ES2698154T3 - Reduction of heavy metals in plants - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresión para inhibir la traducción de ARNm de NtMRP4 cuando se expresa en una planta de tabaco, que comprende un promotor unido operativamente a: (a) un polinucleótido, la secuencia del polinucleótido que consiste de cualquiera de secs. con núms. de ident.: 13- 23 o 53, ubicadas en orientación antisentido con respecto al promotor; o (b) un constructo de polinucleótidos de 15 a 100 nucleótidos de longitud que es al menos 80 % idéntico a una región de sec. con núm. de ident.: 1, ubicado en orientación antisentido con respecto al promotor; o (c) un polinucleótido que codifica un polinucleótido de ARNi capaz de autoaparearse para formar una estructura de horquilla que comprende: una primera secuencia de 15 a 300 nucleótidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1; una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura en horquilla; y una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.An expression vector for inhibiting translation of NtMRP4 mRNA when expressed in a tobacco plant, comprising a promoter operably linked to: (a) a polynucleotide, the polynucleotide sequence consisting of any of secs. with nos. Ident .: 13-23 or 53, located in antisense orientation with respect to the promoter; or (b) a polynucleotide construct 15 to 100 nucleotides in length that is at least 80% identical to a region of sec. with no. Ident .: 1, located in antisense orientation with respect to the promoter; or (c) a polynucleotide that encodes an RNAi polynucleotide capable of self-pairing to form a hairpin structure comprising: a first sequence of 15 to 300 nucleotides having at least 80% sequence identity with sec. with no. of ident .: 1; a second sequence encoding a spacer element that forms a loop of the hairpin structure; and a third sequence having an inverse complementary sequence of the first sequence, located in the same orientation as the first sequence, wherein the second sequence is located between the first sequence and the third, and the second sequence is operably linked to the first. sequence and the third sequence.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Reducción de metales pesados en plantasReduction of heavy metals in plants

Campo de la invenciónField of the invention

La presente invención se dirige a polinucleótidos y polipéptidos que codifican transportadores ABC que se implican en el transporte de metales pesados. La presente invención se dirige, además, a modificar la expresión de dichos polinucleótidos o polipéptidos en plantas. En particular, la presente invención se refiere a la modulación (por ejemplo, reducción o inhibición) de la expresión o actividad de uno o más transportadores ABC implicados en el transporte de metales pesados subcelular.The present invention is directed to polynucleotides and polypeptides encoding ABC transporters that are involved in the transport of heavy metals. The present invention is also directed to modify the expression of said polynucleotides or polypeptides in plants. In particular, the present invention relates to the modulation (eg, reduction or inhibition) of the expression or activity of one or more ABC transporters involved in the transport of heavy subcellular metals.

IntroducciónIntroduction

Las plantas obtienen metales pesados esenciales - tales como el zinc y el cobre - mediante la absorción de substratos con iones metálicos de su entorno mediante diversos mecanismos de transporte mediados por transportadores transmembrana que se expresan en la superficie de las células de las raíces y otros tejidos vasculares. Un mecanismo usa el transporte de toxinas hacia fuera del citosol. Por ejemplo, la familia de bombas de glutatión S-conjugado (GS-X) es una clase de transportadores de casete de unión a ATP (ABC) que es responsable de la eliminación/secuestro de compuestos en plantas así como también en células de levadura y de mamífero. La estructura molecular y la función de las bombas GS-X codificadas por los genes MRP, cMOAT (transportador de aniones multiespecíficos canalizado) y YCF1 (factor de cadmio de levadura) de mamíferos y plantas parecen haberse conservado a lo largo de la evolución molecular.Plants obtain essential heavy metals - such as zinc and copper - by absorbing substrates with metal ions from their environment by various transport mechanisms mediated by transmembrane transporters that are expressed on the surface of root cells and other tissues Vascular One mechanism uses the transport of toxins out of the cytosol. For example, the S-conjugated glutathione pump family (GS-X) is a class of ATP-binding cassette transporters (ABC) that is responsible for the elimination / sequestration of compounds in plants as well as in yeast cells and of mammal. The molecular structure and function of the GS-X pumps encoded by the MRP genes, cMOAT (channeled multispecific anion transporter) and YCF1 (yeast cadmium factor) of mammals and plants appear to have been conserved throughout molecular evolution.

Las plantas se exponen a toxinas exógenas - tales como productos microbianos, aleloquímicos, agroquímicos y metales pesados - lo que hace que la supervivencia celular dependa de mecanismos para desintoxicar o reducir la acumulación de estos agentes. Los metales pesados - tales como plomo, cadmio, mercurio, etcétera - son tóxicos ambientales importantes, que causan la generación de especies de oxidación reactiva, daño en el ADN y la inactivación enzimática mediante la unión a sitios activos de enzimas en células de organismos vivos. La contaminación del ambiente con metales pesados ha aumentado drásticamente debido a la industrialización y al aumento del tamaño de la población. Los suelos contaminados con metales pesados inhiben el crecimiento normal de las plantas y causan la contaminación de los productos alimenticios. Muchos metales pesados son muy tóxicos para la salud humana y cancerígenos a bajas concentraciones.Plants are exposed to exogenous toxins - such as microbial, allelochemical, agrochemical and heavy metal products - which makes cell survival dependent on mechanisms to detoxify or reduce the accumulation of these agents. Heavy metals - such as lead, cadmium, mercury, etc. - are important environmental toxins, causing the generation of species of reactive oxidation, DNA damage and enzymatic inactivation by binding to active sites of enzymes in cells of living organisms . The contamination of the environment with heavy metals has increased drastically due to industrialization and the increase in the size of the population. Soils contaminated with heavy metals inhibit the normal growth of plants and cause contamination of food products. Many heavy metals are very toxic to human health and carcinogenic at low concentrations.

La reducción en el contenido de metales pesados - tales como el cadmio - en plantas o productos vegetales consumidos por animales y humanos es muy conveniente y se requiere urgentemente. Un objeto de la presente invención es satisfacer esta necesidad.The reduction in the content of heavy metals - such as cadmium - in plants or plant products consumed by animals and humans is very convenient and is urgently required. An object of the present invention is to satisfy this need.

Aspectos y modalidades de la invenciónAspects and methods of the invention

Los aspectos y modalidades de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se define en las reivindicaciones independientes y ciertas características opcionales de estas se definen en las reivindicaciones dependientes. En la medida en que los términos “invención”, “ejemplo”, “aspecto” y “modalidad” se usan en la presente descripción, esto se interpretará de tal manera que la única protección buscada es para la invención tal como se reivindica.The aspects and embodiments of the present invention are set forth in the appended claims. The present invention is defined in the independent claims and certain optional features of these are defined in the dependent claims. Insofar as the terms "invention", "example", "aspect" and "embodiment" are used in the present description, this will be interpreted in such a way that the only protection sought is for the invention as claimed.

En un aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos un 71 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51; un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o 30 a 50; un polinucleótido que codifica un polipéptido NtMRP que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con cualquiera de secs. con núms. de ident.: 24 a 26 o 52, y preferentemente, en donde el polipéptido tiene actividad transportadora de metales pesados.In one aspect, there is provided an isolated polynucleotide selected from the group consisting of: an isolated polynucleotide comprising, consisting of or consisting essentially of a sequence having at least 71% sequence identity with sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident. 27 or sec. with no. Ident. 28, sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. of ident .: 51; an isolated polynucleotide comprising, consisting or consisting essentially of a sequence having at least 65% sequence identity with any of secs. with numbers Ident .: 3 to 23 or 30 to 50; a polynucleotide encoding an NtMRP polypeptide comprising, consisting of or consisting essentially of a sequence having at least 65% sequence identity with any of secs. with numbers Ident .: 24 to 26 or 52, and preferably, wherein the polypeptide has heavy metal transport activity.

En un aspecto adicional, se proporciona un constructo de polinucleótido de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud que es al menos un 65 % idéntico a una región de cualquiera de secs. con núms. de ident.: 1 a 23 o 27 a 51.In a further aspect, there is provided a polynucleotide construct of at least 15 contiguous nucleotides in length that is at least 65% identical to a region of any one of secs. with numbers Ident .: 1 to 23 or 27 to 51.

En un aspecto adicional, se proporciona un ribopolinucleótido bicatenario que comprende al menos dos secuencias que son al menos complementarias parcialmente entre sí y en donde una cadena sentido comprende una primera secuencia y una cadena antisentido comprende una segunda secuencia y en donde al menos una de las secuencias comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de ARN de NtMRP. In a further aspect, a double-stranded ribopolynucleotide comprising at least two sequences that are at least partially complementary to each other and wherein a sense strand comprises a first sequence and an antisense strand comprises a second sequence and wherein at least one of the sequences comprises at least 10 contiguous nucleotides of NtMRP RNA.

Adecuadamente, el ARN bicatenario comprende una primera secuencia que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con al menos 10 nucleótidos de ADN de NtMRP; una segunda secuencia; y una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se coloca entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.Suitably, the double-stranded RNA comprises a first sequence having at least 65% sequence identity with at least 10 nucleotides of NtMRP DNA; a second sequence; and a third sequence having an inverse complementary sequence of the first sequence, placed in the same orientation as the first sequence, wherein the second sequence is placed between the first sequence and the third sequence, and the second sequence is operatively linked to the first sequence and the third sequence.

Adecuadamente, la primera secuencia tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 3, sec. con núm. de ident.: 4, sec. con núm. de ident.: 5, sec. con núm. de ident.: 6, sec. con núm. de ident.: 7, sec. con núm. de ident.: 8, sec. con núm. de ident.: 9, sec. con núm. de ident.: 10, sec. con núm. de ident.: 11, sec. con núm. de ident.: 12, sec. con núm. de ident.: 13, sec. con núm. de ident.: 14, sec. con núm. de ident.: 15 sec. con núm. de ident 16, sec. con núm. de ident.: 17, sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 19, sec. con núm. de ident.: 20 sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident. 21, sec. con núm. de ident.: 22, sec. con núm. de ident.. 23, sec. con núm. de ident. 30, sec. con núm. de ident. 31, sec. con núm. de ident.: 32, sec. con núm. de ident.: 33, sec. con núm. de ident. 34, sec. con núm. de ident. 35, sec. con núm. de ident.: 36, sec. con núm. de ident.: 37, sec. con núm. de ident. 38, sec. con núm. de ident. 39, sec. con núm. de ident.: 40, sec. con núm. de ident.: 41, sec. con núm. de ident. 42, sec. con núm. de ident. 43, sec. con núm. de ident.: 44, sec. con núm. de ident.: 45, sec. con núm. de ident. 46, sec. con núm. de ident. 47, sec. con núm. de ident.: 48, sec. con núm. de ident.: 49, sec. con núm. de ident.: 50 y sec con núm. dr ident. 53.Suitably, the first sequence has at least 65% sequence identity with a sequence selected from the group consisting of: sec. with no. of ident .: 3, sec. with no. of ident .: 4, sec. with no. of ident .: 5, sec. with no. Ident. 6, sec. with no. Ident. 7, sec. with no. Ident. 8, sec. with no. Ident. 9, sec. with no. Ident. 10, sec. with no. Ident. 11, sec. with no. Ident. 12, sec. with no. of ident .: 13, sec. with no. Ident. 14, sec. with no. of Ident .: 15 sec. with no. of ident 16, sec. with no. Ident. 17, sec. with no. Ident. 18, sec. with no. Ident. 19, sec. with no. Ident. 20 sec. with no. Ident. 21, sec. with no. of ident. 21, sec. with no. Ident. 22, sec. with no. of ident .. 23, sec. with no. of ident. 30, sec. with no. of ident. 31, sec. with no. Ident. 32, sec. with no. Ident. 33, sec. with no. of ident. 34, sec. with no. of ident. 35, sec. with no. Ident. 36, sec. with no. Ident. 37, sec. with no. of ident. 38, sec. with no. of ident. 39, sec. with no. Ident. 40, sec. with no. Ident. 41, sec. with no. of ident. 42, sec. with no. of ident. 43, sec. with no. Ident. 44, sec. with no. Ident. 45, sec. with no. of ident. 46, sec. with no. of ident. 47, sec. with no. Ident. 48, sec. with no. Ident. 49, sec. with no. Ident .: 50 and sec with no. dr ident 53

Adecuadamente, la tercera secuencia tiene al menos 65 % de identidad de secuencia con el complemento inverso de la secuencia correspondiente a sec. con núm. de ident .: 3, sec. con núm. de ident.: 4, sec. con núm. de ident.: 5, sec. con núm. de ident.: 6, sec. con núm. de ident.: 7, sec. con núm. de ident.: 8, sec. con núm. de ident.: 9, sec. con núm. de ident.: 10, sec. con núm. de ident.: 11, sec. con núm. de ident.: 12, sec. con núm. de ident.: 13, sec. con núm. de ident.: 14, sec. con núm. de ident.: 15 sec. con núm. de ident.: 16, sec. con núm. de ident.: 17, sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 19, sec. con núm. de ident.: 20, sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident.: 22, sec. con núm. de ident..23, sec. con núm. de ident.: 30, sec. con núm. de ident.: 31, sec. con núm. de ident.: 32, sec. con núm. de ident.: 33, sec. con núm. de ident.: 34, sec. con núm. de ident.: 35, sec. con núm. de ident.: 36, sec. con núm. de ident.: 37, sec. con núm. de ident.: 38, sec. con núm. de ident.: 39, sec. con núm. de ident.: 40, sec. con núm. de ident.: 41, sec. con núm. de ident.: 42, sec. con núm. de ident.: 43, sec. con núm. de ident.: 44, sec. con núm. de ident.: 45, sec. con núm. de ident.: 46, sec. con núm. de ident.: 47, sec. con núm. de ident.: 48, sec. con núm. de ident.: 49, sec. con núm. de ident.: 50 y sec con núm. de ident. 53.Suitably, the third sequence has at least 65% sequence identity with the reverse complement of the sequence corresponding to sec. with no. of ident.: 3, sec. with no. of ident .: 4, sec. with no. of ident .: 5, sec. with no. Ident. 6, sec. with no. Ident. 7, sec. with no. Ident. 8, sec. with no. Ident. 9, sec. with no. Ident. 10, sec. with no. Ident. 11, sec. with no. Ident. 12, sec. with no. of ident .: 13, sec. with no. Ident. 14, sec. with no. of Ident .: 15 sec. with no. Ident. 16, sec. with no. Ident. 17, sec. with no. Ident. 18, sec. with no. Ident. 19, sec. with no. Ident. 20, sec. with no. Ident. 21, sec. with no. Ident. 21, sec. with no. Ident. 22, sec. with no. of ident..23, sec. with no. Ident. 30, sec. with no. Ident. 31, sec. with no. Ident. 32, sec. with no. Ident. 33, sec. with no. Ident. 34, sec. with no. Ident. 35, sec. with no. Ident. 36, sec. with no. Ident. 37, sec. with no. Ident. 38, sec. with no. Ident. 39, sec. with no. Ident. 40, sec. with no. Ident. 41, sec. with no. Ident. 42, sec. with no. Ident. 43, sec. with no. Ident. 44, sec. with no. Ident. 45, sec. with no. Ident. 46, sec. with no. Ident. 47, sec. with no. Ident. 48, sec. with no. Ident. 49, sec. with no. Ident .: 50 and sec with no. of ident. 53

En un aspecto adicional, se proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado o el constructo de polinucleótido.In a further aspect, there is provided an expression vector comprising the isolated polynucleotide or the polynucleotide construct.

En un aspecto adicional, se proporciona una célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica que comprende el polinucleótido aislado, el constructo de polinucleótido, el ribonucleótido bicatenario o el vector de expresión.In a further aspect, there is provided a mutant, non-natural or transgenic plant cell comprising the isolated polynucleotide, the polynucleotide construct, the double-stranded ribonucleotide or the expression vector.

En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende la célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica.In a further aspect, a mutant plant of non-natural or transgenic origin comprising the mutant plant cell of non-natural or transgenic origin is provided.

En un aspecto adicional, se proporciona material vegetal lo que incluye biomasa, semillas u hojas que comprenden células o tejido de dicha planta.In a further aspect, plant material is provided which includes biomass, seeds or leaves comprising cells or tissue of said plant.

En un aspecto adicional, se proporciona un producto de tabaco que comprende una parte de dicha planta o célula vegetal o dicho material vegetal.In a further aspect, a tobacco product comprising a part of said plant or plant cell or said plant material is provided.

En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica, en donde disminuye la expresión del polinucleótido de NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera y las hojas de dicha planta tienen una reducción en el contenido de cadmio de al menos 5 % en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no han disminuido. In a further aspect, there is provided a mutant plant, of non-natural or transgenic origin, wherein the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this manner or the activity of the protein encoded in this manner and the leaves decreases. of said plant have a reduction in the cadmium content of at least 5% compared to a control plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this manner or the activity of the protein encoded in this way they have not diminished.

En un aspecto adicional, se proporciona biomasa, semillas u hojas que comprenden tejido de la planta.In a further aspect, biomass, seeds or leaves comprising plant tissue are provided.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para reducir los niveles de cadmio en al menos una parte de una planta, que comprende la etapa de reducir la expresión del polinucleótido de NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.In a further aspect, there is provided a method for reducing the levels of cadmium in at least a part of a plant, comprising the step of reducing the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this manner or the activity of the protein encoded in this manner as compared to a control plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this manner or the activity of the protein encoded in this way has not decreased.

En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida u obtenible por el método descrito en la presente descripción, en donde hay una reducción en el contenido de cadmio de al menos aproximadamente 5 % en al menos una parte de la planta en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.In a further aspect, there is provided a mutant plant, of non-natural or transgenic origin obtained or obtainable by the method described in the present description, wherein there is a reduction in the cadmium content of at least about 5% in at least a part of the plant compared to a control plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this manner or the activity of the protein encoded in this way has not decreased.

En un aspecto adicional, se proporciona un polipéptido NtMRP aislado expresado por la secuencia expuesta en cualquiera de secs. con núms. de ident.: 24 a 26 o sec. con núm. de ident.: 52, preferentemente, en donde el polipéptido tiene actividad transportadora de metales pesados.In a further aspect, an isolated NtMRP polypeptide expressed by the sequence set forth in any of secs. with numbers Ident .: 24 to 26 or sec. with no. ID: 52, preferably, wherein the polypeptide has heavy metal transport activity.

En un aspecto adicional, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido aislado.In a further aspect, there is provided an antibody that specifically binds to the isolated polypeptide.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar un polinucleótido NtMRP en una muestra que comprende la etapa de: (a) proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido; (b) poner en contacto dicha muestra con uno de más cebadores o una o más sondas para detectar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP; y (c) detectar la presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación indica la presencia del polinucleótido NtMRP en la muestra.In a further aspect, there is provided a method for detecting an NtMRP polynucleotide in a sample comprising the step of: (a) providing a sample comprising a polynucleotide; (b) contacting said sample with one of more primers or one or more probes to specifically detect at least a portion of the NtMRP polynucleotide; and (c) detecting the presence of an amplification product, wherein the presence of an amplification product indicates the presence of the NtMRP polynucleotide in the sample.

Otros aspectos de la presente invención se exponen más abajo.Other aspects of the present invention are discussed below.

Un gen quimérico que comprende el polinucleótido que unido operativamente a una o más secuencias reguladoras. Un constructo polinucleotídico o un ARN bicatenario de acuerdo con la presente invención, en donde el polinucleótido comprende, consiste o consiste esencialmente en al menos 15-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50­ 100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 nucleótidos, 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 nucleótidos o 600-700 nucleótidos.A chimeric gene comprising the polynucleotide that operably linked to one or more regulatory sequences. A polynucleotide construct or a double-stranded RNA according to the present invention, wherein the polynucleotide comprises, consists or consists essentially of at least 15-30 nucleotides, 30-50 nucleotides, 50-100 nucleotides, 100-150 nucleotides, 150-200 nucleotides , 200-300 nucleotides, 300-400 nucleotides, 400-500 nucleotides, 500-600 nucleotides or 600-700 nucleotides.

Un conjugado que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, el constructo de polinucleótido o el ARN bicatenario de acuerdo con la presente invención y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico que se une covalentemente al mismo.A conjugate comprising the isolated polynucleotide, the chimeric gene, the polynucleotide construct or the double-stranded RNA according to the present invention and at least one non-nucleotide or non-polynucleotide moiety that is covalently linked thereto.

Una célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, el constructo de polinucleótido, el ARN bicatenario, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.A mutant plant cell of non-natural or transgenic origin comprising the isolated polynucleotide, the chimeric gene, the polynucleotide construct, the double-stranded RNA, the conjugate or the expression vector according to the present invention.

Una planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende la célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica de acuerdo con la presente invención.A mutant plant of non-natural or transgenic origin comprising the mutant plant cell of non-natural or transgenic origin according to the present invention.

Adecuadamente, la biomasa seca de las hojas recolectadas es aproximadamente la misma que la de la planta control.Suitably, the dry biomass of the collected leaves is approximately the same as that of the control plant.

Biomasa, semilla u hojas que comprenden tejido de la planta de la presente invención.Biomass, seed or leaves comprising tissue of the plant of the present invention.

Un producto consumible que incorpora o usa la biomasa, la semilla o las hojas de acuerdo con la presente invención.A consumable product that incorporates or uses biomass, seed or leaves according to the present invention.

Biomasa, semilla u hojas de acuerdo con la presente invención o un producto consumible de acuerdo con la presente invención, en donde hay una reducción en el contenido de cadmio de al menos aproximadamente 5 % en la misma en comparación con la biomasa, semilla u hojas de una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.Biomass, seed or leaves according to the present invention or a consumable product according to the present invention, wherein there is a reduction in the cadmium content of at least about 5% therein compared to the biomass, seed or leaves of a control plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this manner or the activity of the protein encoded in this manner has not decreased.

Una línea celular que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, el constructo de polinucleótido, el ARN bicatenario, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.A cell line comprising the isolated polynucleotide, the chimeric gene, the polynucleotide construct, the double-stranded RNA, the conjugate or the expression vector according to the present invention.

Un método para preparar una planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende la etapa de reducir la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada en al menos una parte de dicha planta en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.A method for preparing a mutant, non-natural or transgenic plant comprising the step of reducing the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this way or the activity of the encoded protein in at least a part of said plant in comparison with a control plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this way or the activity of the protein encoded in this manner has not decreased.

Un método para reducir los niveles de cadmio en al menos una parte de una planta, que comprende la etapa de reducir la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido. A method for reducing the levels of cadmium in at least a part of a plant, comprising the step of reducing the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this way or the activity of the protein encoded in this way in comparison with a control plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this way or the activity of the protein encoded in this way has not decreased.

Adecuadamente, dicho método comprende la primera etapa de poner en contacto dicha planta con el constructo de polinucleótido, el ARN bicatenario, el conjugado, el vector de expresión, una meganucleasa o una proteína con dedos de zinc.Suitably, said method comprises the first step of contacting said plant with the polynucleotide construct, the double-stranded RNA, the conjugate, the expression vector, a meganuclease or a protein with zinc fingers.

Adecuadamente, dicho método comprende la primera o la etapa adicional de poner en contacto dicha planta con un mutágeno.Suitably, said method comprises the first or the additional step of contacting said plant with a mutagen.

Una planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida u obtenible por los métodos de la presente invención, en donde hay una reducción en el contenido de cadmio de al menos aproximadamente 5 % en al menos una parte de la planta en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.A mutant plant, of non-natural or transgenic origin obtained or obtainable by the methods of the present invention, wherein there is a reduction in the cadmium content of at least about 5% in at least a part of the plant as compared to a plant control in which the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this way or the activity of the protein encoded in this way has not decreased.

Un método para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión del polinucleótido NtMRP o la actividad de la proteína codificada de esta manera en una célula, dicho método comprende administrar el gen quimérico, el constructo del polinucleótido, el ARN bicatenario, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.A method for modulating (eg, reducing or inhibiting) the expression of the NtMRP polynucleotide or the activity of the protein encoded in this way in a cell, said method comprising administering the chimeric gene, the polynucleotide construct, the double-stranded RNA, the conjugate or the expression vector according to the present invention.

Un método para detectar, aislar, amplificar o analizar un polinucleótido NtMRP, el método comprende la etapa de proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido e hibridar dicho polinucleótido a una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con la presente invención.A method for detecting, isolating, amplifying or analyzing an NtMRP polynucleotide, the method comprises the step of providing a sample comprising a polynucleotide and hybridizing said polynucleotide to a polynucleotide molecule comprising a nucleotide sequence of at least 10 contiguous nucleotides of the isolated nucleotide sequence according to the present invention.

El uso de un agente que modula (por ejemplo, reduce o inhibe) la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera para reducir el contenido de cadmio en al menos una parte de una planta por lo menos 5 % en comparación con una planta control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta manera o la actividad de la proteína codificada de esta manera no ha disminuido.The use of an agent that modulates (eg, reduces or inhibits) the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this manner or the activity of the protein encoded in this manner to reduce the cadmium content in at least one part of a plant at least 5% compared to a control plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide and the activity of the protein encoded in this way or the activity of the protein encoded in this way has not decreased.

El método o el uso de acuerdo con la presente invención, en donde el agente es o se deriva del polinucleótido NtMRP, un gen NtMRP quimérico, un constructo de polinucleótido que comprende un polinucleótido NtMRP, un ARN antisentido, un ARN bicatenario, un ADNc, un conjugado que comprende un polinucleótido NtMRP y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico que se une covalentemente a él, una ribozima, un mutágeno, una dedos de zinc, una molécula pequeña o una meganucleasa.The method or use according to the present invention, wherein the agent is or is derived from the NtMRP polynucleotide, a chimeric NtMRP gene, a polynucleotide construct comprising an NtMRP polynucleotide, an antisense RNA, a double-stranded RNA, a cDNA, a conjugate comprising an NtMRP polynucleotide and at least one non-nucleotide or non-polynucleotide moiety that is covalently bound to it, a ribozyme, a mutagen, a zinc finger, a small molecule or a meganuclease.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para producir un producto de tabaco que comprende las etapas de: (a) obtener semilla de la planta de tabaco mutante, de origen no natural o transgénica; (b) plantar y cultivar la semilla hasta obtener una planta; (c) cosechar la planta; y (d) preparar un producto de tabaco a partir de la planta cosechada.In a further aspect, there is provided a method for producing a tobacco product comprising the steps of: (a) obtaining seed from the plant of mutant tobacco, of non-natural or transgenic origin; (b) plant and grow the seed to obtain a plant; (c) harvest the plant; and (d) preparing a tobacco product from the harvested plant.

Las modalidades mencionadas anteriormente se describen como modalidades de cada uno de los aspectos descritos anteriormente.The modalities mentioned above are described as modalities of each of the aspects described above.

Algunas ventajasSome advantages

Producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas (lo que incluye biomasa, semillas y hojas obtenidas a partir de las mismas) en las cuales están presentes cantidades menores de cadmio proporciona una serie de ventajas.Producing mutant, non-natural or transgenic plants (which includes biomass, seeds and leaves obtained from them) in which smaller amounts of cadmium are present provides a number of advantages.

A manera de ejemplo, las plantas, lo que incluye las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas, pueden cultivarse en suelos que contienen concentraciones variables de cadmio, o en suelos que contienen concentraciones de cadmio menores que las convenientes. Estas plantas y las semillas derivadas pueden proporcionar más opciones para cultivarlas en una gama más amplia de ambientes de suelo, lo que puede aumentar la cantidad de suelos cultivables disponibles para los practicantes (por ejemplo, agricultores).By way of example, plants, which include mutant plants, of non-natural origin or transgenic, can be grown in soils containing varying concentrations of cadmium, or in soils containing cadmium concentrations lower than those suitable. These plants and derived seeds can provide more options for cultivating them in a wider range of soil environments, which can increase the amount of arable land available to practitioners (eg farmers).

A modo de ejemplo adicional, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas (lo que incluye biomasa, semillas y hojas obtenidas a partir de las mismas) exhiben un contenido de cadmio reducido, en comparación con sus contrapartes control y pueden consumirse directamente como productos comestibles. El consumo de estos productos comestibles puede ser una opción más saludable. Plantas adecuadas que pueden manipularse de acuerdo con los métodos descritos incluyen plantas cultivables para uso agrícola, lo que incluye tabaco, arroz, maíz, calabaza, soja, lechuga, patatas, remolachas, hierbas, trigo, cebada y zanahorias, etcétera.By way of further example, the mutant, non-natural or transgenic plants (including biomass, seeds and leaves obtained therefrom) exhibit a reduced cadmium content, as compared to their control counterparts and can be consumed directly as edible products. The consumption of these edible products can be a healthier option. Suitable plants that can be handled according to the methods described include agriculturally grown plants, which include tobacco, rice, corn, squash, soybeans, lettuce, potatoes, beets, herbs, wheat, barley and carrots, and so on.

A modo de ejemplo adicional, la altura y/o el peso de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas es igual sustancialmente que las plantas control. Por lo tanto, no se encuentran diferencias significativas en las hojas secas recogidas de las plantas en comparación con un control lo que indica que la modulación de los transcritos de NtMRP no tiene un efecto relevante estadísticamente sobre la biomasa seca. Esto es ventajoso porque las plantas se usan para la producción comercial de diversos productos, lo que incluye el tabaco, donde las alteraciones en el aspecto visual no serían aceptables para la industria o podrían resultar en rendimientos de producción reducidos inaceptablemente.By way of further example, the height and / or the weight of the mutant plants, of non-natural origin or transgenic is substantially the same as the control plants. Therefore, no significant differences are found in the dried leaves collected from the plants compared to a control which indicates that the modulation of the NtMRP transcripts does not have a statistically relevant effect on the dry biomass. This is advantageous because the plants they are used for the commercial production of various products, including tobacco, where alterations in visual appearance would not be acceptable to the industry or could result in unacceptably low production yields.

Breve descripción de las figurasBrief description of the figures

Figura 1. La Figura 1(a) es un diagrama esquemático del locus de NtMRP4; la Figura 1(b) muestra la secuencia de nucleótidos de NtMRP4 en la cual las regiones 5' y 3' UTR están subrayadas; los exones se muestran en letras mayúsculas y negritas; los intrones se muestran en letra minúscula y normal; y los codones de inicio y finalización se muestran en gris. Las secuencias 5' y 3' de los cebadores para la generación de una secuencia de ARNi de NtMRP4 se indican en cursiva y tachadas.Figure 1. Figure 1 (a) is a schematic diagram of the NtMRP4 locus; Figure 1 (b) shows the nucleotide sequence of NtMRP4 in which the 5 'and 3' UTR regions are underlined; the exons are shown in uppercase and bold letters; the introns are shown in lowercase and normal letters; and the start and end codons are shown in gray. The 5 'and 3' sequences of the primers for the generation of an RNA sequence of NtMRP4 are indicated in italics and crossed out.

La Figura 2 ilustra la expresión del polinucleótido NtMRP4 durante el tratamiento con cadmio en condiciones hidropónicas durante 7 días. Se trataron plántulas KY14 de tres semanas con 0, 0,05 y 0,5 CdCh (a) y plántulas de 4 semanas de N. rustica y N. tabacum (TN90) se trataron con 0,5 pM de CdCl2 durante una semana (b). El ARN se aisló y se sometió a RT-PCR semicuantitativa.Figure 2 illustrates the expression of the NtMRP4 polynucleotide during treatment with cadmium under hydroponic conditions for 7 days. Three week KY14 seedlings were treated with 0, 0.05 and 0.5 CdCh (a) and 4 week seedlings of N. rustica and N. tabacum (TN90) were treated with 0.5 pM CdCl2 for one week ( b) The RNA was isolated and subjected to semiquantitative RT-PCR.

La Figura 3 ilustra la reducción de cadmio en la hoja en las líneas 1 y 2 de las líneas de ARNi de NtMRP4 en comparación con las plantas cultivadas en el campo de tipo silvestre.Figure 3 illustrates the reduction of cadmium in the sheet in lines 1 and 2 of the RNAi lines of NtMRP4 compared to plants grown in the wild-type field.

La Figura 4 muestra la reducción de cadmio en la hoja para dos líneas cultivadas de ARNi de NtMRP4. En este experimento, se añadió un vector control sin una inserción de NtMRP4.Figure 4 shows the cadmium reduction in the leaf for two cultured lines of NtMRP4 RNAi. In this experiment, a control vector without an insertion of NtMRP4 was added.

La Figura 5 muestra la estructura del intrón-exón y la localización de los intrones y exones a lo largo de la secuencia de clonación genómica NtPMI-BAC-GOTOWE_5_gDNA BAC que abarca la región de codificación de NtMRP4. La homología de la secuencia de ADNc (pares de bases 1-4.521 de cadena superior) y la secuencia de clonación de BAC genómica que comprende la región de codificación de MRP4 (pares de bases 61 781-69 748 de cadena inferior) es del 100 %.Figure 5 shows the structure of the intron-exon and the location of the introns and exons along the genomic cloning sequence NtPMI-BAC-GOTOWE_5_gDNA BAC spanning the coding region of NtMRP4. The homology of the cDNA sequence (base pairs 1-4,521 higher chain) and genomic BAC cloning sequence comprising the coding region of MRP4 (base pairs 61 781-69 748 lower chain) is 100 %.

La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos de NtMRP3 en la cual las regiones 5' y 3' UTR están en cursiva; los exones se muestran en letras mayúsculas y en negrita; los intrones se muestran en letra minúscula y normal; y los codones de inicio y finalización se muestran en letras mayúsculas, en negrita y en cursiva.Figure 6 shows the nucleotide sequence of NtMRP3 in which the 5 'and 3' UTR regions are in italics; the exons are shown in capital letters and in bold; the introns are shown in lowercase and normal letters; and the start and end codons are shown in capital letters, in bold and in italics.

DefinicionesDefinitions

Los términos técnicos y expresiones usados dentro del alcance de esta solicitud generalmente tendrán el significado aplicado comúnmente para ellos en la técnica pertinente a la biología molecular y de plantas. Todas las definiciones de los términos siguientes se aplican a todo el contenido de esta solicitud. La palabra "que comprende" no excluye otros elementos o etapas, y los artículos indefinidos "un" o "una" no excluyen una pluralidad. Una sola etapa puede cumplir con las funciones de varias características enumeradas en las reivindicaciones. Los términos “esencialmente”, “alrededor de”, “aproximadamente” y similares en conexión con un atributo o un valor particularmente también definen exactamente el atributo o exactamente el valor, respectivamente. El término “aproximadamente” en el contexto de un valor o intervalo numérico dado se refiere a un valor o intervalo que está dentro del 20 %, dentro del 10 %, o dentro del 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % del valor o intervalo dado. Un “polinucleótido” se refiere a un polímero de nucleótidos, que puede ser un desoxirribopolinucleótido (ADN) o un ribopolinucleótido (ARN) modificado o no modificado. En consecuencia, un polinucleótido puede ser, sin limitación, un ADN genómico, ADN complementario (ADNc) (por ejemplo, sec. con núm. de ident.: 27), ARNm, o ARN antisentido. Además, un polinucleótido puede ser a Dn monocatenario o bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias o bicatenarias, una molécula híbrida que comprende ADN y ARN, o una molécula híbrida con una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Adicionalmente, el polinucleótido puede estar compuesto de regiones de triple cadena que comprenden ADN, ARN, o ambos. Un polinucleótido puede contener una o más bases modificadas, tales como fosfotioatos, y puede ser un polinucleótido peptídico (PNA). Generalmente, los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden ensamblarse a partir de fragmentos de ADNc, ADN genómico, oligonucleótidos aislados o clonados, o nucleótidos individuales, o una combinación de los anteriores. Aunque las secuencias de polinucleótidos descritas en la presente descripción se muestran como secuencias de ADN, las secuencias incluyen sus secuencias de ARN correspondientes, y sus secuencias de ADN o ARN complementarias (por ejemplo, complementarias completamente), lo que incluye los complementos inversos de estas.The technical terms and expressions used within the scope of this application will generally have the meaning commonly applied to them in the art pertinent to plant and molecular biology. All definitions of the following terms apply to the entire content of this application. The word "comprising" does not exclude other elements or steps, and the indefinite articles "a" or "an" do not exclude a plurality. A single stage can fulfill the functions of several features listed in the claims. The terms "essentially", "about", "about" and the like in connection with an attribute or a value particularly also define exactly the attribute or exactly the value, respectively. The term "approximately" in the context of a given numerical value or range refers to a value or range that is within 20%, within 10%, or within 5%, 4%, 3%, 2% or 1 % of the given value or interval. A "polynucleotide" refers to a polymer of nucleotides, which may be a deoxyribopolinucleotide (DNA) or a modified or unmodified ribopolynucleotide (RNA). Accordingly, a polynucleotide can be, without limitation, a genomic DNA, complementary DNA (cDNA) (eg, SEQ ID No. 27), mRNA, or antisense RNA. Moreover, a polynucleotide may be a single or double stranded D n, DNA that is a mixture of single- or double - stranded regions, hybrid molecule comprising DNA and RNA, or a hybrid molecule with a mixture of single- and double - stranded regions. Additionally, the polynucleotide may be composed of triple chain regions comprising DNA, RNA, or both. A polynucleotide may contain one or more modified bases, such as phosphothioates, and may be a peptide polynucleotide (PNA). Generally, the polynucleotides described in the present disclosure can be assembled from cDNA fragments, genomic DNA, isolated or cloned oligonucleotides, or individual nucleotides, or a combination of the foregoing. Although the polynucleotide sequences described in the present description are shown as DNA sequences, the sequences include their corresponding RNA sequences, and their complementary DNA or RNA sequences (for example, completely complementary), which includes the inverse complements thereof. .

El término “polinucleótido NtMRP” abarca polinucleótidos en los cuales un polímero de nucleótidos comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia expuesta en secs. con núms. de ident.: 1, 2, 27, 28, 29 o 51. Este término abarca, además, una secuencia de polinucleótidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con secs. con núms. de ident.: 1, 2, 27, 28, 29 o 51; fragmentos de secs. con núms. de ident.: 1, 2, 27, 28, 29 o 51; y fragmentos de secs. con núms. de ident.: 1, 2, 27, 28, 29 o 51 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. La variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia del gen NtMRP aislado - tales como el gen NtMRP3 o el gen NtMRP4. Aunque las secuencias de polinucleótidos NtMRP descritas en la presente descripción se muestran como secuencias de ADN, las secuencias incluyen sus secuencias de ARN correspondientes y sus secuencias de ADN o ARN complementarias (por ejemplo, complementarias completamente), lo que incluye el(los) complemento(s) inverso(s) de estos y las secuencias de ADN o ARN antisentido. Fragmentos ilustrativos se exponen en secs. con núms. de ident.: 3 a 23 y 30 a 50 y 53.The term "NtMRP polynucleotide" encompasses polynucleotides in which a nucleotide polymer comprises, consists or consists essentially of the sequence set forth in secs. with numbers Ident .: 1, 2, 27, 28, 29 or 51. This term also encompasses a polynucleotide sequence with substantial homology (ie, sequence similarity) or substantial identity with secs. with numbers Ident .: 1, 2, 27, 28, 29 or 51; fragments of secs. with numbers Ident .: 1, 2, 27, 28, 29 or 51; and fragments of secs. with numbers of ident: 1, 2, 27, 28, 29 or 51 with substantial homology (ie, sequence similarity) or substantial identity therewith. The variant can have at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with respect to the isolated NtMRP gene sequence - such as the NtMRP3 gene or the NtMRP4 gene. Although the NtMRP polynucleotide sequences described in the present disclosure are shown as DNA sequences, the sequences include their corresponding RNA sequences and their complementary DNA or RNA sequences (eg, completely complementary), which includes the complement (s) (s) inverse of these and the antisense DNA or RNA sequences. Illustrative fragments are discussed in secs. with numbers Ident .: 3 to 23 and 30 to 50 and 53.

El término "polinucleótido NtMRP3" se refiere a una modalidad en la cual un polímero de nucleótidos comprende, consiste o consiste esencialmente en un polinucleótido designado en la presente descripción como sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51. El término abarca variantes de polinucleótidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51; fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51; y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. Como se describe en la presente descripción, la variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP3 aislado. Fragmentos ilustrativos se exponen en secs. con núms. de ident.: 30 a 50.The term "NtMRP3 polynucleotide" refers to an embodiment in which a nucleotide polymer comprises, consists or consists essentially of a polynucleotide designated in the present disclosure as sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51. The term encompasses variants of polynucleotides with substantial homology (ie, sequence similarity) or substantial identity with sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. of ident .: 51; fragments of sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. of ident .: 51; and fragments of sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51 with substantial homology (ie, sequence similarity) or substantial identity with it. As described in the present description, the variant can have at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the sequence of the isolated NtMRP3 gene. Illustrative fragments are discussed in secs. with numbers Ident .: 30 to 50

El término "polinucleótido NtMRP4" se refiere a una modalidad en la cual un polímero de nucleótidos comprende, consiste o consiste esencialmente en un polinucleótido designado en la presente descripción como sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27. El término abarca variantes de polinucleótidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27; fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27; y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. La variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP3 aislado. Fragmentos ilustrativos se exponen en secs. con núms. de ident.: 3 a 23 y 53. The term "NtMRP4 polynucleotide" refers to an embodiment in which a nucleotide polymer comprises, consists of or consists essentially of a polynucleotide designated in the present disclosure as sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident .: 27. The term encompasses variants of polynucleotides with substantial homology (ie, sequence similarity) or substantial identity with sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. of ident .: 27; fragments of sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. of ident .: 27; and fragments of sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident .: 27 with substantial homology (ie, sequence similarity) or substantial identity with it. The variant can have at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% , 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the sequence of the isolated NtMRP3 gene. Illustrative fragments are discussed in secs. with numbers Ident .: 3 to 23 and 53.

El término "polipéptido NtMRP" se refiere a un polipéptido que comprende, que consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tiene homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial a secs. con núms. de ident.: 24 a 26 y 52; fragmentos de secs. con núms. de ident.: 24 a 26 y 52; y fragmentos de secs. con núms. de ident.: 24 a 26 y 52 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial a la misma. Los polipéptidos NtMRP incluyen fragmentos y secuencias que comprenden un grado suficiente o sustancial de identidad o similitud con secs. con núms. de ident.: 24 a 26 y 52 que pueden funcionar mediante el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) a través de las membranas celulares. Los polipéptidos NtMRP incluyen, además, las variantes o mutantes producidas mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan el replegamiento o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), las que pueden modificarse genéticamente deliberadamente o aislarse naturalmente. Los polipéptidos NtMRP pueden estar en forma lineal o cíclica mediante el uso de métodos conocidos. La variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %,70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia del polipéptido NtMRP4. The term "NtMRP polypeptide" refers to a polypeptide comprising, consisting or consisting essentially of an amino acid sequence having substantial homology (i.e., sequence similarity) or substantial identity to secs. with numbers Ident .: 24 to 26 and 52; fragments of secs. with numbers Ident .: 24 to 26 and 52; and fragments of secs. with numbers Ident .: 24 to 26 and 52 with substantial homology (ie, sequence similarity) or substantial identity to it. NtMRP polypeptides include fragments and sequences comprising a sufficient or substantial degree of identity or similarity with secs. with numbers Ident .: 24 to 26 and 52 that can function by transporting heavy metals (eg, cadmium) through cell membranes. The NtMRP polypeptides also include the variants or mutants produced by the introduction of any type of alterations (e.g., insertions, deletions, or amino acid substitutions, changes in glycosylation states, changes that affect refolding or isomerizations, three-dimensional structures, or self-association states), which can be deliberately genetically modified or isolated naturally. The NtMRP polypeptides may be in linear or cyclic form by the use of known methods. The variant can have at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with the NtMRP4 polypeptide sequence.

El término "polipéptido NtMRP3" se refiere a una modalidad en la cual el polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia expuesta en sec. con núm. de ident.: 52 o a un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con sec. con núm. de ident.: 52; fragmentos de sec. con núm. de ident.: 52; y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 52 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. Los polipéptidos NtMRP3 incluyen fragmentos y secuencias que comprenden un grado suficiente o sustancial de identidad o similitud con sec. con núm. de ident.: 52 que pueden funcionar mediante el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) a través de las membranas celulares. Los polipéptidos NtMRP3 incluyen, además, las variantes o mutantes producidos mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan el replegamiento o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), las que pueden modificarse genéticamente deliberadamente o aislarse naturalmente. Los polipéptidos NtMRP3 pueden estar en forma lineal o cíclica mediante el uso de métodos conocidos. Como se describe en la presente descripción, la variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad con la secuencia del polipéptido NtMRP3.The term "NtMRP3 polypeptide" refers to an embodiment in which the polypeptide comprises, consists or consists essentially of the sequence set forth in sec. with no. Ident .: 52 or a polypeptide comprising, consisting or consisting essentially of an amino acid sequence with substantial homology (i.e., sequence similarity) or substantial identity with sec. with no. Ident .: 52; fragments of sec. with no. Ident .: 52; and fragments of sec. with no. Ident .: 52 with substantial homology (ie, sequence similarity) or substantial identity with it. NtMRP3 polypeptides include fragments and sequences comprising a sufficient or substantial degree of identity or similarity with sec. with no. Ident .: 52 that can function by transporting heavy metals (eg, cadmium) through cell membranes. The NtMRP3 polypeptides also include variants or mutants produced by the introduction of any type of alterations (for example, insertions, deletions, or amino acid substitutions, changes in glycosylation states, changes that affect refolding or isomerizations, three-dimensional structures, or self-association states), which can be deliberately genetically modified or isolated naturally. The NtMRP3 polypeptides may be in linear or cyclic form by the use of known methods. As described in the present description, the variant can have at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity with the NtMRP3 polypeptide sequence.

El término "polipéptido NtMRP4" se refiere a una modalidad en la cual el polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia expuesta en sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm. The term "NtMRP4 polypeptide" refers to an embodiment in which the polypeptide comprises, consists or consists essentially of the sequence set forth in sec. with no. Ident. 24, sec. with no. Ident .: 25, or sec. with no.

de ident.: 26 o a un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm. de ident.: 26; fragmentos de sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm. de ident.: 26; y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm. de ident.: 26 con homología sustancial (es decir, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma. Los polipéptidos NtMRP4 incluyen fragmentos y secuencias que comprenden un grado suficiente o sustancial de identidad o similitud con sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.: 25, o sec. con núm. de ident.: 26 que pueden funcionar mediante el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) a través de las membranas celulares. Los polipéptidos NtMRP4 incluyen, además, las variantes o mutantes producidos mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan el replegamiento o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), las que pueden modificarse genéticamente deliberadamente o aislarse naturalmente. Los polipéptidos NtMRP4 pueden estar en forma lineal o cíclica mediante el uso de métodos conocidos. Como se describe en la presente descripción, la variante puede tener al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad con la secuencia del polipéptido NtMRP4.Ident .: 26 or a polypeptide comprising, consisting or consisting essentially of an amino acid sequence with substantial homology (i.e., sequence similarity) or substantial identity with sec. with no. Ident. 24, sec. with no. Ident .: 25, or sec. with no. of ident .: 26; fragments of sec. with no. Ident. 24, sec. with no. Ident .: 25, or sec. with no. of ident .: 26; and fragments of sec. with no. Ident. 24, sec. with no. Ident .: 25, or sec. with no. Ident .: 26 with substantial homology (ie, sequence similarity) or substantial identity with it. NtMRP4 polypeptides include fragments and sequences comprising a sufficient or substantial degree of identity or similarity with sec. with no. Ident. 24, sec. with no. Ident .: 25, or sec. with no. Ident .: 26 that can function by transporting heavy metals (eg, cadmium) through cell membranes. NtMRP4 polypeptides also include variants or mutants produced by the introduction of any type of alterations (for example, insertions, deletions, or amino acid substitutions, changes in glycosylation states, changes that affect refolding or isomerizations, three-dimensional structures, or self-association states), which can be deliberately genetically modified or isolated naturally. The NtMRP4 polypeptides may be in linear or cyclic form by the use of known methods. As described in the present description, the variant can have at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity with the NtMRP4 polypeptide sequence.

El término “aislado” se refiere a cualquier entidad que se toma de su ambiente natural, pero el término no implica ningún grado de purificación.The term "isolated" refers to any entity that is taken from its natural environment, but the term does not imply any degree of purification.

“Secuencia génica” se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de polinucleótido o polinucleótido que codifica un polipéptido o un ARN activo biológicamente, y abarca la secuencia de nucleótidos de una secuencia codificante parcial que solo codifica un fragmento de una proteína."Gene sequence" refers to the nucleotide sequence of a polynucleotide or polynucleotide molecule that encodes a biologically active polypeptide or RNA, and encompasses the nucleotide sequence of a partial coding sequence that only encodes a fragment of a protein.

El término “vector” se refiere a un vehículo de polinucleótidos que comprende una combinación de componentes de polinucleótidos para permitir el transporte de polinucleótidos, constructos de polinucleótidos y conjugados de polinucleótidos y similares. Los vectores adecuados incluyen episomas capaces de replicación extracromosómica tales como plásmidos de polinucleótidos circulares bicatenarios; plásmidos de polinucleótidos lineales bicatenarios; y otros vectores de cualquier origen.The term "vector" refers to a polynucleotide carrier that comprises a combination of polynucleotide components to allow the transport of polynucleotides, polynucleotide constructs, and polynucleotide conjugates and the like. Suitable vectors include episomes capable of extrachromosomal replication such as circular double-stranded polynucleotide plasmids; linear double-stranded polynucleotide plasmids; and other vectors of any origin.

"Vector de expresión" se refiere a un vehículo de polinucleótidos que comprende una combinación de componentes de polinucleótidos para permitir la expresión de polinucleótidos, constructos de polinucleótidos y conjugados de polinucleótidos y similares. Los vectores de expresión adecuados incluyen episomas capaces de replicación extracromosómica tales como plásmidos de polinucleótidos circulares bicatenarios; plásmidos de polinucleótidos lineales bicatenarios; y otros vectores de expresión equivalentes funcionalmente de cualquier origen. Un vector de expresión comprende al menos un promotor ubicado aguas arriba y unido operativamente a un polinucleótido, constructos de polinucleótidos o conjugado de polinucleótidos, como se define más abajo."Expression vector" refers to a polynucleotide carrier that comprises a combination of polynucleotide components to allow the expression of polynucleotides, polynucleotide constructs, and polynucleotide conjugates and the like. Suitable expression vectors include episomes capable of extrachromosomal replication such as circular double-stranded polynucleotide plasmids; linear double-stranded polynucleotide plasmids; and other functionally equivalent expression vectors of any origin. An expression vector comprises at least one promoter located upstream and operably linked to a polynucleotide, polynucleotide constructs or polynucleotide conjugate, as defined below.

Un “constructo” se refiere a un fragmento de polinucleótido recombinante bicatenario que comprende uno o más polinucleótidos NtMRP. El constructo comprende una “cadena molde” con apareamiento de bases con una “cadena codificante o sentido” complementaria. Un constructo dado puede insertarse en un vector en dos orientaciones posibles, ya sea en la misma orientación (o sentido) o en la orientación inversa (o antisentido) con respecto a la orientación de un promotor ubicado dentro de un vector - tal como un vector de expresión.A "construct" refers to a double-stranded recombinant polynucleotide fragment comprising one or more NtMRP polynucleotides. The construct comprises a "template chain" with base pairing with a complementary "coding or sense" chain. A given construct can be inserted into a vector in two possible orientations, either in the same orientation (or sense) or in the inverse orientation (or antisense) with respect to the orientation of a promoter located within a vector - such as a vector expression.

El término “conjugado” se refiere a un compuesto formado por la unión covalente ("conjugación") de un polinucleótido a uno o más restos que no son en sí mismos polinucleótidos o monómeros ("restos conjugados"). “Cadena molde” se refiere a la cadena que comprende una secuencia que complementa la de la "cadena de sentido o codificación" de un dúplex de polinucleótidos, tal como un fragmento genómico de NtMRP, ADNc de NtMRP o un constructo de NtMRP, o cualquier fragmento de polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que puede transcribirse por la a Rn polimerasa. Durante la transcripción, la ARN polimerasa puede translocarse a lo largo de la cadena molde en la dirección de 3' a 5' durante la síntesis del ARN naciente.The term "conjugate" refers to a compound formed by the covalent attachment ("conjugation") of a polynucleotide to one or more moieties that are not themselves polynucleotides or monomers ("conjugated moieties"). "Mold chain" refers to the chain comprising a sequence that complements that of the "sense or coding chain" of a polynucleotide duplex, such as a genomic fragment of NtMRP, NtMRP cDNA or an NtMRP construct, or any polynucleotide fragment comprising a polynucleotide sequence that can be transcribed by the Rn polymerase. During transcription, RNA polymerase can be translocated along the template chain in the 3 'to 5' direction during the synthesis of nascent RNA.

“Cadena sentido” se usa de forma intercambiable en la presente descripción con el término "cadena de codificación", y se refiere a la cadena que comprende una secuencia que complementa a la de la cadena molde en un dúplex de ADN. Por ejemplo, la secuencia de la cadena sentido ("secuencia sentido") para el clon genómico de NtMRP identificado se designa como sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: Por ejemplo, si la cadena sentido comprende una secuencia hipotética 5'-TAATCCGGT-3', entonces la secuencia correspondiente sustancialmente idéntica dentro de un ARNm objetivo hipotético es 5'-UAAUCCGGU-3'."Sense chain" is used interchangeably in the present description with the term "coding strand", and refers to the strand comprising a sequence that complements that of the template strand in a DNA duplex. For example, the sequence of the sense strand ("sense sequence") for the identified NtMRP genomic clone is designated as sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: For example, if the sense strand comprises a hypothetical 5'-TAATCCGGT-3 'sequence, then the corresponding substantially identical sequence within a hypothetical target mRNA is 5'-UAAUCCGGU-3'.

"Secuencia complementaria inversa" se refiere a la secuencia que complementa la "secuencia sentido" de interés (por ejemplo, secuencia del exón) ubicada dentro de la misma cadena, en la misma orientación con respecto a la secuencia sentido. Por ejemplo, si una cadena comprende una secuencia hipotética 5'-TAATCCGGT-3', entonces la secuencia complementaria inversa 5'-ACCGGATTA-3' puede unirse operativamente a la secuencia sentido, separada por una secuencia espaciadora."Complementary complementary sequence" refers to the sequence that complements the "sense sequence" of interest (eg, exon sequence) located within the same chain, in the same orientation with respect to the sense sequence. For example, if a string comprises a hypothetical sequence 5'-TAATCCGGT-3 ', then the Reverse complementary sequence 5'-ACCGGATTA-3 'can be operatively linked to the sense sequence, separated by a spacer sequence.

“NtMRP”, “NtMRP3” o “transcrito de ARN de NtMRP4” incluye moléculas de polirribopolinucleótidos producidas dentro de una célula vegetal huésped de interés, que resultan de la transcripción del gen NtMRP3 o NtMRP4 endógeno o ADNc como se describe en la presente descripción. Por lo tanto, este término incluye cualquier especie de ARN o variantes de ARN producidas como productos transcripcionales de NtMRP3 o NtMRP4 o ARN de NtMRP3 o NtMRP4, lo que incluye aquellas especies de ARN o variantes de ARN que tienen similitud suficiente a niveles estructurales/funcionales. Por ejemplo, los transcritos de ARN de NtMRP3 o NtMRP3 incluyen, pero no se limitan a: (1) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción del gen o ADNc NtMRP3 o NtMRP3 aislado; (2) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de cualesquiera genes que tengan al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 % , 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP3 aislado (es decir, otros genes distintos sustancialmente idénticos al gen NtMRP3 identificado y que codifican isoformas relacionadas de transportadores ABC); y (3) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de alelos del gen NtMRP3. Los transcritos de ARN de NtMRP3 incluyen variantes de ARN producidas como resultado de reacciones alternativas de corte y empalme de ARN heteronucleares ("ARNhn") de un gen particular, variantes de ARNm que resultan de tales reacciones alternativas de corte y empalme del ARN, y cualquier variante intermedia de ARN."NtMRP", "NtMRP3" or "NtMRP4 RNA transcript" includes polyribopolinucleotide molecules produced within a host plant cell of interest, which result from the transcription of the endogenous NtMRP3 or NtMRP4 gene or cDNA as described in the present disclosure. Therefore, this term includes any species of RNA or RNA variants produced as transcriptional products of NtMRP3 or NtMRP4 or RNA of NtMRP3 or NtMRP4, which includes those RNA species or RNA variants that have sufficient similarity at structural / functional levels . For example, RNA transcripts of NtMRP3 or NtMRP3 include, but are not limited to: (1) pre-mRNA and mRNA produced from transcription of the isolated NtMRP3 or NtMRP3 gene or cDNA; (2) pre-mRNA and mRNA produced from the transcription of any genes having at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% , 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence of the isolated NtMRP3 gene (i.e., other distinct genes substantially identical to the identified NtMRP3 gene and encoding related isoforms of ABC transporters); and (3) pre-mRNA and mRNA produced from the transcription of alleles of the NtMRP3 gene. NtMRP3 RNA transcripts include RNA variants produced as a result of alternative RNA splicing reactions ("ARNhn") of a particular gene, mRNA variants resulting from such alternative RNA splicing reactions, and any intermediate variant of RNA.

A modo de ejemplo adicional, las transcripciones de ARN de NtMRP4 o NtMRP4 incluyen: (1) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción del gen o ADNc de NtMRP4 o NtMRP4 aislado, como se describe en la presente descripción; (2) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de cualesquiera genes que tengan al menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % o más, identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP4 aislado (es decir, otros genes distintos sustancialmente idénticos al gen NtMRP4 identificado y que codifican isoformas relacionadas de transportadores ABC); y (3) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de alelos del gen NtMRP o NtMRP4. Los transcritos de ARN de NtMRP y NtMRP4 incluyen variantes de ARN producidas como resultado de reacciones de corte y empalme de ARN alternativas de ARN heteronucleares ("ARNhn") de un gen particular, variantes de ARNm resultantes de tales reacciones de corte y empalme de ARN alternativas y cualquier variante de ARN intermedia.By way of further example, RNA transcripts of NtMRP4 or NtMRP4 include: (1) pre-mRNA and mRNA produced from the transcription of the isolated NtMRP4 or NtMRP4 gene or cDNA, as described in the present disclosure; (2) pre-mRNA and mRNA produced from the transcription of any genes having at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% , 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% or more, identity of sequence with the sequence of the isolated NtMRP4 gene (i.e., other distinct genes substantially identical to the identified NtMRP4 gene and encoding related isoforms of ABC transporters); and (3) pre-mRNA and mRNA produced from the transcription of alleles of the NtMRP or NtMRP4 gene. RNA transcripts of NtMRP and NtMRP4 include RNA variants produced as a result of alternative RNA splicing reactions of heteronuclear RNA ("ARNhn") of a particular gene, mRNA variants resulting from such RNA splicing reactions alternatives and any intermediate RNA variant.

"Homología, identidad o similitud" se refiere al grado de similitud de secuencias entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de polinucleótidos comparadas mediante alineación de secuencias. El grado de homología entre dos secuencias de polinucleótidos discretas que se comparan es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes, en posiciones comparables. El grado de similitud expresado en términos de porcentaje de identidad puede determinarse mediante inspección visual y cálculo matemático. Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótidos puede determinarse mediante la comparación de la información de la secuencia mediante el uso del programa de computadora GAP, versión 6.0 descrito por Devereux y otros (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y disponible del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin (Uw Gc G), ClustalW, BLAST, FASTA o Smith-Waterman. Los parámetros predeterminados típicos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) para los nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res."Homology, identity or similarity" refers to the degree of sequence similarity between two polypeptides or between two polynucleotide molecules compared by sequence alignment. The degree of homology between two discrete polynucleotide sequences that are compared is a function of the number of identical or coincident nucleotides, at comparable positions. The degree of similarity expressed in terms of percent identity can be determined by visual inspection and mathematical calculation. Alternatively, the percent identity of two polynucleotide sequences can be determined by comparing the sequence information by using the GAP computer program, version 6.0 described by Devereux et al. ( Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) and available from the Genetics Computer Group of the University of Wisconsin (U w G c G), ClustalW, BLAST, FASTA or Smith-Waterman. Typical default parameters for the GAP program include: (1) a unit comparison matrix (containing a value of 1 for identities and 0 for non-identities) for nucleotides, and the weighted comparison matrix of Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res .

14: 6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para los huecos en los extremos. Pueden usarse alternativamente diversos programas conocidos por los expertos en la técnica de comparación de secuencias.14: 6745, 1986, as described by Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, p. 353-358, 1979; (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each symbol in each gap; and (3) without penalty for the holes at the ends. Various programs known to those skilled in the art of sequence comparison can alternatively be used.

El término “aguas arriba” se refiere a una dirección/posición relativa con respecto a un elemento de referencia a lo largo de una secuencia de polinucleótido lineal, que indica una dirección/posición hacia el extremo 5' de la secuencia de polinucleótido. “Aguas arriba” puede usarse indistintamente con el "extremo 5' de un elemento de referencia". The term "upstream" refers to a relative direction / position with respect to a reference element along a linear polynucleotide sequence, indicating a direction / position towards the 5 'end of the polynucleotide sequence. "Upstream" can be used interchangeably with the "5 'end of a reference element".

“Unido operativamente” se refiere a la unión de distintos elementos, fragmentos o secuencias de polinucleótidos para producir una unidad de transcripción funcional o un vector de expresión funcional."Operably linked" refers to the joining of different elements, fragments or polynucleotide sequences to produce a functional transcription unit or a functional expression vector.

Un “promotor” se refiere a un elemento/secuencia de polinucleótido, ubicado típicamente aguas arriba y unido operativamente a un fragmento de ADN bicatenario - tal como un constructo de ARNi de NtMRP. Por ejemplo, un promotor adecuado permite la activación transcripcional de un constructo de ARNi de NtMRP mediante el reclutamiento del complejo de transcripción, lo que incluye la ARN polimerasa y diversos factores, para iniciar la síntesis de ARN. Los promotores pueden derivarse totalmente de regiones próximas a un gen de interés nativo, o pueden componerse de elementos diferentes derivados de promotores nativos diferentes o segmentos de ADN sintéticos.A "promoter" refers to a polynucleotide element / sequence, typically located upstream and operably linked to a double-stranded DNA fragment - such as an NtMRP RNAi construct. For example, a suitable promoter allows the transcriptional activation of an NtMRP RNAi construct by the recruitment of the transcription complex, which includes the RNA polymerase and various factors, to initiate RNA synthesis. The promoters can be derived entirely from regions close to a gene of native interest, or they can be composed of different elements derived from different native promoters or synthetic DNA segments.

Un “potenciador” se refiere a una molécula de polinucleótido, o una secuencia de polinucleótidos, que puede reclutar proteínas reguladoras de la transcripción tales como activadores transcripcionales, para potenciar la activación transcripcional mediante el aumento de la actividad del promotor. Los potenciadores adecuados pueden derivarse de regiones próximas a un promotor de interés nativo (fuentes homologas) o pueden derivarse de contextos no nativos (fuentes heterólogas) y unirse operativamente a cualquier promotor de interés dentro de los constructos de NtMRP -tales como los vectores de expresión de ARNi - para potenciar la actividad o la especificidad de tejido de un promotor. Algunos potenciadores pueden funcionar en cualquier orientación con respecto a la orientación de una unidad de transcripción. Por ejemplo, los potenciadores pueden ubicarse aguas arriba o aguas abajo de una unidad transcripcional que comprende un promotor y un constructo de NtMRP.An "enhancer" refers to a polynucleotide molecule, or a polynucleotide sequence, which can recruit transcriptional regulatory proteins such as transcriptional activators, to enhance transcriptional activation by increasing the activity of the promoter. Suitable enhancers can be derived from regions close to a promoter of native interest (homologous sources) or can be derived from non-native contexts (heterologous sources) and operatively linked to any promoter of interest within the NtMRP constructs-such as the RNAi expression vectors-to enhance activity or tissue specificity of a promoter. Some enhancers can operate in any orientation with respect to the orientation of a transcription unit. For example, enhancers can be located upstream or downstream of a transcriptional unit comprising a promoter and an NtMRP construct.

Como se usa en la presente descripción, el término “planta” se refiere a cualquier planta en cualquier etapa de su ciclo de vida o desarrollo, y a sus progenies. En una modalidad, la planta es una “planta de tabaco”, la cual se refiere a una planta que pertenece al género Nicotiana. Las especies, cultivares, híbridos y variedades de la planta de tabaco se describen en la presente descripción.As used in the present description, the term "plant" refers to any plant at any stage of its life cycle or development, and to its progenies. In one embodiment, the plant is a "tobacco plant", which refers to a plant belonging to the genus Nicotiana. The species, cultivars, hybrids and varieties of the tobacco plant are described in the present description.

El término “célula vegetal” se refiere a una unidad estructural y fisiológica de una planta. La célula vegetal puede estar en la forma de un protoplasto sin una pared celular, una sola célula aislada o una célula en cultivo, o como una parte de una unidad más organizada, tal como pero sin limitarse a, un tejido vegetal, un órgano de una planta, o una planta completa.The term "plant cell" refers to a structural and physiological unit of a plant. The plant cell may be in the form of a protoplast without a cell wall, a single isolated cell or a cell in culture, or as a part of a more organized unit, such as but not limited to, a plant tissue, an organ of a plant, or a complete plant.

"Material vegetal" se refiere a cualquier composición sólida, líquida o gaseosa, o sus combinaciones, obtenible a partir de una planta, lo que incluye biomasa, hojas, lámina foliar, nervadura, tallos, raíces, flores o partes de una flor, frutos, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, secreciones, extractos, cultivos de células o tejidos, o cualquiera de otras partes o productos de una planta. En una modalidad, el material vegetal comprende o consiste en biomasa, semilla u hojas. En otra modalidad, el material vegetal comprende o consiste en las hojas."Plant material" refers to any solid, liquid or gaseous composition, or combinations thereof, obtainable from a plant, which includes biomass, leaves, leaf blade, rib, stems, roots, flowers or parts of a flower, fruits , pollen, ovules, zygotes, seeds, cuttings, secretions, extracts, cell or tissue cultures, or any other parts or products of a plant. In one embodiment, the plant material comprises or consists of biomass, seed or leaves. In another embodiment, the plant material comprises or consists of the leaves.

El término "variedad" se refiere a una población de plantas que comparten características constantes que las separan de otras plantas de la misma especie. A la vez que poseen uno o más rasgos distintivos, una variedad se caracteriza además por una variación global muy pequeña entre los individuos dentro de esa variedad. Frecuentemente una variedad se vende comercialmente.The term "variety" refers to a population of plants that share constant characteristics that separate them from other plants of the same species. While possessing one or more distinctive features, a variety is further characterized by a very small overall variation among individuals within that variety. Frequently a variety is sold commercially.

El término "línea" o “línea de mejoramiento” denota un grupo de plantas que se usan durante el mejoramiento de plantas. Una línea es distinguible de una variedad cuando exhibe poca variación entre los individuos para uno o más rasgos de interés, aunque puede existir cierta variación entre individuos para otros rasgos.The term "line" or "line of improvement" denotes a group of plants that are used during plant breeding. A line is distinguishable from a variety when it exhibits little variation between individuals for one or more traits of interest, although there may be some variation between individuals for other traits.

El término “reducir” o “reducido”, se refiere a una reducción de aproximadamente 10 % a aproximadamente 99 %, o una reducción de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o al menos 100 %, 200 % o 300 % o más de una cantidad o una actividad, tal como, pero sin limitarse a, la actividad de un polipéptido, la actividad transcripcional y/o la expresión de proteínas.The term "reduce" or "reduced" refers to a reduction from about 10% to about 99%, or a reduction of at least 10%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or at less 100%, 200% or 300% or more of an amount or an activity, such as, but not limited to, the activity of a polypeptide, transcriptional activity and / or protein expression.

El término “inhibir” o “inhibido” como se usa en la presente descripción, se refiere a una reducción de aproximadamente 98 % a aproximadamente 100 %, o una reducción de al menos 98 %, al menos 99 %, pero particularmente de 100 %, de una cantidad o una actividad, tal como, pero sin limitarse a, la actividad de un polipéptido, la actividad transcripcional y/o la expresión de proteínas.The term "inhibit" or "inhibited" as used in the present disclosure, refers to a reduction of from about 98% to about 100%, or a reduction of at least 98%, at least 99%, but particularly from 100% , of a quantity or an activity, such as, but not limited to, the activity of a polypeptide, transcriptional activity and / or protein expression.

El término “aumentar” o “aumentado”, se refiere a un aumento de aproximadamente 10 % a aproximadamente 99 %, o un aumento de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o al menos 100 %, 200 % o 300 % o más de una cantidad o una actividad, tal como, pero sin limitarse a, la actividad de un polipéptido, la actividad transcripcional y/o la expresión de proteínas.The term "increase" or "increased" refers to an increase from approximately 10% to approximately 99%, or an increase of at least 10%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or at less 100%, 200% or 300% or more of an amount or an activity, such as, but not limited to, the activity of a polypeptide, transcriptional activity and / or protein expression.

El término "control" en el contexto de una planta control o células vegetales control significa una planta o células vegetales en las cuales la expresión o actividad de un gen o proteína en particular - tal como NtMRP - no se ha modificado (por ejemplo, aumentado o reducido) por lo que puede proporcionar una comparación con una planta en donde la expresión o actividad de un gen o proteína en particular - tal como NtMRP - se ha modificado. La planta control puede comprender un vector vacío. La planta control puede corresponder a una planta de tipo silvestre. Descripción detalladaThe term "control" in the context of a control plant or control plant cells means a plant or plant cells in which the expression or activity of a particular gene or protein - such as NtMRP - has not been modified (eg, increased or reduced) so it can provide a comparison with a plant in which the expression or activity of a particular gene or protein - such as NtMRP - has been modified. The control plant may comprise an empty vector. The control plant may correspond to a wild-type plant. Detailed description

Los polinucleótidos y polipéptidos NtMRP se describen en la presente descripción, lo que incluye polinucleótidos y polipéptidos NtMRP3 y NtMRP4. Como se muestra en la Figura 6, el clon genómico NtMRP3, designado como sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 comprende: intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 30), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 31), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 32), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 33), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 34), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 35), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 36), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 37), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 38), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 39), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 40), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 41), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 42) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 43), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 44), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 45) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 46) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 47), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 48) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 49) y exón 11 (sec. con núm. de ident.: 50).The NtMRP polynucleotides and polypeptides are described in the present disclosure, including NtMRP3 and NtMRP4 polynucleotides and polypeptides. As shown in Figure 6, the genomic clone NtMRP3, designated as sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident .: 29 comprises: intron 1 (sec. with ident. no .: 30), intron 2 (sec. with ident. no .: 31), intron 3 (sec. with ident. no .: 32) ), intron 4 (sec. with ID: 33), intron 5 (sec. with ident. no .: 34), intron 6 (sec. with ident. no .: 35), intron 7 ( sec with ID: 36), intron 8 (sec. with ID: 37), intron 9 (sec. with ID: 38), intron 10 (sec. Ident .: 39), exon 1 (sec. with ID: 40), exon 2 (sec. with ID: 41), exon 3 (sec. with ID: 42) exon 4 (sec. no. Ident .: 43), exon 5 (sec. with ident. no .: 44), exon 6 (sec. with ident. no .: 45) exon 7 (sec. with ident. no .: 46) exon 8 (sec. with ID: 47), exon 9 (sec. with ID: 48) exon 10 (sec. with ID: 49) and exon 11 (sec. Ident. no .: 50).

Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que representan fragmentos genómicos aislados en el locus NtMRP3, que comprende sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29, o variantes de estas.Various embodiments are directed to isolated polynucleotides representing isolated genomic fragments at the NtMRP3 locus, comprising sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident .: 29, fragments of sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident .: 29, or variants of these.

Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que representan secuencias de ADNc del locus NtMRP3, que comprende sec. con núm. de ident.: 51, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 51, o variantes de estas.Various embodiments are directed to isolated polynucleotides representing cDNA sequences of the NtMRP3 locus, comprising sec. with no. Ident .: 51, fragments of sec. with no. Ident .: 51, or variants of these.

