ES2707288T3 - Partículas de vectores lentivíricos que tienen eficiencia de transducción mejorada para células que expresan DC-SIGN - Google Patents

Partículas de vectores lentivíricos que tienen eficiencia de transducción mejorada para células que expresan DC-SIGN Download PDF

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Abstract

Un método para generar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que comprende: (a) cultivar en un medio de cultivo que comprende kifunensina, una célula de empaquetamiento de virus que comprende: (1) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de interés expresable, (2) a polinucleótido que codifica una glicoproteína de la envuelta de alfavirus que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN y (3) un polinucleótido que codifica una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1; y (b) aislar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, en donde dichas partículas de vectores lentivíricos están más altamente manosiladas en comparación con una composición de control de las mismas partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas preparadas en ausencia de un inhibidor de manosidasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Partículas de vectores lentivíricos que tienen eficiencia de transducción mejorada para células que expresan DC-SIGN
Campo de la invención
La presente descripción se refiere a materiales y métodos útiles para generar partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas mejoradas.
Antecedentes
Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígenos esenciales para el inicio y el control de las respuestas inmunitarias. Las DC pueden capturar y procesar antígenos, migrar desde la periferia a un órgano linfoide y presentar los antígenos a células T en reposo en una forma restringida del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Estas células derivan de la médula ósea (BM) y presentan morfología dendrítica y alta movilidad. El descubrimiento de DC como células presentadoras de antígenos (APC) especializadas ha impulsado intentos de estrategias de inmunización/vacunación basadas en DC que implican dirigir DC para presentar antígenos específicos. Se han desarrollado vectores basados en virus recombinantes como un mecanismo para suministrar directamente un gen que codifica un antígeno/antígenos designados a células hospedantes. Mediante la inducción de una respuesta inmunitaria adaptativa deseada, el producto génico expresado proporciona un beneficio terapéutico.
Los desafíos para lograr un sistema seguro y eficaz incluyen diseñar un vector que se dirija eficazmente a un conjunto de células hospedantes deseado, proporcionar un sistema de suministro adecuado y expresar un antígeno deseado que produzca una respuesta inmunitaria eficaz de modo que se pueda usar ampliamente en toda una población de sujetos humanos designados.
Las glicoproteínas de la envuelta del virus Sindbis y otros alfavirus descritos en la presente memoria se incorporan en la bicapa lipídica de la membrana de partículas víricas. Típicamente, la membrana vírica (envuelta) incluye múltiples copias de trímeros de dos heterodímeros de glicoproteínas, E1 y E2, que se producen por escisión de una sola proteína precursora. La proteína precursora comprende, desde su extremo N a C, las proteínas E3, E2, 6K y E1. La glicoproteína E3 pequeña sirve como una secuencia señal para la traslocación de la proteína E2 en la membrana, y es escindida de E2 por la furina o alguna otra serina proteinasa dependiente de Ca2+. La proteína 6K sirve como una secuencia señal para la traslocación de la proteína E1 en la membrana y después es escindida de la proteína precursora. Los documentos WO 2008/011636 y US 2011/0064763 describen sistemas de empaquetamiento lentivíricos.
Breve resumen de la invención
Los autores de la invención han descubierto que las partículas de vectores lentivíricos que presentan dos características (a) pseudotipadas con una glicoproteína de alfavirus altamente manosilada y (b) que comprenden una proteína Vpx, tienen una eficacia de transducción inesperadamente mejorada para las células que expresan DC-SIGN. Estas partículas infectan células que expresan DC-SIGN, en particular células dendríticas, significativamente más eficazmente que las partículas de vectores lentivíricos que tienen solo una de estas dos características.
La presente invención proporciona un método para generar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que comprende: (a) cultivar, en un medio de cultivo que comprende kifunensina, una célula de empaquetamiento de virus que comprende: (1) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia expresable de interés, (2) un polinucleótido que codifica una glicoproteína de la envuelta de alfavirus que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, y (3) un polinucleótido que codifica una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1; y (b) aislar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, en donde dichas partículas de vectores lentivíricos están más altamente manosiladas en comparación con una composición de control de las mismas partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas preparados en ausencia de un inhibidor de manosidasa. La presente descripción también expone ("proporciona") una serie de composiciones y métodos como se describe a continuación en la presente memoria. Sin embargo, la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
En casos particulares, se proporcionan partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas altamente manosiladas que comprenden una proteína Vpx y un genoma lentivírico que comprende una secuencia de interés (p. ej., un polinucleótido que codifica un antígeno).
Métodos para generar partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas.
Un aspecto de la descripción proporciona un método para generar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que comprende: (a) cultivar en un medio de cultivo con kifunensina una célula de empaquetamiento de virus que comprende: (1) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno exógeno, (2) un polinucleótido que codifica una glicoproteína de alfavirus que se une preferentemente a células que expresan DC-SIGn, y (3) un polinucleótido que codifica un inhibidor de SAMHD1; y (b) aislar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que se une preferentemente a células que expresan DC-SIGN.
Otro aspecto de la descripción proporciona un método para generar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que comprende: (a) cultivar en un medio de cultivo que comprende kifunensina una célula de empaquetamiento de virus que comprende: (1) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno exógeno, (2) un polinucleótido que codifica una glicoproteína E2 de Sindbis que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, y (3) un polinucleótido que codifica una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1; y (b) aislar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN. En algunas realizaciones, la glicoproteína E2 es 90% idéntica a la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1]. En algunas realizaciones, (i) el resto 160 de la glicoproteína E2 está ausente o es un aminoácido distinto del ácido glutámico, (ii) uno o más de los restos 70, 76 o 159 de la variante de glicoproteína E2 es un resto no básico, y (iii) la variante de la glicoproteína E2 no es parte de una proteína de fusión con la glicoproteína E3 del virus Sindbis. En algunas realizaciones, la glicoproteína E2 es la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1].
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44).
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46), o HIV-2 Vpx (SEQ ID NO: 47).
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la proteína Vpr comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SeQ ID NO: 49).
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el antígeno es un antígeno específico de tumor o un antígeno específico de virus. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el antígeno específico de tumor se selecciona del grupo que consiste en NY-ESO-1, MAGE, p. ej., MAGE-A3 y MAGE-A1, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa, p. ej., TRP2, antígeno de carcinoma de células renales, 5T4, SM22-alfa, anhidrasa carbónica I, anhidrasa carbónica IX (también conocida como G250), HIF-1alfa, HIF-2alfa, VEGF, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno específico de la próstata (PSA), fosfatos de ácido prostático, antígeno epitelial de la próstata con seis dominios transmembranales (STEAP), NKX3.1, enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reordenamiento bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado, p53 de tipo natural, citocromo P4501B1, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, proteína E6 del papilomavirus humano, proteína E7 del papilomavirus humano, antígeno carcinoembrionario, oncoproteínas de antígeno T del virus de células de Merkel y alfa-fetoproteína. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el antígeno específico de virus es un antígeno del HIV, un antígeno del SIV, un antígeno de adenovirus, un antígeno de enterovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de calicivirus, un antígeno de virus del moquillo, un antígeno de virus del Ébola, un antígeno de flavivirus, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno del herpesvirus, un antígeno de virus de la peritonitis infecciosa, un antígeno del influenzavirus, un antígeno de virus de la leucemia, un antígeno de virus de Marburg, un antígeno del ortomixovirus, un antígeno del papilomavirus, un antígeno de virus parainfluenza, un antígeno del paramixovirus, un antígeno de parvovirus, un antígeno de pestivirus, un antígeno de picornavirus, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus de la viruela, un antígeno de poliomavirus, un antígeno de virus de la rabia, un antígeno de reovirus, un antígeno de retrovirus o un antígeno de rotavirus.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo antígeno. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el primer y segundo antígeno son expresados como una proteína de fusión que comprende un péptido A2 de autoescisión entre los dos antígenos. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el péptido A2 de autoescisión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o la SEQ ID NO: 57. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el primer antígeno es MAGE-A3 y el segundo antígeno es NY-ESO-1.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 1 mg/ml. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la célula de empaquetamiento del virus comprende, además: (i) un polinucleótido que comprende los genes gag y pol; y (ii) un polinucleótido que codifica una proteína rev. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, los genes gag y pol son codones optimizados humanos y comprenden una ventana no optimizada alrededor de la posición 1228 a 1509 de la SEQ ID NO: 54. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el polinucleótido que comprende los genes gag y pol carece de un elemento de respuesta a rev (RRE) funcional. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el polinucleótido que comprende los genes gag y pol carece de un RRE funcional porque el RRE se ha eliminado. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el gen pol codifica una enzima integrasa inactiva. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la enzima integrasa tiene una mutación D64V. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el polinucleótido que codifica la proteína Vpx o la proteína Vpr está en el mismo o diferente plásmido que el polinucleótido que codifica la proteína rev, o el polinucleótido que comprende los genes gag y pol.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico se obtiene de HIV-1.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico tiene una repetición terminal larga 3' (LTR) inactivada o una repetición terminal larga 3' (LTR) autoinactivante. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico comprende un elemento U3 que carece de al menos una secuencia de potenciador, una caja TATA, un sitio Sp1, un sitio NK-kappa B o un tramo de polipurina (PPT).
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 21 [vector SIN], 22 [vector 703] o 23 [vector 704].
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de maduración/estimulación de células dendríticas. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el factor de maduración/estimulación de las células dendríticas se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 y CD40 inducible por fármaco.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno está operativamente unida a un promotor seleccionado del grupo que consiste en el promotor de ubiquitina-C humana (UbiC), el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y el promotor sensible a tetraciclinas. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el promotor es un promotor deficiente en intrones. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el promotor deficiente en intrones es una UbiC
Aspectos relacionados de la descripción proporcionan una partícula de vector lentivírico producida por cualquiera de los métodos mencionados antes.
Composiciones que comprenden partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas.
Otro aspecto de la descripción proporciona una composición que comprende partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que comprenden (a) un inhibidor de SAMHD1, (b) un polinucleótido exógeno que codifica un antígeno, y (c) una glicoproteína de envuelta que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, en donde al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90% de los glicanos unidos a N en dicha composición comprenden una estructura Man5 a Mang, preferiblemente Mang.
Otro aspecto de la descripción proporciona una composición que comprende partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que comprenden (a) una proteína Vpx, (b) un polinucleótido exógeno que codifica un antígeno, y (c) una glicoproteína de envuelta que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, en donde al menos el 80% de los glicanos unidos a N en dicha composición comprenden una estructura Mang.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la proteína SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44).
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46), o HIV-2 Vpx (SEQ ID NO: 47).
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la proteína Vpr comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SeQ ID NO: 49). En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la partícula de vector lentivírico pseudotipada infecta células dendríticas que expresan DC-SIGN con una eficacia de transducción in vitro de al menos 1%, o al menos 5%, o al menos 10%, o al menos 20%. Véase, p. ej., el procedimiento del ejemplo 8.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la glicoproteína es una glicoproteína E2 del virus Sindbis. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la glicoproteína E2 tiene al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1]. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, (i) el resto 160 de la glicoproteína E2 está ausente o es un aminoácido distinto del ácido glutámico, (ii) uno o más de los restos 70, 76 o 159 de la variante de la glicoproteína E2 es un resto no básico, y (iii) la variante de la glicoproteína E2 no es parte de una proteína de fusión con la glicoproteína E3 del virus Sindbis.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el antígeno es un antígeno específico de tumor o un antígeno específico de virus. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el antígeno específico de tumor se selecciona del grupo que consiste en NY-ESO-1, MAGE, p. ej., MAGE-A3 y MAGE-A1, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa, p. ej., TRP2, antígeno de carcinoma de células renales, 5T4, SM22-alfa, anhidrasa carbónica I, anhidrasa carbónica IX (también conocida como G250), HIF-1alfa, HIF-2alfa, VEGF, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno específico de la próstata (PSA), fosfatos de ácido prostático, antígeno epitelial de la próstata con seis dominios transmembranales (STEAP), NKX3.1, enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reordenamiento bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado, p53 de tipo natural, citocromo P4501B1, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, proteína E6 del papilomavirus humano, proteína E7 del papilomavirus humano, antígeno carcinoembrionario, oncoproteínas de antígeno T del virus de células de Merkel y alfa-fetoproteína. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el antígeno específico de virus es un antígeno del HIV, un antígeno del SIV, un antígeno de adenovirus, un antígeno de enterovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de calicivirus, un antígeno de virus del moquillo, un antígeno de virus del Ébola, un antígeno de flavivirus, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno del herpesvirus, un antígeno de virus de la peritonitis infecciosa, un antígeno del influenzavirus, un antígeno de virus de la leucemia, un antígeno de virus de Marburg, un antígeno del ortomixovirus, un antígeno del papilomavirus, un antígeno de virus parainfluenza, un antígeno del paramixovirus, un antígeno de parvovirus, un antígeno de pestivirus, un antígeno de picornavirus, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus de la viruela, un antígeno de virus de la rabia, un antígeno de reovirus, un antígeno de retrovirus o un antígeno de rotavirus.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo antígeno. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el primer y segundo antígeno son expresados como una proteína de fusión que comprende un péptido A2 de autoescisión entre los dos antígenos. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el péptido A2 de autoescisión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 57. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el primer antígeno es NY-ESO-1 y el segundo antígeno es MAGE-A3.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico se obtiene de HIV-1.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico tiene una repetición terminal larga 3' (LTR) inactivada o una repetición terminal larga 3' (LTR) autoinactivante. En algunos aspectos, el genoma del vector lentivírico comprende un elemento U3 que carece de al menos una secuencia de potenciador, una caja TATA, un sitio Sp1, un sitio NK-kappa B o un tramo de polipurina (PPT).
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 21 [vector SIN], 22 [vector 703] o 23 [vector 704].
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de maduración/estimulación de células dendríticas. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el factor de maduración/estimulación de las células dendríticas se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL- 21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 y CD40 inducible por fármaco.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno está operativamente unida a un promotor seleccionado del grupo que consiste en el promotor de ubiquitina-C humana (UbiC), el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y el promotor sensible a tetraciclina. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el promotor es un promotor deficiente en intrones. En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el promotor deficiente en intrones es un promotor de ubiquitina-C humana (UbiC).
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas tienen una UI de al menos 105/ml.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la composición comprende además un agente inmunoestimulador.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, la composición comprende además un adyuvante. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, los adyuvantes incluyen alumbre o monofosforil lípido A (MPL) 3 Des-O-acilado. Las clases de adyuvantes descritas en la presente memoria incluyen (a) sales de aluminio, (b) formulaciones de emulsión de aceite en agua, opcionalmente con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos, tales como péptidos de muramilo u otros componentes de la pared celular bacteriana, (c) adyuvantes de saponina, incluyendo ISCOM (complejos inmunoestimuladores) e ISCOMATRIX; (d) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (e) citoquinas; y (f) adyuvantes de fórmula (I).
Figure imgf000006_0001
en donde los restos A1 y A2 se seleccionan independientemente del grupo de hidrógeno, fosfato y sales de fosfato. Sodio y potasio son contraiones de ejemplo para las sales de fosfato. Los restos R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo de hidrocarbilo que tiene de 3 a 23 carbonos, representado por C3-C23. Para mayor claridad, se explicará que cuando un resto se selecciona "independientemente de" un grupo específico que tiene varios miembros, debe entenderse que el miembro elegido para el primer resto no tiene impacto ni limita de ninguna manera la elección del miembro seleccionado para el segundo resto. Los átomos de carbono a los que se unen R1, R3, R5 y R6 son asimétricos y, por lo tanto, pueden existir en la estereoquímica R o S. En una realización todos esos átomos de carbono tienen la estereoquímica R, mientras que en otra realización todos esos átomos de carbono tienen la estereoquímica S.
En varias realizaciones de la descripción, el adyuvante tiene la estructura química de la fórmula (I) pero los restos A1, A2, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan de subconjuntos de las opciones proporcionadas previamente estos restos, donde estos subconjuntos se identifican a continuación por E1, E2, etc.
E1: A1 es fosfato o sal de fosfato y A2 es hidrógeno.
E2: R1, R3, R5 y R6 son alquilo D21; y R2 y R4 son hidrocarbilo C5-C23.
E3: R1, R3, R5 y R6 son alquilo D17; y R2 y R4 son hidrocarbilo C7-C19.
R1, R3, R5 y R6 son alquilo D15; y R2 y R4 son hidrocarbilo C9-C17.
R1, R3, R5 y R6 son alquilo 13; y R2 y R4 son hidrocarbilo C11-C15.
R1, R3, R5 y R6 son alquilo 15; y R2 y R4 son hidrocarbilo C11-C17.
R1, R3, R5 y R6 son alquilo D13; y R2 y R4 son hidrocarbilo C9-C15.
R1, R3, R5 y R6 son alquilo ■C20; y R2 y R4 son hidrocarbilo C12-C20.
R1, R3, R5 y R6 son alquilo y R2 y R4 son hidrocarbilo C13.
E10: R1, R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo.
En ciertas opciones, cada uno de E2 a E10 se combina con la realización E1, y/o los grupos hidrocarbilo de E2 a E9 son grupos alquilo, preferiblemente grupos alquilo de cadena lineal. Un adyuvante preferido es E1 en combinación con E10, donde (i) A1 es fosfato o sal de fosfato y A2 es hidrógeno y (ii) R1, R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, las glicoproteínas de la envuelta también se unen a células que expresan SIGNR1 de ratón.
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas también transducen más eficazmente células que expresan SIGNR1 de ratón en comparación con células que no expresan SIGNR1 de ratón.
Otras características y ventajas de la presente descripción se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones específicas de la descripción, se proporcionan solo a modo de ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la descripción serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A y 1B ilustran la capacidad de las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas producidas en presencia de diferentes inhibidores de la manosidasa (p. ej., kifunensina, DMNJ y swainsonina) para infectar células HT1080 que expresan de manera estable el receptor DC-SIGN (1A) o carecen de DC-SIGN (1B). La eficacia de la infección se evaluó determinando la expresión de la GFP a partir del vector lentivírico. El eje y es el porcentaje de células positivas para GFP.
Las figuras 2A y 2B ilustran la capacidad de las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas producidas en presencia de DMNJ 400 pg/ml o diferentes concentraciones de kifunensina, para infectar células HT1080 que expresan de manera estable el receptor DC-SIGN (2A) o que carecen de DC-SlGN (2B). La eficacia de la infección se evaluó como en la figura 1.
La figura 3A es un diagrama que ilustra la especificidad del sustrato para PNGasaF y EndoH. La PNGasaF es una endoglicosidasa general que escindirá toda la glicosilación unida a N, independientemente del perfil de glicosilación. La EndoH es una endoglicosidasa especializada que solo escindirá glucosilación unida a N con alto contenido de manosa. La EndoH solo escinde glicosilación unida a N con alto contenido en manosa (es decir, EndoH se dirigirá a 2 de 4 sitios en SINVarl en ausencia de kifunensina, y a 4 de 4 sitios en SINVarl en presencia de kifunensina). La figura 3B ilustra los resultados de un experimento para determinar el estado de glicosilación de las glicoproteínas en partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas producidas en presencia de kifunensina o DMNJ usando desplazamientos en gel mediante realización en un gel de SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo contra la envuelta vírica de Sindbis.
La figura 4A ilustra la capacidad de las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas producidas en presencia de DMNJ 400 pg/ml o diferentes concentraciones de kifunensina, para infectar células HT1080 que expresan de manera estable el receptor DC-SIGN. La eficacia de la infección se evaluó como en la figura 1. La figura 4B ilustra los resultados de un experimento para determinar el estado de glicosilación de la glicoproteína E2 en partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas producidas en la figura 4A.
La figura 5A es una transferencia Western (anti-HA) de SlVmacVpx marcada con HA expresada en células 293T. Se clonó en un vector de expresión de mamífero dirigido por un promotor de CMV (construcción denominada pENV-SlVmacVpx). La figura 5B es una transferencia Western (anti-HA) de extractos de proteínas víricas de partículas víricas que comprenden SlVmacVpx marcada con HA. Se cargaron 100 ng de p24 por pocillo en un gel para inmunotransferencia con anticuerpo anti-HA. Se usó anticuerpo anti-p24 como un control de carga.
La figura 6 es un diagrama de dispersión de sucesos de transducción medidos por selección en células dendríticas que eran positivas para CD11c y evaluación del porcentaje de células positivas para GFP (eje x; como resultado de infección por el lentivirus de integración defectuosa, pseudotipado VSV-G con o sin Vpx) con DC-SIGN en el eje y. La figura 7 es un diagrama de dispersión de sucesos de transducción medidos por selección en células dendríticas que eran positivas para CD11c y evaluación del porcentaje de células positivas para GFP (eje x; como resultado de la infección por el lentivirus de integración competente, pseudotipado VSV-G con o sin Vpx) con DC-SIGN en el eje y.
La figura 8 es un diagrama de dispersión de sucesos de transducción medidos por selección en células dendríticas infectadas con lentivirus de integración defectuosa, pseudotipado SINvarl con o sin Vpx y producido en la presencia de ausencia de kifunensina. El eje y mide las células que eran positivas para CD11c o DC-SIGN y el eje x mide el porcentaje de células positivas para GFP.
La figura 9A es una transferencia Western de glicoproteínas del virus Sindbis preparadas de acuerdo con el ejemplo 1 sin tratamiento (bandas 1-3), DMNJ 400 pg/ml (bandas 4-6), o 1 pg/ml de kifunensina (bandas 7-9 ). Las partículas no se trataron con endoglicosidasa (bandas 1, 4, 7), se incubaron con EndoH durante 1 hora (bandas 2, 5, 8) o se incubaron con PNGasaF durante 1 hora (bandas 3, 6, 9). Las muestras después se analizaron usando un ensayo de desplazamiento en gel e inmunotransferencia con anticuerpo contra la envuelta del virus Sindbis. La figura 9B (sin inhibidor de manosidasa) es un perfil de intensidad de cada banda de las bandas 1-3 y su ubicación en la banda. La figura 9C (tratado con DMNJ) es un perfil de intensidad de cada banda de las bandas 4-6 y su ubicación en la banda. La figura 9D (tratada con kifunensina) es un perfil de intensidad de cada banda de las bandas 7-9 y su ubicación en la banda.
Para la figura 10A, se transdujeron células 293T huDC-SIGN con vectores empaquetados con integrasa de tipo natural (WT) o defectuosa (D64V) y un genoma de vector que contenía 3'PPT extendido (703) o eliminación de 3'PPT (704). A las 48 horas después de la transducción, se llevó a cabo un análisis de Alu-PCR anidado en el ADN genómico extraído de las células transducidas. Las barras de error indican el error estándar de la media de las transducciones realizadas por triplicado. Las figuras 10B y 10C demuestran la tasa de integración de los vectores WT/703 y D64V/704 que codifican GFP-T2A-NeoR usando dos métodos independientes. Para la figura 10B, se transdujeron células HT1080 huDC-SIGN con diluciones seriadas de los vectores indicados. Las células transducidas se cultivaron bajo selección con G418 y se contaron las colonias resistentes a neomicina, que representan sucesos de integración individuales. Los sucesos de integración se calcularon como se describe en el ejemplo 10. Para la figura 10C, se transdujeron células HT1080 huDC-SIGN con los vectores indicados. Se llevó a cabo citometría de flujo en múltiples tiempos de medición después de la transducción para determinar el porcentaje de células que expresan GFP. Las barras de error indican el error estándar de la media de la citometría de flujo por triplicado.
Figura 11: PBMC humanas se trataron con GM-CSF e IL-4 durante 3 días, después se incubaron con 20 ng de p24 de ID-VP02 que codifica GFP. En el momento de la adición del vector, el cultivo consistía principalmente en DC, células B y células T. Tres días después de la transducción, se analizaron en las células los marcadores de superficie y se clasificaron como DC (CD11cpos) 6%, células B (CD11cneg, CD19pos) 10% o células T (CD11cneg, cD3£pos) 80%. Los sucesos de transducción se midieron evaluando el porcentaje de células positivas para GFP dentro de cada población de células. Los números en las gráficas son el porcentaje de células dentro de la selección de GFP+.
Figura 12: Se representa una parte del genoma vectorial (arriba) que contiene repeticiones terminales largas (LTR) en cada extremo. Los sitios del donador de empalme (SD) y del aceptador de empalme (SA) flanquean la señal de empaquetamiento psi (V), la secuencia de gag parcial y el elemento de respuesta a Rev (RRE). Los componentes entre el promotor de antígeno (Promotor) y la LTR 3' no se resaltan y, por lo tanto, se usan las marcas de reducción (//). Se representa una parte de WT gag/pol (centro) que muestra los genes gag (recuadro negro) y pol (recuadro gris) seguidos por el r Re . Los dos componentes que son homólogos entre WT gag/pol y el genoma del vector (el RRE y los primeros 354 pb de gag) están representados entre paréntesis (no están dibujados a escala). La región hipotética de recombinación entre el genoma del vector y el Wt gag/pol se muestra con líneas de conexión. Se representa una parte de RI gag/pol (abajo) que muestra los genes gag y pol de codones optimizados (recuadros blancos para distinguirlos del tipo natural). El marco de lectura de codones no optimizados entre los genes gag y pol se representa en su secuencia de codones naturales (recuadros negros y grises superpuestas). Los cebadores usados para el ensayo de recombinación de psi-gag se muestran con sus ubicaciones aproximadas en los constructos. Los cebadores del primer ciclo de la PCR se representan con flechas cerradas y son las parejas 709 y 710 (para detectar el recombinante psi-gag) o 709 y 378 (para detectar el genoma del vector integrado). El amplicón esperado para el vector integrado con los pares de cebadores 709 y 378 es de 1697 pb. Los cebadores de la PCR anidada se representan con flechas abiertas y son las parejas 863 y 835 (para detectar psi-gag recombinante con WT gag/pol) u 863 y 864 (para detectar la recombinación de psi-gag con RI gag/pol). El amplicón esperado con cualquiera de los pares de cebadores recombinantes psi-gag es de 937 pb.
Figura 13: se transfectaron células 293T con plásmidos WT gag/pol o RI gag/pol en presencia del plásmido Rev (+) o plásmido de cadena principal vacía (-). Veinticuatro horas después, las células se lisaron y se analizó la expresión de proteínas Gag usando anticuerpo anti-p24. La proteína Gag sin procesar (p55) y p24 se indican con flechas. El lisado de células no transfectadas se incluyó como control. La carga igual de los pocillos se confirmó con anticuerpos anti-actina.
Figura 14A: el vector que codifica GFP se produjo con dos cantidades de plásmidos (6 |jg o 3 |jg) de WT gag/pol o RI gag/pol. Los niveles de p24 resultantes en el líquido sobrenadante del vector se muestran en la tabla. Figura 14B: se transdujeron células 293T con diluciones de 2 veces de vectores producidos en 14A y se analizó la expresión de GFP después de 2 días. Se calcularon las UFG/ml y se representaron en el eje y. La cantidad de jg del plásmido gag/pol usado para hacer el vector (6 jg o 3 jg ) se representa en el eje x. WT gag/pol y RI gag/pol se muestran en columnas negras o blancas respectivamente.
Figura 15: se inmunizaron ratones C57BL/6 con las dosis indicadas (2 * 107, 1 * 108, o 5 * 108 TU) de LV que codifica el vehículo de OVA o HBSS de longitud completa solo. Los LV eran de integración competente (INT+) o de integración deficiente (INT-) y se generaron con WT o RI gag/pol, como se indica. El día 12 después de inmunización, se midió el porcentaje de células T CD8 esplénicas específicas de OVA257 por ICS para IFN-y después de reestimulación del péptido ex vivo.
Figura 16: Se inmunizaron ratones C57BL/6 (5 por grupo) con 5 * 108 TU de LV de integración deficiente (INT-) generado con WT o RI gag/pol que codifica un antígeno poliepítopo (LV1b) que contiene el epítopo de célula T CD8 OVA257 restringido por H-2b y después se estimularon el día 28 después de la inmunización con 1 * 107 TCID50 virus de vacuna de cepa WR de tipo natural (VV-WT), virus vacuna de OVA recombinante de cepa WR ( rVV-OVA), o dejado sin estimular. El día 33 (día 5 después de la estimulación) se midió la carga vírica en los ovarios de cada animal por ensayo de TCID50.
Figura 17A: se transdujeron células 293T con los vectores WT gag/pol o RI gag/pol. Dos días después, se aisló el ADN genómico y se analizó el ADN provírico integrado por PCR usando los pares de cebadores 709 y 378 que se unen dentro del genoma del vector como se esquematiza en la figura 12. Los productos de la PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1%. El tamaño del amplicón del genoma del vector se indica con una flecha. No se incluyó control de molde en la PCR y el gel. Figura 17B: se analizó en el ADN genómico de la figura 17A recombinantes de psi-gag províricos con el primer ciclo de PCR seguido de una PCR anidada. El primer ciclo de PCR usó los pares de cebadores 709 y 710 que se unen en el genoma del vector y el marco de lectura dentro de gag/pol respectivamente. Se usó 1 |jl del producto del primer ciclo de la PCR como molde sin diluir (1:1), o con diluciones 1:100 o 1:1000 en una PCR anidada. Los pares de cebadores para la PCR anidada eran 863 y 835, u 863 y 864. El primer par (863, 835) se une al genoma del vector y a WT gag/pol respectivamente. El último par (863, 864) se une al genoma del vector y a RI gag/pol. Todos los cebadores y sus sitios de unión están esquematizados en la figura 12. Sólo se incluyeron controles de molde. Los productos de la PCR anidada resultantes se visualizaron en un gel de agarosa al 1%. El tamaño del amplicón del recombinante psi-gag se muestra con una flecha. Figura 17C: La banda de la PCR anidada para WT gag/pol (la banda brillante por debajo de 1 kb) se clonó en un vector TOPO-TA y se secuenció. La secuencia de la banda de recombinante WT gag/pol psi-gag se muestra con regiones marcadas para el alineamiento con el genoma del vector, gag parcial o WT gag/pol. Las barras dobles (//) y los puntos indican secuencias que no se muestran para simplificar. Los números en la secuencia indican la posición del nucleótido en el amplicón. Los pares de bases 1-414 del recombinante psi-gag se alinean con el genoma del vector, mientras que los pb 120-937 se alinea con el WT gag/pol. Para referencia, la secuencia parcial de gag son los pb 76-439 del recombinante. Figura 17D: La banda de la PCR anidada para RI gag/pol (banda débil entre 1 kb y 3 kb) se clonó en un vector TOPO-TA y se secuenció. La secuencia de la banda de recombinante RI gag/pol se muestra con regiones marcadas para el alineamiento con el genoma del vector o RI gag/pol. Los puntos indican secuencias que no se muestran por simplicidad. Los números en la secuencia indican la posición del nucleótido en el amplicón. Los pares de bases 1­ 1253 del recombinante RI se alinean con el genoma del vector, mientras que los pb 1254-1329 se alinean con el RI gag/pol. Para referencia, la secuencia parcial de gag son los pb 76-439 del recombinante. La secuencia completa y la alineación se muestran en (Figura complementaria S1B).
Figura 18: Células HT1080 y células HT1080 que expresan de manera estable (A) DC-SIGN humano (HT1080 huDC-SIGN), (B) SIGNR1 de ratón (HT1080 mSIGNR1), (C) SIGNR3 de ratón (HT1080 mSIGNR3) o (D) SIGNR5 de ratón (HT1080 mSIGNR5), se incubaron con un vector pseudotipado VSV-G de integración deficiente concentrado (1.000 veces) que codifica GFP, o vectores pseudotipados ID-VP02 que codifican GFP que se produjeron en ausencia o en presencia de kifunensina (kifu).
Figura 19A: La expresión de SIGNR1 y SIGNR5 en células de bazo y sistema linfático se analizó en sucesos de células individuales vivas. Se muestra el patrón de tinción de control que carece de anticuerpos específicos contra SIGNR1 o SIGNR5. Figura 19B: los sucesos de células individuales vivas de bazo y ganglios linfáticos se subdividieron en células B (B220+ TCRp-, R4 marcadas), células T (TCRp+, B220', R5 marcadas) y DC (B220‘ TCRp' MHC-II+ CD11chi, R7 marcadas) y posteriormente se analizó la expresión de SIGNR5 y SIGNR1. Para todos los subconjuntos, las frecuencias de sucesos positivos fueron < 0,00 en las tinciones de control negativo que carecen de anticuerpos específicos para SIGNR1 y SIGNR5.
Figura 20: se analizó el fenotipo de las células que expresan GFP en ganglios linfáticos drenantes después de inyección subcutánea con ID-VP02 que codifica GFP por citometría de flujo. Se inyectaron por vía subcutánea en ratones BALB/c hembra (15 por grupo) en la almohadilla de la pata 3x1010 genomas de ID-VP02 que codifican GFP, ID-VP02 de control que codifica una proteína no fluorescente, o se dejaron sin tratar. Cuatro días después, los ganglios linfáticos poplíteos y cervicales se agruparon por separado en 5 ratones (3 grupos por grupo de tratamiento) y se analizó la presencia de células que expresaban GFP. (A) Se analizó en sucesos individuales, vivos de los ganglios linfáticos poplíteos (drenantes) o cervicales (no drenantes) la expresión de GFP. Las células de los ganglios linfáticos poplíteos de ID-VP02 sin tratamiento previo o de control negativo sirvieron como controles negativos. (B) Se muestra la frecuencia de CD11c y MHC-II en sucesos GFP+ de los ganglios linfáticos poplíteos de ratones a los que se inyectó ID-VP02 que codifica GFP, como puntos negros sobrepuestos sobre el total de sucesos B220- TCRp-, que se muestran en gris, como referencia. (C) Expresión de SIGNR1 en sucesos GFP+ CD11c+ MHC-II+, que se muestran con (panel izquierdo) y sin (panel derecho) inclusión de anticuerpo específico para SIGNR1. Las estadísticas de regulación son el valor medio de tres repeticiones biológicas. Los valores en el panel (A) son el número de sucesos positivos por 1 * 106 células, mientras que todos los demás valores de regulación son porcentajes.
Figura 21: ratones C57BL/6 (3 por grupo) recibieron una única inyección subcutánea de 3 * 1010 genomas de ID-VP02 en la base de la cola. La biodistribución, determinada por la presencia de ADN de vector de transcripción inversa, de ID-VP02 en los tejidos indicados se evaluó por PCR cuantitativa a los 1, 4, 8, 21 o 42 días después de la inyección. Los ganglios linfáticos inguinales y cervicales están indicados como drenantes y no drenantes, respectivamente. El ADN de entrada se normalizó respecto a 200 ng. El límite de cuantificación (LOQ) de 10 copias por reacción se definió por el número de copia más bajo en la curva de referencia. Las muestras que no se amplificaron en 40 ciclos de qPCR se designaron como no detectadas (ND).
Figura 22: (A) Se inmunizaron ratones C57BL/6 con las dosis indicadas (genomas de vector) de ID-VP02 que codifican el vehículo OVA o HBSS de longitud completa solo. El día 12 después de inmunización, se midió el porcentaje de células T CD8 esplénicas específicas de OVA257 por ICS. (B) La cinética de la respuesta de las células T CD8 primarias y secundarias a ID-VP02 que codifica el OVA se determinó por inmunización de ratones (5 por grupo) con 1 x 1010 genomas de ID-VP02 en un régimen de sensibilización-refuerzo con un intervalo de 35 días y análisis de las respuestas de las células T CD8 esplénicas en los tiempos de medición indicados. Las inmunizaciones se escalonaron de manera que todos los grupos se analizaron por ICS el mismo día. (C) IFN-y, TNF-a, e IL-2 intracelulares representativos, y tinción de CD107a de superficie en células T CD8 viables después de reestimulación con péptido. (D) Frecuencia de células T CD8 que expresan combinaciones de IFN-y, TNF-a, IL-2, y CD107a alrededor de la contracción máxima y posterior de las respuestas primarias y secundarias. Los números insignificantes de células T CD8 que eran IFN-y negativas expresaban cualquier otra molécula efectora. (E) Se evaluó el fenotipo efector/memoria de las células T CD8 pentámero+ CD44hi H-2Kb-OVA257 mediante tinción con CD127 y KLRG1 en los tiempos de medición indicados.
