ES2877562T3 - Composiciones relacionadas con la vitamina D - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula: (R1)p- (L)q-Z en la que **(Ver fórmula)** o H, en la que al menos un R1 no sea H, Y es O, S o NR4, X es -O-(CH2)n-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-(CH2)x-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-NH(CH2)y-C(O)-, o -NR3-C(O)-, R2 es independientemente H o alquilo, R3, R4, R5 y R6 son independientemente H o alquilo, o R4 y R5 se pueden tomar juntos para formar un enlace, o R5 y R6 se pueden tomar juntos para formar un enlace, o R y R5 se pueden tomar juntos para formar un enlace, R11 es H, alquilo o acilo, n es un número entero desde 0 a 10, w es un número entero desde 1 a 10, x es un número entero desde 1 a 10, y es un número entero desde 1 a 10, p es un número entero desde 1 a 10, L es un grupo de unión, q es 0 o 1, y Z es OR8 en el que R8 es H, alquilo o NR9R10 en el que R9 y R10 son independientemente H o alquilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones relacionadas con la vitamina D

Antecedentes

Esta invención se refiere a composiciones, métodos y kits para determinar la presencia y/o cantidad de analitos de vitamina D, incluidos los isómeros de vitamina D, y metabolitos de los mismos en una muestra que se sospecha que los contiene.

El artículo de D. Bailey et al.,"Analytical measurement and clinical relevance of vitamin D3 C3-epimer", in: CLINICAL BIOCHEMISTRY 46 [2013] p. 190-196 enseña la detección de la forma epimérica en poblaciones infantiles, pediátricas y adultas. El artículo de J. van den Ouweland et al.: "C3-epimer cross-reactivity of automated 25-hydroxyvitamin D immunoassay", in: NED. TIJDSCHR. KLIN. CHEM. LABGENEESK 38 [2013] p. 136-138 proporciona un método de determinación de los compuestos de dihidroxi vitamina D. Más específicamente, se investigó la reactividad cruzada de 3-epi-25-hidroxi-vitamina D3 en inmunoensayos que es causada por la adición exógena de 3-epi-25-hidroxi-vitamina D3 pero también por el uso de muestras de recién nacidos humanos con concentraciones significativas de epímero C3 endógeno. Se usaron muestras neonatales para la medición mediante un ensayo de CPB y un método LC-MS/MS que separa la 25-hidroxi-vitamina D3 y la 3-epi-25-hidroxi-vitamina D3 en el artículo de J. van den Ouweland et.al "Evaluation of 3-epi-25-hydroxyvitamin D3 cross-reactivity in the Roche Elecsys Vitamin D Total protein binding assay", en: Clinical chemistry and Laboratory medicine 52 [2014] p. 373 - 380.

El artículo JINGE ZHU et.al "Screening of the selective inhibitors of 1 alfa, 25-dihydroxyvitamin D324 hydrolase using recombinant human enzyme expressed in escherichia coli", en: BIOCHEMISTRY 49 [2010] p. 10403-10411, analiza variantes de proteínas CYP24A1 humanas que se sobreexpresaron en E. coli y se purificaron hasta una aparente homogeneidad. La actividad hidroxilasa se reconstituyó in vitro y se aplicó el sistema de ensayo sin células en el cribado de análogos de vitamina D para la inhibición de CYP24A1.

El término "vitamina D" se refiere a un grupo de secosteroides solubles en grasa. En los seres humanos, la vitamina D es única porque se puede ingerir como colecalciferol (vitamina D3) o ergocalciferol (vitamina D2) y porque el cuerpo también puede sintetizarla (a partir del colesterol) cuando la exposición al sol es adecuada. Debido a esta última propiedad, algunos consideran que la vitamina D es una vitamina dietética no esencial, aunque la mayoría la considera un nutriente esencial. La vitamina D tiene un papel fisiológico importante en la regulación positiva de la homeostasis del ion calcio. La vitamina D3 es la forma de vitamina sintetizada por los animales. También es un suplemento común que se agrega a los productos lácteos y ciertos productos alimenticios como es la vitamina D2.

Tanto la vitamina D3 dietética como la sintetizada intrínsecamente deben experimentar una activación metabólica para generar metabolitos bioactivos. En los seres humanos, la etapa inicial de la activación de la vitamina D3 ocurre principalmente en el hígado e implica la hidroxilación para formar el metabolito intermedio 25-hidroxicolecalciferol. El calcidiol es la forma principal de vitamina D3 en el sistema circulatorio. La vitamina D2 también experimenta una activación metabólica similar a la 25-hidroxivitamina D2. En conjunto, estos compuestos se denominan 25-hidroxivitamina D (abreviado 25(OH)D) y son los principales metabolitos que se miden en el suero para determinar el estado de la vitamina D; la 25(OH)D y sus epímeros son prehormonas que deben convertirse en 1,25(OH)D para ejercer funciones biológicas. La comparación de la bioactividad de 1,25(OH)D frente a la de 3-epi-1,25(OH)D es compleja.

Los compuestos de vitamina D 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2 son epiméricos en la posición 3 con los epímeros designados como 25-hidroxivitamina D3 y 3-epi-25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2 y 3-epi-25-hidroxivitamina D2, respectivamente. Sólo uno de los epímeros de cada uno de estos compuestos epiméricos, a saber, 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2, respectivamente, son activos. Las estructuras de los epímeros de 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2 se muestran en la figura 1.

Muchos compuestos de moléculas pequeñas o haptenos tales como, por ejemplo, fármacos y vitaminas, existen en formas isoméricas, de las cuales sólo una forma es activa. Para obtener una medición precisa de la forma activa de un analito, se debe abordar la presencia del isómero no activo del analito. Las mediciones de ambas formas isoméricas de un analito, es decir, formas activas y no activas, pueden conducir a inexactitudes que pueden ser perjudiciales para un individuo dependiendo de la función de la forma activa del analito. Es importante evaluar con precisión el nivel de cada uno de un par de analitos isoméricos en muestras biológicas, especialmente cuando solo uno de los isómeros está activo y las mediciones que incluyen la cantidad del isómero no activo distorsionan el nivel del analito en una muestra. Por ejemplo, medir los niveles de vitamina D en muestras biológicas es importante ya que la deficiencia de vitamina D está relacionada con un número de trastornos en los mamíferos. En los bebés, por ejemplo, las mediciones de vitamina D que incluyen cantidades de isómeros 3-epi pueden conducir a una evaluación inexacta de los niveles de vitamina D en el bebé, lo que a su vez puede conducir a una falta de suplementación adecuada. Es importante medir la forma activa de vitamina D para que un bebé pueda recibir la terapia adecuada de vitamina D, si es necesario.

La evaluación de los niveles de vitamina D en muestras biológicas es importante ya que la deficiencia de vitamina D está relacionada con un número de trastornos en mamíferos. Existe una necesidad de reactivos y métodos para determinaciones precisas y sensibles de concentraciones de vitamina D, formas epiméricas de vitamina D y análogos de vitamina D y metabolitos de los mismos en muestras.

Sumario

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento se refieren a un compuesto de fórmula I:

(R V (L )q-Z,

en la que

o

H, en la que al menos un R1 no sea H,

Y es O, S o NR4,

X es -O-(CH2)n-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-(CH2)x-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-NH(CH2)y-C(O)-, -NR3-C(O)-, R es independientemente H o alquilo,

R2 es independientemente H o alquilo,

R3, R4, R5 y R6 son independientemente H o alquilo, o R4 y R5 se pueden tomar juntos para formar un enlace, o R5 y R6 se pueden tomar juntos para formar un enlace,

R11 es H, alquilo o acilo,

n es un número entero desde 1 a 10,

w es un número entero desde 0 a 10,

x es un número entero desde 1 a 10,

y es un número entero desde 1 a 10,

p es un número entero desde 1 a 10,

L es un grupo de unión,

q es 0 o 1, y

Z es OR8 en el que R8 es H, alquilo o NR9R10 en el que R9 y R10 son independientemente H o alquilo

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a un compuesto en el que

(RV(L)qes

NHR1-(CH2)r-NR1)s-NR7-en la que R1 es independientemente

y H, en la que al menos uno de R1 no sea H, r es independientemente un número entero de 1 a 10, s es un número entero de 1 a 10, y R7 es H o alquilo

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a un compuesto de fórmula III:

en la que

W es N-O-(CH2)nC(O)-Z",

n" es un número entero desde 1 a 10,

R11" es H, alquilo o acilo, y

Z" es OR8 en la que R8 es H, alquilo o NR9R10 en la que R9 y R10 son independientemente H o alquilo; e incluyendo mezclas de dos o más de los compuestos anteriores.

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a métodos de determinación de una o ambas de la presencia y la cantidad de vitamina D en una muestra que se sospecha que contiene vitamina D.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos proporcionados en este documento no están a escala y se proporcionan con el propósito de facilitar la comprensión de ciertos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento y se proporcionan a modo de ilustración y no como limitación del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

La figura 1 es una descripción de las fórmulas químicas para las formas epiméricas de 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2.

La figura 2 es un diagrama esquemático de una síntesis de compuestos de acuerdo con ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento.

La figura 3 es un diagrama esquemático de una síntesis de compuestos de acuerdo con ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento.

La figura 4 es un diagrama esquemático de una síntesis de compuestos de acuerdo con ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento.

La figura 5 es un diagrama esquemático de una síntesis de compuestos de acuerdo con ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento.

La figura 6 es un diagrama esquemático de una síntesis de compuestos de acuerdo con ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento.

La figura 7 es un diagrama esquemático de una síntesis de compuestos de acuerdo con ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento.

La figura 8 es un diagrama esquemático de una síntesis de compuestos de acuerdo con ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento.

La figura 9 ilustra una comparación de curvas estándar generadas usando reactivos con y sin anticuerpo anti-3-epímero-VD agregado.

La figura 10 es una curva estándar para un inmunoensayo para la determinación de 3-epi-25(OH)D en muestras usando un anticuerpo anti-3-epímero-VD.