Diversas modalidades se dirigen a variantes aisladas de polinucleótidos NtMRP que comprenden al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29, o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29.Various modalities are directed to isolated variants of NtMRP polynucleotides comprising at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% sequence identity with sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident .: 29, or fragments of sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29

Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que complementan las variantes de polinucleótidos NtMRP que comprenden al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51.Various embodiments are directed to isolated polynucleotides that complement the NtMRP polynucleotide variants comprising at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% , 98%, and 99% sequence identity with sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51 or fragments of sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident. 51

Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que pueden hibridar específicamente, en condiciones moderadas a altamente rigurosas, con polinucleótidos que comprenden sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51, o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 0 sec. con núm. de ident.: 51.Various embodiments are directed to isolated polynucleotides that can hybridize specifically, under moderate to highly stringent conditions, with polynucleotides comprising sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51, or fragments of sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 0 sec. with no. Ident. 51

Como se muestra en la Figura 1, el clon genómico NtMRP4, designado como sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 comprende: intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 3), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 4), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 5), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 6), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 7), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 8), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 9), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 10), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 11), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 12), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 13), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 14), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 15) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 16), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 17), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 18) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 19) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 20), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 21) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 21) y exón 11 (sec. con núm. de ident.: 22) o sec. con núm. de ident.: 23.As shown in Figure 1, the genomic clone NtMRP4, designated as sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 comprises: intron 1 (sec. with ident. no .: 3), intron 2 (sec. with ident. no .: 4), intron 3 (sec. with ident. no .: 5) ), intron 4 (sec. with ident. no .: 6), intron 5 (sec. with ident. no .: 7), intron 6 (sec. with ident. no .: 8), intron 7 ( sec. with ID No. 9), intron 8 (sec. with ID No. 10), intron 9 (sec. with ID No. 11), intron 10 (sec. Ident .: 12), exon 1 (sec. with ID: 13), exon 2 (sec. with ID: 14), exon 3 (sec. with ID: 15) ) exon 4 (sec. with ident. no .: 16), exon 5 (sec. with ident. no .: 17), exon 6 (sec. with ident. no .: 18) exon 7 (sec. with identification number: 19) exon 8 (sec. with ident. no .: 20), exon 9 (sec. with ident. no .: 21) exon 10 (sec. with ident. no .: 21) and exon 11 (sec. With ident. No .: 22) or sec. with no. Ident. 23

Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que representan fragmentos genómicos aislados en el locus NtMRP4, que comprende sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2, o variantes de estas.Various embodiments are directed to isolated polynucleotides representing isolated genomic fragments at the NtMRP4 locus, comprising sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2, fragments of sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2, or variants of these.

Varias modalidades se refieren a ADNc aislado que comprende sec. con núm. de ident.: 27, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 27, o variantes de estas.Various embodiments refer to isolated cDNA comprising sec. with no. Ident .: 27, fragments of sec. with no. Ident .: 27, or variants of these.

Diversas modalidades se dirigen a variantes aisladas de polinucleótidos NtMRP que comprenden al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.. 27, o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27.Various modalities are directed to isolated variants of NtMRP polynucleotides comprising at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% sequence identity with sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident. 27, or fragments of sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident. 27

Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que complementan variantes de polinucleótidos NtMRP que comprenden al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27.Various embodiments are directed to isolated polynucleotides that complement variants of NtMRP polynucleotides comprising at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, and 99% sequence identity with sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident .: 27 or fragments of sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident. 27

Diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que pueden hibridar específicamente, en condiciones moderadas a altamente rigurosas, con polinucleótidos que comprenden sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27, o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27.Various embodiments are directed to isolated polynucleotides that can hybridize specifically, under moderate to highly stringent conditions, with polynucleotides comprising sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident .: 27, or fragments of sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident. 27

Un polinucleótido como se describe en la presente descripción generalmente contendrá enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos se incluyen análogos de polinucleótidos que pueden tener cadenas principales alternas, que comprenden, por ejemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, o enlaces O-metilfosforoamidita; y cadenas principales y enlaces de polinucleótidos peptídicos. Otros polinucleótidos análogos incluyen los que tienen cadenas principales positivas; cadenas principales no iónicas, y cadenas principales sin ribosa. Las modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato pueden realizarse por una variedad de razones, por ejemplo, para aumentar la estabilidad y el tiempo de vida media de tales moléculas en ambientes fisiológicos o como sondas en un biochip. Pueden obtenerse mezclas de polinucleótidos y análogos de origen natural; alternativamente, pueden obtenerse mezclas de diferentes análogos de polinucleótidos, y mezclas de polinucleótidos y análogos de origen natural. A polynucleotide as described in the present disclosure will generally contain phosphodiester linkages, although in some cases polynucleotide analogs may be included which may have alternating backbones, comprising, for example, phosphoramidate, phosphorothioate, phosphorodithioate, or O-methylphosphoramidite bonds; and peptide polynucleotide backbones and backbones. Other analogous polynucleotides include those having positive backbones; nonionic main chains, and main chains without ribose. Modifications of the ribose-phosphate backbone can be made for a variety of reasons, for example, to increase the stability and the half-life of such molecules in physiological environments or as probes in a biochip. Mixtures of polynucleotides and analogues of natural origin can be obtained; alternatively, mixtures of different polynucleotide analogs, and mixtures of polynucleotides and analogs of natural origin can be obtained.

Se conoce una diversidad de análogos de polinucleótidos, lo que incluye, por ejemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, enlaces O-metilfosforoamidita y cadenas principales y enlaces de polinucleótidos peptídicos. Otros polinucleótidos análogos incluyen aquellos con cadenas principales positivas, cadenas principales no iónicas y cadenas principales sin ribosa. Se incluyen además polinucleótidos que contienen uno o más azúcares carboxílicos. A variety of polynucleotide analogs are known, including, for example, phosphoramidate, phosphorothioate, phosphorodithioate, O-methylphosphoramidite linkages, and peptide polynucleotide backbones and backbones. Other analogous polynucleotides include those with positive backbones, non-ionic backbones and ribose-free backbones. Polynucleotides containing one or more carboxylic sugars are also included.

Otros análogos incluyen polinucleótidos peptídicos (PNA) que son análogos de polinucleótidos peptídicos. Estas cadenas principales son esencialmente no iónicas en condiciones neutras, a diferencia de la cadena principal de fosfodiéster altamente cargada de los polinucleótidos de origen natural. Esto puede resultar en ventajas. En primer lugar, la cadena principal de PNA puede mostrar una mejor cinética de hibridación. Los PNA tienen cambios más grandes en la temperatura de fusión (Tm) para los pares de bases con error de apareamiento frente a los apareados perfectamente. El ADN y el ARN muestran típicamente una caída de 2-4 °C en la Tm durante un error de apareamiento interno. Con la cadena principal de PNA no iónica, la caída es cercana a 7-9 °C. Similarmente, debido a su naturaleza no iónica, la hibridación de las bases unidas a estas cadenas principales es relativamente insensible a la concentración de sales. Adicionalmente, los PNA no deben degradarse o se degradan en una menor extensión por las enzimas celulares, y por lo tanto pueden ser más estables.Other analogs include peptide polynucleotides (PNA) which are peptide polynucleotide analogues. These main chains are essentially non-ionic under neutral conditions, unlike the highly charged phosphodiester backbone of the naturally occurring polynucleotides. This can result in advantages. First, the PNA backbone can show better hybridization kinetics. PNAs have larger changes in melting temperature (Tm) for base pairs with mating error compared to perfectly matched pairs. DNA and RNA typically show a 2-4 ° C drop in Tm during an internal mating error. With the main non-ionic PNA chain, the drop is close to 7-9 ° C. Similarly, due to its non-ionic nature, the hybridization of the bases bound to these main chains is relatively insensitive to the concentration of salts. Additionally, PNAs should not be degraded or degraded to a lesser extent by cellular enzymes, and therefore may be more stable.

Entre los usos de los polinucleótidos NtMRP descritos, y combinaciones de fragmentos de estos, está el uso de fragmentos como sondas en ensayos de hibridación de polinucleótidos o cebadores para su uso en ensayos de amplificación de polinucleótidos o el uso de fragmentos en el desarrollo de diversos constructos de polinucleótidos -tales como moléculas de ARNi. Dichos fragmentos comprenden generalmente al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras modalidades, un fragmento de ADN comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 60 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. Por lo tanto, en un aspecto adicional, se proporciona, además, un método para detectar polinucleótidos NtMRP que comprende el uso de las sondas y/o los cebadores descritos en la presente descripción. Among the uses of the described NtMRP polynucleotides, and combinations of fragments thereof, is the use of fragments as probes in hybridization assays of polynucleotides or primers for use in polynucleotide amplification assays or the use of fragments in the development of various polynucleotide constructs - such as RNAi molecules. Such fragments generally comprise at least about 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 or more contiguous nucleotides of a DNA sequence. In other embodiments, a DNA fragment comprises at least about 10, 15, 20, 30, 40, 50 or 60 or more contiguous nucleotides of a DNA sequence. Therefore, in a further aspect, there is further provided a method for detecting NtMRP polynucleotides comprising the use of the probes and / or primers described in the present disclosure.

Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y la guía para proyectar las condiciones adecuadas se describen por Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Mediante el uso del conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, pueden prepararse conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Dichos oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), de manera que los fragmentos de polinucleótidos se aíslan y se amplifican. En ciertas modalidades, pueden usarse cebadores degenerados como sondas para las genotecas no humanas. Dichas genotecas incluirían, pero no se limitan a, genotecas de ADNc, genotecas genómicas, e incluso genotecas de ADN o EST (etiquetas de secuencias de expresión) electrónicas. Las secuencias homólogas identificadas por este método podrían usarse después como sondas para identificar homólogos no humanos de la secuencia de NtMRP identificada en la presente descripción.The basic parameters that affect the choice of hybridization conditions and the guidance for projecting suitable conditions are described by Sambrook, J., EF Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY). By using the knowledge of the genetic code in combination with the amino acid sequences described above, sets of degenerate oligonucleotides can be prepared. Said oligonucleotides are useful as primers, for example, in polymerase chain reactions (PCR), so that the polynucleotide fragments are isolated and amplified. In certain embodiments, degenerate primers can be used as probes for non-human libraries. Such libraries would include, but are not limited to, cDNA libraries, genomic libraries, and even DNA or EST libraries (electronic expression sequence tags). The homologous sequences identified by this method could then be used as probes to identify non-human homologs of the NtMRP sequence identified in the present disclosure.

Además, son de uso potencial los polinucleótidos y oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores o sondas) que hibridan en condiciones de rigurosidad reducidas, típicamente condiciones moderadamente rigurosas, y comúnmente condiciones altamente rigurosas para el(los) polinucleótido(s) de NtMRP como se describe en la presente descripción. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y la guía para idear condiciones adecuadas se describen en Sambrook, J., E. F. Fritsch y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica basándose, por ejemplo, en la longitud o composición de bases del polinucleótido.In addition, polynucleotides and oligonucleotides (e.g., primers or probes) that hybridize under stringent stringency conditions, typically moderately stringent conditions, and commonly highly stringent conditions for the NtMRP polynucleotide (s) are of potential use as described. in the present description. The basic parameters that affect the choice of hybridization conditions and the guidance for devising appropriate conditions are described in Sambrook, J., EF Fritsch and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) and can be readily determined by those skilled in the art based, for example, on the length or base composition of the polynucleotide.

Una manera de lograr condiciones moderadamente rigurosas implica el uso de una solución de prelavado que contiene Citrato de sodio estándar 5x, Dodecil sulfato de sodio al 0,5 %, ácido etilendiaminotetraacético 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de formamida aproximadamente al 50 %, Citrato de sodio estándar 6x, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 55 °C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como una que contiene formamida aproximadamente al 50 %, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42 °C), y condiciones de lavado de aproximadamente 60 °C, en Citrato de sodio estándar 0,5x, Dodecil sulfato de sodio al 0,1 %. Generalmente, las condiciones altamente rigurosas se definen como las condiciones de hibridación anteriores, pero con lavado a aproximadamente 68 °C, Citrato de sodio estándar 0,2x, Dodecil sulfato de sodio al 0,1 %. SSPE (SSPE 1x es cloruro de sodio 0,15 M, fosfato de sodio 10 mM, y ácido etilendiaminotetraacético 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituirse por Citrato de sodio estándar (Citrato de sodio estándar 1x es cloruro de sodio 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después que se completa la hibridación. Debe entenderse que la temperatura del lavado y la concentración de sales del lavado pueden ajustarse según sea necesario para alcanzar un grado de rigurosidad deseado mediante la aplicación de los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y la estabilidad de dúplex, como se conoce por los expertos en la técnica y se describe con más detalle más abajo (ver, por ejemplo, Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Cuando un polinucleótido hibrida con un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, se asume que la longitud del híbrido es la del polinucleótido con que hibrida. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse mediante la alineación de las secuencias de los polinucleótidos y la identificación de la región o regiones de complementariedad de secuencias óptima. La temperatura de hibridación para los híbridos que se anticipa que sean menores que 50 pares de bases de longitud debe ser de 5 a 10 °C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde la Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores de 18 pares de bases de longitud, la Tm (°C)=2(número de bases A+T)+4(número de bases G+C). Para híbridos por encima de 18 pares de bases de longitud, la Tm (°C)=81,5+16,6(log10 [Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na+] para el Citrato de sodio estándar 1x=0,165 M). Típicamente, cada polinucleótido que hibrida tiene una longitud que es al menos 25 % (comúnmente al menos 50 %, 60 %, o 70 %, y más comúnmente al menos 80 %) de la longitud de un polinucleótido con el cual hibrida, y tiene al menos 60 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, o al menos 99 %) con un polinucleótido con el cual hibrida.One way to achieve moderately stringent conditions involves the use of a prewash solution containing standard 5x sodium citrate, 0.5% sodium dodecyl sulfate, 1.0 mM ethylenediaminetetraacetic acid (pH 8.0), hybridization buffer approximately 50% formamide, 6x standard sodium citrate, and a hybridization temperature of about 55 ° C (or other similar hybridization solutions, such as one containing about 50% formamide, with an annealing temperature of about 42 °) C), and wash conditions of approximately 60 ° C, in 0.5x standard sodium citrate, 0.1% sodium dodecyl sulfate. Generally, highly stringent conditions are defined as the above hybridization conditions, but with washing at about 68 ° C, standard 0.2x sodium citrate, 0.1% sodium dodecyl sulfate. SSPE (SSPE 1x is 0.15 M sodium chloride, 10 mM sodium phosphate, and 1.25 mM ethylenediaminetetraacetic acid, pH 7.4) can be replaced by standard sodium citrate (standard sodium citrate 1x is sodium chloride 0 , 15 M and 15 mM sodium citrate) in the hybridization and washing buffers; the washes are performed for 15 minutes after the hybridization is complete. It is to be understood that the washing temperature and the concentration of washing salts can be adjusted as necessary to achieve a desired degree of stringency by applying the basic principles governing the hybridization reactions and the duplex stability, as is known from the skilled in the art and is described in more detail below (see, for example, Sambrook, J., EF Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) When a polynucleotide hybridizes to a target polynucleotide of unknown sequence, it is assumed that the length of the hybrid is that of the polynucleotide with which it hybridizes.When polynucleotides of known sequence are hybridized, the length of the hybrid can be determined by aligning the sequences of the polynucleotides and the identification of the region or regions of optimal sequence complementarity. Hybridization temperature for hybrids that are anticipated to be less than 50 base pairs in length should be 5 to 10 ° C lower than the melting temperature (Tm) of the hybrid, where the Tm is determined in accordance with the following equations . For hybrids less than 18 base pairs in length, the Tm (° C) = 2 (number of bases A + T) +4 (number of bases G + C). For hybrids above 18 base pairs in length, the Tm (° C) = 81.5 + 16.6 (log10 [Na +]) + 0.41 (% G + C) - (600 / N), where N is the number of bases in the hybrid, and [Na +] is the concentration of sodium ions in the hybridization buffer ([Na +] for standard sodium citrate 1x = 0.165 M). Typically, each polynucleotide that hybridizes has a length that is at least 25% (commonly at least 50%, 60%, or 70%, and more commonly at least 80%) of the length of a polynucleotide with which it hybridizes, and has at least 60% sequence identity (eg, at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, or at least 99%) with a polynucleotide with which hybridizes.

Como se entenderá por el experto en la técnica, un ADN lineal tiene dos orientaciones posibles: la dirección 5' a 3' y la dirección 3' a 5'. Por ejemplo, si una secuencia de referencia se ubica en la dirección 5' a 3', y si una segunda secuencia se ubica en la dirección 5' a 3' dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia se orientan en la misma dirección, o tienen la misma orientación. Típicamente, una secuencia promotora y un gen de interés bajo la regulación del promotor dado se ubican en la misma orientación. Sin embargo, con respecto a la secuencia de referencia ubicada en la dirección 5' a 3', si una segunda secuencia se ubica en la dirección 3' a 5' dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia se orientan en la dirección antisentido, o tienen orientación antisentido. Dos secuencias que tienen orientaciones antisentido una con respecto a la otra pueden describirse alternativamente como que tienen la misma orientación, si la secuencia de referencia (dirección 5' a 3') y la secuencia complementaria inversa de la secuencia de referencia (secuencia de referencia ubicada en 5' a 3') se ubican dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido. Las secuencias que se exponen en la presente descripción se muestran en la dirección 5' a 3'.As will be understood by the person skilled in the art, a linear DNA has two possible orientations: the 5 'to 3' direction and the 3 'to 5' direction. For example, if a reference sequence is located in the 5 'to 3' direction, and if a second sequence is located in the 5 'to 3' direction within the same molecule / polynucleotide chain, then the reference sequence and the second sequence are oriented in the same direction, or have the same orientation. Typically, a promoter sequence and a gene of interest under the regulation of the given promoter are located in the same orientation. However, with respect to the reference sequence located in the 5 'to 3' direction, if a second sequence is located in the 3 'to 5' direction within the same molecule / polynucleotide chain, then the reference sequence and the second sequence are oriented in the antisense direction, or have antisense orientation. Two sequences having antisense orientations with respect to each other can alternatively be described as having the same orientation, whether the reference sequence (5 'to 3' direction) and the inverse complementary sequence of the reference sequence (reference sequence located in 5 'to 3') are located within the same molecule / polynucleotide chain. The sequences set forth in the present description are shown in the 5 'to 3' direction.

Los polipéptidos NtMRP incluyen variantes producidas mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan el replegamiento o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), las que pueden modificarse genéticamente deliberadamente o aislarse de manera natural. Los polipéptidos NtMRP3 o NtMRP4 pueden estar en forma lineal o cíclica mediante el uso de métodos conocidos. Los polipéptidos NtMRP4 comprenden al menos 10, al menos 20, al menos 30, o al menos 40 aminoácidos contiguos.NtMRP polypeptides include variants produced by the introduction of any type of alterations (e.g., insertions, deletions, or amino acid substitutions, changes in glycosylation states, changes that affect refolding or isomerizations, three-dimensional structures, or self-association states), those that can be genetically modified deliberately or isolated naturally. The NtMRP3 or NtMRP4 polypeptides may be in linear or cyclic form by the use of known methods. The NtMRP4 polypeptides comprise at least 10, at least 20, at least 30, or at least 40 contiguous amino acids.

Diversas modalidades se dirigen a polipéptidos NtMRP3 aislados codificados por una secuencia de polinucleótidos que comprende, consiste o consiste esencialmente en sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 y fragmentos de sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51, o variantes de estas.Various embodiments are directed to isolated NtMRP3 polypeptides encoded by a polynucleotide sequence comprising, consisting or consisting essentially of sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51 and fragments of sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51, or variants of these.

Diversas modalidades se dirigen a polipéptidos NtMRP4 aislados codificados por una secuencia de polinucleótidos que comprende, que consiste de o consiste esencialmente en sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27, fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27, o variantes de estas.Various embodiments are directed to isolated NtMRP4 polypeptides encoded by a polynucleotide sequence comprising, consisting of or consisting essentially of sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident .: 27, fragments of sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident .: 27, or variants of these.

Diversas modalidades se dirigen a variantes de polipéptido NtMRP aisladas que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o fragmentos de sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51.Various embodiments are directed to isolated NtMRP polypeptide variants comprising at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% sequence identity with sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident. 27 or sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51 or fragments of sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident. 27 or sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident. 51

Las variantes de polipéptidos mutantes de NtMRP, NtMRP3 y NtMRP4 se abarcan, además, por las reivindicaciones y se describen en la presente descripción como plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas (por ejemplo, plantas de tabaco mutantes, de origen no natural o transgénicas) que comprenden las variantes de polipéptidos mutantes de NtMRP y/o NtMRP3 y/o NtMRP4.Mutant polypeptide variants of NtMRP, NtMRP3 and NtMRP4 are further encompassed by the claims and are described herein as mutant, non-natural or transgenic plants (eg, mutant tobacco plants, of non-natural origin or transgenic) comprising the mutant polypeptide variants of NtMRP and / or NtMRP3 and / or NtMRP4.

El término “de origen no natural” como se usa en la presente describe una entidad (por ejemplo, un polinucleótido, una mutación genética, un polipéptido, una planta, una célula vegetal y material vegetal) que no se forma naturalmente o que no existe en la naturaleza. Dichas entidades de origen no natural o entidades artificiales pueden obtenerse, sintetizarse, iniciarse, modificarse, intervenirse, o manipularse mediante métodos descritos en la presente descripción o que se conocen en la técnica. Así, a manera de ejemplo, una planta de origen no natural, una célula vegetal de origen no natural o material vegetal de origen no natural puede producirse con el uso de técnicas tradicionales de mejoramiento de plantas - tales como retrocruzamiento - o mediante tecnologías de manipulación genética - tales como ARN antisentido, ARN de interferencia, meganucleasa y similares. A modo de ejemplo adicional, una planta de origen no natural, una célula vegetal de origen no natural o material vegetal de origen no natural puede producirse mediante introgresión de, o al transferir una o más mutaciones genéticas (por ejemplo uno o más polimorfismos) a partir de una primera planta o célula vegetal dentro de una segunda planta o célula vegetal (la cual puede ser en sí misma de origen natural), de manera que la planta, célula vegetal o material vegetal resultantes o la progenie de estas comprende una constitución genética (por ejemplo, un genoma, un cromosoma o un segmento de estos) que no se forma naturalmente o que no existe en la naturaleza. Así, la planta, célula vegetal o material vegetal resultantes son artificiales o de origen no natural. En consecuencia, una planta o célula vegetal artificial o de origen no natural puede producirse mediante la modificación de una secuencia genética en una primera planta o célula vegetal de origen natural, incluso si la secuencia genética resultante se produce naturalmente en una segunda planta o célula vegetal que comprende un fondo genético diferente de la primera planta o célula vegetal. Las diferencias en el fondo genético pueden detectarse mediante diferencias fenotípicas o mediante técnicas de biología molecular conocidas en la técnica - tales como secuenciación de polinucleótidos, presencia o ausencia de marcadores genéticos (por ejemplo, marcadores de ARN de microsatélites).The term "of non-natural origin" as used herein describes an entity (eg, a polynucleotide, a genetic mutation, a polypeptide, a plant, a plant cell and plant material) that is not naturally formed or does not exist In nature. Said entities of non-natural origin or artificial entities can be obtained, synthesized, initiated, modified, intervened, or manipulated by methods described in the present description or which are known in the art. Thus, by way of example, a plant of non-natural origin, a plant cell of non-natural origin or plant material of non-natural origin can be produced with the use of traditional plant breeding techniques - such as backcrossing - or by manipulation technologies genetic - such as antisense RNA, interfering RNA, meganuclease and the like. As a further example, a plant of non-natural origin, a plant cell of non-natural origin or plant material of non-natural origin can be produced by introgression of, or by transferring one or more genetic mutations (for example one or more polymorphisms) to starting from a first plant or plant cell within a second plant or plant cell (which may itself be of natural origin), so that the resulting plant, plant cell or plant material or their progeny comprises a genetic constitution (for example, a genome, a chromosome or a segment of these) that is not naturally formed or that does not exist in nature. Thus, the resulting plant, plant cell or plant material are artificial or of non-natural origin. Consequently, an artificial plant or cell of unnatural origin can be produced by modifying a genetic sequence in a first plant or plant cell of natural origin, even if the resulting genetic sequence occurs naturally in a second plant or plant cell which comprises a genetic background different from the first plant or plant cell. Differences in genetic background can be detected by phenotypic differences or by molecular biology techniques known in the art - such as polynucleotide sequencing, presence or absence of genetic markers (eg, microsatellite RNA markers).

Un polipéptido puede prepararse mediante el cultivo de células huéspedes transformadas o recombinantes en condiciones de cultivo adecuadas para expresar un polipéptido. El polipéptido expresado resultante puede purificarse después a partir de dicho cultivo mediante el uso de procesos de purificación conocidos. La purificación del polipéptido puede incluir además una columna de afinidad que contiene agentes que se unirán al polipéptido; una o más etapas en columna sobre tales resinas de afinidad tal como concanavalina A-agarosa, heparinatoyopearl® o Cibacron blue 3GA Sepharose®; una o más etapas que implican cromatografía por interacción hidrofóbica mediante el uso de dichas resinas como fenil éter, butil éter, o propil éter; o cromatografía por inmunoafinidad. Alternativamente, el polipéptido puede expresarse, además, en una forma que facilitará la purificación. Por ejemplo, puede expresarse como un polipéptido de fusión, tal como el polipéptido de unión a maltosa (MBP), glutatión-5-transferasa (GST) o tioredoxina (TRX). Los kits para la expresión y purificación de dichos polipéptidos de fusión están disponibles comercialmente de New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, N.J.), e InVitrogen, respectivamente. El polipéptido puede marcarse con un epítopo y posteriormente purificarse mediante el uso de un anticuerpo específico dirigido a dicho epítopo. Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes u otros grupos alifáticos, pueden emplearse para purificar adicionalmente el polipéptido. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones, también pueden emplearse para proporcionar un polipéptido recombinante homogéneo esencialmente. El polipéptido purificado de esta forma es esencialmente libre de otros polipéptidos y en la presente descripción se define como un "polipéptido esencialmente purificado"; dichos polipéptidos purificados incluyen polipéptidos, fragmentos, variantes de NtMRP, y similares. La expresión, aislamiento, y purificación de los polipéptidos y fragmentos pueden llevarse a cabo mediante cualquier técnica adecuada, lo que incluye, pero no se limita a, los métodos descritos en la presente descripción.A polypeptide can be prepared by culturing transformed or recombinant host cells under culture conditions suitable for expressing a polypeptide. The resulting expressed polypeptide can then be purified from said culture by the use of known purification processes. The purification of the polypeptide may further include an affinity column containing agents that will bind to the polypeptide; one or more column steps on such affinity resins such as concanavalin A-agarose, heparinateyopearl® or Cibacron blue 3GA Sepharose®; one or more steps involving chromatography by hydrophobic interaction by using such resins as phenyl ether, butyl ether, or propyl ether; or immunoaffinity chromatography. Alternatively, the polypeptide can be further expressed in a form that will facilitate purification. For example, it can be expressed as a fusion polypeptide, such as maltose binding polypeptide (MBP), glutathione-5-transferase (GST) or thioredoxin (TRX). Kits for the expression and purification of said fusion polypeptides are commercially available from New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, N.J.), and InVitrogen, respectively. The polypeptide can be labeled with an epitope and subsequently purified by the use of a specific antibody directed to said epitope. Finally, one or more reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) steps employing hydrophobic RP-HPLC media, for example, silica gel having pendant methyl groups or other aliphatic groups, can be used to further purify the polypeptide. Some or all of the above purification steps, in various combinations, may also be employed to provide an essentially homogeneous recombinant polypeptide. The polypeptide purified in this way is essentially free of other polypeptides and in the present description is defined as an "essentially purified polypeptide"; said purified polypeptides include polypeptides, fragments, variants of NtMRP, and the like. The expression, isolation, and purification of the polypeptides and fragments can be carried out by any suitable technique, including, but not limited to, the methods described in the present disclosure.

Es posible, además, usar una columna de afinidad tal como un anticuerpo monoclonal generado contra los polipéptidos, para purificar por afinidad los polipéptidos expresados. Estos polipéptidos pueden retirarse de una columna de afinidad mediante el uso de técnicas convencionales, por ejemplo, en un tampón de elución con contenido alto de sales y después separar mediante diálisis en un tampón con bajo contenido de sales para el uso o mediante el cambio del pH u otros componentes en dependencia de la matriz de afinidad usada, o retirarse de manera competitiva mediante el uso del sustrato de origen natural del motivo de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la descripción.It is further possible to use an affinity column such as a monoclonal antibody raised against the polypeptides, to affinityly purify the expressed polypeptides. These polypeptides can be removed from an affinity column by the use of conventional techniques, for example, in an elution buffer with high salt content and then removed by dialysis in a buffer with low salt content for use or by changing the pH or other components depending on the affinity matrix used, or competitively removed by using the naturally-occurring substrate of the affinity motif, such as a polypeptide derived from the description.

Un polipéptido puede producirse, además, mediante síntesis química convencional conocida. Los métodos para construir los polipéptidos o fragmentos de estos por medios sintéticos se conocen por los expertos en la técnica. Las secuencias de polipéptidos construidas sintéticamente, en virtud de compartir características conformacionales o estructurales primarias, secundarias o terciarias con los polipéptidos nativos pueden poseer propiedades biológicas en común con ellos, lo que incluye la actividad biológica.A polypeptide can also be produced by known conventional chemical synthesis. Methods for constructing the polypeptides or fragments thereof by synthetic means are known to those skilled in the art. Synthetically constructed polypeptide sequences, by virtue of sharing primary, secondary or tertiary conformational or structural features with the native polypeptides, may possess biological properties in common with them, including biological activity.

Las modalidades se dirigen a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que se han modificado para reducir o impedir el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) a la lámina foliar mediante la reducción de los niveles de expresión del polinucleótido NtMRP o mediante la reducción de la actividad de la proteína codificada de esta manera. El nivel en estado de equilibrio de los transcritos de ARN de NtMRP puede disminuirse en comparación con una planta de control. En consecuencia, el número de transportadores de NtMRP activos funcionalmente disponibles para transportar metales pesados (por ejemplo, cadmio) a través de las membranas celulares puede disminuirse de manera que también disminuye el nivel de cadmio en la planta.The embodiments are directed to compositions and methods for producing mutant, non-natural or transgenic plants that have been modified to reduce or prevent the transport of heavy metals (eg, cadmium) to the leaf blade by reducing expression levels of the NtMRP polynucleotide or by reducing the activity of the protein encoded in this way. The steady state level of the NtMRP RNA transcripts can be decreased compared to a control plant. Accordingly, the number of active NtMRP transporters functionally available to transport heavy metals (eg, cadmium) through the cell membranes can be decreased so that the level of cadmium in the plant also decreases.

La reducción en la expresión de polinucleótido NtMRP puede ser de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 %, o una reducción de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o hasta 100 %, lo que incluye una reducción en la actividad transcripcional o la expresión de proteínas.The reduction in NtMRP polynucleotide expression can be from about 5% to about 100%, or a reduction of at least 10%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or up to 100%, which includes a reduction in transcriptional activity or protein expression.

La reducción de la actividad de la proteína NtMRP puede ser de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 %, o una reducción de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o hasta 100 %. The reduction of NtMRP protein activity can be from about 5% to about 100%, or a reduction of at least 10%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 40%, at less 50%, at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or up to 100%.

La inhibición se refiere a una reducción de aproximadamente 98 % a aproximadamente 100 %, o una reducción de al menos 98 %, al menos 99 %, pero particularmente del 100 %.Inhibition refers to a reduction of about 98% to about 100%, or a reduction of at least 98%, at least 99%, but particularly 100%.

Los polinucleótidos y constructos recombinantes descritos en la presente descripción pueden usarse para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión de un polipéptido NtMRP en una especie vegetal de interés. Se conoce que varios métodos basados en polinucleótidos, lo que incluye ARN antisentido, escisión de ARN dirigida por ribozima, silenciamiento génico postranscripcional (PTGS), por ejemplo, ARN de interferencia (ARNi) y silenciamiento génico transcripcional (TGS) inhiben la expresión génica en plantas. Los polinucleótidos adecuados incluyen polinucleótidos de longitud completa que codifican polipéptidos NtMRP o fragmentos de dichos polinucleótidos de longitud completa. En algunas modalidades, puede usarse un complemento del polinucleótido de longitud completa o un fragmento de este. Típicamente, un fragmento es de al menos 10 nucleótidos contiguos, por ejemplo, al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleótidos contiguos o más. Generalmente, puede usarse una homología más alta para compensar el uso de una secuencia más corta.The polynucleotides and recombinant constructs described in the present disclosure can be used to modulate (e.g., reduce or inhibit) the expression of an NtMRP polypeptide in a plant species of interest. It is known that several methods based on polynucleotides, including antisense RNA, ribozyme-directed RNA cleavage, posttranscriptional gene silencing (PTGS), eg, RNA interference (RNAi) and transcriptional gene silencing (TGS) inhibit gene expression in plants. Suitable polynucleotides include full-length polynucleotides that encode NtMRP polypeptides or fragments of said full-length polynucleotides. In some embodiments, a complement of the full length polynucleotide or a fragment thereof can be used. Typically, a fragment is at least 10 contiguous nucleotides, for example, at least 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 contiguous nucleotides or more. Generally, a higher homology can be used to compensate for the use of a shorter sequence.

Por tanto, las composiciones que pueden modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o la actividad de NtMRP incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la transcripción de uno o más gen(es) NtMRP endógeno(s); polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la traducción de transcritos de ARN de NtMRP (por ejemplo, ARN bicatenario, ARNip, ribozimas); polipéptidos específicos de secuencia que pueden interferir con la estabilidad de las proteínas NtMRP; polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de unión de la proteína NtMRP con respecto a sustratos o proteínas reguladoras; anticuerpos que exhiben la especificidad por la proteína NtMRP; compuestos de moléculas pequeñas que pueden interferir con la estabilidad de la proteína NtMRP o la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de unión de la proteína NtMRP; proteínas con dedos de zinc que se unen al polinucleótido NtMRP; y meganucleasas que tienen actividad hacia el polinucleótido NtMRP.Thus, compositions that can modulate (e.g., reduce or inhibit) the expression or activity of NtMRP include, but are not limited to, sequence specific polynucleotides that can interfere with the transcription of one or more NtMRP gene (s) endogenous (s); sequence-specific polynucleotides that can interfere with the translation of NtMRP RNA transcripts (eg, double-stranded RNA, siRNA, ribozymes); sequence-specific polypeptides that can interfere with the stability of NtMRP proteins; sequence-specific polynucleotides that can interfere with the enzymatic activity of the NtMRP protein or the binding activity of the NtMRP protein with respect to substrates or regulatory proteins; antibodies that exhibit specificity for the NtMRP protein; compounds of small molecules that can interfere with the stability of the NtMRP protein or the enzymatic activity of the NtMRP protein or the binding activity of the NtMRP protein; proteins with zinc fingers that bind to the NtMRP polynucleotide; and meganucleases that have activity towards the NtMRP polynucleotide.

La tecnología antisentido es un método que se conoce bien que puede usarse para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión de un polipéptido NtMRP. Un polinucleótido del gen a reprimir se clona y se une operativamente a una región regulatoria y una secuencia de terminación de la transcripción de manera que la cadena de ARN antisentido se transcribe. El constructo recombinante se transforma después en las plantas, como se describe en la presente descripción, y se produce la cadena de ARN antisentido. El polinucleótido no necesita ser la secuencia completa del gen a reprimir, pero típicamente será complementaria esencialmente a al menos una porción de la cadena sentido del gen a reprimir.Antisense technology is a well-known method that can be used to modulate (e.g., reduce or inhibit) the expression of an NtMRP polypeptide. A polynucleotide of the gene to be repressed is cloned and operably linked to a regulatory region and a transcription termination sequence such that the antisense RNA strand is transcribed. The recombinant construct is then transformed into the plants, as described in the present description, and the antisense RNA strand is produced. The polynucleotide need not be the complete sequence of the gene to be repressed, but will typically be complementary to essentially at least a portion of the sense strand of the gene to be repressed.

Un polinucleótido puede transcribirse en una ribozima, o ARN catalítico, que afecta la expresión de un ARNm. Las ribozimas pueden diseñarse para aparearse específicamente con virtualmente cualquier ARN objetivo y escindir la cadena principal de fosfodiéster en una ubicación específica, de esta manera inactivan funcionalmente el ARN objetivo. Los polinucleótidos heterólogos pueden codificar ribozimas diseñadas para escindir transcritos de ARNm particulares, lo que impide así la expresión de un polipéptido. Las ribozimas cabeza de martillo son útiles para destruir ARNm particulares, aunque pueden usarse varias ribozimas que escinden ARNm en secuencias de reconocimiento específicas de sitio. Las ribozimas cabeza de martillo escinden ARNm en ubicaciones determinadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con el ARNm objetivo. El único requerimiento es que el ARN objetivo contenga una secuencia de nucleótidos 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas cabeza de martillo se conoce en la técnica. Las secuencias de ribozimas cabeza de martillo pueden incorporarse en un ARN estable tal como un ARN de transferencia (ARNt) para aumentar la eficacia de escisión in vivo. A polynucleotide can be transcribed into a ribozyme, or catalytic RNA, which affects the expression of an mRNA. The ribozymes can be designed to specifically pair with virtually any target RNA and cleave the phosphodiester backbone at a specific location, thereby functionally inactivating the target RNA. The heterologous polynucleotides can encode ribozymes designed to cleave transcripts from particular mRNAs, thus preventing the expression of a polypeptide. Hammerhead ribozymes are useful for destroying particular mRNAs, although several ribozymes that cleave mRNA can be used in site-specific recognition sequences. Hammerhead ribozymes cleave mRNA at locations determined by flanking regions that form base pairs complementary to the target mRNA. The only requirement is that the target RNA contains a 5'-UG-3 'nucleotide sequence. The construction and production of hammerhead ribozymes is known in the art. The hammerhead ribozyme sequences can be incorporated into a stable RNA such as a transfer RNA (tRNA) to increase the cleavage efficiency in vivo.

Por ejemplo, puede prepararse un constructo que incluye una secuencia que se transcribe en un ARN que puede aparearse a sí mismo, por ejemplo, un ARN bicatenario que tiene una estructura en tallo-lazo. En algunas modalidades, una hebra de la porción de tallo de un ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia codificadora sentido o un fragmento de esta de un polinucleótido NtMRP, y que es de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 2 500 nucleótidos contiguos en longitud. La longitud de la secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de codificación sentido puede ser de 10 nucleótidos contiguos a 500 nucleótidos contiguos, de 15 nucleótidos contiguos a 300 nucleótidos contiguos, de 20 nucleótidos contiguos a 100 nucleótidos contiguos, o de 25 nucleótidos contiguos a 100 nucleótidos contiguos. La otra cadena de la porción del tallo de un ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la cadena antisentido o un fragmento de esta de la secuencia codificante del polinucleótido NtMRP, y puede tener una longitud que es más corta, la misma que, o más larga que la longitud correspondiente de la secuencia sentido. En algunos casos, una cadena de la porción de tallo de un ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la región 3' o 5' no traducida, o un fragmento de esta, de un ARNm que codifica un polipéptido NtMRP, y la otra cadena de la porción del tallo del ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia que es complementaria a la región 3' o 5' no traducida, respectivamente, o un fragmento de esta, del ARNm que codifica el NtMRP. En otras modalidades, una cadena de la porción de tallo de un ARN bicatenario comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de un intrón, o un fragmento de esta, en el pre-ARNm que codifica un polipéptido NtMRP, y la otra cadena de la porción de tallo comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia que es complementaria a la secuencia del intrón, o un fragmento de esta, en el pre-ARNm.For example, a construct can be prepared that includes a sequence that is transcribed into an RNA that can be paired to itself, for example, a double-stranded RNA having a stem-loop structure. In some embodiments, a strand of the stem portion of a double-stranded RNA comprises a sequence that is similar or identical to the sense coding sequence or a fragment thereof of an NtMRP polynucleotide, and that is from about 10 nucleotides to about 2,500 nucleotides contiguous in length. The length of the sequence that is similar or identical to the sense coding sequence can be from 10 nucleotides contiguous to 500 contiguous nucleotides, from 15 nucleotides contiguous to 300 contiguous nucleotides, from 20 nucleotides contiguous to 100 contiguous nucleotides, or from 25 contiguous nucleotides to 100 contiguous nucleotides. The other chain of the stem portion of a double-stranded RNA comprises a sequence that is similar or identical to the antisense strand or a fragment thereof of the coding sequence of the NtMRP polynucleotide, and may have a length that is shorter, the same as , or longer than the corresponding length of the sense sequence. In some cases, a chain of the stem portion of a double-stranded RNA comprises a sequence that is similar or identical to the 3 'or 5' untranslated region, or a fragment thereof, of an mRNA encoding an NtMRP polypeptide, and the other chain of the stem portion of the double-stranded RNA comprises a sequence that is similar or identical to the sequence that is complementary to the 3 'or 5' untranslated region, respectively, or a fragment thereof, of the mRNA encoding the NtMRP . In other embodiments, a chain of the stem portion of a double-stranded RNA comprises a sequence that is similar or identical to the sequence of an intron, or a fragment thereof, in the pre-mRNA encoding a NtMRP polypeptide, and the other chain of the stem portion comprises a sequence that is similar or identical to the sequence that is complementary to the sequence of the intron, or a fragment thereof, in the pre-mRNA.

La porción de lazo de un ARN bicatenario puede ser de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 5000 nucleótidos, tal como de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 1 000 nucleótidos, de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 500 nucleótidos, de aproximadamente 25 nucleótidos a 250 nucleótidos. La porción de lazo del ARN puede incluir un intrón o un fragmento de este. Un ARN bicatenario puede tener cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más estructuras de tallo-lazo.The loop portion of a double-stranded RNA can be from about 3 nucleotides to about 5000 nucleotides, such as from about 15 nucleotides to about 1000 nucleotides, from about 20 nucleotides to about 500 nucleotides, from about 25 nucleotides to 250 nucleotides. The loop portion of the RNA may include an intron or a fragment thereof. A double-stranded RNA can have zero, one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten or more stem-loop structures.

Un constructo que incluye una secuencia que se une operativamente a una región reguladora o una secuencia de terminación de la transcripción, y que se transcribe en un ARN que puede formar un ARN bicatenario, puede transformarse en plantas como se describe en la presente descripción. Los expertos en la técnica conocen métodos para usar ARNi para inhibir la expresión de un gen.A construct that includes a sequence that is operably linked to a regulatory region or a transcription termination sequence, and that is transcribed into an RNA that can form a double-stranded RNA, can be transformed into plants as described in the present disclosure. Methods for using RNAi to inhibit the expression of a gene are known to those skilled in the art.

Las constructos que comprenden regiones reguladoras unidas operativamente a moléculas de polinucleótidos en orientación sentido pueden usarse, además, para inhibir la expresión de un gen. El producto de transcripción puede ser similar o idéntico a la secuencia de codificación sentido, o un fragmento de esta, de un polipéptido NtMRP. El producto de transcripción también puede ser no poliadenilado, carecer de una estructura de caperuza 5' o contener un intrón no divisible. Los métodos para inhibir la expresión génica mediante el uso de un ADNc completo así como también una secuencia parcial de ADNc se conocen en la técnica.Constructs comprising regulatory regions operably linked to polynucleotide molecules in sense orientation can also be used to inhibit the expression of a gene. The transcription product may be similar or identical to the sense coding sequence, or a fragment thereof, of an NtMRP polypeptide. The transcription product may also be non-polyadenylated, lacking a 5 'cap structure or contain a non-divisible intron. Methods for inhibiting gene expression by using a complete cDNA as well as a partial cDNA sequence are known in the art.

En algunas modalidades, se usa un constructo que comprende un polinucleótido que tiene al menos una cadena que es un molde para las secuencias sentido y antisentido que son complementarias entre sí para inhibir la expresión de un gen. Las secuencias sentido y antisentido pueden ser parte de una molécula de polinucleótido mayor o pueden ser parte de moléculas de polinucleótidos separadas que tienen secuencias que no son complementarias. La secuencia sentido o antisentido puede ser una secuencia que es idéntica o complementaria a la secuencia de un ARNm, la región 3' o 5' no traducida de un ARNm, o un intrón en un pre-ARNm que codifica un polipéptido NtMRP, o un fragmento de dichas secuencias. En algunas modalidades, la secuencia sentido o antisentido es idéntica o complementaria a una secuencia de la región reguladora que dirige la transcripción del gen que codifica un polipéptido NtMRP. En cada caso, la secuencia sentido es la secuencia que es complementaria a la secuencia antisentido.In some embodiments, a construct comprising a polynucleotide having at least one strand that is a template for sense and antisense sequences that are complementary to each other to inhibit the expression of a gene is used. The sense and antisense sequences may be part of a larger polynucleotide molecule or may be part of separate polynucleotide molecules having sequences that are not complementary. The sense or antisense sequence may be a sequence that is identical or complementary to the sequence of an mRNA, the 3 'or 5' untranslated region of an mRNA, or an intron in a pre-mRNA encoding an NtMRP polypeptide, or an fragment of said sequences. In some embodiments, the sense or antisense sequence is identical or complementary to a sequence of the regulatory region that directs the transcription of the gene encoding an NtMRP polypeptide. In each case, the sense sequence is the sequence that is complementary to the antisense sequence.

Las secuencias sentido y antisentido pueden tener una longitud mayor que aproximadamente 10 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos). Por ejemplo, una secuencia antisentido puede tener una longitud de aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos. Típicamente, las secuencias sentido y antisentido varían en longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 30 nucleótidos, por ejemplo, de aproximadamente 18 nucleótidos a aproximadamente 28 nucleótidos, o de aproximadamente de aproximadamente 21 nucleótidos a aproximadamente 25 nucleótidos, o de aproximadamente 23 nucleótidos a aproximadamente 25 nucleótidos.The sense and antisense sequences can have a length greater than about 10 nucleotides (e.g., about 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30 or more nucleotides). For example, an antisense sequence may have a length of about 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nucleotides. Typically, the sense and antisense sequences vary in length from about 15 nucleotides to about 30 nucleotides, for example, from about 18 nucleotides to about 28 nucleotides, or from about 21 nucleotides to about 25 nucleotides, or from about 23 nucleotides to about 25 nucleotides.

En algunas modalidades, una secuencia antisentido es una secuencia complementaria a una secuencia de ARNm, o un fragmento de esta, que codifica un polipéptido NtMRP descrito en la presente descripción. La secuencia sentido complementaria a la secuencia antisentido puede ser una secuencia presente dentro del ARNm del polipéptido NtMRP. Típicamente, las secuencias sentido y antisentido se diseñan para que correspondan a una secuencia de 15-30 nucleótidos de un ARNm objetivo de manera que se reduce el nivel de ese ARNm objetivo.In some embodiments, an antisense sequence is a sequence complementary to a mRNA sequence, or a fragment thereof, that encodes an NtMRP polypeptide described in the present disclosure. The sense sequence complementary to the antisense sequence may be a sequence present within the mRNA of the NtMRP polypeptide. Typically, the sense and antisense sequences are designed to correspond to a 15-30 nucleotide sequence of a target mRNA so that the level of that target mRNA is reduced.

En algunas modalidades, un constructo que comprende un polinucleótido que tiene al menos una cadena que es un molde para más de una secuencia sentido (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias sentido) puede usarse para inhibir la expresión de un gen. Asimismo, un constructo que comprende un polinucleótido que tiene al menos una cadena que es un molde para más de una secuencia antisentido (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias antisentido) puede usarse para inhibir la expresión de un gen. Por ejemplo, un constructo puede contener un polinucleótido que tiene al menos una cadena que es un molde para dos secuencias sentido y dos secuencias antisentido. Las secuencias sentido múltiples pueden ser idénticas o diferentes. Las secuencias antisentido múltiples pueden ser idénticas o diferentes. Por ejemplo, un constructo puede comprender un polinucleótido que tiene una cadena que es un molde para dos secuencias sentido idénticas y dos secuencias antisentido idénticas que son complementarias a las dos secuencias sentido idénticas. Alternativamente, un polinucleótido aislado puede comprender una cadena que es un molde para (1) dos secuencias sentido idénticas de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud, (2) una secuencia antisentido que es complementaria a las dos secuencias sentido idénticas de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud, (3) una secuencia sentido de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud, y (4) tres secuencias antisentido idénticas que son complementarias a la secuencia sentido de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud. Los constructos proporcionados en la presente descripción pueden diseñarse para tener cualquier disposición de secuencias sentido y antisentido. Por ejemplo, dos secuencias sentido idénticas pueden seguirse por dos secuencias antisentido idénticas o pueden posicionarse entre dos secuencias antisentido idénticas.In some embodiments, a construct comprising a polynucleotide having at least one strand that is a template for more than one sense sequence (e.g., about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more sense sequences) can be used to inhibit the expression of a gene. Also, a construct comprising a polynucleotide having at least one chain that is a template for more than one antisense sequence (e.g., about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more antisense sequences). ) can be used to inhibit the expression of a gene. For example, a construct can contain a polynucleotide having at least one strand that is a template for two sense sequences and two antisense sequences. The multiple sense sequences may be identical or different. The multiple antisense sequences may be identical or different. For example, a construct can comprise a polynucleotide having a chain that is a template for two identical sense sequences and two identical antisense sequences that are complementary to the two identical sense sequences. Alternatively, an isolated polynucleotide may comprise a chain that is a template for (1) two identical sense sequences of approximately 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 or more nucleotides in length, (2) an antisense sequence that is complementary to the two identical sense sequences of approximately 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 or more nucleotides in length, (3) a sense sequence of approximately 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 or more nucleotides in length, and (4) three identical antisense sequences that are complementary to the sense sequence of approximately 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 or more nucleotides of length. The constructs provided in the present disclosure can be designed to have any sense and antisense sequence arrangement. By For example, two identical sense sequences can be followed by two identical antisense sequences or can be positioned between two identical antisense sequences.

Un polinucleótido que comprende al menos una cadena que es un molde para una o más secuencias sentido o antisentido puede unirse operativamente a una región reguladora para conducir la transcripción de una molécula de ARN que comprende la(s) secuencia(s) sentido o antisentido. Además, dicho polinucleótido puede unirse operativamente a una secuencia de terminación de la transcripción, tal como el terminador del gen de la nopalina sintasa (nos). En algunos casos, dos regiones reguladoras pueden dirigir la transcripción de dos transcritos: una de la cadena superior y una de la cadena inferior. Las dos regiones reguladoras pueden ser iguales o diferentes. Los dos transcritos pueden formar moléculas de ARN bicatenario que inducen la degradación del ARN diana. En algunos casos, un polinucleótido puede colocarse dentro de un ADN-T o ADN de transferencia derivado de una planta (ADN-P) de manera que las secuencias de borde izquierdo y derecho del ADN-T, o las secuencias de borde izquierdo y derecho del ADN-P, flanquean o están a cada lado del polinucleótido. La secuencia de polinucleótidos entre las dos regiones regulatorias puede ser de aproximadamente 15 a aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 15 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 18 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud.A polynucleotide comprising at least one strand that is a template for one or more sense or antisense sequences can be operably linked to a regulatory region to drive the transcription of an RNA molecule comprising the sense or antisense sequence (s). In addition, said polynucleotide can be operably linked to a transcription termination sequence, such as the terminator of the nopaline synthase (nos) gene. In some cases, two regulatory regions can direct the transcription of two transcripts: one of the upper chain and one of the lower chain. The two regulatory regions can be the same or different. The two transcripts can form double-stranded RNA molecules that induce degradation of the target RNA. In some cases, a polynucleotide can be placed within a T-DNA or transfer DNA derived from a plant (P-DNA) so that the left and right border sequences of the T-DNA, or the left and right border sequences of the P-DNA flank or are on either side of the polynucleotide. The polynucleotide sequence between the two regulatory regions can be from about 15 to about 300 nucleotides in length, from about 15 to about 200 nucleotides in length, from about 15 to about 100 nucleotides in length, from about 15 to about 50 nucleotides in length , from about 18 to about 50 nucleotides in length, from about 18 to about 40 nucleotides in length, from about 18 to about 30 nucleotides in length, or from about 18 to about 25 nucleotides in length.

En consecuencia, las composiciones que pueden modular (por ejemplo, regulan negativamente) la expresión o la actividad de la proteína NtMRP incluyen polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la transcripción de uno o más gen(es) de NtMRP endógeno(s); polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la traducción de transcritos de ARN de NtMRP (por ejemplo, ARN bicatenario, ARNip, ribozimas); polipéptidos específicos de secuencia que pueden interferir con la estabilidad de las proteínas NtMRP; polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de unión de la proteína NtMRP con respecto a sustratos o proteínas reguladoras; anticuerpos que exhiben especificidad por la proteína NtMRP; compuestos de moléculas pequeñas que pueden interferir con la estabilidad de la proteína NtMRP o la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de unión de la proteína NtMRP; proteínas con dedos de zinc que se unen al polinucleótido NtMRP; y meganucleasas que tienen actividad hacia el polinucleótido NtMRP.Accordingly, compositions that can modulate (e.g., downregulate) the expression or activity of the NtMRP protein include sequence specific polynucleotides that can interfere with the transcription of one or more endogenous NtMRP gene (s); sequence-specific polynucleotides that can interfere with the translation of NtMRP RNA transcripts (eg, double-stranded RNA, siRNA, ribozymes); sequence-specific polypeptides that can interfere with the stability of NtMRP proteins; sequence-specific polynucleotides that can interfere with the enzymatic activity of the NtMRP protein or the binding activity of the NtMRP protein with respect to substrates or regulatory proteins; antibodies that exhibit specificity for the NtMRP protein; compounds of small molecules that can interfere with the stability of the NtMRP protein or the enzymatic activity of the NtMRP protein or the binding activity of the NtMRP protein; proteins with zinc fingers that bind to the NtMRP polynucleotide; and meganucleases that have activity towards the NtMRP polynucleotide.

Un antagonista eficaz puede reducir el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmio) hacia la hoja (por ejemplo, estructuras de la lámina foliar) por al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.An effective antagonist can reduce the transport of heavy metals (e.g., cadmium) to the leaf (e.g., leaf blade structures) by at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%.

En una modalidad, el polinucleótido de secuencia específica que puede interferir con la traducción de transcrito(s) de ARN de NtMRP es un ARNi.In one embodiment, the sequence-specific polynucleotide that can interfere with the translation of NtMRP RNA transcript (s) is an RNAi.

La interferencia por ARN ("ARNi") o el silenciamiento por ARN es un proceso conservado evolutivamente mediante el cual los ARNm específicos pueden dirigirse a la degradación enzimática. Un ARN de doble cadena (ARN bicatenario) debe introducirse o se produce por una célula (por ejemplo, virus de ARN bicatenario, o polinucleótidos de ARNi de NtMRP) para iniciar la vía del a Rní. El ARN bicatenario puede convertirse en múltiples dúplex de ARNip de 21-23 pb de longitud ("ARNip") por las RNasas III, que son endonucleasas específicas de a Rn bicatenario (“Dicer”). Los ARNip pueden reconocerse posteriormente mediante complejos de silenciamiento inducidos por ARN ("RISC") que promueven el desenrollamiento de ARNip a través de un proceso dependiente de ATP. La cadena antisentido desenrollada del ARNip guía al RISC activado hacia el ARNm objetivo (por ejemplo, variantes de ARN de NtMRP) que comprende una secuencia complementaria a la cadena antisentido del ARNip. El ARNm objetivo y la cadena antisentido pueden formar una hélice en forma A, y el surco mayor de la hélice en forma A puede ser reconocido por los RISC activados. El ARNm objetivo puede escindirse mediante el RISC activado en un sitio único definido por el sitio de unión del extremo 5' de la cadena del ARNip. El RISC activado puede reciclarse para catalizar otro evento de escisión.RNA interference ("RNAi") or RNA silencing is an evolutionarily conserved process by which specific mRNAs can target enzymatic degradation. A double-stranded RNA (double-stranded RNA) must be introduced or produced by a cell (e.g., double-stranded RNA virus, or NtMRP RNAi polynucleotides) to initiate the Rní pathway. The double-stranded RNA can be converted into multiple siRNA duplexes of 21-23 bp in length ("siRNA") by RNases III, which are specific endonucleases of a double-stranded R n ("Dicer"). The siRNAs can be subsequently recognized by RNA-induced silencing complexes ("RISC") that promote the unwinding of siRNAs through an ATP-dependent process. The uncoiled antisense strand of the siRNA guides the activated RISC towards the target mRNA (eg, NtMRP RNA variants) comprising a sequence complementary to the antisense strand of the siRNA. The target mRNA and the antisense chain can form a helix in form A, and the major groove of the helix in form A can be recognized by the activated RISCs. The target mRNA can be cleaved by activated RISC at a single site defined by the binding site of the 5 'end of the siRNA chain. The activated RISC can be recycled to catalyze another cleavage event.

Los vectores de expresión de ARNi de NtMRP que comprenden constructos de ARNi de NtMRP que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP exhiben actividad de interferencia de ARN lo que reduce el nivel de expresión de ARN de NtMRP, pre-ARN de NtMRP, o variantes de ARN de NtMRP relacionadas. Los vectores de expresión pueden comprender un promotor ubicado aguas arriba y unido operativamente a un constructo de ARNi de NtMRP, como se describe adicionalmente en la presente descripción. Los vectores de expresión de ARNi de NtMRP pueden comprender un promotor mínimo adecuado, un constructo de ARNi de NtMRP de interés, una región reguladora aguas arriba (5'), una región reguladora aguas abajo (3'), lo que incluye señales de terminación de la transcripción y poliadenilación, y otras secuencias conocidas para los expertos en la técnica, tales como varios marcadores de selección.NtMRP RNAi expression vectors comprising NtMRP RNAi constructs encoding NtMRP RNAi polynucleotides exhibit RNA interference activity which reduces the level of RNA expression of NtMRP, pre-RNA of NtMRP, or RNA variants of related NtMRP. Expression vectors may comprise a promoter located upstream and operably linked to an NtMRP RNAi construct, as further described in the present disclosure. The NtMRP RNAi expression vectors may comprise a suitable minimum promoter, an NtMRP RNAi construct of interest, an upstream regulatory region (5 '), a downstream regulatory region (3'), which includes termination signals of transcription and polyadenylation, and other sequences known to those skilled in the art, such as various selection markers.

Los polinucleótidos NtMRP pueden producirse en varias formas, lo que incluye estructuras bicatenarias (es decir, una molécula de ARN bicatenario que comprende una cadena antisentido y una cadena sentido complementaria), estructuras bicatenarias similares a horquilla ("ARNi-bc"), estructuras monocatenarias (es decir, una molécula de ARNmc que comprende solo una cadena antisentido). Las estructuras pueden comprender un dúplex, dúplex asimétrico, horquilla o estructura secundaria de horquilla asimétrica, que tiene cadenas sentido y antisentido autocomplementarias. Los ARNbc-i de NtMRP pueden convertirse enzimáticamente a ARNip de NtMRP bicatenarios. Una de las cadenas del dúplex de ARNip de NtMRP puede aparearse con una secuencia complementaria dentro del ARNm de NtMRP objetivo y variantes de ARN de NtMRP relacionadas. Los híbridos de ARNip/ARNm son reconocidos por el RISC que puede escindir los ARN de NtMRP en múltiples sitios de una manera dependiente de la secuencia, lo que da como resultado la degradación del ARNm de NtMRP objetivo y variantes relacionadas del ARN de NtMRP.NtMRP polynucleotides can be produced in various forms, including double-stranded structures (ie, a double-stranded RNA molecule comprising an antisense strand and a complementary sense strand), double-stranded hairpin-like structures ("RNAi-bc"), single-stranded structures (that is, a molecule of MRNA comprising only one antisense strand). The structures may comprise a duplex, asymmetrical duplex, fork or asymmetric secondary fork structure, which has self-complementary sense and antisense chains. The NtMRP siRNAs can be converted enzymatically to double stranded NtMRP siRNAs. One of the strands of the NtMRP siRNA duplex can be paired with a complementary sequence within the target NtMRP mRNA and related NtMRP RNA variants. The siRNA / mRNA hybrids are recognized by the RISC which can cleave NtMRP RNAs at multiple sites in a sequence dependent manner, which results in the degradation of target NtMRP mRNA and related variants of NtMRP RNA.

Las moléculas de ARN bicatenario pueden incluir moléculas de ARNip, ensambladas a partir de un solo oligonucleótido en una estructura de tallo-lazo, en donde las regiones sentido y antisentido autocomplementarias de la molécula de ARNip se unen por medio de un enlazador(es) basado(s) en un polinucleótido o no basado(s) en un polinucleótido, así como también ARN circular monocatenario que tiene dos o más estructuras de lazo y un tallo que comprende las cadenas sentido y antisentido autocomplementarias, en donde el ARN circular puede procesarse lo mismo in vivo que in vitro para generar una molécula activa de ARNip capaz de mediar ARNi.Double-stranded RNA molecules can include siRNA molecules, assembled from a single oligonucleotide in a stem-loop structure, where the self-complementary sense and antisense regions of the siRNA molecule are linked by means of a linker (s) based (s) in a polynucleotide or not based on a polynucleotide, as well as single-stranded circular RNA having two or more loop structures and a stem comprising the sense and antisense self-complementary chains, wherein the circular RNA can be processed same in vivo as in vitro to generate an active siRNA molecule capable of mediating RNAi.

Las moléculas de ARN en horquilla pequeña (ARNhp) también se describen en la presente descripción y comprenden una secuencia antisentido específica además de la secuencia complementaria (sentido) inversa, separadas típicamente por un espaciador o secuencia en lazo. La escisión del espaciador o lazo proporciona una molécula de ARN monocatenario y su complemento inverso, de manera que pueden aparearse para formar una molécula de ARN bicatenario (opcionalmente con etapas de procesamiento adicionales que pueden resultar en la adición o eliminación de uno, dos, tres o más nucleótidos a partir del extremo 3' o el extremo 5' de cualquiera de las cadenas o de ambas). El espaciador puede ser de una longitud suficiente para permitir que las secuencias antisentido y sentido se apareen y formen una estructura bicatenario (o tallo) antes de la escisión del espaciador (y, opcionalmente, etapas de procesamiento posteriores que pueden resultar en la adición o eliminación de uno, dos, tres, cuatro, o más nucleótidos a partir del extremo 3' o el extremo 5' de cualquiera de las cadenas o de ambas). La secuencia del espaciador típicamente es una secuencia de nucleótidos no relacionada que se ubica entre dos regiones complementarias de secuencias de nucleótidos las cuales, cuando se aparean en un polinucleótido bicatenario, comprenden un ARNhp. La secuencia del espaciador comprende generalmente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleótidos.RNA molecules in small hairpin (hsRNA) are also described in the present disclosure and comprise a specific antisense sequence in addition to the complementary (sense) reverse sequence, typically separated by a spacer or loop sequence. Cleavage of the spacer or loop provides a single-stranded RNA molecule and its reverse complement, so that they can be paired to form a double-stranded RNA molecule (optionally with additional processing steps that can result in the addition or removal of one, two, three or more nucleotides from the 3 'end or the 5' end of either or both chains). The spacer may be of sufficient length to allow the antisense and sense sequences to pair and form a double-stranded structure (or stem) prior to cleavage of the spacer (and, optionally, subsequent processing steps that may result in addition or deletion). of one, two, three, four, or more nucleotides from the 3 'end or the 5' end of either or both chains). The sequence of the spacer is typically an unrelated nucleotide sequence that is located between two complementary regions of nucleotide sequences which, when paired in a double-stranded polynucleotide, comprise a hsRNA. The sequence of the spacer generally comprises between about 3 and about 100 nucleotides.

Cualquier polinucleótido de ARN de NtMRP de interés puede producirse mediante la selección de una adecuada composición de secuencias, tamaño del lazo, y longitud del tallo para producir el dúplex en horquilla de NtMRP. Un intervalo adecuado para diseñar las longitudes del tallo de un dúplex en horquilla, incluye las longitudes del tallo de al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos - tal como aproximadamente 14­ 30 nucleótidos, aproximadamente 30-50 nucleótidos, aproximadamente 50-100 nucleótidos, aproximadamente 100­ 150 nucleótidos, aproximadamente 150-200 nucleótidos, aproximadamente 200-300 nucleótidos, aproximadamente 300-400 nucleótidos, aproximadamente 400-500 nucleótidos, aproximadamente 500-600 nucleótidos, y aproximadamente 600-700 nucleótidos. Un intervalo adecuado para diseñar las longitudes del lazo de un dúplex en horquilla, incluye las longitudes del lazo de aproximadamente 4-25 nucleótidos, aproximadamente 25-50 nucleótidos, o más largas si la longitud del tallo del dúplex en horquilla es sustancial. En ciertas modalidades, una molécula de ARN bicatenario o de ARNmc es de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN es una molécula de ARN bicatenario o un ARNmc entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN es una molécula de ARN bicatenario o un ARNmc entre aproximadamente 17 y aproximadamente 30 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN es una molécula de a Rn bicatenario o un ARNmc entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN es una molécula de ARN bicatenario o un ARNmc entre aproximadamente 21 y aproximadamente 23 nucleótidos en longitud. En ciertas modalidades, las estructuras de horquillas con regiones dobles más largas que 21 nucleótidos pueden promover un eficaz silenciamiento dirigido por el ARNip, independientemente de la secuencia y la longitud del lazo.Any NtMRP RNA polynucleotide of interest can be produced by selecting an appropriate sequence composition, loop size, and stem length to produce the NtMRP hairpin duplex. A suitable range for designing the stem lengths of a hairpin duplex includes the stem lengths of at least about 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 nucleotides - such as about 14 30 nucleotides, about 30-50 nucleotides, about 50-100 nucleotides, about 100 150 nucleotides, about 150-200 nucleotides, about 200-300 nucleotides, about 300-400 nucleotides, about 400-500 nucleotides, about 500-600 nucleotides , and approximately 600-700 nucleotides. A suitable range for designing the loop lengths of a fork duplex includes the loop lengths of about 4-25 nucleotides, about 25-50 nucleotides, or longer if the stem length of the fork duplex is substantial. In certain embodiments, a double-stranded RNA or mRNA molecule is between about 15 and about 40 nucleotides in length. In another embodiment, the RNA molecule is a double-stranded RNA molecule or a mRNA between about 15 and about 35 nucleotides in length. In another embodiment, the RNA molecule is a double-stranded RNA molecule or a mRNA between about 17 and about 30 nucleotides in length. In another embodiment, the RNA molecule is a molecule to R n or double stranded ssRNA from about 19 to about 25 nucleotides in length. In another embodiment, the RNA molecule is a double-stranded RNA molecule or an mRNA between about 21 and about 23 nucleotides in length. In certain embodiments, hairpin structures with double regions longer than 21 nucleotides can promote efficient silencing directed by the siRNA, regardless of the sequence and length of the loop.

La secuencia del ARNm objetivo está típicamente entre aproximadamente 14 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. El ARNm objetivo puede, por lo tanto, examinarse por regiones entre aproximadamente 14 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud que cumplen preferentemente con uno o más de los siguientes criterios para una secuencia objetivo: una relación A+T/G+C de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2; un dinucleótido AA o un dinucleótido CA en el extremo 5' de la secuencia objetivo; una secuencia de al menos 10 nucleótidos consecutivos única para el ARNm objetivo; y sin "corridas" de más de tres nucleótidos de guanina (G) consecutivos o más de tres nucleótidos de citosina (C) consecutivos. Estos criterios pueden evaluarse mediante el uso de diversas técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, pueden usarse programas informáticos tales como BLAST para buscar bases de datos disponibles públicamente para determinar si la secuencia objetivo seleccionada es única para el ARNm objetivo. Alternativamente, puede seleccionarse una secuencia objetivo (y se diseña una secuencia de ARNip) mediante el uso de un software informático disponible comercialmente (por ejemplo, OligoEngineTM (Seattle, Washington); Dharmacon, Inc. (Lafayette, Colorado); Target Finder de Ambion Inc. (Austin, TX) y la herramienta de diseño de ARNip de QIAGEN, Inc. (Valencia, CA)). The target mRNA sequence is typically between about 14 to about 50 nucleotides in length. The target mRNA can, therefore, be examined by regions between about 14 and about 50 nucleotides in length which preferably fulfill one or more of the following criteria for a target sequence: an A + T / G + C ratio of between about 2 : 1 and approximately 1: 2; an AA dinucleotide or a CA dinucleotide at the 5 'end of the target sequence; a sequence of at least 10 consecutive nucleotides unique to the target mRNA; and without "runs" of more than three consecutive guanine nucleotides (G) or more than three consecutive cytosine nucleotides (C). These criteria can be evaluated by using various techniques known in the art, for example, computer programs such as BLAST can be used to search publicly available databases to determine if the selected target sequence is unique to the target mRNA. Alternatively, a target sequence can be selected (and a siRNA sequence is designed) by using commercially available computer software (eg, OligoEngineTM (Seattle, Washington); Dharmacon, Inc. (Lafayette, Colorado); Ambion Target Finder; Inc. (Austin, TX) and the siRNA design tool of QIAGEN, Inc. (Valencia, CA)).

En una modalidad, se selecciona que las secuencias de ARNm objetivo sean entre aproximadamente 14 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que cumplan uno o más de los criterios anteriores. En otra modalidad, se selecciona que las secuencias objetivos sean entre aproximadamente 16 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En una modalidad adicional, se selecciona que las secuencias objetivos sean entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En otra modalidad, se selecciona que las secuencias objetivos sean entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud que cumplan con uno o más de los criterios anteriores.In one embodiment, it is selected that the target mRNA sequences are between about 14 and about 30 nucleotides in length that meet one or more of the above criteria. In another embodiment, it is selected that the target sequences are between about 16 and about 30 nucleotides in length that meet one or more of the above criteria. In a further embodiment, it is selected that the target sequences are between about 19 and about 30 nucleotides in length that meet one or more of the above criteria. In another embodiment, it is selected that the target sequences are between about 19 and about 25 nucleotides in length that meet one or more of the above criteria.

En una modalidad ilustrativa, las moléculas de ARNip comprenden una secuencia antisentido específica que es complementaria a al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos contiguos de una cualquiera de las secuencias como se expone en secs. con núms. de ident.: 1-23. La secuencia antisentido específica comprendida por la molécula de ARNip puede ser idéntica o idéntica sustancialmente al complemento de la secuencia objetivo. En una modalidad, la secuencia antisentido específica comprendida por la molécula de ARNip es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al complemento de la secuencia de ARNm objetivo. Los métodos para determinar la identidad de secuencia se conocen en la técnica y pueden determinarse, por ejemplo, mediante el uso del programa BLASTN del programa informático del Grupo de Computación de la Universidad de Wisconsin (GCG) o proporcionarse en el sitio de internet del NCBI.In an illustrative embodiment, the siRNA molecules comprise a specific antisense sequence that is complementary to at least 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 or more contiguous nucleotides of any one of the sequences as set forth in secs. with numbers Ident .: 1-23 The specific antisense sequence comprised by the siRNA molecule can be identical or substantially identical to the complement of the target sequence. In one embodiment, the specific antisense sequence comprised by the siRNA molecule is at least about 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the sequence complement of target mRNA. Methods for determining sequence identity are known in the art and can be determined, for example, by using the BLASTN program from the computer program of the Computing Group of the University of Wisconsin (GCG) or provided on the NCBI website. .

La secuencia antisentido específica de la molécula de ARNip descrita en la presente descripción puede exhibir variabilidad al diferir (por ejemplo, por sustitución de nucleótidos, lo que incluye transición o transversión) en uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos de la secuencia del ARNm objetivo. Cuando tales sustituciones de nucleótidos están presentes en la cadena antisentido de una molécula de ARN bicatenario, el nucleótido complementario en la cadena sentido con el cual el nucleótido sustituto típicamente formaría apareamiento de bases por enlace de hidrógeno puede o no estar sustituido de manera correspondiente. Las moléculas de ARN bicatenario en las cuales se produce una o más sustituciones de nucleótidos en la secuencia sentido, pero no en la cadena antisentido, también se contemplan. Cuando la secuencia antisentido de una molécula de ARNip comprende uno o más errores de apareamiento entre la secuencia de nucleótidos del ARNip y la secuencia de nucleótidos objetivo, como se describió anteriormente, los errores de apareamiento pueden encontrarse en el extremo 3' terminal, el extremo 5' terminal o en la porción central de la secuencia antisentido.The specific antisense sequence of the siRNA molecule described in the present disclosure may exhibit variability by differing (eg, by substitution of nucleotides, including transition or transversion) in one, two, three, four or more nucleotides of the sequence of the Target mRNA. When such nucleotide substitutions are present in the antisense strand of a double-stranded RNA molecule, the complementary nucleotide in the sense strand with which the substitution nucleotide would typically form base pairing by hydrogen bonding may or may not be substituted accordingly. Double-stranded RNA molecules in which one or more nucleotide substitutions are produced in the sense sequence, but not in the antisense strand, are also contemplated. When the antisense sequence of a siRNA molecule comprises one or more mismatches between the nucleotide sequence of the siRNA and the target nucleotide sequence, as described above, mating errors can be found at the 3 'end, the extreme 5 'terminal or in the central portion of the antisense sequence.

