ES2695579T3 - Matriz de regeneración de tejido - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para preparar una matriz de tejido adecuada para una reparación regenerativa de tejido blando, que comprende: poner en contacto una porción aislada de tejido conectivo con un tensioactivo, poner en contacto el tejido conectivo con un desinfectante, reduciendo al menos uno de proteoglicanos, lípidos, fosfolípidos, ácidos nucleicos y antígenos de complejo principal de histocompatibilidad (CPH) que inhiben la infiltración y la fijación celulares, y deshidratando la matriz resultante de tejido para su almacenamiento, y que comprende, además, reducir el contenido de proteoglicanos del tejido conectivo en un intervalo de 30% hasta un 50%, de forma que la matriz de tejido contenga un 50% hasta un 70% de proteoglicanos extraíbles.

Description

DESCRIPCION

Matriz de regeneracion de tejido

Declaracion en relacion con la investigacion y el desarrollo patrocinados federalmente

No aplicable.

Antecedentes de la invencion

Campo de la invencion

La presente invencion versa, en general, acerca del campo de matrices de tejido para una reparacion regenerativa. Mas en particular, la presente invencion versa acerca de procedimientos para procesar tejidos para su uso en una reparacion regenerativa de defectos de tejido blando y las matrices resultantes de tejido segun se divulga en las reivindicaciones 1 y 10.

Descripcion de la tecnica relacionada

Cuando se produce un dano al tejido blando, se inicia una respuesta inflamatoria y se destinan celulas y factores moleculares al sitio de la lesion para comenzar el procedimiento de curacion. Para que se produzca la curacion, estas celulas deben poder infiltrar y proliferar en el area herida.

La proliferacion celular en tejidos es controlada por agentes tanto positivos como negativos presentes en ese tejido. Los agentes positivos estan presentes en el tejido para estimular una proliferacion (agentes mitogenicos) y una diferenciacion celulares (agentes morfogenicos). Hay presentes agentes negativos en el tejido para detener la proliferacion celular y/o la diferenciacion celular. Es este enfoque sensible y equilibrado para regular la actividad celular en tejidos que representa lo que, en ciertos casos, es una lfnea delgada entre un estado no neoplasico y uno neoplasico, o canceroso. La medicina regenerativa se ha convertido en una estrategia importante que implica el uso de materiales biologicos en la reparacion de patologfas tisulares cuando la expectativa de los aspectos regenerativos de la reparacion es reducir las cantidades de formacion de tejido cicatrizante fibroso que puede cerrar la patologfa, pero no participar adicionalmente en la funcion del tejido que esta siendo regenerado. Por ejemplo, la patente US n° 7.851.447 describe un procedimiento para una reparacion nervosa que comprende una o mas enzimas degradantes del sulfato de condroitina proteoglicano (SCPG) (por ejemplo, condroitinasa ABC) que fomentan una penetracion axonal en el tejido nervioso danado.

El documento WO02/43778 da a conocer un procedimiento para la preparacion de un tejido bioprotesico. El procedimiento incluye la eliminacion de sitios de union por fosfolfpidos contenidos en un tejido biologico, de forma que se evite o inhiba que los agentes infecciosos u otras sustancias no deseadas se unan al tejido. El procedimiento comprende poner en contacto un tejido bioprotesico con un tensioactivo (por ejemplo, Tween 80) al igual que un agente desnaturante, tal como una preparacion de disolvente protico (por ejemplo, etanol e isopropanol) que tiene una afinidad de union hacia el agente infeccioso. Preferentemente, todos los fosfolfpidos en un tejido son esencialmente eliminados. Dado que hay presentes proteoglicanos en los sitios de union de agente infeccioso, el procedimiento elimina los sitios de union que tienen tanto una protefna como un componente de polisacarido, tal como proteoglicano.

El documento US 2003/0087428 da a conocer un procedimiento para producir implantes de tejido blando acelular. El procedimiento incluye extraer una muestra de tejido blando con una solucion que comprende detergentes no ionicos para producir tejido extrafdo, tratar el tejido extrafdo con una solucion que comprende detergentes anionicos, lavar el tejido tratado con una solucion descontaminante para producir el injerto de tejido blando acelular; y almacenar el injerto de tejido blando acelular en una solucion de almacenamiento que comprende agentes descontaminantes. Ademas, las patentes U.S. nos 7.008.763, 7.736.845 y 7.687.230 describen procedimientos para el tratamiento de tejidos conectivos colagenosos, siendo el objetivo de ese tejido que sea “rehabitado” o “recolonizado” por celulas anfitrionas sin un rechazo inmunologico y una reaccion inflamatoria. Describen un tejido empapado a temperaturas frfas con poliglicol, sal, peroxido de hidrogeno y tampon fosfato con el objetivo de permitir que sustancias molidas se disocien de forma que las fibras de colageno permanezcan estables. Como segunda solucion de procesamiento, los tejidos son empapados en una solucion de alcohol y de agua y/o en soluciones que comprenden agentes antiinflamatorios y antitrombogenicos.

Como otro ejemplo, muchos ataques cardfacos son el resultado de vasculatura ocluida y el dano isquemico resultante a los cardiomiocitos que comprenden el componente contractil del corazon. Los esfuerzos por reparar este dano isquemico han sido variados, tales como esfuerzos que implican la siembra de celulas en las areas danadas isquemicamente con el objetivo de restaurar los cardiomiocitos funcionales. Por ejemplo, la patente U.S. n° 6.953.466 describe procedimientos para la administracion de implantes terapeuticos a tejidos, incluyendo los agentes terapeuticos un factor de crecimiento endotelial vascular, un factor de crecimiento de fibroblastos, un factor de crecimiento derivado de plaquetas y angiopoyetinas. En este procedimiento particular, los agentes terapeuticos son administrados mediante un cateter alargado y depositando el vehfculo y el agente terapeutico en el tejido. En la patente U.S. n° 6.749.617 se describe un procedimiento similar; sin embargo, el procedimiento descrito en esta patente incluye el uso de un vehfculo solido o liquido de los agentes terapeuticos y los agentes terapeuticos incluyen celulas. En este procedimiento particular, el vehfculo constituye un soporte para las celulas que se moveran desde ese soporte al tejido que esta siendo reparado. En la patente U.S. n° 7.686.799 se describe un procedimiento para la administracion de materiales celulares al musculo cardfaco, en el que se despliegan los materiales celulares directamente en la pared del musculo cardfaco. La patente U.S. n° 7.892.829 describe especfficamente una regeneracion del musculo cardfaco utilizando celulas madre mesenquimales. Estas celulas madre pueden ser administradas como un liquido inyectable o como una preparacion de celulas en una matriz que es un solido o semisolido, o llega a serlo.

Estos esfuerzos por reparar el musculo cardfaco danado implican el uso de vehfculos lfquidos o solidos de agentes terapeuticos y aunque estos agentes terapeuticos pueden incluir celulas; estos esfuerzos no dependen del uso de un procedimiento para preparar el musculo cardfaco danado para que reciba celulas mediante un mecanismo de recrecimiento natural en el que se han eliminado o modificado los restos celulares muertos del dano isquemico al corazon de alguna forma para exponer restos moleculares que normalmente estan presentes en una matriz colagenosa o en una matriz de tejido. El resultado ha sido, principalmente, la formacion de tejido cicatrizante (un procedimiento de reparacion), no la formacion de musculo cardfaco funcional (un procedimiento de regeneracion). Las tecnologfas disponibles en la actualidad no llegan a abordar la presencia de agentes en el miocardio danado que actuaran de una forma negativa hacia las celulas que son anadidas, de forma que las celulas sean dirigidas en un sistema de reparacion que da lugar a una formacion de tejido cicatrizante en vez de un sistema regenerativo que da lugar a la restauracion de tejido muscular cardfaco funcional.

Existe un acervo considerable de bibliograffa y de patentes pertinente a una eliminacion de celulas de tejidos que han de ser utilizados clfnicamente y mucho de este material se encuentra en una amplia categorfa de descelularizacion de tejidos o de producir tejidos acelulares y/o avitales (que carecen de una poblacion celular vital). De hecho, una de las primeras patentes que describen un procedimiento para la descelularizacion de tejidos fue de Brendel y Duhamel (patente U.S. n° 4.801.299) que implicaba el uso de detergentes no ionicos, soluciones hipotonicas, detergentes anionicos, enzimas DNasa y RNasa e inhibidores de proteasas para la eliminacion de celulas de tejidos. Veanse tambien las patentes U.S. nos 4.539.716; 4.546.500; 4.835.102; 4.776.853; 5.558.875; 5.843.181; 4.776.853; y 5.843.180 para ejemplos de distintas estrategias para la descelularizacion de tejidos. La mayorfa de estas estrategias de descelularizacion se centraban en la produccion de tejidos descelularizados en los que el exito quedo en evidencia por la falta de restos celulares visibles en preparaciones histologicas. De hecho, las patentes U.S. nos 5.613.982; 5.632.778; 5.843.182; y 5.899.936 reivindicaron unicamente una reduccion parcial en acidos nucleicos extrafbles en tejidos descelularizados con poca evidencia de otros cambios en composiciones de lfpidos, fosfolfpidos y/o proteoglicanos. Se describio que tales tejidos se habfan recelularizado tras su implantacion en un paciente; sin embargo, los resultados iniciales indicaron una calcificacion considerable de los tejidos sin indicar la causa o acciones correctivas necesarias con este procedimiento para descelularizar tejidos.

De forma similar, las patentes U.S. nos 6.743.574, 6.432.712 y 7.179.287 describieron metodologfas de descelularizacion que implicaban la eliminacion de restos celulares hasta un nivel en el que la evidencia histologica de celulas no era visible en preparaciones histologicas. Desde entonces, los injertos de parche pulmonar procesados segun la patente U.S. n° 6.743.574 han recibido aprobacion por una notificacion a la FDA previa a la comercializacion, y se ha mostrado que tales tejidos se recelularizan in situ con poca indicacion de complicaciones patologicas. Por lo tanto, se ha identificado provisionalmente un procesamiento especffico de tejidos para eliminar elementos celulares de tejidos que proporciona tejidos adecuados para reparar defectos de tejido blando. Sin embargo, hasta la fecha no se han producido tales tejidos que contribuyan a una regeneracion de tejidos blandos para producir materiales tisulares que sean funcionalmente equivalentes al tejido nativo en el que son implantados.

Una serie de patentes U.S. (patentes U.S. nos 6.576.265; 6.893.666; 6.890.564; 6.890.563; 6.890.562; 6.887.495; 6.869.619; 6.861.074; 6.852.339; y 6.849.273) describen un procedimiento para producir un tejido conectivo desvitalizado para ser utilizado en una reparacion y una regeneracion de tejido. Sin embargo, solo se describe que el procedimiento utilizado para producir este tejido desvitalizado, en general, implica el uso de solucion salina hipotonica y peroxidos. Ademas, no es suficiente simplemente descelularizar un tejido, ni es suficiente simplemente anadir agentes a un tejido procesado que actuen de una forma positiva para estimular la proliferacion y la diferenciacion celular.

Por lo tanto, el campo de medicina regenerativa sigue teniendo la necesidad de un tejido que sea eficaz en la regeneracion, mas que en la reparacion, de tejidos blandos danados, y procedimientos de creacion del mismo. No es suficiente solo descelularizar un tejido, ni es suficiente solo anadir agentes a un tejido procesado que actua de forma positiva para estimular la proliferacion y la diferenciacion celulares.

Sumario de la invencion

La presente invencion esta dirigida a un procedimiento para la preparacion de una matriz de tejido que sea adecuada para una reparacion regenerativa de tejido blando, al igual que esta dirigida a tal matriz de tejido y kits para la misma, segun se describe en las reivindicaciones. La presente invencion esta dirigida a un procedimiento para la preparacion de una matriz de tejido adecuada para una reparacion regenerativa de tejidos que incluye etapas de aislar una porcion de tejido conectivo para ser utilizada como la matriz de tejido, y poner en contacto el tejido conectivo con un tensioactivo y con un desinfectante. Esto tiene como resultado la reduccion de los niveles de al menos uno de proteoglicanos, lfpidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos, antfgenos de complejos principales de histocompatibilidad (CPH) (por ejemplo, CPH I o CPH II), microorganismos contaminantes y endotoxinas medidas. Aunque muchos de estos elementos estan reducidos significativamente, tal como, en general, hasta un 90% o 99%, en general se retiene una cantidad sustancial de proteoglicanos extrafbles, tal como un 70% de proteoglicanos extrafble. El procedimiento tiene como resultado la produccion de una matriz de tejido que facilita la recelularizacion y la reparacion regenerativa en aplicaciones in vitro e in vivo.

En algunas realizaciones, el procedimiento tambien incluye poner en contacto el tejido conectivo con una condroitinasa, un alcohol, una endonucleasa y/o una lipasa para reducir adicionalmente ciertos agentes inhibidores de la matriz de tejido conectivo. Ademas, el procedimiento puede incluir deshidratar y/o liofilizar la matriz de tejido resultante para su almacenamiento y/o transporte.

En al menos una realizacion, el procedimiento de la presente invencion incluye poner en contacto una porcion aislada de tejido conectivo con una o mas soluciones con capacidad para reducir los fosfolfpidos, lfpidos, proteoglicanos, acidos nucleicos, antfgenos de complejos principales de histocompatibilidad (CPH) I y II, microorganismos contaminantes y endotoxinas. La matriz resultante de tejido retiene senales moleculares apropiadas a la recelularizacion en aplicaciones in vitro e in vivo.

La presente invencion tambien esta dirigida a una matriz de tejido producida por el presente procedimiento. La matriz de tejido de la presente invencion es adecuada para ser utilizada en una reparacion regenerativa de tejido blando. Tal matriz de tejido incluye una porcion de soporte estructurada para proporcionar una forma a la matriz de tejido, y puede estar fabricada de proteoglicanos estructurales y tiene una estructura colagenosa. La matriz de tejido tambien incluye una porcion no estructural dispuesta en una relacion intercalada en al menos una porcion de la porcion de soporte o estructural, y que puede incluir proteoglicanos no estructurales. Las diversas porciones de la matriz de tejido estan estructuradas colectivamente para fomentar la infiltracion, la fijacion y la proliferacion celulares de celulas anfitrionas en la matriz tras una implantacion o un transplante tisular en un anfitrion. Por ejemplo, la matriz de tejido tiene niveles reducidos de fosfolfpidos, lfpidos, acidos nucleicos, antfgenos de complejos principales de histocompatibilidad (CPH) I y II, microorganismos contaminantes y endotoxinas, y, en cierta medida, proteoglicanos y, en algunas realizaciones, es al menos parcialmente acelularizada.

La presente invencion tambien esta dirigida a kits para una reparacion regenerativa de tejido blando que tienen al menos una matriz de tejido segun se describe en la presente memoria para su implantacion o uso, al igual que a kits para procesar tejido conectivo para producir una matriz resultante de tejido adecuada para una reparacion regenerativa de tejido blando, incluyendo, al menos, una cantidad de tensioactivo y una cantidad de desinfectante.

Los procedimientos, matrices de tejido y kits descritos en la presente memoria pueden ser utilizados en conexion con aplicaciones farmaceuticas, medicas y veterinarias, al igual que metodologfas e investigaciones cientfficas fundamentales, segun serfa identificable por un experto tras la lectura de la presente divulgacion.

