ES2692774T3 - Composición para estimulación ovárica controlada - Google Patents

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ES2692774T3 ES17154031.3T ES17154031T ES2692774T3 ES 2692774 T3 ES2692774 T3 ES 2692774T3 ES 17154031 T ES17154031 T ES 17154031T ES 2692774 T3 ES2692774 T3 ES 2692774T3
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Abstract

Un producto que comprende FSH para su uso en el tratamiento de la esterilidad en un sujeto que está en riesgo de OHSS y que tiene un nivel de AMH en suero de 6GE;15 pmol/l, en el que el producto va a administrarse a una dosis de, o dosis equivalente a, 0,09 a 0,19 μg de FSH recombinante derivada de línea celular de un ser humano por kilogramo de peso corporal del paciente por día, en donde la FSH incluye α2,3- y α2,6-sialilación, en el que del 1% al 99% de la sialilación total es α2,6-sialilación.

Description

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DESCRIPCION
Composicion para estimulacion ovarica controlada
La presente invencion se refiere a composiciones y a productos farmaceuticos para el tratamiento de la esterilidad.
Se conocen ampliamente tecnicas de tecnologfa de reproduccion asistida (ART) tales como la fecundacion in vitro (IFV). Estas tecnicas de ART requieren generalmente una etapa de estimulacion ovarica controlada (COS), en la que se estimula una cohorte de folmulos hasta su completa madurez. Los regfmenes de COS convencionales incluyen la administracion de gonadotropinas, tales como hormona estimulante del folmulo (FSH) sola o en combinacion con actividad de hormona luteinizante (LH) para estimular el desarrollo folicular, normalmente con la administracion de un analogo de GnRH antes de y/o durante la estimulacion para prevenir un aumento de LH prematuro. Las composiciones farmaceuticas generalmente usadas para COS incluyen hormona estimulante del folmulo recombinante (rFSH), FSH derivada de orina, preparaciones de LH + FSH recombinante, menotropina derivada de orina [gonadotropina menopausica humana (hMG)] y gonadotropina menopausica humana altamente purificada (HP-hMG). La IVF puede asociarse con un riesgo de desarrollar el smdrome de hiperestimulacion ovarica (OHSS), que puede ser potencialmente mortal en casos graves.
La capacidad para predecir el potencial de respuesta de las mujeres a la estimulacion ovarica controlada (COS) puede permitir el desarrollo de protocolos de COS individualizados. Esto podna, por ejemplo, reducir el riesgo de desarrollar OHSS en mujeres a las que se predijo que tendnan una respuesta excesiva a la estimulacion, y/o mejorar los desenlaces de embarazo en mujeres que se clasificaron como de escaso potencial de respuesta. La concentracion en suero de la hormona antimulleriana (AMH) se establece ahora como marcador fiable de la reserva ovarica. Niveles decrecientes de AMH se correlacionan con una respuesta ovarica reducida a gonadotropinas durante COS. Ademas, altos niveles de AMH son un buen factor pronostico de una respuesta ovarica excesiva, y un indicador de riesgo de desarrollar OHSS.
En un estudio preliminar de mujeres con menos de 35 anos de edad que se sometfan a ART, se uso el algoritmo de dosificacion CONSORT (que incorpora FSH basal, IMC, edad y AFC) para predecir la dosis inicial optima de FSH para COS en mujeres que corren el riesgo de desarrollar OHSS (Olivennes et al., 2009). La individualizacion de la dosis condujo a un rendimiento de ovocitos adecuado y una buena tasa de embarazos. Sin embargo, hubo altas tasas de cancelaciones en el grupo de dosis baja (75 UI de FSH) debido a una respuesta inadecuada, y se produjo OHSS en una proporcion significativa de las pacientes.
Por tanto, existe la necesidad de una composicion para su uso en protocolos de COS individualizados que proporcione una respuesta adecuada a la estimulacion, y/o una disminucion del riesgo de desarrollar OHSS.
Tal como se indico anteriormente, los protocolos de COS convencionales pueden incluir la administracion de FSH. FSH se secreta de manera natural por la hipofisis anterior y funciona soportando el desarrollo folicular y la ovulacion. FSH comprende una subunidad alfa de 92 aminoacidos, tambien comun para las demas hormonas de glicoprotema LH y CG, y una subunidad beta de 111 aminoacidos unica para FSH que confiere la especificidad biologica de la hormona (Pierce y Parsons, 1981). Cada subunidad se modifica de manera postraduccional mediante la adicion de restos de hidratos de carbono complejos. Ambas subunidades portan 2 sitios para la union a glicano unido a N, la subunidad alfa en los aminoacidos 52 y 78 y la subunidad beta en los restos de aminoacido 7 y 24 (Rathnam y Saxena, 1975, Saxena y Rathnam, 1976). Por tanto, FSH se glicosila hasta aproximadamente el 30% en masa (Dias y Van Roey. 2001. Fox et al. 2001).
Se ha usado FSH purificada a partir de orina humana posmenopausica durante muchos anos en el tratamiento de la esterilidad; tanto para fomentar la ovulacion en la reproduccion natural como para proporcionar ovocitos para tecnologfas de reproduccion asistida. Los productos de FSH recombinante (rFSH) aprobados actualmente para estimulacion ovarica, tales como folitropina alfa (GONAL-F, Merck Serono / EMD Serono) y folitropina beta (PUREGON/FOLLISTIM, MSD/Schering-Plough), se derivan de una lmea celular de ovario de hamster chino (CHO). Actualmente, no esta disponible comercialmente ningun producto de rFSH procedente de una lmea celular humana.
Existe una heterogeneidad considerable asociada con las preparaciones FSH que esta relacionada con diferencias en las cantidades de las diversas isoformas presentes. Las isoformas de FSH individuales presentan secuencias de aminoacidos identicas, pero difieren en el grado en que se modifican de manera postraduccional; isoformas particulares se caracterizan por heterogeneidad de las estructuras de ramificacion de hidrato de carbono y las distintas cantidades de incorporacion de acido sialico (un azucar terminal), que parecen influir ambas en la actividad biologica de la isoforma espedfica.
La glicosilacion de FSH natural es sumamente compleja. Los glicanos en FSH hipofisaria derivada de manera natural pueden contener una amplia variedad de estructuras que pueden incluir combinaciones de glicanos mono-, bi-, tri-y tetra-antenarios (Pierce y Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger y Green, 1988). Los glicanos pueden portar modificaciones adicionales: fucosilacion central, glucosamina bisectriz, cadenas extendidas con acetil- lactosamina, sialilacion parcial o completa, sialilacion con uniones a2,3 y a2,6, y galactosamina sulfatada sustituida
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por galactosa (Dalpathado et al., 2006). Ademas, existen diferencias entre las distribuciones de estructuras de glicano en los sitios de glicosilacion individuales. Se ha encontrado un nivel comparable de complejidad de glicanos en FSH derivada del suero de individuos y de la orina de las mujeres posmenopausicas (Wide et al., 2007).
La glicosilacion de productos de FSH recombinante refleja la gama de glicosil-transferasas presentes en la lmea celular del huesped. Los productos de rFSH disponibles comercialmente se derivan de celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO) modificadas por ingeniena genetica. La variedad de modificaciones de glicano en rFSH derivada de celulas CHO son mas limitadas que las encontradas en los productos naturales. Los ejemplos de la heterogeneidad de glicano reducida en rFSH derivada de celulas CHO incluyen una ausencia de glucosamina bisectriz y un contenido reducido de fucosilacion central y extensiones de acetil-lactosamina (Hard et al., 1990). Ademas, las celulas CHO solo pueden anadir acido sialico usando la union a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990); rFSH derivada de celulas CHO solo incluye acido sialico con uniones a2,3 y no incluye acido sialico con uniones a2,6.
Por tanto, FSH derivada de celulas CHO es diferente de la FSH producida de manera natural (por ejemplo, FSH hipofisaria/de suero/de orina humana) que contiene glicanos con una mezcla de acido sialico con uniones a2,3 y a2,6, con una predominancia del primero.
Ademas, se ha demostrado que la preparacion de FSH recombinante disponible comercialmente difiere en las cantidades de FSH con un punto isoelectrico (pi) inferior a 4 (consideradas las isoformas acidas) en comparacion con FSH hipofisaria, de suero o de orina posmenopausica (Ulloa-Aguirre et al. 1995). La cantidad de isoformas acidas en las preparaciones de orina fue mucho mayor en comparacion con los productos recombinantes derivados de celulas CHO, Gonal-f (Merck Serono) y Puregon (Schering Plough) (Andersen et al. 2004). Esto debe reflejar un menor contenido molar de acido sialico en la FSH recombinante puesto que el contenido de glicano cargado negativamente modificado con sulfato es bajo en FSH recombinante. El menor contenido de acido sialico, en comparacion con FSH natural, es una caractenstica de ambos productos de FSH recombinante disponibles comercialmente y puede reflejar una limitacion en el proceso de fabricacion.
Se ha documentado la semivida circulatoria de FSH para materiales procedentes de una variedad de fuentes. Algunos de estos materiales se han fraccionado basandose en la carga molecular global, tal como se caracteriza por su pi, en el que mas acido es igual a una mayor carga negativa. Tal como se establecio previamente, el principal factor contribuyente a la carga molecular global es el contenido de acido sialico total de cada molecula de FSH. Por ejemplo, rFSH (Organon) tiene un contenido de acido sialico de aproximadamente 8 mol/mol, mientras que la FSH derivada de orina tiene un mayor contenido de acido sialico (de Leeuw et al. 1996). Las tasas de aclaramiento plasmatico correspondientes en la rata son de 0,34 y 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al. 2003). En otro ejemplo en el que se dividio una muestra de FSH recombinante en fracciones de alto y bajo pi, disminuyo la potencia in vivo de la fraccion de alto pi (menor contenido de acido sialico) y tuvo una semivida plasmatica mas corta (D'Antonio et al. 1999). Tambien se ha notificado que la FSH mas basica circulante durante las etapas posteriores del ciclo de ovulacion se debe a la regulacion por disminucion de a2,3 sialil-transferasa en la hipofisis anterior que esta provocada por niveles crecientes de estradiol (Damian-Matsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). No se han notificado resultados para la a2,6 sialil-transferasa.
Por tanto, tal como se expuso anteriormente, protemas recombinantes expresadas usando el sistema CHO diferiran de sus homologos naturales en su tipo de uniones de acido sialico terminales. Esto es una consideracion importante en la produccion de productos biologicos para uso farmaceutico puesto que los restos de hidrato de carbono pueden contribuir a los atributos farmacologicos de la molecula. Los presentes solicitantes han desarrollado una FSH recombinante derivada de ser humano que es el objeto de la solicitud de patente internacional n.° PCT/GB2009/000978, publicada como documento WO2009/127826A. Se preparo FSH recombinante con una mezcla de acido sialico con uniones tanto a2,3 como a2,6 mediante modificacion por ingeniena genetica de una lmea celular humana para expresar tanto rFSH como a2,3-sialiltransferasa. El producto expresado es altamente acido y porta una mezcla de acidos sialicos con uniones tanto a2,3 como a2,6; este ultimo proporcionado mediante la actividad sialil transferasa endogena. Se encontro que el tipo de union del acido sialico, a2,3- o a2,6-, puede tener una influencia drastica sobre el aclaramiento biologico de FSH. La FSH recombinante con una mezcla de acido sialico con uniones tanto a2,3 como a2,6 tiene dos ventajas con respecto a rFSH expresada en celulas CHO convencionales: en primer lugar, el material esta mas altamente sialilado debido a las actividades combinadas de las dos sialiltransferasas; y en segundo lugar, el material se asemeja mas estrechamente a la FSH natural. Probablemente, esto es mas apropiado a nivel biologico en comparacion con productos recombinantes derivados de celulas CHO que han producido solo acido sialico con uniones a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) y tienen un contenido de acido sialico disminuido (Ulloa-Aguirre et al. 1995., Andersen et al. 2004).
El producto de rFSH dado a conocer en la solicitud de patente internacional n.° PCT/GB2009/000978 contiene restos de glicano ramificado. La FSH comprende glicanos (unidos a las glicoprotemas de FSH) y estos glicanos pueden contener una amplia variedad de estructuras. Tal como se conoce bien en la tecnica, la ramificacion (de un glicano) puede producirse con el resultado de que el glicano puede tener 1, 2, 3, 4 o mas restos de azucar terminales o