Descripción detallada de realizaciones específicas

Compuestos

Como se mencionó anteriormente, algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a compuestos de fórmula I:

(R1)p-(L)q-Z

en la que

o

H, en la que al menos un R1 no sea H,

Y es O, S o NR4,

X es -O-(CH2)n-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-, o -NR3-C(O)-; en algunos ejemplos, X es -O-(CH2)n-C(O)- cuando Y es NR4, por ejemplo, -(CH2)w-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-(CH2)x-C(O)-, o -(CH2)w-C(O)-NH(CH2)y-C(O)- cuando Y es O o S, por ejemplo, o -NR3-C(O)- cuando Y es CR, por ejemplo,

R2 es independientemente H o alquilo,

R3, R4, R5 y R6 son independientemente H o alquilo, o R4 y R5 se pueden tomar juntos para formar un enlace, o R5 y

R6 se pueden tomar juntos para formar un enlace,

R11 es H, alquilo o acilo,

n es un número entero desde 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10, o 2 a

9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a

10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a

7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo,

w es un número entero desde 0 a 10, 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o

a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2 10, o 2 a 9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 4, o 4 a 10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a

8, o 6 a 7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo,

x es un número entero desde 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10, o 2 a

9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a

10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a

7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo,

y es un número entero desde 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10, o 2 a

9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a

10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a

7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo,

p es un número entero desde 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10, o 2 a

9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a

10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a

7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo,

L es un grupo de unión,

q es 0 o 1, y

Z es OR8 en el que R8 es H, alquilo o NR9R10 en el que R9 y R10 son independientemente H o alquilo

Como se usa en este documento, el término "alquilo" incluye aquellos grupos alquilo de un número designado de átomos de carbono de configuración lineal, ramificada o cíclica. Los ejemplos de "alquilo" incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec- y tert-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, norbornilo, por ejemplo. En algunos ejemplos, el alquilo contiene 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10, o 2 a 9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a

10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a 10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a

9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a 7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, átomos de carbono, que pueden ser no sustituidos o uno o más de los cuales puede estar sustituido por uno o más de hidroxi, alcoxi de 1 a 5, o 1 a 4, of 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a 5 átomos de carbono.

Como se usa en este documento, el término "acilo" significa R12C(O)- donde R12 es alquilo o arilo.

Como se usa en este documento, el término "arilo" significa un radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático mediante la eliminación de un átomo y que contiene uno o más anillos aromáticos, normalmente de uno a cuatro anillos aromáticos, tales como, por ejemplo, fenilo (de benceno), naftilo (de naftaleno), etc., por ejemplo, fenilo, naftilo, fenantrilo.

Como se usa en este documento, la expresión "grupo de unión" se refiere a una unidad estructural química que puede comprender aproximadamente 2 a aproximadamente 50 átomos, o 4 a aproximadamente 30 átomos, sin contar el hidrógeno y puede comprender una cadena de 2 a aproximadamente 30 átomos, o de 3 a aproximadamente 20 átomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que normalmente consiste en carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno y fósforo. En algunos ejemplos, parte o todo el grupo de unión puede ser una parte de la molécula que se está enlazando tal como, pero sin limitarse a, un residuo de aminoácido en un poli(aminoácido), por ejemplo. El número de heteroátomos en el grupo de unión puede estar en el intervalo desde 0 a aproximadamente 20, o 1 a aproximadamente 15, o aproximadamente 2 a aproximadamente 10. El grupo de unión puede ser alifático o aromático. Cuando están presentes heteroátomos, el oxígeno está normalmente presente como oxo u oxi, unido a carbono, azufre, nitrógeno o fósforo, el nitrógeno está normalmente presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido a carbono, oxígeno, azufre o fósforo; el azufre es análogo al oxígeno; mientras que el fósforo está unido al carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno, normalmente como fosfonato y fosfato mono o diéster. Las funcionalidades comunes en la formación de un enlace covalente entre el grupo de unión y la molécula a conjugar son alquilamina, amidina, tioamida, éter, urea, tiourea, guanidina, azo, tioéter y carboxilato, sulfonato y ésteres de fosfato, amidas y tioésteres.

En su mayor parte, cuando un grupo de unión tiene una funcionalidad de enlace (funcionalidad para la reacción con una unidad estructural) tal como, por ejemplo, un grupo no oxocarbonilo que incluye análogos de nitrógeno y azufre, un grupo fosfato, un grupo amino, agente alquilante tal como halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o el análogo de azufre, mercapto) oxocarbonilo (por ejemplo, aldehído o cetona), u olefina activa tal como una vinilsulfona o éster a-, pinsaturado, estas funcionalidades están unidas a grupos amina, grupos carboxilo, olefinas activas, agentes alquilantes, por ejemplo, bromoacetilo. Cuando se unen una amina y un ácido carboxílico o su derivado de nitrógeno o ácido fosfórico, se forman amidas, amidinas y fosforamidas. Cuando se enlazan mercaptano y olefina activada, se forman tioéteres. Cuando se unen un mercaptano y un agente alquilante, se forman tioéteres. Cuando se unen aldehído y una amina en condiciones reductoras, se forma una alquilamina. Cuando se unen una cetona o aldehído y una hidroxilamina (incluidos los derivados de los mismos en los que un sustituyente está en lugar del hidrógeno del grupo hidroxilo), se forma una funcionalidad oxima (= N-O-). Cuando se unen un ácido carboxílico o ácido fosfato y un alcohol, se forman ésteres.

Como se usa en este documento, el término "portador inmunogénico" significa un grupo o una unidad estructural que está conjugada con un hapteno. El conjugado del portador inmunogénico y el hapteno se puede inyectar en un organismo capaz de provocar una respuesta inmune tal como, pero sin limitarse a, un mamífero, un ave (por ejemplo, pollo o paloma), un anfibio o un reptil; o el conjugado se puede usar para inocular una muestra in vitro (de mamífero, incluyendo humano, ave, anfibio o reptil) o se puede emplear de otro modo en una técnica para producir un socio de unión para el hapteno.

La expresión "socio de unión" se refiere a una molécula que es miembro de un par de unión específico, que es una de dos moléculas diferentes que se une específicamente y por lo tanto se define como complementaria con la otra molécula. Por ejemplo, un miembro del par de unión específico puede tener un área en la superficie o en una cavidad que se une específicamente a una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de unión específico. El socio de unión puede ser, a modo de ilustración y no de limitación, un anticuerpo o un aptámero (por ejemplo, aptámero de ácido nucleico o aptámero de péptido), por ejemplo. En un ejemplo, se puede emplear un portador inmunogénico como inmunógeno para inducir una respuesta inmune y provocar la producción de un socio de unión para un hapteno. Otras técnicas incluyen la expresión en fago y la selección in vitro. Los portadores inmunogénicos también se denominan a veces portadores antigénicos. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, los inmunógenos que comprenden portadores inmunogénicos, incluidos los portadores inmunogénicos poli(aminoácidos) y no poli(aminoácidos), se sintetizan y usan para preparar anticuerpos. Los haptenos son compuestos capaces de unirse específicamente a los anticuerpos correspondientes, pero no actúan por sí mismos como inmunógenos (o antígenos) para la preparación de los anticuerpos. En consecuencia, un hapteno se une a un portador inmunogénico, que se puede emplear, por ejemplo, para generar anticuerpos.

El intervalo de peso molecular (en Dalton) para poli(aminoácidos) que son portadores inmunogénicos es de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 10,000,000, o aproximadamente 20,000 a aproximadamente 600,000, o aproximadamente 25,000 a aproximadamente 250,000, por ejemplo. Las "unidades estructurales de portadores inmunogénicos de poli(aminoácidos)" incluyen proteínas tales como, por ejemplo, albúminas, proteínas séricas, por ejemplo, globulinas, proteínas del cristalino ocular y lipoproteínas. Las proteínas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH), ovoalbúmina de huevo y gammaglobulina bovina (BGG), por ejemplo. Las "unidades estructurales de portadores inmunogénicos no poli(aminoácidos)" incluyen polisacáridos, ácidos nucleicos y partículas (materiales biológicos y sintéticos). Una amplia variedad de portadores inmunogénicos se describe en Davalian, et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,089,390, columna 4, línea 57 to columna 5, línea 5.

Como se mencionó anteriormente, la unidad estructural de portador inmunogénico puede ser un polisacárido, que es un polímero de monosacáridos de alto peso molecular que se puede preparar de forma natural o sintética y normalmente implica condensaciones repetidas de monosacáridos. Ejemplos de polisacáridos son almidones, glucógeno, celulosa, gomas de carbohidratos, tales como goma arábiga, agar, etc. El polisacárido también puede contener residuos de poli(aminoácidos) y/o residuos de lípidos.

Como se usa en este documento, el término "marcador" incluye marcadores de poli(aminoácidos) y marcadores de no poli(aminoácidos). El término " unidades estructurales de marcadores de poli(aminoácidos)" incluye marcadores que son proteínas tales como, pero sin limitarse a, enzimas, anticuerpos, péptidos e inmunógenos, por ejemplo. Con proteínas marcadoras tales como, por ejemplo, enzimas, el intervalo de peso molecular promedio en peso será desde aproximadamente 10,000 a aproximadamente 600,000 o desde aproximadamente 10,000 a aproximadamente 300,000. Normalmente, hay al menos un compuesto de acuerdo con los principios descritos en este documento (grupo análogo) por aproximadamente 200,000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 150,000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 100,000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 50,000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por 40,000, de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por 30,000 de peso molecular, o al menos 1 por 20,000 de peso molecular, o al menos uno por 10,000 molecular, o al menos uno por 5,000 de peso molecular, por ejemplo, de la proteína. En el caso de enzimas, el número de grupos análogos es normalmente desde 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 2 a aproximadamente 15, aproximadamente 3 a aproximadamente 12, o aproximadamente 6 a aproximadamente 10.

Las enzimas incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, enzimas redox tales como, por ejemplo, deshidrogenasas, por ejemplo, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) y lactato deshidrogenasa; enzimas que implican la producción de peróxido de hidrógeno y el uso del peróxido de hidrógeno para oxidar un colorante precursor a un colorante tal como, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, lactoperoxidasa y microperoxidasa; hidrolasas tales como, por ejemplo, fosfatasa alcalina y p-galactosidasa; luciferasas tales como, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; transferasas; combinaciones de enzimas tales como, pero sin limitarse a, sacáridos oxidasas, por ejemplo, glucosa y galactosa oxidasa, u oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, junto con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante, es decir, un peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante, lactoperoxidasa o microperoxidasa, por ejemplo.

Como se usa en este documento, el término "marcadores no poli(aminoácidos)" incluye aquellos marcadores que no son proteínas. El marcador no poli(aminoácido) se puede detectar directamente o se puede detectar a través de una reacción que produce una señal detectable. El marcador no poli(aminoácido) puede ser isotópico o no isotópico y puede ser, a modo de ilustración y no de limitación, un radioisótopo, un compuesto luminiscente (que incluye, pero no se limita a, compuestos fluorescentes y compuestos quimioluminiscentes, por ejemplo), un polinucleótido que codifica un catalizador, un promotor, un colorante, una coenzima, un sustrato enzimático, un grupo radiactivo, una molécula orgánica pequeña (peso molecular de 200 a 2,000), una partícula y una secuencia polinucleotídica amplificable, por ejemplo.