Breve descripcion de los dibujos

Para una comprension mas completa de la naturaleza de la presente invencion, se deberfa hacer referencia a la siguiente descripcion detallada tomada junto con las figuras adjuntas, en las que:

La Figura 1 muestra una fijacion y una proliferacion de celulas L-929 en la matriz dermica procesada a partir del donante UPS9571. Cuando fueron colocadas en placas a una densidad reducida (1000 celulas/muestra), las celulas L929 apenas fueron detectables en un instante temprano (datos no mostrados), pero formaron una buena capa de celula en ambos lados de las muestras tras 36 dfas (A, B, C, D). B y D: lado de la membrana fundamental. Barras de escala: 100 pm.

La Figura 2 muestra la fijacion de celulas L-929 en la matriz dermica procesada a partir del donante UPS9238. Cuando fueron colocadas en placas a una mayor densidad (200000 celulas/muestra), las celulas L-929 fueron facilmente observables tan solo 2 dfas despues de la colocacion en placas (A, B) y formaron una capa gruesa de celulas el dfa 5 (C, D). El dfa 22, fue observable (E, F, G, H) la infiltracion de celulas en el tejido. Barras de escala: 100 pm.

La Figura 3 muestra una fijacion de celulas MIAMI patentadas en la dermis de matriz dermica procesada a partir del donante UIN 9611. Cuando fueron colocadas en placas con una densidad reducida (10000 celulas/muestra), las celulas MIAMI fueron observables 35 dfas despues de la colocacion en placas (flechas negras A, B, C) tanto en la superficie como en el interior de la matriz dermica. Barras de escala: 100 pm.

La Figura 4 muestra ADN extrafdo de la matriz dermica y cuantificado, comparando la matriz dermica tratada con el procedimiento de la presente invencion y un control no tratado. Se extrajo significativamente menos ADN de la matriz dermica tratada, indicando que el procedimiento de la presente invencion es eficaz en la reduccion de acidos nucleicos en la matriz.

La Figura 5 muestra una curva de calibracion de la senal de fluorescencia relacionada con el numero de celulas viables.

La Figura 6 muestra la valoracion de toxicidad de tejido de banda iliotibial.

La Figura 7 muestra la morfologfa de la celula L-929 al final de un ensayo de inhibicion celular. Se hace notar que las celulas de control colocadas en placas a 20000 celulas por centfmetro cubico el dfa 1 fueron demasiado confluentes el dfa 3 (E). Barras de escala: 100 pm.

La Figura 8 muestra la biocompatibilidad de matriz dermica micronizada sembrada con celulas L-929, lo que indica una proliferacion celular con el paso del tiempo.

La Figura 9 muestra una curva de calibracion de la senal de fluorescencia relacionada con el numero de celulas L-929 viables sembradas en la matriz dermica micronizada, lo que indica que estas celulas siguen siendo viables. La Figura 10 muestra la morfologfa de la celula L-929 durante el ensayo de biocompatibilidad el dfa 10. Las celulas parecfan sanas y agregadas en la superficie de la dermis micronizada (A-C). Detalle a 200X (B). Control negativo: dermis micronizada UMTB 25-300 pm (D).

La Figura 11 muestra la morfologfa de la celula L-929 durante el ensayo de biocompatibilidad el dfa 16. Las celulas parecfan sanas y agregadas en la superficie de la dermis micronizada (A-C). Control negativo: dermis micronizada UMTB 25-300 pm (D).

La Figura 12 muestra la morfologfa de la celula L-929 durante el ensayo de biocompatibilidad el dfa 30. Las celulas parecfan sanas y agregadas en la superficie de la dermis micronizada (A-C). Control negativo: dermis micronizada UMTB 25-300 pm (D).

La Figura 13 muestra la cicatrizacion de una herida en un primer paciente utilizando un injerto de matriz dermica. El dfa 0 (A), se coloco un injerto de matriz dermica de 4x4 cm en la herida. El dfa 12 (B), se observa el desarrollo del tejido de granulacion por debajo de la pomada antibiotica, segun se indica mediante la flecha. El dfa 40 (C), el tejido herido se ha regenerado casi por completo.

La Figura 14 muestra la cicatrizacion de una herida en un segundo paciente utilizando un injerto de matriz dermica. El panel A muestra un injerto de herida dehiscente posterior a la radiacion el dfa 1. El panel B muestra el dfa 2 posterior a la colocacion del injerto. El panel C muestra el dfa 30 posterior a la colocacion del injerto, cuando el tejido herido se ha regenerado casi por completo.

Descripcion detallada

La presente invencion esta dirigida a procedimientos para el tratamiento de tejido conectivo para preparar una matriz de tejido adecuada para ser utilizada en una reparacion regenerativa de tejido blando, al igual que tal matriz de tejido y kits para la misma.

A no ser que se defina lo contrario, se concibe que todos los terminos de la tecnica, las anotaciones y otros terminos o terminologfa cientfficos utilizados en la presente memoria tengan los significados entendidos normalmente por los expertos en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. En algunos casos, los terminos con significados entendidos habitualmente se definen en la presente memoria en aras de la claridad y/o para una referencia inmediata, y no se deberfa interpretar necesariamente que la inclusion de tales definiciones en la presente memoria represente una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la tecnica. Se comprendera, ademas, que se deberfa interpretar que los terminos, tales como los definidos en los diccionarios utilizados habitualmente, tienen un significado que es coherente con su significado en el contexto de la tecnica relevante y/o segun se definen de otra manera en la presente memoria.

La terminologfa utilizada en la presente memoria unicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares y no se concibe que sea limitante de la invencion. Segun se utilizan en la presente memoria, se deberfa entender que los artfculos indefinidos “un”, “una”, “el” y “la” incluyen una referencia plural a no ser que el contexto indique claramente lo contrario.

Segun se utiliza en la presente memoria, se deberfa entender que la frase “y/o” significa “cualquiera o ambos” de los elementos asf unidos, es decir, los elementos que estan presentes de forma unida en algunos casos y presentes de forma no unida en otros casos.

Se deberfa entender que, segun se utiliza en la presente memoria, “o” tiene el mismo significado que “y/o”, segun se ha definido anteriormente. Por ejemplo, cuando se separa una lista de elementos, se deberfa interpretar que “y/o” u “o” es incluyente —es decir, la inclusion de al menos uno de un numero de elementos—, pero que tambien incluye mas de uno, y, opcionalmente, elementos no enumerados adicionales. Solo las expresiones que indiquen claramente lo contrario, tales como “unicamente uno de” o “exactamente uno de” o, cuando se utilice en las reivindicaciones, “que consiste en”, haran referencia a la inclusion de exactamente un elemento de un numero o una lista de elementos. En general, solo se interpretara que el termino “o”, segun se utiliza en la presente memoria, indica alternativas excluyentes (es decir, “uno u otro, pero no ambos”) cuando sea precedido por expresiones de exclusividad, tales como “cualquiera”, “uno de”, “unicamente uno de” o “exactamente uno de”.

Segun se utilizan en la presente memoria, se concibe que los terminos “incluyendo”, “incluye”, “teniendo”, “tiene”, “con” o variantes de los mismos, sean incluyentes, de forma similar al termino “comprendiendo”.

Como comprenderan los expertos en la tecnica, los procedimientos, las matrices de tejido y los kits de la presente invencion son aplicables a la reparacion regenerativa de tejidos.

La presente invencion esta dirigida a un procedimiento para preparar una matriz de tejido adecuada para una reparacion regenerativa de tejido blando. En al menos una realizacion, el procedimiento incluye el aislamiento de una porcion de tejido conectivo para ser utilizado como la matriz de tejido. Se puede utilizar cualquier tejido conectivo apropiado, tal como, sin limitacion, la dermis, la fascia, la piel, el pericardio, el periostio, un tendon, un ligamento, la dura, el epiplon, cartflago y combinaciones de los mismos. El tejido conectivo puede ser alogeno, autogeno o xenogeno, y puede aislarse de un cadaver o donante vivo. Los tejidos que han de ser procesados mediante los procedimientos de la presente memoria pueden ser obtenidos o recogidos en primer lugar de un donante humano o animal y colocados inmediatamente en una solucion estabilizante de transporte que detiene y restringe la degradacion autolftica y proteolftica, protege contra una contaminacion bacteriana y fungica, y reduce los danos mecanicos. La solucion estabilizante contiene, en general, un tampon apropiado, uno o mas antibioticos, y es transportada a las temperaturas de hielo humedo. Ejemplos no limitantes de componentes de una solucion estabilizante incluyen una solucion frfa (generalmente, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 grados Celsius) de lactato de Ringer, bicarbonato sodico y antibioticos (por ejemplo, gentamicina, vancomicina, etc.).

Una vez aislado, el procedimiento incluye las etapas de poner en contacto el tejido conectivo con al menos una solucion con capacidad para reducir, de forma significativa, los elementos moleculares que son inhibidores del recrecimiento y de la proliferacion celulares, que incluye al menos un componente seleccionado del grupo constituido por lfpidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos, antfgenos de complejos principales de histocompatibilidad, endotoxinas y microorganismos contaminantes. Tambien reducira, al menos parcialmente, el contenido de proteoglicanos del tejido conectivo. En al menos una realizacion, el procedimiento incluye poner en contacto el tejido conectivo con un tensioactivo, tal como un detergente, al igual que poner en contacto el tejido conectivo con un desinfectante, descrito con mayor detalle de aquf en adelante.

Todas las soluciones utilizadas en el procedimiento de la invencion reduciran el “contenido de proteoglicanos”. Segun se utiliza en la presente memoria, “contenido de proteoglicanos” hace referencia a proteoglicanos estructurales, material blando de carga de proteoglicanos, condroitinas, hialuronanos, protefnas, polisacaridos, etc. Todas las etapas de procesamiento extraeran mas facilmente estos componentes que residen en los aspectos no estructurales del tejido, pero las etapas que incluyen desinfectantes, tales como acido peracetico, funcionaran igualmente bien sobre los proteoglicanos en los aspectos tanto estructural como no estructural (es decir, material blando de carga) del tejido. Sin embargo, en otras realizaciones, el procedimiento incluye poner en contacto un tejido con al menos una enzima condroitinasa, tal como, sin limitacion, condroitinasa ABC, para reducir, de forma significativa, la presencia de proteoglicanos particulares, tales como sulfato de condroitina.

Los proteoglicanos contienen “condroitinas” enlazadas covalentemente. Los proteoglicanos que forman el aspecto estructural del tejido no son extrafdos, en general, con facilidad mediante la presente invencion, pero pueden ser modificados qufmicamente mediante la presente invencion. Para proteoglicanos que no forman el aspecto estructural del tejido, la presente invencion no solo servira para extraer, sino para modificar qufmicamente, mediante oxidacion, estos proteoglicanos al igual que las condroitinas no estructurales, hialuroninas y otras protefnas de menor peso molecular y polisacaridos y acidos nucleicos de peso molecular elevado.

Los proteoglicanos extrafbles son principalmente condroitinas e hialuronanos asociados con protefnas no incorporadas aun en los aspectos estructurales del tejido (es decir, que residen en el aspecto “material blando de carga” del tejido). Se deberfa tener cuidado de no eliminar demasiado contenido de proteoglicanos. Los intervalos permisibles de eliminacion de “proteoglicanos” extrafbles (es decir, condroitinas, hialuronanos, protefnas, etc.) en los que las maximas reducciones en “proteoglicanos” extrafbles no deberfan ser superiores al 50%, ni inferiores al 30%. Es necesaria una extraccion suficiente de los “proteoglicanos” extrafbles para reducir el “material blando de carga” contenido en los elementos estructurales del tejido, de forma que las celulas puedan infiltrar la matriz de tejido, pero no tanto como para hacerla inadecuada a celulas que entran en la matriz de tejido. Como ilustracion de este punto, la matriz extracelular de tejido es normalmente muy viscosa y una reduccion nominal de esta viscosidad ayudara en un movimiento celular al entorno ahora menos viscoso, pero aun conservara una naturaleza ffsica suficiente que las celulas tengan una solucion adyacente a sus membranas plasmaticas que evite que las moleculas que producen y secretan las celulas desaparezcan rapidamente de las mismas por difusion.

Como tal, el procedimiento puede tener como resultado la retencion de una cantidad sustancial de proteoglicanos extrafbles, que ayuda a fomentar interacciones entre celulas y entre celula y matriz. El procedimiento tiene como resultado la produccion de una matriz de tejido que facilita la recelularizacion y la reparacion regenerativa en aplicaciones in vitro e in vivo. La retencion de proteoglicanos, las protefnas de matriz tales como colageno, laminina y elastina, al igual que la glucoprotefna vitronectina son todas importantes en la union celular y fomentan el remodelado del tejido. El procedimiento de preparacion de la matriz de tejido reduce muchos componentes de la matriz extracelular (ECM) incluyendo glucosaminoglicanos (GAG), que estan enlazados covalentemente con protefnas para formar proteoglicanos. Los GAG tales como hialuronano, sulfato de queratina y sulfato de heparina son un componente integral de la ECM y desempenan un papel importante en las interacciones entre celulas y celula y matriz, y contribuyen a la migracion y la diferenciacion de celulas. Por lo tanto, en una realizacion preferente, la matriz de tejido retiene aproximadamente un 70% de proteoglicanos extrafbles.

Segun se describe en toda la memoria, el procedimiento de la presente invencion incluye etapas de poner en contacto el tejido conectivo con diversas soluciones. Segun se utiliza en la presente memoria, “poner en contacto” puede incluir la aplicacion de la solucion a unicamente una porcion del tejido conectivo, pero tambien puede incluir la inmersion del tejido conectivo en la solucion, de forma que el tejido sea cubierto por completo de ese modo. En al menos una realizacion, la inmersion puede ser estatica, en la que el tejido conectivo esta cubierto por la solucion y no es movido. En otras realizaciones, la inmersion es dinamica, lo que incluye cubrir con una solucion, al igual que incluye oscilacion, vibracion, agitacion, energfa ultrasonica u otro movimiento o energfa que se imparta sobre el tejido conectivo mientras esta sumergido. Ademas, el procedimiento puede incluir enjuagar el tejido conectivo con una o mas soluciones de enjuague o de limpieza, tales como solucion salina, solucion salina tamponada o agua, para enjuagar el tejido en diversas etapas en el procedimiento para eliminar cualquier solucion utilizada anteriormente.

Las soluciones utilizadas en el procedimiento de la presente invencion incluyen al menos un tensioactivo, tal como un detergente, y un desinfectante. Los tensioactivos descompondran el contenido de lfpidos y de fosfolfpidos, y tambien tienen impacto molecular sobre las endotoxinas y los antfgenos de CPH para ayudar tambien a reducirlos. Los tensioactivos y detergentes pueden ser anionicos, no ionicos o cationicos. Ejemplos de tensioactivos y/o detergentes utiles incluyen, sin limitacion, detergente BRIJ 95, detergente BRIJ 96, detergente BRIJ 98, Triton X-100, Tween 20 y combinaciones de los mismos.

