CN101959425A - 饲料产品中黄曲霉毒素的解毒 - Google Patents

饲料产品中黄曲霉毒素的解毒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于受到真菌毒素黄曲霉毒素污染的饲料产物解毒的方法。

Description

饲料产品中黄曲霉毒素的解毒
涉及序列表
本申请含有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过题述并入本文。
发明领域
本发明涉及解毒受到真菌毒素黄曲霉毒素(mycotoxin aflatoxin)污染的饲料产物的方法。
发明背景
黄曲霉毒素是天然存在的真菌毒素，其由曲霉属多个种，特别是黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生。黄曲霉毒素有毒并致癌。
曲霉属的产生黄曲霉毒素的成员在自然界是常见的和广泛的。它们可在收获前或储藏过程中在谷物上形成菌落并污染谷物。宿主作物在长期暴露于高湿度环境后或在由应激条件，如干旱(其为降低了进入的障碍的条件)造成损伤后，特别易受曲霉属的感染，
经常受影响的作物包括谷类，如玉米(maize)、高粱(sorghum)、黍(millet)、稻(rice)和小麦(wheat)，以及油籽(oilseeds)，如油菜(rape)、花生(peanut)、大豆(soybean)、向日葵(sunflower)和棉花(cotton)。
当在乙醇产生中使用谷粒和消耗淀粉时，黄曲霉毒素在发酵副产物中，例如，在用作饲料产物的蒸馏干酒糟(distillers’dried grain)中富集，且在发酵副产物中黄曲霉毒素可相对于在谷粒中增加为三倍。因此，受黄曲霉毒素污染的蒸馏酒糟(distillers’grain)可对消耗这些产物的动物的安全造成风险，而且随着蒸馏酒糟在乳牛饲料中的广泛应用，还存在由于牛奶中的黄曲霉毒素残余物导致潜在的对人类安全的担忧。
使用微生物使黄曲霉毒素失活公开于WO2006053357。酶法灭活其他真菌毒素公开于WO9612414。需要对受真菌毒素黄曲霉毒素污染的动物饲料，如发酵副产物，包括湿和干的蒸馏酒糟(distillers’wet and dried grain)进行解毒的其它方法。
发明内容
在第一个方面，本发明提供了从植物材料产生饲料产物的方法，所述方法包括用降解黄曲霉毒素的酶处理所述植物材料，以产生黄曲霉毒素水平降低的饲料产物。
在第二个方面，本发明提供了在植物材料中降解黄曲霉毒素的方法，该方法包括用酶处理所述植物材料。
在第三个方面，本发明提供了酶用于降解黄曲霉毒素的用途。
所述酶优选选自下组：漆酶、角质酶和羧肽酶(carboxypeptidase)。
发明详述
黄曲霉毒素
在本发明的语境中，术语“黄曲霉毒素”包括任何类型的黄曲霉毒素。术语“黄曲霉毒素”还包括黄曲霉毒素的任何衍生物，其对于酶(例如漆酶、角质酶或羧肽酶)的修饰是易感的(susceptible)。
在自然界中产生了至少13中不同类型的黄曲霉毒素。被认为是最毒的黄曲霉毒素B1，以及B2由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)两者产生。黄曲霉毒素G1和G2仅完全由寄生曲霉产生。
黄曲霉毒素M1和M2起初在以发霉谷粒饲养的母牛所产的奶中发现。这些化合物是动物肝脏中转换过程的产物。然而，黄曲霉毒素M1亦存在于寄生曲霉的发酵液中。
虽然在饲料产物中存在曲霉属并非总是表明还存在有害水平的黄曲霉毒素，但其确实暗示食用该产物具有显著的风险。
植物材料
植物材料可包括谷类，例如，玉米(corn)、小麦、大麦、黑麦、稻、高粱和黍中的一种或多种；豆类，例如大豆、豌豆和花生中的一种或多种；油籽，例如，油菜、大豆、向日葵和棉花。所述植物材料可经磨制，例如，湿磨或干磨的谷粒，包括含有谷蛋白/面筋(gluten)、蛋白质、淀粉、糠(bran)和/或油的磨制级分。
所述植物材料可为除具有不受欢迎水平(unwanted level)的黄曲霉毒素外适于产生动物饲料产物的植物材料。所述植物材料亦可为怀疑其包含不受欢迎水平的黄曲霉毒素的植物材料，和/或具有未知水平黄曲霉毒素的植物材料，其中包括未包含可检测水平黄曲霉毒素的植物材料。
本发明的方法可与如下的任何方法组合，该方法中产生适合作为动物饲料产物的产物，或者作为主产物，或者作为副产物。因此本发明的植物材料可为用于产生发酵产物的方法的醪液(mash)。所述发酵产物优选为乙醇产物，例如，啤酒、饮用乙醇、燃料乙醇和/或工业乙醇。本发明的方法可在发酵步骤之前，过程中或之后实施，其目的为降解醪液中包含的存在于植物材料中的黄曲霉毒素，以产生黄曲霉毒素量减少的产物，例如，酒糟(spend grain)或者湿或干的蒸馏酒糟。类似的，本发明的植物材料可为在湿磨方法中的浸渍步骤中的谷粒，在所述方法亦产生适合作为动物饲料产物的产物。