Figura 23: (A) Programa experimental: los ratones C57BL/6 (5 por grupo) se inmunizaron con 5 x 1 0 10, 1 x 1 0 10 o 2 x 109 genomas de vector de ID-VP02 que codifican un antígeno de poliepítopo (LV1b) que contiene los epítopos de células T CD8 H-2b-restringido OVA257 y LCMV GP33 y después se estimularon el día 35 después de inmunización con 1x107 TCID50 virus vacuna de cepa WR de tipo natural (VV-WT), virus vacuna OVA recombinante de cepa WR (rVV-OVA), o se dejaron sin estimular. El día 40 (día 5 después de estimulación) se midieron las respuestas de células T CD8 esplénicas y la carga vírica en los ovarios. (B) Las respuestas de células T CD8 específicas de OVA257- y LCMV GP33 se midieron por tinción de IFN-y y TNF-a intracelular después de reestimulación con péptido ex vivo. Se muestran gráficas de puntos representativas del perfil de citoquinas de células T CD8. (C) Frecuencia de células T CD8 IFN-Y+ específicas de OVA257 para cada animal. (D) Carga vírica (medida por el ensayo de TCID50) dentro de los ovarios de cada animal.
Figura 24: (A) Se inmunizaron ratones BALB/c (5 por grupo) con las dosis indicadas, con genomas de vectores, de ID-VP02 que codifica AH1A5, un mutante heteroclítico del epítopo endógeno de rechazo tumoral CT26 AH1, ligado a OVA (OVA- AH1A5) o vehículo HBSS solo. El día 12 después de inmunización, se midió el porcentaje de células T CD8 esplénicas específicas de AH1A5 o AH1 por ICS. (B) Doce días después de inmunización, una mezcla 1:1:1 de células diana marcadas con colorante cada una pulsada con AH1, AH1 A5 o un péptido de control se transfirió por vía intravenosa a ratones inmunizados e sin tratamiento previo (3 por grupo). Al día siguiente, se recogieron los bazos y se comparó la recuperación relativa de cada población entre ratones sin tratamiento previo e inmunizados para calcular la muerte específica. (C) Se inmunizaron ratones BALB/c (10 por grupo) con 4 x 109 genomas de vectores de ID-VP02 que codifican OVA-AH1A5. Cuatro semanas después, se inyectaron a los ratones por vía subcutánea 8x104 células tumorales CT26 en el flanco derecho y los ratones se sacrificaron cuando los tumores superaron los 100 mm2. (D) Inmunización terapéutica: se inyectaron ratones BALB/c (10 por grupo) por vía subcutánea con 8 x 104 células tumorales CT26. Cuatro días después, los ratones se inmunizaron con 4x109 genomas de vector de ID-VP02 que codifican OVA-AH1A5 o se dejaron sin tratar y los ratones se sacrificaron cuando los tumores superaron 100 mm2.
Descripción detallada
Esta descripción se refiere a métodos y materiales útiles para generar partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que se unen eficazmente e infectan productivamente células que expresan DC-SIGN (p. ej., células dendríticas). Los métodos y materiales en esta descripción se refieren al descubrimiento inesperado de que la combinación de una proteína Vpx en una partícula de vector lentivírico con glicoproteínas de alfavirus (p. ej., glicoproteínas del virus Sindbis) altamente manosiladas (p. ej., por cultivo de células de empaquetamiento de virus en presencia de kifunensina) en la envuelta da como resultado partículas de vectores lentivíricos que infectan células que no se dividen que expresan DC-SIGN (p. ej., células dendríticas) de manera significativamente más eficaz que las partículas de vectores lentivíricos que carecen de una proteína Vpx o glicoproteínas altamente manosiladas en la envuelta. Un aspecto ventajoso de la descripción es que las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteína e2 del virus Sindbis y producidas en presencia de kifunensina, infectan células dendríticas de forma significativamente más eficaz si las partículas comprenden también una proteína Vpx en el virión, permitiendo así el suministro y expresión de una secuencia de interés (p. ej., un polinucleótido que codifica un antígeno) a una célula dendrítica.
Definiciones
La expresión "fragmento funcional" cuando se usa en referencia a un polipéptido significa un polipéptido que está truncado, es decir, faltan uno o más aminoácidos del extremo N o extremo C, y que retiene la actividad deseada. Cuando se usa en referencia a una proteína Vpx, "fragmento funcional" significa un fragmento que retiene la capacidad de inhibir la actividad de SAMHD1. El término se puede aplicar de forma análoga a los polinucleótidos que están truncados.
El término "variante" cuando se usa en referencia a un polipéptido significa un polipéptido que tiene una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones con respecto a un polipéptido original. En algunos contextos, la variante es una que retiene la actividad deseada. Cuando se usa en referencia a una proteína Vpx, "variante funcional" significa una variante que retiene la capacidad de inhibir la actividad de SAMHD1. La expresión se puede aplicar de forma análoga a polinucleótidos que tienen una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones con respecto a un polinucleótido original.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "sustitución de aminoácidos conservadora" es la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, p. ej., tamaño, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o aromaticidad, e incluye intercambios como se indican a continuación:
Original Ejemplo
Ala (A) val; leu; ile
Arg (R) lys; gln; asn
Asn(N) gln; his; asp, lys; gln
Asp (D) glu; asn
Cys (C) ser; ala
Gln (Q) asn; glu
Glu (E) asp; gln
Gly (G) ala
His (H) asn; gln; lys; arg
Ile (I) leu; val; met; ala;
phe; norleucina
Leu (L) norleucine; ile; val;
met; ala; phe
Lys (K) arg; gln; asn
Met (M) leu; phe; ile
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr
Pro (P) ala
Ser (S) thr
Thr (T) ser
Trp (W) tyr; phe
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser
Val (V) ile; leu; met; phe;
ala; norleucina
Los restos de aminoácidos que comparten propiedades comunes de la cadena lateral a menudo se agrupan como sigue:
(1) hidrófobo: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrófilo neutro: cys, ser, thr;
(3) ácido: asp, glu;
(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromático: trp, tyr, phe.
Como se usa en la presente memoria, las expresiones "de integración deficiente" y "de integración defectuosa" se usan indistintamente. Un vector viral de integración deficiente es uno que es al menos 10 veces (preferiblemente, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces, al menos 250 veces, al menos 300 veces, al menos 350 veces, al menos 400 veces, al menos 450 veces, al menos 500 veces, al menos 550 veces, al menos 600 veces, al menos 650 veces, al menos 700 veces, al menos 750 veces, al menos 800 veces, al menos 850 veces, al menos 900 veces, al menos 950 veces, o al menos 1000 veces) menos eficaz en la integración que un vector vírico de integración competente. Por ejemplo, la integración deficiente puede significar de al menos aproximadamente 20 veces a aproximadamente 100 veces menos eficaz en la integración que un vector vírico que no se ha modificado para ser de integración defectuosa. La integración se puede medir por cualquier método conocido en la técnica, p. ej., por detección por PCR de sucesos de integración cerca de un elemento Alu.
Un lentivirus "pseudotipado" es una partícula lentivírica que tiene una o más glicoproteínas de envuelta que son codificadas por un virus que es distinto del genoma lentivírico. La glicoproteína de la envuelta se puede modificar, mutar o diseñar como se describe en la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "antígeno exógeno" se refiere a un antígeno que se ha modificado genéticamente para ser expresado en los vectores lentivíricos descritos en la presente memoria. Por consiguiente, la expresión incluye explícitamente antígenos derivados del HIV que se han diseñado genéticamente para ser expresados en los vectores lentivíricos descritos en la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, una glicoproteína E2 de Sindbis que "se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN" es una glicoproteína que se une a células dendríticas que expresan DC-SIGN más eficazmente que a las células que no expresan DC-SIGN.
La proteína de la envuelta del virus Sindbis contiene cuatro glicanos unidos a N, dos en la proteína E2 y dos en la proteína E1. Dos N-glicanos del virus producidos en células de mamíferos en ausencia de un inhibidor de manosidasa I tienen una estructura con alto contenido en manosa (un glicano unido a N de E2 y un glicano unido a N de E1), mientras que los dos restantes tienen una estructura compleja. Los dos N-glicanos de estructura compleja están expuestos en la superficie de la proteína de la envuelta, mientras que los dos N-glicanos de estructura con alto contenido en manosa están enterrados dentro del centro del trímero de las proteínas de la envuelta. Véase, Morizono et al., J Virol, 84:14, 6923-34 (2010). Por consiguiente, típicamente 50% de los glicanos unidos a N en una partícula vírica con una glicoproteína del virus Sindbis producida en células de mamíferos tendría la estructura de alto contenido en manosa. Una partícula vírica "altamente mannosilada" es una partícula en la que al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100% de los glicanos unidos a N en las glicoproteínas de la envuelta vírica comprenden al menos una estructura de Man5 , preferiblemente Mang, medido, por ejemplo, por espectrometría de masas (véase, Crispin et al., JBC 2009).
Inhibidores de SAMHD1
Vpx y Vpr
En algunas o cualquiera de las realizaciones, el inhibidor de SAMHD1 es una proteína Vpx o una proteína Vpr. Vpx es codificada por virus del HIV-2, SIV de mangabey gris (SIVsm), SIV de mangabey de boina roja (SlVrcm) y SIV de macaco (SlVmac), entre otros. Vpx del HIV-2 y SIV es una proteína de 112 aminoácidos (aa), 18 kDa, y se empaqueta en el virión en cantidades significativas a través de su interacción con la región p6 del precursor p55gag. Recientemente se demostró que Vpx inhibe la actividad de un factor de restricción expresado en células dendríticas y mieloides humanas, SAMHD1. Laguette et al., Nature, 474, 654-657 (2011). SAMHD1 se identificó como el factor de restricción que hace que las células dendríticas y mieloides humanas sean en gran parte refractarias a la infección por el HIV-1.
Vpx de SIV y HIV-2 son 83% idénticas a nivel de los aminoácidos. Véase, Goujon et al., J Virol, 82:24, 12335-12345 (2008). Por consiguiente, se puede suponer que los restos que difieren entre SIV y HIV-2 no son importantes para la función de Vpx. Además, otros han llevado a cabo el análisis mutacional de Vpx de SIV y HIV-2 y se puede usar como una guía para generar variantes de Vpx para usar en los materiales y métodos de esta descripción. Véase, Goujon et al. Los mutantes Asn26Ala, Ser52Ala y Ser63Ala/Ser65Ala no afectan a la función de Vpx. La eliminación del resto 11 C-terminal, rico en prolina, las mutaciones Ser13Ala, Lys84Ala/Lys85Ala, Thr17Ala, Thr28Ala, Gly86Ala/Cys87Ala, Ser13Ala/Thr17Ala/Thr28Ala, His39Ala, y Tyr66Ala/Tyr68Ala/Tyr71Ala, Trp49Ala/Trp53Ala/Trp56Ala, y Lys68Ala/Lys77Ala anulan la actividad de Vpx.
En algunas o cualquiera de las realizaciones, las partículas de vector lentivírico descritas en la presente memoria comprenden una proteína Vpx o una variante de la misma. En algunas o en cualquiera de las realizaciones, la variante retiene la capacidad de inhibir SAMHD1. En algunas o cualquiera de las realizaciones, la variante comprende una secuencia de aminoácidos al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a la SEQ ID NO: 45 (SIVsm Vpx). En algunas o cualquiera de las realizaciones, la variante comprende una secuencia de aminoácidos al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a la SEQ ID NO: 46 (SIVrcm Vpx). En algunas o cualquiera de las realizaciones, la variante comprende una secuencia de aminoácidos al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a la SEQ ID NO: 44 (SIVmac Vpx). En algunas o cualquiera de las realizaciones, la variante comprende una secuencia de aminoácidos al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a la SEQ ID NO: 47 (HIV-2).
La actividad anti-SAMHD1 de Vpx se ha localizado en los 86 restos N-terminales de Vpx. Gramberg et al., J Virol, 84: 3, 1387-1396. Por consiguiente, en algunas o cualquiera de las realizaciones, el fragmento funcional comprende la región inhibidora de SAMHD1 de Vpx, es decir, los restos de aminoácidos 1 a 86 de la SEQ ID NO: 44.
Mientras que Vpx solo está presente en algunos lentivirus, todos los lentivirus de primates codifican un gen estrechamente relacionado con Vpx llamado Vpr. Se sabe que Vpr causa la detención del ciclo celular. Recientemente, sin embargo, se mostró que las proteínas Vpr aisladas de SIVdeb y SIVmus inhibían SAMHD1 humana. Lim et al., Cell Host & Microbe, 11, 194-204 (2012). Por consiguiente, en algunas o cualquiera de las realizaciones, las partículas de vectores lentivíricos descritas en la presente memoria comprenden una proteína Vpr que inhibe SAMHD1 o una variante de la misma que retiene la capacidad de inhibir SAMHD1. En algunas o cualquiera de las realizaciones, la variante comprende una secuencia de aminoácidos al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a la SEQ ID NO: 48 (SIVdeb Vpr). En algunas o cualquiera de las realizaciones, la variante comprende una secuencia de aminoácidos al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a la SEQ ID NO: 49 (SlVmus Vpr).
La información de los alineamientos de secuencia de proteínas Vpx se puede usar para generar variantes funcionales y variantes de fragmentos funcionales de Vpx, como se ha definido antes. Las técnicas para eliminar y mutar los aminoácidos son bien conocidas en la técnica. Véase, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1998), incluidos todos los suplementos hasta 2011. En general, para construir variantes funcionales, se pueden introducir sustituciones o eliminaciones no conservadoras o conservadoras en las posiciones que difieren entre los virus que codifican una proteína Vpx, ya que estas posiciones tienden a ser sustituciones no conservadoras permitidas mientras retienen la función. Para las posiciones con restos de aminoácidos conservados a través de los virus, el resto se conserva o se introducen sustituciones conservadoras. Se ensaya la capacidad de Vpx, Vpr y sus variantes para inhibir la actividad de SAMHD1 de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica. Véase, Lim et al., Cell Host & Microbe, 11, 194-204 (2012) y Lahouassa et al., Nature Immunol, 13: 3, 223-229 (2012).
A pesar de informes previos que indicaban que el empaquetamiento de Vpx de SIVmac en viriones de HIV-1 requería la modificación de la región p6 de la proteína Gag para parecerse a p6 de SIVmac (Sunseri et al., J Virol, 86:6 (2012)), los autores de la invención han descubierto inesperadamente que Vpx de SIVmac se empaqueta eficazmente en los vectores lentivíricos pseudotipados basados en HIV-1 descritos en la presente memoria sin necesidad de modificar p6 o fusionar Vpx a Vpr de HIV-1. Por consiguiente, en algunas o cualquiera de las realizaciones, la proteína Vpx no está fusionada con una proteína Vpr. De manera similar, en algunas o cualquiera de las realizaciones, la proteína gag en la célula de empaquetamiento no se modifica de su secuencia natural.
En algunas o cualquiera de las realizaciones, la proteína Vpx se fusiona con la proteína Vpr del HIV-1.
Típicamente, la proteína Vpx se empaqueta en la partícula vírica. Sin embargo, en algunas o cualquiera de las realizaciones, se incluye un gen que codifica una proteína Vpx en el genoma lentivírico y se expresa cuando la partícula vírica infecta una célula diana.
Envuelta del vector vírico
Los virus transmitidos por artrópodos (Arbovirus) son virus que se transmiten a un hospedante, tal como seres humanos, caballos o aves, por un vector artrópodo infectado, tal como un mosquito. Los arbovirus se dividen más en subfamilias de virus, que incluyen alfavirus y flavivirus, que tienen un genoma de ARN monocatenario de polaridad positiva y una envuelta que contiene glicoproteínas. Por ejemplo, el virus de la fiebre del dengue, virus de la fiebre amarilla y virus del Nilo occidental pertenecen a la familia de los flavivirus, y el virus Sindbis, virus del bosque Semliki y virus de la encefalitis equina venezolana, son miembros de la familia de los alfavirus (Wang et al. J. Virol. 66, 4992 (1992)). La envuelta del virus Sindbis incluye dos glicoproteínas transmembranales (Mukhopadhyay et al. Nature Rev. Microbio. 3, 13 (2005)): E1, que se cree es responsable de la fusión, y E2, que se cree que es responsable de la unión celular. Las glicoproteínas de la envuelta del virus Sindbis son conocidas por pseudotipar otros retrovirus, incluyendo oncorretrovirus y lentivirus.
La envuelta del virus Sindbis y otros alfavirus se incorpora en la bicapa lipídica de la membrana de la partícula vírica, y típicamente incluye copias múltiples de dos glicoproteínas, E1 y E2. Cada glicoproteína tiene regiones que se extienden por la membrana; E2 tiene un dominio citoplásmico de aproximadamente 33 restos, mientras que la cola citoplásmica de E1 es muy corta (aproximadamente 2 restos). Tanto E1 como E2 tienen ácidos palmíticos unidos en o cerca de las regiones que se extienden por la membrana. E2 es sintetizada inicialmente como una proteína precursora que es escindida por la furina u otra serina proteinasa dependiente de Ca2+ en E2 y en una glicoproteína pequeña llamada E3. Situada entre las secuencias que codifican E2 y E1 hay una secuencia que codifica una proteína llamada 6K. E3 y 6K son secuencias señal que sirven para traslocar las glicoproteínas E2 y E1, respectivamente, a la membrana. En el genoma del virus Sindbis, la región codificante para las proteínas de la envuelta de Sindbis incluye la secuencia que codifica E3, E2, 6K y E1. Como se usa en la presente memoria, la "envuelta" de un virus arbovirus incluye al menos E2, y también puede incluir E1, 6K y E3. Una secuencia de ejemplo de glicoproteínas de la envuelta del virus Sindbis, cepa HR, se presenta como SEQ ID NO: 17 (poliproteína E3, E2, 6K y E1). Las secuencias de las glicoproteínas de la envuelta para otros arbovirus se pueden encontrar, p. ej., en GenBank. Por ejemplo, la secuencia que codifica las glicoproteínas del virus del dengue se puede encontrar en el n° de acceso GQ252677 (entre otras en GenBank) y en la base de datos de variaciones de virus en el NCBI (n° de acceso de GenBank y base de datos de variaciones de virus se refieren a las secuencias de glicoproteínas de la envuelta) y la secuencia que codifica el virus de la encefalitis equina venezolana en el n° de acceso NP 040824 (que se refiere a secuencias de glicoproteínas de la envuelta).
Se entiende que las referencias a un "número de resto de la glicoproteína E2" (tal como el resto 160, 70, 76 o 159) se definen por referencia a la secuencia de aminoácidos de la proteína de SEQ ID NO: 18, que es la glicoproteína E2 de la cepa HR de Sindbis (es decir, "cepa de referencia HR de Sindbis"). Por ejemplo, si se ha producido una variante de la glicoproteína E2 de Sindbis en la que el resto 70 se ha eliminado de la SEQ ID NO: 18, entonces el "resto 160" se referirá al resto real 159 de dicha variante. Las posiciones análogas en otros alfavirus se pueden determinar por alineamientos que maximizan la homología.
El uso de los términos "ligado", "unión", "direcdonamiento" y similares se usan de manera intercambiable y no pretenden indicar un mecanismo de la interacción entre la glucoproteína de la envuelta del virus Sindbis y un componente celular. DC-SIGN (ICAM-3 (molécula de adhesión intercelular 3) no asociada a integrina, específica de células dendríticas; también conocido como CD209) es un receptor tipo lectina tipo C capaz de unión rápida y endocitosis de materiales (Geijtenbeek, TB, et al. Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 2004). Parece que E2 dirige virus a células dendríticas a través de DC-SIGN. Como se muestra en la presente memoria, las células que expresan DC-SIGN son transducidas por partículas de vectores víricos pseudotipados con E2 del virus Sindbis mejor (al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, o al menos 10 veces mejor) que las células isogénicas que no expresan DC-SIGN. El mecanismo de cómo la glicoproteína E2 facilita la infección vírica parece que implica a DC-SIGN, posiblemente a través de la unión directa a DC-SIGN o causando un cambio en la conformación o algún otro mecanismo. Independientemente del mecanismo real, el direccionamiento por E2 es preferencial para las células que expresan DC-SIGN, en particular, células dendríticas.
El virus Sindbis también se une a las células por el sulfato de heparán (Klimstra et al., J Virol 72: 7357, 1998; Burmes y Griffin, J Virol 72: 7349, 1998). Debido a que el sulfato de heparán y otros glicosaminoglicanos de la superficie celular se encuentran en la superficie de la mayoría de los tipos de células, es deseable reducir la interacción entre el sulfato de heparán y las glicoproteínas de la envuelta de Sindbis. Esto se puede lograr disminuyendo la unión de la envuelta del virus Sindbis al sulfato de heparán o aumentando la unión, p. ej., aumentando la avidez, de la envuelta del virus Sindbis a las células dendríticas o ambas. Como resultado, se reduce la unión no específica a otras moléculas, que pueden ser expresadas por otros tipos de células y que puede ocurrir incluso si la envuelta es específica para DC-SIGN, y la especificidad mejorada puede servir para evitar efectos secundarios no deseados, tales como efectos secundarios que pueden reducir la respuesta inmunitaria deseada, o efectos secundarios asociados con la transducción fuera del objetivo de otros tipos de células. Alternativamente o además de las ventajas de la transducción relativamente específica de células que expresan DC-SIGN, las partículas víricas pseudotipadas con la glicoproteína E2 de la envuelta del virus Sindbis pueden ofrecer otras ventajas frente a partículas víricas pseudotipadas con glicoproteínas tales como VSVG. Los ejemplos de dichas ventajas incluyen la reducción de la lisis mediada por complemento y/o la reducción del direccionamiento de células neuronales, y se cree que ambas están asociadas con la administración de partículas víricas pseudotipadas con VSV-G.
En diferentes realizaciones, las partículas de vectores lentivíricos descritas en la presente memoria se unen específicamente a células que expresan DC-SIGN y tienen una unión reducida o anulada al sulfato de heparán. Es decir, una glicoproteína E2 de la envuelta del virus Sindbis se puede modificar para dirigir preferentemente el virus a células dendríticas que expresan DC-SIGN con respecto a otros tipos de células. Basándose en la información obtenida de estudios estructurales y modelización molecular entre otros estudios, las secuencias variantes de proteínas de la envuelta, en especial las glicoproteínas E2 y E1, se diseñan y generan de manera que las glicoproteínas mantengan sus funciones como proteínas de envuelta, pero tengan la especificidad de unión, avidez o nivel de unión deseados. Se pueden crear secuencias variantes candidatas para cada glicoproteína y ensayar usando los métodos descritos a continuación, u otros métodos conocidos en la técnica, para identificar glicoproteínas de la envuelta con las características más deseables.
Ciertas secuencias variantes de E2 de Sindbis tienen al menos una alteración de aminoácidos en el resto 160 en comparación con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18 (secuencia de referencia de E2 de Sindbis HR). El resto 160 se elimina o cambia a un aminoácido distinto del ácido glutámico. Una alteración es los más habitualmente una sustitución de al menos un aminoácido, pero alternativamente puede ser una adición o eliminación de uno o más aminoácidos. Preferiblemente, cualesquiera aminoácidos adicionales son pocos en número y no comprenden un epítopo antigénico (p. ej., secuencia de marcador de hemaglutinina), que puede comprometer la seguridad. Cuando hay dos o más alteraciones, ambas pueden ser del mismo tipo (p. ej., sustitución) o de diferentes tipos (p. ej., una sustitución y una eliminación). Múltiples alteraciones pueden estar dispersas o situadas de manera contigua en la secuencia de proteína.
En algunas realizaciones, las secuencias variantes comprenden al menos una alteración de aminoácido en la región de aproximadamente el resto 50 a aproximadamente el resto 180 de E2 del virus Sindbis (SEQ ID NO: 18). Dentro de esta región hay aminoácidos que están implicados en la unión al sulfato de heparán. Al reducir la carga neta positiva de E2, se puede reducir la interacción electrostática con el sulfato de heparán, lo que da como resultado una menor unión al sulfato de heparán. Los aminoácidos con carga positiva candidatos en esta región incluyen lisinas en los restos 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149, 159 y arginina en los restos 65, 92, 128, 137, 157, 170, 172 (Bear et al., Virology 347: 183-190, 2006) de la SEQ ID nO: 18. Al menos varios de estos aminoácidos están directamente implicados en la unión de E2 al sulfato de heparán. La carga positiva neta se puede reducir por eliminación de lisina o arginina o sustitución de lisina o arginina por un aminoácido neutro o con carga negativa. Por ejemplo, una o más de estas lisinas y argininas se pueden reemplazar por ácido glutámico o aspártico. Ciertas realizaciones tienen al menos una sustitución de la lisina 70, 76 o 159. En los casos en que E2 es expresada como una poliproteína con E3, la lisina situada adyacente al sitio de escisión E3/E2 natural se mantiene, es decir, la secuencia de reconocimiento y el sitio de escisión están inalterados. Alternativamente, la secuencia del sitio de escisión de la endopeptidasa natural se reemplaza por una secuencia de reconocimiento para una endopeptidasa diferente.
Algunas variantes de E2 del virus Sindbis también se modifican de una manera que tenga un impacto positivo en la unión a las células dendríticas. La alteración del ácido glutámico que se encuentra en el resto 160 en la secuencia de referencia de HR (SEQ ID NO: 18) puede mejorar la unión a células dendríticas (véase, Gardner et al., J Virol 74, 11849, 2000). En algunas variantes se encuentran alteraciones, tales como una eliminación del resto 160 o sustitución del resto 160. En variantes particulares, un aminoácido no cargado se sustituye por Glu, en otras variantes, un aminoácido no ácido se sustituye por Glu. Normalmente, la Glu160 se reemplaza por uno de los aminoácidos pequeños o alifáticos, que incluyen glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina.
Otras variantes comprenden dos o más (p. ej., 3, 4 o 5) alteraciones de aminoácidos. Típicamente, en estas variantes, una de las alteraciones es Glu160 y la o las alteraciones restantes son cambios de una o más de las lisinas y argininas en la región que abarca los restos de aproximadamente 50 a aproximadamente 180. Algunas de las variantes comprenden una alteración de Glu160 a resto no ácido o eliminación y una o más alteraciones de la lisina 70, lisina 76 o lisina 159 con un aminoácido no básico. Algunas variantes específicas comprenden una Glu160 a Gly, Lys 70 a Glu y Lys 159 a Glu; una Glu 160 a Gly, Lys 70, 76 y 159 a Glu; una eliminación de Glu 160 y Lys 70 y 159 a Glu; y una eliminación de Glu 160 y Lys 70, 76 y 159 a Glu. En algunas realizaciones, la variante de E2 es entre 80 y 100% (p. ej., 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97% o 99%) idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 30 -43 [SINvar1-14 E2].
En ciertos casos, la proteína E2 es expresada primero como una poliproteína en fusión con al menos E3 o en fusión con una secuencia líder. Independientemente de si la secuencia líder es E3 u otra secuencia, E2 en la envuelta vírica debe carecer de E3 u otra secuencia líder. En otras palabras, E2 preferiblemente no es una proteína de fusión E3/E2. En ciertas realizaciones, E2 es expresada como parte de la poliproteína E3-E2-6K-E1. En estas realizaciones, la poliproteína es entre 80 y 100% (p. ej., 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97% o 99%) idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 3 - 16 [poliproteína SINvar1-14]. El virus Sindbis expresa de forma natural E2 como parte de una poliproteína y las regiones de unión para E3/E2, E2/6K, y 6K/E1 tienen secuencias reconocidas y escindidas por endopeptidasas. Normalmente, la unión E3/E2 es escindida por furina o una serina endopeptidasa similar a furina entre los restos 65 y 66. La furina tiene especificidad por restos de arginina pareados que están separados por dos aminoácidos. Para mantener la escisión de E3/E2 por furina, los restos 62-66 (RSKRS; SEQ ID NO: 26) deben mantener los dos restos de arginina con separación de dos aminoácidos y el resto de serina. Alternativamente, se puede usar una secuencia de escisión diferente en lugar de la secuencia de escisión de furina de E3/E2 o cualquiera de las otras secuencias de escisión. Se pueden incorporar sitios de reconocimiento y escisión para las endopeptidasas, que incluyen, sin limitación, aspártico endopeptidasas (p. ej., catepsina D, quimosina, proteasa del HIV), cisteína endopeptidasas (bromelaínas, papaína, calpaína), metaloendopeptidasas (p. ej., colagenasa, termolisina), serina endopeptidasas (p. ej., quimotripsina, factor IXa, factor X, trombina, tripsina), estreptoquinasas. Las secuencias de reconocimiento y de sitios de escisión de estas enzimas son bien conocidas.
También se pueden alterar aminoácidos en E2 del virus Sindbis, distintos de los ya mencionados. En general, una secuencia variante de E2 tendrá al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de referencia de E2, o puede tener al menos 82%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, o al menos 98% de identidad de secuencia. En algunas realizaciones, una secuencia variante de E2 tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 30 [SINvar1], o puede tener al menos 82%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, o al menos 98% de identidad de secuencia. En algunas realizaciones, una secuencia de E2 variante tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 31 [SINvar2], o puede tener al menos 82%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, o al menos 98% de identidad de secuencia. En algunas realizaciones, una secuencia de E2 variante tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 32 [SINvar3], o puede tener al menos 82%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, o al menos 98% de identidad de secuencia.
La glicoproteína variante debería presentar función biológica, tal como la capacidad de facilitar la infección de células dendríticas por una partícula vírica que tiene una envuelta que comprende E2. Los experimentos han identificado regiones de glicoproteínas de la envuelta que parecen tener una función importante en diversos aspectos del ensamblaje vírico, la unión a la superficie celular y la infección. Cuando se hacen variantes, se puede usar la siguiente información como guía. La cola citoplásmica de E2 - aproximadamente los restos 408 a 415 - es importante para el ensamblaje del virus (West et al. J Virol 80: 4458-4468, 2006). Otras regiones están implicadas en la formación de la estructura secundaria (aproximadamente restos 33-53); e implicadas en el transporte y la estabilidad de las proteínas (aproximadamente restos 86-119) (Navaratmarajah et al., J Virol 363: 124-147, 2007). La variante puede retener el carácter hidrófobo de una región que se extiende por la membrana, aproximadamente los restos 370-380. La variante puede retener uno o ambos sitios de glicosilación unidos a N restos NIT (restos 196­ 198) y NFT (restos 318-320) y puede retener uno o más de los sitios que están palmitoilados (C-396, c416 y C417) (Strauss y Strauss Microbiol Rev 58, 491-562, 1994; pág. 499-509 incorporado). Por otro lado, se pueden alterar muchas regiones de E2 sin suceso perjudicial. Por ejemplo, las inserciones de transposones en muchos lugares diferentes en E2 todavía daban como resultado un virus viable (Navaratmarajah, ibidem).
En ciertas realizaciones, se puede incorporar un péptido marcador en proteínas E3, 6K o E1. Para algunos propósitos, se puede incorporar un marcador en E2, pero no es deseable un marcador para usar en un producto para la administración a pacientes humanos. Se puede usar un péptido marcador, que es una secuencia corta (p. ej., 5-30 aminoácidos), para facilitar la detección de la expresión de la envuelta y su presencia en partículas víricas. Para propósitos de detección, una secuencia de marcador será típicamente detectable por anticuerpos o productos químicos. Otro uso para un marcador es facilitar la purificación de partículas víricas. Se puede usar un sustrato que contiene una pareja de unión para el marcador para absorber el virus. La elución del virus se puede lograr por tratamiento con un motivo que desplaza el marcador de la pareja de unión o cuando la secuencia de marcador está en conexión con una secuencia escindible, el tratamiento con la endopeptidasa adecuada permitirá convenientemente la liberación de virus. (Véase, por ejemplo, catálogo de Qiagen, Factor Xa Protease System). La eliminación del péptido marcador en general es deseable para fines de seguridad del uso de partículas de virus en sujetos animales. Si no se quita el marcador, se puede producir una respuesta inmunitaria contra el marcador.
Los marcadores adecuados incluyen, sin limitación, FLAG (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 28) (patente de EE.UU. N° 4.703.004, para el cual están disponibles en el mercado anticuerpos, proteína de unión a quitina, proteína de unión a maltosa, glutatión-S-transferasa, poli(His) (patente de EE.UU. N° 4.569.794), tioredoxina, HA (hemaglutinina)-marcador, entre otros. La poli(His) se puede adsorber en medios de afinidad que contienen iones metálicos unidos, p. ej., níquel o cobalto, y eluir con un medio a pH bajo.
Las partículas víricas se pueden evaluar para determinar la especificidad de la glicoproteína de envuelta incorporada en el virus que se dirige a las células dendríticas. Por ejemplo, se puede obtener una población mixta de células de médula ósea de un sujeto y cultivar in vitro. Alternativamente, se pueden obtener y usar líneas de células isogénicas que expresan o no expresan DC-SIGN. El virus recombinante se puede administrar a la población mixta de células de la médula ósea o líneas celulares isogénicas, y se puede analizar la expresión de un gen indicador incorporado en el virus en las células cultivadas. Ciertas realizaciones pueden usar un análisis de dilución limitante, en el que la población mixta de células se divide en partes separadas, que después se incuban por separado con cantidades decrecientes de virus (p. ej., 2 veces, 5 veces, 10 veces menos virus en cada parte). En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente 60%, 70%, 80% o 90%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de las células infectadas en la población de células mixtas son células dendríticas que expresan DC-SIGN. En ciertas realizaciones, la proporción de células dendríticas infectadas a células no dendríticas infectadas (o células que no expresan DC-SIGN) es al menos aproximadamente 2:1, al menos aproximadamente 3:1, al menos aproximadamente 4:1, al menos aproximadamente 5:1, al menos aproximadamente 6:1, al menos aproximadamente 7:1, al menos aproximadamente 8:1, al menos aproximadamente 9:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 30:1, al menos aproximadamente 40:1, al menos aproximadamente 50:1, al menos aproximadamente 100:1, al menos aproximadamente 200:1, al menos aproximadamente 500:1, al menos aproximadamente 1000:1, al menos aproximadamente 5000:1, al menos aproximadamente 10.000:1, o más. Para la dilución limitante, típicamente se observa mayor selectividad a diluciones más altas (es decir, cantidades menores) de virus de entrada.
La actividad de las partículas víricas pseudotipadas se puede determinar por cualquiera de una variedad de técnicas. Por ejemplo, un método preferido para medir la eficacia de la infectividad (UI, unidades infecciosas) es administrar partículas víricas a células y medir la expresión de un producto codificado en el genoma del vector. Se puede usar cualquier producto que se pueda analizar. Un tipo conveniente de producto es una proteína fluorescente, tal como la proteína verde fluorescente (GFP). Otros productos que se pueden usar incluyen proteínas expresadas en una superficie celular (p. ej., detección por unión a anticuerpos), enzimas y similares. Si el producto es un antígeno y las células son células dendríticas, se puede evaluar la infectividad/actividad determinando una respuesta inmunitaria. Además, se pueden determinar los efectos secundarios en un mamífero. También se puede ensayar directamente la capacidad para dirigirse específicamente a células dendríticas, por ejemplo, en cultivo celular como se describe más adelante.
Las partículas víricas también se pueden preparar y ensayar su selectividad y/o su capacidad para facilitar la penetración de la membrana de la célula diana. Las partículas víricas que tienen una envuelta con glicoproteínas no modificadas se pueden usar como controles para la comparación. Brevemente, las células que expresan un receptor para una glicoproteína de envuelta son infectadas por el virus usando un ensayo de infección estándar. Después de un tiempo específico, por ejemplo, 48 horas después de la infección, las células se pueden recoger y se puede determinar el porcentaje de células infectadas por el virus por citometría de flujo, por ejemplo. La selectividad se puede calificar calculando el porcentaje de células infectadas por virus. De forma similar, el efecto de una glicoproteína de envuelta variante en el título vírico se puede cuantificar dividiendo el porcentaje de células infectadas por virus que comprende una envuelta de variante entre el porcentaje de células infectadas por virus que comprenden la correspondiente glucoproteína de envuelta de tipo natural (no modificada). Una variante particularmente adecuada tendrá la mejor combinación de selectividad y título infeccioso. Una vez que se selecciona una variante, se pueden realizar ensayos de concentración vírica para confirmar que estos virus se pueden concentrar sin comprometer la actividad. Los líquidos sobrenadantes víricos se recogen y se concentran por ultracentrifugación. Los títulos de los virus se pueden determinar por dilución limitada de solución madre de virus e infección de las células que expresan el receptor para la glicoproteína de la envuelta, midiendo la expresión de un producto expresado por los virus como se ha descrito antes.