Los desinfectantes, y opcionalmente otros agentes biocidas, son utilizados en el presente procedimiento por mas que unicamente su capacidad de matar microbios. Los desinfectantes son agentes muy nocivos, y reduciran significativamente los niveles de lfpidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos, antfgenos de CPH, endotoxinas y microorganismos contaminantes del tejido conectivo que este siendo tratado. Ejemplos de desinfectantes utiles en el presente procedimiento incluyen, sin limitacion: acido peracetico, dioxido de cloro, peroxido de hidrogeno, yoduro de polivinilpirrolidina, formaldehfdo, glutaraldehfdo, fenoxietanol, metilparabeno, propilparabeno, hidroximetilglicinato de sodio, urea de diazolidinilo, DMDM hidantofna, butilcarbamato de yodopropinilo, propilenglicol y combinaciones de los mismos. En al menos una realizacion preferente, se utiliza acido peracetico como desinfectante. El acido peracetico es un potente desinfectante antibacteriano, antiviral y antifungico.

La solucion desinfectante de procesamiento, tal como acido peracetico, es la solucion mas eficaz reduciendo el contenido de acido nucleico. En el caso del acido peracetico, esto puede ser debido, al menos en parte, a la capacidad oxidativa del acido peracetico para degradar el tamano de los polfmeros de acido nucleico haciendolos mas solubles en una solucion acuosa y mas probable su difusion en el tejido durante el procesamiento. De las soluciones opcionales de procesamiento, las soluciones de reduccion de endotoxinas son las mas agresivas para reducir el contenido de acido nucleico, y funcionan degradando los acidos nucleicos hasta sus componentes de poco peso molecular, que se difundiran facilmente del tejido durante todas las etapas subsiguientes de procesamiento. En algunas realizaciones, el procedimiento tambien incluye poner en contacto el tejido conectivo con una endonucleasa. Opcionalmente, se pueden utilizar una o mas endonucleasas en algunas realizaciones tras cualquiera de las etapas de tratamiento con detergente o con acido peracetico. Por ejemplo, Benzonase®, OmniCleave™, Pulmozyme® (alfa domasa), y otras endonucleasas de amplio espectro son utiles en la presente invencion para seleccionar como diana acidos nucleicos para una destruccion.

La etapa desinfectante de los procedimientos descritos en la presente memoria tambien es la mas eficaz reduciendo los antfgenos de histocompatibilidad. Por ejemplo, en el caso del acido peracetico, la capacidad oxidativa de la solucion de acido peracetico logra este resultado. Sin embargo, las condroitinasas tales como condroitinasa ABC tambien son muy eficaces, degradando enzimaticamente precisamente los polisacaridos de la superficie celular de los que estan constituidos los antfgenos CPH I y II.

La reduccion de los acidos nucleicos y de los antfgenos de complejos principales de histocompatibilidad en las etapas de los procedimientos de la presente invencion es util en la reduccion significativa de las respuestas inmunologicas, y posible rechazo del tejido, en un anfitrion que recibe la matriz procesada de tejido. Los acidos nucleicos que pueden ser reducidos incluyen acidos desoxirribonucleicos, acidos ribonucleicos y combinaciones de los mismos. Los derivados tanto de acidos desoxirribonucleicos como de acidos ribonucleicos pueden ser reducidos adicionalmente mediante los procedimientos implicados.

El desinfectante contribuye adicionalmente a la alteracion de restos y de estructuras moleculares, tales como colageno, y tambien actua como un potente oxidante de elementos estructurales de la matriz extracelular (ECM) del tejido conectivo que esta siendo tratado. Utilizando acido peracetico como ejemplo, el componente de acido acetico de acido peracetico altera la distribucion de cargas de los polisacaridos sulfatados, lo que tiene como resultado una alteracion de las estructuras moleculares de los elementos no estructurales (es decir, “material blando de carga”) (por ejemplo, sulfatos de condroitina, sulfatos de dermatina, hialuroninas, tropocolagenos, etc.) y de los elementos estructurales (por ejemplo, colagenos fibrosos, elastinas, proteoglicanos, etc.) de la matriz extracelular de tejidos. Las propiedades oxidativas del acido peracetico tienen como resultado la oxidacion de grupos (por ejemplo, grupos alcohol a grupos aldehfdo, grupos amino a grupos nitrato, etc.) y la rotura de enlaces covalentes. Colectivamente, tales propiedades del acido peracetico ayudan a solubilizar los elementos no estructurales y tambien alterar/solubilizar las caracterfsticas estructurales de los elementos estructurales de tejidos.

Mas especfficamente, la oxidacion de restos moleculares por las etapas de acido peracetico en la presente memoria (1) altera la naturaleza antigenica de los antfgenos de complejos principales de histocompatibilidad modificando qufmicamente los azucares de la parte de polisacarido de los antfgenos de CPH I y II, (2) altera la distribucion de cargas ionicas en las condroitinas y las hialuroninas facilitando su solubilizacion, (3) altera las interacciones estructurales entre los proteoglicanos estructurales (contribuyendo, fundamentalmente, a enlaces cruzados intra e intermoleculares) haciendo los tejidos menos reabsorbibles tras la implantacion y reforzandolos contra esfuerzos de traccion y deformaciones por traccion (haciendolos mas manejables para una manipulacion y una aplicacion clfnica a un sitio de herida). Las reacciones oxidativas tambien sirven para (4) degradar los lfpidos y fosfolfpidos rompiendo las uniones en el enlace covalente de alcohol/fosfato del glicerol a un grupo fosfotidilacflico (o serina, etc.). La reaccion oxidativa tambien (5) rompera los enlaces O-glucosfdicos que enlazan los polisacaridos (condroitinas, hialuroninas, etc.) con protefnas (es decir, descompone los proteoglicanos). Un aspecto de esta descomposicion de proteoglicanos tiene que ver con la reduccion de los componentes antfgenos (la parte de polisacarido de los antfgenos de CPH I y II en las membranas celulares) de los antfgenos de complejos principales de histocompatibilidad, evitando, por lo tanto, una respuesta inflamatoria.

Por lo tanto, se puede reducir la viscosidad de los elementos del tejido blando, mejorando la solubilidad y su degradacion formando moleculas mas pequenas, tanto mediante la alteracion de los elementos no estructurales (es decir, los sulfatos de condroitina, sulfatos de dermatina, etc.) como alterando qufmicamente la distribucion de cargas de esas moleculas no extrafdas del tejido. El objetivo es reducir esta viscosidad del elemento de tejido blando y cambiar la estructura/naturaleza molecular de los elementos no estructurales, que cambiaran los restos moleculares que interactuan con los receptores de la superficie celular de las celulas que intentan fijarse, proliferar e infiltrarse en el tejido, ya sea implantadas en el cuerpo o en condiciones de cultivo celular in vitro.

El grado o medida de oxidacion de los restos moleculares en la matriz de tejido puede ser cuantificado como un porcentaje (o numero de grupos oxidables por peso humedo/seco unitario del tejido) de los restos moleculares oxidables originales utilizando concentraciones reducidas de un peroxido, pudiendose determinar con precision la reduccion de la o las concentraciones de peroxido utilizando ensayos estandar para peroxidos. Las propiedades mecanicas (por ejemplo, la resistencia a la traccion de suturas) de la matriz de tejido pueden determinarse utilizando metodologfas estandar de ensayo mecanico de resistencia a la traccion.

A continuacion, se proporcionan ejemplos no limitantes de algunas realizaciones de concentraciones y de tiempos de contacto. Se puede utilizar acido peracetico para su contacto en los procedimientos proporcionados como soluciones al 0,05%, 0,1%, 0,5% durante 8 horas, 4 horas y 2 horas, respectivamente. Se puede utilizar BRIJ 95 para su contacto en los procedimientos proporcionado como soluciones al 0,25%, 0,5% y 1,0% durante 48 horas, 24 horas y 12 horas, respectivamente. De forma alternativa, se podrfa utilizar Triton X-100 en vez de BRIJ 95 como una solucion al 0,25%, 0,5% o 1,0% para su contacto durante 48 horas, 24 horas y 12 horas, respectivamente. Se pueden utilizar alcoholes para su contacto como soluciones aproximadamente al 50% hasta aproximadamente al 85% durante aproximadamente 1-2 horas. Ademas, cuando se utiliza NaCl, puede utilizarse en soluciones de contacto a 1M durante 48 horas, 1,5M durante 24 horas o 2M durante 18 horas.

Los tejidos tambien pueden ser procesados asepticamente mediante soluciones de uno o mas tipos de antibioticos, antivirales, antifungicos o combinaciones de los mismos para reducir los microorganismos contaminantes. Ejemplos incluyen detergente, acido peracetico y/o alcohol. Esto hara negativo al tejido con respecto a microorganismos contaminantes. De aquf en adelante se describen con mas detalle los tiempos y las condiciones deseados utilizando las concentraciones deseadas de las soluciones de procesamiento para un tratamiento aseptico. Opcionalmente, se pueden retirar las soluciones de procesamiento entre las etapas de procesamiento utilizando solucion salina, tal como solucion salina tamponada con fosfato (PBS), 1,5M de NaCl y NaCl al 0,9%, o soluciones de enjuague con agua.

En algunas realizaciones, el procedimiento tambien incluye poner en contacto el tejido conectivo con una condroitinasa. Opcionalmente, se pueden utilizar enzimas condroitinasas en algunas realizaciones tras las etapas de tratamiento con detergente, para degradar uno o mas proteoglicanos de sulfato de condroitina, que se pretende que inhiben el crecimiento axonal mediante un nervio aloinjertado procesado que se utiliza en la reparacion de nervios cortados o danados del sistema nervioso periferico. Un ejemplo de una enzima condroitinasa es la condroitinasa ABC, aunque se contemplan otras condroitinasas.

El procedimiento tambien puede incluir poner en contacto el tejido con una solucion reductora de endotoxinas, haciendo negativo al tejido resultante con respecto a ensayos para endotoxinas. En algunas realizaciones, existen dos procedimientos que contribuyen a hacer a la matriz modificada negativa a las endotoxinas detectables. El primero es la oxidacion y la degradacion de la endotoxina de lipopolisacaridos (LPS). La dilucion de la endotoxina mediante multiples etapas de enjuague explica su reduccion adicional. Tales etapas de enjuague pueden incluir una o mas de los siguientes: una solucion de acido peracetico al 0,1%, una solucion de NaCl 1,5M, una solucion de BRIJ 35 al 0,5% y combinaciones de las mismas. Los desinfectantes tales como el acido peracetico, al igual que las lipasas y condroitinasas tambien serviran para reducir los niveles de endotoxinas fundamentalmente eliminando los restos en las endotoxinas reconocidas por procedimientos de ensayo conocidos en la tecnica y, al hacerlo, tambien reduciran el potencial de que cualquier endotoxina restante genere una respuesta inflamatoria cuando se implanten los tejidos.

En algunas realizaciones, el procedimiento tambien incluye poner en contacto el tejido conectivo con un alcohol. Por ejemplo, los alcoholes son utiles para contribuir adicionalmente a la descomposicion de proteoglicanos, lfpidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos, antfgenos de CPH, endotoxinas y microorganismos contaminantes. Ejemplos de alcoholes que pueden ser utilizados incluyen, sin limitacion, etanol, propanol, isopropanol, butanol, glicerol, metanol, pentanol y combinaciones de los mismos. La etapa de tratamiento con alcohol permite una solubilizacion y una extraccion modestas de fosfolfpidos y de lfpidos de los tejidos. Esta bien establecido en la tecnica que el etanol/isopropanol al 70% tiene una eficacia maxima en la solubilizacion de lfpidos. Por lo tanto, es valioso como desinfectante para bacterias gram negativas, en las que los lfpidos presentes en las paredes celulares bacterianas hacen tales microorganismos gram negativos mas resistentes a ciertos antibioticos y agentes biocidas. De forma similar, las enzimas lipasa degradaran lfpidos y la condroitinasa (por ejemplo, condroitinasa ABC) degradara condroitinas, con los que pueden asociarse fntimamente los lfpidos y los fosfolfpidos.

Los lfpidos reducibles de los procedimientos descritos en la presente memoria incluyen lfpidos no saponificables, o derivados de los mismos, incluyendo colesteroles, derivados de colesteroles y combinaciones de los mismos. Los fosfolfpidos reducibles o derivados de los mismos incluyen diacilgicerofosfatidos, triacilgliceridos y combinaciones de los mismos. Los lfpidos y fosfolfpidos tienden a formar estructuras micelares en soluciones acuosas y, por lo tanto, tienden a cubrir restos moleculares que las celulas infiltrantes necesitaran “reconocer” (mediante sus receptores de la superficie celular); y, por lo tanto, es importante eliminar tanto contenido del lfpido/fosfolfpido como sea posible. En algunas realizaciones, el procedimiento tambien incluye, por lo tanto, poner en contacto el tejido conectivo con una lipasa, para aumentar la reduccion de lfpidos. Esto puede desearse cuando se tratan tejidos conectivos con un contenido elevado de lfpidos y fosfolfpidos, tales como tejidos dermicos y, en particular, procesando tejidos dermicos gruesos.

Una vez tratada, el procedimiento incluye deshidratar la matriz resultante de tejido para su almacenamiento y/o transporte. Por ejemplo, la matriz de tejido puede ser liofilizada, tal como mediante liofilizacion u otro procedimiento criogenico, para reducir el contenido de humedad residual de la matriz de tejido hasta entre aproximadamente un 2% y aproximadamente un 6%. Dado que tales tejidos pueden ser mas quebradizos de lo deseado, en algunas realizaciones los tejidos pueden ser tratados en primer lugar con una solucion al 10% hasta al 30% de glicerol durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la solucion de conservacion o de almacenamiento sustituya el contenido de agua de los tejidos procesados, y luego liofilizados hasta un contenido de humedad residual de entre un 2% y un 6%. Tales tejidos seran menos quebradizos que tejidos similares que no son tratados de antemano con glicerol antes de la liofilizacion, y tales tejidos tambien son conservados mejor y protegidos mejor contra cualquier exposicion subsiguiente a irradiacion gamma utilizada en algunas etapas terminales de esterilizacion. Entonces, se puede almacenar la matriz de tejido en una solucion de almacenamiento, que es, preferentemente, no acuosa, tal como aceite mineral o glicerol.

En algunas realizaciones, el tejido procesado puede ser dividido en trozos mas pequenos a partir del estado hidratado, el liofilizado, el conservado hidratado o el conservado deshidratado. Esta division en trozos mas pequenos puede llevarse a cabo mediante procedimientos estandar y medios establecidos conocidos por los expertos en la tecnica, tales como utilizando fuerzas de cizallamiento en una mezcladora mecanica, fragmentacion por impacto, criofractura y/o simple fragmentacion mecanica utilizando un mortero y un triturador. En al menos una realizacion, la matriz de tejido es micronizada, lo que tiene como resultado una pluralidad de fragmentos o trozos que miden en el intervalo micrometrico. Por ejemplo, los trozos micronizados de tejido pueden tener un diametro en el intervalo de 100 - 300 micrometros, aunque algunos fragmentos pueden tener un diametro medio inferior a 100 micrometros. Esta matriz micronizada o fragmentada de tejido tambien puede proporcionarse en un estado congelado, en un estado deshidratado a temperatura ambiente, en un estado liofilizado o en un estado hidratado a temperatura ambiente. Esta matriz micronizada de tejido puede ser utilizada posteriormente como una matriz inyectable de tejido, para una reparacion regenerativa subcutanea, tal como para ser utilizada en aplicaciones cosmeticas como unico ejemplo ilustrativo.

