ES2709102T3

ES2709102T3 - Ligantes de micotoxinas

Info

Publication number: ES2709102T3
Application number: ES13711665T
Authority: ES
Inventors: Christian Elend; Marco Krämer
Original assignee: Direvo Industrial Biotechnology GmbH; BASF Enzymes LLC
Current assignee: Direvo Industrial Biotechnology GmbH; BASF Enzymes LLC
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2013-03-20
Publication date: 2019-04-15
Anticipated expiration: 2033-03-20
Also published as: DK2958438T3; WO2014127851A1; PL2958438T3; US20150376558A1; US10131866B2; EP2958438A1; HUE042895T2; EP2958438B1

Abstract

Un método para mejorar la capacidad de unión a micotoxinas de un subproducto derivado de un proceso de producción fermentativo que emplea levadura como microorganismo fermentador, que comprende las etapas de: i) someter la pasta fermentada después de la fermentación a una composición de enzimas capaz de degradar uno o más componentes de la pasta fermentada, ii) separar el producto de fermentación principal deseado, iii) separar el subproducto de la fermentación que tiene capacidades de unión a micotoxinas, en el que dicha composición de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y la pasta fermentada se deriva de un proceso de producción de alcohol fermentativo y el producto de fermentación principal deseado es el etanol.

Description

DESCRIPCION

Ligantes de micotoxinas

Campo de la invencion

La presente descripcion se refiere a un nuevo ligante de micotoxinas. La presente descripcion se refiere ademas al uso de enzimas para mejorar la capacidad de union a micotoxinas de subproductos derivados de un proceso de produccion fermentativo y a composiciones que comprenden enzimas capaces de degradar componentes en la pasta fermentada en el proceso de fermentacion.

Antecedentes de la invencion

Las micotoxinas son metabolitos secundarios segregados por una diversidad de hongos, a menudo producidos en granos de cereales, asf como en forrajes antes, durante y despues de la recoleccion. En la naturaleza, los forrajes y los cereales se ponen en contacto con esporas fungicas.

Algunos hongos producen toxinas solo a niveles espedficos de humedad, temperatura u oxfgeno. Los efectos de las micotoxinas vanan mucho con respecto a su gravedad. Algunas micotoxinas son mortales, algunas provocan enfermedades identificables o problemas de salud, algunas debilitan el sistema inmunologico sin producir smtomas espedficos de esa micotoxina, algunas actuan como alergenos o irritantes, y algunas no tienen efectos conocidos sobre animales o seres humanos. Segun informes recientes de la Organizacion de las Naciones Unidas para la Alimentacion y la Agricultura (FAO), aproximadamente 25% del suministro mundial de grano esta contaminado con micotoxinas. La contaminacion por micotoxinas tiene un impacto economico negativo sobre los productores de alimentos y piensos, en particular los productores de granos y aves de corral.

La formacion de micotoxinas puede producirse cuando los hongos causativos crecen sobre los cultivos en el campo, durante la recoleccion, durante el almacenamiento o durante el procesamiento del pienso, fundamentalmente, siempre que existan condiciones favorables para su formacion. Es diffcil hacer generalizaciones acerca de la distribucion geografica de tipos concretos de micotoxinas, debido a la amplia distribucion de los hongos causativos. Sin embargo, las aflatoxinas y la fumonisina tienden a prevalecer en climas mas templados, mientras que en las regiones mas fnas con mayor humedad aparecen la ocratoxina, la zearalenona, la vomitoxina (desoxinivalenol, DON), la toxina T2 y otras. Cada micotoxina tiene su propio efecto concreto y todas pueden ser terribles. La cocontaminacion por uno o mas tipos de micotoxinas se produce de modo natural y ejerce un mayor impacto negativo sobre la salud y la productividad del ganado que la contaminacion por micotoxinas individuales.

Los efectos ffsicos de las micotoxinas vanan de una menor ingesta de alimentos y baja conversion del pienso a una incapacidad general para crecer de un animal. Los smtomas vanan segun la toxina. La vomitoxina, denominada factor de rechazo del pienso, afecta principalmente a los cerdos.

La zearalenona afecta a los organos reproductores de cerdos y del ganado para la produccion de leche. La fumonisina provoca un trastorno nervioso en caballos debido a su impacto sobre el cerebro. La ocratoxina provoca danos renales. Las aves de corral y los cerdos son sensibles a la ocratoxina, mientras que el ganado para la produccion de leche puede tolerar niveles mas altos de ocratoxina debido a su biotransformacion en una forma no toxica por las bacterias ruminales. Las aflatoxinas, la micotoxina mas habitual, provocan una mayor susceptibilidad a enfermedades. Al nivel de organo o celular, las micotoxinas se diferencian en sus efectos. Las aflatoxinas provocan danos graves en el tugado y el rinon y la zearalenona en los organos reproductores. Otros indices de micotoxicosis incluyen el hinchamiento de las glandulas mamarias y la atrofia ovarica (zearalenona), lesiones orales en pollitos (toxinas T2), trastornos del sistema nervioso y necrosis de las extremidades (alcaloides ergoticos). Las micotoxinas tambien pueden afectar a la salud humana, puesto que muchas se trasladan a la leche o la carne tras su ingestion por el animal. Por ejemplo, las aflatoxinas aparecen en la leche como aflatoxina M1, un metabolito.

Los smtomas agudos de la micotoxicosis a menudo son relativamente faciles de identificar. Sin embargo, los smtomas cronicos, que incluyen una actuacion ligeramente disminuida y/o inmunosupresion, pueden provocar mayores perdidas economicas. Los metodos tradicionales para enfrentarse a las micotoxinas incluyen el uso de inhibidores de mohos para prevenir el crecimiento de mohos en piensos almacenados. Sin embargo, en particular en la industria del ganado, las circunstancias economicas obligan a los productores a encontrar formas para emplear piensos contaminados por micotoxinas.

Las micotoxinas pueden aparecer en la cadena alimentaria como resultado de una infeccion fungica de productos vegetales, tales como forraje, grano, protema vegetal, fibra dietetica y productos de melazas y en subproductos de cereales procesados, y pueden ser consumidas directamente por los seres humanos o pueden ser introducidas por granos, ganado u otros productos de piensos animales contaminados. Las micotoxinas son muy resistentes a la descomposicion durante la digestion, por tanto permanecen en la cadena alimentaria en productos comestibles (por ejemplo, carne, pescado, huevos y productos lacteos) o bajo la forma de metabolitos de la toxina originaria ingerida. Los metodos habituales han incluido la dilucion de piensos contaminados con productos de piensos que se sabe que no contienen micotoxinas, la separacion ffsica para retirar los piensos muy contaminados, y la amoniacion o el calentamiento para desintoxicar los piensos. Estos metodos son muy trabajosos y caros, y pueden no ser eficaces contra ciertas micotoxinas.

Un metodo mas viable para gestionar los piensos contaminados con micotoxinas es mezclar una sustancia capaz de unirse a las micotoxinas y captarlas, evitando as ^la absorcion de las toxinas hacia la corriente sangumea del animal. Muy pocos productos qmmicos han demostrado tener el exito suficiente para poder ser usados a nivel comercial. Entre estos, el uso de arcillas minerales como ligantes es habitual. Por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.149.549 indica el uso de una arcilla de montmorillonita, en particular una arcilla de bentonita, mezclada con piensos animales como ligante de micotoxinas. La patente de EE. UU. n.° 5.165.946 indica el uso de una arcilla de montmorillonita en combinacion con un secuestrante adecuado, en particular sales de fosfato y polifosfato, como ligante de micotoxinas. La patente de EE. UU. n.° 5.639.492 perfecciona aun mas la tecnica e indica el uso de una arcilla de bentonita de calcio activada con acidos mezclada con piensos animales para reducir los efectos de la contaminacion por micotoxinas.

Sin embargo, las arcillas como ligantes de micotoxinas presentan limitaciones significativas. Las arcillas deben incluirse en los piensos animales a niveles altos para que se produzca una union de micotoxinas significativa.

