ES2691946T3 - Métodos y reactivos para la determinación de analitos isoméricos - Google Patents

Abstract

Un metodo de determinacion en una muestra de una cantidad de un primer analito isomerico y un segundo analito isomerico, comprendiendo el metodo: (a) medir una cantidad total del primer analito isomerico y el segundo analito isomerico mediante la realizacion de un ensayo en una porcion de la muestra usando un primer anticuerpo que tiene una afinidad 5 de union para cada uno de entre el primer analito isomerico y el segundo analito isomerico de al menos 107 litros/mol para obtener un primer valor de medicion; (b) medir una cantidad del segundo analito isomerico mediante la realizacion del ensayo en una porcion de la muestra usando el primer anticuerpo para obtener un segundo valor de medicion, en el que un segundo anticuerpo que tiene una afinidad de union para el primer analito isomerico de 106 a 108 litros/mol y una afinidad de union para el segundo analito isomerico de menos de 104 litros/mol se emplea en exceso para bloquear la union del primer analito isomerico al primer anticuerpo; e (c) igualar el segundo valor de medicion a una cantidad del segundo analito isomerico en la muestra y restar el segundo valor de medicion del primer valor de medicion para obtener un valor resultante e igualar el valor resultante a una cantidad del primer analito isomerico en la muestra, en el que los dos analitos isomericos son 25-hidroxivitamina D3 y 3-epi 25-hidroxivitamina D3.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y reactivos para la determinacion de analitos isomericos Antecedentes

La presente invencion se refiere a metodos para la determinacion de la presencia y/o cantidad de cada uno de los dos analitos isomericos 25-hidroxivitamina D3 y 3-epi 25-hidroxivitamina D3 en una muestra que se sospecha que contiene los analitos isomericos.

Muchos compuestos de molecula pequena o haptenos tales como, por ejemplo, farmacos y vitaminas, existen en formas isomericas, de las cuales solo una forma es activa. Con el fin de obtener una medicion precisa de la forma activa de un analito, debe abordarse la presencia del isomero no activo del analito. Las mediciones de ambas formas isomericas de un analito, es decir, formas activas y no activas, pueden conducir a imprecisiones que pueden ser perjudiciales para un individuo dependiendo de la funcion de la forma activa del analito. La evaluacion precisa del nivel de cada uno de un par de analitos isomericos en muestras biologicas es importante, especialmente cuando solo uno de los isomeros es activo y las mediciones que incluyen la cantidad del isomero no activo distorsionan el nivel del analito en una muestra. Por ejemplo, la medicion de los niveles de vitamina D en muestras biologicas es importante puesto que la deficiencia de vitamina D esta relacionada con una serie de trastornos en mamiferos. En lactantes, por ejemplo, las mediciones de vitamina D que incluyen cantidades de isomeros 3-epi pueden conducir a una evaluacion imprecisa de los niveles de vitamina D en el lactante, lo que a su vez puede conducir a una falta de complementation adecuada. Es importante medir la forma activa de la vitamina D de manera que un infante pueda recibir la terapia con vitamina D adecuada, si es necesario.

El termino "vitamina D" se refiere a un grupo de secoesteroides solubles en grasa. En los seres humanos, la vitamina D es unica porque puede ingerirse como colecalciferol (vitamina D3) o ergocalciferol (vitamina D2) y porque el cuerpo tambien puede sintetizarla (a partir de colesterol) cuando la exposition al sol es adecuada. Debido a esta ultima propiedad, la vitamina D es considerada por algunos una vitamina dietetica no esencial, aunque la mayoria la considera un nutriente esencial. La vitamina D tiene un papel fisiologico importante en la regulation positiva de la homeostasis del ion calcio. La vitamina D3 es la forma de la vitamina sintetizada por los animales. Tambien es un complemento habitual anadido a los productos lacteos y ciertos productos alimentarios como lo es la vitamina D2.

La vitamina D3 tanto dietetica como intrinsecamente sintetizada debe experimentar la activation metabolica para generar metabolitos bioactivos. En seres humanos, la etapa inicial de la activacion de la vitamina D3 se produce principalmente en el higado e implica la hidroxilacion para formar el metabolito intermedio 25-hidroxicolecalciferol (tambien denominado calcidiol, calcifediol, 25-hidroxicolecalciferol o 25-hidroxivitamina D3. El calcidiol es la forma principal de la vitamina D3 en el sistema circulatorio. La vitamina D2 tambien experimenta una activacion metabolica similar a la 25-hidroxivitamina D2. En conjunto, estos compuestos se denominan 25-hidroxivitamina D (abreviado 25(OH)D) y son los principales metabolitos que se miden en suero para la determinacion del estado de vitamina D; 25(OH)D y sus epimeros son prehormonas que deben convertirse en 1,25(OH)D para ejercer funciones biologicas. La comparacion de la bioactividad de 1,25(OH)D frente a la de 3-epi-1,25(OH)D es compleja.

Los compuestos de vitamina D 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2 son epimericos en la position 3, designandose los epimeros 25-hidroxivitamina D3 y 3-epi-25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2 y 3-epi-25- hidroxivitamina D2, respectivamente. Solo uno de los epimeros de cada uno de estos compuestos epimericos, en concreto, 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2, respectivamente, estan activos. Las estructuras para los epimeros de 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2 se exponen en la Fig. 1. La patente de los EE.UU. N.° 2009/0137056 se refiere a metodos basados en espectrometria de masas de detection de la presencia o cantidad de metabolitos de dihidroxivitamina D, incluyendo epimeros de la vitamina-D3, en una muestra.

Existe la necesidad de reactivos y metodos para determinaciones precisas y sensibles de concentraciones de formas epimericas de la vitamina D.

Sumario

Los principios que se describen en el presente documento se refieren a metodos de determinacion en una muestra de una cantidad de un primer analito isomerico y un segundo analito isomerico. En el metodo, se determinan un primer valor de medicion y un segundo valor de medicion. Para la determinacion del primer valor de medicion, se mide una cantidad total del primer analito isomerico y el segundo analito isomerico mediante la realization de un ensayo en una portion de la muestra usando un primer anticuerpo que tiene una afinidad de union para cada uno de entre el primer analito isomerico y el segundo analito isomerico de al menos aproximadamente 107 litros/mol. Para la determinacion del segundo valor de medicion, se mide una cantidad del segundo analito isomerico mediante la realizacion del ensayo en una porcion de la muestra usando el primer anticuerpo para obtener un segundo valor de medicion, en el que un segundo anticuerpo que tiene una afinidad de union por el primer analito isomerico de

aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 litros/mol y una afinidad de union por el segundo analito isomerico de menos de aproximadamente 104 litros/mol se emplea en exceso para bloquear la union del primer analito isomerico al primer anticuerpo. El segundo valor de medicion se compara con una cantidad del segundo analito isomerico en la muestra y el segundo valor de medicion se resta del primer valor de medicion para obtener un valor 5 resultante, que se equipara a una cantidad del primer analito isomerico en la muestra. Los dos analitos isomericos son 25-hidroxivitamina D3 y 3-epi 25-hidroxivitamina D3.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 es una representacion de las formulas quimicas para las formas epimericas de 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2.

10 La Fig. 2 es un grafico que representa las mediciones de vitamina D de 3-epi-25-hidroxivitamina D3 con y sin la

adicion de un segundo anticuerpo de acuerdo con los ejemplos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento.

La Fig. 3 es un grafico que representa las mediciones de vitamina D de 3-epi-25-hidroxivitamina D3 con y sin la adicion de un segundo anticuerpo de acuerdo con los ejemplos de acuerdo con los principios que se describen 15 en el presente documento.

Descripcion detallada de realizaciones especificas

Analisis general

Los metodos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento minimizan la reactividad cruzada y miden una cantidad de uno de los dos isomeros de un analito donde uno de los isomeros o su producto 20 metabolico es potente y el otro o su producto metabolico no lo es. El termino "potente" se refiere al grado de actividad de un analito con respecto a una funcion particular, que puede ser, por ejemplo, una funcion biologica tal como, por ejemplo, el metabolismo oseo. Por ejemplo, la actividad biologica de una sustancia se relaciona con la capacidad de la sustancia para potenciar o suprimir una funcion biologica tal como, por ejemplo, mantener niveles apropiados de minerales y sales en un sujeto, una funcion celular. La vitamina D mantiene niveles apropiados de 25 calcio y fosfato en un sujeto, lo que se relaciona con la homeostasis del calcio y el metabolismo oseo.

Los metodos incluyen determinar en una muestra una cantidad de un primer analito isomerico y un segundo analito isomerico. Se determinan un primer valor de medicion y un segundo valor de medicion. El primer valor de medicion representa una cantidad total del primer analito isomerico y el segundo analito isomerico. El segundo valor de medicion representa una cantidad del segundo analito isomerico solamente. El segundo valor de medicion se resta 30 del primer valor de medicion para obtener un valor resultante y el valor resultante se iguala a una cantidad del primer analito isomerico en la muestra.

En metodos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento, se utilizan al menos dos porciones de una muestra que se ha de analizar. Se realiza un ensayo en una primera porcion de la muestra que se sospecha que contiene al menos dos formas isomericas de un analito usando un anticuerpo (primer anticuerpo) que 35 se une a ambas formas isomericas del analito. El primer anticuerpo presenta una afinidad de union de ensayo suficiente para cada uno de entre el primer analito isomerico y el segundo analito isomerico.

La frase "afinidad de union de ensayo" se refiere a la fuerza con la que un anticuerpo se une a un analito correspondiente para producir un complejo de anticuerpo unido al analito.

La frase "afinidad de union de ensayo suficiente" significa que la afinidad de union de un anticuerpo por un analito es 40 la que produce un complejo detectable en una cantidad suficiente para obtener una senal de ensayo que da como resultado una determinacion precisa y sensible del analito. La afinidad de union del primer anticuerpo es lo suficientemente fuerte para formar complejos detectables del primer anticuerpo y cada uno de entre el primer analito isomerico y el segundo analito isomerico donde los complejos detectables representan con precision la cantidad del primer analito isomerico y el segundo analito isomerico en la muestra una vez que el sistema de ensayo y el 45 instrumento han sido sometidos a calibracion adecuada y se han aplicado cualesquiera factores de correccion para el reconocimiento de anticuerpos de uno o ambos analitos isomericos. Este ensayo en la primera porcion de la muestra mide la cantidad o concentracion de ambas formas isomericas de un analito en una muestra.

El mismo ensayo se realiza en una segunda porcion de la misma muestra usando tanto el primer anticuerpo que se une a ambas formas isomericas del analito como un segundo anticuerpo que se une a una de las formas isomericas 50 (primera forma isomerica) pero que no presenta sustancialmente ninguna afinidad de union para la otra forma isomerica (segunda forma isomerica) dejando la segunda forma isomerica libre para la deteccion por el primer anticuerpo en el ensayo realizado en la segunda porcion. El segundo anticuerpo que se une a la primera forma isomerica, pero no a la segunda forma isomerica, presenta una afinidad de union de ensayo insuficiente para el primer analito isomerico. En algunos ejemplos, el segundo anticuerpo que se une a una de las formas isomericas,

pero no a la otra forma isomerica, se une a la forma isomerica activa, pero no a la forma isomerica no activa. Este ensayo en la segunda porcion de la muestra mide la concentracion de solo una de las formas isomericas del analito, es decir, el segundo analito isomerico en la descripcion anterior. Los valores de senal obtenidos pueden usarse para la determinacion de la concentracion de analito total y la concentracion de cada una de las dos formas isomericas 5 del analito.

La frase "afinidad de union de ensayo insuficiente" significa que la afinidad de union del segundo anticuerpo por un analito isomerico es menor que la afinidad de union del primer anticuerpo por el analito isomerico. En algunos ejemplos, la frase "afinidad de union de ensayo insuficiente" significa que la afinidad de union del segundo anticuerpo por un analito isomerico no es lo suficientemente grande para formar complejos detectables entre el 10 segundo anticuerpo y el primer analito isomerico y, por tanto, ningun complejo detectable representa de forma precisa la cantidad del primer analito isomerico. El segundo anticuerpo, cuando se usa en exceso, presenta una afinidad de union suficiente para que el primer analito isomerico bloquee la union del primer anticuerpo al primer analito isomerico en el ensayo en la segunda porcion de la muestra. La afinidad de union del segundo anticuerpo por la primera forma isomerica del analito es demasiado baja para generar complejos de segundo anticuerpo y primer 15 analito isomerico de manera que se produzca suficiente senal para la detection precisa del primer analito isomerico en el ensayo empleado.