Estas anteriores etapas tienen como resultado una modificacion de la matriz de tejido suficiente para fomentar la infiltracion y la proliferacion celulares. Por ejemplo, el presente procedimiento implica la reduccion de los niveles de al menos proteoglicanos, lfpidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos y antfgenos de CPH. Segun se ha expuesto en otro lugar en la presente memoria, los niveles de proteoglicanos se reducen en un intervalo de un 30% a un 50%, de forma que la matriz de tejido retenga un 50% hasta un 70% de proteoglicanos extrafbles. Los lfpidos y fosfolfpidos son reducidos en un intervalo de un 70% a un 95%. Los acidos nucleicos son reducidos en un intervalo de un 30% a un 90%. Los antfgenos del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) I y II son reducidos en un intervalo de un 85% a un 99%. Ademas, las endotoxinas son eliminadas esencialmente de la matriz de tejido.

Estos resultados pueden ser evaluados comparando la capacidad de las celulas estandar de mamfferos para infiltrar los tejidos conectivos no procesados con respecto a tejidos conectivos procesados segun la presente invencion. La infiltracion celular puede ser evaluada utilizando una evaluacion histologica tradicional y/o extrayendo acidos nucleicos de tejidos procesados y no procesados como una funcion del tiempo de incubacion en presencia de una poblacion de ensayo de celulas de mamfferos cultivadas en condiciones estandar de cultivo de tejido. Un aumento en los acidos nucleicos extrafbles con el paso del tiempo es indicativo de una infiltracion y una proliferacion celulares. Los Ejemplos proporcionados de aquf en adelante demuestran la confirmacion por algunos de estos ensayos.

La presente invencion tambien esta dirigida a una matriz de tejido adecuada para su uso en una reparacion regenerativa de tejido blando, que puede ser un resultado del procedimiento descrito anteriormente en algunas realizaciones. Especfficamente, la matriz de tejido de la presente invencion comprende una porcion de soporte estructurada para proporcionar una forma a la matriz de tejido. Por ejemplo, la porcion de soporte puede estar fabricada de proteoglicanos estructurales o no extrafbles. En algunas realizaciones, la matriz esta compuesta de una estructura colagenosa derivada de tejidos conectivos. La estructura colagenosa es adecuada para una infiltracion celular, una fijacion celular, una proliferacion celular y una diferenciacion celular en condiciones tanto in vivo como in vitro. La estructura colagenosa de la matriz de tejido puede poseer propiedades hemostaticas cuando se utiliza en condiciones tanto in vivo como in vitro.

La matriz de tejido tambien incluye una porcion no estructural dispuesta en una relacion intercalada en al menos una parte de la porcion de soporte. Por ejemplo, la porcion no estructural de la matriz de tejido es el componente de matriz extracelular (ECM) del tejido. Segun se ha descrito anteriormente, empapa el soporte e incluye factores celulares y moleculares necesarios para una interaccion entre celulas y celula y matriz que facilitan una infiltracion, fijacion y proliferacion celulares. La porcion no estructural de la matriz de tejido tambien puede estar compuesta de proteoglicanos, tales como proteoglicanos extrafbles y no extrafbles.

La porcion de soporte y la porcion no estructural de la matriz de tejido estan estructuradas colectivamente para fomentar la infiltracion, la fijacion y la proliferacion celulares de al menos una celula anfitriona en la matriz de tejido tras la implantacion o el transplante de la matriz de tejido en un tejido anfitrion que ha de ser reparado.

Ademas, la matriz de tejido puede retener restos moleculares asociados con moleculas que comprenden la estructura colagenosa apropiada para la fijacion de celulas de mamfferos. En particular, la matriz de tejido esta compuesta de tejido conectivo con una reduccion significativa en al menos uno de lfpidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos, antfgenos del complejo principal de histocompatibilidad, endotoxinas y algunos proteoglicanos. En consecuencia, al menos parte de la matriz de tejido, bien en la porcion de soporte o bien en la porcion no estructural, ha sido acelularizada, al menos parcialmente, mediante el procedimiento de eliminacion de estos componentes. No obstante, la matriz de tejido retiene una cantidad significativa de proteoglicanos extrafbles. Preferentemente, la matriz de tejido retiene aproximadamente un 70% de proteoglicanos extrafbles.

En algunas realizaciones, la matriz de tejido tambien puede retener factores de crecimiento y de diferenciacion derivados endogenamente. Tales factores de crecimiento y de diferenciacion incluyen, sin limitacion, factores angiogenicos, factores mitogenicos, factores morfogenicos y combinaciones de los mismos. Los factores angiogenicos incluyen, sin limitacion, uno o mas factores apropiados para la revascularizacion de una matriz de tejido en condiciones in vivo e in vitro. Asimismo, los factores mitogenicos incluyen, sin limitacion, uno o mas factores apropiados para la induccion de celulas a dividirse mitoticamente, proliferando y aumentando, de ese modo, en numero. Los factores morfogenicos incluyen, sin limitacion, uno o mas factores apropiados para la induccion de celulas que infiltran la matriz de tejido para diferenciarse en fenotipos celulares adecuados para la formacion de tejidos de estructura y funcion similares a los tejidos en los que se coloca la matriz de tejido.

En consecuencia, la matriz de tejido de la presente invencion satisface uno o mas de los siguientes criterios: (1) esta reducida en al menos aproximadamente un 30%, y preferentemente mas de aproximadamente un 90%, en acidos nucleicos extrafbles; (2) esta reducida en al menos aproximadamente un 70% hasta aproximadamente un 95% en fosfolfpidos extrafbles; (3) esta reducida en aproximadamente un 70% hasta aproximadamente un 95% en lfpidos extrafbles; (4) retiene aproximadamente un 50% hasta aproximadamente un 70% de proteoglicanos extrafbles; (5) presenta restos moleculares que han sido oxidados; (6) esta reducida en al menos aproximadamente un 85% en antfgenos inmunorreactivos de complejo principal de histocompatibilidad; (7) presenta una estructura colagenosa ligeramente alterada que ha sido disociada parcialmente por el acido organico (preferentemente, acido acetico); (8) es desinfectada y es negativa en cultivo segun valoraciones de esterilidad de la seccion 71 USP; (9) es negativa (es decir, no detectable mediante procedimientos de ensayo utilizados por los expertos en la tecnica o dentro de los lfmites permitidos en la actualidad por organismos reguladores) con respecto a niveles clfnicamente aceptables de endotoxinas; (10) retiene restos moleculares asociados con la matriz de tejido colagenoso segun sea apropiado para las necesidades de las celulas que infiltran la matriz de tejido y (11) facilita la infiltracion, la fijacion, la proliferacion, la diferenciacion celulares y la sfntesis de materiales matriciales apropiados para la reparacion regenerativa de defectos del tejido blando.

La presente invencion tambien esta dirigida a kits para una reparacion regenerativa de tejido blando, que incluyen una matriz tisular de tejido conectivo aislado, segun se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, tales kits incluyen una matriz de tejido que tiene niveles reducidos de al menos uno de proteoglicanos, lfpidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos, antfgenos de complejo principal de histocompatibilidad (CPH) y endotoxinas. La matriz de tejido proporcionada por el kit esta estructurada, por lo tanto, para fomentar la infiltracion, fijacion y proliferacion celulares de las celulas anfitrionas en la misma. Ademas, los kits de la presente invencion pueden incluir matrices de tejido de cualquier tipo de tejido, segun se describe en la presente memoria, tales como, sin limitacion, dermis y fascia. La matriz de tejido puede comprender cualquier estructura y dimension apropiada adecuada para un fin particular de reparacion, tal como, sin limitacion, una capa, una capa gruesa (como entienden facilmente las personas con un nivel normal de dominio de la tecnica), una matriz fragmentada y/o micronizada, y que estan listas para ser utilizadas en implantes.

En al menos una realizacion, el kit incluye, ademas, una cantidad de solucion de transferencia, que ha de ser utilizada para facilitar o contribuir a la transferencia de la matriz de tejido a un anfitrion. Tal solucion de transferencia puede ser cualquier solucion biocompatible apropiada, tal como, sin limitacion, solucion salina, solucion salina tamponada o agua. Ademas, se puede incluir instrumentacion diversa en algunas realizaciones del kit para llevar a cabo la transferencia o la implantacion de la matriz de tejido a un anfitrion. Por ejemplo, el kit puede incluir una aguja y al menos una jeringa en la que puede cargarse la matriz de tejido para una inyeccion subcutanea en el anfitrion. Esto es particularmente util en conexion con una matriz micronizada de tejido, en la que la matriz micronizada de tejido puede estar suspendida en una solucion de transferencia proporcionada en el kit e inyectada en el anfitrion. Se pueden incluir una pluralidad de jeringas y/o de agujas en el kit para inyecciones reiteradas. En algunas realizaciones, el kit esta disponible con la jeringa precargada con la matriz de tejido y la solucion de transferencia. En otras realizaciones, la matriz de tejido, la solucion de transferencia y la jeringa estan separadas en el kit y deben ser combinadas por un usuario.

La presente invencion tambien esta dirigida a kits para procesar tejido conectivo para producir una matriz resultante de tejido adecuada para una reparacion regenerativa. Tales kits incluyen una cantidad de tensioactivo y una cantidad de desinfectante. Segun se ha expuesto anteriormente, el tensioactivo puede ser un detergente, tal como BRIJ 95, BRIJ 96, Tween 20, Triton X100 u otros. El desinfectante puede ser acido peracetico, dioxido de cloro, peroxido de hidrogeno, yoduro de polivinilpirrolidina, formaldehfdo, glutaraldehfdo, fenoxietanol, metilparabeno, propilparabeno, hidroximetilglicinato de sodio, urea de diazolidinilo, DMDM hidantofna, butilcarbamato de yodopropinilo, propilenglicol y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, tambien se incluyen soluciones adicionales en el kit, tales como alcohol, condroitinasa, endonucleasa y lipasa y una solucion reductora de endotoxinas, segun se ha descrito anteriormente. Los kits tambien pueden incluir una solucion de almacenamiento, preferentemente una solucion no acuosa tal como aceite mineral, para almacenar la matriz resultante de tejido. Muchas realizaciones incluyen, ademas, instrucciones de uso.

Cualquiera de los kits descritos anteriormente tambien pueden incluir instrucciones para el uso del kit. Ademas, algunas realizaciones de los kits tambien pueden incluir al menos un reactivo de ensayo para ser utilizado en la deteccion de una reparacion regenerativa y/o instrucciones para su uso. Estos reactivos estan estructurados para su uso en la deteccion de al menos una de una infiltracion, fijacion, proliferacion, diferenciacion celulares y la sfntesis de materiales de matriz apropiados para la reparacion regenerativa de defectos de tejido blando. Los procedimientos de deteccion pueden incluir por conjugacion de etiquetas o sustratos detectables, tales como compuestos fluorescentes, enzimas, radioisotopos, atomos pesados, genes indicadores, compuestos luminiscentes o anticuerpos contra componentes moleculares de la matriz de tejido. Como comprenderan los expertos en la tecnica, se pueden utilizar metodologfas adicionales de deteccion o de marcado en los kits proporcionados.

Sin una elaboracion adicional, se cree que un experto en la tecnica, utilizando la descripcion precedente, puede utilizar la presente invencion en su maximo grado. Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo ilustrativo, no limitante. Aunque se han proporcionado ejemplos especfficos, la anterior descripcion es ilustrativa y no restrictiva. Se pueden combinar cualesquiera o mas de las caracterfsticas de las realizaciones descritas anteriormente de cualquier forma con una o mas caracterfsticas de cualquier otra realizacion en la presente invencion. Ademas, seran evidentes muchas variaciones de la invencion para los expertos en la tecnica tras un repaso de la memoria.

Todas las publicaciones y los documentos de patente citados en la presente solicitud estan incorporados por referenda en su parte pertinente para todos los fines en el mismo grado que si se denotase individualmente cada publicacion o documento de patente individual. Por la cita de diversas referencias en el presente documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia particular sea “tecnica anterior” a su invencion.

Ejemplos

Los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria y los kits relacionados son ilustrados adicionalmente en los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo ilustrativo y no se pretende que sean limitantes. Se apreciara que seran evidentes para los expertos en la tecnica y se encuentran dentro del alcance de las realizaciones de la presente invencion variaciones en las proporciones y alternativas en elementos de los componentes mostrados. Se presentan aspectos teoricos con el entendimiento de que los solicitantes no buscan estar limitados por la teorfa presentada. Todas las partes o cantidades, a no ser que se especifique lo contrario, son en peso.

Ejemplo 1: Procesamiento (A) de tejido cutaneo en la produccion de un tejido de matriz dermica.

1. Procedimiento

1.1 Preparacion de tejidos conectivos cutaneos

1.1.1 Si ha sido congelado anteriormente en una solucion de cloruro sodico 1,5 M, retirar del congelador el envase de piel envuelta, colocar un agitador orbital a 60 RPM, y permitir que la piel se descongele completamente durante 24 horas a 36°C ±1°C. Si ha sido recien recuperada, proceder a procesar segun se detalla a continuacion. Si se convierte piel crioconservada en dermis descelularizada, retirar del congelador el envase de piel y colocarlo en una incubadora a 36°C ±1°C. Despues de la descongelacion, retirar la piel del envase esteril y continuar con la seccion 1.2.

1.2 Inspeccion, limpieza y pesaje de los tejidos

1.2.1 Utilizando tecnicas asepticas, presentar los tejidos cutaneos al campo esteril.

1.2.2 Colocar cada trozo de piel con el lado epidermico hacia arriba sobre una tabla para cortar.

1.2.3 Inspeccionar los tejidos cutaneos en busca de agujeros, lunares, verrugas y tatuajes y recortar estas areas utilizando un bisturf.

1.2.4 Examinar los tejidos en busca de pelo y retirarlo con forceps.

1.2.5 Enjuagar los tejidos limpiados colocandolos en una cubeta que contenga agua esteril.

1.2.6 Utilizando un bisturf, cortar con cuidado una muesca triangular pequena aproximadamente 0,5 cm por debajo de la esquina superior izquierda del injerto.

1.2.7 Transferir los tejidos al interior de un recipiente esteril vacfo y colocarlo asepticamente sobre la bascula de pesaje desinfectada de antemano. Determinar y registrar el peso total (peso de los tejidos y del recipiente) en el registro de procesamiento.

1.2.8 Transferir asepticamente los tejidos a un tarro esteril de plastico en el campo esteril dejando la cubeta sobre la bascula de pesaje. Determinar y registrar el peso de la cubeta vacfa.

1.3 Enjuague de los tejidos

1.3.1 En funcion del peso del tejido determinado en la seccion 1.2.8, determinar el volumen de solucion salina normal libre de antibiotico que ha de utilizarse para una etapa de enjuague.

1.3.2 Anadir solucion salina normal nueva libre de antibiotico (5 ml de solucion salina por 1 gramo de piel) en el tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

1.3.3 Retirar la tapa y decantar la solucion.

1.3.4 Repetir la etapa de enjuague tres (3) veces.

NOTA: UTILIZAR EL VOLUMEN RECOMENDADO DE NUEVA SOLUCION PARA CADA ENJUAGUE.

1.3.5 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

1.4 Incubacion con cloruro sodico

1.4.1 Transferir los tejidos cutaneos a un nuevo tarro esteril de plastico.

1.4.2 Verter la solucion preparada anteriormente de cloruro sodico 1,5 M (5 ml por 1 gramo de piel o volumen de solucion determinado en la etapa 1.3.1) en el tarro con piel y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos, incluyendo los sucedaneos, estan completamente sumergidos en la solucion.

1.4.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos cutaneos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

1.4.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 18-24 horas.