Ademas, la mayona de las arcillas presentan una gama de eficacia de union limitada, y solo se unen a las aflatoxinas en un grado significativo. Ademas, en situaciones de producciones ganaderas domesticas, las arcillas excretadas pueden provocar problemas con la obturacion del equipo de manipulacion del estiercol. Asf, es necesario un agente de union a micotoxinas que sea eficaz contra una amplia gama de micotoxinas que pueda mezclarse con los piensos animales a unas tasas de inclusion mas bajas que las que pueden usarse en la actualidad con sustancias empleadas habitualmente para unirse a micotoxinas en piensos.

El documento US 2010/189856 A1 describe el uso de DDGS para unirse a micotoxinas en un pienso animal. Los DDGS se tratan enzimaticamente con proteasa, beta-glucanasa y celulosa antes de ser utilizados.

El documento US 2010/189856 A1 describe el uso de una biomasa de levaduras con granos de destilena humedos para la union de micotoxinas en animales.

El documento WO 2012/084225 A1 se refiere a un proceso mejorado para producir un producto de fermentacion, en particular etanol.

Por tanto, un objeto de la presente descripcion consiste en proporcionar nuevos ligantes de micotoxinas y metodos mejorados para producir ligantes de micotoxinas para el uso en animales.

Sumario de la descripcion

La presente descripcion se refiere al uso de subproductos derivados de un proceso de produccion fermentativo, en particular a partir de un proceso de fermentacion de etanol, para unir micotoxinas en un animal, en el que el subproducto se selecciona del grupo que consiste en granos de destilena humedos ("distillers' wet grain", DWG), granos de destilena desecados ("distillers' dried grains", DDG), productos solubles de destilena ("distillers' solubles", DS), productos solubles de destilena desecados ("distillers' dried solubles", DDS), granos de destilena desecados con productos solubles ("distillers' dried grain with solubles", DDGS), y sus mezclas.

La presente invencion solo se define por sus reivindicaciones. El termino "realizaciones" y la expresion "aspectos de la invencion", etc., segun se lista a continuacion, tienen un objetivo ilustrativo.

En un aspecto, la presente descripcion se refiere a metodos para mejorar la capacidad de union a micotoxinas de un subproducto derivado de un proceso de produccion fermentativo, que comprenden las etapas de: i) someter la pasta fermentada despues de la fermentacion a una composicion de enzimas capaz de degradar uno o mas componentes de la pasta fermentada, ii) separar el producto de fermentacion principal deseado, iii) separar el subproducto de la fermentacion que tiene capacidades de union a micotoxinas.

En otro aspecto, la presente descripcion se refiere a metodos para producir un ligante de micotoxinas que comprende un subproducto de la fermentacion surgido de un material que contiene almidon en un proceso de produccion de etanol, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

i) convertir el material que contiene almidon en azucares fermentables,

ii) fermentar los azucares fermentables con una levadura para producir una pasta fermentada,

iii) someter la pasta fermentada despues del proceso de fermentacion a una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa,

iv) separar el etanol en la pasta fermentada mediante destilacion,

v) separar el subproducto.

Ademas, otros aspectos de la presente descripcion se refieren al uso de una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa para mejorar la capacidad de union a micotoxinas de un subproducto derivado de una pasta fermentada en un proceso de produccion fermentativo de etanol.

Otro aspecto se refiere a metodos para producir un subproducto exento de micotoxinas derivado de un proceso de produccion fermentativo que emplea un material que contiene almidon contaminado con micotoxinas, que comprenden las etapas de: i) someter la pasta fermentada despues de la fermentacion a una composicion de enzimas capaz de degradar una o mas micotoxinas, ii) separar el producto de fermentacion principal deseado, iii) separar el subproducto de la fermentacion que tiene un contenido bajo en micotoxinas.

i) convertir el material que contiene almidon en azucares fermentables,

iii) someter la pasta fermentada antes o despues del proceso de fermentacion a una composicion de enzimas que comprende una enzima capaz de degradar las micotoxinas presentes que se originan del material que contiene almidon,

iv) someter la pasta fermentada despues del proceso de fermentacion a una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa,

v) separar el producto de fermentacion principal en la pasta fermentada,

vi) separar el subproducto.

Ademas, otros aspectos de la presente descripcion se refieren al uso de una composicion de enzimas que comprende capacidades de degradacion de micotoxinas para retirar las micotoxinas presentes en el material que contiene almidon y/o que comprende una beta-1,3-glucanasa para mejorar la capacidad de union a micotoxinas de un subproducto derivado de una pasta fermentada en un proceso de produccion fermentativo de etanol.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra esquematicamente un proceso de produccion de etanol.

La figura 2 muestra esquematicamente un proceso de etanol que incluye un tanque de fermentacion in situ para la produccion de enzimas basada en WDG.

La figura 3 muestra esquematicamente un proceso de etanol que incluye un tanque de fermentacion in situ para la produccion de enzimas basada en residuos de destilena totales.

La figura 4 es un diagrama que muestra la union mayor de zearalenona por sobrenadantes de celulas de levadura tratadas de modo enzimatico.

La figura 5 es un diagrama que muestra la union mayor de zearalenona por sobrenadantes de celulas de levadura tratadas con Glu4 y Glu5.

La figura 6 es un diagrama que muestra las capacidades de union de zearalenona por los DDGS, celulas de levadura y otros glucanos.

La figura 7 es un diagrama que muestra las capacidades de union de zearalenona por diferentes productos de DDGS.

Descripcion de la invencion

El objeto de la presente es proporcionar nuevos productos con una mejor calidad y funcionalidad para unirse a micotoxinas en animales.

Se han identificado un gran numero de micotoxinas. En la actualidad, existe cinco grupos principales de interes agncola concreto: las aflatoxinas, los tricotenos (por ejemplo, desoxinivalenol), el grupo de la zearalenona, las fumonisinas y las toxinas endofticas.

Las aflatoxinas pueden provocar una reduccion del crecimiento, una inmunidad suprimida, una eficacia del pienso reducida y una mayor mortalidad en ganado, entre otros smtomas. En cerdos puede observarse una eficacia del pienso reducida, una mayor mortalidad y menores tasas de crecimiento. En las aves de corral se producen smtomas similares y una menor capacidad para metabolizar las grasas, las protemas y el almidon.

La zearalenona, en el ganado y los cerdos, imita al estrogeno y produce una considerable reduccion en la actuacion reproductiva, un menor crecimiento, una produccion reducida de leche y una eficacia del pienso reducida. En las aves de corral se observa una mayor mortalidad.

El desoxinivalenol (DON), un ejemplo de tricoteno, provoca smtomas graves en el ganado, cerdos y aves de corral, que incluyen efectos gastricos, tales como vomitos, tasas de crecimiento reducidas, menor produccion de huevos, diarreas y una eficacia del pienso reducida.

La fumonisina produce efectos negativos a traves de una reduccion en la circulacion de la sangre y del gasto cardfaco, al menos en parte debido a receptores de esfingosina agonizantes. De esta forma reducen el crecimiento y provocan edemas pulmonares en cerdos y aves de corral. Esta reduccion de la circulacion afecta a todos los organos principales, incluyendo el Idgado, y puede exacerbar y potenciar los efectos de otras toxinas que tambien pueden estar presentes.

La ocratoxina puede ser carcinogenica en el ser humano y produce inmunosupresion en animales de granja. El lolitremo B (Acremonium lolii en el cesped ingles) es un ejemplo de una toxina endoftica que produce una forma de alteraciones nerviosas que a menudo se confunden con la hipomagnesemia.

De forma sorprendente, los inventores han descubierto que ciertos subproductos derivados de un proceso de produccion fermentativo tienen un uso excelente como ligantes de micotoxinas en mairnferos. En particular, el subproducto de granos de destilena desecados con productos solubles ("distillers' dried grain with solubles", DDGS) del mafz se une de modo excelente a micotoxinas debido a su estructura espedfica.

En una realizacion ventajosa, el tratamiento de la pasta fermentada con una composicion de enzimas que comprende beta-1,3-glucanasa en un proceso de produccion de etanol que emplea levaduras como microorganismo fermentador produce un subproducto del proceso de fermentacion con capacidades de union a micotoxinas aun mas mejoradas, que puede usarse, por tanto, como un pienso animal.

En una realizacion ventajosa, la micotoxina que se va a unir y/o que se va a degradar es un tricoteno, tal como desoxinivalenol, o es zearalenona, aflatoxina, fumonisina, roquefortina, una ocratoxina o una toxina endoftica. En particular, la micotoxina es zearalenona.