En otra modalidad, la molécula de ARNip comprende una secuencia antisentido específica que es capaz de hibridar selectivamente en condiciones rigurosas a una porción de un gen objetivo de origen natural o ARNm objetivo. Las condiciones rigurosas adecuadas incluyen, por ejemplo, hibridación de acuerdo con procedimientos de hibridación convencionales y condiciones de lavado de 1-3 veces. Citrato de sodio estándar, sulfato de dodecilo sódico al 0,1-1 %, 50-70 °C, con un cambio de solución de lavado después de aproximadamente 5-30 minutos. Como se conoce por los expertos en la técnica, las variaciones en la rigurosidad de las condiciones de hibridación pueden lograrse mediante la alteración del tiempo, temperatura o concentración de las soluciones usadas para las etapas de hibridación y lavado. Además, las condiciones adecuadas pueden depender en parte en las secuencias de nucleótidos particulares usadas, por ejemplo la secuencia del ARNm o gen objetivos.In another embodiment, the siRNA molecule comprises a specific antisense sequence that is capable of selectively hybridizing under stringent conditions to a portion of a target gene of natural origin or target mRNA. Suitable stringent conditions include, for example, hybridization according to conventional hybridization procedures and 1-3 times wash conditions. Standard sodium citrate, 0.1-1% sodium dodecyl sulfate, 50-70 ° C, with a change in wash solution after approximately 5-30 minutes. As is known to those skilled in the art, variations in the stringency of the hybridization conditions can be achieved by altering the time, temperature or concentration of the solutions used for the hybridization and washing steps. In addition, suitable conditions may depend in part on the particular nucleotide sequences used, for example the target mRNA or gene sequence.

Las moléculas de ARNi que tienen una estructura dúplex o bicatenaria, por ejemplo ARN bicatenario o ARNhp, pueden tener extremos romos, o pueden tener salientes en 3' o 5'. Como se usa en la presente descripción, "saliente" se refiere al nucleótido o nucleótidos no pareados que se proyectan a partir de una estructura dúplex cuando un extremo 3' terminal de una cadena de ARN se extiende más allá del extremo 5' terminal de la otra cadena (saliente en 3'), o viceversa (saliente en 5'). Los nucleótidos que comprenden el saliente pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o versiones modificadas de estos. En una modalidad, al menos una cadena de la molécula de ARNi tiene un saliente en 3' de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 nucleótidos de longitud. En otras modalidades, el saliente en 3' es de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 nucleótidos, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 nucleótidos y de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud.RNAi molecules having a duplex or double-stranded structure, for example double-stranded RNA or hsRNA, may have blunt ends, or may have 3 'or 5' overhangs. As used in the present description, "salient" refers to the unpaired nucleotide or nucleotides projecting from a duplex structure when a 3 'terminal end of an RNA strand extends beyond the terminal 5' end of the another chain (3 'overhang), or vice versa (5' overhang). The nucleotides comprising the projection may be ribonucleotides, deoxyribonucleotides or modified versions thereof. In one embodiment, at least one strand of the RNAi molecule has a 3 'overhang of about 1 to about 6 nucleotides in length. In other embodiments, the 3 'overhang is from about 1 to about 5 nucleotides, from about 1 to about 3 nucleotides, and from about 2 to about 4 nucleotides in length.

Cuando la molécula de ARNi comprende un saliente en 3' en un extremo de la molécula, el otro extremo puede ser un extremo romo o tener también un saliente (5' o 3'). Cuando la molécula de ARNi comprende un saliente en ambos extremos de la molécula, la longitud de los salientes puede ser la misma o diferente. En una modalidad, la molécula de ARNi descrita en la presente descripción comprende salientes en 3' de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. En una modalidad adicional, la molécula de ARNi es un ARN bicatenario que tiene un saliente en 3' de 2 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. En aún otra modalidad, los nucleótidos que comprenden el saliente del ARNi son dinucleótidos TT o dinucleótidos UU.When the RNAi molecule comprises a 3 'overhang at one end of the molecule, the other end may be a blunt end or also have a protrusion (5' or 3 '). When the RNAi molecule comprises a protrusion at both ends of the molecule, the length of the protrusions can be the same or different. In one embodiment, the RNAi molecule described in the present disclosure comprises 3 'overhangs from about 1 to about 3 nucleotides at both ends of the molecule. In a further embodiment, the RNAi molecule is a double-stranded RNA having a 3 'overhang of 2 nucleotides at both ends of the molecule. In yet another embodiment, the nucleotides comprising the RNAi overhang are TT dinucleotides or UU dinucleotides.

Cuando se determina el porcentaje de identidad de la molécula de ARNi que comprende uno o más salientes con la secuencia de ARNm objetivo, el(los) saliente(s) puede(n) tomarse en cuenta o no. Por ejemplo, los nucleótidos de un saliente en 3' y hasta 2 nucleótidos de los extremos 5' o 3' terminales de la doble cadena pueden modificarse sin una pérdida significativa de la actividad de la molécula de ARNip. When the percent identity of the RNAi molecule comprising one or more projections with the target mRNA sequence is determined, the projection (s) can be taken into account or not. For example, the nucleotides of a 3 'overhang and up to 2 nucleotides of the 5' or 3 'terminal ends of the double strand can be modified without significant loss of siRNA molecule activity.

Las moléculas de ARNi pueden comprender una o más estructuras de caperuza en 5' o 3'. La molécula de ARNi puede comprender una estructura de caperuza en el extremo 3' de la cadena sentido, la cadena antisentido, o ambas cadenas sentido y antisentido; o en el extremo 5' de la cadena sentido, la cadena antisentido, o ambas cadenas sentido y antisentido de la molécula de ARNi. Alternativamente, la molécula de ARNi puede comprender una estructura de caperuza en ambos extremos 3' y 5' de la molécula de ARNi. El término "estructura de caperuza" se refiere a una modificación química incorporada en cualquier extremo terminal de un oligonucleótido (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Núm. 5,998,203), la cual protege la molécula de la degradación de exonucleasas, y puede facilitar además el suministro o localización dentro de una célula.The RNAi molecules may comprise one or more cap structures at 5 'or 3'. The RNAi molecule may comprise a cap structure at the 3 'end of the sense strand, the antisense strand, or both sense and antisense strands; or at the 5 'end of the sense strand, the antisense strand, or both sense and antisense strands of the RNAi molecule. Alternatively, the RNAi molecule may comprise a cap structure at both 3 'and 5' ends of the RNAi molecule. The term "cap structure" refers to a chemical modification incorporated at either terminus of an oligonucleotide (see, for example, U.S. Patent No. 5,998,203), which protects the molecule from the degradation of exonucleases, and can also facilitate the supply or location within a cell.

Otra modificación aplicable a moléculas de ARNi es el enlace químico a la molécula de ARNi de uno o más motivos o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular, captación celular, biodisponibilidad o estabilidad de la molécula de aRní. Los polinucleótidos pueden sintetizarse o modificarse mediante métodos bien establecidos en la técnica. Las modificaciones químicas pueden incluir, pero no se limitan a modificaciones en 2', introducción de bases no naturales, unión covalente a un ligando, y reemplazo de enlaces fosfato con enlaces tiofosfato. En esta modalidad, la integridad de la estructura de dúplex se fortalece mediante al menos uno, y típicamente dos, enlaces químicos. La unión química puede alcanzarse mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo mediante la introducción de enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrofóbicas, interacciones de van der Waals o de apilamiento; por medio de una coordinación metal-ión, o a través del uso de análogos de purina.Another modification applicable to RNAi molecules is the chemical link to the RNAi molecule of one or more motifs or conjugates that improve the activity, cellular distribution, cellular uptake, bioavailability or stability of the aRni molecule. The polynucleotides can be synthesized or modified by methods well established in the art. Chemical modifications may include, but are not limited to, 2 'modifications, introduction of non-natural bases, covalent attachment to a ligand, and replacement of phosphate bonds with thiophosphate linkages. In this embodiment, the integrity of the duplex structure is strengthened by at least one, and typically two, chemical bonds. The chemical bond can be achieved by any of a variety of well-known techniques, for example by the introduction of covalent, ionic or hydrogen bonds; hydrophobic interactions, van der Waals or stacking interactions; by means of metal-ion coordination, or through the use of purine analogues.

En aún otra modalidad, los nucleótidos en una o ambas de las dos cadenas sencillas pueden modificarse para evitar o inhibir la activación de enzimas celulares, tales como, por ejemplo, sin limitación, determinadas nucleasas. Las técnicas para inhibir la activación de enzimas celulares se conocen en la técnica, incluyen, pero no se limitan a, modificaciones 2'-amino, modificaciones 2'-fluoro, modificaciones 2'-alquilo, modificaciones a la cadena principal no cargada, modificaciones morfolino, modificaciones 2'-O-metil, y fosforamidato. Así, al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos en un ARN bicatenario se reemplaza por un grupo químico. Además, al menos un nucleótido puede modificarse para formar un nucleótido bloqueado. Tal nucleótido bloqueado contiene un puente de metileno o etileno que conecta el oxígeno 2' de la ribosa con el carbono 4' de la ribosa. La introducción de un nucleótido bloqueado en un oligonucleótido mejora la afinidad por secuencias complementarias y aumenta la temperatura de fusión en varios grados.In yet another embodiment, the nucleotides in one or both of the two single chains can be modified to prevent or inhibit the activation of cellular enzymes, such as, for example, without limitation, certain nucleases. Techniques for inhibiting the activation of cellular enzymes are known in the art, include, but are not limited to, 2'-amino modifications, 2'-fluoro modifications, 2'-alkyl modifications, modifications to the uncharged backbone, modifications morpholino, 2'-O-methyl modifications, and phosphoramidate. Thus, at least one 2'-hydroxyl group of the nucleotides in a double-stranded RNA is replaced by a chemical group. In addition, at least one nucleotide can be modified to form a blocked nucleotide. Such a blocked nucleotide contains a methylene or ethylene bridge which connects the oxygen 2 'of the ribose with the carbon 4' of the ribose. The introduction of a blocked nucleotide into an oligonucleotide improves the affinity for complementary sequences and increases the melting temperature by several degrees.

Los ligandos pueden conjugarse a una molécula de ARNi, por ejemplo, para aumentar su absorción celular. En cierta modalidad, un ligando hidrófobo se conjuga a la molécula para facilitar la permeación directa de la membrana celular. Estos enfoques se han usado para facilitar la permeación celular de oligonucleótidos antisentido. En ciertos casos, la conjugación de un ligando catiónico a oligonucleótidos resulta frecuentemente en una resistencia mejorada a las nucleasas. Los ejemplos representativos de ligandos catiónicos incluyen propilamonio y dimetilpropilamonio. Los oligonucleótidos antisentido pueden retener su afinidad alta de unión al ARNm cuando el ligando catiónico está disperso en todo el oligonucleótido.Ligands can be conjugated to an RNAi molecule, for example, to increase their cellular uptake. In a certain embodiment, a hydrophobic ligand is conjugated to the molecule to facilitate direct permeation of the cell membrane. These approaches have been used to facilitate cellular permeation of antisense oligonucleotides. In certain cases, the conjugation of a cationic ligand to oligonucleotides often results in improved resistance to nucleases. Representative examples of cationic ligands include propylammonium and dimethylpropylammonium. Antisense oligonucleotides can retain their high binding affinity to mRNA when the cationic ligand is dispersed throughout the oligonucleotide.

Las moléculas y nucleótidos descritos en la presente descripción pueden prepararse mediante el uso de técnicas bien conocidas de síntesis en fase sólida. Cualquier otro medio conocido en la técnica para dicha síntesis puede emplearse adicionalmente o alternativamente.The molecules and nucleotides described in the present disclosure can be prepared by the use of well-known solid phase synthesis techniques. Any other means known in the art for said synthesis can be used additionally or alternatively.

Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión de NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión de NtMRP3) que comprenden polinucleótidos NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP que comprenden uno o más de: sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29, sec. con núm. de ident.: 51, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 30), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 31), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 32), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 33), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 34), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 35), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 36), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 37), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 38), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 39), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 40), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 41), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 42) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 43), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 44), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 45) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 46) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 47), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 48) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 49) o exón 11 (sec. con núm. de ident.: 50) y fragmentos de estos, y variantes de estos. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.Various embodiments are directed to NtMRP expression vectors (e.g., NtMRP3 expression vectors) comprising NtMRP polynucleotides or NtMRP RNAi constructs comprising one or more of: sec. with no. Ident. 28, sec. with no. Ident. 29, sec. with no. Ident .: 51, intron 1 (sec. with ID: 30), intron 2 (sec. with ID: 31), intron 3 (sec. with ID: 32) , Intron 4 (Sections with ID No. 33), Intron 5 (Sections with ID No. 34), Intron 6 (Sections with ID No. 35), Intron 7 (Secs. Identification Number: 36), Intron 8 (Sections with ID No. 37), Intron 9 (Sections with ID No. 38), Intron 10 (Seq. ident .: 39), exon 1 (sec. with ID number: 40), exon 2 (sec. with ID: 41), exon 3 (sec. with ID number: 42) exon 4 (sec. with ident. no .: 43), exon 5 (sec. with ident. no .: 44), exon 6 (sec. with ident. no .: 45) exon 7 (sec. Ident ID: 46) Exon 8 (Sections with Ident ID: 47), Exon 9 (Sections with Ident ID: 48) Exon 10 (Sections with ID: 49 ) or exon 11 (sec. with ident. no .: 50) and fragments thereof, and variants of these. As described in the present description, the reference to the specific sequences also includes the complement or inverse complement of these.

Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión de NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión de NtMRP4) que comprenden polinucleótidos NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP que comprenden uno o más de: sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 27, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 3), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 4), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 5), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 6), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 7), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 8), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 9), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 10), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 11), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 12), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 13), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 14), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 15) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 16), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 17), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 18) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 19) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 20), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 21) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 21), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 22) o sec. con núm. de ident.: 23 y fragmentos de estos y variantes de estos. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.Various embodiments are directed to NtMRP expression vectors (e.g., NtMRP4 expression vectors) comprising NtMRP polynucleotides or NtMRP RNAi constructs comprising one or more of: sec. with no. of ident .: 1, sec. with no. of ident .: 2, sec. with no. Ident .: 27, intron 1 (sec. with ID no .: 3), intron 2 (sec. with ID no .: 4), intron 3 (sec. with ID no .: 5) , intron 4 (sec. with ID no .: 6), intron 5 (sec. with ID no .: 7), intron 6 (sec. with ID no .: 8), intron 7 (sec. Identification Number: 9), Intron 8 (Sections with Identification No. 10), Intron 9 (Sections with Identification No. 11), Intron 10 (Seq. ident: 12), exon 1 (sec. with ID number: 13), exon 2 (sec. with ID number: 14), exon 3 (sec. with ID number: 15) exon 4 (sec. with ident. no .: 16), exon 5 (sec. with ident. no .: 17), exon 6 (sec. with ident. no .: 18) exon 7 (sec. Ident ID: 19) exon 8 (sec. with ident. no .: 20), exon 9 (sec. with ident. no .: 21) exon 10 (sec. with ident. no .: 21 ), exon 11 (sec. with ident. no .: 22) or sec. with no. Ident .: 23 and fragments of these and variants of these. As described in the present description, the reference to the specific sequences also includes the complement or inverse complement of these.

Diversas modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: uno o más polinucleótidos NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP3 o constructos de ARNi de NtMRP3) que tienen al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 30), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 31), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 32), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 33), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 34), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 35), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 36), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 37), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 38), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 39), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 40), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 41), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 42) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 43), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 44), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 45) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 46) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 47), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 48), exón 10 (sec. con núm. de ident.: 49), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 50) o sec. con núm. de ident.: 51 y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de estos. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.Various embodiments are directed to expression vectors comprising: one or more NtMRP polynucleotides or NtMRP RNAi constructs (e.g., NtMRP3 polynucleotide or NtMRP3 RNAi constructs) having at least 71%, 72%, 73%, 74% , 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% sequence identity with a sequence selected from the group consisting of: sec. with no. Ident. 28, sec. with no. Ident .: 29, intron 1 (sec. with ID: 30), intron 2 (sec. with ID: 31), intron 3 (sec. with ID: 32) , Intron 4 (Sections with ID No. 33), Intron 5 (Sections with ID No. 34), Intron 6 (Sections with ID No. 35), Intron 7 (Secs. Identification Number: 36), Intron 8 (Sections with ID No. 37), Intron 9 (Sections with ID No. 38), Intron 10 (Seq. ident .: 39), exon 1 (sec. with ID number: 40), exon 2 (sec. with ID: 41), exon 3 (sec. with ID number: 42) exon 4 (sec. with ident. no .: 43), exon 5 (sec. with ident. no .: 44), exon 6 (sec. with ident. no .: 45) exon 7 (sec. Ident ID: 46) Exon 8 (Sections with Ident ID: 47), Exon 9 (Sections with ID No. 48), Exon 10 (Sections with Ident. 49), exon 11 (sec. With ident. No .: 50) or sec. with no. Ident .: 51 and fragments of these, and variants of these or a combination of two or more of these. As described in the present description, the reference to the specific sequences also includes the complement or inverse complement of these.

Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: polinucleótido NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP4 o constructos de ARNi de NtMRP4) que tienen al menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 3), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 4), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 5), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 6), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 7), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 8), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 9), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 10), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 11), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 12), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 13), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 14), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 15) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 16), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 17), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 18) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 19) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 20), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 21) exón 10 (sec. con núm. de ident.: 21), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 22) o sec. con núm. de ident.: 23 y fragmentos de estas, y variantes de estas o una combinación de dos o más de estas. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.Several embodiments are directed to expression vectors comprising: NtMRP polynucleotide or NtMRP RNAi constructs (e.g., NtMRP4 polynucleotide or NtMRP4 RNAi constructs) having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74% , 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% sequence identity with a sequence selected from the group consisting of: sec. with no. of ident .: 1, sec. with no. Ident .: 2, intron 1 (sec. with ID number: 3), intron 2 (sec. with ID number: 4), intron 3 (sec. with ID number: 5) , intron 4 (sec. with ID no .: 6), intron 5 (sec. with ID no .: 7), intron 6 (sec. with ID no .: 8), intron 7 (sec. Identification Number: 9), Intron 8 (Sections with Identification No. 10), Intron 9 (Sections with Identification No. 11), Intron 10 (Seq. ident: 12), exon 1 (sec. with ID number: 13), exon 2 (sec. with ID number: 14), exon 3 (sec. with ID number: 15) exon 4 (sec. with ident. no .: 16), exon 5 (sec. with ident. no .: 17), exon 6 (sec. with ident. no .: 18) exon 7 (sec. Ident ID: 19) exon 8 (sec. with ident. no .: 20), exon 9 (sec. with ident. no .: 21) exon 10 (sec. with ident. no .: 21 ), exon 11 (sec. with ident. no .: 22) or sec. with no. Ident .: 23 and fragments of these, and variants of these or a combination of two or more of these. As described in the present description, the reference to the specific sequences also includes the complement or inverse complement of these.

Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: polinucleótido NtMRP o constructo de ARNi de NtMRP que codifica polinucleótidos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP3 o constructos de ARNi de NtMRP3 que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP3) capaz de auto-aparearse para formar una estructura en horquilla, en la cual el constructo comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 30), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 31), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 32), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 33), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 34), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 35), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 36), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 37), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 38), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 39), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 40), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 41), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 42) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 43), exón 5 (sec. con núm. de ident.: 44) , exón 6 (sec. con núm. de ident.: 45) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 46), exón 8 (sec. con núm. de ident.: 47), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 48), exón 10 (sec. con núm. de ident.: 49), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 50) o sec. con núm. de ident.: 51 y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de estos; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador del que forma un lazo de la estructura en horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.Several embodiments are directed to expression vectors comprising: NtMRP polynucleotide or NtMRP RNAi construct encoding NtMRP RNAi polynucleotides (eg, NtMRP3 polynucleotide or NtMRP3 RNAi constructs encoding NtMRP3 RNAi polynucleotides) capable of self mating to form a hairpin structure, in which the construct comprises (a) a first sequence that is at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% , 96%, 97%, 98% and 99% sequence identity with a sequence selected from the group consisting of: sec. with no. Ident. 28, sec. with no. Ident .: 29, intron 1 (sec. with ID: 30), intron 2 (sec. with ID: 31), intron 3 (sec. with ID: 32) , Intron 4 (Sections with ID No. 33), Intron 5 (Sections with ID No. 34), Intron 6 (Sections with ID No. 35), Intron 7 (Secs. Identification Number: 36), Intron 8 (Sections with ID No. 37), Intron 9 (Sections with ID No. 38), Intron 10 (Seq. ident .: 39), exon 1 (sec. with ID number: 40), exon 2 (sec. with ID: 41), exon 3 (sec. with ID number: 42) exon 4 (sec. with ident. no .: 43), exon 5 (sec. with ident. no .: 44), exon 6 (sec. with ident. no .: 45) exon 7 (sec. ID No. 46), exon 8 (sec. with ID No. 47), exon 9 (sec. with ID No. 48), exon 10 (sec. with ident. : 49), exon 11 (sec. With ident. No .: 50) or sec. with no. Ident .: 51 and fragments of these, and variants of these or a combination of two or more of these; (b) a second sequence encoding a spacer element of which it forms a loop of the fork structure; and (c) a third sequence comprising an inverse complementary sequence of the first sequence, located in the same orientation as the first sequence, wherein the second sequence is located between the first sequence and the third, and the second sequence is operatively linked to the first sequence and the third sequence. As described in the present description, the reference to the specific sequences also includes the complement or inverse complement of these.

Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: polinucleótido NtMRP o constructo de ARNi de NtMRP que codifica polinucleótidos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP4 o constructos de ARNi de NtMRP4 que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP4) capaz de autoaparearse para formar una estructura en horquilla, en donde el constructo comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, intrón 1 (sec. con núm. de ident.: 3), intrón 2 (sec. con núm. de ident.: 4), intrón 3 (sec. con núm. de ident.: 5), intrón 4 (sec. con núm. de ident.: 6 ), intrón 5 (sec. con núm. de ident.: 7), intrón 6 (sec. con núm. de ident.: 8), intrón 7 (sec. con núm. de ident.: 9), intrón 8 (sec. con núm. de ident.: 10), intrón 9 (sec. con núm. de ident.: 11), intrón 10 (sec. con núm. de ident.: 12), exón 1 (sec. con núm. de ident.: 13), exón 2 (sec. con núm. de ident.: 14), exón 3 (sec. con núm. de ident.: 15) exón 4 (sec. con núm. de ident.: 16) , exón 5 (sec. con núm. de ident.: 17), exón 6 (sec. con núm. de ident.: 18) exón 7 (sec. con núm. de ident.: 19) exón 8 (sec. con núm. de ident.: 20), exón 9 (sec. con núm. de ident.: 21) exon 10 (sec. con núm. de ident.: 21), exón 11 (sec. con núm. de ident.: 22), sec. con núm. de ident.: 23 o sec. con núm. de ident.: 51 y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de los mismos; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador del que forma un lazo de la estructura en horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.Various embodiments are directed to expression vectors comprising: NtMRP polynucleotide or NtMRP RNAi construct encoding NtMRP RNAi polynucleotides (e.g., NtMRP4 polynucleotide or NtMRP4 RNAi constructs encoding NtMRP4 RNAi polynucleotides) capable of autopairing to forming a hairpin structure, wherein the construct comprises (a) a first sequence that has at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% , 97%, 98% and 99% sequence identity with a sequence selected from the group consisting of: sec. with no. of ident .: 1, sec. with no. Ident .: 2, intron 1 (sec. with ID number: 3), intron 2 (sec. with ID number: 4), intron 3 (sec. with ID number: 5) , intron 4 (sec. with ID no .: 6), intron 5 (sec. with ID no .: 7), intron 6 (sec. with ID no .: 8), intron 7 (sec. Identification Number: 9), Intron 8 (Sections with Identification No. 10), Intron 9 (Sections with Identification No. 11), Intron 10 (Seq. ident: 12), exon 1 (sec. with ID number: 13), exon 2 (sec. with ID number: 14), exon 3 (sec. with ID number: 15) exon 4 (sec. with ident. no .: 16), exon 5 (sec. with ident. no .: 17), exon 6 (sec. with ident. no .: 18) exon 7 (sec. Ident ID: 19) exon 8 (sec. with ident. no .: 20), exon 9 (sec. with ident. no .: 21) exon 10 (sec. With ident. No .: 21), exon 11 (sec. With ident. No .: 22), sec. with no. Ident. 23 or sec. with no. Ident .: 51 and fragments thereof, and variants thereof or a combination of two or more thereof; (b) a second sequence encoding a spacer element of which it forms a loop of the fork structure; and (c) a third sequence comprising an inverse complementary sequence of the first sequence, located in the same orientation as the first sequence, wherein the second sequence is located between the first sequence and the third, and the second sequence is operatively linked to the first sequence and the third sequence. As described in the present description, the reference to the specific sequences also includes the complement or inverse complement of these.

Las secuencias descritas pueden usarse para construir diversos polinucleótidos NtMRP que no forman estructuras en horquilla. Por ejemplo, un ARN bicatenario de NtMRP puede formarse mediante (1) transcribir una primera cadena del ADNc de NtMRP mediante la unión operativa a un primer promotor, y (2) transcribir la secuencia complementaria inversa de la primera cadena del fragmento de ADNc de NtMRP mediante la unión operativa a un segundo promotor. Cada cadena del polinucleótido NtMRP puede transcribirse a partir del mismo vector de expresión, o a partir de vectores de expresión diferentes. El dúplex de ARN de NtMRP que tiene actividad de interferencia del ARN puede convertirse enzimáticamente a ARNip para reducir los niveles de ARN de NtMRP. The described sequences can be used to construct various NtMRP polynucleotides that do not form hairpin structures. For example, a double stranded RNA of NtMRP can be formed by (1) transcribing a first strand of the NtMRP cDNA by operative binding to a first promoter, and (2) transcribing the reverse complementary sequence of the first strand of the NtMRP cDNA fragment. by operative binding to a second promoter. Each NtMRP polynucleotide chain can be transcribed from the same expression vector, or from different expression vectors. The NtMRP RNA duplex having RNA interference activity can be enzymatically converted to siRNA to reduce NtMRP RNA levels.

Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión de NtMRP que comprenden polinucleótidos NtMRP o constructos de ARNi de NtMRP que codifican polinucleótidos de a Rní de NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión de NtMRP3 que comprenden polinucleótidos NtMRP3 o constructos de ARNi de NtMRP3 que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP3) capaces de autoaparearse, en los cuales el constructo comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos el 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de secuencia identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29, sec. con núm. de ident.: 30, sec. con núm. de ident.: 31, sec. con núm. de ident.: 32, sec. con núm. de ident.: 33, sec. con núm. de ident.: 34, sec. con núm. de ident.: 35, sec. con núm. de ident.: 36, sec. con núm. de ident.: 37, sec. con núm. de ident.: 38, sec. con núm. de ident.: 39, sec. con núm. de ident.: 40, sec. con núm. de ident.: 41, sec. con núm. de ident.: 42, sec. con núm. de ident.: 43, sec. con núm. de ident.: 44, sec. con núm. de ident.: 45, sec. con núm. de ident.: 46, sec. con núm. de ident.: 47, sec. con núm. de ident.: 48, sec. con núm. de ident.: 49, sec. con núm. de ident.: 50 y sec. con núm. de ident.: 51, y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de estos; y (b) una segunda secuencia que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, complementaria inversa) de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.Several embodiments are directed to NtMRP expression vectors comprising NtMRP polynucleotides or NtMRP RNAi constructs encoding NtMRP a R ní polynucleotides (e.g., NtMRP3 expression vectors comprising NtMRP3 polynucleotides or NtMRP3 RNAi constructs encoding NtMRP3. ntMRP3 RNAi polynucleotides) capable of autopairing, in which the construct comprises (a) a first sequence that has at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to a sequence selected from the group consisting of: sec. with no. Ident. 28, sec. with no. Ident. 29, sec. with no. Ident. 30, sec. with no. Ident. 31, sec. with no. Ident. 32, sec. with no. Ident. 33, sec. with no. Ident. 34, sec. with no. Ident. 35, sec. with no. Ident. 36, sec. with no. Ident. 37, sec. with no. Ident. 38, sec. with no. Ident. 39, sec. with no. Ident. 40, sec. with no. Ident. 41, sec. with no. Ident. 42, sec. with no. Ident. 43, sec. with no. Ident. 44, sec. with no. Ident. 45, sec. with no. Ident. 46, sec. with no. Ident. 47, sec. with no. Ident. 48, sec. with no. Ident. 49, sec. with no. Ident .: 50 and sec. with no. Ident .: 51, and fragments of these, and variants of these or a combination of two or more of these; and (b) a second sequence comprising a complementary sequence (eg, inverse complementary) of the first sequence, located in the same orientation as the first sequence. As described in the present description, the reference to the specific sequences also includes the complement or inverse complement of these.

Otras modalidades se dirigen a vectores de expresión de NtMRP que comprenden polinucleótidos NtMRP, constructos de ARNi de NtMRP que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión de NtMRP4 que comprenden polinucleótidos NtMRP4 o constructos de ARNi de NtMRP4 que codifican polinucleótidos de ARNi de NtMRP4) capaces de autoaparearse, en los cuales el constructo comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos el 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de secuencia identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 3, sec. con núm. de ident.: 4, sec. con núm. de ident.: 5, sec. con núm. de ident.: 6, sec. con núm. de ident.: 7, sec. con núm. de ident.: 8, sec. con núm. de ident.: 9, sec. con núm. de ident.: 10, sec. con núm. de ident.: 11, sec. con núm. de ident.: 12, sec. con núm. de ident.: 13, sec. con núm. de ident.: 14, sec. con núm. de ident.: 15, sec. con núm. de ident.: 16, sec. con núm. de ident.: 17, sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 19, sec. con núm. de ident.: 20, sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident.: 21, sec. con núm. de ident.: 22, sec. con núm. de ident.: 23 y sec. con núm. de ident.: 27 y fragmentos de estos, y variantes de estos o una combinación de dos o más de estos; y (b) una segunda secuencia que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, complementaria inversa) de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia. Como se describe en la presente descripción, la referencia a las secuencias específicas incluye, además, el complemento o complemento inverso de estas.Other embodiments are directed to NtMRP expression vectors comprising NtMRP polynucleotides, NtMRP RNAi constructs encoding NtMRP RNAi polynucleotides (e.g., NtMRP4 expression vectors comprising NtMRP4 polynucleotides or NtMRP4 RNAi constructs encoding NtMRP4 polynucleotides). RNAi of NtMRP4) capable of self-repairing, in which the construct comprises (a) a first sequence that has at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to a sequence selected from the group consisting of: sec. with no. of ident .: 1, sec. with no. of ident .: 2, sec. with no. of ident .: 3, sec. with no. of ident .: 4, sec. with no. of ident .: 5, sec. with no. Ident. 6, sec. with no. Ident. 7, sec. with no. Ident. 8, sec. with no. Ident. 9, sec. with no. Ident. 10, sec. with no. Ident. 11, sec. with no. Ident. 12, sec. with no. of ident .: 13, sec. with no. Ident. 14, sec. with no. Ident. 15, sec. with no. Ident. 16, sec. with no. Ident. 17, sec. with no. Ident. 18, sec. with no. Ident. 19, sec. with no. Ident. 20, sec. with no. Ident. 21, sec. with no. Ident. 21, sec. with no. Ident. 22, sec. with no. Ident. 23 and sec. with no. Ident .: 27 and fragments of these, and variants of these or a combination of two or more of these; and (b) a second sequence comprising a complementary sequence (eg, inverse complementary) of the first sequence, located in the same orientation as the first sequence. As described in the present description, the reference to the specific sequences also includes the complement or inverse complement of these.

Se proporcionan diversas composiciones y métodos para modular (por ejemplo, reducir) los niveles de expresión endógenos para miembros de la familia de genes NtMRP mediante la promoción de la cosupresión de la expresión génica de NtMRP. El fenómeno de cosupresión se produce como un resultado de introducir múltiples copias de un transgén en una célula vegetal huésped. La integración de múltiples copias de un transgén puede resultar en una expresión reducida del transgén y el gen objetivo endógeno. El grado de cosupresión depende del grado de identidad de secuencias entre el transgén y el gen objetivo endógeno. El silenciamiento de ambos, el gen endógeno y el transgén, puede producirse por metilación extensa de los loci silenciados (es decir, el promotor endógeno y el gen endógeno de interés) que puede impedir la transcripción. Alternativamente, en algunos casos, la cosupresión del gen endógeno y el transgén puede producirse mediante silenciamiento génico post transcripcional ("PTGS"), en la cual los transcritos pueden producirse pero el aumento de las tasas de degradación impide la acumulación de transcritos. El mecanismo para la cosupresión mediante PTGS parece asemejarse a la interferencia por ARN, en que el ARN parece ser tanto un cebador importante como un objetivo en estos procesos, y puede mediarse al menos en parte por la misma maquinaria molecular, a través posiblemente de la degradación de los ARNm guiada por ARN. Various compositions and methods are provided to modulate (e.g., reduce) endogenous expression levels for members of the NtMRP gene family by promoting the co-suppression of NtMRP gene expression. The phenomenon of cosuppression occurs as a result of introducing multiple copies of a transgene into a host plant cell. The integration of multiple copies of a transgene can result in reduced expression of the transgene and the endogenous target gene. The degree of cosuppression depends on the degree of sequence identity between the transgene and the endogenous target gene. The silencing of both the endogenous gene and the transgene can be produced by extensive methylation of the silenced loci (i.e., the endogenous promoter and the endogenous gene of interest) that can prevent transcription. Alternatively, in some cases, the co-suppression of the endogenous gene and the transgene can be produced by post-transcriptional gene silencing ("PTGS"), in which transcripts can occur but increased rates of degradation prevent the accumulation of transcripts. The mechanism for cosuppression by PTGS seems to resemble RNA interference, in that RNA appears to be both an important primer and an objective in these processes, and can be mediated at least in part by the same molecular machinery, possibly through the degradation of mRNAs guided by RNA.

La cosupresión del polinucleótido de NtMRP puede lograrse mediante la integración de múltiples copias del ADNc de NtMRP o fragmentos de este, como transgenes, en el genoma de una planta de interés. La planta huésped puede transformarse con un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente al ADNc de NtMRP o fragmentos de este. Diversas modalidades se dirigen a vectores de expresión para promover la cosupresión de genes endógenos de NtMRP que comprenden: un promotor unido operativamente a NtMRP (por ejemplo, ADNc de NtMRP) identificado como sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 28, sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o un fragmento de esta - tal como cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o de 30 a 50 - o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con ellas.Co-suppression of the NtMRP polynucleotide can be achieved by integrating multiple copies of the NtMRP cDNA or fragments thereof, such as transgenes, into the genome of a plant of interest. The host plant can be transformed with an expression vector comprising a promoter operably linked to the NtMRP cDNA or fragments thereof. Various embodiments are directed to expression vectors to promote the co-suppression of endogenous NtMRP genes comprising: a promoter operably linked to NtMRP (e.g., NtMRP cDNA) identified as sec. with no. of ident .: 1, sec. with no. of ident .: 2, sec. with no. Ident. 28, sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51 or a fragment of this - such as any of secs. with numbers Ident .: 3 to 23 or 30 to 50 - or a variant of these that has at least approximately 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with them.

Varias modalidades se dirigen a métodos para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) el nivel de expresión de polinucleótido NtMRP mediante la integración de múltiples copias de polinucleótido NtMRP (por ejemplo, ADNc de NtMRP) identificado como sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o un fragmento de estas - tal como cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o de 30 a 50 - o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con estas en el genoma de una planta, que comprende: transformar una célula vegetal huésped con un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente a sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o un fragmento de estas - tal como cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o de 30 a 50 - o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con ellas.Several embodiments are directed to methods for modulating (e.g., reducing or inhibiting) the expression level of NtMRP polynucleotide by integrating multiple copies of NtMRP polynucleotide (e.g., NtMRP cDNA) identified as sec. with no. of ident .: 1, sec. with no. of ident .: 2, sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51 or a fragment of these - such as any of secs. with numbers Ident .: 3 to 23 or 30 to 50 - or a variant of these that has at least approximately 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of sequence identity with these in the genome of a plant, which comprises: transforming a host plant cell with an expression vector comprising a promoter operably linked to sec. with no. of ident .: 1, sec. with no. of ident .: 2, sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51 or a fragment of these - such as any of secs. with numbers Ident .: 3 to 23 or 30 to 50 - or a variant of these that has at least approximately 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with them.

Se proporcionan diversas composiciones y métodos para reducir el nivel de expresión génica endógena de NtMRP mediante la inhibición de la traducción de ARNm de NtMRP. Una célula vegetal huésped puede transformarse con un vector de expresión que comprende: un promotor unido operativamente a un polinucleótido NtMRP o una variante o fragmento de este, ubicado en orientación antisentido con respecto al promotor para permitir la expresión de polinucleótidos de ARN que tienen una secuencia complementaria a una porción de ARNm de NtMRP.Various compositions and methods are provided for reducing the level of endogenous gene expression of NtMRP by inhibiting the translation of NtMRP mRNA. A host plant cell can be transformed with an expression vector comprising: a promoter operably linked to an NtMRP polynucleotide or a variant or fragment thereof located in antisense orientation with respect to the promoter to allow the expression of RNA polynucleotides having a sequence complementary to a portion of NtMRP mRNA.

Diversos vectores de expresión para inhibir la traducción de ARNm de NtMRP pueden comprender: un promotor unido operativamente a NtMRP (por ejemplo, ADNc de NtMRP) identificada como sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.: 2 o sec. con núm. de ident.: 27 o sec. con núm. de ident.: 28 o sec. con núm. de ident.: 29 o sec. con núm. de ident.: 51 o un fragmento de estas - tales como cualquiera de secs. con núms. de ident.: 3 a 23 o de 30 a 50 - o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con ellas en los cuales la secuencia se ubica en orientación antisentido con respecto al promotor. Las longitudes de los polinucleótidos de ARN de NtMRP antisentido pueden variar, y pueden ser de aproximadamente 15-20 nucleótidos, aproximadamente 20-30 nucleótidos, aproximadamente 30-50 nucleótidos, aproximadamente 50-75 nucleótidos, aproximadamente 75-100 nucleótidos, aproximadamente 100-150 nucleótidos, aproximadamente 150-200 nucleótidos, y aproximadamente 200-300 nucleótidos.Various expression vectors to inhibit translation of NtMRP mRNA may comprise: a promoter operably linked to NtMRP (e.g., NtMRP cDNA) identified as sec. with no. Ident .: 1 or sec. with no. Ident .: 2 or sec. with no. Ident. 27 or sec. with no. Ident. 28 or sec. with no. Ident. 29 or sec. with no. Ident .: 51 or a fragment of these - such as any of secs. with numbers Ident .: 3 to 23 or 30 to 50 - or a variant of these that has at least approximately 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of sequence identity with them in which the sequence is located in antisense orientation with respect to the promoter. The lengths of the antisense NtMRP RNA polynucleotides can vary, and can be from about 15-20 nucleotides, about 20-30 nucleotides, about 30-50 nucleotides, about 50-75 nucleotides, about 75-100 nucleotides, about 100- 150 nucleotides, approximately 150-200 nucleotides, and approximately 200-300 nucleotides.

Se proporcionan, además, métodos para obtener polinucleótidos y polipéptidos NtMRP mutantes. Cualquier planta de interés, lo que incluye una célula vegetal o material vegetal puede modificarse genéticamente por diversos métodos conocidos para inducir mutagénesis, lo que incluye mutagénesis dirigida a un sitio, mutagénesis dirigida a un oligonucleótido, mutagénesis dirigida químicamente, mutagénesis dirigida por radiación, mutagénesis que usa bases modificadas, mutagénesis que usa ADN híbrido con brechas, mutagénesis por ruptura de la doble cadena, mutagénesis que usa cepas huéspedes deficientes en la reparación, mutagénesis por síntesis génica total, barajado de ADN y otros métodos equivalentes.Methods for obtaining mutant NtMRP polynucleotides and polypeptides are further provided. Any plant of interest, including a plant cell or plant material, can be genetically modified by various methods known to induce mutagenesis, including site-directed mutagenesis, oligonucleotide-directed mutagenesis, chemically-directed mutagenesis, radiation-directed mutagenesis, mutagenesis using modified bases, mutagenesis using hybrid DNA with gaps, mutagenesis by double-strand break, mutagenesis using host strains deficient in repair, mutagenesis by total gene synthesis, DNA shuffling and other equivalent methods.

Alternativamente, el direccionamiento a los genes NtMRP puede ser por inactivación mediante la introducción de transposones (por ejemplo, elementos IS) en los genomas de plantas de interés. Estos elementos genéticos móviles pueden introducirse por fecundación cruzada sexual y los mutantes por inserción pueden tamizarse para determinar la pérdida de la actividad de proteína NtMRP, tal como una reducción del transporte de cadmio. El gen NtMRP interrumpido en una planta parental puede introducirse en otras plantas mediante el cruzamiento de la planta parental con una planta no sujeta a mutagénesis inducida por transposones mediante, por ejemplo, fertilización cruzada sexual. Puede usarse cualquier técnica de mejoramiento estándar conocida por los expertos en la técnica.Alternatively, targeting to NtMRP genes can be by inactivation by introducing transposons (eg, IS elements) into the genomes of plants of interest. These mobile genetic elements can be introduced by sexual cross-fertilization and the insertion mutants can be screened for loss of NtMRP protein activity, such as a reduction in cadmium transport. The interrupted NtMRP gene in a parent plant can be introduced into other plants by crossing the parent plant with a plant not subject to transposon-induced mutagenesis by, for example, sexual cross-fertilization. Any standard breeding technique known to those skilled in the art can be used.

En una modalidad, uno o más genes relacionados con NtMRP pueden inactivarse mediante la inserción de uno o más transposones. Las mutaciones pueden resultar en interrupción homocigótica de uno o más genes NtMRP, en interrupción heterocigótica de uno o más genes NtMRP, o una combinación de ambas interrupciones homocigótica y heterocigótica si se interrumpe más de un gen NtMRP. Los elementos transponibles adecuados pueden seleccionarse de dos amplias clases, designadas como Clase I y Clase II. Los elementos transponibles de Clase I adecuados incluyen retrotransposones, retroposones, y elementos similares a SINE. Tales métodos se conocen por los expertos en la técnica. In one embodiment, one or more genes related to NtMRP can be inactivated by the insertion of one or more transposons. Mutations may result in homozygous disruption of one or more NtMRP genes, in heterozygous disruption of one or more NtMRP genes, or a combination of both homozygous and heterozygous interruptions if more than one NtMRP gene is disrupted. Suitable transposable elements can be selected from two broad classes, designated as Class I and Class II. Appropriate Class I transposable elements include retrotransposons, retroposons, and SINE-like elements. Such methods are known to those skilled in the art.

Alternativamente, el direccionamiento a los genes NtMRP puede ser por inactivación mediante la introducción de ribozimas derivadas a partir de un número de ARN circulares pequeños que son capaces de autoescindirse y replicarse en plantas. Estos ARN pueden replicarse lo mismo solos (ARN viroides) o con un virus auxiliar (ARN satélites). Los ejemplos de ARN adecuados incluyen los derivados del viroide del veteado marrón rojizo del aguacate y ARN satélites derivados de virus de la mancha de anillo del tabaco, virus del veteado transitorio de la alfalfa, virus del moteado del tabaco suave, virus del moteado nodoso de flor del género Solanum, y virus del moteado del trébol subterráneo. Varias ribozimas específicas de ARN objetivo se conocen por los expertos en la técnica.Alternatively, targeting the NtMRP genes can be by inactivation by introducing ribozymes derived from a number of small circular RNAs that are capable of self-sparing and replicating in plants. These RNAs can replicate themselves (viroid RNA) or with an auxiliary virus (RNA satellites). Examples of suitable RNAs include viroid derivatives of reddish-brown avocado vein and RNA satellites derived from tobacco ring stain virus, alfalfa transient vein virus, soft tobacco mottle virus, mottle virus nodosum flower of the genus Solanum, and mottled virus of the subterranean clover. Several specific RNA target ribozymes are known to those skilled in the art.

En algunas modalidades, la expresión de un polipéptido NtMRP se modula, reduce o inhibe por medios no transgénicos, tales como la creación de una mutación en un gen NtMRP, lo que incluye un gen NtMRP3 y/o NtMRP4. Los métodos que introducen una mutación de manera aleatoria en una secuencia génica pueden incluir mutagénesis química, mutagénesis EMS y mutagénesis por radiación. Los métodos que introducen una o más mutaciones dirigidas en una célula incluyen, pero no se limitan a tecnología de edición de genomas, particularmente la mutagénesis mediada por nucleasas con dedos de zinc, direccionamiento a lesiones locales inducidas en genomas (tilling), recombinación homóloga, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, y mutagénesis mediada por meganucleasas.In some embodiments, the expression of an NtMRP polypeptide is modulated, reduced or inhibited by non-transgenic means, such as the creation of a mutation in an NtMRP gene, which includes an NtMRP3 and / or NtMRP4 gene. Methods that randomly introduce a mutation into a gene sequence can include chemical mutagenesis, EMS mutagenesis, and radiation mutagenesis. Methods that introduce one or more targeted mutations in a cell include, but are not limited to, genome-editing technology, particularly nuclease-mediated mutagenesis with zinc fingers, targeting to local lesions induced in genomes (tilling), homologous recombination, oligonucleotide-directed mutagenesis, and meganuclease-mediated mutagenesis.

Algunos ejemplos de mutaciones son deleciones, inserciones y mutaciones sin sentido de al menos un nucleótido, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y una repetición de una secuencia simple. Después de la mutación, puede realizarse el tamizaje para identificar deleciones que crean codones de parada prematuros o de cualquier otra manera genes no funcionales de NtMRP. El tamizaje de mutantes puede llevarse a cabo mediante secuenciación, o mediante el uso de una o más sondas o cebadores específicos para el gen o proteína NtMRP. Además, pueden crearse mutaciones específicas en polinucleótidos NtMRP que pueden dar como resultado una expresión disminuida del gen NtMRP, disminución de la estabilidad del ARNm de NtMRP o disminución de la estabilidad de la proteína NtMRP. Dichas plantas se refieren en la presente descripción como plantas "de origen no natural" o plantas mutantes.Some examples of mutations are deletions, insertions and nonsense mutations of at least one nucleotide, polymorphisms of a single nucleotide (SNP) and a repetition of a single sequence. After the mutation, screening can be performed to identify deletions that create premature stop codons or in any other way non-functional genes of NtMRP. Mutant screening can be carried out by sequencing, or by using one or more probes or primers specific for the NtMRP gene or protein. In addition, specific mutations can be created in NtMRP polynucleotides that can result in decreased expression of the NtMRP gene, decrease in the stability of the NtMRP mRNA or decrease in the stability of the NtMRP protein. Said plants are referred to in the present description as "non-natural" plants or mutant plants.

Las plantas mutantes y de origen no natural pueden tener cualquier combinación de una o más mutaciones que da como resultado niveles de polipéptido NtMRP reducidos. Por ejemplo, las plantas pueden tener una única mutación en un solo gen NtMRP o mutaciones múltiples en un solo gen NtMRP. En consecuencia, se describen plantas mutantes o de origen no natural (por ejemplo, plantas de tabaco mutantes, de origen no natural o transgénicas y similares, como se describen en la presente descripción) que comprenden las variantes de polipéptidos mutantes de NtMRP, NtMRP3 y NtMRP4.Mutant and non-naturally occurring plants can have any combination of one or more mutations that results in reduced NtMRP polypeptide levels. For example, plants may have a single mutation in a single NtMRP gene or multiple mutations in a single NtMRP gene. Accordingly, mutant or non-naturally occurring plants (for example, mutant, non-natural or transgenic tobacco plants and the like, as described in the present description) are described which comprise the variants of mutant polypeptides of NtMRP, NtMRP3 and NtMRP4.

Se describe que se produce mutagénesis en semillas de plantas y después se cultivan para obtener plantas mutantes de la primera generación. Después, se deja que las plantas de la primera generación se autopolinicen y las semillas de la planta de la primera generación se cultivan para obtener plantas de la segunda generación, que después se analizan en busca de mutaciones en sus loci de NtMRP. Aunque el material vegetal con mutaciones puede analizarse en busca de mutaciones, una ventaja del análisis de las plantas de la segunda generación es que todas las mutaciones somáticas corresponden a mutaciones de la línea germinal. Un experto en la técnica comprenderá que una variedad de materiales vegetales, lo que incluye pero no se limita a, semillas, polen, tejido vegetal o células vegetales, puede someterse a mutagénesis con el objetivo de crear las plantas mutadas de NtMRP. Sin embargo, el tipo de material vegetal que se somete a mutagénesis puede afectar cuando el polinucleótido vegetal se analiza en busca de mutaciones. Por ejemplo, cuando el polen se somete a mutagénesis antes de la polinización de una planta sin mutaciones, las semillas que resultan de esa polinización se cultivan para obtener plantas de la primera generación. Cada célula de las plantas de la primera generación contendrán mutaciones creadas en el polen; así estas plantas de la primera generación pueden analizarse después en busca de mutaciones de NtMRP en lugar de esperar hasta la segunda generación.It is described that mutagenesis occurs in plant seeds and then they are grown to obtain mutant plants of the first generation. Then, the plants of the first generation are allowed to self-pollinate and the seeds of the first-generation plant are grown to obtain plants of the second generation, which are then analyzed for mutations in their NtMRP loci. Although plant material with mutations can be analyzed for mutations, an advantage of second-generation plant analysis is that all somatic mutations correspond to germline mutations. One skilled in the art will understand that a variety of plant materials, including but not limited to seeds, pollen, plant tissue or plant cells, can be mutagenized with the aim of creating the mutated plants of NtMRP. However, the type of plant material that undergoes mutagenesis can affect when the plant polynucleotide is analyzed for mutations. For example, when pollen is subjected to mutagenesis before pollination of a plant without mutations, the seeds resulting from that pollination are grown to obtain plants of the first generation. Each cell of the first generation plants will contain mutations created in the pollen; thus, these first generation plants can then be analyzed for NtMRP mutations instead of waiting until the second generation.

Los mutágenos que crean principalmente mutaciones puntuales y deleciones, inserciones, transversiones, y/o transiciones cortas, lo que incluye mutágenos químicos o radiación, pueden usarse para crear las mutaciones. Los mutágenos incluyen, pero no se limitan a, metanosulfato de etilo (e Ms ), sulfonato de metilmetano (MMS), N-etil-N-nitrosourea (ENU), trietilmelamina (TEM), N-metil-N-nitrosourea (MNU), procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietilo, monómero de acrilamida, melfalano, mostaza de nitrógeno, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-nitrosoguanidina (MNNG), nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno (DMBA), óxido de etileno, hexametilfosforamida, bisulfano, diepoxialcanos (diepoxioctano (DEO), diepoxibutano (BEB), y similares), dihidrocloruro 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)aminopropilamino]acridina (ICR-170) y formaldehído. Además, se contemplan las mutaciones espontáneas en el locus de NtMRP que pueden no haber sido causadas directamente por el mutágeno siempre y cuando resulten en el fenotipo deseado descrito en la presente descripción. Los agentes mutagénicos adecuados incluyen además, por ejemplo, radiación ionizante - tal como rayos X, rayos gamma, radiación con neutrones rápidos y radiación UV.Mutagens that create mainly point mutations and deletions, insertions, transversions, and / or short transitions, which includes chemical mutagens or radiation, can be used to create the mutations. Mutagens include, but are not limited to, ethyl methanesulfate (e Ms), methyl methane sulfonate (MMS), N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), triethylmelamine (TEM), N-methyl-N-nitrosourea (MNU) ), procarbazine, chlorambucil, cyclophosphamide, diethyl sulfate, acrylamide monomer, melphalan, nitrogen mustard, vincristine, dimethylnitrosamine, N-methyl-N'-nitro-nitrosoguanidine (MNNG), nitrosoguanidine, 2-aminopurine, 7,12 dimethyl -benz (a) anthracene (DMBA), ethylene oxide, hexamethylphosphoramide, bisulfan, diepoxyalkanes (diepoxyoctane (DEO), diepoxybutane (BEB), and the like), 2-methoxy-6-chloro-9 [3- (ethyl-) dihydrochloride 2-Chloro-ethyl) aminopropylamino] acridine (ICR-170) and formaldehyde. In addition, spontaneous mutations at the NtMRP locus that may not have been caused directly by the mutagen are contemplated as long as they result in the desired phenotype described in the present disclosure. Suitable mutagenic agents further include, for example, ionizing radiation - such as X-rays, gamma rays, fast neutron radiation and UV radiation.

Cualquier método de preparación de polinucleótidos vegetales, conocido por los expertos en la técnica, puede usarse para preparar el polinucleótido vegetal para el tamizaje de mutaciones de NtMRP. Any method of preparing plant polynucleotides, known to those skilled in the art, can be used to prepare the plant polynucleotide for screening for NtMRP mutations.

El polinucleótido preparado a partir de plantas individuales puede mezclarse opcionalmente para acelerar el tamizaje de mutaciones en el gen NtMRP de toda la población de plantas que se originan a partir del tejido vegetal sometido a mutagénesis. Pueden tamizarse una o más generaciones posteriores de plantas, células vegetales o material vegetal. El tamaño del grupo mezclado opcionalmente depende de la sensibilidad del método de tamizaje usado. The polynucleotide prepared from individual plants can optionally be mixed to accelerate the screening of mutations in the NtMRP gene of the entire population of plants that originate from the plant tissue subjected to mutagenesis. One or more subsequent generations of plants, plant cells or plant material can be screened. The size of the mixed group optionally depends on the sensitivity of the screening method used.

Después que las muestras de polinucleótidos se agrupan opcionalmente, pueden someterse a técnicas de amplificación específicas de polinucleótidos NtMRP, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Pueden usarse cualquiera o más cebadores o sondas específicos para el gen NtMRP o las secuencias adyacentes inmediatamente al gen NtMRP para amplificar las secuencias de NtMRP dentro de la muestra de polinucleótidos mezclada. Preferentemente, el uno o más cebadores o sondas se diseñan para amplificar las regiones del locus NtMRP donde es más probable que surjan mutaciones útiles. Con la máxima preferencia, el uno o más cebadores o sondas se diseñan para detectar mutaciones dentro de las regiones exónicas del polinucleótido NtMRP. Además, se prefiere que el uno o más cebadores o sondas eviten los sitios polimórficos conocidos para facilitar el tamizaje de las mutaciones puntuales. Para facilitar la detección de los productos de amplificación, el uno o más cebadores o sondas pueden marcarse con el uso de cualquier método de marcaje convencional. Uno o más cebadores o sondas pueden diseñarse en base a las secuencias de NtMRP descritas en la presente descripción mediante el uso de métodos que se conocen bien en la técnica. Los polimorfismos pueden identificarse por medios conocidos en la técnica.After the polynucleotide samples are optionally clustered, they can be subjected to specific amplification techniques of NtMRP polynucleotides, such as the polymerase chain reaction (PCR). Any one or more primers or probes specific for the NtMRP gene or the sequences immediately adjacent to the NtMRP gene can be used to amplify the NtMRP sequences within the mixed polynucleotide sample. Preferably, the one or more primers or probes are designed to amplify the regions of the NtMRP locus where useful mutations are most likely to arise. Most preferably, the one or more primers or probes are designed to detect mutations within the exonic regions of the NtMRP polynucleotide. Furthermore, it is preferred that the one or more primers or probes avoid the known polymorphic sites to facilitate the screening of point mutations. To facilitate the detection of the amplification products, the one or more primers or probes can be labeled with the use of any conventional labeling method. One or more primers or probes can be designed based on the NtMRP sequences described in the present disclosure by using methods that are well known in the art. Polymorphisms can be identified by means known in the art.

En un aspecto adicional se proporciona un método para preparar una planta mutante. El método implica proporcionar al menos una célula de una planta que comprende un gen que codifica un polipéptido NtMRP funcional. Seguidamente, al menos una célula de la planta se trata en condiciones eficaces para modular la actividad del gen NtMRP. La al menos una célula vegetal mutante se propaga después para obtener una planta mutante, donde la planta mutante tiene un nivel modulado del (de los) polipéptido(s) de NtMRP en comparación con el de una planta control. En una modalidad de este método para crear una planta mutante, la etapa de tratamiento implica someter al menos una célula a un agente mutagénico químico como se describió anteriormente y en condiciones efectivas para obtener al menos una célula vegetal mutante. En otra modalidad de este método, la etapa de tratamiento implica someter al menos una célula a una fuente de radiación en condiciones efectivas para obtener al menos una célula vegetal mutante. El término "planta mutante" incluye plantas mutantes en las cuales el genotipo se modifica en comparación con una planta control, convenientemente por medios diferentes a la ingeniería genética o modificación genética.In a further aspect, a method for preparing a mutant plant is provided. The method involves providing at least one cell of a plant comprising a gene encoding a functional NtMRP polypeptide. Next, at least one cell of the plant is treated under effective conditions to modulate the activity of the NtMRP gene. The at least one mutant plant cell is then propagated to obtain a mutant plant, wherein the mutant plant has a modulated level of the NtMRP polypeptide (s) compared to that of a control plant. In one embodiment of this method for creating a mutant plant, the treatment step involves subjecting at least one cell to a chemical mutagenic agent as described above and under conditions effective to obtain at least one mutant plant cell. In another embodiment of this method, the treatment step involves subjecting at least one cell to a radiation source under effective conditions to obtain at least one mutant plant cell. The term "mutant plant" includes mutant plants in which the genotype is modified in comparison with a control plant, conveniently by means other than genetic engineering or genetic modification.

En ciertas modalidades, la planta mutante será la misma o sustancialmente la misma que la planta antes de la mutagénesis.In certain embodiments, the mutant plant will be the same or substantially the same as the plant before mutagenesis.

En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden tener una o más mutaciones localizadas en más de una región de la planta - tal como dentro de la secuencia del polinucleótido NtMRP y en una o más regiones adicionales del genoma. De conformidad con esta modalidad, la secuencia genómica restante de la planta mutante no será la misma o no será esencialmente la misma que la planta antes de la mutagénesis. En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden no tener una o más mutaciones en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más exones del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más intrones del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en un promotor del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en la región 3' no traducida del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en la región 5' no traducida del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en la región de codificación del polinucleótido NtMRP; o puede no tener una o más mutaciones en la región no codificante del polinucleótido NtMRP; o cualquier combinación de dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más; o seis o más de partes de estos.In certain embodiments, the mutant plants may have one or more mutations located in more than one region of the plant - such as within the NtMRP polynucleotide sequence and in one or more additional regions of the genome. According to this embodiment, the remaining genomic sequence of the mutant plant will not be the same or will not be essentially the same as the plant before mutagenesis. In certain embodiments, the mutant plants may not have one or more mutations in one or more, two or more, three or more, four or more or five or more exons of the NtMRP polynucleotide; or it may not have one or more mutations in one or more, two or more, three or more, four or more or five or more introns of the NtMRP polynucleotide; or may not have one or more mutations in an NtMRP polynucleotide promoter; or may not have one or more mutations in the 3 'untranslated region of the NtMRP polynucleotide; or may not have one or more mutations in the 5 'untranslated region of the NtMRP polynucleotide; or it may not have one or more mutations in the coding region of the NtMRP polynucleotide; or may not have one or more mutations in the non-coding region of the NtMRP polynucleotide; or any combination of two or more, three or more, four or more, five or more; or six or more parts of these.

Las proteínas con dedos de zinc pueden usarse para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o la actividad de NtMRP. En varias modalidades, una secuencia de polinucleótido genómico que comprende una parte o toda la secuencia codificante del polinucleótido NtMRP se modifica por mutagénesis mediada por nucleasas con dedos de zinc. En la secuencia de polinucleótido genómico se busca un sitio único para la unión de proteínas con dedos de zinc. Alternativamente, en la secuencia de polinucleótido genómico se buscan dos sitios únicos para la unión de proteínas con dedos de zinc en donde ambos sitios están en cadenas opuestas y muy juntos, por ejemplo, separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pares de bases. En consecuencia, se proporcionan las proteínas con dedos de zinc que se unen a los polinucleótidos NtMRP. Un dominio o motivo de unión a ADN del dedos de zinc consiste en aproximadamente 30 aminoácidos que se pliegan en una estructura beta-beta-alfa de la cual la hélice alfa (a-hélice) se inserta en la doble hélice del a Dn . Una “hélice alfa” se refiere a un motivo en la estructura secundaria de una proteína que se enrolla a la derecha o a la izquierda en la cual el hidrógeno de cada grupo N-H de un aminoácido se une al grupo C=O de un aminoácido en la posición -4 con relación al primer aminoácido. Un “barril beta” (barril p) como se usa en la presente se refiere a un motivo en la estructura secundaria de una proteína que comprende dos cadenas beta (cadenas p) en las cuales la primera cadena se une por hidrógeno a una segunda cadena para formar una estructura cerrada. Una “estructura beta-beta-alfa” como se usa en la presente se refiere a una estructura en una proteína que consiste en un barril p que comprende dos cadenas p antiparalelas y una hélice a. El término “dominio con dedos de zinc de unión al ADN” se refiere a un dominio de proteína que comprende un ion de zinc y es capaz de unirse a una secuencia específica de ADN de tres pares de bases. El término “dominio con dedos de zinc de unión al ADN, de origen no natural” se refiere a un dominio con dedos de zinc de unión al ADN que no se produce en la célula u organismo que comprende el ADN que se modificará.Zinc finger proteins can be used to modulate (e.g., reduce or inhibit) the expression or activity of NtMRP. In various embodiments, a genomic polynucleotide sequence comprising part or all of the coding sequence of the NtMRP polynucleotide is modified by nuclease-mediated nuclease mutagenesis. In the genomic polynucleotide sequence a unique site for the binding of proteins with zinc fingers is sought. Alternatively, in the genomic polynucleotide sequence, two unique sites are sought for the binding of proteins with zinc fingers where both sites are in opposite and close together chains, for example, separated by 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more base pairs. Accordingly, the proteins are provided with zinc fingers that bind to the NtMRP polynucleotides. A DNA finger binding domain or motif consists of approximately 30 amino acids that fold into a beta-beta-alpha structure from which the alpha helix (a-helix) is inserted into the double helix of a D n . An "alpha helix" refers to a motif in the secondary structure of a protein that winds to the right or to the left in which the hydrogen of each NH group of an amino acid joins the C = O group of an amino acid in the position -4 in relation to the first amino acid. A "beta barrel" (barrel p) as used herein refers to a motif in the secondary structure of a protein comprising two beta chains (p chains) in which the first chain is linked by hydrogen to a second chain to form a closed structure. A "beta-beta-alpha structure" as used herein refers to a structure in a protein consisting of a barrel p comprising two antiparallel p chains and one a helix. The term "zinc finger domain with DNA binding" refers to a protein domain comprising a zinc ion and is capable of binding to a specific DNA sequence of three base pairs. The term "DNA finger domain with DNA binding, of non-natural origin" refers to a DNA finger domain of DNA binding that is not produced in the cell or organism comprising the DNA to be modified.

Los aminoácidos clave dentro de un dominio o motivo con dedos de zinc de unión al ADN que se unen a la secuencia de tres pares de bases dentro del ADN objetivo, son aminoácidos -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 con relación al comienzo de la hélice alfa (a-hélice). Los aminoácidos en la posición -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 con relación al comienzo de la hélice a de un dominio o motivo con dedos de zinc de unión al ADN pueden modificarse mientras se mantenga la cadena principal de barril-beta (barril-p) para generar nuevos dominios o motivos de unión a ADN que se unen a una secuencia de tres pares de bases diferente. Dicho nuevo dominio de unión a ADN puede ser un dominio con dedos de zinc de unión al ADN, de origen no natural. Además del reconocimiento de la secuencia de tres pares de bases por los aminoácidos en la posición -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 con relación al comienzo de la ahélice, algunos de estos aminoácidos pueden también interactuar con un par de bases fuera del sitio de reconocimiento de la secuencia de tres pares de bases. Mediante la combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN, puede generarse una proteína con dedos de zinc que se une específicamente a una secuencia de ADN más larga. Por ejemplo, una proteína con dedos de zinc que comprende dos dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN puede reconocer una secuencia de seis pares de bases específica y una proteína con dedos de zinc que comprende cuatro dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN puede reconocer una secuencia específica de doce pares de bases. Una proteína con dedos de zinc puede comprender dos o más dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN naturales o dos o más dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN no naturales derivados de una proteína con dedos de zinc naturales o de tipo silvestre mediante truncamiento o expansión o proceso de mutagénesis dirigida a sitio acoplado a un método de selección tal como, pero no limitado a, selección de presentación de fagos, selección de dos híbridos bacterianos o selección de un híbrido bacteriano o cualquier combinación de dominios de dedos de zinc de unión a ADN naturales y no naturales. "Truncamiento" como se usa dentro de este contexto se refiere a una proteína con dedos de zinc que contiene menos del número completo de dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN que se encuentran en la proteína natural de dedos de zinc. Expansión, como se usa dentro de este contexto se refiere a una proteína con dedos de zinc que contiene más del número completo de dominios o motivos con dedos de zinc de unión a ADN que se encuentran en la proteína natural con dedos de zinc. Las técnicas para seleccionar una secuencia de polinucleótidos dentro de una secuencia genómica para la unión a proteínas con dedos de zinc se conocen en la técnica.The key amino acids within a DNA-binding domain or finger with zinc fingers that bind to the sequence of three base pairs within the target DNA are amino acids -1, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 with relation to the beginning of the alpha helix (a-helix). The amino acids in the -1, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 position relative to the start of the α-helix of a DNA-binding domain or finger with zinc fingers can be modified as long as the main chain of the barrel is maintained -beta (barrel-p) to generate new domains or DNA binding motifs that bind to a sequence of three different base pairs. Said new DNA binding domain can be a zinc finger domain with DNA binding, of non-natural origin. In addition to the recognition of the sequence of three base pairs by the amino acids in the position -1, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 in relation to the beginning of the aelice, some of these amino acids can also interact with a pair of Off-site bases for recognition of the sequence of three base pairs. By combining two, three, four, five, six or more domains or DNA finger motifs of DNA binding, a protein with zinc fingers that specifically binds to a longer DNA sequence can be generated. For example, a zinc finger protein comprising two domains or DNA finger motifs of DNA binding can recognize a sequence of six specific base pairs and a zinc finger protein comprising four domains or motifs with zinc fingers DNA binding can recognize a specific sequence of twelve base pairs. A protein with zinc fingers can comprise two or more domains or motifs with zinc fingers of natural DNA binding or two or more domains or motifs with zinc fingers of non-natural DNA binding derived from a protein with natural zinc fingers or wild-type by truncation or expansion or site-directed mutagenesis process coupled to a selection method such as, but not limited to, selection of phage display, selection of two bacterial hybrids or selection of a bacterial hybrid or any combination of domains of natural and unnatural DNA binding zinc fingers. "Truncation" as used within this context refers to a zinc finger protein that contains less than the full number of DNA-binding domains or DNA finger motifs found in the natural zinc finger protein. Expansion, as used within this context, refers to a zinc-finger protein that contains more than the full number of DNA-binding domains or motifs of zinc that are found in the natural protein with zinc fingers. Techniques for selecting a polynucleotide sequence within a genomic sequence for protein binding with zinc fingers are known in the art.

En la técnica se conocen métodos para el diseño de dominios de proteínas con dedos de zinc que se unen a secuencias de nucleótidos específicas que son únicas para un gen objetivo. Se ha calculado que una secuencia que comprende 18 nucleótidos es suficiente para especificar una localización única en el genoma de organismos superiores. Típicamente, por lo tanto, los dominios de proteína con dedos de zinc contienen 6 dedos de zinc, cada uno con su hélice alfa diseñada específicamente para la interacción con un triplete en particular. Sin embargo, en algunos casos, puede ser conveniente una secuencia objetivo de nucleótidos más corta o más larga. Por lo tanto, los dominios de dedos de zinc en las proteínas pueden contener de 2 a 12 dedos - tal como 3 a 8 dedos, 5 a 7 dedos o 6 dedos.Methods for the design of protein domains with zinc fingers that bind to specific nucleotide sequences that are unique to a target gene are known in the art. It has been calculated that a sequence comprising 18 nucleotides is sufficient to specify a unique location in the genome of higher organisms. Typically, therefore, the protein domains with zinc fingers contain 6 zinc fingers, each with its alpha helix designed specifically for interaction with a particular triplet. However, in some cases, a shorter or longer nucleotide target sequence may be desirable. Therefore, the zinc finger domains in the proteins may contain from 2 to 12 fingers - such as 3 to 8 fingers, 5 to 7 fingers or 6 fingers.

Las proteínas con dedos de zinc de uso pueden comprender al menos un polipéptido con dedos de zinc unido a través de un enlazador, preferentemente un enlazador flexible, a al menos un segundo dominio de unión a ADN, que opcionalmente es un segundo polipéptido con dedos de zinc. La proteína con dedos de zinc puede contener más de dos dominios de unión al ADN, así como también uno o más dominios reguladores. Los polipéptidos con dedos de zinc pueden modificarse genéticamente para reconocer un sitio objetivo seleccionado en el gen de elección.The zinc-finger proteins of use can comprise at least one zinc finger polypeptide linked through a linker, preferably a flexible linker, to at least a second DNA binding domain, which optionally is a second finger-like polypeptide. zinc. The zinc finger protein can contain more than two DNA binding domains, as well as one or more regulatory domains. Zinc finger polypeptides can be genetically modified to recognize a selected target site in the gene of choice.

En una modalidad, la proteína con dedos de zinc comprende un marco (o cadena principal) derivado de una proteína con dedos de zinc de origen natural. Puede usarse un marco (o cadena principal) derivado de cualquier proteína con dedos de zinc que se produce de manera natural. Por ejemplo, puede usarse la proteína con dedos de zinc que comprende un marco (o cadena principal) derivado de una proteína con dedos de zinc que comprende un motivo C2H2.In one embodiment, the protein with zinc fingers comprises a framework (or main chain) derived from a protein with zinc fingers of natural origin. A frame (or backbone) derived from any protein with zinc fingers that occurs naturally can be used. For example, zinc finger protein comprising a framework (or backbone) derived from a zinc finger protein comprising a C2H2 motif can be used.

En otra modalidad específica, la proteína con dedos de zinc comprende un marco (o cadena principal) derivado de una proteína con dedos de zinc que es funcional naturalmente en células vegetales. Por ejemplo, la proteína con dedos de zinc puede comprender un dedos de zinc C3H, un motivo QALGGH, un motivo de dedos de zinc RING-H2, un motivo C2H2 de 9 aminoácidos, un motivo de dedos de zinc de Arabidopsis LSD1 y un motivo de dedos de zinc del dominios de proteínas BBF/Dof.In another specific embodiment, the zinc finger protein comprises a framework (or backbone) derived from a protein with zinc fingers that is naturally functional in plant cells. For example, the zinc finger protein may comprise a C3H zinc finger, a QALGGH pattern, a RING-H2 zinc finger motif, a 9 amino acid C2H2 motif, a zinc finger motif of Arabidopsis LSD1 and a motif of zinc fingers of the protein domains BBF / Dof.

La proteína con dedos de zinc puede proporcionarse a las células vegetales mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la proteína con dedos de zinc puede añadirse exógenamente a las células vegetales y las células vegetales se mantienen en condiciones tales que la proteína con dedos de zinc se une a la secuencia nucleotídica objetivo y regula la expresión del gen objetivo en las células vegetales. Alternativamente, una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína con dedos del zinc puede expresar las células vegetales y las células vegetales se mantienen en condiciones de manera que la proteína con dedos de zinc se expresa en la secuencia de los nucleótidos objetivo y regula la expresión del gen objetivo en las células vegetales.The zinc finger protein can be provided to plant cells by any suitable method known in the art. For example, zinc finger protein can be added exogenously to plant cells and plant cells are maintained under conditions such that the zinc finger protein binds to the target nucleotide sequence and regulates the expression of the target gene in plant cells . Alternatively, a nucleotide sequence that encodes protein with zinc fingers can express plant cells and proteins. Plant cells are maintained in conditions such that the protein with zinc fingers is expressed in the sequence of the target nucleotides and regulates the expression of the target gene in plant cells.

El gen de dedos de zinc puede expresarse en una planta mediante el uso de cualquier vector de expresión de planta adecuado. Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores se conocen bien en la técnica. Además de los dominios reguladores, a menudo la proteína con dedos de zinc puede expresarse como una proteína de fusión con proteína de unión a maltosa ("MBP"), glutatión S transferasa (GST), hexahistidina, c-myc o el epítopo FLAG, para facilitar la purificación, monitoreo de expresión o monitoreo de localización celular y subcelular. En una modalidad, se produce una planta mutada o de origen no natural o una célula vegetal mutada o de origen no natural mediante mutagénesis mediada por nucleasa con dedos de zinc.The zinc finger gene can be expressed in a plant by the use of any suitable plant expression vector. Typical vectors useful for the expression of genes in higher plants are well known in the art. In addition to the regulatory domains, zinc finger protein can often be expressed as a fusion protein with maltose binding protein ("MBP"), glutathione S transferase (GST), hexahistidine, c-myc or the FLAG epitope, to facilitate purification, monitoring of expression or monitoring of cellular and subcellular localization. In one embodiment, a mutated plant of non-natural origin or a mutated plant cell or of non-natural origin is produced by nuclease-mediated mutagenesis with zinc fingers.

