agentes inmunomoduladores distintos tales como, por ejemplo interleucinas, interferones u otras citocinas. Las composiciones de las vacunas que se emplean en los métodos de la presente invención pueden incluir también gentamicina y mertiolato. Aunque las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos de utilidad en el contexto de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por el experto en la técnica, la presente invención contempla composiciones que comprenden desde aproximadamente 50 µg a aproximadamente 2000 µg de adyuvante y preferiblemente aproximadamente 500 µg/dosis de 2 ml de la composición de la vacuna. En otra modalidad preferida, la presente invención contempla las composiciones de las vacunas que comprenden desde aproximadamente 1 µg/ml a aproximadamente 60 µg/ml de antibiótico y, más preferiblemente, menos de aproximadamente 30 µg/ml de antibiótico. Las composiciones de las vacunas que se emplean en los métodos de la presente invención pueden prepararse en formas diversas dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, las composiciones de las vacunas pueden prepararse en forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles adecuadas para uso inyectable o prepararse en formas liofilizadas usando técnicas de liofilización. Las composiciones de las vacunas liofilizadas se mantienen típicamente a aproximadamente 4°C y pueden reconstituirse en una disolución estabilizante, por ejemplo solución salina o/y HEPES con o sin adyuvante. Las composiciones de las vacunas de la presente invención pueden administrarse a sujetos animales para inducir una respuesta inmunitaria contra los virus de la BVD tipo 1 o tipo 2 o contra ambos virus de la BVD tipo 1 y fipo 2. En consecuencia, otra modalidad de la presente invención proporciona métodos para estimular una respuesta inmunitaria contra los virus de la BVD tipo 1 o tipo 2 o contra una combinación de los virus de la BVD tipo 1 y tipo 2 administrando a un sujeto animal una cantidad eficaz de una composición inmunógena de la presente invención descrita anteriormente. Por "sujeto animal" se pretende incluir a cualquier animal que sea susceptible a las infecciones por BVDV, tal como ganado vacuno, ovino y porcino. De acuerdo con los métodos de la presente invención, una composición inmunógena preferida para la administración a un sujeto animal ¡ncluye el virus BVDV cp NADL y/o el virus BVDV cp53637. Una composición inmunógena que contiene un virus BVDV, preferiblemente vivo modificado por pases en serie en cultivo, se administra a ganado vacuno preferiblemente por las vías intramuscular o subcutánea, aunque también pueden usarse otras vías de administración, tales como por ejemplo por vía oral, intranasal, en los nodulos linfáticos, intradérmica, intraperitoneal, administración rectal o vaginal o mediante una combinación de vías. Los protocolos de inmunización pueden optimizarse usando procedimeintos bien conocidos en la técnica. Puede administrarse una dosis única a los animales o, de forma alternativa, pueden tener lugar dos o más inoculaciones con intervalos de dos a diez semanas. Dependiendo de la edad del animal, puede volverse a administrar la composición inmunógena o de la vacuna. Por ejemplo, la presente ¡nvención contempla la vacunación de ganado vacuno sano antes de los seis meses de edad y la revacunación a los seis meses de edad. En otro ejemplo, la presente invención contempla la vacunación del ganado vacuno antes de la fase .de cría, aproximadamente 5 semanas antes de la fase de cría (o antes de ser añadido a un hato) y opcionalmente de nuevo aproximadamente 2 semanas antes de la fase de cría o durante la gestación para proteger al feto de la infección provocada por BVDV tipos 1 y 2. También pueden administrarse dosis únicas de las composiciones de la presente invención aproximadamente 3 a 4 semanas después de una primera dosis. También se contempla la revacunación semestral con una dosis única de la vacuna combinada para prevenir la infección fetal con BVDV. El grado y la naturaleza de las respuestas inmunitarias inducidas en el ganado vacuno pueden evaluarse usando una variedad de técnicas. Por ejemplo, pueden recogerse los sueros de los animales inoculados y analizarse para determinar la presencia de anticuerpos específicos para los virus BVDV, por ejemplo en un ensayo convencional de neutralización de virus. El término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de vacuna combinada suficiente para provocar una respuesta inmunitaria en el animal al que se administra. La respuesta inmunitaria puede comprender, sin limitación, inducción de inmunidad celular y/o humoral. La cantidad de una vacuna que es terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo del virus particular que se use, el estado del ganado y/o el grado de infección y puede ser determinada por un veterinario.