1.5 Separacion de la epidermis/dermis

1.5.1 Retirar de la incubadora/unidad agitadora los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

1.5.2 Retirar la tapa del tarro y examinar los tejidos. Deberfa haber una separacion evidente de las capas cutaneas epidermica y dermica.

1.5.3 Transferir un trozo de tejido cutaneo a una cubeta esteril nueva que contiene agua esteril.

1.5.4 Retirar la capa epidermica.

1.5.5 Transferir el tejido cutaneo dermico a una cubeta esteril nueva que contiene agua esteril.

1.5.6 Continuar este procedimiento hasta que se haya retirado la capa epidermica de todos los trozos de tejido cutaneo dermico.

1.5.7 Volver a pesar el tejido dermico que ha de ser utilizado en el resto de la etapa de procesamiento.

1.6 Enjuague

1.6.1 Transferir los tejidos cutaneos a un tarro esteril de plastico.

1.6.2 Anadir agua esteril nueva (5 ml de solucion salina por 1 gramo de piel) al tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

1.6.3 Retirar la tapa y decantar la solucion.

1.6.4 Repetir esta etapa de enjuague tres (3) veces.

1.6.5 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

1.6.6 Colocar cubetas separadas en el campo esteril y etiquetar cada una con el grosor del tejido.

1.6.7 Verter solucion salina normal esteril en cada cubeta.

1.6.8 Cortar tejidos en dimensiones especificadas utilizando un bisturf y una regla como gufa y colocarlos en la cubeta respectiva. Mantener cada cubeta separada cuando prosigue cada etapa de procesamiento. Colocar todos los recortes de tejido cutaneo dermico en el lado del campo esteril hasta que se hayan cortado todos los injertos. 1.6.9 Despues de que se corta cada injerto, colocar un injerto cortado con el lado de la dermis hacia abajo y la membrana fundamental orientada hacia arriba. Utilizando un bisturf, cortar con cuidado una muesca triangular pequena aproximadamente 0,5 cm por debajo de la esquina superior izquierda del injerto.

1.6.10 Colocar el injerto cortado con la muesca en la cubeta respectiva.

1.6.11 Repetir el procedimiento hasta que se hayan cortado todos los injertos con una muesca.

1.7 Incubacion en detergente (por lote de tejido)

1.7.1 Colocar los injertos de tejido cutaneo dermico en un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

1.7.2 Verter la solucion de BRIJ 35 al 0,5% (laurileter de poli(oxietileno) (23), solucion acuosa al 10%, calidad proteomica) (5 ml de solucion por 1 gramo de piel) (G-Biosciences, Cat. n°: DG004) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

1.7.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos cutaneos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

1.7.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 18-24 horas.

1.8 Preparar la solucion (solucion de acido peracetico al 0,1%)

1.9 Enjuague

1.9.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

1.9.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de BRIJ 35 al 0,5%.

1.9.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de piel) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

1.9.4 Decantar la solucion.

1.9.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

1.10 Desinfeccion

1.10.1 Transferir los injertos de tejido cutaneo dermico a un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

1.10.2 Verter solucion de acido peracetico al 0,1% (5 ml por 1 gramo de piel) al interior del recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

1.10.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos cutaneos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

1.10.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 4 horas.

1.11 Enjuague

1.11.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

1.11.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de acido peracetico al 0,1%.

1.11.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de piel) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

1.11.4 Decantar la solucion.

1.11.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

1.12 Liofilizacion

1.12.1 Cargar los tejidos en el liofilizador.

1.12.2 Llevar a cabo el procedimiento de liofilizacion segun los parametros aplicables de liofilizacion - Operation of the VirTis Freeze Dryers.

1.12.3 Liofilizar los tejidos durante 2 a 10 dfas.

Ejemplo 2: Procesamiento (B) de piel para la produccion de matriz dermica.

2. Procedimiento

2.1 Preparacion de tejidos conectivos cutaneos

2.1.1 Si ha sido congelado anteriormente en una solucion de cloruro sodico 1,5 M, retirar del congelador el envase de piel envuelta, colocar un agitador orbital a 60 RPM, y permitir que la piel se descongele completamente durante 24 horas a 36°C ±1°C. NO DESPRECINTAR EL ENVASE. Saltar a la seccion 2.2

2.1.2 Si ha sido recuperado, proseguir al procesamiento segun se detalla a continuacion. Continuar con la seccion 2.2

2.1.3 Si se convierte piel crioconservada en dermis descelularizada, retirar del congelador el envase de piel y colocarlo en una incubadora a 36°C ±1°C. Despues de la descongelacion, retirar la piel del envase esteril y continuar con la seccion 2.2.

2.2 Inspeccion, limpieza y pesaje de los tejidos

2.2.1 Utilizando una tecnica aseptica, presentar los tejidos cutaneos al campo esteril.

2.2.2 Colocar cada trozo de piel con el lado epidermico hacia arriba sobre una tabla para cortar.

2.2.3 Inspeccionar los tejidos cutaneos en busca de agujeros, lunares, verrugas y tatuajes y recortar estas areas utilizando un bisturf.

2.2.4 Examinar los tejidos en busca de pelo y retirarlo con forceps.

2.2.5 Enjuagar los tejidos limpiados colocandolos en una cubeta que contenga agua esteril.

2.2.6 Utilizando un bisturf, cortar con cuidado una muesca triangular pequena aproximadamente 0,5 cm por debajo de la esquina superior izquierda del injerto.

2.2.7 Transferir los tejidos a un recipiente esteril vacfo y colocarlo asepticamente sobre la bascula de pesaje desinfectada de antemano. Determinar y registrar el peso total (peso de los tejidos y del recipiente) en el registro de procesamiento.

2.2.8 Transferir asepticamente los tejidos a un tarro esteril de plastico en el campo esteril dejando la cubeta sobre la bascula de pesaje. Determinar y registrar el peso de la cubeta vacfa.

2.3 Enjuague de los tejidos

2.3.1 En funcion del peso del tejido determinado en la seccion 2.2, determinar el volumen de solucion salina normal libre de antibiotico que ha de utilizarse para una etapa de enjuague.

2.3.2 Anadir solucion salina normal nueva libre de antibiotico (5 ml de solucion salina por 1 gramo de piel) en el tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

2.3.3 Retirar la tapa y decantar la solucion.

2.3.4 Repetir la etapa de enjuague tres (3) veces.

NOTA: UTILIZAR EL VOLUMEN RECOMENDADO DE NUEVA SOLUCION PARA CADA ENJUAGUE.

2.3.5 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

2.4 Incubacion con cloruro sodico

2.4.1 Transferir los tejidos cutaneos a un nuevo tarro esteril de plastico.

2.4.2 Verter la solucion preparada anteriormente de cloruro sodico 1,5 M (5 ml por 1 gramo de piel o volumen de solucion determinado en la etapa 2.3.1) en el tarro con piel y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos, incluyendo los sucedaneos, estan completamente sumergidos en la solucion.

2.4.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos cutaneos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

2.4.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 18-24 horas.

2.5 Separacion de la epidermis/dermis

2.5.1 Retirar de la incubadora/unidad agitadora los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

2.5.2 Retirar la tapa del tarro y examinar los tejidos. Deberfa haber una separacion evidente de las capas cutaneas epidermica y dermica.

2.5.3 Transferir un trozo de tejido cutaneo a una cubeta esteril nueva que contiene agua esteril.

2.5.4 Retirar la capa epidermica.

2.5.5 Transferir el tejido cutaneo dermico a una cubeta esteril nueva que contiene agua esteril.

2.5.6 Continuar este procedimiento hasta que se haya retirado la capa epidermica de todos los trozos de tejido cutaneo dermico.

2.5.7 Volver a pesar el tejido dermico que ha de ser utilizado en el resto de la etapa de procesamiento.

2.6 Enjuague

2.6.1 Transferir los tejidos cutaneos a un tarro esteril de plastico.

2.6.2 Anadir agua esteril nueva (5 ml de solucion salina por 1 gramo de piel) al tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

2.6.3 Retirar la tapa y decantar la solucion.

2.6.4 Repetir esta etapa de enjuague tres (3) veces.

2.6.5 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

2.6.6 Colocar cubetas separadas en el campo esteril y etiquetar cada una con el grosor del tejido.

2.6.7 Verter solucion salina normal esteril en cada cubeta.

2.6.8 Cortar tejidos en dimensiones especificadas utilizando un bisturf y una regla como gufa y colocarlos en la cubeta respectiva. Mantener cada cubeta separada cuando prosigue cada etapa de procesamiento. Colocar todos los recortes de tejido cutaneo dermico en el lado del campo esteril hasta que se hayan cortado todos los injertos. 2.6.9 Despues de que se corta cada injerto, colocar un injerto cortado con el lado de la dermis hacia abajo y la membrana fundamental orientada hacia arriba. Utilizando un bisturf, cortar con cuidado una muesca triangular pequena aproximadamente 0,5 cm por debajo de la esquina superior izquierda del injerto.

2.6.10 Colocar el injerto cortado con la muesca en la cubeta respectiva.

2.6.11 Repetir el procedimiento hasta que se hayan cortado todos los injertos con una muesca.

2.7 Incubacion en detergente (por lote de tejido)

2.7.1 Colocar los injertos de tejido cutaneo dermico en un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

2.7.2 Verter la solucion de BRIJ 35 al 0,5% (5 ml de solucion por 1 gramo de piel) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.7.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos cutaneos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

2.7.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 18-24 horas.

2.8 Incubar en condroitinasa ABC

2.8.1 Colocar los injertos de tejido cutaneo dermico en un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa

2.8.2 Verter la solucion salina que contiene 100 unidades de condroitinasa ABC (5 ml de solucion/1 gramo de tejido) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.8.3 Colocar en el agitador orbital y en la unidad de incubacion el tejido envuelto. Cerrar la tapa de la unidad. 2.8.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 4-6 horas.

2.9 Preparar la solucion (solucion de acido peracetico al 0,1%) que ha de utilizarse el dfa 3.

2.10 Enjuague

2.10.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

2.10.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de BRIJ 35 al 0,5%.

2.10.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de piel) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

2.10.4 Decantar la solucion.

2.10.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

2.11 Desinfeccion

2.11.1 Transferir los injertos de tejido cutaneo dermico a un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

2.11.2 Verter solucion de acido peracetico al 0,1% (5 ml por 1 gramo de piel) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.11.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos cutaneos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

2.11.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 4 horas.

2.12 Enjuague

2.12.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

2.12.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de acido peracetico al 0,1%.

2.12.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de piel) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

2.12.4 Decantar la solucion.

2.12.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

2.13 Liofilizacion.

2.13.1 Cargar los tejidos en el liofilizador.

2.13.2 Llevar a cabo el procedimiento de liofilizacion segun los parametros aplicables de liofilizacion - Operation of the VirTis Freeze Dryers.

2.13.3 Liofilizar los tejidos durante 2 a 10 dfas.

Ejemplo 3: Preparacion (A) de fascia para una matriz de tejido conectivo

Preparacion de tejidos conectivos de fascia

2.1 Enjuague de los tejidos

En funcion del peso del tejido determinado en la seccion 2.2, determinar el volumen de solucion salina normal libre de antibiotico que ha de utilizarse para una etapa de enjuague.

2.1.1 Anadir solucion salina normal nueva libre de antibiotico (5 ml de solucion salina por 1 gramo de fascia) en el tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

2.1.2 Retirar la tapa y decantar la solucion.

2.1.3 Repetir la etapa de enjuague tres (3) veces.

NOTA: UTILIZAR EL VOLUMEN RECOMENDADO DE NUEVA SOLUCION PARA CADA ENJUAGUE.

2.1.4 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

2.2 Enjuague

2.2.1 Transferir los tejidos de fascia a un tarro esteril de plastico.

2.2.2 Anadir agua esteril nueva (5 ml de solucion salina por 1 gramo de fascia) al tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

2.2.3 Retirar la tapa y decantar la solucion.

2.2.4 Repetir esta etapa de enjuague tres (3) veces.

2.2.5 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

2.2.6 Colocar cubetas separadas en el campo esteril y etiquetar cada una con el grosor del tejido.

2.2.7 Verter solucion salina normal esteril en cada cubeta.

2.2.8 Cortar tejidos en dimensiones especificadas utilizando un bisturf y una regla como gufa y colocarlos en la cubeta respectiva. Mantener cada cubeta separada cuando prosigue cada etapa de procesamiento. Colocar todos los recortes de tejido de fascia en el lado del campo esteril hasta que se hayan cortado todos los injertos.

2.2.9 Despues de que se corta cada injerto, colocar un injerto cortado con el lado inferior hacia abajo y la membrana superior orientada hacia arriba. Utilizando un bisturf, cortar con cuidado una muesca triangular pequena aproximadamente 0,5 cm por debajo de la esquina superior izquierda del injerto.

2.2.10 Colocar el injerto cortado con la muesca en la cubeta respectiva.

2.2.11 Repetir el procedimiento hasta que se hayan cortado todos los injertos con una muesca.

2.3 Incubacion en detergente (por lote de tejido)

2.3.1 Colocar los injertos de tejido de fascia en un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

2.3.2 Verter la solucion de BRIJ 35 al 0,5% (5 ml de solucion por 1 gramo de piel) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.3.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos cutaneos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

2.3.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 18-24 horas.

2.4 Incubar en condroitinasa ABC

2.4.1 Colocar los injertos de tejido en un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa

2.4.2 Verter la solucion salina que contiene 50 unidades de condroitinasa ABC (5 ml de solucion/1 gramo de tejido) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.4.3 Colocar en el agitador orbital y en la unidad de incubacion el tejido envuelto. Cerrar la tapa de la unidad.

2.4.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 4-6 horas.

2.5 Preparar la solucion (solucion de acido peracetico al 0,1%) que ha de utilizarse el dfa 3.

2.6 Enjuague

2.6.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

2.6.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de condroitinasa.

2.6.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de piel) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

2.6.4 Decantar la solucion.

2.6.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

2.7 Desinfeccion

2.7.1 Transferir los injertos de tejido a un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

2.7.2 Verter solucion de acido peracetico al 0,1% (5 ml por 1 gramo de piel) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.7.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos cutaneos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

2.7.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 4 horas.

2.8 Enjuague

2.8.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

2.8.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de acido peracetico al 0,1%.

2.8.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de piel) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

2.8.4 Decantar la solucion.

2.8.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

2.9 Liofilizacion

2.9.1 Cargar los tejidos en el liofilizador.

2.9.2 Llevar a cabo el procedimiento de liofilizacion segun los parametros aplicables de liofilizacion - Operation of the VirTis Freeze Dryers.

2.9.3 Liofilizar los tejidos durante 2 a 10 dfas.

Ejemplo 4: Preparacion (B) de una matriz de tejido conectivo de fascia

2.10 Preparacion de tejidos conectivos de fascia

2.11 Enjuague de los tejidos

2.11.1 En funcion del peso del tejido determinado en la seccion 2.2, determinar el volumen de solucion salina normal libre de antibiotico que ha de utilizarse para una etapa de enjuague.