La frase "no presenta sustancialmente ninguna afinidad de union" por la segunda forma isomerica significa que sustancialmente no se forman complejos detectables entre el segundo anticuerpo y la segunda forma isomerica del analito.

20 Debe observarse que, si el resultado del ensayo en la segunda porcion de la muestra es sustancialmente equivalente a cero, entonces el resultado obtenido del ensayo en la primera porcion de la muestra representa la concentracion de solo una de las dos formas isomericas del analito puesto que la otra forma isomerica del analito no se detecta en el ensayo en la segunda porcion de la muestra. En una circunstancia de este tipo, no seria necesario realizar ensayos en dos porciones de la muestra en cuestion puesto que los resultados de los metodos de acuerdo 25 con los principios que se describen en el presente documento indican que solo una de las formas isomericas del analito contribuye a la senal obtenida en el ensayo en la primera porcion de la muestra. Por otro lado, si el resultado del ensayo en la segunda porcion de la muestra no es sustancialmente equivalente a cero, entonces el resultado obtenido del ensayo en la primera porcion de la muestra representa la concentracion de ambas formas isomericas del analito puesto que la otra forma isomerica del analito se detecta en el ensayo en la segunda porcion de la 30 muestra. En una circunstancia de este tipo, seria necesario realizar ensayos en dos porciones de la muestra en cuestion, puesto que los resultados de los metodos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento indican que las dos formas isomericas del analito contribuyen a la senal obtenida en el ensayo en la primera porcion de la muestra.

Preparation de anticuerpos

35 Se describen ejemplos de metodos de preparacion de anticuerpos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento a modo de ilustracion y no de limitation. Se requieren al menos dos anticuerpos diferentes, que tengan las propiedades de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento. Un anticuerpo presenta suficiente afinidad de union de ensayo tanto para el primer analito isomerico como para el segundo analito isomerico. El otro anticuerpo se une al primer analito isomerico, pero presenta una afinidad de union 40 de ensayo insuficiente para el primer analito isomerico y no presenta sustancialmente ninguna afinidad de union de ensayo para el segundo analito isomerico.

La afinidad de union de ensayo suficiente es de al menos aproximadamente 107 litros/mol, o al menos aproximadamente 108 litros/mol, o al menos aproximadamente 109 litros/mol, o al menos aproximadamente 1010 litros/mol, o al menos aproximadamente 1011 litros/mol, o al menos aproximadamente 1012 litros/mol, o al menos 45 aproximadamente 1013 litros/mol, o al menos aproximadamente 1014 litros/mol, por ejemplo, y la cantidad de complejo detectable es suficiente para obtener una senal de ensayo que da como resultado una determinacion precisa y sensible del analito. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento, la afinidad de union de ensayo suficiente es de aproximadamente 107 a aproximadamente 1014 litros/mol o de aproximadamente 107 a aproximadamente 1011 litros/mol, o de aproximadamente 107 a aproximadamente 50 1012 litros/mol, o de aproximadamente 108 a aproximadamente 1014 litros/mol, o de aproximadamente 108 a

aproximadamente 1011 litros/mol, o de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 litros/mol, por ejemplo.

Una afinidad de union de ensayo insuficiente significa que la afinidad de union del segundo anticuerpo para un primer analito isomerico es menor que la afinidad de union del primer anticuerpo para el primer analito isomerico. En algunos ejemplos, dependiendo de la afinidad de union del primer anticuerpo para el primer analito isomerico, la 55 afinidad de union del segundo anticuerpo por un primer analito isomerico es menor que la afinidad de union del primer anticuerpo por el primer analito isomerico por un factor, por ejemplo, de aproximadamente 10 o aproximadamente l02, o aproximadamente 103, o aproximadamente 104, o aproximadamente 105. Por ejemplo, si la afinidad de union del primer anticuerpo para el primer analito isomerico es de aproximadamente 109 litros/mol, la

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afinidad de union del segundo anticuerpo puede ser inferior a aproximadamente 107 litros/mol o inferior a aproximadamente 106 litros/mol. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento, una afinidad de union de ensayo insuficiente significa que la afinidad de union de un anticuerpo por un analito es de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 litros/mol o de aproximadamente 106 a aproximadamente 107 litros/mol, por ejemplo, dependiendo de la naturaleza del anticuerpo y la naturaleza del analito.

En algunos ejemplos, sustancialmente ninguna afinidad de union significa que un anticuerpo tiene una afinidad de union por un analito isomerico de menos de aproximadamente 104 litros/mol o menos de aproximadamente 103 litros/mol, o menos de aproximadamente 102 litros/mol, o menos de aproximadamente 10 litros/mol, por ejemplo.

En el analisis anterior, la afinidad de union es la afinidad de union especifica, que implica el reconocimiento especifico de una de dos moleculas diferentes por la otra en comparacion con un reconocimiento sustancialmente menor de otras moleculas. Por otro lado, la union no especifica implica la union no covalente entre moleculas que es relativamente independiente de las estructuras superficiales especificas. La union no especifica puede ser el resultado de varios factores, incluyendo interacciones hidrofobicas entre moleculas.

El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o fragmento de la misma, inmunoglobulinas que incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los fragmentos de las mismas pueden incluir Fab, Fv y F(ab')2, Fab' y similares. Ademas, pueden usarse agregados, polimeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea apropiado a condicion de que se mantenga la afinidad de union por una molecula particular.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante tecnicas que son bien conocidas en la tecnica, tales como la preparacion de estirpes celulares hibridas continuas y la recoleccion de la proteina secretada (tecnicas de hibridacion de celulas somaticas). Pueden producirse anticuerpos monoclonales de acuerdo con las tecnicas convencionales de Kohler y Milstein, Nature 265: 495-497, 1975. Se encuentran revisiones de tecnicas de anticuerpos monoclonales en Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag (Nueva York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980) y Methods of Enzymology 73 (Parte B): 3-46 (1981).

En otro enfoque para la preparacion de anticuerpos, la secuencia que codifica los sitios de union del anticuerpo puede escindirse del ADN del cromosoma e insertarse en un vector de clonacion, que puede expresarse en bacterias para producir proteinas recombinantes que tienen los sitios de union del anticuerpo correspondientes. Este enfoque implica clonar y expresar secuencias de nucleotidos o versiones mutagenizadas de las mismas que codifican al menos las secuencias de aminoacidos necesarias para la union especifica de anticuerpos naturales.

En un enfoque para la produccion de anticuerpos monoclonales, una primera etapa incluye la inmunizacion de un animal productor de anticuerpos tal como un raton, una rata, una cabra, una oveja o una vaca con el antigeno, por ejemplo, con un inmunogeno. La inmunizacion puede realizarse con o sin un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund u otros adyuvantes tales como el monofosforil lipido A y el adyuvante dicorinomicolato de trehalosa sintetico. Una siguiente etapa incluye el aislamiento de celulas de bazo del animal productor de anticuerpos y fusionar las celulas del bazo productoras de anticuerpos con un companero de fusion apropiado, normalmente una celula de mieloma, tal como mediante el uso de polietilenglicol u otras tecnicas. Normalmente, las celulas de mieloma utilizadas son aquellas que crecen normalmente en medio de hipoxantina-timidina (HT) pero que no pueden crecer en medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), utilizados para la seleccion de las celulas fusionadas. Una siguiente etapa incluye la seleccion de las celulas fusionadas, normalmente mediante seleccion en medio HAT. Una siguiente etapa incluye el cribado de los hibridos clonados para la produccion de anticuerpos apropiados usando inmunoensayos tales como el ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) u otros inmunoensayos apropiados para el cribado.

La expresion "transportador inmunogenico" significa un grupo o resto que, cuando se conjuga con un hapteno y se inyecta en un mamifero o se emplea de otro modo como un inmunogeno, induce una respuesta inmunitaria y provoca la produccion de anticuerpos que se unen al hapteno. Los transportadores inmunogenicos tambien se denominan a veces transportadores antigenicos. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento, se sintetizan y usan inmunogenos que comprenden transportadores inmunogenicos, incluyendo transportadores inmunogenicos de poli(aminoacidos) y no poli(aminoacidos), unidos a un compuesto inmunosupresor en una posicion particular y se usan para la preparacion de anticuerpos. Los haptenos son compuestos capaces de unirse especificamente a los anticuerpos correspondientes, pero no actuan ellos mismos como inmunogenos (o antigenos) para la preparacion de los anticuerpos. En consecuencia, un hapteno se une a un transportador inmunogenico, que se emplea para generar anticuerpos.

El intervalo de pesos moleculares (en Daltons) para los poli(aminoacidos) que son transportadores inmunogenicos es de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 10.000.000, o de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 600.000, o de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 250.000 de peso molecular, por ejemplo. Los transportadores inmunogenicos de poli(aminoacidos) incluyen proteinas tales como, por ejemplo, albuminas,

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proteinas sericas, por ejemplo, globulinas, protemas de cristalino y lipoproteinas. Las protemas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, albumina de suero bovino (BSA, por sus siglas en ingles), hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en ingles), ovoalbumina de huevo y gamma-globulina bovina (BGG, por sus siglas en ingles), por ejemplo. Los transportadores inmunogenicos no de poli(aminoacidos) incluyen polisacaridos, acidos nucleicos y particulas (materiales biologicos y sinteticos). Se desvela una amplia diversidad de transportadores inmunogenicos en Davalian, et al., Patente de los EE.UU. N.° 5.089.390, columna 4, linea 57 a columna 5, linea 5.

Como se ha mencionado anteriormente, el transportador inmunogenico puede ser un polisacarido, que es un un polimero de alto peso molecular de monosacaridos que puede prepararse de forma natural o sintetica y que, por lo general, implica condensaciones repetidas de monosacaridos. Son ejemplos de polisacaridos almidones, glucogeno, celulosa, gomas de carbohidratos, tales como goma arabiga, agar y similares. El polisacarido tambien puede contener restos de poli(aminoacido) y/o restos de Kpidos.

Como se ha mencionado anteriormente, en algunos ejemplos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento, el transportador inmunogenico puede unirse a un analogo de analito en una posicion predeterminada en el analito por medio de un grupo de enlace. En algunos ejemplos, el grupo de enlace puede comprender de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 atomos o de 4 a aproximadamente 30 atomos, sin contar el hidrogeno, y puede comprender una cadena de 2 a aproximadamente 30 atomos o de 3 a aproximadamente 20 atomos, seleccionados cada uno independientemente entre el grupo que consiste normalmente en carbono, oxigeno, azufre, nitrogeno y fosforo. Parte o la totalidad del grupo de enlace puede ser una porcion de la molecula que esta unida al compuesto inmunosupresor, tal como, pero no limitada a, un resto de aminoacido en un poli(aminoacido), por ejemplo. En algunos ejemplos, el grupo de enlace comprende una funcionalidad oxima.

El numero de heteroatomos en el grupo de enlace puede estar en el intervalo de 0 a aproximadamente 20 o de 1 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 10. El grupo de enlace puede ser alifatico o aromatico. Cuando hay heteroatomos presentes, el oxigeno normalmente esta presente como oxo u oxi, unido a carbono, azufre, nitrogeno o fosforo, el nitrogeno esta normalmente presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido a carbono, oxigeno, azufre o fosforo; el azufre es analogo al oxigeno; mientras que el fosforo esta unido a carbono, azufre, oxigeno o nitrogeno, por lo general como fosfonato y mono- o diester de fosfato. Las funcionalidades comunes en la formacion de un enlace covalente entre el grupo de enlace y la molecula que se ha de conjugar son alquilamina, amidina, tioamida, eter, urea, tiourea, guanidina, azo, tioeter y carboxilato, sulfonato y esteres de fosfato, amidas y tioesteres. Una realizacion especifica de un grupo de enlace que comprende heteroatomos es una funcionalidad oxima como se ha mencionado anteriormente.

En su mayor parte, cuando un grupo de enlace tiene una funcionalidad de enlace (funcionalidad para la reaccion con un resto) tal como, por ejemplo, un grupo no oxocarbonilo incluyendo analogos de nitrogeno y azufre, un grupo fosfato, un grupo amino, un agente alquilante tal como halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o el analogo de azufre, mercapto) oxocarbonilo (por ejemplo, aldehido o cetona) u olefina activa tal como una vinilsulfona o un ester a o p- insaturado, estas funcionalidades se unen a grupos amina, grupos carboxilo, olefinas activas, agentes alquilantes, por ejemplo, bromoacetilo. Cuando se unen una amina y un acido carboxilico o su derivado de nitrogeno o acido fosforico, se forman amidas, amidinas y fosforamidas. Cuando el mercaptano y la olefina activada se unen, se forman tioeteres. Cuando se unen un mercaptano y un agente alquilante, se forman tioeteres. Cuando el aldehido y una amina se unen en condiciones reductoras, se forma una alquilamina. Cuando se unen una cetona o aldehido y una hidroxilamina (incluyendo sus derivados cuando un sustituyente esta en lugar del hidrogeno del grupo hidroxilo), se forma una funcionalidad oxima (=N-O-). Cuando se unen un acido carboxilico o acido de fosfato y un alcohol, se forman esteres. Diversos grupos de enlace son bien conocidos en la tecnica; vease, por ejemplo, Cautrecasas, J. Biol. Chem. (1970) 245: 3059.