Vacunas inactivadas (partes de células o células completas) y vacunas con patógenos vivos modificados Las vacunas inactivadas o con patógenos vivos modificados para usar en el método de la presente ¡nvención pueden prepararse usando una variedad de métodos que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden obtenerse aislamientos de BVDV directamente del útero de vacas infectadas usando técnicas conocidas. Los aislamientos de BVDV pueden atenuarse usando una variedad de métodos conocidos que incluyen pases en serie, por ejemplo. Además de los aislamientos víricos vivos modificados, un producto de vacuna empleado en los métodos de la presente invención puede incluir también una cantidad apropiada de uno o más adyuvantes usados comúnmente. Los adyuvantes adecuados pueden incluir, pero sin limitación: geles minerales, por ejemplo hidróxido de aluminio; sustancias tensioactivas tales como lisolecitina; glucósidos, por ejemplo derivados de saponina tales como Quil A o GPI-0100; polioles plurónicos; polianiones; polímeros de bloque no iónicos, por ejemplo
Pluronic F-127 (B.A.S.F., EE. UU.); péptidos, aceites minerales, por ejemplo
Montanide ISA-50 (Seppic, París, Francia), carbopo!, Amphigen, Amphigen
Mark II (Hydronics, EE. UU.), Alhydrogel, emulsiones de aceite, por ejemplo una emulsión de aceite mineral tal como BayolF/Arlacel A y agua o una emulsión de aceite vegetal, agua y un emulsionante tal como lecitina; alumbre; citocinas bovinas; colesterol; y combinaciones de adyuvantes. En una modalidad preferida, la emulsión de aceite en agua que contiene saponina está convencionalmente microfluidizada. Una fuente particularmente preferida de BVDV tipo 1 y 2, para usar en el método de la presente ¡nvención es la línea de productos de vacunas Bovi-Shield® GOLD™ (PFIZER INC.), que contiene la cepa NADL de BVDV (adquirida del National Animal Disease Center (NADC), USDA, Ames, IA) y la cepa de BVDV tipo 2 cp BVDV 53637 (Univ. Guelph, Guelph, Ont.) (ATCC No. PTA-4859). Preferiblemente, las cepas NADL y 53637 son cepas vivas modificadas. De acuerdo con la presente invención, las cepas de la presente
¡nvención pueden adyuvarse con un adyuvante disponible en el mercado, preferiblemente Quil A-Colesterol-Amphigen (Hydronics, EE.UU.). Una dosis preferida de las composiciones inmunógenas y de vacunas de la presente invención es aproximadamente 2.0 ml. Pueden incluirse conservantes en las composiciones que se emplean en los métodos de la presente invención. Los conservantes contemplados por la presente ¡nvención incluyen gentamicina y mertiolato. También puede añadirse un vehículo, preferiblemente, PBS. La preparación de vacunas con patógenos vivos modificados, tal como mediante la atenuación de cepas virulentas por pases en cultivos, es conocida en la técnica. Los aislamientos de BVDV vivos modificados pueden combinarse también con las siguientes bacterias y virus, ¡ncluyendo pero sin limitación, virus del herpes bovino tipo 1 (BHV-1); virus sincitial respiratorio bovino (BRSV); virus paragripal (PIV3); Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno, Leptospira icterohaemmorrhagia, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava, Campylobacter fetus, Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida, Mycobacterium bovis y Mycobacterium dispar.