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“antenas”; los glicanos con 1, 2, 3 o 4 restos de azucar terminales o “antenas” se denominan respectivamente estructuras mono-antenarias, di-antenarias, tri-antenarias o tetra-antenarias. Los glicanos pueden tener la presencia de sialilacion en estructuras mono-antenarias y/o di-antenarias y/o tri-antenarias y/o tetra-antenarias. Una rFSH a modo de ejemplo dada a conocer en la solicitud de patente internacional n.° PCT/GB2009/000978 inclma estructuras de glicano mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas con las siguientes cantidades relativas: el 915% de mono-sialiladas; el 27-30% de di-sialiladas; el 3 -36% de tri-sialiladas y el 25-29% de tetrasialiladas. Tal como se conoce bien, una estructura de glicano mono-sialilada porta un resto de acido sialico; una estructura de glicano di-sialilada porta dos restos de acido sialico; una estructura de glicano tri-sialilada porta tres restos de acido sialico; y una estructura de glicano tetra-sialilada porta cuatro restos de acido sialico. En el presente documento, terminologfa tal como “X% de mono-sialiladas”, “X% de di-sialiladas”, “X% de tri-sialiladas” o “X% de tetra-sialiladas” se refiere al numero de estructuras de glicano en FSH que estan mono-, di, tri o tetra-sialiladas (respectivamente), expresadas como porcentaje (X%) del numero total de estructuras de glicano en la FSH que estan sialiladas de algun modo (portan acido sialico). Por tanto, la expresion “el 30-36% de estructuras de glicano tri-sialiladas” significa que, del numero total de estructuras de glicano en la FSH que portan restos de acido sialico (es decir, estan sialiladas), del 30 al 36% de estas estructuras de glicano estan tri-sialiladas (portan tres restos de acido sialico). Los solicitantes han encontrado sorprendentemente que FSH que tiene una cantidad espedfica de estructuras de glicano tetra-sialiladas (que es diferente a la del producto de rFSH a modo de ejemplo dado a conocer en el documento PCT/GB2009/000978 mencionado anteriormente) es notablemente mas potente que productos de FSH recombinante que estan actualmente en el mercado. La secuencia de aminoacidos de los productos del solicitante es la secuencia nativa y es identica a FSH humana natural y productos de rFSH derivados de celulas CHO existentes. Sin embargo, los presentes solicitantes han encontrado que productos de FSH recombinante derivada de ser humano (es decir, FSH recombinante producida o expresada en una lmea celular humana por ejemplo preparada mediante modificacion por ingeniena genetica de una lmea celular humana) que tienen una mezcla de acido sialico con uniones tanto a2,3 como a2,6 y/o una cantidad espedfica de estructuras de glicano tetra-sialiladas pueden ser particularmente eficaces cuando se usan en protocolos de COS (por ejemplo, individualizados).
Los solicitantes han encontrado que generalmente es necesario recuperar aproximadamente nueve ovocitos para permitir la seleccion de dos ovocitos de alta calidad para la transferencia.
Los solicitantes han encontrado que para sujetos que tienen bajo nivel de AMH (AMH <15 pmol/l por litro) se requiere una dosis razonablemente alta de FSH recombinante (por ejemplo, de 12 |ig) para lograr esto. A esta dosis, se recuperaran de 8 a 14 ovocitos del 60% de los sujetos con bajo nivel de AMH. Esto es una mejora inesperada y significativa con respecto al tratamiento de sujetos con bajo nivel de AMH tratados con 150 UI de Gonal-f, en el que se recuperan de 8 a 14 ovocitos solo del 33% de los sujetos. Los solicitantes han encontrado que no hay necesidad de ajustar esta dosis segun el peso corporal de la paciente.
Sin embargo, el 60% de la poblacion (y el 80% de las mujeres con menos de 30 anos tratadas para esterilidad) tienen un alto nivel de AMH (es decir, AMH de > 15 pmol/l). Para estos sujetos, generalmente resulta bastante sencillo recuperar una media de 9 a 11 ovocitos; el problema con los protocolos de estimulacion es el riesgo de
desarrollar OHSS. Los solicitantes han encontrado que en pacientes a las que se les dosifico dosis bajas de FSH
recombinante humana existe una relacion entre ovocitos recuperados y peso corporal del sujeto. Esto significa que puede haber un riesgo asociado con el tratamiento con una dosis fija de FSH (lo que es habitual en la tecnica). Los presentes solicitantes han establecido una relacion entre dosis de FSH y nivel de AMH y peso del sujeto que proporciona un perfil de seguridad mejorado (riesgo reducido de desarrollar OHSS) con una recuperacion de ovocitos aceptable o mejorada en comparacion con los protocolos de tratamiento conocidos (vease el ejemplo 10).
Segun la invencion, en un aspecto adicional, se proporciona un producto (por ejemplo, una composicion
farmaceutica) que comprende FSH para su uso en el tratamiento de la esterilidad en un sujeto que esta en riesgo de
OHSS y que tiene un nivel de AMH en suero > 15 pmol/l, en el que el producto va a administrarse a una dosis, o equivalente a, de 0,09 a 0,19 |ig (por ejemplo 0.09 a 0.17 |ig) de FSH recombinante derivada de una lmea celular humana por kilogramo de peso corporal de la paciente al dfa, en donde la FSH incluye a2,3- y a2,6-sialilacion, en el que del 1% al 99% de la sialilacion total es a2,6-sialilacion. Preferentemente el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinacion (por ejemplo, medida) del nivel de AMH en suero de la paciente, y administracion de la dosis a una paciente que tiene el nivel de AMH en suero de > 15 pmol/l. En una realizacion, el producto es para su uso en el tratamiento de esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 15 a 24,9 pmol/l, y el producto va a administrarse a una dosis diaria, o dosis equivalente a, de 0,14 a 0,19 |ig de FSH recombinante derivada de un ser humano (preferentemente de 0.15 a 0.16 |ig de FSH recombinante derivada de un ser humano ) por kg de peso corporal de la paciente al dfa. En esta realizacion, el tratamiento de la esterilidad puede comprender una etapa de determinacion (por ejemplo, medicion) del nivel de AMH en suero de la paciente, y administracion de la dosis a una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 15 a 24,9 pmol/l. En otra realizacion, el producto es para su uso en el tratamiento de esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 25 a 34,9 pmol/l, y el producto va a administrarse a una dosis diaria, o dosis equivalente a, de 0,11 a 0,14 |ig de FSH (preferentemente de 0.12 a 0.13 |ig de FSH recombinante derivada de un ser humano) derivada de un ser humano por kg de peso corporal de la paciente al dfa. En esta realizacion, el tratamiento de la esterilidad puede comprender un paso para determinar (por ejemplo, medir) el nivel de AMH en suero del paciente, y administrar la
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dosis a una paciente con un nivel de AMH en suero de 25 a 34.9 pmol/L. En una realizacion adicional mas, el producto es para uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente con un nivel de AMH en suero de> 35 pmol/L, y el producto se debe administrar a una dosis diaria o dosis equivalente a 0.10 a 0.11 |ig de FSH recombinante derivada de un ser humano, por kg de peso corporal de la paciente. En esta realizacion, el tratamiento de la esterilidad puede comprender una etapa de determinacion (por ejemplo, medicion) del nivel de AMH en suero de la paciente, y administracion de la dosis a una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de > 35 pmol/l. Preferentemente, la FSH es una FSH recombinante (“rFSH” o “recFSH”). Preferentemente, la FSH es una FSH recombinante derivada de lmea celular humana. Las dosis proporcionan una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS.
Las dosis anteriores pueden ser para el tratamiento de la esterilidad en el primer protocolo de estimulacion de la paciente (del sujeto). Se apreciara que, para ciclos de estimulacion adicionales, las dosis pueden ajustarse segun la respuesta ovarica real en el primer ciclo.
Preferentemente, la rFSH (por ejemplo, FSH recombinante derivada de lmea celular humana) incluye a2,3- y a2,6- sialilacion. La FSH (rFSH) puede tener del 1% al 99% de la sialilacion total que es a2,3-sialilacion. La FSH (rFSH) tiene del 5% al 99% de la sialilacion total que es a2,6-sialilacion. Preferentemente, del 50 al 70%, por ejemplo, del 60 al 69%, por ejemplo, aproximadamente el 65%, de la sialilacion total es a2,3-sialilacion. Preferentemente, del 25 al 50%, por ejemplo, del 30 al 50%, por ejemplo, del 31 al 38%, por ejemplo, aproximadamente el 35%, de la sialilacion total es a2,6-sialilacion.
Preferentemente, la rFSH (por ejemplo, FSH recombinante derivada de lmea celular humana) incluye estructuras de glicano mono-, di-, tri- y tetra-sialiladas, en las que el 15-24%, por ejemplo, el 17-23% de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetrasialiladas (por ejemplo, tal como se muestra mediante analisis por WAX de glicanos cargados, tal como se expone en los ejemplos a continuacion). La FSH comprende glicanos (unidos a las glicoprotemas de FSH). Se conoce bien que los glicanos en FSH pueden contener una amplia variedad de estructuras. Estas pueden incluir combinaciones de glicanos mono, bi, tri y tetra-antenarios. En el presente documento, terminologfa tal como “X% de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetrasialiladas” se refiere al numero de estructuras de glicano en la FSH que estan tetra-sialiladas, es decir portan cuatro restos de acido sialico, expresadas como porcentaje (X%) del numero total de estructuras de glicano en la FSH que estan sialiladas de algun modo (portan acido sialico). Por tanto, la expresion “el 15-24% de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetrasialiladas” significa que, del numero total de estructuras de glicano en FSH que portan restos de acido sialico (es decir, estan sialiladas), del 15 al 24% de estas estructuras de glicano estan tetra-sialiladas (portan cuatro restos de acido sialico).
La rFSH puede estar presente como una unica isoforma o como una mezcla de isoformas.
Los solicitantes han concebido protocolos de COS “individualizados” en los que se usan dosis espedficas de FSH recombinante que tienen caractensticas espedficas para tratar pacientes basandose en sus niveles de AMH espedficos, aumentando de ese modo la probabilidad de una respuesta adecuada a la estimulacion (por ejemplo, en pacientes que tienen un bajo potencial de respuesta), y/o un riesgo disminuido de desarrollar OHSS (por ejemplo, en pacientes que se clasificaron como de potencial de respuesta alto o excesivo).
El nivel de AMH en suero puede determinarse (por ejemplo, medirse) mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Preferentemente, el nivel de AMH en suero se mide usando el kit del ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH mayores de 0,57 pmol/l con un lfmite de cuantificacion irnnimo de 1,1 pmol/l. Pueden usarse otros ensayos.
En el presente documento, los valores de AMH en suero se citan generalmente en terminos de pmol/l. Esto puede convertirse a ng/ml usando la ecuacion de conversion: 1 ng/ml de AMH = 7,1 pmol/l de AMH.
En el presente documento, los terminos “paciente” y “sujeto” se usan indistintamente.
El producto (por ejemplo, la composicion farmaceutica) comprende preferentemente una dosis diaria de, o una dosis diaria equivalente a, las cantidades de rFSH derivada de ser humano definidas anteriormente, en el presente documento, y en las reivindicaciones. La dosis (diaria) puede ser una dosis inicial (es decir, puede reducirse, aumentarse o mantenerse durante el tratamiento).
El producto (por ejemplo, la composicion farmaceutica) puede ser para la administracion (diaria) de FSH empezando en el dfa uno de tratamiento y continuando por siete a trece dfas, por ejemplo, de nueve a trece dfas, por ejemplo, de 10 a 13 dfas, por ejemplo, de 10 a 11 dfas. El producto (por ejemplo, la composicion farmaceutica) puede ser para la administracion de 12 a 16, por ejemplo, de 13 a 15, por ejemplo 14 dfas tras la administracion de (por ejemplo, tras el inicio de la administracion de, por ejemplo, tras el inicio de la administracion diaria de) un agonista de GnRH (por ejemplo, Synarel, Lupron, Decapeptyl). El producto (por ejemplo, la composicion farmaceutica) puede ser para la administracion con un agonista de GnRH. El producto (por ejemplo, la composicion farmaceutica) puede
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ser para la administracion antes de la administracion de un antagonista de GnRH (por ejemplo, ganirelix, cetrorelix), por ejemplo, para la administracion cinco o seis dfas antes de la administracion de un antagonista de GnRH. El producto (por ejemplo, la composicion farmaceutica) puede ser para la administracion con un antagonista de GnRH. Preferentemente, el producto (por ejemplo, la composicion farmaceutica) es para la administracion antes de la administracion de una dosis alta (ovulatoria) de hCG (por ejemplo, de 4.000 a 11.000 UI de hCG, por ejemplo 5.000 UI de hCG, 10.000 UI de hCG etc.; o de 150 a 350 microgramos de hCG recombinante, por ejemplo 250 microgramos de hCG recombinante) para inducir la maduracion folicular final.
Se apreciara que el producto puede ser para una dosificacion a frecuencias mas frecuentes (o menos) que diaria, en cuyo caso las dosis relevantes seran equivalentes a las dosis (diarias) especificadas en el presente documento.