2.11.2 Anadir solucion salina normal nueva libre de antibiotico (5 ml de solucion salina por 1 gramo de fascia) en el tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

2.11.3 Repetir la etapa de enjuague tres (3) veces.

2.11.4 Repetir la etapa de enjuague tres (3) veces.

2.11.5 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

2.12 Enjuague

2.12.1 Transferir los tejidos de fascia a un tarro esteril de plastico.

2.12.2 Anadir agua esteril nueva (5 ml de solucion salina por 1 gramo de fascia) al tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

2.12.3 Retirar la tapa y decantar la solucion.

2.12.4 Repetir esta etapa de enjuague tres (3) veces.

2.12.5 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

2.12.6 Colocar cubetas separadas en el campo esteril y etiquetar cada una con el grosor del tejido.

2.12.7 Verter solucion salina normal esteril en cada cubeta.

2.12.8 Cortar tejidos en dimensiones especificadas utilizando un bisturf y una regla como gufa y colocarlos en la cubeta respectiva. Mantener cada cubeta separada cuando prosigue cada etapa de procesamiento. Colocar todos los recortes de tejido de fascia en el lado del campo esteril hasta que se hayan cortado todos los injertos.

2.12.9 Despues de que se corta cada injerto, colocar un injerto cortado con el lado inferior hacia abajo y la membrana superior orientada hacia arriba. Utilizando un bisturf, cortar con cuidado una muesca triangular pequena aproximadamente 0,5 cm por debajo de la esquina superior izquierda del injerto.

2.12.10 Colocar el injerto cortado con la muesca en la cubeta respectiva.

2.12.11 Repetir el procedimiento hasta que se hayan cortado todos los injertos con una muesca.

2.13 Incubacion en detergente (por lote de tejido)

2.13.1 Colocar los injertos de tejido de fascia en un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

2.13.2 Verter la solucion de BRIJ 35 al 0,5% (5 ml de solucion por 1 gramo de tejido) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.13.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

2.13.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 18-24 horas.

2.14 Preparar la solucion (solucion de acido peracetico al 0,1%).

2.15 Enjuague

2.15.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

2.15.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de detergente.

2.15.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de tejido) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

2.15.4 Decantar la solucion.

2.15.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

2.16 Desinfeccion

2.16.1 Transferir los injertos de tejido a un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

2.16.2 Verter solucion de acido peracetico al 0,1% (5 ml por 1 gramo de tejido) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.16.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

2.16.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 4 horas.

2.17 Enjuague

2.17.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

2.17.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de acido peracetico al 0,1%.

2.17.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de tejido) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

2.17.4 Decantar la solucion.

2.17.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

2.18 Liofilizacion

2.18.1 Cargar los tejidos en el liofilizador.

2.18.2 Llevar a cabo el procedimiento de liofilizacion segun los parametros aplicables de liofilizacion - Operation of the VirTis Freeze Dryers.

2.18.3 Liofilizar los tejidos durante 2 a 10 dfas.

Ejemplo 5: Preparacion de una matriz de tejido pericardico

2.19 Enjuague de los tejidos

2.19.1 En funcion del peso del tejido determinado en la seccion 2.2, determinar el volumen de solucion salina normal libre de antibiotico que ha de utilizarse para una etapa de enjuague.

2.19.2 Anadir solucion salina normal nueva libre de antibiotico (5 ml de solucion salina por 1 gramo de tejido) en el tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

2.19.3 Retirar la tapa y decantar la solucion.

2.19.4 Repetir la etapa de enjuague tres (3) veces.

2.19.5 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

2.20 Enjuague

2.20.1 Transferir los tejidos a un tarro esteril de plastico.

2.20.2 Anadir agua esteril nueva (5 ml de solucion salina por 1 gramo de tejido) al tarro esteril de plastico, cerrar el tarro con su tapa y agitar energicamente durante 15 segundos.

2.20.3 Retirar la tapa y decantar la solucion.

2.20.4 Repetir esta etapa de enjuague tres (3) veces.

2.20.5 Despues del ultimo enjuague, decantar la solucion.

2.20.6 Colocar cubetas separadas en el campo esteril y etiquetar cada una con el grosor del tejido.

2.20.7 Verter solucion salina normal esteril en cada cubeta.

2.20.8 Cortar tejidos en dimensiones especificadas utilizando un bisturf y una regla como gufa y colocarlos en la cubeta respectiva. Mantener cada cubeta separada cuando prosigue cada etapa de procesamiento. Colocar todos los recortes de tejido pericardico en el lado del campo esteril hasta que se hayan cortado todos los injertos.

2.20.9 Despues de que se corta cada injerto, colocar un injerto cortado con el lado inferior hacia abajo y la membrana superior orientada hacia arriba. Utilizando un bistun, cortar con cuidado una muesca triangular pequena aproximadamente 0,5 cm por debajo de la esquina superior izquierda del injerto.

2.20.10 Colocar el injerto cortado con la muesca en la cubeta respectiva.

2.20.11 Repetir el procedimiento hasta que se hayan cortado todos los injertos con una muesca.

2.21 Incubacion en detergente (por lote de tejido)

2.21.1 Colocar los injertos de tejido en un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

2.21.2 Verter la solucion de BRIJ 35 al 0,5% (5 ml de solucion por 1 gramo de tejido) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.21.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos cutaneos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

2.21.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 18-24 horas.

2.22 Incubar en condroitinasa ABC

2.22.1 Colocar los injertos de tejido en un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa

2.22.2 Verter la solucion salina que contiene 150 unidades de condroitinasa ABC (5 ml de solucion/1 gramo de tejido) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.22.3 Colocar en el agitador orbital y en la unidad de incubacion el tejido envuelto. Cerrar la tapa de la unidad. 2.22.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 4-6 horas.

2.23 Preparar la solucion (solucion de acido peracetico al 0,1%).

2.24 Enjuague

2.24.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

2.24.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de condroitinasa.

2.24.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de tejido) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

2.24.4 Decantar la solucion.

2.24.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

2.25 Desinfeccion

2.25.1 Transferir los injertos de tejido a un nuevo recipiente esteril de plastico con tapa.

2.25.2 Verter solucion de acido peracetico al 0,1% (5 ml por 1 gramo de tejido) en el recipiente y cerrar la tapa. Asegurarse de que todos los tejidos estan completamente sumergidos en la solucion.

2.25.3 Colocar en el agitador orbital/unidad de incubadora los tejidos envueltos. Cerrar la tapa de la unidad.

2.25.4 Fijar la velocidad del agitador orbital a 60 RPM y permitir que los tejidos den vueltas e incubar a 37°C durante 4 horas.

2.26 Enjuague

2.26.1 Despues de la incubacion, retirar de la unidad de incubadora/agitador los tejidos envueltos y desenvolver asepticamente el tarro.

2.26.2 Retirar la tapa del tarro y decantar la solucion de acido peracetico al 0,1%.

2.26.3 Anadir agua esteril (5 ml de solucion por 1 gramo de tejido) al recipiente y agitar energicamente durante 30 segundos.

2.26.4 Decantar la solucion.

2.26.5 Repetir el procedimiento ocho (8) veces.

2.27 Liofilizacion

2.27.1 Cargar los tejidos en el liofilizador.

2.27.2 Llevar a cabo el procedimiento de liofilizacion segun los parametros aplicables de liofilizacion - Operation of the VirTis Freeze Dryers.

2.27.3 Liofilizar los tejidos durante 2 a 10 dfas.

Ejemplo 6: Infiltracion celular sobre y en la matriz dermica procesada.

Se prepararon mediante la unidad de procesamiento muestras liofilizadas de dermis utilizando un sacabocados de biopsia de 10 mm (Acuderm Inc., Ft. Lauderdale, EE.UU.). La biocompatibilidad fue evaluada mediante contacto directo de celulas L929 y MIAMI (lfnea celular patentada segun se identifica y describe en la patente U.S. n° 7.807.458) con las muestras de matriz dermica durante diversos periodos de tiempo. Se llevo a cabo un ensayo histologico cualitativo y los resultados fueron recogidos y documentados.

Se formulo la hipotesis de que las muestras de tejido que carecen de agentes que pueden ser citotoxicos para celulas de mamiferos y que presentan una estructura matricial que, a escala molecular y macroscopica, proporciona un entorno que es adecuado y apropiado para una fijacion y proliferacion celulares eran biocompatibles para la fijacion y la proliferacion celulares. Cuando se sometieron a ensayo tales tejidos de esta forma y se hallo que son biocompatibles se adopta la firme premisa de que tales matrices de tejido tendran capacidad regenerativa cuando sean utilizadas clfnicamente en el tratamiento de patologfas.

Materiales y procedimientos:

Todos los procedimientos fueron llevados a cabo en una cabina de flujo laminar disenada para proporcionar un entorno esteril de trabajo. Se utilizaron herramientas y recipientes esteriles.

Procedimiento experimental:

1) Se expandieron y utilizaron celulas L-929 o celulas MIAMI antes de alcanzar la confluencia.

2) Cada muestra de matriz dermica fue transferida (membrana fundamental orientada hacia abajo) a pocillos individuales de placas de 24 pocillos (superficie de adherencia ultra baja, Corning, n° 3473) que contienen 500 pL de caldo de expansion de celulas L-929 o MIAMI.

3) Se recogieron y sembraron 10x103 o 200x103 celulas L929 o MIAMI directamente sobre la superficie de las muestras de tejido de matriz dermica en los pocillos (volumen final de caldo/pocillos: 1000 pL). Se utilizaron muestras de matriz dermica sin celulas como controles negativos.

4) Se incubaron las placas a 37°C y con un 5% de CO² en un oscilador (Rocker II, n° 260350, Boekel Scientific, 15 oscilaciones/min) y se recogieron muestras de tejido de matriz dermica y fueron colocadas en formol (4% de CH²O, 1% de metanol) para preparaciones histologicas en distintos dfas para proporcionar una comprension del comportamiento de las celulas tras un contacto a corto, medio y largo plazo con la dermis.

5) Se llevaron a cabo una inclusion en parafina, corte y tincion con hematoxilina/eosina de las muestras segun metodologfas histologicas estandar.

Resultados:

Las preparaciones histologicas fueron examinadas y se tomaron imagenes digitales de secciones representativas con el objetivo de ilustrar la adherencia de las celulas bien L-929 o bien MIAMI sobre las superficies de las muestras de tejido de matriz dermica, al igual que cualquier evidencia de proliferacion celular.

Segun se ilustra en las Figuras 1 y 2, la matriz dermica soporto con facilidad la fijacion celular y la proliferacion celular de celulas L-929 (Figura 1 de un primer donante y Figura 2 de un segundo donante). Segun se ilustra en la Figura 1, la colocacion en placas de unicamente una densidad reducida de celulas (10000 celulas/muestra) parece mostrar que las celulas L-929 proliferaron en contacto con la dermis, con unicamente pocas celulas observadas en instantes tempranos en comparacion con la cantidad observada tras 36 dfas.

De forma similar, segun se ilustra en la Figura 3, las celulas MIAMI menos robustas tambien sobrevivieron en contacto con la matriz dermica.

Se vio que ambos tipos de celulas infiltraban el tejido, indicando, de ese modo, que la matriz dermica era biocompatible y soporta con facilidad el crecimiento celular en una situacion in vitro.

Ejemplo 7A: Reduccion del ADN extrafble en muestras de matriz dermica.

Se utilizo una extraccion y una cuantificacion del ADN de una matriz dermica para reflejar la eficacia del procedimiento de descelularizacion.

Materiales y procedimientos:

El ADN fue cuantificado en:

- Dermis nueva, no procesada

- Dermis lavada, liofilizada

Nota: todos los materiales que hicieron contacto con las muestras eran esteriles para evitar una contaminacion exogena del ADN. Se utilizo el kit (QIAamp DNA Mini, Qiagen, n° 51304) de extraccion de ADN segun las instrucciones del fabricante, con las modificaciones segun se describen en el siguiente procedimiento. Cada etapa relacionada con el kit fue llevada a cabo a temperatura ambiente.

1) Se pesaron las muestras de dermis y se transfirieron aproximadamente 10 mg a tubos esteriles de microcentrifugadora de 2 ml (eppendorfs®). Se registro el peso exacto en el cuaderno del laboratorio. Para las muestras no lavadas se utilizaron 1,5 mg.

2) Se ajusto el volumen del tampon de lisis tisular (tampon ATL) por muestra segun su peso (360 pl de tampon de lisis/5 mg, y 360 pl/1,5 mg).

3) El volumen de proteinasa K por muestra fue ajustado segun su peso (40 p de proteinasa K/5 mg de muestra y mismo volumen para 1,5 mg), fue anadido y mezclado mediante centrifugacion con impulsos durante 15 seg.

4) Las muestras fueron incubadas a 56°C durante 20 h hasta que fueron lisadas completamente.

5) Se colocaron 400 pl de cada muestra en un nuevo tubo eppendorf y se anadieron 8 pl de RNasa A (100 mg/ml), mezclados mediante centrifugacion con impulsos durante 15 seg e incubados durante 2 min a temperatura ambiente.

6) Se anadieron 400 pl de tampon de lisis (tampon AL) y fueron mezclados mediante centrifugacion con impulsos durante 15 seg.

7) Se incubaron las muestras a 70°C durante 10 min.

8) Se anadieron 400 pl de etanol (100%) y fueron mezclados mediante centrifugacion con impulsos durante 15 seg.

9) Se transfirieron la mitad de los lisados (600 pl) a las columnas QIAamp MinElute.

10) Las columnas fueron centrifugadas a 6000g durante 1 min.

11) Se colocaron las columnas en tubos limpios de toma de muestras de 2 ml. Se repitieron las etapas 9, 10 y 11 con la otra mitad del lisado en la misma columna.

12) Se anadieron 500 pl de tampon de lavado (tampon AW1) a las columnas y fueron centrifugadas a 6000g durante 1 min.

13) Se colocaron las columnas en tubos limpios de toma de muestras de 2 ml.

14) Se repitieron las etapas 12 y 13.

15) Se anadieron 500 pl de tampon de lavado (tampon AW2) y fueron incubados durante 2 min antes del centrifugado a 18.000g durante 1 min.

16) Se colocaron las columnas en tubos limpios de toma de muestras de 2 ml.

17) Se anadieron 500 pl de tampon de lavado (tampon AW2) y fueron incubados durante 2 min antes del centrifugado a 18.000g durante 3 min.

18) Se colocaron las columnas en tubos limpios de toma de muestras de 2 ml.

19) Se centrifugo la columna a 18.000g durante 1 min para secar la membrana.

0) Se colocaron las columnas en tubos limpios de toma de muestras de 2 ml.

21) Se aplicaron 100 pl de tampon TE en el centro de la columna y fueron incubados a temperatura ambiente (15-25°C) durante 5 min.

2) Se centrifugaron las columnas a 6000g durante 1 min.

23) Se colocaron las columnas en otro tubo limpio de microcentrifugadora.

24) Se repitieron las etapas 21-23 dos veces.

25) Las muestras fueron centrifugadas y luego se determino la concentracion de ADN utilizando un espectrofotometro Nanodrop ND-1000 (Thermo Fischer Scientific). El instrumento fue inicializado utilizando agua y dejado virgen utilizando tampon TE.

Resultados:

Se determino la cantidad de ADN extrafdo de cada muestra dermica, proporcionando los resultados mostrados a continuacion:

Tabla 1

Tabla 2

Conclusion:

Se analizaron dos muestras nuevas no procesadas de dermis de distintos donantes. Ambas tenfan contenidos similares de ADN (0,83 y 0,66 pg de ADN/mg de tejido). Las muestras de dermis fueron procesadas segun el procedimiento de la presente invencion, tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Esta muestra de dermis analizada tenia un 90% menos de ADN que la muestra nueva no procesada del mismo donante (0,085 y 0,83 pg de ADN/mg de tejido, respectivamente). Esto se muestra en las anteriores Tablas 1 y 2 y se muestra en el grafico de la Figura 4.