Dosificación y modos de administración De acuerdo con la presente invención, una cantidad eficaz de una vacuna de BVDV o vacuna combinada administrada a animales macho susceptibles proporciona una inmunidad eficaz contra la infección testicular asociada a BVDV tipo 1 y 2. En una modalidad, la vacuna se administra a terneros en dos dosis con un intervalo de aproximadamente 3 a 4 semanas. Por ejemplo, la primera administración se realiza cuando el animal tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 meses de edad. La segunda administración se realiza de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 semanas después de la primera administración de la vacuna combinada. En otra modalidad preferida, una administración se realiza aproximadamente 4 a 5 semanas antes de la fase de cría del animal o antes de admitirlo en una instalación de inseminación artificial. La administración de dosis subsiguientes de vacunas se realiza preferiblemente anualmente. En otra modalidad preferida, ios animales que se vacunan antes de la edad de aproximadamente 6 meses deberían volverse a vacunar después de los 6 meses de edad. Preferiblemente la administración de dosis de vacunas subsiguientes se realiza anualmente, aunque la presente invención también contempla las dosis de vacunas subsiguientes bianuales y semestrales. La cantidad de vacuna que es eficaz depende de los ingredientes de la vacuna y del calendario de administración. Típicamente, cuando se usa una preparación de BVDV vivo modificado en una vacuna, es efectiva una cantidad de vacuna que contenga de aproximadamente 102 a aproximadamente 1010 unidades de TCID50 por dosis de BVDV y preferiblemente de aproximadamente 104 a aproximadamente 107 unidades de TCID50 por dosis de BVDV tipos 1 y 2 cuando se administra una vez a animales susceptibles. Preferiblemente, una vacuna que proporciona inmunidad eficaz contiene de aproximadamente 104 a 107 unidades de TCID50/dosis de BVDV tipos 1 y 2 y más preferiblemente, aproximadamente 105 unidades de TCID50/dosis, cuando se administra una vez a animales macho susceptibles. Preferiblemente, la administración de dosis de vacunas subsiguientes se realiza anualmente. Los animales que se vacunan antes de la edad de aproximadamente 6 meses deberían volverse a vacunar después de los 6 meses de edad. Preferiblemente, la administración de dosis de vacunas subsiguientes se realiza anualmente. De acuerdo con la presente invención, cuando se administra el producto preferido, Bovi-Shield® GOLD™ 5 (Pfizer, Inc.), el producto se administra preferiblemente una vez, en una cantidad de aproximadamente 0.1 ml a aproximadamente 5.0 ml, preferiblemente de aproximadamente 1.5 ml a aproximadamente 2.5 ml, y más preferiblemente, aproximadamente 2 ml. Preferiblemente, la administración de dosis de vacunas subsiguientes se realiza anualmente. Los animales que se vacunan antes de la edad de aproximadamente 6 meses deberían volverse a vacunar después de los 6 meses de edad. Preferiblemente, la administración de dosis de vacunas subsiguientes se realiza anualmente. De acuerdo con la presente invención, la administración puede lograrse por vías conocidas que ¡ncluyen la oral, intranasal, tópica, transdérmica y parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o intramuscular). Una vía de administración preferida es la administración intramuscular o subcutánea. La presente invención contempla también una única dosis primaria seguida de revacunación anual, lo que elimina la necesidad de administrar dosis adicionales a los terneros antes de la revacunación anual para generar y/o mantener la inmunidad contra la infección. Las vacunas que se administran de acuerdo con la presente invención pueden incluir componentes adicionales, tales como un adyuvante (por ejemplo geles minerales, por ejemplo hidróxido de aluminio; sustancias tensioactivas tales como colesterol, lisolecitina; glucósidos, por ejemplo derivados de saponina tales como Quil A, QS-21 o GPI-0100; polioles plurónicos; polianiones; polímeros de bloque no iónicos, por ejemplo Pluronic F-127; péptidos, aceites minerales, por ejemplo Montanide ISA-50, carbopol, Amphigen®, Alhydrogel, emulsiones de aceite, por ejemplo una emulsión de aceite mineral tal como BayolF/Arlacel A y agua o una emulsión de aceite vegetal, agua y un emulsionante tal como lecitina; alumbre; citocinas bovinas; y combinaciones de adyuvantes). De acuerdo con la presente invención, la administración de una cantidad eficaz de una vacuna administrada a animales macho susceptibles aproximadamente a los 3 meses de edad proporciona una inmunidad eficaz contra la infección testicular. En una modalidad preferida, la vacuna se administra por vía intramuscular. En otra modalidad preferida, la vacuna se administra por vía subcutánea. Además, se prefiere que la dosis de la vacuna comprenda de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 7 mi, y preferiblemente aproximadamente 2 ml, conteniendo cada ml de aproximadamente 102 a aproximadamente 1010 unidades de TCID50/dosis de virus. De forma deseable, la vacuna combinada se administra dos veces al animal; una vez con aproximadamente 1 a aproximadamente 3 meses de edad y una vez aproximadamente de 5 a 3 semanas después. La presente invención contempla también las revacunaciones anuales con una dosis única.