Cada anticuerpo diferente se selecciona por su afinidad de union a uno o a los dos analitos isomericos como se ha descrito anteriormente. En consecuencia, se prepara y se selecciona un primer anticuerpo por medio de un metodo de cribado apropiado de manera que el primer anticuerpo presente una afinidad de union de ensayo suficiente para cada uno de entre el primer analito isomerico y el segundo analito isomerico. Se prepara y se selecciona un segundo anticuerpo por medio de un metodo de cribado apropiado de manera que el segundo anticuerpo se una al primer analito isomerico, pero presente una afinidad de union de ensayo insuficiente para el primer analito isomerico y ademas no presente sustancialmente ninguna afinidad de union de ensayo para el segundo analito isomerico. Un anticuerpo con la afinidad de union necesaria para un analito como se ha establecido anteriormente puede seleccionarse mediante metodologias de cribado bien conocidas, que incluyen, a modo de ilustracion y no de limitacion, ELISA, transferencias puntuales, analisis de Western y Resonancia de Plasmon Superficial, por ejemplo.

Description general de los ensayos

Se puede emplear cualquier ensayo apropiado que utilice un anticuerpo en porciones de la muestra en las determinaciones implicadas de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento. Los ensayos pueden realizarse ya sea sin separation (homogeneos) o con separation (heterogeneos) de cualquiera de los componentes o productos de ensayo. Los ensayos heterogeneos generalmente implican una o mas etapas de

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separacion y pueden ser competitivos o no competitivos. Los ensayos pueden ser manuales o automaticos.

La muestra que se ha de analizar es una que se sospecha que contiene un analito. Las muestras pueden ser muestras biologicas o muestras no biologicas. Las muestras biologicas pueden ser de un sujeto mamifero o un sujeto no mamifero. Los mamiferos pueden ser, por ejemplo, seres humanos u otras especies animales. Las muestras biologicas incluyen fluidos biologicos tales como sangre completa, suero, plasma, esputo, fluido linfatico, semen, moco vaginal, heces, orina, fluido espinal, saliva, heces, Kquido cefalorraqrndeo, lagrimas, moco y similares; tejido biologico tal como cabello, piel, secciones o tejidos extirpados de organos u otras partes del cuerpo; etcetera. En muchos casos, la muestra es sangre completa, plasma o suero. Las muestras no biologicas que incluyen, pero no se limitan a, corrientes residuales, por ejemplo, tambien pueden analizarse usando compuestos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento.

La muestra puede prepararse en cualquier medio conveniente, que puede ser, por ejemplo, un medio de ensayo, que se analiza mas detalladamente a continuacion en el presente documento. En algunos casos, puede aplicarse un pretratamiento a la muestra, tal como, por ejemplo, para lisar celulas sanguineas. En algunos ejemplos, dicho pretratamiento se realiza en un medio que no interfiere posteriormente con un ensayo.

En muchas realizaciones, los inmunoensayos implican reactivos marcados. Los inmunoensayos que implican reactivos marcados incluyen inmunoensayos de quimioluminiscencia, inmunoensayos enzimaticos, inmunoensayos de polarizacion de fluorescencia, radioinmunoensayos, ensayo de inhibicion, ensayos de luminiscencia inducida y ensayos de canalizacion de oxigeno fluorescente, por ejemplo.

Un grupo general de inmunoensayos incluye inmunoensayos que usan una concentracion limitada de uno de los reactivos de ensayo. Otro grupo de inmunoensayos implica el uso de un exceso de uno o mas de los principales reactivos. Otro grupo de inmunoensayos son los ensayos homogeneos son separacion en los que los reactivos marcados modulan la senal del marcador tras la union de uno de los anticuerpos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento a uno o a los dos analitos isomericos en la muestra.

Como se ha mencionado anteriormente, los ensayos pueden realizarse sin separacion (homogeneos) o con separacion (heterogeneos) de cualquiera de los componentes o productos de ensayo. Los inmunoensayos homogeneos se ejemplifican mediante el ensayo EMIT® (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield, IL) desvelado en Rubenstein, et al., Patente de los EE.UU. N.° 3.817.837, columna 3, linea 6 a columna 6, linea 64; el inmunoensayo de luminiscencia inducida ("tecnologia LOCI®") desvelado en la Patente de los EE.UU. N.° 5.340.716 (Ullman, et al.); metodos de inmunofluorescencia tales como los desvelados en Ullman, et al., Patente de los EE.UU. N.° 3.996.345, columna 17, linea 59, columna 23, linea 25; inmunoensayos de canalizacion enzimatica ("ECIA", por sus siglas en ingles) tales como los desvelados en Maggio, et al., Patente de los Estados Unidos Num. 4.233.402, columna 6, linea 25 a columna 9, linea 63; el inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia ("FPIA", por sus siglas en ingles) como se describe, por ejemplo, en, entre otros, la Patente de los EE.UU. N.° 5.354.693; inmunoensayos enzimaticos tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ("ELISA", por sus siglas en ingles). Son ejemplos de ensayos heterogeneos el radioinmunoensayo, desvelados en Yalow, et al., J. Clin. Invest. 39: 1157 (1960).

Otros inmunoensayos enzimaticos son el inmunoensayo mediado por enzimas moduladas ("EMMIA", por sus siglas en ingles) analizado por Ngo y Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116: 285-288; el inmunoensayo de fluorescencia de sustrato marcado ("SLFIA", por sus siglas en ingles) desvelado por Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22: 895-904; los inmunoensayos de donantes enzimaticos combinados ("CEDIA", por sus siglas en ingles) desvelados por Khanna, et al., Clin. Chem. Acta (1989) 185: 231-240; inmunoensayos marcados con particulas homogeneas tales como inmunoensayos de inhibicion turbidimetricos potenciados con particulas ("PETINIA", por sus siglas en ingles), e inmunoensayo turbidimetrico potenciado con particulas ("PETIA", por sus siglas en ingles), etc.; por ejemplo.

Otros ensayos incluyen el inmunoensayo de particulas sol ("SPIA", por sus siglas en ingles), el inmunoensayo de colorante disperso ("DIA", por sus siglas en ingles); el metaloinmunoensayo ("MIA", por sus siglas en ingles); los inmunoensayos enzimaticos de membrana ("EMIA", por sus siglas en ingles); luminoinmunoensayos ("LIA", por sus siglas en ingles); etcetera. Otros tipos de ensayos incluyen ensayos de inmunosensor que implican el control de los cambios en las propiedades opticas, acusticas y electricas de un reactivo tras la union de un analito. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunosensor optico, ensayos de inmunosensor acustico, ensayos de inmunosensor de semiconductor, ensayos de inmunosensor de transductor electroquimico, ensayos de inmunosensor potenciometrico y ensayos de electrodo amperometrico.

Los ensayos heterogeneos generalmente implican una o mas etapas de separacion y pueden ser competitivos o no competitivos. Se desvela una diversidad de formatos de ensayo heterogeneos competitivos y no competitivos en Davalian, et al., Patente de los EE.UU. N.° 5.089.390, columna 14, linea 25 a columna 15, linea 9. En un ejemplo de un ensayo heterogeneo competitivo, se pone en contacto un soporte que tiene un anticuerpo para analito unido al mismo con un medio que contiene la muestra que se sospecha que contiene el analito y un analito analogo que

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comprende un marcador. El analito en la muestra compite, por la union al anticuerpo del analito, con el analogo del analito marcado. Despues de separar el soporte y el medio, la actividad de marcaje del soporte o medio se determina mediante tecnicas convencionales y se relaciona con la cantidad de analito en la muestra. En una variacion del ensayo heterogeneo competitivo anterior, el soporte comprende un analogo de analito, que compite con el analito de la muestra por la union a un reactivo de anticuerpo de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento.

En algunos ejemplos, la muestra a analizar se somete a un pretratamiento para liberar el analito de sustancias de union endogenas tales como, por ejemplo, proteinas de plasma o suero que se unen al analito. La liberation del analito de las sustancias de union endogenas puede realizarse, por ejemplo, mediante la adicion de un agente de digestion o un agente de liberacion o una combination de un agente de digestion y un agente de liberacion utilizados secuencialmente. El agente de digestion es el que descompone las sustancias de union endogenas para que ya no puedan unirse al analito. Dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, proteinasa K y proteinasa K y agentes desnaturalizantes de proteinas tales como, por ejemplo, detergentes (dodecilsulfato de sodio, por ejemplo). Los agentes de liberacion para liberar el analito de las sustancias de union endogenas incluyen, a modo de ilustracion y no de limitation, agentes desnaturalizantes acidos tales como, por ejemplo, acido salicilico, warfarina, acidos sulfonicos, acidos tolueno sulfonico, acido naftaleno sulfonico, acidos anilinonaftaleno sulfonicos (ANS) (incluyendo, por ejemplo, acido 1-anilinonaftaleno-8-sulfonico (1,8-ANS) y acido 8-anilinonaftaleno-1-sulfonico (8-ANS)), acidos salicilicos y derivados de los anteriores.

Las condiciones tales como, por ejemplo, la duration, la temperatura, el pH y la concentration del agente liberador en el medio para realizar las acciones de digestion o liberacion dependen de la naturaleza del analito, la naturaleza de las sustancias de union endogenas, la naturaleza de la muestra y la naturaleza del agente liberador, por ejemplo. En general, las condiciones son suficientes para conseguir el efecto o funcion deseados. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento, una concentracion eficaz de agente de liberacion es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente de 0,01 a aproximadamente 10 mg/ml, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/ml, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 mg/ml. El pretratamiento de la muestra para liberar el analito de las sustancias de union endogenas puede realizarse como una etapa separada antes de realizar un ensayo o como una primera etapa en un ensayo. En cualquier caso, pueden necesitarse uno o mas reactivos para detener la action del agente de digestion y/o el agente de liberacion.

Las condiciones para realizar un ensayo en una portion de una muestra de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento incluyen realizar el ensayo en un medio acuoso tamponado a un pH moderado, generalmente el que proporciona una sensibilidad de ensayo optima. El medio acuoso puede ser unicamente agua o puede incluir del 0,1 a aproximadamente el 40 por ciento en volumen de un cosolvente. El pH para el medio estara en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 11, o en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, o en el intervalo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5, por ejemplo. El pH por lo general sera un termino medio entre la union optima de los miembros de union de cualquier par de union especifico, el pH optimo para otros reactivos del ensayo tales como los miembros del sistema de production de senales, etc. Se pueden usar diversos tampones para conseguir el pH deseado y mantener el pH durante el ensayo. Los tampones ilustrativos incluyen, a modo de ilustracion y no de limitacion, borato, fosfato, carbonato, TRIS, barbital, PIPES, HEPES, MES, ACES, MOPS y BICINE, por ejemplo. El tampon particular empleado no es critico, pero en un ensayo individual puede preferirse uno u otro tampon.

Pueden emplearse diversos materiales auxiliares en los metodos de ensayo. Por ejemplo, ademas de tampones, el medio puede comprender estabilizadores para el medio y para los reactivos empleados. En algunas realizaciones, ademas de estos aditivos, pueden incluirse proteinas, tales como, por ejemplo, albuminas; disolventes organicos tales como, por ejemplo, formamida; sales de amonio cuaternario; polianiones tales como, por ejemplo, sulfato de dextrano; potenciadores de union, por ejemplo, polialquilenglicoles; polisacaridos tales como, por ejemplo, dextrano o trehalosa. El medio tambien puede comprender agentes para prevenir la formation de coagulos sanguineos. Dichos agentes son bien conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, EDTA, EGTA, citrato, heparina, por ejemplo. El medio tambien puede comprender uno o mas conservantes tales como, entre otros, azida sodica, sulfato de neomicina, PROCLIN® 300, estreptomicina, por ejemplo. El medio puede comprender adicionalmente uno o mas tensioactivos. Cualquiera de los materiales anteriores, si se emplea, esta presente en una concentracion o cantidad suficiente para conseguir el efecto o la funcion deseados.