Un aspecto de la presente descripcion se refiere a metodos para la produccion de subproductos de union a micotoxinas derivados de un proceso de produccion fermentativo, que comprenden las etapas de: i) someter la pasta fermentada despues de la fermentacion a una composicion de enzimas capaz de degradar uno o mas componentes de la pasta fermentada, ii) separar el producto de fermentacion principal deseado, iii) separar el subproducto de la fermentacion que tiene capacidades de union a micotoxinas.

Los subproductos o residuos de un proceso de fermentacion incluyen granos de destilena, granos de cervecena, granos de destilena desecados, productos solubles de destilena desecados, granos de destilena desecados con productos solubles, WDG o/y restos de la industria de procesamiento de cereales o sus mezclas. Por ejemplo, los DDGS son el residuo desecado que permanece despues de que la fraccion de almidon del mafz se fermenta con levaduras y enzimas seleccionadas para producir etanol y dioxido de carbono. Despues de finalizar la fermentacion se retira el alcohol mediante destilacion y los residuos de la fermentacion remanentes se secan.

En algunas realizaciones ventajosas, el subproducto se selecciona del grupo que consiste en granos de destilena humedos ("distillers' wet grain", DWG), granos de destilena desecados ("distillers' dried grains", DDG), productos solubles de destilena ("distillers' solubles", DS), productos solubles de destilena desecados ("distillers' dried solubles", DDS), granos de destilena desecados con productos solubles ("distillers' dried grain with solubles", DDGS), y sus mezclas. En particular, el subproducto que tiene capacidades de union a micotoxinas es DDGS. Los residuos de destilena son el producto que permanece despues de que la pasta haya sido convertida en azucares, fermentada y destilada para producir etanol. Los residuos de destilena pueden separarse en dos fracciones, tal como mediante centrifugacion o tamizado: (1) la torta humeda (fase solida), y (2) los residuos de destilena finos (sobrenadante). La fraccion solida o granos de destilena humedos (DWG) pueden prensarse para eliminar el exceso de humedad y despues secarse para producir los granos de destilena desecados (^dD^g). Despues de haber retirado el etanol de la fraccion lfquida, el lfquido remanente puede evaporarse para concentrar el material soluble en productos solubles de destilena (DS) condensados o puede secarse y triturarse para crear los productos solubles de destilena desecados (DDS). Los DDS a menudo se mezclan con DDG para formar los granos de destilena desecados con productos solubles (DDGS). Los DDG, DDGS, y DWG se denominan colectivamente granos de destilena.

En una realizacion de la presente descripcion se anaden enzimas durante y/o preferiblemente despues de la fermentacion a la pasta fermentada en el proceso de produccion y antes de la etapa de separacion del producto de fermentacion principal, en particular mediante destilacion, por lo cual el producto de fermentacion principal deseado se separa del resto de la pasta fermentada. Las enzimas segun la presente descripcion son capaces de degradar, en particular, las celulas de levadura en la pasta fermentada (cerveza o pasta de cerveza), lo cual mejora la capacidad de union a micotoxinas de los subproductos o residuos, tales como granos de cervecena, granos de destilena desecados, productos solubles de destilena desecados, granos de destilena desecados con productos solubles, WDG o/y restos de la industria de procesamiento de cereales o sus mezclas, a la vista de su contenido en micotoxinas. Los componentes de la pasta fermentada pueden ser, en particular, las paredes celulares de las celulas de levaduras fermentadoras.

De modo sorprendente, la degradacion de las propias celulas de levaduras fermentadoras mediante la adicion de una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa y/o una esterasa y/o una epoxidasa, tambien provoca una disminucion en el contenido en micotoxinas en la propia pasta de cervecena, lo cual produce un aumento en la calidad nutricional y la funcionalidad de los subproductos.

En una realizacion ventajosa, las composiciones de enzimas usadas en los metodos segun la presente descripcion son capaces de degradar los componentes de la pared celular de las celulas de levaduras fermentadoras despues de la etapa de fermentacion, lo cual provoca la union de una o mas micotoxinas en el subproducto de la fermentacion.

Por tanto, la descripcion se refiere ademas a metodos para producir un subproducto exento de micotoxinas derivado de un proceso de produccion fermentativo que emplea un material que contiene almidon contaminado con micotoxinas, que comprenden las etapas de: i) someter la pasta fermentada despues de la fermentacion a una composicion de enzimas capaz de degradar una o mas micotoxinas, ii) separar el producto de fermentacion principal deseado, iii) separar el subproducto de la fermentacion que tiene un contenido bajo en micotoxinas.

En un aspecto de la presente descripcion, la calidad de los subproductos procedentes de un proceso de produccion fermentativo, tales como DDG, DDGS o WDG, puede mejorarse con los metodos segun la presente descripcion aumentando el contenido en p-glucano y, por tanto, las capacidades de union a micotoxinas de los subproductos. El metodo de la descripcion puede usarse con una cerveza derivada de la produccion de cualquier producto de fermentacion adecuado. La materia prima para producir el producto de la fermentacion puede ser cualquier material que contenga almidon y/o azucar, preferiblemente, un material vegetal que contiene almidon y/o azucar, que incluye cana de azucar, tuberculos, rafces, grano entero y cualquiera de sus combinaciones.

El material que contiene almidon puede obtenerse de cereales. Un material que contiene almidon adecuado incluye mafz, trigo, cebada, mandioca, sorgo, centeno, triticale, patata o cualquiera de sus combinaciones.

La materia prima preferida es el mafz, en especial cuando el producto de la fermentacion es el etanol. El material que contiene almidon tambien puede consistir o comprender, por ejemplo, una corriente lateral procedentes del procesamiento del almidon, por ejemplo, corrientes del proceso que contienen carbohidratos C6 que pueden no ser adecuados para la produccion de jarabes. Los componentes de la cerveza incluyen los componentes de fibra, cascaras, germen, aceite y protemas procedentes de la materia prima que contiene almidon, asf como almidon no fermentado, levaduras, paredes celulares de levaduras y productos residuales. La produccion de un producto de fermentacion generalmente se divide en las siguientes etapas principales del proceso: a) reducir el tamano de partfcula del material que contiene almidon, por ejemplo, mediante molienda en seco o en humedo; b) cocer el material que contiene almidon en una suspension acuosa para gelatinizar el almidon, c) licuar el material que contiene almidon gelatinizado para descomponer el almidon (mediante hidrolisis) en maltodextrinas (dextrinas); d) sacarificar las maltodextrinas (dextrinas) para producir azucares de bajo peso molecular (por ejemplo, DP1-2) que pueden ser metabolizados por un organismo fermentador; e) fermentar el material sacarificado empleando un organismo fermentador adecuado que convierte, directa o indirectamente, los azucares de bajo peso molecular en el producto de fermentacion deseado; f) recuperar el producto de fermentacion, por ejemplo, mediante destilacion para separar el producto de la fermentacion de la pasta de fermentacion.

Tal como se explico anteriormente, la cerveza (o la pasta fermentada) es el producto de fermentacion que consiste en etanol, otros lfquidos y solidos de un producto de fermentacion deseado. Segun la invencion, el producto de fermentacion principal puede ser cualquier producto de fermentacion, que incluye alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol, 1,3-propandiol); acidos organicos (por ejemplo, acido dtrico, acido acetico, acido itaconico, acido lactico, acido gluconico, gluconato, acido succmico, acido 2,5-diceto-D-gluconico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoacidos (por ejemplo, acido glutamico); gases (por ejemplo, H2 y CO2), y compuestos mas complejos que incluyen, por ejemplo, antibioticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. La fermentacion tambien se utiliza habitualmente en la produccion de alcoholes consumibles (por ejemplo, licores blancos, cerveza y vino), productos lacteos (por ejemplo, en la produccion de yogur y queso), cuero y en la industria del tabaco. En una realizacion preferida, el producto de fermentacion es un lfquido, preferiblemente un alcohol, en especial etanol. La cerveza contemplada segun la invencion puede ser el producto que resulta de un proceso de produccion de productos de fermentacion que incluye las etapas a) a f) mencionadas anteriormente. Sin embargo, la cerveza tambien puede ser el producto que resulta de otros procesos de produccion de productos de fermentacion basados en un material de partida que contiene almidon y/o lignocelulosa.