Identificación de animales con riesgo aumentado de infección por BVDV La invención comprende además un método para prevenir la infección testicular por BVDV en un animal macho susceptible a la infección por BVDV que comprende: a) identificar un animal con riesgo aumentado de infección testicular por BVDV; y b) administrar al animal una cantidad eficaz de una vacuna que se selecciona del grupo que consiste en una vacuna con BVDV tipo 1 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 2 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado y una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado. Para identificar al animal que padece un riesgo aumentado de infección por BVDV, el experto reconoce que un animal padece un riesgo elevado de infección cuando se introduce una infección por BVDV en un hato que previamente no estaba infectado o en el que un animal susceptible está en contacto con otro animal susceptible con una infección por BVDV. BVDV se trasmite de un animal a otro de una forma fecal-oral. La carga vírica necesaria para provocar la infección sintomática se correlaciona con el tipo y cepa de virus de la BVD y esto se correlaciona con ia rapidez de la extensión por el hato. Los animales infectados pueden identificarse por la sintomatología. Las manifestaciones comunes de infección por BVDV pueden incluir: rachas de abortos, infertilidad, ciclos de celo irregulares, muertes embrionarias tempranas, momificación fetal, inmunosupresión, disentería, trombocitopenia e hipoplasia cerebral. Los síntomas de la enfermedad están habitualmente precedidos por leucopenia y los intentos experimentales hasta la fecha se han centrado en la identificación de este efecto. Los estudios serológicos han demostrado que un elevado porcentaje del ganado vacuno infectado por BVDV, incluido el que se considera que está infectado de forma persistente (Pl), no muestra síntomas clínicos. Por lo tanto, un método preferido para identificar a los animales infectados es detectar la presencia del virus mismo en lugar de basarse en la sintomatología. Se han desarrollado varios métodos de análisis diferentes para la detección de BVDV y/o la detección de animales infectados por BVDV. Estos métodos de análisis incluyen: transcripción inversa - reacción en cadena de la polimerasa, inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), técnicas estándar de aislamiento de virus e inmunohistoquímica (Haines y cois., "Monoclonal Antibody-Based Immunohistochemical Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues," Vet. Pathol., 29: 27-32 (1992)). Tanto la técnica de PCR como la de aislamiento de virus, debido a su inherente sensibilidad, son capaces cada una de detectar niveles muy bajos de BVDV. La inmunohistoquímica en las muestras de tejidos, tales como las muestras de biopsias de muescas de la oreja, es una técnica eficaz para detectar los animales Pl, así como la tecnología ELISA, aunque algo menos sensible, está bien adaptada como herramienta de diagnóstico de base amplia para detectar la infección por BVDV en animales, porque es barata, proporciona resultados en un periodo de tiempo corto y no necesita de técnicos muy preparados ni de unas instalaciones de laboratorio muy especializadas. Los métodos de ELISA para la detección de la infección por BVDV se describen en la bibliografía. Véase la patente de Estados Unidos No.
6,174,667 y el documento WO 99/15900 de Huchzermeier y cois, y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 20030143573 y se han comparado con otros métodos, "Comparison of an Antigen Capture Enzyme- Linked Assay with Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction and Cell Culture Immunoperoxidase Tests for the Diagnosis of Ruminant Pestivirus Infections," Vet. Microbiol., 43: 75-84 (1995)). La presente invención se ilustra adicionalmente, pero no se limita a los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 1 Protección testicular
Visión qeneral del estudio La línea de vacunas Bovi-Shield® GOLD™ 5, formulada con BVDV tipo 1 y BVDV tipo 2, se introdujo en la industria del ganado vacuno en noviembre de 2003 para optimizar el nivel de protección fetal que la vacunación proporciona contra BVDV tipo 2. Aquí se reseñan los resultados de un estudio de eficacia previo a la obtención del permiso que evalúa si la vacunación prepúber con Bovi-Shield® GOLD™ 5 fue eficaz en la prevención de la infección testicular ante la exposición grave a BVDV tipo 2, 10 comparado con un placebo (Bovi-Shield® IBR-PI3-BRSV). Todas las crías de toro (n = 17) asignadas a un estudio de exposición a BVDV tipo 2 más extenso, se evaluaron además para determinar si la vacunación con Bovi-Shield® GOLD™ 