Pueden aplicarse uno o mas periodos de incubation al medio a uno o mas intervalos incluyendo cualquier intervalo entre las adiciones de diversos reactivos empleados en un ensayo incluyendo los mencionados anteriormente. El medio por lo general se incuba a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que se produzca la union de diversos componentes de los reactivos y la union del analito en la muestra. Normalmente se emplean temperaturas moderadas para realizar el metodo y, por lo general, temperatura constante, preferentemente, temperatura ambiente, durante el periodo de medicion. En algunos ejemplos, las temperaturas de incubacion varian de aproximadamente 5 ° a aproximadamente 99 °C o de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 70 °C, o de

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aproximadamente 20 °C a aproximadamente 45 °C, por ejemplo. El penodo de tiempo para la incubacion, en algunos ejemplos, es de aproximadamente 0,2 segundos a aproximadamente 24 horas o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 6 horas, o de aproximadamente 2 segundos a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 15 minutos, por ejemplo. El periodo de tiempo depende de la temperatura del medio y de la velocidad de union de los diversos reactivos, que esta determinada por la constante de velocidad de asociacion, la concentracion, la constante de union y la constante de velocidad de disociacion.

Muchos ensayos analizados en el presente documento usan un sistema de production de senales, que puede tener uno o mas componentes, siendo al menos un componente un marcador. El sistema de produccion de senales genera una senal que se relaciona con la presencia de un analito en una muestra. El sistema de produccion de senales incluye todos los reactivos necesarios para producir una senal medible. Otros componentes del sistema de produccion de senales pueden incluirse en una solution reveladora y pueden incluir, pero no se limitan a, sustratos, potenciadores, activadores, compuestos quimioluminiscentes, cofactores, inhibidores, neutralizantes, iones metalicos y sustancias de union especificas necesarias para la union de sustancias generadoras de senal, por ejemplo. Otros componentes del sistema de produccion de senales pueden ser coenzimas, sustancias que reaccionan con productos enzimaticos, otras enzimas y catalizadores, por ejemplo. El sistema de produccion de senales proporciona una senal detectable por medios externos, mediante el uso de radiation electromagnetica, deseablemente mediante examen visual. Los sistemas de produccion de senales de ejemplo se describen en la Patente de los EE.UU. N.° 5.508.178.

El termino "marcador" incluye marcadores de poli(aminoacidos) y marcadores no de poli(aminoacidos). La expresion "restos de marcador de poli(aminoacido)" incluye marcadores que son proteinas tales como, pero no limitadas a, enzimas, anticuerpos, peptidos e inmunogenos, por ejemplo. Con proteinas marcadoras, tales como, por ejemplo, enzimas, el intervalo de peso molecular sera de aproximadamente 600.000 aproximadamente o de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 300.000 de peso molecular. Por lo general hay al menos un compuesto de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento (grupo analogo) por aproximadamente 200.000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 150.000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 100.000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 50.000 de peso molecular, por ejemplo, de la proteina. En el caso de las enzimas, el numero de grupos analogos es por lo general de 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 o de aproximadamente 6 a aproximadamente 10.

Las enzimas incluyen, a modo de ilustracion y no de limitation, enzimas redox tales como, por ejemplo, deshidrogenasas, por ejemplo, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y lactato deshidrogenasa; enzimas que implican la produccion de peroxido de hidrogeno y el uso del peroxido de hidrogeno para oxidar un precursor de colorante a un colorante tal como, por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, lactoperoxidasa y microperoxidasa; hidrolasas tales como, por ejemplo, fosfatasa alcalina y p-galactosidasa; luciferasas tales como, por ejemplo, luciferasa de luciernaga y luciferasa bacteriana; transferasas; combinaciones de enzimas tales como, pero no limitadas a, oxidasas de sacaridos, por ejemplo, glucosa y galactosa oxidasa, u oxidasas de compuestos heterociclicos, tales como la uricasa y la xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peroxido de hidrogeno para oxidar un precursor de colorante, es decir, una peroxidasa tal como peroxidasa de rabano picante, lactoperoxidasa o microperoxidasa, por ejemplo.

La expresion "marcadores no de poli(aminoacidos)" incluye aquellos marcadores que no son proteinas. El marcador no de poli(aminoacido) es susceptible de ser detectado directamente o es detectable a traves de una reaction que produce una senal detectable. El marcador no de poli(aminoacido) puede ser isotopico o no isotopico y puede ser, a modo de ilustracion y no de limitacion, un radioisotopo, un compuesto luminiscente (que incluye, pero no se limita a, compuestos fluorescentes y compuestos quimioluminiscentes, por ejemplo), un polinucleotido que codifica un catalizador, un promotor, un colorante, una coenzima, un sustrato de enzima, un grupo radioactivo y una secuencia polinucleotidica amplificable, por ejemplo.

En algunos ejemplos, un miembro del sistema de produccion de senales es una molecula organica pequena que se refiere a una molecula de peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 o de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.500, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 500. Dichas moleculas organicas pequenas incluyen, pero sin limitacion, biotina, moleculas fluorescentes (tales como fluoresceina y rodamina, por ejemplo), moleculas quimioluminiscentes y dinitrofenol, por ejemplo. Un companero de union para una molecula organica pequena es una molecula que especificamente reconoce y se une a la molecula pequena. Los companeros de union para una molecula pequena se definen por la naturaleza de la molecula pequena e incluyen, pero no se limitan a, avidina, estreptavidina, anticuerpo para la pequena molecula organica (que incluye, pero no se limita a, anticuerpo para una molecula fluorescente tal como anticuerpo para fluoresceina y anticuerpo para rodamina, por ejemplo), anticuerpo para una molecula quimioluminiscente, anticuerpo para dinitrofenol, por ejemplo.

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En algunos ejemplos de ensayos, se utiliza un soporte. El soporte puede estar compuesto por un material insoluble en agua, solido o fluido, organico o inorganico, y que puede ser transparente o parcialmente transparente. El soporte puede tener cualquiera de una serie de formas, tales como, pero sin limitacion, una particula (soporte en forma de particulas) incluyendo una perla, una pelicula, una membrana, un tubo, un pocillo, una tira, una varilla, una fibra o una superficie plana tal como, por ejemplo, una placa o papel, por ejemplo. El soporte puede o no suspenderse en el medio en el que se emplea. Son ejemplos de soportes que pueden suspenderse materiales polimericos, tales como latex, bicapas lipidicas o liposomas, gotitas de aceite, celulas e hidrogeles y particulas magneticas, por ejemplo. Otras composiciones de soporte incluyen polimeros, tales como, a modo de ilustracion y no de limitacion, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4 metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nylon, poli(butirato de vinilo), por ejemplo, ya sea utilizados solos o en combination con otros materiales. El soporte puede o no estar marcado adicionalmente con un colorante, catalizador u otro grupo detectable, por ejemplo.

En algunos ejemplos, el soporte puede ser una particula. Las particulas tienen un diametro promedio de al menos aproximadamente 0,02 micrometros y no mas de aproximadamente 100 micrometros. En algunos ejemplos, las particulas tienen un diametro promedio de aproximadamente 0,05 micrometros a aproximadamente 20 micrometros o de aproximadamente 0,3 micrometros a aproximadamente 10 micrometros. La particula puede ser organica o inorganica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, preferentemente de una densidad cercana a la del agua, generalmente de aproximadamente 0,7 g/ml a aproximadamente 1,5 g/ml y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las particulas pueden ser materiales biologicos tales como celulas y microorganismos, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, estreptococos, Staphylococcus aureus y E. coli, virus, por ejemplo. Las particulas tambien pueden ser particulas compuestas de polimeros organicos e inorganicos, liposomas, particulas de latex, particulas magneticas o no magneticas, vesiculas de fosfolipidos, quilomicrones, lipoproteinas y similares. En algunos ejemplos, las particulas son particulas de dioxido de cromo (cromo) o particulas de latex.

Las particulas quimioluminiscentes son particulas que tienen asociado a las mismas un compuesto quimioluminiscente. La frase "asociado a las mismas" como se usa en el presente documento significa que un compuesto tal como, por ejemplo, un compuesto quimioluminiscente y una particula pueden asociarse mediante enlace directo o indirecto, adsorcion, absorcion, incorporation o solution, por ejemplo. Son ejemplos de compuestos quimioluminiscentes que pueden utilizarse los expuestos en las Patentes de los EE.UU. N.° 5.340.716 y 6.251.581. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento, el compuesto quimioluminiscente es una sustancia fotoactivable que experimenta una reaction quimica tras la excitation directa o sensibilizada por la luz, o tras la reaccion con oxigeno singlete para formar un producto de reaccion metaestable que es capaz de descomponerse con la emision simultanea o posterior de luz, por lo general dentro del intervalo de longitud de onda de 250 a 1200 nm. El termino "fotoactivable" incluye "activable fotoquimicamente". En algunos ejemplos, los compuestos quimioluminiscentes son aquellos que reaccionan con el oxigeno singlete para formar dioxetanos o dioxetanonas. Las ultimas son por lo general olefinas ricas en electrones. Son ejemplos de dichas olefinas ricas en electrones enol eteres, enaminas, 9-alquiliden-N-alquilacridanos, arilvinileteres, dioxanos, arilimidazoles, 9-alquiliden-xantanos y lucigenina. Otros compuestos incluyen luminol y otros ftalilhidrazidas y compuestos quimioluminiscentes que estan protegidos frente a experimentar una reaccion quimioluminiscente en virtud de estar protegidos por un grupo protector fotoquimicamente labil, incluyendo dichos compuestos, por ejemplo, luciferina de luciernaga, acuaporina y luminol. Son ejemplos de dichos compuestos quimioluminiscentes que pueden utilizarse los que se exponen en la Patente de los EE.UU. N.° 5.709.994.

Las particulas de sensibilizador son particulas que tienen asociado a las mismas un compuesto sensibilizador, que incluye, pero no se limita a, un compuesto fotosensibilizador. Son ejemplos de compuestos sensibilizadores que pueden utilizarse los que se exponen en las Patentes de los EE.UU. N.° 5.340.716 y 6.251.581.

Un fotosensibilizador es un sensibilizador para la generation de oxigeno singlete por lo general mediante excitacion con luz. En algunos ejemplos, el fotosensibilizador absorbe a una longitud de onda mas larga que el compuesto quimioluminiscente y tiene un triplete de energia menor que el compuesto quimioluminiscente. El fotosensibilizador puede ser fotoactivable (por ejemplo, colorantes y compuestos aromaticos). El fotosensibilizador es por lo general un compuesto por atomos unidos covalentemente, por lo general con multiples enlaces dobles o triples conjugados. El compuesto debe absorber luz en el intervalo de longitud de onda de 200-1100 nm, por lo general de 300-1000 nm, preferentemente de 450-950 nm. Los fotosensibilizadores tipicos incluyen, pero no se limitan a, acetona, benzofenona, 9-tioxantona, eosina, 9,10-dibromoantraceno, azul de metileno, metalo-porfirinas (por ejemplo, hematoporfirina), ftalocianinas, clorofilas, Rosa de Bengala, fullereno de Buckminster, por ejemplo, y derivados de estos compuestos. Se enumeran ejemplos de otros fotosensibilizadores en N.J. Turro, "Molecular Photochemistry", pagina 132, W.A. Benjamin Inc., N.Y. 1965. El fotosensibilizador ayuda a la fotoactivacion donde la activation es mediante oxigeno singlete. Por lo general, el fotosensibilizador absorbe la luz y el fotosensibilizador excitado formado de este modo activa el oxigeno para producir oxigeno singlete, que reacciona con el compuesto quimioluminiscente para proporcionar un intermedio luminiscente metaestable.

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Algunos ensayos conocidos utilizan un sistema de produccion de senales (sps) que emplea los miembros del sps primero y segundo. Los miembros del sps pueden estar relacionados en que la activacion de un miembro del sps produce un producto tal como, por ejemplo, luz o un producto activado, lo que da como resultado la activacion de otro miembro del sps.

En un ejemplo de un ensayo de este tipo, los miembros del sps comprenden un sensibilizador tal como, por ejemplo, un fotosensibilizador y una composition quimioluminiscente que incluye un compuesto quimioluminiscente donde la activacion del sensibilizador da como resultado un producto que activa la composicion quimioluminiscente. El segundo miembro del sps por lo general genera una senal detectable que se relaciona con la cantidad de miembro del sps unido y/o sin unir, es decir, la cantidad de miembro del sps unido o sin unir al analito que se esta detectando. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento memoria, uno de entre el reactivo sensibilizador o el reactivo quimioluminiscente comprende un reactivo de anticuerpos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento.