El organismo fermentador puede ser un organismo fungico, tal como levaduras, o bacterias. Las bacterias adecuadas pueden ser, por ejemplo, especies de Zymomonas, tales como Zymomonas mobilis y E. coli. Los ejemplos de hongos filamentosos incluyen cepas de especies de Penicillium. Los organismos preferidos para la produccion de etanol son las levaduras, tales como, por ejemplo, Pichia o Saccharomyces. Las levaduras preferidas segun la descripcion son especies de Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae o levadura de panadero.

En otra realizacion, los solidos procedentes de la etapa de fermentacion pueden fraccionarse. Despues de la fermentacion pueden retirarse grandes trozos de fibras antes o despues de la destilacion. La retirada puede realizarse con un recogedor para superficies lfquidas antes de la destilacion de la cerveza. El material puede separarse de la mezcla de etanol/agua, por ejemplo, mediante centrifugacion. Como alternativa, las fibras y los germenes puede retirarse tamizando los residuos de destilena totales despues de la destilacion o los granos triturados antes de la fermentacion. Despues de retirar los germenes y los trozos grandes de fibras, la cerveza o los residuos de destilena totales remanentes se tratan con enzimas o combinaciones de enzimas para mejorar aun mas la calidad nutricional del subproducto final, tal como DDGS, que se va a usar.

Ademas, la adicion de las enzimas segun la presente descripcion a la pasta fermentada antes de la etapa de separacion, tal como una etapa de destilacion, resulta ventajosa puesto que las enzimas en las composiciones de enzimas son inactivadas durante la destilacion.

Debido a su mejor calidad, los subproductos y los residuos pueden usarse como pienso animal de alta calidad con una mayor capacidad para unirse a micotoxinas en animales y/o los propios subproductos muestran un menor contenido en micotoxinas si el material que contiene almidon utilizado como materia prima para la fermentacion estaba contaminado con micotoxinas.

En una realizacion, la descripcion se refiere a metodos para formular aditivos de piensos utiles desde el punto de vista nutricional como coproductos de los metodos indicados anteriormente para mejorar las caractensticas de union a micotoxinas de un producto de pienso animal.

Los procesos para producir productos de fermentacion, tales como el etanol, a partir de un material que contiene almidon o lignocelulosa son muy conocidos en la tecnica. La preparacion del material que contiene almidon, tal como mafz, para su utilizacion en dichos procesos de fermentacion generalmente comienza triturando el mafz en un proceso de trituracion en seco o de molienda en humedo. Los procesos de molienda en humedo implican fraccionar el mafz en diferentes componentes, de los cuales solo la fraccion del almidon entra en el proceso de fermentacion. Los procesos de trituracion en seco implican triturar los granos de mafz para producir una harina y mezclar la harina con agua y enzimas. En general, se emplean dos tipos diferentes de procesos de trituracion en seco. El proceso que se emplea mas habitualmente, a menudo denominado "proceso convencional", incluye triturar el material que contiene almidon y despues licuar el almidon gelatinizado a alta temperatura usando generalmente una alfa-amilasa bacteriana, seguido de una sacarificacion y fermentacion simultaneas ("simultaneous saccharification and fermentation", SSF) realizada en presencia de una glucoamilasa y un organismo de fermentacion. Otro proceso muy conocido, a menudo denominado proceso de "hidrolisis de almidon bruto" ("raw starch hydrolysis", proceso RSH), incluye triturar el material que contiene almidon y despues sacarificar y fermentar simultaneamente el almidon granular por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial, generalmente en presencia de una alfa-amilasa fungica acida y una glucoamilasa.

En un proceso para producir etanol a partir del mafz, despues de una SSF o del proceso RSH, el etanol se destila de la pasta total despues de la fermentacion. La suspension sin etanol resultante, denominada habitualmente residuos de destilena totales, se separa en las fracciones solida y lfquida (concretamente, la torta humeda y los residuos de destilena finos que contienen aproximadamente 35% y 7% de solidos, respectivamente). Los residuos de destilena finos a menudo se condensan mediante evaporacion para producir unos residuos de destilena espesos o jarabe y se recombinan con la torta humeda y se vuelven a secar para producir granos de destilena desecados con productos solubles (DDGS) para su uso en piensos animales.

El metodo de la invencion puede usarse con una cerveza derivada de la produccion de cualquier producto de fermentacion adecuado. La materia prima para producir el producto de la fermentacion puede ser cualquier material que contenga almidon y/o azucar, preferiblemente, un material vegetal que contiene almidon y/o azucar, que incluye cana de azucar, tuberculos, rafces, grano entero y cualquiera de sus combinaciones.

En una realizacion ventajosa, las composiciones de enzimas comprenden una beta-1,3-glucanasa, en particular para la degradacion de las paredes celulares de los microorganismos fermentadores. Para evitar la degradacion de los microorganismos fermentadores, la composicion de enzimas se anade despues de la etapa de fermentacion. Tal como se emplea en la presente "despues de la fermentacion" o "despues de la etapa de fermentacion" significa que una gran parte o todos los azucares fermentables, tales como la glucosa, se convierten en los productos de fermentacion deseados, tales como etanol.

En una realizacion, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y una 1,6-beta-glucanasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una proteasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y una proteasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una 1,6-beta-glucanasa y una proteasa.

En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una mananasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una mananasa y una beta-1,3-glucanasa.

Otras realizaciones se refieren a metodos para producir un subproducto exento de micotoxinas derivado de un proceso de produccion fermentativo que emplea un material que contiene almidon contaminado con micotoxinas, que comprenden las etapas de: i) someter la pasta fermentada despues de la fermentacion a una composicion de enzimas capaz de degradar una o mas micotoxinas, ii) separar el producto de fermentacion principal deseado, iii) separar el subproducto de la fermentacion que tiene un contenido bajo en micotoxinas. En realizaciones ventajosas, la composicion de enzimas comprende una esterasa y/o una epoxidasa. En otras realizaciones, la composicion de enzimas comprende ademas una beta-1,3-glucanasa.

Las beta-1,3-glucanasas, tal como se emplean en la presente, son enzimas capaces de degradar el glucano. El glucano y la quitina son mucho mas resistentes a la degradacion microbiana que la celulosa, que es el constituyente principal de la pared celular de muchas levaduras y organismos similares a hongos. El glucano esta predominantemente beta-1,3-enlazado con algunas ramificaciones a traves de un 1,6-enlace (Manners et al., Biotechnol. Bioeng, 38, p. 977, 1973), y se sabe que es degradable por ciertos sistemas de beta-1,3-glucanasa. La beta-1,3-glucanasa incluye el grupo de endo-beta-1,3-glucanasas, tambien denominadas laminarinasas (E.C.

3.2.1.39 y E.C. 3.2.1.6, Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc. 1992).

En la tecnica anterior se han descrito una serie de genes de beta-1,3-glucanasa y sus usos. Un ejemplo es el documento DD 226012 (Akad. Wissenshaft, DDR), que se refiere a un metodo para la produccion de una beta-1,3-glucanasa de Bacillus. Ademas, el documento JP 61040792 A (DOI K) describe un plasmido recombinante de citolasa de la pared celular y beta-1,3-glucanasa para eliminar las paredes celulares de levaduras. El gen se deriva de Arthrobacter y se transforma en bacterias del grupo de la Escherichia. El documento EP 440.304 se refiere a plantas a las que se les proporciona una resistencia mejorada contra hongos patogenos transformadas con al menos un gen que codifica una quitinasa intracelular o una beta-1,3-glucanasa intra- o extracelular. Tambien se describen los correspondientes polinucleotidos recombinantes. El documento WO 87/01388 (The Trustees of Columbia University) describe un metodo para preparar enzimas ltticas celulares, tales como beta-1,3-glucanasas, que pueden ser producidas por Oerksovia. El documento WO 92/03557 (Majesty (Her) in Right of Canada) describe un vector de expresion de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN de 2,7 kb derivada de Oerskovia xanthineolytica, que codifica una beta-1,3-glucanasa. A partir del documento WO 92/16632 se conoce una secuencia de ADN recombinante para codificar una nueva protema con actividad beta-1,3-glucanasa.

Los ejemplos de beta-1,3-glucanasas disponibles en el mercado son Rohalase BX de AB Enzymes y Rapidase Glucalees de DSM.