En el presente documento, el termino “tratamiento de la esterilidad” incluye tratamiento de la esterilidad mediante estimulacion ovarica controlada (COS) o metodos que incluyen una etapa o fase de estimulacion ovarica controlada (COS), por ejemplo, inseminacion intrauterina (IUI), fecundacion in vitro (IVF) o inyeccion intracitoplasmatica de espermatozoides (ICSI). El termino “tratamiento de la esterilidad” incluye tratamiento de la esterilidad mediante induccion de la ovulacion (OI) o mediante metodos que incluyen una etapa o fase de induccion de la ovulacion (OI). El termino “tratamiento de la esterilidad” incluye tratamiento de la esterilidad en un sujeto que tiene esterilidad tubarica o idiopatica, incluyendo tratamiento de la esterilidad en un sujeto que tiene endometriosis, por ejemplo, endometriosis de estadio I o estadio II, y/o en un sujeto que tiene esterilidad anovulatoria, por ejemplo, esterilidad anovulatoria de tipo II de la OMS, y/o en un sujeto con una pareja con esterilidad por factor masculino. El producto (o la composicion) puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulacion ovarica controlada) en un sujeto que tiene endometriosis, por ejemplo en un sujeto que tiene endometriosis de estadio I o estadio II, tal como se define por el sistema de clasificacion de The American Society for Reproductive Medicine (ASRM) para los diversos estadios de endometriosis, (estadio IV el mas intenso; estadio I el menos intenso) [American Society for Reproductive Medicine. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 1997; 67.817 821].
El producto (la composicion) puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulacion ovarica controlada) en un sujeto que tiene un nivel de FSH en suero normal de 1 a 16 UI/l, por ejemplo, de 1 a 12 UI/l en la fase folicular temprana.
El producto (la composicion) puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulacion ovarica controlada) en un sujeto de 18 a 42 anos, por ejemplo, de 25 a 37 anos. El producto puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulacion ovarica controlada) en un sujeto que tiene un IMC >1 e IMC < 35 kg/m2, por ejemplo, un sujeto que tiene un IMC >18 e IMC < 25 kg/m2, por ejemplo, un sujeto que tiene un IMC >20 e IMC < 25 kg/m2.
La rFSH puede incluir preferentemente el 27-33%, por ejemplo, el 30-32%, de estructuras de glicano tri-sialiladas. La rFSH puede incluir preferentemente el 24-33%, por ejemplo, el 26-30%, de estructuras de glicano di-sialiladas. La rFSH puede incluir preferentemente el 12-21%, por ejemplo, el 15-17%, de estructuras de glicano mono-sialiladas. La rFSH incluye preferentemente estructuras de glicano mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas con las siguientes cantidades relativas: del 15 al 17% de mono-sialiladas; el 26-30% de di-sialiladas; el 27-33% (por ejemplo, del 29 al 32%, por ejemplo el 30-32%, por ejemplo del 30 al 31%) de tri-sialiladas y el 17-23% de tetra- sialiladas (por ejemplo, tal como se muestra mediante analisis por WAX de glicanos cargados, tal como se expone en los ejemplos). La rFSH puede incluir desde el 0 hasta el 7%, por ejemplo, del 0,1 al 7%, por ejemplo, del 3 al 6%, por ejemplo, del 5 al 6%, de estructuras sialiladas neutras. La fSh comprende glicanos (unidos a las glicoprotemas de la FSH). En el presente documento, terminologfa tal como “X% de mono-sialiladas”, “X% de di-sialiladas”, “X% de tri-sialiladas” o “X% de tetra-sialiladas” se refiere al numero de estructuras de glicano en FSH que estan mono-, di, tri o tetra-sialiladas (respectivamente), expresadas como porcentaje (X%) del numero total de estructuras de glicano en la FSH que estan sialiladas de algun modo (portan acido sialico). Por tanto, la expresion “el 27-33% de estructuras de glicano tri-sialiladas” significa que, del numero total de estructuras de glicano en FSH que portan restos de acido sialico (es decir, estan sialiladas), del 27 al 33% de estas estructuras de glicano estan tri-sialiladas (portan tres restos de acido sialico).
La rFSH puede tener un contenido de acido sialico [expresado en cuanto a la razon de moles de acido sialico con respecto a moles de protema] de 6 mol/mol o mayor, por ejemplo entre 6 mol/mol y 15 mol/mol, por ejemplo entre 8 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 10 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 11 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 12 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 12 mol/mol y 13 mol/mol. La rFSH puede producirse o expresarse en una lmea celular humana.
La FSH (rFSH) para su uso segun la invencion puede tener del 1% al 99% de la sialilacion total que es a2,3- sialilacion. La rFSH puede tener el 10% o mas de la sialilacion total que es a2,3-sialilacion. Por ejemplo, el 20, 30,40, 50, el 60, el 70, el 80 o el 90% o mas de la sialilacion total puede ser a2,3-sialilacion. La rFSH puede incluir Preferentemente a2,3-sialilacion en una cantidad que es de desde el 50 hasta el 70% de la sialilacion total, por ejemplo, desde el 60 hasta el 69% de la sialilacion total, por ejemplo, desde el 63 hasta el 67%, por ejemplo, aproximadamente el 65% de la sialilacion total. La FSH (rFSH) para su uso segun la invencion puede tener del 1% al
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99% de la sialilacion total que es a2,6-sialilacion. La rFSH (o preparacion de rFSH) de la invencion puede tener el 5% o mas, por ejemplo, del 5% al 99%, de la sialilacion total que es a2,6-sialilacion. La rFSH puede tener el 50% o menos de la sialilacion total que es a2,6-sialilacion. La rFSH puede incluir Preferentemente a2,6-sialilacion en una cantidad que es de desde el 25 hasta el 50% de la sialilacion total, por ejemplo, desde el 30 hasta el 50% de la sialilacion total, por ejemplo, desde el 31 hasta el 38%, por ejemplo, aproximadamente el 35% de la sialilacion total. Por sialilacion, quiere decirse la cantidad de restos de acido sialico presentes en las estructuras de hidrato de carbono de la FSH. a2,3-Sialilacion significa sialilacion en la posicion 2,3 (tal como se conoce bien en la tecnica) y a2,6-sialilacion en la posicion 2,6 (tambien se conoce bien en la tecnica). Por tanto “% de la sialilacion total puede ser a2,3 sialilacion” se refiere al % del numero total de restos de acido sialico presentes en la FSH que estan sialilados en la posicion 2,3. El termino “% de la sialilacion total que es a2,6-sialilacion” se refiere al % del numero total de restos de acido sialico presentes en la FSH que estan sialilados en la posicion 2,6.
La rFSH puede tener un contenido de acido sialico (cantidad de sialilacion por molecula de FSH) de (basandose en la masa de protema, en vez de la masa de protema mas hidrato de carbono) del 6% o mayor (por ejemplo, entre el 6% y el 15%, por ejemplo entre el 7% y el 13%, por ejemplo entre el 8% y el 12%, por ejemplo entre el 11% y el 15%, por ejemplo entre el 12% y el 14%) en masa.
La rFSH puede ser rFSH o una preparacion de rFSH en la que el 16% o menos (por ejemplo, del 0,1 al 16%) de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) N-acetilglucosamina bisectriz (GlcNAc bisectriz o bisGlcNAc). Preferentemente, la rFSH (o preparacion de rFSH) es una rFSH o preparacion de rFSH en la que del 8 al 14,5% de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) una N-acetilglucosamina bisectriz (GlcNAc bisectriz o bisGlcNAc).
Se entendera que FSH comprende glicanos unidos a las glicoprotemas de la FSH. Tambien se entendera que el 100% de los glicanos se refiere a o significa todos los glicanos unidos a las glicoprotemas de la FSH. Por tanto, en el presente documento, la terminologfa “del 8 al 14,5% de los glicanos comprenden (portan) N-acetilglucosamina bisectriz” significa que del 8 al 14,5% del numero total de glicanos unidos a las glicoprotemas de la FSH incluyen/portan N-acetilglucosamina bisectriz; “el 16% o menos de los glicanos comprenden (portan) N- acetilglucosamina bisectriz” significa que el 16% o menos del numero total de glicanos unidos a las glicoprotemas de la FSH incluyen/portan N-acetilglucosamina bisectriz, etcetera.
Los solicitantes han encontrado que FSH recombinante (preparaciones de rFSH; composiciones de rFSH) en la que el 16% o menos (por ejemplo, del 8 al 14,5%) de los glicanos comprendidos en las glicoprotemas de la FSH portan GlcNAc bisectriz puede tener propiedades farmacocineticas ventajosas. Se cree que las propiedades ventajosas pueden surgir debido a que la cantidad de glicanos que portan GlcNAc bisectriz es similar a la que existe en el producto derivado de orina humana Bravelle, que es bastante menor que la de otras preparaciones de FSH recombinante tales como las dadas a conocer en el documento WO2012/017058.
La rFSH (o preparacion de rFSH) puede ser una rFSH o preparacion de rFSH en la que el 20% o mas de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) N-acetilgalactosamina (GalNAc), por ejemplo, en la que el 20% o mas de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) una GalNAc terminal. Preferentemente, la rFSH (o preparacion de rFSH) es una FSH o preparacion de fSh en la que del 40 al 55%, por ejemplo, del 42 al 52%, de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc. Preferentemente, la rFSH (o preparacion de rFSH) es una FSH o preparacion de FSH en la que del 40 al 55%, por ejemplo, del 42 al 52%, de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc terminal.
Se entendera que FSH comprende glicanos unidos a las glicoprotemas de la FSH. Tambien se entendera que el 100% de los glicanos se refiere a o significa todos los glicanos unidos a las glicoprotemas de la FSH. Por tanto, en el presente documento, la terminologfa “en la que el 20% o mas de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc” significa que el 20% o mas del numero total de glicanos unidos a las glicoprotemas de la FSH incluyen/portan N-acetilgalactosamina (GalNAc); “del 40 al 55%, por ejemplo del 42 al 52%, de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc terminal” significa que del 40 al 55%, por ejemplo del 42 al 52%, del numero total de glicanos unidos a las glicoprotemas de la FSH incluyen/portan GalNAc terminal, etcetera.
Parece que la disponibilidad de la union a2,6 aumenta el numero de estructuras tetra-sialiladas, en comparacion con productos derivados de celulas CHO que tienen solo la union a2,3 disponible. Los solicitantes tambien han encontrado que su rFSH se distingue con respecto a otros productos aprobados debido a la composicion de azucares: incluye, o puede incluir, una cantidad espedfica de GalNac. Esto puede vincularse con la tetrasialilacion y potencia porque la 2,6-sialilacion esta asociada con GalNac. En otras palabras, los presentes solicitantes han desarrollado un producto de rFSH que incluye caractensticas espedficas (sitios de grupo de union 2,6, GalNac) que proporcionan rFSH con un alto grado de sialilacion, lo que parece conducir a una potencia mejorada in vivo.
La rFSH (o preparacion de rFSH) puede tener del 16 al 24% de los glicanos que comprenden 1-fucosa-Lewis (por ejemplo, terminal), por ejemplo, del 16,5 al 18% de los glicanos que comprenden 1-fucosa-Lewis (por ejemplo, terminal). La rFSH (o preparacion de rFSH) puede tener del 1,5 al 4,5%, por ejemplo, del 2 al 4%, por ejemplo, el 3,7%, de los glicanos que comprenden 2-fucosa-Lewis (por ejemplo, terminal). El contenido de fucosa-Lewis puede
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tener un efecto sobre la potencia.
La rFSH puede producirse o expresarse en una lmea celular humana, por ejemplo, una lmea celular Per.C6, una lmea celular HEK293, una lmea celular HT1080, etc. Esto puede simplificar (y hacer mas eficaz) el metodo de produccion porque la manipulacion y el control de, por ejemplo, el medio de crecimiento celular para conservar la sialilacion pueden ser menos cnticos que con procedimientos conocidos. El metodo tambien puede ser mas eficaz porque se produce poca cantidad de rFSH basica en comparacion con la produccion de productos de rFSH conocidos; se produce mas rFSH acida y la separacion/retirada de FSH basica es menos problematica. La rFSH puede producirse o expresarse en una lmea celular PER.C6®, una lmea celular derivada de PER.C6® o una lmea celular PER.C6® modificada. rFSH que se produce o se expresa en una lmea celular humana (por ejemplo, lmea celular PER.C6®, la lmea celular HEK293, lmea celular HT1080, etc.) incluira cierta cantidad de acidos sialicos con uniones a2,6 (a2,6-sialilacion) proporcionados por actividad sialil transferasa endogena [de la lmea celular] e incluira cierta cantidad de acidos sialicos con uniones a2,3 (a2,3-sialilacion) proporcionados por actividad sialil transferasa endogena. La lmea celular puede modificarse usando a2,3-sialiltransferasa. La lmea celular puede modificarse usando a2,6-sialiltransferasa. Alternativa o adicionalmente, la rFSH puede incluir acidos sialicos con uniones a2,6 (a2,6-sialilacion) proporcionados por actividad sialil transferasa endogena [de la lmea celular]. En el presente documento, el termino “FSH recombinante derivada de ser humano” significa FSH recombinante que se produce o se expresa en una lmea celular humana (por ejemplo, FSH recombinante preparada mediante modificacion por ingeniena genetica de una lmea celular humana).
La rFSH puede producirse usando a2,3- y/o a2,6-sialiltransferasa. En un ejemplo, rFSH se produce usando a2,3- sialiltransferasa. La rFSH puede incluir acidos sialicos con uniones a2,6 (a2,6-sialilacion) proporcionados por actividad sialil transferasa endogena.
El producto puede ser una composicion farmaceutica. La composicion farmaceutica es para el tratamiento de la esterilidad. El tratamiento de la esterilidad puede comprender tecnologfas de reproduccion asistida (ART), induccion de la ovulacion o inseminacion intrauterina (IUI). La composicion farmaceutica puede usarse, por ejemplo, en indicaciones medicas en las que se usan las preparaciones de FSH conocidas.