Como se mencionó anteriormente, una "molécula orgánica pequeña" tiene un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 2,000, o aproximadamente 200 a aproximadamente 1,500, o aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000, o aproximadamente 200 a aproximadamente 500. Tales "moléculas orgánicas pequeñas" incluyen, pero no se limitan a, biotina, moléculas fluorescentes (tales como fluoresceína y rodamina, por ejemplo), moléculas quimioluminiscentes y dinitrofenol, por ejemplo. Un socio de unión para una molécula orgánica pequeña es una molécula que reconoce y se une específicamente a la molécula pequeña. Los socios de unión para una molécula pequeña se definen por la naturaleza de la molécula pequeña e incluyen, pero no se limitan a, avidina, estreptavidina, anticuerpo para la molécula orgánica pequeña (que incluye, pero no se limita a, anticuerpo para una molécula fluorescente (tal como anticuerpo para fluoresceína y anticuerpo para rodamina, por ejemplo), anticuerpo para una molécula quimioluminiscente y anticuerpo para dinitrofenol, por ejemplo.

Como se usa en este documento, los términos "unidad estructural de poli(aminoácido) no marcada" y "unidad estructural de poli(aminoácido) portador no inmunogénico" se refieren a poli(aminoácidos) que normalmente no se consideran marcadores o portadores inmunogénicos aunque tales unidades estructurales pueden ser marcadores o portadores inmunogénicos en determinadas circunstancias. Por ejemplo, un anticuerpo no se puede considerar un marcador, pero puede ser un marcador si el anticuerpo se modifica para incluir una unidad estructural productora de señales o parte de un sistema productor de señales. Adicionalmente, un anticuerpo no se puede considerar un portador inmunogénico, pero no obstante es capaz de ser un portador inmunogénico en determinadas circunstancias debido a su mayor peso molecular.

En algunos ejemplos, el marcador no poli(aminoácido) se puede seleccionar del grupo que consiste en soportes, partículas magnéticas, ésteres de acridinio, una combinación de partículas magnéticas y ésteres de acridinio (tales como, por ejemplo, partículas paramagnéticas marcadas con o éster de acridinio), partículas quimioluminiscentes y partículas sensibilizantes.

El término "covalente" se refiere a la unión de moléculas, por ejemplo, mediante una conexión directa, por ejemplo, un enlace químico entre las moléculas. El término "no covalente" se refiere a la unión de moléculas que implican unión específica entre miembros de pares de unión específicos complementarios (sbp) que están unidos a las moléculas.

En algunos ejemplos, los compuestos de acuerdo con los principios descritos en este documento se pueden asociar con un soporte, por ejemplo, mediante unión covalente o no covalente. Como se mencionó anteriormente, en algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, Z puede ser un soporte, que puede estar compuesto por un material orgánico o inorgánico, sólido o fluido, insoluble en agua y que puede ser transparente o parcialmente transparente. El soporte puede tener cualquiera de un número de formas, tales como, pero no se limitan a, una partícula (soporte de partículas) que incluye una microesfera, una película, una membrana, un tubo, un pozo, una tira, una varilla, una fibra o una superficie plana tal como, por ejemplo, una placa o un papel, por ejemplo. El soporte puede o no ser suspendido en el medio en el que se emplea. Ejemplos de soportes suspendibles son materiales poliméricos tales como látex, bicapas lipídicas o liposomas, gotitas de aceite, células e hidrogeles y partículas magnéticas, por ejemplo. Otras composiciones de soporte incluyen polímeros, tales como, a modo de ilustración y no de limitación, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4 metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nailon, poli(butirato de vinilo), por ejemplo, usados solos o junto con otros materiales. El soporte puede estar marcado adicionalmente o no con un colorante, catalizador u otro grupo detectable, por ejemplo.

En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, el soporte puede ser una partícula. Las partículas tienen un diámetro promedio de al menos aproximadamente 0.02 micrómetros y no más de aproximadamente 100 micrómetros. En algunos ejemplos, las partículas tienen un diámetro promedio desde aproximadamente 0.05 micrómetros a aproximadamente 20 micrómetros, o desde aproximadamente 0.3 micrómetros a aproximadamente 10 micrómetros. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, preferiblemente de una densidad aproximada al agua, generalmente desde aproximadamente 0.7 g/mL a aproximadamente 1.5 g/mL, y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos tales como células y microorganismos, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, estreptococos, Staphylococcus aureus y E. coli, virus, por ejemplo. Las partículas también pueden ser partículas compuestas de polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, partículas de látex, partículas magnéticas o no magnéticas, vesículas de fosfolípidos, quilomicrones, lipoproteínas y similares. En algunos ejemplos, las partículas son partículas de dióxido de cromo (cromo) o partículas de látex.

Las partículas magnéticas incluyen partículas paramagnéticas, partículas ferromagnéticas y partículas diamagnéticas. Tales partículas incluyen, pero no se limitan a, metales de transición de los periodos 4-7 de la Tabla Periódica que incluyen cromo, cobre, cobalto, aluminio, manganeso, hierro y níquel, por ejemplo.

Las partículas quimioluminiscentes son partículas que tienen asociado un compuesto quimioluminiscente. La expresión "asociado con el mismo" como se usa en este documento significa que un compuesto tal como, por ejemplo, un compuesto quimioluminiscente y una partícula se pueden asociarse por enlace directo o indirecto, adsorción, absorción, incorporación o solución, por ejemplo. Ejemplos de compuestos quimioluminiscentes que se pueden usar son los expuestos en las Patentes de los Estados Unidos No. 5,340,716 y 6,251,581. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, el compuesto quimioluminiscente es una sustancia fotoactivable que sufre una reacción química por excitación directa o sensibilizada por luz o por reacción con oxígeno singlete para formar un producto de reacción metaestable que es capaz de descomponerse con la emisión simultánea o posterior de luz, normalmente dentro del intervalo de longitud de onda de 250 a 1200 nm. El término "fotoactivable" incluye "fotoquímicamente activable". En algunos ejemplos, los compuestos quimioluminiscentes son aquellos que reaccionan con el oxígeno singlete para formar dioxetanos o dioxetanonas. Estas últimas suelen ser olefinas ricas en electrones. Ejemplos de tales olefinas ricas en electrones son enol éteres, enaminas, 9-alquiliden-N-alquilacridanos, arilviniléteres, dioxenos, arilimidazoles, 9-alquiliden-xantanos y lucigenina. Otros compuestos incluyen luminol y otras ftalhidrazidas y compuestos quimioluminiscentes que están protegidos de sufrir una reacción quimioluminiscente en virtud de que están protegidos por un grupo protector fotoquímicamente lábil, tales compuestos incluyen, por ejemplo, luciferina de luciérnaga, acuaforina y luminol. Ejemplos de tales compuestos quimioluminiscentes que se pueden usar son los expuestos en la Patente de los Estados Unidos No. 5,709,994.

Las partículas sensibilizantes son partículas que tienen asociado un compuesto sensibilizante, que incluye, pero no se limita a, un compuesto fotosensibilizante. Ejemplos de compuestos sensibilizantes que se pueden usar son los expuestos en las Patentes de los Estados Unidos No. 5,340,716 y 6,251,581.

Un fotosensibilizante es un sensibilizante para la generación de oxígeno singlete normalmente por excitación con luz. En algunos ejemplos, el fotosensibilizante absorbe a una longitud de onda más larga que el compuesto quimioluminiscente y tiene un triplete de energía menor que el compuesto quimioluminiscente. El fotosensibilizante puede ser fotoactivable (por ejemplo, tintes y compuestos aromáticos). El fotosensibilizante suele ser un compuesto formado por átomos unidos covalentemente, normalmente con múltiples enlaces dobles o triples conjugados. El compuesto debería absorber luz en el intervalo de longitud de onda de 200-1100 nm, normalmente 300-1000 nm, preferiblemente 450-950 nm. Los fotosensibilizantes típicos incluyen, pero no se limitan a, acetona, benzofenona, 9-tioxantona, eosina, 9,10-dibromoantraceno, azul de metileno, metaloporfirinas (por ejemplo, hematoporfirina), ftalocianinas, clorofilas, rosa de bengala, buckminsterfullereno, por ejemplo, derivados de estos compuestos. Se enumeran ejemplos de otros fotosensibilizantes en N.J. Turro, "Molecular Photochemistry", page 132, W. A. Benjamin Inc., N.Y. 1965. El fotosensibilizante ayuda a la fotoactivación cuando la activación es por oxígeno singlete. Normalmente, el fotosensibilizante absorbe luz y el fotosensibilizante excitado formado de este modo activa el oxígeno para producir oxígeno singlete, que reacciona con el compuesto quimioluminiscente para dar un intermedio luminiscente metaestable.

En las fórmulas expuestas en este documento, una línea ondulada a través de un enlace indica el punto de unión de una unidad estructural en la fórmula.

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento se refieren a compuestos de fórmula IV, que son compuestos de fórmula I en los que:

o H, en el que al menos un R1 no sea H; e incluyendo mezclas de dos o más de los compuestos anteriores.

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a derivados de (7aS,E)-4-((Z)-2-((R)-5-hidroxi-2-metileno-cidohexilideno)etilideno)-7a-metiloctahidro-1H-inden-1-ona (derivados de HMCHEMOIO), o compuestos de fórmula V, que son compuestos de fórmula I en los que:

o H, en el que al menos un R1 no sea H; e incluyendo mezclas de dos o más de los compuestos anteriores.

Algunos ejemplos están dirigidos a compuestos de fórmula VI, que son compuestos de fórmula I en los que (R1)p-(L)qes NHR1-(CH2)r-NR1-((CH2)r-NR1)s-(CH2)r-NR7- en la que R1 es independientemente

en la que al menos un R1 no sea H,

p, q y n son como se definieron anteriormente,

r es independientemente un número entero desde 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10, o 2 a 9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a 10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a 7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo,

s es un número entero desde 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10, o 2 a 9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a 10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a 7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo, y

R7 es H o alquilo; e incluyendo mezclas de dos o más de los compuestos anteriores.