Las mananasas son hemicelulasas clasificadas como EC 3.2.1.78, y se denominan endo-1,4-beta-manosidasas. La mananasa incluye la beta-mananasa, la endo-1,4-mananasa, y la galacto-mananasa. La mananasa preferiblemente es capaz de catalizar la hidrolisis de enlaces 1,4-beta-D-manosfdicos en mananos, que incluyen glucomananos, galactomananos y galactoglucomananos. Los mananos son polisacaridos compuestos principalmente o por completo de unidades de D-manosa. La mananasa puede tener cualquier origen, tal como una bacteria o un organismo fungico. En una realizacion espedfica, la mananasa se deriva de una cepa del genero de hongo filamentoso Trichoderma, preferiblemente Trichoderma reseei. En una realizacion, la mananasa es una de las mananasas descritas en el documento WO2008/009673.

Las mananasas se han identificado en varios organismos de Bacillus. Por ejemplo, Talbot et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 56, n.° 11, pp. 3505-3510 (1990) describen una beta-mananasa derivada de Bacillus stearothermophilus. Mendoza et al., World J. Microbiol. Biotech., vol. 10, n.° 5, pp. 551-555 (1994) describen una beta-mananasa derivada de Bacillus subtilis. El documento JP-A-03047076 describe una beta-mananasa derivada Bacillus sp. El documento JP-A-63056289 describe la produccion de una beta-mananasa alcalina termoestable. El documento JP-A-63036775 se refiere al microorganismo de Bacillus FERM P-8856 que produce beta-mananasa y beta-manosidasa. El documento JP-A-08051975 describe beta-mananasas alcalinas procedentes de Bacillus sp. AM-001 alcalofilo. En el documento WO 97/11164 se describe una mananasa purificada a partir de Bacillus amyloliquefaciens. El documento WO 91/18974 describe una hemicelulasa, tal como una glucanasa, xilanasa o mananasa activa. Los ejemplos de mananasas disponibles en el mercado incluyen GAMANASE (TM) disponible en Novozymes A/S Dinamarca, y Rohapect GMP ™ disponible en AB Enzymes GmbH.

La mananasa puede anadirse en una cantidad eficaz en el intervalo de 0,3 x 106-1,6 x 106 unidades por tonelada de pasta de cerveza.

Las proteasas, tal como se emplean en la presente descripcion, son enzimas que catalizan la ruptura de enlaces peptfdicos. Las proteasas adecuadas incluyen proteasas fungicas y bacterianas. Las proteasas preferidas son proteasas acidas, es decir, proteasas que se caracterizan por la capacidad para hidrolizar protemas bajo condiciones acidos por debajo de pH 7

Las proteasas fungicas acidas adecuadas incluyen proteasas fungicas derivadas de Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Penicillium, Sclerotium y Torulopsis. Las proteasas comerciales incluyen GC 106(TM) y SPEZYME(TM) FAN (disponibles en Genencor, EE. UU.). Las proteasas bacterianas adecuadas, aunque no sean proteasas acidas, incluyen los productos disponibles en el mercado ALCALASE(TM) y NEUTRASE(TM) (disponibles en Novozymes A/S).

La proteasa puede anadirse en una cantidad eficaz en el intervalo de 0,002 x106-314x 106 unidades por tonelada de pasta de cerveza.

En otro aspecto, la presente descripcion se refiere a metodos para producir un ligante de micotoxinas que comprende un subproducto de la fermentacion surgido de un material que contiene almidon en un proceso de produccion de fermentacion, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

i) convertir el material que contiene almidon en azucares fermentables,

iv) separar el producto de fermentacion principal en la pasta fermentada,

v) separar el subproducto.

i) convertir el material que contiene almidon en azucares fermentables,

iii) someter la pasta fermentada despues de la fermentacion a una composicion de enzimas capaz de degradar una o mas micotoxinas,

v) separar el producto de fermentacion principal en la pasta fermentada,

vi) separar el subproducto.

La conversion del material que contiene almidon en azucares fermentables puede realizarse (a) licuando un material que contiene almidon, y (b) sacarificando el material licuado obtenido en la etapa (a).

En una realizacion ventajosa, la composicion de enzimas capaz de degradar una o mas micotoxinas comprende una enzima seleccionada del grupo que consiste en una esterasa, lipasa, proteasa, oxidasa, aminoacido oxidasa, lactonohidrolasa, peroxidasa, lactoperoxidasa, manganeso peroxidasa, epoxidasa, polisacarasa o deshidrogenasa. En particular, la composicion de enzimas comprende una lipasa y/o una epoxidasa.

La licuacion se realiza preferiblemente en presencia de una alfa-amilasa, preferiblemente una alfa-amilasa bacteriana o una alfa-amilasa fungica acida. En una realizacion se anade una pululanasa, una isoamilasa y/o una fitasa durante la licuacion.

Los organismos preferidos para la produccion de etanol son las levaduras, tales como, por ejemplo, Pichia o Saccharomyces. La levadura preferida segun la descripcion es una especie de Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae o levadura de panadero. Las celulas de levadura pueden anadirse en cantidades de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, en especial un recuento de 5 x 107 levaduras viables por ml de caldo de fermentacion. Durante la fase productora de etanol, el recuento de celulas de levadura debe estar preferiblemente en el intervalo de 107 a 1010, en especial aproximadamente 2 x 108. Pueden encontrarse mas indicaciones con respecto a la utilizacion de levaduras para la fermentacion, por ejemplo, en "The alcohol Textbook" (editores K. Jacques, T. P. Lyons y D. R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido, 1999).

El microorganismo utilizado para la fermentacion se anade a la pasta, y la fermentacion continua hasta que se produce la cantidad deseada de producto de fermentacion; en una realizacion preferida en la que el producto de fermentacion que se va a recuperar es el etanol, este tiempo puede ser, por ejemplo, durante 24-96 horas, tal como 35-60 horas. La temperatura y el pH durante la fermentacion es una temperatura y un pH adecuados para el microorganismo en cuestion y que toma en cuenta el uso previsto del producto de fermentacion, tal como, por ejemplo, en una realizacion en la que el organismo fermentador es una levadura y el producto que se va a recuperar es el etanol, la temperatura preferida estana en el intervalo de aproximadamente 26-34 °C, por ejemplo, aproximadamente 32 °C, y el pH estana, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente pH 3-6, por ejemplo, aproximadamente pH 4-5.

En otra realizacion en la que el organismo fermentado es una levadura y la pasta fermentada se va a utilizar como cerveza, la temperatura preferida de la pasta fermentada estana de aproximadamente 10 a 35 °C, en particular 12 16 °C, en particular 14 °C.

Tal como se menciono anteriormente, el organismo fermentador es preferiblemente levadura, por ejemplo, una cepa de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces diastaticus. En una realizacion ventajosa se emplea una cepa de levaduras de Saccharomyces diastaticus (SIHA Amyloferm®, E. Begerow GmbH&Co, Langenlonsheim, Alemania), puesto que su actividad exoamilasa puede romper el almidon lfquido y tambien la dextrina, la maltosa y la melibiosa. En la etapa de licuacion, el almidon gelatinizado (pasta corriente abajo) se degrada (hidroliza) para producir maltodextrinas (dextrinas). Para lograr la hidrolisis del almidon se anade una enzima adecuada, preferiblemente una alfa-amilasa. La licuacion puede realizarse como un proceso de suspension en caliente de tres etapas. La suspension se calienta hasta 60-95 °C, preferiblemente 80-85 °C, y puede anadirse una alfa-amilasa para iniciar la licuacion (fluidificacion). Despues la suspension puede cocerse a chorro a una temperatura de entre 95-140 °C, preferiblemente 105-125 °C, durante aproximadamente 1-15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 3 10 minutos, y en especial durante aproximadamente 5 minutos. La suspension se enfna hasta 60-95 °C y puede anadirse mas alfa-amilasa para completar la hidrolisis (licuacion secundaria). El proceso de licuacion habitualmente se realiza a un pH de 4,0 a 6.5, en particular a un pH de 4,5 a 6.