En modalidades específicas, una secuencia de ADN genómico que comprende una parte o toda la secuencia codificante del polinucleótido NtMRP se modifica por mutagénesis mediada por nucleasas con dedos de zinc. En la secuencia de ADN genómico se busca un sitio único para la unión de proteínas con dedos de zinc. Alternativamente, en la secuencia de ADN genómico se buscan dos sitios únicos para la unión de proteínas con dedos de zinc en donde ambos sitios están en cadenas opuestas y muy juntos. Los dos sitios objetivo de proteína con dedos de zinc pueden separarse por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pares de bases. El sitio de unión de proteína con dedos de zinc puede estar en la secuencia codificante de la secuencia del gen NtMRP o un elemento regulador que controla la expresión del gen NtMRP, tal como, pero sin limitación, a la región promotora del gen NtMRP. Particularmente, una o ambas proteínas con dedos de zinc son proteínas con dedos de zinc no naturales.In specific embodiments, a genomic DNA sequence comprising part or all of the coding sequence of the NtMRP polynucleotide is modified by nuclease-mediated nuclease mutagenesis. In the genomic DNA sequence, a unique site for the binding of proteins with zinc fingers is sought. Alternatively, in the genomic DNA sequence, two unique sites are sought for the binding of proteins with zinc fingers where both sites are in opposite and close together chains. The two target protein sites with zinc fingers can be separated by 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more base pairs. The zinc finger protein binding site may be in the sequence encoding the NtMRP gene sequence or a regulatory element that controls the expression of the NtMRP gene, such as, but not limited to, the promoter region of the NtMRP gene. Particularly, one or both proteins with zinc fingers are proteins with unnatural zinc fingers.

En consecuencia, la presente descripción proporciona proteínas con dedos de zinc que se unen a los polinucleótidos NtMRP.Accordingly, the present disclosure provides proteins with zinc fingers that bind to the NtMRP polynucleotides.

Se contempla que un método para mutar una secuencia génica, tal como una secuencia de ADN genómico, que codifica el gen NtMRP mediante mutagénesis mediada por nucleasa con dedos de zinc comprende opcionalmente una o más de las etapas siguientes: (i) proporcionar al menos dos proteínas con dedos de zinc que se unen selectivamente a diferentes sitios objetivo en la secuencia del gen; (ii) construir dos constructos de expresión que codifican cada uno una nucleasa con dedos de zinc diferente que comprende una de las dos proteínas con dedos de zinc no naturales diferentes de la etapa (i) y una nucleasa, unida operativamente a secuencias de control de expresión operables en una célula vegetal; (iii) introducir los dos constructos de expresión en una célula vegetal en donde se producen las dos nucleasas con dedos de zinc diferentes, de manera que se introduce una rotura bicatenaria en la secuencia de ADN genómico en el genoma de la célula vegetal, en o cerca de al menos uno de los sitios objetivo. La introducción de los dos constructos de expresión en la célula vegetal puede llevarse a cabo de forma simultánea o secuencial, lo que incluye opcionalmente la selección de las células que tomaron el primer constructo.It is contemplated that a method for mutating a gene sequence, such as a genomic DNA sequence, that encodes the NtMRP gene by zinc finger nuclease-mediated mutagenesis optionally comprises one or more of the following steps: (i) providing at least two proteins with zinc fingers that selectively bind to different target sites in the gene sequence; (ii) constructing two expression constructs each encoding a different zinc finger nuclease comprising one of the two proteins with unnatural zinc fingers different from step (i) and a nuclease, operably linked to control sequences of operable expression in a plant cell; (iii) introducing the two expression constructs into a plant cell in which the two nucleases are produced with different zinc fingers, so that a double-stranded break is introduced into the genomic DNA sequence in the genome of the plant cell, in or near at least one of the target sites. The introduction of the two expression constructs into the plant cell can be carried out simultaneously or sequentially, which optionally includes the selection of the cells that took the first construct.

Una ruptura bicatenaria (DSB) como se usa en la presente, se refiere a una ruptura en ambas cadenas del ADN o ARN. La ruptura bicatenaria puede producirse en la secuencia de ADN genómico en un sitio que es de no más de entre 5 pares de bases y 1500 pares de bases, particularmente no más de entre 5 pares de bases y 200 pares de bases, particularmente no más de entre 5 pares de bases y 20 pares de bases eliminados de uno de los sitios objetivo. La rotura bicatenaria puede facilitar la unión de extremos no homólogos que conduce a una mutación en la secuencia de ADN genómico en o cerca del sitio objetivo. "Unión de extremos no homólogos (NHEJ)" como se usa en la presente se refiere a un mecanismo de reparación que repara una rotura bicatenaria mediante ligadura directa sin la necesidad de un molde homólogo, y puede ser por lo tanto mutágeno con relación a la secuencia antes de que se produzca la rotura bicatenaria.A double-stranded break (DSB) as used herein, refers to a break in both strands of DNA or RNA. Double-stranded cleavage can occur in the genomic DNA sequence at a site that is no more than between 5 base pairs and 1500 base pairs, particularly no more than between 5 base pairs and 200 base pairs, particularly not more than between 5 base pairs and 20 base pairs removed from one of the target sites. The double-stranded break can facilitate the binding of non-homologous ends that leads to a mutation in the genomic DNA sequence at or near the target site. "Non-homologous end joining (NHEJ)" as used herein refers to a repair mechanism that repairs a double-stranded break by direct ligation without the need for a homologous template, and may therefore be mutagenic with respect to the sequence before the double-stranded break occurs.

El método puede comprender opcionalmente, además, la etapa de (iv) introducir en la célula vegetal un polinucleótido que comprende al menos una primera región de homología con una secuencia de nucleótidos aguas arriba de la ruptura bicatenaria y una segunda región de homología con una secuencia de nucleótidos aguas abajo de la ruptura bicatenaria. El polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de polinucleótido NtMRP que contiene una deleción o una inserción de secuencias de nucleótidos heterólogas. El polinucleótido puede por lo tanto facilitar la recombinación homóloga en o cerca del sitio objetivo, lo que da como resultado la inserción de una secuencia heteróloga en el genoma o la deleción de la secuencia de ADN genómico del genoma. La secuencia de ADN genómico resultante en la célula vegetal puede comprender una mutación que interrumpe la actividad enzimática de una proteína de NtMRP mutante expresada, un codón de terminación de la traducción temprana o un motivo de secuencia que interfiere con el procesamiento adecuado de pre-ARNm en un ARNm que da como resultado expresión reducida o inactivación del gen. Los expertos en la técnica conocen métodos para alterar la síntesis de proteínas mediante la mutación de una secuencia genética que codifica una proteína.The method may optionally further comprise the step of (iv) introducing into the plant cell a polynucleotide comprising at least a first region of homology with a sequence of nucleotides upstream of the double-stranded cleavage and a second region of homology with a sequence of nucleotides downstream of the double-stranded break. The polynucleotide may comprise a nucleotide sequence corresponding to the NtMRP polynucleotide sequence containing a deletion or an insertion of heterologous nucleotide sequences. The polynucleotide can therefore facilitate homologous recombination at or near the target site, which results in the insertion of a heterologous sequence into the genome or deletion of the genomic DNA sequence of the genome. The resulting genomic DNA sequence in the plant cell may comprise a mutation that interrupts the enzymatic activity of an expressed mutant NtMRP protein, an early translation stop codon, or a sequence motif that interferes with the proper processing of pre-mRNA. in an mRNA that results in reduced expression or inactivation of the gene. Methods for altering protein synthesis by mutating a genetic sequence encoding a protein are known to those skilled in the art.

Puede construirse una nucleasa con dedos de zinc mediante la creación de una fusión de un primer polinucleótido que codifica una proteína con dedos de zinc que se une a un polinucleótido NtMRP, y un segundo polinucleótido que codifica una endonucleasa inespecífica tal como, pero no se limita a, aquellas endonucleasas de Tipo IIS. Una endonucleasa de tipo IIS es una enzima de restricción que tiene un dominio de reconocimiento separado y un dominio de escisión de endonucleasa en donde la enzima escinde ADN en sitios que se eliminan del sitio de reconocimiento. Los ejemplos no limitantes de endonucleasas tipo IIS pueden ser, pero no se limitan a, AarI, BaeI, CdiI, DrdII, EciI, FokI, FauI, GdiII, HgaI, Ksp632I, MboII, Pfl1108I, Rle108I, RleAI, SapI, TspDTI o UbaPI.A nuclease with zinc fingers can be constructed by creating a fusion of a first polynucleotide that encodes a zinc finger protein that binds to an NtMRP polynucleotide, and a second polynucleotide that encodes a nonspecific endonuclease such as, but is not limited to a, those Type IIS endonucleases. An IIS-type endonuclease is a restriction enzyme that has a separate recognition domain and a endonuclease cleavage domain where the enzyme cleaves DNA at sites that are removed from the recognition site. Non-limiting examples of type IIS endonucleases can be, but are not limited to, AarI, BaeI, CdiI, DrdII, EciI, FokI, FauI, GdiII, HgaI, Ksp632I, MboII, Pfl1108I, Rle108I, RleAI, SapI, TspDTI or UbaPI .

Se conocen en la técnica métodos para el diseño y construcción de proteínas de fusión, métodos para la selección y separación del dominio de endonucleasa del dominio de reconocimiento de secuencia de una endonucleasa de tipo IIS, métodos para el diseño y construcción de una nucleasa con dedos de zinc que comprende una proteína de fusión de una proteína con dedos de zinc y una endonucleasa. En una modalidad específica, el dominio de nucleasa en una nucleasa con dedos de zinc es FokI. Una proteína de fusión entre una proteína con dedos de zinc y la nucleasa de FokI puede comprender un espaciador que consiste de dos pares de bases o alternativamente, el espaciador puede consistir en tres, cuatro, cinco, seis, o más pares de bases. En una modalidad, se describe una proteína de fusión con un espaciador de siete pares de bases de manera que la endonucleasa de una primera nucleasa con dedos de zinc puede dimerizarse tras entrar en contacto con una segunda nucleasa con dedos de zinc, en donde las dos proteínas con dedos de zinc que forman dichas nucleasas con dedos de zinc pueden unirse aguas arriba y aguas abajo de la secuencia de ADN objetivo. Tras la dimerización, una nucleasa con dedos de zinc puede introducir una ruptura bicatenaria en una secuencia de nucleótidos objetivo que puede seguirse por la unión de extremos no homólogos o recombinación homóloga con una secuencia de nucleótidos exógena que tiene homología con las regiones que flanquean ambos lados de la rotura bicatenaria.Methods for the design and construction of fusion proteins, methods for the selection and separation of the endonuclease domain from the sequence recognition domain of an IIS-type endonuclease, methods for the design and construction of a nuclease with fingers are known in the art. of zinc comprising a protein fusion protein with zinc fingers and an endonuclease. In a specific embodiment, the nuclease domain in a nuclease with zinc fingers is FokI. A fusion protein between a protein with zinc fingers and the FokI nuclease can comprise a spacer consisting of two base pairs or alternatively, the spacer can consist of three, four, five, six, or more base pairs. In one embodiment, a fusion protein with a seven base pair spacer is described so that the endonuclease of a zinc finger first nuclease can be dimerized upon contact with a second nuclease with zinc fingers, where both proteins with zinc fingers forming said nucleases with zinc fingers can join upstream and downstream of the target DNA sequence. After dimerization, a nuclease with zinc fingers can introduce a double-stranded break in a target nucleotide sequence that can be followed by the joining of non-homologous ends or homologous recombination with an exogenous nucleotide sequence having homology with the regions flanking both sides of the double-stranded break.

En aún otra modalidad, se proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína con dedos de zinc y una proteína potenciadora lo que da como resultado un activador con dedos de zinc. Un activador con dedos de zinc puede usarse para regular o activar la transcripción del gen NtMRP, lo que comprende las etapas de (i) diseñar una proteína con dedos de zinc que se une a una región dentro de un promotor o una secuencia unida operativamente a una secuencia de codificación del gen NtMRP, (ii) producir una proteína de fusión entre dicha proteína con dedos de zinc y un activador de transcripción, (iii) producir un constructo de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica dicho activador con dedos de zinc bajo el control de un promotor activo en una célula, tal como una célula vegetal, (iv) introducir dicho constructo génico en la célula, y (v) cultivar la célula y permitir la expresión del activador con dedos de zinc, y (vi) caracterizar la célula que tiene una expresión incrementada de proteína NtMRP.In yet another embodiment, a fusion protein comprising a protein with zinc fingers and an enhancer protein is provided which results in an activator with zinc fingers. A zinc finger activator can be used to regulate or activate the transcription of the NtMRP gene, which comprises the steps of (i) designing a zinc finger protein that binds to a region within a promoter or an operably linked sequence. a coding sequence of the NtMRP gene, (ii) producing a fusion protein between said protein with zinc fingers and a transcription activator, (iii) producing an expression construct comprising a polynucleotide sequence encoding said activator with fingers of zinc under the control of an active promoter in a cell, such as a plant cell, (iv) introducing said gene construct into the cell, and (v) culturing the cell and allowing expression of the activator with zinc fingers, and (vi) ) characterizing the cell having an increased expression of NtMRP protein.

En aún otra modalidad, la descripción proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína con dedos de zinc y un represor de gen lo que da como resultado un represor con dedos de zinc. Un represor con dedos de zinc puede usarse para regular negativamente o reprimir la transcripción del polinucleótido NtMRP , lo que comprende las etapas de (i) diseñar genéticamente una proteína con dedos de zinc que se une a una región dentro de un promotor o una secuencia unida operativamente al polinucleótido NtMRP, y (ii) preparar una proteína de fusión entre dicha proteína con dedos de zinc y un represor de transcripción, y (iii) desarrollar un constructo génico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica dicho represor con dedos de zinc bajo el control de un promotor activo en una célula, tal como una célula vegetal, e (iv) introducir dicho constructo génico en la célula, y (v) proporcionar la expresión del represor con dedos de zinc, y (vi) caracterizar la célula que tiene una transcripción reducida del polinucleótido NtMRP.In yet another embodiment, the disclosure provides a fusion protein comprising a protein with zinc fingers and a gene repressor which results in a zinc finger repressor. A zinc finger repressor can be used to negatively regulate or repress the transcription of the NtMRP polynucleotide, which comprises the steps of (i) genetically engineering a zinc finger protein that binds to a region within a promoter or a linked sequence operatively to the NtMRP polynucleotide, and (ii) preparing a fusion protein between said protein with zinc fingers and a transcription repressor, and (iii) developing a gene construct comprising a polynucleotide sequence encoding said repressor with zinc fingers under the controlling an active promoter in a cell, such as a plant cell, and (iv) introducing said gene construct into the cell, and (v) providing expression of the repressor with zinc fingers, and (vi) characterizing the cell having a reduced transcription of the NtMRP polynucleotide.

En aún otra modalidad, la descripción proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína con dedos de zinc y una metilasa lo que da como resultado una metilasa con dedos de zinc. La metilasa con dedos de zinc puede usarse para regular negativamente o inhibir la expresión del polinucleótido NtMRP en una célula, tal como una célula vegetal, mediante la metilación de una región dentro de la región promotora del polinucleótido NtMRP, lo que comprende las etapas de (i) diseñar una proteína con dedos de zinc que puede unirse a una región dentro de un promotor de polinucleótido NtMRP, y (ii) producir una proteína de fusión entre dicha proteína con dedos de zinc y una metilasa, y (iii) desarrollar un constructo génico que contiene un polinucleótido que codifica dicha metilasa con dedos de zinc bajo el control de un promotor activo en la célula, e (iv) introducir dicho constructo génico en la célula, y (v) permitir la expresión de la metilasa con dedos de zinc, y (vi) caracterizar la célula que tiene expresión reducida o esencialmente nula de proteína NtMRP en la célula.In yet another embodiment, the disclosure provides a fusion protein comprising a protein with zinc fingers and a methylase which results in a zinc finger methylase. Zinc finger methylase can be used to downregulate or inhibit the expression of the NtMRP polynucleotide in a cell, such as a plant cell, by methylation of a region within the promoter region of the NtMRP polynucleotide, which comprises the steps of (FIG. i) design a protein with zinc fingers that can bind to a region within a NtMRP polynucleotide promoter, and (ii) produce a fusion protein between said protein with zinc fingers and a methylase, and (iii) develop a construct gene containing a polynucleotide encoding said methylase with zinc fingers under the control of an active promoter in the cell, and (iv) introducing said gene construct into the cell, and (v) allowing the expression of methylase with zinc fingers , and (vi) characterizing the cell having reduced or essentially null expression of NtMRP protein in the cell.

En diversas modalidades, puede seleccionarse una proteína con dedos de zinc de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción para unirse a una secuencia reguladora de polinucleótidos NtMRP. Más específicamente, la secuencia regulatoria puede comprender un sitio de iniciación de la transcripción, un codón de iniciación, una región de un exón, un límite de un exón-intrón, un terminador, o un codón de parada. La proteína con dedos de zinc puede fusionarse con una nucleasa, un activador o una proteína represora.In various embodiments, a zinc finger protein can be selected according to the methods described in the present disclosure to bind to a regulatory NtMRP polynucleotide sequence. More specifically, the regulatory sequence may comprise a transcription initiation site, an initiation codon, a region of an exon, a limit of an exon-intron, a terminator, or a stop codon. The protein with zinc fingers can be fused with a nuclease, an activator or a repressor protein.

En diversas modalidades, una nucleasa con dedos de zinc introduce una ruptura bicatenaria en una región reguladora, una región codificante, o una región no codificante de una secuencia de ADN genómico del polinucleótido NtMRP, y conduce a una reducción, una inhibición o una inhibición sustancial del nivel de expresión del polinucleótido NtMRP, o una reducción, una inhibición o una inhibición sustancial de la actividad de la proteína codificada de esta manera.In various embodiments, a nuclease with zinc fingers introduces a double-stranded break in a regulatory region, a coding region, or a non-coding region of a genomic DNA sequence of the NtMRP polynucleotide, and leads to a reduction, inhibition or substantial inhibition. of the level of expression of the NtMRP polynucleotide, or a reduction, an inhibition or a substantial inhibition of the activity of the protein encoded in this manner.

La descripción proporciona, además, un método para modificar una célula, tal como una célula vegetal, en donde el genoma de la célula vegetal se modifica por mutagénesis mediada por nucleasa con dedos de zinc, que comprende (a) identificar y producir al menos dos proteínas con dedos de zinc no naturales que se unen selectivamente a diferentes sitios objetivo para la modificación en la secuencia de nucleótidos genómica; (b) expresar al menos dos proteínas de fusión que comprenden cada una nucleasa y una de las al menos dos proteínas con dedos de zinc no naturales en la célula vegetal, de manera que se introduce una ruptura bicatenaria en la secuencia de nucleótidos genómica en el genoma de la planta, particularmente en o cerca de un sitio objetivo en la secuencia de nucleótidos genómicos; y, opcionalmente (c) introducir en la célula un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una primera región de homología con una secuencia aguas arriba de la rotura bicatenaria y una segunda región de homología con una región aguas abajo de la rotura bicatenaria, de manera que el polinucleótido se recombina con ADN en el genoma. Además, se describen células que comprenden uno o más constructos de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más de las proteínas de fusión.The description further provides a method for modifying a cell, such as a plant cell, wherein the genome of the plant cell is modified by nuclease-mediated nuclease mutagenesis, comprising (a) identify and produce at least two proteins with unnatural zinc fingers that selectively bind to different target sites for modification in the genomic nucleotide sequence; (b) expressing at least two fusion proteins comprising each nuclease and one of the at least two proteins with unnatural zinc fingers in the plant cell, so that a double-stranded break is introduced into the genomic nucleotide sequence in the genome of the plant, particularly at or near a target site in the genomic nucleotide sequence; and, optionally (c) introducing into the cell a polynucleotide comprising a nucleotide sequence comprising a first region of homology with a sequence upstream of the double-stranded break and a second region of homology with a downstream region of the double-stranded break, so that the polynucleotide recombines with DNA in the genome. In addition, cells comprising one or more expression constructs comprising nucleotide sequences encoding one or more of the fusion proteins are described.

En otro aspecto, la descripción proporciona además métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas o modificadas genéticamente de cualquier otra manera mediante el uso de meganucleasas, tales como I-CreI. Las meganucleasas de origen natural así como también las meganucleasas recombinantes pueden usarse para provocar de manera específica una ruptura de la doble cadena en un solo sitio o en relativamente pocos sitios en el ADN genómico de una planta para permitir la interrupción de un gen NtMRP. La meganucleasa puede ser una meganucleasa diseñada genéticamente con propiedades de reconocimiento al ADN alteradas. Las proteínas meganucleasas pueden suministrarse a las células vegetales mediante una variedad de mecanismos diferentes conocidos en la técnica.In another aspect, the disclosure further provides methods for producing mutant, non-natural or transgenic plants or genetically modified in any other way by the use of meganucleases, such as I-CreI. Meganucleases of natural origin as well as recombinant meganucleases can be used to specifically cause a double-strand break in a single site or in relatively few sites in the genomic DNA of a plant to allow the disruption of an NtMRP gene. The meganuclease may be a genetically engineered meganuclease with altered DNA recognition properties. Meganuclease proteins can be delivered to plant cells by a variety of different mechanisms known in the art.

La meganucleasa puede ser una meganucleasa diseñada genéticamente con propiedades de reconocimiento al ADN alteradas. Esta cita describe métodos para el diseño genético basado en la estructura de meganucleasas derivadas de la meganucleasa I-CreI de origen natural. Estas meganucleasas diseñadas genéticamente pueden hacerse para reconocer y cortar secuencias de ADN de 22 pares de bases predeterminadas que se encuentran en los genomas de las plantas. Las proteínas meganucleasas pueden suministrarse a las células vegetales mediante una variedad de mecanismos diferentes conocidos en la técnica.The meganuclease may be a genetically engineered meganuclease with altered DNA recognition properties. This citation describes methods for the genetic design based on the structure of meganucleases derived from the meganuclease I-CreI of natural origin. These genetically engineered meganucleases can be made to recognize and cut DNA sequences of 22 predetermined base pairs found in the genomes of plants. Meganuclease proteins can be delivered to plant cells by a variety of different mechanisms known in the art.

Los aspectos de la descripción permiten el uso de meganucleasas para inactivar el polinucleótido NtMRP en una célula o planta vegetal. Los aspectos se refieren, además, a un método para inactivar el polinucleótido NtMRP en una planta mediante el uso de una meganucleasa lo que comprende: (a) proporcionar una célula vegetal que comprende un polinucleótido NtMRP; (b) introducir una meganucleasa o un constructo que codifica una meganucleasa en dicha célula vegetal; y (c) permitir que la meganucleasa inactive el polinucleótido NtMRP.The aspects of the disclosure allow the use of meganucleases to inactivate the NtMRP polynucleotide in a plant cell or plant. The aspects also relate to a method for inactivating the NtMRP polynucleotide in a plant by the use of a meganuclease which comprises: (a) providing a plant cell comprising an NtMRP polynucleotide; (b) introducing a meganuclease or a construct encoding a meganuclease into said plant cell; and (c) allowing the meganuclease to inactivate the NtMRP polynucleotide.

Las meganucleasas pueden usarse para escindir sitios de reconocimiento de meganucleasas dentro de las regiones codificantes de un polinucleótido NtMRP. Dicha escisión resulta frecuentemente en la deleción de ADN en el sitio de reconocimiento de la meganucleasa después de la reparación mutagénica del ADN por unión de extremos no homólogos. Dichas mutaciones en la secuencia codificante de genes son suficientes típicamente para inactivar el gen. Este método implica, primero, el suministro de un casete de expresión de meganucleasa a una célula vegetal mediante el uso de un método de transformación adecuado. Para lograr la mayor eficiencia, es conveniente unir el casete de expresión de la meganucleasa a un marcador de selección y seleccionar las células transformadas exitosamente en presencia de un agente de selección. Este enfoque resultará en la integración del casete de expresión de meganucleasa en el genoma, sin embargo, podría no ser conveniente si es probable que la planta requiera aprobación regulatoria. En dichos casos, el casete de expresión de meganucleasa (y el gen marcador de selección unido) puede segregarse en posteriores generaciones de plantas mediante el uso de técnicas de mejoramiento convencionales. Alternativamente, las células vegetales pueden transformarse inicialmente con un casete de expresión de meganucleasa que carece de un marcador de selección y pueden cultivarse en medios que carecen de un agente de selección. En tales condiciones, una fracción de las células tratadas adquirirá el casete de expresión de meganucleasa y expresará la meganucleasa diseñada genéticamente de manera transitoria sin integrar el casete de expresión de meganucleasa en el genoma. Debido a que no tiene en cuenta la eficiencia de transformación, este último procedimiento de transformación requiere que se examine un mayor número de células tratadas para obtener la modificación deseada del genoma.Meganucleases can be used to cleave meganuclease recognition sites within the coding regions of an NtMRP polynucleotide. Said cleavage often results in the deletion of DNA at the recognition site of the meganuclease after the mutagenic repair of DNA by non-homologous end joining. Said mutations in the gene coding sequence are typically sufficient to inactivate the gene. This method involves, first, the delivery of a meganuclease expression cassette to a plant cell by the use of a suitable transformation method. To achieve the highest efficiency, it is convenient to attach the meganuclease expression cassette to a selection marker and select the transformed cells successfully in the presence of a selection agent. This approach will result in the integration of the meganuclease expression cassette into the genome, however, it may not be convenient if the plant is likely to require regulatory approval. In such cases, the meganuclease expression cassette (and the bound selection marker gene) can be segregated in subsequent generations of plants by the use of conventional breeding techniques. Alternatively, plant cells can be transformed initially with a meganuclease expression cassette lacking a selection marker and can be grown in media lacking a selection agent. Under such conditions, a fraction of the treated cells will acquire the meganuclease expression cassette and express the genetically engineered meganuclease transiently without integrating the meganuclease expression cassette into the genome. Because it does not account for transformation efficiency, this latter transformation procedure requires that a greater number of treated cells be examined to obtain the desired modification of the genome.

Después del suministro del casete de expresión de meganucleasa, las células vegetales se cultivan, inicialmente, en condiciones que son típicas para el procedimiento de transformación particular que se usó. Esto puede significar cultivar las células transformadas en los medios a temperaturas por debajo de 26 grados C, frecuentemente en la oscuridad. Dichas condiciones estándar pueden usarse durante un período de tiempo, preferentemente 1-4 días, para permitir que la célula vegetal se recupere del proceso de transformación. En cualquier punto después de este período de recuperación inicial, puede aumentarse la temperatura de cultivo para estimular la actividad de la meganucleasa diseñada genéticamente para escindir y mutar el sitio de reconocimiento de la meganucleasa.After delivery of the meganuclease expression cassette, the plant cells are cultured, initially, under conditions that are typical for the particular transformation procedure that was used. This may mean culturing the transformed cells in the media at temperatures below 26 degrees C, often in the dark. Said standard conditions can be used for a period of time, preferably 1-4 days, to allow the plant cell to recover from the transformation process. At any point after this initial recovery period, the culture temperature can be increased to stimulate the activity of the genetically engineered meganuclease to cleave and mutate the meganuclease recognition site.

Para ciertas aplicaciones, puede ser conveniente eliminar de manera precisa el polinucleótido NtMRP del genoma de la planta. Dichas aplicaciones son posibles mediante el uso de un par de meganucleasas diseñadas genéticamente, cada una de las cuales escinde un sitio de reconocimiento de meganucleasa a cada lado de la deleción deseada. For certain applications, it may be convenient to accurately remove the NtMRP polynucleotide from the plant genome. Such applications are possible through the use of a pair of genetically engineered meganucleases, each of which cleaves a meganuclease recognition site on either side of the desired deletion.

Los constructos recombinantes proporcionados en la presente descripción pueden usarse para transformar plantas o células vegetales para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) los niveles de expresión de la proteína NtMRP. Un constructo de polinucleótidos recombinante puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido NtMRP como se describe en la presente descripción, unido operativamente a una región reguladora adecuada para expresar el polipéptido NtMRP en la planta o célula. Por lo tanto, un polinucleótido puede comprender una secuencia codificante que codifica el polipéptido NtMRP como se describe en la presente descripción o una variante de esta. The recombinant constructs provided in the present disclosure can be used to transform plants or plant cells to modulate (e.g., reduce or inhibit) the expression levels of the NtMRP protein. A recombinant polynucleotide construct can comprise a polynucleotide encoding an NtMRP polypeptide as described in the present disclosure, operably linked to a suitable regulatory region for expressing the NtMRP polypeptide in the plant or cell. Therefore, a polynucleotide can comprise a coding sequence encoding the NtMRP polypeptide as described in the present description or a variant thereof.

El polipéptido NtMRP codificado por un polinucleótido recombinante puede ser un polipéptido NtMRP nativo, o puede ser heterólogo a la célula. En algunos casos, el constructo recombinante contiene un polinucleótido que reduce o inhibe la expresión de un (unos) polipéptido(s) que modula NtMRP, unido operativamente a una región reguladora. En la presente descripción se describen ejemplos de regiones regulatorias adecuadas.The NtMRP polypeptide encoded by a recombinant polynucleotide can be a native NtMRP polypeptide, or it can be heterologous to the cell. In some cases, the recombinant construct contains a polynucleotide that reduces or inhibits the expression of a polypeptide (s) that modulates NtMRP, operably linked to a regulatory region. Examples of suitable regulatory regions are described in the present description.

Se proporcionan, además, vectores que contienen constructos de polinucleótidos recombinantes tales como los descritos en la presente descripción. Las cadenas principales adecuadas del vector incluyen, por ejemplo, las usadas habitualmente en la técnica tales como plásmidos, virus, cromosomas artificiales, BAC, YAC o PAC. Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitarse a, plásmidos y vectores virales derivados de, por ejemplo, bacteriófago, baculovirus, y retrovirus. Numerosos vectores y sistemas de expresión están disponibles comercialmente.In addition, vectors containing recombinant polynucleotide constructs such as those described in the present disclosure are provided. Suitable vector backbones include, for example, those commonly used in the art such as plasmids, viruses, artificial chromosomes, BAC, YAC or PAC. Suitable expression vectors include, but are not limited to, plasmids and viral vectors derived from, for example, bacteriophage, baculovirus, and retroviruses. Numerous vectors and expression systems are commercially available.

Los vectores pueden incluir además, por ejemplo, orígenes de replicación, regiones de unión al armazón (SARs) o marcadores. Un gen marcador puede conferir un fenotipo seleccionable en una célula vegetal. Por ejemplo, un marcador puede conferir resistencia a biocidas, tal como resistencia a un antibiótico (por ejemplo, kanamicina, G418, bleomicina, o higromicina), o a un herbicida (por ejemplo, glifosato, clorosulfuron o fosfinotricina). Adicionalmente, un vector de expresión puede incluir una secuencia etiqueta diseñada para facilitar la manipulación o detección (por ejemplo, purificación o localización) del polipéptido expresado. Las secuencias etiquetas, tales como luciferasa, beta-glucuronidasa (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), glutatión S-transferasa (GST), polihistidina, secuencias c-myc o hemaglutinina se expresan típicamente como una fusión con el polipéptido codificado. Dichas etiquetas pueden insertarse en cualquier lugar dentro del polipéptido, lo que incluye lo mismo en el carboxilo terminal que en el amino terminal.The vectors may further include, for example, origins of replication, framework binding regions (SARs) or markers. A marker gene can confer a selectable phenotype on a plant cell. For example, a marker can confer resistance to biocides, such as resistance to an antibiotic (eg, kanamycin, G418, bleomycin, or hygromycin), or to a herbicide (eg, glyphosate, chlorosulfuron or phosphinothricin). Additionally, an expression vector may include a tag sequence designed to facilitate manipulation or detection (eg, purification or localization) of the expressed polypeptide. Tag sequences, such as luciferase, beta-glucuronidase (GUS), green fluorescent protein (GFP), glutathione S-transferase (GST), polyhistidine, c-myc sequences or hemagglutinin are typically expressed as a fusion with the encoded polypeptide. Said labels can be inserted anywhere within the polypeptide, which includes the same in the carboxyl terminal as in the amino terminal.

Diversas modalidades se dirigen a plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que se modifican para reducir el nivel de expresión del gen NtMRP mediante diversos métodos que pueden usarse para reducir o silenciar la expresión del gen NtMRP, y de esta manera, producir plantas en las cuales el nivel de expresión de los transportadores NtMRP pueden reducirse dentro de los tejidos vegetales de interés. Las tasas de transporte de metales pesados y los patrones de distribución del transporte de metales pesados, en particular, el transporte de cadmio, pueden alterarse en plantas producidas de acuerdo con los métodos y composiciones descritos.Various modalities are directed to mutant, non-natural or transgenic plants that are modified to reduce the expression level of the NtMRP gene by various methods that can be used to reduce or silence the expression of the NtMRP gene, and in this way, produce plants in which the level of expression of NtMRP transporters can be reduced within the plant tissues of interest. Heavy metal transport rates and distribution patterns of heavy metal transport, in particular, cadmium transport, can be altered in plants produced according to the methods and compositions described.

Diversas modalidades se dirigen a plantas mutantes, plantas de origen no natural o plantas transgénicas modificadas para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) los niveles de expresión del gen NtMRP, lo que produce de esta manera plantas - tales como plantas de tabaco - en las cuales se reduce el nivel de expresión de NtMRP dentro de los tejidos vegetales de interés en comparación con una planta control. Las composiciones y los métodos descritos pueden aplicarse a cualquier especie del género Nicotiana, lo que incluye N. rustica y N. tabacum (por ejemplo, La B21, lN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, y Petico). Otras especies incluyen N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, y N. x sanderae. Various modalities are directed to mutant plants, plants of non-natural origin or transgenic plants modified to modulate (e.g., reduce or inhibit) the expression levels of the NtMRP gene, thereby producing plants - such as tobacco plants - in which reduces the expression level of NtMRP within the plant tissues of interest compared to a control plant. The compositions and methods described can be applied to any species of the genus Nicotiana, including N. rustica and N. tabacum (for example, La B21, IN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, and Petico). Other species include N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, and N. x sanderae.

El uso de cultivares de tabaco y cultivares de tabaco élite se contemplan, además, en la presente descripción. La planta transgénica, de origen no natural o mutante puede ser, por lo tanto, una variedad de tabaco o un cultivar de tabaco élite que comprende uno o más transgenes, o una o más mutaciones genéticas o sus combinaciones. La(s) mutación(es) genética(s) (por ejemplo, uno o más polimorfismos) pueden ser mutaciones que no existen naturalmente en la variedad de tabaco individual o cultivar de tabaco (por ejemplo, cultivar de tabaco élite) o pueden ser mutación(es) genética(s) que se producen naturalmente siempre y cuando la mutación no se produzca naturalmente en la variedad de tabaco individual o cultivar de tabaco (por ejemplo, cultivar de tabaco élite).The use of tobacco cultivars and elite tobacco cultivars are also contemplated in the present description. The transgenic plant, of non-natural or mutant origin may therefore be a tobacco variety or an elite tobacco cultivar comprising one or more transgenes, or one or more genetic mutations or combinations thereof. The genetic mutation (s) (eg, one or more polymorphisms) may be mutations that do not exist naturally in the individual tobacco variety or tobacco cultivar (eg, elite tobacco cultivar) or may be genetic mutation (s) that occur naturally as long as the mutation does not occur naturally in the individual tobacco variety or tobacco crop (eg, elite tobacco cultivar).

Las variedades particularmente útiles de Nicotiana tabacum incluyen los tabacos tipo Burley, tipo oscuro, tipo curado en atmósfera artificial, y tipo Oriental. Los ejemplos no limitantes de variedades o cultivares son: BD 64, c C 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Híbrido 403LC, Híbrido 404LC, Híbrido 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, tabaco "Perique", PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC número 2 Híbrido 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, PO1, PO2, PO3, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Se contemplan, además, subvariedades de baja conversión de lo anterior, incluso si no se identifican específicamente en la presente descripción.Particularly useful varieties of Nicotiana tabacum include Burley type tobaccos, dark type, type cured in artificial atmosphere, and Oriental type. The non-limiting examples of varieties or cultivars are: BD 64, C C 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC , Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC , KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, MsKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC , PD 7312 LC, tobacco "Perique", PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51 , RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor) , Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC number 2 Hybrid 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, PO1, PO2, PO3, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84 / 31, Basma I Zichna ZP4 / B, Basma Xanthi BX 2A, Bate k, Besuki Jember, C104, Coker 347, Missionary Criollo, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian , Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2 / 1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Furthermore, low conversion subvarieties of the above are contemplated, even if they are not specifically identified in the present description.

En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica como se describe en la presente descripción que se ha modificado adicionalmente de manera que también se reduce la expresión de transportadores de NtHMA que puede reducir aún más el contenido de cadmio en la planta. El uso de transportadores de NtHMA para reducir el contenido de cadmio en la planta se describe en el documento WO2009074325. Esto, de acuerdo con una modalidad, se proporciona una célula vegetal mutante, de origen no natural o transgénica que comprende un polinucleótido NtMRP aislado, un gen quimérico NtMRP, un constructo de polinucleótido NtMRP, un ARN bicatenario de NtMRP, un conjugado de NtMRP y/o un vector de expresión de NtMRP conjuntamente con un polinucleótido NtHMA aislado, un gen quimérico de NtHMA, un constructo de polinucleótido NtHMA, un ARN bicatenario de NtHMA, un conjugado de NtHMA y/o un vector de expresión de NtHMA.In a further aspect, there is provided a mutant, non-natural or transgenic plant as described in the present disclosure that has been further modified so that the expression of NtHMA transporters that can further reduce the cadmium content is also reduced. on the floor. The use of NtHMA transporters to reduce the cadmium content in the plant is described in WO2009074325. This, according to one embodiment, provides a mutant, non-natural or transgenic plant cell comprising an isolated NtMRP polynucleotide, a NtMRP chimeric gene, a NtMRP polynucleotide construct, a NtMRP double-stranded RNA, a NtMRP conjugate, and / or an NtMRP expression vector in conjunction with an isolated NtHMA polynucleotide, a chimeric NtHMA gene, a NtHMA polynucleotide construct, a NtHMA double-stranded RNA, a NtHMA conjugate and / or an NtHMA expression vector.

Las modalidades se dirigen, además, a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, plantas de origen no natural, plantas híbridas o plantas transgénicas que se han modificado para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o actividad de NtMRP de modo que se acumulen cantidades menores de cadmio en ellas en comparación con un control. En ciertas modalidades, las plantas que se obtienen son similares o iguales sustancialmente en apariencia general (por ejemplo, fenotipo) a las plantas control. Varias características fenotípicas tales como grado de madurez, número de hojas por planta, altura del rabillo, ángulo de inserción de las hojas, tamaño de las hojas (ancho y longitud), distancia de internudos, y relación lámina-nervadura pueden evaluarse mediante observaciones de campo. En una modalidad preferida, la altura o el peso, o la altura y el peso de las plantas, es el mismo sustancialmente que el de las plantas control. En otra modalidad preferida, no se encuentran diferencias significativas en las hojas secas recogidas de las plantas en comparación con un control, lo que indica que la modulación de los transcritos de NtMRP no tiene un efecto relevante estadísticamente sobre la biomasa seca. The embodiments are further directed to compositions and methods for producing mutant plants, plants of non-natural origin, hybrid plants or transgenic plants that have been modified to modulate (e.g., reduce or inhibit) the expression or activity of NtMRP so that smaller amounts of cadmium accumulate in them compared to a control. In certain embodiments, the plants that are obtained are similar or substantially equal in general appearance (eg, phenotype) to the control plants. Several phenotypic characteristics such as degree of maturity, number of leaves per plant, height of the corner, angle of insertion of the leaves, size of the leaves (width and length), distance of internodes, and ratio of rib-rib can be evaluated by observations of field. In a preferred embodiment, the height or weight, or the height and weight of the plants, is substantially the same as that of the control plants. In another preferred embodiment, no significant differences are found in the dried leaves collected from the plants compared to a control, indicating that the modulation of the NtMRP transcripts does not have a statistically relevant effect on the dry biomass.

Un aspecto es una semilla de la planta mutante, la planta de origen no natural, la planta híbrida o la planta transgénica. Preferentemente, la semilla es una semilla de tabaco. Otro aspecto es el polen o un óvulo de la planta mutante, la planta de origen no natural, la planta híbrida o la planta transgénica. Además, se describe una planta mutante, una planta de origen no natural, una planta híbrida, una planta transgénica que comprende además un polinucleótido que confiere esterilidad masculina.One aspect is a seed of the mutant plant, the plant of non-natural origin, the hybrid plant or the transgenic plant. Preferably, the seed is a tobacco seed. Another aspect is the pollen or an ovule of the mutant plant, the plant of non-natural origin, the hybrid plant or the transgenic plant. In addition, a mutant plant, a plant of non-natural origin, a hybrid plant, a transgenic plant further comprising a polynucleotide that confers male sterility is described.

La descripción proporciona además un cultivo de tejidos de células regenerables de la planta mutante, planta de origen no natural, planta híbrida, o planta transgénica o una parte de estas, cuyo cultivo regenera plantas capaces de expresar todas las características morfológicas y fisiológicas del parental. Las células regenerables incluyen, pero no se limitan a, células de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, raíces, extremos de raíces, anteras, flores y una parte de estas, óvulos, brotes, tallos, rabillos, médula y cápsulas o callos o protoplastos derivados de ellos.The description also provides a tissue culture of regenerable cells of the mutant plant, plant of non-natural origin, hybrid plant, or transgenic plant or a part thereof, whose culture regenerates plants capable of expressing all the morphological and physiological characteristics of the parent. Regenerative cells include, but are not limited to, leaf cells, pollen, embryos, cotyledons, hypocotyls, roots, root tips, anthers, flowers and a part of these, ovules, shoots, stems, spines, marrow and capsules or calluses or protoplasts derived from them.

En algunas modalidades, una planta en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP se modula (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles disminuidos de metal pesado - tal como cadmio - especialmente en las hojas. El nivel de cadmio puede reducirse en al menos aproximadamente 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más - tal como 100 %, 125 %, 150 % o 200 % o más en comparación con el nivel de cadmio en una planta control correspondiente en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP no se ha modulado (por ejemplo, reducido o inhibido). En algunas modalidades, una planta en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP se modula (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles aumentados o disminuidos de cadmio en las raíces. En algunas modalidades, una planta en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP se modula (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles disminuidos o aumentados de cadmio en las raíces y niveles disminuidos de cadmio en las hojas. En algunas modalidades, una planta en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP se modula (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles disminuidos de cadmio en biomasa cosechable. In some embodiments, a plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide is modulated (eg, reduced or inhibited) may have decreased levels of heavy metal - such as cadmium - especially in the leaves. The level of cadmium can be reduced by at least about 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18 %, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more - such as 100%, 125%, 150% or 200% or more as compared to the level of cadmium in a corresponding control plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide has not been modulated (e.g. , reduced or inhibited). In some embodiments, a plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide is modulated (eg, reduced or inhibited) may have increased or decreased levels of cadmium in the roots. In some embodiments, a plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide is modulated (eg, reduced or inhibited) may have decreased or increased levels of cadmium in the roots and decreased levels of cadmium in the leaves. In some embodiments, a plant in which the expression of the NtMRP polynucleotide is modulated (eg, reduced or inhibited) may have decreased levels of cadmium in harvestable biomass.

La expresión puede evaluarse mediante el uso de métodos que incluyen, por ejemplo, RT-PCR, transferencias de Northern, protección de RNasa, extensiones de cebadores, transferencias Western, electroforesis en gel de proteínas, inmunoprecipitación, inmunoensayos ligados a enzimas, ensayos de chips y espectrometría de masas. Debe señalarse que si un polipéptido se expresa bajo el control de un promotor con preferencia tisular o de amplia expresión, la expresión puede evaluarse en toda la planta o en un tejido seleccionado. De manera similar, si un polipéptido se expresa en un momento particular, por ejemplo, en un momento particular del desarrollo o tras la inducción, la expresión puede evaluarse selectivamente en un periodo de tiempo deseado.Expression can be assessed by the use of methods including, for example, RT-PCR, Northern blots, RNase protection, primer extensions, Western blots, protein gel electrophoresis, immunoprecipitation, enzyme-linked immunoassays, chip assays and mass spectrometry. It should be noted that if a polypeptide is expressed under the control of a promoter with a preference for tissue or wide expression, the expression can be evaluated in the whole plant or in a selected tissue. Similarly, if a polypeptide is expressed at a particular time, for example, at a particular time of development or upon induction, the expression can be selectively evaluated over a desired period of time.

Una población de plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas puede tamizarse o seleccionarse en busca de los miembros de la población que tienen un rasgo o fenotipo deseado. Por ejemplo, una población de la progenie de un solo evento de transformación puede tamizarse para detectar las plantas que tienen un nivel deseado de la expresión del polipéptido o polinucleótido NtMRP. Pueden usarse métodos físicos y bioquímicos para identificar los niveles de expresión. Estos incluyen análisis de Southern o amplificación por PCR para la detección de un polinucleótido; transferencias tipo Northern, protección de S1 RNasa, extensión de cebadores, o amplificación por RT-PCR para detectar transcritos de ARN; ensayos enzimáticos para detectar la actividad de enzima o ribozima de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis en gel de proteínas, transferencias tipo Western, inmunoprecipitación, e inmunoensayos con unión a enzimas para detectar polipéptidos. Otras técnicas tales como hibridación in situ, tinción enzimática, e inmunotinción pueden usarse además para detectar presencia o expresión de polipéptidos o polinucleótidos.A population of mutant, non-natural or transgenic plants can be screened or screened for members of the population that have a desired trait or phenotype. For example, a population of the progeny of a single transformation event can be screened to detect plants that have a desired level of NtMRP polypeptide or polynucleotide expression. Physical and biochemical methods can be used to identify levels of expression. These include Southern analysis or PCR amplification for the detection of a polynucleotide; Northern blots, S1 RNase protection, primer extension, or RT-PCR amplification to detect RNA transcripts; enzymatic assays for detecting the enzyme or ribozyme activity of polypeptides and polynucleotides; and protein gel electrophoresis, Western blots, immunoprecipitation, and enzyme-linked immunoassays to detect polypeptides. Other techniques such as in situ hybridization, enzymatic staining, and immunostaining may also be used to detect the presence or expression of polypeptides or polynucleotides.

Una población de plantas puede tamizarse para aquellas plantas que tienen un rasgo deseado, tal como un nivel modulado (por ejemplo, reducido o inhibido) de cadmio. La selección o selección puede llevarse a cabo durante una o más generaciones, o en más de una localización geográfica. En algunos casos, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas pueden cultivarse y seleccionarse en condiciones que inducen un fenotipo deseado o son necesarias de cualquier otra manera para producir un fenotipo deseado en una planta mutante, de origen no natural o transgénica. Además, la selección o tamizaje puede aplicarse durante una etapa de desarrollo particular en la cual se espera que el fenotipo sea exhibido por la planta. La selección o tamizaje puede llevarse a cabo para elegir aquellas plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que tienen una diferencia significativa estadísticamente en su contenido de cadmio en relación con una planta control en la cual la expresión o actividad del polinucleótido o proteína NtMRP no se ha modulado (por ejemplo, reducido o inhibido).A population of plants can be screened for those plants that have a desired trait, such as a modulated (eg, reduced or inhibited) level of cadmium. The selection or selection can be carried out for one or more generations, or in more than one geographical location. In some cases, mutant, non-natural or transgenic plants can be grown and selected under conditions that induce a desired phenotype or are otherwise needed to produce a desired phenotype in a mutant, non-natural or transgenic plant. In addition, selection or screening may be applied during a particular developmental stage in which the phenotype is expected to be exhibited by the plant. The selection or screening can be carried out to choose those mutant, non-natural or transgenic plants that have a statistically significant difference in their cadmium content in relation to a control plant in which the expression or activity of the NtMRP polynucleotide or protein does not it has been modulated (for example, reduced or inhibited).

Las plantas y células vegetales mutantes, de origen no natural o transgénicas que se describen en la presente descripción comprenden uno o más polinucleótidos recombinantes - tales como el polinucleótido aislado, el gen quimérico, el constructo polinucleotídico, el ARN bicatenario, el conjugado o el vector de expresión. Una planta o célula vegetal puede transformarse al tener el polinucleótido recombinante integrado en su genoma para convertirse en transformada de manera estable. Las células transformadas de manera estable típicamente retienen el polinucleótido introducido con cada división celular. Una planta o célula vegetal puede, además, transformarse transitoriamente de manera que el polinucleótido recombinante no se integra en su genoma. Las células transformadas de manera transitoria pierden típicamente todo o alguna porción del polinucleótido recombinante introducido con cada división celular, de manera que el polinucleótido recombinante introducido no puede detectarse en las células hijas después de un número suficiente de divisiones celulares.The plants and mutant, non-natural or transgenic plant cells described in the present disclosure comprise one or more recombinant polynucleotides - such as the isolated polynucleotide, the chimeric gene, the polynucleotide construct, the double-stranded RNA, the conjugate or the vector expression. A plant or plant cell can be transformed by having the recombinant polynucleotide integrated into its genome to become stably transformed. Stably transformed cells typically retain the polynucleotide introduced with each cell division. A plant or plant cell can also be transformed transiently so that the recombinant polynucleotide is not integrated into its genome. Transiently transformed cells typically lose all or some portion of the recombinant polynucleotide introduced with each cell division, so that the introduced recombinant polynucleotide can not be detected in the daughter cells after a sufficient number of cell divisions.

Las técnicas para introducir polinucleótidos en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por vector viral, electroporación y transformación con pistola de partículas. El sistema de Agrobacterium para la integración de polinucleótido foráneo en cromosomas de plantas se ha estudiado, modificado, y explotado extensamente para la ingeniería genética de plantas. Las moléculas de polinucleótido recombinante desnudo que comprenden secuencias de polinucleótido que corresponden a la proteína purificada objetivo unida operativamente, en la orientación sentido o antisentido, a secuencias regulatorias, se unen a secuencias de T-ADN apropiadas mediante métodos convencionales. Estas se introducen en protoplastos de tabaco mediante técnicas con polietilenglicol o mediante técnicas de electroporación, las cuales son estándar. Alternativamente, dichos vectores que comprenden moléculas de polinucleótido recombinante que codifican la proteína objetivo purificada se introducen en células vivas de Agrobacterium, las que después transfieren el polinucleótido dentro de las células vegetales. La transformación por polinucleótido desnudo sin secuencias acompañantes del vector de T-ADN puede llevarse a cabo mediante la fusión de protoplastos con liposomas que contienen polinucleótido o mediante electroporación. El polinucleótido desnudo no acompañado por secuencias del vector de T-ADN puede usarse, además, para transformar células mediante microproyectiles inertes, de velocidad alta.Techniques for introducing polynucleotides into monocotyledonous and dicotyledonous plants are known in the art and include, for example, Agrobacterium-mediated transformation, viral vector mediated transformation, electroporation and particle gun transformation. The Agrobacterium system for the integration of foreign polynucleotide into plant chromosomes has been studied, modified, and extensively exploited for the genetic engineering of plants. The naked recombinant polynucleotide molecules comprising polynucleotide sequences corresponding to the target purified protein operably linked, in sense or antisense orientation, to regulatory sequences, bind to appropriate T-DNA sequences by conventional methods. These are introduced into tobacco protoplasts by polyethylene glycol techniques or by electroporation techniques, which are standard. Alternatively, said vectors comprising recombinant polynucleotide molecules encoding the purified target protein are introduced into live Agrobacterium cells, which then transfer the polynucleotide into the plant cells. Transformation by naked polynucleotide without accompanying sequences of the T-DNA vector can be carried out by fusion of protoplasts with polynucleotide-containing liposomes or by electroporation. The naked polynucleotide unaccompanied by sequences of the T-DNA vector can also be used to transform cells by high-speed inert microprojectiles.

Si se usa una célula o tejido en cultivo como el tejido recipiente para la transformación, las plantas pueden regenerarse a partir de cultivos transformados si se desea, mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica.If a cell or tissue in culture is used as the recipient tissue for transformation, plants can be regenerated from transformed cultures if desired, by techniques known to those skilled in the art.

La elección de incluir regiones regulatorias en un constructo recombinante depende de varios factores, lo que incluye, pero no se limita a, eficiencia, selectividad, inducibilidad, nivel de expresión deseado, y expresión preferencial en células o tejidos. Para un experto en la técnica es un asunto de rutina modular la expresión de una secuencia codificante mediante la selección y ubicación apropiada de las regiones regulatorias con relación a la secuencia codificante. La transcripción de un polinucleótido puede modularse de manera similar. Algunas regiones regulatorias adecuadas inician la transcripción solo, o predominantemente, en ciertos tipos celulares. Los métodos para identificar y caracterizar regiones regulatorias en polinucleótidos genómicos de plantas se conocen en la técnica.The choice to include regulatory regions in a recombinant construct depends on several factors, including, but not limited to, efficiency, selectivity, inducibility, level of expression desired, and preferential expression in cells or tissues. It is a matter of routine for a person skilled in the art to modulate the expression of a coding sequence by selecting and appropriately locating the regulatory regions relative to the coding sequence. The transcription of a polynucleotide can be modulated in a similar manner. Some appropriate regulatory regions initiate transcription only, or predominantly, in certain cell types. Methods for identifying and characterizing regulatory regions in genomic plant polynucleotides are known in the art.

Los promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejidos reconocidos por factores específicos de tejidos presentes en diferentes tejidos o tipos celulares (por ejemplo, promotores específicos de la raíz, promotores específicos de brotes, promotores específicos de xilema), o presentes durante diferentes etapas del desarrollo, o presentes en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores adecuados incluyen promotores constitutivos que pueden activarse en la mayoría de los tipos celulares sin requerir inductores específicos. Los ejemplos de promotores adecuados para controlar la producción de polipéptidos de ARNi de NtMRP incluyen los promotores de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o los promotores de ubiquitina o faseolina. Los expertos en la técnica son capaces de generar variaciones múltiples de promotores recombinantes.Suitable promoters include tissue-specific promoters recognized by tissue-specific factors present in different tissues or cell types (eg, root specific promoters, shoot-specific promoters, xylem-specific promoters), or present during different stages of development, or present in response to different environmental conditions. Suitable promoters include constitutive promoters that can be activated in most cell types without requiring specific inductors. Examples of suitable promoters for controlling the production of NtMRP RNAi polypeptides include the 35S promoters of cauliflower mosaic virus (CaMV / 35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, we or the promoters of ubiquitin or phaseolin. Those skilled in the art are capable of generating multiple variations of recombinant promoters.

Los promotores específicos de tejidos son elementos de control transcripcional que solo son activos en células o tejidos particulares en momentos específicos durante el desarrollo de la planta, tal como en tejidos vegetativos o tejidos reproductivos. La expresión específica de tejidos puede ser ventajosa, por ejemplo, cuando se prefiere la expresión de polinucleótidos en ciertos tejidos. Los ejemplos de promotores específicos de tejidos bajo control del desarrollo incluyen promotores que pueden iniciar la transcripción solo (o solo fundamentalmente) en ciertos tejidos, tales como tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces u hojas, o tejidos reproductivos, tales como frutos, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores, o cualquier tejido embrionario. Los promotores específicos de tejidos reproductivos pueden ser, por ejemplo, específicos de anteras, específicos de óvulos, específicos de embriones, específicos del endospermo, específicos del tegumento, específicos de la cubierta de semillas y de semillas, específicos del polen, específicos de pétalos, específicos de sépalos, o sus combinaciones.Tissue-specific promoters are transcriptional control elements that are only active in particular cells or tissues at specific times during the development of the plant, such as in vegetative tissues or reproductive tissues. Tissue-specific expression may be advantageous, for example, when the expression of polynucleotides in certain tissues is preferred. Examples of tissue-specific promoters under development control include promoters that can initiate transcription only (or only fundamentally) in certain tissues, such as vegetative tissues, eg, roots or leaves, or reproductive tissues, such as fruits, ovules, seeds, pollen, pistils, flowers, or any embryonic tissue. The specific promoters of reproductive tissues may be, for example, anther-specific, ovum-specific, embryo-specific, endosperm-specific, tegument-specific, seed-specific and seed-specific, pollen-specific, petal-specific, specific sepals, or combinations thereof.

Los promotores específicos de hojas adecuados incluyen el promotor de piruvato, ortofosfato diquinasa (PPDK) de plantas C4 (maíz), promotor cab-m1Ca+2 del maíz, el promotor del gen relacionado con myb de Arabidopsis thaliana (Atmyb5), los promotores de ribulosa bifosfato carboxilasa (RBCS) (por ejemplo, los genes de tomate RBCS 1, RBCS2 y RBCS3A expresados en hojas y plántulas cultivadas a la luz, RBCS1 y RBCS2 expresados en frutos de tomate en desarrollo o el promotor de ribulosa bisfosfato carboxilasa expresado casi exclusivamente en células del mesófilo en las láminas y las vainas foliares en niveles altos).Specific promoters of suitable leaves include the pyruvate promoter, orthoprosphate di kinase (PPDK) from C4 plants (maize), cab-m1Ca + 2 promoter from maize, the myb-related gene promoter from Arabidopsis thaliana (Atmyb5), the promoters from ribulose bisphosphate carboxylase (RBCS) (for example, the RBCS 1, RBCS2 and RBCS3A tomato genes expressed in light-cultured leaves and seedlings, RBCS1 and RBCS2 expressed in tomato fruits under development or the ribulose bisphosphate carboxylase promoter expressed almost exclusively in mesophyll cells in the leaves and leaf sheaths in high levels).

Los promotores adecuados específicos de la senescencia incluyen un promotor de tomate activo durante la maduración de los frutos, la senescencia y la abscisión de las hojas, un promotor de maíz del gen que codifica una cisteína proteasa. Pueden usarse promotores específicos de anteras adecuados. Pueden seleccionarse promotores adecuados con preferencia por la raíz conocidos por los expertos en la técnica. Los promotores adecuados con preferencia por las semillas incluyen tanto los promotores específicos de semillas (aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como los promotores de proteínas de almacenamiento en semillas) y promotores de la germinación de semillas (aquellos promotores activos durante la germinación de semillas). Dichos promotores con preferencia por las semillas incluyen, pero no se limitan a, Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maíz); milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa); mZE40-2, conocido además como Zm-40; nuclc; y celA (celulosa sintasa). Gama-zeína es un promotor específico del endospermo. Glob-1 es un promotor específico del embrión. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, beta-faseolina de frijol, napin, pp-conglicinina, lectina de frijol de soja, cruciferina, y similares. Para las monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, un promotor de zeína de 15 kDa de maíz, un promotor de zeína de 22 kDa, un promotor de zeína de 27 kDa, un promotor de g-zeína, un promotor de YY-zeína de 27 kDa (tal como el promotor gzw64A, ver número de acceso al banco de genes S78780), un promotor ceroso, un promotor shrunken 1, un promotor shrunken 2, un promotor de globulina 1 (ver el número de acceso al banco de genes L22344), un promotor Itp2, promotor cim1, promotores de maíz end1 y end2, promotor nuc1, promotor Zm40, eep1 y eep2; promotor lec1, tioredoxina H; promotor mlip15, promotor PCNA2; y el promotor shrunken-2.Suitable promoters specific to senescence include an active tomato promoter during fruit ripening, senescence and abscission of the leaves, a corn promoter of the gene encoding a cysteine protease. Suitable anther-specific promoters can be used. Suitable promoters can be selected with preference for root known to those skilled in the art. Suitable promoters with preference for seeds include both seed-specific promoters (those promoters active during seed development such as promoters of seed storage proteins) and seed germination promoters (those promoters active during germination). of seeds). Said promoters with preference for seeds include, but are not limited to, Cim1 (message induced by cytokinin); cZ19B1 (19 kDa corn zein); milps (myo-inositol-1-phosphate synthase); mZE40-2, also known as Zm-40; nuclc; and celA (cellulose synthase). Gama-zein is a specific endosperm promoter. Glob-1 is a specific promoter of the embryo. For dicots, seed-specific promoters include, but are not limited to, bean beta-phaseolin, napin, pp-conglycinin, soy bean lectin, cruciferin, and the like. For monocotyledons, seed-specific promoters include, but are not limited to, a 15 kDa corn zein promoter, a 22 kDa zein promoter, a 27 kDa zein promoter, a g-zein promoter, a 27 kDa YY-zein promoter (such as the gzw64A promoter, see accession number to gene bank S78780), a waxy promoter, a shrunken 1 promoter, a shrunken 2 promoter, a globulin 1 promoter (see number for access to gene bank L22344), an Itp2 promoter, cim1 promoter, end1 and end2 corn promoters, nuc1 promoter, Zm40 promoter, eep1 and eep2; promoter lec1, thioredoxin H; promoter mlip15, promoter PCNA2; and the shrunken-2 promoter.

Los ejemplos de promotores inducibles incluyen promotores que responden al ataque de patógenos, condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, luz, sequía, temperatura fría, o concentración alta de sales. Los promotores inducibles por patógenos incluyen aquellos de las proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), las cuales se inducen después de una infección por un patógeno (por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa).Examples of inducible promoters include promoters that respond to pathogen attack, anaerobic conditions, elevated temperature, light, drought, cold temperature, or high salt concentration. Pathogen-inducible promoters include those of the pathogenesis related proteins (PR proteins), which are induced after infection by a pathogen (eg, PR proteins, SAR proteins, beta-1,3-glucanase, chitinase) .

Adicionalmente a los promotores de plantas, otros promotores adecuados pueden derivarse de un origen bacteriano por ejemplo, el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa y otros promotores derivados de plásmidos Ti), o pueden derivar de promotores virales (por ejemplo, promotores de ARN 35S y 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), promotores constitutivos del virus del mosaico del tabaco, promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), o el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia).In addition to the plant promoters, other suitable promoters can be derived from a bacterial origin eg, the octopine synthase promoter, the nopaline synthase promoter and other promoters derived from Ti) plasmids, or they can be derived from viral promoters (eg, promoters). of RNA 35S and 19S of cauliflower mosaic virus (CaMV), constitutive promoters of tobacco mosaic virus, 19S and 35S promoters of cauliflower mosaic virus (CaMV), or the 35S promoter of the mosaic virus of the escrofularia).

Los ejemplos de restos conjugados incluyen compuestos macromoleculares tales como proteínas (por ejemplo, anticuerpos), cadenas de ácidos grasos, residuos de azúcar, glicoproteínas, polímeros (por ejemplo, polietilenglicol) o sus combinaciones. Un oligonucleótido puede conjugarse con un resto que aumenta la captación celular del oligonucleótido.Examples of conjugated moieties include macromolecular compounds such as proteins (e.g., antibodies), fatty acid chains, sugar residues, glycoproteins, polymers (e.g., polyethylene glycol) or their combinations. An oligonucleotide can be conjugated with a moiety that increases the cellular uptake of the oligonucleotide.

Los ejemplos no limitantes de restos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, polipéptidos, restos lipídicos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-s-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, restos de dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1-di-o-hexadecil-rac-glicero-S-h-fosfonato, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, un ácido acético adamantano, un resto de palmitilo, un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.Non-limiting examples of moieties include, but are not limited to, antibodies, polypeptides, lipid moieties such as a cholesterol moiety, cholic acid, a thioether, for example, hexyl-s-tritylthiol, a thiocholesterol, an aliphatic chain, example, residues of dodecanediol or undecyl, a phospholipid, for example, di-hexadecyl-rac-glycerol or triethylammonium 1-di-o-hexadecyl-rac-glycero-Sh-phosphonate, a polyamine or a polyethylene glycol chain, an acetic acid adamantane, a palmityl residue, a octadecylamine or hexylamino-carbonyl-oxy-cholesterol radical.

El resto puede ser un polímero cargado positivamente, tal como un péptido cargado positivamente que tiene, por ejemplo, aproximadamente 1 a 50 restos de aminoácidos de longitud u óxido de polialquileno tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. Adecuadamente, el polímero cargado positivamente, tal como un óxido de polialquileno, puede unirse al oligómero a través de un enlazador tal como un enlazador liberable.The remainder may be a positively charged polymer, such as a positively charged peptide having, for example, about 1 to 50 amino acid residues in length or polyalkylene oxide such as polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol. Suitably, the positively charged polymer, such as a polyalkylene oxide, can be attached to the oligomer through a linker such as a releasable linker.

Cuando se mide la expresión del polipéptido NtMRP, la detección de la cantidad de ARNm que codifica un polipéptido NtMRP en la célula puede cuantificarse mediante, por ejemplo, PCR o transferencia de Northern. Cuando se mide un cambio en la cantidad de polipéptido NtMRP en la muestra, la detección de NtMRP mediante el uso de anticuerpos anti-NtMRP puede usarse para cuantificar la cantidad de polipéptido NtMRP en la célula mediante el uso de técnicas conocidas. Alternativamente, la actividad biológica (por ejemplo, el transporte de metales pesados - tales como el cadmio) puede medirse antes y después del contacto con el agente de prueba. When the expression of the NtMRP polypeptide is measured, the detection of the amount of mRNA encoding an NtMRP polypeptide in the cell can be quantified by, for example, PCR or Northern blotting. When a change in the amount of NtMRP polypeptide in the sample is measured, the detection of NtMRP by the use of anti-NtMRP antibodies can be used to quantitate the amount of NtMRP polypeptide in the cell by the use of known techniques. Alternatively, the biological activity (eg, the transport of heavy metals - such as cadmium) can be measured before and after contact with the test agent.

En otra modalidad, en la presente descripción se proporcionan anticuerpos que son inmunorreactivos con los polipéptidos. Los polipéptidos NtMRP, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares, como los que se expone en la presente descripción, pueden emplearse como "inmunógenos" en la producción de anticuerpos inmunorreactivos con ellos. Dichos anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos mediante los sitios de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos de unión específica son aquellos que reconocerán específicamente y se unirán con polipéptidos de la familia NtMRP, homólogos y variantes, pero no con otras moléculas. En una modalidad, los anticuerpos son específicos para polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de NtMRP como se expone en la presente descripción y no reaccionan de manera cruzada con otros polipéptidos.In another embodiment, antibodies that are immunoreactive with the polypeptides are provided in the present disclosure. NtMRP polypeptides, fragments, variants, fusion polypeptides, and the like, as set forth in the present disclosure, may be employed as "immunogens" in the production of immunoreactive antibodies therewith. Said antibodies bind specifically to the polypeptides through the antigen-binding sites of the antibody. The specific binding antibodies are those that will specifically recognize and bind with polypeptides of the NtMRP family, homologs and variants, but not with other molecules. In one embodiment, the antibodies are specific for polypeptides having an amino acid sequence of NtMRP as set forth in the present disclosure and do not cross-react with other polypeptides.

Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares contienen determinantes antigénicos o epítopos que provocan la formación de anticuerpos. Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales se componen de una sola sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos se componen de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena del polipéptido que quedan en una proximidad cercana tras el plegamiento del polipéptido. Los epítopos pueden identificarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente, los epítopos de los polipéptidos pueden usarse como reactivos de investigación, en ensayos, y para purificar anticuerpos de unión específica a partir de sustancias tales como sueros policlonales o sobrenadantes a partir de hibridomas cultivados. Dichos epítopos o variantes de estos pueden producirse mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica tales como síntesis en fase sólida, escisión química o enzimática de un polipéptido, o con el uso de la tecnología de ADN recombinante.More specifically, polypeptides, fragments, variants, fusion polypeptides, and the like contain antigenic determinants or epitopes that elicit the formation of antibodies. These antigenic determinants or epitopes can be linear or conformational (discontinuous). Linear epitopes are composed of a single amino acid section of the polypeptide, while conformational or batch epitopes are composed of sections of amino acids from different regions of the polypeptide chain that remain in close proximity upon folding of the polypeptide. The epitopes can be identified by any of the methods known in the art. Additionally, the epitopes of the polypeptides can be used as research reagents, in assays, and to purify specific binding antibodies from substances such as polyclonal sera or supernatants from cultured hybridomas. Said epitopes or variants thereof may be produced by the use of techniques known in the art such as solid phase synthesis, chemical or enzymatic cleavage of a polypeptide, or with the use of recombinant DNA technology.

Tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales para los polipéptidos pueden prepararse mediante técnicas convencionales. Las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos también se abarcan en la presente descripción. Dichos hibridomas pueden producirse e identificarse mediante técnicas convencionales. Para la producción de anticuerpos, varios animales huésped pueden inmunizarse mediante inyección con un polipéptido NtMRP, fragmento, variante, o mutantes de estos. Dichos animales huéspedes pueden incluir, pero no se limitan a, conejos, ratones, y ratas, por nombrar algunos. Pueden usarse varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. En dependencia de la especie huésped, tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, el adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes útiles potencialmente en humanos tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales pueden recuperarse mediante técnicas convencionales. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina lo que incluye IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de estas.Both polyclonal and monoclonal antibodies to the polypeptides can be prepared by conventional techniques. Hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies specific for the polypeptides are also encompassed in the present disclosure. Said hybridomas can be produced and identified by conventional techniques. For the production of antibodies, several host animals can be immunized by injection with an NtMRP polypeptide, fragment, variant, or mutants thereof. Such host animals may include, but are not limited to, rabbits, mice, and rats, to name a few. Various adjuvants can be used to increase the immune response. Depending on the host species, such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, emulsions in oil, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol, and potentially useful adjuvants in humans such as BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum. The monoclonal antibodies can be recovered by conventional techniques. Said monoclonal antibodies can be of any kind of immunoglobulin which includes IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, and any subclass thereof.

Los anticuerpos pueden usarse, además, en ensayos para detectar presencia de los polipéptidos o fragmentos, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos pueden emplearse además en la purificación de polipéptidos o fragmentos mediante cromatografía de inmunoafinidad.The antibodies can also be used in assays to detect the presence of the polypeptides or fragments, either in vitro or in vivo. The antibodies can be further employed in the purification of polypeptides or fragments by immunoaffinity chromatography.

Diversas modalidades proporcionan plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas, así como también biomasa y semillas en las cuales el nivel de expresión del polinucleótido NtMRP se reduce sustancialmente para reducir o impedir el transporte de cadmio hacia la lámina foliar. La lámina foliar puede incorporarse en diversos productos consumibles - tales como varios artículos fumables, tales como puros, cigarrillos y productos de tabaco sin humo (es decir, no combustibles). Various embodiments provide mutant, non-natural or transgenic plants, as well as biomass and seeds in which the level of expression of the NtMRP polynucleotide is substantially reduced to reduce or prevent the transport of cadmium to the leaf blade. The leaf blade can be incorporated into various consumable products - such as various smokable articles, such as cigars, cigarettes and smokeless (ie, non-combustible) tobacco products.

La reducción del % de cadmio en estos artículos fumables y productos sin humo puede ser un valor de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, 200 % o 300 % menos, cuando se comparan con los productos consumibles derivados de contrapartes no mutantes, de origen no natural o no transgénicos. En algunas modalidades, el contenido de cadmio de estos artículos fumables y productos sin humo es un valor de un intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 partes por millón (ppm), de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, desde de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm. En algunas modalidades, el contenido de cadmio de estos artículos fumables y productos sin humo es aproximadamente 0,001 ppm o menos, aproximadamente 0,01 ppm o menos o aproximadamente 0,05 ppm o menos, o aproximadamente 0,49 ppm o menos o aproximadamente 0,5 ppm o menos.The reduction of% cadmium in these smokable articles and smokeless products can be a value of at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50 %, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%, 200% or 300% less , when compared with consumable products derived from non-mutant counterparts, of non-natural or non-transgenic origin. In some embodiments, the cadmium content of these smokable articles and smokeless products is a value ranging from about 0.01 to about 0.05 parts per million (ppm), from about 0.01 to about 0.1 ppm. , from about 0.01 to about 0.5 ppm, from about 0.01 to about 1.0 ppm, or from about 0.01 to about 5 ppm. In some embodiments, the cadmium content of these smokable articles and smokeless products is about 0.001 ppm or less, about 0.01 ppm or less or about 0.05 ppm or less, or about 0.49 ppm or less or about 0 , 5 ppm or less.