植物材料可为除具有不受欢迎水平或未知水平的黄曲霉毒素之外，适于动物食用的材料，即，根据如下定义的动物饲料产物。
动物饲料产物
术语“动物”包括所有动物，包括人。动物的实例是牛(cattle)，(包括但不限于乳牛/母牛(cow)和小牛(calf))；单胃动物，例如猪(pig or swine)(包括，但不限于，小猪(piglet)、饲育猪(growing pig)和母猪(sow))；家禽如火鸡(turkey)和鸡(chicken)(包括但不限于雏鸡(broiler chick)、蛋鸡(layer))；和鱼(包括但不限于鲑鱼(salmon))。
术语“饲料”或“饲料产物”意指任何适于或意图用于由动物摄取的化合物、制备物、混合物或组合物。
所述饲料产物可以是除具有不受欢迎水平的黄曲霉毒素外适合于由动物食用(consumption)的产物。所述饲料产物也可以是怀疑其包含不受欢迎水平的黄曲霉毒素的产物和/或具有未知水平黄曲霉毒素的产物，其中包括未包含可检测水平黄曲霉毒素的产物。
所述饲料产物优选包含谷类，例如，玉米、小麦、大麦、黑麦、稻、高粱和黍中的一种或多种；豆类，例如，大豆、豌豆和花生中的一种或多种；油籽，例如，油菜、大豆、向日葵和棉花。所述饲料产物可经磨制，例如，湿磨或干磨的谷粒，包括含有谷蛋白/面筋、蛋白质、淀粉、糠和/或油的磨制级分。
漆酶
在本发明的语境中，术语“漆酶”包括由酶类别E.C.1.10.3.2所包含的酶。优选的是下述的酶以及具有同源序列的酶，特别是重组的和/或基本上纯化的酶。
所述漆酶可源自任何来源，优选来自微生物，如真菌或细菌。优选地，所用的漆酶源自多孔菌属菌种(Polyporus sp.)的菌株，特别是Polyporus pinisitus或杂色多孔菌(Polyporus versicolor)的菌株，或毁丝霉属菌种(Myceliophthera sp.)，例如嗜热毁丝霉(M.thermophila)的菌株，或丝核菌属菌种(Rhizoctonia sp.)的菌株，特别是Rhizoctonia praticola或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的菌株，或盐肤木属物种(Rhus sp.)，特别是木蜡树(Rhusvernicifera)的株。
在本发明的具体实施方案中，氧化还原酶是WO 96/00290中描述的Polyporus pinisitus漆酶(也称长绒毛栓菌(Trametes villosa)漆酶)、WO95/33836中描述的嗜热毁丝霉漆酶，或者具有与这些序列中任一同源的氨基酸序列的漆酶。
进一步，漆酶可以是柱顶孢属菌种(Scytalidium sp.)漆酶，如WO 95/33837中描述的嗜热柱顶孢(S.thermophilium)漆酶，或梨孢属菌种(Pyricularia sp.)漆酶，如能够以商品名SIGMA no.L5510购自SIGMA的稻梨孢/稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)漆酶，或鬼伞属菌种(Coprinus sp.)漆酶，如灰盖鬼伞(C.cinereus)漆酶，特别是灰盖鬼伞IFO 30116漆酶，或丝核菌属菌种漆酶，如立枯丝核菌漆酶，特别是WO 95/07988中描述的中性立枯丝核菌漆酶。
在优选的实施方案中，漆酶是来自嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)(MtL)的、具有作为GENESEQP：AAR88500保藏并在本文显示为SEQ ID NO：3的氨基酸序列的漆酶，来自Polyporuspinsitus(PpL)的、具有作为UNIPROT：Q99044保藏并在本文显示为SEQ ID NO：4的氨基酸序列的漆酶，来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)ScL的、具有作为SWISSPROT：Q9XAL8保藏并在本文显示为SEQ ID NO：5的氨基酸序列的漆酶，或具有与这些序列中的任一同源的氨基酸序列的漆酶。
漆酶必需以有效量存在于要解毒的介质中。漆酶优选以0.01-100mg酶蛋白每kg干物质，优选0.1-10mg酶蛋白每kg干物质，或更优选1-5mg酶蛋白每kg干物质的浓度存在。
介体(mediator)
在施用漆酶的一个实施方案中，充当电子的介体可与漆酶一起使用。所述介体应该以有效量存在于要解毒的介质中。