5 prevenía de forma eficaz la infección testicular con BVDV. Todas las crías del estudio inicial eran terneros para carne (machos y hembras) de 3 a 4 meses de edad privados de calostro. A los 28 días de la vacunación con una formulación que contenía dosis mínimas de inmunización (los niveles de las dosis mínimas de inmunización se establecen antes de obtener el permiso de la vacuna y reflejan un volumen menor de virus antígeno del que está presente en el producto final. La determinación de la dosis mínima de inmunización ayuda a asegurar que cuando un producto se usa a los niveles de liberación estimulará una protección adecuada contra la enfermedad de forma consistente.) de BVDV tipo 1 y BVDV tipo 2, todos los temeros vacunados y los controles con placebo se expusieron por vía ¡ntranasal a la cepa no citopatógena de BVDV tipo 2 24515. La cepa 24515 se aisló en Canadá en un brote grave de BVD que mató a más del 40% del ganado vacuno en los hatos afectados. Después de la exposición, los 10 terneros de control desarrollaron una enfermedad grave caracterizada por una viremia prolongada (9 a 14 días), fiebre que variaba en el intervalo de 40.9°C a 41.8°C durante 4 a 9 días, leucopenia (1 a 9 días), írombocitopenia (< 100,000 por µl), morbilidad (que variaba de 4 a 9 días) y elevada mortalidad (7 de 10 (70%>) de los controles murieron). Por el contrario, sólo 1 ternero vacunado desarrolló viremia, 6 tuvieron fiebre durante 1 ó 2 días, 1 padeció leucopenia durante 1 día, ninguno padeció trombocitopenia y ninguno murió. En conjunto, 18 de los 20 vacunados permanecieron sanos durante todo el esíudio y únicamente 2 íemeros mosíraron depresión duraníe 1 día. Esías dos observaciones no se asociaron a viremia, fiebre, leucopenia o írombocitopenia previa o concurrente. 11 Las evaluaciones para determinar la infección tesíicular por BVDV se iniciaron aproximadameníe 2 semanas después de la exposición. Tal como se muesíra en el cuadro 1 , las muestras de testículo se recogieron en ia necropsia de 2 controles con placebo el día 41 del estudio y las muestras de biopsias de cada uno de los 5 controles resíaníes y 10 vacunados con Bovi-Shield® GOLD™ 5 el día 42. También se obluvo una segunda muesíra a partir de 7 de los 10 vacunados con Bovi-Shield® GOLD™ 5 que estaban íodavía disponibles el día 56. Todas las muesíras se analizaron para deíerminar la presencia de BVDV usando méíodos de análisis de aislamiento del cullivo tisular, amplificación de ácidos nucleicos (RT-nPCR) y análisis inmunohistoquímico. El personal que recogía y analizaba las muesíras íesíiculares no íenía conocimienío de las asignaciones de los grupos de íraíamienío.
CUADRO 1 Diseño del estudio: protección testicular tras exposición a BVDV tipo 2
Vacunación Exposición intranasal* intramuscular Grupo de N° de Día de tratamiento crías de Día Dosis Día Dosis muestreo toro Controles 7 0 2 ml 28 5 m! 41.42® con placebo Bovi-Shield® 10 0 2 ml 28 5 ml 42.56#
GOLD™ 5 * El aislamiento 24515 se obtuvo de la Universidad de Guelph, Guelph, Ontario, Canadá.
® Se obtuvieron muestras de 2 de 7 crías de toro vacunados con placebo en necropsia el día 41 y las muestras de los 5 terneros restantes se obtuvieron el día 42. # Se obtuvieron muestras de las 10 crías de toro el día 42 y se obtuvo una segunda muestra de siete terneros el día 56.
El aislamiento de los virus y los ensayos por PCR se realizaron en el Aubum University Veterinary Pathobiology and Clinical Sciences Laboraíory y el análisis inmunohisíoquímico en la Universidad de Nebraska-Llncoln Veíerinary Diagnosíic Center. Los datos fueron analizados por un representaníe de Pfizer Animal Healíh, Veíerinary Medicine and Research, Biomeírics, Technology and Qualiíy, con un méíodo caíegórico (SAS/STAT software cambios y mejoras de la versión 6.12, SAS Instiíute, Cary, NC o SAS/STAT Guía del usuario Versión 8 y Guía de métodos de SAS Versión 8). Se usó el análisis exacto de Fisher para comparar la proporción de animales en cada grupo de traíamienío con al menos un resultado positivo para BVDV. Las estadísíicas descripíivas se calcularon según se consideraba apropiado.
Resulíados El cuadro 2 y la Figura 1 resumen los porceníajes de los grupos de íraíamienlo para la deíección de BVDV en las muesíras de biopsia lesíicular. Se deíecíaron ácidos nucleicos o aníígenos de BVDV en 6 de 7 (85.7%o) de las muestras testiculares recogidas en los toros vacunados con placebo y expuestos. Por el conírario no se enconíraron ácidos nucleicos o aníígenos de BVDV en ninguna (0.0%) de las muesíras íesíiculares recogidas en las crías de íoro expuesías vacunadas con Bovi-Shield® GOLD™, una diferencia significaíiva (P < 0.05).