La etapa de sacarificacion y la etapa de fermentacion pueden realizarse como etapas del proceso separadas o como una etapa de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF). La sacarificacion se realiza en presencia de una enzima sacarificante, por ejemplo, una glucoamilasa, una beta-amilasa o una amilasa maltogenica. Opcionalmente se anade una fitasa y/o una proteasa.

La sacarificacion puede realizarse usando condiciones muy conocidas en la tecnica con una enzima sacarificante, por ejemplo, beta-amilasa, glucoamilasa o amilasa maltogenica, y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa. Por ejemplo, un proceso de sacarificacion completo puede durar de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, aunque es habitual realizar una presacarificacion durante generalmente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, generalmente de aproximadamente 60 °C, seguida de la sacarificacion completa durante la fermentacion en un proceso de sacarificacion y fermentacion simultaneas (proceso SSF). La sacarificacion se realiza generalmente a una temperatura de 20-75 °C, preferiblemente de 40-70 °C, generalmente a aproximadamente 60 °C, y a un pH de entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4,5. El proceso que mas se emplea para producir un producto de fermentacion, en especial etanol, es el proceso de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF), en el que no hay una etapa de espera para la sacarificacion, lo cual significa que pueden anadirse juntos un organismo fermentador, tal como una levadura, y una o mas enzimas, que incluyen una o mas hemicelulasas y/o una o mas endoglucanasas espedficas. El SSF generalmente se realiza a una temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, de 30 °C a 34 °C, preferiblemente a aproximadamente 32 °C. En una realizacion, la fermentacion continua durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.

Despues de la fermentacion, la pasta fermentada se somete a una composicion de enzimas segun la presente descripcion. En una realizacion ventajosa, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y una 1,6-beta-glucanasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una xilanasa. En una realizacion ventajosa, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y una xilanasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una 1,6-beta-glucanasa y una xilanasa. En otras realizaciones, la composicion de enzimas comprende ademas una pectinasa y/o una proteasa. En un ejemplo, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una xilanasa y una proteasa. En otro ejemplo, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una xilanasa y una pectinasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una mananasa. En una realizacion ventajosa, la composicion de enzimas comprende una mananasa y una beta-1,3-glucanasa.

En una realizacion concreta, el proceso de la invencion comprende ademas, antes de licuar el material que contiene almidon, las etapas de:

- reducir el tamano de partfcula del material que contiene almidon, preferiblemente mediante molienda; y

- formar una disolucion que comprende el material que contiene almidon y agua.

La suspension acuosa puede contener del 10-55% en p/p de solidos secos ("dry solids", DS), preferiblemente del 25 45% en p/p de solidos secos (DS), mas preferiblemente del 30-40% en p/p de solidos secos (DS) del material que contiene almidon. La suspension se calienta por encima de la temperatura de gelatinizacion y puede anadirse una alfa-amilasa, preferiblemente, una alfa-amilasa bacteriana y/o una alfa-amilasa fungica acida, para iniciar la licuacion (fluidificacion). La suspension puede cocerse a chorro para gelatinizar aun mas la suspension antes de someterla a una alfa-amilasa en la etapa (a).

En una realizacion preferida, el material que contiene almidon son cereales molidos, preferiblemente cebada o ir^z , y los metodos comprenden una etapa de moler los cereales antes de la etapa (a). En otras palabras, la descripcion tambien incluye metodos en los que el material que contiene almidon se obtiene mediante un proceso que comprende moler cereales, preferiblemente, moler en seco, por ejemplo, mediante un molino de martillo o de rodillos. La trituracion tambien se entiende como molienda, asf como cualquier proceso que sea adecuado para abrir los granos individuales y exponer el endospermo para su posterior procesamiento. En la produccion de alcohol se emplean normalmente dos procesos de molienda: la molienda en humedo y en seco. La expresion "molienda en humedo" indica la molienda del grano entero. En la molienda en seco se muele el grano entero y se emplea en la parte remanente del proceso de formacion de la pasta. La pasta puede proporcionarse formando una suspension que comprende el material que contiene almidon molido y agua para la elaboracion de cerveza. El agua para la elaboracion de cerveza puede calentarse hasta una temperatura adecuada antes de combinarse con el material que contiene almidon molido para lograr una temperatura de la pasta de 45 a 70 °C, preferiblemente de 53 a 66°C, mas preferiblemente de 55 a 60 °C. La pasta generalmente se forma en un tanque conocido como tanque de suspension.

Despues de la fermentacion, el producto de fermentacion puede separarse del medio de fermentacion. La suspension puede destilarse para extraer el producto de fermentacion deseado del medio de fermentacion mediante tecnicas de microfiltracion o de filtracion con membrana. Como alternativa, el producto de la fermentacion puede recuperarse mediante destilacion. Los metodos para recuperar productos de fermentacion son muy conocidos en la tecnica. Generalmente, se obtiene el producto de la fermentacion, por ejemplo, etanol, con una pureza de hasta, por ejemplo, aproximadamente 96% en vol. de etanol.

Despues de completar el proceso de la fermentacion, el material remanente se considera que son los residuos de destilena totales. Tal como se emplea en la presente, la expresion "residuos de destilena totales" incluye el material que queda al final del proceso de fermentacion antes y despues de la recuperacion del producto de la fermentacion, por ejemplo, etanol. El producto de fermentacion puede recuperarse opcionalmente mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. En una realizacion, los residuos de destilena totales se separan o reparten en una fase solida y una fase lfquida mediante uno o mas metodos para separar los residuos de destilena finos de la torta humeda. Estos metodos incluyen, por ejemplo, la centrifugacion y la decantacion. El producto de la fermentacion puede recuperarse opcionalmente antes o despues de separar los residuos de destilena totales en una fase solida y una fase lfquida.

Asf, en una realizacion, los metodos de la descripcion comprenden ademas una destilacion para obtener el producto de fermentacion, por ejemplo, etanol. La fermentacion y la destilacion pueden realizarse de modo simultaneo y/o por separado/de modo secuencial, opcionalmente seguidas de una o mas etapas del proceso para refinar aun mas el producto de la fermentacion.

En una realizacion, el subproducto acuoso (residuos de destilena totales) procedente del proceso de destilacion se separa en dos fracciones, por ejemplo, mediante centrifugacion: grano humedo (fase solida), y residuos de destilena finos (sobrenadante). En otra realizacion, los metodos de la descripcion comprenden ademas la separacion de los residuos de destilena totales mediante una destilacion para producir el grano humedo y los residuos de destilena finos, y el reciclaje de los residuos de destilena finos en el material que contiene almidon antes de la licuacion. En una realizacion, los residuos de destilena finos se reciclan en la suspension de grano entero molido. La fraccion del grano humedo puede secarse, generalmente en un secador de tambor. El producto desecado se denomina granos de destilena desecados y puede usarse como se menciono anteriormente como un pienso animal de alta calidad. La fraccion de los residuos de destilena finos puede evaporarse para proporcionar dos fracciones (vease la figura 1 y la figura 2): (i) una fraccion condensada de 4-6% de DS (principalmente almidon, protemas y componentes de la pared celular), y (ii) una fraccion de jarabe, que consiste principalmente en dextrinas lfmite y azucares no fermentables, que puede introducirse en un secador junto con los granos humedos (procedentes de la etapa de separacion de los residuos de destilena totales) para proporcionar un producto denominado granos de destilena desecados con productos solubles que tambien puede utilizarse como pienso animal. Los residuos de destilena finos es la expresion usada para el sobrenadante de la centrifugacion de los residuos de destilena totales. Generalmente, los residuos de destilena finos contienen 4-6% de DS (principalmente almidon y protemas) y tienen una temperatura de aproximadamente 60-90 °C. En otra realizacion, los residuos de destilena finos no se reciclan, sino que el vapor condensado de los residuos de destilena finos evaporados se recicla en la suspension que contiene el grano entero molido que se va a cocer a chorro.

Los expertos en la tecnica conocen mas detalles acerca de como realizar la licuacion, la sacarificacion, la fermentacion, la destilacion y la recuperacion del etanol.

El producto o productos de fermentacion pueden recuperarse opcionalmente a partir del medio de fermentacion usando cualquier metodo conocido en la tecnica que incluye, pero no se limita a cromatograffa, procedimientos electroforeticos, solubilidad diferencial, destilacion o extraccion. Por ejemplo, el alcohol se separa del material celulosico fermentado y se purifica por medio de metodos convencionales de destilacion, tal como se menciono anteriormente. Puede obtenerse etanol con una pureza de hasta aproximadamente 96% en volumen que puede usarse, por ejemplo, como etanol para combustible, etanol para bebidas, concretamente, licores blancos neutros potables, o etanol industrial.