已知多种介体；参见例如WO9412620、WO9412621、WO9501626、WO9600179和WO9923887。将其中的介体通过提述并入本文。
优选用于本发明的是选自以下的介体：丁香酸甲酯(methylsyringate)(MES)、吩噻嗪-10-丙酸(phenothiazine-10-propionicacid)(PPT)、n-(4-氰基苯基)乙酰氧肟酸(n-(4-cyanophenyl)acetohydroxamic acid)(NCPA)、乙酰丁香酮(acetosyringone)、丁香醛(syringaldehyde)、对香豆酸(p-coumaric acid)、2，2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2，2′-Azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate))、1-羟基苯并***(1-hydroxybenzotriazole)、2，4-戊二酮和吩噻嗪。
所述介体是商业上可得到的或能够通过本领域已知方法制备的。
角质酶
在本发明的语境下，术语“角质酶”包括酶分类EC 3.1.1.74所包括的酶。优选的是下面提及的酶以及具有同源序列的酶，特别是重组的和/或基本上纯化的酶。
所述角质酶可来自微生物，优选来自真菌或细菌。具体而言，所述角质酶可来自腐质霉属(Humicola)，特别是特异腐质霉(H.insolens)的菌株，更具体为特异腐质霉菌株DSM1800(US 5,827,719)，或来自镰孢属(Fusarium)，例如，大刀粉红镰孢(F.roseum culmorum)，或具体为腐皮镰孢豌豆专化型(Fusarium solani f.sp.pisi)的菌株(WO90/09446；WO94/14964，WO94/03578)。所述真菌角质酶亦可源自丝核菌属的菌株，例如，立枯丝核菌(R.solani)，或链格孢属(Alternaria)的菌株，例如，芸薹生链格孢(A.brassicicola)(WO94/03578)。
优选的是示于SEQ ID NO：1的角质酶；特异腐质霉角质酶(对应于US5,827,719中SEQ ID NO：2的成熟部分，以及WO 01/92502的SEQ ID NO：1的成熟部分)，以及示于SEQ ID NO：2的角质酶；根据WO 94/14964图1D的腐皮镰孢豌豆专化型，以及具有与这些序列中的任一同源的氨基酸序列的漆酶。
所述角质酶亦可为亲本角质酶的变体，如描述于WO 00/34450或WO01/92502中的那些，其全部通过提述并入本文。所述角质酶可为包含下述取代的特异腐质霉角质酶：E6Q、G8D、A14P、N15D、E47K、S48E、R51P、A88H、A91H、A130V、E179Q和R189V，其在WO 2001/092502的24页11行中公开，并用于本文的实施例1。
所述角质酶必须以有效量存在于要解毒的介质中。所述角质酶优选以0.01-100mg酶蛋白质每kg干物质，优选0.1-10mg酶蛋白质每kg干物质，或更优选1-5mg酶蛋白质每kg干物质的浓度存在。
羧肽酶
在本发明的语境下，术语“羧肽酶“指剪切肽或多肽链C-末端肽键的酶。该组酶包括但不仅限于归类为酶亚类EC 3.4.16，丝氨酸型羧肽酶的酶。
优选的是下面提及的酶，特别是重组和/或基本上纯化的酶。所述羧肽酶可源自任何来源，优选来自微生物，如真菌或细菌。在优选实施方案中，所述羧肽酶源自米曲霉，优选如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中所示的羧肽酶。
所述羧肽酶必须以有效量存在于要解毒的介质中。所述羧肽酶优选以每kg干物质0.01-100mg酶蛋白质，优选每kg干物质0.1-10mg酶蛋白质，或更优选每kg干物质1-5mg酶蛋白质的浓度存在。
介质(medium)
在一个实施方案中，酶降解包含饲料产物的介质中的黄曲霉毒素。所述介质优选是水性的并且可以是液体、糊剂(paste)或浆。为了形成合适的介质，可以向饲料产物加入水。酶以及(如果有关的话)介体可以分别或一起包含在适合施用于所述介质的固态或液态配制物中。
本发明的解毒效力依赖于例如介质的氧的可用性、pH、温度和缓冲液。例如，可以在实际酶的相对活性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或甚至至少90％的pH值进行处理。同样，例如，可以在实际酶的相对活性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或甚至至少90％的温度进行处理。相对活性是相对于观察到最高活性的pH值的活性计算的。