Ejemplos de metodos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento

Como se ha analizado anteriormente, los metodos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento tienen por objeto determinar en una muestra una cantidad de un primer analito isomerico y un segundo analito isomerico, en los que los analitos isomericos son 25-hidroxivitamina D3 y 3-epi 25-hidroxivitamina D3. En el metodo, se determinan un primer valor de medicion y un segundo valor de medicion. Para la determination del primer valor de medicion, se mide una cantidad total del primer analito isomerico y el segundo analito isomerico mediante la realization de un ensayo en una primera portion de la muestra usando un primer anticuerpo que presenta suficiente afinidad de union de ensayo para cada uno de entre el primer analito isomerico y el segundo analito isomerico. En este ejemplo, el primer anticuerpo es un anticuerpo monoclonal preparado mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente.

La porcion de muestra puede prepararse en cualquier medio conveniente que no interfiera con un ensayo; generalmente se emplea un medio acuoso. El tamano de la porcion de muestra depende de una o mas de entre la naturaleza de los analitos isomericos, la naturaleza del ensayo, la naturaleza de los diversos reactivos para realizar el ensayo y la naturaleza del complejo que comprende el analito, por ejemplo. El tamano de la porcion de muestra deberia ser esencialmente el mismo para ambas mediciones implicadas en la determinacion. En algunos ejemplos, el volumen de la porcion de muestra es de aproximadamente 1 |ji a aproximadamente 100 |jl, o de aproximadamente 2 jl a aproximadamente 100 jl, o de aproximadamente 5 jl a aproximadamente 100 jl, o de aproximadamente 10 jl a aproximadamente 100 jl, o de aproximadamente 1 jl a aproximadamente 80 jl, o de aproximadamente 1 jl a aproximadamente 60 jl, o de aproximadamente 1 jl a aproximadamente 40 jl, o de aproximadamente 1 jl a aproximadamente 20 jl, o de aproximadamente 5 jl a aproximadamente 50 jl, o de aproximadamente 10 jl a aproximadamente 50 jl, por ejemplo.

El ensayo seleccionado para la determinacion del primer valor de medicion se realiza en la primera porcion de muestra, que puede pretratarse como se ha analizado anteriormente para liberar el analito de las sustancias de union endogenas. Una cantidad de un complejo que comprende el primer anticuerpo para el analito y el primer y segundo analitos isomericos se mide mediante la medicion de un nivel de senal generado por el complejo. La senal observada se relaciona con una cantidad total de primer analito isomerico y segundo analito isomerico combinados en la muestra.

Para la determinacion del segundo valor de medicion, se mide una cantidad del segundo analito isomerico mediante la realizacion del ensayo en una segunda porcion de la muestra usando el primer anticuerpo y el medio de ensayo comprende adicionalmente un segundo anticuerpo que se une al primer analito isomerico, pero presenta una afinidad de union de ensayo insuficiente para el primer analito isomerico y sustancialmente ninguna afinidad de union de ensayo para el segundo analito isomerico. La segunda porcion de muestra puede pretratarse como se ha analizado anteriormente para liberar el analito de las sustancias de union endogenas. Como alternativa, la muestra puede pretratarse antes de tomar porciones que se han de emplear en los metodos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento. En este ejemplo, el segundo anticuerpo es un anticuerpo monoclonal preparado mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente. El segundo anticuerpo se emplea en exceso con relation al primer anticuerpo en el medio de ensayo que comprende la segunda porcion de la muestra para bloquear la union del primer analito isomerico al primer anticuerpo. La cantidad en exceso es una cantidad mayor que la del primer anticuerpo necesaria para unir la mayor parte del primer analito isomerico que podria estar presente en una muestra. La cantidad del segundo anticuerpo empleado depende de la naturaleza del segundo anticuerpo, la naturaleza del primer anticuerpo, la naturaleza de los analitos isomericos, la naturaleza del medio de ensayo y la naturaleza del ensayo, por ejemplo. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento, una cantidad en exceso del segundo anticuerpo es de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 veces o de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 veces, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 veces, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 veces, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 veces, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 veces, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 veces, o de aproximadamente 20 a

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aproximadamente 200 veces, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 150 veces, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 veces, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 veces la del primer anticuerpo, por ejemplo. Una cantidad de un complejo que comprende el primer anticuerpo para el analito y el segundo analito isomerico se mide mediante la medicion de un nivel de senal generado por el complejo. La senal observada se relaciona con una cantidad del segundo analito isomerico en la muestra. El segundo valor de medicion se resta del primer valor de medicion para obtener un valor resultante y el valor resultante se iguala a una cantidad del primer analito isomerico en la muestra.

Como se ha analizado mas en detalle anteriormente, puede emplearse cualquier ensayo adecuado. El ensayo comprende anadir reactivos para la determinacion de la concentracion de un analito en la muestra. Los reactivos incluyen al menos el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo y, por tanto, el ensayo es un inmunoensayo. Los ensayos realizados en las porciones de muestra pueden realizarse secuencialmente o de forma concomitante en recipientes de reaccion separados o secuencialmente en el mismo recipiente de reaccion para cada porcion de muestra. El termino "complejo" se refiere a un complejo en el que el anticuerpo para el analito esta unido al analito en la muestra.

Como se ha mencionado anteriormente, las mediciones de los analitos isomericos pueden realizarse en muestras que se han tratado con un agente de liberacion. La cantidad de agente de liberacion que se anade a la muestra es la que es suficiente para desplazar sustancialmente todos los analitos isomericos de las sustancias de union endogenas. La frase "desplazar sustancialmente todos los analitos isomericos que estan unidos por sustancias de union endogenas" significa que los analitos isomericos estan al menos un 80 % o al menos un 90 %, o al menos un 95 %, o al menos un 99 %, o al menos un 99,5 %, o al menos un 99,9 % o esta un 100 % desplazados de las sustancias de union endogenas y disponibles para la deteccion durante un ensayo.

Despues de la adicion de un agente de liberacion, la muestra se incuba durante un periodo de tiempo en condiciones para desplazar sustancialmente la totalidad de los analitos isomericos de las sustancias de union endogenas. La duracion y las condiciones de la incubacion dependen de una o mas de las caracteristicas del agente liberador, la naturaleza del analito y la concentracion supuesta del analito, por ejemplo. En algunas realizaciones, las temperaturas de incubacion para esta etapa pueden ser de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 99 °C, o de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 70 °C, o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 45 °C, por ejemplo. El periodo de tiempo para la incubacion es de aproximadamente 0,2 segundos a aproximadamente 24 horas, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 6 horas, o de aproximadamente 2 segundos a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 minutos, por ejemplo. La incubacion puede realizarse en un medio que, por comodidad, puede ser un medio de ensayo como se describe en el presente documento, pero no es necesario.

Un ejemplo particular de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento se refiere a un metodo que emplea los siguientes reactivos de ensayo en las porciones primera y segunda de la muestra que se sospecha que contiene el analito: (i) un reactivo de anticuerpo de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento, (ii) un reactivo de particulas quimioluminiscentes que comprende un analogo de analito y (iii) un reactivo de particulas fotosensibilizadoras que comprende un resto de union a molecula pequena o un companero de union para la molecula pequena.

Se puede emplear un inmunoensayo de luminiscencia inducida. El inmunoensayo de luminiscencia inducida se menciona en la Patente de los EE.Uu. N.° 5.340.716 (Ullman). En un enfoque, el ensayo utiliza una particula que tiene asociado un fotosensibilizador en el que un analogo de vitamina D se une a la particula (reactivo analogo de particulas). Para el ensayo de la primera porcion de una muestra que se sospecha que contiene las formas no epi y epi del analito de vitamina D, el reactivo quimioluminiscente comprende un primer anticuerpo que presenta suficiente afinidad de union de ensayo para cada una de las formas no epi y epi del analito de vitamina D. Para el ensayo en la segunda porcion de una muestra, el reactivo quimioluminiscente que comprende el primer anticuerpo se emplea junto con un segundo anticuerpo que se une a la forma no epi del analito de vitamina D pero presenta una afinidad de union de ensayo insuficiente para la forma no epi del analito de vitamina D y sustancialmente sin afinidad de union de ensayo para la forma epi del analito de vitamina D. En el ejemplo anterior, el primer anticuerpo se une a una molecula pequena, que se une a un companero de union para la molecula pequena en una particula quimioluminiscente. Este reactivo quimioluminiscente puede preformarse o formarse in situ. El analito de vitamina D (formas no epi y epi) compite con el reactivo analogo de particulas por la union al anticuerpo de vitamina D de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento. Si el analito de vitamina D esta presente, menor es el numero de moleculas de reactivo de analogo de particulas que se acercan mucho al reactivo quimioluminiscente. Por tanto, habra una disminucion en la senal del ensayo. El fotosensibilizador genera oxigeno singlete y activa el reactivo quimioluminiscente cuando los dos marcadores estan muy cerca. El reactivo quimioluminiscente activado produce posteriormente luz, donde se observa una disminucion de la senal en presencia del analito. La cantidad de luz producida esta relacionada con la cantidad del complejo formado, que a su vez, para el ensayo en la primera porcion de muestra se relaciona con la cantidad de formas no epi y epi del analito de vitamina D presente en la muestra (primer valor de medicion) y para el ensayo en la segunda porcion de muestras se relaciona con la cantidad de la forma epi del analito de vitamina D presente en la muestra (segundo

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valor de medicion). La resta del segundo valor de medicion del primer valor de medicion proporciona la cantidad de la forma no epi del analito de vitamina D en la muestra.

En otro ejemplo particular de un inmunoensayo de luminiscencia inducido que usa vitamina D como ejemplo, a modo de ilustracion y no de limitacion, el ensayo usa una particula que tiene asociado un compuesto quimioluminiscente donde un analogo de vitamina D se une a la particula (reactivo analogo de particulas). Para la primera porcion de muestra, un reactivo fotosensibilizador comprende un primer anticuerpo que presenta suficiente afinidad de union de ensayo para cada una de las formas no epi y epi del analito de vitamina D, que esta unido a una molecula pequena que a su vez esta unida a un companero de union de la molecula pequena en una particula quimioluminiscente. Para la segunda porcion de muestra, se emplean el reactivo fotosensibilizador y un segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo se une a la forma no epi del analito de vitamina D, pero presenta una afinidad de union de ensayo insuficiente para la forma no epi del analito de vitamina D y sustancialmente ninguna afinidad de union de ensayo para la forma epi del analito de vitamina D. Para la primera porcion de muestra, tanto la forma no epi como la forma epi del analito de vitamina D compiten con el reactivo analogo de particulas por la union al primer anticuerpo para vitamina D. Si el analito de vitamina D esta presente, menor es el numero de moleculas de reactivo analogo de particulas que estan muy cerca del reactivo fotosensibilizador. Por tanto, habra una disminucion en la senal del ensayo. Para la segunda porcion de muestra, la forma epi del analito de vitamina D compite con el reactivo analogo de particulas por la union al primer anticuerpo de vitamina D debido a que la forma no epi del analito de vitamina D esta unida por el segundo anticuerpo. Si la forma epi del analito de vitamina D esta presente, menor es el numero de moleculas de reactivo analogo de particulas que se acercan mucho al reactivo fotosensibilizador. Por tanto, habra una disminucion en la senal del ensayo. El fotosensibilizador genera oxigeno singlete y activa el compuesto quimioluminiscente del reactivo analogo de particulas cuando los dos marcadores estan muy cerca. El compuesto quimioluminiscente activado produce posteriormente luz, donde se observa una disminucion de la senal en presencia del analito. La cantidad de luz producida esta relacionada con la cantidad del complejo formado, que a su vez para el ensayo en la primera porcion de muestra se relaciona con la cantidad de formas no epi y epi del analito de vitamina D presente en la muestra (primer valor de medicion) y para el ensayo en la segunda porcion de muestra se relaciona con la cantidad de la forma epi del analito de vitamina D presente en la muestra (segundo valor de medicion). La resta del segundo valor de medicion del primer valor de medicion proporciona la cantidad de la forma no epi del analito de vitamina D en la muestra.