Las realizaciones espedficas descritas en la presente no limitan el alcance de las invenciones descritas y reivindicadas en la presente, puesto que estas realizaciones pretenden ser ilustraciones de varios aspectos de la invencion. Se pretende que cualquier realizacion equivalente se encuentre dentro del alcance de esta invencion. En efecto, a partir de la anterior descripcion, a los expertos en la tecnica les resultaran evidentes diversas modificaciones de la invencion, ademas de las mostradas y descritas en la presente. Tambien se pretende que estas modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.

Ejemplos

Ejemplo 1

Las celulas de levadura de cerveza que se emplean tradicionalmente en las fermentaciones de etanol contienen grandes cantidades de p-glucanos en sus paredes celulares. Estos p-glucanos deben ser hidrolizados mediante el uso de enzimas, y los p-glucanos fragmentados resultantes se ensayan para determinar su capacidad para unirse a micotoxinas retirandolas de una disolucion que contiene micotoxinas.

En aplicaciones posteriores, la levadura de cerveza, que es un ingrediente en la pasta fermentada procedente de la fermentacion de etanol, debe hidrolizarse dentro del proceso para crear granos de destilena desecados con propiedades de union a micotoxinas.

1.1 Enzimas:

Las siguientes enzimas listadas en la tabla 1 se usaron por sf solas o en diferentes combinaciones.

Tabla 1

1.2 Determinacion de la actividad del producto de enzima:

Sustratos: Glucanasa: p-glucano de la cebada, viscosidad baja (Megazyme). Los sustratos se disolvieron en tampon a una concentracion del 0,8% (en p/v). Tampon: Na-acetato 50 mM, pH 4,5.

Las enzimas se diluyeron en tampon; debe determinarse la concentracion correcta de enzima para cada enzima. Se mezclaron 90 pl de sustrato y 10 pl de disolucion de enzimas. Se midio un blanco reemplazando la disolucion de enzimas por agua. Se realizo una incubacion durante 30 min a 37 °C (despues de 10 min a 4 °C). Los azucares reductores se midieron despues de mezclar 50 pl de la mezcla de enzima-sustrato incubado con 50 pl del reactivo DNSA-Reagent.

La actividad se calcula como unidades por pl o mg del producto de enzima. Una unidad se define como la cantidad de extremos reductores formados en pmol por minuto. Una unidad de proteasa se define como la formacion de equivalentes de glicina por minuto.

1.3 Hidrolisis de las celulas de levadura

Para la preparacion de los p-glucanos de levadura, se uso una disolucion al 20% (en p/v) de levadura (polvo de levadura de Saccharomyces cerevisiae, Ohly, Hamburgo, Alemania) en tampon Na-acetato 50 mM, pH 4,5. Se introdujeron muestras de 45 ml en tubos Falcon de 50 ml y se trataron como sigue:

- se prepararon disoluciones madre de enzimas de 100 mg/ml en tampon (Na-acetato 50 mM, pH 4,5).

- se anadieron 360 pl de disolucion de enzimas a la disolucion de celulas de levadura y se mezclo a fondo.

- las muestras se incubaron durante 18 h a 37 °C y agitacion horizontal a 150 rpm.

- se prepararon muestras de blanco anadiendo 360 |il de tampon en lugar de las enzimas.

- se tomaron muestras de 1,5 ml para el analisis directamente despues de la adicion de las enzimas y se mantuvieron a -20 °C hasta su posterior analisis.

- despues de 18 h de incubacion, las muestras se centrifugaron (4000 rpm, 4 °C, 15 min) y los sobrenadantes se analizaron para determinar su contenido en p-glucanos.

1.4 Analisis de los beta-glucanos

El analisis de los beta-glucanos se realizo con el kit Yeast beta Glucan Kit K-EBHLG de Megazyme, pero se uso una cuarta parte del volumen descrito en las instrucciones. El analisis se basa en la digestion enzimatica espedfica de (1-3)(1-6)-beta-glucanos a glucosa. Los controles realizados sin digestion enzimatica de los glucanos proporcionan las concentraciones de fondo de glucosa, que deben restarse de las muestras.

Digestion enzimatica de los beta-glucanos

Se anadieron 200 |il de Na-acetato 1,2 M a una muestra de 50 |il que habfa sido pipeteada en un tubo Eppendorf. Las muestras se trataron con 5 |il de Glucazyme™, una mezcla de enzimas que contiene beta-glucanasa, betaglucosidasa y quitinasa, se agito con una espatula de plastico y despues se mantuvo durante 16 h a 40 °C en un incubador. En los controles no se anadio Glucazyme™, anadiendose en su lugar 5 |il de agua destilada.

Analisis de los monomeros de glucosa derivados de los beta-glucanos

Se anadieron 25 |il de las muestras de digestion y de los controles a 1000 |il de reactivo GOPOD (que contiene tampon ajustado a pH 7,4, glucosa oxidasa, peroxidasa y 4-aminoantipirina acido p-hidroxibenzoico) previamente ajustado a 40 °C en un bano de agua en una cubeta de fotometro (cubetas desechables Rotilabo®, poliestirol). Las cubetas se incubaron a 40 °C durante 30 minutos y se determino la densidad optica a 510 nm frente al aire en el paso de luz.

1.5 Union de zearalenona

Se preparo una disolucion madre de la micotoxina zearalenona (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) a 1 mg/ml en acetonitrilo. Las diluciones de trabajo se volvieron a diluir en acetonitrilo hasta una concentracion de 1,04 ppm (partes por millon).

Las muestras de reaccion se prepararon como sigue:

200 |il de disolucion de levadura tratada con enzimas

64.6 |il de disolucion madre de trabajo de zearalenona (concentracion final 33,6 ppb (partes por billon)) hasta 2000 |il de dH2O

Las muestras se incubaron durante 2 h a 37 °C con agitacion horizontal (150 rpm). Tras la incubacion, las muestras se centrifugaron (15 min, 5000 x g, temperatura ambiente) y se uso el sobrenadante para el analisis como se describe en la siguiente seccion.

1.6 Determinacion de las concentraciones de micotoxinas

Para la determinacion de las concentraciones de micotoxinas se emplearon kits comerciales (RIDASCREEN® Zearalenon (artfculo R1401), R-Biopharm AG, Darmstadt, Alemania) con ligeras modificaciones como se describe a continuacion.

Se mezclaron 150 |il de sobrenadante con 350 |il de metanol para lograr una mezcla de metanol:agua de 70:30. Despues las muestras se analizaron segun las instrucciones del fabricante como sigue: El sobrenadante metanolico se diluyo 1:7 (1+6) con tampon de dilucion de muestras (tampon 1, 100 |il de sobrenadante 600 |il de tampon 1) Todos los reactivos se llevaron a temperatura ambiente (20-25 °C) antes del uso. El conjugado de enzimazearalenona se proporciona como un concentrado. Puesto que el conjugado de enzima diluido tiene una estabilidad limitada solo debena reconstituirse la cantidad que realmente es necesaria. Antes de pipetear, el conjugado de enzima debe agitarse cuidadosamente. Para la reconstitucion, el concentrado se diluye 1:11 (1 10) en tampon 1, por ejemplo, 200 |il de concentrado 2,0 ml de tampon, suficiente para 4 tiras de microtitulacion).

El procedimiento de lavado recomendado debe seguirse cuidadosamente y no se debe dejar que los micropocillos se sequen entre las etapas de trabajo.

1. Se inserta el numero suficiente de pocillos de microtitulacion en el soporte de micropocillos para que todos los patrones y las muestras puedan ensayarse por duplicado.

2. Se anaden 50 |il de las disoluciones patron o de la muestra preparada a pocillos por duplicado distintos.

3. Se anaden 50 |il del conjugado de enzima diluido a cada pocillo y se mezcla con cuidado agitando la placa a mano. La placa se incuba durante 2 h a temperatura ambiente (20-25 °C) en la oscuridad.