El producto o la composicion puede formularse en composiciones bien conocidas por cualquier via de administracion de farmacos, por ejemplo, oral, rectal, parenteral, transdermica (por ejemplo, tecnologfa de parche), intravenosa, intramuscular, subcutanea, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, pomadas o gotas) o como pulverizacion bucal o nasal. Una composicion tfpica comprende un portador farmaceuticamente aceptable, tal como disolucion acuosa, excipientes no toxicos, incluyendo sales y conservantes, tampones y similares, tal como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoquinta edicion (Matt Publishing Company, 1975), en las paginas 1405 a 1412 y 1461 - 87, y el Formulario Nacional XIV decimocuarta edicion (American Pharmaceutical Association, 1975), entre otros.
Los ejemplos de portadores farmaceuticos, diluyentes, disolventes o vehmulos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva), y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Las composiciones de la presente invencion tambien pueden contener aditivos tales como, pero sin limitarse a conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, tensioactivos y agentes dispersantes. Pueden incluirse agentes antibacterianos y antifungicos para impedir el crecimiento de microbios e incluyen, por ejemplo, m-cresol, alcohol bendlico, parabeno, clorobutanol, fenol, acido sorbico, y similares. Si se incluye un conservante, se prefieren alcohol bendlico, fenol y/o m-cresol; sin embargo, el conservante no se limita en absoluto a estos ejemplos. Ademas, puede ser deseable incluir agentes isotonicos tales como azucares, cloruro de sodio, y similares. El producto o la composicion puede comprender ademas una sal que comprende un cation de metal alcalino farmaceuticamente aceptable seleccionada del grupo que consiste en sales de Na+ o K+, o una combinacion de las mismas. Preferentemente, la sal es una sal de Na+, por ejemplo, NaCl o Na2SO4.
Preferentemente, el producto o la composicion comprende FSH recombinante y uno o mas de polisorbato 20, L- metionina, fenol, sulfato de disodio y tampon fosfato de sodio.
En algunos casos, para realizar una accion prolongada, es deseable ralentizar la absorcion de FSH (y otros principios activos, si estan presentes) a partir de la inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspension lfquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorcion de FSH depende entonces de su velocidad de disolucion que, a su vez, puede depender del tamano de cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorcion retardada de una forma de combinacion de FSH administrada por via parenteral se logra disolviendo o suspendiendo la combinacion de FSH en un vehmulo aceitoso. Pueden prepararse formas de deposito inyectables formando matrices de microencapsulacion de la FSH (y otros agentes, si estan presentes) en polfmeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la razon de FSH con respecto a polfmero y de la naturaleza del polfmero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberacion de FSH. Los ejemplos de otros polfmeros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, poliortoesteres, polianlddridos, etc. Tambien se preparan formulaciones inyectables de deposito atrapando la FSH
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en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtracion a traves de un filtro que retiene bacterias, o mediante la incorporacion de agentes esterilizantes en forma de composiciones solidas esteriles que pueden disolverse o dispersarse en agua esteril u otro medio inyectable esteril justo antes de su uso. Pueden suministrarse formulaciones inyectables en cualquier recipiente adecuado, por ejemplo, vial, jeringa precargada, cartuchos para inyeccion, y similares.
El producto o la composicion puede formularse para un unico uso o para multiples usos (multiples dosis). Si el producto o la composicion se formula para multiples usos, se prefiere que se incluya un conservante. Si se incluye un conservante, se prefieren alcohol bendlico, fenol y/o m-cresol; sin embargo, el conservante no se limita en absoluto a estos ejemplos. El producto o la composicion formulado para un unico uso o multiples usos puede comprender ademas una sal que comprende un cation de metal alcalino farmaceuticamente aceptable seleccionada del grupo que consiste en sales de Na+ o K+, o una combinacion de las mismas. Preferentemente, la sal es una sal de Na+, por ejemplo, NaCl o Na2SO4.
El producto o la composicion puede incluirse en un recipiente tal como un vial, cartucho precargado (por ejemplo, para una unica administracion o multiples usos) o un dispositivo de inyeccion tal como una “pluma” por ejemplo para la administracion de multiples dosis.
El producto o la composicion puede ser una formulacion (por ejemplo, formulacion inyectable) que incluye FSH (opcionalmente con hCG, LH, actividad LH etc.) La actividad LH, si esta presente, puede originarse a partir de LH o gonadotropina corionica humana, hCG. Si hay mas de un principio activo (es decir, FSH y por ejemplo hCG o LH) estos pueden ser adecuados para la administracion por separado o conjuntamente. Si se administran por separado, la administracion puede ser secuencial. El producto puede suministrarse en cualquier envase apropiado. Por ejemplo, un producto puede incluir varios recipientes (por ejemplo, jeringas precargadas o viales) que contienen o bien FSH o bien hCG, o una combinacion (o combinacion) tanto de FSH como de hCG. La hCG puede ser hCG recombinante o hCG de orina. Si el producto incluye varios recipientes (por ejemplo, jeringas precargadas o viales) que contienen FSH, por ejemplo, FSH recombinante, cada recipiente puede incluir la misma cantidad de FSH. Uno o mas recipientes pueden incluir diferentes cantidades de FSH. Las jeringas o los viales pueden envasarse en un envase de tipo blister u otros medios para mantener la esterilidad. Cualquier producto puede contener opcionalmente instrucciones para el uso de las formulaciones de FSH (y por ejemplo hCG si esta presente). El pH y la concentracion exacta de los diversos componentes de la composicion farmaceutica se ajustan segun la practica de rutina en este campo. Vease GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7a ed. En una realizacion preferida, las composiciones de la invencion se suministran como composiciones para su administracion parenteral. En la tecnica se conocen metodos generales para la preparacion de las formulaciones parenterales y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, citado anteriormente, en las paginas 780-820. Las composiciones parenterales pueden suministrarse en formulacion lfquida o como solido que se mezclara con un medio inyectable esteril justo antes de la administracion. En una realizacion especialmente preferida, las composiciones parenterales se suministran en forma de dosificacion unitaria por su facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se describira ahora con mas detalle con referencia a los dibujos adjuntos en los que: la figura 1 muestra un mapa de plasmido del vector de expresion pFSHalpha/beta; la figura 2 muestra el vector de expresion de a2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4); la figura 3 muestra el vector de expresion de a2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1);
la figura 4 muestra el % de abundancia de la distribucion de acido sialico de ejemplos de FSH recombinante producida por celulas PER.C6® que expresan de manera estable FSH tras la modificacion por ingeniena genetica con a2,3-sialiltransferasa;
la figura 5 muestra el % de abundancia de la distribucion de carga de glicanos de ejemplos de FSH recombinante producida por celulas PER.C6® que expresan de manera estable FSH tras la modificacion por ingeniena genetica con a2,3-sialiltransferasa;
la figura 6 muestra una comparacion de la concentracion de inhibina-B tras la administracion de 225 UI de Gonal f (lmea inferior, lmea discontinua) y 225 UI del ejemplo (lmea superior, lmea continua) de la invencion;
la figura 7 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados en el grupo de tratamiento con bajo nivel de AMH (ejemplos 10, 10A); y
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la figura 8 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados en el grupo de tratamiento con alto nivel de AMH.
Seleccion de secuencias
FSH humana
Se uso la region codificante del gen para el polipeptido de FSH alfa segun Fiddes y Goodman. (1981). La secuencia se registra en el banco como AH007338 y en el momento de la construccion no habfa otras variantes de esta secuencia de protema. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 1.
Se uso la region codificante del gen para el polipeptido de FSH beta segun Keene et al (1989). La secuencia se registra en el banco como NM_000510 y en el momento de la construccion no habfa otras variantes de esta secuencia de protema. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 2
Sialiltransferasa
a2,3-Sialiltransferasa - Se uso la region codificante del gen para beta-galactosido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (a2,3- sialiltransferasa, ST3GAL4) segun Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia se registra en el banco como L23767 y se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 3.
a2,6-Sialiltransferasa - Se uso la region codificante del gen para beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (a2,6-sialiltransferasa, ST6GAL1) segun Grundmann et al. (1990). La secuencia se registra en el banco como NM_003032 y se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 4.
Ejemplos
Ejemplo 1 Construccion del vector de expresion de FSH
Se amplificaron la secuencia codificante del polipeptido de FSH alfa (AH007338, SEQ ID NO: 1) y el polipeptido de FSH beta (NM_003032, SEQ ID NO: 2) mediante PCR usando las combinaciones de cebadores FSHa-fW y FSHa- rev y FSHb-fw y FSHb-rec respectivamente.
FSHa-fw 5’-CC AGG AT CC GC C AC CAT GG ATT ACT AC AG AAAAAT ATG C-3’ (SEQ ID NO:9)
FSHa-rev 5’-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' (SEQ ID NO:10)
FSHb-fw 5’-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' (SEQ ID NO: 11}
FSHb-rev 5’ -C CG GGTT AACTT ATT ATT CTTT C ATTT C ACC AAAGG -3' (SEQ ID NO: 12}
Se digirio el ADN de FSH beta amplificado resultante con las enzimas de restriccion AscI y HpaI y se inserto en los sitios AscI y HpaI en el vector de expresion de mairnferos dirigido por CMV que porta un marcador de seleccion de neomicina. De manera similar, se digirio el ADN de FSH alfa con BamHI y NheI y se inserto en los sitios BamHI y NheI en el vector de expresion que ya contiene el ADN del polipeptido de FSH beta.
Se uso el ADN de vector para transformar la cepa DH5a de E. coli. Se escogieron colonias para amplificacion. Se seleccionaron las colonias que conteman el vector que contema tanto FSH alfa como beta para la secuenciacion y todas conteman las secuencias correctas segun SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Se selecciono el plasmido pFSH A+Bnn°17 para la transfeccion (figura 1).
Ejemplo 2 Construccion del vector de expresion de ST3
Se amplifico la secuencia codificante de beta-galactosido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) mediante PCR usando la combinacion de cebadores 2,3STfw y 2,3STrev.
2,3STfw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3’ (SEQ ID NO: 13)
2,3STrev 5!-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’ (SEQ ID NO: 14)
Se digirio el ADN de ST3 amplificado resultante con las enzimas de restriccion BamHI y AflII y se inserto en los sitios BamHI y AflII en el vector de expresion de marnfferos dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. Se amplifico el vector tal como se describio anteriormente y se secuencio. El clon pST3#1 (figura 2) contema la secuencia correcta segun SEQ ID NO: 3 y se selecciono para la transfeccion.
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Ejemplo 3 Construccion del vector de expresion de ST6
Se amplifico la secuencia codificante de beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) mediante PCR usando la combinacion de cebadores 2,6STfw y 2,6STrev.
2,6STfw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 15)
2,6STrev 5’-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3, (SEQ ID NO: 16)
Se digirio el ADN de ST6 amplificado resultante con las enzimas de restriccion BamHI y Aflll y se inserto en los sitios BamHI y AflII en el vector de expresion de mairnferos dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. Se amplifico el vector tal como se describio anteriormente y se secuencio. El clon pST6#11 (figura 3) contema la secuencia correcta segun SEQ ID NO: 4 y se selecciono para la transfeccion.
Ejemplo 4 Expresion estable de pFSH a+p en celulas PER.C6®. Transfeccion, aislamiento y examen de clones.
Se generaron clones de PER.C6® que produdan FSH expresando ambas cadenas de polipeptido de FSH a partir de un unico plasmido (vease el ejemplo 1).
Para obtener clones estables, un agente de transfeccion basado en liposomas con el constructo pFSH a+p. Se seleccionaron clones estables en VPRO complementado con FCS al 10% y que contema G418. Tres semanas tras la transfeccion, crecieron clones resistentes a G418. Se seleccionaron clones para aislamiento. Se cultivaron los clones aislados en medio de seleccion hasta que fueron confluentes al 70-80%. Se sometieron a ensayo los sobrenadantes para determinar el contenido de protema FSH usando un ELISA selectivo para FSH y la actividad farmacologica en el receptor de FSH en la lmea celular clonada, usando un ensayo de acumulacion de AMPc. Se avanzo con clones que expresaban la protema funcional para la expansion del cultivo en placas de 24 pocillos, 6 pocillos y frascos T80.