En otro ejemplo particular de un ensayo de luminiscencia inducida que usa vitamina D a modo de ilustracion y no de limitacion, se emplea una particula fotosensibilizadora que esta conjugada con un companero de union para una molecula pequena tal como, por ejemplo, avidina o estreptavidina (que son companeros de union para la biotina). Se emplea un reactivo de anticuerpo de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento que comprende biotina unida a un primer anticuerpo que se une tanto a las formas no epimericas como a las formas epimericas del analito de vitamina D. Se emplea un reactivo quimioluminiscente como parte del sistema de deteccion. El medio de reaccion para la primera porcion de muestra o la segunda porcion de muestra, segun sea el caso, se incuba para permitir que la avidina o estreptavidina de las particulas fotosensibilizadoras se unan a la biotina del reactivo de anticuerpo en virtud de la union entre avidina y biotina, y tambien para permitir la union especifica entre el primer anticuerpo del reactivo de anticuerpo de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento, que ahora esta unido a las particulas fotosensibilizadoras, para unirse al analito de la muestra y al analito que es parte del reactivo quimioluminiscente. Despues, el medio se irradia con luz para excitar el fotosensibilizador, que es capaz en su estado excitado de activar el oxigeno a un estado singlete. Debido a que una menor cantidad del reactivo quimioluminiscente esta ahora muy cerca del fotosensibilizador debido a la presencia del analito, hay menos activacion del reactivo quimioluminiscente por el oxigeno singlete y menos luminiscencia. Despues, el medio se examina para la determinacion de la presencia y/o la cantidad de luminiscencia o luz emitida, estando su presencia relacionada con la presencia y/o cantidad del analito donde se observa una disminucion en la senal en presencia del analito. La cantidad de luz producida esta relacionada con la cantidad del complejo formado, que a su vez para el ensayo en la primera porcion de muestra se relaciona con la cantidad de formas no epi y epi del analito de vitamina D presente en la muestra (primer valor de medicion) y para el ensayo en la segunda porcion de muestras se relaciona con la cantidad de la forma epi del analito de vitamina D presente en la muestra (segundo valor de medicion). La resta del segundo valor de medicion del primer valor de medicion proporciona la cantidad de la forma no epi del analito de vitamina D en la muestra.

Otro ejemplo de un formato de ensayo para la deteccion de vitamina D, a modo de ilustracion y no de limitacion, en una muestra es el formato del ensayo ACMIA. Para el formato de ensayo ACMIA, se emplean particulas de cromo, que estan recubiertas con vitamina D o un analogo de vitamina D (reactivo de particulas de cromo), como primer componente. Un segundo componente es un reactivo de anticuerpo que comprende un anticuerpo para la vitamina D de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento. En el reactivo de anticuerpo, el anticuerpo se une por medio de un grupo de union a una enzima indicadora (por ejemplo, p-galactosidasa) para formar un conjugado de anticuerpo-enzima. El reactivo de anticuerpo se anade a un recipiente de reaccion en una cantidad en exceso, es decir, una cantidad mayor que la necesaria para unir todo el analito de vitamina D que podria estar presente en una muestra. Una primera porcion de una muestra, que se somete previamente a tratamiento con un agente de liberacion, se trata con un primer reactivo de anticuerpo como se ha descrito anteriormente, que comprende un anticuerpo que presenta suficiente afinidad de union de ensayo para cada una de las formas no epi y

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epi del analito de vitamina D; el anticuerpo se une a la vitamina D en la muestra. El conjugado anticuerpo-enzima se mezcla con muestra en el medio para permitir que el analito de vitamina D se una al anticuerpo. A continuacion, se anade el reactivo de particulas de cromo para unir cualquier exceso de conjugado anticuerpo-enzima. Despues, se aplica un iman, que extrae todas las particulas de cromo y el exceso de enzima-anticuerpo de la suspension y el sobrenadante se transfiere a un recipiente de reaccion final. El sustrato de la enzima indicadora se anade al recipiente de reaccion final y la actividad de la enzima se mide espectrofotometricamente como un cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo. La cantidad de esta senal esta relacionada con la cantidad de las formas tanto no epi como epi de la vitamina D en la muestra. Una segunda porcion de una muestra, que se somete previamente a tratamiento con un agente de liberacion, se trata con el primer reactivo de anticuerpo y un segundo anticuerpo como se ha descrito anteriormente, que comprende un segundo anticuerpo, que se une a la forma no epi del analito de vitamina D pero presenta afinidad de union de ensayo insuficiente para la forma no epi del analito de vitamina D y sustancialmente ninguna afinidad de union de ensayo para la forma epi de la vitamina D. El conjugado anticuerpo- enzima se mezcla con muestra en el medio para permitir que el analito de vitamina D se una al anticuerpo. A continuacion, se anade el reactivo de particulas de cromo para unir cualquier exceso de conjugado anticuerpo- enzima. Despues, se aplica un iman, que extrae todas las particulas de cromo y el exceso de enzima-anticuerpo de la suspension, y el sobrenadante se transfiere a un recipiente de reaccion final. El sustrato de la enzima indicadora se anade al recipiente de reaccion final y la actividad de la enzima se mide espectrofotometricamente como un cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo. La cantidad de esta senal esta relacionada con la cantidad de formas no epi y epi de la vitamina D en la muestra.

Otro ejemplo de un ensayo para formas isomericas de vitamina D (a modo de ilustracion y no de limitacion) en una muestra es un inmunoensayo de marcador de ester de acridinio usando particulas paramagneticas como fase solida (inmunoensayo ADVIA). El sistema de deteccion empleado para este ejemplo de un ensayo de vitamina D incluye una molecula pequena de vitamina D (fraccion de captura) como el conjugado de molecula pequena o conjugado de captura, companero de union para las particulas de latex paramagneticas recubiertas de molecula pequena como fase solida (FS) y un anticuerpo marcado con ester de acridinio para la vitamina D (anticuerpo de deteccion) de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento. La molecula pequena puede ser, por ejemplo, biotina o fluoresceina y el companero de union respectivo puede ser estreptavidina o anticuerpo para fluoresceina. La vitamina D puede unirse a la molecula pequena directamente o a traves de un grupo de union tal como, por ejemplo, una proteina, por ejemplo, albumina de suero bovino (BSA). La vitamina D en una muestra de un paciente compite con la vitamina D del resto de captura por la union al anticuerpo anti-vitamina D de deteccion marcado con ester de acridinio. La muestra que se sospecha que contiene vitamina D se somete a un pretratamiento con 1,8-ANS. El ensayo puede realizarse en las porciones de muestra primera y segunda usando anticuerpos respectivos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento y un aparato Centaur®, Centaur® XP o Centaur® CP (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE) de acuerdo con las directrices del fabricante proporcionadas con el mismo.

Otro ejemplo de un ensayo para un analito de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento es un inmunoensayo de marcador de ester de acridinio usando particulas paramagneticas como fase solida (inmunoensayo ADVlA). El sistema de deteccion empleado para este ejemplo de un ensayo para analitos isomericos incluye reactivos de anticuerpos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento, en el que una molecula pequena esta unida al anticuerpo por el analito (anticuerpo de captura) como el conjugado de captura, particulas de latex paramagneticas como fase solida (FS) recubierta con un companero de union para la molecula pequena del reactivo de anticuerpo y un analogo de analito marcado con ester de acridinio (hapteno de deteccion). El marcador de ester de acridinio puede unirse directamente al analito para formar el hapteno de deteccion o puede emplearse un grupo de enlace incluyendo, por ejemplo, una proteina tal como, por ejemplo, BSA. El analito de una muestra compite con el hapteno de deteccion marcado con ester de acridinio para unirse con el anticuerpo anti- analito. La muestra que se sospecha que contiene el analito puede someterse a un pretratamiento con uno o mas de un agente de liberacion y un agente de digestion. El ensayo puede realizarse en las porciones primera y segunda de muestra usando un aparato Centaur®, Centaur® XP o Centaur® CP (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante suministradas con el mismo. En variaciones de los ensayos de ester de acridinio anteriores, la molecula pequena puede ser, por ejemplo, biotina o fluoresceina y los companeros de union para la molecula pequena pueden ser, por ejemplo, avidina o estreptavidina o anticuerpo para fluoresceina, respectivamente.

La concentracion de los analitos isomericos en una muestra que puede someterse a ensayo en general varia de aproximadamente 10'5 a aproximadamente 10'17 M, o de aproximadamente 10'6 a aproximadamente 10'14 M, por ejemplo. Consideraciones tales como si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo (relativo a la cantidad del analito presente en la muestra), la tecnica de deteccion particular y la concentracion esperada del analito normalmente determinan las concentraciones de los diversos reactivos.

Las concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo generalmente se determinaran por el intervalo de concentracion de interes del analito, la naturaleza del ensayo y similares. Sin embargo, la concentracion final de cada uno de los reactivos normalmente se determina empiricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo en el intervalo de interes. Es decir, una variacion en la concentracion de analito que sea significativa deberia proporcionar

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una diferencia de senal medible con precision. Consideraciones tales como la naturaleza del sistema de produccion de senales y la naturaleza de los analitos normalmente determinan las concentraciones de los diversos reactivos.

Como se ha mencionado anteriormente, la muestra y los reactivos se proporcionan combinados en el medio. Aunque el orden de la adicion al medio puede variar, habra ciertas preferencias para algunas realizaciones de los formatos de ensayo que se describen en el presente documento. El orden de adicion mas simple, por supuesto, es anadir todos los materiales simultaneamente y determinar el efecto que el medio de ensayo tiene sobre la senal como en un ensayo homogeneo. Como alternativa, cada uno de los reactivos o grupos de reactivos, puede combinarse secuencialmente. En algunas realizaciones, puede incluirse una etapa de incubacion despues de cada adicion como se ha analizado anteriormente. En ensayos heterogeneos, tambien pueden emplearse etapas de lavado despues de una o mas etapas de incubacion.

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento se refieren a metodos de determinacion de una o ambas de entre la presencia y la cantidad de una o ambas formas isomericas de vitamina D en una muestra que se sospecha que contiene vitamina D y puede denominarse en el presente documento como "ensayos de vitamina D". Como se usa en el presente documento con referencia a los ensayos, la expresion "vitamina D" se refiere a una o mas de las formas no epi y epi de uno o mas de 25-hidroxicolecalciferol (tambien denominado calcidiol, calcifediol, 25-hidroxicolecalciferol o 25-hidroxivitamina D (abreviado 25(OH)D); calcidiol; 1,25- dihidroxivitamina D3 (calcitriol; 1,25(OH)2D3); 1,25-dihidroxivitamina D4; 1,25-dihidroxivitamina D5 y 1,25- dihidroxivitamina Da, incluyendo los metabolitos de todos los anteriores.

Etapa de exploration

En una etapa de un metodo de ensayo, el medio se examina para determinar la presencia de un complejo que comprende una o mas formas isomericas del analito y el anticuerpo para un analito de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento. La presencia y/o cantidad de uno o los dos complejos indica la presencia y/o cantidad de una o mas de las formas isomericas del analito en la muestra.

La frase "medicion de la cantidad de analito" se refiere a la determinacion cuantitativa, semicuantitativa y cualitativa de uno o mas de las formas isomericas de un analito. Los metodos que son cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, asi como todos los demas metodos para la determinacion del analito, se consideran metodos de medicion de la cantidad del analito. Por ejemplo, un metodo, que simplemente detecta la presencia o ausencia del analito en una muestra que se sospecha que contiene el analito, se considera incluido dentro del alcance de la presente invention. Los terminos "detectar" y "determinar", asi como otros sinonimos comunes para la medicion, se contemplan dentro del alcance de la presente invencion.

En muchas realizaciones, el examen del medio implica la detection de una senal del medio. La presencia y/o cantidad de la senal se relaciona con la presencia y/o la cantidad de una o mas de las formas isomericas de un analito en la muestra. El modo particular de deteccion depende de la naturaleza del sistema de produccion de senales. Como se ha analizado anteriormente, existen numerosos metodos mediante los cuales un marcador de un sistema productor de senales puede producir una senal detectable por medios externos. La activation de un sistema de produccion de senales depende de la naturaleza de los miembros del sistema de produccion de senales.

Las temperaturas durante las mediciones varian en general entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 70 °C o entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 45 °C, o entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 25 °C, por ejemplo. En un enfoque, las curvas patron se forman usando concentraciones conocidas de analito de vitamina D. Tambien pueden usarse calibradores y otros controles.

La luminiscencia o luz producida a partir de cualquier marcador puede medirse visualmente, fotograficamente, actinometricamente, espectrofotometricamente, tal como mediante el uso de un fotomultiplicador o un fotodiodo, o mediante cualquier otro medio conveniente para la determinacion de la cantidad de la misma, que se relaciona con la cantidad de analito en el medio. El examen de la presencia y/o cantidad de la senal tambien incluye la deteccion de la senal, que generalmente es simplemente una etapa en el que se lee la senal. La senal se lee normalmente usando un instrumento, cuya naturaleza depende de la naturaleza de la senal. El instrumento puede ser, pero no se limita a, un espectrofotometro, un fluorometro, un espectrometro de absorcion, un luminometro y un quimioluminometro, por ejemplo.