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a compuestos de fórmula II:

NHRr -(CH2)r-NR1"-((CH2)r'-NR1"')s'-(CH2)r'-NR7'-Z'

en la que R1', R1" o R1"' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en

(no según la invención),

y h ,

en la que al menos uno de R1’, R1" o R1"’ no sea H,

n y w son como se definieron anteriormente,

r’ es independientemente un número entero desde 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10, o 2 a 9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a 10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a 7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo,

s’ es un número entero desde 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10, o 2 a 9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a 10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a 7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo,

R7’ es H o alquilo,

R11’ es H, alquilo, o acilo, y

Z’ es OR8 en el que R8 es H, alquilo, o NR9R10 en la que R9 y R10 son independientemente H o alquilo.

En algunos ejemplos, s’ es 1. En algunos ejemplos, R7’ es H. En algunos ejemplos, r’ es 2. En algunos ejemplos, R1" y R1"’ son H; en algunos ejemplos, R1' y R1"' son H; y en algunos ejemplos, R1' y R1" son H. En algunos ejemplos, ninguno de R1', R1" y R1"' es H, es decir, R1', R1" y R1"' son todos

o (no según la invención)

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a compuestos de fórmula III:

en la que

W es N-O-(CH2)nC(O)-Z",

n es un número entero de

n es un número entero desde 1 a 10, o 1 a 9, o 1 a 8, o 1 a 7, o 1 a 6, o 1 a 5, o 1 a 4, o 1 a 3, o 1 a 2, o 2 a 10,o 2 a 9, o 2 a 8, o 2 a 7, o 2 a 6, o 2 a 5, o 2 a 4, o 2 a 3, o 3 a 10, o 3 a 9, o 3 a 8, o 3 a 7, o 3 a 6, o 3 a 5, o 3 a 4, o 4 a 10, o 4 a 9, o 4 a 8, o 4 a 7, o 4 a 6, o 4 a 5, o 5 a 10, o 5 a 9, o 5 a 8, o 5 a 7, o 5 a 6, o 6 a 10, o 6 a 9, o 6 a 8, o 6 a 7, o 7 a 10, o 7 a 9, o 7 a 8, o 8 a 10, o 8 a 9, o 9 a 10, por ejemplo,

R11" es H, alquilo o acilo, y

Z” es OR8 en el que R8 es H, alquilo o NR9R10 en la que R9 y R10 son independientemente H o alquilo; e incluyen mezclas de dos o más de los compuestos anteriores.

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a compuestos de fórmula VII:

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de uno o más de los compuestos identificados anteriormente tales como, por ejemplo, compuestos de fórmula III y compuestos de fórmula VII, e incluyendo mezclas de dos o más de los compuestos anteriores.

Preparación de los compuestos

Los ejemplos de métodos de preparación de compuestos que son derivados de HMCHEMOIO de acuerdo con los principios descritos en este documento se analizan a continuación, a modo de ilustración y no de limitación. Se pueden emplear otros enfoques para formar los compuestos anteriores y otros compuestos consistentes con los principios descritos en este documento.

Un ejemplo de una preparación de un compuesto de fórmula VII ((7aS,£)-4-((Z)-2-((R)-5-hidroxi-2-metilenociclohexilideno) etilideno)-7a-metiloctahidro-1H-inden-1-ona) se expone en la figura 2. Con referencia a la figura 2, el compuesto de fórmula VIII, en el que R11O es acetilo, se trata para formar cetal de fórmula IX. En un ejemplo, el compuesto de fórmula VIII se trata con etilenglicol en un disolvente aromático como benceno en presencia de un ácido orgánico fuerte tal como, por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico, en condiciones (temperatura y tiempo) para formar un cetal. En algunos ejemplos, la reacción se lleva a cabo a reflujo durante un período de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 12 a aproximadamente 20 horas.

El compuesto de fórmula IX se trata para introducir un grupo haluro tal como, por ejemplo, un grupo cloruro o un grupo bromuro. En un ejemplo, el compuesto de fórmula IX se trata con N-bromosuccinimida y un iniciador de radicales libres como, por ejemplo, azobisisobutironitrilo en un disolvente orgánico como, por ejemplo, un alcano (por ejemplo, hexano), por ejemplo, en condiciones para introducir un grupo bromuro en el compuesto de fórmula IX para dar un compuesto de fórmula X. En algunos ejemplos, la reacción se lleva a cabo a reflujo durante aproximadamente 30 minutos.

El haluro del compuesto de fórmula X se elimina para dar un compuesto de fórmula XI que tiene dos dobles enlaces que están conjugados. En un ejemplo, el compuesto de fórmula X se trata con una base suave tal como, por ejemplo, fluoruro de tetra-n-butilamonio, en un disolvente orgánico polar tal como, por ejemplo, un éter (por ejemplo, tetrahidrofurano), por ejemplo, bajo condiciones para eliminar un haluro de hidrógeno para formar un doble enlace (compuesto de fórmula XI). En algunos ejemplos, la temperatura durante la reacción es de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El período de tiempo de la reacción es de aproximadamente 2 horas.

El grupo acetilo (R11) del compuesto de fórmula XI se elimina mediante tratamiento con una base inorgánica tal como, por ejemplo, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio, en un disolvente orgánico polar tal como, por ejemplo, un alcanol (por ejemplo, metanol o etanol). Los componentes de reacción se someten a condiciones para eliminar el grupo acetilo para dar el compuesto de fórmula XII. En algunos ejemplos, la temperatura durante la reacción es de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C, o a temperatura ambiente. El período de tiempo de la reacción es de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 8 horas.

El grupo cetal del compuesto de fórmula XII se elimina, por ejemplo, usando un ácido orgánico fuerte tal como, por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico, en una mezcla de agua y un disolvente orgánico polar tal como, por ejemplo, acetona, en condiciones para eliminar un cetal para producir el compuesto de fórmula XIII. En algunos ejemplos, la temperatura durante la reacción es de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El período de tiempo de la reacción es de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 48 horas.

El compuesto de fórmula VII se forma tratando el compuesto de fórmula XIII con reactivos para abrir un anillo tal como, por ejemplo, tratamiento con luz UV (foto reacción) en un disolvente orgánico polar como, por ejemplo, un alcanol. (por ejemplo, metanol o etanol), un éter (por ejemplo, éter etílico), una cetona (por ejemplo, acetona) o una combinación de dos o más de los anteriores, en condiciones para abrir un anillo de fórmula XIII. En algunos ejemplos, la temperatura durante la foto reacción es de aproximadamente -20 °C a aproximadamente 0 °C. El período de tiempo de la foto reacción es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 minutos, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 minutos. La foto reacción va seguida de reflujo del intermedio en etanol durante aproximadamente 3 horas.

La figura 3 representa, a modo de ilustración y no de limitación, un ejemplo de un método de preparación de un compuesto de fórmula IIa (donde Z es BSA, a modo de ejemplo y no de limitación). Con referencia a la figura 3, el compuesto de fórmula VII se hace reaccionar con ácido aminooxiacético (XIX) para formar la oxima de fórmula XX ácido (2-((7aS,£)-4-((Z)-2-((R)-5-hidroxi-2-metilenociclohexilideno) etilideno)-7a-metiloctahidro-1H-inden-1-ilidenoaminooxi)acético). La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un alcohol (por ejemplo, metanol o etanol), en condiciones para formar una oxima. En algunos ejemplos, la temperatura durante la reacción es de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 30 °C, o de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El período de tiempo de la reacción es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 30 horas, o aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas.

En una reacción separada, un portador inmunogénico de poli(aminoácido) (en este ejemplo, BSA (Z' de fórmula II es BSA), a modo de ilustración y no de limitación) se combina con un compuesto de fórmula XXI para formar un compuesto de fórmula XXIa. La reacción se lleva a cabo en un medio regulado acuoso a un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, o aproximadamente 6. Un agente de activación para facilitar la reacción de la funcionalidad ácido carboxílico de BSA con uno o más del (los) grupo (s) amina de XXI se incluyen en el medio de reacción. Tales agentes de acoplamiento incluyen, pero no se limitan a, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC), N-hidroxisuccinimida (NHS), o tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(N-succinimidil)uronio, o combinaciones de dos o más de los anteriores. La reacción se lleva a cabo en condiciones para formar una amida. En algunos ejemplos, la temperatura durante la reacción es de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 3 horas a aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 4 horas a aproximadamente 20 horas, o aproximadamente 4 horas a aproximadamente 10 horas, por ejemplo.

El compuesto de fórmula XX se trata con un agente de activación tal como, pero sin limitación, pero no se limitan a, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC), N-hidroxisuccinimida (NHS), o tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(N-succinimidil)uronio, o combinaciones de dos o más de los anteriores, por ejemplo, para formar XX activado. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico polar tal como, por ejemplo, un alcanol (por ejemplo, metanol o etanol), un éter (por ejemplo, éter etílico o tetrahidrofurano), una cetona (por ejemplo, acetona), dimetilsulfóxido, acetonitrilo, diclorometano, o dimetilformamida (DMF), o una combinación de dos o más de los anteriores, que también pueden contener agua. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 30 °C, o aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C, o aproximadamente temperatura ambiente. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 12 horas a aproximadamente 36 horas, o aproximadamente 20 a aproximadamente 30 horas. El XX activado se hace reaccionar con el compuesto de fórmula XXIa para dar un compuesto de fórmula IIa. Como se muestra, R1' es la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa y R1" y R1"' son cada uno H. Sin embargo, de acuerdo con los principios descritos en este documento, el producto resultante puede ser una mezcla de compuestos en los que en un compuesto de la mezcla R1' es la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa, y en otro compuesto de la mezcla R1' y R1" son ambos la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa, y en otro compuesto de la mezcla R1' y R1"' son tanto la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa, como en otro compuesto de la mezcla, los tres de R1' y R1" y R1"' son la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, DMF o DMSO, por ejemplo, en condiciones para formar una amida. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 30 °C, o aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C, o aproximadamente temperatura ambiente. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 12 horas a aproximadamente 36 horas, o aproximadamente 20 a aproximadamente 30 horas.

La figura 4 representa, a modo de ilustración y no de limitación, un ejemplo alternativo de un método de preparación de un compuesto de fórmula VIa y conversión del compuesto de fórmula VIa en un compuesto de fórmula IIa (donde Z es BSA, a modo de ejemplo y no de limitación). Con referencia a la figura 4, el compuesto de fórmula VII se hace reaccionar con ácido aminooxiacético (XIX) para formar la oxima de fórmula XX. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un alcohol (por ejemplo, metanol o etanol), en condiciones para formar una oxima. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 10 °C a aproximadamente 30 °C, o aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 1 hora a aproximadamente 30 horas, o aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas.

La oxima de fórmula XX se combina con un compuesto de fórmula XXI para formar el compuesto de fórmula Vía. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un alcano (por ejemplo, hexano o pentano, en condiciones para formar una amida. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 10 horas a aproximadamente 48 horas.