El grado de acumulación de cadmio en las plantas puede variar sustancialmente en dependencia de varios parámetros atribuidos a la complejidad del genotipo y al ambiente de cultivo. Por ejemplo, las concentraciones de cadmio en hojas de tabaco cultivado en el campo pueden variar mucho en dependencia de factores tales como el agroclima, la calidad del suelo, los cultivares, y el tipo y origen del fertilizante usado. Además, los patrones relativos de la distribución de cadmio dentro de diferentes porciones de una planta de tabaco pueden variar de acuerdo con la especie, el órgano/tejido, y las condiciones de cultivo (es decir, cultivado en el campo frente a cultivado en hidropónico). Como promedio, las concentraciones de cadmio medidas en hojas de tabaco cultivado en el campo (lo que incluye nervaduras y venas) pueden estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 5 ppm (partes por millón, o microgramos/gramo de peso seco de hojas de tabaco). Sin embargo, muchos niveles de cadmio publicados no definen típicamente la etapa de madurez del tabaco, la variedad de tabaco, o las porciones de la hoja particulares (es decir, remoción a partir de la posición del tallo de la hoja) cosechadas para el análisis. En algunas variedades, las hojas inferiores pueden acumular niveles de cadmio más altos que las hojas medias y superiores. A nivel intracelular, el cadmio puede encontrarse en diversos componentes celulares de una célula vegetal, lo que incluye la pared celular, citoplasma, cloroplastos, núcleo y vacuolas.The degree of accumulation of cadmium in plants can vary substantially depending on several parameters attributed to the complexity of the genotype and the growing environment. For example, the concentrations of cadmium in leaves of tobacco grown in the field can vary greatly depending on factors such as the agroclimate, the quality of the soil, the cultivars, and the type and origin of the fertilizer used. In addition, the relative patterns of the distribution of cadmium within different portions of a tobacco plant may vary according to the species, organ / tissue, and culture conditions ( ie, cultivated in the field versus cultivated in hydroponics). ). On average, the cadmium concentrations measured in tobacco leaves grown in the field (which includes ribs and veins) may be in the range of about 0.5 to 5 ppm (parts per million, or micrograms / gram of dry weight of tobacco leaves). However, many published levels of cadmium typically do not define the stage of maturity of the tobacco, the variety of tobacco, or the particular leaf portions (ie, removal from the position of the leaf stem) harvested for the analysis . In some varieties, the lower leaves can accumulate cadmium levels higher than the middle and upper leaves. At the intracellular level, cadmium can be found in various cellular components of a plant cell, including the cell wall, cytoplasm, chloroplasts, nucleus and vacuoles.

Además, el contenido de cadmio medido en las hojas de tabaco puede variar sustancialmente en dependencia de los niveles de cadmio en el ambiente del suelo donde las plantas de tabaco se cultivaron. Las hojas de tabaco cultivadas en zonas contaminadas con cadmio pueden acumular cadmio de aproximadamente 35 ppm o superior, en comparación con las hojas de las contrapartes idénticas genéticamente cultivadas en zonas no contaminadas, que pueden acumular cadmio en un intervalo de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 8 ppm. Las vacuolas dentro de las hojas de plantas cultivadas en zonas contaminadas con cadmio pueden acumular concentraciones de cadmio muy altas. Los expertos en la técnica conocen los métodos para aplicar las composiciones descritas para que sean adecuadas para una especie de planta dada de interés.In addition, the cadmium content measured in the tobacco leaves can vary substantially depending on the levels of cadmium in the soil environment where the tobacco plants were grown. Tobacco leaves grown in areas contaminated with cadmium can accumulate cadmium of about 35 ppm or higher, compared to the leaves of identical counterparts genetically grown in uncontaminated areas, which can accumulate cadmium in a range of about 0.4 to about 8 ppm. Vacuoles within the leaves of plants grown in areas contaminated with cadmium can accumulate very high concentrations of cadmium. Those skilled in the art know the methods for applying the compositions described to be suitable for a given plant species of interest.

El contenido de metales pesados en las plantas puede medirse mediante el uso de diversos métodos conocidos en la técnica. Un método preferido comprende el uso de espectrofotometría de masa con plasma acoplado inductivamente ("ICP-MS", Agilent 7500A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA).The content of heavy metals in the plants can be measured by the use of various methods known in the art. A preferred method comprises the use of mass spectrometry with inductively coupled plasma ("ICP-MS", Agilent 7500A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que se describen en la presente descripción pueden tener otros usos, por ejemplo, en la agricultura. Por ejemplo, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas descritas en la presente descripción pueden usarse para producir alimentación animal y productos para la alimentación humana.The mutant, non-natural or transgenic plants described in the present description may have other uses, for example, in agriculture. For example, the mutant, non-natural or transgenic plants described in the present description can be used to produce animal feed and products for human food.

Las semillas de las plantas descritas en la presente descripción pueden acondicionarse y empacarse en material de empaque por medios conocidos en la técnica para conformar un artículo de fabricación. Los materiales de empaque tales como papel y tela se conocen bien en la técnica. Un empaque de semilla puede tener una identificación, por ejemplo, una etiqueta o marcador asegurado al material de empaque, un marcador impreso en el material de empaque, o un marcador insertado dentro del empaque, que describe la naturaleza de las semillas en él.The seeds of the plants described in the present description can be packaged and packaged in packaging material by means known in the art for forming an article of manufacture. Packaging materials such as paper and cloth are well known in the art. A seed package may have an identification, for example, a label or marker secured to the packaging material, a marker printed on the packaging material, or a marker inserted within the package, which describes the nature of the seeds therein.

Una planta portadora de un alelo mutante de NtMRP puede usarse en un programa de mejoramiento de plantas para crear líneas, variedades e híbridos útiles. En particular, el alelo mutante de NtMRP se introgresa en las variedades comercialmente importantes descritas anteriormente. Así, se proporcionan métodos para el mejoramiento de plantas, que comprenden cruzar una planta mutante, una planta de origen no natural o una planta transgénica como se describe en la presente descripción con una planta que comprende una identidad genética diferente. El método puede comprender, además, cruzar la planta de la progenie con otra planta, y repetir opcionalmente el cruzamiento hasta que se obtenga una progenie con los rasgos genéticos o fondo genético conveniente. Un propósito ofrecido por dichos métodos de mejoramiento es introducir un rasgo genético conveniente en otras variedades, líneas de mejoramiento, híbridos o cultivares, particularmente los que son de interés comercial. Otro propósito es facilitar el apilamiento de modificaciones genéticas de diferentes genes en una sola variedad de planta, líneas, híbridos o cultivares. Se contemplan apareamientos intraespecíficos así como también interespecíficos. Las plantas de la progenie que surgen de dichos cruces, también referidas como líneas de mejoramiento, son ejemplos de plantas de origen no natural. A plant carrying a mutant allele of NtMRP can be used in a plant breeding program to create useful lines, varieties and hybrids. In particular, the mutant allele of NtMRP is introgressed into the commercially important varieties described above. Thus, methods for the improvement of plants are provided, which comprise crossing a mutant plant, a non-natural plant or a transgenic plant as described herein with a plant comprising a different genetic identity. The method may further comprise crossing the plant of the progeny with another plant, and optionally repeating the crossing until a progeny with the genetic traits or suitable genetic background is obtained. A purpose offered by such breeding methods is to introduce a suitable genetic trait in other varieties, breeding lines, hybrids or cultivars, particularly those of commercial interest. Another purpose is to facilitate the stacking of genetic modifications of different genes in a single variety of plant, lines, hybrids or cultivars. Intraspecific as well as interspecific matings are contemplated. Progeny plants that emerge from such crosses, also referred to as breeding lines, are examples of plants of non-natural origin.

La huella genética, el polimorfismo de nucleótido único, los marcadores microsatélites, o tecnologías similares pueden usarse en un programa de mejoramiento por selección asistida por marcadores (MAS) para transferir o cruzar alelos mutantes de los genes de NtMRP para otros tabacos, como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, un genetista puede crear poblaciones segregantes a partir de hibridaciones de un genotipo que contiene un alelo mutante con un genotipo conveniente agronómicamente. Las plantas en las generaciones F2 o de retrocruzamiento pueden tamizarse mediante el uso de un marcador desarrollado a partir de una secuencia genómica de NtMRP o un fragmento de esta, con el uso de una de las técnicas enumeradas en la presente descripción. Las plantas identificadas por poseer el alelo mutante pueden retrocruzarse o autopolinizarse para crear una segunda población a tamizar. En dependencia del patrón de herencia esperado o la tecnología MAS usada, puede ser necesario autopolinizar las plantas seleccionadas antes de cada ciclo de retrocruzamiento para ayudar en la identificación de las plantas individuales deseadas. El retrocruzamiento u otro procedimiento de mejoramiento pueden repetirse hasta que se recupere el fenotipo deseado del parental recurrente.The genetic fingerprint, the single nucleotide polymorphism, the microsatellite markers, or similar technologies can be used in a marker-assisted selection (MAS) breeding program to transfer or cross mutant alleles of the NtMRP genes to other tobaccos, as described in the present description. For example, a geneticist can create segregating populations from hybridizations of a genotype containing a mutant allele with a suitable agronomic genotype. Plants in the F2 or backcross generations can be screened by the use of a marker developed from a genomic sequence of NtMRP or a fragment thereof, with the use of one of the techniques listed in the present description. Plants identified as having the mutant allele can backcross or self-pollinate to create a second population to be sifted. Depending on the expected inheritance pattern or MAS used technology, it may be necessary to self-pollinate the selected plants before each backcrossing cycle to assist in the identification of the desired individual plants. The backcrossing or other breeding procedure can be repeated until the desired phenotype of the recurrent parent is recovered.

De conformidad con la descripción, en un programa de mejoramiento, los cruces exitosos producen plantas F1 que son fértiles. Las plantas F1 seleccionadas pueden cruzarse con uno de los parentales, y las plantas de la primera generación del retrocruzamiento se autopolinizan para producir una población que se tamiza de nuevo en busca de una expresión génica variante de NtMRP (por ejemplo, la versión nula del gen NtMRP). El proceso de retrocruzamiento, autopolinización, y tamizaje se repite, por ejemplo, al menos 4 veces hasta que el tamizaje final produce una planta que es fértil y similar razonablemente al parental recurrente. Esta planta, si se desea, se autopoliniza y la progenie se tamiza de nuevo subsecuentemente para confirmar que la planta exhibe una expresión génica variante de NtMRP. En algunas modalidades, una población de plantas en la generación F2 se tamiza para detectar la expresión de un gen variante de NtMRP, por ejemplo, se identifica una planta que no expresa NtMRP debido a la ausencia de un gen NtMRP de conformidad con métodos estándar, por ejemplo, mediante el uso de un método de PCR con cebadores basados en la información de la secuencia nucleotídica para NtMRP descrita en la presente descripción.In accordance with the description, in a breeding program, successful crosses produce F1 plants that are fertile. The selected F1 plants can be crossed with one of the parents, and the first-generation plants of the backcross self-pollinate to produce a population that is screened again for a variant NtMRP gene expression (eg, the null version of the gene). NtMRP). The process of backcrossing, self-pollination, and screening is repeated, for example, at least 4 times until the final screening produces a plant that is fertile and reasonably similar to the recurrent parent. This plant, if desired, is self-pollinated and the progeny is screened again subsequently to confirm that the plant exhibits a variant gene expression of NtMRP. In some embodiments, a plant population in generation F2 is screened for the expression of an NtMRP variant gene, for example, a plant that does not express NtMRP is identified due to the absence of an NtMRP gene in accordance with standard methods, for example, by using a PCR method with primers based on the nucleotide sequence information for NtMRP described in the present disclosure.

Las variedades híbridas pueden producirse al evitar la autopolinización de plantas parentales femeninas (es decir, parentales de semillas) de una primera variedad, lo que permite que el polen de plantas parentales masculinas de una segunda variedad fecunden a las plantas parentales femeninas, y permite que se formen semillas híbridas F1 en las plantas femeninas. La autopolinización de plantas femeninas puede evitarse mediante la emasculación de las flores en una etapa temprana del desarrollo de las flores. Alternativamente, la formación de polen puede evitarse en las plantas parentales femeninas mediante el uso de una forma de esterilidad masculina. Por ejemplo, la esterilidad masculina puede producirse por esterilidad masculina citoplasmática (CMS), o esterilidad masculina transgénica en donde un transgén inhibe la microsporogénesis y/o la formación de polen, o autoincompatibilidad. Las plantas parentales femeninas que contienen CMS son útiles particularmente. En modalidades en las cuales las plantas parentales femeninas son CMS, el polen se cosecha a partir de plantas fértiles masculinas y se aplica manualmente a los estigmas de las plantas parentales femeninas CMS, y se cosecha la semilla F1 resultante.Hybrid varieties can be produced by avoiding the self-pollination of female parent plants (ie, seed parents) of a first variety, which allows the pollen of male parent plants of a second variety to fecundate female parent plants, and allows F1 hybrid seeds are formed in female plants. The self-pollination of female plants can be avoided by the emasculation of flowers at an early stage of flower development. Alternatively, pollen formation can be avoided in female parent plants by the use of a male sterile form. For example, male sterility can be caused by male cytoplasmic sterility (CMS), or transgenic male sterility wherein a transgene inhibits microsporogenesis and / or pollen formation, or self-incompatibility. Female parental plants containing CMS are particularly useful. In embodiments in which the female parent plants are CMS, the pollen is harvested from male fertile plants and applied manually to the stigmas of the CMS female parent plants, and the resulting F1 seed is harvested.

Las variedades y líneas descritas en la presente descripción pueden usarse para formar híbridos F1 de un cruce simple. En dichas modalidades, las plantas de las variedades parentales pueden cultivarse como poblaciones adyacentes homogéneas esencialmente para facilitar la polinización cruzada natural de las plantas parentales masculinas a las plantas parentales femeninas. La semilla F1 formada sobre las plantas parentales femeninas se cosecha selectivamente por medios convencionales. Además, las dos variedades de plantas parentales pueden cultivarse de manera masiva y cosecharse una mezcla de semillas híbridas F1 formadas en el parental femenino y la semilla formada en el parental masculino como el resultado de la autopolinización. Alternativamente, pueden llevarse a cabo cruces de tres vías en donde un híbrido F1 de un cruce simple se usa como un parental femenino y se cruza con un parental masculino diferente. Como otra alternativa, pueden crearse híbridos de cruces dobles en donde la progenie F1 de dos cruces simples diferentes se cruzan entre ellas.The varieties and lines described in the present description can be used to form F1 hybrids of a simple cross. In such embodiments, the plants of the parent varieties can be grown as homogeneous adjacent populations essentially to facilitate natural cross-pollination of the male parent plants to the female parent plants. The F1 seed formed on the female parent plants is selectively harvested by conventional means. In addition, the two varieties of parent plants can be grown massively and a mixture of hybrid F1 seeds formed in the female parent and the seed formed in the male parent as the result of self-pollination can be harvested. Alternatively, three-way crosses can be carried out where an F1 hybrid of a simple cross is used as a female parent and crossed with a different male parent. As another alternative, double-cross hybrids can be created where the F1 progeny of two different simple crosses cross each other.

Una población de plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas puede tamizarse o seleccionarse en busca de los miembros de la población que tienen un rasgo o fenotipo deseado. Por ejemplo, una población de la progenie de un solo evento de transformación puede tamizarse para detectar las plantas que tienen un nivel deseado de la expresión del polipéptido o polinucleótido NtMRP. Pueden usarse métodos físicos y bioquímicos para identificar los niveles de expresión. Estos incluyen análisis de Southern o amplificación por PCR para la detección de un polinucleótido; transferencias tipo Northern, protección de S1 RNasa, extensión de cebadores, o amplificación por RT-PCR para detectar transcritos de ARN; ensayos enzimáticos para detectar la actividad de enzima o ribozima de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis en gel de proteínas, transferencias tipo Western, inmunoprecipitación, e inmunoensayos con unión a enzimas para detectar polipéptidos. Otras técnicas tales como hibridación in situ, tinción enzimática, e inmunotinción pueden usarse además para detectar presencia o expresión de polipéptidos o polinucleótidos.A population of mutant, non-natural or transgenic plants can be screened or screened for members of the population that have a desired trait or phenotype. For example, a population of the progeny of a single transformation event can be screened to detect plants that have a desired level of NtMRP polypeptide or polynucleotide expression. Physical and biochemical methods can be used to identify levels of expression. These include Southern analysis or PCR amplification for the detection of a polynucleotide; Northern blots, S1 RNase protection, primer extension, or RT-PCR amplification to detect RNA transcripts; enzymatic assays for detecting the enzyme or ribozyme activity of polypeptides and polynucleotides; and protein gel electrophoresis, Western blots, immunoprecipitation, and enzyme-linked immunoassays to detect polypeptides. Other techniques such as in situ hybridization, enzymatic staining, and immunostaining may also be used to detect the presence or expression of polypeptides or polynucleotides.

En la presente descripción se describe que las células vegetales o plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas comprenden uno o más polinucleótidos recombinantes, tal como uno o más polinucleótidos NtMRP aislados, una o más constructos de polinucleótidos, uno o más ARN bicatenarios, uno o más conjugados o uno o más vectores/vectores de expresión. In the present description it is described that plant cells or mutant plants of non-natural or transgenic origin comprise one or more recombinant polynucleotides, such as one or more isolated NtMRP polynucleotides, one or more polynucleotide constructs, one or more double-stranded RNAs, one or more conjugates or one or more vectors / expression vectors.

La expresión de NtMRP puede evaluarse mediante el uso de métodos que incluyen, por ejemplo, RT-PCR, transferencias Northern, protección de RNasas, extensiones de cebadores, transferencias Western, electroforesis en gel de proteínas, inmunoprecipitación, inmunoensayos ligados a enzimas, ensayos con chips y espectrometría de masa. Debe señalarse que si un polipéptido se expresa bajo el control de un promotor con preferencia tisular o de amplia expresión, la expresión puede evaluarse en toda la planta o en un tejido seleccionado. De manera similar, si un polipéptido se expresa en un momento particular, por ejemplo, en un momento particular del desarrollo o tras la inducción, la expresión puede evaluarse selectivamente en un periodo de tiempo deseado.The expression of NtMRP can be evaluated by the use of methods including, for example, RT-PCR, Northern blots, RNase protection, primer extensions, Western blots, protein gel electrophoresis, immunoprecipitation, enzyme-linked immunoassays, chips and mass spectrometry. It should be noted that if a polypeptide is expressed under the control of a promoter with a preference for tissue or wide expression, the expression can be evaluated in the whole plant or in a selected tissue. Similarly, if a polypeptide is expressed at a particular time, for example, at a particular time of development or upon induction, the expression can be selectively evaluated over a desired period of time.

Sin limitación, las plantas descritas en la presente descripción pueden modificarse para otros propósitos lo mismo antes que después de que se ha modulado la expresión o la actividad de NtMRP (por ejemplo, reducida o inhibida). Una o más de las siguientes modificaciones genéticas pueden presentarse en las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas. En una modalidad, se modifican además uno o más genes que se involucran en la captación de metales pesados o el transporte de metales pesados lo que resulta en plantas o partes de plantas (tales como hojas) que tienen un menor contenido de metales pesados que las plantas control o partes de estas sin la(s) modificación(es). Los ejemplos no limitantes incluyen genes en la familia de facilitadores de la difusión de cationes (CDF), la familia de proteínas similares a Zrt, Irt (ZIP), la familia de intercambiadores de cationes (CAX), la familia de transportadores de cobre (COPT), la familia de ATPasas tipo P de metales pesados (HMA, como se describe en el documento WO2009074325), la familia de homólogos de proteínas de macrófagos asociadas a la resistencia natural (NRAMP), y otro miembro de la familia de transportadores de casetes de unión al ATP (ABC) que participan en el transporte de metales pesados, tal como cadmio. El término metal pesado como se usa en la presente descripción incluye metales de transición. En otra modalidad, se modifican uno o más genes que se implican en la conversión de intermediarios metabólicos nitrogenados lo que da como resultado plantas o partes de plantas (tal como hojas) que cuando se calientan, producen niveles menores de al menos una nitrosamina específica del tabaco (por ejemplo, 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona, N-nitrosonornicotina, N-nitrosoanatabina, y N-nitrosoanabasina) que las plantas control o partes de estas. Los ejemplos no limitantes de genes que puede modificarse incluyen genes que codifican una nicotina desmetilasa, tales como CYP82E4, CYP82E5 y CYP82E10 las cuales participan en la conversión de nicotina a nornicotina y se describen en los documentos WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 y PCT/US2011/021088.Without limitation, the plants described in the present description may be modified for other purposes the same before after the expression or activity of NtMRP has been modulated (eg, reduced or inhibited). One or more of the following genetic modifications may occur in mutant plants, of non-natural or transgenic origin. In one embodiment, one or more genes that are involved in heavy metal uptake or heavy metal transport are modified resulting in plants or parts of plants (such as leaves) that have a lower heavy metal content than those control plants or parts thereof without the modification (s). Non-limiting examples include genes in the family of cation diffusion facilitators (CDF), the Zrt-like protein family, Irt (ZIP), the cation exchange family (CAX), the copper transporter family ( COPT), the family of heavy metal P-type ATPases (HMA, as described in WO2009074325), the family of protein homologs of macrophages associated with natural resistance (NRAMP), and another member of the family of transporters of ATP-binding cassettes (ABC) involved in the transport of heavy metals, such as cadmium. The term heavy metal as used in the present disclosure includes transition metals. In another embodiment, one or more genes that are involved in the conversion of nitrogen metabolite intermediates are modified, which results in plants or parts of plants (such as leaves) which, when heated, produce lower levels of at least one specific nitrosamine. tobacco (for example, 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanone, N-nitrosonornicotine, N-nitrosoanatabine, and N-nitrosoanabasine) than control plants or parts thereof. Non-limiting examples of genes that can be modified include genes encoding a nicotine demethylase, such as CYP82E4, CYP82E5 and CYP82E10 which participate in the conversion of nicotine to nornicotine and are described in WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 and PCT / US2011 / 021088.

Los ejemplos de otras modificaciones incluyen la tolerancia a herbicidas, por ejemplo, el glifosato es un ingrediente activo de muchos herbicidas de amplio espectro. Las plantas transgénicas resistentes a glifosato se han desarrollado mediante la transferencia del gen aroA (una glifosato EPSP sintetasa de Salmonella typhimurium y E. coli). Las plantas resistentes a la sulfonilurea se han producido mediante la transformación del gen de ALS (acetolactato sintetasa) mutante de Arabidopsis. La proteína OB del fotosistema II del híbrido Amaranthus mutante se ha transferido a plantas para producir plantas transgénicas resistentes a la atrazina; y se han producido plantas transgénicas resistentes a bromoxinilo mediante la incorporación del gen bxn de la bacteria Klebsiella pneumoniae. Otra modificación ilustrativa resulta en plantas que son resistentes a insectos. Las toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) pueden proporcionar una manera efectiva de retrasar la emergencia de pestes resistentes a Bt, como se ilustró recientemente en brócoli donde los genes de Bt cry1Ac y cry1C piramidales controlaron las polillas de dorso de diamante resistentes a cada proteína individual y retrasaron significativamente la evolución de insectos resistentes. Otra modificación ilustrativa resulta en plantas que son resistentes a enfermedades causadas por patógenos (por ejemplo, virus, bacterias, hongos). Se han diseñado genéticamente plantas que expresan el gen Xa21 (resistencia a tizón bacteriano) con plantas que expresan tanto un gen de fusión de Bt y un gen de quitinasa (resistencia al barrenador amarillo del tallo y tolerancia a la vaina). Otra modificación ilustrativa resulta en la capacidad reproductiva alterada, tal como la esterilidad masculina. Otra modificación ilustrativa resulta en plantas que son tolerantes a estrés abiótico (por ejemplo, sequía, temperatura, salinidad), y se han producido plantas transgénicas tolerantes mediante la transferencia de la enzima de acil glicerol fosfato de Arabidopsis; los genes que codifican manitol deshidrogenasa y sorbitol deshidrogenasa que se implican en la síntesis de manitol y sorbitol mejoran la resistencia a la sequía. Otra modificación ilustrativa resulta en plantas que producen proteínas que tienen propiedades inmunogénicas favorables para el uso en seres humanos. Por ejemplo, pueden usarse plantas capaces de producir proteínas que carecen sustancialmente de residuos de fucosa con unión alfa-1,3, residuos de xilosa con unión beta-1,2, o ambos, en su N-glicano. Otras modificaciones ilustrativas pueden resultar en plantas con almacenamiento mejorado de proteínas y aceites, plantas con mejor eficacia fotosintética, plantas con prolongada durabilidad, plantas con mayor contenido de carbohidratos, y plantas resistentes a hongos; plantas que codifican una enzima implicada en la biosíntesis de alcaloides. Se contemplan, además, plantas transgénicas en las cuales se ha modulado la expresión de S-adenosil-L-metionina (SAM) y/o cistationina gamma-sintasa (CGS).Examples of other modifications include tolerance to herbicides, for example, glyphosate is an active ingredient of many broad spectrum herbicides. Glyphosate-resistant transgenic plants have been developed by transferring the aroA gene (a glyphosate EPSP synthetase from Salmonella typhimurium and E. coli). Plants resistant to the sulfonylurea have been produced by the transformation of the Arabidopsis mutant ALS (acetolactate synthetase) gene. The OB protein from photosystem II of the hybrid Amaranthus mutant has been transferred to plants to produce transgenic plants resistant to atrazine; and transgenic plants resistant to bromoxynil have been produced by the incorporation of the bxn gene of the bacterium Klebsiella pneumoniae. Another illustrative modification results in plants that are resistant to insects. Bacillus thuringiensis (Bt) toxins may provide an effective way to delay the emergence of Bt-resistant pests, as recently illustrated in broccoli where the Bt cry1Ac and cry1C pyramidal genes controlled the diamondback moths resistant to each individual protein. and significantly delayed the evolution of resistant insects. Another illustrative modification results in plants that are resistant to diseases caused by pathogens (e.g., viruses, bacteria, fungi). Plants expressing the Xa21 gene (resistance to bacterial blight) have been genetically engineered with plants that express both a Bt fusion gene and a chitinase gene (resistance to yellow stem borer and pod tolerance). Another illustrative modification results in altered reproductive capacity, such as male sterility. Another illustrative modification results in plants that are tolerant to abiotic stress (e.g., drought, temperature, salinity), and tolerant transgenic plants have been produced by transferring the acyl glycerol phosphate enzyme from Arabidopsis; the genes encoding mannitol dehydrogenase and sorbitol dehydrogenase that are involved in the synthesis of mannitol and sorbitol improve drought resistance. Another illustrative modification results in plants that produce proteins that have immunogenic properties favorable for use in humans. For example, plants capable of producing proteins lacking substantially fucose residues with alpha-1,3 binding, xylose residues with beta-1,2 binding, or both, can be used in their N-glycan. Other illustrative modifications may result in plants with improved storage of proteins and oils, plants with improved photosynthetic efficiency, plants with prolonged durability, plants with higher carbohydrate content, and fungal resistant plants; plants that encode an enzyme involved in alkaloid biosynthesis. Transgenic plants are also contemplated in which the expression of S-adenosyl-L-methionine (SAM) and / or cystathionine gamma-synthase (CGS) has been modulated.

Sin limitación, las plantas descritas en la presente descripción pueden modificarse adicionalmente. Ejemplos de tales modificaciones adicionales incluyen, pero no se limitan a: (a) Plantas que pueden tolerar herbicidas. Por ejemplo, el glifosato es un ingrediente activo de muchos herbicidas de amplio espectro. Se han desarrollado plantas transgénicas resistentes al glifosato mediante la transferencia del gen aroA (una glifosato EPSP sintetasa de Salmonella typhimurium y E. coli); las plantas resistentes a sulfonilurea se han producido mediante la transformación del gen mutante ALS (acetolactato sintetasa) de Arabidopsis; la proteína OB del fotosistema II del mutante Amaranthus hybridus se ha transferido a las plantas para producir plantas transgénicas resistentes a la atrazina; y plantas transgénicas resistentes a bromoxinilo se han producido mediante la incorporación del gen bxn de la bacteria Klebsiella pneumoniae; (b) Plantas que son resistentes a los insectos. Las toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) pueden proporcionar una manera efectiva de retrasar la emergencia de pestes resistentes a Bt, como se ilustró recientemente en brócoli donde los genes de Bt crylAc y crylC piramidales controlaron las polillas de dorso de diamante resistentes a cada proteína individual y retrasaron significativamente la evolución de insectos resistentes; (c) Plantas que son resistentes a los virus. Las plantas del virus del mosaico del tabaco se han producido mediante la introducción de proteínas de la cubierta viral. Otras plantas transgénicas resistentes a virus incluyen plantas de patata resistentes al virus de la patata, arroz resistente al RSV y gramo negro y gramo verde resistentes al YMV; (d) Plantas que son resistentes a las bacterias. Se han diseñado genéticamente plantas que expresan el gen Xa21 (resistencia a tizón bacteriano) con plantas que expresan tanto un gen de fusión de Bt y un gen de quitinasa (resistencia al barrenador amarillo del tallo y tolerancia a la vaina); (e) Plantas transgénicas tolerantes al estrés: Se han producido plantas transgénicas tolerantes al frío mediante la transferencia de la enzima acil glicerol fosfato de Arabidopsis; los genes que codifican manitol deshidrogenasa y sorbitol deshidrogenasa que se implican en la síntesis de manitol y sorbitol mejoran la resistencia a la sequía; (f) Plantas que producen proteínas que tienen propiedades inmunogénicas favorables para su uso en humanos. Por ejemplo, pueden ser útiles las plantas capaces de producir proteínas que carecen sustancialmente de residuos fucosa con enlaces alfa-1,3, residuos de xilosa con enlaces beta-1,2, o ambos, en su N-glicano; y (g) otros ejemplos de plantas transgénicas son plantas con proteínas y aceites de almacenamiento mejorados, plantas con eficiencia fotosintética mejorada, plantas con vida útil prolongada, plantas con contenido de carbohidratos mejorado y plantas resistentes a hongos; plantas que codifican una enzima implicada en la biosíntesis de alquiloides; los genes para una vía de desintoxicación de mercurio orgánico bacteriano (reductasa mercúrica, merA) y liasa organomercúrica, merB se combinaron mediante el cruzamiento en Arabidopsis, y las plantas que expresaron ambos genes pudieron crecer en concentraciones de metilmercurio 50 veces mayores que las plantas de tipo silvestre.Without limitation, the plants described in the present description may be further modified. Examples of such additional modifications include, but are not limited to: (a) Plants that can tolerate herbicides. For example, glyphosate is an active ingredient of many broad-spectrum herbicides. Transgenic plants resistant to glyphosate have been developed by transferring the aroA gene (a glyphosate EPSP synthetase from Salmonella typhimurium and E. coli); sulfonylurea-resistant plants have been produced by transformation of the mutant ALS (acetolactate synthetase) gene from Arabidopsis; the OB protein from photosystem II of the mutant Amaranthus hybridus has been transferred to plants to produce transgenic plants resistant to atrazine; and transgenic plants resistant to bromoxynil have been produced by the incorporation of the bxn gene of the bacterium Klebsiella pneumoniae; (b) Plants that are resistant to insects. The toxins of Bacillus thuringiensis (Bt) can provide an effective way to delay the emergence of Bt-resistant pests, as recently illustrated in broccoli where the Bt crylAc and crylC pyramidal genes controlled the diamondback moths resistant to each individual protein and significantly delayed the evolution of resistant insects ; (c) Plants that are resistant to viruses. Tobacco mosaic virus plants have been produced by the introduction of viral coat proteins. Other transgenic plants resistant to viruses include potato plants resistant to potato virus, RSV-resistant rice and YMV-resistant black gram and green gram; (d) Plants that are resistant to bacteria. Genetically engineered plants expressing the Xa21 gene (resistance to bacterial blight) have been engineered with plants that express both a Bt fusion gene and a chitinase gene (resistance to yellow stem borer and pod tolerance); (e) Stress-Tolerant Transgenic Plants: Cold-tolerant transgenic plants have been produced by transferring the acyl glycerol phosphate enzyme from Arabidopsis; the genes encoding mannitol dehydrogenase and sorbitol dehydrogenase that are involved in the synthesis of mannitol and sorbitol improve drought resistance; (f) Plants that produce proteins that have immunogenic properties favorable for their use in humans. For example, plants capable of producing proteins lacking substantially fucose residues with alpha-1,3 bonds, xylose residues with beta-1,2 bonds, or both, in their N-glycan; and (g) other examples of transgenic plants are plants with improved storage proteins and oils, plants with improved photosynthetic efficiency, plants with prolonged shelf life, plants with improved carbohydrate content and fungal resistant plants; plants that encode an enzyme involved in the biosynthesis of alkyloids; the genes for a detoxification pathway of bacterial organic mercury (mercuric reductase, merA) and organomercuic lyase, merB were combined by crossing in Arabidopsis, and plants that expressed both genes were able to grow in methylmercury concentrations 50 times higher than plants wild type.

Uno o más de dichos rasgos pueden introgresarse en las plantas de tabaco mutantes, de origen no natural o transgénicas a partir de otro cultivar de tabaco o pueden transformarse directamente en ellas. La introgresión del(de los) rasgo(s) en las plantas mutantes de tabaco, de origen no natural o transgénicas puede lograrse mediante cualquier método de mejoramiento de plantas conocida en la técnica, por ejemplo, mejoramiento por pedigrí, retrocruzamiento, mejoramiento por haploides dobles, y similares (ver, Wernsman, E. A., y Rufty, R. C. 1987. Capítulo Diecisiete. Tobacco. Páginas 669-698 En: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., Nueva York, N.Y 761 pp.). Las técnicas basadas en biología molecular descritas anteriormente, en particular RFLP y marcadores microsatélites, pueden usarse en tales retrocruzamientos para identificar las progenies que tienen el mayor grado de identidad genética con el parental recurrente. Esto permite acelerar la producción de variedades que tienen al menos 90 %, preferentemente, al menos 95 %, con mayor preferencia, al menos 99 % de identidad genética con el parental recurrente, aún con mayor preferencia, idénticas genéticamente al parental recurrente, y que comprenden, además, el(los) rasgo(s) introgresado(s) a partir del parental donante. Dicha determinación de identidad genética puede basarse en marcadores moleculares conocidos en la técnica.One or more of said traits can be introgressed into mutant, non-natural or transgenic tobacco plants from another tobacco crop or can be transformed directly into them. The introgression of the trait (s) in mutant tobacco plants, of non-natural or transgenic origin can be achieved by any method of plant breeding known in the art, eg, pedigree breeding, backcrossing, haploid breeding. doubles, and the like (see, Wernsman, EA, and Rufty, RC 1987. Chapter Seventeen, Tobacco, Pages 669-698 In: Cultivating Development, Crop Species, WH Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co., Inc., New York , NY 761 pp.). The techniques based on molecular biology described above, in particular RFLP and microsatellite markers, can be used in such backcrosses to identify the progenies that have the highest degree of genetic identity with the recurrent parent. This makes it possible to accelerate the production of varieties having at least 90%, preferably at least 95%, more preferably, at least 99% of genetic identity with the recurrent parental, even more preferably, genetically identical to the recurrent parent, and they also include the introgressed trait (s) from the donor parent. Said genetic identity determination can be based on molecular markers known in the art.

La última generación de retrocruzamiento puede autofecundarse para proporcionar progenie de mejoramiento pura para el(los) polinucleótido(s) que se transfiere(n). Generalmente, las plantas resultantes tienen esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas, además del (de los) rasgo(s) transferido(s) (por ejemplo, uno o más rasgos de un solo gen). El protocolo de retrocruzamiento exacto dependerá del rasgo que se altera para determinar un protocolo de prueba apropiado. Aunque los métodos de retrocruzamiento se simplifican cuando el rasgo que se transfiere es un alelo dominante, también puede transferirse un alelo recesivo. En este caso, puede ser necesario introducir una prueba de la progenie para determinar si el rasgo deseado se ha transferido exitosamente.The last generation of backcrossing can self-pollinate to provide pure breeding progeny for the transferred polynucleotide (s). Generally, the resulting plants have essentially all the morphological and physiological characteristics of the mutant, non-natural or transgenic plants, in addition to the transferred trait (s) (eg, one or more traits of a single trait). gen). The exact backcrossing protocol will depend on the trait that is altered to determine an appropriate test protocol. Although backcrossing methods are simplified when the trait that is transferred is a dominant allele, a recessive allele can also be transferred. In this case, it may be necessary to enter a progeny test to determine if the desired trait has been transferred successfully.

Diversas modalidades proporcionan plantas mutantes, plantas de origen no natural o plantas transgénicas, así como también biomasa en las cuales el nivel de expresión del polinucleótido NtMRP se reduce de modo que se acumulan cantidades menores de cadmio en la misma.Various embodiments provide mutant plants, plants of non-natural origin or transgenic plants, as well as biomass in which the level of expression of the NtMRP polynucleotide is reduced so that smaller amounts of cadmium accumulate therein.

Las partes de dichas plantas, particularmente plantas de tabaco, y más particularmente la lámina y la nervadura de las hojas de plantas de tabaco, pueden incorporarse o usarse para producir diversos productos consumibles que incluyen, pero no se limitan a, materiales formadores de aerosol, dispositivos formadores de aerosol, artículos para fumar, artículos fumables, productos sin humo, y productos de tabaco. Ejemplos de materiales formadores de aerosol incluyen, pero no se limitan a, composiciones de tabaco, tabacos, extracto de tabaco, tabaco cortado, relleno cortado, tabaco curado, tabaco expandido, tabaco homogeneizado, tabaco reconstituido, y tabacos para pipas. Los artículos para fumar y los artículos fumables son tipos de dispositivos formadores de aerosol. Los ejemplos de artículos para fumar o artículos fumables incluyen, pero no se limitan a, cigarrillos, puritos y puros. Los ejemplos de productos sin humo comprenden tabacos de mascar, y rapé. En ciertos dispositivos formadores de aerosol, en lugar de la combustión, una composición de tabaco u otro material formador de aerosol se calienta mediante uno o más elementos de calentamiento eléctrico para producir un aerosol. En otro tipo de dispositivo formador de aerosol calentado, el aerosol se produce por la transferencia de calor de un elemento combustible carburante o fuente de calor a un material formador de aerosol separado físicamente, que puede localizarse dentro, cerca o aguas abajo de la fuente de calor. Los productos de tabaco sin humo y los diversos materiales formadores de aerosol que contienen tabaco pueden contener tabaco en cualquier forma, lo que incluye partículas secas, trizas, gránulos, polvos, o una suspensión, depositados, mezclados, rodeados por, o combinados de cualquier otra manera con otros ingredientes en cualquier formato, tales como hojuelas, capas, lengüetas, espumas, o perlas. Como se usa en la presente descripción, el término "humo" se usa para describir un tipo de aerosol que se produce por los artículos de fumar, tales como cigarrillos, o por combustión de un material formador de aerosol.The parts of said plants, particularly tobacco plants, and more particularly the leaf and rib of the leaves of tobacco plants, may be incorporated or used to produce various consumable products including, but not limited to, aerosol forming materials, aerosol forming devices, smoking articles, smokable articles, smokeless products, and tobacco products. Examples of aerosol forming materials include, but are not limited to, tobacco compositions, tobacco, tobacco extract, cut tobacco, cut filler, cured tobacco, expanded tobacco, homogenized tobacco, reconstituted tobacco, and pipe tobacco. Smoking articles and smoking articles are types of aerosol forming devices. Examples of smoking articles or smoking articles include, but are not limited to, cigarettes, cigarillos and cigars. Examples of smokeless products include chewing tobacco, and snuff. In certain aerosol forming devices, instead of combustion, a tobacco composition or other aerosol forming material is heated by one or more electric heating elements to produce an aerosol. In another type of heated aerosol forming device, the aerosol is produced by transferring heat from a fuel fuel element or heat source to a physically separated aerosol forming material, which can be located within, near or downstream of the source of heat. hot. Smokeless tobacco products and the various aerosol forming materials containing tobacco may contain tobacco in any form, including dried particles, shreds, granules, powders, or suspension, deposited, mixed, surrounded by, or combined with another way with other ingredients in any format, such as flakes, layers, tabs, foams, or pearls. As used in this description, the term "smoke" is used to describe a type of aerosol that is produced by smoking articles, such as cigarettes, or by combustion of an aerosol forming material.

En una modalidad, se proporciona además material curado a partir de las plantas de tabaco mutantes, transgénicas y de origen no natural descritas en la presente descripción. Los procesos de curado de hojas verdes de tabaco se conocen por los expertos en la técnica e incluyen sin limitación curado al aire, curado al fuego, curado al humo y curado al sol. El proceso de curado de hojas verdes de tabaco depende del tipo de tabaco cosechado. Por ejemplo, el tabaco Virginia de humo (brillante) se cura típicamente al humo, Burley y ciertas cepas oscuras usualmente, se curan al aire, y el tabaco para pipa, el tabaco de mascar, y el rapé usualmente, se curan al fuego.In one embodiment, cured material is further provided from the mutant, transgenic and non-naturally occurring tobacco plants described in the present disclosure. The green leaf tobacco curing processes are known to those skilled in the art and include, without limitation, air curing, fire curing, smoke curing and sun curing. The curing process of green leaf tobacco depends on the type of tobacco harvested. For example, Virginia smoke tobacco (bright) is typically cured by smoke, Burley and certain dark strains usually are air-cured, and pipe tobacco, chewing tobacco, and snuff are usually cured by fire.

En otra modalidad, se describen productos de tabaco que incluyen materiales formadores de aerosol que contienen tabaco, que comprenden, hojas, preferentemente hojas curadas, a partir de las plantas de tabaco mutantes, las plantas de tabaco transgénicas o las plantas de tabaco de origen no natural descritas en la presente descripción. Los productos de tabaco descritos en la presente descripción pueden ser un producto de tabaco mezclado que puede comprender, además, tabaco no modificado.In another embodiment, tobacco products are described which include tobacco-containing aerosol forming materials, comprising, leaves, preferably cured leaves, from mutant tobacco plants, transgenic tobacco plants or tobacco plants of non-tobacco origin. described in the present description. The tobacco products described in the present description can be a mixed tobacco product which can also comprise unmodified tobacco.

Las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas pueden tener otros usos, por ejemplo, en la agricultura. Por ejemplo, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas descritas en la presente descripción pueden usarse para producir alimentación animal y productos para la alimentación humana.Mutant plants of non-natural or transgenic origin may have other uses, for example, in agriculture. For example, the mutant, non-natural or transgenic plants described in the present description can be used to produce animal feed and products for human food.

La descripción proporciona, además, métodos para producir semillas que comprenden cultivar la planta mutante, planta de origen no natural, o planta transgénica descrita en la presente descripción, y recolectar las semillas de las plantas cultivadas. Las semillas de las plantas descritas en la presente descripción pueden acondicionarse y empacarse en material de empaque por medios conocidos en la técnica para conformar un artículo de fabricación. Los materiales de empaque tales como papel y tela se conocen bien en la técnica. Un empaque de semilla puede tener una identificación, por ejemplo, una etiqueta o marcador asegurado al material de empaque, un marcador impreso en el material de empaque, o un marcador insertado dentro del empaque, que describe la naturaleza de las semillas en él.The description further provides methods for producing seeds comprising cultivating the mutant plant, non-natural plant, or transgenic plant described in the present description, and collecting the seeds of the cultivated plants. The seeds of the plants described in the present description can be packaged and packaged in packaging material by means known in the art for forming an article of manufacture. Packaging materials such as paper and cloth are well known in the art. A seed package may have an identification, for example, a label or marker secured to the packaging material, a marker printed on the packaging material, or a marker inserted within the package, which describes the nature of the seeds therein.

Las composiciones, métodos y kits para genotipar plantas para la identificación, selección o mejoramiento se abarcan en la descripción y pueden comprender un medio para detectar la presencia de un polinucleótido NtMRP en una muestra de polinucleótido. En consecuencia, se describe una composición que comprende uno de más cebadores para amplificar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP y opcionalmente una o más sondas y opcionalmente uno o más reactivos para llevar a cabo la amplificación o detección.Compositions, methods and kits for genotyping plants for identification, selection or breeding are encompassed in the description and may comprise a means for detecting the presence of an NtMRP polynucleotide in a polynucleotide sample. Accordingly, a composition comprising one of more primers is described for specifically amplifying at least a portion of the NtMRP polynucleotide and optionally one or more probes and optionally one or more reagents to carry out amplification or detection.

En consecuencia, se describen cebadores o sondas de oligonucleótidos específicos de genes que comprenden aproximadamente 10 o más polinucleótidos contiguos que corresponden al polinucleótido NtMRP. Dichos cebadores o sondas pueden comprender o consistir en aproximadamente 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 o más polinucleótidos contiguos que hibridan (por ejemplo, hibridan específicamente) con el polinucleótido NtMRP. En algunas modalidades, los cebadores o sondas pueden comprender o consistir en aproximadamente 10 a 50 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 40 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 30 nucleótidos contiguos o aproximadamente 15 a 30 nucleótidos contiguos que pueden usarse en los métodos dependientes de secuencias para la identificación de genes (por ejemplo, hibridación Southern) o aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófagos) o detección de genes (por ejemplo, como uno o más cebadores de amplificación en la amplificación o detección de polinucleótidos). El uno o más cebadores o sondas específicos pueden diseñarse y usarse para amplificar o detectar una parte o todo el polinucleótido NtMRP. A manera de ejemplo específico, pueden usarse dos cebadores en un protocolo de reacción en cadena de la polimerasa para amplificar un fragmento de polinucleótido que codifica un polinucleótido NtMRP - tal como ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa puede realizarse, además, mediante el uso de un cebador que se deriva de una secuencia de polinucleótido NtMRP y un segundo cebador que hibrida con la secuencia aguas arriba o aguas abajo de la secuencia de polinucleótido NtMRP - tal como una secuencia promotora de NtMRP, el extremo 3' del ARNm precursor o una secuencia derivada de un vector. Ejemplos de técnicas térmicas e isotérmicas útiles para la amplificación de polinucleótidos in vitro se conocen bien en la técnica. La muestra puede ser o puede derivarse de una planta, una célula vegetal o material vegetal o un producto fabricado o derivado de la planta, la célula vegetal o el material vegetal como se describe en la presente descripción.Accordingly, gene-specific oligonucleotide primers or probes comprising about 10 or more contiguous polynucleotides corresponding to the NtMRP polynucleotide are described. Said primers or probes may comprise or consist of about 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 or more contiguous polynucleotides that hybridize (eg, specifically hybridize) with the NtMRP polynucleotide. In some embodiments, the primers or probes may comprise or consist of about 10 to 50 contiguous nucleotides, about 10 to 40 contiguous nucleotides, about 10 to 30 contiguous nucleotides, or about 15 to 30 contiguous nucleotides that can be used in sequence dependent methods. gene identification (e.g., Southern hybridization) or isolation (e.g., in situ hybridization of bacterial colonies or bacteriophage plaques) or gene detection (e.g., as one or more amplification primers in the amplification or detection of polynucleotides ). The one or more specific primers or probes can be designed and used to amplify or detect a part or all of the NtMRP polynucleotide. By way of a specific example, two primers can be used in a polymerase chain reaction protocol to amplify a polynucleotide fragment encoding an NtMRP polynucleotide - such as DNA or RNA. The polymerase chain reaction can be further performed by the use of a primer that is derived from a NtMRP polynucleotide sequence and a second primer that hybridizes to the sequence upstream or downstream of the NtMRP polynucleotide sequence - such as an NtMRP promoter sequence, the 3 'end of the precursor mRNA or a sequence derived from a vector. Examples of thermal and isothermal techniques useful for the amplification of polynucleotides in vitro are well known in the art. The sample can be or can be derived from a plant, a plant cell or plant material or a product manufactured or derived from the plant, plant cell or plant material as described in the present description.

Por lo tanto, en otro aspecto, se proporciona, además, un método para detectar un polinucleótido NtMRP en una muestra que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra que comprende, o se supone que comprende, un polinucleótido; (b) poner en contacto dicha muestra con uno de más cebadores o una o más sondas para detectar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP; y (c) detectar la presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación indica la presencia del polinucleótido NtMRP en la muestra. En un aspecto adicional, se proporciona además el uso de uno de más cebadores o sondas para detectar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP. Se proporcionan, además, kits para detectar al menos una porción del polinucleótido NtMRP, los cuales comprenden uno de más cebadores o sondas para detectar específicamente al menos una porción del polinucleótido NtMRP. El kit puede comprender reactivos para la amplificación de polinucleótidos, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o reactivos para la tecnología de detección por hibridación de sondas de polinucleótidos, tales como transferencias Southern, transferencias Northern, hibridación in situ, o microarreglo. El kit puede comprender reactivos para la tecnología de detección por unión de anticuerpos tal como membrana de Western, ELISA, espectrometría de masas SELDI o tiras de pruebas. El kit puede comprender reactivos para la secuenciación de ADN. El kit puede comprender reactivos y/o instrucciones para determinar el contenido de metales pesados - tales como el cadmio. En algunas modalidades, un kit puede comprender instrucciones para uno o más de los métodos descritos. Los kits descritos pueden ser útiles para la determinación de la identidad genética, estudios filogenéticos, determinación del genotipo, determinación del haplotipo, análisis de la genealogía o mejoramiento de plantas particularmente con puntuación co-dominante.Therefore, in another aspect, there is further provided a method for detecting an NtMRP polynucleotide in a sample comprising the steps of: (a) providing a sample comprising, or assumed to comprise, a polynucleotide; (b) contacting said sample with one of more primers or one or more probes to specifically detect at least a portion of the NtMRP polynucleotide; and (c) detecting the presence of an amplification product, wherein the presence of an amplification product indicates the presence of the NtMRP polynucleotide in the sample. In a further aspect, there is further provided the use of one of more primers or probes to specifically detect at least a portion of the NtMRP polynucleotide. Kits are also provided to detect at least a portion of the NtMRP polynucleotide, which comprise one of more primers or probes to specifically detect at least a portion of the NtMRP polynucleotide. The kit may comprise reagents for the amplification of polynucleotides, such as the polymerase chain reaction (PCR), or reagents for Hybridization detection technology of polynucleotide probes, such as Southern blots, Northern blots, in situ hybridization, or microarray. The kit may comprise reagents for detection technology by antibody binding such as Western membrane, ELISA, SELDI mass spectrometry or test strips. The kit may comprise reagents for DNA sequencing. The kit may comprise reagents and / or instructions for determining the content of heavy metals - such as cadmium. In some embodiments, a kit may comprise instructions for one or more of the described methods. The described kits can be useful for the determination of genetic identity, phylogenetic studies, genotype determination, haplotype determination, genealogy analysis or plant improvement particularly with co-dominant score.

La presente descripción proporciona, además, un método para genotipar una planta, una célula vegetal o material vegetal que comprende un polinucleótido NtMRP. El genotipado proporciona un medio para distinguir homólogos de un par cromosómico y puede usarse para diferenciar segregantes en una población de plantas. Los métodos de marcadores moleculares pueden usarse para estudios filogenéticos, caracterización de relaciones genéticas entre variedades de cultivo, identificación de cruces o híbridos somáticos, localización de segmentos cromosómicos que afectan rasgos monogénicos, clonación basada en mapas, y el estudio de herencia cuantitativa. El método específico de genotipado puede emplear cualquier número de técnicas analíticas de marcadores moleculares lo que incluye polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP). Los AFLP son el producto de diferencias alélicas entre los fragmentos amplificados causadas por la variabilidad de secuencias de nucleótidos. Por lo tanto, se describe un medio para seguir la segregación de NtMRP así como también las secuencias cromosómicas unidas genéticamente a estos genes o polinucleótidos mediante el uso de técnicas tales como el análisis de AFLP.The present disclosure further provides a method for genotyping a plant, a plant cell or plant material comprising an NtMRP polynucleotide. Genotyping provides a means to distinguish homologs from a chromosomal pair and can be used to differentiate segregants in a population of plants. Molecular marker methods can be used for phylogenetic studies, characterization of genetic relationships between crop varieties, identification of crosses or somatic hybrids, location of chromosomal segments that affect monogenic traits, cloning based on maps, and the study of quantitative inheritance. The specific genotyping method can employ any number of molecular marker analytical techniques including polymorphisms in the length of the amplified fragments (AFLP). AFLPs are the product of allelic differences between the amplified fragments caused by the variability of nucleotide sequences. Therefore, a means for following the segregation of NtMRP as well as the chromosomal sequences genetically linked to these genes or polynucleotides is described by using techniques such as AFLP analysis.

La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no se destinan a limitar el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.The invention will be further described in the following examples, which are not intended to limit the scope of the invention described in the claims.

EjemplosExamples

Los siguientes ejemplos se proporcionan como una ilustración y no como una limitación. A menos que se indique de cualquier otra manera, la presente invención emplea técnicas y métodos convencionales de la biología molecular, la biología de las plantas, bioinformática y cultivo de plantas.The following examples are provided as an illustration and not as a limitation. Unless indicated otherwise, the present invention employs conventional techniques and methods of molecular biology, plant biology, bioinformatics, and plant culture.

Ejemplo 1: Identificación de la secuencia genómica del ADN de NtMRP3Example 1: Identification of the genomic sequence of NtMRP3 DNA

Biblioteca BAC de tabaco. Se prepara una biblioteca de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) de la siguiente manera: los núcleos se aíslan de hojas de plantas cultivadas en invernadero de la variedad Hicks Broad Leaf de Nicotiana tabacum. El ADN de peso molecular alto se aísla de los núcleos de acuerdo con protocolos estándar y se digiere parcialmente con BamHI y HindIII y se clona en los sitios BamHI o HindIII del vector BAC pINDIGO5. Se obtienen más de 320 000 clones con una longitud de inserto promedio de 135 mega pares de bases lo que cubre aproximadamente 9,7 veces el genoma del tabaco.BAC library of tobacco. A library of Bacterial Artificial Chromosome (BAC) is prepared as follows: the cores are isolated from leaves of plants grown in the Hicks Broad Leaf variety of Nicotiana tabacum. The high molecular weight DNA is isolated from the nuclei according to standard protocols and is partially digested with BamHI and HindIII and cloned into the BamHI or HindIII sites of the BIND vector pINDIGO5. More than 320,000 clones are obtained with an average insert length of 135 mega base pairs which covers approximately 9.7 times the tobacco genome.

Ensamble de la secuencia del genoma del tabaco. Un gran número de clones de BAC seleccionados al azar se someten a la secuenciación mediante el uso del método de Sanger lo que genera más de 1780000 secuencias en bruto de una longitud promedio de 550 pares de bases. El filtrado de metilo se aplica mediante el uso de una cepa Mcr+ de Escherichia coli para la transformación y se aisló solo el ADN hipometilado. Todas las secuencias se ensamblan mediante el uso del ensamblador de genoma CELERA lo que produce más de 800000 secuencias que comprenden más de 200 000 cóntigos y 596 970 secuencias únicas. Los tamaños de cóntigos están entre 120 y 15300 pares de bases con una longitud promedio de 1100 pares de bases.Assembling the sequence of the tobacco genome. A large number of randomly selected BAC clones are subjected to sequencing by using the Sanger method which generates more than 1780000 raw sequences of an average length of 550 base pairs. The methyl filtrate is applied by the use of a Mcr + strain of Escherichia coli for transformation and only the hypomethylated DNA was isolated. All sequences are assembled by using the CELERA genome assembler which produces more than 800,000 sequences comprising more than 200,000 contigs and 596,970 unique sequences. The sizes of contigs are between 120 and 15300 base pairs with an average length of 1100 base pairs.

La secuencia genómica del ADN de NtMRP3 se identifica mediante la secuenciación de un BAC que contiene una parte del genoma que incluye ADN de NtMRP3. La secuencia se expone en la Figura 6.The genomic DNA sequence of NtMRP3 is identified by sequencing a BAC that contains a part of the genome that includes NtMRP3 DNA. The sequence is shown in Figure 6.

Ejemplo 2: Transformación de variedades de tabaco con vectores de expresión de ARNi de NtMRP3Example 2: Transformation of tobacco varieties with NtMRP3 RNAi expression vectors

Las semillas de tabaco se esterilizan y germinan en una placa Petri que contiene medio basal MS suplementado con 5 ml/l de mezcla de conservante de plantas (PPM). Las plántulas, aproximadamente a los 7 a 10 días posteriores a la germinación, se seleccionan para la transformación con diversos vectores de expresión de ARNi de NtMRP3. Una sola colonia de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 se inocula en un medio LB líquido que contiene kanamicina a 50 mg l-1 (mono sulfato de kanamicina), y se incuba durante 48 h a 28 °C con agitación recíproca (150 ciclos min-1).The tobacco seeds are sterilized and germinated in a Petri dish containing MS basal medium supplemented with 5 ml / l of plant preservative mixture (PPM). Seedlings, approximately 7 to 10 days after germination, are selected for transformation with various NtMRP3 RNAi expression vectors. A single colony of Agrobacterium tumefaciens LBA4404 is inoculated in a liquid LB medium containing kanamycin at 50 mg l-1 (kanamycin mono-sulphate), and incubated for 48 h at 28 ° C with reciprocal agitation (150 min-1 cycles).

Las células cultivadas se colectan mediante centrifugación (6000*g, 10 minutos), y se suspenden a una densidad final de 0,4-0,7 OD600, con 20 ml de medio MS líquido que contiene sacarosa a 20 g-1. Los explantes de plántula de 7-10 días se sumergen en una suspensión bacteriana durante 5 minutos, y se transfieren a papeles de filtro estériles. Cincuenta explantes se colocan en alícuotas de 40 ml de medio de agar REG (medio basal MS suplementado con ácido 1-naftalenoacético (NAA) 0,1 mg l-1 y bencilaminopurina (BAP) 1 mg l-1) en placas Petri de 100 mm X 20 mm. Los explantes se cocultivan con Agrobacterium a 25 °C. Después de 3 días de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren a medio RCPK (medio REG con kanamicina 100 mg-1, carbenicilina 500 mg l-1, y 5 ml de PPM) para seleccionar los transformantes. Los explantes se subcultivan cada 2 semanas. Después de 8-12 semanas de cultivo en condiciones selectivas, las plantas supervivientes, que representan los transformantes que han integrado los constructos de expresión de ARNi de NtMRP3 en sus genomas, se transfieren a un medio de enraizamiento (medio basal MS suplementado con kanamicina 100 mg l-1). Las plantas con raíces se transfieren a macetas para promover un crecimiento adicional.Cultured cells are collected by centrifugation (6000 * g, 10 minutes), and suspended at a final density of 0.4-0.7 OD600, with 20 ml of liquid MS medium containing sucrose at 20 g-1. Seedling explants of 7-10 days are immersed in a bacterial suspension for 5 minutes, and transferred to sterile filter papers. Fifty explants are placed in aliquots of 40 ml of REG agar medium (MS basal medium supplemented with 1-naphthaleneacetic acid (NAA) 0.1 mg l-1 and benzylaminopurine (BAP) 1 mg l-1) in Petri dishes of 100 mm X 20 mm. The explants are cocultivated with Agrobacterium at 25 ° C. After 3 days of cocultivation, the explants are washed and transferred to RCPK medium (REG medium with kanamycin 100 mg-1, carbenicillin 500 mg l-1, and 5 ml of PPM) to select the transformants. The explants are subcultured every 2 weeks. After 8-12 weeks of culture under selective conditions, the surviving plants, which represent the transformants that have integrated the RNAi expression constructs of NtMRP3 in their genomes, are transferred to a rooting medium (MS basal medium supplemented with kanamycin 100 mg l-1) . Root plants are transferred to pots to promote additional growth.

Ejemplo 3: Expresión del polinucleótido NtMRP3 en plantas de tabacoExample 3: Expression of the NtMRP3 polynucleotide in tobacco plants

Para determinar la expresión del polinucleótido NtMRP3, se aísla el ARN celular total de diversas partes de las plantas. El ARN total se aísla mediante el uso del Reactivo TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para eliminar las impurezas de ADN, el ARN purificado se trata con ADNasa libre de ARNasa (TURBO ADN-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar la primera cadena de ADNc, aproximadamente 10 pg del ARN total se retrotranscriben mediante el uso del kit High Capacity ADNc Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir el nivel de transcritos de NtMRP3 en las muestras, se lleva a cabo una RT-PCR cuantitativa de 2 etapas de acuerdo con la química basada en sondas Taqman MGB. La mezcla de RT contiene una mezcla de dNTP 4 pM, cebadores aleatorios 1X, tampón de RT 1X, 10 g de ADNc, 50 U de transcriptasa inversa Multiscribe (Applied Biosystems), 2 U del Inhibidor de ARNasa Superase-In (Ambion), y agua libre de nucleasas. La mezcla de pCr contiene la mezcla Taqman Universal PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems, Foster City, CA), cebador directo 400 nM, cebador inverso 400 nM, sonda Taqman MGB 250 nM, 2 ng de ADNc, y agua libre de nucleasas. La RT-PCR se lleva a cabo mediante el uso de un sistema en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y en condiciones de amplificación: 50 °C durante 2 minutos; 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos; y 60 °C durante 1 minuto. To determine the expression of the NtMRP3 polynucleotide, total cellular RNA is isolated from various parts of the plants. Total RNA is isolated by the use of TRI® Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). To remove DNA impurities, the purified RNA is treated with RNase-free DNase (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX). To synthesize the first strand of cDNA, approximately 10 pg of the total RNA is retrotranscribed using the High Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). To measure the level of NtMRP3 transcripts in the samples, a quantitative 2-step RT-PCR is carried out according to the chemistry based on Taqman MGB probes. The RT mixture contains a mixture of 4 pM dNTP, 1X random primers, 1X RT buffer, 10 g of cDNA, 50 U of Multiscribe reverse transcriptase (Applied Biosystems), 2 U of the RNAse Superase-In inhibitor (Ambion), and nuclease-free water. The pCr mixture contains the Taqman Universal PCR Mix Master Mix 1X (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM forward primer, 400 nM reverse primer, 250 nM Taqman MGB probe, 2 ng of cDNA, and nuclease-free water. RT-PCR is carried out by using a real-time ABI 7500 system (Applied Biosystems, Foster City, CA) and under amplification conditions: 50 ° C for 2 minutes; 95 ° C for 10 minutes; 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds; and 60 ° C for 1 minute.

Ejemplo 4: Silenciamiento de la expresión de polinucleótidos NtMRP3 en plantas de tabacoExample 4: Silencing the expression of NtMRP3 polynucleotides in tobacco plants

Se encuentra una primera secuencia parcial que codifica un transcrito de NtMRP3 putativo mediante el uso de anotaciones de la Iniciativa del Genoma del Tabaco (TGI). A partir de esta secuencia particular, se generan cebadores para silenciar la expresión de polinucleótidos NtMRP3 en tabaco mediante el uso de un enfoque de ARNi. La secuencia de ARNi de NtMRP3 correspondiente se amplifica a partir del ADNc mediante RT-PCR y después se inserta en el vector Gateway pB7GWIWG2 (II) mediante un vector de entrada, exactamente como se detalla por el fabricante (Invitrogen). Este vector contiene un promotor para la expresión constitutiva (el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor CaMV) del transgén en todos los tejidos de la planta y el gen bar para la selección de herbicidas con BASTA en placas de agar (30 mg/ml). El constructo se inserta después en el genoma del tabaco Burley KY14 a través de Agrobacterium tumefasciens mediante el uso de un procedimiento clásico de disco de hoja. A partir de los callos, se regeneran líneas individuales y se seleccionan en Basta. Las líneas de silenciamiento de a Rní se controlan mediante RT-PCR y se cultivan para la producción de semillas. Las semillas T1 se recogen, se vuelven a cultivar en placas de agar que contienen Basta para su selección y las plantas resistentes se cultivan en bandejas flotantes antes del cultivo en el campo.A first partial sequence encoding a putative NtMRP3 transcript is found by using annotations from the Tobacco Genome Initiative (TGI). From this particular sequence, primers are generated to silence the expression of NtMRP3 polynucleotides in tobacco by using an RNAi approach. The corresponding NtMRP3 RNAi sequence is amplified from the cDNA by RT-PCR and then inserted into the Gateway vector pB7GWIWG2 (II) by an entry vector, exactly as detailed by the manufacturer (Invitrogen). This vector contains a promoter for constitutive expression (the 35S promoter of cauliflower mosaic virus CaMV) of the transgene in all tissues of the plant and the bar gene for the selection of herbicides with BASTA on agar plates (30 mg / ml). The construct is then inserted into the genome of Burley KY14 tobacco through Agrobacterium tumefasciens by using a classical leaf disc method. From the calluses, individual lines are regenerated and selected in Basta. The silencing lines of a Rní are controlled by RT-PCR and are cultured for seed production. T1 seeds are harvested, re-grown on agar plates containing Basta for selection and resistant plants are grown on floating trays prior to field cultivation.

Se pesan aproximadamente 500 mg de la planta y se digieren en 10 ml de HNO3 concentrado mediante un sistema de reacción acelerado por microondas, sistema de digestión 5 (CEM corporation, Mathews, NC). Las concentraciones de los metales pesados se analizan mediante el uso de espectrofotometría de masa con plasma acoplado inductivamente ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Como control de tabaco no transgénico, una muestra que consiste en hojas de tabaco Virginia, certificado en Polonia, CTA-VTL-2, se prepara en condiciones comparables.Approximately 500 mg of the plant are weighed and digested in 10 ml of concentrated HNO3 by a microwave accelerated reaction system, digestion system 5 (CEM corporation, Mathews, NC). Heavy metal concentrations are analyzed by the use of mass spectrometry with inductively coupled plasma ("ICP-MS," Agilent 7500A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). As a control of non-transgenic tobacco, a sample consisting of Virginia tobacco leaves, certified in Poland, CTA-VTL-2, is prepared under comparable conditions.

Ejemplo 5: Identificación de la secuencia genómica del ADN NtMRP4Example 5: Identification of the genomic sequence of NtMRP4 DNA

La secuencia genómica del ADN de NtMRP4 se identifica mediante la secuenciación de un BAC que contiene una parte del genoma que incluye ADN de NtMRP4. La secuencia se expone en la Figura 1.The genomic DNA sequence of NtMRP4 is identified by sequencing a BAC that contains a part of the genome that includes NtMRP4 DNA. The sequence is shown in Figure 1.

Ejemplo 6: Transformación de variedades de tabaco con vectores de expresión de ARNi de NtMRP4Example 6: Transformation of tobacco varieties with NtMRP4 RNAi expression vectors

Las semillas de tabaco se esterilizan y germinan en una placa Petri que contiene medio basal MS suplementado con 5 ml/l de mezcla de conservante de plantas (PPM). Las plántulas, aproximadamente a los 7 a 10 días posteriores a la germinación, se seleccionan para la transformación con diversos vectores de expresión de ARNi de NtMRP4. Una sola colonia de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 se inocula en un medio LB líquido que contiene kanamicina a 50 mg l-1 (mono sulfato de kanamicina), y se incuba durante 48 h a 28 °C con agitación recíproca (150 ciclos min-1). Las células cultivadas se colectan mediante centrifugación (6000*g, 10 minutos), y se suspenden a una densidad final de 0,4-0,7 OD600, con 20 ml de medio MS líquido que contiene sacarosa a 20 g-1. Los explantes de plántula de 7-10 días se sumergen en una suspensión bacteriana durante 5 minutos, y se transfieren a papeles de filtro estériles. Cincuenta explantes se colocan en alícuotas de 40 ml de medio de agar REG (medio basal MS suplementado con ácido 1-naftalenoacético (NAA) 0,1 mg l-1 y bencilaminopurina (BAP) 1 mg l-1) en placas Petri de 100 mm X 20 mm. Los explantes se cocultivan con Agrobacterium a 25 °C. Después de 3 días de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren a medio RCPK (medio REG con kanamicina 100 mg-1, carbenicilina 500 mg l-1, y 5 ml de PPM) para seleccionar los transformantes. Los explantes se subcultivan cada 2 semanas. Después de 8­ 12 semanas de cultivo en condiciones selectivas, las plantas supervivientes, que representan los transformantes que han integrado los constructos de expresión de ARNi de NtMRP4 en sus genomas, se transfieren a un medio de enraizamiento (medio basal MS suplementado con kanamicina 100 mg l-1). Las plantas con raíces se transfieren a macetas para promover un crecimiento adicional.The tobacco seeds are sterilized and germinated in a Petri dish containing MS basal medium supplemented with 5 ml / l of plant preservative mixture (PPM). The seedlings, approximately 7 to 10 days after germination, are selected for transformation with various RNAi expression vectors of NtMRP4. A single colony of Agrobacterium tumefaciens LBA4404 is inoculated in a liquid LB medium containing kanamycin at 50 mg l-1 (kanamycin mono-sulphate), and incubated for 48 h at 28 ° C with reciprocal agitation (150 min-1 cycles). Cultured cells are collected by centrifugation (6000 * g, 10 minutes), and suspended at a final density of 0.4-0.7 OD600, with 20 ml of liquid MS medium containing sucrose at 20 g-1. Seedling explants of 7-10 days are immersed in a bacterial suspension for 5 minutes, and transferred to sterile filter papers. Fifty explants are placed in aliquots of 40 ml of REG agar medium (MS basal medium supplemented with 1-naphthaleneacetic acid (NAA) 0.1 mg l-1 and benzylaminopurine (BAP) 1 mg l-1) in Petri dishes of 100 mm X 20 mm. The explants are cocultivated with Agrobacterium at 25 ° C. After 3 days of cocultivation, the explants are washed and transferred to RCPK medium (REG medium with kanamycin 100 mg-1, carbenicillin 500 mg l-1, and 5 ml of PPM) to select the transformants. The explants are subcultured every 2 weeks. After 8 12 weeks of culture under selective conditions, the surviving plants, representing the transformants that they have integrated the RNAi expression constructs of NtMRP4 into their genomes, they are transferred to a rooting medium (MS basal medium supplemented with kanamycin 100 mg l-1). Root plants are transferred to pots to promote additional growth.

Ejemplo 7: Expresión del polinucleótido NtMRP4 en plantas de tabacoExample 7: Expression of the NtMRP4 polynucleotide in tobacco plants

Para determinar la expresión del polinucleótido NtMRP4, se aísla el ARN celular total de diversas partes de las plantas. El ARN total se aísla mediante el uso del Reactivo TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para eliminar las impurezas de ADN, el ARN purificado se trata con ADNasa libre de ARNasa (TURBO ADN-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar la primera cadena de ADNc, aproximadamente 10 pg del ARN total se retrotranscriben mediante el uso del kit High Capacity ADNc Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir el nivel de transcritos de NtMRP4 en las muestras, se lleva a cabo una RT-PCR cuantitativa de 2 etapas de acuerdo con la química basada en sondas Taqman MGB. La mezcla de RT contiene una mezcla de dNTP 4 pM, cebadores aleatorios 1X, tampón de RT 1X, 10 g de ADNc, 50 U de transcriptasa inversa Multiscribe (Applied Biosystems), 2 U del Inhibidor de ARNasa Superase-In (Ambion), y agua libre de nucleasas. La mezcla de pCr contiene la mezcla Taqman Universal PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems, Foster City, CA), cebador directo 400 nM, cebador inverso 400 nM, sonda Taqman MGB 250 nM, 2 ng de ADNc, y agua libre de nucleasas. La RT-PCR se lleva a cabo mediante el uso de un sistema en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y en condiciones de amplificación: 50 °C durante 2 minutos; 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos; y 60 °C durante 1 minuto. To determine the expression of the NtMRP4 polynucleotide, the total cellular RNA is isolated from various parts of the plants. Total RNA is isolated by the use of TRI® Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). To remove DNA impurities, the purified RNA is treated with RNase-free DNase (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX). To synthesize the first strand of cDNA, approximately 10 pg of the total RNA is retrotranscribed using the High Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). To measure the level of NtMRP4 transcripts in the samples, a quantitative 2-step RT-PCR is carried out according to the chemistry based on Taqman MGB probes. The RT mixture contains a mixture of 4 pM dNTP, 1X random primers, 1X RT buffer, 10 g of cDNA, 50 U of Multiscribe reverse transcriptase (Applied Biosystems), 2 U of the RNAse Superase-In inhibitor (Ambion), and nuclease-free water. The mixture of p C r contains the Taqman Universal PCR Mix Master Mix 1X (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM forward primer, 400 nM reverse primer, 250 nM Taqman MGB probe, 2 ng of cDNA, and free water of nucleases. RT-PCR is carried out by using a real-time ABI 7500 system (Applied Biosystems, Foster City, CA) and under amplification conditions: 50 ° C for 2 minutes; 95 ° C for 10 minutes; 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds; and 60 ° C for 1 minute.

El polinucleótido NtMRP4 se expresa en tejidos de tabaco, según se determina mediante RT-PCR mediante el uso de ADNc de pétalos, estambres, pistilos, sépalos, cápsulas, tallos, hojas y raíces.The NtMRP4 polynucleotide is expressed in tobacco tissues, as determined by RT-PCR using cDNA from petals, stamens, pistils, sepals, capsules, stems, leaves and roots.