Kits que comprenden reactivos para realizar ensayos

Pueden prepararse kits para realizar ensayos en porciones de una muestra que se sospecha que contiene formas isomericas de un analito. Los kits comprenden reactivos de anticuerpos para ensayos que se han de realizar en porciones respectivas de la muestra. En consecuencia, un reactivo de anticuerpo comprende un anticuerpo que presenta una afinidad de union de ensayo suficiente para cada uno de entre un primer analito isomerico y un segundo analito isomerico. Se incluye un segundo anticuerpo que se une al primer analito isomerico, pero presenta

una afinidad de union de ensayo insuficiente para el primer analito isomerico y sustancialmente ninguna afinidad de union de ensayo para el segundo analito isomerico. El kit puede incluir adicionalmente otros reactivos para realizar el ensayo, cuya naturaleza depende del formato de ensayo particular.

Los reactivos pueden estar cada uno en recipientes separados o pueden combinarse diversos reactivos en uno o 5 mas recipientes dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos. El kit puede incluir adicionalmente otros reactivos empaquetados por separado para realizar un ensayo tal como miembros de pares de union especificos adicionales, miembros del sistema de produccion de senales y reactivos auxiliares, por ejemplo.

Las cantidades relativas de los diversos reactivos en los kits pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones de los reactivos que optimicen sustancialmente las reacciones que es necesario que se produzcan 10 durante los presentes metodos y adicionalmente para optimizar sustancialmente la sensibilidad de un ensayo. En circunstancias apropiadas, uno o mas de los reactivos en el kit pueden proporcionarse en forma de un polvo seco, por lo general liofilizado, incluyendo excipientes, que al disolverse proporcionaran una solucion de reactivo que tenga las concentraciones apropiadas para realizar un metodo o ensayo usando un reactivo compuesto de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento. El kit puede incluir adicionalmente una description 15 escrita de un metodo que utiliza reactivos que incluyen un reactivo compuesto de acuerdo con los principios que se describen en el presente documento.

La designation "primero" y "segundo" como se usa en el presente documento es completamente arbitraria y no tiene por objeto sugerir ningun orden o clasificacion entre los restos referidos ni ningun orden de adicion de restos en los presentes metodos.

20 La frase "al menos" como se usa en el presente documento significa que el numero de elementos especificados puede ser igual o mayor que el numero indicado. La frase "aproximadamente", como se usa en el presente documento, significa que el numero enumerado puede diferir en mas o menos el 10 %; por ejemplo, "aproximadamente 5" significa un intervalo de 4,5 a 5,5.

Ejemplos

25 A menos que se indique lo contrario, los materiales en los experimentos a continuation pueden adquirirse en Sigma- Aldrich Chemical Corporation (San Luis, MO) o Fluka Chemical Corporation (Milwaukee, WI). Las partes y los porcentajes desvelados en el presente documento son en peso a volumen a menos que se indique lo contrario.

Definiciones:

mg = miligramo

30 g = gramo o gramos

ng = nanogramo o nanogramos ml = mililitro o mililitros |jl = microlitro o microlitros |jmol = micromolar 35 °C = grados centigrados

min = minuto o minutos s = segundo o segundos h = hora u horas p/v = peso en volumen 40 v/v = volumen en volumen

CCF = cromatografia en capa fina HPLC = cromatografia Kquida de alta resolution EDTA = etilendiaminotetraacetato PEG = polietilenglicol 45 EtOAc = acetato de etilo

DMF = dimetilformamida DMSO = dimetilsulfoxido MeOP = 1-metoxi-2-propanol MES = acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico 50 DI = destilada

UPA = Ultra analizador de particulas

LOCI = inmunoensayo de canalization de oxigeno luminiscente Ab = anticuerpo

Preparacion de un primer anticuerpo biotinilado que presenta afinidad de union de ensayo suficiente para la vitamina D no epi y la vitamina D epi

Una solucion (0,8 ml a 2,63 mg/ml) de anticuerpo 5H10 de vitamina D (monoclonal de oveja de Bioventix, Farnham, Surrey, Reino Unido) en PO4 10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,0 se mezclo con 43,2 |jl de una solucion acuosa 5 (2,0 mg/ml) de NHS-dPEG®4-biotina (Quanta Biodesign Ltd., Powell OH, numero de pieza 10200). La cantidad de

reactivo de biotinilacion anadido representa una exposicion molar de 10 veces del agente de biotinilacion con el anticuerpo. La mezcla de reaccion se incubo a temperatura ambiente durante 3 horas y despues la reaccion se inactivo mediante la adicion de 80 jl de TRIS 0,5 M. La mezcla de reaccion se sometio a intercambio de tampon con PO4 10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,0 en un dispositivo AMICON® (YM10) hasta que la absorcion a 260 nm del efluente 10 fue de < 0,03. La solucion de anticuerpo (1,04 ml a 2,1 mg/ml de proteina) se mezclo con 10 jl de PROCLIN® 300 y

10 jl de una solucion acuosa de sulfato de neomicina (10 mg/ml), se filtro usando un filtro de jeringa ACRODISC® de 0,2 um (Pall Corporation) y se almaceno a 2-8 °C.

Preparacion de perlas de EPRM-EDA

Se anaden perlas de EPRM (2000 mg, 20,0 ml) a un vial de 40 ml. Las perlas de EPRM se preparan mediante un 15 procedimiento similar al descrito en la Patente de los EE.UU. N.° 7.179.660 y el compuesto quimioluminiscente es 2-

(4-(N,N,di-tetradecil)-anilino-3-fenil tioxeno con quelato de europio. Se combina EDA (800 mg, 890 jl) con 10 ml de tampon MES pH 6 (el "Tampon") y aproximadamente 4,2 ml de HCl 6 N. El pH de la mezcla es o se ajusta a, aproximadamente 6,9. La solucion de EDA se anade a las perlas de EPRM con formation de vortice y la mezcla se balancea a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se combina cianoborohidruro de sodio (400 mg) en un vial de 20 15 ml con 10 ml de agua DI y la combination se anade a la mezcla de perlas desde arriba. La mezcla se agita a

37 °C durante 18-20 horas. Las perlas se transfieren a seis tubos de centrifuga de 40 ml. Se anade tampon MES para llevar el volumen a 35 ml y la mezcla se centrifuga a 19.000 rpm durante 30 min. El sobrenadante se decanta y las perlas se resuspenden en 2 ml de tampon con una varilla de agitation y se anade tampon adicional a 35 ml. La mezcla somete a ultrasonidos con 18 vatios de potencia durante 30 segundos, usando hielo para mantener la 25 mezcla fria. La etapa de lavado/ultrasonidos se realiza 4 veces para retirar todo el producto quimico de activation. Despues de la ultima centrifugation del tampon MES, se anaden 2 ml de tampon que contiene MeOP al 5 % y Tween® 20 al 0,1 % (el "segundo tampon") a los tubos para la etapa de resuspension. Se anade un segundo tampon adicional a 35 ml antes del tratamiento con ultrasonidos. La suspension de perlas se centrifuga a 19.000 rpm durante 30 min. El sobrenadante se descarta. El tratamiento con ultrasonidos final uso 12 ml del segundo tampon en 30 cada tubo para proporcionar una dilution 25 mg/ml. El tamano de particula es 277 nm como se determina en un

instrumento UPA.

La chemibead (perla quimica) de EPRM se prepara de una manera similar al metodo descrito en la Patente de los EE.UU. N.° 6.153.442 y la Publication de Solicitud de Patente de los EE.UU. N.° 20050118727A, cuyas divulgaciones relevantes se incorporan en el presente documento por referencia. La chemibead de EPRM 35 comprende una capa interna de aminodextrano y una capa externa de aldehido de dextrano que tiene

funcionalidades aldehido libres. Veanse, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N.° 5.929.049, 7.179.660 y 7.172.906, cuyas divulgaciones relevantes se incorporan en el presente documento por referencia. La reaccion se realiza a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 40 °C durante un periodo de aproximadamente 16 a aproximadamente 64 horas a un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0 o de 40 aproximadamente 6, en un medio acuoso tamponado que emplea un tampon adecuado tal como como, por ejemplo,

MES. La reaccion se interrumpe mediante la adicion de un agente de enfriamiento adecuado tal como, por ejemplo, hemiclorhidrato de carboximetilaminoamina (CMO) y el posterior lavado de las particulas.

Los grupos aldehido en la capa externa de aldehido de dextrano se hacen reaccionar con etilendiamina en condiciones de aminacion reductora para formar el reactivo EPRM-EDA que tiene restos colgantes que comprenden 45 una cadena de etileno y un grupo amino terminal. Las condiciones de aminacion reductora incluyen el uso de un agente reductor tal como, por ejemplo, un hidruro metalico. La reaccion se realiza en un medio acuoso a una temperatura durante la reaccion de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 100 °C durante un periodo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas.

Sintesis de 3-carbamato de 25-OH Vitamina D3 (3-carbamato de 25-OH Vitamina D2)

50 Una mezcla de 22 mg (55 jmol) de 25-OH VD3 adquirida de ChemReagents.com, Sugarland TX, 100 mg (420 jmol) de carbonato de disuccinimidilo (DSC), 100 jl de trietilamina en 1 ml de acetonitrilo anhidro en un matraz de 5 ml (cubierto con papel de aluminio) se agito a temperatura ambiente durante 18 h en atmosfera de nitrogeno para preparar 25-OH VD3 activada. La CCF (EtOAc:Hexano = 2:1) mostro que no quedaba material de partida. Se preparo una suspension mediante la adicion de 150 mg de hemiclorhidrato de carboximetoxilamina (CMO), 0,3 ml de 55 trietilamina y 1 ml de DMF a un matraz de 10 ml. Se anadio una solucion que contenia 25-OH VD3 activada gota a gota a la suspension de OCM con agitacion, que continuo durante otras 18 h. Se aplico vacio para retirar los solventes tanto como sea posible (la temperatura del bano de calentamiento no debe superar los 50 °C). Se anadio EtOAc (25 ml) al resto, que se lavo tres veces con 2 ml de salmuera. La fase organica se seco con Na2SO4 anhidro y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

se filtro; el disolvente se retiro usando rotavapor. Se obtuvo producto en bruto (42 mg) despues del secado y se purifico mediante HPLC. Se obtuvo producto puro (24 mg) despues de que se secara a alto vado. El producto se disolvio en 1,2 ml de DMSO anhidro. Se transfirieron alicuotas a viales, que se mantuvieron a -70 °C.

Acoplamiento de EPRM-EDA y 3-carbamato de 25-OH vitamina D3 para proporcionar el reactivo chemibead

Se anadio 3-carbamato de 25-OH vitamina D3 (10 jl de alicuota en DMSO preparada como se ha descrito anteriormente) (0,2 mg) a un vial de 2 ml. Se anadieron EDAC (6,8 mg) y SNHS (9,4 mg) mas 2,27 ml de DMSO seco (3 mg/ml) a un vial de 5 ml. La solucion de EDAC/SNS (190 |jl) se combino con el contenido del vial de 2 ml anterior (1 mg/ml) para preparar 3-carbamato de 25-OH vitamina D3 activo. La mezcla se dejo rotar a temperatura ambiente durante 18 horas. Una alicuota de 0,4 ml de una solucion de tensioactivo GAFAC® al 16 % (GAF Corporation, Wayne NJ) (0,15 %) se diluyo al 1,6 % con 3,6 ml de agua DI.

Se combinaron vitamina D3 (8,5 mg) y 850 jl de DMSO (10 mg/ml). A un matraz de fondo redondo de 10 ml (etiquetado como 3323-064B) equipado con una varilla de agitacion se le anadieron 2,0 ml (200 mg) de EPRM-EDA seguido de 400 jl (4 mg) de la solucion de vitamina D3 desde arriba. La mezcla se agito durante la noche a temperatura ambiente.

A un matraz de fondo redondo de 10 ml equipado con una barra de agitacion se le anadieron 2,0 ml (200 mg) de EPRM-EDA (preparado como se ha descrito anteriormente) seguido de 260 jl de solucion de tensioactivo GAFAC® al 1,6 % (0,15 %) con agitacion moderada. A un tubo de ensayo pequeno se le anadieron 504 jl de DMSO anhidro, seguido de 60 jl (0,06 mg) de 3-carbamato de vitamina D3 activado preparado como se ha descrito anteriormente; y la mezcla se anadio a la mezcla de perlas EPRM-EDA. El contenido total de DMSO de la suspension de perlas fue del 20 %. El recipiente de reaccion se dejo en agitacion durante la noche a temperatura ambiente. Despues, las perlas se lavaron por medio de diafiltracion.