El compuesto de fórmula Vía se hace reaccionar con un portador inmunogénico de poli(aminoácido) (Z' de fórmula II es BSA, a modo de ilustración y no de limitación) para dar un compuesto de fórmula lía. Como se muestra, R1' es la unidad estructural del compuesto de fórmula lía y R1" y R1"' son cada uno H. Sin embargo, de acuerdo con los principios descritos en este documento, el producto resultante puede ser una mezcla de compuestos en los que en un compuesto de la mezcla R1' es la unidad estructural del compuesto de fórmula lía, y en otro compuesto de la mezcla R1' y R1" son ambos la unidad estructural del compuesto de fórmula íía, y en otro compuesto de la mezcla R1' y R1"' son tanto la unidad estructural del compuesto de fórmula íía, como en otro compuesto de la mezcla, los tres de R1' y R1" y R1"' son la unidad estructural del compuesto de fórmula íía. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un alcano (por ejemplo, hexano o pentano), en condiciones para formar una amida. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 10 horas a aproximadamente 48 horas.

Otro ejemplo de un método de preparación de ejemplos de compuestos de acuerdo con los principios descritos en este documento se describe, a modo de ilustración y no de limitación, con referencia a la figura 5. Se pueden emplear otros enfoques para formar los compuestos consistentes con los principios descritos en este documento. La preparación de un compuesto de fórmula XVííí (Y es C en la fórmula í) se expone en la figura 5. Con referencia a la figura 5, el compuesto de fórmula Víí (preparado, por ejemplo, como se analiza en la figura 3) se trata para proteger el grupo hidroxilo libre (R13 es un grupo protector) para formar un compuesto de fórmula XíV. Las condiciones de la reacción dependen de la naturaleza del grupo protector, por ejemplo.

En un ejemplo, el compuesto de fórmula Víí se trata con cloruro de tert-butildimetilsililo en condiciones para formar un éter de sililo. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico polar tal como, por ejemplo, piridina, dimetilsulfóxido, un éter (por ejemplo, tetrahidrofurano, éter etílico o 1,4-dioxano), acetonitrilo, diclorometano o dimetilformamida (DMF). En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 10 °C a aproximadamente 30 °C, o aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 1 hora a aproximadamente 30 horas, o aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas.

Ejemplos de grupos protectores, a modo de ejemplo y no de limitación, son grupos sililo (tales como, pero sin limitarse a, trimetilsililo, trimetilsililo, tert-butildimetilsililo, triisopropilsililo, tert-butildifenilsililo, por ejemplo), t-butoxicarbonilo (t-Boc), fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), acetaminometilo (Acm), trifenilmetilo (Trt), benciloxicarbonilo, bifenilisopropiloxicarbonilo, 1-amiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, alfa-dimetil-3,5-dimetoxibenxiloxicarbonilo, onitrofenilsulfenil, 2-ciano-1,1-dimentil-etoxicarbonilo, bromobenciloxi, carbamilo, y formilo, por ejemplo.

Un compuesto de fórmula XV se forma a partir del compuesto de fórmula XíV mediante, por ejemplo, reacción con un alfa-haloéster en presencia de zinc (reacción de Reformatsky). En este ejemplo, el compuesto de fórmula XíV se trata con un reactivo de Reformatsky tal como, por ejemplo, BrZnCH2COOR14 (Zn y alfa-bromoacetato de etilo en el ejemplo mostrado, w = 1) para dar el compuesto de fórmula XV. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un éter (por ejemplo, tetrahidrofurano o éter etílico) o un disolvente aromático (por ejemplo, benceno o tolueno). En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 4 °C a aproximadamente 100 °C, o aproximadamente 10 °C a aproximadamente 90 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 4 horas a aproximadamente 24 horas.

El grupo hidroxilo libre del compuesto de fórmula XV se reduce para formar un compuesto de fórmula XVí. El compuesto de fórmula XV se puede tratar para reducir el grupo hidroxi mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a, formación de éster de tosilato seguida de tratamiento con un hidruro metálico tal como, por ejemplo, LiAl H4 o NaBH4; eliminación del hidroxilo para formar un alqueno (tal como, por ejemplo, por tratamiento con un ácido orgánico concentrado, por ejemplo, ácido sulfúrico concentrado o ácido clorhídrico concentrado) seguido de hidrogenación en presencia de un catalizador tal como, por ejemplo, platino o paladio; por ejemplo. Las condiciones para la reacción dependen de una o ambas de la naturaleza de los reactivos empleados y la naturaleza del disolvente, por ejemplo.

El compuesto resultante de fórmula XVí se trata para hidrolizar el grupo éster a un grupo de ácido carboxílico (reacción de desesterificación) para dar el compuesto de fórmula XVíí. Están disponibles numerosos enfoques para la desesterificación e incluyen, pero no se limitan a, saponificación o tratamiento con una base acuosa tal como, por ejemplo, NaOH o KOH con calor; o hidrólisis ácida o tratamiento con un ácido acuoso tal como, por ejemplo, un ácido mineral acuoso (tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico), por ejemplo. Las condiciones para la reacción dependen de una o más de la naturaleza de los reactivos y la naturaleza del éster, por ejemplo.

Se forma un compuesto de fórmula XVIII mediante la eliminación del grupo protector R13 del compuesto de fórmula XVII. Se pueden emplear diversos enfoques para la eliminación de grupos protectores e incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con ácido mineral diluido (tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico; tratamiento con un ácido orgánico (tal como, por ejemplo, ácido acético), en un disolvente orgánico polar (tal como, por ejemplo, un alcanol (por ejemplo, metanol o etanol), un éter (por ejemplo, éter etílico o tetrahidrofurano), una cetona (por ejemplo, acetona), dimetilsulfóxido, acetonitrilo, diclorometano o dimetilformamida (DMF), o una combinación de dos o más de los anteriores, que también pueden contener agua, en las condiciones para eliminar el grupo protector para producir el compuesto de fórmula x V iII. Las condiciones para la reacción dependen de uno o más de la naturaleza de los reactivos y la naturaleza del grupo protector, por ejemplo.

La figura 6 representa, a modo de ilustración y no de limitación, un ejemplo de un método de preparación de un compuesto de fórmula VIb y conversión del compuesto de fórmula VIb en un compuesto de fórmula IIb (donde Z' es KLH, a modo de ejemplo y no de limitación). Con referencia a la figura 6, el compuesto de fórmula XVIII se trata para activar el grupo ácido carboxílico tal como, pero sin limitarse a, la reacción para formar un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) (compuesto de fórmula XXII). La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico polar tal como, por ejemplo, dimetilsulfóxido, un éter (por ejemplo, tetrahidrofurano o éter etílico), acetonitrilo, diclorometano o dimetilformamida (DMF), por ejemplo, en condiciones para formar un éster de NHS. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 4 horas a aproximadamente 48 horas.

El éster de NHS de fórmula XXII se combina con un compuesto de fórmula XXI para formar un compuesto de fórmula VIb. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un alcano (por ejemplo, hexano o pentano), por ejemplo, en condiciones para formar una amida. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 4 horas a aproximadamente 48 horas.

El compuesto de fórmula VIb se hace reaccionar con un portador inmunogénico de poli(aminoácido) (Z' de fórmula II es KLH, por ejemplo) para dar un compuesto de fórmula IIb. Como se muestra, R1' es la unidad estructural del compuesto de fórmula IIb y R1" y R1"' son cada uno H. Sin embargo, de acuerdo con los principios descritos en este documento, el producto resultante puede ser una mezcla de compuestos en los que un compuesto de la mezcla R1' es la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa, y en otro compuesto de la mezcla R1' y R1" son ambos la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa, y en otro compuesto de la mezcla R1' y R1"' son tanto la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa, como en otro compuesto de la mezcla, los tres de R1' y R1" y R1"' son la unidad estructural del compuesto de fórmula IIb. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un alcano (por ejemplo, hexano o pentano), en condiciones para formar una amida. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 4 horas a aproximadamente 48 horas.

En una ruta alternativa, se puede preparar un compuesto de fórmula IIb a partir de un compuesto de fórmula XVIII de una manera similar a la descrita anteriormente para la figura 3 para la preparación del compuesto de fórmula IIa.

Otro ejemplo de un método de preparación de ejemplos de compuestos de acuerdo con los principios descritos en este documento se describe, a modo de ilustración y no de limitación, con referencia a la figura 7. Se pueden emplear otros enfoques para formar los compuestos consistentes con los principios descritos en este documento. La preparación de un compuesto de fórmula XXVII (Y es O en la fórmula I y w es de 0 a 10 o de 1 a 10) se expone en la figura 7. Con referencia a la figura 7, el compuesto de fórmula VII (preparado, por ejemplo, como se analiza en la figura 2) se trata para proteger el grupo hidroxilo libre (R15 es un grupo protector) para formar un compuesto de fórmula XXIII. Las condiciones de la reacción dependen de la naturaleza del grupo protector, por ejemplo.

En un ejemplo, el compuesto de fórmula VII se trata con cloruro de tert-butildimetilsililo (a modo de ejemplo y no de limitación) en condiciones para formar un silil éter. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico polar tal como, por ejemplo, piridina, dimetilsulfóxido, un éter (por ejemplo, tetrahidrofurano, éter etílico o 1,4-dioxano), acetonitrilo, diclorometano o dimetilformamida (DMF). En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 4 horas a aproximadamente 48 horas.

Un compuesto de fórmula XXIV se forma a partir del compuesto de fórmula XXIII por reducción del grupo cetona a un grupo hidroxi, por ejemplo. El compuesto de fórmula XXIII se puede tratar para reducir el grupo hidroxi mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con un hidruro metálico tal como, por ejemplo, LiAlH4 o NaBH4, para dar el compuesto de fórmula XXIV. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un alcanol (por ejemplo, etanol). En algunos ejemplos, la temperatura durante la reacción es de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 4 horas.

Un compuesto de fórmula XXV se forma a partir del compuesto de fórmula XXIV mediante, por ejemplo, reacción con un haloéster (tal como, a modo de ejemplo y no de limitación) un alfa-haloéster en presencia de una base. En este ejemplo, el compuesto de fórmula XXV se trata con, por ejemplo, BrCH2COOR16 (alfa-bromoacetato de etilo en el ejemplo mostrado, w es 1 y R16 es etilo) para dar el compuesto de fórmula XXV. La reacción se lleva a cabo formando un ion alcóxido a partir del grupo hidroxi del compuesto de fórmula XXIV en presencia de una base tal como, por ejemplo, KOH, NaOH, Na2CO3 o K2CO3, y reacción del alcóxido con el haloéster. El disolvente para la reacción es un disolvente acuoso, que puede contener del 1 % al 40 % de un disolvente orgánico polar tal como el descrito anteriormente. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 50 °C a aproximadamente 100 °C, o aproximadamente 50 °C a aproximadamente 90 °C, por ejemplo. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 1 hora a aproximadamente 8 horas, por ejemplo.