介质中的氧
当使用漆酶时，所需的氧的来源可以是来自大气的氧或用于原位产生氧的氧前体。来自大气的氧会通常以充足的量存在。如果需要更多的O2，可以加入额外的氧，例如，作为加压的大气或作为加压的纯氧。
介质中的pH
依赖于所采用的酶的特征及其他因素，所用介质的pH应通常在5-11的范围内，优选在6-10的范围内，例如6.5-8.5。
介质中的温度
优选使用接近于用于酶的最适温度的反应温度。在本发明的多个实施方案中，应使用10-65℃，更优选30-50℃范围内的温度。
处理持续时间
处理的持续时间依赖于处理类型、要处理的产物(item)的类型、介质的性质(例如温度和pH)和所用的酶的类型和量等。
酶反应持续进行直到达到期望的结果，其后可以或可以不通过使酶失活(例如，通过热处理步骤)终止所述酶反应。
为了解毒的目的，可以使用范围在1分钟至1周的处理时间。在许多情况下，6-48小时范围内的处理时间是合适的。
通过本发明的方法，饲料产物中黄曲霉毒素的含量相对于采用该方法之前的水平优选减少到少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于15％、少于10％或甚至少于5％，如少于4、3、2或甚至1％。
同一性
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性用参数“同一性”描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定的。所用的任选参数是：缺口产生罚分(gapopen penalty)为10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记为“longest identity”(“最长同一性”)的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并且该输出结果是如下计算的：
(相同的残基数x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，见上文)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定的。所用的任选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记为“longest identity”(“最长同一性”)的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并且该输出结果是如下计算的：
(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
同源序列
术语“同源序列”定义为在使用指定序列进行的tfasty检索(Pearson，W.R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，185-219页)中给出的E值(或期望得分)小于0.001的预测蛋白。
术语“同源序列”也可以定义为与指定序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性程度的序列。
实施例
材料和方法
酶
角质酶，其为SEQ ID NO：1所示的特异腐质霉角质酶中具有如下取代的变体：E6Q、G8D、A14P、N15D、E47K、S48E、R51P、A88H、A91H、A130V、E179Q和R189V。
来自嗜热毁丝霉的漆酶(MtL)，其具有在本文如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
来自天蓝色链霉菌的漆酶(ScL)，其具有在本文如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的漆酶。
来自Polyporus pinsitus的漆酶(PpL)，其具有在本文如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
来自米曲霉的羧肽酶(CPY)，其具有在本文如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
介体
丁香酸甲酯(MeS)
吩噻嗪-10-丙酸(PPT)
测定法：反应在Eppendorf管中的600微升体积中进行，其中包含黄曲霉毒素30μM、乙酸钠100mM和酶0.1mg EP/mL。在涉及漆酶的反应中，还包括0.2mM介体。在对照反应中，将酶体积用等量H2O替代。将反应在37℃温育24小时，其后通过加入600μL的100μM乙腈终止溶液来终止反应。将反应储存在-20℃直到进行层析分析。