Se iniciaron estudios para determinar la productividad y calidad del material de siete clones en frascos T80 para generar suficiente material. Se cultivaron las celulas en medios complementados tal como se describio anteriormente durante 7 dfas y se recogio el sobrenadante. Se determino la productividad usando el ELISA selectivo para FSH. Se determino el perfil isoelectrico del material mediante isoelectroenfoque (IEF), mediante metodos conocidos en la tecnica. Se seleccionaron clones con suficiente productividad y calidad para la modificacion por ingeniena genetica de sialiltransferasa.
Ejemplo 5 El nivel de sialilacion aumenta en celulas que sobreexpresan a2,3-sialiltransferasa. Expresion estable de pST3 en celulas PER.C6® que expresan FSH; transfeccion, aislamiento y examen de clones.
Se generaron clones de PER.C6® que produdan FSH altamente sialilada expresando a2,3-sialiltransferasa a partir de plasmidos independientes (ejemplo 2) en celulas PER.C6® que ya expresan ambas cadenas de polipeptido de FSH (del ejemplo 4). Se seleccionaron clones producidos a partir de las celulas PER.C6® tal como se expone en el ejemplo 4 por sus caractensticas incluyendo productividad, buen perfil de crecimiento, produccion de protema funcional, y produjeron FSH que incluia cierta sialilacion. Se generaron clones estables tal como se describio anteriormente en el ejemplo 4. Se aislaron los clones, se expandieron y se sometieron a ensayo. Se adaptaron los clones de a2,3-sialiltransferasa a medios libres de suero y las condiciones de suspension.
Igual que antes, se sometieron a ensayo los clones usando un ELISA selectivo para FSH, la respuesta funcional en una lmea celular de receptor de FSH, IEF, tasa de aclaramiento metabolico y analisis de Steelman Pohley. Se compararon los resultados con una FSH recombinante disponible comercialmente (Gonal-f, Serono) y las lmeas celulares PER.C6® de FSH parentales. La FSH producida por la mayor parte de los clones tiene una sialilacion significativamente mejorada (es decir, en promedio mas isoformas de FSH con altos numeros de acidos sialicos) en comparacion con FSH expresada sin a2,3-sialiltransferasa. En conclusion, la expresion de FSH junto con sialiltransferasa en celulas PER.C6® dio como resultado un aumento de los niveles de FSH sialilada en comparacion con celulas que expresan FSH unicamente.
Ejemplo 6 Vision general de la produccion y purificacion
Se desarrollo un procedimiento para producir FSH en celulas PER.C6® que se cultivaron en suspension en medio libre de suero. El procedimiento se describe a continuacion y se aplico a varias lmeas celulares PER.C6® que producen FSH.
Se preparo FSH a partir del clon a2,3 (ejemplo 5) usando una modificacion del metodo descrito por Lowry et al. (1976).
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Para la produccion de PER.C6®FSH, se adaptaron las lmeas celulares a un medio libre de suero, es decir, Excell 525 (JRH Biosciences). En primer lugar, se cultivaron las celulas para formar una monocapa confluente al 70%-90% en un frasco de cultivo T80. En el pase, se resuspendieron las celulas en el medio libre de suero, Excell 525 + L- glutamina 4 mM, hasta una densidad celular de 0,3x106 celulas/ml. Se puso una suspension celular de 25 ml en un frasco con agitacion de 250 ml y se agito a 100 rpm a 37°C al 5% de CO2. Tras alcanzar una densidad celular de > 1x106 celulas/ml, se subcultivaron las celulas hasta una densidad celular de 0,2 o 0,3x106 celulas/ml y se cultivaron adicionalmente en frascos con agitacion a 37°C, el 5% de CO2 y 100 rpm.
Para la produccion de FSH, se transfirieron las celulas a un medio de produccion libre de suero, es decir, VPRO (JRH Biosciences), que soporta el crecimiento de celulas PER.C6® hasta densidades celulares muy altas (habitualmente > 107 celulas/ml en un cultivo discontinuo). En primer lugar, se cultivaron las celulas hasta > 1x106 celulas/ml en Excell 525, luego se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm y posteriormente se suspendieron en medio VPRO + L-glutamina 6 mM hasta una densidad de 1x106 celulas/ml. Entonces se cultivaron las celulas en un frasco con agitacion durante 7-10 dfas a 37°C, el 5% de CO2 y 100 rpm. Durante este periodo, las celulas crecieron hasta una densidad de > 107 celulas/ml. Se recogio el medio de cultivo tras empezar a disminuir la viabilidad celular. Se centrifugaron las celulas durante 5 min a 1000 rpm y se uso el sobrenadante para la cuantificacion y purificacion de FSH. Se determino la concentracion de FSH usando ELISA (DRG EIA 1288).
Despues de eso, se llevo a cabo la purificacion de FSH usando una modificacion del metodo descrito por Lowry et al. (1976). Se llevo a cabo la purificacion usando cromatograffa de carga selectiva para enriquecer las formas altamente sialiladas mediante metodos bien conocidos en la tecnica.
Durante todos los procedimientos cromatograficos, se confirmo el enriquecimiento de las formas sialiladas de FSH, segun se reivindica en el presente documento, mediante RIA (DRG EIA 1288) y/o IEF.
Ejemplo 7 Cuantificacion de cantidades relativas de acido a2,3 y a2,6-sialico
Se midieron las cantidades en porcentaje relativas de acido a2,3 y a2,6-sialico en rFSH purificada (ejemplo 6) usando tecnicas conocidas.
Se liberaron N-glicanos de las muestras usando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y luego se marcaron con 2-aminobenzamida. Entonces se separaron las formas de glicano liberadas y se analizaron mediante una columna de intercambio anionico debil (WAX) para la determinacion de la distribucion de carga. Se analizaron adicionalmente mediante una columna para WAX los glicanos marcados tratados con 2,3,6,8-sialidasa para la determinacion del acido sialico total y 2,3-sialidasa para la determinacion de acido 2,3-sialico.
Se calcularon los porcentajes relativos de los glicanos cargados a partir de las estructuras presentes en las reservas de glicanos no digeridos y digeridos y se muestran en la figura 4 (para 8 muestras). Se encontro que estos estaban en los intervalos del 50% - 70% (por ejemplo, aproximadamente el 60% o el 65%) para a2,3-sialilacion y del 28 al 50%, generalmente del 30 al 35% (por ejemplo, aproximadamente el 31% o el 35%), para a2,6-sialilacion.
Ejemplo 8 Cuantificacion de cantidades relativas de estructuras de glicano mono, di, tri y tetra-sialiladas
Se midieron las cantidades en porcentaje relativas de estructuras mono, di, tri y tetra-sialiladas en glicanos extrafdos de rFSH purificada (ejemplo 6) usando tecnicas conocidas.
Se liberaron N-glicanos de las muestras usando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y luego se marcaron con 2-aminobenzamida. Se liberaron glicanos de las muestras usando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y luego se marcaron con 2-aminobenzamida. Entonces se separaron las formas de glicano liberadas y se analizaron mediante una columna de intercambio anionico debil (WAX) para la determinacion de la distribucion de sialilacion. Las cantidades relativas de estructuras neutras, mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas se muestran en la figura 5 (para las 8 muestras mostradas en la figura 4).
La rFSH incluye estructuras de glicano neutras, mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas con las siguientes cantidades relativas: el 5-6% de neutras; el 15-17% de mono-sialiladas; el 26-30% de di-sialiladas; el 3032% de tri-sialiladas y el 17-23% de tetra-sialiladas.
Ejemplo 8a
Se midieron las cantidades en porcentaje relativas de acido a2,6-sialico en rFSH purificada extrafda de nueve muestras de rFSH purificada (producida mediante los metodos del ejemplo 6) usando tecnicas conocidas.
Se liberaron N-glicanos de las muestras usando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y entonces se marcaron con 2-aminobenzamida. Entonces se separaron las formas de glicano liberadas y se analizaron mediante una columna de intercambio anionico debil (WAX) para la determinacion de la distribucion de carga. se analizaron
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adicionalmente mediante una columna para WAX glicanos marcados tratados con 2,3,6,8-sialidasa para la determinacion de acido sialico total y 2,3-sialidasa para la determinacion de acido 2,3-sialico (vease el ejemplo 8). El analisis permite el calculo de acido a2,6-sialico.
Se calcularon los porcentajes relativos de los glicanos cargados a partir de las estructuras presentes en las reservas de glicanos no digeridos y digeridos y se muestran en la siguiente tabla. Se encontro que estos estaban en los intervalos del 25 al 50%, generalmente del 30 al 35% para a2,6-sialilacion.
Se midieron las cantidades en porcentaje relativas de GlcNAc bisectriz, GalNac y 1-fucosa-Lewis en glicanos extrafdos de las nueve muestras de rFSH purificada (producida mediante los metodos del ejemplo 6) usando tecnicas conocidas. Se liberaron N-glicanos de la glicoprotema usando PNGasa F y se marcaron con 2- aminobenzamida (2AB). Se realizo el analisis mediante analisis de HPLC bidimensional (2d) en combinacion con degradacion enzimatica de los glicanos. Para la verificacion, se analizaron los glicanos mediante MALDI-EM. Las cantidades relativas de acido alfa 2,6-sialico y los restos terminales se muestran en la siguiente tabla, junto con los mismos para Gonal F (FSH recombinante derivada de celulas CHO) y Bravelle (FSH de orina humana). ______
Muestra
Ref. O Ref. N I-1 I-2 I-3 II II III-1 III-2 3romedio Gonal F Bra velle
Q) O" if Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" if Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" 1* Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" if Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" 1* Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" 1* Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" af Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" af Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" 1* Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" 1* Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" af Q) Q- 3 © O Q)' Q) O" Q) Q- 3 © O Q)'
acido 2,6- sialico
27,7 34,9 26,2 30,1 31,1 28,3 30,4 35 33 30,7 0 55,4
1GalNAc
51 44,6 50,7 44,7 49 47,6 45,3 46,4 44,9 47,1 0 11,3
GalNAc bisectriz
10 12,4 10,2 8,9 8,7 11,8 11,4 10,6 13,9 10,9 55 14,
1-Fucosa- Lewis
21,1 16,7 23,3 16,1 20,3 18,1 17,9 18,7 19,0 19,0 3,11 2,2
2-Fucosa- Lewis
4 4,1 4,3 1,9 3,1 4,2 3,8 3,9 4,4 3,7 - n.d.2
1 El valor de 3,1 es el total de A de fucosa-Lewis. 2 No determinado
Puede observarse que la cantidad de GalNac en la FSH de la invencion vana entre aproximadamente el 44,9 y el 51%, promediando aproximadamente el 47,1%.
Puede observarse que la cantidad de GlcNAc bisectriz en la FSH de la invencion vana entre el 8,7 y el 13,9%, promediando aproximadamente el 10,9%.
Puede observarse que la cantidad de 1-fucosa-Lewis en la FSH de la invencion vana entre el 16,1 y el 23,3%, promediando aproximadamente el 19%.
Puede observarse que la cantidad de 2-fucosa-Lewis en la FSH de la invencion vana entre el 1,9 y el 4,4%, promediando aproximadamente el 3,7%.
Ejemplo 9 - Un estudio de multiples dosis que investiga la seguridad, tolerancia, farmacocinetica, farmacodinamia e inmunogenicidad de FE 999049 en comparacion con GONAL-F.
Poblacion de estudio
Un total de 48 (24 en cada farmaco) mujeres sanas recibieron dosis diarias de 14,6 |ig de FE 999049 (una composicion segun la invencion, producida segun el ejemplo 6) o 16,5 |ig de Gonal-F durante siete dfas.
Resultados de seguridad
La administracion de multiples dosis de FE 999049 y GONAL-F fue segura y generalmente se tolero bien tal como se evaluo mediante los acontecimientos adversos (AA), signos vitales, ECG, mediciones de laboratorio clmico y exploracion ffsica. No se produjo ningun acontecimiento adverso grave o muerte durante el estudio.
Resultados farmacocineticos
Tras la administracion de FE 999049 y GONAL-F a lo largo de 7 dfas, los valores de concentracion de FSH tal como se evaluaron inmediatamente antes de la siguiente inyeccion aumentaron y parecieron alcanzar un nivel de estado estacionario tras 6-7 dfas. Sin embargo, la exposicion (AUC y Cmax) de FE 999049 fue un 60% mayor en comparacion con Gonal-F.
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Resultados farmacodinamicos
Todas las concentraciones de inhibina-B (vease la figura 6), estradiol y progesterona aumentaron despues de la administracion de FE 999049 y GONAL-F, sin embargo, en mayor grado tras la administracion de FE 999049 en comparacion con GONAL-F. Tanto el numero como la distribucion de tamano de los folfculos mostraron una mayor respuesta a FE 999049 en comparacion con GONAL-F.
El ejemplo 9 demuestra que FSH que tiene una cantidad espedfica (el 17-23%) de estructuras de glicano tetra- sialiladas y, por ejemplo, cantidades espedficas de a2,3-sialilacion y a2,6-sialilacion es notablemente mas potente que los productos de FSH recombinante que estan actualmente en el mercado.
Ejemplo 10 - Un estudio de multiples dosis que investiga FE 999049 en comparacion con GONAL-F.