La entrada de una partícula de vector lentivírico en una célula diana es otro tipo de evaluación de la actividad. La proteína de fusión BlaM-Vpr (beta-lactamasa Vpr) se ha usado para evaluar la penetración vírica del HIV-1; se puede usar una fusión de BlaM y una glicoproteína de la envuelta del virus Sindbis, tal como E1 o una proteína de fusión E2/E1 para evaluar la eficacia de una proteína de la envuelta para facilitar la fusión y la penetración en una célula diana. Las partículas víricas se pueden preparar, por ejemplo, por transfección transitoria de células de empaquetamiento con uno o más vectores que comprenden los elementos víricos, BlaM-Vpr y la envuelta de la variante de interés (y una molécula de afinidad si es adecuado). Los virus resultantes se pueden usar para infectar células que expresan una molécula, la molécula de direccionamiento (o molécula de afinidad) se une específicamente en ausencia o presencia del inhibidor de unión libre (tal como un anticuerpo). Después, las células se pueden lavar con un medio independiente de CO2 y cargar con colorante CCF2 (Aurora Bioscience). Después de incubación a temperatura ambiente para permitir que se complete la reacción de escisión, las células se pueden fijar mediante paraformaldehído y analizar por citometría de flujo y microscopía. La presencia de células azules indica la penetración de virus en el citoplasma; se esperarían menos células azules cuando se añade el anticuerpo de bloqueo (Cavrois et al. Nat Biotechnol 20: 1151-1154, 2002).
Para investigar si la penetración depende de un pH bajo, y para identificar las glicoproteínas de la envuelta con la dependencia del pH deseado, se puede añadir NH4Cl u otro compuesto que altera el pH en la etapa de infección (el NH4Cl neutralizará los compartimentos ácidos de los endosomas). En el caso de NH4Cl, la desaparición de células azules indicará que la penetración de los virus depende del pH bajo. Además, para confirmar que la actividad depende del pH, se pueden añadir al tampón de incubación agentes lisosomotrópicos, tales como cloruro amónico, cloroquina, concanamicina, bafilomicina A1, monensina, nigericina, etc. Estos agentes elevan el pH dentro de los compartimentos endosómicos (p. ej., Drose y Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997). El efecto inhibidor de estos agentes pondrá de manifiesto el papel del pH en la fusión y entrada de virus. Las diferentes cinéticas de entrada entre virus que presentan diferentes moléculas fusogénicas se pueden comparar y seleccionar el más adecuado para una aplicación particular.
Los ensayos de entrada basados en PCR se pueden usar para controlar la transcripción inversa y medir la cinética de la síntesis de ADN vírico como una indicación de la cinética de la entrada de virus. Por ejemplo, las partículas víricas que comprenden una molécula de proteína de la envuelta particular se incuban con células diana, tales como células 293T, DC o cualquier otra célula que se haya diseñado para expresar, o que exprese de forma natural, la pareja de unión adecuada (receptor) para la molécula de proteína de la envuelta. Inmediatamente, o después de un incremento de tiempo (para permitir que ocurra la infección), se eliminan los virus no unidos y se analiza en partes alícuotas de las células los ácidos nucleicos víricos. El ADN se extrae de estas partes alícuotas y se somete a análisis por amplificación, en general en un ensayo semicuantitativo, cebado con cebadores específicos de LTR. La aparición de productos de ADN específicos de LTR indica el éxito de la entrada de virus.
Genoma de vector lentivírico
La partícula de vector vírico comprende un genoma, que comprende al menos una secuencia (p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5) de interés. Se pueden incluir otras secuencias, tales como secuencias que permiten que el genoma sea empaquetado en la partícula vírica y secuencias que promueven la expresión de la/las secuencias de interés después de la transducción de la célula diana. El genoma se puede obtener de cualquiera de un gran número de vectores basados en genomas lentivíricos disponibles adecuados, incluyendo los identificados para aplicaciones de terapia génica humana, tales como los descritos por Pfeifer y Verma (Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2: 177-211, 2001). En aras de la simplicidad, el genoma también se denomina "genoma de vector vírico" o "genoma de vector". Cadena principal
Los genomas de vectores lentivíricos adecuados incluyen los basados en el virus de inmunodeficiencia humana (HIV-1), HIV-2, virus de inmunodeficiencia felina (FIV), virus de la anemia infecciosa equina, virus de inmunodeficiencia de simio (SIV) y el virus de maedi/visna. Una característica deseable de los lentivirus es que pueden infectar tanto células que se dividen como células que no se dividen, no es necesario que las células diana se dividan (o estimular las células diana para que se dividan). En general, el genoma y las glicoproteínas de la envuelta se basarán en diferentes virus, de manera que la partícula de vector vírico resultante está pseudotipada. Las características de seguridad del genoma del vector se incorporan convenientemente. Las características de seguridad incluyen LTR autoinactivante y un genoma que no se integra.
En algunas realizaciones de ejemplo, el genoma del vector vírico comprende secuencias de un genoma de lentivirus, tal como el genoma de HIV-1 o el genoma de SIV. La construcción del genoma vírico puede comprender secuencias de las LTR 5' y 3' de un lentivirus, y en particular puede comprender las secuencias R y U5 de la LTR 5' de un lentivirus y una LTR 3' inactivada o autoinactivante de un lentivirus. Las secuencias LTR pueden ser secuencias LTR de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias LTR de HIV, SIV, FIV o BIV. Típicamente, las secuencias de LTR son secuencias de LTR de HIV.
El genoma del vector puede comprender una LTR 3' inactivada o autoinactivante (Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72: 8150, 1998; US2010/0323403). Un vector autoinactivante en general tiene una eliminación de las secuencias de potenciador y promotor de la repetición terminal larga 3' (LTR), que es copiada en la LTR 5' durante la integración del vector. En un caso, el elemento U3 de la LTR 3' contiene una eliminación de su secuencia de potenciador, el tracto de la polipurina (PPT), la caja TATA, los sitios Sp1 y NF-kappa B. Como resultado de la LTR 3' autoinactivante, el provirus que se genera después de la entrada y transcripción inversa comprenderá una LTR 5' inactivada. El fundamento es mejorar la seguridad reduciendo el riesgo de movilización del genoma del vector y la influencia de la LTR en los promotores celulares cercanos. La LTR 3' autoinactivante se puede construir por cualquier método conocido en la técnica. En diversas realizaciones, el vector lentivírico pseudotipado comprende un genoma de vector lentivírico que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 23. Este vector comprende una eliminación del PPT 3' y la caja TATA. Por lo tanto, el vector es autoinactivante, de modo que (a) se evita la transcripción del genoma del vector de longitud completa a partir de vectores de dsADN transcritos de forma inversa en la célula diana infectada, (b) se minimiza el riesgo de activación por inserción que puede ocurrir cuando una 3' LTR puede funcionar como un promotor después de integración, y (c) la eliminación de U3 extendida se puede complementar por mecanismos de seguridad adicionales y redundantes (p. ej., mutación de integrasa).
Opcionalmente, la secuencia U3 de la LTR 5' lentivírica se puede reemplazar por una secuencia de promotor en la construcción vírica, tal como una secuencia de promotor heteróloga. Esto puede aumentar el título de virus recuperado de la línea celular de empaquetamiento. También se puede incluir una secuencia de potenciador. Se puede usar cualquier combinación de potenciador/promotor que aumente la expresión del genoma de ARN vírico en la línea celular de empaquetamiento. En un ejemplo, se usa la secuencia de potenciador/promotor de CMV (patente de EE.UU. N° 5.385.839 y patente de EE.UU. N° 5.168.062).
En ciertas realizaciones, el riesgo de mutagénesis por inserción se minimiza construyendo el genoma del vector lentivírico para que sea de integración defectuosa. Se puede perseguir una variedad de enfoques para producir un genoma vectorial no integrante. Estos enfoques implican diseñar una mutación(es) en el componente de la enzima integrasa del gen pol, de modo que codifica una proteína con una integrasa inactiva. Se puede modificar el propio genoma del vector para evitar la integración, por ejemplo, mutando o eliminando uno o ambos sitios de unión, o haciendo el 3' LTR-tracto de polipurina (PPT) proximal no funcional por eliminación o modificación. Además, están disponibles procedimientos no genéticos; estos incluyen agentes farmacológicos que inhiben una o más funciones de la integrasa. Los procedimientos no son mutuamente excluyentes, es decir, se puede usar más de uno de ellos a la vez. Por ejemplo, tanto la integrasa como los sitios de unión pueden ser no funcionales, o la integrasa y el sitio de PPT pueden ser no funcionales, o los sitios de unión y el sitio de PPT pueden ser no funcionales, o todos ellos pueden ser no funcionales.
Como se ha indicado antes, un procedimiento es hacer y usar una integrasa no funcional. La integrasa está implicada en la escisión del ADN de doble cadena de extremos romos vírico y en la unión de los extremos a 5'-fosfatos en las dos cadenas de un sitio diana cromosómico. La integrasa tiene tres dominios funcionales: el dominio N-terminal, que contiene un motivo de unión a zinc (HHCC), el núcleo del dominio central, que contiene el núcleo catalítico y un motivo DD35E conservado (D64, D116, E152 en HIV-1), y un dominio C-terminal, que tiene propiedades de unión a ADN. Las mutaciones puntuales introducidas en la integrasa son suficientes para alterar la función normal. Se han construido y caracterizado muchas mutaciones de la integrasa (véase, Philpott y Thrasher, Human Gene Therapy 18: 483, 2007; Apolonia, Tesis presentada en University College London, abril de 2009, pág.
82-97; Engelman et al. J Virol 69: 2729, 1995; Nightingale et al. Mol Therapy, 13: 1121, 2006). La secuencia que codifica la proteína integrasa se puede eliminar o mutar para hacer que la proteína sea inactiva, preferiblemente sin perjudicar significativamente la actividad de transcriptasa inversa o el direccionamiento nuclear, evitando así solo la integración del provirus en el genoma de la célula diana. Las mutaciones aceptables pueden reducir la catálisis de la integrasa, la transferencia de cadena, la unión a sitios att, la unión al ADN cromosómico del hospedante y otras funciones. Por ejemplo, una sola sustitución de ácido aspártico a asparagina en el resto 35 de la integrasa del VIH o SIV suprime completamente la integración del ADN vírico. Las eliminaciones de integrasa en general se limitarán al dominio C-terminal. La eliminación de la secuencia codificante para los restos 235-288 da como resultado una integrasa no funcional útil (Engelman et al. J Virol 69: 2729, 1995). Como ejemplos adicionales, se pueden generar mutaciones, por ejemplo, Asp64 (los números de restos se dan para el HIV-1, los números de restos correspondientes para la integrasa de otros lentivirus o retrovirus los puede determinar fácilmente un experto en la técnica) (p. ej., D64E, D64V), Asp116 (p. ej., D116N), Asn120 (p. ej., N120K), Glu152, Gln148 (p. ej., Q148A), Lys156, Lys159, Trp235 (p. ej., W235E), Lys264 (p. ej., K264R), Lys266 (p. ej., K266R), Lys273 (p. ej., K273R). Se pueden construir y ensayar otras mutaciones para la integración, expresión transgénica y cualquier otro parámetro deseable. Los ensayos para estas funciones son bien conocidos. Las mutaciones se pueden generar por cualquiera de una variedad de técnicas, que incluyen mutagénesis dirigida al sitio y síntesis química de la secuencia de ácido nucleico. Se puede hacer una mutación o pueden estar presentes más de una de estas mutaciones en la integrasa. Por ejemplo, una integrasa puede tener mutaciones en dos aminoácidos, tres aminoácidos, cuatro aminoácidos, etc.
Alternativamente o en combinación con el uso de mutante(s) de integrasa, también se pueden mutar los sitios de unión (att) en U3 y U5. La integrasa se une a estos sitios y el dinucleótido 3'-terminal se escinde en ambos extremos del genoma del vector. Un dinucleótido CA se encuentra en el extremo 3' procesado; el CA es necesario para el procesamiento, la mutación de los nucleótidos bloquea la integración en el cromosoma del hospedante. El A del dinucleótido CA es el nucleótido más crítico para la integración, y las mutaciones en ambos extremos del genoma darán los mejores resultados (Brown et al. J Virol 73: 9011 (1999). En una ilustración, el CA en cada extremo se cambia a TG. En otras ilustraciones, el CA en cada extremo se cambia a TG en un extremo y GT en el otro extremo. En otras ilustraciones, se elimina el CA en cada extremo; en otras ilustraciones, se elimina el A del CA en cada extremo.
La integración también se puede inhibir por mutación o eliminación del tracto de polipurina (PPT) (documento WO 2009/076524), situado en la proximidad de la LTR 3'. El PPT es una secuencia de polipurina de aproximadamente 15 nucleótidos que pueden servir como un sitio de unión de cebador para la síntesis de ADN de cadena positiva. En este caso, las mutaciones o eliminaciones de PPT se dirigen al proceso de transcripción inversa. Sin desear estar sujetos a un mecanismo, al mutar o eliminar la PPT, la producción de ADN lineal se reduce radicalmente y, esencialmente, solo se producen círculos de ADN de 1-LTR. La integración requiere un genoma de vector de ADN de doble cadena lineal, y la integración es esencialmente eliminada sin él. Como se ha indicado antes, un PPT se puede hacer no funcional por mutación o por eliminación. Típicamente, se elimina el PPT de aproximadamente 15 nt entero, aunque en algunas realizaciones, se pueden hacer eliminaciones más cortas de 14 nt, 13, nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt y 2 nt. Cuando se hacen las mutaciones, típicamente se hacen múltiples mutaciones, en especial en la mitad 5' del PPT (McWilliams et al., J Virol 77: 11150, 2003), aunque las mutaciones simples y dobles en las primeras cuatro bases todavía reducen la transcripción. Las mutaciones hechas en el extremo 3' de PPT en general tienen un efecto más notable (Powell y Levin J Virol 70: 5288, 1996).
Estos diferentes procedimientos para hacer que un genoma de vector no integrante se pueden usar individualmente o en combinación. El uso de más de un procedimiento se puede usar para construir un vector a prueba de fallos mediante mecanismos redundantes. Por lo tanto, las mutaciones o eliminaciones de PPT se pueden combinar con mutaciones o eliminaciones del sitio att o con mutaciones de integrasa o las mutaciones o eliminaciones de PPT se pueden combinar tanto con mutaciones o eliminaciones de sitios att como con mutaciones de integrasa. De manera similar, las mutaciones o eliminaciones de sitio att y las mutaciones de integrasa se pueden combinar entre sí o con mutaciones o eliminaciones de PPT.
Un procedimiento adicional para mejorar la seguridad de las partículas lentivíricas pseudotipadas implica modificar el plásmido que comprende los genes gag/pol para eliminar sitios de recombinación potencial con el vector lentivírico. Este procedimiento se puede usar individualmente o en combinación con cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, los genes gag y pol pueden ser de "codones optimizados" de mamífero o humanos, es decir, al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% del 95% de los codones de los genes gag y/o pol se reemplazan por codones que codifican el mismo aminoácido pero que son preferidos por las células de mamíferos, p. ej., células humanas, mejorando u optimizando así la expresión en las células de mamíferos, p. ej., humanas. Para la optimización de codones de los genes gag y pol, se genera un polinucleótido que altera los codones de "tipo natural" a codones usados con más frecuencia en el genoma humano. Sin embargo, en el HIV, ciertas partes del genoma deben conservar sustancialmente los codones originales (p. ej., al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de los codones originales) con el fin de permitir el desplazamiento del marco de lectura que se requiere para sintetizar Gag y Pol empezando desde el mismo codón de inicio de su ARNm. La traducción de Gag-Pol requiere un cambio del marco de lectura en la dirección 5' (cambio -1) en la unión p7/p1, alrededor del codón 432 del ARNm. La traducción de Gag-Pol después continúa en este nuevo marco de lectura hasta que se alcanza un codón de parada aproximadamente 3.000 nucleótidos más tarde. El desplazamiento del marco de lectura -1 ribosómico es un suceso muy controlado que requiere tanto una secuencia consenso deslizante específica como una estructura de ARN secundaria en la dirección 3' que hace que el ribosoma se detenga. Así, de acuerdo con la presente descripción, el ácido nucleico que codifica gag y pol contiene una "ventana no optimizada": una región que empieza alrededor de la posición 1228 (o empieza alrededor de la posición 1218-1298, o 1218-1238, o 1228-1238, o 1218-1228, o 1228-1298, o 1238-1248, o 1248-1258, o 1258-1268, o 1268-1278, o 1278-1288, o 1288-1298) de la SEQ ID NO: 54 (el marco de lectura abierto de gag-pol) y termina en la posición 1509 (o termina alrededor de la posición 1373-1558, o 1373-1509, o 1373-1500, o 1373-1470, o 1373-1440, o 1373-1410, o 1373-1401, o 1373­ 1392, o 1373-1383, o 1401-1509, o 1440-1509, o 1499-1519, o 1499-1509, o 1509-1519) de la SEQ ID NO: 54 que no se ha modificado sustancialmente con respecto a la secuencia de gag-pol de tipo natural. En otras palabras, la ventana no optimizada retiene sustancialmente los codones originales (p. ej., al menos 90%, 95% o 100% de los codones originales). Se entiende que la ventana no optimizada correspondiente a los nucleótidos 1228-1509 de la SEQ ID NO: 54 puede tener una numeración de nucleótidos real diferente cuando la SEQ ID NO: 54 está mutada o es parte de una secuencia de nucleótidos más grande; por ejemplo, si un plásmido contiene 100 nucleótidos 5' de la SEQ ID NO: 54, entonces la ventana no optimizada corresponderá a los nucleótidos 1328-1609 en el plásmido. En algunas realizaciones, la región de los nucleótidos 1229 a 1298 retiene sustancialmente los codones originales, y/o la región de los nucleótidos 1510-1558 es de codones optimizados. En algunas realizaciones, el polinucleótido de codones optimizados que codifica Gag y Pol comprende la SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, el plásmido que codifica el polinucleótido gag-pol de codones optimizados comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55.
En algunas o cualquiera de las realizaciones, el plásmido que codifica los genes gag y pol de codones optimizados humanos (y que comprende la ventana no optimizada descrita antes) también carece de un elemento de respuesta a Rev (RRE). La eliminación del RRE elimina también otra región de homología y la potencial recombinación entre el plásmido gag/pol y el plásmido de vector lentivírico. En combinación, dicho procedimiento elimina o minimiza regiones de homología entre el plásmido gag/pol y el vector lentivírico, minimizando así las posibilidades de recombinación entre estos plásmidos que podría dar como resultado un virus competente para la replicación. Se entiende que el RRE todavía puede estar presente en la célula y el proceso de empaquetamiento, pero está presente en un plásmido diferente.
Elementos reguladores
Como se describe en la presente memoria, el genoma del vector vírico comprende una secuencia de interés que es conveniente para expresar en células diana. Típicamente, la secuencia de interés se ubica entre las secuencias LTR 5' y LTR 3'. Además, la secuencia de interés preferiblemente está en una relación funcional con otros elementos genéticos, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripción que incluyen promotores o potenciadores, para regular la expresión de la secuencia de interés de una manera particular. En ciertos casos, las secuencias reguladoras de la transcripción útiles son las que están altamente reguladas con respecto a la actividad, tanto temporal como espacialmente. Los elementos de control de la expresión que se pueden usar para regular la expresión de los componentes son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción, potenciadores y otros elementos reguladores.
La secuencia de interés y cualquier otra secuencia expresable típicamente están en una relación funcional con las secuencias reguladoras del promotor/potenciador interno. Un promotor/potenciador "interno" es uno que está localizado entre las secuencias LTR 5' y LTR 3' en la construcción de vector vírico y está operativamente unido a la secuencia de interés. El promotor/potenciador interno puede ser cualquier promotor, potenciador o combinación de promotor/potenciador que se sabe que aumenta la expresión de un gen con el que está en una relación funcional. Una "relación funcional" y " operativamente unido" significa, sin limitación, que la secuencia está en la ubicación y orientación correctas con respecto al promotor y/o potenciador, de modo que la secuencia de interés será expresada cuando el promotor y/o potenciador se ponga en contacto con las moléculas adecuadas.
La elección de un promotor/potenciador interno se basa en el patrón de expresión deseado de la secuencia de interés y las propiedades específicas de los promotores/potenciadores conocidos. Por lo tanto, el promotor interno puede ser constitutivamente activo. Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos que se pueden usar incluyen el promotor para ubiquitina (patente de EE. UU. N° 5.510.474; WO 98/32869), CMV (Thomsen et al., PNAS 81:659, 1984; patente de EE. UU. N° 5.168.062), beta-actina (Gunning et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835) y pgk (véase, por ejemplo, Adra et al. 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et al. 1984 Gene 32:409-417; y Dobson et al. 1982 Nucleic Acids Res. 10: 2635-2637). En algunas realizaciones, el promotor usado para controlar la expresión de los antígenos codificados por el genoma del vector lentivírico pseudotipado es un promotor deficiente en intrones. En algunas realizaciones, se usa el promotor de ubiquitina-C humana (UbiC) para controlar la expresión de los antígenos codificados por el genoma del vector lentivírico pseudotipado. En diferentes realizaciones, el promotor de UbiC se ha modificado para eliminar intrones, es decir, el promotor es deficiente en intrones. El promotor de UbiC de longitud completa es de 1250 nucleótidos. El intrón empieza en 412 y va hasta el final (412­ 1250). Esta región se puede eliminar con el fin de minimizar transcritos genómicos víricos heterogéneos. El genoma vírico del VIH tiene un intrón natural dentro del mismo. Por lo tanto, un lentivirus que comprende un promotor de UbiC tendría un total de 2 intrones en el genoma de lentivirus. El intrón de UbiC puede existir en formas empalmadas y no empalmadas. La eliminación de los intrones de UbiC elimina la posibilidad de transcritos víricos heterogéneos y asegura homogeneidad en las partículas lentivíricas pseudotipadas suministradas.
Alternativamente, el promotor puede ser un promotor específico de tejido. En algunas realizaciones preferidas, el promotor es un promotor específico de células diana. Por ejemplo, el promotor puede ser de cualquier producto expresado por células dendríticas, incluyendo CD11c, CD103, TLR, DC-SIGN, BDCA-3, DEC-205, dC|R2, receptor de manosa, Dectin-1, Clec9A, MHC clase II. Además, los promotores se pueden seleccionar para permitir la expresión inducible de la secuencia de interés. Se conocen en la técnica una serie de sistemas para la expresión inducible, incluyendo el sistema sensible a tetraciclinas, el sistema operador-represor lac, así como promotores que responden a una variedad de cambios ambientales o fisiológicos, incluyendo choque térmico, iones metálicos, tales como promotor de metalotioneína, interferones, hipoxia, esteroides, tales como progesterona o promotor del receptor de glucocorticoides, radiación, tal como promotor de VEGF. También se puede usar una combinación de promotores para obtener la expresión deseada del gen de interés. El experto en la técnica podrá seleccionar un promotor basándose en el patrón de expresión deseado del gen en el organismo o la célula diana de interés.
El genoma vírico puede comprender al menos un promotor sensible a ARN polimerasa II o III. Este promotor puede estar operativamente unido a la secuencia de interés y también puede estar unido a una secuencia de terminación. Además, se puede incorporar más de un promotor de ARN polimerasa II o III. Los promotores de la ARN polimerasa II y III son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se puede encontrar una variedad adecuada de promotores de la ARN polimerasa III, por ejemplo, en Paule y White, Nucleic Acids Research., Vol. 28, pág. 1283-1298 (2000). Los promotores de la ARN polimerasa II o III también incluyen cualquier fragmento de ADN sintético o genéticamente modificado que pueda dirigir la ARN polimerasa II o III para transcribir secuencias codificantes de ARN en la dirección 3'. Además, el promotor o promotores de la ARN polimerasa II o III (Pol II o III) usados como parte del genoma del vector vírico pueden ser inducibles. Se puede usar cualquier promotor inducible de Pol II o III adecuado con los métodos de la descripción. Los promotores de Pol II o III particularmente adecuados incluyen los promotores sensibles a tetraciclinas proporcionados en Ohkawa y Taira, Human Gene Therapy, vol. 11, pág. 577­ 585 (2000) y en Meissner et al. Nucleic Acids Research, vol. 29, pág. 1672-1682 (2001).
También puede estar presente un potenciador interno en la construcción vírica para aumentar la expresión del gen de interés. Por ejemplo, se puede usar el potenciador de CMV (Boshart et al. Cell, 41: 521, 1985). Se han identificado y caracterizado muchos potenciadores en genomas víricos, tales como HIV, CMV y en genomas de mamíferos (véase, GenBank). Se puede usar un potenciador en combinación con un promotor heterólogo. Un experto en la técnica podrá seleccionar el potenciador adecuado basándose en el patrón de expresión deseado.
Un genoma de vector vírico normalmente contendrá un promotor que es reconocido por la célula diana y que está operativamente unido a la secuencia de interés, componentes víricos y otras secuencias descritas en la presente memoria. Un promotor es un elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ácido nucleico que permite la unión de la ARN polimerasa y que se produzca la transcripción. Los promotores pueden ser inducibles, constitutivos, temporalmente activos o específicos de tejido. La actividad de los promotores inducibles se induce por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos. Los promotores inducibles pueden ser una herramienta útil en la ingeniería genética debido a que la expresión de los genes a los que están operativamente unidos se puede activar o desactivar en ciertas etapas del desarrollo de un organismo, su fabricación o en un tejido en particular. Los promotores inducibles se pueden agrupar como promotores químicamente regulados y promotores físicamente regulados. Los promotores químicamente regulados típicos incluyen, pero no se limitan a promotores regulados por alcohol (p. ej., promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa I (alcA)), promotores regulados portetraciclinas (p. ej., promotor sensible a tetraciclinas), promotor regulado por esteroides (p. ej., promotor basado en receptor de glucocorticoides (GR) de rata, promotor basado en receptor de estrógenos humano (ER), promotor basado en receptor de ecdisona de polilla y los promotores basados en la superfamilia de receptores de esteroides/retinoides/tiroides), promotores regulados por metales (p. ej., promotores basados en el gen de la metalotioneína), y promotores relacionados con patogénesis (p. ej., promotores basados en proteínas relacionadas con patógenos (PR) del maíz y Arabidopsis). Los promotores físicamente regulados típicos incluyen, pero no se limitan a, promotores regulados por temperatura (p. ej., promotores de choque térmico), y promotores regulados por luz (p. ej., promotores SSU de la soja).
Un experto en la técnica podrá seleccionar un promotor adecuado basándose en las circunstancias específicas. Muchos promotores diferentes son bien conocidos en la técnica, así como lo son los métodos para unir operativamente el promotor al gen a expresar. Se pueden usar tanto secuencias de promotores naturales como muchos promotores heterólogos para dirigir la expresión en la célula de empaquetamiento y la célula diana. Sin embargo, se prefieren promotores heterólogos, ya que en general permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos de la proteína deseada en comparación con el promotor natural.
El promotor se puede obtener, por ejemplo, de genomas de virus como el poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus, papilomavirus bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40). El promotor también puede ser, por ejemplo, un promotor heterólogo de mamífero, p. ej., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, un promotor de choque térmico, o el promotor asociado normalmente con la secuencia natural, con la condición de que dichos promotores sean compatibles con la célula diana. En una realización, el promotor es el promotor vírico que se encuentra de forma natural en un sistema de expresión vírico. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor específico de células dendríticas. El promotor específico de células dendríticas puede ser, por ejemplo, el promotor CD11c.
La transcripción se puede aumentar insertando una secuencia de potenciador en el(los) vector(es). Los potenciadores son típicamente elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Ahora se conocen muchas secuencias de potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina) y de virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica específica de antígeno, pero preferiblemente se localiza en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias se encuentran a menudo en las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o víricos y son bien conocidas en la técnica.
El genoma del vector vírico también puede contener elementos genéticos adicionales. Los tipos de elementos que se pueden incluir en la construcción no están limitados de ninguna manera y se pueden elegir para lograr un resultado particular. Por ejemplo, se puede incluir una señal que facilite la entrada nuclear del genoma vírico en la célula diana. Un ejemplo de dicha señal es la señal flap del HIV-1. Además, se pueden incluir elementos que faciliten la caracterización del sitio de integración de provirus en la célula diana. Por ejemplo, se puede incluir una secuencia de supresor ámbar de ARNt en la construcción. También se puede incluir una secuencia aislante, p. ej., de p-globina de pollo en la construcción del genoma vírico. Este elemento reduce la posibilidad de silenciar un provirus integrado en la célula diana debido a los efectos de metilación y heterocromatinización. Además, el aislante puede proteger al potenciador interno, promotor y gen exógeno de los efectos posicionales positivos o negativos del ADN circundante en el sitio de integración en el cromosoma. Además, el genoma del vector puede contener uno o más elementos genéticos diseñados para mejorar la expresión del gen de interés. Por ejemplo, se puede colocar un elemento sensible al virus de la hepatitis de la marmota (WRE) en la construcción (Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74: 3668­ 3681; Deglon et al. 2000. Hum. Gene Ther. 11: 179- 190).
El genoma del vector vírico se construye típicamente en una forma de plásmido que se puede transfectar en una línea celular productora o de empaquetamiento. El plásmido en general comprende secuencias útiles para la replicación del plásmido en bacterias. Dichos plásmidos son bien conocidos en la técnica. Además, los vectores que incluyen un origen de replicación procariota también pueden incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable o seleccionable, tal como la resistencia a un fármaco. Los productos de resistencia a fármacos bacterianos típicos son los que confieren resistencia a la ampicilina o tetraciclina.
Los plásmidos que contienen uno o más de los componentes descritos en la presente memoria se construyen fácilmente usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Para que el análisis confirme las secuencias correctas en plásmidos construidos, el plásmido se puede replicar en E. Coli, purificar y analizar por digestión con endonucleasas de restricción o determinar su secuencia de ADN por métodos convencionales.
También se pueden usar vectores construidos para la expresión transitoria en células de mamíferos. La expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que se puede replicar de manera eficaz en una célula hospedante, de modo que la célula hospedante acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles altos de un polipéptido codificado por el polinucleótido específico de antígeno en el vector de expresión. Véase, Sambrook et al., véase antes, pág. 16.17-16.22. Otros vectores y métodos adecuados para la adaptación a la expresión de polipéptidos son bien conocidos en la técnica y se adaptan fácilmente a las circunstancias específicas.
Usando las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria, un experto en la técnica reconocerá que la eficacia de un sistema de expresión particular se puede ensayar transfectando células de empaquetamiento con un vector que comprende un gen que codifica una proteína indicadora y midiendo la expresión usando una técnica adecuada, por ejemplo, midiendo la fluorescencia de un conjugado de proteína fluorescente verde. Los genes indicadores adecuados son bien conocidos en la técnica.
Tipos de secuencias de interés
La secuencia de interés no está limitada de ninguna manera e incluye cualquier ácido nucleico que un experto en la técnica desee tener integrado, transcrito y expresado en la célula diana. El producto puede ser una proteína o un ácido nucleico. La secuencia de interés puede codificar una proteína o una molécula de ácido nucleico, incluyendo ARNip, microARN, un ARN bicatenario autocomplementario en el que la región complementaria tiene una longitud mayor de aproximadamente 20 ribonucleótidos, o un ARN que es complementario a un ARN mensajero, donde la unión de dicho ARN complementario (antiparalelo) al ARN mensajero bloquea su capacidad para ser traducido en proteína. En algunos casos, la secuencia de interés puede codificar un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. En particular, son deseables antígenos tumorales y antígenos de enfermedades infecciosas de agentes tales como el HIV, HSV, HCV, HPV, malaria o tuberculosis. Además, se pueden incluir múltiples secuencias de interés en un solo vector.
En ciertos casos, la secuencia de interés puede ser un gen que codifica un ARN inhibidor pequeño (ARNip) o un microARN (miARN) de interés que regula por disminución la expresión de una molécula. Por ejemplo, se puede usar el gen que codifica un ARNip o un microRNA para regular por disminución la expresión de reguladores negativos en una célula, incluyendo los que inhiben la activación o maduración de células dendríticas. Los ARNip y los microARN son bien conocidos en la técnica (Fire et al., Nature 391:806, 1998; véase también "The RNA Interference Resource" de Applied Biosystems, Trang et al., Oncogene Suppl 2:S52, 2008; Taganov, K., et al. 2007. Immunity 26:133-137; Dahlberg, J.E. y E. Lund. 2007. Sci. STKE 387:pe25; Tiemann y Rossi, EMBO Mol Med 1: 142, 2009). Alternativamente, la secuencia de interés puede codificar un ARN bicatenario autocomplementario en el que la región complementaria es mayor de aproximadamente 20 ribonucleótidos de longitud, o un ARN antiparalelo que es mayor de aproximadamente 20 ribonucleótidos de longitud. Los expertos en la materia apreciarán que las moléculas de ARNip, ARNip, ARNbc y ARN antiparalelo se pueden expresar a partir de un promotor de ARN polimerasa III o, como alternativa, pueden ser un componente de un ARN no codificante que es transcrito a partir de un promotor de la ARN polimerasa II.
Además, la secuencia de interés puede codificar más de un producto. En algunas configuraciones, la secuencia que se va a suministrar puede comprender múltiples genes que codifican al menos una proteína, al menos un ARNip, al menos un microARN, al menos un ARNbc o al menos una molécula de ARN antiparalelo o cualquiera de sus combinaciones. Por ejemplo, la secuencia que se va a suministrar puede incluir uno o más genes que codifican uno o más antígenos contra los que se desea una respuesta inmunitaria. El uno o más antígenos pueden estar asociados con una sola enfermedad o trastorno, o pueden estar asociados con múltiples enfermedades y/o trastornos. En algunos casos, se puede incluir un gen que codifica una proteína reguladora inmunitaria junto con un gen que codifica un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria, y la combinación puede provocar y regular la respuesta inmunitaria en la dirección y magnitud deseadas. En otros casos, se puede construir una secuencia que codifica una molécula de ARNip, microARN, ARNbc o ARN antiparalelo con un gen que codifica un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria, y la combinación puede regular el alcance de la respuesta inmunitaria. Los productos se pueden producir como un producto de fusión inicial en el que la secuencia codificante está en relación funcional con un promotor. Alternativamente, los productos pueden estar codificados por separado y cada secuencia codificante en relación funcional con un promotor. Los promotores pueden ser iguales o diferentes.
En ciertas configuraciones, los vectores contienen secuencias de polinucleótidos que codifican factores de maduración/estimulación de células dendríticas. Las moléculas estimuladoras de ejemplo incluyen GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (CD40L), CD40 inducible por fármacos (iCD40), y similares. Estos polinucleótidos están típicamente bajo el control de uno o más elementos reguladores que dirigen la expresión de las secuencias codificantes en células dendríticas. La maduración de las células dendríticas contribuye a una vacunación satisfactoria (Banchereau, J y Palucka, A.K. Nat. Rev. Immunol. 5:296-306 (2005); Schuler, G. et al. Curr. Opin. Immunol. 15:138-147 (2003); Figdor, C.G. et al. Nat. Med. 10:475-480 (2004)). La maduración puede transformar las DC de células activamente implicadas en la captura de antígenos a células especializadas para el cebado de células T. Por ejemplo, la vinculación de CD40 por CD40L en células T auxiliares c D4 es una señal crítica para la maduración de DC, que da como resultado una potente activación de las células T CD8. Dichas moléculas estimuladoras también se denominan factores de maduración o factores estimuladores de la maduración. Los puntos de control inmunitarios representan barreras significativas para la activación de la inmunidad celular funcional en el cáncer, y los anticuerpos antagonistas específicos para ligandos inhibidores en células T, incluyendo CTLA4 y muerte programada-1 (PD-1), son ejemplos de agentes dirigidos que se están evaluando en las clínicas. Un mecanismo de tolerancia importante en las infecciones crónicas y el cáncer es el agotamiento funcional de células T específicas de Ag que expresan niveles altos de PD-1. Puesto que se ha mostrado que la potencia de la inmunización terapéutica mejora significativamente por la combinación con el control del punto de control inmunitario, como un ejemplo no limitante, los expertos en la técnica podrán apreciar que un procedimiento alternativo para inhibir el punto de control inmunitario es inhibir la expresión de los ligandos de muerte programada (PD) uno y dos (PD-L1/L2). Una forma de lograr la inhibición es mediante la expresión de moléculas de ARN como las que se describen en la presente memoria, que reprimen la expresión de PD-L1/L2 en las DC transducidas con el vector de lentivirus que codifica una o más de las moléculas de ARN. La maduración de las DC o la expresión de elementos particulares, tal como los puntos de control inmunitario, por ejemplo ligandos de PD-1, se pueden caracterizar por análisis de citometría de flujo de la regulación por aumento de un marcador de superficie tal como el MHC II y el perfil de las quimiocinas y citoquinas expresadas.