层析分析：将样品离心并通过HPLC-DAD如Smedsgaard(J.Chromatogr.A，1997，760，264-270)所述分析上清液的黄曲霉毒素。DAD扫描从200-600nm。在Phenomenex(Torrance，CA)Luna C18(2)10×2mm ID，3μm，柱2上在20分钟使用从5％到100％乙腈的线性梯度进行分离。相对于对照计算残余的黄曲霉毒素。
实施例1
表1.在用3种漆酶(MtL、PpL或ScL)和作为介体的MeS在pH 4.5
或pH 7.0温育24小时后残余的黄曲霉毒素
Figure BPA00001214285900091
Figure BPA00001214285900101
实施例2
表2.用角质酶在pH 4.5或pH 7.0下温育24小时后的残余黄曲霉毒素
Figure BPA00001214285900102
实施例3
表3.用羧肽酶在pH 4.5下温育24小时后的残余黄曲霉毒素
Figure BPA00001214285900103
Figure IPA00001214285200011
Figure IPA00001214285200021
Figure IPA00001214285200031
Figure IPA00001214285200041
Figure IPA00001214285200061
Figure IPA00001214285200071
Figure IPA00001214285200081
Figure IPA00001214285200091
Figure IPA00001214285200101

Claims (16)

1.一种从植物材料产生饲料产物的方法，所述方法包括用降解黄曲霉毒素的酶处理所述植物材料以产生黄曲霉毒素水平降低的饲料产物。
2.一种在植物材料中降解黄曲霉毒素的方法，所述方法包括用酶处理所述植物材料。
3.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述植物材料是发酵方法的醪液或湿磨方法中的谷粒。
4.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述植物材料是饲料产物。
5.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述酶是漆酶。
6.前述权利要求中任一所述的方法，其中使用了介体。
7.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述介体是丁香酸甲酯或吩噻嗪-10-丙酸。
8.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述酶是角质酶。
9.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述角质酶是具有SEQ ID NO：1所示的序列或同源序列的角质酶。
10.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述角质酶是SEQ ID NO：1所示角质酶中包含G8D、N15D、S48E、A88H、N91H、A130V和R189V取代中的一种或多种，优选包括所有取代的变体。
11.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述是羧肽酶。
12.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述羧肽酶是具有SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6所示的序列或其同源序列的羧肽酶。
13.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述饲料产物包括选自玉米、小麦、大麦、黑麦、稻、高粱和黍的一种或多种组分。
14.前述权利要求中任一所述的方法，其中所述饲料产物包括酿酒酒糟(brewers spent grain)、蒸馏酒糟(distillers’spent grain)、蒸馏湿酒糟(distillers’wet grain)和/或蒸馏干酒糟(distillers’dried grain)。
15.酶用于降解饲料产物中的黄曲霉毒素的用途。
16.前述权利要求中的用途，其中所述酶选自下组：角质酶、漆酶和羧肽酶。
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