El compuesto resultante de fórmula XXV se trata para hidrolizar el grupo éster a un grupo de ácido carboxílico (reacción de desesterificación) para dar el compuesto de fórmula XXVI. Están disponibles numerosos enfoques para la desesterificación e incluyen, pero no se limitan a, saponificación o tratamiento con una base acuosa tal como, por ejemplo, NaOH o KOH, con calor; hidrólisis ácida o tratamiento con un ácido acuoso tal como, por ejemplo, un ácido mineral acuoso (tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, por ejemplo. Las condiciones para la reacción dependen de una o más de la naturaleza de los reactivos y la naturaleza del éster, por ejemplo.

Se forma un compuesto de fórmula XXVII mediante la eliminación del grupo protector R15 del compuesto de fórmula XXVI. Se pueden emplear diversos enfoques para la eliminación de grupos protectores e incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con ácido mineral diluido (tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico); tratamiento con un ácido orgánico (tal como, por ejemplo, ácido acético), en un disolvente orgánico polar (tal como, por ejemplo, un alcanol (por ejemplo, metanol o etanol), un éter (por ejemplo, éter etílico, tetrahidrofurano o 1, 4-dioxano), una cetona (por ejemplo, acetona), dimetilsulfóxido, acetonitrilo, diclorometano, dimetilformamida (DMF), o una combinación de dos o más de los anteriores, que también pueden contener agua, en condiciones para eliminar el grupo protector para producir el compuesto de fórmula XXVII. Las condiciones para la reacción dependen de una o más de la naturaleza de los reactivos y la naturaleza del grupo protector, por ejemplo.

La figura 8 representa, a modo de ilustración y no de limitación, un ejemplo de un método de preparación de un compuesto de fórmula VIc y conversión del compuesto de fórmula VIc en un compuesto de fórmula IIc (donde Z' es la enzima G6PDH, a modo de ejemplo y no de limitación). Con referencia a la figura 8, el compuesto de fórmula XXVII se trata para activar el grupo ácido carboxílico tal como, pero sin limitarse a, la reacción para formar un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) (compuesto de fórmula XXVIII). La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico polar tal como, por ejemplo, dimetilsulfóxido, un éter (por ejemplo, tetrahidrofurano, éter etílico o 1,4-dioxano), acetonitrilo, diclorometano o dimetilformamida (DMF), por ejemplo, bajo condiciones para formar un éster de NHS. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas.

El éster de NHS de fórmula XXVIII se combina con un compuesto de fórmula XXI para formar un compuesto de fórmula VIc. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un alcano (por ejemplo, hexano o pentano), por ejemplo, en condiciones para formar una amida. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas.

El compuesto de fórmula VIc se hace reaccionar con la enzima, G6PDH (Z' de fórmula II es G6PDH, por ejemplo), para dar un compuesto de fórmula IIc. Como se muestra, R1' es la unidad estructural del compuesto de fórmula IIc y R1" y R1"' son cada uno H. Sin embargo, de acuerdo con los principios descritos en este documento, el producto resultante puede ser una mezcla de compuestos en los que un compuesto de la mezcla R1' es la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa, y en otro compuesto de la mezcla R1' y R1" son ambos la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa, y en otro compuesto de la mezcla R1' y R1"' son tanto la unidad estructural del compuesto de fórmula IIa, como en otro compuesto de la mezcla, los tres de R1' y R1" y R1"' son la unidad estructural del compuesto de fórmula IIc. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, un alcano (por ejemplo, hexano o pentano), en condiciones para formar una amida. En algunos ejemplos la temperatura durante la reacción es aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C. El periodo de tiempo de la reacción es aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas.

En una ruta alternativa, se puede preparar un compuesto de fórmula IIc a partir de un compuesto de fórmula XXVII de una manera similar a la descrita anteriormente para la figura 3 para la preparación del compuesto de fórmula IIa.

Se pueden preparar otros compuestos de acuerdo con los principios descritos en este documento de una manera similar a la descrita anteriormente.

Preparación de socios de unión

Se pueden emplear ejemplos de compuestos de acuerdo con los principios descritos en este documento donde Z es un portador inmunogénico poli(aminoácido) o un portador inmunogénico no poli(aminoácido) para preparar socios de unión para vitamina D tales como, por ejemplo, aptámeros para vitamina D o anticuerpos para vitamina D, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos específicos para vitamina D3, anticuerpos específicos para vitamina D2, anticuerpos específicos para 25-hidroxivitamina D3, anticuerpos específicos para 25-hidroxivitamina D2, anticuerpos específicos para 3-epi-25-hidroxivitamina D3, y anticuerpos específicos para 3-epi-25-hidroxivitamina D2, por ejemplo. De particular interés son los anticuerpos específicos para la 3-epi-25-hidroxivitamina D3, los anticuerpos específicos para la 3-epi-25-hidroxivitamina D2 y los anticuerpos específicos para los epímeros de otros compuestos de vitamina D ("anticuerpos para la vitamina D epimérica"), que se pueden emplear en ensayos de 3-epi-25-hidroxivitamina D3 y de 3-epi-25-hidroxivitamina D2, o que se puede emplear en ensayos de vitamina D no epimérica para reducir o eliminar la interferencia de formas epiméricas de vitamina D tales como, por ejemplo, 3-epi-25-hidroxivitamina D3 y de 3-epi-25-hidroxivitamina D2, que pueden estar presentes en una muestra para analizar la presencia de vitamina D.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales y pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, inmunoglobulinas que incluyen, pero no se limitan a, diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, por ejemplo. Los fragmentos de los mismos pueden incluir Fab, Fv y F(ab')2, Fab', y similares. Además, los agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos se pueden usar cuando sea apropiado siempre que se mantenga la afinidad de unión por una molécula particular.

Los anticuerpos de acuerdo con los principios descritos en este documento se pueden preparar mediante técnicas que incluyen, pero no se limitan a, la inmunización de un huésped y la recolección de sueros (policlonal), la preparación de líneas celulares híbridas continuas y la recolección de la proteína secretada (monoclonal) o la clonación y expresar secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de las mismas que codifican al menos las secuencias de aminoácidos necesarias para la unión específica de anticuerpos naturales, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante técnicas tales como preparar líneas celulares híbridas continuas y recolectar la proteína secretada (técnicas de hibridación de células somáticas). Los anticuerpos monoclonales se pueden producir según las técnicas estándar de Kohler and Milstein, Nature 265:495-497, 1975. Se encuentran reseñas de técnicas de anticuerpos monoclonales en Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), y Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981).

En otro enfoque para la preparación de anticuerpos, la secuencia que codifica los sitios de unión del anticuerpo puede escindirse del ADN del cromosoma e insertarse en un vector de clonación, que se puede expresar en bacterias para producir proteínas recombinantes que tienen los correspondientes sitios de unión al anticuerpo. Este enfoque implica la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de las mismas que codifican al menos las secuencias de aminoácidos necesarias para la unión específica de anticuerpos naturales.

En un enfoque para la producción de anticuerpos monoclonales, una primera etapa incluye la inmunización de un animal productor de anticuerpos tal como un ratón, una rata, una cabra, una oveja o una vaca con un inmunógeno que comprende un compuesto de fórmula I en el que Z es un portador inmunogénico, por ejemplo. La inmunización se puede realizar con o sin un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund u otros adyuvantes tales como monofosforil lípido A y adyuvante dicorinomicolato de trehalosa sintético. Una siguiente etapa incluye aislar las células del bazo del animal productor de anticuerpos y fusionar las células del bazo que producen anticuerpos con un socio de fusión apropiado, por lo general una célula de mieloma, tal como mediante el uso de polietilenglicol u otras técnicas. Por lo general, las células de mieloma usadas son aquellas que crecen normalmente en medio de hipoxantina-timidina (HT) pero no pueden crecer en medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), que se usa para la selección de las células fusionadas. Una siguiente etapa incluye la selección de las células fusionadas, por lo general mediante selección en medio HAT. Una siguiente etapa incluye el cribado de los híbridos clonados para la producción apropiada de anticuerpos usando inmunoensayos tales como, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) u otros inmunoensayos apropiados para el cribado.

Se puede seleccionar un anticuerpo (preparado a partir de un inmunógeno de acuerdo con los principios descritos en este documento) con la especificidad requerida mediante metodologías de cribado, que incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, ELISA, dot blots, análisis Western y resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo. De esta manera se obtiene un anticuerpo que se une a un analito de vitamina D de interés y no se une en ningún grado detectable a una molécula de vitamina D que no sea de interés en un ensayo particular. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, un anticuerpo que se une a un analito de vitamina D de interés tiene una afinidad de unión por el analito de vitamina D de interés de aproximadamente 107 a aproximadamente 1014 litros/mol, o aproximadamente 107 a aproximadamente 1011 litros/mol, o aproximadamente 107 a aproximadamente 1012 litros/mol, o aproximadamente 108 a aproximadamente 1014 litros/mol, o aproximadamente 108 a aproximadamente 1011 litros/mol, o aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 litros/mol, por ejemplo. La expresión "cualquier grado detectable" significa que el anticuerpo que se une específicamente a un analito de vitamina D de interés (por ejemplo, 3-3pi-25-hidroxivitamina D) tiene una afinidad de unión por una molécula de vitamina D que no sea de interés (por ejemplo, un compuesto que no sea epi-vitamina D) de menos de aproximadamente 104 litros/mol, o menos de aproximadamente 103 litros/mol, o menos de aproximadamente 102 litros/mol, o menos de aproximadamente 10 litros/mol, por ejemplo.

En un ejemplo de acuerdo con los principios descritos en este documento, se emplea un inmunógeno, preparado a partir de un compuesto de fórmula I anterior en el que Z es un portador inmunogénico, para preparar anticuerpos que son específicos para 3-epi-25-hidroxivitamina D3 donde los anticuerpos no se unen en ningún grado detectable con 25-hidroxivitamina D3 ni con otras variantes de vitamina D que incluyen compuestos que no son epi-vitamina D tales como, por ejemplo, 25-hidroxivitamina D; calcidiol; 1,25-dihidroxivitamina D3; 1,25-dihidroxivitamina D4; 1,25-dihidroxivitamina D5; y 1,25-dihidroxivitamina Da, por ejemplo.