Se puede incluir una secuencia que codifica un producto detectable, normalmente una proteína, para permitir la identificación de las células que están expresando el producto deseado. Por ejemplo, se incorpora una proteína marcadora fluorescente, como la proteína verde fluorescente (GFP), a la construcción junto con una secuencia de interés (p. ej., que codifica un antígeno). En otros casos, la proteína puede ser detectable por un anticuerpo o la proteína puede ser una enzima que actúa en un sustrato para producir un producto detectable, o un producto que permite la selección de una célula diana transfectada o transducida, por ejemplo, confiere resistencia a fármaco, como resistencia a la higromicina. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas adecuadas para su uso en células eucariotas, p. ej., neomicina, metotrexato, blasticidina, entre otros conocidos en la técnica, o complementan deficiencias auxotróficas, o suministran nutrientes críticos retenidos de los medios. El marcador seleccionable puede estar presente opcionalmente en un plásmido separado e introducirse por cotransfección.
Se pueden usar una o más unidades de expresión multicistrónicas que incluyen dos o más de los elementos (p. ej., secuencia(s) de interés, la molécula de la envuelta, factores de maduración de DC) necesarios para la producción del virus deseado en células de empaquetamiento. El uso de vectores multicistrónicos reduce el número total de moléculas de ácido nucleico requeridas y, por lo tanto, evita las posibles dificultades asociadas con la coordinación de la expresión de múltiples genomas de vectores. En un vector multicistrónico, los diferentes elementos que se van a expresar están operativamente unidos a uno o más promotores (y otros elementos de control de expresión, según sea necesario). En algunas configuraciones, un vector multicistrónico comprende una secuencia de interés, una secuencia que codifica un producto indicador y elementos víricos. La secuencia de interés típicamente codifica un antígeno y, opcionalmente, un factor de maduración de DC. Aveces, el vector multicistrónico comprende un gen que codifica un antígeno, un gen que codifica un factor de maduración de DC y elementos víricos.
Los vectores lentivíricos pseudotipados descritos se pueden modificar genéticamente para expresar más de uno, p. ej., dos, tres o cuatro, antígenos a la vez. Se conocen varios métodos en la técnica para expresar simultáneamente más de un gen a partir de un solo vector. Por ejemplo, los vectores pueden comprender múltiples promotores fusionados a los marcos de lectura abiertos (ORF) de los genes, inserción de señales de empalme entre genes, fusión de genes cuyas expresiones están dirigidas por un solo promotor, inserción de sitios de escisión proteolítica entre genes, inserción de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) entre genes, inserción de promotores bidireccionales entre genes y/o péptidos 2A de "autoescisión". Cada componente que se va a expresar en un vector de expresión multicistrónico puede estar separado, por ejemplo, por un elemento de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) o un elemento 2A vírico, para permitir la expresión separada de las diferentes proteínas del mismo promotor. Los elementos IRES y elementos 2A son conocidos en la técnica (patente de EE.UU. N° 4.937.190; de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626). En una realización, se usan oligonucleótidos que codifican secuencias de sitios de escisión de furina (RAKR) (Fang et al., 2005. Nat. Biotech 23: 584-590) unidos a secuencias similares a 2A de virus de la fiebre aftosa (FMDV; F2A), teschovirus porcino-1 (P2A), el virus de la rinitis equina A (ERAV; E2A) y el virus Thosea asigna (TaV; T2A) (Szymczak et al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594) para separar los elementos genéticos en un vector multicistrónico. La secuencia consenso del péptido 2A es D(V/I)EXNPGP (SEQ ID NO: 56). En algunas realizaciones, el vector lentivírico comprende un polinucleótido que codifica T2A (SEQ ID NO: 57). En algunas realizaciones, el péptido 2A es codificado por el polinucleótido de s Eq ID NO: 52. La eficacia de un vector multicistrónico particular se puede ensayar fácilmente detectando la expresión de cada uno de los genes usando protocolos convencionales.
La expresión de dos o más antígenos también se puede lograr usando los sitios internos de entrada al ribosoma (IRES). Los IRES permiten que los ribosomas eucariotas entren y escaneen un ARNm en una posición distinta de la estructura de 5' m7 G-cap. Si está situado internamente, p. ej., 3' de una primera región codificante (o cistrón), un IRES permitirá la traducción de una segunda región codificante dentro del mismo transcrito. La segunda región codificante se identifica por el primer ATG encontrado después del IRES. Los elementos IRES de ejemplo incluyen IRES víricos, tales como el IRES de picornavirus y los IRES de cardiovirus (véase, p. ej., patente de EE.UU. N° 4.937.190) y elementos IRES no víricos que se encuentran en las UTR 5' (p. ej., los elementos de transcritos que codifican la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (BiP) (Macejak et al., Nature, 35390-4, 1991); Drosophila Antennapedia (Oh et al., Genes Dev. 6:1643-53, 1992) y Ultrabithorax (Ye et al., Mol. Cell Biol., 17:1714-21, 1997); factor de crecimiento de fibroblastos 2 (Vagner et al., Mol. Cell Biol., 15:35-44, 1995); factor de iniciación eIF4G (Gan et al., J. Biol. Chem. 273:5006-12, 1998); protooncogén c-myc (Nanbru et al., J. Biol. Chem., 272:32061-6, 1995; Stoneley, Oncogene, 16:423-8, 1998); y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Stein etal., Mol. Cell Biol., 18:3112-9, 1998).
La expresión de dos o más antígenos también se puede lograr usando promotores bidireccionales, es decir, una región de promotor o dos promotores clonados consecutivos cuyas direcciones de lectura se alejan una de la otra, y desde la cual se transcriben dos marcos de lectura abiertos que flanquean la región del promotor. Los ejemplos de dichos promotores incluyen los promotores de PDGF-A, virus neurotrópico JC, BRCA1, transcobalamina II y dipeptidilpeptidasa IV.
En un ejemplo específico, el genoma del vector vírico comprende: una secuencia de potenciador/promotor de citomegalovirus (CMV); las secuencias R y U5 de la LTR 5' del HIV; una secuencia de empaquetamiento (y ); la señal flap del HIV-1; un potenciador interno; un promotor interno; un gen de interés; el elemento sensible al virus de la hepatitis de la marmota; una secuencia del supresor ámbar de ARNt; un elemento U3 con una eliminación de su secuencia de potenciador; el aislador de p-globina de pollo; y las secuencias R y U5 de la LTR 3' del HIV. En algunos ejemplos, el genoma del vector comprende una LTR 5' lentivírica intacta y una LTR 3' autoinactivante (Iwakuma et al. Virology 15: 120, 1999).
La construcción del genoma del vector se puede lograr usando cualquier técnica de ingeniería genética adecuada conocida en la técnica, incluyendo, sin limitación, las técnicas convencionales de digestión con endonucleasas de restricción, ligación, transformación, purificación de plásmidos y secuenciación de ADN, por ejemplo, como se describe en Sambrook et al. (1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1997)) y "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000).
En algunas realizaciones, la secuencia de interés codifica al menos un antígeno. Se puede suministrar cualquier antígeno que esté asociado con una enfermedad o trastorno a células dendríticas usando las partículas víricas como se describe en la presente memoria. Se identifica un antígeno que está asociado con la enfermedad o trastorno para la preparación de una partícula vírica que se dirige a las células dendríticas. Los antígenos asociados con muchas enfermedades y trastornos son bien conocidos en la técnica. Se puede saber previamente que un antígeno está asociado con la enfermedad o trastorno, o se puede identificar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un antígeno para un tipo de cáncer que está sufriendo un paciente puede ser conocido, tal como un antígeno asociado a tumor o se puede identificar a partir del propio tumor por cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.
Se conocen antígenos asociados a tumores para una variedad de cánceres que incluyen, por ejemplo, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, melanoma y cáncer de mama. En algunos cánceres de mama, por ejemplo, el receptor Her-2 es sobreexpresado en la superficie de las células cancerosas. Los antígenos tumorales de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, MAGE, p. ej., MAGE-A3 y MAGE-A1, BAGE, RAGE y NY-ESO-1, que son antígenos no mutados expresados en las áreas con privilegios inmunitarios de los testículos y en una variedad de células tumorales; antígenos tumorales específicos de linaje, tales como los antígenos del linaje melanocito-melanoma, MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa y proteína relacionada con la tirosinasa, p. ej., TRP2; carcinoma de células renales - 5T4, SM22-alfa, anhidrasas carbónicas I y IX (también conocidas como G250), factores inducibles por hipoxia (p. ej., HIF-1alfa y HIF-2alfa), VEGF o antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno específico de la próstata (PSA), fosfatos de ácido prostático y antígeno epitelial con seis dominios transmembranales de la próstata (STEAP), NKX3.1, que son antígenos expresados en células normales y neoplásicas derivadas del mismo tejido; proteínas/péptidos epítopos derivados de genes mutados en células tumorales o genes transcritos en diferentes niveles en tumores en comparación con células normales, tales como la enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reordenación bcr/abl, Her2/neu, p53mutado o de tipo natural, citocromo P4501B1, y secuencias intrónicas expresadas anormalmente, tales como N-acetilglucosaminiltransferasa-V; reordenamientos clonales de genes de inmunoglobulina que generan idiotipos únicos en el mieloma y los linfomas de células B; proteínas/péptidos epítopos derivados de procesos oncovíricos, tales como las proteínas E6 y E7 del papilomavirus humano; proteínas oncofetales no mutadas con expresión selectiva del tumor, tal como el antígeno carcinoembrionario y la alfa-fetoproteína. Se han revisado una serie de antígenos asociados a tumores (ver, por ejemplo, "Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes," Boon T, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review Of Immunology 12: 337-365, 1994; "A listing of human tumor antigens recognized by T cells," Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cáncer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 MAR 2001).
En algunas o cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el vector lentivírico pseudotipado comprende un polinucleótido que codifica MAGE-A3 (SEQ ID NO: 58). En algunas realizaciones, MAGE-A3 es codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 50. En algunas realizaciones, MAGE-A3 es codificada por el polinucleótido de al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 por ciento de identidad con la SEQ ID NO: 50. En algunas realizaciones, el vector lentivírico pseudotipado comprende un polinucleótido que codifica un fragmento de MAGE-A3 de al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 o 310 aminoácidos de la SEQ ID NO: 58. En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica una variante de MAGE-A3 que tiene al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 por ciento de identidad con la SEQ ID NO: 58. En algunas realizaciones, el vector lentivírico pseudotipado comprende un polinucleótido que codifica NY-ESO-1 (SEQ ID NO: 59). En algunas realizaciones, NY-ESO-1 es codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 51. En algunas realizaciones, MAGE-A3 es codificada por el polinucleótido de al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 99 por ciento de identidad con la SEQ ID NO: 51. En algunas realizaciones, el vector lentivírico pseudotipado comprende un polinucleótido que codifica un fragmento de NY-ESO-1 de al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 o 170 aminoácidos de la SEQ ID NO: 59. En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica una variante de NY-ESO-1 que tiene al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 por ciento de identidad con la SEQ ID NO: 59. En algunas realizaciones, el vector lentivírico pseudotipado comprende un polinucleótido que codifica MAGE-A3 (SEQ ID NO: 58) y un polinucleótido que codifica NY-ESO-1 (SEQ ID NO: 59). En algunas o cualquiera de las realizaciones, NY-ESO-1 y MAGE-A3 son expresadas a partir del mismo transcrito que una proteína de fusión que comprende NY-ESO-1 y MAGE-A3 y un péptido A2 de autoescisión entre los dos antígenos, p. ej., SEQ ID NO: 56 o 57. Los antígenos pueden estar en cualquier orden (p. ej., NY-ESO-1 primero y MAGE-A3 segundo, o MAGE-A3 primero y NY-ESO-1 segundo).
El antígeno también puede ser un antígeno asociado con una enfermedad infecciosa, tal como, por ejemplo, HIV/SIDA. El antígeno puede ser, por ejemplo, gp120 (Klimstra, WB, et al. 2003. J Virol 77: 12022-12032; Bernard, KA, et al. 2000. Virology 276: 93-103; Byrnes, AP, et al. 1998. J Virol 72: 7349-7356). Otros antígenos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: gag, pol, env, tat, nef y rev (Lieberman, J. et al. 1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13 (5):383-392; Menendez-Arias, Letal. 1998. ViralImmunol 11 (4): 167-181).
Los ejemplos de antígenos víricos incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de adenovirus, polipéptidos de alfavirus, polipéptidos de calicivirus, p. ej., un antígeno de cápside de calicivirus, polipéptidos de coronavirus, polipéptidos de virus del moquillo, polipéptidos de virus del ébola, polipéptidos de enterovirus, polipéptidos de flavivirus, polipéptidos del virus de la hepatitis (AE), p. ej., un antígeno del núcleo o de la superficie de la hepatitis B, o glicoproteínas E1 o E2 del virus de la hepatitis C, proteínas del núcleo o no estructurales, polipéptidos del herpesvirus, p. ej., una glicoproteína del virus del herpes simple o del virus varicella zoster, polipéptidos del virus de inmunodeficiencia, p. ej., la envuelta o proteasa del virus de inmunodeficiencia humana, polipéptidos del virus de la peritonitis infecciosa, polipéptidos del influenzavirus, p. ej., una hemaglutinina de la gripe A, neuraminidasa o nucleoproteína, polipéptidos del virus leucémico, polipéptidos del virus de Marburg, polipéptidos del ortomixovirus, polipéptidos del papilomavirus, polipéptidos del virus de parainfluenza, p. ej., la hemaglutinina/neuraminidasa, polipéptidos de paramixovirus, polipéptidos de parvovirus, polipéptidos de pestivirus, polipéptidos de picornavirus, p. ej., polipéptidos de la cápside de poliovirus, polipéptidos de virus de la viruela, p. ej., un polipéptido del virus vaccinia, polipéptidos del virus de la rabia, p. ej., una glicoproteína G del virus de la rabia, polipéptidos de reovirus, polipéptidos de retrovirus y polipéptidos de rotavirus.
Los ejemplos de antígenos bacterianos incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de Actinomyces, polipéptidos de Bacillus, polipéptidos de bacteroides, polipéptidos de Bordetella, polipéptidos de Bartonella, polipéptidos de Borrelia, p. ej., B. burgdorferi OspA, polipéptidos de Brucella, polipéptidos de Campylobacter, polipéptidos de Capnocytophaga, polipéptidos de Chlamydia, polipéptidos de Clostridium, polipéptidos de Corynebacterium, polipéptidos de Coxiella, polipéptidos de Dermatophilus, polipéptidos de Enterococcus, polipéptidos de Ehrlichia, polipéptidos de Escherichia, polipéptidos de Francisella, polipéptidos de Fusobacterium, polipéptidos de Haemobartonella, polipéptidos de Haemophilus, p. ej., proteína de la membrana externa de H. influenzae tipo b, polipéptidos de Helicobacter, polipéptidos de Klebsiella, polipéptidos de bacterias de forma L, polipéptidos de Leptospira, polipéptidos de Listeria, polipéptidos de Mycobacteria, polipéptidos de Mycoplasma, polipéptidos de Neisseria, polipéptidos de Neorickettsia, polipéptidos de Nocardia, polipéptidos de Pasteurella, polipéptidos de Peptococcus, polipéptidos de Peptostreptococcus, polipéptidos de Pneumococcus, polipéptidos de Proteus, polipéptidos de Pseudomonas, polipéptidos de Rickettsia, polipéptidos de Rochalimaea, polipéptidos de Salmonella, polipéptidos de Shigella, polipéptidos de Staphylococcus, polipéptidos de Streptococcus, p. ej., proteínas de S. pyogenes M, polipéptidos de Treponema, y polipéptidos de Yersinia, p. ej., antígenos de Y. pestis F1 y V.
Los ejemplos de antígenos fúngicos incluyen, pero no se limitan a polipéptidos de Absidia, polipéptidos de Acremonium, polipéptidos de Alternaria, polipéptidos de Aspergillus, polipéptidos de Basidiobolus, polipéptidos de Bipolaris, polipéptidos de Blastomyces, polipéptidos de Candida, polipéptidos de Coccidioides, polipéptidos de Conidiobolus, polipéptidos de Cryptococcus, polipéptidos de Curvalaria, polipéptidos de Epidermophyton, polipéptidos de Exophiala, polipéptidos de Geotrichum, polipéptidos de Histoplasma, polipéptidos de Madurella, polipéptidos de Malassezia, polipéptidos de Microsporum, polipéptidos de Moniliella, polipéptidos de Mortierella, polipéptidos de Mucor, polipéptidos de Paecilomyces, polipéptidos de Penicillium, polipéptidos de Phialemonium, polipéptidos de Phialophora, polipéptidos de Prototheca, polipéptidos de Pseudallescheria, polipéptidos de Pseudomicrodochium, polipéptidos de Pythium, polipéptidos de Rhinosporidium, polipéptidos de Rhizopus, polipéptidos de Scolecobasidium, polipéptidos de Sporothrix, polipéptidos de Stemphylium, polipéptidos de Trichophyton, polipéptidos de Trichosporon, y polipéptidos de Xylohypha.
Los ejemplos de antígenos de parásitos protozoarios incluyen, pero no se limitan a polipéptidos de Babesia, polipéptidos de Balantidium, polipéptidos de Besnoitia, polipéptidos de Cryptosporidium, polipéptidos de Eimeria, polipéptidos de Encephalitozoon, polipéptidos de Entamoeba, polipéptidos de Giardia, polipéptidos de Hammondia, polipéptidos de Hepatozoon, polipéptidos de Isospora, polipéptidos de Leishmania, polipéptidos de Microsporidia, polipéptidos de Neospora, polipéptidos de Nosema, polipéptidos de Pentatrichomonas, polipéptidos de Plasmodium, p. ej., circumsporozoíto de P. falciparum (PfCSP), proteína de superficie de esporozoíto 2 (PfSSP2), extremo carboxilo del antígeno 1 del estado del hígado (PfLSA1 extremo c), y proteína exportada 1 (PfExp-1), polipéptidos de Pneumocystis, polipéptidos de Sarcocystis, polipéptidos de Schistosoma, polipéptidos de Theileria, polipéptidos de Toxoplasma, y polipéptidos de Trypanosoma.
Los ejemplos de antígenos de parásitos helmintos incluyen, pero no se limitan a polipéptidos de Acanthocheilonema, polipéptidos de Aelurostrongylus, polipéptidos de Ancylostoma, polipéptidos de Angiostrongylus, polipéptidos de Ascaris, polipéptidos de Brugia, polipéptidos de Bunostomum, polipéptidos de Capillaria, polipéptidos de Chabertia, polipéptidos de Cooperia, polipéptidos de Crenosoma, polipéptidos de Dictyocaulus, polipéptidos de Dioctophyme, polipéptidos de Dipetalonema, polipéptidos de Diphyllobothrium, polipéptidos de Diplydium, polipéptidos de Dirofilaria, polipéptidos de Dracunculus, polipéptidos de Enterobius, polipéptidos de Filaroides, polipéptidos de Haemonchus, polipéptidos de Lagochilascaris, polipéptidos de Loa, polipéptidos de Mansonella, polipéptidos de Muellerius, polipéptidos de Nanophyetus, polipéptidos de Necator, polipéptidos de Nematodirus, polipéptidos de Oesophagostomum, polipéptidos de Onchocerca, polipéptidos de Opisthorchis, polipéptidos de Ostertagia, polipéptidos de Parafilaria, polipéptidos de Paragonimus, polipéptidos de Parascaris, polipéptidos de Physaloptera, polipéptidos de Protostrongylus, polipéptidos de Setaria, polipéptidos de Spirocerca polipéptidos de Spirometra, polipéptidos de Stephanofilaria, polipéptidos de Strongyloides, polipéptidos de Strongylus, polipéptidos de Thelazia, polipéptidos de Toxascaris, polipéptidos de Toxocara, polipéptidos de Trichinella, polipéptidos de Trichostrongylus, polipéptidos de Trichuris, polipéptidos de Uncinaria, de y polipéptidos Wuchereria.
Los ejemplos de antígenos de ectoparásitos incluyen, pero no se limitan a polipéptidos (que incluyen antígenos protectores así como alérgenos) de pulgas; garrapatas, incluyendo garrapatas duras y blandas; moscas, tales como mosquillas, mosquitos, moscas de la arena, moscas negras, tábanos, moscas del cuerno, moscas del venado, moscas tse-tsé, moscas de los establos, moscas causantes de miasis y beatillas; hormigas; arañas; piojos; ácaros y hemípteros, tales como chinches de cama y chinches asesinas.
Una vez que se ha identificado y seleccionado un antígeno, se identifica una secuencia que codifica el antígeno deseado. Preferiblemente, la secuencia comprende un ADNc. Tras la infección vírica, la secuencia de interés (p. ej., una que codifica el antígeno) es expresada por las células dendríticas diana. Si se ponen en contacto ex vivo, las células dendríticas diana se transfieren de nuevo al paciente, por ejemplo, por inyección, donde interaccionan con células inmunitarias que son capaces de generar una respuesta inmunitaria contra el antígeno deseado. En realizaciones preferidas, se inyecta al paciente el virus recombinante donde transduce las células dendríticas diana in situ. Las células dendríticas expresan entonces el antígeno particular asociado con una enfermedad o trastorno que se va a tratar, y el paciente es capaz de montar una respuesta inmunitaria eficaz contra la enfermedad o trastorno.
El genoma del vector vírico puede contener una secuencia de polinucleótido que codifica más de un antígeno, y tras la transducción de una célula dendrítica diana, genera respuestas inmunitarias contra la multitud de antígenos suministrados a la célula. En algunas realizaciones, los antígenos están relacionados con una sola enfermedad o trastorno. En otras realizaciones, los antígenos están relacionados con múltiples enfermedades o trastornos. En algunas realizaciones, el genoma del vector vírico contiene una secuencia de polinucleótido que codifica MART-1/Melan-A, NY-ESO-1 y MAGE.
Producción de partículas víricas.
Se puede usar cualquiera de una variedad de métodos ya conocidos en la técnica para producir partículas víricas infecciosas, p. ej., partículas lentivíricas, cuyo genoma comprende una copia de ARN del genoma del vector vírico. En un método, el genoma del vector vírico se introduce en una línea celular de empaquetamiento que contiene todos los componentes necesarios para empaquetar el ARN genómico vírico, transcrito desde el genoma del vector vírico, a partículas víricas. Alternativamente, el genoma del vector vírico puede comprender uno o más genes que codifican componentes víricos además de una o más secuencias de interés. Sin embargo, con el fin de prevenir la replicación del genoma en la célula diana, los genes víricos endógenos requeridos para la replicación normalmente se eliminarán y se proporcionarán por separado en la línea celular de empaquetamiento.
En general, las partículas del vector lentivírico son producidas por una línea celular que se transfecta con uno o más vectores plásmidos que contienen los componentes necesarios para generar las partículas. Estas partículas de vectores lentivíricos típicamente no son competentes para la replicación, es decir, solo son capaces de un único ciclo de infección. La mayoría de las veces, se usan múltiples vectores plasmídicos para separar los diferentes componentes genéticos que generan las partículas del vector lentivírico, principalmente para reducir la posibilidad de sucesos de recombinación que de otro modo podrían generar virus competentes para la replicación. Sin embargo, si se desea, se puede usar un solo vector plasmídico que tenga todos los componentes lentivíricos. Como ejemplo de un sistema que usa múltiples vectores plasmídicos, una línea celular se transfecta con al menos un plásmido que contiene el genoma del vector vírico (es decir, el plásmido del genoma del vector), que incluye las LTR, la secuencia de empaquetamiento que actúa en cis y la(las) secuencia(s) de interés, que a menudo están operativamente unidas a un promotor heterólogo, al menos un plásmido que codifica los componentes enzimáticos y estructurales del virus (es decir, el plásmido de empaquetamiento que codifica componentes tales como, Gag y Pol), y al menos un plásmido de la envuelta que codifica una glicoproteína de la envuelta de Arbovirus. Se pueden usar plásmidos adicionales para mejorar la producción de partículas de retrovirus, p. ej., plásmidos de expresión Rev, como se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica. Las partículas víricas salen a través de la membrana celular y comprenden un núcleo que incluye un genoma que contiene la secuencia de interés y una glicoproteína de la envuelta de Arbovirus que se dirige a las células dendríticas. Cuando la glicoproteína de Arbovirus es la glicoproteína E2 del virus Sindbis, la glicoproteína se modifica genéticamente para que tenga menor unión al sulfato de heparán en comparación con la glicoproteína E2 de la cepa HR de referencia (SEQ ID NO: 18).
La transfección de células de empaquetamiento con vectores plasmídicos de la presente descripción se puede llevar a cabo por métodos bien conocidos, y el método que se usa no está limitado de ninguna manera. Se conocen en la técnica varios sistemas de suministro no víricos, que incluyen, por ejemplo, electroporación, sistemas de suministro basados en lípidos que incluyen liposomas, suministro de a Dn "desnudo" y suministro usando compuestos de policiclodextrina, como los descritos en Schatzlein AG. (2001. Non-Viral Vectors in Cáncer Gene Therapy: Principies and Progresses. Anticancer Drugs). Se usan típicamente métodos de tratamiento de sales o lípidos catiónicos, véase, por ejemplo, Graham et al. (1973. Virol. 52: 456; Wigler et al. (1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373-76). El método de precipitación con fosfato de calcio es el usado con más frecuencia. Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducir el vector en células, incluyendo microinyección y fusión de protoplastos bacterianos.
La línea celular de empaquetamiento proporciona los componentes, que incluyen proteínas reguladoras y estructurales víricas, que se requieren en trans para el empaquetamiento del ARN genómico vírico en partículas de vectores lentivíricos. La línea celular de empaquetamiento puede ser cualquier línea celular que sea capaz de expresar proteínas lentivíricas y producir partículas de vectores lentivíricos funcionales. Algunas líneas celulares de empaquetamiento adecuadas incluyen células 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430). La línea celular de empaquetamiento puede expresar de manera estable las proteínas víricas necesarias. Dicha línea celular de empaquetamiento se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 6.218.181. Alternativamente, una línea celular de empaquetamiento se puede transfectar transitoriamente con moléculas de ácido nucleico que codifican una o más proteínas víricas necesarias junto con el genoma del vector vírico. Las partículas víricas resultantes se recogen y se usan para infectar una célula diana. El o los genes que codifican la o las glicoproteínas se clonan normalmente en un vector de expresión, tal como pcDNA3 (Invitrogen, CA, EE. UU.). Los vectores de expresión de células eucariotas son bien conocidos en la técnica y están disponibles de una serie de fuentes comerciales. Las células de empaquetamiento, como las células 293T, después se cotransfectan con el genoma del vector vírico que codifica una secuencia de interés (que codifica típicamente un antígeno), al menos un plásmido que codifica los componentes de empaquetamiento del virus y un vector para la expresión de la molécula diana. La envuelta es expresada en la membrana de la célula de empaquetamiento y es incorporada en el vector vírico.
La producción de virus se mide como se describe en la presente memoria y se expresa como IU por volumen. IU es una unidad infecciosa (del inglés infectious unit), o alternativamente unidades de transducción (TU, del inglés transduction units); IU y TU se pueden usar indistintamente como una medida cuantitativa del título de una preparación de partículas de vectores víricos. Como se describe en la presente memoria, se produce un virus en el que el genoma puede expresar un producto que se puede medir fácilmente. Se prefiere una proteína fluorescente, la proteína verde fluorescente. El vector lentivírico típicamente es no integrante. Después, el virus se administra a las células diana y se determina el número de células diana que expresan GFP, tal como por citometría de flujo. Después se calcula el título. El título es preferiblemente lo más alto posible, pero al menos 1 x 105 lU/ml, al menos 3 x 105 lU/ml, al menos 1 x 106 lU/ml, al menos 3 x 106 lU/ml, o al menos 1 x 107 lU/ml de líquido sobrenadante celular (antes de cualquier concentración). Alternativamente, el título es al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 100% del título del mismo vector lentivírico pseudotipado en las mismas células con envuelta de VSV-G.
Producción de partículas víricas altamente manosiladas
La proteína de la envuelta del virus Sindbis contiene cuatro glicanos unidos a N, dos en la proteína E2 y dos en la proteína E1. Dos N-glicanos del virus producidos en células de mamíferos en ausencia de un inhibidor de manosidasa l tienen una estructura con alto contenido en manosa (un glicano unido a N E2 y un glicano unido a N E1), mientras que los dos restantes tienen una estructura compleja. Los dos N-glicanos de estructura compleja están expuestos en la superficie de la proteína de la envuelta, mientras que los dos N-glicanos de estructura con alto contenido en manosa están enterrados dentro del centro del trímero de las proteínas de la envuelta. Las partículas del virus Sindbis con glicanos complejos unidos a N no se unen a DC-SIGN tan eficientemente como las partículas con glicoproteínas menos complejas, altamente manosiladas.
En la presente descripción, los autores de la invención demuestran que las partículas víricas producidas en células de mamíferos en presencia del inhibidor de manosidasa I, kifunensina, presentan inesperadamente un aumento significativo de la unión de DC-SIGN en comparación con las partículas producidas en presencia de DMNJ.
En algunas o cualquiera de las realizaciones, una célula de empaquetamiento de virus se cultiva en presencia de un inhibidor de manosidasa I. En algunas o cualquiera de las realizaciones, el inhibidor de la manosidasa I es kifunensina. En algunas realizaciones, la kifunensina está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 10 |jg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml, de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml o de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml.
En algunas o cualquiera de las realizaciones en donde una partícula de vector lentivírico pseudotipada comprende una glicoproteína E2 del virus Sindibis y una proteína Vpx, las partículas lentivíricos se producen en presencia de un inhibidor de manosidasa I. En algunas realizaciones, el inhibidor de manosidasa es desoxanojojirimicina (DMNJ). En realizaciones preferidas, el inhibidor de manosidasa es kifunensina. En algunas realizaciones, DMNJ está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 900 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 800 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 700 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 600 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 400 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 300 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 400 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 300 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 400 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 300 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, de aproximadamente 200 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml, o de aproximadamente 200 pg/ml a aproximadamente 400 pg/ml.
En algunas o cualquiera de las realizaciones, una partícula de vector lentivírico pseudotipada producida en presencia de un inhibidor de manosidasa I (p. ej., kifunensina) comprende una glicoproteína de envuelta (p. ej., virus E2 de Sindibis), en donde al menos el 60% de los glicanos unidos a N comprende una estructura Manosas (Mans), Man6, Man7, Mana y/o Mang. En algunas realizaciones, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de los glicanos unidos a N comprenden una estructura Man5, Man6, Man7, Mane y/o Man9 +.
En un escenario, se usan uno o más vectores para introducir secuencias de polinucleótidos en una línea celular de empaquetamiento para la preparación de una partícula de vector lentivírico pseudotipada con una glicoproteína de envuelta de virus Sindbis tal como E2, como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, la partícula de vector lentivírico está altamente manosilada. En algunas realizaciones, la partícula de vector lentivírico también comprende una proteína Vpx o una variante de la misma. En otras realizaciones más, la partícula de vector lentivírico está altamente manosilada y comprende una proteína Vpx o una variante de la misma. Los vectores pueden contener secuencias de polinucleótidos que codifican los diferentes componentes del virus que incluyen la envuelta del virus Sindbis, una secuencia o secuencias de interés (que típicamente codifican un antígeno), y cualesquiera componentes necesarios para la producción del virus que no proporciona la célula de empaquetamiento.
El perfil de glicosilación de una proteína de envuelta vírica se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden comparar ensayos de cambio de gel de glicoproteínas víricas tratadas con glucosidasas (p. ej., EndoH o PNGasaF) o que se dejan sin tratar. Otros métodos incluyen escindir glicanos de las glicoproteínas víricas y separar e identificar los componentes por HPLC y métodos de espectrometría de masas.
Suministro de los virus
El virus se puede suministrar a una célula diana de cualquier manera que permita al virus ponerse en contacto con la célula diana, p. ej., una célula dendrítica (DC), en la que se desea el suministro de un polinucleótido de interés. A veces, se introducirá una cantidad adecuada de virus en un ser humano u otro animal directamente (in vivo), p. ej., por inyección en el cuerpo. Los animales adecuados incluyen, sin limitación, caballos, perros, gatos, vacas, cerdos, ovejas, conejos, pollos u otras aves. Las partículas víricas se pueden inyectar por una serie de vías, tales como la intravenosa, intradérmica, subcutánea, intranodal, cavidad intraperitoneal o mucosa. El virus puede suministrar usando un dispositivo de inyección subdérmica, tal como los dispositivos descritos en las patentes de EE. UU.
7.241.275, 7.115.108, 7.108.679, 7.083.599, 7.083.592, 7.047.070, 6.971.999, 6.808.506, 6.780.171, 6.776.776, 6.689.118, 6.670.349, 6.569.143, 6.494.865, 5.997.501, 5.848.991, 5.328.483, 5.279.552, 4.886.499. También son adecuados otros sitios de inyección, tal como directamente en órganos que comprenden células diana. Por ejemplo, se puede usar la inyección intraganglionar, inyección intrabazo o inyección intramédula ósea para suministrar el virus al ganglio linfático, el bazo y la médula ósea, respectivamente. Dependiendo de las circunstancias particulares y la naturaleza de las células diana, la introducción se puede realizar por otros medios que incluyen, por ejemplo, inhalación o el contacto directo con tejidos epiteliales, por ejemplo, los de los ojos, boca o piel.
Alternativamente, se proporcionan células diana y se ponen en contacto con el virus in vitro, tal como en placas de cultivo. Las células diana típicamente son poblaciones de células que comprenden células dendríticas obtenidas de un sujeto sano o un sujeto que necesita tratamiento o en el que se desea estimular una respuesta inmunitaria a un antígeno. Los métodos para obtener células de un sujeto son bien conocidos en la técnica e incluyen flebotomía, escisión quirúrgica y biopsia. Las DC humanas también se pueden generar obteniendo progenitores hematopoyéticos humanos CD34a+ y usando un método de cultivo in vitro como se describe en otro lugar (p. ej., Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001)).
El virus se puede suspender en medio y añadir a los pocillos de una placa de cultivo, tubo u otro recipiente. Los medios que contienen el virus se pueden añadir antes de la siembra en placa de las células o después de haber sembrado en placa las células. Las células se incuban típicamente en una cantidad apropiada de medio para proporcionar viabilidad y para permitir concentraciones adecuadas de virus en el medio de manera que se produzca la transducción de la célula hospedante. Las células se incuban preferiblemente con el virus durante un tiempo suficiente para permitir que el virus infecte las células. Preferiblemente, las células se incuban con virus durante al menos 1 hora, al menos 5 horas o al menos 10 horas.