Cuando las plantas de tabaco se cultivan en una solución hidropónica, la expresión del polinucleótido NtMRP4 se regula positivamente ligeramente por cadmio en las plántulas de raíz y hoja de N. tabacum (TN90, ver Figura 2). Sin embargo, aunque se encuentra que el polinucleótido NtMRP4 también se induce en la hoja de N. rustica, se observan datos opuestos en las raíces de N. rustica (regulación negativa) en comparación con N. tabacum, lo que sugiere que el polinucleótido NtMRP4 puede jugar un papel en la acumulación de cadmio en la raíz y la tolerancia alta al cadmio de N. rustica. When the tobacco plants are grown in a hydroponic solution, the expression of the NtMRP4 polynucleotide is positively regulated slightly by cadmium in the root and leaf seedlings of N. tabacum (TN90, see Figure 2). However, although it is found that the NtMRP4 polynucleotide is also induced in the leaf of N. rustica, opposite data are observed in the roots of N. rustica (negative regulation) compared to N. tabacum, suggesting that the NtMRP4 polynucleotide it can play a role in the accumulation of cadmium in the root and the high tolerance to cadmium of N. rustica.

Ejemplo 8: Silenciamiento de la expresión de polinucleótidos NtMRP4 en plantas de tabacoExample 8: Silencing the expression of NtMRP4 polynucleotides in tobacco plants

Se encuentra una primera secuencia parcial (CHO_SL022xb24f1.ab1) que codifica un transcrito de NtMRP4 putativo (no mostrado) mediante el uso de anotaciones de la Iniciativa del Genoma del Tabaco (TGI). A partir de esta secuencia particular, se generan cebadores para silenciar la expresión de polinucleótidos NtMRp4 en tabaco mediante el uso de un enfoque de ARNi (Figura 1). La secuencia ARNi de MRP4 correspondiente se amplifica a partir de ADNc mediante RT-PCR y después se inserta en el vector Gateway pB7GWIWG2 (II) a través de un vector de entrada, exactamente como lo detalla el fabricante (Invitrogen). Este vector contiene un promotor para la expresión constitutiva (el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor CaMV) del transgén en todos los tejidos de la planta y el gen bar para la selección de herbicidas con BASTA en placas de agar (30 mg/ml). El constructo se inserta después en el genoma del tabaco Burley KY14 a través de Agrobacterium tumefasciens mediante el uso de un procedimiento clásico de disco de hoja. A partir de los callos, se regeneran líneas individuales y se seleccionan en Basta. Las líneas de silenciamiento de ARNi se controlan mediante RT-PCR y se cultivan para la producción de semillas. La Figura 3 muestra que el silenciamiento de NtMRP4 es eficaz en líneas transgénicas, lo que incluye las líneas 1 y 2. Las semillas T1 se recogen, se vuelven a cultivar en placas de agar que contienen Basta para su selección y las plantas resistentes se cultivan en bandejas flotantes antes del cultivo en el campo.A first partial sequence (CHO_SL022xb24f1.ab1) encoding a putative NtMRP4 transcript (not shown) is found by using annotations from the Tobacco Genome Initiative (TGI). From this particular sequence, primers are generated to silence the expression of NtMRp4 polynucleotides in tobacco by using an RNAi approach (Figure 1). The corresponding MRP4 RNAi sequence is amplified from cDNA by RT-PCR and then inserted into the Gateway vector pB7GWIWG2 (II) through an input vector, exactly as detailed by the manufacturer (Invitrogen). This vector contains a promoter for constitutive expression (the 35S promoter of cauliflower mosaic virus CaMV) of the transgene in all tissues of the plant and the bar gene for the selection of herbicides with BASTA on agar plates (30 mg / ml). The construct is then inserted into the genome of Burley KY14 tobacco through Agrobacterium tumefasciens by using a classical leaf disc method. From the calluses, individual lines are regenerated and selected in Basta. The RNAi silencing lines are controlled by RT-PCR and cultured for seed production. Figure 3 shows that the silencing of NtMRP4 is effective in transgenic lines, including lines 1 and 2. T1 seeds are harvested, re-grown on agar plates containing Basta for selection and resistant plants are grown in floating trays before cultivation in the field.

Se pesan aproximadamente 500 mg de la planta y se digieren en 10 ml de HNO3 concentrado mediante un sistema de reacción acelerado por microondas, sistema de digestión 5 (CEM corporation, Mathews, NC). Las concentraciones de los metales pesados se analizan mediante el uso de espectrofotometría de masa con plasma acoplado inductivamente ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Como control de tabaco no transgénico, una muestra que consiste en hojas de tabaco Virginia, certificado en Polonia, CTA-VTL-2, se prepara en condiciones comparables.Approximately 500 mg of the plant are weighed and digested in 10 ml of concentrated HNO3 by a microwave accelerated reaction system, digestion system 5 (CEM corporation, Mathews, NC). Heavy metal concentrations are analyzed by the use of mass spectrometry with inductively coupled plasma ("ICP-MS," Agilent 7500A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). As a control of non-transgenic tobacco, a sample consisting of Virginia tobacco leaves, certified in Poland, CTA-VTL-2, is prepared under comparable conditions.

La Figura 4 muestra una reducción de cadmio en la hoja cercana al 20 % en las dos líneas de ARNi de NtMRP4 probadas (líneas 1 y 2) después de dos experimentos de campo sucesivos en dos años consecutivos. En cada caso, las unidades experimentales consisten en cuatro réplicas independientes de 4 plantas recolectadas (peso, líneas 1 y 2 y vector control de plantas en el experimento de campo de segundo año) que se asignan al azar dentro de bloques. Además, las muestras control se añaden a los bloques para usar como control para tendencias espaciales. Los análisis de las líneas de ARNi de NtMRP4 demuestran un efecto fuerte y significativo estadísticamente en la reducción del nivel medio de cadmio.Figure 4 shows a cadmium reduction in the sheet close to 20% in the two NtMRP4 RNAi lines tested (lines 1 and 2) after two successive field experiments in two consecutive years. In each case, the experimental units consist of four independent replicas of 4 collected plants (weight, lines 1 and 2 and plant control vector in the second year field experiment) that are randomly assigned within blocks. In addition, control samples are added to the blocks to use as control for spatial trends. The analyzes of the RNAi lines of NtMRP4 demonstrate a strong and statistically significant effect in the reduction of the average level of cadmium.

Ejemplo 9: Análisis de altura y peso en plantas derivadas de plantas de tabaco en las cuales se silencia la expresión del polinucleótido NtMRP4. Example 9: Analysis of height and weight in plants derived from tobacco plants in which the expression of the NtMRP4 polynucleotide is silenced.

La altura y el peso de las líneas de NtMRP4 silenciadas se afecta ligeramente en comparación con las plantas control. Sin embargo, no se encuentran diferencias significativas en las hojas secas recolectadas entre las plantas de ARNi de NtMRP4 y las plantas de tipo silvestre o vector control, lo que indica que la degradación de las transcripciones de NtMRP4 no tiene efecto relevante estadísticamente en la biomasa seca. Estos datos se confirman por otro experimento de campo que muestra que la sobreexpresión de AtMRP4 (homólogo al polinucleótido NtMRP4) en el mismo fondo de tabaco (KY14) conduce a un 10-30 % más de acumulación de cadmio en las hojas (en dependencia de las líneas transgénicas). Es evidente que la degradación del ARNm que codifica la proteína NtMRP4 reduce significativamente el nivel de cadmio en la hoja de tabaco.The height and weight of the silenced NtMRP4 lines is slightly affected compared to the control plants. However, no significant differences are found in the dry leaves collected between the NtMRP4 RNAi plants and the wild type or control vector plants, indicating that the degradation of NtMRP4 transcripts has no statistically relevant effect on the dry biomass . These data are confirmed by another field experiment that shows that the overexpression of AtMRP4 (homologous to the NtMRP4 polynucleotide) in the same tobacco background (KY14) leads to 10-30% more accumulation of cadmium in the leaves (depending on the the transgenic lines). It is evident that the degradation of the mRNA encoding the NtMRP4 protein significantly reduces the level of cadmium in the tobacco leaf.

Ejemplo 10: Identificación de mutantes inducidos por EMS en NtMRP4Example 10: Identification of mutants induced by EMS in NtMRP4

Una biblioteca de ADN se hace de plantas Nicotiana tabacum que se han expuesto al metanosulfonato de etilo (EMS) y se examinan en busca de mutantes en el exón 1 y el exón 2 del polinucleótido NtMRP4 mediante la secuenciación de la parte relevante del gen NtMRP4 de plantas individuales.A DNA library is made of Nicotiana tabacum plants that have been exposed to ethyl methanesulfonate (EMS) and examined for mutants in exon 1 and exon 2 of the NtMRP4 polynucleotide by sequencing the relevant part of the NtMRP4 gene from individual plants.

Para el exón 1For exon 1

NtMRP4Exon1FW (5'-CATCTCCTTACGAAGGATACTACC-3') y NtMRP4Exon1REV(5'-GCTGCAAGCTCTCCTTTT CTAA-3')NtMRP4Exon1FW (5'-CATCTCCTTACGAAGGATACTACC-3 ') and NtMRP4Exon1REV (5'-GCTGCAAGCTCTCCTTTT CTAA-3')

se usan para la secuenciación, y para el exón 2, NtMRP4Exon2FW (5'-GTGCAATCTGGCAAATATAGTGAG-3') y NtMRP4Exon2REV (5'-AAAAT GACAT AGGAGCAT GCAGT A-3')are used for sequencing, and for exon 2, NtMRP4Exon2FW (5'-GTGCAATCTGGCAAATATAGTGAG-3 ') and NtMRP4Exon2REV (5'-AAAAT GACAT AGGAGCAT GCAGT A-3')

se usan para la secuenciación.they are used for sequencing.

En la Tabla 1 se presenta una visión general de todos los mutantes encontrados para el exón 1 y el exón 2 del polinucleótido NtMRP4. Se indican el codón original (codón ori) y el codón mutado (codón mut) así como también el aminoácido original (AS ori) y la sustitución de aminoácidos (AS mut) o el codón de parada.An overview of all the mutants found for exon 1 and exon 2 of the NtMRP4 polynucleotide is presented in Table 1. The original codon (codon ori) and the mutated codon (codon mut) as well as the original amino acid (AS ori) and the substitution of amino acids (AS mut) or the stop codon are indicated.

Ejemplo 11: Protocolo de búsqueda para la selección de sitios objetivo de nucleasa con dedos de zincExample 11: Search protocol for the selection of nuclease target sites with zinc fingers

Este ejemplo ilustra cómo buscar el gen NtMRP4 para detectar la aparición de sitios objetivo únicos dentro de la secuencia de gen dada en comparación con una base de datos de genoma dada para desarrollar herramientas para modificar la expresión del gen. Los sitios objetivo identificados por los métodos de la descripción, lo que incluye aquellos descritos más abajo, los motivos de secuencia, y el uso de cualquiera de los sitios o motivos para modificar la secuencia génica correspondiente en una planta, tal como tabaco, se abarcan en la descripción.This example illustrates how to search for the NtMRP4 gene to detect the appearance of unique target sites within the given gene sequence compared to a given genome database to develop tools for modifying gene expression. The target sites identified by the methods of the description, including those described below, the sequence motifs, and the use of any of the sites or motifs to modify the corresponding gene sequence in a plant, such as tobacco, are encompassed in the description.

Algoritmo de búsqueda.Search algorithm

Se desarrolla un programa de computadora que permite seleccionar una secuencia de nucleótidos de consulta de entrada (objetivo) para la aparición de dos motivos de ADN de subcadena de longitud fija separados por un tamaño de espaciador dado mediante el uso de un arreglo de sufijos dentro de una base de datos de ADN, tal como por ejemplo el ensamble de secuencia de genoma de tabaco del Ejemplo 1. La construcción del arreglo de sufijos y la búsqueda usan la biblioteca de código abierto libdivsufsort-2.0.0 (http://code.***.com/p/libdivsufsort/) que convierte cualquier cadena de entrada directamente en una cadena transformada de Burrows-Wheeler. El programa escanea la secuencia de nucleótidos de entrada completa (objetivo) y devuelve todas las combinaciones de subcadenas que se producen menos de un número seleccionado de veces en la base de datos de ADN seleccionada.A computer program is developed that allows selecting a nucleotide sequence of input query (target) for the appearance of two fixed length substring DNA motifs separated by a given spacer size by using a suffix array within a DNA database, such as for example the tobacco genome sequence assembly of Example 1. The construction of the suffix array and the search uses the open source library libdivsufsort-2.0.0 (http: // code. ***.com/p/libdivsufsort/) that converts any input string directly into a transformed Burrows-Wheeler string. The program scans the entire input (target) nucleotide sequence and returns all combinations of substrings that occur less than a selected number of times in the selected DNA database.

Selección del sitio objetivo para la mutagénesis mediada por nucleasa con dedos de zinc de una secuencia de consulta.Selection of the target site for nuclease-mediated nuclease mutagenesis of a query sequence.

Un dominio con dedos de zinc de unión a ADN reconoce una secuencia de nucleótidos de tres pares de bases. Una nucleasa con dedos de zinc comprende una proteína con dedos de zinc que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dominios con dedos de zinc de unión a ADN, y la nucleasa no específica de una enzima de restricción de tipo IIS. Las nucleasas con dedos de zinc pueden usarse para introducir una ruptura bicatenaria en una secuencia objetivo. Para introducir una ruptura bicatenaria, se requiere un par de nucleasas con dedos de zinc, una de las cuales se une a la hebra más (superior) de la secuencia objetivo y la otra a la hebra menos (inferior) de la misma secuencia objetivo separadas por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más nucleótidos. Mediante el uso de plurales de 3 para cada uno de los dos motivos de ADN de subcadena de longitud fija, el programa puede usarse para identificar dos sitios objetivo de proteína con dedos de zinc separados por una longitud de espaciador dada.A domain with zinc fingers of DNA binding recognizes a nucleotide sequence of three base pairs. A nuclease with zinc fingers comprises a protein with zinc fingers comprising one, two, three, four, five, six or more domains with zinc fingers for DNA binding, and nonspecific nuclease for a restriction enzyme of type IIS. Nucleases with zinc fingers can be used to introduce a double-stranded break in an objective sequence. To introduce a double-stranded break, a pair of nucleases with zinc fingers is required, one of which binds to the most (upper) strand of the target sequence and the other to the least (lower) strand of the same target sequence. by 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more nucleotides. By using plurals of 3 for each of the two fixed-length substring DNA motifs, the program can be used to identify two protein target sites with zinc fingers separated by a given spacer length.

Entradas del programa:Program entries:

1. La secuencia de ADN de consulta objetivo1. The target query DNA sequence

2. La base de datos de ADN a examinar 2. The DNA database to be examined

3. El tamaño fijado del primer motivo de ADN de subcadena3. The fixed size of the first substring DNA motif

4. El tamaño fijado del espaciador4. The fixed size of the spacer

5. El tamaño fijado del segundo motivo de ADN de subcadena5. The fixed size of the second substring DNA motif

6. El número umbral de apariciones de la combinación de entradas de programa 3 y 5 separadas por la entrada de programa 4 en la base de datos de ADN elegida de la entrada de programa 26. The threshold number of occurrences of the combination of program entries 3 and 5 separated by program entry 4 in the DNA database chosen from program entry 2

Salida del programa:Exit of the program:

1. Una lista de secuencias de nucleótidos con, para cada secuencia, la cantidad de veces que aparece la secuencia en la base de datos de ADN con un máximo del umbral de entrada del programa 6.1. A list of nucleotide sequences with, for each sequence, the number of times the sequence appears in the DNA database with a maximum of the entry threshold of program 6.

Ejemplo 12: Expresión de perfiles de transcritos de NtMRP3 y NtMRP4 en tabacoExample 12: Expression of transcript profiles of NtMRP3 and NtMRP4 in tobacco

Desarrollo y análisis de matriz de exones de tabaco. Mediante el uso de los clones de BAC obtenidos como se describió en el Ejemplo 1, se identifican 272342 exones mediante la combinación y comparación de los datos EST de tabaco y las secuencias filtradas con metilo obtenidas de la secuenciación de BAC. Para cada uno de estos exones, se diseñan cuatro oligonucleótidos de 25 mer y se usan para construir una matriz de exones de tabaco. La matriz de exones se fabrica por Affymetrix (Santa Clara, EE.UU.) mediante el uso de protocolos estándar.Development and analysis of tobacco exons matrix. By using the BAC clones obtained as described in Example 1, 272342 exons are identified by combining and comparing the EST data of tobacco and the methyl filtered sequences obtained from the BAC sequencing. For each of these exons, four 25 mer oligonucleotides are designed and used to construct a matrix of tobacco exons. The exon matrix is manufactured by Affymetrix (Santa Clara, USA) through the use of standard protocols.

Expresión de NtMRP3 y NtMRP4 en tabaco. El ARN se aísla de especies de Nicotiana cultivadas en suelos Cd+ (contaminados con Cd) y Cd-(deficientes en Cd), y se analizan mediante el uso de protocolos de hibridación estándar y herramientas analíticas. El perfil de expresión se realiza para identificar conjuntos de genes relacionados con la acumulación de Cd y para determinar la influencia del Cd del suelo sobre la variación de los transcritos de NtMRP3 y NtMRP4. Las sondas NtMRP3 y NtMRP4 usadas se encuentran en el primer y el último exón así como también en la región 3' UTR. Los resultados que se muestran en la Tabla 2 indican que las hojas de plantas de N. tabacum cultivadas en un suelo contaminado con Cd acumulan más Cd que las plantas de N. rustica cultivadas en el mismo suelo. Las raíces de plantas de N. tabacum acumulan menos Cd que las raíces de plantas de N. rustica. Curiosamente, tanto NtMRP3 como NtMRP4 no se regulan por Cd, pero su expresión es diferente en las dos especies de Nicotiana, lo que sugiere que ambos genes conducen de forma diferente la captación, translocación y acumulación de Cd en las accesiones de Nicotiana (los datos están en log 2 y corresponden a la media de tres repeticiones biológicas). Como controles, se muestra la expresión de tres genes de mantenimiento (UBP12, exones 1 y 2), a-tubulina y la proteína ribosomal S16.Expression of NtMRP3 and NtMRP4 in tobacco. The RNA is isolated from Nicotiana species grown in Cd + (Cd-contaminated) and Cd- (Cd-deficient) soils, and analyzed using standard hybridization protocols and analytical tools. The expression profile is performed to identify sets of genes related to the accumulation of Cd and to determine the influence of soil Cd on the variation of NtMRP3 and NtMRP4 transcripts. The NtMRP3 and NtMRP4 probes used are found in the first and last exons as well as in the 3 'UTR region. The results shown in Table 2 indicate that the leaves of N. tabacum plants grown in a soil contaminated with Cd accumulate more Cd than the N. rustica plants grown in the same soil. The roots of N. tabacum plants accumulate less Cd than the roots of N. rustica plants. Interestingly, both NtMRP3 and NtMRP4 are not regulated by Cd, but their expression is different in the two Nicotiana species, suggesting that both genes lead in a different manner to the uptake, translocation and accumulation of Cd in the Nicotiana accessions (the data they are in log 2 and correspond to the average of three biological repeats). As controls, the expression of three maintenance genes (UBP12, exons 1 and 2), a-tubulin and the ribosomal protein S16 is shown.

Tabla 1Table 1

Codón AS Codón AS Amplicón sec f sec r ori ori mut mut Exón 1 NtMRP4-1 gaagctggaatg attttaaagag gau asp aau asn Exón 1 NtMRP4-1 atgcttatt gatcgacact cga arg uga stop Exón 1 NtMRP4-1 aggttgtcatg tcagctagac ugc cys ugu cys Exón 1 NtMRP4-1 tgctcagcta acaggctcatg aga arg aaa lys Exón 1 NtMRP4-1 acaggctcatg tgttggacag ggu gly gau asp Exón 1 NtMRP4-1 caggctcatg tgttggacag ggu gly gau asp Exón 1 NtMRP4-1 tgttggaca attgtaaattat cag gln caa gln Exón 1 NtMRP4-1 ccgtagatgct agcagctttc cag gln uag stop Exón 1 NtMRP4-1 gcagctgtcc atatgatgcta gau asp aau asn Exón 1 NtMRP4-1 gctacagcta attccatttg cau his uau tyr Exón 1 NtMRP4-1 attccatttg ctcatgccatt ugg trp uga stop Exón 1 NtMRP4-1 tgccattgcaa tttctgtggc guu val auu Ile Exón 1 NtMRP4-1 ctttagccatc tttatactta cuu leu uuu phe Exón 1 NtMRP4-1 ttcaactgtt taacactagc gua val aua ile Exón 1 NtMRP4-1 tggacttgca cagtgatggta gca ala aca thr Exón 1 NtMRP4-1 aggcaacaaat agatgctta gag glu aag lys Exón 1 NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggg uuc phe uuu phe Exón 1 NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggga uuc phe uuu cys Exón 1 NtMRP4-1 attgaatcttt cgcgagtccga uuc phe uuu phe Exón 1 NtMRP4-1 aatctttccgc agtccgagt gag glu aag lys Codon AS Codon AS Amplicon sec f sec r ori ori mut mut Exon 1 NtMRP4-1 gaagctggaatg attttaaagag gau asp aau asn Exon 1 NtMRP4-1 atgcttatt gatcgacact cga arg uga stop Exon 1 NtMRP4-1 aggttgtcatg tcagctagac ugc cys ugu cys Exon 1 NtMRP4- 1 tgctcagcta acaggctcatg aga arg aaa lys Exon 1 NtMRP4-1 acaggctcatg tgttggacag ggu gly gau asp Exon 1 NtMRP4-1 caggctcatg tgttggacag ggu gly gau asp Exon 1 NtMRP4-1 tgttggaca attgtaaattat cag gln caa gln Exon 1 NtMRP4-1 ccgtagatgct agcagctttc cag gln uag stop Exon 1 NtMRP4-1 gcagctgtcc atatgatgcta gau asp aau asn Exon 1 NtMRP4-1 gctacagcta attccatttg cau his uau tyr Exon 1 NtMRP4-1 attccatttg ctcatgccatt ugg trp uga stop Exon 1 NtMRP4-1 tgccattgcaa tttctgtggc guu val auu Ile Exon 1 NtMRP4-1 ctttagccatc tttatactta cuu leuuu phe Exon 1 NtMRP4-1 ttcaactgtt taacactagc gua val aua ile Exon 1 NtMRP4-1 tggacttgca cagtgatggta gca ala aca thr Exon 1 NtMRP4-1 aggcaacaaat agatgctta gag glu aag lys Exon 1 NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggg uuc phe uuu phe Exon 1 NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggga uuc phe uuu cys Exon 1 NtMRP4-1 attgaatcttt cgcgagtccga uuc phe uuu phe Exon 1 NtMRP4-1 aatctttccgc agtccgagt gag glu aag lys

Exón 1 NtMRP4-1 agtacggatg ttgtccaagtt ugg trp uga stop Exón 1 NtMRP4-1 agttcttgtact aatagctggt uca ser uua leu Exón 1 NtMRP4-1 cattgtcttgt gagcactcct ugg trp uag stop Exón 1 NtMRP4-1 ttgtcttgtg agcactcctc ugg trp uga stop Exón 1 NtMRP4-1 tggagcactc tcttctagt ccu pro cuu leu Exón 1 NtMRP4-1 tcttctagttg tacgctcactt gcu ala guu val Exón 1 NtMRP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gcg ala acg thr Exón 1 NtMRP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gug val aug met Exón 1 NtMRP4-1 gaaccgatca ggctttccct agg arg aag lys Exón 1 NtMRP4-1 aaccgatcag gctttccctc agg arg aga arg Exón 1 NtMRP4-1 catgatctca tttcacaagca cuu leu uuu cys Exón 1 NtMRP4-1 atctcttgata attggacaaat aga arg aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 tattagaagct gaatggatttt gga gly aga arg Exón 2 NtMRP4-2 ttcaccgcga atctctcttc aca thr aua ile Exón 2 NtMRP4-2 aaacaaccaaa agagcaatgc gag gly aag lys Exón 2 NtMRP4-2 ccttgaagaat aaaatcttctc uca ser uua leu Exón 2 NtMRP4-2 agaatcaaaat ttctcgaagat ucu ser uuu phe Exón 2 NtMRP4-2 tatctaaggaa aaaacggaga gaa glu aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 tcaacagtcta atctga aca thr aua ile Exón 2 NtMRP4-2 atctgatagg gggattctaaa ggg gly agg arg Exón 2 NtMRP4-2 acttataaag aagaagaaag gaa glu aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 aacttataaag aagaagaaag gaa glu aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 aaggaagaa aaagagaaactg gaa glu aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ile Exón 2 NtMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ile Exón 2 NtMRP4-2 gaagcttttg atggtgggg gga gly gaa glu Exón 2 NtMRP4-2 ttggatggtg ggcgtagtgct ugg trp uga stop Exón 2 NtMRP4-2 ttgtggcaaa ttctctaatg agu ser aau asn Exón 2 NtMRP4-2 gttctctaat gcaagtga aug leu aua leu Exón 2 NtMRP4-2 gcaaagttct taatggcaag cua leu uua leu Exón 2 NtMRP4-2 tattggctg catatgaaac gca ala aca thr Exón 2 NtMRP4-2 caacaaatga atgcttaatt gag glu gaa glu Exón 2 NtMRP4-2 cttcagcrgay gtgccatgtcct cgu arg ugu cys Exón 2 NtMRP4-2 tgtccttcaat cttctctgtt ccu pro ucu ser Exón 2 NtMRP4-2 ggcatgggaa aacattttaa gaa glu aaa lys Exon 1 NtMRP4-1 agtacggatg ttgtccaagtt ugg trp uga stop Exon 1 NtMRP4-1 agttcttgtact aatagctggt uca be uu leu Exon 1 NtMRP4-1 cattgtcttgt gagcactcct ugg trp uag stop Exon 1 NtMRP4-1 ttgtcttgtg agcactcctc ugg trp uga stop Exon 1 NtMRP4-1 tggagcactc tcttctagt ccu pro cuu leu Exon 1 NtMRP4-1 tcttctagttg tacgctcactt gcu wing guu val Exon 1 NtMRP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gcg wing acg thr Exon 1 NtMRP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gug val aug met Exon 1 NtMRP4-1 gaaccgatca ggctttccct agg arg aag lys Exon 1 NtMRP4-1 aaccgatcag gctttccctc agg arg aga arg Exon 1 NtMRP4-1 catgatctca tttcacaagca cuu leu uu cys Exon 1 NtMRP4-1 atctcttgata attggacaaat aga arg aaa lys Exon 2 NtMRP4-2 tattagaagct gaatggatttt gga gly aga arg Exon 2 NtMRP4-2 ttcaccgcga atctctcttc aca thr aua ile Exon 2 NtMRP4-2 aaacaaccaaa agagcaatgc gag gly aag lys Exon 2 NtMRP4-2 ccttgaagaat aaaatcttctc uca be uu leu Exon 2 NtMRP4-2 agaatcaaaat ttctcgaagat ucu be uuu phe Exon 2 NtMRP4-2 tatctaaggaa aaaacggaga gaa glu aaa lys Exon 2 NtMRP4-2 tcaacagtcta atctga aca thr aua ile Exon 2 NtMRP4-2 atctgatagg gggattctaaa ggg gly agg arg Exon 2 NtMRP4-2 acttataaag aagaagaaag gaa glu aaa lys Exon 2 NtMRP4-2 aacttataaag aagaagaaag gaa glu aaa lys Exon 2 NtMRP4- 2 aaggaagaa aaagagaaactg gaa glu aaa lys Exon 2 NtMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ile Exon 2 NtMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ile Exon 2 NtMRP4-2 gaagcttttg atggtgggg gga gly gaga glu Exon 2 NtMRP4-2 ttggatggtg ggcgtagtgct ugg trp uga stop Exon 2 NtMRP4-2 ttgtggcaaa ttctctaatg agu be aau asn Exon 2 NtMRP4-2 gttctctaat gcaagtga aug leu aua leu Exon 2 NtMRP4-2 gcaaagttct taatggcaag cua leu uua leu Exon 2 NtMRP4-2 tattggctg catatgaaac gca ala aca thr Exón 2 NtMRP4-2 caacaaatga atgcttaatt gag glu gaa glu Exon 2 NtMRP4-2 cttcagcrgay gtgccatgtcct cgu arg ugu cys Exon 2 NtMRP4-2 tgtccttcaat cttctctgtt ccu pro uc to be Exon 2 NtMRP4-2 ggcatgggaa aacattttaa gaa glu aaa lys

Tabla 2Table 2

Figure imgf000045_0001
Figure imgf000045_0001

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Figure imgf000046_0001

Secuencias (el sombreado indica la posición de los exones)Sequences (the shading indicates the position of the exons)

Sec. con núm. de ident.: 1 (secuencia de ADN de NtMRP4 con 5' y 3' UTR)Sec. With no. Ident .: 1 (DNA sequence of NtMRP4 with 5 'and 3' UTR)

t c c t a g t a c t g t a a g t g a a c c a g c a a g g a a a c t g c a a a g t a g a t t t c t t g t t c a t c a a a t a a a t c c t t g a g c t g a g a g a t a t g a t t t t t t c t a a g g a a t t t c t c t t t g g c t c t c t g t a g t g g t g a g t t t g a t t c a t a t t t c a a t c t a g t t t t t a g c t t t g c t t a a a a g c t t c t t c t t g c c a c t a g a c c a a a t c c t t t t c c t t t t t g c a t g a c a c t t t t t t g a g t t t c a t t t c t c t t a t t t a t a g a g a a a a t c t t t t g a t g g g g a t g g t t t t t t t t c t c t t t t g c a t t a a t g a t t a g a a t t t a t c a t t g t t a a a t g g t a c t c c c t c a a t a a c t t t t t g a t t t a a a a a a a a a a c t g t c c t t t c a t t c a t a a t c a t c a t c t c c t t t a t t a t a t t a c t c t a a a c t g t t g c t a a a g t t c c t t t t t g t a t a t t t t c c c t a c a t g a a c t e t t g c t g t a c t g t g a a a g t t g a t g a a c t t t t a t t g t a c a a t g t t t t g g t c c a g t a g c t a a c a g c c c t t t t a t t t a a t t c t g a g a g g t c t c t t t c t c t t t c t c t t c a c a c t t t c a c a t g t t t c c g t t t c c t g t a g a t t t c t c c t t t c t c t t t c c t t g g t t c t t t t t c c a a c t c a t a a t c t t c a t g t g a t t t c a a t t t t t g t t t g t t t t t a t t c c a t c c t t t g t c t c t t t t g a t a t g g g t g a c a a a c a t c t t c t c t t g c t g a a t a a a a a t t t c a c c t t t t t t c a g t g t a t g c a g a t t c a g g g g a t a t a a a g a c a t a a a g g a t g a a t c t t t t a t g g t a t a a c a t g g a t a t g a g g a a c a g t a t g t c t t c a g a a t c t t g t t t a g c a t c a c t t t c t t g t t c t g c c t c c a c a t t t c a a t c g t c a g a g g a t t c a g c a g t t g t t a a a t g g t t a a g a t t c a t t t t c c t c t c t c c a t g t c c a c a a a g g a c t c t t c t a t c t t c c a t t g a t g t g c t g c t t t t g c t t a c t t t c a t t g t a t t t g c a g t a c a a a a g t t g t a c t c a a a g t t g a g g t c c a a t g a g c a c t c t a c t t c t a g c a t t g a t a a g c c t c c a a t t g c a c a c a a c a g g a c t t c t g t t a g a a c c a a t c t t t g g t t t a a g c t g t c t c t g a t t t t g t c a g c t a t t t t a g c c t t a t c t t c t a t a g t t t t a t g c a t t t t g g t t a t t g t g g g a a a t t c c c a g t c g c c t t g g a a a g t c a t a g a t g g a c t g t a t t g g t t g t t t c a g g c g a c t a c a c a t g t t g t a a t c a c t a t a c t a a t a g t t c a t g a g a a a a g a t t t c a c g c t a t t t c c c a t c c a c t g t c c c t g c g c g t g t t t t g g a t t g c a a a c t t t g t a g t t a t g a g t t t g t t c t t t g g t t g t g g g a t c a c a a g g c t t g t g t c a c t t a a g g a a a t t g a t c c t a a t t t a a g a a t g g a t g a t a t a a g t t c a t t a g t t t c a t t t c c t a t t t c t g t t g t t c t c t t c a t t g t t g c c a t t a a a g g t t c g a c c g g a g t t g c t g t a a t t a g t g a t t c t g a a t c t c a c t t a a g t g a t g a a a c c a a t g g t t a t g a a c t c c t g g a t a a a t c c a g t g t g a g t g g c t t t g c t t c a g c t t c t c t a a t a t c g a a a g c c t t t t g g a t t t g g a t g a a c c c t t t a c t g c a a a a a g g t t a c a a g t c a c c t c t c a a g a t t g a t g a a g t t c c t t c a c t t t c c c c a c t g c a t a g a g c a g a g a a a a t g t c t c a a c t t t t c g a a a g a a a t t g g c c t a a a c c t g a a g a a a t a t c a a a g c a t c c t g t c c g a a c a a c a t t g c t g c g t t g c t t t t g g a a g g a a g t t a t t t t t a c t g c c a t t c t t g c a g t a a t t a g g g t t c c t a g t a c t g t a a g t g a a c c a g c a a g g a a a c t g c a a a g t a g a t t t c t t g t t c a t c a a a t a a a t c c t t g a g c t g a g a g a t a t g a t t t t t t c t a a g g a a t t t c t c t t t g g c t c t c t g t a g t g g t g a g t t t g a t t c a t a t t t c a a t c t a g t t t t t a g c t t t g c t t a a a a g c t t c t t c t t g c c a c t a g a c c a a a t c c t t t t c c t t t t t g c a t g a c a c t t t t t t g a g t t t c a t t t c t c t t a t t t a t a g a g a a a a t c t t t t g a t g g g g a t g g t t t t t t t t c t c t t t t g c a t t a a t g a t t a g a a t t t a t c a t t g t t a a a t g g t a c t c c c t c a a t a a c t t t t t g a t t t a a a a a a a a a a c t g t c c t t t c a t t c a t a a t c a t c a t c t c c t t t a t t a t a t t a c t c t a a a c t g t t g c t a a a g t t c c t t t t t g t a t a t t t t c c c t a c a t g a a c t e t t g c t g t a c t g t g a a a g t t g a t g a a c t t t t a t t g t a c a a t g t t t t g g t c c a g t a g c t a a c a g c c c t t t t a t t t a a t t c t g a g a g g t c t c t t t c t c t t t c t c t t c a c a c t t t c a c a t g t t t c c g t t t c c t g t a g a t t t c t c c t t t c t c t t t c c t t g g t t c t t t t t c c a a c t c a t a a t c t t c a t g t g a t t t c a a t t t t t g t t t g t t t t t a t t c c a t c c t t t g t c t c t t t t g a t a t g g g t g a c a a a c a t c t t c t c t t g c t g a a t a a a a a t t t c a c c t t t t t t c a g t g t a t g c a g a t t c a g g g g a t a t a a a g a c a t a a a g g a t g a a t c t t t t a t g g t a t a a c a t g g a t a t g a g g a a c a g t a t g t c t t c a g a a t c t t g t t t a g c a t c a c t t t c t t g t t c t g c c t c c a c a t t t c a a t c g t c a g a g g a t t c a g c a g t t g t t a a a t g g t t a a g a t t c a t t t t c c t c t c t c c a t g t c c a c a a a g g a c t c t t c t a t c t t c c a t t g a t g t g c t g c t t t t g c t t a c t t t c a t t g t a t t t g c a g t a c a a a a g t t g t a c t c a a a g t t g a g g t c c a a t g a g c a c t c t a c t t c t a g c a t t g a t a a g c c t c c a a t t g c a c a c a a c a g g a c t t c t g t t a g a a c c a a t c t t t g g t t t a a g c t g t c t c t g a t t t t g t c a g c t a t t t t a g c c t t a t c t t c t a t a g t t t t a t g c a t t t t g g t t a t t g t g g g a a a t t c c c a g t c g c c t t g g a a a g t c a t a g a t g g a c t g t a t t g g t t g t t t c a g g c g a c t a c a c a t g t t g t a a t c a c t a t a c t a a t a g t t c a t g a g a a a a g a t t t c a c g c t a t t t c c c a t c c a c t g t c c c t g c g c g t g t t t t g g a t t g c a a a c t t t g t a g t t a t g a g t t t g t t c t t t g g t t g t g g g a t c a c a a g g c t t g t g t c a c t t a a g g a a a t t g a t c c t a a t t t a a g a a t g g a t g a t a t a a g t t c a t t a g t t t c a t t t c c t a t t t c t g t t g t t c t c t t c a t t g t t g c c a t t a a a g g t t c g a c c g g a g t t g c t g t a a t t a g t g a t t c t g a a t c t c a c t t a a g t g a t g a a a c c a a t g g t t to t g to a c t c c t g g to t to to to t c c a g t g t g to g t g g c t t t g c t t c a g c t t c t c t to to t to t c g a a a g c c t t t t g g a t t t g g a t g to a c c c t t t a c t g c a a a a a g g t t a c a a g t c a c c t c t c a a g a t t g to t g as g t t c c t t c a c t t t c c c c a c t g c a t a g a g c a g a g a a a a t g t c t c a a c t t t c g a a a g a a a t t g g c c t a a a c c t g as g a a a t a t c a a a g c to t c c t g t c c g a a c a a c a t t g c t g c g t t gc t t t t g g a a g g a to g t t a t t t t t a c t g c c a t t c t t g c to g t a a t t a g g g t a t g t g t t a t g t a t g t a g g g c c a a c a c t c a t a c a a a g a t t t g t t g a t t a c a c a g c a g g a a a g a g g a c a t c t c c t t a t g a a g g a t a c t a c c t t a t a g g a a c t c t c c t a a t a g c c a a a t t t g t g g a a g t c c t a a c c t c t c a t c a g t t c a a c t t t a a c t c c c a a a a g c t t g g c a t g c t t a t t c g a g c g a c a c t t c t c a c t t c t t t g t a t a a g a a g g g g t t a a g g t t g t c a t g c t c a g c t a g a c a g g c t c a t g g t g t t g g a c a g a t t g t a a a t t a t a t g g c c g t c g a t g c t c a g c a g c t g t c c g a t a t g a t g c t a c a g c t a c a t t c c a t t t g g c t c a t g c c a t t g c a a g t t t c t g t g g c t t t a g g c a t c c t t t a t a c t t a c c t c g g t g c t t c a a c t g t t g t 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t t g t g g t t c t t t g c g g a a t t a t g c a a c c a a c t t t t t a t g t g t t t c a a a t a t a t a t a c t g a t a a c t g a a t a c t g t c a t t g g t a a a t c a t a g t t g t t g a t a a c g g a g a t a a c t g g a g t g t c g g a c a g a g g c a g c t t c t t t g c t t g g g a a g a g t g a t g c t a a a a c g t a g c a g a c t t c t a t t t a t g g a t g a g g c a a c t g c c t c t g t t g a t t c a c a g a c a g a t g c a g t g a t t c a g a a a a t c a t c c g c g a g g a c t t t g c g g c c t g t a c t a t a a t c a g c a t t g c c c a c a g a a t a c c a a c a g t c a t g g a c t g t g a t a g a g t t c t t g t t a t a g a t g c a g g t g c t g a t t t c t c t c c t t t t a c t t t g t a c c t t a t t t t g a a t c t g g t a a a t g a t t a t t t a t c t g t a t g t g a t g g t t t c c a a c c a a t c a t a g t c a g t a c c t t t a t g a a g a a a t t g c c t a a t g t t a g c c a a g t a g t a g t a a a t g c a t g a a g t c a t t a g c c t a t t t g t t t t g g a 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t g g a t g a g g c a a c t g c c t c t g t t g a t t c a c a g a c a g a t g c a g t g a t t c a g a a a a t c a t c c g c g a g g a c t t t g c g g c c t g t a c t a t a a t c a g c a t t g c c c a c a g a a t a c c a a c a g t c a t g g a c t g t g a t a g a g t t c t t g t t a t a g a t g c a g g t g c t g a t t t c t c t c c t t t t a c t t t g t a c c t t a t t t t g a a t c t g g t a a a t g a t t a t t t a t c t g t a t g t g a t g g t t t c c a a c c a a t c a t a g t c a g t a c c t t t a t g a a g a a a t t g c c t a a t g t t a g c c a a g t a g t a g t a a a t g c a t g a a g t c a t t a g c c t a t t t g t t t t g g a t t t t g t g a g t t t c a t a c t t c a a a c t g g a a g c t t a t g c t a t a c t a t c t g a t c c c t t g t t t g t a t a g a t t g c t t t c t t t t c c t t t t t c t c g g a t t t a t c t t a t a t a t a a g c g g a c a g a g t a a a a g a a t g t a a a c a t g c g t a a t t t g a c c t a t t a t a g c a g a t t a t t t g t c t t a t t t t c c a g g t c g c t g a t t c c a c t t a t t a g g a g t a g t t a c a c g t a t t t a t c t t t t a a g t g a a a t a a t a g t g t a a a g t t t c t t t t g g c a c t g t c g g t g t a a a g a a g t t a a a c t c c t t t c t t t a a c c c c g g c a t t t c t t a t t c a t g c a g g a a t a g c a a a a g a g t t t g a c a a a c c a t c t c g t t t gc t t g a a a g g c c t t c a c t t t t t g g g g c t c t g g t t c a a g a a c a c g c c a a c c g a t c c t c t g to g c t c t a a c c a c a c t a t t t t g g c t t t c a t g c c t t t t g c t g t to to to t t g c a g c t a t c t t g g a g g a t a g g t g a a a c a g g a a a a a t a c c t a t c c a a a t g t t a c a t a g a t t t c c a a a t a g t g t t a t c t c c t a c t a to g c t a t c c a g t a g a t t t t t g g a a a t g t a a c a a t a t t g g g a t t a a c a a t t g t to to t t g to t g a a t c t a t t a a t c a a a t a c a a t g to t t to t t c t g t t to t to g a t g t a g t c t g t g c a a t g t t to t to t to g a c t g to t t t c

Sec. con núm. de ident.: 2 (secuencia de ADN de NtMRP4 sin 5' y 3' UTR)Sec. With no. Ident .: 2 (DNA sequence of NtMRP4 without 5 'and 3' UTR)

a t g g a t a t g a g g a a c a g t a t g t c t t c a g a a t c t t g t t t a g c a t c a c t t t c t t g t t c t g c c t c c a c a t t t c a a t c g t c a g a g g a t t c a g c a g t t g t t a a a t g g t t a a g a t t c a t t t t c c t c t c t c c a t g t c c a c a a a g g a c t c t t c t a t c t t c c a t t g a t g t g c t g c t t t t g c t t a c t t t c a t t g t a t t t g c a g t a c a a a a g t t g t a c t c a a a g t t g a g g t c c a a t g a g c a c t c t a c t t c t a g c a t t g a t a a g c c t c t a a t t g c a c a c a a c a g g a c t t c t g t t a g a a c c a a t c t t t g g t t t a a g c t g t c t c c g a t t t t g t c a g c t a t t t t a g c c t t a t c t t c t a t a g t t t t a t g c a t t t t g g t t a t t g t g g g a a a t t c c c a g t c g c c t t g g a a a g t c a t a g a t g g a c t g t a t t g g t t g t t t c a g g c g a t t a c a c a t g t t g t a a t c a c t a t a c t a a t a g t t c a t g a g a a a a g a t t t c a c g c c a c c c c c c a t c c a c t g t c c c t g c g c g c g t t c t g g a t t g c a a a c t t c g c a g t t a t g a g t t t g t t c t t t g g t t g t g g g a t c a c a a g g c t t g t g t c a c t t a a g g a a a t t g a t c c t a a t t t a a g a a t g g a t g a t a t a a g t t c a t t a g t t t c a t t t c c t a t t t c t g t t g t t c t c t t c a t t g t t g c c a t t a a a g g t t c g a c c g g a g t t g c t g t a a t t a g t g a t t c t g a a t c t c a c t t a a g t g a t g a a a c c a a t g g t t a t g a a c t c c t g g a t a a a t c c a g t g t g a g t g g c t t t g c t t c a g c t t c t c t a a t a t c g a a a g c c t t t t g g a t t t g g a t g a a c c c t t t a c t g c a a a a a g g t t a c a a g t c a c c t c t c a a g a t t g a t g a a g t t c c t t c a c t t t c c c c a c t g c a t a g a g c a g a g a a a a t g t c t c a a c t t t t c g a a a g a a a t t g g c c t a a a c c t g a a g a a a t a t c a a a g c a t c c t g t c c g a a c a a c a t t g c t g c g t t g c t t t t g g a a g g a a g t t a t t t t t a c t g c c a t t c t t g c a g t a a t t a g g g t a t g t g t t a t g t a t g t a g g g c c a a c a c t c a t a c a a a g a t t t g t t g a t t a c a c a g c a g g a a a g a g g a c a t c t c c t t a t g a a g g a t a c t a c c t t a t a g g a a c t c t c c t a a t a g c c a a a t t t g t g g a a g t t c t a a c c t c t c a t c a g t t c a a c t t t a a c t c c c a a a a g c t t g g c a t g c t t a t t c g a g c g a c a c t t c t c a c t t c t t t g c a t a a g a a g g g g t t a a g g t t g t c a t g c t c a g c t a g a c a g g c t e a t g g t g t t g g a c a g a t t g t a a a t t a t a t g g c c g t c g a t g c t c a g c a g c t g t c c g a t a t g a t g c t a c a g c t a c a t t c c a t t t g g c t c a t g c c a t t g c a a g t t t c t g t g g c t t t a g g c a t c c t t t a t a c t t a c c t c g g t g c t t c a a c t g t t g t a a c g c t a g c t g g a c t t g c a g c a g t g a t g g t a t t t g t g g t g t t t g g a a c t a a a a g a a a c a a c a g g t t t c a a t t t a a c a t c a t g a a g a a t c g t g a t t c t a g a a t g a a a g c g a c a a a t g a g a t g c t t a a t t a t a t g c g c g t t a t a a a gt t c c a g g c a t gggaagaac a t t t t aac a a a a g a a ttg a a t c c t t ccgcga& tccgagta t g s a tg g r tg tC c a a g t t c t tg r a c tc ñ a ü c g c tg g g a a ta tc a t tg tc tc g tg g a g c ü C t c c t c t t c t a g t g g c t a c a c t c a c t t t t g g a a g t g c a a t c L t g t tg g g a a tc c c g c t t g g tg c ag gga ca g t g t t c a c t gcaa ca t c t c t C11 caa ga c g 11 ge ag ga ac: cgatca ggg c t t t c c c t c a a C c c a t g a t c t c a c t t t c a c a a g c a a t g a t a t c t c ¡ t t g a t a g a t t g g a c a a a t a t a t ga tga gt a aggagt t ag tg ga t aa agetg t gga aa ga c t a ga a g g t t gtggggg ta c a a c c g c ta tg c a g g tg a a a g a tg g a g c t t t t tg c tg g g a tg a tg a a a a c a g ta a a g a a g a a tc g a aa aa tg taaac tt tg ag a tcag aaaa g g a g ag c ttg cag cag t iag ^ g g g g ac a g t tg g g g c g g g g a a g tc t t c c c tc c t tg c a t t tg ta c t t9 g tg a g a t9 C a c a a g t tg tC g g g t c a g g t a t g g c c c t c a t c c c t c t g t t t g t t t g a t t a a t a c a a a c t t t g c t g c c a a t t a c c t t t L g c c c c t t g t t g c t a e c t c t t t t c t g t g g t a t a a a a a a t t a a t g t a g g c t a a t g tg ta g a g tg g ig g ta t ta t & t g c a g a a c a a t t g c a a t c a a g c a a t t a c c t g t g a g a t a c t a t t t t g t t t t c a t a t t a g t g g a c t g g t a c a t t c t c a t t g g t g t a t e g t t t g a t e t c c a c c a f la g c a g a g g c c t ta c tg g c c g a c a g a g tc a a a c ta c tg tg c t tc f lc r tc c t t t ta c te c a a t c c t tA í j t a g tC t t tg c tE C t f lA tg a a e t tc a a g a g tg ta a ta g a a a c a c c a t ta ta C t a t t a g c t g a t t a g t t a c t t t a c a a t t c c a g a g c a t a t t t a c a t t t t c t g c t t g g t t g t c t a t ta c tc tg g a c a a c a g tc c c a a a c g e a a g e a a a a tc a a c tg tg t t t tc a g tc t tg a g c i : g a c c a a tc a g ttC a C -g a tg c e e te a g e ttg tc c a a g c tg g tg c c C c a c c g g a a tta c g tg g g a c c t t c g t a c t t a a t c a a c t a g t t c a c c t t c t t c t t a a a a a t a t t g a a t g a t t t g a t t g g t c a a t a g t t e c t t a a a t g t a g t a a t t a t t t g c t a a e t t i c t t t a d c a a c e c í t t g t C C aacag g tcae aa t L t g t g g t t c a a c t g c c t a t g t t g c a c a a a c a t c g t g g a t t r a g a a t g g c a c g a ta c a a g a a a a ta tc e tg t t tg g ta tg c c a a tg a a c a g a g a c a g a ta c a a g g a a g tg a tc c g g g t t tg c c g e t tg g a g a d g g a c t tg g a a a ta a tg g a g t t tg g agaccagactg a a a ta g g ag aa cg E g g ca tcaacc tcag tg g tg g tcag aag ca g c g aa tccag c ttg eaa g a g ? t g t t t a c c a g g a c t g t g a t a t t t a £ C C t C l : a g a t g a t g t a t t c a g t g e a g t t g a t g c tc a c a c tg g c tc tg a a a t c t t c a a g g t t a g a a g t c c a c a a t g tc a t g t g t c a t t g a a g a t t t a a t t t a a g a t a g a a a t t a c a t t g t t t c a t t c t g c a a a t t a t g g a c c t a t c a g a g a a a aa t c a t g g a t t t t g a a tg g f l ta c c t tc c e c a g tg a a g a c a e a ta tc a tL te g tg g g a g g A a g a t g t g a a a g t g g c a a g c ta t t ta c tc c a a a a a g ta ta a tc ta a a a g a c t t t t a t t a a g t t L 9 g a a g 9 e t t a a t c c a t e a t t t g t t a t c t g t t g t c t a c t c g t c t t c a t t a a a a t t c t t : c t t a g t c c a s t c a c t t t c g a t g a a g t t g a c t a g t c t t a g t c a c c t g a a t a c t t t a a a t e t t t g c c t m g g t g t c t e t a t a t t t t c a g c c a t c r t e a a t t e e g a a g e t c a t a t t t g t t c t c t c t t t g c a a t g t c c a t c t g a a a g t t t c a t g c t t t t t t g c a g g a a t g t g t g a g g g g a a t t e r t t s a a g a t a a s a c c a t t t t g c t t g t C a c a c a c e a a g t t g a c t t c t t g c a t a a t g t t g a c c t g a t c c t t g t a a g t t t c a g a g t g t t t t a t c a a c c c c t t t g g a a c c a a g t g t c a a g a g c a g t g t t t c t t g g t t g t t a a a t g a t t c s c a t g t g t g t c g g t t t c t a t a a a a c c t g a a c t t t a t g t c t ta E c a g a g tg t t tu g c t t tc r t tg a a g g tc a tg c g a g a rg g g a tg a tc g tg c a ñ tc tg g c a a a t a t a a tg a g a ta t ta g a a g c tg g a a tg g a tc t ta a a g a g c ta g ta g c tg c a c a tg a g a c e t e t t t a gAa e t tg 11 ga e g tg g a a i ta a cea aa gaga g esa t g cc t cc c t tgaa ga a tc a a a a tc t tc tc g a a g a t ta tc ta a g g a a g a a a a c g g a g a tg a ta a a te tc a a c a g tc caca tc tg ac ag g g gg g a c tc taaac ttacaaag g aa g aag aaag ag aaac tg g aa aag t C a g t c c t c g t g t g t a c a a g e t a t a t a t t a c t g a a g e t t t eg g o tg g tg g g g tg ta g tg e t a g t t a t c t t g t - t c t c g c t c t t g t g g c a a a g t t c t c t a a t g g c a a g t g a t t a t t g 9 ctggc 4 t a t g a a a c L t c a g c g g a t c g t g c c a t g t c c t t c a a t c e t t c t c t g t t t a t t g g g a t a t a c g g t g t t a t t g c a g t t g t t t c t t c g t t g c t g a t a g t g a t c a g g a t g t a t t t c g t g a c a c t t a tgggg c tcaagac tg c CCaa a t a 1 1 t t t c g g a c a g a t t c t t t a c agea t a c t g c atg c t c c t a t g t c a t t t t t tg a c a c a a e a c c t t e e g g a a g a a t t c t g a g t c g g g t a a a t t t c t g a g g a c a a g t t t t C C C t t t t g c a t g t a a a t t c a a a c t t t g c t g c t t a g a t g a t t a a a t a a t g a a a a a t a t c c a t t g c a t g t t t t a a t g t g t a t g a c a t g t t a g a a t t t t g a a t a g a a g t t c a t t e a c t g a t g t t g a g a t g t t t t g t t t t t t t t c t g c a g g e a tc ta a tg a tc A g a c c s s c a t t g a t g t c t t c e t c e c g t t t t t t a t g a a t c t c a c t t t g g c c a t g t c t a t c a c a c t g c t c g g c a t c a t c a t c a t c a c a t g c c a a t a t t c t t g g c c t a c c g t a c t a c t t t t g a t t C C t e t g g g t t g g c t t a a t a t c t g g t a e c g g g t a t g a g c a c t g t t t a t a a c a g c c g t c c t t t t t t c r t t t c t t g t c t g a a c t e a a a t t t g a a t e c t t t g t t t a g a g g c a a t t a g t c t g c t c t g a g c a t t t t g g c t g a c a g c t a t c a t g t a t a t t a a a a g g c a a c t t t t t t a t t c g t t c t g t e e a g c t s a a a c t c t t t a e t c a a a a t g t g g t t a a c t g c a t a t t t c c g t g t c t c c t a t t t t t t g a t t a t t t g e a a c t e t g a t c a a t c t a g a t t t g g g g a a g g c t t g t t g t t a g t t g a t g a c t s g s t a c t a a g c t c a c a t c t a c a t t g g t t g e i a g t a g a a t t t t t a a g t t g t c a t t c a c t t a t a t t g t t t g a a c ta g g a g a t ta g c a t tc t tc tg c a a g g a g c c c tg a a tg c t tg a a a a g t ta a a c a g a a a a g a a a a a g c tc a g g g e a g a ta g a c a c a a tg tg t ta a a g ta a t tc a a t tggageac*ga ta ta tg a c a tg tg tC a t t tg g g a g c ta c g a a a a a g a ta a g g a c ta t ta tg ta g a c ta c a a t t g a a a t a a c a g g t a a t t c a t t t c t g g t t r a c a g g g a c a t c a t c t c g c a a c a t c t c g t g a a t t g a c t c g g c t t g a c t c a a t t a c & a a a g e r a c c tg t t s i t t c a t c a c t t c t c t g a a a g e a t C t c a g g t g t t a t g a c t a t a c g t t g c t t t a g g a a g c a g g a g a t g t t t t g t a iC g ig a a t g t aaaccga g tg aa 11 cea a t c tg c g a a t gga 111 c c a t a a ea a rig gan c ta a t ga a t gg 11 g g g c t t t c g a c c g g a a t t g a t g g g a a g c t t a c t t c t t t g t g t t t c t g c a a t g t t c a t g a t tg tc t ta c c ta g e a g e o t a a tc a a g c c a g g t a t a a c a c c g E c c a a t g c c c s t t t a t g g g a a t t a t a a a t t c t a g t a t t t g a t a a t c C t t c t g t a c t t t a g a t c t a C C t g c t c t a c t g a a a a a t g a a a t g a g t a t g a g g a & a t a g a a t a t c c g t t g a g c a t t t i t g t c t t t c t a t t a a a a a t t t g c a t t c n a t c t t c r t t g c t t c a a g t c a a a a c c t t g a a c a a c t a t a t c t a g a g a a c t t t c c t t c t t g t g a & g t a a t g e & t a t a t a c a t c a a g a g a a g t c a g a g t t g c t g a a t g a a a t a g t a g a t c a a a t t t a a g t g t t g t g c c t a t a a a g a a t t g t a t g g t g a g a t t g a a t a t a g j i g g t c a t a t t a t t t t c t c a a t e t t a g t g a t t a a a g t a t t c c a t a c a a a c a g a c a a g c a t t t a g t c g t g c a t t c a t t g g c a c t a c a a a a t t a t c a a c c a a g & g t a a t a t c c t t t c a g c t c t c c t t : t g t a t a t g t g t g t t c t a t t c t g g a g c t g a * g a t a a c t a a t a t t c t t t t t t a c t t c t a c a g a a a a t g t t g g t t t g t c a c t a t a a t a t g g c t t g t C t c t t a a t a g t g t t C t a t t c t g g t c c a t c t t t g t g a g t t g c t t t g t g g a a a a t a a a a t g g t t t c t g t c g a a a g a t t a a a a e a g t t C t ta g a a a ta c c a tc & g a a g c a g a g tg g a g a a a g a tg g a t t tL c tc c c a c c t tc a a g t tg g c c a a g c c g t g g g * * t g t i : g a g í t t g a a a a c g t g c a g g t a a t a a t t c t a a c t a a t t í : t g t g g t tg c ta tn tg c ta g ta t t t g c a c a a a a g g & a a d e t a t a a a a a g b t c a t a g t a a g g a a g a g a g g g t a g c t g t a t t a a c a a g c c t a c a g a t t c t t t a a t t t c a a a t a t g t t a c g t t g a a t c t e t a t a t t g t L t g t t e t a e t g g te a a eragg 11 a g a ta t c g t o c gaa c a c t c c t c t a g t g c t t a a a g g a g t t a c tc tc a g c a t ta g a g g g g g a g a g a a g a ta g g tg t tg t tg g tc g ta c a g g g g g t g g a a a a t c a a c a t c a a t t e a a g t c t t c c t t c g t t t g g t ggag e c tg c a g c tg g a a g a a t a a t e * t t g a t g a c g t a g a t a t a t C C i g a c t t g g g c t t c a t g a t c t t a g a t t : t c g c t t c g g g a t c a t t c c c c a a g a g e e a g tc e t t t t tg a a g g a a e tg tg a g a a g e a a c a t tg a e c c c a t t g g a c a a t a t t c a g s 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aga ta tcgtoc gaa cactcctctagtgcttaaagg agttac tc tc agcat ta gagggggagagaaga ta gg tg t tg t tg g tc g ta cagggggtggaaaatcaacat caatteaagtcttccttcgtt TGGT GGAG ec tg CAGC tg gaagaataate * ttgatgacgtagatatat CC igacttgggcttcatgatctt agatt: tcgcttcgggatcattcccca agageeag etttt tc tg tg tg aaggaae agaageaacat tg aecccattggacaatattcag tctaacttgctgactgaaata stgatgaaatttggaaggtaa tagtacagagttagccaaaca atttacaaaaatctcaaaata tgtcttctgagtgctgagatc tttttggattataaflttctg taagagcaacatactatttgt tagtgagaflgaaaagcatat aeteeagtgtt ttgttatctc ccagaatgtctctaacatgaa atcgtgtacattgca gagcc tc gaacgc tg ccaae tc aaaga tg tg g tg tc tt ta aaaeecgaaaaact tg at tc accaggtaaattttcct C ctctacgtcatccttgtggtt ctttgcggaattatgcaacca actttttatgtgtttcaaata tatataergataactgaatac tgtcattggtaaatcatagtt gttgataacggagataactgg agtgtcggacagaggcagctt ctttgcttgggaagig tg tg crta aa AEGT agea tgaggcaa gaettctatttatgga c tg cctctgctgattcacagacag to tg cag tg attcagaaaa tc to tc cgcgaggactt L gcggcc tg r ta t t t t t t t t t t t 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Sec. con núm. de ident.: 3 (Intrón 1) Sec. With no. of Ident .: 3 (Intron 1)

gttagaaccaatctttggtttaagctgtctctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcat tttggttattgtgggaaattcccaggttagaaccaatctttggtttaagctgtctctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcat tttggttattgtgggaaattcccag

Sec. con núm. de ident.: 4 (Intrón 2)Sec. With no. of Ident .: 4 (Intron 2)

g t a t g g c t c t c a t c c t t c t g t t t g t t t g a t t a a t a c a a a c t t t g c t g c e a a t t a c c t t t t g c c c c t t g t t g c t a c c t c t t t tc tg tg g ta ta a a a a a t ta a tg ta g g c ta a tg tg ta g a g tg g a g g ta t ta ta tg c a g a a c a a t tg c a a tc a a g c a a t t a c c t g t g a g a t a c t a t t t t g t t t t c a t a t t a g c g g a c t g g t a c a t t c t c a t t g g t g t a t c g t t t g a t c t c c a c c a a a g c a g a g g t t t ta c tg g c c g a c a g a g tc a a a c ta c tg tg c t tc a c tc c t t t ta c tc c a a tc c t ta g ta g tc t t tg c t tc ta a tg a a c t t c a a g c g t g t a a t a g a a a c a c c a t t a t a t t a t t a g c t g a t ta g t t a c t t t a c a a t t c c a g a g c a t a t t t a c a t t t t c t g c t t g g t t g t c t a t t a c t c t g g a t a a c a g t c c t a a a t g c a a g c a a a a t c a a c t g t g t t t t c a g tc t tg a g c tg a c c a a tta g t tc a tg a tg tc c tc a g c t tg tc c a a g c tg g tg c c tc a c c g g a a tta tg tg g g a c c t t c g t a c t t a a t c a a c t a g t t c a c c t t c t t c t t a a a a a t a t t g a a t g a t t t g a t t g g t t a a t a g t t c c t t a a a t g t a g t a a t t a t t t g c t a a c t t a c t t t a c c a a c c c c t t g t c c a a c a ggtatggctctcatccttctgt ttgtttgattaatacaaactt tgctgceaattaccttttgcc ccttgttgctacctcttt tc tg tg g ta ta aaaaat ta tg ta ggc ta tg tg ta gag tg gagg t t t t tg cagaacaat tg caa tc aagcaattacctgtgagatac tattttgttttcatattagcg gactggtacattctcattggt gtatcgtttgatctccaccaa agcagaggttt ta c tg gccgacagag tc AAAC ta c tg tg ct tc ac tc CTTT ta c tc caa tc ct t g t g tc tt tg ct tc ta tg aacttcaagcgtgtaatagaa acaccattatattattagctg at ta gttactttacaattccagagc atatttacattttctgcttgg ttgtctattactctggataac agtcctaaatgcaagcaaaat caactgtgttttcag tc t tg agc tg accaa tta gt tc to tg tg tc c tc AGCT tg tc caagc tg g tg cc tc accggaat a t g t a g t a t t a t t a t t a t t t g a t t t g a t g t t g t t a t g t t a t g t t a t t t g t t t t t t t t t t t t t t t

Sec. con núm. de ident.: 5 (Intrón 3) Sec. With no. of Ident .: 5 (Intron 3)

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Sec. con núm. de ident.: 6 (Intrón 4)Sec. With no. of Ident .: 6 (Intron 4)

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Sec. con núm. de ident.: 7 (Intrón 5)Sec. With no. of Ident .: 7 (Intron 5)

g c a a a tte e tg a g g a c a a g tt t t td C tt t tg c a tg ta a a t tc a a a c t tC g c tg c t ta g a tg a t ta a a ta a tg a a a a a ta tc c a t tg e a tg t t t ta a tg E g ta tg a c a tg t t& g a a t t t tg a a ta g a a g t tc a t tc a c tg a tg i : tg a g a tg tc t t g c t t t t t t t e t g c a g gcaaa tte e tg aggacaag tt tt td C tt t tg ca tg ta aat tc aaact tC gc tg ct ta ga tg at ta aa ta tg aaaaa ta tc cat tg ea tg ttt ta tg E g ta tg aca tg t t & gaattt tg aa ta gaagt tc at tc ac tg a tg i: tg aga tg tc tt gctttttttetgcag

Sec. con núm. de ident.: 8 (Intrón 6)Sec. With no. number: 8 (Intron 6)

g ta tg ag cactg ttta taacag c cg tcc t C t t t t c t t t t c t t g t c t g a a c t c a a a t t t g a a t c c t t t g t t t a g a g g c a a tta g t c tg c tc tg ag catt t tg g c tg a c a g tta t ta tg E a ta t ta a a a g g c a a c ttL t fc ta t tc g t tc tg tc c a g c t a ü ja c t t t t t a c t t a a a a t g t g g t t a a t t g o a t a t t t c t g t g t c t c c t a t t t t t t g a t t a C t t g c a a c t c e g a t o aatccagatttggggaaggcttgttgttagttgatgactagatactaagctcaeatctaC^ttggtitgcaagtagaa t t t tc a a g t tg tc a t tc a c t ta ta c tg t t tg a a c ta g g a g a e c a g c a t tc t tc tg c a a g g a g c c c tg a itg c t tg a a aagttaaacagaaaagaaaaagttcagggcagatagacat a a tg tg t ta a a g ta a t tc a a t t ggageacagatat*t g aeatg tg tta tt tgggagctaegaaaaaga taaggacta tta tg t3gactacaa ttgaaa taacaggtaa t t c a t t te tg g tt ta c a gg ta tg ag cactg ttta taacag c c tcc t C ttttcttttttcttgtctgaact caaatttgaatcctttgttta gaggcaa tta gtc tg c tc tg ag catt t tg gc tg acag tta t ta tg E a ta t a t aag gcaac ttl t fc t t tc g t tc tg tc cagcta ü ja ctttttacttaaaatgtggtt aattgoatatttctgtgtctc ctattttttgatta C ttgcaactcegato aatccagatttggggaaggcttgttgttagttgatgactagatactaagctcaeatctaC ^ ttggtitgcaagtagaa ttt tc AAGT tg tc at tc act ta ta c tg tt tg aac ta ggagaecagcat tc t tc tg caaggagccc tg itg ct tg aa aagttaaacagaaaagaaaaagttcagggcagatagacat aa tg tg t ta aag ta at tc TAs ggageacagatat * tg aeatg tg tta tt tgggagctaegaaaaaga taaggacta tta tg t3gactacaa ttgaaa taacaggtaa ttcatt te tg g tt ta cag

Sec. con núm. de ident.: 9 (Intrón 7)Sec. With no. of Ident .: 9 (Intron 7)

g ta ta a c a c c g tc c a a tg c tc a t t ta tg g g a a t ta ta a a t tc ta g ta tc tg a ta a tC C t tC tg t f te t t t * g a tC ta c c tg c tc ta c tg a a a a f l tg f la a tg a g ta tg a g g a a a ta g a a ta tc c g ttg a g c a tC ta tg tc t t tc ta t ta a a a a t t t g c a t tc ta tc t tc t tg t t tc a a g tc a a a a tc t tg a a e a a c ta t3 tC ta g a g a a tt t tC c t tc t tg tg a a g ta a tg c a ta ta taca tca ag ag aag tcag ag ttg c tg aa tg aaa tag tag a tcaa a tt taag tg tcg tgc c ta taaag aa ttg t a tg g tg a g a ttg a a ta ta g tg g tc a ta t ta t t t tc tc a a tc t ta g tg a t ta a a g ta t tc c a ta c a a a c a g a c a a g c a t t ta g tc g tg c a t tc a t tg g e a c ta e a a a a t ta E c a a c c a a g a g ta a ta t tc t t tc a g c t t tc c tc tg ta ta tg tg t g t tc ta t tc tg g a g c tg a a g a fc a a c ta a ta t tc t t t t t ta t t tc ta c a g g ta ta acaccg tc caa tg c tc att ta tg ggaat ta ta aat tc ta g ta tc tg at rt tC C t tC tg tf I ttt * ga tC ta c c tg c tc ta c tg aaaafl tg f the a tg ag t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t tg t tg a ta ta t g a ta ta tca ag ag aag tcag ag t tg a tg aa tg aaa tag tag a tca a tt taag tg tcg tgc c ta taaag aa ttg ta tg g tg aga ttg aa ta ta g tg g tc a T ta t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t tg tg tgt tc ta t tc tg gagc tg aaga fc aac ta t ta t ttttt ta tt tc ta cag

Sec. con núm. de ident.: 10 (Intrón 8) Sec. With no. number: 10 (Intron 8)

gtaataattctnactaattctgtggttgctatttgcbagcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttc&tatfta a g g a a g a g a g g g ta g c tg ta t ta a c a a g c c ta c a g a ttc t t ta a c t tc a a a ta tg tta c g ttg a a tc tc ta ta . t tg L t tg ttc tac tg g ccaacaggtaataattctnactaattctgtggttgctatttgcbagcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttc & tatfta g g a g a g g g ta g ta t ta a c a ta g a t t a t t a t t a t a t a t t t t t t t t a t t t t a t t t t t t t t t a t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t a t t t t t tg L t tg ttc tac tg g ccaacag

Sec. con núm. de ident.: 11 (Intrón 9)Sec. With no. of Ident .: 11 (Intron 9)

gt aazct & acttgctgactgaaataatt cacaaaaatctcaaaatatagtacagagt tagccaeacatg tc ttc tga g tg c tg a g a tc t t t t tg g a t ta ta a a t tc tg t aagagc&acatactatttgttagtg-agaagaaaagC&C&taCtíC a g tg t t t tg t ta tc tc c c a g a a tg tc tc ta a c a tg & a a tc g tg ta c a t tg c a ggt aazct & acttgctgactgaaataatt cacaaaaatctcaaaatatagtacagagt tagccaeacatg tc ttc tga g tg c tg aga tc ttt t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t cag

Sec. con núm. de ident.: 12 (Intrón 10 )Sec. With no. number: 12 (Intron 10)

g ta a a t t t tc c tC C C C ta tg te a tc c t tg tg g tc e t t tg e g g a a t ta tg c a a c c a a c t t t t ta tg tg t t tc a a a ta t a ta ta e tg a ta a c tg a a ta c tg tc a t tg g ta a a tc a ta g ta ta t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t a ta g

Sec. con núm. de ident.: 13 (Exón 1)Sec. With no. ID: 13 (Exon 1)

a tg g a ta tg a g g a a c a g ta tg tc t t - c ^ a a te t tg t t ta g c a tc a c t t te t tg t te tg c e - te c í ta t t t tA iE c jtC a g a g g & ttq a g c a g ttg t ta a a tg g tta a g a ttc a tt t tc e tc tC tc e a tg tC C íC a a a g g a c tc ttc ta tc ttc c a t tg a tg tg c tg c c t t tg c t ta c t t tc a t tg ta t t tg c a g ta c a a a a g t tg ta c tc :a ñ a g t tg a g g tc c a a tg a g c a c tctac" tccagcat tga taagccLct aal: t:gcacacaacaqgacttct a tg ga ta tg aggaacag t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t aga tt t t t t t t t t t t c t c t c t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t tg agg tc caa tg agcac tctac "tccagcat tga taagccLct aal: t: gcacacaacaqgacttct