Ejemplo 7B: Efectos del detergente y del acido peracetico en la reduccion de ADN extraible en muestras de matriz dermica.

Se prepararon muestras de matriz dermica mediante la unidad de procesamiento utilizando un sacabocados de biopsia de 10 mm (Acuderm Inc., Ft. Lauderdale, EE. UU.). Se cuantifico el ADN en las muestras tomadas en etapas de procesamiento previo al detergente, de procesamiento posterior al detergente y de procesamiento posterior al acido peracetico. Se analizaron varios donantes durante estas 2 etapas. Se utilizaron cinco muestras de cada donante individual para promediar los resultados:

Procedimiento de extraccion de ADN:

1) Las muestras recogidas de la sala de procesamiento fueron congeladas instantaneamente en nitrogeno liquido para evitar la degradacion del ADN.

2) Descongelar lentamente las muestras sobre hielo.

3) Se elimino el exceso de agua de las muestras colocandolas sobre papel secante esteril durante 2-3 minutos. Nota: todos los materiales que hacfan contacto con las muestras son esteriles y evitan una contaminacion exogena del ADN.

4) Se escindieron submuestras con un peso aproximado de 12,5 mg de cada muestra y fueron transferidas a tubos esteriles de microcentrifugadora (Eppendorf®). Se registro el peso exacto en el cuaderno del laboratorio.

Nota: se utilizo un kit (QIAamp DNA Mini, Quiagen, n° 51304) de extraccion de ADN segun las instrucciones del fabricante, con modificaciones segun se describe a continuacion. Se llevaron a cabo todas las etapas a temperatura ambiente.

5) Anadir 180 pL de tampon de lisis tisular (tampon ATL) a cada muestra.

6) Disociar completamente las muestras mediante el uso de microtijeras.

7) Anadir 40 pL de proteinasa K y mezclarlos mediante centrifugacion con impulsos durante 15 segundos.

8) Incubar a 56°C durante la noche para lisar por completo la muestra.

9) Anadir 4 pL de RNasa A (100 mg/ml), mezclarlos mediante centrifugacion con impulsos durante 15 segundos e incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.

10) Anadir 200 pL tampon de lisis (tampon AL) y mezclarlos mediante centrifugacion con impulsos durante 15 s. 11) Incubar a 70°C durante 10 minutos.

12) Anadir 200 pL de etanol (100%) y mezclarlos mediante centrifugacion con impulsos durante 15 segundos.

13) Transferir con cuidado todo el lisado a la columna QIAamp MinElute.

14) Centrifugar a 6000g durante 1 min.

15) Colocar la columna QIAamp MinElute en un tubo limpio de toma de muestras de 2 mL y desechar el tubo de toma de muestras que contiene el flujo pasante.

16) Anadir 500 pL de tampon de lavado (tampon AW1) y centrifugar a 6000g durante 1 minuto.

17) Colocar la columna QIAamp MinElute en un tubo limpio de toma de muestras de 2 mL y desechar el tubo de toma de muestras que contiene el flujo pasante.

18) Anadir 500 pL de tampon de lavado (tampon AW2) y centrifugar a 20000g durante 3 minutos.

19) Colocar la columna QIAamp MinElute en un tubo limpio de toma de muestras de 2 mL y desechar el tubo de toma de muestras que contiene el flujo pasante.

20) Centrifugar a 20.000 x g durante 1 minuto para secar la membrana.

21) Colocar la columna QIAamp MinElute en un tubo limpio de microcentrifugadora y desechar el tubo de toma de muestras que contiene el flujo pasante.

22) Aplicar 200 pL de tampon de elucion (tampon AE) e incubarlos a temperatura ambiente (15-25°C) durante 1 minuto.

23) Centrifugar a 6000 x g durante 1 minuto.

24) Colocar la columna QIAamp MinElute en otro tubo limpio de microcentrifugadora y repetir las etapas 22-23.

25) Cuantificar la concentracion de ADN bicatenario en las muestras utilizando un espectrofotometro Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific). Inicializar el instrumento utilizando agua y dejarlo virgen utilizando tampon de elucion (tampon AE).

Resultados:

Se calcula la cantidad de ADN presente por peso de una muestra a partir de la cantidad media de las 2 muestras de ADN recogidas en las etapas 23 y 24 del protocolo. Se promedian entonces, para una unica etapa, los resultados obtenidos en cinco muestras para proporcionar los resultados presentados en la siguiente tabla:

Tabla 3

Conclusion:

De media, los experimentos llevados a cabo en 3 donantes (5 muestras por donante en cada etapa), revelaron que se elimino un 63±15% de ADN entre las etapas previa al BRIJ y las etapas posteriores al PAA.

Ejemplo 8: Inhibicion de la proliferacion celular y de la actividad celular de tejido de fascia no procesado y un ejemplo de elementos presentes en tejido no procesado que pueden inhibir la fijacion y la proliferacion celulares a tejidos en condiciones in vivo y/o in vitro.

Se prepararon muestras congeladas de tejido de fascia mediante la unidad de procesamiento para su uso en este estudio. Las muestras de tejido de fascia solo fueron desbridadas de elementos sangufneos extrfnsecos y no fueron procesadas segun la presente invencion. Para valorar las propiedades de inhibicion celular de extractos de estos tejidos, se extrajeron compuestos presentes en los productos finales durante 24 horas siguiendo las normas generales ISO 10993-5 e ISO 10993-12. Entonces, se aplicaron medios de extraccion, que contenfan los compuestos inhibidores potenciales, a las celulas de fibroblastos en cultivo (lfnea celular L-929 ATCC n° CCL-1). Se llevo a cabo una valoracion cuantitativa de la densidad de celulas sanas utilizando un ensayo de proliferacion celular CyQUANT® Direct mientras que se llevaron a cabo valoraciones cualitativas de la morfologfa celular mediante observacion microscopica.

Se escogio el ensayo de proliferacion celular CyQUANT® Direct por su capacidad para proporcionar una medida de densidad de celulas viables en un experimento de una unica etapa. De hecho, combina una tincion de union a ADN y un reactivo de supresion de fondo. La tincion de union a ADN es un reactivo permeable a las celulas vivas que se concentra principalmente en el nucleo de celulas de mamfferos metabolicamente viables, mientras que la tincion de supresion es impermeable a las celulas vivas (viables) y apaga la fluorescencia de la tincion de union a ADN en celulas con una membrana celular comprometida. La combinacion de estos dos componentes tiene como resultado un ensayo basado tanto en el contenido del ADN como en la integridad de la membrana celular.

Se emitio la hipotesis de que la evaluacion de citotoxicidad de extractos de materiales implica una extraccion de agentes potencialmente toxicos de materiales y una aplicacion subsiguiente de estos extractos a una poblacion de celulas metabolicamente viables de mamfferos. El ensayo de proliferacion celular CyQUANT® Direct utiliza una tincion que se une a acidos nucleicos y se unira con el ^a Dⁿ de celulas tanto vivas como metabolicamente no vivas. Sin embargo, el ensayo tambien emplea un reactivo de supresion de fondo que suprimira la fluorescencia de la tincion. Dado que el reactivo de supresion de fondo no penetrara en el interior de una celula viable, cualquier celula viable en la poblacion de celulas tendra fluorescencia, pero las celulas no vivas no la tendran debido a la accion de apagado del reactivo de supresion de fondo. Por lo tanto, este ensayo es una herramienta util para determinar los porcentajes de celulas viables con respecto a las no viables en una poblacion de celulas y cualquier extracto de material que contenga agentes extrafbles toxicos a una celula de mamffero alterara este porcentaje de celulas viables con respecto a las no viables y, por lo tanto, puede ser utilizado para determinar de forma cuantitativa la toxicidad de los extractos.

Materiales y procedimientos:

Todos los procedimientos fueron llevados a cabo en un entorno aseptico de trabajo. Se adaptaron los siguientes materiales y condiciones a partir de las recomendaciones descritas en ISO 10993-12.

Etapas experimentales:

1) Se diseccionaron muestras cuadradas de 1 cm2 de fascia humana y fueron colocadas en los pocillos de una placa de 6 pocillos de baja adherencia (total de 21 cm2/pocillos), 1 pocillo/donante (Costar, n° 3471).

2) Se registro el peso total de las muestras y se anadieron 7 mL de caldo de extraccion a cada pocillo (caldo de expansion celular L-929):

- a-MEM (Gibco, n° 12571)

- 10% de suero fetal bovino

- 1% de penicilina/estreptomicina

Nota: La presencia de suero bovino fetal deberfa permitir la extraccion de materiales lixiviables polares y no polares. Segun ISO 10993-12, el volumen de extraccion deberfa ser de 1 mL para 3 cm2 de muestras (grosor > 0,5 mm). 2) Entonces, se colocaron las muestras en un oscilador y fueron incubadas durante 24 horas a 37°C en una incubadora (atmosfera con >90% de humedad y 5% de CO²). Tambien se incubo caldo por si solo para controles de L-929 y controles positivos (SDS).

3) Fueron colocadas en placas 20.000 celulas L-929 subconfluentes/pocillos en una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos (cultivo tisular tratado, Costar n° 3904) en un volumen final de 100 pL de medio de expansion. Se sembro otra placa negra con una densidad de 10.000 celulas/pocillo para garantizar el uso de celulas subconfluentes en el momento del ensayo (es decir, el dfa 3).

4) El caldo de extraccion fue recogido en tubos Falcon de 15 mL y centrifugado a 300g durante 10 minutos para eliminar partfculas/celulas grandes extrafdas de la fascia (siendo fascia un injerto congelado; de hecho, se observaron las celulas en el medio de extraccion si no se llevaba a cabo esta etapa, lo que tenia como resultado un sesgo en el siguiente ensayo Cyquant®).

5) Se aplico el sobrenadante del medio de extraccion a las celulas L-929 colocadas en placas el dfa 1 (eliminacion del caldo de expansion y adicion de 100 pL de medio de extraccion/pocillo). Al mismo tiempo, se llevaron a cabo controles negativo, positivo y en virgen:

- control negativo: celulas en el medio incubado de expansion (5 pocillos).

- control positivo: celulas, 0,1 y 0,2 mg/ml de SDS (dodecilsulfato de sodio) en medio incubado de expansion (5 pocillos/cada concentracion de SDS).

- variable experimental: celulas y medio de extraccion (5 pocillos/donante).

- en virgen: unicamente medio incubado de expansion, sin celulas, ni tejido (2 pocillos por cada condicion individual).

6) Se incubaron las placas durante otras 24 horas a 37°C en una incubadora. (Nota: para crear una curva de calibracion, las celulas L-929 fueron colocadas en placas partiendo de concentraciones que variaban desde 0 hasta 60.000 celulas por pocillo de una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos).

7) Se llevaron a cabo evaluaciones cualitativas de la morfologfa celular mediante observaciones microscopicas antes de efectuar la cuantificacion de celulas sanas utilizando el ensayo de proliferacion celular CyQUANT® Direct (Invitrogen, n° 35012).

Nota: todas las siguientes etapas fueron llevadas a cabo evitando una exposicion directa a la luz.

8) Se preparo reactivo Cyquant® segun la siguiente receta (para 12 ml de reactivo):

- 11,7 mL de PBS

- 48 pL de tincion de acidos nucleicos CyQUANT® Direct

- 240 pL de supresor de fondo CyQUANT® Direct

9) Se mezclo bien la anterior solucion antes de anadir 100 pL de la misma a cada pocillo de la placa que contenfa las celulas L-929.

10) Entonces, se incubo la placa durante 1 hora a 37°C en una incubadora.

11) Se eliminaron las burbujas de aire (si las habfa) utilizando una aguja de calibre 26 para evitar interferencias. 12) Se leyo la fluorescencia a la longitud de onda de excitacion/emision de 485/535 nm en un modo de mfnimo (SpectraMax Gemini EM, Molecular Devices).

Resultados:

Como puede observarse en la Figura 5, la senal fluorescente era proporcional a la densidad celular, con una buena respuesta lineal. Los resultados obtenidos con los controles positivos y los grupos experimentales sometidos a ensayo son resumidos en la Figura 6.

Como puede verse en la Figura 6, la exposicion de las celulas L-929 al medio de extraccion durante 24 horas tuvo poco efecto sobre la densidad de celulas sanas. Es importante hacer notar que la densidad celular utilizada afecto muchfsimo los resultados obtenidos. De hecho, las celulas parecfan ser mas sensibles a compuestos inhibidores cuando fueron colocadas en placas a 20kc.

Es importante hacer notar que los resultados de cuantificacion obtenidos con el ensayo Cyquant® apenas se correlacionaban con las observaciones microscopicas en la Figura 7: las celulas de control (A, y mayor aumento B) eran densas y estaban muy dispersas sobre la superficie de los pocillos de plastico. Las celulas expuestas al medio de extraccion (C, y mayor aumento D) eran menos densas y una fraccion elevada de las mismas era redondeado, a pesar de que el ensayo Cyquant® parece indicar que estas celulas segufan teniendo una membrana sana en comparacion con las celulas expuestas a SDS (0,1 mg/mL de SDS (E) o 0,2 mg/mL (F)).

Conclusion:

Segun los criterios descritos en ISO 10993-5, se considera que los ensayos de cuantificacion que tienen como resultado mas de un 30% de reduccion en la viabilidad celular un efecto citotoxico o de inhibicion celular. Los resultados promediados obtenidos en los 5 donantes de este experimento estuvieron precisamente en el lfmite de este umbral del 30% (ligeramente menor para una de las fascias procesadas del donante UBO9084).

Los documentos ISO tambien proporcionan direcciones en cuanto a una evaluacion morfologica cualitativa de la toxicidad/inhibicion celular (vease la Tabla 4).

Tabla 4 - Clasificacion morfologica cualitativa de citotoxicidad de extractos

Segun esta tabla, a pesar de una inhibicion del crecimiento de aproximadamente un 30%, mas de un 50% de las celulas eran redondeadas despues de una exposicion al medio de extraccion, por lo que se puede concluir de forma razonable que los elementos presentes en el tejido normal pueden ser inhibidores de una infiltracion celular en tales tejidos y que la eliminacion de estos elementos inhibidores deberfa facilitar una naturaleza regenerativa de los tejidos procesados.

Ejemplo 9: Biocompatibilidad de una matriz de tejido dermico micronizado

El fin de este experimento es someter a ensayo y documentar la biocompatibilidad de dermis micronizada producida mediante el procedimiento de la presente invencion. Se prepararon muestras de dermis micronizada liofilizadas segun el procedimiento descrito en la presente memoria para obtener dermis micronizada. La biocompatibilidad fue evaluada mediante contacto directo de las muestras con celulas L-929 (ATCC n°CCL-1, fuente: Mus musculus) durante dos meses. Se llevo a cabo una evaluacion cualitativa de la morfologfa celular mediante observacion microscopica. Se llevo a cabo una evaluacion cuantitativa de la densidad de celulas sanas utilizando el ensayo de proliferacion celular CyQUANT®.

Procedimiento:

Nota: todos los procedimientos fueron llevados a cabo en una cabina de flujo laminar en condiciones asepticas. Los siguientes materiales y condiciones han sido adaptados a partir de las recomendaciones descritas en ISO 10993-12 e ISO 10993-xx.