Tanto en el suministro in vivo como in vitro, se puede usar una parte alícuota de partículas víricas que contiene un número suficiente para infectar las células diana deseadas. Cuando se debe cultivar la célula diana, la concentración de las partículas víricas es en general de al menos 1 lU/jl, más preferiblemente al menos 10 lU/jl, incluso más preferiblemente al menos 300 lU/jl, incluso más preferiblemente al menos 1X104 lU/jl, incluso más preferiblemente al menos 1X105 lU/jl, incluso más preferiblemente al menos 1X106 lU/jl, o incluso más preferiblemente al menos 1X107 lU/jl.
Después de la infección con el virus in vitro, las células diana se pueden introducir (o reintroducir) en un ser humano u otro animal. Las células se pueden introducir en la dermis, debajo de la dermis o en el torrente sanguíneo periférico. Las células introducidas en un animal son preferiblemente células obtenidas de ese animal, para evitar una respuesta inmunitaria adversa. También se pueden usar células obtenidas de un donante que tiene un contexto inmunitario similar. Otras células que también se pueden usar incluyen las diseñadas para evitar una respuesta inmunológica adversa.
Se puede analizar en las células diana la integración, transcripción y/o expresión de la secuencia o gen(es) de interés, el número de copias del gen integrado y la ubicación de la integración, por ejemplo. Dicho análisis se puede llevar a cabo en cualquier momento y se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en la técnica.
En los sujetos a los que se administra un virus, o células dendríticas infectadas por el virus, se pueden analizar la ubicación de las células infectadas, expresión del polinucleótido o gen de interés suministrado por el virus, estimulación de una respuesta inmunitaria, y controlar los síntomas asociados. con una enfermedad o trastorno por cualquier método conocido en la técnica.
Los métodos para infectar células descritos antes no dependen de características individuales específicas de las células. Como resultado, se extienden fácilmente a una variedad de especies animales. En algunos casos, las partículas víricas se suministran a un humano o a células dendríticas humanas, y en otros casos se suministran a un animal tal como un ratón, caballo, perro, gato o ratón o a aves. Como se describe en la presente memoria, el genoma del vector vírico está pseudotipado para conferirle una amplia variedad de hospedantes, así como también especificidad de la célula diana. Un experto en la técnica también conocería los promotores internos adecuados y otros elementos para lograr la expresión deseada de una secuencia de interés en una especie animal particular. Por lo tanto, un experto en la técnica podrá modificar el método de infectar células dendríticas de cualquier especie. lnmunizaciones terapéuticas y profilácticas.
Las células dendríticas se pueden infectar con una partícula de vector de lentivirus como se describe en la presente memoria para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno, en particular aquellos para los que sería beneficiosa la activación de una respuesta inmunitaria en un paciente. Muchas de estas enfermedades son bien conocidas. Por ejemplo, las enfermedades o trastornos que son susceptibles de tratamiento o prevención mediante los métodos de la presente descripción incluyen, sin limitación, cánceres, enfermedades autoinmunitarias e infecciones, incluidas infecciones víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias. En un método, una enfermedad se trata con partículas víricas (p. ej., partículas víricas altamente manosiladas que comprenden una proteína Vpx) descritas en la presente memoria con el fin de suministrar una secuencia de interés a las células dendríticas, en donde la expresión de la secuencia de interés produce un antígeno específico de la enfermedad y conduce a la estimulación de respuestas inmunitarias celulares específicas de antígeno y respuestas inmunitarias humorales. En general, la secuencia de interés codifica un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria, pero normalmente no se expresa en una célula dendrítica. El antígeno es expresado y presentado por la célula dendrítica. El genoma del vector vírico puede codificar además un factor de maduración de DC.
En un uso típico, las partículas víricas suministran a las células dendríticas secuencias que codifican un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. El suministro se puede lograr poniendo en contacto células dendríticas con el virus in vitro, después de lo cual se proporcionan las células dendríticas infectadas a un paciente. Otras veces, el suministro se puede lograr suministrando el virus a un sujeto para infectar células dendríticas in vivo. Las células dendríticas estimulan entonces las células T o células B específicas de antígeno en un paciente para inducir respuestas inmunitarias humorales y celulares contra antígeno expresado. De esta manera, un paciente que sufre una enfermedad o trastorno se trata generando células inmunitarias con una especificidad deseada.
En algunos de los virus, los factores de maduración de las DC que activan y/o estimulan la maduración de las DC se suministran junto con la secuencia de interés. Alternativamente, las DC se activan mediante el suministro de factores de maduración de DC antes, simultáneamente o después del suministro del virus. Los factores de maduración de DC se pueden proporcionar por separado de la administración del virus.
Como se describe en la presente memoria, uno o más factores de modulación inmunitaria o maduración de DC pueden estar codificados por una o más secuencias que están contenidas en el genoma vírico y son expresadas después de que el virus infecta una célula dendrítica. Las secuencias que codifican factores de modulación inmunitaria también se pueden proporcionar en un vector separado que es cotransfectado con el vector vírico que codifica uno o más antígenos en una línea celular de empaquetamiento.
Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar para inmunoterapia adoptiva en un paciente. Como se ha descrito antes, se identifica un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. Se obtiene un polinucleótido que codifica el antígeno deseado y se empaqueta en un virus recombinante. Se obtienen del paciente células dendríticas diana y se transducen con un virus recombinante que contiene un polinucleótido que codifica el antígeno deseado. Las células dendríticas se transfieren de nuevo al paciente.
Las partículas víricas se pueden inyectar in vivo, donde infectan DC y suministran una secuencia de interés, que codifica típicamente un antígeno. La cantidad de partículas víricas es al menos 3X106 IU, y puede ser al menos 1X107 IU, al menos 3X107 IU, al menos 1X108 IU, al menos 3X108 IU, al menos 1X109 IU, o al menos 3X109 IU. A intervalos seleccionados, las DC de los órganos linfoides del receptor se pueden usar para medir la expresión, por ejemplo, mediante la observación de la expresión de marcadores, tales como GFP o luciferasa. Las técnicas de control de ácidos nucleicos y las mediciones de la actividad de la transcriptasa inversa (RT) también se pueden usar para analizar la biodistribución de partículas víricas. Células T de células mononucleares de sangre periférica, ganglios linfáticos, bazos, o tejido maligno o infectado por patógenos diana de receptores tratados con partículas de vectores lentivíricos se puede medirse a partir de la magnitud y la durabilidad de la respuesta a la estimulación de antígenos. Se puede analizar en células tisulares distintas de las DC, tales como las células epiteliales y células linfoides, la especificidad del suministro génico in vivo.
Las vacunas a menudo incluyen un adyuvante. Las partículas de vectores lentivíricos descritas en la presente memoria también se pueden administrar junto con un adyuvante. El adyuvante se puede administrar con las partículas de virus recombinantes, antes de las partículas de virus recombinantes, o después de las partículas de virus recombinantes. Si se administra con las partículas víricas, los adyuvantes deseables no alteran significativamente la integridad de la partícula vírica, tal como alterando la membrana vírica que contiene las glicoproteínas de la envuelta.
Se puede usar una variedad de adyuvantes en combinación con el virus para provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno codificado en el genoma del vector vírico. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrínseca a un antígeno sin causar cambios conformacionales en el antígeno que afecten la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen alumbre, monofosforil lípido A (MPL) 3-Des-O-acilado (véase GB 2220211). QS21 es un glucósido triterpénico o saponina aislado de la corteza del árbol de Quillaja Saponaria Molina que se encuentra en América del Sur (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente de EE.UU. N° 5.057.540). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tal como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimuladores inmunitarios, tal como monofosforil lípido A (véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998). Los adyuvantes se pueden administrar como un componente de una composición terapéutica con un agente activo o se pueden administrar por separado, antes, simultáneamente o después de la administración del agente terapéutico.
Una clase de adyuvantes son las sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos, tales como MPL o 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos o monoméricos tales como poli(ácido glutámico) o polilisina. Otra clase de adyuvantes son las formulaciones de emulsión de aceite en agua. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos, tales como péptidos de muramilo (p. ej., N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi-propilamida (DTP-DPP) Theramide.TM.), u otros componentes de la pared celular bacteriana. Las emulsiones de aceite en agua incluyen (a) MF59 (WO 90/14837), que contiene 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80 y 0,5% de Span 85 (que contiene opcionalmente diferentes cantidades de MTP-PE) formuladas en partículas submicrónicas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton Mass.), (b) SAF, que contiene 10% de escualano, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado con Pluronic L121 y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrónica o agitada con vórtice para generar una emulsión de mayor tamaño de partículas, y (c) Sistema adyuvante de Ribi (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80 y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil-lipido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL+CWS (Detox™). Otra clase de adyuvantes preferidos son los adyuvantes de saponina, tales como StimulonTM. (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) o partículas generadas allí tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores) e ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA). Otros adyuvantes incluyen citoquinas, tales como interleuquinas (IL-1, IL-2 e IL-12), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF).
Otro adyuvante que se puede usar con las composiciones de la presente memoria se identifica por la fórmula química (I):
Figure imgf000031_0001
en donde los restos A1 y A2 se seleccionan independientemente del grupo de hidrógeno, fosfato y sales de fosfato. Sodio y potasio son contraiones de ejemplo para las sales de fosfato. Los restos R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo de hidrocarbilo que tiene 3 a 23 carbonos, representado por C3-C23. Para mayor claridad, se explicará que cuando un resto se selecciona "independientemente de" un grupo específico que tiene varios miembros, debe entenderse que el miembro elegido para el primer resto no tiene impacto ni limita de ninguna manera la elección del miembro seleccionado para el segundo resto. Los átomos de carbono a los que se unen R1, R3, R5 y R6 son asimétricos y, por lo tanto, pueden existir en la estereoquímica R o S. En una realización todos esos átomos de carbono tienen la estereoquímica R, mientras que en otra realización todos esos átomos de carbono tienen la estereoquímica S.
"Hidrocarbilo" se refiere a un resto químico formado completamente de hidrógeno y carbono, donde la disposición de los átomos de carbono puede ser de cadena lineal o ramificada, no cíclica o cíclica, y la unión entre los átomos de carbono adyacentes puede ser por enlaces simples completamente, es decir, para proporcionar un hidrocarbilo saturado, o puede haber enlaces dobles o triples presentes entre cualesquiera dos átomos de carbono adyacentes, es decir, para proporcionar un hidrocarbilo insaturado, y el número de átomos de carbono en el grupo hidrocarbilo es entre 3 y 24 átomos de carbono. El hidrocarbilo puede ser un alquilo, donde los alquilos de cadena lineal representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo y similares, incluyendo undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, etc.; mientras que los alquilos ramificados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo, y similares. Los hidrocarbilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras que los hidrocarbilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo, y similares. Los hidrocarbilos insaturados contienen al menos un enlace doble o triple entre átomos de carbono adyacentes (denominados un "alquenilo" o "alquinilo", respectivamente, si el hidrocarbilo es no cíclico, y cicloalquenilo y cicloalquinilo, respectivamente, si el hidrocarbilo es al menos parcialmente cíclico). Entre los alquenilos de cadena lineal y ramificados representativos se incluyen etilenilo, propilenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, y similares; mientras que los alquinilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, 3-metiM-butinilo, y similares.
El adyuvante de fórmula (I) se puede obtener por métodos sintéticos conocidos en la técnica, por ejemplo, la metodología sintética descrita en la publicación internacional PCT número WO 2009/035528, así como las publicaciones identificadas en el documento WO 2009/035528. Algunos de los adyuvantes también se pueden obtener comercialmente. Un adyuvante preferido es el producto No°699800 como se identifica en el catálogo de Avanti Polar Lipids, Alabaster, a L, véase E1 en combinación con E10, a continuación.
En diferentes realizaciones de la descripción, el adyuvante tiene la estructura química de la fórmula (I), pero los restos A1, A2, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan de subconjuntos de las opciones proporcionadas previamente estos restos, donde estos subconjuntos se identifican a continuación por E1, E2, etc.
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En ciertas opciones, cada uno de E2 a E10 se combina con la realización E1, y/o los grupos hidrocarbilo de E2 a E9 son grupos alquilo, preferiblemente grupos alquilo de cadena lineal.
El adyuvante de fórmula (I) se puede formular en una composición farmacéutica, opcionalmente con un coadyuvante, cada uno como se describe a continuación. A este respecto, se hace referencia a la publicación de patente de EE.UU. N° 2008/0131466 que proporciona formulaciones, p. ej., formulación acuosa (AF) y formulaciones de emulsiones estables (SE) para el adyuvante GLA, donde estas formulaciones se pueden usar para cualquiera de los adyuvantes de fórmula (I).
Un adyuvante se puede administrar con el virus de la descripción como una composición única, o se puede administrar antes, simultáneamente con o después de la administración del virus recombinante de la descripción. El inmunógeno y el adyuvante se pueden envasar y suministrar en el mismo vial o se pueden envasar en viales separados y mezclar antes de usar. El inmunógeno y el adyuvante se envasan típicamente con una etiqueta que indica la aplicación terapéutica prevista. Si el inmunógeno y el adyuvante se envasan por separado, el envase típicamente incluye instrucciones para mezclar antes de usar. La elección de un adyuvante y/o vehículo depende de la estabilidad de la vacuna que contiene el adyuvante, la vía de administración, la pauta posológica, la eficacia del adyuvante para la especie que se vacuna y, en seres humanos, un adyuvante farmacéuticamente aceptable es uno que ha sido aprobado o puede ser aprobado para administración humana por los organismos reguladores pertinentes. Por ejemplo, el adyuvante completo de Freund no es adecuado para la administración humana. Se prefieren alumbre, MPL y QS21. Opcionalmente, se pueden usar dos o más adyuvantes diferentes simultáneamente, tales como alumbre con MPL, alumbre con QS21, MPL con QS21 y alumbre, QS21 y MPL juntos. Además, se puede usar el adyuvante incompleto de Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opcionalmente en combinación con cualquiera de alumbre, QS21 y MPL y todas sus combinaciones.
Composiciones farmacéuticas y kits
También se contemplan en la presente memoria composiciones farmacéuticas y kits que contienen un virus proporcionado en la presente memoria y uno o más componentes. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir partículas de vectores víricos como se proporciona en la presente memoria y un vehículo farmacéutico. Los kits pueden incluir las composiciones farmacéuticas y/o combinaciones proporcionadas en la presente memoria, y uno o más componentes, tales como instrucciones de uso, un dispositivo para administrar un compuesto a un sujeto y un dispositivo para administrar un compuesto a un sujeto.
En la presente memoria se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen partículas víricas como se proporciona en la presente memoria y un vehículo farmacéutico adecuado. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria pueden estar en diferentes formas, p. ej., en forma sólida, líquida, en polvo, acuosa o liofilizada. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son conocidos en la técnica. Dichos vehículos y/o aditivos se pueden formular por métodos convencionales y se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. Los agentes estabilizantes, como lípidos, inhibidores de nucleasa, polímeros y agentes quelantes pueden preservar las composiciones de la degradación dentro del cuerpo.
Las partículas de vectores víricos proporcionadas en la presente memoria se pueden envasar como kits. Los kits pueden incluir opcionalmente uno o más componentes, tales como instrucciones de uso, dispositivos y reactivos adicionales, y componentes, tales como tubos, recipientes y jeringas para la práctica de los métodos. Los kits de ejemplo pueden incluir los virus proporcionados en la presente memoria, y pueden incluir opcionalmente instrucciones de uso, un dispositivo para detectar un virus en un sujeto, un dispositivo para administrar el virus a un sujeto y un dispositivo para administrar un compuesto a un sujeto.
Los kits que comprenden polinucleótidos que codifican un gen de interés (típicamente un antígeno) también están contemplados en la presente memoria. El kit puede incluir al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus y el vector que codifica la variante de la glicoproteína E2 del virus Sindbis. Algunos kits contendrán al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus, un vector que codifica la variante de la glicoproteína E2 del virus Sindbis y un vector que codifica al menos un factor de maduración de DC. Los kits que comprenden un vector vírico que codifica una secuencia de interés (típicamente un antígeno) y opcionalmente, una secuencia de polinucleótido que codifica un factor de maduración de DC, también están contemplados en la presente memoria. En algunos kits, el kit incluye al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus y un vector que codifica la variante de la glicoproteína E2 del virus Sindbis.
Un kit también puede contener instrucciones. Las instrucciones incluyen típicamente una expresión tangible que describe el virus y, opcionalmente, otros componentes incluidos en el kit, y los métodos de administración, incluyendo los métodos para determinar el estado adecuado del sujeto, la cantidad de dosis adecuada y el método de administración adecuado, para administrar el virus. Las instrucciones también pueden incluir una guía para el seguimiento del sujeto durante el tiempo de tratamiento.
Los kits proporcionados en la presente memoria también pueden incluir un dispositivo para administrar un virus a un sujeto. Se puede incluir cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la técnica para administrar medicamentos o vacunas en los kits que se proporcionan en la presente memoria. Los dispositivos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un dispositivo de inyección sin aguja, un inhalador y un dispensador de líquido, como un cuentagotas para ojos. Típicamente, el dispositivo para administrar un virus del kit será compatible con el virus del kit; por ejemplo, se puede incluir un dispositivo de inyección sin aguja, tal como un dispositivo de inyección de alta presión, en kits con virus no dañados por la inyección de alta presión, pero típicamente no se incluye en kits con virus dañados por la inyección de alta presión. Los kits proporcionados en la presente memoria también pueden incluir un dispositivo para administrar un compuesto, tal como un activador o estimulador de DC, a un sujeto. Se puede incluir cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la técnica para administrar medicamentos a un sujeto en los kits que se proporcionan en la presente memoria. Los dispositivos de ejemplo incluyen una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, una inyección sin aguja, pero no se limitan a una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un dispositivo de inyección sin aguja, un inhalador y un dispensador de líquido tal como un cuentagotas para ojos. Típicamente, el dispositivo para administrar el compuesto del kit será compatible con el método de administración deseado del compuesto.
Realizaciones de ejemplo
Métodos para generar partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas
En algunas realizaciones de la descripción, un método para generar una partícula de vector lentivírico pseudotipada comprende:
(a) cultivar en un medio de cultivo que comprende kifunensina una célula de empaquetamiento de virus que comprende:
(1) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno exógeno, (2) un polinucleótido que codifica una glicoproteína de alfavirus que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, y
(3) un polinucleótido que codifica una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1; y
(b) aislar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN.
En aspectos específicos, la glicoproteína del alfavirus es una glicoproteína E2 del virus Sindbis.
En aspectos específicos, el inhibidor de SAMHD1 es una proteína Vpx, p. ej., una proteína SIVmac Vpx, una proteína SIVsm, una SIVrcm o una proteína HIV-2 Vpx. En aspectos específicos, el inhibidor de SAMHD1 es un anticuerpo o fragmento del mismo. En aspectos específicos, el inhibidor de SAMHD1 es una proteína Vpr con capacidad inhibidora de SAMHD1, por ejemplo, una proteína SIVdeb Vpr o una proteína SIVmus Vpr.
En algunas realizaciones de la descripción, un método para generar una partícula de vector lentivírico pseudotipada comprende:
(a) cultivar en un medio de cultivo que comprende kifunensina una célula de empaquetamiento de virus que comprende:
(1) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno exógeno,
(2) un polinucleótido que codifica una glicoproteína E2 de Sindbis que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, y
(3) un polinucleótido que codifica una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1; y
(b) aislar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN.
En aspectos específicos, la glicoproteína E2 es 90% idéntica a la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1]. En algunos aspectos, (i) el resto 160 de la glicoproteína E2 está ausente o es un aminoácido distinto del ácido glutámico, (ii) uno o más de los restos 70, 76 o 159 de la variante de glicoproteína E2 es un resto no básico, y (iii) la variante de la glicoproteína E2 no es parte de una proteína de fusión con la glicoproteína E3 del virus Sindbis. En algunos aspectos, la glicoproteína E2 es la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1].
En aspectos específicos, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44).
En aspectos específicos, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46), o HIV-2 Vpx (SEQ ID NO: 47). En aspectos específicos, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46) o VIH -2 Vpx (SEQ ID NO: 47).
En aspectos específicos, la proteína Vpr de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de vector lentivírico de cualquiera de las realizaciones precedentes, comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SEQ ID NO: 49). En aspectos específicos, la proteína Vpr de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de vector lentivírico de cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SEQ ID NO: 49).
En aspectos específicos, el antígeno es un antígeno específico de tumor o un antígeno específico de virus. En algunos aspectos, el antígeno específico de tumor se selecciona del grupo que consiste en NY-ESO-1, MAGE, p. ej., MAGE-A3 y MAGE-A1, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa, p. ej., TRP2, antígeno de carcinoma de células renales, 5T4, SM22-alfa, anhidrasa carbónica I, anhidrasa carbónica IX (también conocida como G250), HIF-1alfa, HIF-2alfa, VEGF, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno específico de la próstata (PSA), fosfatos de ácido prostático, antígeno epitelial de la próstata con seis dominios transmembranales (STEAP), NKX3.1, enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reordenamiento bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado, p53 de tipo natural, citocromo P4501B1, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, proteína E6 del papilomavirus humano, proteína E7 del papilomavirus humano, antígeno carcinoembrionario, oncoproteínas de antígeno T del virus de células de Merkel y alfa-fetoproteína. En algunos aspectos, el antígeno específico de virus es un antígeno del HIV, un antígeno del SIV, un antígeno de adenovirus, un antígeno de enterovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de calicivirus, un antígeno de virus del moquillo, un antígeno de virus del Ébola, un antígeno de flavivirus, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno del herpesvirus, un antígeno de virus de la peritonitis infecciosa, un antígeno del influenzavirus, un antígeno de virus de la leucemia, un antígeno de virus de Marburg, un antígeno del ortomixovirus, un antígeno del papilomavirus, un antígeno de virus parainfluenza, un antígeno del paramixovirus, un antígeno de parvovirus, un antígeno de pestivirus, un antígeno de picornavirus, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus de la viruela, un antígeno de virus de la rabia, un antígeno de reovirus, un antígeno de retrovirus o un antígeno de rotavirus.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo antígeno. En aspectos específicos, el primer y segundo antígeno son expresados como una proteína de fusión que comprende un péptido A2 de autoescisión entre los dos antígenos. En algunos aspectos, el péptido A2 de autoescisión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 57. En algunos aspectos, el primer antígeno es NY-ESO-1 y el segundo antígeno es MAGE-A3.
En aspectos específicos, la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. En algunos aspectos, la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml. En algunos aspectos, la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml.
En aspectos específicos, la célula de empaquetamiento del virus comprende además:
(i) un polinucleótido que comprende los genes gag y pol; y
(ii) un polinucleótido que codifica una proteína rev. En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica la proteína Vpx está en el mismo o diferente plásmido que el polinucleótido que codifica la proteína rev, o el polinucleótido que comprende los genes gag y pol. En algunos aspectos, los genes gag y pol son codones humanos optimizados y comprenden una ventana no optimizada alrededor de la posición 1228 a 1509 de la SEQ ID NO: 54. En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende los genes gag y pol carece de un elemento de respuesta a rev (RRE). En algunos aspectos, el gen pol codifica una enzima integrasa inactiva. En algunos aspectos, la enzima integrasa tiene una mutación D64V.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico se obtiene del HIV-1.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores es capaz de integrarse.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o el sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores es de integración defectuosa o de integración deficiente. Por ejemplo, el vector lentivírico se puede integrar con una frecuencia al menos 10 veces (p. ej., al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, a al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces, al menos 250 veces, al menos 300 veces, al menos 350 veces, al menos 400 veces, al menos 450 veces, al menos 500 veces, al menos 550 veces, al menos 600 veces, al menos 650 veces, al menos 700 veces, al menos 750 veces, al menos 800 veces, al menos 850 veces, al menos 900 veces, al menos 950 veces, o al menos 1000 veces) menos eficaz en la integración que un vector vírico de integración competente. En realizaciones de ejemplo, el vector lentivírico puede ser de al menos aproximadamente 20 veces a aproximadamente 100 veces menos eficaz en la integración.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico tiene una repetición terminal larga 3' (LTR) inactivada o una repetición terminal larga 3' (LTR) autoinactivante. En algunos aspectos, el genoma del vector lentivírico comprende un elemento U3 que carece de al menos una secuencia de potenciador, una caja TATA, un sitio Sp1, un sitio NK-kappa B o un tracto de polipurina (PPT). En algunos aspectos, el gen pol codifica una enzima integrasa inactiva y el genoma del vector lentivírico carece de un tracto de polipurina funcional (PPT).
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 21 [vector SIN], 22 [vector 703] o 23 [vector 704].
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de estimulación/maduración de células dendríticas. En algunos aspectos, el factor de estimulación/maduración de células dendríticas se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 y CD40 inducible por fármacos.
En aspectos específicos, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno está operativamente unida a un promotor seleccionado del grupo que consiste en el promotor de ubiquitina-C humana (UbiC), el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), y el promotor sensible a tetraciclinas. En algunos aspectos, el promotor es un promotor deficiente en intrones. En algunos aspectos, el promotor deficiente en intrones es una UbiC.
En aspectos específicos, se proporciona una partícula de vector lentivírico producida por el método del párrafo [0206], [0210] o [0218].
En aspectos específicos, se proporciona una partícula de vector lentivírico producida por el método del párrafo [0216].
Composiciones que comprenden partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas.
En algunas o cualquiera de las realizaciones de la descripción, se proporciona una composición que comprende partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que comprenden (a) una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1, (b) un polinucleótido exógeno que codifica un antígeno, y (c) una pluralidad de glicoproteínas de envuelta que se unen preferentemente a células que expresan DC-SIGN, en donde la composición está más altamente manosilada en comparación con una composición de control de las mismas partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas preparadas en ausencia de un inhibidor de manosidasa. Por ejemplo, dicha composición altamente manosilada se caracteriza por contener glicoproteínas de envuelta que son más sensibles a EndoH que las glicoproteínas de envuelta de una composición de control preparada en ausencia de un inhibidor de manosidasa. Como otro ejemplo, dicha composición altamente manosilada se caracteriza por contener glicoproteínas de envuelta que presentan una mayor cantidad de glicano sensible a EndoH en comparación con las glicoproteínas de envuelta de una composición de control preparada en ausencia de un inhibidor de manosidasa. Se entiende que la composición de control contendrá aproximadamente el mismo número de partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que comprenden glicoproteínas de envuelta que tienen la(s) misma(s) secuencia(s) de aminoácidos. También se entiende que aunque la descripción se centra principalmente en la glicoproteína E2 del alfavirus, que es responsable del reconocimiento y la unión a las células dendríticas, y sus versiones altamente manosiladas, la envuelta del alfavirus también contiene glicoproteínas E1 que son susceptibles de la manosilación alta. Por lo tanto, las referencias a las glicoproteínas de envuelta y glicoproteínas de envuelta altamente manosiladas incluyen referencias a glicoproteínas E2 y/o E1 de alfavirus altamente manosiladas, específicamente las glicoproteínas E2 y/o E1 altamente manosiladas de Sindbis. La alta manosilación de otros tipos de envueltas de virus, específicamente envueltas de retrovirus, también mejora el reconocimiento de las células dendríticas.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona una composición que comprende partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que comprenden (a) una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1, (b) un polinucleótido exógeno que codifica un antígeno, y (c) una pluralidad de glicoproteínas E2 de Sindbis que se unen preferentemente a células que expresan DC-SIGN, en donde la composición está más altamente manosilada en comparación con una composición de control de partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas preparadas en ausencia de un inhibidor de manosidasa. Un número sustancial de glicoproteínas E2 en dichas composiciones están más altamente manosiladas, p. ej., más sensibles a EndoH, que las glicoproteínas E2 en composiciones de control preparadas en ausencia de un inhibidor de manosidasa.
EndoH es una endoglicosidasa especializada que solo escindirá la glicosilación unida a N con alto contenido de manosa (véase la figura 3A), p. ej., glicanos Man5-9; los glicanos Man3-4 son resistentes a EndoH. Por el contrario, PNGasa F escindirá todos los tipos de glicosilación, incluyendo los glicanos de bajo contenido de manosa <Man5. Cuando se producen partículas víricas en presencia de un inhibidor de la manosidasa I, como la kifunensina, las glicoproteínas en la envuelta vírica contendrán más glicanos con alto contenido de manosa que son susceptibles de ser escindidos por EndoH (es decir, serán más "sensibles a EndoH"). Una forma de detectar la presencia de glicanos con alto contenido de manosa en una composición de partículas víricas es determinar el peso molecular de las glicoproteínas de la envuelta por electroforesis mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodiopoliacrilamida (SDS-PAGE) después del tratamiento con EndoH. Este ensayo de “desplazamiento en gel" se ilustra en el ejemplo 3. Muestras de las partículas víricas y de composiciones de control de las mismas partículas víricas preparadas en ausencia de inhibidor de manosidasa, se pueden llevar a un gel de SDS-PAGE al 10% e inmunotransferir con anticuerpo contra las glicoproteínas de Sindbis. La envuelta del virus producida en presencia de inhibidores de manosidasa I es más sensible a EndoH y, por consiguiente, se desplaza más rápido en el gel (una distancia mayor) después del tratamiento con EndoH, en comparación con el virus de control. Por lo tanto, la presencia de glicoproteína de alto contenido de manosa se puede medir usando un ensayo de cambio en gel después de tratamiento con EndoH.
El virus de control puede ser parcialmente sensible al tratamiento con EndoH debido a la presencia de sitios de glicosilación en las glicoproteínas de Sindbis que normalmente son de alto contenido en manosa porque son internos y no están expuestos a la manosidasa I durante la producción. Por lo tanto, cuando se lleva al SDS-PAGE al 10%, el virus de control puede mostrar algún cambio en el peso molecular después del tratamiento con EndoH, debido a la escisión por EndoH de dichos glicanos internos con alto contenido de manosa. Sin embargo, este cambio puede ser solo alrededor del 35% del cambio observado cuando el virus de control se trata con PNGasa F, que escinde todos los glicanos.
Por lo tanto, en aspectos específicos, la cantidad de glicano sensible a EndoH se detecta determinando el peso molecular de las glicoproteínas de Sindbis por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) después de tratamiento con EndoH. Se detecta una mayor cantidad de glicano sensible a endoH en la composición, que indica que la composición de las partículas víricas está altamente manosilada, cuando el tratamiento con EndoH da como resultado que la banda correspondiente a las glicoproteínas de la envuelta (E2 y/o E1) en un gel de SDS-PAGE al 10% cambia a un peso molecular más bajo en comparación con las glicoproteínas de la envuelta de control, determinado por inspección visual.
En algunas realizaciones ilustrativas, el peso molecular de dichas glicoproteínas de envuelta después de tratamiento con EndoH ha cambiado completamente, y es sustancialmente el mismo que el peso molecular de dichas glicoproteínas de envuelta después del tratamiento con PNGasaF. En otras realizaciones ilustrativas, el peso molecular de dichas glicoproteínas de envuelta después de tratamiento con EndoH ha cambiado aproximadamente 90% o más de la distancia entre (a) glicoproteínas de la envuelta no tratadas con endoglicosidasa, y (b) glicoproteínas de envuelta tratadas con PNGasa F. En otras realizaciones ilustrativas, el peso molecular de dichas glicoproteínas de envuelta después de tratamiento con EndoH ha cambiado aproximadamente 90% o más de la distancia entre (a) glicoproteínas de la envuelta no tratadas con endoglicosidasa, y (b) glicoproteínas de la envuelta tratadas con PNGasa F. En otras realizaciones ilustrativas más, el peso molecular de dichas glicoproteínas de la envuelta ha cambiado aproximadamente 40% o más, o preferiblemente aproximadamente 45% o más, o aproximadamente 50% o más, o aproximadamente 55% o más, aproximadamente 60% o más, o aproximadamente 65% o más, o aproximadamente 70% o más, o aproximadamente 75% o más, o aproximadamente 80% o más, o aproximadamente 85% o más de la distancia entre (a) glicoproteínas de la envuelta no tratadas con endoglicosidasa, y (b) glicoproteínas de envuelta tratadas con PNGasa F. Como se ha indicado antes, la referencia a glicoproteínas de la envuelta incluye específicamente la referencia a glicoproteínas E2 y/o E1 de Sndbis.
En aspectos específicos, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95% de las glicoproteínas de la envuelta en dicha composición, p. ej., las glicoproteínas E2 y/o E1 de Sindbis en dicha composición, tienen una mayor cantidad de glicano sensible a EndoH en comparación con las glicoproteínas de la envuelta de control que tienen la(s) misma(s) secuencia(s) de aminoácidos en una composición de control de partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas preparadas en ausencia de un inhibidor de manosidasa.
En algunas realizaciones de la descripción, una composición comprende partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que comprenden (a) un inhibidor de SAMHD1, (b) un genoma lentivírico que comprende una secuencia de interés, y (c) una glicoproteína de envuelta que se une preferentemente a células que expresan DC-SIGN, en donde al menos 80% de los glicanos unidos a N en dicha composición comprenden una estructura Mang. En aspectos específicos, el inhibidor de SAMHD1 es una proteína Vpx, p. ej., una proteína SlVmac Vpx, una proteína SIVsm Vpx, una proteína SlVrcm Vpx o una proteína HIV-2 Vpx. En aspectos específicos, el inhibidor de SAMHD1 es un anticuerpo o fragmento del mismo. En aspectos específicos, el inhibidor de SAMHD1 es una proteína Vpr con capacidad inhibidora de SAMHD1, p. ej., una proteína SlVdeb Vpr o una proteína SlVmus Vpr. En aspectos específicos, la secuencia de interés codifica una proteína o una molécula de ácido nucleico, tal como un ARNip, microARN, un ARN bicatenario autocomplementario en el que la región complementaria es mayor que aproximadamente 20 ribonucleótidos de longitud, o un ARN que es complementario de un ARN de mensajero, donde la unión de dicho ARN complementario (antiparalelo) al ARN de mensajero bloquea su capacidad de ser traducido en proteína. En algunos casos, la secuencia de interés codifica un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. En aspectos específicos, la secuencia de interés codifica un antígeno tumoral o antígenos de una enfermedad infecciosa (p. ej., de agentes tales como HIV, HSV, HCV, HPV, malaria o tuberculosis). En aspectos específicos, se incluyen múltiples secuencias de interés en un solo vector.
En algunas realizaciones de la descripción, una composición comprende partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que comprenden (a) una proteína Vpx, (b) un polinucleótido exógeno que codifica un antígeno, y (c) una glicoproteína de envuelta que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, en donde al menos el 80% de los glicanos unidos a N en dicha composición comprenden una estructura Mang.
En aspectos específicos, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la proteína SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44).
En aspectos específicos, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46) o HIV-2 Vpx (SEQ ID NO: 47). En aspectos específicos, la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46) o VIH-2 Vpx (SEQ ID NO: 47).
En aspectos específicos, la proteína Vpr de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de vector lentivírico o cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 80% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SeQ ID NO: 49). En aspectos específicos, la proteína Vpr de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de vector lentivírico de cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SEQ ID NO: 49).
En aspectos específicos, la partícula de vector lentivírico pseudotipada infecta células dendríticas que expresan DC-SIGN con una eficacia de transducción in vitro de al menos 1%, o al menos 5%, o al menos 10%, o al menos 20%. En aspectos específicos, la glicoproteína es una glicoproteína E2 del virus Sindbis. En algunos aspectos, la glicoproteína E2 tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1]. En algunos aspectos, (i) el resto 160 de la glicoproteína E2 está ausente o es un aminoácido distinto del ácido glutámico, (ii) uno o más de los restos 70, 76 o 159 de la variante de la glicoproteína E2 es un resto no básico, y (iii) la variante de la glicoproteína E2 no es parte de una proteína de fusión con la glicoproteína E3 del virus Sindbis.