Lo siguiente describe un ensayo aleatorizado, controlado, ciego para el evaluador, de grupos paralelos, multinacional y multicentrico que evalua la relacion dosis-respuesta de FE 999049 en pacientes que se someten a estimulacion ovarica controlada para fecundacion in vitro (IVF)/inyeccion intracitoplasmatica de espermatozoides (ICSI). La poblacion de pacientes eran 265 pacientes sometidas a iVf con edades comprendidas entre 18 y 37 anos, con IMC de 18,5 a 32,0 kg/m2 Se diseno el ensayo como un ensayo de dosis-respuesta con el numero de ovocitos recuperados como criterio de valoracion principal. Los criterios de valoracion secundarios exploraran el impacto cualitativo y cuantitativo de diferentes dosis de Fe 999049 con respecto al perfil endocrino, el desarrollo folicular, la fecundacion de ovocitos, la calidad de los embriones y la eficacia del tratamiento (es decir, consumo de gonadotropina total y duracion de la estimulacion). Se disena el ensayo para evaluar la eficacia de FE 999049 para establecer un embarazo cuando se usa en estimulacion ovarica controlada para ciclos de IVF/ICSI.
Se evaluaron los sujetos en el plazo de 3 meses antes de la aleatorizacion para determinar el cumplimiento de los criterios de inclusion y exclusion, incluyendo una evaluacion del nivel de hormona antimulleriana (AMH) para aumentar la homogeneidad de la poblacion de ensayo en relacion con la respuesta ovarica y minimizar el numero de posibles pacientes con potencial de respuesta escaso y superalto frente a las dosis de Fe 999049 y la dosis de
GONAL-F usadas en el ensayo. Se midio la valoracion del nivel de AMH usando el kit de ensayo de
inmunoabsorcion ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH mayores de 0,57 pmol/l con un lfmite de cuantificacion mmimo de 1,1 pmol/l.
En el dfa 2-3 de su ciclo menstrual, se aleatorizaron los sujetos en un modo 1:1:1:1:1:1 con respecto al tratamiento con o bien 90 UI, 120 UI, 150 UI, 180 UI o 210 UI de FE 999049 o bien 150 UI de GONAL-F, y se inicio la
estimulacion ovarica. Se estratifico la aleatorizacion segun el nivel de AMH en la seleccion [5,0-14,9 pmol/l (bajo
nivel de AMH) y de 15,0 a 44,9 pmol/l (alto nivel de AMH)).
Gonal-F es del tipo llenado en masa (FbM) a peticion de la FDA; por tanto, es apropiada la referencia a una dosis en ug. La etiqueta de Gonal-F indica 600 UI/44 ug, lo que indica que 150 UI son 11 ug. Sin embargo, existe cierta variacion y el certificado de lote para este ensayo indico que 11,3 ug de Gonal-F eran equivalentes a 150 UI. Las dosis de FE999049 se presentan mediante el contenido de protema (ug) en vez de por la actividad biologica. Por tanto, las dosis de FE999049 fueron de 5,2 ug (90 UI), 6,9 ug (120 UI), 8,6 ug (150 UI), 10,3 ug (180 UI) o 12,1 ug (210 UI).
La distribucion de sujetos y dosis se expone de la siguiente manera (los datos son numero de sujetos):
Tabla 1
FE 999049 GONAL-F
5,2 ug 6,9 ug 8,6 ug 10,3 ug 12,1 ug 11,3 ug Total
Seleccionados
334
Aleatorizados y expuestos
42 45 44 45 46 43 265
Estratos con alto nivel de AMH (15,0 - 44,9 pmol/l)
23 26 24 24 26 25 148 (56%)
Estratos con bajo nivel de AMH (5,0 - 14,9 pmol/l)
19 19 20 20 21 18 117 (44%)
Por protocolo
40 42 42 44 44 43 255
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35
40
45
50
Se fija el nivel de dosis diaria de FE 999049 o GONAL-F en la totalidad del periodo de estimulacion. Durante la estimulacion, se monitorizan los sujetos en el dfa de estimulacion 1,4 y 6 y de aqu en adelante al menos cada dos dfas. Cuando se observan 3 folmulos de > 15 mm, se realizan visitas diariamente. Se tratan los sujetos con FE 999049 o GONAL-F durante un maximo de 16 dfas.
Para prevenir un aumento de LH prematuro, puede iniciarse el tratamiento con un antagonista de GnRH (acetato de ganirelix, ORGALUTRAN, MSD/Schering-Plough) en el dfa de estimulacion 6 a una dosis diaria de 0,25 mg y continuarse en la totalidad del periodo de estimulacion. Se realiza la induccion de la maduracion folicular final en el dfa en el que se observan > 3 folmulos con un diametro >17 mm. Si hay < 25 folmulos con un diametro > 12 mm, se administran 250 ug de hCG recombinante (coriogonadotropina alfa, OVITRELLE, Merck Serono/EMD Serono). Si hay 25-35 folmulos con un diametro > 12 mm, se administran 0,2 mg de agonista de GnRH (acetato de triptorelina, DECAPEPTYL / GONAPEPTYL, Ferring Pharmaceuticals). En caso de respuesta ovarica excesiva, definida como > 35 folmulos con un diametro > 12 mm, se cancela el tratamiento. En caso de escasa respuesta ovarica, definida como < 3 folmulos con un diametro > 10 mm observados en el dfa de estimulacion 10, podna cancelarse el ciclo.
La recuperacion de ovocitos tiene lugar 36 h (+ 2 h) tras la induccion de la maduracion folicular final y se inseminan los ovocitos mediante IVF y/o ICSI. Se evaluan la fecundacion y el desarrollo de embriones desde la recuperacion de ovocitos hasta el dfa de la transferencia. Para sujetos que se sometieron a induccion de la maduracion folicular final con hCG, se transfirio un blastocisto de la mejor calidad disponible en el dfa 5 tras la recuperacion de ovocitos mientras que se congelan los blastocistos restantes. Para sujetos que se someten a induccion de la maduracion folicular final con agonista de GnRH, no tuvo lugar una transferencia de embriones en el nuevo ciclo y en su lugar se congelan los blastocistos en el dfa 5. Se proporcionan ovulos vaginales de progesterona (LUTINUS, Ferring Pharmaceuticals) 100 mg 3 veces al dfa para el soporte de la fase lutea desde el dfa tras la recuperacion de ovocitos hasta el dfa de la visita de embarazo clmico. Se realiza una prueba de phCG 13-15 dfas tras la transferencia de embriones y se confirmara el embarazo clmico mediante ecograffa transvaginal (TVU) 5-6 semanas tras la transferencia de embriones.
Resultados
En la siguiente tabla, se muestra el numero de ovocitos recuperados (criterio de valoracion principal).
Tabla 2
FE 999049 GONAL-F
5,2 ug 6,9 ug 8,6 ug 10,3 ug 12,1 ug 11,3 (11) ug
Ovocitos recuperados
Todos
5,2 (3,3) 7,9 (5,9) 9,2 (4,6) 10,6 (7,0) 12,2 (5,9) 10,4 (5,2)
Alto nivel de AMH
5,9 (3,9) 9,1 (6,4) 10,6 (4,8) 13,6 (7,8) 14,4 (5,8) 12,4 (5,4)
Bajo nivel de AMH
4,5 (2,2) 6,3 (4,9) 7,4 (3,8) 6,9 (3,6) 9,4 (4,9) 7,8 (3,4)
Los datos son la media (D.E.)
Se cumplio el objetivo primario: se establecio una relacion dosis-respuesta significativa para FE 999049 con respecto al numero de ovocitos recuperados. Se observo este hallazgo no solo para la poblacion de ensayo global, sino tambien para cada uno de los dos estratos de AMH usados en la aleatorizacion. Se demostro una relacion dosis-respuesta significativa para FE 999049 para todos los parametros farmacodinamicos objetivo clave, por ejemplo, estradiol, inhibina B e inhibina A. A un nivel de dosis de microgramos similar, las respuestas farmacodinamicas con FE 999049 fueron mayores que con GONAL-F (no se muestran estos resultados).
Las concentraciones de FSH en suero tras la exposicion a FE 999049 fueron significativamente mayores que para GONAL-F. Los resultados confirman que el perfil PK de FE 999049 difiere del de GONAL-F. Las tasas de fecundacion, el desarrollo de blastocistos y las tasas de embarazos en pacientes sometidas a IVF/ICSI tratadas con FE 999049 estuvieron dentro de las expectativas. No hubo problemas de seguridad con el uso de FE 999049. Se documento una buena tolerancia local.
Analisis adicional
Los solicitantes han analizado ademas los datos para identificar la(s) dosis de FE 999049 que cumple(n) con los siguientes criterios con respecto al numero de ovocitos recuperados:
5
10
15
20
25
• Ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14
• Minimizan la proporcion de pacientes con < 8 ovocitos
• Minimizan la proporcion de pacientes con > 20 ovocitos
Los solicitantes tambien investigaron el impacto del peso corporal. Si es relevante, se convierte la dosis en |ig/kg para un sujeto medio. Se evalua este valor de |ig/kg y + 0,01 |ig/kg en un modelo con respecto a la distribucion de ovocitos recuperados, asf como al perfil de seguridad, y se identifica la dosis optima.
Estratos con bajo nivel de AMH
Tal como se observa en la tabla 2, la dosis de FE999049 que cumplio con el primer criterio (ovocitos recuperados en
el intervalo de 8-14) fue de 12,1 ug (media de 9,4 ovocitos recuperados). La distribucion de ovocitos se muestra en
la tabla 3 a continuacion.
Tabla 3
FE 999049 GONAL-F
5,2 ug
6,9 ug 8,6 ug 10,3 ug 12,1 ug 11,3 (11) ug
Ovocitos
recuperados
< 4
32% 24% 15% 10% 10% 6%
4-7
63% 42% 45% 60% 20% 56%
8-14
5% 24% 35% 30% 60% 33%
15-19
0% 5% 5% 0% 5% 6%
> 20
0% 5% 0% 0% 5% 0%
Los datos son el % de sujetos
Tal como se muestra mediante el recuadro y la flecha, una dosis de 12,1 ug de FE999049 proporciona la recuperacion del numero de ovocitos mas deseable en el 60% de los sujetos en el grupo con bajo nivel de AMH. Esto es una mejora notable con respecto a Gonal-F (el numero de ovocitos mas deseable solo en el 33% de los sujetos).
La tabla 4 a continuacion muestra el analisis de signos de respuesta excesiva en los estratos con bajo nivel de AMH (los datos son el numero de sujetos). Puede observarse que no hubo indicaciones de OHSS temprano de naturaleza moderada o intensa y no hubo incidencias que requirieran accion preventiva; no hay problemas asociados con la dosis de 12,1 ug de FE999049 en una paciente que tiene bajo nivel de AMH.
Tabla 4
FE 999049 GONAL-F
5,2 ug 6,9 ug 8,6 ug 10,3 ug 12,1 ug 11,3 (11) ug
Todos los sujetos
19 19 20 20 21 18
OHSS temprano, mod./int.
0 0 0 0 0 0
Induccion con agonista de GnRH
0 0 0 0 0 0
Accion preventiva
0 0 0 0 0 0
> 15 ovocitos
0 2 1 0 2 1
Cualquiera de las anteriores
0 2 1 0 2 1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
La figura 7 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados (para los estratos con bajo nivel de AMH), para las diversas dosis. Las flechas indican el numero de ovocitos recuperados de sujetos de peso corporal entre 45 kg y 90 kg tratados a la dosis de 12,1 ug. Tal como puede observarse (recuadro de texto) la variacion entre pacientes de peso corporal de 45 kg y las de 90 kg es menor de aproximadamente 0,5 ovocitos; en otras palabras, no se requiere una dosificacion segun el peso corporal en pacientes con bajo nivel de AMH cuando la dosis de FE999049 es de al menos 12 ug, porque no existe una variacion significativa en los ovocitos recuperados con el peso corporal, a esta dosis.
Por tanto, los solicitantes han encontrado que una dosis, o dosis equivalente a, de 6 a 18 ug, por ejemplo de 9 a 14 |ig, por ejemplo 12 ug de FSH recombinante derivada de ser humano es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero <15 pmol/l, por ejemplo de 0,05-14,9 pmol/l por ejemplo de 5,0-14,9 pmol/l. La dosis proporciona una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS.
Estratos con alto nivel de AMH
Tal como se observa en la tabla 2, tres dosis de FE999049 cumplieron con el primer criterio (ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14): 6,9 ug (media de 9,1 ovocitos recuperados), 8,6 ug (media de 10,6 ovocitos recuperados) y 10,3 ug (media de 13,6 ovocitos recuperados).
La figura 8 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados (para los estratos con alto nivel de AMH), para las diversas dosis. Las flechas indican el numero de ovocitos recuperados de sujetos de peso corporal entre 45 kg y 90 kg tratados a las dosis de 6,9 ug, 8,6 ug y 10,3 ug. Tal como puede observarse (recuadros de texto) la variacion es significativa: para la dosis de 6,9 ug, se recuperaran 6 ovocitos adicionales de una paciente de 45 kg en comparacion con una paciente de 90 kg; para la dosis de 8,6 ug, se recuperaran 4 ovocitos adicionales de una paciente de 45 kg en comparacion con una paciente de 90 kg; y para la dosis de 10,1 ug, se recuperaran 2,5 ovocitos adicionales de una paciente de 45 kg en comparacion con una paciente de 90 kg. En otras palabras, una dosificacion segun el peso corporal tiene un impacto en pacientes con alto nivel de AMH cuando la dosis de FE999049 es menor de 12 ug, porque existe una variacion significativa en los ovocitos recuperados con el peso corporal, a estas dosis.
La tabla 5a a continuacion muestra un desglose adicional de los ovocitos recuperados (de la tabla 2) segun el nivel de AMH. Esto muestra las dosis que cumplieron con el primer criterio (ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14) para cada subestrato de nivel de AMH (recuadros).
Tabla 5a
FE 999049
5,2 ug 6,9 ug 8,6 ug 10,3 ug 12,1 ug
Ovocitos recuperados
15-24 pmol/l
4,9 (3,8) 7,3 (3,6) 10,6 (5,1) 11,5 (6,7) 12,3 (5,9) |
25-34 pmol/l
7,0 (1,8) 9,1 (6,8) 9,7 (6,7) 15,5 (6,4) 16,7 (4,9)
35-45 pmol/l
8,5 (9,2)
21,0 (1,4)
11,3 (2,6)
18,0 (12,2)
15,7 (6,5)
La tabla 5b a continuacion muestra el analisis de pacientes en las que se cancelo tratamiento debido a o bien respuesta excesiva o bien induccion con agonista, para estos subgrupos. Por ejemplo, se cancelo el tratamiento a una paciente en el estrato de nivel de AMH de 25-34 pmol/l debido a respuesta excesiva tras la dosis de 10,3 ug y se cancelo el tratamiento a una paciente en el estrato de nivel de AMH de 25-34 pmol/l debido a respuesta excesiva tras la dosis de 12,1 ug; se cancelo el tratamiento a una paciente en el estrato de nivel de AMH de 35-45 pmol/l tras induccion con agonista tras la dosis de 10,3 ug; y se cancelo el tratamiento a una paciente en el estrato de nivel de AMH de 35-45 pmol/l tras induccion con agonista tras la dosis de 6,9 ug.
Tabla 5b
FE 999049
5,2 ug 6,9 ug 8,6 ug 10,3 ug 12,1 ug
OHSS***, cancelacion debida a respuesta excesiva o induccion con agonista****
15-24 pmol/l
0 0 0 0 0
25-34 pmol/l
0 0 0 sj *** sj ***
35-45 pmol/l
0 sj *** 0 sj *** 0