Sec. con núm. de ident.: 14 (Exón 2)Sec. With no. Ident. 14 (Exon 2)

t c:gcc11ggaaagt« t agatgga,Ptgt at t gg11gt CtCíggcgat t acacatgt tgt aatea cta t act aa tagttcatgagao.aagattteaegctatttcceateeaetgtecc'tgc-gcgtgttttggattgcaaactttgt A g tta tg a g tt tg t tc t t tg g tC g C g g g a tc a c a a g g c ttg tg tc a c t ta a g g a a a ttg a tc c ta a t t ta a g a a tg g a tg a t * ta a g t tc a t ta g t t tC 4 t t tC C ta t t tc tg l ; tg t tc tc t tC £ t tg t tg C C i t ta ü s g g t tc :g a ccg g ag ttg c tg taa ttag tg a ttc tg aa tc teac tta ag tg a tg a aaecaa tg g 1 ;ta tg aac tcc tg g íitaa atccag tg tg ag tg g c tt tg c t tc a g c t tc tc ta a ta tc g a a a g c c t t t tg g a t t tg g a tg a a c c c t t ta c tg caa&aAggttacaagtcacctttCapgat tgatgaagtt.ee ttcactttC C C cictgcatagagcagagaaaa c g tc tc a a c t t t tc g a a a g a a a ttg g c c ta a a c c tg a a g ia ita E ía a a g c a tc c tg to e g a a c a a ú it tg e t ge-gttgcttftgqaaggaagt ta t t t t t a C tg c c a t t c t t g c a g t a a t t a g g g t a t g t g t t a t g t a t g t a g g g ccaacactcatacaaagatttg ttgattacacagC aggaaagaggscatC tc títta tgSaggatactacc ttñ ta g g a a c tc tc c ta a ta g c c a a a tt tg tg g a a g ttc ta a c c te tc a tc a g ttc a a c t t ta a c tc c c a a a a g c t C g g ca tg c tta t tcgagcgacac ttcccactcc tc tg ta tñagaaggggttñaggttg tca tgc tcagctaga cag g ctc fttg g tg ttg g acag a ttg taaa tta t icg g ccg teg a tg c tca gc ag c tg tccg a ta tg a tg c iac a g tta c a c tc c a tc c g g c tc g tg c c a ttg c a a g tc tc tg tg g c tc ta g g c a tc tT tt ta ta c tta c c tc g g tg c t tcaac tg ttg taacgctagctggac ttgcagcag tga tgg ta ttcg tggcgc ttggaactaaaagaaacaac a g g tt tcaa tt taaca tca cg aag ñ a tcg tg a ttc tag aa tg aaag cg aca aa tg ag a tg c ttaa tta taE g c gcgEtataaagttcc:aggcatgggaagaacaEtttaacaaaaga3Ctgaatccctccgcgaatccgagtatgg a tg g t tg tc c a s g t tc t tg ta c tc s a tc g c tg g g a a ta tc a t tg tc t tg tg g a g a a c tc e tc t tc ta g tg g e t a c a c tc a c tt t tg g a a g tg c a a tc ttg ttg g g a a tc c c g c ttg g tg c a g g g a c a g tg ttc a c tg c a a c a te tc tc t tc a a g a tg ttg c a g g a a c c g a tc a g g g c tt tc c c tc a a tc c a c g a tc tc a ttc te a e a s g c a a tg a ta tc tc t tg a ta g a ttg g acaaa ta ta tg a tg a g ta ag g ag tta g tg g ^ ta sag c tg tg g aaag ac tag aag g ttg t gggggtñcaattgcta tgcaggtgaaagatggagcttt t tgc tgggatga tgaaaacag taa *gaaga*ttga a a a a tg ra a a o tttg a g a tta g a a a a g g a g a g c rttg c iA g ca g ta g E g g g g a ca g ttg g g g cg g g g a a g tc ttc c c tc c ttg c a tc tg ta c ttg g tg a g a tg c a c a a g ttg tc g g g tc a g tc: gcc11ggaaagt «t agatgga, Ptgt at t gg11gt CtCiggcgat t acacatgt tgt aatea cta t act aa tagttcatgagao.aagattteaegctatttcceateeaetgtecc'tgc-gcgtgttttggattgcaaactttgt A t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t g t t t t t t t t t t t t t t t t t aggaaa ttg a tc c ta att ta agaa tg ga tg at * ta agt tc at ta gtt tC 4 tt tC t t t t t t l l; tg t tc tc t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t a t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t g tita t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t E aagca ed tc c tg to egaacaa uit tg et ge-gttgcttftgqaaggaagt ta ttttta C tg ccattcttgcagtaattaggg tatgtgttatgtatgtaggg ccaacactcatacaaagatttg ttgattacacagC aggaaagaggscatC tc TITTA tgSaggatactacc TTN ta ggaac tc tc c ta to ta gccaaa tt tg tg Gaag ttc ta acc will tc to tc ag ttc aactt ta ac tc ccaaaagct C gg ca tg c tta t tcgagcgacac ttcccactcc tc t ttagaaggggttñaggttg tca tgc tcagctaga cag g ctc fttg g tg ttg g acag a ttg taaa tta t icg g ccg teg a tg c tca gc ag c tg tccg a ta tg a tc t tc t tc t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t tc t tc gg tg ct tcaac tg ttg taacgctagctggac ttgcagcag tga tgg ta TGCTs tggcgc ttggaactaaaagaaacaac agg tt tt TCAA taaca tca cg aag ñ to tcg tg ttc tag aa tg AAAG cg aca aa tg ag to tg c ttaa tta TAE gc gcgEtataaagttcc: aggcatgggaagaacaEtttaacaaaaga3Ctgaatccctccgcgaatccgagtatgg to tg gt tg tc t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t g t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t tg t tg t tg t cagggacag tg ttc ac tg caaca te tc tc t tc aaga tg ttg caggaaccga tc agggc tt tc cc tc aa tc cacga tc tc a ttc te aeasgcaa tg a ta tc tc t t a tga t tg g acaaa ta ta tg a tg ag ta g g g tta g tg g ^ ta sag c tg tg g AAAG ac tag aag g ttg t gggggtñcaattgcta tgcaggtgaaagatggagcttt t tgc tgggatga tgaaaacag taa * gaaga * tTGA aaaa tg ra AAO TTTG aga tta gaaaaggagagc rttg c iA g ca g ta g E gggga ca g ttg ggg cg gggaag tc ttc cc tc c ttg ca tc tg tac ttg g tg aga tg cacaag ttg tc ggg tc ag

Sec. con núm. de ident.: 15 (Exón 3)Sec. With no. ID: 15 (Exon 3)

g tc a c a a tttg tg g ttc a a c tg c c ta tg ttg c a c a a c a tc g tg g a C tc & g a a tg g c a c g a ta c a a g a a a a ta tc c tg tttggtatgCcaatgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggttLgctgCttggagaaggacttggaaataat ggag 11 tgga gaccaga c t g a aa t agga ga acgt ggc a t c a a cct c agt g g tg g t e a ga age ag cgaat C c a g c t tg d a a g a g c tg tt ta c c a g g a c tg tg a ta C tta tc ttc ta g a C g a tg ta ttc a g tg c a g ttg a tg e te a e a c tg g C tc c g&aatcttcaag g tc acaa tttg tg g ttc aac tg cc ta tg ttg cacaaca tc g g tg ga C tc & gaa tg gcacga ta caagaaaa ta tc c tg tttggtatgCcaatgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggttLgctgCttggagaaggacttggaaataat ggag 11 tgga gaccaga ctga aa t agga ga acgt ggc atcaa cct c agt gg tg gtea ga age ag cgaat C cagct tg tg tt ta daagagc ccaggac tg tg C to rt tta ttc tc ta ga ga C tg tg ta ttc cag ttg ag to tg tg e te EACA c g g C tc & aatcttcaag

Sec. con núm. de ident.: 16 (Exón 4)Sec. With no. of Ident .: 16 (Exón 4)

gaatgtgtgaggggaattC ttaaagataaaaccattttgcttgtCSCacaccaagttgacttctCgcataatgttga c c tg a tc e ttgaatgtgtgaggggaattC ttaaagataaaaccattttgcttgtCSCacaccaagttgacttctCgcataatgttga c c tg a tc e tt

Sec. con núm. de ident.: 17 (Exón 5) Sec. With no. Ident. 17 (Exon 5)

gtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctggcaaatataatgag&tattagaagctggaatggattttaaagagct agtagctgcacatgagacctctttagaacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccctgaagaat caaaatcttctcgaagattatctaaggaagaaaacggaga Lgataaatctcaacagtctadatctgataggggggat tetaa&cttataaaggaagaagaaflgagaaactggaaaagtcagtcctcgLgtgtacaagctatatattactgaagc t t t tg g a tg g tg g g g tg ta g tg c ta g t ta te L tg t t t tc g t tc t tg tg g c a a a g t te tc ta a tg g c a a g tg a t ta t t ggctggcatatgaaacttCftefcggatcgtífCtatgtcetECaa tc c t tc tc L g t t ta t tg g g a ta ta c g g tg t ta t t gcagttg tttc ttcg ttgctgatag tga tcaggatg taC tttg tgacpcC ta tggggctcaagactgcccaaata tt t t tc g g a c a g a ttc t t ta c a g c a ta c L g c a tg c tc c ta tg tc & tt t t t tg a c a c a s C a c c ttc c g g a a g a a ttc tg a Stcgg gtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctggcaaatataatgag & tattagaagctggaatggattttaaagagct agtagctgcacatgagacctctttagaacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccctgaagaat caaaatcttctcgaagattatctaaggaagaaaacggaga Lgataaatctcaacagtctadatctgataggggggat tetaa & cttataaaggaagaagaaflgagaaactggaaaagtcagtcctcgLgtgtacaagctatatattactgaagc ttt tg g tg g tg ggg tg ta g tg c ta gt ta like L tg ttt tc gt tc t tg tg gcaaagt you tc ta tg gcaag tg at rt tt ggctggcatatgaaacttCftefcggatcgtífCtatgtcetECaa tc ct tc tc L gtt ta t tg gga ta ta cgg tg t ta tt gcagttg TTTC TGCTs ttgctgatag tga tcaggatg taC TTTG tgacpcC ta tggggctcaagactgcccaaata tt tt tc ggacaga ttc tt ta cagca ta c L gca tg c tc c ta tg tc & tt ttt tg acacas C acc ttc cggaagaa ttc tg to Stcgg

Sec. con núm. de ident.: 18 (Exón 6) Sec. With no. Ident. 18 (Exon 6)

qcatctflatgatcafjaccaacflttgit^tcttCCtCCC9ttttttatgflfl.tCtcactttggccaCgtttatcfl£ractqcatctflatgatcafjaccaacflttgit ^ tcttCCtCCC9ttttttatgflfl.tCtcactttggccaCgtttatcfl £ ract

g c tc g g c a tc a te a tc a tc a c a tg c c a a ta tte ttg g c c ta c c g ta c c a c ttt tg a ttc c tc tg g g ttg g c tta a ta tctggtaccgg gc tc ggca tc a te tc a tc aca tg ccaa ta tte ttg gcc ta ccg ta ccac ttt tg a ttc c tc tg gg ttg gc tta a ta tctggtaccgg

Sec. con núm. de ident.: 19 (Exón 7) Sec. With no. of Ident .: 19 (Exón 7)

ggatactatettgcaacatctcgtgaattgactcggcttgacteaattacaaaagcacctgtt&ttC&tflatttCtcggatactatettgcaacatctcgtgaattgactcggcttgacteaattacaaaagcacctgtt & ttC & tflatttCtc

tg a a a g ca tc tca g g tg tta tg a c ta ta cg ttg c ttta g g a a g ca g g a g a tg ttttg ta a cg a g fla tg t& a a ce g a g tgaittceaatetgcgaatggat 11ccacaaeaatggatceaatgaatgg11ggget11cgactggaa11gatggga agcttacttctttgtgtttctgtaatgttcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccag tg aaag ca tc tg gg tg tta tg ac ta ta cg ttg c ttta ggaag ca ggaga tg ttttg ta a cg ag tg t & aa ce gag tgaittceaatetgcgaatggat 11ccacaaeaatggatceaatgaatgg11ggget11cgactggaa11gatggga agcttacttctttgtgtttctgtaatgttcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccag

Sec. con núm. de ident.: 20 (Exón 8)Sec. With no. number: 20 (Exón 8)

a a a a tg t tg g t t tg tc a c c a tc a ta tg g c t tg tc tc t ta a ta g tg tc c ta t tc tg g tc c a tc t t tg tg a g t tg c t t t g tggaaaataaaatggtttc tg tcgaaagattaaaacagttc teaga&ataccatcagaagcagagtggagaaagata a a t a t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

ggatLLtctcceaCCtteaagttggccaagccgtgggaatgttgagettgaaaacgtgeagggatLLtctcceaCCtteaagttggccaagccgtgggaatgttgagettgaaaacgtgeag

Sec. con núm. de ident.: 21 (Exón 9)Sec. With no. of Ident .: 21 (Exón 9)

g11 agacaccgtccgascactcctctagtgcttaaaggag 11 actetcageattagagggggagagaagataggegt tgttggtcgtaeagggggtggaaaatcaaeattaattcaagttttetttcgtttggtggagcctgcagctggaflgaag11 agacaccgtccgascactcctctagtgcttaaaggag 11 actetcageattagagggggagagaagataggegt tgttggtcgtaeagggggtggaaaatcaaeattaattcaagttttetttcgtttggtggagcctgcagctggaflgaa

ta a tc a ttg a tg a c g c a g a ta ta tc c a g a c ttg g g c ttc a tg a tc tta g a tc tc g c ttc g g g a tc a ttc c c c a a g a g ceagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccccattggacaatattcagatgatgaaatt tggaag ta a tc a ttg a tg acgcaga ta ta tc cagac ttg ggc ttc a tg a tc tta ga tc tc gc ttc ggga tc a ttc cccaagag ceagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccccattggacaatattcagatgatgaaatt tggaag

Sec. con núm. de ident.: 22 (Exón 10)Sec. With no. ID: 22 (Exon 10)

agcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccagagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccag

Sec. con núm. de ident.: 23 (Secuencia de ARNi) aagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc Sec. With no. ID: 23 (RNAi Sequence) aagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc

cattggacaatat tcagatgscgaaatt tggaaggtastctaactt gctgsctgaaataacattggacaatat tcagatgscgaaatt tggaaggtastctaactt gctgsctgaaataa

tttücdiaaaü tctcaaaat;atagtEicagag ttagcoaaacatgtctrct gagtgctgaga tctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagca tatactccagtgttttgttatctCfcagaatgtc-tctaacatgaaatcgtgtacattgca gagCdtcgoadgctgc;caactcaaag*tgtggtgtcttcaaaacccgaaaaacttgaqtC accaggtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggttctttgcggaattatgcaacca actttttatgtgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggtoaatcflta gttgttgataaeggagataactggagtgtcggacagaggcagcctetttgcttgggaaga gtgatgctaaaaegtageagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagaC&gaLgcagtgattcaga&aatcatccgCgaggactttgeggCCtgtietataatc agcaEtgcccacagaatsccaaeagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta tctgtatgtgñtggtttcgaacMatcatagtcagtacetttatgaaga^attgcctaac gttagccaagtigtpgtnaatgcat9aa.gtcattagcctatttgttttggattttgtgag tttcatacttcaaactggaagcttatgceataetatctgatcccttgtttgtatagattg ctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggaoagagtaiaagaatgta aacatgcgtaatttgíicctattatageagattatttgtcttattttcGaggtcgctgatt ccacttattaggagtagt tacacgtatttatettttaagtgaaataatagtgtaaagttt cttttggcactgtcgctgtaaaqaagtt aeacHtcc tf.cttCaedcotggcatttcttat tcatgeaggaatagcaaaagagtctg&cílaaecatetcgtttgtttgaaaggccttcace ttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgattttücdiaaaü tctcaaaat; atagtEicagag ttagcoaaacatgtctrct tctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagca gagtgctgaga tatactccagtgttttgttatctCfcagaatgtc-tctaacatgaaatcgtgtacattgca gagCdtcgoadgctgc; caactcaaag * tgtggtgtcttcaaaacccgaaaaacttgaqtC actttttatgtgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggtoaatcflta accaggtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggttctttgcggaattatgcaacca gtgatgctaaaaegtageagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca gttgttgataaeggagataactggagtgtcggacagaggcagcctetttgcttgggaaga cagaC & gaLgcagtgattcaga & aatcatccgCgaggactttgeggCCtgtietataatc agcaEtgcccacagaatsccaaeagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta tctgtatgtgñtggtttcgaacMatcatagtcagtacetttatgaaga ^ attgcctaac gttagccaagtigtpgtnaatgcat9aa.gtcattagcctatttgttttggattttgtgag tttcatacttcaaactggaagcttatgceataetatctgatcccttgtttgtatagattg ctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggaoagagtaiaagaatgta aacatgcgtaatttgíicctattatageagattatttgtcttattttcGaggtcgctgatt ccacttatta ggagtagt tacacgtatttatettttaagtgaaataatagtgtaaagttt cttttggcactgtcgctgtaaaqaagtt aeacHtcc tf.cttCaedcotggcatttcttat tcatgeaggaatagcaaaagagtctg & cílaaecatetcgtttgtttgaaaggccttcace ttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgat

Sec. con núm. de ident.: 24 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 1; - denota el codón de parada putativo) Sec. With no. Ident .: 24 (protein sequence of NtMRP4; 5'-3 'frame 1; - denotes the putative stop codon)

MDMRNSM5 SES CLASL SCS A5TFQS5E3EA WKWLRFIFL 5 PCPQRTL.LSS IDVTjLL-LT FMDMRNSM5 SES CLASL SCS A5TFQS5E3EA WKWLRFIFL 5 PCPQRTL.LSS IDVT j LL-LT F

IVFAVQKLY5 KLR SNEHSTS SIDKPLI AKWRTS S FWK VIDGLY WL.FQAITMWITI L l VR EKRFHAISHFLSLRVFWIANFVVJI&LFFGCGITRLVSLKEÍDPNLKMDDISSLVSFÍ'ÍSV VLFIVAIKÍSST3VAVISDS ESHL S DETNG Y E LLCE S SVSGFA SAS LISKAFWIMMW ?LLQIVFAVQKLY5 KLR SNEHSTS SIDKPLI AKWRTS S FWK VIDGLY WL.FQAITMWITI L l VR EKRFHAISHFLSLRVFWIANFVVJI & LFFGCGITRLVSLKEÍDPNLKMDDISSLVSFÍ'ISV VLFIVAIKISST3VAVISDS ESHL S DETNG AND E LLCE S SVSGFA SAS LISKAFWIMMW? LLQ

KG Y KS PL KI DE V P S LS PLH RAEKMSQ LF E RMWP K PEEISKH P VB TT LLRCF WKEV1 FTAI LAVIRVCVMYVaPTLIQR FVDYTAGKRT5 PYEGY YLIGTLLlAKFVEVLTSHQFNFNSQK LGMLIRATLLTSLY KKGLFLSCSARQAHGVGQI VNY MAVDAQQLSDMÍíLQLH SI WLM PLQKG and KS PL KI DE V P S LS PLH RAEKMSQ LF E RMWP K PEEISKH P VB TT LLRCF WKEV1 FTAI LAVIRVCVMYVaPTLIQR FVDYTAGKRT5 PYEGY YLIGTLLlAKFVEVLTSHQFNFNSQK LGMLIRATLLTSLY KKGLFLSCSARQAHGVGQI VNY MAVDAQQLSDMÍíLQLH SI WLM PLQ

v s v a lg í i . yty l g a s t w t la g la a v m v f w f g t k r nnr fo fnim knrdsrm katw ehln vsva lg í i. yty lgastwt the g the avmvfwfgtkr nnr fo fnim knrdsrm katw ehln

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LGI PI^AGrVFTATS LF KMLQEPI RA FPQSM IS L9QAM I SLiDRLiDKIYMMSKELVD'KAVERLGI PI ^ AGRVFTATS LF KMLQEPI RA FPQSM IS L9QAM I SL i DRL i DKIYMMSKELVD'KAVER

LEGC&GT IAHQ VKDGAFCWDÜ ENS KEBLÍ^JVIIF El EKGEWyWVGTVGAG KS S LLASVLGLEGC & GT IAHQ VKDGAFCWDÜ ENS KEBLÍ ^ JVIIF The EKGEWyWVGTVGAG KS S LLASVLG

EMHKLSGQVTI CGSTAYVAQT SWIQNGT IQENIDFGKPMNKDRYKEVI RVCCLE KD LE IM EPGDQTEIGERGIWLS GGQKOHIQLARAVYQDCDIYLLDDVF5AVDAHTGS-EIFKE CVRGEMHKLSGQVTI CGSTAYVAQT SWIQNGT IQENIDFGKPMNKDRYKEVI RVCCLE KD LE IM EPGDQTEIGERGIWLS GGQKOHIQLARAVYQDCDIYLLDDVF5AVDAHTGS-EIFKE CVRG

I ULDKT3 LLVTKQVDFLHNVP LILVMHDGMIVQ5GKYNE1 LEAGtí DFKEL VAAH ET S LE L V'DVETTKÉSNASLiEESKSSRRLiSKEENGD-DK.SQQSTSDHGIJSKLIKEEERETGfCVSPRVYI ULDKT3 LLVTKQVDFLHNVP LILVMHDGMIVQ5GKYNE1 LEAGTí DFKEL VAAH ET S LE L V'DVETTKÉSNASLiEESKSSRRLiSKEENGD-DK.SQQSTSDHGIJSKLIKEEERETGfCVSPRVY

KLY 3 TEAFGWWGWDVI LFS f LWQS SUtASD YWDAYETS ADRAMS FMP S LFIíJl YG VIAVKLY 3 TEAFGWWGWDVI LFS f LWQS SUtASD YWDAYETS ADRAMS FMP S LFIJJ YG VIAV

VS &LLIVIRMYFVTLHGLKTAGIFFGQILYSILHAPMSFFDTT P£ G R 3LÉRA5NDQTNID VfLFFFMHLTLAMPITLLGIIXITCQÍSWP1VLLL3PLGWLNIWYRGYYLATS&ELTRLD SITKAPVIitHFSESISGVtfTIRCFRKGEMFCWENVNHVNSNLRMDívHíWGSNEWLGFRLEVS & LLIVIRMYFVTLHGLKTAGIFFGQILYSILHAPMSFFDTT P £ G R 3LÉRA5NDQTNID VfLFFFMHLTLAMPITLLGIIXITCQÍSWP1VLLL3PLGWLNIWYRGYYLATS & ELTRLD SITKAPVIitHFSESISGVtfTIRCFRKGEMFCWENVNHVNSNLRMDívHíWGSNEWLGFRLE

lhgslllcvsam fh iv l p s s i i kp eíjvg lslsyg lsln svlf ws i fvsc fven kmvs verlhgslllcvsam fh iv l p s s i i kp eíjvg lslsyg lsln svlf ws i fvsc fven kmvs ver

LKQFS E3 PSEAEWKKMDFLPPS SW PSRGNVELENVqVRYRFNT PLVLKGVTLSI RGGEX.ILKQFS E3 PSEAEWKKMDFLPPS SW PSRGNVELENVqVRYRFNT PLVLKGVTLSI RGGEX.I

G WGRTGGGKSTLI QVFFRLVE PAAGRIIIDDVDISRLGLHDLRS G WGRTGGGKSTLI QVFFRLVE PAAGRIIIDDVDISRLGLHDLRS RFQRFQ 11PQE P VL FEGT VRSNItíPIGGYSDDElWKEPRTLPTQRCGVFKTRKT- FTSC--RR-LECí LTEAASLLGKS11PQE P VL FEGT VRSNItíPIGGYSDDElWKEPRTLPTQRCGVFKTRKT- FTSC - RR-LEC í LTEAASLLGKS

DAKT-QTSIYG-GNCLC-FTDRCSDSENHPRGLCGLYYHQHCFQKTWSHGL--53CYKCRDAKT-QTSIYG-GNCLC-FTDRCSDSENHPRGLCGLYYHQHCFQKTWSHGL - 53CYKCR

C-FLSFYFVPYFESGK-LFICM-HFPTNHSQYLYEEIA-C-PSSSKCMC-FLSFYFVPYFESGK-LFICM-HFPTNHSQYLYEEIA-C-PSSSKCM

Sec. con núm. de ident.: 25 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 2; - denota el codón de parada putativo) Sec. With no. Ident .: 25 (protein sequence of NtMRP4; 5'-3 'framework 2; - denotes the putative stop codon)

WI-GTVCLQNLV-HHFLVLPPHFNRORIQQLLHG-DSFSSLHVHKGLFYLPLMCCÍFCLLSWI-GTVCLQNLV-HHFLVLPPHFNRORIQQLLHG-DSFSSLHVHKGLFYLPLMCCÍFCLLS

tiYLOYKSCTQS-GPMSTLLLALISL-LHTTGLLRLGKS-MDCIGCFRRLHML- SLY--FMtiYLOYKSCTQS-GPMSTLLLALISL-LHTTGLLRLGKS-MDCIGCFRRLHML- S LY - FM

RKDFTLFPIHCPCACFGLQTL-L*VCSLWGSQGLCHLRKLILI-EWMI-VH-FÉíFLPLLRKDFTLFPIHCPCACFGLQTL-L * VCSLWGSQGLCHLRKLILI-EWMI-VH-FÉÍFLPLL

FSSLLPLKVRPEKL-LVIUÍLT-VMKPMVMN5W1HPV-VALLQLL-YRKPFGFG-TLYCKFSSLLPLKVRPEKL-LVIUÍLT-VMKPMVMN5W1HPV-VALLQLL-YRKPFGFG-TLYCK

RVTSHLSRLMRFLHFFHClEQRKCLHFSKÉ3GLULKKYQSILEEGHCCVAFGRKLFLLFFRVTSHLSRLMRFLHFFHClEQRKCLHFSKÉ3GLULKKYQSILEEGHCCVAFGRKLFLLFF

LO-LGYVLCM-GQMSYEÍDLLITiQC¡RRGHLLHlÜ>TTL-ELS--PNLHKF-FDlS5TLTPKS LACLFERHFSLLCIRRG-GCHAQLDRLMVLERL-11WPSMLS5CPI-CYSYIPFGSCKCKLO-LGYVLCM-GQMSYEDDLLITTQQRRGHLLHUÜ> TTL-ELS - PNLHKF-FDlS5TLTPKS LACLFERHFSLLCIRRG-GCHAQLDRLMVLERL-11WPSMLS5CPI-CYSYIPFGSCKCK

FLWL-A5FILT5VLQLL-R-LDLQQ-WYLWCLELKETTGFNLT5-RIVILE-KRQMRCLIFLWL-A5FILT5VLQLL-R-LDLQQ-WYLWCLELKETTGFNLT5-RIVILE-KRQMRCLI

ICAL-SSRHGKlíILTKELWPSANPSHDGCFSECTQSLGISLECaALLP-WLHSLLBVQSCICAL-SSRHGKlILTKELWPSANPSHDGCFSECTQSLGISLECaALLP-WLHSLLBVQSC

WESRLVQG0C5LQHLSSRCCRHRSGLSLNP’5HFHKQ-YL.LIDHTHI--VRS-WIKLWKDWESRLVQG0C5LQHLSSRCCRHRSGLSLNP'5HFHKQ-YL.LIDHTHI - VRS-WIKLWKD

- KWGVOLLCR-KMELFAGHMKTVKKW-KM-TLfiLEKESLQQ-WGQDGRG5LF5LHLYLV- KWGVOLLCR-KMELFAGHMKTVKKW-KM-TLfiLEKESLQQ-WGQDGRG5LF5LHLYLV

RCT5CRVRSQFWQLPMLHKHEGFRYARYKKISCLVCO-TETDTRK-SGFAAWRRTWK-WRCT5CRVRSQFWQLPMLHKHEGFRYARYKKISCLVCO-TETDTRK-SGFAAWRRTWK-W

SLETRLK-ENVASTSVWRSsesSlqelftrtvif i f-mnysvql mlt l al kss ¡LW-GE S LETRLK-ENVASTSVWRSsesSlqelftrtvif i f-mnysvql mlt l al kss LW-GE

FLKIKPFCLSHTKLTSCIMLT-SLSCEMG-SCNLANIMRY-KLÉWILK5-~LHMRPL-NLFLKIKPFCLSHTKLTSCIMLT-SLSCEMG-SCNLANIMRY-KLÉWILK5- ~ LHMRPL-NL

LTWKQPKRAMPPLK1JQNLLEDYLRKKTEMINLNSLHLIGG3LNL-RRKKEKLEF S'VLVCTLTWKQPKRAMPPLK1JQNLLEDYLRKKTEMINLNSLHLIGG3LNL-RRKKEKLEF S 'VLVCT

SY1LLKLLDGGV-C-LSCFRSCGKVL-WQViIGWHMKDQRIVPCPSILLCLLGYTVLLQLSY1LLKLLDGGV-C-LSCFRSCGKVL-WQViIGWHMKDQRIVPCPSILLCLLGYTVLLQL

FLRC £GC IL - H LWG £R LPK Y FS DR FFTAY CU LLCHFLTQEtLPÉ EF-VGHLMIR PTLMFLRC £ GC IL - H LWG £ R LPK & FS DR FFTAY CU LLCHFLTQEtLPÉ EF-VGHLMIR PTLM

S5SRFL-ISLWPCLSHCSASSSSHANILGLPYYF■FLWVGLISGTGDIILQHLW-LGLTS5SRFL-ISLWPCLSHCSASSSSHANILGLPYYF ■ FLWVGLISGTGDIILQHLW-LGLT

QLQKHLLF11SLKAfiQVL-LYVAI.CSRRCFVTRM'ÍE-IPTCEWI5TTMDPMHGWAFDWN -WEAYFFVFLÜCS-LSYLAASSSQKMLVCHYHHACLLIVSYSGPSL-VALHKIKWFLSKD -WSSQKYHQKQSGERWIFSHLQVGQAVGMLSI.KTCRLDIVRTLE-CLJCELLSALEGRRR-VLLWOGVENQH-FKFSFWfWSLQLEE-SLMT-3YPDLGFHILELASGSFPKSQSFLKEL -■EATLTPLDNIQMr'iííFGFSI.ERCQLKOWSLKPEKLDSPWDNGDMHSVGÜRQLLCLGftVQLQKHLLF11SLKAfiQVL- L YVAI.CSRRCFVTRM'ÍE-IPTCEWI5TTMDPMHGWAFDWN -WEAYFFVFLÜCS-LSYLAASSSQKMLVCHYHHACLLIVSYSGPSL-VALHKIKWFLSKD -WSSQKYHQKQSGERWIFSHLQVGQAVGMLSI.KTCRLDIVRTLE-CLJCELLSALEGRRR-VLLWOGVENQH-FKFSFWfWSLQLEE-slmt-3YPDLGFHILELASGSFPKSQSFLKEL - ■ EATLTPLDNIQMr'iííFGFSI.ERCQLKOWSLKPEKLDSPWDNGDMHSVGÜRQLLCLGftV

HLKRSRLLFHDEATASVDHQTDAVTQK11REDFAACTIISIAMRIPTVMDCDRVLV1DAGHLKRSRLLFHDEATASVDHQTDAVTQK11REDFAACTIISIAMRIPTVMDCDRVLV1DAG

ADFSPFTLYLiLMLVWEYLSVCDGFQPIIVSTFMKKLp n v s q v w n a -ADFSPFTLYL i LMLVWEYLSVCDGFQPIIVSTFMKKL pnvsqvwna -

Sec. con núm. de ident.: 26 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 3; - denota el codón de parada putativo) Sec. With no. Ident .: 26 (protein sequence of NtMRP4; 5'-3 'framework 3; - denotes the putative stop codon)

<3y e e q y v f h il f .s it f l f c l h is iv h g f s s C'Mv k ik f pl sm st k e>s s t f h - caaf&yfh<3y e e q y v f h il f .s it f l f c l h i s h i f f s c'Mv k ik f pl sm st k e> s s t f h - caaf & yfh

CICST KWLftVEVQ - AL YP ’ H - ~ A5NCTQQDF FALESH RWTVL WSGDYTCCNHYTNS S -BKISRYFPSTVPARVLDCKLCSYHF’VLWLWEHKACVT-(Hí-S-FKHG ■ YHFigFISYFCCCICST KWLftVEVQ - AL YP 'H - ~ A5NCTQQDF FALESH RWTVL WSGDYTCCNHYTNS S -BKISRYFPSTVPARVLDCKLCSYHF'VLWLWEHKACVT- (Hí-S-FKHG ■ YHFigFISYFCC

SLHCCH-RFDRSCCN--F-ISLK--NQHL-TPG-IÍCEWLCFSFSMIEñLLDLOEFFTAK RLQVTS(JD''SSFTFPTA-SREHVSTFRKK3jA-T-EHIKASCPNÍÍIAALLLRGSYFYCE1í3SLHCCH-RFDRSCCN - F-ISLK - NQHL-TPG-IÍCEWLCFSFSMIEñLLDLOEFFTAK RLQVTS (JD''SSFTFPTA-SREHVSTFRKK3jA-T-EHIKASCPNÍÍIAALLLRGSYFYCE1í3

CSN-GMCYVCRATÍTHTKIC-lhsrkrdisl-rilpyr hsfhsqi ggsskl ssv ql-l pka WHAYSSDTSHFEV-EOVKWMES. TG SW CWT3CKLYG.R RCS AAVRYDATATFH LAHAIASCSN-GMCYVCRATÍTHTKIC-lhsrkrdisl-rilpyr hsfhsqi ggsskl ssv ql-l pka WHAYSSDTSHFEV-EOVKWMES. TG SW CWT3CKLYG.R RCS AAVRYDATATFH LAHAIAS

FCGFRH.P LYLPRCFUCCNASWTCSSDGICG VWN - KXQQVSI - HHEES - F - NESEK-DA-LFCGFRH.P LYLPRCFUCCNASWTCSSDGICG VWN - KXQQVSI - HHEES - F - NESEK-DA-L

YAK Y EtVPGMGRT YAK and EtVPGMGRT F -QKN-1F-QKN-1 LPR1RVWM WG VLVLKRWEY HCL VEHSSSSG YTH F WKCNLV GNPAWCRDSVRCNI£LODVAGTDQGFPS3JÍDLTFrSNDia- - IGQiYDE-GV3G-SCGKT rrlwgymcyagerwsflíjg- - kq - r r ie k c k l - d - krracsssgdswggevfppgictw*LPR1RVWM WG VLVLKRWEY HCL VEHSSSSG YTH F WKCNLV GNPAWCRDSVRCNI £ LODVAGTDQGFPS3JÍDLTFrSNDia- - IGQiYDE-GV3G-SCGKT rrlwgymcyagerwsflíjg- - kq - r r ie k c k l - d - krracsssgdswggevfppgictw *

OAQVVGS GHNL WPKC L CCTKIVD8 EWH DTRKY PWYAKEOROIQGSDPGLL LGÍGljGnngOAQVVGS GHNL WPKC L CCTKIVD8 EWH DTRKY PWYAKEOROIQGSDPGLL LGIGljGnng

VMRPD- MRRT WRQFQWH S EAAN PAC KSCLPGL- YLSSR-CIQGS-CSHWL-HLOGIí CEGN VMRPD- MRRT WRQFQW H S EAAN PAC KSCLPGL- YLSSR-CIQGS-CSHWL-HLOGI í CEGN

5-R -NHFACHTPS-LLA -C-PDPCHAÍ1WDDRATWQI--DIRSWNGF -RAS5CT-DLFRTC -RGNNGREQCLP- RIKIPS3ÍII-GRKftfL--ISTVYl --qGF-TYKG&ftiCRlíHK:SC}SSCvG5-R -NHFACHTPS-LLA -C-PDPCHAÍ1WDDRATWQI - DIRSWNGF -RAS5CT-DLFRTC -RGNNGREQCLP- RIKIPS3ÍII-GRKftfL - ISTVYl --qGF-TYKG & ftiCRlíHK: SC} SSCvG

AIYY -SFWHVGCSA5YLV FVLVAKFSNGK -LLAGI-NFSGSCHVTjQSFSVYWDIRCYCSCAIYY -SFWHVGCSA5YLV FVLVAKFSNGK -LLAGI-NFSGSCHVTjQSFSVYWDIRCYCSC

FFVADS DQDVPtDTYGAQD-CPNIFRTDSLQHTAC5 YVIF-HNTFRKN5ESGI --SDQH-CFFVADS DQDVPtDTYGAQD-CPNIFRTDSLQHTAC5 YVIF-HNTFRKN5ESGI --SDQH-C

LPPVFY ESHFGH.VYHTAR.HHi13133MPlFLAYRTTFDSSGLA-YLVPGILSCNIS -IDSA-LLPPVFY ESHFGH.VYHTAR.HHi13133MPlFLAYRTTFDSSGLA-YLVPGILSCNIS -IDSA-L

NYKSTCYSS FL-KMLRCYDYTLl-EAGDVL-RECKPSEFCÍSAWGFPOQWIQ-MVG LSTGI DGKLTS^CFCNVHDCLT-QHHCAJíKCHFVTIIWLVS’-Í’FILVHLCELLCGK-NGFCÍÍKI KTVLRMTIRSRVEKIX3FSPTFKLéAKFWEC-A-K3AG- ISSEHS5SA- ESYSQH -RGR2DR CCWSYRGWKININSSFLSFGGACSWKNNH--RRY1QTWAS-S-ISLRDHSPHA£PF-RNCNYKSTCYSS FL-KMLRCYDYTLl-EAGDVL-RECKPSEFCÍSAWGFPOQWIQ-MVG LSTGI DGKLTS ^ CFCNVHDCLT-QHHCAJíKCHFVTIIWLVS'-Í'FILVHLCELLCGK-NGFCÍÍKI KTVLRMTIRSRVEKIX3FSPTFKLéAKFWEC-A-K3AG- ISSEHS5SA- ESYSQH -RGR2DR CCWSYRGWKININSSFLSFGGACSWKNNH - RRY1QTWAS-S-ISLRDHSPHA £ PF-RNC

EKQH -PHWTIFR- -HLEGASNAANSKMWCL-N PKNL1HQLLITE1TGV SDRGSFFAW EE-C-NVABFYLWMRQLPLLI.H RQMQ-FRKSsart lr PVT>-SALFTGÍQOSWTVIEFLL-MDV Ll5tLLLCTLF-IW-HllYLYVHVSNQS-SVPL-RWCLMLAK WHEKQH -PHWTIFR- -HLEGASNAANSKMWCL-N PKNL1HQLLITE1TGV SDRGSFFAW EE-C-NVABFYLWMRQLPLLI.H RQMQ-FRKS sart lr PVT> -SALFTGÍQOSWTVIEFLL-MDV Ll5tLLLCTLF-IW-HllYLYVHVSNQS-SVPL-RWCLMLAK WH

Sec. con núm. de ident.: 27 (secuencia de ADNc de NtMRP4 derivada de la secuenciación directa de ADNc) Sec. With no. Ident .: 27 (NtMRP4 cDNA sequence derived from direct cDNA sequencing)

ñtggatatgaggaacagtatgtctccagflatcttgtttagcatcaGttccctgttctgcctccacatttcafltcgtc agaggattcageagttgttaaatggttaagattcattttcctctctccatgtccacaaaggactcttetatcCtecB t tg a tg tg e tg c ttt tg c tta c C tC C a c tg ta ttE g c a g ta C a a a a g tc g ta c tc a a flg ttg a g g tc c a a tg a g c a c tctaettctagcattgataagcctctaattgcacacflacaggacttetgttagiiaccaatetttggtttñagctgtc tctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcat cttggttattgtgggaaattcccagtcgc cttggaaagt catagatggacegtattggetgtttcaggcgattacacatgttgtaatcactatac-taatagtteat gagaaaagatttcacgcCatttcccratC-CactgtcíCtgcgcgtgttttggattgcaaactttgtagttatgagtt t gttpttiggt tgtgggfltcacüaggctCgtgtcacCtaaggaaattgatcctaatttaagaatggatgatataflgtc cattagtttcatttcctattt ctgttgttctcttcattgttgccattaaaggttcga ccggagttgctgtaattagt gattctgaatetcacttaagtg^tga&&tca&tggttatgflaitteCgg*taCC#gtgtgsgtggctttgcttc agcttetctaatatcgaaagccctttggatttggatgaa.í:cctttactgcaaaaaggttflcaagtcacrctetcaaga 11gatgaagttce11cactttccc caetgcatagageagagaa &atgtctcaact111cg 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Sec. con núm. de ident.: 28 (secuencia de ADN de NtMRP3 con 5' y 3' UTR) Sec. With no. Ident .: 28 (DNA sequence of NtMRP3 with 5 'and 3' UTR)

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Sec. con núm. de ident.: 29 (secuencia de ADN de NtMRP3 sin 5' y 3' UTR)Sec. With no. Ident .: 29 (DNA sequence of NtMRP3 without 5 'and 3' UTR)

atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccat tttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttccttgtaattcttgggttgtgttgttggaatacaa tcaggagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttg ttttgttcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttg gtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgc acacccagttccttaattcttgtgaaaccaaataccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtt tcttgttattgccttgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctga tgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgc ttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacc ccttatgccaatgctaacatttttagtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaa accattagaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatttttagagaaa aactagaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacagca 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aagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgttt cttgatttacaggtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttgg aatctttgtatgatggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcc tcttatcatagaatccaacagaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtaa attaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaatagg tccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaagaagactggaatt gtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaat aaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggatc caactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggaggtg acagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaaact ttgtttgatgttatgcttcaggcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaacttta ttctacaggtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgc 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tatgaaattgatagacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgtttgg atatgttatctctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcctgttggaacaattgacccaagt aagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgttt cttgatttacaggtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttgg aatctttgtatgatggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcc tcttatcatagaatccaacagaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtaa attaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaatagg tccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcact ttctttggtggaaagaagactggaatt gtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaat aaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggatc caactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggaggtg acagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaaact ttgtttgatgttatgcttcaggcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaacttta ttctacaggtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgc gttgctgcagtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggccgtgtgctact gaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgacactgcaactgataatcttattcagcaaa ctctaaggctgcacttctctgattccacggttataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatg gtcctactattagatcatggtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttacc ttttttttatgctatgctgcagggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcatt gtttgctaagctcgtggcagagtatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcagacatgtga

Sec. con núm. de ident.: 30 (Intrón 1 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 30 (Intrón 1 of NtMRP3)

gtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcaggtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcag

Sec. con núm. de ident.: 31 (Intrón 2 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 31 (Intrón 2 de NtMRP3)

gtaagtcctttcatatatatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgattgacccatcctttaa ttgcaggtaagtcctttcatatatatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgattgacccatcctttaa ttgcag

Sec. con núm. de ident.: 32 (Intrón 3 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 32 (Intrón 3 of NtMRP3)

gtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatatagacttaactcatttaactatgatatttctct tcaggtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatagacttaactcatttaactatgatatttctct tcag

Sec. con núm. de ident.: 33 (Intrón 4 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 33 (Intrón 4 de NtMRP3)

gtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgacta atcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacaggtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgacta atcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacag

Sec. con núm. de ident.: 34 (Intrón 5 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 34 (Intrón 5 of NtMRP3)

gttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcata actttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcaggttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcata actttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcag

Sec. con núm. de ident.: 35 (Intrón 6 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 35 (Intrón 6 de NtMRP3)

gtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgt gtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgt ttcttgatttacagttcttgatttacag

Sec. con núm. de ident.: 36 (Intrón 7 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 36 (Intrón 7 of NtMRP3)

gtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa taggtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa tag

Sec. con núm. de ident.: 37 (Intrón 8 de NtMRP3)Sec. With no. Identifier: 37 (Intrón 8 de NtMRP3)

gtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa actttgtttgatgttatgcttcaggtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa actttgtttgatgttatgcttcag

Sec. con núm. de ident.: 38 (Intrón 9 de NtMRP3)Sec. With no. Identity: 38 (Intrón 9 de NtMRP3)

gtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgc aggtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgc ag

Sec. con núm. de ident.: 39 (Intrón 10 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 39 (Intrón 10 of NtMRP3)

gtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctg caggtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctg cag

Sec. con núm. de ident.: 40 (Exón 1 de NtMRP3)Sec. With no. Ident .: 40 (Exon 1 of NtMRP3)

AtggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgagAtggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgag

Sec. con núm. de ident.: 41 (Exón 2 de NtMRP3)Sec. With no. Ident .: 41 (Exon 2 of NtMRP3)

gagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgtttt gttcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttggtca gaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgcacac ccagttccttaattcttgtgaaaccaaataccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttctt gttattgccttgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctgatgtt gttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgcttca ggaacccctttaaatggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacccctta tgccaatgctaacatttttagtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccat tagaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatttttagagaaaaacta gaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacagcacggaa ggagatagtgttatcggctctcttcgtgcttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgatacct tagttcagtatctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgttgcaaag ttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggagggtatcgggcacgggcagcactggt ttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgtcagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaatt ttatgacagttgatgccgagaggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagtt gctctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgctacaataatagtgat gttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggagaaactcatggaatcgaaagatagaaggatga aggctacatctgaagtcttaaggaatatgagaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatc ttggacctcaggactacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtcttctg ggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatgggaatcccacttgaatctgggaaga tattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagagcccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgct caaaccaaagtttctcttgatcgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagct tccaaaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatccacctcgactccac ttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgccatttgtggtacagttggttcaggaaaatca agcttactgtctagcattttaggagagatgcccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgt tgcacagtcgccctggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggagaagt atgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctcttttggcgatcaaacagaaataggg gagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagagaatacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgt ttacctatttgatgatccgttcagtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagtgagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgtttt gttcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttggtca gaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgcacac ccagttccttaattcttgtgaaaccaaataccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttctt gttattgccttgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctgatgtt gttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgcttca ggaacccctttaaatggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacccctta tgccaatgctaacatttttagtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccat tagaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatttttagagaaaaacta gaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacagcacggaa ggagatagtgttatcggctctcttcgtgcttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgatacct tagttcagtatctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgttgcaaag ttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggagggtatcgggcac gggcagcactggt ttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgtcagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaatt ttatgacagttgatgccgagaggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagtt gctctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgctacaataatagtgat gttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggagaaactcatggaatcgaaagatagaaggatga aggctacatctgaagtcttaaggaatatgagaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatc ttggacctcaggactacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtcttctg ggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatgggaatcccacttgaatctgggaaga tattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagagcccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgct caaaccaaagtttctcttgatcgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagct tccaaaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatccacctcgactccac ttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgccatttgtggtacagttggttcaggaaaatca agcttactgtctagcattttaggagagatgcccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgt tgcacagtcgccctggatacagagtggaaagatagaggagaacatattat ttggtaaagagatgcagagggagaagt atgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctcttttggcgatcaaacagaaataggg gagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagagaatacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgt ttacctatttgatgatccgttcagtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagt

Sec. con núm. de ident.: 42 (Exón 3 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 42 (Exon 3 of NtMRP3)

gaatgtataatggggctattgaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcgga tttgatcttggaatgtataatggggctattgaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcgga tttgatcttg

Sec. con núm. de ident.: 43 (Exón 4 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 43 (Exon 4 of NtMRP3)

tgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatga ctggtgataatacaaatgtacagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttgga acaaagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttactggaaatatataac aactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaagttggttttcagctccttcaaattggaagca attattggatggcgtgggcaactcccgtctcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtc tatgttgctttaggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatataagac agcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtccttcttcgatgccacaccgagtg ggcggattctaaacagatgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatga ctggtgataatacaaatgtacagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttgga acaaagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttactggaaatatataac aactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaagttggttttcagctccttcaaattggaagca attattggatggcgtgggcaactcccgtctcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtc tatgttgctttaggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatataagac agcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtccttcttcgatgccacaccgagtg ggcggattctaaacaga

Sec. con núm. de ident.: 44 (Exón 5 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 44 (Exon 5 of NtMRP3)

gcatcgacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagct tttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtcattgcagtttgca tctggttggaggcatcgacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagct tttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtcattgcagtttgca tctggttggag

Sec. con núm. de ident.: 45 (Exón 6 de NtMRP3) Sec. With no. Ident .: 45 (Exon 6 of NtMRP3)

caatattacataccatcagcacgagaactggcacggctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgc cgagacaatttcaggatcaagcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattga tagacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgtttggatatgttatct ctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcctgttggaacaattgacccaacaatattacataccatcagcacgagaactggcacggctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgc tagacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgtttggatatgttatct cgagacaatttcaggatcaagcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattga ctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcctgttggaacaattgacccaa

Sec. con núm. de ident.: 46 (Exón 7 de NtMRP3) Sec. With no. Ident .: 46 (Exon 7 of NtMRP3)

gtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatg atggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcataga atccaacagaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatg atggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcataga atccaacagaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcag

Sec. con núm. de ident.: 47 (Exón 8 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 47 (Exon 8 of NtMRP3)

gtccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaagaagactggaat tgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaa taaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggat ccaactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggaggtccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaagaagactggaat tgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaa taaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggat ccaactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag

Sec. con núm. de ident.: 48 (Exón 9 de NtMRP3) Sec. With no. Ident .: 48 (Exon 9 of NtMRP3)

gcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattctacaggcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattctacag

Sec. con núm. de ident.: 49 (Exón 10 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 49 (Exon 10 of NtMRP3)

tatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggccgtgtgctactgaaaaagagc aaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgacactgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggct gcacttctctgattccacggttataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactat tagatcatgtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggccgtgtgctactgaaaaagagc aaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgacactgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggct gcacttctctgattccacggttataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactat tagatcatg

Sec. con núm. de ident.: 50 (Exón 11 de NtMRP3) Sec. With no. Ident .: 50 (Exon 11 of NtMRP3)

ggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattgtttgctaagctcgtggcagag tatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcagacatgtgaggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattgtttgctaagctcgtggcagag tatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcagacatgtga

Sec. con núm. de ident.: 51 (secuencia de ADNc de NtMRP3 como se predijo a partir de la secuencia del clon de BAC)Sec. With no. Ident .: 51 (NtMRP3 cDNA sequence as predicted from the BAC clone sequence)

atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggagggacaataatgctggc cacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgttttgt tcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtat agaaatggttggtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgcta gcttggttgtcaatctctgttttcttgcacacccagttccttaattcttgtgaaaccaaa taccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttcttgttattgcctt gttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacct gatgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaaca gagagtgaggagaatatgcttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatg gactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcaccccttatgccaatgctaacattttt agtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccattaatggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggagggacaataatgctggc cacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgttttgt tcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtat agaaatggttggtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgcta gcttggttgtcaatctctgttttcttgcacacccagttccttaattcttgtgaaaccaaa taccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttcttgttattgcctt gttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacct gatgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaaca gagagtgaggagaatatgcttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatg gactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcaccccttatgccaatgctaacattttt agtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccatta

gaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatt gaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatt

tttagagaaaaactagaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatg ctggtgaaggctttggttttcacagcacggaaggagatagtgttatcggctctcttcgtg cttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgataccttagttcagtat ctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgtt gcaaagttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggaggg tatcgggcacgggcagcactggtttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgt cagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaattttatgacagttgatgccgag aggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagttgct ctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgct acaataatagtgatgttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggag aaactcatggaatcgaaagatagaaggatgaaggctacatctgaagtcttaaggaatatg agaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatcttggacctcagg actacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtc ttctgggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatggga atcccacttgaatctgggaagatattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagag cccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgctcaaaccaaagtttctcttgat 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gacatgtgagacatgtga

Sec. con núm. de ident.: 52 (secuencia de proteína de NtMRP3; 5'-3'; - denota el codón de parada putativo) Sec. With no. Ident .: 52 (protein sequence of NtMRP3; 5'-3 '; - denotes the putative stop codon)

MEIAKGMSVFQSLRRDNNAGHKQSSTRNARFLYYKSTLFCSIGLAIFSFVLCLLAHFYWY RNGWSEEKIITLLDFALKLLAWLSISVFLHTQFLNSCETKYPLVLRVWWGLFFFVSCYCL VIDLVYGEKNQSLPTQFCIPDVVFTLMGLFFCFVGFIVKTESEENMLQEPLLNGSVANGM DSKKSTGDQTVTPYANANIFSLFTFSWMGPLISVGNKKPLDLEDVPQLHFDDSVKGSFPI FREKLESVGGGNSNRVTTFMLVKALVFTARKEIVLSALFVLLYALASFVGPYLIDTLVQY LNGKRDFDNEGYVLVAAFFVAKLVECLAQRHWFFKVQQGGYRARAALVSKIYNKGLTLSC QSKQSHTSGEIINFMTVDAERIGDFGWYMHDPWMVIIQVALALVILYKNLGLAAIAAFVA TIIVMLANIPLGSLQEKFQEKLMESKDRRMKATSEVLRNMRILKLQAWEMKFLSRILDLR TTEAGWLMKYVYTSAMTTFVFWVAPTFVSVTTFGAAMLMGIPLESGKILSALATFRILQE PIYNLPDTISMIAQTKVSLDRIASFLSLDDLQPDVIEKLPKGSSDEAIEIVGGNFAWDAS TSTPLLKDVNLRVLNGMRVAICGTVGSGKSSLLSSILGEMPKLSGTIKLSGTKAYVAQSP WIQSGKIEENILFGKEMQREKYDKVLEACSLKKDLEILSFGDQTEIGERGINLSGGQKQR IQIARALYQDADVYLFDDPFSAVDAHTGSHLFSECIMGLLNSKTVLYVTHQVEFLPAADL ILVMKDGRISETGKYNDLLKLGSDFMELVGAHQEALTAIDTVKGEALRKSEEMTGDNTNV QKDKNISDGQNGKVDDIVGTKGQIVQEEEREKGSVGFSVYWKYITTAYGGALVPFMLLAQ VGFQLLQIGSNYWMAWATPVSKSEPPPVGSSTLIIVYVALGIASALCILARTMFLVTAGY KTASLLFHKMHLCIFRAPMSFFDATPSGRILNRASTDQSAIDLNVPIQVGSFAFTIIQLL GIIGVMSQVAWQVFIVFIPVIAVCIWLEQYYIPSARELARLNGTCKAPVIQHFAETISGS STIRSFDQESRFQDTSMKLIDNYSRPKFHIAAAMEWLCLRLDMLSLITFAFSLIFLISLP VGTIDPSVAGLAVTYGLNLNIIQARVVWNLCMMENKIISVERILQYTALPSESPLIIESN RPDPNWPSCGEVDFSNLQVRYAPHMPLVLRGLTCTFFGGKKTGIVGRTGSGKSTLIQTLF RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIIPQDPTMFEGTVRSNLDPLEEYSDEQIWE ALDKCQLGEEVRKKEGKLYSTVSENGENWSVGQRQLVCLGRVLLKKSKVLVLDEATASVD TATDNLIQQTLRLHFSDSTVITIAHRITSVLDSDMVLLLDHGLIAEYGTPARLLENESSL FAKLVAEYSMRSNSSFENVSDM-MEIAKGMSVFQSLRRDNNAGHKQSSTRNARFLYYKSTLFCSIGLAIFSFVLCLLAHFYWY RNGWSEEKIITLLDFALKLLAWLSISVFLHTQFLNSCETKYPLVLRVWWGLFFFVSCYCL VIDLVYGEKNQSLPTQFCIPDVVFTLMGLFFCFVGFIVKTESEENMLQEPLLNGSVANGM DSKKSTGDQTVTPYANANIFSLFTFSWMGPLISVGNKKPLDLEDVPQLHFDDSVKGSFPI FREKLESVGGGNSNRVTTFMLVKALVFTARKEIVLSALFVLLYALASFVGPYLIDTLVQY LNGKRDFDNEGYVLVAAFFVAKLVECLAQRHWFFKVQQGGYRARAALVSKIYNKGLTLSC QSKQSHTSGEIINFMTVDAERIGDFGWYMHDPWMVIIQVALALVILYKNLGLAAIAAFVA TIIVMLANIPLGSLQEKFQEKLMESKDRRMKATSEVLRNMRILKLQAWEMKFLSRILDLR TTEAGWLMKYVYTSAMTTFVFWVAPTFVSVTTFGAAMLMGIPLESGKILSALATFRILQE PIYNLPDTISMIAQTKVSLDRIASFLSLDDLQPDVIEKLPKGSSDEAIEIVGGNFAWDAS TSTPLLKDVNLRVLNGMRVAICGTVGSGKSSLLSSILGEMPKLSGTIKLSGTKAYVAQSP WIQSGKIEENILFGKEMQREKYDKVLEACSLKKDLEILSFGDQTEIGERGINLSGGQKQR IQIARALYQDADVYLFDDPFSAVDAHTGSHLFSECIMGLLNSKTVLYVTHQVEFLPAADL ILVMKDGRISETGKYNDLLKLGSDFMELVGAHQEALTAIDTVKGEALRKSEEMTGDNTNV QKDKNISDGQNGKVDDIVGTKGQIVQEEEREKGSVGFSVYWKYITTAYGGALVPFMLLAQ VGFQLLQIGSNYWMAWATPVSKSEPPPVGSSTLIIVYVALGIASALCILARTMFLVTAGY KTASLLFHKMHLCIFRAPMSFFDATPSGRILNRASTDQSAIDLNVPIQVGSFAFTIIQLL GIIGVMSQVAWQVFIVFIPVIAVCIWLEQYYIPSARELARLNGTCKAPVIQHFAETISGS STIRSFDQESRFQDTSMKLIDNYS RPKFHIAAAMEWLCLRLDMLSLITFAFSLIFLISLP VGTIDPSVAGLAVTYGLNLNIIQARVVWNLCMMENKIISVERILQYTALPSESPLIIESN RPDPNWPSCGEVDFSNLQVRYAPHMPLVLRGLTCTFFGGKKTGIVGRTGSGKSTLIQTLF RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIIPQDPTMFEGTVRSNLDPLEEYSDEQIWE ALDKCQLGEEVRKKEGKLYSTVSENGENWSVGQRQLVCLGRVLLKKSKVLVLDEATASVD TATDNLIQQTLRLHFSDSTVITIAHRITSVLDSDMVLLLDHGLIAEYGTPARLLENESSL FAKLVAEYSMRSNSSFENVSDM-

Sec. con núm. de ident.: 53 (Exon 11 de NtMRP4) Sec. With no. number: 53 (Exon 11 of NtMRP4)

ttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat gttagccaagtagtagtaaatgcatgattgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta gttagccaagtagtagtaaatgcatga

Secuencias (el sombreado indica la posición de los exones)Sequences (the shading indicates the position of the exons)

Sec. con núm. de ident.: 1 (secuencia de ADN de NtMRP4 con 5' y 3' UTR) o tg g a ta L g a g g a a c a y t d t g t e t t C * g & í i t c t L g t t L a g c a L c a c t t t e t t g L t c t g c c t c c a c a t t t c a a t c g t c a g a g g a t t c a g c a g t t g t t a a a t g g t t a a g a r L c a t t t t c e t e t c t e c a t y t e c a c a a a g g a c t c t t c t a t c t t e e a t E g a t g t g c t g c t L t t g c t c a e t t t c d 11 y t a 111 g cag t ac aa a ag 11 g t a t t cu aag t tg a g g t ce a a t gag c a c t c t a c t t C t a g c a e t g a t a age c t c t a a c t g c a caca ac agga e t t c t g t t aya a c í a a t c t t tg g 11 t a agecg t c t e t g a t t t tg c ca g c t a t t 11 a gee t t f i t c 11 c t a T . a g t t c t a L g c a t e t t g g c ta c c g c g g g a a a t cecea g t e g e c c t g g a a u g t c a t a g a t g g a c i ig t a t L g g t t g L t t c aggcga 11 a ca c a t g t L y t a a t c a c t a t a c t a a ta g e t ca t gagaaa ag a 111 C-& tg C t a n t t c c c a t c c a c t g t e c c t g c g c g t g t t t t g g a t c g t a A a c t t t g t a g t t a t g a g t t t g tC C t c t g g t t g t ggga t e s t a agg C t t g t g t c a C t t a agy aa a 11 g a t c c t a a 11 t a a g aa tg g a t g a t a t a a g t t e a t t a g t t t c a t t t c e ta 11L c t g t t g t t c t e t t ca 11 g t t g C c a t t a a a g g t t e g a c c g g a g t t g c t j t a a t t & g t g 3 t t c t g a f l c c t c a e e t a a g t g a c . g a a a c e a a tg a t t .a t g a a c t c c t g g a t & a a c c c a g c g c g a g t g g c t c c g c tc c a g e c c -c tc t o a t a t cga aa g c c t t t tg g a 11C gga t gaa c ce t C t a c cgcaa a aa g g t enea agt-cac c t c t c a aga 11 ya t naa g 11 c c t t ca c t 11 ce ce a c tg c a t agag ca ga g aa aa cgt-C t e a a c t t t t c g a a a g a a a t t g g c t t a a a c c t g a a g 3 a s t e t c a a a g c a t C C t g t C C f f a a - e A a e B t tg e tg c g t tg c 111 tg g aa g gaag t t a t t t t t a c t g cea t t c t t ge a y t aa t t aggg t a t g t g c t a c g E a t g t u ggy cea Seo c t c a t a ca aa g a t t t g t t g a t t a c a ca g cagga a a ga gga ca t c t c q t t a t gaagga t a c t a c c t t a t aggaa c t C t e C t a a t age c a a a t t t g c g g aag 11C t a a c c t c t ca t ed y L L e*j a t L t t a a c E Ccc aaaag c 11 gg e a t ye 11 a 11 c g 3 g cga c a e t t e t t a c t t e t 11 g t a t a a g aagggg 11 aa ggt t g t ca tg c t c ag c t agaca gg ct c at g g t gtt gga ca g a 11 g t a a a t t a t a t g g ccg tcg a t g Ct ca g ca ge t g tc c g ft t a tg a tg c t a caget. a ca t t c c a t t t g g c t c a t g c c a t c geaag 11 t e t g t yg Ct 11 agg ca tCC 11 t a t &Ct ca C C t egg e g e t t c a a t t g t t g t a a cgc t a g e tg g a c t t gca geag t g a t g g t a t t t g í ig g t g t t t g g a a e t a í ia a g a a a c a a c a y g t t t c a a t t t a a c a t c a t g a a g a a t cg t ya 11 e t ag a a L gaa age gac aaa tg a ga tg c t t a a t t a t a t g cgcg C t a t a i f l g 11 c cagg ca tg g g a aga aqa c t t t a a ca a aa g &a 11 g n a t c c t t e cy ego at ce g ag t a tg g a t .g g t t g t c c aa g c t c t tg t a c t eaa t cge t g gga a t a t c a t t g t c t t g t g g a g e a c t C Ct c 11C t ag t g ge t a c a e t c a e t t t tg g aa g tg e a a t e 11 g t tg g g sa C CCcq C11 gg t g ca ggga cag t g t t c ac tg c a a c & t c t Ct C11 ca aga t g t t g ca gga accga t C agggc t t t c c c t c a a t c c a t g a t c t c a c t t t e a c a a g c & a t g a t a t c t c t t g a c a g f l t t g g a e a a a c a ta c g a c g f tg t& a g g a g t t& g tg g a ta a a g c tg tg g a £ ia g a c ta g ü a g g t tg tg g g g g t a ca a 11 y e t a t g cag y t gaa aga t ggage 111 t t yc t g g y a tg a e g a aaa c a g t aa a g& aga a t t gaa a a a t g t a a a c t t tg a ga t t a g aa a a gga ga g e 11geage ag t a g t gggy ac a g t t g g g g c g g q g & a g c c t t c e c t e c L tg e a t c c g ta c t t y g tg a g a tg e a c o a g t t g t e g g g t c a g g t a c g g e t e c e a t c c t t c t g t t t g t t t g a t t a a i a caa a c t t t g e tg c ga 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a a t a g E t c c t t a a a t g t a g t a a c t a t t t g c t a a c t t a c t t t a c c a a t e c c t t g t c c aa e a g g t ca ca a 1.1 cg c g g t c e a a c t g t e t a t g 11 gcac aa a ca t c g tg g a t t e aga a t g g ta c g a t a e a a g a a r t A t a t c c t g t t t g g t a t g rc a a c g a ac aga gacaga t a caaggaa g tg a t ccgg g c 11 g e tg c t c ggagaa ggac t t ggaaa t a a tg g a g r 11 ggaga ceaga c t g aa □ t ag ya gao c g t ggc a t c a a e c t e a g t gg tgg te a g a ag cagcga n. t c ta g e 11 g cao ga g c t g 11 t a c caggac tg tg a t a 11 t i t C L t C t a y a t ga tg t a t t e a g tg c a g t L ga L g c t c ac a c t ggc c c t g a & a t e t t e c a g g t t a g a a y tc c a c a a c g t c a t yt g t c a t C ga aga ttt^ttt^aqatagaaattacattgtLtcattctgcdañttetggaectfitcagag&aa aa t e a t g g a e t t t g a a t ggc t ac t t t ce c c a c t gaa ya c a t a t a t e a 111 ce t ggg agga agetgtgsaagtggcaagctatttaccccaaaaagt ataatct íiaaagactctt.attaag tr 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t g g a g c t g a a g a t a a c t a a t a t t e t t t t t t a t t t e t a c a g aaaatgttggtctgtcactatcatatg^ctEgtctcttaacayLgtcctattccggLcctt tcttCgtgagttgctttgtggaaaatanaatggtttctgtcgaaagattaaaacagttct cagaaataCcatcagaagcagagtggagaaagatggattttctcccaccttcaagttggc c a a g c c g tg g g a a tg t tg a g e t tg a a a a e g tg c a g g ta a ta a t tC ta a c ta -a t tC tg tg g ttgctatttgctagcatttgcacaaaaggaaaactataaa&agttcatagtaaggaag&g agggtagctgtfltcaacaagcctaca.gattctctaat!:teaaatatgttflcgttg&ttttt cta tattgtt tgtt ctaetgg tea aeagg 11agatat cgt cegaacict eetC tagtgct taaaggngttaatctcagcattagagqgggagagaagataggtgttgttggtcgtaeagg ggg tggaaaateaaea 11aat tea agt tttet ttcgt 11gg tggage ctg cagctggaag aataa tcattgatga cg taga tatatccagactt gggct tcatg a, tcttaga tet cgc11 cggga tcattceccaaga gccagt cet tt11g&a gga actgt gagaageaa cattga cce cattggacaaEattc&gacgacgddatttggaaggtaatct&aettgccgactg&aataa C t ta c o f la e & tc tc a a a a t a t a g t a C a g a g t ta g c ra a e e f it í jC c t L c 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With no. Ident .: 1 (DNA sequence of NtMRP4 with 5 'and 3' UTR) o tg ga ta L gaggaacaytdtgtett C lgt lt 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Sec. con núm. de ident.: 2 (secuencia de ADN de NtMRP4 sin 5' y 3' UTR)Sec. With no. Ident .: 2 (DNA sequence of NtMRP4 without 5 'and 3' UTR)

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Sec. con núm. de ident.: 3 (Intrón 1)Sec. With no. of Ident .: 3 (Intron 1)

gtacgg-ctctcatccttctgt ttgLttgattafltaeaaactttgctgccaattaccttttgccccttgttgctaect cttttctgtggtataaaaaattaatgtaggctaaLgtgtagagtggaggtattaiiaLgcíigaíiciiíittccaatcasg caattacetgtgagatactattttgttercaLattagtggactggtacflttctcattggtgtatcgtttgatcteca ccaaagcagaggttttactggccgaeagagtcflaaetactgtgcttC&ctccttCtactccaatccttagtagtctC tgeetetaatgaa-cttcaagcgLgtaatagaaacaccattatattattagctgaetagttactttacasttccagag catatttacflttttctgettggttgtCtattactctggataacagtccCaaatgcaagcaaaatcaaet'gtgttttC agtCttgagctgaccaattagt tcatgatgtcctcagcttgcccaagctggtgcctcaccggaattfltgtgggaccC Lcgtaettaatcaactpgtteaccttcttettaaaaatat tgaatgat ttgattggttaatagttccttaaatgtag taattatttgctaacttactt taecaaccecttgtceaaeaggtacgg-ctctcatccttctgt ttgLttgattafltaeaaactttgctgccaattaccttttgccccttgttgctaect cttttctgtggtataaaaaattaatgtaggctaaLgtgtagagtggaggtattaiiaLgcíigaíiciiíittccaatcasg caattacetgtgagatactattttgttercaLattagtggactggtacflttctcattggtgtatcgtttgatcteca ccaaagcagaggttttactggccgaeagagtcflaaetactgtgcttC & ctccttCtactccaatccttagtagtctC tgeetetaatgaa-cttcaagcgLgtaatagaaacaccattatattattagctgaetagttactttacasttccagag catatttacflttttctgettggttgtCtattactctggataacagtccCaaatgcaagcaaaatcaaet'gtgttttC agtCttgagctgaccaattagt tcatgatgtcctcagcttgcccaagctggtgcctcaccggaattfltgtgggaccC Lcgtaettaatcaactpgtteaccttcttettaaaaatat tgaatgat ttgattggttaatagttccttaaatgtag taattatttgctaacttactt taecaaccecttgtceaaeag

Sec. con núm. de ident.: 4 (Intrón 2) gttagaagtccacaaLgtcaLgtgLcflttgflagatttaatttaagatsgaaattacattgtttcattctgcaaatta tggpcctatcagageaaaatcfttggattttgaatggcEactttceecflgtgaagacacatatcatttcctgggagga a g a tg tg a a a g tg g c a a g c c a tt ta c tc e a a a a a g ta ta a tc tñ a a a g a c tt t ta t ta a g tt tg g a a g g c tta .a c c 'c atcatttgttatctgtCgtctacttgtctttattaaaattettCttagtccaatcactttcgatgaagttgactagt cttpgtcacetgaatactttaaatctttgccttggtgLctctatattttcagecstctcaattccgaagctcacatt tgttttctctttgtaatgtceatetgaaagtt ícatgcttttttgcag Sec. With no. ident .: 4 (Intron 2) aga tg tg gttagaagtccacaaLgtcaLgtgLcflttgflagatttaatttaagatsgaaattacattgtttcattctgcaaatta tggpcctatcagageaaaatcfttggattttgaatggcEactttceecflgtgaagacacatatcatttcctgggagga AAAG gcaagcca tg tt c tc ta eaaaaag tc ta ta to ta t tN aaagac tt tt tg t ta ag gaaggc tta .acc 'c atcatttgttatctgtCgtctacttgtctttattaaaattettCttagtccaatcactttcgatgaagttgactagt cttpgtcacetgaatactttaaatctttgccttggtgLctctatattttcagecstctcaattccgaagctcacatt tgttttctctttgtaatgtceatetgaaagtt ícatgcttttttgcag

Sec. con núm. de ident.: 5 (Intrón 3)Sec. With no. of Ident .: 5 (Intron 3)

g ts a g t t tc íg a g tg t t t ta tc a a c C M tt tg g a a c c a a g c e jC e a a g a g ta g tg L t tc t tg g t tg t ta a a tg a t tc a cítgtgtgttggtttccataaaacctgaactctatgttttatcagagtgttttgc;tttetcgaag g t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t tc tc tcg tc t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t tc tc tcgaag

Sec. con núm. de ident.: 6 (Intrón 4)Sec. With no. of Ident .: 6 (Intron 4)

gcaaat tcetgagga,caa.g-tttttCCtttcgeatgtaaattcaaactttgctgct tagatgattaaataatgaaaaa ta tc c a t tg c a tg t t t c a a tg tg L a tg a c ^ tg t t& g a a t t t tg a a ta g a a g t tq a t tc a c tg ^ tg c tg a g a tg tc t t gctctttttetgcag gcaaat tcetgagga, caa.g-tttttCCtttcgeatgtaaattcaaactttgctgct tagatgattaaataatgaaaaa ta tc cat tg tg tg tttcaa ca tg L tg tg ^ ac & gaattt tg t aa t gaagt tq ta tc at ac tg tg ^ c aga tg tg tt tc gctctttttetgcag

Sec. con núm. de ident.: 7 (Intrón 5)Sec. With no. of Ident .: 7 (Intron 5)

gtatgagcactgtttataacagccgtcct tttttcttttcttgtctgaactcaaatttgaatcctttgt ttagaggc aattagt ctgctctgagcatt ttggctgacagttattatguatattaaaaggcaacttLtfctattcgttctgtccag ctaajactt tttacttaaaiJtgtgg ttaa.ctgoa tatttctgtgtctcctatt ttttgat teCtt-gcaactccgaec a a tc c a g a t t tg g g g a a g g c ttg t tg t ta g t tg a tg a c ta g a ta c ta a g c tc a tíA tc ta c a ttg g ttg c á a g ta g a a ttttcaagttgtcattcacttatactgtttgaactaggagatcagcattcttctgcaaggagceetgaatgcttgaa aagttaaaeagaaaagaaaaagttcagggcagatagacataatgtgttaaagtaattcaattggagcacagatatAt gaeatgtgttattCgggagctaegaaaaagataaggactattatgt3gactacaatCgaaataacaggtaat tcatt tctggtttacag gtatgagcactgtttataacagccgtcct tttttcttttcttgtctgaactcaaatttgaatcctttgt ttagaggc aattagt ctgctctgagcatt ttggctgacagttattatguatattaaaaggcaacttLtfctattcgttctgtccag ctaajactt tttacttaaaiJtgtgg ttaa.ctgoa tatttctgtgtctcctatt ttttgat teCtt-gcaactccgaec aa tc cagatt tg tg gggaaggc ttg t t t tg gt tg t ac agc ga ta tc ta c tc ta ca tia ttg ttg g Ag ta c gaa ttttcaagttgtcattcacttatactgtttgaactaggagatcagcattcttctgcaaggagceetgaatgcttgaa aagttaaaeagaaaagaaaaagttcagggcagatagacataatgtgttaaagtaattcaattggagcacagatatAt gaeatgtgttattCgggagctaegaaaaagataaggactattatgt3gactacaatCgaaataacaggtaat tcatt tctggtttacag