CUADRO 2 Sinopsis de los resultados del ensayo de BVDV para las muestras testiculares
N° de positivos para BVDV Positivos % de N° de para terneros Grupo terneros VI PCR IHC BVDV positivos
Placebo 7 5 6 4 6 85.7%a Bovi-Shield GOLD 10 0 0 0 0 0.0%b
VI = aislamiento de virus, PCR = reacción en cadena de la polimerasa, IHC = inmunohistoquímica, a' b Los porcentajes en una columna con letras minúsculas en superíndice diferentes son significativamente diferentes (P < 0.05).
Conclusión y discusión Los resultados del estudio demostraron tanío la seguridad como la eficacia de la vacunación de los toros con Bovi-Shield® GOLD™ 5. La vacuna formulada con niveles de dosis mínimas de inmunización de BVDV íipo 1 y 2 no sólo no provocaron infección íesíicular sino que íambién proíegieron de forma eficaz a las crías de toro prepuber contra la infección íesíicular iras una exposición grave a BVDV íipo 2. El uso de Bovi-Shield® GOLD™ 5 en toros prepúberes puede ser un componeníe importanle de los programas de conírol de la BVD en la producción de terneros y de leche. La vacunación oportuna puede ayudar a proteger a las crías de toro contra infecciones agudas que han sido asociadas a la infección tesíicular íransiloria y persisíeníe y a la íransmisión subsiguieníe de BVDV a través del semen a las vacas susceptibles. Además, la vacunación de los toros prepúberes para evitar la infección aguda pospúber por BVDV puede ayudar a mantener la calidad del semen, que se ha demostrado que se ve afecíada (mofilidad disminuida y anormalidades morfológicas) durante los 60 primeros días después de la infección aguda por BVDV. 9 Aunque los presentes resultados demuestran una protección exitosa tras la exposición al BVDV tipo 2, sería de esperar que se observaran resultados similares iras la exposición a BVDV íipo 1.
EJEMPLO 2 Protección testicular contra la exposición a BVDV tipo 1
Visión general del estudio Se realizó un estudio para evaluar la eficacia de Bovi-Shield® GOLD™ 5 en la prevención de la infección íesíicular aníe la exposición grave a BVDV tipo 1. El diseño de este esíudio fue un diseño aleatorio generalizado en bloques con una estruclura de íraíamiento unidireccional. La información dei traíamienío se ocultó a iodo el personal del laboraíorio del esíudio. Se asignaron al esíudio cuarenía y cinco (45) crías de toro de raza cárnica enteros peripúberes. Los terneros tenían entre 9 y 15 meses de edad. Todos los animales eran seronegativos para los virus de la BVD tipos 1 y 2, negativos para el aislamiento del virus de la BVD en el suero y negativos según el análisis del suero por reacción en cadena de la polimerasa de transcripíasa inversa (RT-nPCR). El día 42, las medias de los mínimos cuadrados de los pesos corporales de los torneros en el grupo con placebo (n = 23) y el grupo de experimeníación (n = 22) eran de 283.8 ± 14.0 kg y 278.3 ± 16.3 kg, respecíivameníe. Se vacunó a los animales con placebo (Bovi-Shield® IBR-PI3-BRSV) o con Bovi-Shield® GOLD™ 5 (IBR-BVDV1-BVDV2-PI3-BRSV). A los 28 días de la vacunación con una formulación que coníenía dosis mínimas de inmunización, iodos los torneros vacunados y los controles con placebo se expusieron por vía intranasal a la cepa de BVDV tipo 1 a no ciíopáíica SD-1 aislada en la Aubum Universiíy. La exposición iníranasal se realizó hiperventilando a los toros durante 30 segundos colocando una bolsa de plástico sobre los orificios nasales y después instilando 5 ml de virus cultivado en MEM con sales de Earle suplementado con suero equino a 10% (vol/vol), bicarbonato sódico (0.75 mg/ml), L-glutamina (0.29 mg/ml) y aníibióticos (100 unidades de penicilina G, 100 µg de esíreptomicina y 0.25 µg de anfoíericina B/ml). El suero equino estaba libre de virus de la BVD tal como se determinó mediante aislamiento de virus y RT-nPCR. Las evaluaciones de la infección tesíicular por BVDV se realizaron el día 42 y 93. El diseño básico del esíudio se describe en el cuadro 3 a coníinuación.