4. El lfquido se vierte de los pocillos y el soporte de micropocillos se golpea con fuerza boca abajo (tres veces seguidas) contra un papel absorbente para asegurarse de la eliminacion completa del lfquido de los pocillos. Todos los pocillos se rellenan con 250 |il de agua destilada y el lfquido se vuelve a verter. Este preferiblemente de lavado se repite dos veces.

5. Se anaden 50 |il de sustrato y 50 |il de cromogeno a cada pocillo. La placa despues se mezcla a mano mediante agitacion y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente (20-25 °C) en la oscuridad.

6. Se anaden 100 |il de la disolucion de detencion a cada pocillo. La placa despues se mezcla a mano mediante agitacion y se mide la absorbancia a 450 nm dentro de 30 minutos despues de la adicion de la disolucion de detencion.

Se determinan las concentraciones de zearalenona mediante una comparacion con los patrones suministrados en el kit.

1.7 Resultados

Solo las enzimas Glu4 y Glu5 produjeron sobrenadantes que conteman p-glucano a partir de las celulas de levadura, y redujeron la cantidad de zearalenona hasta 54,9% y 60,1% (tabla 2) de las celulas de levadura no tratadas, tal como se muestra en la figura 4 y la figura 5. Por tanto, claramente presentan un potencial para liberar los p-glucanos con efectos de union a micotoxinas de las celulas de levadura en DDGS y, con ello, generan unos con potencial de union a micotoxinas.

Tabla 2

Ejemplo 2 (no segun la invencion)

Los granos de destilena desecados (DDGS), como un subproducto de un proceso de fermentacion de etanol que contienen gran cantidad de celulas de levadura residuales procedentes del proceso de fermentacion de etanol, deben ensayarse para su capacidad para unirse a micotoxinas. Como las paredes celulares de las levaduras contienen principalmente p-1,3-glucanos, los DDGS deben ensayarse contra otros productos de levaduras y pglucanos puros para determinar sus capacidades de union a micotoxinas.

2.1 Fermentacion del mafz para producir etanol

En una realizacion, el proceso de produccion de etanol a partir del mafz se llevo a cabo como sigue:

a) reducir el tamano de partfcula del material que contiene almidon mediante molienda:

- el mafz se muele hasta < 2 mm de tamano de partfcula.

b) formar una suspension que comprende el material que contiene almidon y agua:

- Se lavaron con agua de grifo 10 kg de mafz a 35 °C para obtener una disolucion con aproximadamente 31,25% de solidos, con un volumen total de 30 litros.

- el intervalo de pH fue de 5,6-6,0.

c) licuar el material que contiene almidon:

- la temperatura aumenta hasta 90 °C.

- se anaden 7 ml de alfa-amilasa (Novozymes Liquozyme SC).

- se anade antiespumante al 1%o (30 ml).

- se incuba durante 90 min a 90 °C y 150 rpm.

- la suspension se enfna hasta 30 °C, y el pH se ajusta a aproximadamente 4 con NH2SO41.

d) sacarificar el material licuado obtenido:

- se anaden 12 ml de glucoamilasa (Novozymes Spirizyme Ultra).

e) fermentacion:

- propagacion de las levaduras: se incuban 200 ml de medio YNB-almidon durante la noche (30 °C, 150 rpm), se inoculan con 2 g de levaduras (SIHA Amyloferm), y el precultivo completo se anade a la fermentacion.

- se anaden 300 ppm de ((NH4)2SO4) (10 g) como fuente de nitrogeno.

- se anaden las levaduras.

- el pH se titula hasta 4,0 con una disolucion de amoniaco (al 25%), que suministra mas nitrogeno.

- se incuba durante un maximo de 48 h a 30 °C y 100 rpm.

- se toman muestras de 2 ml cada 12 h para controlar el avance de la fermentacion (concentracion de azucar, concentraciones de etanol)

2.2 Union de zearalenona

Se preparo una disolucion madre de zearalenona (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemana) a 1 mg/ml en acetonitrilo. Las diluciones de trabajo se volvieron a diluir en acetonitrilo hasta una concentracion de 1,04 ppm (partes por millon).

Las muestras de reaccion se prepararon como sigue:

10 mg de DDGS o producto de levadura o p-glucano

64,6 |il de disolucion madre de trabajo de zearalenona (concentracion final de 33,b ppb (partes por billon)

hasta 2000 |il de dH2O

2.3 Determinacion de las concentraciones de micotoxinas

La determinacion de la concentracion de zearalenona se realizo como se describio anteriormente. Se determinan las concentraciones de zearalenona mediante una comparacion con los patrones suministrados en el kit.

2.4 Resultados

La adicion de diferentes p-glucanos (paquimano, p-glucano de levadura, p-glucano de cebada) no afecto a la concentracion de zearalenona, como sf lo hicieron los controles negativos (1,4-p-D-manano, almidon). Incluso el pglucano de levadura puro no tratado no afecto a la union de la zearalenona. La adicion de DDGS, paredes celulares de levadura y polvo de levadura redujo las concentraciones de zearalenona hasta 20%, 12% y 17%, respectivamente, tal como se muestra en la figura 6 y la tabla 3.

Tabla 3

Ademas, los resultados de la figura 7 muestran la capacidad positiva de union a micotoxinas de diferentes productos de DDGS.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un metodo para mejorar la capacidad de union a micotoxinas de un subproducto derivado de un proceso de produccion fermentativo que emplea levadura como microorganismo fermentador, que comprende las etapas de: i) someter la pasta fermentada despues de la fermentacion a una composicion de enzimas capaz de degradar uno o mas componentes de la pasta fermentada, ii) separar el producto de fermentacion principal deseado, iii) separar el subproducto de la fermentacion que tiene capacidades de union a micotoxinas, en el que dicha composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y la pasta fermentada se deriva de un proceso de produccion de alcohol fermentativo y el producto de fermentacion principal deseado es el etanol.

2. - El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el producto de fermentacion principal deseado se separa mediante destilacion.

3. - El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a 2, en el que la pasta fermentada se deriva de un material que contiene almidon.

4. - El metodo segun la reivindicacion 3, en el que el material que contiene almidon se selecciona del grupo que consiste en mafz, trigo, cebada, triticale, mandioca, sorgo, centeno, patata o cualquiera de sus combinaciones.

5. - El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el subproducto se selecciona del grupo que consiste en granos de destilena humedos ("distillers' wet grain", DWG), granos de destilena desecados ("distillers' dried grains", DDG), productos solubles de destilena ("distillers' solubles", DS), productos solubles de destilena desecados ("distillers' dried solubles", DDS), granos de destilena desecados con productos solubles ("distillers' dried grain with solubles", DDGS), y sus mezclas.

6. - El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el subproducto comprende granos de destilena desecados con productos solubles (DDGS).

7. - Un metodo para producir un ligante de micotoxinas que comprende un subproducto de la fermentacion surgido de un material que contiene almidon en un proceso de produccion de etanol, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

i) convertir el material que contiene almidon en azucares fermentables,

iv) separar el etanol en la pasta fermentada mediante destilacion,

v) separar el subproducto.

8. - El metodo segun la reivindicacion 7, en el que el material que contiene almidon se selecciona del grupo que consiste en mafz, trigo, cebada, triticale, mandioca, sorgo, centeno, patata o cualquiera de sus combinaciones.

9. - El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en el que el subproducto se selecciona del grupo que consiste en granos de destilena humedos ("distillers' wet grain", DWG), granos de destilena desecados ("distillers' dried grains", DDG), productos solubles de destilena ("distillers' solubles", DS), productos solubles de destilena desecados ("distillers' dried solubles", DDS), granos de destilena desecados con productos solubles ("distillers' dried grain with solubles", DDGS), y sus mezclas.

10. - El uso de una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa para mejorar la capacidad de union a micotoxinas de un subproducto derivado de una pasta fermentada en un proceso de produccion de etanol fermentativo que emplea levaduras como el microorganismo fermentador, en el que el subproducto se selecciona del grupo que consiste en granos de destilena humedos ("distillers' wet grain", DWG), granos de destilena desecados ("distillers' dried grains", DDG), productos solubles de destilena ("distillers' solubles", DS), productos solubles de destilena desecados ("distillers' dried solubles", DDS), granos de destilena desecados con productos solubles ("distillers' dried grain with solubles", DDGS), y sus mezclas.