Sec. con núm. de ident.: 8 (Intrón 6)Sec. With no. number: 8 (Intron 6)

gtataacaccgtccaatgctcatttatgggaattataaattGtagtat ttgataatqrcttctgtACtttagAtCt-ac ctgctctactgaaaaatgaaatgagtatgaggaaatagaataíLccgttgagcatttatgtctttctattaaaaattt gcattetatcttcttgt ttcaagteaaaatcttgaacaactatd tCtagagaattttCcttctCgCgaagtaatgca tatatacateaagagaagtcagagttgctgaatgaaatagtagatcaaatttaagtgtcgtgectataaagaattgt atggtgagattgñatst&gtggteatattattttctcaatcttagtgaetaaagtattccatflcaBacagacaagea tttagtcgtgcatteattggeaetaeaaaattatcaaccaagagtaatattctttcagctttcctctgtatatgtgt gttctattctggagctgaagataactaatattcttttttatttctacaggtataacaccgtccaatgctcatttatgggaattataaattGtagtat ttgataatqrcttctgtACtttagAtCt-ac ctgctctactgaaaaatgaaatgagtatgaggaaatagaataíLccgttgagcatttatgtctttctattaaaaattt gcattetatcttcttgt ttcaagteaaaatcttgaacaactatd tCtagagaattttCcttctCgCgaagtaatgca tatatacateaagagaagtcagagttgctgaatgaaatagtagatcaaatttaagtgtcgtgectataaagaattgt atggtgagattgñatst & gtggteatattattttctcaatcttagtgaetaaagtattccatflcaBacagacaagea tttagtcgtgcatteattggeaetaeaaaattatcaaccaagagtaatattctttcagctttcctctgtatatgtgt gttctattctggagctgaagataactaatattcttttttatttctacag

Sec. con núm. de ident.: 9 (Intrón 7)Sec. With no. of Ident .: 9 (Intron 7)

g ta a ta a t tc ta e c ta a tE e t< jtg g tc g c ta t t tg c ta g c a tt tg c a c a a a a g g a a a a c ta ta a a a a g ttc a ta g ta aggaagagagggtagctgta ttaacaagcctacagat tetttaatctcaaatatgttacgttgüatctcta t&ttgt ttgttctactggtcaacag g ta tc ta to ta at tE ec ta and t <jtg gc tc ta g tt tg tg tt c t gca cacaaaaggaaaac ta ta aaaag ttc at rt g ta aggaagagagggtagctgta ttaacaagcctacagat tetttaatctcaaatatgttacgttgüatctcta t & TTGT ttgttctactggtcaacag

Sec. con núm. de ident.: 10 (Intrón 8) Sec. With no. number: 10 (Intron 8)

gtaatctaacttgetgactgaaataatttaeaaaaatcttaaaaLaLagLac&gagttagecaaacatgtcttctga gtgctgagatctttttggattataaattctgtaagagcaacataet atttgttagtgagaagaaaagcatatactcc agtgttttgttatctcccagdstgtctetsacatgaaatcgtgtacattgeagtaatctaacttgetgactgaaataatttaeaaaaatcttaaaaLaLagLac & gagttagecaaacatgtcttctga gtgctgagatctttttggattataaattctgtaagagcaacataet atttgttagtgagaagaaaagcatatactcc agtgttttgttatctcccagdstgtctetsacatgaaatcgtgtacattgea

Sec. con núm. de ident.: 11 (Intrón 9 ) agtcattagcctatttgttttggattttgtgagtttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatccc ttgtttgtatagattgctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaa Sec. With no. Photo: 11 ( Intrón 9) agtcattagcctatttgttttggattttgtgagtttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatccc ttgtttgtatagattgctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaa

Sec. con núm. de ident.: 12 (Intrón 10)Sec. With no. number: 12 (Intron 10)

□gt-cattagectatttgttttggat 111 gtgagttteatacttca3-a.Ctggaagcttfttgttatíittatetgit£cC 11gCttgtaLagattgc 111ct111cc11tt t-ctcgga11tatcttatatataagcggácagag taaaa □ gt-cattagectatttgttttggat 111 gtgagttteatacttca3-a.Ctggaagcttfttgttatíittatetgit £ cC 11gCttgtaLagattgc 111ct111cc11tt t-ctcgga11tatcttatatataagcggácagag taaaa

Sec. con núm. de ident.: 13 (Exón 1)Sec. With no. ID: 13 (Exon 1)

tggatatgaggaacagtatgtctteaga atcttgtttageatcac11tett g11ctgcctceaea 111caatcgtea gaggattcagcagctgttaaacggtca agatteattttcctctctccat gt,ceaeaaaggactcttctatcttccat tgatgzgctgettttgcttactttcattgtattt gcagtaenaangttgta ctcaaagtt-gfaegtccaatgageact Ctacttetagcactgataageetetaat tgcacacaacaggacttetgt tagaacea*tC111ggCttaag ctgtet c t g a t t t t g t c f t g c t a t t t t i g e c t t a t c t t c t i t i 'g t t t t a t g c A t t t t s s t t f l t ts jtgggA M tcccca ig tcgcc CtnjgaaagteatagatggactgLatcggttgttteaggcgactacacatgtLgtaattattStactaatagtteatg *ige.aE i.,agaLttcacgcL£ i.c ttcccaccc3-C tg tccctgcgcgcgctttggat.tgcaaüctttg o«g tU itg fl.g ttLg ttetttggttgtgggatcflcnaggct tgcgtcae11naggoaa11gatcctaatttangetttggatgatataagttc a11ag111ca111-cet-a111etg11gttetc11C-Attgttgcca11aaaggLtcgaccgga-gttgetgtaA11£gtg attc 13aatctca-cttaagtgatgaeíceaatgg 11 atgaactcer.ggatB.aat.ceagtgtgagtggctttgc 11 ca gctt-ctetaatatírgan&gccttctgga11tggatgaaceec11aetgcaaaaagettacaagt cacotetcaagat tgatgaagLtce11Cae 111ceccactgcatagageaga gnaaatgtCtcaac1111cgd&ag aaa11ggcCtaaa C Ctgaagaaatatcaaag catcetgtcegsacaaCa11ge tgcgttgc1111ggaacgaagt ta 1111 Lactgcca 11 cttgcagcaattagggtatgigitaLgtatgtagggecaacactcetflcaaagatttgttgatLac&cagcaggaaa gttggatatttcct 1atgaaggatactaccttataggaactCCcctaatagceaaatttgt9gaflgttCtaacctctC atcagLtcaactttaa.eteccaaaagcLtggestgcCta 11 egageg-acarttctcac 11C11 tgtataaaaagggg tteaggttgtcatgetc&gctagacsggctcatggtgttggacagatcgtaaattatatggecgtcgatgcccagca gctgtccgatatgatgctacagctaeat teca LttggctcaCge-categcaagtttctgtggctttaggeatecttt atact Laceteggtgettcaactgttgtaaegetígctgga cttgeageagtgatggta 11 tgtggtgtttggaact a a e a g a a a e a a e a g iittte a a ttra a ca te a tg a a a a a tcg tg a ttc ta g a a tg a a a g cg sca ^a tg a g a cg e tta a 11.a.L&Lgegcgttataaag11ccaggeatgggaagaac^1111daClaaagaatcgaatC CtCccgegantcegagt atggatggttgtccaag 11cttgtacteaategctgggB.atatCattgtcttgtggagenC tCCt□11ctagtggct aca.ctc-acttttggsagtgcaalc11gtt-gggaa.teeegc 11ggtgcagggacagtgttcactgeaacatCtCtC11 caegatgttgcaggaaccg atcagggc111 ecctcaatceatgatcteac111caeaegcae tgetetctcttgete gattggaeaaatatatgatgagt□aggagttagtggataaagctgtggaeagactagaaggtcgtgggggtacaatt gctatgcaggtgaaagatggagct1111gCtgggatg*tgaaaaeiigtaaagaagaa11gaaaaatgtaaact11ga gattegaaaaggegage ttgcagCagtagtggggaeng11 ggggcggggaagtcttecctcet tgcatctgtactcg gtgogatffcacaajttgteggHjteafl tggatatgaggaacagtatgtctteaga atcttgtttageatcac11tett g11ctgcctceaea 111caatcgtea gaggattcagcagctgttaaacggtca gt agatteattttcctctctccat, ceaeaaaggactcttctatcttccat tgatgzgctgettttgcttactttcattgtattt gcagtaenaangttgta ctcaaagtt-gfaegtccaatgageact Ctacttetagcactgataageetetaat tgcacacaacaggacttetgt tagaacea * tC111ggCttaag ctgtet ctgattttgtcftgctatttt igecttatcttctiti 'gttttatgc A ttttssttflt ts jtgggA M tcccca ig tcgcc CtnjgaaagteatagatggactgLatcggttgttteaggcgactacacatgtLgtaattattStactaatagtteatg * ige.aE i., agaLttcacgcL £ ic ttcccaccc3-C tg tccctgcgcgcgctttggat.tgcaaüctttg or "g tU itg fl.g ttLg ttetttggttgtgggatcflcnaggct tgcgtcae11naggoaa11gatcctaatttangetttggatgatataagttc a11ag111ca111-cet-a111etg11gttetc11C-Attgttgcca11aaaggLtcgaccgga-gttgetgtaA11 £ gtg attc 13aatctca-cttaagtgatgaeíceaatgg 11 atgaactcer.ggatB.aat.ceagtgtgagtggctttgc gctt 11 ca-ctetaatatírgan & gccttctgga11tggatgaaceec11aetgcaaaaagettacaagt cacotetcaagat tgatgaagLtce11Cae 111ceccactgcatagageaga gnaaatgtCtcaac1111cgd & ag aaa11ggcCtaaa C Ctgaagaaatatcaaag catcetgtcegsacaaCa11ge tgcgttgc1111ggaacgaagt ta 1111 Lactgcca 11 cttgcagcaattagggtatgigitaLgtatgtagggecaacactcetflcaaagatttgttgatLac & cagcaggaaa gttggatatttcct 1atgaaggatactaccttataggaactCCcctaatagceaaatttgt9gaflgttCtaacctctC atcagLtcaactttaa.eteccaaaagcLtggestgcCta 11 egageg-acarttctcac 11C11 tgtataaaaagggg tteaggttgtcatgetc & gctagacsggctcatggtgttggacagatcgtaaattatatggecgtcgatgcccagca gctgtccgatatgatgctacagctaeat teak LttggctcaCge-categcaagtttctgtggctttaggeatecttt atact Laceteggtgettcaactgttgtaaegetígctgga cttgeageagtgatggta 11 tgtggtgtttggaact aaeagaaaeaaeag iittte aa TTRA to ca you tg aaaaa tcg tg ttc ta gaa tg AAAG cg sca ^ a tg aga cg and tta to 11.aL & Lgegcgttataaag11ccaggeatgggaagaac ^ 1111daClaaagaatcgaatC CtCccgegantcegagt atggatggttgtccaag 11cttgtacteaategctgggB.atatCattgtcttgtggagenC □ TCCT 11ctagtggct aca.ctc-acttttggsagtgcaalc11gtt-gggaa.teeegc 11ggtgcagggacagtgttcactgeaacatCtCtC11 caegatgttgcaggaaccg atcagggc111 ecctcaatceatgatcteac111caeaegcae tgetetctcttgete gattggaeaaatatatgatgagt □ aggagttagtggataaagctgtggaeagactagaaggtcgtgggggtacaatt gctatgcaggtgaaagatggagct1111gCtgggatg * tgaaaaeiigtaaagaagaa11gaaaaatgtaaact11ga gattegaaaaggegage ttgcagCagtagtggggaeng11 ggggcggggaagtcttecctcet tgcatctgtactcg gtgogatffcacaajttgteggHjteafl

Sec. con núm. de ident.: 14 (Exón 2)Sec. With no. Ident. 14 (Exon 2)

g tc a c a a tttg tg g ttc a a c tg c c ta tg ttg c a c a a c a tc g tg g a C te a < ja a tg g e a e g a ta c a a g a a a a ta tc c tg tttggtatgCc&atgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggt ttgetgcttggagaaggacttggaaataat ggagtttggagaceagactgaaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggteagaagcagcgaatCcagcttg eaagagetgtttaccaggactgtgatatttatcttctagatgatgtattcagtgcagttgatjeteas*ctggttCt gumtcttcaag g tc ACAA TTTG tg aac ttc tg g tg cc ta tc g tg ttg cacaaca you ga C <tg geaega ja ta tc ta caagaaaa c tg tttggtatgCc & atgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggt ttgetgcttggagaaggacttggaaataat ggagtttggagaceagactgaaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggteagaagcagcgaatCcagcttg eaagagetgtttaccaggactgtgatatttatcttctagatgatgtattcagtgcagttgatjeteas * ctggttCt gumtcttcaag

Sec. con núm. de ident.: 15 (Exón 3) Sec. With no. ID: 15 (Exon 3)

gaatgtgtgaggggaatttttaaagataaaaceattttgettgtCSCacaccaagttgact tcttgcataatgttga ectgatccttgaatgtgtgaggggaatttttaaagataaaaceattttgettgtCSCacaccaagttgact tcttgcataatgttga ectgatcctt

Sec. con núm. de ident.: 16 (Exón 4) Sec. With no. of Ident .: 16 (Exón 4)

gtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctggciaatat4atgagatattagaagctggaatggattttaaagagct a g ta g e tg c a e a tg a g a c c tc tt ta g a a c ttg ttg a e g tg g a a a e a a e c a a a g íig ñ g C fla tg e c tc c c ttg a a g a a t caaaatcttctcgaagattat:cLaaggaagaaaacggagatgata£iatcteaacagtctacatctgetaggggggñt te ta a a c tta ta a a g g a a g a a g a a a g a g a a a c tg g a a a a g tc a g tc a tc g tg tg ta c a a g c ta ta ta tta c tg a a g c t t t t g g a tg g tg g g g tg ta g tg c te g t ta t c t t g t t t t c g t t c t t g tg g c : a a a g t t c t c ! t a a tg g c a a g tg a tc a t t 39ct33Gatatgaaaettcagcggatcgtgccatgtcctccaatccttctetgtttattgggatatacggtgttatt gcagttgtttcttcgttgctgatagtgatcaggatgtattttgtgacacttatggggctcaagactgcccaaatatt tttcggacagattctttacagcatactgcatgctcctatgtcattttttgacaí;aacaccttccggaagaattctga gtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctggciaatat4atgagatattagaagctggaatggattttaaagagct ag ta ge tg EAPC tg agacc tc tt ta GAAC ttg ttg aeg tg gaaaeaaecaaag IIg ñ g C fla tg ec tc cc ttg aagaat caaaatcttctcgaagattat: cLaaggaagaaaacggagatgata £ iatcteaacagtctacatctgetaggggggñt you ta aac tta ta aaggaagaagaaagagaaac tg gaaaag tc ag tc to tc g tg tg ta caagc ta ta ta tta c tg aagcttttgga tg g tg ggg tg ta g tg c te gt ta tcttgttttcgttcttg tg gc: aaagttctc! tg tg gcaag taa tc att 39ct33Gatatgaaaettcagcggatcgtgccatgtcctccaatccttctetgtttattgggatatacggtgttatt gcagttgtttcttcgttgctgatagtgatcaggatgtattttgtgacacttatggggctcaagactgcccaaatatt tttcggacagattctttacagcatactgcatgctcctatgtcattttttgacaí; aacaccttccggaagaattctga

Sec. con núm. de ident.: 17 (Exón 5) Sec. With no. Ident. 17 (Exon 5)

gcatctflatgatcagaccaacattgacgtEittectcccgttttttatgaatctcactttggccatgttEatcaract ge t c g g c a tc a te a tc a t caca t g e c a a ta t t c t t g g í r C ta c c g ta c ta c t t t t g a t t c c t c t g g g t t g g e t t s a ta tctggtaccgg gcatctflatgatcagaccaacattgacgtEittectcccgttttttatgaatctcactttggccatgttEatcaract ge tcggca tc to tc to t you tgecaa caca ta ta ttcttgg í r C c ccg ta ta ta cttttgattcctctgggttgg ETTSA tctggtaccgg

Sec. con núm. de ident.: 18 (Exón 6) Sec. With no. Ident. 18 (Exon 6)

ggata.ctatettgcaacatctcgtgaattgactcggcttgacteaattacaaaagcacctgttattcatcatttctc tg a a a g e & tc tca g g tg tta tg a c ta ta cg ttg c ttta g g a a g ca g g a g A tg ttttg ta a cg a g fla tg t& a a ce g a g tgaittceaatctgcgaatggat 11ccacaaeaatggatceaatgaatgg11ggget11cgactggaa11gatggga a g c c ta c ttc t t tg tg t t tc tg c a a tg t tc a tg a ttg rc t ta c c ta g c a g c a tc a tc a a g c c a g ggata.ctatettgcaacatctcgtgaattgactcggcttgacteaattacaaaagcacctgttattcatcatttctc tg aaage & tc tca tta gg tg tg ttg cg ac ta ta ca c TTTA ggaag GGAG A tg ttttg ta tg t cg ag fla & aa ce gag tgaittceaatctgcgaatggat 11 ccacaaeaatggatceaatgaatgg 11 ggget 11 cgactggaa 11 gatggga SCFA ta c ttc tg tt tg tt tc tg caa tg t tc a tg a ttg rc t ta cc ta gcagca tc a tc aagccag

Sec. con núm. de ident.: 19 (Exón 7)Sec. With no. of Ident .: 19 (Exón 7)

a a a a tg t tg g t t tg tc a c c a tc a c a L g g c t tg tc tc t ta a ta g tg tc c ta t tc tg g tc c a tc t t tg tg a g t tg c t t t g tggaaaataaaatggtttctg tcgaaagattaaaacagttctcaga&ataccatcagaagcagagtggagfaaagata a a t a t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

ggat LLtctcceaCCtteaagttggccaagccgtgggaatgt tgagcttgaa aacgtgcagggat LLtctcceaCCtteaagttggccaagccgtgggaatgt tgagcttgaa aacgtgcag

Sec. con núm. de ident.: 20 (Exón 8)Sec. With no. number: 20 (Exón 8)

S tta g a ta tc g tc c g a a c a c tc c tc ta g tg c ttM a g g a g ttK rto tc a g c a tta g a g g tjg g íig a g a a g a ta g g tg t tg ttg g tc jtíie a g c fg g g tg g a a a a tc a a c a L ta a ttc a a g tttte tttc ! jtc tg g ty ífa gcctgcagetggaagaa ta a tc a t tg a c g a c g ta g a ta ta tc c a g a c t tg g g c t tc a tg a tc t ta g a tc t tg í t tc g g g a tc a t tc c c c a a g a g e e a g tc c tttttg a a g g a a c tg tg a g a a g c a a c a ttg a c c c c a ttg g a c a a ta ttc a g a tg a tg a a a tttg g a a g S tta ga ta tc g tc cgaacac tc c tc t g tg c ttM aggag ttk rto tc agca tta gagg tjg g ilig agaaga ta gg tg t tg tc g tc jtieie agc fg gg tg gaaaa tc aaca ! jtc tg g y tc gcctgcagetggaagaa ta a tc at tg acgacg ta ta ta tc cagact tg ggct tc t t t t t t t t t tc ggga tc at tc cccaagag eeag tc c tttttg aaggaac tg tg agaagcaaca ttg acccca ttg gacaa ta ttc aga tg a tg aaa tttg gaag

Sec. con núm. de ident.: 21 (Exón 9)Sec. With no. of Ident .: 21 (Exón 9)

agcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccagagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccag

Sec. con núm. de ident.: 21 (Exón 10) tLgttgataacggagaLaaotggagLgteggacagaggcagcttCtttgíttgggflígagtgatgCtSdaacgtage agacttctñttcatggatgaggcaactgcctccgctgatteacagacagatgcagtgattcagaaaatcatecgcga ggactttgcggcctgtactataatcagcattgcececagaataceaac^gccaCggactgtgatagagttcttgtta taga tgengSec. With no. Photo: 21 ( Exón 10) tLgttgataacggagaLaaotggagLgteggacagaggcagcttCtttgíttgggflígagtgatgCtSdaacgtage agacttctñttcatggatgaggcaactgcctccgctgatteacagacagatgcagtgattcagaaatcatecgcga ggactttgcggcctgtactataatcagcattgcececagaataceaac ^ gccaCggactgtgatagagttcttgtta taga tgeng

Sec. con núm. de ident.: 22 (Exón 11)Sec. With no. ID: 22 (Exon 11)

g aacag ea aaag ag tttg acaaacca tc ccg tttg c ttg a aag g eeC tcae ttLt tggggc t t t g g t tca&gaataC gccaaccgatcctc tgagctc taag aacag ea aaag ag tttg acaaacca tc ccg tttg c ttg a aag g eeC tcae ttLt tggggc t t t g g t tca & gaataC gccaaccgatcctc tgagctc taa

Sec. con núm. de ident.: 23 (Secuencia de ARNi)Sec. With no. Ident .: 23 (RNAi Sequence)

aa na g ccag t c c t t t t t g a aggaac t g tg ag a age n a c a ttg a c c caa na g ccag t c c t t t t g a aggaac t g ag a age n a c a ttg a c c c

ca t tgga c a a ta t tc a g s tg a tg a a a t t t gga agg t a a t c ta a c t tg c tg a c tga s a t a *t t a t t a t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

t L ta c aa a a a tC tc a a aa t a t a g t a Ca ga n c t ag c c a a i c a t j t C t t c t g a g t g c t ga gat T a t a t a t a t a t a t a t a t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

t c t t t 11 gga 1 t a ta a a t t c t g ta a g a g c. a □ c a t a c t a L t t g t t a g t gagaagaa a age a tcttt 11 gga 1 ta ta aattctg ta agag c. a □ catacta L ttgttagt gagaagaa a age a

t a t a c te c a g tg t 11 tg t t a t c tc c caga a t g t c t c t aa ca tg aa a tc g t g ta ca t tg e at a t c t c t t t t t t t t t t t c t c t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

g a g c c c c g a a c g c tg c c a a c tc a a a g a e g tg g tg tc te ta a a a c c e g a a a a a c e t g a t t eg a g c c c g a a c c g c t c c a a c a c a a a g a g g t g t a t a c a c a c a t a c e t t

acc ag g t aa a 1111 cc te c t e t a cg t c a t c e t tg tg g t L c 111 ge ggaa 11 a Lge aac caacc ag g t aa 1111 cc te c t t a c t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

a c t L t c t a c g tg t 11 c aa a t a t a t a ta c t g a t aa e L gaa ta c t g t c a t t g e t aaa t ca t aa c t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

g t tg t tg & ta a c g g a g a ta a c tg g & g tg tc g g a c a g a g g c a g c e tc t t tg c tk g g g s a g ag t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t g t t

g t g a t g c ta a a ac g t a ge a gac t t c ta 11 ta t gg a t gaggca a c t g tc t t t g t t ga 11 cag t g a t g a t a g a t a g a t t a t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

cagac aga tg c a g tg a 11 caga aaa te a t cegeg aggac t t t g eggc c t g ta c t a ta a t ecagac aga tg c a g tg a 11 caga aaa te a t cegeg aggac t t t g eggc c t g t a t a t a t

a g c a tc g c e c & c a g a a ta c c a a c a g tc a t .g g a c tg tg & t& g a g ttc ttg t£ a ta g & tg c aa g c a t c g c e c a c t a c t a c t a t t a t g t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

g g t g t t g a t t t c t c t c c t c t t f lc t £ t g c a c c c c a t t t 7 g a a t c t g g i : f la a £ g a t : t & t t t ag g t g t t g t t t t c t c c c t t t f lc t g t a c c c c t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

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aaca tg c g taa 111 ga c c t a t t a t age a g a t t a t t t g t c t ta 111 tc c a g g te g e tg a 11aaca tg c g taa 111 ga c c t a t t a t a t a t a t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

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c t t t t g g c & c c g t c g g t g t a a a g a a g t t a a a c t c c t t e c t t t a a c c c c g g c a t t t c i t a tc t t t t g g c & c c g t c g g t t a a g a g t t a a c c t t e c t t a a c c c g g a t t t t i t t

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t C t t g g g g c t t t g g t t c a a g a a t i t g c c A a c c j f l tt C t t g g g g t t t g g t t c a a g a a t t t t c c a A c c t

Sec. con núm. de ident.: 24 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 1; - denota el codón de parada putativo) KDWIRN5M5 SESCLASOSCSASTFQS SEDSAWttWLRP 3FLS PCPQRTLLS SIDVLLLLT F 3VFAVQKLY gKLR5 NER 5TS ÉILKPL3AH NRTSS PWKVIDGLYWLFQAI T H W I TILI VH EKEFFAIS H FLSLRVFW3ANF W M 5 LFFGCG TTRLVS LÜE Ifl&NLfcKiDDISSLVS FPrSV VLFIVAIKG STGVftV1SDS E5HL SDETNGYELLDK5SVSG FASASL3S EAFWI WMNPLLQ Sec. With no. Ident .: 24 (protein sequence of NtMRP4; 5'-3 'frame 1; - denotes the putative stop codon) KDWIRN5M5 SESCLASOSCSASTFQS SEDSAWttWLRP 3FLS PCPQRTLLS SIDVLLLLT F 3VFAVQKLY gKLR5 NER 5TS ÉILKPL3AH NRTSS PWKVIDGLYWLFQAI THWI TILI VH EKEFFAIS H FLSLRVFW3ANF WM 5 LFFGCG TTRLVS Lue Ifl & NLfcKiDDISSLVS FPrSV VLFIVAIKG STGVftV1SDS E5HL SDETNGYELLDK5SVSG FASASL3S EAFWI WMNPLLQ

KG YKS PLKIDFVPG LSF LHRAEKMSg LFERNHF KPER3SKH PVHTTLLRCFHKBVI FTAIKG YKS PLKIDFVPG LSF LHRAEKMSg LFERNHF KPER3SKH PVHTTLLRCFHKBVI FTAI

LAVIK VCVM YVG PPL IQRFVDYTAGERTS PYEG IfYLIGTLLIAKFVEVLTSHQFNFNSQKLAVIK VCVM YVG PPL IQRFVDYTAGERTS PYEG IfYLIGTLLIAKFVEVLTSHQFNFNSQK

LGMLI KATLL.TSLYKKGLRLSCSARQASGVGQ I’/NYMAVOAQQLSDHM LQLHSIWLNPLQLGMLI KATLL.TSLYKKGLRLSCSARQASGVGQ I '/ NYMAVOAQQLSDHM LQLHSIWLNPLQ

VSVALGILYTY LGAST VVT'LAGLAAVMV1.tWFGT:-:RNNH FQPR IMKHRD 5RXKArNEtíLN YMHVIKPQAWEEHFNKR ZEEPR ESEYGWLSKFLY S3AGWr IVLHSTPLLVATLTFG3AILVSVALGILYTY LGAST VVT'LAGLAAVMV1.tWFGT: -: RNNH FQPR IMKHRD 5RXKArNEtíLN YMHVIKPQAWEEHFNKR ZEEPR ESEYGWLSKFLY S3AGWr IVLHSTPLLVATLTFG3AIL

LGI PIjGAGTVFTATSLF KM LQEPI RAF PQSttlSLSQAMl SLÜRLDKY MMS KELVDKAVER LEGCGGTIAttgVKGGAFCWEDEN 3RE ELKNVN FE3RKG3 LAAWGTVGAG KSS LLASVLGLGI PIjGAGTVFTATSLF KM LQEPI RAF PQSttlSLSQAMl SLÜRLDKY MMS KELVDKAVER LEGCGGTIAttgVKGGAFCWEDEN 3RE ELKNVN FE3RKG3 LAAWGTVGAG KSS LLASVLG

EMHKL 5GQVTI CGSTAYVAjQTSHI QWGTIQEtfIOFGM PtfNRDRYKEVIR VCCbERDLEI MEMHKL 5GQVTI CGSTAYVAjQTSHI QWGTIQEtfIOFGM PtfNRDRYKEVIR VCCbERDLEI M

EFCDQTEIG ERG INLSCGQ-KQRIQLARAVY QDCDI YLLDDVF SAVDAHTÜS ÉlFKECVRGEFCDQTEIG ERG INLSCGQ-KQRIQLARAVY QDCDI YLLDDVF SAVDAHTÜS ÉlFKECVRG

iLtíCK'TILUT’HÜVDFL.H^ VDLILVMR=>GM EVQSG KYNSl L&AGMDFKE0VAAKET5LEL VDVETTK ESNAS LEES KSS RRLSKEBNGDDKSQQSTSDRGPS KLIK EEERETGKVSPRVY KOY TTEA FGWHGVVLVTLFS PLUQ5SLHASDYWLAYffTSADRAM SFNPSLFIGIYG VIAViLtíCK'TILUT'HÜVDFL.H ^ VDLILVMR => GM EVQSG KYNSl L & AGMDFKE0VAAKET5LEL VDVETTK ESNAS LEES KSS RRLSKEBNGDDKSQQSTSDRGPS KLIK EEERETGKVSPRVY KOY TTEA FGWHGVVLVTLFS PLUQ5SLHASDYWLAYFFTSADRAM SFNPSLFIGIYG VIAV

VS SOI.IVIRHY FVTLWG OKTACIPFGQILYSILHAPM SFFÜTTP ÉGRILS RASHDQTFQ DVS SOI.IVIRHY FVTLWG OKTACIPFGQILYSILHAPM SFFÜTTP ÉGRILS RASHDQTFQ D

VFLPF FMIÍLITLAHFITLLGIIIITCQY5 WPTVLLLIP LCWLHIWYRGYY LATSRELTR C.R STTKAPV1HII ESES 3SGWIT 3RCFF KOIÍMFCHE^VNi!VNSHLRWDFHNMGSNEVLGFRLE OHGSOLLCVSAH FMIVL FS S3IKPEMVGLSLEYGLSLN5VLFWSIFVS CFVENKMVS VER LKQFSEIP3 EAEWREÍMOFLP PSSWPSRGNVELEHVQVRYÍt PHTPGVOkGVTLS IRGGEKIVFLPF FMIÍLITLAHFITLLGIIIITCQY5 WPTVLLLIP LCWLHIWYRGYY LATSRELTR CR STTKAPV1HII ESES 3SGWIT 3RCFF KOIÍMFCHE ^ VNI! VNSHLRWDFHNMGSNEVLGFRLE OHGSOLLCVSAH FMIVL FS S3IKPEMVGLSLEYGLSLN5VLFWSIFVS CFVENKMVS SEE LKQFSEIP3 EAEWREÍMOFLP PSSWPSRGNVELEHVQVRYÍt PHTPGVO k GVTLS IRGGEKI

GWG STÜ GG ESTO EQVF FRLVEPñAGRIIIDDVEIS3LGLH DLRSRFG1rPQBPVLFEGTGWG STÜ GG ESTO EQVF FRLVEPñAGRIIIDDVEIS3LGLH DLRSRFG1rPQBPVLFEGT

VR SHIDPIGQYSDDEIWKE PRTL prqRCGVFKTF KT -FTSC --RR-LECRTEAAS LLGKSVR SHIDPIGQYSDDEIWKE PRTL prqRCGVFKTF KT -FTSC --RR-LECRTEAAS LLGKS

DAKT ■QT5IYG -GHCLC -FTDRCSDS EífflPRC LOCLYYNQH CPQNTNSHCO £StYRí RDAKT ■ QT5IYG -GHCLC -FTDRCSDS EífflPRC LOCLYYNQH CPQNTNSHCO £ StYRí R

C -FLS FYFVPY FE5GK -LFICK -WFPTNU SQYLY 5ElA-C -PSSSKCMC -FLS FYFVPY FE5GK -LFICK -WFPTNU SQYLY 5ElA-C -PSSSKCM

Sec. con núm. de ident.: 25 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 2; - denota el codón de parada putativo) Sec. With no. Ident .: 25 (protein sequence of NtMRP4; 5'-3 'framework 2; - denotes the putative stop codon)

WI-GTVCLQNLV -HÜFLVL PPHFríFÜRlÜOLLKG -D£ FSSLRYH KGLFYLP LMCCFCOEjS LYUgYKSCTQS-GPMSTLLOAOISL-LHTTGLLRLGKS-MDCIGCFRRLHML-SOY--RKDFTLFPIHCPCACFOLQTL- L-VCSLWGSQQLCHLEIKLILI ■EHHI 'VH- FHPLPLLWI-GTVCLQNLV -HÜFLVL PPHFRIFLÜOLLKG -D £ FSSLRYH KGLFYLP LMCCFCOEJS LYUgYKSCTQS-GPMSTLLOAOISL-LHTTGLLRLGKS-MDCIGCFRRLHML-SOY - RKDFTLFPIHCPCACFOLQTL- L-VCSLWGSQQLCHLEIKLILI ■ EHHI 'VH- FHPLPLL

fssl lplkvr pell-l vilml t-vhjcphvmhs hihpv-val lülo-yr kpfgf g-tlyckfssl lplkvr pell-l vilml t-vhjcphvmhs hihpv-val lülo-yr kpfgf g-tlyck

KVI'SHLERLH KFLHFPJTCIEQH KC1.NFSKETGLHLKKYÍ3SIOSEQHCtT^AFCRKLFLOPFKVI'SHLERLH KFLHFPJTCIEQH KC1.NFSKETGLHLKKYÍ3SIOSEQHCtT ^ AFCRKLFLOPF

Lg -LGWLGH -GOHSY KPLOTTgOERGHLOHKDrTL -EL5 --PULWÍÍF-Ptl SETLTFKS LACLFBRUFSLLCIRRG-GCHAQLDRLHVLDRL-IIWPSMLSSCPI-CYSYIPFGSCHGKLg -LGWLGH -GOHSY KPLOTTgOERGHLOHKDrTL -EL5 --PULWÍÍF-Ptl SETLTFKS LACLFBRUFSLLCIRRG-GCHAQLDRLHVLDRL-IIWPSMLSSCPI-CYSYIPFGSCHGK

PLWL ■AS PIOÍSVLOIíL■tt-ODLíX!*HY LHL’LEOKEl'TÜFMLTS - R L VI LE - RR^PIRCLIPLWL ■ AS PIOISVLOIÍL ■ tt-ODLíX! * HY LHL'LEOKEl'TÜFMLTS - RLV I LE - RR ^ PIRCLI

3CAL -SSR][GKNILTKELN PSANPSHD&C PSSCTQ5LGT5LS0GALLF _WLH gLLEV<>3C HESROVQQQCSLQHIiS SKCCENRSCOSLN P-SHFHKQ-YOL3 DWTNI -’-VRS-UIKLWKD3CAL -SSR] [GKNILTKELN PSANPSHD & C PSSCTQ5LGT5LS0GALLF _WLH gLLEV <> 3C HESROVQQCSLQHIiS SKCCENRSCOSLN P-SHFHKQ-YOL3 DWTNI -'- VRS-UIKLWKD

-EW G VÜLLCR -RPIELFAGMHRTVKKH -KK -TLRLÉKÉSLQÜ -WñQOÜRGSLPSLHLY LV fiCTSCEVRÉÜ FWgLPHLHKS RGFEiMARYKE JSCLVCQ -TETIKTKK-5GPAAWRRTHK- H-EW G VÜLLCR -RPIELFAGMHRTVKKH -KK -TLRLÉKÉSLQÜ -WñQOÜRGSLPSLHLY LV fiCTSCEVRÉÜ FWgLPHLHKS RGFEiMARYKE JSCLVCQ -TETIKTKK-5GPAAWRRTHK- H

SLETRLK -ÉPTVñSTSWV B SS E5ELQELPTRTVIFIF -MMYSVgLWOTOALiESS RNV -GESLETRLK -ÉPTVñSTSWV B SS E5ELQELPTRTVIFIF -MMYSVgLWOTOALiESS RNV -GE

FLK3 KPFCLEHTRLTSCIWLT -SL3CEMG ■3GHLAWIWRY ’ELEWI LES --LHF.RPL ■HL LTWKgrRRAH ?PLRNttNLLEDY LRRKT3MINL-YSLEiLIGGILM L-RRKKÉ ELEESVLVCT SYILLKLLDGGV -C-LECFRS FLK3 KPFCLEHTRLTSCIWLT -SL3CEMG ■ 3GHLAWIWRY 'ELEWI LES --LHF.RPL ■ HL LTWKgrRRAH? PLRNttNLLEDY LRRKT3MINL-YSLEiLIGGILM L-RRKKÉ ELEESVLVCT SYILLKLLDGGV -C-LECFRS CGY7SL-CGY7SL- WQVT 3GWRríKLQR3VPCPE tLLCLLGYTVLLQLWQVT 3GWRríKLQR3VPCPE tLLCLLGYTVLLQL

FLEC---EGCIO -HLWGS RLPK YFSDRF FTAYCMLLCH FLTQHLPEEP-VGHLKIRPTLMFLEC --- EGCIO -HLWGS RLPK YFSDRF FTAYCMLLCH FLTQHLPEEP-VGHLKIRPTLM

SSSRFL-1SLWPCLSHGSASSSSHAHILGLPYYF■FLÍT^GLISGTGDIILQHLVN LGLTSSSRFL-1SLWPCLSHGSASSSSHAHILGLPYYF ■ FLÍT ^ GLISGTGDIILQHLVN LGLT

íLCEHLLF 31SLKASQVL -LYVADaSRRCFVTRH -TE -1£■!CE'rfISTTM3 PMNGWAFDWCfILCEHLLF 31SLKASQVL -LYVADaSRRCFVTRH -TE -1 £ ■! CE'rfISTTM3 PMNGWAFDWCf

-WüftYFFVFLgcS -LSYLAAS S5QKM0VCH Y][MACLLrVS YSG FSL VALWK3Kw FLS KD-WüftYFFVFLgcS -LSYLAAS S5QKM0VCH Y] [MACLLrVS YSG FSL VALWK3Kw FLS KD

-NS SgKYtigHgSGEKWf FSHLgV&gA VGHLS rjKTCRLDIV3tTLL-CLKELL3ALEGERR -VLLWQGYENQH -FK.FSPVWWSLQLEE -SLMT -IYPDOGFM J.LDLASGSF PKSGS FLKEL-NS SgKYtigHgSGEKWf FSHLgV & gA VGHLS rjKTCRLDIV3tTLL-CLKELL3ALEGERR -VLLWQGYENQH -FK.FSPVWWSLQLEE -SLMT -IYPDOGFM J. LDLASGSF PKSGS FLKEL

EATLT PLDN10H>11íFGItSLERCDLKDW S LEPEKLDS PVTONG2)NWSVCÜRQLLCLGRVEATLT PLDN10H> 11íFGItSLERCDLKDW S LEPEKLDS PVTONG2) NWSVCÜRQLLCLGRV

MLEIÍSRLLFMDFJ^TASVDSQTDAV3 QKI1H RDFAACTI ESIñiíftlPl’VMDCÜRVLVlDAGMLEIISRLLFMDFJ ^ TASVDSQTDAV3 QKI1H RDFAACTI ESIñiíftlPl'VMDCÜRVLVlDAG

AlJFSPFTLYL 3LWLVNÜY LSVCDG F0FT3 VSTFí1KKLPNVSÜ'>,WhlA-AlJFSPFTLYL 3LWLVNÜY LSVCDG F0FT3 VSTFí1KKLPNVSÜ '>, WhlA-

Sec. con núm. de ident.: 26 (secuencia de proteína de NtMRP4; 5'-3' marco 3; - denota el codón de parada putativo) GYEEQYVF RIL F5 iT FLFCLHISíVRG F33 C-MVK113PFL5M STRESSI FH -CAAFAYFK CICSTKWLTÍVFVG- ALYF- H --A5MCTgGPFFAljESHR*JTVLVv£2DYTCCNHYrNSS -EftTSRYFPSTVPARYIiDCKLCSY E FVLW LHDHKACVT- GH -S -FKN3 -YKF1SFl SYFCC S t.HCCFÍ-J?FDS 5CCN --F -1SLK --IÍGWL-T PG -1QCEWLCPS FStíIESLLDLD EPPTASÍ RLQVTSQD - -SE FIF'FTA -3RÉNVSTFJtKKLA -T -RflIK A BC t ™ IAALLL ECS YFYeH S Ge n -GWCWCftAKTH TKIC- LHSFKEDISL-RLLPY RKS ?W3Q ICGESflLEEVQ L-LPKA vnIAY5 SDT5H FFV -EGVKW M LS -TGSlíCHTDCK LYGK HCSAAVRYDATAT FHLAHAIA S FCGFRFt PLYLPF CFWCCWAS HTCSSDGICG VWN -KKQQVSI -HH EES -F-NE5DEÍ'DA -L YARY KV PGMGRTF -QKN -1LPF rFVWNWOVLVLNRWEYHCL VEKS ESSGYTHFttKCIÍLV Sec. With no. Ident .: 26 (protein sequence of NtMRP4; 5'-3 'framework 3; - denotes the putative stop codon) GYEEQYVF RIL F5 iT FLFCLHI Yes VRG F33 C-MVK 1 13PFL5M STRESSI FH -CAAFAYFK CICSTKWLTÍVFVG- ALYF- H --A5MCTgGPFFAljESHR * JTVLVv £ 2DYTCCNHYrNSS -EftTSRYFPSTVPARYIiDCKLCSY E FVLW LHDHKACVT- GH - S -FKN3 -YKF 1 SFl SYFCC S t.HCCFÍ- J? FDS 5CCN --F -1SLK --IÍGWL-T PG -1QCEWLCPS FStíIESLLDLD EPPTASÍ RLQVTSQD - -SE FIF'FTA -3 R ÉNVSTFJtKKLA -T -RflIK A BC t ™ IAALLL ECS YFYeH S Ge n -GWCWCftAKTH TK I C- LHSFKEDISL-RLLPY RKS? W3Q ICGESflLEEVQ L-LPKA vnIAY5 SDT5H FFV -EGVKW M LS -TGSlíCHTDCK LYGK HCSAAVRYDATAT FHLAHAIA S FCGFRFt PLYLPF CFWCCWAS HTCSSDGICG VWN -KKQQVSI -HH EES -F-NE5DEÍ'DA -L YARY KV PGMGRTF -QKN -1LPF rFVWNWOVLVLNRWEYHCL VEKS ESSGYTHFttKCIÍLV

GNFAWCRCSWCNISLQE'VACTL'QGFPSIHDLTFTSHDI5- -IGÍJIYD3-GVEG-5CGKTGNFAWCRCSWCNISLQE'VACTL'QGFPS IHD LTFTSHDI5- -IGÍJIYD3-GVEG-5CGKT

RR LWGYfJCVAGEKWS FLLG --KQ -R.R.1EICCKL -P -KRRACS SSGDSUQGEVF PPCICTW -D A Q W G 3 GHNLWFNCLCCTJíIVDSEWHDTR KYPVWYANSQRO I CCS DPÜLL LGeGLíGNNÜ VWR PtJ-h-RRrWHQPQWUS EAANPACKSCLPGL -YLS SR -c tOCS -C5HWL -N UgGMC BíjH S- R -tfHFRCHTPS -LIA-C-PDPCKARW^DRAIWQI --DIRSWMGF-RASSCT’ DLFRTC RR LWGYfJCVAGEKWS FLLG - KQ -RR1 EICCKL -P -KRRACS SSGDSUQGEVF PPCICTW -DAQWG 3 GHNLWFNCLCCTJIIVDSEWHDTR KYPVWYANSQRO I CCS DPÜLL LG e GL í GNNÜ VWR PtJ-h-RRrWHQPQWUS EAANPACKSCLPGL -YLS SR -c tOCS -C5HWL -N UgGMC BíjH S- R -tfHFRCHTPS -LIA-C-PDPCKARW ^ DRAIWQI --DIRSWMGF-RASSCT 'DLFRTC

-RGNNQREÜCLP-RIKIFSK13 -GRHRR -ISTVYI--G GF -TYKGRRXRNWKSQ3SCVQ-RGNNQREÜCLP-RIKIFSK13 -GRHRR -ISTVYI - G GF -TYKGRRXRNWKSQ3SCVQ

A LYr-SFkJMVGCSAS YLVFVLVAKF3HGR -LLAGI -MFSGS C>[VLi(}SFSVYWEIRCYCSC FFVADSEKJDVFCDTYGAÜDCPMT PK rDSLQHTACSYVIF■HNTFRKNS ESGI- -SDQH-C A LYr-SFkJMVGCSAS YLVFVLVAKF3HGR -LLAGI -MFSGS C> [VLi (} SFSVYWEIRCYCSC FFVADSEKJDVFCDTYGAÜDCPMT PK rDSLQHTACSYVIF ■ HNTFRKNS ESGI- -SDQH-C

L PPVFYESHFGH VYHTñRH^'HHHMPI FLAYRTTFDSSGLA -YLVPGI LSCMÍS -IDEA -LL PPVFYESHFGH VYHTñRH ^ 'HHHMPI FLAYRTTFDSSGLA -YLVPGI LSCMÍS -IDEA -L

NY RSTCY SSFL -KHLRCY DYT LL -HAGDVL-RÉCKPSEFQSAJJG FPgpw rQ-MVGLSTG 3 DGKLTSLCFCIÍVHDCLT -QHHQAEiKCW FVTITWLvs --CPILVH LCELLCGTÍ-NGFCRKI KTVLRNTI RE RVE KDG FEPTFKLAKPWEC- A -KRAfl-1SSEbíSSBA -KSY3QH -RGRMJR CCWS YRGVJKIUINFS FLEFCCACSWKÍWH -RRYIQTWAS -S -1SLftDrtSPRAE PF -fiJJC NY RSTCY SSFL -KHLRCY DYT -HAGDVL LL-RÉCKPSEFQSAJJG FPgpw r Q -MVGLSTG 3 DGKLTSLCFCIÍVHDCLT -QHHQAEiKCW FVTITWLvs --CPILVH LCELLCGTÍ-NGFCRKI KTVLRNTI RE RVE KDG FEPTFKLAKPWEC- A -KRAfl-1SSEbíSSBA -KSY3QH -RGRMJR CCWS YRGVJKIUINFS FLEFCCACSWKÍWH -RRYIQTWAS -S - 1SLftDrtSPRAE PF -fiJJC

P.YOK -PH HTT FK --KL EGA3WAANS :<HWCL- NPRNÍ.THQ LEI TR TTCVSDRGS FFAHEE - PY OK -PH HTT FK --KL EGA3WAANS: <HWCL- NPRNÍ.THQ LEI TR TTCVSDRGS FFAHEE -

C-NVftDFYLHMRQPL LTHFQWQ-FRKSSARTLRPVL-SALPTEYQOS WTVIEFLL- MOV LT SLLLLCTLF -IW -H 11YLYVKVS NQS -SVPL -RHCLMUUÍ MRC-NVftDFYLHMRQPL LTHFQWQ-FRKSSARTLRPVL-SALPTEYQOS WTVIEFLL- MOV LT SLLLLCTLF -IW -H 11YLYVKVS NQS -SVPL -RHCLMUUÍ MR

Sec. con núm. de ident.: 27 (secuencia de ADNc de NtMRP4 derivada de la secuenciación directa de ADNc) Sec. With no. Ident .: 27 (NtMRP4 cDNA sequence derived from direct cDNA sequencing)

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Sec. con núm. de ident.: 28 (secuencia de ADN de NtMRP3 con 5' y 3' UTR) Sec. With no. Ident .: 28 (DNA sequence of NtMRP3 with 5 'and 3' UTR)

ccgtcaacccagtcttggccaccacataaacacagctttgacttgtctctcccttttccctattttcaccacccttt tcaatttcccaccttatattcattattatatttaatcaatcaaatcaaagttggaaaaaaagggagtaataatcaaa tggagtagtatatacataccagaacaatgaaagagcactcataagctaaagcccataattcatcacgaaaccacaat atagaggaaacctgacgtgtcccttaaaatctaaccttgaacctctgagacctccaaaaaaaacatcatggaaattg caaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgt gtcattagttgttctttgcacctgggattgttccttgtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcaggaggga caataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgttttgttcaa taggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttggtcagaagaa aaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgcacacccagtt ccttaattcttgtgaaaccaaataccc tcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttcttgttattgccttgttatagaccttgtttatgggg aaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctgatgttgttttcactcttatggggttattcttctgtttt gttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgcttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatgg 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Sec. con núm. de ident.: 29 (secuencia de ADN de NtMRP3 sin 5' y 3' UTR)Sec. With no. Ident .: 29 (DNA sequence of NtMRP3 without 5 'and 3' UTR)

atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccat tttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttccttgtaattcttgggttgtgttgttggaatacaa tcaggagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttg ttttgttcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttg gtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgc acacccagttccttaattcttgtgaaaccaaataccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtt tcttgttattgccttgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctga tgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgc ttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacc ccttatgccaatgctaacatttttagtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaa accattagaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatttttagagaaa aactagaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacagca 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cacaagttggttttcagctccttcaaa ttggaagcaattattggatggcgtgggcaactcccgtctcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctc atcattgtctatgttgctttaggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctgg atataagacagcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtccttcttcgatgcca gtgtcaatctttctgttacatgactaatcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgta caccgagtgggcggattctaaacagagtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttatta ctttggtatgaaaacaggcatcgacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgcc ttcacaataatacagcttttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattcc ggtcattgcagtttgcatctggttggaggttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctac tatatgctttttcacaaagtgagtcataactttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgt tttcattgcagcaatattacataccatcagcacgagaactggcacggctaaatgggacatgcaaagctccagtaata cagcactttgccgagacaatttcaggatcaagcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaag tatgaaattgatagacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgtttgg atatgttatctctgatcacttttgctttctctttaa 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Sec. con núm. de ident.: 30 (Intrón 1 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 30 (Intrón 1 of NtMRP3)

gtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcaggtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcag

Sec. con núm. de ident.: 31 (Intrón 2 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 31 (Intrón 2 de NtMRP3)

gtaagtcctttcatatatatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgattgacccatcctttaa ttgcag gtaagtcctttcatatatatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgattgacccatcctttaa ttgcag

Sec. con núm. de ident.: 32 (Intrón 3 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 32 (Intrón 3 of NtMRP3)

gtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatatagacttaactcatttaactatgatatttctct tcaggtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatagacttaactcatttaactatgatatttctct tcag

Sec. con núm. de ident.: 33 (Intrón 4 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 33 (Intrón 4 de NtMRP3)

gtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgacta atcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacaggtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgacta atcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacag

Sec. con núm. de ident.: 34 (Intrón 5 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 34 (Intrón 5 of NtMRP3)

gttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcata actttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcaggttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcata actttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcag

Sec. con núm. de ident.: 35 (Intrón 6 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 35 (Intrón 6 de NtMRP3)

gtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgt ttcttgatttacaggtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgt ttcttgatttacag

Sec. con núm. de ident.: 36 (Intrón 7 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 36 (Intrón 7 of NtMRP3)

gtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa taggtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa tag

Sec. con núm. de ident.: 37 (Intrón 8 de NtMRP3)Sec. With no. Identifier: 37 (Intrón 8 de NtMRP3)

gtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa actttgtttgatgttatgcttcaggtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa actttgtttgatgttatgcttcag

Sec. con núm. de ident.: 38 (Intrón 9 de NtMRP3)Sec. With no. Identity: 38 (Intrón 9 de NtMRP3)

gtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgc aggtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgc ag

Sec. con núm. de ident.: 39 (Intrón 10 de NtMRP3)Sec. With no. ID: 39 (Intrón 10 of NtMRP3)

gtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctg caggtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctg cag

Sec. con núm. de ident.: 40 (Exón 1 de NtMRP3)Sec. With no. Ident .: 40 (Exon 1 of NtMRP3)

AtggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgagAtggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgag

Sec. con núm. de ident.: 41 (Exón 2 de NtMRP3)Sec. With no. Ident .: 41 (Exon 2 of NtMRP3)

gagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgtttt gttcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttggtca gaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgcacac ccagttccttaattcttgtgaaaccaaataccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttctt gttattgccttgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctgatgtt gttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgcttca ggaacccctttaaatggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacccctta tgccaatgctaacatttttagtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccat tagaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatttttagagaaaaacta gaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacagcacggaa ggagatagtgttatcggctctcttcgtgcttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgatacct tagttcagtatctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgttgcaaag ttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggagggtatcgggcacgggcagcactggt ttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgtcagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaatt ttatgacagttgatgccgagaggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagtt gctctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgctacaataatagtgat gttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggagaaactcatggaatcgaaagatagaaggatga aggctacatctgaagtcttaaggaatatgagaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatc ttggacctcaggactacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtcttctg ggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatgggaatcccacttgaatctgggaaga gagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgtttt gttcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtatagaaatggttggtca gaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgctagcttggttgtcaatctctgttttcttgcacac ccagttccttaattcttgtgaaaccaaataccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttctt gttattgccttgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctgatgtt gttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgcttca ggaacccctttaaatggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacccctta tgccaatgctaacatttttagtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccat tagaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatttttagagaaaaacta gaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacagcacggaa ggagatagtgttatcggctctcttcgtgcttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgatacct tagttcagtatctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgttgcaaag ttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggagggtatcgggcac gggcagcactggt ttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgtcagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaatt ttatgacagttgatgccgagaggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagtt gctctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgctacaataatagtgat gttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggagaaactcatggaatcgaaagatagaaggatga aggctacatctgaagtcttaaggaatatgagaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatc ttggacctcaggactacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtcttctg ggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatgggaatcccacttgaatctgggaaga tattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagagcccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgct caaaccaaagtttctcttgatcgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagct tccaaaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatccacctcgactccac ttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgccatttgtggtacagttggttcaggaaaatca agcttactgtctagcattttaggagagatgcccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgt tgcacagtcgccctggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggagaagt atgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctcttttggcgatcaaacagaaataggg gagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagagaatacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgt ttacctatttgatgatccgttcagtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagttattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagagcccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgct caaaccaaagtttctcttgatcgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagct tccaaaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatccacctcgactccac ttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgccatttgtggtacagttggttcaggaaaatca agcttactgtctagcattttaggagagatgcccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgt tgcacagtcgccctggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggagaagt atgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctcttttggcgatcaaacagaaataggg gagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagagaatacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgt ttacctatttgatgatccgttcagtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagt

Sec. con núm. de ident.: 42 (Exón 3 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 42 (Exon 3 of NtMRP3)

gaatgtataatggggctattgaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcgga tttgatcttggaatgtataatggggctattgaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcgga tttgatcttg

Sec. con núm. de ident.: 43 (Exón 4 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 43 (Exon 4 of NtMRP3)

gtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatcttctcaaattaggtagtgacttcatggaact tgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatga ctggtgataatacaaatgtacagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttgga acaaagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttactggaaatatataac aactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaagttggttttcagctccttcaaattggaagca attattggatggcgtgggcaactcccgtctcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtc tatgttgctttaggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatataagac agcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtccttcttcgatgccacaccgagtg ggcggattctaaacagagtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatcttctcaaattaggtagtgacttcatggaact ctggtgataatacaaatgtacagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttgga tgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatga aactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaagttggttttcagctccttcaaattggaagca acaaagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttactggaaatatataac attattggatggcgtgggcaactcccgtctcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtc tatgttgctttaggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatataagac agcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtccttcttcgatgccacaccgagtg ggcggattctaaacaga

Sec. con núm. de ident.: 44 (Exón 5 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 44 (Exon 5 of NtMRP3)

gcatcgacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagct tttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtcattgcagtttgca tctggttggaggcatcgacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagct tttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtcattgcagtttgca tctggttggag

Sec. con núm. de ident.: 45 (Exón 6 de NtMRP3) Sec. With no. Ident .: 45 (Exon 6 of NtMRP3)

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Sec. con núm. de ident.: 46 (Exón 7 de NtMRP3) Sec. With no. Ident .: 46 (Exon 7 of NtMRP3)

gtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatg atggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcataga atccaacagaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaacataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatg atggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcataga atccaacagaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcag

Sec. con núm. de ident.: 47 (Exón 8 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 47 (Exon 8 of NtMRP3)

gtccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaagaagactggaat tgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaa taaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggat ccaactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag gtccgatatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaagaagactggaat tgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttccgcatagttgaaccagctgctggacaaa taaaaatagatggtatcagcatctcctcaattggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggat ccaactatgtttgagggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag

Sec. con núm. de ident.: 48 (Exón 9 de NtMRP3)Sec. With no. Ident .: 48 (Exon 9 of NtMRP3)

Sec. con núm. de ident.: 49 (Exón 10 de NtMRP3) Sec. With no. ID: 49 (Exon 10 of NtMRP3)

tatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggccgtgtgctactgaaaaagagc aaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgacactgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggct gcacttctctgattccacggttataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactat tagatcatgtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggccgtgtgctactgaaaaagagc aaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgacactgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggct gcacttctctgattccacggttataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactat tagatcatg

Sec. con núm. de ident.: 50 (Exón 11 de NtMRP3) Sec. With no. Ident .: 50 (Exon 11 of NtMRP3)

ggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattgtttgctaagctcgtggcagag tatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcagacatgtga ggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattgtttgctaagctcgtggcagag tatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcagacatgtga

Sec. con núm. de ident.: 51 (secuencia de ADNc de NtMRP3 como se predijo a partir de la secuencia del clon de BAC)Sec. With no. Ident .: 51 (NtMRP3 cDNA sequence as predicted from the BAC clone sequence)

atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggagggacaataatgctggc cacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgttttgt tcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtat agaaatggttggtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgcta gcttggttgtcaatctctgttttcttgcacacccagttccttaattcttgtgaaaccaaa taccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttcttgttattgcctt gttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacct gatgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaaca gagagtgaggagaatatgcttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatg gactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcaccccttatgccaatgctaacattttt agtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccatta gaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatt tttagagaaaaactagaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatg ctggtgaaggctttggttttcacagcacggaaggagatagtgttatcggctctcttcgtg cttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgataccttagttcagtat ctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgtt gcaaagttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggaggg tatcgggcacgggcagcactggtttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgt cagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaattttatgacagttgatgccgag aggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagttgct ctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgct acaataatagtgatgttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggag aaactcatggaatcgaaagatagaaggatgaaggctacatctgaagtcttaaggaatatg agaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatcttggacctcagg actacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtc ttctgggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatggga atcccacttgaatctgggaagatattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagag cccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgctcaaaccaaagtttctcttgat cgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagcttcca aaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatcc acctcgactccacttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgcc atttgtggtacagttggttcaggaaaatcaagcttactgtctagcattttaggagagatg 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cagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaattttatgacagttgatgccgag aggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagttgct ctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgct acaataatagtgatgttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggag aaactcatggaatcgaaagatagaaggatgaaggctacatctgaagtcttaaggaatatg agaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatcttggacctcagg actacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtc ttctgggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatggga atcccacttgaatctgggaagatattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagag cccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgctcaaaccaaagtttctcttgat cgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagcttcca aaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatcc acctcgactccacttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgcc atttgtggtacagttggttcaggaaaatcaagcttactgtctagcattttaggagagatg cccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgtt gcacagtcgccc tggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggag aagtatgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctctttt ggcgatcaaacagaaataggggagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagaga atacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgtttacctatttgatgatccgttc agtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagtgaatgtataatggggctattg aattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcggatttg atcttggtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatcttctcaaa ttaggtagtgacttcatggaacttgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgac acagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatgactggtgataatacaaatgta cagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttggaaca aagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttac tggaaatatataacaactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaa gttggttttcagctccttcaaattggaagcaattattggatggcgtgggcaactcccgtc tcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtctatgttgcttta ggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatat aagacagcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtcc ttcttcgatgc cacaccgagtgggcggattctaaacagagcatcgacagatcaaagtgca attgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagctttta gggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtc attgcagtttgcatctggttggagcaatattacataccatcagcacgagaactggcacgg ctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgccgagacaatttcaggatca agcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattgata gacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgt ttggatatgttatctctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcct gttggaacaattgacccaagtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaac ataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatgatggaaaataaaattatttctgtt gaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcatagaatccaac agaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtccga tatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaag

aagactggaattgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttc aagactggaattgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttc

cgcatagttgaaccagctgctggacaaataaaaatagatggtatcagcatctcctcaatt ggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggatccaactatgtttgag ggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag gcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattct acagtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggc cgtgtgctactgaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgac actgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggctgcacttctctgattccacggtt ataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactattagat catgggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattg tttgctaagctcgtggcagagtatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcacgcatagttgaaccagctgctggacaaataaaaatagatggtatcagcatctcctcaatt ggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggatccaactatgtttgag ggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag gcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattct acagtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggc cgtgtgctactgaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgac actgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggctgcacttctctgattccacggtt ataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactattagat catgggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattg tttgctaagctcgtggcagagtatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttca

gacatgtgagacatgtga

Sec. con núm. de ident.: 52 (secuencia de proteína de NtMRP3; 5'-3'; - denota el codón de parada putativo) Sec. With no. Ident .: 52 (protein sequence of NtMRP3; 5'-3 '; - denotes the putative stop codon)

MEIAKGMSVFQSLRRDNNAGHKQSSTRNARFLYYKSTLFCSIGLAIFSFVLCLLAHFYWY RNGWSEEKIITLLDFALKLLAWLSISVFLHTQFLNSCETKYPLVLRVWWGLFFFVSCYCL VIDLVYGEKNQSLPTQFCIPDVVFTLMGLFFCFVGFIVKTESEENMLQEPLLNGSVANGM DSKKSTGDQTVTPYANANIFSLFTFSWMGPLISVGNKKPLDLEDVPQLHFDDSVKGSFPI FREKLESVGGGNSNRVTTFMLVKALVFTARKEIVLSALFVLLYALASFVGPYLIDTLVQY LNGKRDFDNEGYVLVAAFFVAKLVECLAQRHWFFKVQQGGYRARAALVSKIYNKGLTLSC QSKQSHTSGEIINFMTVDAERIGDFGWYMHDPWMVIIQVALALVILYKNLGLAAIAAFVA TIIVMLANIPLGSLQEKFQEKLMESKDRRMKATSEVLRNMRILKLQAWEMKFLSRILDLR TTEAGWLMKYVYTSAMTTFVFWVAPTFVSVTTFGAAMLMGIPLESGKILSALATFRILQE PIYNLPDTISMIAQTKVSLDRIASFLSLDDLQPDVIEKLPKGSSDEAIEIVGGNFAWDAS TSTPLLKDVNLRVLNGMRVAICGTVGSGKSSLLSSILGEMPKLSGTIKLSGTKAYVAQSP WIQSGKIEENILFGKEMQREKYDKVLEACSLKKDLEILSFGDQTEIGERGINLSGGQKQR IQIARALYQDADVYLFDDPFSAVDAHTGSHLFSECIMGLLNSKTVLYVTHQVEFLPAADL ILVMKDGRISETGKYNDLLKLGSDFMELVGAHQEALTAIDTVKGEALRKSEEMTGDNTNV QKDKNISDGQNGKVDDIVGTKGQIVQEEEREKGSVGFSVYWKYITTAYGGALVPFMLLAQ VGFQLLQIGSNYWMAWATPVSKSEPPPVGSSTLIIVYVALGIASALCILARTMFLVTAGY KTASLLFHKMHLCIFRAPMSFFDATPSGRILNRASTDQSAIDLNVPIQVGSFAFTIIQLL GIIGVMSQVAWQVFIVFIPVIAVCIWLEQYYIPSARELARLNGTCKAPVIQHFAETISGS STIRSFDQESRFQDTSMKLIDNYSRPKFHIAAAMEWLCLRLDMLSLITFAFSLIFLISLP VGTIDPSVAGLAVTYGLNLNIIQARVVWNLCMMENKIISVERILQYTALPSESPLIIESN RPDPNWPSCGEVDFSNLQVRYAPHMPLVLRGLTCTFFGGKKTGIVGRTGSGKSTLIQTLF RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIIPQDPTMFEGTVRSNLDPLEEYSDEQIWE ALDKCQLGEEVRKKEGKLYSTVSENGENWSVGQRQLVCLGRVLLKKSKVLVLDEATASVD TATDNLIQQTLRLHFSDSTVITIAHRITSVLDSDMVLLLDHGLIAEYGTPARLLENESSL FAKLVAEYSMRSNSSFENVSDM MEIAKGMSVFQSLRRDNNAGHKQSSTRNARFLYYKSTLFCSIGLAIFSFVLCLLAHFYWY RNGWSEEKIITLLDFALKLLAWLSISVFLHTQFLNSCETKYPLVLRVWWGLFFFVSCYCL VIDLVYGEKNQSLPTQFCIPDVVFTLMGLFFCFVGFIVKTESEENMLQEPLLNGSVANGM DSKKSTGDQTVTPYANANIFSLFTFSWMGPLISVGNKKPLDLEDVPQLHFDDSVKGSFPI FREKLESVGGGNSNRVTTFMLVKALVFTARKEIVLSALFVLLYALASFVGPYLIDTLVQY LNGKRDFDNEGYVLVAAFFVAKLVECLAQRHWFFKVQQGGYRARAALVSKIYNKGLTLSC QSKQSHTSGEIINFMTVDAERIGDFGWYMHDPWMVIIQVALALVILYKNLGLAAIAAFVA TIIVMLANIPLGSLQEKFQEKLMESKDRRMKATSEVLRNMRILKLQAWEMKFLSRILDLR TTEAGWLMKYVYTSAMTTFVFWVAPTFVSVTTFGAAMLMGIPLESGKILSALATFRILQE PIYNLPDTISMIAQTKVSLDRIASFLSLDDLQPDVIEKLPKGSSDEAIEIVGGNFAWDAS TSTPLLKDVNLRVLNGMRVAICGTVGSGKSSLLSSILGEMPKLSGTIKLSGTKAYVAQSP WIQSGKIEENILFGKEMQREKYDKVLEACSLKKDLEILSFGDQTEIGERGINLSGGQKQR IQIARALYQDADVYLFDDPFSAVDAHTGSHLFSECIMGLLNSKTVLYVTHQVEFLPAADL ILVMKDGRISETGKYNDLLKLGSDFMELVGAHQEALTAIDTVKGEALRKSEEMTGDNTNV QKDKNISDGQNGKVDDIVGTKGQIVQEEEREKGSVGFSVYWKYITTAYGGALVPFMLLAQ VGFQLLQIGSNYWMAWATPVSKSEPPPVGSSTLIIVYVALGIASALCILARTMFLVTAGY KTASLLFHKMHLCIFRAPMSFFDA TPSGRILNRASTDQSAIDLNVPIQVGSFAFTIIQLL GIIGVMSQVAWQVFIVFIPVIAVCIWLEQYYIPSARELARLNGTCKAPVIQHFAETISGS STIRSFDQESRFQDTSMKLIDNYSRPKFHIAAAMEWLCLRLDMLSLITFAFSLIFLISLP VGTIDPSVAGLAVTYGLNLNIIQARVVWNLCMMENKIISVERILQYTALPSESPLIIESN RPDPNWPSCGEVDFSNLQVRYAPHMPLVLRGLTCTFFGGKKTGIVGRTGSGKSTLIQTLF RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIIPQDPTMFEGTVRSNLDPLEEYSDEQIWE ALDKCQLGEEVRKKEGKLYSTVSENGENWSVGQRQLVCLGRVLLKKSKVLVLDEATASVD TATDNLIQQTLRLHFSDSTVITIAHRITSVLDSDMVLLLDHGLIAEYGTPARLLENESSL FAKLVAEYSMRSNSSFENVSDM

Claims (6)

REIVINDICACIONES 1. Un vector de expresión para inhibir la traducción de ARNm de NtMRP4 cuando se expresa en una planta de tabaco, que comprende un promotor unido operativamente a:An expression vector for inhibiting translation of NtMRP4 mRNA when expressed in a tobacco plant, comprising a promoter operably linked to: (a) un polinucleótido, la secuencia del polinucleótido que consiste de cualquiera de secs. con núms. de ident.: 13­ 23 o 53, ubicadas en orientación antisentido con respecto al promotor; o(a) a polynucleotide, the polynucleotide sequence consisting of any of secs. with numbers Ident .: 13 23 or 53, located in antisense orientation with respect to the promoter; or (b) un constructo de polinucleótidos de 15 a 100 nucleótidos de longitud que es al menos 80 % idéntico a una región de sec. con núm. de ident.: 1, ubicado en orientación antisentido con respecto al promotor; o(b) a polynucleotide construct of 15 to 100 nucleotides in length that is at least 80% identical to a region of sec. with no. Ident .: 1, located in antisense orientation with respect to the promoter; or (c) un polinucleótido que codifica un polinucleótido de ARNi capaz de autoaparearse para formar una estructura de horquilla que comprende:(c) a polynucleotide encoding an RNAi polynucleotide capable of autopairing to form a hairpin structure comprising: una primera secuencia de 15 a 300 nucleótidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1;a first sequence of 15 to 300 nucleotides having at least 80% sequence identity with sec. with no. of ident .: 1; una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura en horquilla; ya second sequence encoding a spacer element that forms a loop of the fork structure; Y una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.a third sequence having an inverse complementary sequence of the first sequence, located in the same orientation as the first sequence, wherein the second sequence is located between the first sequence and the third, and the second sequence is operatively linked to the first sequence and the third sequence. 2. Una planta de tabaco transgénico o una planta de tabaco que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la inducción del vector de expresión da como resultado la expresión de un polinucleótido de ARNi de NtMRP4 y una reducción en la concentración de cadmio de al menos 5 % en al menos una parte de la planta transgénica en comparación con una planta control en la cual la expresión o actividad del gen NtMRP4 y/o la actividad de la proteína codificada de esta manera no se ha reducido.2. A transgenic tobacco plant or a tobacco plant comprising an expression vector according to claim 1, wherein induction of the expression vector results in the expression of an NtMRP4 RNAi polynucleotide and a reduction in the a cadmium concentration of at least 5% in at least a part of the transgenic plant compared to a control plant in which the expression or activity of the NtMRP4 gene and / or the activity of the protein encoded in this manner has not been reduced. 3. Material de planta de tabaco, lo que incluye biomasa, semilla u hojas, que comprende células o tejido de la planta de conformidad con la reivindicación 2 que comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1.3. Tobacco plant material, including biomass, seed or leaves, comprising cells or tissue of the plant according to claim 2 comprising an expression vector according to claim 1. 4. Un producto de tabaco que comprende material vegetal de conformidad con la reivindicación 3 o una parte de la planta de la reivindicación 2 que comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1.4. A tobacco product comprising plant material according to claim 3 or a part of the plant of claim 2 comprising an expression vector according to claim 1. 5. Un método para reducir los niveles de cadmio en al menos una parte de una planta de tabaco que comprende la etapa de inducir la expresión del ARN de interferencia de NtMRP4 a partir de un polinucleótido transgénico seleccionado del grupo que consiste en:A method for reducing cadmium levels in at least a portion of a tobacco plant comprising the step of inducing expression of the interfering RNA of NtMRP4 from a transgenic polynucleotide selected from the group consisting of: (i) un polinucleótido, la secuencia del polinucleótido que consiste de cualquiera de secs. con núms. de ident.: 13­ 23 o 53; o(i) a polynucleotide, the polynucleotide sequence consisting of any of secs. with numbers Ident .: 13 23 or 53; or (ii) un constructo de polinucleótido de 15 a 100 nucleótidos de longitud que es al menos 80 % idéntico a una región de sec. con núm. de ident.: 1; o(ii) a polynucleotide construct of 15 to 100 nucleotides in length that is at least 80% identical to a region of sec. with no. of ident .: 1; or (iii) un polinucleótido que codifica un polinucleótido de ARNi capaz de autoaparearse para formar una estructura de horquilla que comprende:(iii) a polynucleotide encoding an RNAi polynucleotide capable of autopairing to form a hairpin structure comprising: una primera secuencia de 15 a 300 nucleótidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1;a first sequence of 15 to 300 nucleotides having at least 80% sequence identity with sec. with no. of ident .: 1; una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura en horquilla; ya second sequence encoding a spacer element that forms a loop of the fork structure; Y una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia,a third sequence having an inverse complementary sequence of the first sequence, located in the same orientation as the first sequence, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.wherein the second sequence is located between the first sequence and the third sequence, and the second sequence is operatively linked to the first sequence and the third sequence. 6. Un polinucleótido de ARNi de NtMRP4 capaz de autoaparearse para formar una estructura en horquilla que comprende:6. An NtMRP4 RNAi polynucleotide capable of autopairing to form a hairpin structure comprising: una primera secuencia de 15 a 300 nucleótidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con sec. con núm. de ident.: 1;a first sequence of 15 to 300 nucleotides having at least 80% sequence identity with sec. with no. of ident .: 1; una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura en horquilla; ya second sequence encoding a spacer element that forms a loop of the fork structure; Y una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia,a third sequence having an inverse complementary sequence of the first sequence, located in the same orientation as the first sequence, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia. wherein the second sequence is located between the first sequence and the third sequence, and the second sequence is operatively linked to the first sequence and the third sequence.
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