En otro ejemplo de acuerdo con los principios descritos en este documento, se emplea un inmunógeno, preparado a partir de un compuesto de fórmula I anterior en el que Z es un portador inmunogénico, para preparar anticuerpos que son específicos para 3-epi-25-hidroxivitamina D2 donde los anticuerpos no se unen en ningún grado detectable con 25-hidroxivitamina D2 ni con otras variantes de vitamina D que incluyen compuestos que no son epi-vitamina D tales como, por ejemplo, 25-hidroxivitamina D; calcidiol; 1,25-dihidroxivitamina D3; 1,25-dihidroxivitamina D4; 1,25-dihidroxivitamina D5; y 1,25-dihidroxivitamina Da, por ejemplo.

En un ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, se emplea un inmunógeno en el que Z en el compuesto de fórmula I es BSA. Este inmunógeno se usa para inmunizar ratones (por ejemplo, ratones BALB/c, ratones Swiss Webster o una cepa de ratones AJ) por vía intraperitoneal. Las muestras de suero de estos ratones se prueban para determinar anticuerpos anti-3-epi-25-hidroxivitamina D3 usando un conjugado de 3-epi-25-hidroxivitamina D3 y ovoalbúmina (conjugado de ovoalbúmina). Se emplea una placa de microtitulación ELISA y se examinan los anticuerpos para determinar su unión al conjugado de ovoalbúmina y posteriormente a la 3-epi-25-hidroxivitamina D3. Los ratones con títulos más altos se refuerzan tres días antes de la fusión. El día de la fusión, se recolectan células de bazo de estos ratones y se fusionan con la línea celular de mieloma P3X63Ag8.653 usando protocolos de fusión asistida por PEG. Después de aproximadamente diez días, los sobrenadantes de hibridomas se criban en busca de anticuerpos anti-3-epi-25-hidroxivitamina D3 usando una placa ELISA. Los clones positivos se expanden adicionalmente, se subclonan y los sobrenadantes se purifican usando una columna de proteína A Sepharose. Las muestras de anticuerpos purificados se analizan mediante ELISA para determinar la unión al conjugado de ovoalbúmina y a la 3-epi-25-hidroxivitamina D3 libre.

Los ejemplos particulares, a modo de ilustración y no de limitación, de anticuerpos preparados como se describió anteriormente que son específicos para 3-epi-25-hidroxivitamina D3 o específicos para 3-epi-25-hidroxivitamina D2, incluyen el anticuerpo 4G8 y el anticuerpo 8F10, por ejemplo.

En algunos ejemplos, se pueden emplear socios de unión tales como, por ejemplo, anticuerpos de acuerdo con los principios descritos en este documento para purificar compuestos de vitamina D. Por ejemplo, anticuerpos tales como los descritos anteriormente se pueden unir a un soporte y el soporte empleado para purificar compuestos de vitamina D. En un ejemplo, los anticuerpos para la 3-epi-25-hidroxivitamina D3 se pueden unir a un sustrato de cromatografía de purificación por afinidad tal como, por ejemplo, una columna, y las preparaciones de vitamina D pueden ponerse en contacto con el sustrato de cromatografía donde el anticuerpo sobre el sustrato se une 3-epi-25-hidroxivitamina D3 de la preparación de vitamina D mientras que otros compuestos de vitamina D se eluyen del sustrato.

Descripción general de los ensayos de vitamina D

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a métodos de determinación de uno o ambos de la presencia y la cantidad de un analito de vitamina D en una muestra que se sospecha que contiene el analito de vitamina D y se puede denominar en este documento como "ensayos de vitamina D".

La expresión "vitamina D" se refiere a uno o más de 25-hidroxivitamina D; calcidiol; 1,25-dihidroxivitamina D2; 1,25-dihidroxivitamina D3; 1,25-dihidroxivitamina D4; 1,25-dihidroxivitamina D5; y 1,25-dihidroxivitamina Da; incluyendo formas epiméricas y metabolitos de todos los anteriores. De este modo, el analito de vitamina D incluye vitamina D y epímeros de vitamina D como se definió anteriormente. Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a métodos de determinación de una o ambas de la presencia y la cantidad de formas epiméricas de vitamina D en una muestra que se sospecha que contiene formas epiméricas de vitamina D (tal como, por ejemplo, 3-epi-25-hidroxivitamina D3 o 3-epi-25-hidroxivitamina D2) y se pueden denominar en este documento "ensayos de epímeros de vitamina D".

En un ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, del método de determinación de un analito de vitamina D, se proporciona una combinación que comprende la muestra, un socio de unión tal como, por ejemplo, un anticuerpo para un epímero de vitamina D producido de acuerdo con los principios descritos en este documento, un socio de unión tal como, por ejemplo, un anticuerpo para el analito de vitamina D y un conjugado que comprende un análogo de vitamina D y un miembro de un sistema productor de señal.

Como se mencionó anteriormente, la muestra y los reactivos se proporcionan "en combinación en el medio". Si bien el orden de adición al medio se puede variar para formar la combinación, habrá ciertas preferencias para algunas realizaciones de los formatos de ensayo descritos en este documento. En un ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, el orden de adición es agregar todos los materiales simultáneamente y determinar el efecto que tiene el medio de ensayo sobre la señal como en un ensayo homogéneo. En otro ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, cada uno de los reactivos, o grupos de reactivos, puede combinarse secuencialmente. En algunas realizaciones, puede estar implicada una etapa de incubación después de cada adición como se discutió anteriormente. En ensayos heterogéneos, las etapas de separación y lavado también se pueden emplear después de una o más etapas de incubación.

La expresión "análogo de vitamina D" se refiere a un compuesto que compite con un analito de vitamina D por un receptor, como un anticuerpo para la vitamina D o un anticuerpo para un epímero de la vitamina D. El análogo de la vitamina D puede ser una vitamina D modificada, donde la modificación proporciona un medio para unir la vitamina D a otra molécula tal como, pero no se limita a, un soporte, un marcador, una molécula pequeña o un socio de unión para una molécula pequeña, por ejemplo. El análogo de vitamina D se puede unir a otra molécula directa o indirectamente por medio de un grupo de unión. El análogo de la vitamina D puede ser, por ejemplo, una molécula relacionada estructuralmente con la vitamina D o la vitamina D conjugada con otra molécula a través de un grupo de unión. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, un análogo de vitamina D puede ser un compuesto de fórmula I en la que Z es una unidad estructural marcadora de poli(aminoácido) o una unidad estructural marcadora de no poli(aminoácido) o en la que Z es un portador inmunogénico, donde dicho compuesto de fórmula I compite con un analito de vitamina D por unirse a un anticuerpo de vitamina D.

La muestra que se va a analizar es una que se sospecha que contiene un analito de vitamina D. Las muestras pueden ser muestras biológicas o muestras no biológicas. Las muestras biológicas pueden ser de un sujeto mamífero o de un sujeto no mamífero. Los sujetos mamíferos pueden ser, por ejemplo, seres humanos u otras especies animales. Las muestras biológicas incluyen fluidos biológicos tales como sangre total, suero, plasma, esputo, fluido linfático, semen, moco vaginal, heces, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, heces, líquido cerebroespinal, lágrimas, moco y similares; tejido biológico tal como pelo, piel, cortes o tejidos extirpados de órganos u otras partes del cuerpo; y así sucesivamente. En muchos casos, la muestra es sangre total, plasma o suero. Las muestras no biológicas que incluyen, pero no se limitan a, corrientes residuales, por ejemplo, también se pueden analizar usando compuestos de acuerdo con los principios descritos en este documento.

La muestra se puede preparar en cualquier medio conveniente, que puede ser, por ejemplo, un medio de ensayo, que se describe con más detalle a continuación. En algunos casos, se puede aplicar un tratamiento previo a la muestra como, por ejemplo, para lisar células sanguíneas. En algunos ejemplos, tal tratamiento previo se realiza en un medio que no interfiere posteriormente con un ensayo.

La combinación en el medio se somete a condiciones para la unión del analito de vitamina D y el análogo de vitamina D al anticuerpo del analito de vitamina D para formar un complejo. La cantidad de complejo se mide cuando la cantidad de complejo está relacionada con una o ambas de la presencia y la cantidad del analito de vitamina D en la muestra.

Se puede realizar un ensayo para un analito de vitamina D ya sea sin separación (homogénea) o con separación (heterogénea) de cualquiera de los componentes o productos del ensayo. Los ensayos heterogéneos normalmente implican una o más etapas de separación y pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos pueden implicar reactivos marcados o no marcados. Los inmunoensayos que implican reactivos no marcados normalmente comprenden la formación de complejos relativamente grandes que implican uno o más anticuerpos preparados a partir de conjugados inmunogénicos de acuerdo con los principios descritos en este documento. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitina y métodos de aglutinación y las correspondientes técnicas de dispersión de luz tales como, por ejemplo, nefelometría y turbidimetría, para la detección de complejos de anticuerpos. Los inmunoensayos marcados incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayos de quimioluminiscencia, inmunoensayos enzimáticos, inmunoensayos de polarización de fluorescencia, radioinmunoensayos, ensayos de inhibición, ensayos de luminiscencia inducida y ensayos de canalización de oxígeno fluorescente, por ejemplo.

Un grupo general de inmunoensayos incluye inmunoensayos que usan una concentración limitada de un compuesto de acuerdo con los principios descritos en este documento. Otro grupo de inmunoensayos implica el uso de un exceso de uno o más de los reactivos principales tal como, por ejemplo, un exceso de un compuesto de acuerdo con los principios descritos en este documento. Otro grupo de inmunoensayos incluye ensayos homogéneos sin separación en los que la señal de un análogo de vitamina D marcado se modula tras la unión del análogo de vitamina D marcado a un anticuerpo producido de acuerdo con los principios descritos en este documento, compitiendo de este modo con un analito de vitamina D que puede estar presente en la muestra.