CUADRO 3 Diseño del estudio: protección testicular tras exposición a BVDV tipo 1
Vacunación Exposición ¡ntranasa I* intramuscular Grupo de N° de Día Dosis Día Dosis Día de tratamiento crías de muestreo toro Controles 23 0 2 ml 28 5 ml 42.93 con placebo Bovi-Shield® 22 0 2 ml 28 5 ml 42.93 GOLD™ 5
Tras la exposición, se analizó el suero de los animales de ambos grupos para determinar la presencia de virus. Según se analizó mediante el aislamiento del virus en suero, 18 terneros en el grupo con placebo sufrían viremia el día 34. Nueve de estos 18 sufrían viremia también el dia 35. Cinco terneros en el grupo con Bovi-Shield® GOLD™ 5 sufrieron viremia sólo el día 34. Ningún oíro análisis de aislamiento de virus dio posiíivo en los terneros de ninguno de los grupos de íraíamienío en ningún día de esíudio. También se usaron análisis por RT-nPCR para determinar si los terneros padecían viremia. Para el grupo con placebo, había 3, 9, 12 y 6 terneros con resulíados posiíivos los días 34, 35, 36 y 37 respecíivamente. En el grupo con Bovi-Shield® GOLD™ 5, había 1 , 1 , 2 y 1 terneros con resultados positivos los días 34, 35, 36 y 37, respectivamente. Ningún otro análisis por RT-nPCR de los sueros dio positivo en los terneros de ninguno de los grupos de íraíamienío en ningún día del esíudio. Se midieron las íemperaíuras reciales medias por mínimos cuadrados de ambos grupos. Solameníe el día 36 fueron las medias significaíivamente diferentes (40°C para el placebo y 39°C para el grupo con Bovi-Shield GOLD 5) (P < 0.05).
Resultados de proíección testicular Los resultados de los análisis realizados el día 93 de las muesíras de biopsia íesíicular se muestran en el cuadro 4. Las muestras de 6 de 23 terneros (26.1 %) en el grupo con placebo dieron posiíivo en el análisis de RT-nPCR, mieníras que todas las muestras de los 22 terneros en el grupo con Bovi-Shield® GOLD™ 5 dieron negativo. Todas las muestras de las biopsias de ios grupos con placebo y con Bovi-Shield® GOLD™ 5 dieron negativo en el aislamiento de virus. Las muestras de las biopsias de 5 de 23 terneros (21.7%) del grupo con placebo y 0 de los 22 terneros del grupo con Bovi-Shield® GOLD™ 5 dieron positivo en el análisis por IHC. Todas las muestras de semen de los terneros en ambos grupos de íraíamienío dieron negaíivo en el análisis por RT-nPCR para determinar la presencia de virus de la BVD el día 42 (cuadro 4). El día 93, 10 de 23 (43.5%) de los íerneros en el grupo con placebo dieron posiíivo en el análisis por RT- nPCR y los 22 íerneros del grupo con Bovi-Shield® GOLD™ 5 dieron negaíivo. No se aisló ningún virus de ninguna de las muestras de semen de ninguno de los grupos de traíamienío el día 42 o el día 93 (cuadro 4). En el grupo con placebo 10 de 23 terneros dieron positivo al menos en un análisis. Cuatro de estos diez íerneros dieron posiíivo sólo en un análisis (RT-PCR del semen el día 93). Un ternero dio posiíivo en dos análisis (RT-nPCR de biopsia íesíicuiar y RT-nPCR de semen el día 93). Cinco íerneros dieron posiíivo en íres análisis (RT-nPCR de biopsia íesficular, RT-nPCR de semen e IHC de biopsia el día 93).
CUADRO 4 Sinopsis de los resultados del ensayo de BVDV para las muestras testiculares y de semen
Grupo N° de N° de positivos N° de N° de Positivos % de terneros para BVDV* positivos positivos para terneros para para BVDV" BVDV positivos BVDV® VI PCR IHC VI PCR VI PCR Placebo 23 0 6 5 0 0 n 10 10 43.5
Bovi- 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0%
Shield® GOLD™ 5 VI = aislamiento de virus, PCR = reacción en cadena de la polimerasa, IHC = inmunohistoquímica, a' b Los porcentajes en una columna con letras minúsculas en superíndice diferentes son significativamente diferentes (P < 0.0002). * Día 93 Muestras de biopsia testicular ® Día 42 Muestras de semen Día 93 Muestras de semen En cada animal, se determinó la presencia/ausencia de virus de la BVD en semen o en biopsias tesíiculares en cualquier punto de íiempo, se resumieron por grupos de íraíamienío y se analizaron usando el íesí exacto de Fisher lal como se describe en el Ejemplo 1.