Dfa 1

Se prepararon muestras (lote 2) de dermis micronizada acelular liofilizadas segun el procedimiento de la presente invencion. Dermis micronizada del donante BO39698, UBO 0099050202-12; tamano de partfcula sometida a ensayo 25-300 pm.

Se peso la dermis micronizada y luego fue mezclada con caldo preparado, a-MEM Gibco (lote n° 1045867), con un 10% de suero fetal bovino, P^aA (lote n° 20411-7008) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Sigma, 051M0853), centrifugada y colocada en una placa de adherencia ultra baja de 6 pocillos (Corning, Costar n° 3471, lote n° 08711003, fecha de caducidad 27/03/2014), segun la Tabla 5.

Tabla 5

El cultivo P5 de L-929 subconfluentes fue dividido y contado segun protocolos estandar.

Tres de las muestras de dermis micronizada fueron sembradas con 800.000 celulas L-929, dos muestras fueron utilizadas como control sin celulas. Se incubaron las muestras durante 2 meses a 37°C, 5% de CO² , >90% de humedad (equipo n° 08-016). Tambien se coloco caldo por si solo en la misma placa y fue incubado en las mismas condiciones.

Dias 2-55

Se cambio la mitad del caldo dos veces por semana. Se tomaron fotograffas los dfas 10, 16 y 30.

Dfa 57

Se recogieron y dividieron cultivos de L-929 (P6) segun el protocolo estandar y se colocaron 300.000 celulas en 2 ml de caldo recien preparado en un tubo de centrifugadora. Estas celulas fueron utilizadas posteriormente para una curva de calibracion. Se centrifugaron las celulas, junto con una muestra de dermis micronizada sembrada y un control. El sobrenadante fue desechado y los sedimentos fueron congelados a -80°C.

Dfa 60

Se recogieron y centrifugaron dos muestras de dermis micronizada y un control, se desecho el sobrenadante y los sedimentos fueron congelados a -80°C.

Dfa 61

Se llevo a cabo una evaluacion cuantitativa de densidad de celulas sanas utilizando el kit de ensayo de proliferacion celular CyQUANT® (lote n° 1050079), C7026.

1) Se preparo reactivo CyQUANT® mezclando 7,6 ml de H²O, 400 pl de tampon y 100 pl de Cyquant. El tampon de lisis obtenido fue administrado de la siguiente forma:

• se anadieron 200 pl a los pocillos A1-H1 en una placa negra de 96 pocillos (Corning Costar 3650, lote n° 24211045, fecha de caducidad 30/8/2013) para la curva de calibracion.

• se anadieron 200 pl a los sedimentos celulares en un tubo de centrifugadora (300.000 a -80°C) para la curva de calibracion

• se anadieron 800 pl a una muestra de dermis micronizada (control) en una placa negra de 96 pocillos (3 pocillos) • se anadieron 800 pl a las muestras de dermis micronizada sembrada con celulas L-929 en una placa negra de 96 pocillos (6 pocillos, 3 cada una)

2) Las muestras fueron centrifugadas.

3) Pipetar con cuidado, homogeneizar y anadir 200 pi de la suspension celular en el pocillo A1.

4) Pipetar 200 pl de la solucion de A1 a B1 para crear una curva de calibracion.

5) Pipetar con cuidado y homogeneizar sin crear burbujas, continuar el procedimiento hasta el pocillo G1 (H1=virgen).

6) Pipetar 200 pl de la solucion en G1 y desecharlos.

7) Centrifugar ligeramente y colocar en placa las muestras y el control.

8) Proteger de la luz, cubrir la placa con papel de aluminio.

9) Incubar durante 5-15 minutos a temperatura ambiente.

10) Se leyo la fluorescencia a la longitud de onda de excitacion/emision de 480/520 nm en un modo de maximo utilizando una Molecular Devices Flex Station 3.

Analisis e interpretacion de los datos:

Las muestras recogidas el dfa 60 muestran un mayor numero de celulas que las recogidas el dfa 57, segun se prevefa. Las celulas L-929 proliferaron y sobrevivieron durante 60 dfas unidas a la matriz de dermis micronizada, lo que muestra que esta matriz es biocompatible. Veanse la siguiente Tabla 6 y las Figuras 8 y 9 para estos datos cuantitativos.

Tabla 6

Analisis cualitativo:

Se examinaron las muestras microscopicamente y se tomaron microfotograffas digitales de cada condicion con el objetivo de ilustrar la proliferacion celular y la adherencia de las celulas a la matriz dermica. Todas las microfotograffas fueron tomadas a 100x a no ser que se haga notar lo contrario. Se tomaron microfotograffas similares de muestras de dermis micronizada en las que no habfa celulas L-929 sembradas para que sirviesen de control.

El dfa 10, mostrado en la Figura 10, las celulas L-929 parecfan sanas y agregadas en la superficie de la dermis micronizada (A-C). Tambien se muestra (B) un detalle a 200x. El control negativo (D) muestra unicamente dermis micronizada de 25-300 pm. Esto continua el dfa 16, mostrado en la Figura 11. El dfa 30, mostrado en la Figura 12, las celulas siguen estando sanas y agregadas a la superficie de la dermis micronizada (A-C).

Conclusiones:

La dermis micronizada producida mediante el procedimiento de la presente invencion tiene una estructura de matriz que es biocompatible y proporciona un entorno que es adecuado y apropiado para la fijacion y la proliferacion celulares.

Ejemplo 10: Resorcion de matriz de tejido dermico micronizado tras la inyeccion en ratones calvos.

El fin de este estudio fue examinar la resorcion durante cuatro semanas del producto de matriz dermica micronizada inyectado subcutaneamente en cualquier lado de la columna vertebral de un raton calvo.

Se emitio la hipotesis de que el producto de matriz dermica no deberfa ser resorbido rapidamente en un raton calvo, utilizando un producto competitivo como control positivo. El tamano del sitio de inyeccion no deberfa cambiar de forma significativa. Sin embargo, esta medida es bastante subjetiva. Tambien se examinara la evidencia histologica de la resorcion.

Materiales y procedimientos:

Cada raton fue inyectado subcutaneamente con un artfculo de ensayo y de control. Se examinaron los sitios de inyeccion mediante palpacion y medicion al acabar. Se obtuvieron los pesos corporales en el momento de la inyeccion, diariamente durante la primera semana, luego dos veces durante cada semana a partir de entonces, siendo recogidos los pesos al acabar. Se observaron los animales a diario en la jaula buscando signos de salud clfnica general.

Al final de la duracion programada, se sacrificaron los animales designados. Los sitios de inyeccion fueron palpados y medidos y el tejido circundante fue escindido quirurgicamente. Se colocaron los tejidos en formol para su fijacion. Entonces, las muestras fueron tincionadas con H&E, azul alcian, tricromo y para buscar elastina.

Se sugiere el raton como un animal modelo apropiado para evaluar la biocompatibilidad mediante las normas generales actuales ISO de ensayo. El tamano del grupo esta basado en la cantidad minima de animales requerida para una evaluacion biologica. Se escogio el numero de animales para proporcionar cierto sentido estadfstico en los resultados.

Se selecciono la via de exposicion de inyeccion subcutanea debido a que es la via prevista de administracion en seres humanos.

Nota: todos los procedimientos fueron llevados a cabo en un entorno aseptico de trabajo. Los siguientes materiales y condiciones fueron adaptados a partir de las recomendaciones descritas en ISO 10993-12.

Resultados:

Palpaciones y mediciones

Tabla 6: area media por instante de medicion

Observaciones histologicas

Tabla 7

Observaciones generales:

El implante del artfculo de control fue mixoideo con celularidad poco densa. En el implante del artfculo de ensayo, el colageno es mas denso y menos celular.

Conclusiones:

Tanto el artfculo de control como el artfculo de ensayo muestran la evolucion de una pseudocapsula subdermica con una inflamacion leve. Ninguno muestra una respuesta inflamatoria significativa ni celulas gigantes. El artfculo de control consiste en tejido suelto, vagamente mixoideo, fibroconectivo. La angiogenesis esta mas desarrollada en el artfculo de control que en el artfculo de ensayo. El artfculo de ensayo consiste en colageno desorganizado mas maduro con fibroblastos quiescentes. En consecuencia, el artfculo de ensayo es mas “activo”.

Ejemplo 11: Datos clfnicos de cicatrizacion de heridas utilizando una matriz de tejido dermico como injerto

Se suministraron matrices de tejido dermico en forma de injertos de tejido a diversos clfnicos para comprobar si los injertos podrfan fomentar una reparacion regenerativa de tejido blando en aplicaciones in situ en seres humanos. Los clfnicos siguieron sus propios procedimientos y protocolos para aplicar y/o utilizar los injertos de tejido de matriz dermica en heridas de sus pacientes. Al menos dos proporcionaron datos de sus resultados, mostrados en las Figuras 13 y 14.

Especfficamente, en la Figura 13 se coloco un injerto de 4x4 cm de matriz dermica, tal como una capa dermica, en un area de piel herida (panel A). El dfa 12 (panel B), la herida ya comenzaba a cicatrizar, como es evidente por el tejido de granulacion que se desarrollaba en el sitio, al igual que por el tamano reducido de la herida. El dfa 40 (panel C), la herida ya estaba cicatrizada casi por completo. Mas que simplemente cicatrizar, se producfa una regeneracion, segun se indica mediante la falta de cicatrizacion en el tejido.

La Figura 14, tomada de un paciente distinto, tambien muestra una reparacion regenerativa. El dfa 1 (panel A), se coloco un injerto de matriz dermica en una herida posteriormente a la radiacion. Al dfa siguiente (panel B), la infiltracion celular ya era observable. El dfa 30 (panel C), la regeneracion del tejido herido estaba muy avanzada.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para preparar una matriz de tejido adecuada para una reparacion regenerativa de tejido blando, que comprende:

poner en contacto una porcion aislada de tejido conectivo con un tensioactivo,

poner en contacto el tejido conectivo con un desinfectante, reduciendo al menos uno de proteoglicanos, lipidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos y antfgenos de complejo principal de histocompatibilidad (CPH) que inhiben la infiltracion y la fijacion celulares, y deshidratando la matriz resultante de tejido para su almacenamiento, y que comprende, ademas, reducir el contenido de proteoglicanos del tejido conectivo en un intervalo de 30% hasta un 50%, de forma que la matriz de tejido contenga un 50% hasta un 70% de proteoglicanos extrafbles.

2. El procedimiento segun se indica en la reivindicacion 1, que comprende, ademas, reducir el contenido de lipidos y de fosfolfpidos del tejido conectivo en al menos un 70%, preferentemente en un intervalo de 70% hasta un 95%.

3. El procedimiento segun se indica en la reivindicacion 1, que comprende, ademas, reducir el contenido de acidos nucleicos del tejido conectivo en al menos un 30%, preferentemente en un intervalo de 30% hasta un 90%.

4. El procedimiento segun se indica en la reivindicacion 1, que comprende, ademas, reducir el contenido de antigeno de complejo principal de histocompatibilidad (CPH) I y II del tejido conectivo en al menos un 85%, preferentemente en un intervalo de 85% hasta un 99%.

5. El procedimiento segun se indica en la reivindicacion 1, que comprende, ademas, eliminar endotoxinas del tejido conectivo.

6. El procedimiento segun se indica en la reivindicacion 1, que comprende, ademas, poner en contacto el tejido conectivo con una enzima condroitinasa, preferentemente condroitinasa ABC, para reducir al menos uno de proteoglicanos, lipidos, fosfolfpidos, antfgenos de complejo principal de histocompatibilidad (CPH) I y II y endotoxinas en el tejido conectivo.

7. El procedimiento segun se indica en la reivindicacion 1, que comprende, ademas, poner en contacto el tejido conectivo con una endonucleasa para reducir los acidos nucleicos en el tejido conectivo y con una enzima lipasa para reducir al menos uno de lipidos, fosfolfpidos y endotoxinas en el tejido conectivo.

8. El procedimiento segun se indica en la reivindicacion 1, en el que dicho tensioactivo comprende al menos un tensioactivo anionico, un tensioactivo no ionico, un tensioactivo cationico y combinaciones de los mismos, en el que, preferentemente, dicho tensioactivo es un detergente que comprende al menos uno de un detergente anionico, un detergente no ionico, un detergente cationico y combinaciones de los mismos.

9. El procedimiento segun se indica en la reivindicacion 1, en el que dicho desinfectante comprende al menos uno de acido peracetico, dioxido de cloro, peroxido de hidrogeno, yoduro de polivinilpirrolidina, formaldehfdo, glutaraldehfdo, fenoxietanol, metilparabeno, propilparabeno, hidroximetilglicinato de sodio, urea de diazolidinilo, DMDM hidantofna, butilcarbamato de yodopropinilo, propilenglicol y combinaciones de los mismos.

10. Una matriz de tejido que puede obtenerse mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su uso en la reparacion regenerativa de tejido blando, comprendiendo dicha matriz de tejido: una porcion de soporte estructurada para proporcionar una forma a la matriz de tejido y una porcion no estructural dispuesta en una relacion intercalada en al menos una parte de dicha porcion de soporte, estando estructuradas colectivamente dicha porcion de soporte y dicha porcion no estructural para fomentar la infiltracion, la fijacion y la proliferacion celulares de al menos una celula anfitriona en la matriz de tejido tras la implantacion o el transplante de la matriz de tejido en un tejido anfitrion, comprendiendo dicha porcion de soporte y dicha porcion no estructural niveles reducidos de al menos uno de proteoglicanos, lipidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos, antfgenos de complejo principal de histocompatibilidad (CPH) y endotoxinas, estando reducidos los niveles de proteoglicanos en un intervalo de 30% hasta un 50%, de forma que la matriz de tejido retenga un 50% hasta un 70% de proteoglicanos extrafbles.

11. La matriz de tejido segun se indica en la reivindicacion 10, en la que al menos una de dicha porcion estructural y de dicha porcion no estructural ha sido acelularizada, al menos parcialmente.

12. Un kit para una reparacion regenerativa de tejido blando, comprendiendo dicho kit: una matriz tisular de tejido conectivo aislado segun cualquiera de las reivindicaciones 10-11, comprendiendo dicha matriz de tejido niveles reducidos de al menos uno de proteoglicanos, lipidos, fosfolfpidos, acidos nucleicos, antfgenos de complejo principal de histocompatibilidad (CPH) y endotoxinas, estando estructurada dicha matriz de tejido para fomentar la infiltracion, la fijacion y la proliferacion celulares de al menos una celula anfitriona en la matriz de tejido tras su implantacion o transplante de la matriz de tejido en un tejido anfitrion.

13. El kit segun se indica en la reivindicacion 12, que comprende, ademas, una cantidad de solucion de transferencia para transferir dicha matriz de tejido a un tejido anfitrion.

14. El kit segun se indica en la reivindicacion 12, que comprende, ademas, al menos un reactivo de ensayo para su uso en la deteccion de una reparacion regenerativa en un tejido, estando estructurado dicho reactivo de ensayo para su uso en la deteccion de al menos uno de infiltracion celular, fijacion celular, proliferacion celular, diferenciacion celular y materiales sintetizados en un tejido, y que son seleccionados, preferentemente, de al menos un compuesto fluorescente, una etiqueta molecular, un sustrato de etiqueta molecular, una enzima, un radioisotopo, atomos pesados, un gen indicador, un vector, un compuesto luminiscente y un anticuerpo.