En aspectos específicos, el antígeno es un antígeno específico de tumor o un antígeno específico de virus. En algunos aspectos, el antígeno específico de tumor se selecciona del grupo que consiste en NY-ESO-1, MAGE, MAGE-A3 y MAGE-A1, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa, p. ej., TRP2, antígeno de carcinoma de células renales, 5T4, SM22-alfa, anhidrasa carbónica I, anhidrasa carbónica IX (también conocida como G250), HIF-1alfa, HIF-2alfa, VEGF, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno específico de la próstata (PSA), fosfatos de ácido prostático, antígeno epitelial de la próstata con seis dominios transmembranales (STEAP), NKX3.1, enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reordenamiento bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado, p53 de tipo natural, citocromo P4501B1, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, proteína E6 del papilomavirus humano, proteína E7 del papilomavirus humano, antígeno carcinoembrionario, oncoproteínas de antígeno T del virus de células de Merkel y alfa-fetoproteína. En algunos aspectos, el antígeno específico de virus es un antígeno del HIV, un antígeno del SIV, un antígeno de adenovirus, un antígeno de enterovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de calicivirus, un antígeno de virus del moquillo, un antígeno de virus del Ébola, un antígeno de flavivirus, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno del herpesvirus, un antígeno de virus de la peritonitis infecciosa, un antígeno del influenzavirus, un antígeno de virus de la leucemia, un antígeno de virus de Marburg, un antígeno del ortomixovirus, un antígeno del papilomavirus, un antígeno de virus parainfluenza, un antígeno de paramixovirus, un antígeno de parvovirus, un antígeno de pestivirus, un antígeno de picornavirus, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus de la viruela, un antígeno de virus de la rabia, un antígeno de reovirus, un antígeno de retrovirus o un antígeno de rotavirus.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo antígeno. En aspectos específicos, el primer y segundo antígeno son expresados como una proteína de fusión que comprende un péptido A2 de autoescisión entre los dos antígenos. En algunos aspectos, el péptido A2 de autoescisión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 57. En algunos aspectos, el primer antígeno es MAGE-A3 y el segundo antígeno es NY-ESO-1.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico se obtiene de HIV-1.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores, es capaz de integración.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores, es de integración deficiente o integración defectuosa.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico tiene una repetición terminal larga 3' (LTR) inactivada o una repetición terminal larga 3' (LTR) autoinactivadora. En algunos aspectos, el genoma del vector lentivírico comprende un elemento U3 que carece de al menos una secuencia de potenciador, una caja TATA, un sitio Sp1, un sitio NK-kappa B o un tramo de polipurina (PPT).
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 21 [vector SIN], 22 [vector 703] o 23 [vector 704].
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de maduración/estimulación de células dendríticas. En algunos aspectos, el factor de maduración/estimulación de las células dendríticas se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL- 21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 y CD40 inducible por fármaco.
En aspectos específicos, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno está operativamente unida a un promotor seleccionado del grupo que consiste en el promotor de ubiquitina-C humana (UbiC), el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y el promotor sensible a tetraciclinas. En algunos aspectos, el promotor se ha modificado para ser deficiente en intrones.
En algunos aspectos, las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas comprenden una proteína Rev.
En aspectos específicos, las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas tienen una UI de al menos 105/ml. En aspectos específicos, la composición comprende además un agente inmunoestimulador.
En aspectos específicos, la composición comprende además un adyuvante. Por ejemplo, como se ha indicado antes, los adyuvantes incluyen alumbre o monofosforil lípido A (MPL) 3 Des-O-acilado. Las clases de adyuvantes descritas en la presente memoria incluyen (a) sales de aluminio, (b) formulaciones de emulsión de aceite en agua, opcionalmente con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos, tales como péptidos de muramilo u otros componentes de la pared celular bacteriana, (c) adyuvantes de saponina, incluyendo ISCOM (complejos inmunoestimuladores) e ISCOMATRIX; (d) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (e) citoquinas; y (f) adyuvantes de fórmula (I). Dentro de la fórmula (I), un adyuvante preferido es el producto N° 699800 como se identifica en el catálogo de Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, véase E1 en combinación con E10, donde (i) A1 es fosfato o sal de fosfato y A2 es hidrógeno y (ii) R1, R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo. En aspectos específicos, las glicoproteínas de la envuelta también se unen a las células que expresan SIGNR1 de ratón.
En aspectos específicos, las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas también transducen más eficazmente células que expresan SIGNR1 de ratón en comparación con células que no expresan SIGNR1 de ratón.
En algunas realizaciones de la descripción, las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas mencionadas antes son para usar en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un paciente. En aspectos específicos, la enfermedad o trastorno es un cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o una infección, por ejemplo, una infección vírica, una infección bacteriana, una infección fúngica o una infección parasitaria.
Partículas de vectores víricos que comprenden una proteína Vpx.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona una partícula de vector lentivírico pseudotipada capaz de dirigirse a una célula que expresa que comprende:
(a) una glicoproteína de envuelta no natural;
(b) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido exógeno de interés; y
(c) una proteína Vpx u otro inhibidor de SAMHD1.
En algunos aspectos, la partícula de vector lentivírico pseudotipada comprende además una proteína Rev.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona un sistema de empaquetamiento de vector lentivírico para producir una partícula de vector lentivírico pseudotipada, que comprende:
(i) un primer polinucleótido que codifica una glicoproteína de envuelta no natural;
(ii) un segundo polinucleótido que comprende genes gag y pol;
(iii) un tercer polinucleótido que codifica una proteína rev;
(iv) un cuarto polinucleótido que codifica una proteína Vpx u otro inhibidor de SAMHD1; y
(v) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido exógeno de interés, en donde dos o más polinucleótidos están en el mismo plásmido o en plásmidos diferentes. En aspectos específicos, el polinucleótido de (iv) está en el mismo plásmido que uno cualquiera o más de los polinucleótidos de (i), (ii), (iii) o (v).
En aspectos específicos, la célula de empaquetamiento se selecciona del grupo que consiste en células 293, 293T, HeLa, D17, MDCK, BHK y Cf2Th.
En aspectos específicos, la proteína Vpx de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o el sistema de empaquetamiento de vector lentivírico de cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 44 (SIVmac), opcionalmente una proteína SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), una proteína SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), una proteína SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46) o una proteína HIV-2 VPX (SEQ ID NO: 47). En aspectos específicos, la proteína Vpx de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de vector lentivírico de cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 44 (SIVmac), opcionalmente un proteína SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), proteína SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), proteína SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46), o una proteína HIV-2 VPX (SEQ ID NO: 47).
En aspectos específicos, la proteína Vpr de la partícula de vector lentivírico pseudotípica o sistema de empaquetamiento de vector lentivírico de cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SEQ ID NO: 49). En aspectos específicos, la proteína Vpr de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de vector lentivírico de cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SEQ ID NO: 49).
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de vector lentivírico de cualquiera de las realizaciones anteriores se obtiene de HIV-1 o MLV. En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico de la partícula del vector lentivírico pseudotipado o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores es capaz de integrarse.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico de la partícula del vector lentivírico pseudotipado o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores no es integrante.
En aspectos específicos, la glucoproteína de envuelta no natural de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores se selecciona del grupo que consiste en una glicoproteína alfavirus, que incluye la glicoproteína E2 de Sindbis, glicoproteína E2 de VEE, glicoproteína de rabdovirus o vesiculovirus, que incluye la glicoproteína VSV-G, glucoproteína de arenavirus, glucoproteína de coronavirus, glicoproteína de paramixovirus, glicoproteína de flavirvirus, glicoproteína de ortomixovirus y glicoproteína de baculovirus, preferiblemente un alfavirus tal como el virus Sindbis.
En aspectos específicos, la glicoproteína de envuelta no natural de la partícula de vector lentivírico pseudotipada o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores es una glicoproteína E2 del virus Sindbis que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 30 [SINVar1].
En aspectos específicos, la glicoproteína de envuelta no natural de la partícula del vector lentivírico pseudotipado o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores se une preferentemente a una célula que expresa SAMHD1. En algunos aspectos, la célula que expresa SAMHD1 es una célula mieloide, opcionalmente una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.
En aspectos específicos, la glicoproteína de envuelta no natural de la partícula del vector lentivírico pseudotipado o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN.
En aspectos específicos, el polinucleótido de interés codifica (i) un antígeno, (ii) un polipéptido terapéutico, o (iii) un oligonucleótido inhibidor. En algunos aspectos, el polinucleótido de interés codifica un ARNip.
En aspectos específicos, el polinucleótido de interés codifica un antígeno vírico, bacteriano, fúngico, protozoario o de cáncer.
En aspectos específicos, las glicoproteínas de envuelta también se unen a células que expresan SIGNR1 de ratón. En aspectos específicos, las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas también transducen más eficazmente células que expresan SIGNR1 de ratón en comparación con células que no expresan SIGNR1 de ratón.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona un método para producir una partícula de vector lentivírico pseudotipada de cualquiera de las realizaciones anteriores que comprende cultivar el sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores en un medio de cultivo. En algunos aspectos, el medio de cultivo comprende un inhibidor de manosidasa I que es kifunensina.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona una composición que comprende las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas de cualquiera de las realizaciones anteriores en donde las partículas de vectores están altamente manosiladas.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona una composición que comprende las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas de cualquiera de las realizaciones anteriores en donde al menos 80% de los glicanos unidos a N en dicha composición comprenden una estructura Mang.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona un método para suministrar un genoma de vector lentivírico a una célula que expresa SAMHD1, in vitro o in vivo, que comprende poner en contacto la célula con la partícula de vector de cualquiera de las realizaciones anteriores. En algunos aspectos, la célula que expresa SAMHD1 es una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona un método para provocar una respuesta inmunitaria o inmunizar a un individuo, que comprende administrar la partícula de vector de cualquiera de las realizaciones anteriores a un individuo, preferiblemente una partícula de vector que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN.
En algunas realizaciones de la descripción, las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas mencionadas antes son para usar en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un paciente. En aspectos específicos, la enfermedad o trastorno es un cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o una infección, por ejemplo, una infección vírica, una infección bacteriana, una infección fúngica o una infección parasitaria.
Métodos de generación de partículas de vectores víricos con glicoproteínas de la envuelta altamente manosiladas En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona un método para generar una partícula de vector de virus que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN que comprende: cultivar una célula de empaquetamiento de virus que comprende virus componentes de partículas víricas en un medio de cultivo, comprendiendo dichos componentes un polinucleótido que codifica una glicoproteína de envuelta que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, y en donde el medio de cultivo comprende kifunensina en una concentración de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml.
En aspectos específicos, la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml.
En aspectos específicos, la kifunensina está presente en el medio de cultivo a una concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, o de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml, o de aproximadamente 0,5 pg/ml a alrededor de 5 pg/ml.
En aspectos específicos, los componentes de partículas víricas comprenden un genoma de vector lentivírico.
En aspectos específicos, la partícula vírica infecta células que expresan DC-SIGN con una eficacia de transducción al menos 5 veces mayor que una partícula vírica producida en un medio de cultivo que carece de kifunensina.
En aspectos específicos, la célula de empaquetamiento de virus comprende:
(i) un primer polinucleótido que codifica una glicoproteína de envuelta;
(ii) un segundo polinucleótido que comprende los genes gag y pol;
(iii) un tercer polinucleótido que codifica una proteína rev; y
(iv) un genoma de vector lentivírico que comprende un cuarto polinucleótido que codifica un antígeno.
En aspectos específicos, la glicoproteína de la envuelta es una glicoproteína E2 del virus Sindbis. En algunos aspectos, la glicoproteína E2 comprende [SINVar1] o una variante de la misma que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la misma. En algunos aspectos, la glicoproteína E2 es 90% idéntica a la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1]. En algunos aspectos, (i) el resto 160 de la glicoproteína E2 está ausente o es un aminoácido distinto del ácido glutámico, (ii) uno o más de los restos 70, 76 o 159 de la variante de la glicoproteína E2 es un resto no básico, y (iii) la variante de la glicoproteína E2 no es parte de una proteína de fusión con la glicoproteína E3 del virus Sindbis. En algunos aspectos, la glicoproteína E2 es la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1].
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico se obtiene de HIV-1.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico de la partícula del vector lentivírico pseudotipado o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores es capaz de integrarse.
En aspectos específicos, el genoma del vector lentivírico de la partícula del vector lentivírico pseudotipado o sistema de empaquetamiento de cualquiera de las realizaciones anteriores es de integración deficiente en la o integración defectuosa. En algunos aspectos, el gen pol codifica una enzima integrasa inactiva y el genoma del vector lentivírico carece de un tracto de polipurina funcional (PPT).
En aspectos específicos, la célula de empaquetamiento de virus comprende además un polinucleótido que codifica una proteína Vpx que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1, que comprende opcionalmente una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44).
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona una composición que comprende partículas de virus que presentan una glicoproteína E2 de alfavirus, en donde al menos 80% de los glicanos unidos a N en dicha composición comprenden una estructura Mang.
En aspectos específicos, la glicoproteína E2 de alfavirus es una glicoproteína E2 de Sindbis que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporciona un método para suministrar un genoma de vector vírico a una célula que expresa DC-SIGN que comprende administrar la partícula o composición de virus de cualquiera de las realizaciones anteriores.
Aspectos adicionales de la descripción
1. Un método para generar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que comprende:
(a) cultivar en un medio de cultivo que comprende kifunensina una célula de empaquetamiento de virus que comprende:
(1) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno exógeno, (2) un polinucleótido que codifica una glicoproteína E2 de Sindbis que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, y
(3) un polinucleótido que codifica una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD 1; y
(b) aislar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN.
2. El método de la realización 1, en donde la glicoproteína E2 es 90% idéntica a la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1].
3. El método de la realización 1 o 2, en donde (i) el resto 160 de la glicoproteína E2 está ausente o es un aminoácido distinto del ácido glutámico, (ii) uno o más de los restos 70, 76 o 159 de la variante de la glicoproteína E2 es un resto no básico, y (iii) la variante de la glicoproteína E2 no es parte de una proteína de fusión con la glicoproteína E3 del virus Sindbis.
4. El método de la realización 2, en donde la glicoproteína E2 es la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1].
5. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a SIVmac Vpx [SEQ ID NO: 44].
6. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en donde la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46), o HIV-2 Vpx (SEQ ID NO: 47).
7. El método de una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en donde la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SeQ ID NO: 49).
8. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el antígeno es un antígeno específico de tumor o un antígeno específico de virus.
9. El método de la realización 8, en donde el antígeno específico de tumor se selecciona del grupo que consiste en NY-ESO-1, MAGE, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa, antígeno de carcinoma de células renales, 5T4, SM22-alfa, anhidrasa carbónica I, anhidrasa carbónica IX (también conocida como G250), HIF-1alfa, HIF-2alfa, VEGF, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno específico de la próstata (PSA), fosfatos de ácido prostático, antígeno epitelial de la próstata con seis dominios transmembranales (STEAP), NKX3.1, enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reordenación bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado, p53 de tipo natural, citocromo P450 1B1, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, proteína E6 del papilomavirus humano, proteína E7 del papilomavirus humano, antígeno carcinoembrionario y alfa-fetoproteína.
10. El método de la realización 8, en donde el antígeno específico de virus es un antígeno del HIV, un antígeno del SIV, un antígeno de adenovirus, un antígeno de enterovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de calicivirus, un antígeno de virus del moquillo, un antígeno de virus del Ébola, un antígeno de flavivirus, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno del herpesvirus, un antígeno de virus de la peritonitis infecciosa, un antígeno del influenzavirus, un antígeno de virus de la leucemia, un antígeno de virus de Marburg, un antígeno de ortomixovirus, un antígeno del papilomavirus, un antígeno de virus parainfluenza, un antígeno de paramixovirus, un antígeno de parvovirus, un antígeno de pestivirus, un antígeno de picornavirus, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus de la viruela, un antígeno de virus de la rabia, un antígeno de reovirus, un antígeno de retrovirus o un antígeno de rotavirus.
11. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo antígeno.
12. El método de la realización 11, en donde el primer y segundo antígeno son expresados como una proteína de fusión que comprende un péptido A2 de autoescisión entre los dos antígenos.
13. El método de la realización 12, en donde el péptido A2 de autoescisión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 57.
14. El método de una cualquiera de las realizaciones 11 a 13, en donde el primer antígeno es NY-ESO-1 y el segundo antígeno es MAGE-A3.
15. El método de la realización 11, en donde el primer y segundo antígeno son expresados a partir de un promotor bidireccional.
16. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml.
17. El método de la realización 16, en donde la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml.
18. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la célula de empaquetamiento de virus comprende además:
(i) un polinucleótido que comprende los genes gag y pol; y
(ii) un polinucleótido que codifica una proteína rev.
19. El método de la realización 18, en donde los genes gag y pol son de codones optimizados humanos y comprenden una ventana no optimizada alrededor de la posición 1228 a 1509 de la SEQ ID NO: 54.
20. El método de la realización 18 o 19, en donde el polinucleótido que comprende los genes gag y pol carece de un elemento de respuesta a rev (RRE) funcional.
21. El método de una cualquiera de las realizaciones 18 a 20, en donde el gen pol codifica una enzima integrasa inactiva.
22. El método de la realización 21, en donde la enzima integrasa tiene una mutación D64V.
23. El método de una cualquiera de las realizaciones 18 a 22, en donde el polinucleótido que codifica la proteína Vpx está en el mismo o diferente plásmido que el polinucleótido que codifica la proteína rev, o el polinucleótido que comprende los genes gag y pol.
24. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el genoma del vector lentivírico se obtiene de HIV-1.
25. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el genoma del vector lentivírico tiene una repetición terminal larga 3' (LTR) inactivada o una repetición terminal larga 3' (LTR) autoinactivante.
26. El método de la realización 25, en donde el genoma del vector lentivírico comprende un elemento U3 que carece de al menos una secuencia de potenciador, una caja TATA, un sitio Sp1, un sitio NK-kappa B o un tracto de polipurina (PPT).
27. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el genoma del vector lentivírico comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 21, 22 o 23.
28. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de estimulación/maduración de células dendríticas.
29. El método de la realización 28, en donde el factor de estimulación/maduración de células dendríticas se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 y CD40 inducible por fármacos.
30. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno está operativamente unida a un promotor seleccionado del grupo que consiste en el promotor de ubiquitina-C humana (UbiC), el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y el promotor sensible tetraciclinas.
31. El método de la realización 30, en donde el promotor es un promotor deficiente en intrones.
32. El método de la realización 31, en donde el promotor deficiente en intrones es un promotor de UbiC.
33. La partícula de vector lentivírico producida por la realización de la reivindicación 1.
34. La partícula de vector lentivírico producida por la realización de la reivindicación 18.
35. Un método para generar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que comprende:
(a) cultivar en un medio de cultivo que comprende kifunensina una célula de empaquetamiento de virus que comprende:
(1) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido que codifica MAGE-A3 y NY-ESO-1, en donde un polinucleótido que codifica un péptido TA2 de autoescisión se coloca entre el polinucleótido que codifica MAGE-A3 y NY- ESO-1, en donde el genoma lentivírico carece de un tracto de polipurina (PPT), y en donde la expresión de MAGE-A3 y NY-ESO-1 está controlada por un promotor de UbiC que carece de un intrón,
(2) un polinucleótido que codifica una glicoproteína E2 de Sindbis que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN,
(3) un polinucleótido que comprende los genes gag y pol de codones optimizados humanos, en donde el polinucleótido carece de un elemento de respuesta a rev (RRE) funcional y en donde el gen pol codifica una enzima integrasa inactiva,
(4) un polinucleótido que codifica una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1; y
(b) aislar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN.
36. Una composición que comprende partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que comprenden (a) una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1, (b) un polinucleótido exógeno que codifica un antígeno, y (c) una pluralidad de glicoproteínas de envuelta que se unen preferentemente a células que expresan DC-SIGN, en donde dicha composición está más altamente manosilada en comparación con una composición de control de las mismas partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas preparada en ausencia de un inhibidor de manosidasa.
37. La composición de la realización 36, en donde las glicoproteínas de la envuelta son glicoproteínas de alfavirus.
38. La composición de la realización 37, en donde las glicoproteínas de la envuelta son glicoproteínas de Sindbis. 39. La composición de cualquiera de las realizaciones 36-38, en donde la alta manosilación se caracteriza por ser más sensible a EndoH que una composición de control preparada en ausencia de un inhibidor de manosidasa. 40. La composición de cualquiera de las realizaciones 36-38, en la que la sensibilidad a EndoH se determina evaluando el peso molecular de las glicoproteínas de la envuelta por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodiopoliacrilamida (SDS-PAGE) después del tratamiento con EndoH.
41. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-38, en donde el peso molecular de las glicoproteínas de la envuelta después de tratamiento con EndoH ha cambiado aproximadamente 45% o más de la distancia entre (a) las glicoproteínas de la envuelta no tratadas con una endoglicosidasa, y (b) las glicoproteínas de la envuelta tratadas con PNGasa F.
42. La composición de la realización 41, en donde el peso molecular de las glicoproteínas de la envuelta después de tratamiento con EndoH ha cambiado aproximadamente 70% o más de la distancia entre (a) las glicoproteínas de la envuelta no tratadas con endoglicosidasa, y (b) las glicoproteínas de la envuelta tratadas con PNGasa F.
43. La composición de la realización 41, en donde el peso molecular de las glicoproteínas de la envuelta después de tratamiento con EndoH ha cambiado aproximadamente 90% o más de la distancia entre (a) las glicoproteínas de la envuelta no tratadas con endoglicosidasa, y (b) las glicoproteínas de la envuelta tratadas con PNGasa F.
44. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-43, en donde al menos 30% de las glicoproteínas de la envuelta en dicha composición tienen una cantidad mayor de glicano sensible a EndoH en comparación con las glicoproteínas de control que tienen la(s) misma(s) secuencia(s) de aminoácidos en una composición de control de partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas preparada en ausencia de un inhibidor de manosidasa.
45. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-44, en donde la mayoría de las glicoproteínas de la envuelta están altamente manosiladas.
46. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-45, en donde las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas son de integración deficiente.
47. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-46, en donde la composición comprende una glicoproteína E2 de Sindbis.
48. La composición de la realización 47, en donde la glicoproteína E2 es 90% idéntica a la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1].
49. La composición de la realización 47 o 48, en donde (i) el resto 160 de la glicoproteína E2 está ausente o es un aminoácido distinto del ácido glutámico, (ii) uno o más de los restos 70, 76 o 159 de la variante de la glicoproteína E2 es un resto no básico, y (iii) la variante de la glicoproteína E2 no es parte de una proteína de fusión con la glicoproteína E3 del virus Sindbis.
50. La composición de la realización 49, en donde la glicoproteína E2 es la SEQ ID NO: 30 [SIN-Var1].
51. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-50, en donde la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a SIVmac Vpx [SEQ ID NO: 44].
52. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-50, en donde la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVmac Vpx (SEQ ID NO: 44), SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46), o HIV-2 Vpx (SEQ ID NO: 47).
53. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-49, en donde la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SEQ ID NO: 49).
54. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-53, en donde el antígeno es un antígeno específico de tumor o un antígeno específico de virus.
55. La composición de la realización 54, en donde el antígeno específico de tumor se selecciona del grupo que consiste en NY-ESO-1, MAGE, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa, antígeno de carcinoma de células renales, 5T4, SM22-alfa, anhidrasa carbónica I, anhidrasa carbónica IX (también conocida como G250), HIF-1alfa, HIF-2alfa, VEGF, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno específico de la próstata (PSA), fosfatos de ácido prostático, antígeno epitelial de la próstata con seis dominios transmembranales (STEAP), NKX3.1, enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reordenación bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado, p53 de tipo natural, citocromo P450 1B1, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, proteína E6 del papilomavirus humano, proteína E7 del papilomavirus humano, antígeno carcinoembrionario y alfa-fetoproteína.
56. La composición de la realización 54, en donde el antígeno específico del virus es un antígeno del HIV, un antígeno del SIV, un antígeno de adenovirus, un antígeno de enterovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de calicivirus, un antígeno de virus del moquillo, un antígeno de virus del Ébola, un antígeno de flavivirus, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno del herpesvirus, un antígeno de virus de la peritonitis infecciosa, un antígeno del influenzavirus, un antígeno de virus de la leucemia, un antígeno de virus de Marburg, un antígeno de ortomixovirus, un antígeno del papilomavirus, un antígeno de virus parainfluenza, un antígeno de paramixovirus, un antígeno de parvovirus, un antígeno de pestivirus, un antígeno de picornavirus, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus de la viruela, un antígeno de virus de la rabia, un antígeno de reovirus, un antígeno de retrovirus o un antígeno de rotavirus.
57. La composición de una cualquiera de las realizaciones 36-56, en donde el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo antígeno.
58. La composición de la realización 57 en donde el primer y segundo antígeno son expresados como una proteína de fusión que comprende un péptido A2 de autoescisión entre los dos antígenos.
59. La composición de la realización 58, en donde el péptido A2 de autoescisión comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56 o la SEQ ID NO: 57.
60. La composición de una cualquiera de las realizaciones 57-59, en donde el primer antígeno es NY-ESO-1 y el segundo antígeno es MAGE-A3.
61. La composición de la realización 57, en donde el primer y segundo antígeno son expresados a partir de un promotor bidireccional.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretende que limiten el alcance de la descripción.
Ejemplo 1
Partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteínas del virus Sindbis producidas en presencia de kifunensina infectan eficazmente células que expresan DC-SIGN
El objetivo de los siguientes experimentos era intentar producir y caracterizar vectores lentivíricos pseudotipados con glicoproteínas de envuelta altamente manosiladas. Al hacerlo, los autores de la invención descubrieron inesperadamente que la kifunensina era mucho más eficaz en la producción de vectores lentivíricos pseudotipados con capacidad para infectar eficazmente células que expresan DC-SIGN (p. ej., células dendríticas) usando concentraciones significativamente más pequeñas en comparación con otros inhibidores de la manosidasa I, incluyendo DMNJ.
Las células 293T se transfectaron con cuatro plásmidos separados que codificaban el genoma lentivírico, Gag/Pol, Rev y la envuelta, respectivamente, usando polietilenimina (PEI). Cinco horas después de la transfección, se separó la mezcla+medio. El medio se volvió a añadir al recipiente junto con la cantidad indicada de inhibidor de manosidasa (es decir, DMNJ, kifunensina y swainsonina). 48 horas después, se recogió el líquido sobrenadante (que contenía el vector) y se filtró con un filtro de 0,45 pm. Las células HT1080 que expresaban de forma estable el receptor de DC-SIGN humano después se transdujeron con los volúmenes indicados de vector. Las células HT1080 originales (que carecían de DC-SIGN), se usaron como controles y no se transdujeron mediante ninguno de los vectores. 48 horas después de la transducción, se analizó en las células la expresión de GFP (gfp %). Los resultados se muestran en las figuras 1A (HT1080 que expresan DC-SIGN) y 1B (HT1080 originales).
Las partículas de vectores lentivíricos pseudotipados con glicoproteínas del virus Sindbis y producidas en presencia de bajas concentraciones de kifunensina (1 pg/ml) inesperadamente transfectan células que expresan DC-SIGN significativamente mejor que las producidas en presencia de concentraciones más altas de DMNj (400 pg/ml) o swainsonina (10 pg/ml). Por consiguiente, la producción de partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteínas del virus Sindbis en presencia del inhibidor de manosidasa I kifunensina da como resultado una infección significativamente mayor de células que expresan DC-SIGN en comparación con las partículas producidas en presencia de otros inhibidores de la manosidasa I.
Ejemplo 2
Se requieren bajas cantidades de kifunensina para generar partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas que infectan eficazmente las células que expresan DC-SIGN
El objetivo de este experimento era determinar la concentración de kifunensina más eficaz para producir partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con capacidad para infectar células que expresan DC-SIGN.
Se transfectaron células 293T con los plásmidos descritos en el ejemplo 1 usando PEI. Cinco horas después de la transfección, se separó la mezcla+medio. El medio se volvió a añadir al recipiente junto con la cantidad indicada de kifunensina (pg/ml), o con 400 pg/ml de DMNJ. 48 horas más tarde, se recogió el líquido sobrenadante (que contenía partículas de vectores lentivíricos) y se filtró con un filtro de 0,45 pm. Las células HT1080 que expresaban de forma estable el receptor de DC-SIGN humano después se transdujeron con los volúmenes indicados de líquido sobrenadante que contenía el vector. Las células HT1080 originales, que no eran transducidas por el vector, se usaron como controles. 48 horas después de la transducción, se analizó en las células la expresión de gfp (gfp %). Los resultados se muestran en las figuras 2A (células HT1080 que expresan DC-SIGN) y 2B (células HT1080 originales).
Las partículas producidas en presencia de 0,125 pg/ml de kifunensina igualaron la capacidad de las partículas producidas en presencia de DMNJ 400 pg/ml para infectar células que expresan DC-SIGN (figura 2A). Las partículas producidas en presencia de todas las concentraciones de kifunensina que superaban 0,125 pg/ml infectaban células que expresan DC-SIGN mucho más eficientemente que las partículas producidas en presencia de DMNJ 400 pg/ml. La valoración de kifunensina ponía de manifiesto que la capacidad de las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteínas del virus Sindbis para infectar células que expresan DC-SIGN alcanza el máximo con partículas producidas en presencia de 0,25 pg/ml.
Ejemplo 3
El objetivo de este experimento era caracterizar el perfil de glicosilación de partículas lentivíricas pseudotipadas producidas en presencia de DMNJ o kifunensina.
Las partículas de vectores lentivíricos pseudotipados con glicoproteínas del virus Sindbis se prepararon de acuerdo con el ejemplo 1 en presencia de 1 pg/ml de kifunensina, DMNJ, o sin inhibidor de la manosidasa I. Las partículas se incubaron con PNGasaF o EndoH durante 1 hora. La PNGasaF es una endoglicosidasa general que escindirá toda la glicosilación unida a N independientemente del perfil de glicosilación (véase la figura 3A). La EndoH es una endoglicosidasa especializada que solo escindirá la glucosilación unida a N con alto contenido de manosa (véase la figura 3A). Cuando se producen partículas víricas en presencia de un inhibidor de manosidasa I, se espera que la envuelta vírica tenga glicoproteínas con alto contenido de Mang y susceptibles de ser escindidas por EndoH. Las muestras se analizaron usando un ensayo de desplazamiento en gel realizándose en un gel de SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo contra la envuelta vírica de Sindbis. Los resultados se ilustran en la figura 3B. El grado de movilidad de la envuelta vírica (SIN-Var1) del virus producido en presencia o ausencia de kifunensina o DMNJ, combinado con el tratamiento de PNGasaF o EndoH, es indicativo del grado de glicosilación de Var1. El virus de control (banda 1) está glicosilado (por consiguiente, se mueve más lentamente en el gel) y esta glicosilación se puede eliminar completamente mediante PNGasaF (como se pone de manifiesto por la movilidad más rápida observada en la banda 2). Como se esperaba debido a la capacidad de la PNGasaF para escindir cualquier glicosilación unida a N, el virus producido en presencia de DMNJ o Kifunensina es sensible al tratamiento con PNGasaF (bandas 5 y 8). Sin embargo, solo los virus producidos en presencia de inhibidores de manosidasa I (Var1 DMNJ o kifunensina) son sensibles al tratamiento con EndoH (bandas 6 y 9) mientras que el virus de control (Var1) es solo parcialmente sensible a la EndoH. La sensibilidad parcial probablemente proviene de sitios en E2-Var1 que normalmente no están expuestos a la manosidasa I durante la producción y no contribuyen a la unión a células dendríticas. Estos resultados indican que la eficacia del inhibidor de manosidasa I kifunensina en la producción de partículas víricas con glicoproteínas con alto contenido en mañosa se puede medir usando un ensayo de desplazamiento en gel después de tratamiento con EndoH y comparando su eficiencia con las partículas producidas en presencia de DMNj .
Ejemplo 4
El contenido de manosa en las glicoproteínas de la envuelta se correlaciona con la concentración de kifunensina en los medios usados para preparar partículas víricas
El objetivo de este experimento era caracterizar el perfil de glicosilación de partículas lentivíricas pseudotipadas producidas en presencia de concentraciones variables de kifunensina.
Las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteínas del virus Sindbis se prepararon de acuerdo con el ejemplo 1 con concentraciones variables de kifunensina o 400 pg/ml de DMNJ. Las partículas se incubaron con EndoH durante 1 hora. Después las muestras se analizaron usando un ensayo de desplazamiento en gel e inmunotransferencia con anticuerpo contra la envuelta del virus Sindbis. En paralelo, células HT1080 que expresan establemente el receptor de DC-SIGN humano se transdujeron con los volúmenes indicados de partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas preparadas con o sin kifunensina o DMNJ. 48 horas después de la transducción, se analizó en las células la expresión de GFP (que se muestra en el eje y como porcentaje de células positivas para GFP) para crear las gráficas. Los resultados se ilustran en la figura 4.
El grado de contenido de manosa se correlaciona con el grado de transducción de las células HT1080 DC-SIGN, como indica el grado de desplazamiento en el gel de las muestras tratadas con EndoH (figura 4A) y las gráficas del porcentaje de transducción de GFP (figura 4B). Es decir, concentraciones cada vez mayores de kifunensina en los medios usados para preparar partículas víricas daban como resultado glicoproteínas de envuelta con mayor contenido de manosa, como demuestran los mayores desplazamientos con el tratamiento con EndoH y la mayor expresión de GFP (es decir, infección) en células HT1080 que expresan DC-SIGN. Estos resultados indican que la kifunensina afecta directamente al grado de contenido de manosa en la envuelta vírica y esto se correlaciona directamente con la capacidad para transducir células HT1080 que expresan el receptor de DC-SIGN humano. Ejemplo 5
Confirmación de la expresión de Vpx en partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas
El objetivo de este experimento era determinar si SlVmac Vpx podría expresarse y detectarse en partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas.
SlVmac Vpx con un marcador de HA N-terminal se clonó en un vector de expresión de mamífero dirigido por un promotor de CMV (construcción denominada pENV-SIVmacVpx). Para confirmar que la proteína Vpx era expresada, las células 293T se transfectaron con esta construcción y se lisaron 24 horas después de la transfección. Los lisados se analizaron por inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-HA (figura 5A). Para confirmar que Vpx era empaquetada en partículas de lentivirus, se prepararon lentivirus usando cuatro plásmidos transfectados en células de empaquetamiento 293T. Estos cuatro plásmidos codifican el genoma lentivírico, Gag/Pol (ya sea de integración competente [lnt+] o de integración defectuosa [Int-]), Rev y la envuelta. Se incluyó un quinto plásmido para Vpx o no. El virus se recogió dos días después de la transfección y se concentró usando centrifugación. Se cargaron 100 ng de p24 por pocillo en un gel para la inmunotransferencia con anticuerpo anti-HA (Figura 5B). Como control de carga se usó anticuerpo anti-p24.
En las células 293T transfectadas con el plásmido que codifica el gen de Vpx, la proteína Vpx es expresada de manera eficaz (figura 5A). De manera similar, Vpx es empaquetada en partículas de lentivirus tanto de integración competente (Int ) como de integración defectuosa (Int-) (Figura 5B).
Ejemplo 6
Vpx es necesaria para la transducción eficiente de células dendríticas humanas por partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas-VSV-G de integración deficiente
El objetivo de este experimento era determinar si Vpx era necesaria para una infección productiva de células dendríticas por partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas-VSV-G de integración deficiente.
Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas se enriquecieron en monocitos CD14+, seguido de enriquecimiento en células dendríticas usando GMCSF e IL-4. Estas células dendríticas humanas derivadas de PBMC se transdujeron con cantidades crecientes de construcciones de partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas-VSV-G de integración deficiente (0,2 ng, 2 ng, 20 ng o 200 ng de p24) que contenían o no contenían Vpx. Cinco días después de la infección, se midieron los sucesos de transducción regulando células que eran positivas para CD11c y evaluando el porcentaje de células positivas para GFP (eje x) con DC-SIGN en el eje y. Se utilizó AZT (un inhibidor de la transcriptasa inversa) en la dosis más alta de partículas de vectores lentivíricos (200 ng).
Los resultados se ilustran en la figura 6. Vpx era necesaria para que las partículas lentivíricas pseudotipadas-VSV-G de integración deficiente transdujeran células dendríticas humanas derivadas de las PBMC. La transducción eficiente depende de la transcripción inversa porque era inhibida por AZT.
Ejemplo 7
Vpx mejora la transducción de células dendríticas humanas por partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas-VSV-G de integración competente
El objetivo de este experimento era determinar si Vpx era necesaria para una infección productiva de células dendríticas por partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas-VSV-G de integración competente.