Puede observarse por tanto que sena util el ajuste a medida de la dosis segun el peso corporal (figura 8) y el nivel de AMH en los estratos con alto nivel de AMH, para minimizar las cancelaciones y maximizar la recuperacion de 5 ovocitos.
Los solicitantes han encontrado que las siguientes dosis proporcionan una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS (kg es kg de peso corporal de paciente).
Nivel de AMH en suero
Dosis (Dosis maxima)
< 15 pmol/l
12 ug (12 ug)
15-24 pmol/l
0,14-0,19 ug/kg, por ejemplo 0,150,16 ug/kg, Preferentemente 0,15 ug/kg (12 ug)
25-34 pmol/l
0,11-0,14 ug/kg, por ejemplo 0,120,13 ug/kg, Preferentemente 0,13 ug/kg (12 ug)
> 35 pmol/l
0,10-0,11 ug/kg, Preferentemente 0,11 ug/kg (12 ug)
Las siguientes son apropiadas si no se desea una dosificacion segun el peso corporal.
Nivel de AMH en suero
Dosis (Dosis maxima)
< 15 pmol/l
12 ug (12 ug)
15-24 pmol/l
9,3-10 ug (12 ug)
25-34 pmol/l
7,3-8 ug (12 ug)
> 35 pmol/l
6,3-7 ug (12 ug)
Las siguientes son apropiadas si se requieren menos categorias de nivel de AMH.
4 categorias de nivel de AMH
3 categorias de nivel de AMH 2 categorias de nivel de AMH Una dosis
AMH
Dosis AMH Dosis AMH Dosis AMH Dosis
< 15
12 ug < 15 12 ug < 15 12 ug - 0,16
ug/kg
15-24
0,15-0,16 ug/kg 15-24 0,15-0,16 ug/kg > 15 0,14 ug/kg
25-34
0,12-0,13 ug/kg > 25 0,12 ug/kg
> 35 0,10-0,11 jLig/kg
15
Las siguientes son apropiadas si no se desea una dosificacion segun el peso corporal.
4 categorias de nivel de AMH
3 categorias de nivel de AMH 2 categorias de nivel de AMH Una dosis
AMH
Dosis AMH Dosis AMH Dosis AMH Dosis
< 15
12 ug < 15 12 ug < 15 12 ug - 9,3 ug o
10 ug
15-24
9,3-10 ug 15-24 9,3-10 ug > 15 8,7 ug
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
4 categorias de nivel de AMH
3 categorias de nivel de AMH 2 categorias de nivel de AMH Una dosis
AMH Dosis
AMH Dosis
AMH Dosis
AMH Dosis
25-34 7,3-8 |ig
> 25 7,3 |ig
> 35 6,3-7 |ig
Por tanto, los solicitantes han encontrado que una dosis, o dosis equivalente a, de 9 a 14 |ig, por ejemplo, de 12 |ig, de FSH recombinante derivada de ser humano es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero <15 pmol/l, por ejemplo, de 0,05-14,9 pmol/l por ejemplo de 5,014,9 pmol/l.
La dosis proporciona una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS.
Los solicitantes han encontrado que una dosis (por ejemplo, diaria), o dosis equivalente a, de 0,09 a 0,19 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de >15 pmol/l. Los solicitantes han encontrado que una dosis (por ejemplo, diaria), o dosis equivalente a, de 0,14 a 0,19 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano (preferentemente de 0,15 a 0,16 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de la paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 15 a 24,9 pmol/l. Los solicitantes han encontrado que una dosis (por ejemplo, diaria), o dosis equivalente a, de 0,11 a 0,14 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano (preferentemente de 0,12 a 0,13 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de la paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 25 a 34,9 pmol/l. Los solicitantes han encontrado que una dosis (por ejemplo, diaria), o dosis equivalente a, de 0,10 a 0,11 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de > 35 pmol/l. Estas dosis proporcionan una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS.
Ejemplo 10 A - Protocolo de COS individualizado (bajo nivel de AMH)
Las pacientes seleccionadas estan a punto de someterse a COS para fecundacion in vitro (IVF)/inyeccion intracitoplasmatica de espermatozoides (ICSI) mediante metodos conocidos en la tecnica. El protocolo previo al tratamiento incluye evaluacion/examen del nivel de AMH en suero de la paciente usando el kit de ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH mayores de 0,57 pmol/l con un lfmite de cuantificacion mmimo de 1,1 pmol/l. Puede medirse el nivel de AMH usando otros kits de ensayo (por ejemplo, disponibles de Roche).
El protocolo de COS avanza de la manera habitual aparte de la administracion de la dosis inicial de FE 999049 segun el nivel de AMH en la seleccion. A una paciente con un nivel de AMH de <14,9 pmol/l se le administrana una dosis diaria inicial de aproximadamente 12 |ig de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado segun el metodo del ejemplo 6. Una paciente con un nivel de AMH de 15 a 24,9 pmol/l recibiria una dosis diaria inicial de 0,15 a 0,19 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente. Una paciente con un nivel de AMH de 25 a 34,9 pmol/l recibina una dosis diaria inicial de 0,11 a 0,13 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente. Una paciente con un nivel de AMH de > 35 pmol/l recibiria una dosis diaria inicial de 0,10 a 0,11 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente.
Ejemplo 11 - Protocolos de COS individualizados.
Las dosis en este protocolo se prefieren menos que las del ejemplo 10A.
Las pacientes seleccionadas estan a punto de someterse a COS para fecundacion in vitro (IVF)/inyeccion intracitoplasmatica de espermatozoides (ICSI) mediante metodos conocidos en la tecnica. El protocolo previo al tratamiento incluye evaluacion/examen del nivel de AMH en suero de la paciente usando el kit de ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH mayores de 0,57 pmol/l con un lfmite de cuantificacion mmimo de 1,1 pmol/l.
El protocolo de COS avanza de la manera habitual aparte de la administracion de la dosis inicial de FE 999049 segun el nivel de AMH en la seleccion en lmea con la siguiente tabla. Por tanto, a una paciente con un nivel de AMH de 5-14,8 pmol/l se le administranan 180 UI de FSH en forma de aproximadamente 8-11 |ig de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado segun el metodo del ejemplo 6. A una paciente con un nivel de AMH de 30-44,9 pmol/l se le administranan 120 UI de FSH en forma de aproximadamente 4-7 |ig de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado segun el metodo del ejemplo 6. Si
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
el nivel de AMH no esta disponible, a la paciente recombinante se le administranan 120-180 UI de FSH en forma de aproximadamente 6-11 |ig de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado segun el metodo del ejemplo 6.
Nivel de AMH
Dosis inicial, FSH Equivalente aprox. en p,g
< 5 pmol/l
210 UI 10-15 |ig
5-14,9 pmol/l
180 UI 8-11 iig
> 15-29,9 pmol/l
150 UI 6-9 |ig
> 30-44,9 pmol/l
120 UI 4-7 |ig
> 45 pmol/l
90 UI 2-5 |ig
No disponible
120-180 UI 6-11 |ig
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5
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15
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25
30
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40
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5
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15
20
25
30
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SEQ ID NO: 1
Polipeptido de hormona estimulante del folfculo alfa Numero de registro AH007338 Secuencia de nucleotidos de FSH alfa
1
ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT GTTTCTGCAT
61
GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA GGAAAACCCA
121
TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA
181
TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAACGT CACCTCAGAG
241
TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG
301
GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA A
Secuencia de protema de FSH alfa (SEQ ID NO: 5)
1 MDYYRKYAAI FLVTLSVFLH VLHSAPDVQD CPECTLQENP FFSQPGAPIL QCMGCCFSRA 61 YPTPLRSKKT MLVQKNVTSE STCCVAKSYN RVTVMGGFKV ENHTACHCST CYYHKS
5
10
15
20
25
SEQ ID NO: 2
Polipeptido de hormona estimulante del folfculo beta Numero de registro NM_000510 Secuencia de nucleotidos de FSH beta
1 ATGAAGACAC TCCAGTTTTT CTTCCTTTTC TGTTGCTGGA AAGCAATCTG CTGCAATAGC 61 TGTGAGCTGA CCAACATCAC CATTGCAATA GAGAAAGAAG AATGTCGTTT CTGCATAAGC 121 ATCAACACCA CTTGGTGTGC TGGCTACTGC TACACCAGGG ATCTGGTGTA TAAGGACCCA 181 GCCAGGCCCA AAATCCAGAA AACATGTACC TTCAAGGAAC TGGTATATGA AACAGTGAGA 241 GTGCCCGGCT GTGCTCACCA TGCAGATTCC TTGTATACAT ACCCAGTGGC CACCCAGTGT 301 CACTGTGGCA AGTGTGACAG CGACAGCACT GATTGTACTG TGCGAGGCCT GGGGCCCAGC 361 TACTGCTCCT TTGGTGAAAT GAAAGAATAA Secuencia de protema de FSH beta (SEQ ID NO: 6)
1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP 61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST DCTVRGLGPS 121 YCSFGEMKE SEQ ID NO: 3
Beta-galactosido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 Numero de registro L23767 Secuencia de nucleotidos de ST3GAL4
1
ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT CGTCATGGTG
61
TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTATTTTCC CATCCCAGAG
121
AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGAGCAAGG CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC
181
TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG CTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA
241
TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA
301
GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGAAC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG
361
GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCTCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC
421
GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC
481
AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC
541
AACCCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG
601
ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC
661
TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT
721
GACAAACTGC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CCACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG
781
GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT
841
GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC
901
AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG
961
CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA
Secuencia de protema de ST3GAL4 (SEQ ID NO: 7)
1 MCPAGWKLLA MLALVLWMV WYSISREDRY IELFYFPIPE KKEPCLQGEA ESKASKLFGN
61 YSRDQPIFLR LEDYFWVKTP SAYELPYGTK GSEDLLLRVL AITSSSIPKN IQSLRCRRCV
121 WGNGHRLRN SSLGDAINKY DWIRLNNAP VAGYEGDVGS KTTMRLFYPE SAHFDPKVEN
181 NPDTLLVLVA FKAMDFHWIE TILSDKKRVR KGFWKQPPLI WDVNPKQIRI LNPFFMEIAA
241 DKLLSLPMQQ PRKIKQKPTT GLLAITLALH LCDLVHIAGF GYPDAYNKKQ TIHYYEQITL
301 KSMAGSGHNV SQEALAIKRM LEMGAIKNLT SF
5 SEQ ID NO: 4
Beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 Numero de registro NM_003032
10
Secuencia de nucleotidos de ST6GAL1
1
ATGATTCACA CCAACCTGAA GAAAAAGTTC AGCTGCTGCG TCCTGGTCTT TCTTCTGTTT
61
GCAGTCATCT GTGTGTGGAA G GAAAAGAAG AAAGGGAGTT ACTATGATTC CTTTAAATTG
121
CAAACCAAGG AATTCCAGGT GTTAAAGAGT CTGGGGAAAT TGGCCATGGG GTCTGATTCC
181
CAGTCTGTAT CCTCAAGCAG CACCCAGGAC CCCCACAGGG GCCGCCAGAC CCTCGGCAGT
241
CTCAGAGGCC TAGCCAAGGC CAAACCAGAG GCCTCCTTCC AGGTGTGGAA CAAGGACAGC
301
TCTTCCAAAA ACCTTATCCC TAGGCTGCAA AAGATCTGGA AGAATTACCT AAGCATGAAC
361
AAGTACAAAG TGTCCTACAA GGGGCCAGGA CCAGGCATCA AGTTCAGTGC AGAGGCCCTG
421
CGCTGCCACC TCCGGGACCA TGTGAATGTA TCCATGGTAG AGGTCACAGA TTTTCCCTTC
481
AATACCTCTG AATGGGAGGG TTATCTGCCC AAGGAGAGCA TTAGGACCAA GGCTGGGCCT
541
TGGGGCAGGT GTGCTGTTGT GTCGTCAGCG GGATCTCTGA AGTCCTCCCA ACTAGGCAGA
601
GAAATCGATG ATCATGACGC AGTCCTGAGG TTTAATGGGG CACCCACAGC CAACTTCCAA
661
CAAGATGTGG GCACAAAAAC TACCATTCGC CTGATGAACT CTCAGTTGGT TACCACAGAG
721
AAGCGCTTCC TCAAAGACAG TTTGTACAAT GAAGGAATCC TAATTGTATG GGACCCATCT
781
GTATACCACT CAGATATCCC AAAGTGGTAC CAGAATCCGG ATTATAATTT CTTTAACAAC
841
TACAAGACTT ATCGTAAGCT GCACCCCAAT CAGCCCTTTT ACATCCTCAA GCCCCAGATG
901
CCTTGGGAGC TATGGGACAT TCTTCAAGAA ATCTCCCCAG AAGAGATTCA GCCAAACCCC
961
CCATCCTCTG GGATGCTTGG TATCATCATC ATGATGACGC TGTGTGACCA GGTGGATATT
1021
TATGAGTTCC TCCCATCCAA GCGCAAGACT GACGTGTGCT ACTACTACCA GAAGTTCTTC
1081
GATAGTGCCT GCACGATGGG TGCCTACCAC CCGCTGCTCT AT GAGAAGAA TTTGGTGAAG
1141
CATCTCAACC AGGGCACAGA TGAGGACATC TACCTGCTTG GAAAAGCCAC ACTGCCTGGC
1201
TTCCGGACCA TTCACTGCTA A
Op-
15 Secuencia de protema de ST6GAL1 (SEQ ID NO: 8)
1 MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS
61 QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN
121 KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP
181 WGRCAWSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE
241 KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM
301 PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIII MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF
361 DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC
5
10
15
20
25
30
LISTADO DE SECUENCIAS
imagen1
<120> Composicion para la estimulacion ovarica controlada <130> P/66643.EP01
<150> EP 11176803.2
<151 > <160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 351
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400>
atggattact acagaaaata tgcagctatc tttctggtca cattgtcggt gtttctgcat gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag tccacttgct gtgtagctaa atcatataac agggtcacag taatgggggg tttcaaagtg
gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tgttattatc acaaatctta a
<210> 2 <211> 390
<212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2
atgaagacac tccagttttt cttccttttc tgttgctgga aagcaatctg ctgcaatagc tgtgagctga ccaacatcac cattgcaata gagaaagaag aatgtcgttt ctgcataagc atcaacacca cttggtgtgc tggctactgc tacaccaggg atctggtgta taaggaccca gccaggccca aaatccagaa aacatgtacc ttcaaggaac tggtatatga aacagtgaga gtgcccggct gtgctcacca tgcagattcc ttgtatacat acccagtggc cacccagtgt cactgtggca agtgtgacag cgacagcact gattgtactg tgcgaggcct ggggcccagc tactgctcct ttggtgaaat gaaagaataa