Conclusión En esíe esíudio, la vacunación de crías de loro con Bovi-Shield®
GOLD™ 5 evitó la infección testicular persistente con virus de la BVD tipo 1 y la subsiguiente transmisión de virus en el semen. El contraste entre los animales con placebo y los vacunados con al menos un análisis positivo por el test exacto de Fisher bimodal fue significativo (P = 0.0002). Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones que se citan anteriormente se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad en tanto en cuanto no sean inconsistentes con la descripción que se proporciona en la presente memoria. La presente invención no está limitada en su alcance por las modalidades específicas que se describen, que se pretende que sean ilustraciones de aspectos individuales de la invención. Las composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de las que se muestran y se describen en la presente memoria, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Se pretende que tales modificaciones queden dentro del alcance de los anexos.
Referencias 1. Meyling A, Jensen AM. Transmission of bovine virus diarrhea virus (BVDV) by artificial insemination (Al) with semen from a persistently- infected bull. 2. Kirkland PD, Mackintosh SG, Moyle A. The outcome of widespread use of semen from a bull persistently infected with pestivirus. Veterinary Record 1994;135:527-529. 3. McGowan MR, Kirkland PD. Early reproductive loss due to bovine pestivirus infection. British Vete nary Journal 1995;151 :263-270. 4. Kirkland PD, Richards SG, Rothwell JT, et al. Replication of bovine viral diarrhea virus in the bovine reproductive tract and excretion of virus ¡n semen during acute and chronic infections. Veterinary Record 1991;128:587-590. 5. Kirkland PD, McGowan MR, Mackintosh SG, et al. Insemination of cattle with semen from a bull transiently infected with pestivirus. Veterinary Record 1997;140:124-127. 6. Voges H, Horner GW, Rowe S, et al. Persistent bovine pestivirus infection localized in íhe lestes of an immuno-competent, non-viraemic bull. Veterinary Microbiology 1998;61 :165-175. 7. Gives MD, Heath AM, Brock KV, et al. Detection of bovine viral diarrhea virus in semen obtained from inoculation of seronegative postpubertal bulls. AJVR 2003;64:428-434.
8. Niskanen R, Alenius S, Belak K, et al. Insemination of susceptible heifers with semen from a non nonviraemic bull with persistent bovine virus diarrhea virus infection localized in the testes. Reproduction in Domestic Animáis 2002;37:171-175. 9. Patón DJ, Goodey R, Brockman S, et al. Evaluation of the quality and virological stalus of semen from bulls acutely infeeted with BVDV. Veterinary Record 1989;124:63-64.
Claims (9)
1.- El uso de una vacuna que se selecciona del grupo que consiste en una vacuna con BVDV tipo 1 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 2 inactivado, una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado y una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado para fabricar un medicamento para prevenir la infección testicular por BVDV en un animal macho susceptible con riesgo aumentado de infección teslicular por BVDV.
2.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el animal se selecciona del grupo que consiste en toros, carneros y verracos.
3.- El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el animal es un toro.
4.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la vacuna comprende tanto una vacuna con BVDV tipo 1 vivo modificado como una vacuna con BVDV tipo 2 vivo modificado.
5.- Ei uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde al menos una vacuna con BVDV vivo modificado deriva de un virus citopatógeno.
6.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde al menos una vacuna con BVDV vivo modificado deriva de un virus no citopatógeno.
7.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde ambas vacunas con BVDV vivos modificados derivan de un virus ciíopatógeno.
8.- El uso como se reclama en la reivindicación 1-7, en donde la vacuna comprende a! menos un antígeno adicional que se selecciona del grupo que consiste en virus del herpes bovino (BHV-1); virus paragripal tipo 3 (PIV3); virus sincitial respiratorio bovino (BRSV); Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno, Leptospira icterohaemmorrhagia, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava, Campylobacter fetus, Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida, Mycobacterium bovis y Mycobacterium dispar.
9.- El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde dichos aníígenos adicionales comprenden virus del herpes bovino (BHV-1 ); virus paragripal tipo 3 (PIV3) y virus sincitial respiratorio bovino (BRSV).
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| US60/553,867 | 2004-03-17 |
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