Las PBMC humanas se enriquecieron en monocitos CD14+, seguido de enriquecimiento en células dendríticas usando GMCSF e IL-4. Estas células dendríticas humanas derivadas de PBMC se transdujeron con cantidades crecientes de construcciones de partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas-VSV-G de integración competente (0,2 ng, 2 ng o 20 ng de p24) que contenían o no contenían Vpx. Cinco días después de la infección, se midieron los sucesos de transducción regulando las células que eran positivas para CD11c y evaluando el porcentaje de células positivas para GFP (eje x) con CD11c en el eje y. Se usó nevirapina (Nev, un inhibidor de la transcriptasa inversa) en la dosis más alta de partículas de vectores lentivíricos (20 ng).
Los resultados se ilustran en la figura 7. Vpx mejoró la capacidad de las partículas de vectores lentivíricos de integración competente para transducir células dendríticas humanas derivadas de PBMC. La transducción mejorada depende de la transcripción inversa porque era inhibida por la nevirapina.
Ejemplo 8
Vpx y las glicoproteínas de envuelta altamente manosiladas son necesarias para la transducción eficaz de células dendríticas humanas por partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteínas de la envuelta del virus Sindbis
El objetivo de este experimento era ensayar la capacidad de partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteínas E2 del virus Sindbis que comprenden una proteína Vpx y producidas en presencia de kifunensina, para infectar productivamente células dendríticas.
PBMC humanas se enriquecieron en monocitos CD14+, seguido de enriquecimiento en células dendríticas usando GMCSF e IL-4. Estas células dendríticas humanas derivadas de PBMC se transdujeron con cantidades variables de construcciones de partículas de vectores lentivíricos de integración defectuosa pseudotipadas con SINvar1 (0,2 ng, 2 ng o 20 ng de p24) que o no contenían Vpx, o se produjeron en presencia o ausencia del inhibidor de manosidasa I, kifunensina. Cinco días después de la infección, se midieron los sucesos de transducción regulando las células que eran positivas para CD11c y evaluando el porcentaje de células positivas para GFP (eje x) con DC-SIGN o CD11c en el eje y. Se usó nevirapina (Nev, un inhibidor de la transcriptasa inversa) en la dosis más alta de partículas de vectores lentivíricos (20 ng).
Como se muestra en la figura 8, inesperadamente, se requiere tanto Vpx como la producción de partículas víricas en presencia de kifunensina para la transducción eficaz de células dendríticas humanas usando un lentivirus pseudotipado con glicoproteínas del virus Sindbis. Por consiguiente, estos resultados muestran que las partículas que comprenden la combinación de glicoproteínas altamente manosiladas (un resultado de la formación de partículas en presencia de kifunensina) y Vpx actúan de forma sinérgica para infectar y expresar eficazmente las proteínas codificadas por el genoma lentivírico. Es decir, si falta una de Vpx o glicoproteínas altamente manosiladas de las partículas lentivíricas de integración defectuosa pseudotipadas con glicoproteínas de la envuelta de Sindbis, las células dendríticas no se transducen de manera eficaz.
Ejemplo 9
Cuantificación de la manosilación de las envueltas de partículas de vectores lentivíricos
Las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteínas del virus Sindbis se prepararon de acuerdo con el ejemplo 1 sin tratamiento (figura 9A, bandas 1-3), 400 pg/ml de DMNJ (figura 9A, bandas 4-6), o 1 pg/ml de kifunensina (figura 9A, bandas 7-9). Las partículas no se trataron (bandas 1, 4, 7), se incubaron con EndoH durante 1 hora (bandas 2, 5, 8) o se incubaron con PNGasaF durante 1 hora (bandas 3, 6, 9). Después las muestras se analizaron usando un ensayo de desplazamiento en gel e inmunotransferencia con anticuerpo contra la envuelta del virus Sindbis.
El análisis de los datos de desplazamiento en gel se realizó usando el software Quantity One de Biorad. En resumen, usando la función "Banda", se dibujaron líneas verticales a lo largo de cada una de las 9 bandas que se muestran en la figura 9A. Esto especifica al programa el área que se va a analizar. A continuación, usando la función "Atributos de banda", se determinó la intensidad máxima para cada banda. Estos valores también se muestran en la figura 9A. Esto nos da el valor de intensidad máxima de cada banda en el gel a lo largo de la "banda" indicada previamente.
A continuación, las gráficas se ensamblaron a partir del perfil de intensidad de cada banda y su ubicación en la banda. Los resultados se muestran en la figura 9B (sin tratamiento con manosidasa), figura 9C (tratamiento con DMNJ) y figura 9D (tratamiento con kifunensina).
Cada gráfica representa cada uno de los tipos de envuelta digeridos sin enzima, Endo H o PNGasaF, como se indica. El eje Y es la intensidad de la banda y el eje X es la ubicación de la banda a lo largo de la banda descrita (es decir, el valor del "frente relativo" (rf); el valor de rf es la distancia de la banda desde la parte superior del gel respecto a la longitud total de la banda).
Para cuantificar el desplazamiento, se comparó la intensidad máxima de una banda que no se cortó con una enzima digestiva (es decir, glicosilación completa) con una banda que se cortó con la enzima PNGasaF (es decir, se eliminaron todos los sitios de glicosilación). Por lo tanto, una intensidad máxima que es igual a una banda que no ha sido digerida con ninguna enzima será un desplazamiento del 0% y una intensidad máxima que es igual a una banda que ha sido digerida con PNGasaF se considerará un desplazamiento de 100%. Sin la adición de kifunensina (banda 2), el desplazamiento en gel de EndoH es 36% de un desplazamiento de PNGasaF. Significativamente, la muestra tratada con kifunensina digerida con EndoH (es decir, digestión específica de alto contenido de manosa) se desplazó 90% de la distancia del desplazamiento de PNGasaF. Por consiguiente, casi todos los sitios glicosilados en la envuelta del vector vírico están en un estado de alto contenido de manosa después del tratamiento con 1 pg/ml de kifunensina.
Todo el análisis cuantitativo se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1
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El valor de intensidad de espectro es el valor de la intensidad máxima menos el valor de la intensidad máxima de la envuelta digerida sin enzima. Esto se hace para normalizar los valores en un espectro de desplazamiento 0% a desplazamiento 100%, como se ha explicado antes. El% de desplazamiento es el valor de la intensidad del espectro dividido entre el valor de la intensidad del espectro de las muestras tratadas con PNGasaF multiplicado por 100. Esto genera un porcentaje que cuantifica el desplazamiento de un corte de banda con EndoH en relación con las bandas tratadas sin enzima o con PNGasaF. Las envueltas tratadas con DMNJ se excluyeron de este análisis porque tenían patrones de glicosilación unida a N heterogéneos.
Ejemplo 10
Vectores víricos con elementos de diseño de integración deficiente
Para aplicaciones clínicas que requieren la administración directa de vectores víricos pero no requieren la expresión sostenida del gen suministrado por el vector, tales como para vacunas e inmunoterapias dirigidas a antígeno, los vectores lentivíricos de integración deficiente representan una alternativa adecuada y viable a los vectores lentivíricos de integración competente para el suministro de su carga genética. Se ensayó la tasa de impacto de la mutación de la integrasa D64V dentro del gen gag/pol y la eliminación de cPPT dentro del genoma del vector solos y en combinación, en la tasa de integración de un vector vírico.
Materiales y Métodos
Cuantificación de la integración por Alu-PCR.
Células 293T huDC-SIGN sembradas con 5E5 células/pocillo en placas de 6 pocillos se transdujeron por triplicado con 2E9 genomas por pocillo de vector. A las 48 horas después de la transducción, las células se recogieron y se extrajo el ADN genómico usando el kit DNeasy (Qiagen, Valencia, CA). El ADN genómico se analizó usando un ensayo de PCR anidada basado en Alu-LTR, que amplifica solo las secuencias de provirus que se han integrado en el ADN genómico del hospedante. Se introdujeron las siguientes modificaciones en el método previamente publicado de Brussel et al., Methods Mol. Biol. 304, 139 (2005). Se usó Platinum Taq (Life Technologies, Grand Island, NY) para la primera tanda de amplificación en un volumen de reacción final de 25 pl. Las condiciones de ciclo de la PCR de la primera tanda eran las siguientes: una etapa de desnaturalización de 2 min a 95°C y después 20 ciclos de amplificación (95°C durante 30 s, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 90 segundos). La PCR anidada se realizó usando EXPRESS qPCR Supermix Universal (Life Technologies) y sonda MH60310 100 nM en un volumen final de 25 pl. El protocolo de PCR anidada empezaba con un mantenimiento de 2 minutos a 50°C y una etapa de desnaturalización de 10 minutos a 95°C, seguido de 40 ciclos de amplificación (95°C durante 15 segundos, 60°C durante 30 segundos). Todas las reacciones de amplificación se llevaron a cabo usando el Bio-Rad CFX (modelo -96 o -384, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). El número de copias del provirus integrado se calculó con respecto a una curva patrón generada por Alu-PCR anidada paralela de una línea celular 293T de referencia que contiene provirus integrados de un número de copias conocido, diluido en un intervalo de 5-log. El ADN genómico total en la curva patrón se normalizó mezclando con el ADN genómico de células no transducidas; cada muestra estándar y desconocida contenía 100 ng de ADN genómico total. Este ensayo permitió la detección de 58 provirus (Experimento 1) o 4 provirus (Experimento 2) en 100 ng de ADN genómico.
Cuantificación de la integración por resistencia a la neomicina.
Los vectores que codifican el antígeno GFP-T2A-NeoR se analizaron independientemente para determinar la tasa de integración por formación de colonias resistentes a neomicina. Las células huDC-SIGN HT1080 se transdujeron en placas de 6 pocillos con 0,5 ml de vector diluido en serie (normalizado por genomas) durante 2 horas, después de lo cual se añadieron 2 ml de medio completo. A las 24 horas después de la transducción, las células se alimentaron con medio que contenía G418 800 pg/ml (Life Technologies, Grand Island, NY). Después las células se cultivaron sin pases durante 11-13 días bajo selección con G418, después de lo cual las colonias se visualizaron por tinción con cristal violeta (BD Biosciences, Rockville, MD). Los sucesos de integración total se calcularon como sigue: (n° de colonias) * (factor de dilución) = Sucesos de integración.
Cuantificación de la integración por expresión de GFP.
Para los vectores que codifican el antígeno GFP-T2A-NeoR, la tasa de integración relativa se midió mediante la expresión de GFP a lo largo del tiempo en cultivo en masa. Las células HT1080 huDC-SIGN se transdujeron en placas de 6 pocillos con cantidades iguales de vector WT/703 o D64V/704 (normalizado por genomas) en 0,5 ml durante 2 horas, seguido de la adición de 2 ml de medio completo. Las células transducidas se mantuvieron en un medio sin selección de fármaco durante hasta 30 días, con pases a intervalos regulares. Durante este período, se analizó periódicamente en las células la expresión de GFP por citometría de flujo (Guava EasyCyte Plus, Millipore, Billerica, MA).
Resultados
Las células 293T huDC-SIGN se transdujeron con vectores pseudotipados con VSV-G integrasa-D64V o WT que empaquetaban genomas WT ("703") o con eliminación cPPT ("704"). A las 48 horas después de la transducción, se analizó en las células la presencia de provirus integrados por un análisis de Alu-PCR anidada. Como se muestra en la figura 10A, los vectores WT/704 y D64V/703 tenían tasas de integración que disminuían aproximadamente 2 logs en comparación con el vector WT/703. En comparación, la tasa de integración del vector D64V/704 se redujo en más de 2 logs. Estos resultados demuestran que el genoma ID-VP02 (partículas de vectores lentivíricos pseudotipados con glicoproteína E2 del virus Sindbis con SIVmac Vpx y glicoproteínas de la envuelta altamente manosiladas y preparadas usando células de empaquetamiento que comprenden el sistema gag/pol independiente de rev descrito en el ejemplo 12) tiene una potencial integración significativamente reducida, y que los elementos D64V y 704 contribuyen independientemente a este fenotipo.
Para complementar el análisis de Alu-PCR anidada, se emplearon dos métodos adicionales para investigar la tasa de integración del genoma del vector vírico. En ambos métodos, las células HT1080 huDC-SIGN se transdujeron con el vector WT/703 o D64V/704 que codifica GFP y la resistencia a la neomicina (NeoR) separados por un conector T2A de autoescisión (GFP-T2A-NeoR). La transducción con cualquiera de estos vectores da como resultado la expresión de GFP y NeoR. La tasa de integración se midió en función de la expresión del antígeno, ya sea por el crecimiento de colonias resistentes a la neomicina después de selección por G418 o por la expresión de GFP a lo largo del tiempo en cultivo en masa.
En el primer método de medición de la tasa de integración (es decir, resistencia a la neomicina), las células HT1080 huDC-SIGN se transdujeron con diluciones seriadas del vector y se cultivaron sin pases en presencia de selección por G418. El vector de entrada se normalizó respecto al número de copias del genoma. Se supuso que las células que expresaban NeoR y sobrevivían a la exposición prolongada a G418, formando colonias, albergaban provirus integrados. Estas colonias se contaron y se calcularon los sucesos de integración total. Usando este procedimiento experimental, la tasa de integración del vector D64V/704 se redujo en 3 logs con respecto a la de WT/703, en dos experimentos independientes (Figura 10B).
En el segundo método (es decir, expresión de GFP), las células transducidas se sometieron a pases seriados en ausencia de selección y se analizaron por citometría de flujo en diferentes momentos después de la transducción.
En el día 2 después de la transducción, aproximadamente 40 por ciento de las células transducidas con el vector WT/703 eran positivas para GFP (figura 10C). Esta población se mantuvo uniforme durante la duración del experimento, lo que sugiere que la expresión de GFP era principalmente de los provirus integrados. En cambio, el porcentaje de células positivas para GFP transducidas con el vector D64V/704 se redujo aproximadamente 100 veces el día 6 después de la transducción y se mantuvo bajo, aunque superior al control transducido de manera simulada, durante el resto del experimento. Estos resultados sugieren que la mayoría de los sucesos de transducción D64V/704 produjeron ADN de vector no integrado, que expresaba GFP en tiempos tempranos después de la transducción, pero se perdió durante las subsiguientes divisiones celulares. El pequeño porcentaje de células que expresaban GFP que quedaba el día 9 después de la transducción probablemente representa la minoría de los sucesos de transducción que produjeron provirus integrados. Al completarse el experimento (día 30), se calculó que el vector D64V/704 había disminuido en 386 veces su capacidad para sufrir integración, en comparación con el vector WT/703. Estos descubrimientos son comparables a los resultados del análisis de Alu-PCR anidada.
Considerados juntos, los resultados de los tres métodos de medición de la tasa de integración (Alu-PCR anidada, crecimiento de colonias NeoR y % de expresión de GFP) demuestran que la tasa de integración del genoma del vector vírico se reduce en 2-3 logs respecto a la del vector lentivírico de 3a generación, de integración competente estándar (WT/703).
Ejemplo 11
Las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas transducen específicamente células dendríticas en una población homogénea de células
La especificidad del vector vírico para células dendríticas se evaluó en el contexto de una población heterogénea de potenciales células diana. PBMC humanas se pusieron en cultivo en presencia de GM-CSF e IL-4 durante tres días para generar un conjunto de células primarias que incluía un número suficiente de DC derivadas de monocitos que expresaban DC-SIGN. El tercer día, se añadieron al cultivo 20 ng de p24 de vector lentivírico pseudotipado que codifica GFP que se produjeron en presencia de kifunensina y que contenían Vpx. Tres días después de la introducción del vector en el cultivo, se analizó en las células la expresión de GFP como una medida de transducción dentro de las principales poblaciones de células presentes en el momento del análisis: DC (CD11cpos) 6%, células B (CD11cneg, CD19pos) 10%, y células T (CD11cneg, CD3gpos) 80%. Como se muestra en la figura 11, se transdujeron 42% de las células dentro de la población de CD11chi, DC-SIGN+ en comparación con 0,1% para las poblaciones tanto de células B como T presentes en el cultivo. La transducción se anuló por completo en todas las poblaciones de células cuando se incluyó en el cultivo el inhibidor de la transcriptasa inversa nevirapina (inhibidor de la RT). Estos resultados demuestran que en una población heterogénea de células humanas de las cuales las DC son una minoría, el vector lentivírico pseudotipado transduce específicamente las DC que expresan DC-SIGN.
Ejemplo 12
Diseño de un plásmido gag/pol independiente de Rev
Del sistema de cuatro plásmidos típico de los LV de tercera generación pseudotipados, dos de los plásmidos contienen secuencias dentro de sus transcritos que tienen el potencial de recombinación. En concreto, el vector de transferencia (denominado aquí como el genoma de LV) y el plásmido gag/pol. Hay dos regiones de homología de secuencia entre los transcritos del genoma de LV y gag/pol (figura 12). Primero, el genoma de LV tiene una secuencia gag parcial después de la señal de empaquetamiento psi que consiste en 354 pares de bases (pb) que son idénticos al extremo 5' de la secuencia de gag en el plásmido gag/pol. Los sucesos de recombinación que tienen lugar a partir de esta secuencia se solapan y se denominan sucesos de recombinación psi-gag. Segundo, tanto el genoma de LV como gag/pol contienen el elemento de respuesta a Rev (RRE), que consiste en 234 pb que forman una estructura de ARN secundaria que permite la exportación nuclear dependiente de Rev de transcritos que contienen RRE al citoplasma. Estas dos secuencias homólogas se eliminaron eliminando el RRE de plásmido gag/pol y por optimización de codones del marco de lectura abierto de gag/pol (ORF), con la excepción de una región de cambio de marco de lectura entre gag y pol que se requiere para la traducción de productos de proteína pol (figura 12). La región de desplazamiento de marco de lectura forma una estructura de ARN secundaria en la unión de gag y pol que produce un desplazamiento de registro -1 del ribosoma durante la traducción que es esencial para traducir productos génicos de pol. Watts et al., Nature, 460: 711-716 (2009). Para estos experimentos, no se optimizaron los codones de una región de 282 pb entre los pares de bases 1228 y 1509 de del ORF de gag/pol. Esta región empieza en el pb 1563 de la secuencia de pNL4-3 del HIV-1 de tipo natural que codifica la Lisina409 de la proteína Gag y se extiende para incluir el codón de parada de Gag. En las regiones restantes (pb 1-1228 y pb 1510­ 4307 de gag/pol) se optimizaron los codones basándose en la tabla de codones humanos. Nakamura et al., Nucleic Acids Res, 28: 292 (2000). El ORF completo de RI gag/pol se sintetizó en Genscript y se clonó en lugar del ORF que consiste en gag/pol WT y el RRE.
Se sabe que la eliminación del RRE elimina la exportación dependiente de Rev de transcritos de gag/pol del núcleo porque la estructura secundaria de ARN de gag/pol retiene los transcritos en el núcleo. Banchereau y Steinman, Nature, 392 (6673), 245 (1998). Por lo tanto, la optimización de codones sirve tanto para eliminar estas estructuras secundarias de retención como para minimizar la homología de secuencia con el gag parcial en el genoma de LV.
Debido al hecho de que estas modificaciones alivian hipotéticamente al transcrito gag/pol de la necesidad de Rev, el esquema se denomina gag/pol independiente de Rev (RI gag/pol), aunque Rev todavía es necesario durante la producción del vector.
Ejemplo 13
La exportación nuclear de RI gag/pol no requiere Rev
Para demostrar que el transcrito de RI gag/pol es de hecho independiente de Rev, se transfectaron células 293T con plásmidos gag/pol de tipo natural (WT gag/pol) o RI, en presencia o ausencia de un plásmido que codifica Rev. Materiales y métodos
Expresión de la proteína Gag.
Se sembraron células 293T en una placa de 6 pocillos con 1x106 células/pocillo. Veinticuatro horas después, las células se transfectaron con 0,5 |jg de plásmidos WT gag/pol o RI gag/pol en presencia de 0,5 |jg de plásmido Rev o 0,5 jg de plásmido de cadena principal vacía usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Veinticuatro horas más tarde, las células se lisaron con tampón de extracción celular (Invitrogen, n° de catálogo FNN0011) y se analizaron por SDS-PAGE usando geles de NuPAGE Bis-Tris 4-12% premoldeados (Invitrogen, n° de catálogo NP0321PK2) seguido de transferencia a una membrana de nitrocelulosa. Después las transferencias se hibridaron con anticuerpo anti-p24 (Abcam, n° de catálogo ab9071) o anticuerpo anti-actina (Santa Cruz Biotech, n° de catálogo sc-130656). Resultados
Se analizó en los lisados celulares la expresión de productos de proteína gag usando SDS-PAGE y transferencia Western con anticuerpo anti-p24. El plásmido RI gag/pol podía expresar p24 y sus precursores estuviera o no presente Rev, mientras que el transcrito WT gag/pol requería Rev para la expresión de proteínas (figura 13). El procesamiento de la proteína p55 Gag aparecía diferente entre los transcritos RI y WT gag/pol en función de la proporción de proteína p55:p24, lo que sugiere efectos de la optimización de codones en la expresión y/o procesamiento de proteínas. Estos resultados indican que los transcritos pueden sufrir exportación nuclear en ausencia de Rev, lo que confirma que los cambios de diseño en la construcción RI gag/pol alivian el requisito para Rev.
Ejemplo 14
RI gag/pol produce vector infeccioso con títulos comparables a WT gag/pol
Estudios previos han descrito reducciones en los títulos de los vectores producidos en ausencia de Rev. Véase Gasmi et al., J.Virol. 73: 1828-1834 (1999); Lucke et al., J.Virol. 79: 9359-9362 (2005). El vector hecho con la construcción gag/pol "independiente de rev" se ensayó para determinar si generaría partículas infecciosas con títulos comparables a los de WT gag/pol.
Materiales y métodos
Producción de vectores.
El vector se produjo a gran escala (CF10) o a pequeña escala (placa de 10 cm). Para la producción a gran escala, las células 293T se sembraron en 5E8 células/1 litro en un dispositivo Cell Factory de 10 capas (Nunc, n° de catálogo 140400) en medio DMEM que contenían suero al 5%, L-glutamina y antibióticos. Tres días después, las células se transfectaron usando PEI (solución madre 1 mg/ml) y ADN plasmídico total en una relación 3:1 (ml de PEI:mg de ADN). Por cada Cell Factory de 10 capas, se usaron 1 mg del plásmido genómico del vector y 0,5 mg de los plásmidos restantes (gag/pol, Rev y VSV-G). Cinco horas más tarde, los medios se reemplazaron con 1 litro de medios exento de suero (medio Transfx-293, Hyclone n° de catálogo SH30860.LS). El vector se recogió 2 y 3 días después de la transfección. Las recolecciones se clarificaron usando un prefiltro y un filtro Stericup de 0,45 jm (Millipore). El vector se concentró por centrifugación en una botella de centrífuga de 1 litro a 16.000g durante 5 horas. El sedimento de cada litro de recolección se volvió a suspender en 1 ml de HBSS y se dividió en partes alícuotas para su almacenamiento a -80°C, o se volvió a suspender en 1 ml de tampón para el tratamiento con benzonasa (Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, MgCl2 1 mM, sacarosa al 5% v/v). La nucleasa benzonasa se añadió en una concentración final de 250 U/ml y se incubó durante la noche a 4°C con el fin de degradar cualquier plásmido sobrante de la transfección. Las preparaciones de vectores tratadas con benzonasa se volvieron a concentrar usando una almohadilla de sacarosa (30% de sacarosa arriba, 5% de sacarosa abajo) y se centrifugaron a 116.000g en una ultracentrífuga durante 1,5 horas a 4°C. El sedimento de vectores se volvió a suspender en 1 ml de HBSS, se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80°C. Para la producción de vectores a pequeña escala, se sembraron células 293T en una placa de 10 cm a 2,5E5 células/placa y se transfectaron al día siguiente usando PEI de forma similar a como se ha descrito antes, pero con 6 jg de plásmido de genoma de vector y 3 jg de plásmidos restantes, excepto en cantidades variables de plásmidos gag/pol cuando se compara la producción de vectores. Las transfecciones a pequeña escala se realizaron por triplicado para mayor precisión. Cinco horas después, se reemplazaron los medios con 4 ml de medio DMEM que contenían suero al 5%, L-glutamina y antibióticos. El vector se recogió 2 y 3 días después de la transfección y se aclaró usando un filtro de 0,45 pm. El vector se almacenó a -80°C.
Cuantificación de vectores - ensayo de p24
La cuantificación de p24 se llevó a cabo usando el kit de ELISA HIV-1 p24 de Advanced Bioscience Laboratories (Rockville, MD), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Cuantificación de vectores - ensayo de GFU
Se sembraron en placa células 293T con 2E5 células/pocillo en una placa de 12 pocillos en 1 ml de medio DMEM que contenía suero al 5%, L-glutamina y antibióticos. Veinticuatro horas más tarde, las células en cada pocillo se transdujeron con diluciones de 2 veces del vector que codifica GFP. Cada cantidad de vector se prepara en un volumen final de 1 ml en medio completo DMEM. Se prepararon cinco diluciones seriadas de 2 veces del líquido sobrenadante que contenía vector partiendo de 200 pl de vector por pocillo. Como control para descartar la pseudotransducción, se usó el inhibidor de la transcriptasa inversa nevirapina 10 pM con el mayor volumen de vector en un pozo paralelo. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se analizó en las células la expresión de GFP en una máquina Guava (Guava technologies, ahora Millipore). Las unidades de fluorescencia verde (GFU) por ml se calcularon usando un modelo de regresión lineal de mejor ajuste (mínimos cuadrados) basado en los volúmenes de vector y los valores de porcentaje de GFP resultantes con el fin de predecir el número de células positivas para GFP por ml de vector usando la función FORECAST en EXCEL. Los sucesos que dieron como resultado menos de 1% de células positivas para GFP se establecieron como el límite de cuantificación (LOQ).
Resultados
Se generaron dos preparaciones de vectores paralelos pseudotipados con VSV-G usando un genoma de vector que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) como marcador, y con dos cantidades de ADN de entrada de construcciones de WT gag/pol o RI gag/pol. En ambas preparaciones de vectores se analizó p24 y se mostró que tenían títulos de partículas físicas comparables, independientemente del plásmido gag/pol usado para producirlos (figura 14A). Después, se ensayó en estas preparaciones su capacidad para transducir células diana. Cuando se normalizó por volumen, el vector RI gag/pol dio sucesos de transducción comparables a WT gag/pol para ambas cantidades de entrada de plásmido gag/pol (3 pg o 6 pg) usadas durante la producción del vector (figura 14B). Estos resultados indican que los elementos de diseño introducidos para generar la construcción de gag/pol independiente de rev no reducían el rendimiento de partículas físicas o la infectividad del vector lentivírico.
Ejemplo 15
Los vectores RI y WT gag/pol generan respuestas inmunitarias equivalentes
Los LV se usan comúnmente para suministrar ácidos nucleicos que codifican proteínas a diferentes tipos de células para aplicaciones de investigación y en el marco clínico. Sin embargo, también se están desarrollando LV directamente inyectables tanto para la terapia génica como para la inmunoterapia dirigida a antígenos. Para ensayar si un vector RI gag/pol serviría como un LV adecuado para aplicaciones de inmunoterapia, se evaluaron las respuestas inmunitarias generadas contra un transgén de antígeno codificado por el vector RI gag/pol.
Materiales y Métodos
Vector de cuantificación - ensayo de TU
Las unidades de transducción (TU) se determinaron usando un ensayo en el que los sucesos de transducción en una línea celular diana se miden usando un ensayo de PCR cuantitativo que amplifica secuencias de ARN de vector de transcripción inversa. Se incubaron diluciones seriadas de las muestras de ensayo y material de referencia por duplicado en placas de cultivo tisular de 96 pocillos en presencia de células 293T diana. La etapa de transducción se llevó a cabo tanto en presencia como en ausencia del inhibidor de transcriptasa inversa nevirapina como un medio para evaluar la señal de fondo que puede aportar el ADN plasmídico residual. Un día después de la transducción, se lisaron células transducidas de forma simulada o con vector por la adición de un tampón que contenía desoxicolato de sodio, Tween-20, dodecilsulfato de sodio (SDS) y proteinasa K. Los lisados celulares después se incubaron secuencialmente a 37°C, 55°C y 95°C para asegurar la proteólisis y la desnaturalización del ADN. Los lisados celulares desnaturalizados después se analizaron por qPCR usando un conjunto de cebador/sonda que se diseñó para amplificar una secuencia de genoma de vector de aproximadamente 400 pb localizada en la dirección 5' del promotor de antígeno (EXPRESS qPCR Supermix Universal, Life technologies). El título de infectividad se calculó con referencia a una curva patrón que comprende ADN plasmídico linealizado que contiene las secuencias diana diluidas en un intervalo de 7 log (5,3 copias - 5,3 * 106 copias).
Inmunizaciones
Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía subcutánea en la base de la cola el día 0 con 2 * 107, 1 * 108, o 5 * 108TU de LV que codifica LV1b, una construcción de poliepítopo que contiene el epítopo restringido H-2Kb de OVA257 (SIINFEKL) (SEQ ID NO: 24), o vehículo HBSS. Las partes alícuotas de LV almacenadas a -80°C se descongelaron a temperatura ambiente y después se mantuvieron en hielo. El vector se diluyó en serie en HBSS estéril frío y se transportó a la instalación animal para la inyección. Los ratones se colocaron en un dispositivo de retención ranurado convencional con la base de la cola accesible. El vector se administró por inyección de 50 pl con una jeringa de insulina de 0,3 ml de calibre 29 (Becton Dickenson [BD]) insertada por vía subcutánea en el lado derecho de la base de la cola, aproximadamente 1 cm caudal al ano, lo que produce una distensión menor pero notable de la piel alrededor de la base de la cola.
Tinción intracelular de citoquinas (ICS)
Se homogeneizaron los bazos presionando a través de un filtro de nailon de 70 pM. Los glóbulos rojos se lisaron por choque hipotónico por una breve exposición a agua ultrafiltrada enfriada con hielo, seguido de una restauración isotónica inmediata con 10x PBS. Para el análisis de citoquinas, las células se estimularon en 96 pocillos con péptidos en una concentración de 1 pg/ml por péptido en RPMI completo (FCS al 10%, HEPES 10 mM, pmercaptoetanol 2 pM y L-glutamina) durante 5 horas a 37°C, 5% de CO2. El péptido OVA257 (SIINFEKL) se fabricó con una pureza del 95% por AnaSpec (Fremont, CA). Después de la estimulación, se llevó a cabo la tinción de la superficie en tampón FACS (PBS, FCS al 1%, EDTA 2 mM, azida sódica al 0,01%) en presencia del anticuerpo de bloqueo FcR 2.4G2 y LIVE/DEAD® Fixable Near-IR (L/D NIR, Invitrogen). Los anticuerpos usados para la tinción de la superficie en experimentos in vivo incluían anticuerpo anti-CD4-PerCP-Cy5.5 de ratón (eBioscience) o CD4-Alexa Fluor 700 (eBioscience), CD8-Pacific Blue (eBioscience) y B220-V500 (BD). Después de la tinción de la superficie, las células se fijaron con Cytofix® (BD) y se almacenaron a 4°C durante la noche en tampón FACS. Las células después se permeabilizaron con tampón Perm/Wash™ (BD) que contenía suero de rata al 5% (Sigma Aldrich). Los anticuerpos para la tinción intracelular se diluyeron con tampón Perm/Wash™ que contenía suero de rata al 5% y se añadieron a células permeabilizadas. Los anticuerpos incluían anticuerpo anti-TNF-a de ratón-FITC (eBioscience), IFN-y-PE (eBioscience) e IL-2-APC (eBioscience). Las células se lavaron dos veces con tampón Perm/Wash™ y se volvieron a suspender en tampón FACS y se analizaron en un dispositivo LSRFortessa de 3 láser con muestreador de alto rendimiento (BD). Los datos se analizaron usando el software FlowJo (TreeStar, Ashland, OR). Las células T CD8 viables se regularon como sigue: linfocitos (FSCint, SSClD), células individuales (SSC-A = SSC-H), vivas (L/D NIRlD), B220' CD4' CD8+. Las regulaciones de citoquinas se basaron en el percentil 99,9 (0,1% de los sucesos positivos en células no estimuladas).
Resultados
Los ratones se inmunizaron con un intervalo de dosis de vectores WT o RI gag/pol, que contenía, una integrasa de tipo natural (INT(+)) o mutante D64V (INT(-)), que codificaban una construcción de poliepítopo denominada LV1b que contiene el OVA257 (SIINFEKL) (SEQ ID No : 24) epítopo de células T CD8 restringidas a H-2Kb. 12 días después de la inmunización, se midieron las respuestas de células T CD8 específicas de OVA257 en el bazo por ICS para el IFN-y (figura 15). Tanto para los vectores de integración competente como para los de integración deficiente, los vectores RI gag/pol y WT gag/pol generaron respuestas de células T CD8 comparables, lo que confirma que la optimización de codones del gen gag/pol no tenía impacto negativo en la función de LV como un vehículo de inmunoterapia.
Ejemplo 16
Los vectores RI y WT gag/pol inducen inmunidad antivírica protectora
Aunque se observó que las respuestas primarias de las células T CD8 inducidas por LV eran equivalentes con vectores RI gag/pol, se llevaron a cabo los siguientes experimentos para determinar si la inmunidad funcional inducida por estos vectores también era similar. Para abordar esto, se usó una estimulación de virus vaccinia vivo recombinante como modelo de infección vírica.
Materiales y métodos
Estimulación con virus vaccina
Ratones C57BL/6 se inmunizaron por vía subcutánea en la base de la cola el día 0 con 5 * 108 TU del vector que codifica LV1b o vehículo HBSS. Cuatro semanas más tarde, los ratones se estimularon por vía intraperitoneal con 1 x 107 TCID50 virus vaccinia recombinante que expresaba OVA (rVV-OVA), 1E7 TCID50 virus vaccinia de tipo natural (VV-WT) o vehículo HBSS. Cinco días después de la estimulación, se recogieron los ovarios para la cuantificación de la carga vírico mediante un ensayo de TCID50.
Resultados
Los ratones se vacunaron con vectores LV de integración deficiente (INT (-)) que codifican OVA257 con WT o RI gag/pol, y después se estimularon 4 semanas más tarde con virus vaccinia recombinante que codificaba OVA (rVV-OVA) o virus vaccinia de tipo natural (VV-WT) como control (figura 16). Los ratones vacunados con vectores RI gag/pol y WT gag/pol mostraron reducciones notables de la carga vírica después de estimulación con rVV-OVA. Confirmando que la protección era específica de antígeno, la carga vírica después de estimulación con VV-WT era similar entre el vehículo y los grupos tratados con LV. Estos datos indican que los LV RI gag/pol puede inducir células T CD8 de memoria que responden a la estimulación vírica y proporcionan inmunidad funcional.
Ejemplo 17
Las modificaciones de RI gag/pol eliminan la recombinación psi-gag, pero no otros sucesos de recombinación entre el genoma del vector y los transcritos de gag/pol.
El RI gag/pol se diseñó para intentar eliminar la recombinación psi-gag, minimizando además por lo tanto las posibilidades de formación de RCL para los LV de tercera generación. Se usó un procedimiento basado en PCR anidada para analizar el ADN genómico de células transducidas con integración de vector con el fin de detectar la recombinación psi-gag.
Métodos y materiales
Cuantificación de vectores - ensayo de genomas
Se aisló ARN genómico de partículas de vectores usando el Mini kit QIAamp Viral RNA (Qiagen, Valencia, CA). Para eliminar el ADN contaminante, el ácido nucleico extraído después se digirió con DNAsaI (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después se analizaron dos diluciones de cada muestra de ARN tratada con DNAsaI por RT-PCR cuantitativa usando el sistema de RT-PCR cuantitativo RNA Ultrasense One-Step (Invitrogen) y los cebadores y sonda específicos de vectores descritos previamente. El número de copias de genoma de ARN se calculó con respecto a una curva patrón compuesta de ADN plasmídico linealizado que contiene las secuencias diana, diluidas en un intervalo de 7 log (10 copias - 1,0 * 107 copias). El título de genoma como se expresa aquí refleja el número de partículas de vectores físicos, calculadas en función de los genomas, con la predicción de que cada partícula de vector contiene dos copias monocatenarias de ARN genómico.
