CN106119196A - 一种dc细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DC细胞的制备方法，包括如下步骤：S1、用人单核细胞在培养基中孵育得到未成熟DC细胞溶液；S2、取S1中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL‑1β、IL‑6、TNF‑α、PGE2、GM‑CSF、IL‑4、IL‑7得到混合液；调节温度至35‑37℃，孵育48‑52h，收集细胞。本发明制备得到的DC细胞个数多，操作简单，适合工业化生产。

Description

一种DC细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种DC细胞的制备方法。
背景技术
树突状细胞简称DC细胞，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞，已证实，DC细胞是唯一能够显著刺激初始T细胞增殖的抗原提呈细胞。DC细胞可以有效诱导抗原特异性T细胞的增殖和活化，是机体肿瘤免疫反应的主要启动者和参与者，是充满前景的治疗工具。目前体外培养DC细胞主要是使用GM-CSF和IL-4两种细胞因子配合DC细胞培养基进行，这个方法制备得到的DC细胞个数不高，不能满足人们对DC细胞的需求，因此，需要提供一种新的DC细胞制备方法，来提高制备得到的DC细胞个数。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种DC细胞的制备方法，本发明制备得到的DC细胞个数多，操作简单。
本发明提出的一种DC细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、用人单核细胞在培养基中孵育得到未成熟DC细胞溶液；
S2、取S1中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；调节温度至35-37℃，孵育48-52h，收集细胞。
优选地，S1中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml。
优选地，S1中，将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A；调节温度至35-37℃，孵育3.5-4.5h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，继续孵育23-25h得到未成熟DC细胞溶液。
优选地，S1中，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml。
优选地，S1中，在继续孵育，至有细胞集落生成的过程中，若培养基颜色变黄，则补加培养基。
优选地，S2中，混合液中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml，IL-7的浓度为20ng/ml。
上述S1中，DC-GROW培养基可以从市场上购得。
上述S2中，IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7均可从市场上购得。
本发明选用GM-CSF、IL-4、IL-7相互配合，可以在制备DC细胞的过程中，抑制巨噬细胞的过渡生长，从而将更多的人单核细胞诱导分化成DC细胞，进而大大增加了制备得到的DC细胞个数；在GM-CSF促进人单核细胞和巨噬细胞分化的过程中，IL-4和IL-7配合GM-CSF，可以抑制巨噬细胞的过渡生长，促进得到更多的DC细胞；在人单核细胞分化成DC细胞后，GM-CSF配合IL-4、IL-7，促进DC细胞存活，从而进一步增加了DC细胞的个数；GM-CSF还可以提高细胞表面MHC-II类分子的表达，从而增强DC细胞的抗原递呈功能；GM-CSF、IL-4、IL-7与IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2相互配合，可以进一步促进DC细胞的生长和成熟；本发明操作简单，适合工业化大生产。
附图说明
图1为本发明所得DC细胞的含量与未添加IL-7所得DC细胞的含量的比较图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种DC细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、用人单核细胞在培养基中孵育得到未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；调节温度至36℃，孵育50h，收集细胞，其中，混合液中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml，IL-7的浓度为20ng/ml。
实施例2
一种DC细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A；调节温度至35℃，孵育4.5h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，继续孵育23h得到未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；调节温度至37℃，孵育48h，收集细胞，其中，混合液中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml，IL-7的浓度为20ng/ml。
实施例3
一种DC细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A；调节温度至37℃，孵育3.5h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，继续孵育25h得到未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；调节温度至35℃，孵育52h，收集细胞，其中，混合液中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml，IL-7的浓度为20ng/ml。
实施例4
一种DC细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A；调节温度至35.5℃，孵育4.3h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，继续孵育23.5h得到未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；调节温度至36.5℃，孵育49h，收集细胞，其中，混合液中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml，IL-7的浓度为20ng/ml。
实施例5
一种DC细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A；调节温度至37℃，孵育4h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，继续孵育24h得到未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；调节温度至37℃，孵育48h，收集细胞，其中，混合液中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml，IL-7的浓度为20ng/ml。
试验例1
对照组DC细胞的制备方法为：在S2中，取S1中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4得到混合液，其他操作同实施例5，得到细胞。
对实施例5得到的细胞和对照组得到的细胞进行检测，测定细胞中DC细胞的含量，检测结果参照图1，图1为本发明所得DC细胞的含量与未添加IL-7所得DC细胞的含量的比较图。由图1可以看出，本发明所得DC细胞的含量高于未添加IL-7所得DC细胞的含量。IL-7和GM-CSF、IL-4相互配合，可以大大增加DC细胞的含量。
其中，DC细胞可以表达特定的表面标记物HLA-DR、CD83和CD86，通常通过检测这三种物质的含量来体现DC细胞的含量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种DC细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、用人单核细胞在培养基中孵育得到未成熟DC细胞溶液；
S2、取S1中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；调节温度至35-37℃，孵育48-52h，收集细胞。
2.根据权利要求1所述DC细胞的制备方法，其特征在于，S1中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml。
3.根据权利要求1或2所述DC细胞的制备方法，其特征在于，S1中，将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A；调节温度至35-37℃，孵育3.5-4.5h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，继续孵育23-25h得到未成熟DC细胞溶液。
4.根据权利要求3所述DC细胞的制备方法，其特征在于，S1中，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml。
5.根据权利要求3所述DC细胞的制备方法，其特征在于，S1中，在继续孵育，至有细胞集落生成的过程中，若培养基颜色变黄，则补加培养基。
6.根据权利要求1或2所述DC细胞的制备方法，其特征在于，S2中，混合液中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml，IL-7的浓度为20ng/ml。
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