Se llevo cada lote de perlas hasta un volumen de trabajo de 20 ml con MeOP al 10 %/GAFAC® al 1 %/tampon MES pH6. La mezcla se diafiltro con 5 volumenes del tampon y despues se sometio a tratamiento con ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos de sonda a 18-21 vatios usando hielo para mantener la mezcla fria. La diafiltracion/tratamiento con ultrasonidos continuo a traves de 50 volumenes con muestras de efluente tomadas a 35, 40, 45 y 50 volumenes. El tampon se cambio a Tampon de Lavado de Hapteno LOCI (HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, sulfato de neomicina al 0,01 %, TRITON® 405X al 0,1 % y PROCLIN® 300 al 0,15 %, pH 7,2) usandose 10 volumenes. La mezcla se redujo a aproximadamente 7 ml y se realizo una UPA. Los tamanos de particula fueron de 3323-064A = 289 nm y 3323-064B = 298 nm. Se determinaron los porcentajes de solidos y se llevo el lote de perlas hasta 10 mg/ml con Tampon de Lavado de Hapteno LOCI pH 7,2. El rendimiento fue de 160,4 mg.

Ensayo para no epi-Vitamina D y epi-vitamina D

Los ensayos se realizaron en un analizador DIMENSION® VISTA® (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield, IL) siguiendo el protocolo para un ensayo LOCI y usando soluciones de calibrador que contenian cantidades variables de no epi-25-hidroxivitamina D3 y/o 3-epi-25-hidroxivitamina D3. En este ejemplo, el ensayo usa, como reactivo quimioluminiscente, el reactivo chemibead preparado como se ha descrito anteriormente. Las porciones de muestra se hacen reaccionar con (i) el primer reactivo de anticuerpo biotinilado (primera porcion de muestra) preparado como se ha descrito anteriormente o (ii) el primer anticuerpo biotinilado y un segundo anticuerpo (segunda porcion de muestra) y despues con el reactivo chemibead. Para la segunda porcion de muestra, el segundo anticuerpo es una solucion (0,8 ml a 2,63 mg/ml) de anticuerpo 10H9 de vitamina D (monoclonal de raton descubierto en el ensayo de vitamina D CENTAUR®, Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE); el segundo anticuerpo estaba presente en una cantidad en exceso (75 jg/ml o 100 veces la del anticuerpo 5H10). Las chemibeads se unen a la fraccion de los sitios de union del anticuerpo monoclonal que no estan ocupados por el analito de la muestra. Posteriormente, se anaden perlas sensibilizantes acopladas a estreptavidina a la mezcla de reaccion. Esto conduce a la formacion de pares chemibead/sensibead cuya concentracion esta inversamente relacionada con una concentracion de ambas formas de la vitamina D (primera porcion de muestra) o la forma epi de la vitamina D (segunda porcion de muestra). Tras la iluminacion a 680 nm, las perlas sensibilizadoras generan oxigeno singlete que difunde en las chemibeads que estan apareadas con sensibeads, reaccionan con el colorante olefinico y desencadena una senal quimioluminiscente a aproximadamente 612 nm que esta inversamente relacionada con la concentracion del analito.

La perla sensibilizadora a estreptavidina ("sensibead o sensibeads") se prepara usando un metodo analogo al descrito en las Patentes de los EE.UU. N.° 6.153.442, 7.022.529, 7.229.842 y la publication de Solicitud de Patente de los EE.UU. N.° 20050118727A. El fotosensibilizador era bis-(trihexil)-silicon-t-butil-ftalocianina. La concentracion del reactivo sensibead era de 200 jg/ml en tampon HEPES, pH 8,0 que contiene NaCl 150 mM. El reactivo de particula de EPRM-EDA-25-OH Vitamina D3 preparado como se ha descrito anteriormente se empleo como el "reactivo chemibead" a una concentracion de 200 jg/ml en tampon HEPES, pH 7,2, que contenia NaCl 150 mM y detergente al 0,1 %.

Para una porcion de muestra respectiva, en el instante t = cero segundos, se anadieron 20 jl de reactivo de anticuerpo biotinilado y 20 |jl de agua a un recipiente de reaccion. Se anadio una muestra de 12 |jl 21,6 segundos mas tarde, seguida de 8 jl de agua. A t = 414,0 segundos, se le anadieron 40 jl de reactivo chemibead seguido de 20 ml de agua. Despues, el reactivo sensibead se dispenso a 457,2 segundos. Las mediciones se tomaron 601,2 5 segundos despues del inicio de la secuencia de reaccion. Se obtuvieron un primer valor de medicion que representaba una cantidad de las formas tanto epi como no epi de vitamina D y un segundo valor de medicion que representaba una cantidad de solamente la forma epi de vitamina D.

Usando el formato de ensayo anterior, los ensayos se realizaron en muestras de suero con adiciones de cantidades variables de no-epi-25-hidroxivitamina D3 (no epi-VD) pero no de 3-epi-25-hidroxivitamina D3 (3-epi-VD). Este 10 conjunto de ensayos se realizo para calibrar el instrumento y las muestras que contenian o no el segundo anticuerpo 10H9. Los resultados se resumen en la Tabla 1 a continuacion y se representan en un grafico representado en la Fig. 3.

Tabla 1

Ab 10H9 ausente no-epi-VD (ng/ml) Ab 10H9 presente no-epi-VD (ng/ml)

0,0

0,0

9,2

7,5

19,6

10,8

71,6

19,7

167

29,1

Los resultados muestran que el ensayo todavia detecta algo de no-epi-VD incluso con una cantidad en exceso del 15 segundo anticuerpo 10H9 presente. Por tanto, los resultados obtenidos en otros ensayos que emplean el segundo anticuerpo 10H9 en este sistema de instrumentos tendran que ajustarse para tener en cuenta los resultados de esta calibracion.

Usando el formato de ensayo anterior, los ensayos se realizaron en muestras de suero con adiciones de cantidades variables de no-epi-VD y con 3-epi-VD. Los ensayos se realizaron tanto con (+10H9) como sin (-10H9) el segundo 20 anticuerpo 10H9. Los valores "Previsto 1" y "Previsto 2" se obtienen con referencia a los graficos en las Figs. 2 y 3. Los valores son en ng/ml; Dif = diferencia entre el valor de +10H9 y el valor de Previsto 1. "Cantidad anadida" es la cantidad de 3-epi-VD que se anadio en las muestras. Los resultados se resumen en la Tabla 2 a continuacion.

-10H9

+ 10H9 Previsto 1 Dif Tabla 2 3-epi-VD presente Previsto 2 Cantidad anadida

53

48,5 18 30,6 Si 170 167

25,2

24,1 12 12,1 Si 67 70

15,3

14,5 9 5,7 Si 32 30

10,8

10,6 7 7 Si 20 10

9,2

7,5 6 1,2 No 0 0

19,6

10,8 10 0,5 No 0 0

71,6

19,7 21 -0,9 No 0 0

Usando los datos anteriores en la Tabla 2, se calcula una cantidad corregida de 3-epi-VD de la siguiente manera; la 25 cantidad pronosticada de epimero 3 se enumera en las columnas segunda a columna. Las explicaciones para cada columna de la Tabla 2 anterior son las siguientes:

Columna 1: -10H9 es 25(OH)D en ng/ml medido en ausencia de Ab 10H9. Esto representa la cantidad total de 25(OH)D ng/ml (D2 + D3 +3epi * reactividad cruzada)

Columna 2: +10H9 es 25(OH)D e n ng/ml medido en presencia de Ab 10H9. Esto representa la cantidad total 30 suprimida de 25(OH)D ng/ml (parcial D2 + parcial D3 + 3epi * reactividad cruzada)

Columna 3: Previsto 1 es la cantidad de 25(OH)D ng/ml en presencia de 10H9 si no hubiera epimero 3 presente en la muestra (parcial D2 + parcial D3)

Columna 4: Dif es la columna 2 menos la columna 3 = 3epi * reactividad cruzada

Columna 5: Previsto 2 es la columna 4 dividida por la reactividad cruzada o (3epi * reactividad 35 cruzada)/reactividad cruzada = 3epi ng/ml)

Columna 6: La cantidad anadida es la cantidad de epimero 3 que se anade a la muestra. Esta columna debe compararse con la columna 5 para mostrar que tan cerca estan los resultados en la columna 5 y la columna 6.

Los resultados se resumen en la Tabla 3. Corregida significa 25(OH)D ng/ml calculada despues de restar el epimero 3 medido ng/ml de la 25(OH)D ng/ml total medida en ausencia de Ab 10H9. CXR significa reactividad cruzada del 40 epimero 3 del ensayo de recipiente de reaccion 2 despues de eliminar la interferencia del epimero 3. Esto no es lo

mismo que la reactividad cruzada mencionada anteriormente. La reactividad cruzada en la Tabla 2 es la reactividad cruzada del Ab 5H10 con el epimero 3. La reactividad cruzada en la Tabla 3 es la reactividad cruzada del ensayo despues de restar la concentracion del epimero 3 de la concentracion final de 25(OH)D ng/ml.

Tabla 3

-10H9

+ 10H9 Cantidad anadida Dif 3-epi-VD presente Corregido CRX de 3-epi-VD

53

48,5 167 30,6 Si 14 3 %

25,2

24,1 70 12,1 Si 10 2 %

15,3

14,5 30 5,7 Si 10 3 %

10,8

10,6 10 7 Si 9 2 %

9,2

7,5 0 1,2 No 0 0

19,6

10,8 0 0,5 No 0 0

71,6

19,7 0 -0,9 No 0 0

5 En la Tabla 3, las columnas 1, 2, 3, 4 y 5 corresponden a las columnas 1, 2, 7, 4 y 5 en la Tabla 2, respectivamente. La columna 6 se corrigio, que es 25(OH)D ng/ml sin epimero 3. Basicamente, se representaron valores de 25(OH)D ng/ml para los calibradores L2-L5 frente a las diferencias en ng/ml entre los valores de 25(OH)D en presencia y ausencia del anticuerpo 10H9. Los coeficientes generados a partir de este grafico se usaron para predecir valores de no epimero 3 de 25(OH)D por las diferencias. Esto se debe a que la diferencia es la senal suprimida que representa 10 la senal del no epimero 3, puesto que el anticuerpo 10H9 solo se une a los no epimeros.

A menos que se indique lo contrario, los materiales en los experimentos anteriores pueden adquirirse en Sigma- Aldrich Chemical Corporation (San Luis, MO) o Fluka Chemical Corporation (Milwaukee, WI). Las partes y los porcentajes desvelados en el presente documento son en peso en volumen a menos que se indique lo contrario.

Claims (7)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de determinacion en una muestra de una cantidad de un primer analito isomerico y un segundo analito isomerico, comprendiendo el metodo:

   (a) medir una cantidad total del primer analito isomerico y el segundo analito isomerico mediante la realizacion de un ensayo en una porcion de la muestra usando un primer anticuerpo que tiene una afinidad de union para cada uno de entre el primer analito isomerico y el segundo analito isomerico de al menos 107 litros/mol para obtener un primer valor de medicion;

   (b) medir una cantidad del segundo analito isomerico mediante la realizacion del ensayo en una porcion de la muestra usando el primer anticuerpo para obtener un segundo valor de medicion, en el que un segundo anticuerpo que tiene una afinidad de union para el primer analito isomerico de 106 a 108 litros/mol y una afinidad de union para el segundo analito isomerico de menos de 104 litros/mol se emplea en exceso para bloquear la union del primer analito isomerico al primer anticuerpo; e

   (c) igualar el segundo valor de medicion a una cantidad del segundo analito isomerico en la muestra y restar el segundo valor de medicion del primer valor de medicion para obtener un valor resultante e igualar el valor resultante a una cantidad del primer analito isomerico en la muestra,

   en el que los dos analitos isomericos son 25-hidroxivitamina D3 y 3-epi 25-hidroxivitamina D3.
2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el ensayo es un ensayo homogeneo competitivo, un ensayo heterogeneo competitivo, un ensayo homogeneo no competitivo o un ensayo heterogeneo no competitivo.
3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el ensayo emplea reactivos que comprenden un analogo del analito en el que el analogo comprende un marcador.
4. 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el ensayo emplea reactivos que comprenden una particula.
5. 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el ensayo emplea reactivos que comprenden un reactivo fotosensibilizador y una particula quimioluminiscente.
6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5 en el que el reactivo fotosensibilizador comprende una particula.
7. 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el ensayo es un inmunoensayo de canalizacion de oxigeno luminiscente.