Ensayo de recombinación de psi-gag
Se sembraron en placa células 293T con 2E6 en una placa de 10 cm. Al día siguiente, las células se transdujeron con 1E11 genomas del vector pseudotipado VSV-G concentrado hecho con WT gag/pol o RI gag/pol. Los títulos para estos vectores eran 1,2E13 genomas/ml y 1,5 genomas/ml respectivamente. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se recogieron las células y el ADN genómico se aisló usando un kit de ADN para cultivo de sangre y celular (Qiagen, n° de catálogo 13323). Se usaron 100 ng de ADN genómico como molde para la primera tanda de PCR usando polimerasa Platinum taq de alta fidelidad (Invitrogen, n° de catálogo 11304-011) y los siguientes parámetros de ciclo: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos; 40 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 90 segundos; 1 ciclo a 68°C durante 5 minutos. Se usó 1 j l (de 50 jl) de la primera PCR como molde sin diluir (1:1) o diluido 1:100 o diluido 1:1000 para la PCR anidada. Los parámetros de ciclo de la PCR anidada eran idénticos a los usados en la primera tanda. No se incluyeron controles de cebadores para todas las reacciones. Los cebadores usados para las PCR era 378
(TAAGGCCGAGTCTTATGAGCAGC) (SEQ ID NO: 60), 709
(AGGACTCGGCTTGCTGAAG) (SEQ ID NO: 61), 710
(AGCCTGTCTCTCAGTACAATC) (SEQ ID NO: 62), 835
(TGTCTTATGTCCAGAATGCT) (SEQ ID NO: 63), 863 (GCACGGCAAGAGGCGAGG) (SEQ ID NO: 64), y 864 (GCCGGATGTCCAGGATGCTG) (SEQ ID NO: 65). Se visualizaron 25 j l del total de 50 j l de la PCR anidada en un gel de agarosa al 1% hecho con tampón 1xTAE y bromuro de etidio. Se extrajeron las bandas y el ADN se purificó usando un kit de extracción de gel (Qiagen, n° de catálogo 28704) seguido de clonación en un vector TOPO-TA (Invitrogen, n° de catálogo K4500-02) y secuenciación (Davis Sequencing, CA) usando cebadores directos e inversos M13.
Resultados
Usando el procedimiento de la PCR anidada, se llevó a cabo una primera tanda de PCR usando un cebador directo (709) que se une al genoma de LV 5' de la señal de empaquetamiento psi y un cebador inverso (710) que se une dentro de la región de desplazamiento del marco de lectura tanto de RI gag/pol como WT gag/pol (figura 12). Después el producto de la PCR de esta primera tanda se diluyó y se usó como molde para una segunda PCR usando un cebador directo anidado (863) que se une al genoma de LV, y un cebador inverso anidado (835 u 864) que se une a la región gag dentro de WT gag/pol o RI gag/pol, respectivamente. Estos dos cebadores inversos se diseñaron para unirse a la misma región en ambas construcciones, debiéndose las únicas diferencias a la optimización de codones. El tamaño del amplicón de un hipotético recombinante psi-gag sería de 937 pb usando los pares de cebadores 863 y 835, o los pares de cebadores 863 y 864.
Las preparaciones de vectores que codifican el poliepítopo LV1b se generaron con los plásmidos RI gag/pol o WT gag/pol, y se usaron para transducir células 293T. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se recogió el ADN genómico y se llevó a cabo la PCR, seguido de un análisis en un gel de agarosa. Primero, se realizó una PCR de control positivo usando cebadores que se unen solo dentro del genoma de LV (cebadores 709 y 378). Se predice que el tamaño previsto del amplicón del genoma de LV con estos cebadores será de 1697 pb. Los cultivos celulares transducidos con vector WT gag/pol o RI gag/pol produjeron ambos el tamaño de amplicón esperado, confirmando así que la transducción y la integración de provirus son comparables para ambos vectores (figura 17A).
A continuación, se llevó a cabo la PCR anidada para la recombinación de psi-gag como se ha descrito antes. El ADN genómico de las células transducidas con el vector WT gag/pol produjo una banda en el tamaño esperado de 937 pb, consistente con la recombinación de psi-gag (mitad izquierda, figura 17B). En cambio, el ADN genómico de las células transducidas con RI gag/pol produjo una banda más grande pero más débil a 1329 pb (mitad derecha, figura 17B). Para determinar la naturaleza de las bandas de la PCR, se extrajo la banda de 937 pb de WT gag/pol, así como la banda de 1329 pb de RI gag/pol y se clonaron en plásmidos TOPO-TA. La secuenciación puso de manifiesto que la banda de WT gag/pol era consistente con un recombinante de psi-gag en cuando que la primera mitad de la secuencia se alineaba con el genoma del vector y la segunda mitad se alineaba con el transcrito de gag/pol que se extendía más allá de la secuencia parcial de gag (figura 17C). La banda más débil de 1329 pb de RI gag/pol codificaba una secuencia que consistía en las primeras 1253 pb que se alineaban con el genoma de LV, pero las últimas 77 pb se alineaban con una región de RI gag/pol (figura 17D). Estos resultados indican que la recombinación de psi-gag era detectable en células transducidas con el vector WT gag/pol, pero no en células transducidas con el vector RI gag/pol. Además, estos resultados presentan la prueba de que la recombinación, aunque aparentemente no depende de las secuencias psi-gag, todavía era detectable en las células transducidas con el vector RI gag/pol.
Ejemplo 18
Identificación de SIGNR1 homólogo de DC-SIGN como receptor de ratón para SINvar1
Se investigaron partículas de vectores ID-VP02 para determinar si podían usar un receptor de ratón endógeno para la unión y entrada. Mientras que los seres humanos codifican DC-SIGN y un parálogo, DC-SIGNR, los ratones tienen 8 homólogos de DC-SIGN (denominados SIGNR1 a SIGNR8). De estos, se predice que seis estarán unidos a la membrana, en concreto, SIGNR1, -R3, -R4, -R5, -R7 y -R8. Según los estudios funcionales, se describe que SIGNR1, SIGNR3 y SIGNR5 (también conocido como Dc -SIGN de ratón) son los ortólogos funcionales más cercanos de DC-SIGn humano. Por lo tanto, se ensayó la capacidad de SINvar1 para mediar la unión y la entrada por estos receptores.
Se generaron células HT1080 que expresan de forma estable SIGNR1, SIGNR3 o SIGNR5 de ratón. Estas células se incubaron con concentraciones variables de vector que codifica GFP de integración deficiente que se pseudotipó con SINvar1, SINvar1 de alto contenido en manosa modificada con kifunensina o con VSV-G pantrópico. En el ejemplo 8, se estableció que se requiere una envuelta SINvar1 producida en presencia del inhibidor de manosidasa I kifunensina para la unión de DC-SIGN y la transducción de Dc humanas. En este experimento, por lo tanto, se usaron células HT1080 que sobreexpresaban DC-SIGN humano como control positivo. De los tres ortólogos de DC-SIGN de ratón ensayados, el vector pseudotipado con SINvar1 transdujo solo células que expresaban SIGNR1 de ratón y lo hizo de una forma dependiente de kifunensina (figura 18A-D), como se había observado para el receptor humano. La eficacia de la transducción del vector SINvar1 modificado con kifunensina en células que expresan DC-SIGN humano y SIGNR1 de ratón era notablemente similar (figura 18A,B), indicando que SIGNR1 es un receptor ortólogo funcional para partículas de vectores ID-VP02 en el ratón.
Ejemplo 19
SIGNR1 se expresa en DC de ratón in vivo
Con el fin de investigar más la utilidad del modelo de ratón para estudios funcionales que reflejaban el mecanismo de acción previsto en seres humanos, se realizaron experimentos para determinar si SIGNR1 era expresado en células dendríticas de ratón.
Materiales y Métodos
Expresión de SIGNR1 y 5 in vivo
Células de bazos individuales o grupos de 10 ganglios linfáticos poplíteos de 5 ratones se tiñeron en tampón FACS (PBS, FCS al 1%, EDTA 2 mM, azida sódica al 0,01%) en presencia del anticuerpo de bloqueo FcR 2.4G2 y LIVE/DEAD® Fixable Near-IR (L/D NIR, Invitrogen). Los anticuerpos usados para la tinción de la superficie incluían anticuerpo anti-CD4-PerCP-Cy5.5 de ratón (eBioscience) o CD4-Alexa Fluor 700 (eBioscience), CD8-Pacific Blue (eBioscience) y B220-V500 (BD). Después de la tinción de la superficie, las células se fijaron con Cytofix® (BD) y se analizaron en un citómetro de flujo multiparamétrico LSRFortessa. Los sucesos de células individuales vivas (L/D NIR-, SSH = SSA) se subdividieron en células B (B220+ TCRp-), células T (TCRP+, B220') y DC (B220- TCRp- MHC-II+ CD11chi). Las regulaciones para la expresión de SIGNR5 y SIGNR1 de cada uno de estos subconjuntos se establecieron usando tinciones de control negativo que carecían de anticuerpos específicos de SIGNR1 y SIGNR5, de modo que las frecuencias de los sucesos positivos eran < 0,00.
Resultados
Las suspensiones de células individuales de tres bazos individuales o tres grupos de ganglios linfáticos poplíteos se analizaron para determinar la expresión de SIGNR1 y SIGNR5 en células T, células B y DC. La expresión de SIGNR5 era relativamente rara en el estado estacionario, detectándose solo en una pequeña población de células B (figura 19). Por el contrario, mientras que la expresión de SIGNR1 estaba limitada en los linfocitos, aproximadamente 10-12% de las DC MHC-II+ CD11chi expresaban SIGNR1 (figura 19). Dado que SIGNR1 también es un receptor funcional para las partículas de vectores ID-VP02, estos datos llevaron a evaluar si las partículas de vectores ID-VP02 se podrían dirigir específicamente a DC de ratones in vivo.
Ejemplo 20
Las partículas de vectores ID-VP02 se dirigen a DC de ganglios linfáticos drenadores de ratón in vivo.
Con el fin de determinar si el producto de un transgén codificado por partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteína E2 del virus Sindbis se podría detectar en DC después de la administración directa, se inyectaron partículas que codificaban GFP o una proteína de control negativo no fluorescente en la almohadilla de la pata derecha de ratones BALB/c receptores.
Materiales y métodos
Transducción de ID-VP02-GFP in vivo.
Se inyectaron por vía subcutánea en ratones BALB/c (n = 15/grupo) en la almohadilla de la pata 3x1010 genomas de partículas de vectores ID-VP02 que codificaban GFP, partículas de control que codificaban NY-ESO-1, o se dejaron sin tratar. Cuatro días después, los ganglios linfáticos poplíteos drenantes o cervicales no drenantes de 5 ratones se agruparon (3 agrupamientos por grupo de tratamiento) y se analizó en los sucesos vivos (L/D individuales (L/D NIR-, SSH=SSA) la presencia de GFP. El fenotipo de las células GFP+ se determinó por la tinción conjunta con anticuerpo anti-CD11c-PE-Cy7 de ratón (eBioscience), MHC-II-Pacific Blue (eBioscience), SIGNR5-PE (eBioscience) y SIGNR1-APC (eBioscience).
Resultados
Cuatro días después de inyectar las partículas de vectores ID-VP02 que codificaban GFP, se agruparon los ganglios linfáticos poplíteos drenantes y cervicales no drenantes de 5 ratones (3 agrupaciones por grupo de tratamiento) y se analizó la expresión de GFP. La inyección de partículas de vectores ID-VP02 que codificaban GFP, pero no una proteína de control no fluorescente, condujo a la detección de células GFP+ en el ganglio linfático poplíteo drenante pero no en el ganglio linfático distal (figura 20A). Tras un análisis adicional de marcadores de superficie, aproximadamente 90% de las células transducidas se identificaron como DC indicado por la expresión de CD11c y MHC-II (figura 20B), y más de un tercio de estas DC GFP+ eran SIGNR1+ (figura 20C), apoyando una función probable para este receptor en la transducción de DC de ratón vivo.
Ejemplo 21
El ADN de partículas de vectores ID-VP02 tiene una biodistribución limitada
Aunque el análisis de las células de los ganglios linfáticos era consistente con el direccionamiento específico de DC de ratón in vivo, se llevaron a cabo estudios de biodistribución para establecer si los sucesos de transducción se podrían detectar en otros tejidos, en particular no linfoides, y caracterizar la cinética de aclaramiento en sitios de tejido positivos.
Materiales y Métodos
Biodistribución de vectores.
Ratones C57BL/6 (n = 3/grupo) recibieron 3 x 1010 genomas de ID-VP02 que codificaban la construcción de poliepítopo LV1b por vía subcutánea en la base de la cola. La presencia de ADN de vector de transcripción inversa se analizó por qPCR a los 1, 4, 8, 21 o 42 días después de inyección en los siguientes tejidos: sitio de inyección (base de la cola), bazo, hígado, corazón, ovarios, cerebro y ganglio linfático drenante (inguinal) y no drenante (cervical). Los tejidos se procesaron en tubos Fastprep Lysing Matrix D usando un homogeneizador Fastprep-24 (MP Biomedicals, Santa Ana, CA) y se aisló el ADN genómico de los homogeneizados usando el kit Qiagen DNeasy Blood & Tissue (Qiagen Inc., Valencia, CA). El ADN eluido (200 ng por muestra) se analizó por qPCR por cuadruplicado usando EXPRESS qPCR Supermix Universal (Life Technologies, Carlsbad, CA) y un conjunto de cebador/sonda diseñado para amplificar una secuencia diana de 85 pb dentro del casete de LV1b. Todas las reacciones se realizaron con el Bio-Rad CFX384 y se analizaron usando el software Bio-Rad CFX Manager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). El número de copias de vector de ADN se calculó con respecto a una curva patrón compuesta del ADN plasmídico que contiene las secuencias diana diluidas en un intervalo de 7 log (101 copias - 107 copias).
Resultados
Se usaron partículas del vector ID-VP02 que codifican una construcción de antígeno de modelo de poliepítopo denominada LV1b para determinar la biodistribución de las partículas. Después de la inyección del vector, la presencia de genomas de vectores de transcripción inversa (a Dn del vector) se puede medir por qPCR usando un conjunto de cebadores y sonda específicos para el casete LV1b. Se administraron a los ratones 2,8 * 1010 genomas de partículas de vectores pseudotipadas-LVlb en una sola inyección subcutánea en la base de la cola. En una evolución temporal entre 1 y 42 días después de la inyección, se cuantificó el ADN del vector en el lugar de la inyección (base de la cola), ganglios linfáticos drenantes (inguinales) y no drenantes (cervicales), bazo, corazón, hígado, cerebro y ovarios). En los tiempos de medición tempranos después de la administración, el ADN del vector se detectó exclusivamente en el sitio de la inyección y en el ganglio linfático drenante. La señal del vector en estos tejidos disminuía a lo largo del tiempo, sin señal cuantificable a los 8 días en el ganglio linfático drenante y señal apenas por encima del límite de cuantificación (LOQ; 10 copias) a los 42 días en el sitio de la inyección (figura 21). Estos resultados indican que la dispersión de las partículas de vectores ID-VP02 fuera del sitio de la inyección se limita al ganglio linfático drenante, donde se suponen que se produciría su actividad biológica, y más de 99% del ADN del vector era eliminado en el plazo de tres semanas.
Ejemplo 22
Las partículas del vector ID-VP02 inducen respuestas de células T CD8 primarias y secundarias polifuncionales Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para medir la capacidad de las partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteína E2 del virus de Sindbis para generar una respuesta inmunitaria específica de antígeno in vivo.
Materiales y métodos
Tinción intracelular de citoquinas (ICS)
Los bazos se homogeneizaron presionando a través de un filtro de nailon de 70 pM. Los glóbulos rojos se lisaron por choque hipotónico por una breve exposición a agua ultrafiltrada enfriada con hielo, seguido de restauración isotónica inmediata con 10x PBS. Para el análisis de citoquinas, las células se estimularon en 96 pocillos con péptidos en una concentración 1 pg/ml por péptido en RPMI completo (FCS al 10%, HEPES 10 mM, p-mercaptoetanol 2 pM y L-glutamina) durante 5 h a 37°C, 5% de CO2. Los péptidos, incluyendo OVA257 (SIINFEKL) (SEQ ID NO: 24), LCMV GP33 (KAVYNFATM) (SEQ ID NO: 66), AH1 (SPSYVYHQF) (SEQ ID NO: 67) y AH1A5 (SPSYAYHQF) (SEQ ID NO: 25) fueron fabricados con una pureza de 95% por AnaSpec (Fremont, CA). En algunos experimentos, como se ha indicado, se incluyó anticuerpo anti-CD107a-PerCP-eF710 de ratón (eBioscience) en el cóctel de estimulación para capturar CD107a translocado en la superficie de células T de desgranulación. Después de la estimulación, se llevó a cabo la tinción de la superficie en tampón FACS (PBS, FCS al 1%, EDTA2 mM, azida sódica al 0,01%) en presencia de anticuerpo de bloqueo FcR 2.4G2 y LIVE/DEAD® Fixable Near-IR (L/D NIR, Invitrogen). Los anticuerpos usados para la tinción de la superficie en los experimentos in vivo incluían anticuerpo anti-CD4-PerCP-Cy5.5 de ratón (eBioscience) o CD4-Alexa Fluor 700 (eBioscience), CD8-Pacific Blue (eBioscience) y B220-V500 (BD). Después de la tinción de la superficie, las células se fijaron con Cytofix® (BD) y se almacenaron a 4°C durante la noche en tampón FACS. Después las células se permeabilizaron con tampón Perm/Wash™ (BD) que contenía suero de rata al 5% (Sigma Aldrich). Los anticuerpos para la tinción intracelular se diluyeron con tampón Perm/Wash™ que contenía suero de rata al 5% y se añadieron a células permeabilizadas. Los anticuerpos incluían anticuerpo anti-TNF-a de ratón-FITC (eBioscience), IFN-y-PE (eBioscience) e IL-2-APC (eBioscience). Las células se lavaron dos veces con tampón Perm/Wash™ y se volvieron a suspender en tampón FACS y se analizaron en un LSRFortessa de 3 láser con muestreador de alto rendimiento (BD). Los datos se analizaron usando el software FlowJo (TreeStar, Ashland, OR). Las células T CD8 viables se regularon como sigue: linfocitos (FSCint, SSClD), células individuales (SSC-A = SSC-H), vivas (L/D NIRlD), B220' CD4' CD8+. Las regulaciones de citoquinas se basaron en el percentil 99,9 (0,1% de los sucesos positivos en células no estimuladas) y la regulación de CD107a se basó en el percentil 99.
Resultados
Para evaluar la actividad inmunológica de las partículas de vectores ID-VP02 in vivo, se administró por vía subcutánea un intervalo de dosis de vector que codifica la ovoalbúmina de pollo de longitud completa (ID-VP02-OVA) a ratones C57BL/6 y se midió la respuesta de células T CD8 específicas de OVA257 en el bazo por tinción de citoquinas intracelulares (ICS) (figura 22A). La frecuencia de los efectores de IFN-Y+ entre las células T CD8 esplénicas varía desde una media de aproximadamente 15% con una dosis de 7,0 * 1010 genomas a aproximadamente 1% con 2,7 * 108 genomas, lo que indica que ID-VP02 induce respuestas de células T CD8 de una manera dependiente de la dosis en al menos un intervalo de dosis de 2 log.
Para determinar si la sensibilización con partículas de vectores ID-VP02 inducía células T de memoria que podrían ser recordadas mediante la administración de ID-VP02 como un refuerzo homólogo, los animales se sensibilizaron con una dosis de intervalo medio de 1,0 * 1010 genomas y después se reforzaron con una dosis equivalente 35 días después de la sensibilización. En diferentes tiempos de medición después de la sensibilización y refuerzo, se midió la respuesta de las células T CD8 por ICS. Al analizar la frecuencia de las células T CD8 IFN-Y+, se encontró que el refuerzo con ID-VP02-OVA inducía una respuesta de recuerdo específica de OVA257 que era tanto más rápida como más de dos veces mayor en magnitud que la respuesta primaria (figura 22B). Estos datos indican que la aplicación de ID-VP02 no se limita a una administración única por inmunidad específica de vector, que se sabe que es un problema para otros vectores víricos, tales como vectores basados en adenovirus.
Además de la tinción para IFN-y, se analizó la calidad de las respuestas de las células T CD8 primarias y secundarias por tinción simultánea de dos citoquinas adicionales, TNF-a e IL-2, así como la translocación de superficie de CD107a, un concepto correlacionado con la actividad citotóxica. Después de tanto la sensibilización como el refuerzo, la mayoría de las células CD8 T respondedoras tenían un fenotipo multifuncional, como se ponía de manifiesto por elucidación de CD107a, TNF-a e IL-2 (figura 22C,D). En especial, 35 días después del refuerzo, esencialmente 100% de las células IFN-Y+ eran CD107a+, una mayoría también expresaba TNF-a, y una fracción sustancial de estas células "triple positivas" también producía IL- 2, que indica la formación de células T de memoria con alta calidad funcional.
Los marcadores KLRG1 y CD127, cuando se miden en torno al máximo de una respuesta de células T CD8 específicas de virus, se han asociado con destinos de células efectoras de corta duración (SLEC) y células precursoras de memoria (MPEC), respectivamente. Como se observó durante la infección con LCMV, cuando se analizó el fenotipo de las células T CD8 que se unen a multímero H-2Kb-OVA257 específico de antígeno el día 9 después de la inmunización, una fracción de células se polarizó a cualquiera de los fenotipos KLRG1+ CD127' SLEC o KLRG1 CD127+ MPEC (figura 22E). Es interesante que 35 días después de las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo, aunque la mayoría de las células tenían un fenotipo de memoria CD127+, se dividían aproximadamente de manera equitativa entre los subconjuntos KLRG1+ y KLRG1', y se describe que ambos tienen un mayor potencial de recuerdo frente a SLEC.
Ejemplo 23
Las células T CD8 de memoria inducidas por partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas con glicoproteína E2 del virus Sindbis se expanden y presentan función antivírica
Para evaluar directamente la función de las células T CD8 de memoria inducidas por inmunización por SINVarl, se usó un casete de antígeno alternativo denominado LV1b, que codifica las secuencias peptídicas tanto de OVA257 como de LCMV GP33 mínimas, dos epítopos restringidos por H-2Kb robustos.
Materiales y Métodos
Multímero MHC-I y análisis de fenotipo de memoria.
Esplenocitos preparados como se ha descrito antes se tiñeron con pentámeros de MHC-I H-2Kb-OVA257 (ProImmune, Oxford, Reino Unido) en tampón FACS a temperatura ambiente durante 10 minutos en presencia de anticuerpo 2-4G2. Las células se lavaron una vez y se tiñeron con anticuerpos de superficie más L/D NIR durante 20 minutos sobre hielo. Los anticuerpos incluían CD127-FITC, CD44-PerCP-Cy5.5, KlRg 1-APC, CD8-Alexa Fluor 700 (todos de eBioscience), y B220-V500 (BD). Las células se lavaron, se fijaron con Cytofix®, y se analizaron como antes. Dentro de la población de células T CD8 viables, se analizaron sucesos CD44hi H-2Kb-OVA257 pentámero+, regulados basados en el percentil 99,9° en ratones no inmunizados, para determinar su expresión de KLRG1 y CD127.
Estimulación con virus vaccinia
Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía subcutánea en la base de la cola el día 0 con un intervalo de dosis de ID-VP02 que codifica LV1b, una construcción de poliepítopo que contiene los epítopos restringidos por H-2Kb OVA257 (SIINFEKL) (SEQ ID NO: 24) y LCMV GP33 (KAVYNFATM) (SEQ ID NO:66), o vehículo HBSS. Cinco semanas después, los ratones se estimularon por vía intraperitoneal con 1x107 TCID50 virus vaccinia recombinantes que expresaban OVA (rVV-OVA), 1E7 TCID50 virus vaccinia de tipo natural (VV-WT), o vehículo HBSS. Cinco días después de la estimulación, los bazos se recogieron para el ICS específico de OVA257 y GP33 como se ha descrito antes, y los ovarios se recogieron para la cuantificación de la carga vírica por el ensayo de TCID50.
Resultados
Como se muestra esquemáticamente en la figura 23A, 35 días después de la inmunización con ID-VP02-LV1b, los ratones estimulados con virus vaccinia recombinante que expresaban OVA (rVV-OVA), pero no el virus vaccinia de tipo natural (VV-WT), mostraron una expansión notable de las células T CD8 específicas de OVA257 (figura 23B, C), indicando que estas células de memoria eran recordadas de una manera específica de antígeno. Además, rVV-OVA no expandía las células de memoria específicas de GP33 (figura 23B), confirmando el requisito de especificidad de antígeno dentro del mismo animal. En correspondencia con la inducción dependiente de la dosis de células T CD8 que respondían a la infección, había una clara reducción dependiente de la dosis en la carga vírica de rVV-OVA en los ovarios de ratones infectados (figura 23D). Es importante que la única secuencia antigénica compartida entre la construcción de antígeno LV1b y la cepa de estimulación de rVV-OVA era el epítopo de MHC de clase I del SIINFEKL, lo que indica que la protección era mediada por células T CD8. Al confirmar que la protección era de hecho específica para el antígeno, la infección con VV-WT no era afectada por la inmunización.
Ejemplo 24
La inmunización por SINVar1 proporciona eficacia antitumoral tanto profiláctica como terapéutica
La línea celular de tumor CT26 se obtiene de un carcinoma de colon espontáneo en ratones BALB/c. Un epítopo endógeno que puede mediar el rechazo de los tumores CT26 implantados es el péptido AH1. Aunque la interacción de MHC-TCR es relativamente débil con el epítopo AH1, el ligando peptídico alterado AH1A5 puede estabilizar esta interacción, conduciendo a una mayor expansión de las células T c D8 y respuestas antitumorales. Para generar SINVar1 que codifica este epítopo, se generó un casete de antígeno en el que se insertó la secuencia de AH1A5 en la secuencia de OVA de longitud completa (OVA-AH1A5), como se ha descrito previamente. Brockstedt et al., Proc. NatlAcadSci. U.S.A 101 (38), 13832 (2004).
Materiales y métodos
Ensayo de citotoxicidad in vivo
Se inmunizaron ratones BALB/c (3 por grupo) por vía subcutánea en la base de la cola con ID-VP02 que codifica OVA-AH1A5. Doce días después, las células diana pulsadas con péptido, marcadas con colorante, se transfirieron por vía intravenosa a través del seno retroorbital a ratones inmunizados y de control no tratados. Las células diana se prepararon a partir de esplenocitos que no habían recibido tratamiento previo mediante lisis de los glóbulos rojos por choque hipotónico, después las células se dividieron en tres poblaciones que se pulsaron con 1 pg/ml de péptidos AH1 (SPSYVYHQF) (SEQ ID NO: 67), AH1A5 (SPSYAYHQF) (SEQ ID NO: 25), o control negativo NY-ESO-181-88 (Rg PESRLL) (SEq ID NO: 68). Las células se lavaron y después se marcaron con CFSE 2 pM (Invitrogen) más una de tres concentraciones de Cell Trace Violet (Invitrogen): 2 pM, 0,2 pM o 0,02 pM. Las células diana se combinaron en una relación 1:1:1 y se transfirieron 5*10® células totales a los receptores. Al día siguiente, se recogieron los bazos y se comparó la recuperación relativa de cada población entre ratones no tratados previamente e inmunizados para calcular la muerte específica como se ha descrito previamente. Wonderlich et al., Curr. Protoc. Immunol. Capítulo 3, Unit (2006).
Estimulación de tumor CT26
Para los experimentos de profilaxis, ratones BALB/c (10 por grupo) se inmunizaron por vía subcutánea en la base de la cola con ID-VP02 que codifica OVA-AH1A5, un antígeno que contiene un epítopo de rechazo restringido por MHC-I definido para células tumorales CT26. Cuatro semanas más tarde, se inyectó a los ratones inmunizados y de control no tratados por vía subcutánea 8 * 104 células tumorales CT26 en el flanco derecho. El crecimiento tumoral se controló tres veces por semana y los ratones se sacrificaron cuando el área del tumor superó los 100 mm2. Los experimentos de ensayo de ID-VP02 en el modo terapéutico se realizaron de la misma manera, con la excepción de que la inmunización con ID-VP02 se retrasó hasta cuatro días después de la implantación del tumor.
Resultados
Cuando los ratones BALB/c se inmunizaron con ID-VP02 que codifica OVA-AH1A5, se observó la inducción dependiente de la dosis de células T CD8 específicas de AH1A5 multifuncionales, aproximadamente la mitad de los cuales reaccionaron de forma cruzada con la secuencia de AH1 endógena (figura 24a ). La capacidad de las células T CD8 inducidas por ID-VP02 para adquirir capacidad citolítica se analizó directamente por ensayo de citotoxicidad in vivo. Tres poblaciones de células diana de esplenocitos se marcaron simultáneamente con CFSE más concentraciones variables de Cell Trace Violet, después se pulsaron con AH1, AH1A5 o un péptido de control negativo. Las células diana se mezclaron en una relación 1:1:1, después se transfirieron conjuntamente a ratones receptores inmunizados 12 días antes con ID-VP02 o dejados sin tratar. Después de 1 día, la recuperación relativa de los objetivos pulsados con AH1 y AH1A5 se redujo en ratones inmunizados con ID-VP02, con tasas de muerte específicas de más de 90% contra AH1A5 y aproximadamente 25% contra AH1 (figura 24B), indicando que ID-VP02 induce células T CD8 citotóxicas funcionales contra el antígeno inmunizante.
Como primer ensayo de eficacia antitumoral, los ratones inmunizados por vía subcutánea con ID-VP02-OVA-AH1A5 o vehículo se estimularon 28 días después con células tumorales CT26 implantadas en el flanco. Aunque todos los ratones de control tenían un crecimiento tumoral letal (> 100 mm2) el día 21, 70% de los ratones inmunizados con ID-VP02 podían rechazar los tumores implantados y estos ratones supervivientes estaban libres de tumor durante al menos 60 días (figura 24C). Estos hallazgos se extendieron por la aplicación de ID-VP02 como terapia a tumores CT26 previamente implantados. En este modelo, los tumores se dejaron crecer durante 5 días, después los animales se trataron con ID-VP02-OVA-AH1A5 o control de vehículo. Como en los experimentos profilácticos, todos los animales de control sucumbieron al crecimiento del tumor en aproximadamente tres semanas (figura 24D). Por el contrario, todos los ratones tratados con ID-VP02 mostraron efectos en la progresión del tumor, que van desde un retraso en la cinética de crecimiento hasta el rechazo absoluto. Los tumores bien no crecieron hasta alcanzar un tamaño palpable (2/10) o retrocedieron completamente (3/10) en el grupo inmunizado, conduciendo a que 50% de los ratones estuvieran sin hasta al menos el día 60. Estos datos muestran que ID-VP02 puede ejercer actividad citotóxica antitumoral tanto en el marco profiláctico como terapéutico, lo que respalda la evaluación de ID-VP02 como un agente terapéutico para el cáncer en seres humanos.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para generar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que comprende:
(a) cultivar en un medio de cultivo que comprende kifunensina, una célula de empaquetamiento de virus que comprende:
(1) un genoma de vector lentivírico que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de interés expresable,
(2) a polinucleótido que codifica una glicoproteína de la envuelta de alfavirus que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN y
(3) un polinucleótido que codifica una proteína Vpx o una proteína Vpr que retiene la actividad inhibidora de SAMHD1; y
(b) aislar una partícula de vector lentivírico pseudotipada que se une preferentemente a células dendríticas que expresan DC-SIGN, en donde dichas partículas de vectores lentivíricos están más altamente manosiladas en comparación con una composición de control de las mismas partículas de vectores lentivíricos pseudotipadas preparadas en ausencia de un inhibidor de manosidasa.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la partícula de vector lentivírico es de integración deficiente.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la glicoproteína de la envuelta del alfavirus se selecciona del grupo que consiste en una glicoproteína E2 de Sindbis, una glicoproteína E2 de Sindbis que es 90% idéntica a la SEQ ID No : 30 [SIN-Var1] una glicoproteína E2 de Sindbis que es 90% idéntica a la SEQ iD NO: 30 [SIN-Var1] en donde (i) el resto 160 de la glicoproteína E2 está ausente o es un aminoácido distinto del ácido glutámico, (ii) uno o más de los restos 70, 76 o 159 de la variante de la glicoproteína E2 es un resto no básico, y (iii) la variante de la glicoproteína E2 no es parte de una proteína de fusión con la glicoproteína E3 del virus Sindbis o una glicoproteína E2 del Sindbis como se expone en la SEQ ID NO: 30 [ SIN-Var1].
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a SIVmac Vpx [SEQ ID NO: 44], o en donde la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90% idéntica a SIVmac Vpx (s Eq ID NO: 44), SIVsm Vpx (SEQ ID NO: 45), SIVrcm Vpx (SEQ ID NO: 46), o HIV-2 Vpx (SEQ ID NO: 47), o en donde la proteína Vpx comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a SIVdeb Vpr (SeQ ID NO: 48) o SIVmus Vpr (SeQ ID NO: 49).
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la secuencia expresable de interés codifica un antígeno exógeno, en donde dicho antígeno exógeno es opcionalmente:
(a) un antígeno específico de tumor o un antígeno específico de virus;
(b) un antígeno específico de tumor seleccionado del grupo que consiste en NY-ESO-1, MAGE, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa, antígeno de carcinoma de células renales, 5T4, SM22-alfa, anhidrasa carbónica I, anhidrasa carbónica IX (también conocida como G250), HIF-1alfa, HIF-2alfa, VEGF, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno específico de la próstata (PSA), fosfatos de ácido prostático, antígeno epitelial de la próstata con seis dominios transmembranales (STEAP), NKX3.1, enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reordenación bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado, p53 de tipo natural, citocromo P4501B1, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, proteína E6 del papilomavirus humano, proteína E7 del papilomavirus humano, antígeno carcinoembrionario y alfa-fetoproteína; o
(c) un antígeno específico de virus seleccionado de un antígeno de HIV, un antígeno de SIV, un antígeno de adenovirus, un antígeno de enterovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de calicivirus, un antígeno de virus del moquillo, un antígeno de virus del Ébola, un antígeno de flavivirus, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno de herpesvirus, un antígeno de virus de la peritonitis infecciosa, un antígeno de influenzavirus, un antígeno de virus de la leucemia, un antígeno de virus de Marburg, un antígeno de ortomixovirus, un antígeno de papilomavirus, un antígeno de virus parainfluenza, un antígeno de paramixovirus, un antígeno de parvovirus, un antígeno de pestivirus, un antígeno de picornavirus, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus de la viruela, un antígeno de virus de la rabia, un antígeno de reovirus, un antígeno de retrovirus o un antígeno de rotavirus.
6. El método de la reivindicación 5, en donde el vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo antígeno.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el primer y el segundo antígeno son expresados como una proteína de fusión que comprende un péptido A2 de autoescisión entre los dos antígenos, o en donde el primer y el segundo antígeno son expresados a partir de un promotor bidireccional.
8. El método de la reivindicación 6 o 7, en donde el primer antígeno es NY-ESO-1 y el segundo antígeno es MAGE-A3.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en donde el genoma del vector lentivírico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula estimuladora seleccionada del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNF-alfa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 y CD40 inducible por fármacos.
10. El método de la reivindicación 1, en donde el polinucleótido de interés codifica una molécula estimuladora seleccionada del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFalfa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 y Cd40 inducible por fármacos.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, o en donde la kifunensina está presente en el medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 0,25 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la célula empaquetadora de virus comprende además un polinucleótido que comprende los genes gag y pol.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la célula de empaquetamiento de virus comprende además:
(i) un polinucleótido que comprende los genes gag y pol; y
(ii) un polinucleótido que codifica una proteína rev.
14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde el polinucleótido que comprende los genes gag y pol carece de un elemento de respuesta a rev (RRE) funcional y/o el gen pol codifica una enzima integrasa inactiva.
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