<210> 3

<211> 999
<212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 3
atgtgtcctg caggctggaa gctcctggcc atgttggctc tggtcctggt cgtcatggtg
60
120
180
240
300
351
60
120
180
240
300
360
390
tggtattcca
tctcccggga agacaggtac atcgagcttt tttattttcc catcccagag 120
aagaaggagc
cgtgcctcca gggtgaggca gagagcaagg cctctaagct ctttggcaac 180
tactcccggg
atcagcccat cttcctgcgg cttgaggatt atttctgggt caagacgcca 240
tctgcttacg
agctgcccta tgggaccaag gggagtgagg atctgctcct ccgggtgcta 300
gccatcacca
gctcctccat ccccaagaac atccagagcc tcaggtgccg ccgctgtgtg 360
gtcgtgggga
acgggcaccg gctgcggaac agctcactgg gagatgccat caacaagtac 420
gatgtggtca
tcagattgaa caatgcccca gtggctggct atgagggtga cgtgggctcc 480
aagaccacca
tgcgtctctt ctaccctgaa tctgcccact tcgaccccaa agtagaaaac 540
aacccagaca
cactcctcgt cctggtagct ttcaaggcaa tggacttcca ctggattgag 600
accatcctga
gtgataagaa gcgggtgcga aagggtttct ggaaacagcc tcccctcatc 660
tgggatgtca
atcctaaaca gattcggatt ctcaacccct tcttcatgga gattgeaget 720
gacaaactgc
tgagcctgcc aatgcaacag ccacggaaga ttaagcagaa gcccaccacg 780
ggcctgttgg
ccatcacgct ggccctccac ctctgtgact tggtgcacat tgccggcttt 840
ggctacccag
acgcctacaa caagaagcag accattcact actatgagea gatcacgctc 900
aagtccatgg
cggggtcagg ccataatgtc tcccaagagg ccctggccat taagcggatg 960
ctggagatgg
gagctatcaa gaacctcacg tccttctga 999
<210>4 <211> 1221 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 4 atgattcaca
ccaacctgaa gaaaaagttc agctgctgcg tcctggtctt tcttctgttt 60
gcagtcatct
gtgtgtggaa ggaaaagaag aaagggagtt actatgattc ctttaaattg 120
caaaccaagg
aattccaggt gttaaagagt ctggggaaat tggccatggg gtctgattcc 180
cagtctgtat
cctcaagcag cacccaggac ccccacaggg gccgccagac cctcggcagt 240
ctcagaggcc
tagccaaggc caaaccagag gcctccttcc aggtgtggaa caaggacagc 300
tcttccaaaa
accttatccc taggctgcaa aagatctgga agaattacct aagcatgaac 360
aagtacaaag
tgtcctacaa ggggccagga ccaggcatca agttcagtgc agaggccctg 420
cgctgccacc
tccgggacca tgtgaatgta tccatggtag aggtcacaga ttttcccttc 480
aatacctctg
aatgggaggg ttatctgccc aaggagagea ttaggaccaa ggctgggcct 540
tggggcaggt
gtgctgttgt gtcgtcagcg ggatctctga agtcctccca actaggcaga 600
gaaatcgatg
atcatgacgc agtcctgagg tttaatgggg cacccacagc caacttccaa 660
caagatgtgg
gcacaaaaac taccattcgc ctgatgaact ctcagttggt taccacagag 720
aagcgcttcc
tcaaagacag tttgtacaat gaaggaatcc taattgtatg ggacccatct 780
gtataccact
cagatatccc aaagtggtac cagaatccgg attataattt ctttaacaac 840
tacaagactt
atcgtaagct gcaccccaat cagccctttt acatcctcaa gccccagatg 900
ccttgggagc
tatgggacat tcttcaagaa atctccccag aagagattca gccaaacccc 960
ccatcctctg
ggatgcttgg tatcatcatc atgatgacgc tgtgtgacca ggtggatatt 1020
tatgagttcc
tcccatccaa gcgcaagact gacgtgtgct actactacca gaagttcttc 1080
gatagtgcct
gcacgatggg tgcctaccac ccgctgctct atgagaagaa tttggtgaag 1140
catctcaacc
agggcacaga tgaggacatc tacctgcttg gaaaagccac actgcctggc 1200
ttccggacca
ttcactgcta a 1221
<210>5 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Met Asp Tyr Tyr Arg Lys 1 5

Tyr Ala Ala lie Phe Leu Val Thr Leu Ser 10 15

Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gin Asp Cys Pro 20 25 30

Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gin Pro Gly Ala Pro 35 40 45

lie Leu Gin Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 50 55 60

Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gin Lys Asn Val Thr Ser Glu 65 70 75 80

Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly 85 90 95

Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110
Tyr His Lys Ser 115
5
<210> 6
10 <211> 129
<212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 6

Met Lys Thr Leu Gin Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala lie 15 10 15

Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn lie Thr lie Ala lie Glu Lys 20 25 30

Glu Glu Cys Arg Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45

Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60

lie Gin Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg 65 70 75 80
Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val

85 90 95

Ala Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110

Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 115 120 125
Glu
<210>7 <211> 332 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 7

Met Cys Pro Ala Gly Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val Leu 15 10 15

Val Val Met Val Trp Tyr Ser lie Ser Arg Glu Asp Arg Tyr lie Glu 20 25 30

Leu Phe Tyr Phe Pro lie Pro Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gin Gly 35 40 45

Glu Ala Glu Ser Lys Ala Ser Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp 50 55 60

Gin Pro lie Phe Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro 65 70 75 80

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un producto que comprende FSH para su uso en el tratamiento de la esterilidad en un sujeto que esta en riesgo de OHSS y que tiene un nivel de AMH en suero de >15 pmol/l, en el que el producto va a administrate a una dosis
    5 de, o dosis equivalente a, 0,09 a 0,19 |ig de FSH recombinante derivada de lmea celular de un ser humano por kilogramo de peso corporal del paciente por dfa, en donde la FSH incluye a2,3- y a2,6-sialilacion, en el que del 1% al 99% de la sialilacion total es a2,6-sialilacion.
  2. 2. Un producto para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que se trata la esterilidad mediante estimulacion 10 ovarica controlada.
  3. 3. Un producto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el tratamiento de la esterilidad incluye una etapa para determinar el nivel de AMH en suero de la paciente.
    Figuras
    Figs 1,2 y 3: Mapas de plasmidos de los vectores de expresion pFSHalpha/beta, pST3 y pST6. CMV= promotor de citomegalovirus, BGHp(A) = secuencia de poliadenilacion de la hormona de crecimiento bovina, fl ori= origen de replicacion, SV40= promotor del virus 40 de simios, Neo= marcador de resistencia a neomicina, Hyg= marcador de resistencia a higromicina, SV40 p(A)= secuencia de poliadenilacion del virus 40 de simios, FSH A = polipeptido alfa de la hormona estimulante del folfculo, FSH B = polipeptido beta de la hormona estimulante del folfculo, ST3GAL4= a2,3 -sialiltransferasa, ST6GAL1= a2,6-sialiltransferasa, CoIEI= origen de replicacion de ColEI, Amp= marcador de resistencia a ampicilina.
    Figura 1. Vector de expresion de FSH
    imagen1
    BGH p(A)
    imagen2
    Fig 4 % de abundancia (eje y) de la distribucion de acido sialico
    imagen3
    Acido 2,6-sialico Acido 2,3-sialico Otras cargas
    distintas al acido sialico
    ■ Muestra 1
    ■ Muestra 2
    □ Muestra 3
    □ Muestra 4
    ■ Muestra 5
    ■ Muestra 6
    ■ Muestra 7
    □ Muestra 8
    % de abundancia de la distribucion de acido sialico
    Fig 5 % de abundancia (eje y) de la distribucion de carga de glicanos de rFSH
    imagen4
    ■ Muestra 1
    ■ Muestra 2
    □ Muestra 3
    □ Muestra 4
    ■ Muestra 5
    ■ Muestra 6
    ■ Muestra 7
    □ Muestra 8
    Transcurso temporal de la concentracion de inhibina B a lo largo del tiempo
    imagen5
    225 Ul DE FE999049 -------- 225 Ul DE GONAL-F
    FIG. 6
    Menos f de 0.5 j ovocitos I
    imagen6
    FIG. 7
    imagen7
    FIG. 8
ES17154031.3T 2011-08-08 2012-08-08 Composición para estimulación ovárica controlada Active ES2692774T3 (es)

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