Como se mencionó anteriormente, los ensayos se pueden realizar sin separación (homogénea) o con separación (heterogénea) de cualquiera de los componentes o productos del ensayo. Los inmunoensayos homogéneos se ejemplifican mediante el ensayo EMIT® (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield, IL) descrito en Rubenstein, et al., Patente de los Estados Unidos No. 3,817,837, columna 3, línea 6 a columna 6, línea 64; métodos de inmunofluorescencia tales como los descritos en Ullman, et al., Patente de los Estados Unidos No. 3,996,345, columna 17, línea 59, a columna 23, línea 25; inmunoensayos de canalización de enzimas ("ECIA") tales como los descritos en Maggio, et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,233,402, columna 6, línea 25 a columna 9, línea 63; el inmunoensayo de polarización de fluorescencia ("FPIA") como se describe, por ejemplo, entre otras, la Patente de los Estados Unidos No. 5,354,693; e inmunoensayos enzimáticos tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ("ELISA"). Son ejemplos de ensayos heterogéneos el radioinmunoensayo, los descritos en Yalow, et al., J. Clin. Invest. 39:1157 (1960). Otros inmunoensayos enzimáticos son el inmunoensayo mediado por modulación enzimática ("EMMIA") analizado por Ngo and Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116:285-288; el inmunoensayo de fluorescencia marcado con sustrato ("SLFIA") descrito por Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904; los inmunoensayos combinados de donantes de enzimas ("CEDIA") descritos por Khanna, et al., Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240; inmunoensayos marcados con partículas homogéneas tales como inmunoensayos de inhibición turbidimétrica potenciada con partículas ("PETINIA"), inmunoensayo turbidimétrico potenciado con partículas ("PETIA"); el formato de ensayo de ensayo inmunológico mediado por dióxido de cromo de afinidad ("ACMiA"), que se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,186,518, 5,147,529, 5,128,103, 5,158,871, 4,661,408, 5,151,348, 5,302,532, 5,422,284, 5,447,870, y 5,434,051.

Otros ensayos incluyen ensayos de marcaje de éster de acridinio tales como los analizados en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,355,803; 6,673,560; 7,097,995 y 7,319,041. Un ejemplo particular de un ensayo de marcaje de éster de acridinio es un inmunoensayo de marcaje de éster de acridinio que usa partículas paramagnéticas como fase sólida (inmunoensayo "ADVIA"). Otros ensayos incluyen el inmunoensayo de partículas de sol ("SPIA"), el inmunoensayo de colorante disperso ("DIA"); el metaloinmunoensayo ("MIA"); los inmunoensayos de membrana enzimática ("EMIA"); y luminoinmunoensayos ("LIA"). Otros tipos de ensayos incluyen ensayos de inmunosensores que implican el seguimiento de los cambios en las propiedades ópticas, acústicas y eléctricas del presente conjugado tras la unión del analito de vitamina D. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunosensores ópticos, ensayos de inmunosensores acústicos, ensayos de inmunosensores de semiconductores, ensayos de inmunosensores de transductores electroquímicos, ensayos de inmunosensores potenciométricos, ensayos de electrodos amperométricos.

Los ensayos heterogéneos normalmente implican una o más etapas de separación y pueden ser competitivos o no competitivos. Una variedad de formatos de ensayo heterogéneos competitivos y no competitivos se describen en Davalian, et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,089,390, columna 14, línea 25 to columna 15, línea 9. En un ejemplo de un ensayo heterogéneo competitivo, un soporte que tiene un anticuerpo para un analito de vitamina D unido al mismo se pone en contacto con un medio que contiene la muestra que se sospecha que contiene el analito de vitamina D y un compuesto marcado de acuerdo con los principios descritos en este documento. El analito de vitamina D en la muestra compite, por unirse al anticuerpo por el analito de vitamina D, con un análogo de vitamina D que lleva un marcado detectable. Después de separar el soporte y el medio, la actividad marcadora del soporte o del medio se determina mediante técnicas convencionales y se relaciona con la cantidad de analito de vitamina D en la muestra. En una variación del ensayo heterogéneo competitivo anterior, el soporte comprende un análogo de vitamina D como reactivo marcado y el anticuerpo de vitamina D comprende un marcador.

En algunos ejemplos, una muestra que se va a analizar se combina en un medio de ensayo con un anticuerpo para el analito de vitamina D y un análogo de vitamina D marcado. El medio se examina en busca de una o ambas de la presencia y cantidad de un complejo que comprende el análogo de vitamina D marcado y el anticuerpo para el analito de vitamina D cuando la presencia y/o la cantidad de dicho complejo indica la presencia y/o cantidad del analito de vitamina D en la muestra.

En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, la muestra que se va a analizar se somete a un tratamiento previo para liberar el analito de vitamina D de sustancias de unión endógenas tales como, por ejemplo, proteínas plasmáticas o séricas que se unen a la vitamina D. La liberación del analito de vitamina D a partir de sustancias de unión endógenas se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la adición de un agente de digestión o un agente de liberación o una combinación de un agente de digestión y un agente de liberación usados secuencialmente. El agente de digestión es aquel que descompone las sustancias aglutinantes endógenas para que ya no puedan unirse a la vitamina D. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, proteinasa K y proteinasa K y agentes desnaturalizantes de proteínas tales como, por ejemplo, detergentes (dodecil sulfato de sodio, por ejemplo). Los agentes de liberación para liberar vitamina D de sustancias aglutinantes endógenas incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, agentes desnaturalizantes ácidos tales como, por ejemplo, ácido salicílico, warfarina, ácidos sulfónicos, ácidos toluenosulfónicos, ácido naftalensulfónico, ácidos anilinonaftalenosulfónicos (ANS) (incluyendo, por ejemplo, ácido 1-anilinonaftalen-8-sulfónico (1,8-ANS) y ácido 8-anilinonaftalen-1-sulfónico (8-ANS)), ácidos salicílicos y derivados y sales de los anteriores.

Las condiciones tales como, por ejemplo, duración, temperatura, pH y concentración del agente de liberación en el medio para llevar a cabo las acciones de digestión o liberación dependen de la naturaleza de las sustancias de unión endógenas, la naturaleza de la muestra, y la naturaleza del agente de liberación, por ejemplo. En general, las condiciones son suficientes para lograr el efecto o función deseados. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, una concentración eficaz de agente de liberación es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20 mg/mL, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 mg/mL, o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/mL, o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg/mL, o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5 mg/mL, o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 mg/mL. El tratamiento previo de la muestra para liberar el analito de vitamina D de las sustancias de unión endógenas se puede llevar a cabo como una etapa separada antes de realizar un ensayo o como una primera etapa en un ensayo. En cualquier caso, se pueden requerir uno o más reactivos para detener la acción del agente de digestión y/o del agente de liberación.

Las condiciones para realizar los ensayos incluyen llevar a cabo el ensayo en un medio regulado acuoso a un pH moderado, generalmente el que proporciona una sensibilidad de ensayo óptima. El medio acuoso puede ser únicamente agua o puede incluir desde 0.1 a aproximadamente 40 por ciento en volumen de un codisolvente. El pH del medio estará en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 11, o en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, o en el intervalo de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9.5, por ejemplo. El pH normalmente será un compromiso entre la unión óptima de los miembros de unión de cualquier par de unión específico, el pH óptimo para otros reactivos del ensayo, tales como los miembros del sistema de producción de señales, y así sucesivamente. Se pueden usar diversas soluciones reguladoras para lograr el pH deseado y mantener el pH durante el ensayo. Las soluciones reguladoras ilustrativas incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, borato, fosfato, carbonato, TRIS, barbital, PIPES, HEPES, MES, Ac Es , MOPS y BICINE, por ejemplo. La solución reguladora particular empleada no es crítica, pero en un ensayo individual se puede preferir una u otra solución reguladora.

Se pueden emplear diversos materiales auxiliares en los métodos de ensayo. Por ejemplo, además de soluciones reguladoras, el medio puede comprender estabilizantes para el medio y para los reactivos empleados. En algunas realizaciones, además de estos aditivos, se pueden incluir proteínas, tales como, por ejemplo, albúminas; disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, formamida; sales de amonio cuaternario; polianiones tales como, por ejemplo, sulfato de dextrano; potenciadores de la unión, por ejemplo, polialquilenglicoles; polisacáridos tales como, por ejemplo, dextrano o trehalosa. El medio también puede comprender agentes para prevenir la formación de coágulos sanguíneos. Tales agentes son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, EDTA, EGTA, citrato, heparina, por ejemplo. El medio también puede comprender uno o más conservantes tales como, pero no se limitan a, azida sódica, sulfato de neomicina, PROCLIN® 300, estreptomicina, por ejemplo. El medio puede comprender adicionalmente uno o más surfactantes. Cualquiera de los materiales anteriores, si se emplea, está presente en una concentración o cantidad suficiente para lograr el efecto o función deseados.

Se pueden aplicar uno o más períodos de incubación al medio a uno o más intervalos que incluyen cualquier intervalo entre adiciones de diversos reactivos empleados en un ensayo, incluidos los mencionados anteriormente. El medio normalmente se incuba a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que se produzca la unión de diversos componentes de los reactivos y la unión de vitamina D en la muestra. Normalmente se emplean temperaturas moderadas para llevar a cabo el método y normalmente temperatura constante, preferiblemente temperatura ambiente, durante el período de la medición. En algunos ejemplos, las temperaturas de incubación oscilan entre aproximadamente 5 °C y aproximadamente 99 °C, o entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 70 °C, o entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 45 °C, por ejemplo. El período de tiempo de incubación, en algunos ejemplos, es de aproximadamente 0.2 segundos a aproximadamente 24 horas, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 6 horas, o de aproximadamente 2 segundos a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 15 minutos, por ejemplo. El período de tiempo depende de la temperatura del medio y la tasa de unión de los diversos reactivos, que está determinada por la constante de tasa de asociación, la concentración, la constante de unión y la constante de tasa de disociación.

En un ejemplo de un método de determinación de un analito de vitamina D en una muestra que se sospecha que contiene el analito de vitamina D, se proporciona una combinación en un medio donde la combinación incluye la muestra, un agente de liberación (si la muestra no ha sido tratada previamente para liberar el analito de vitamina D de las sustancias de unión endógenas), un anticuerpo para la vitamina D y un análogo de vitamina D marcado donde el marcador es un marcador de poli(aminoácido) o un marcador de no poli(aminoácido). El medio se examina en busca de una o ambas de la presencia y cantidad de uno o ambos de un complejo que comprende vitamina D y el anticuerpo para la vitamina D o un complejo que comprende el compuesto marcado y el anticuerpo para la vitamina D. La presencia y/o la cantidad de uno o ambos complejos indica la presencia y/o la cantidad del analito de vitamina D en la muestra.

Algunos ensayos conocidos usan un sistema de producción de señales (sps) que emplea un primer y segundo miembros sps. La designación "primero" y "segundo" es completamente arbitraria y no pretende sugerir ningún orden o clasificación entre los miembros sps o ningún orden de adición de los miembros sps en los métodos presentes. Los miembros de sps pueden estar relacionados porque la activación de un miembro de sps produce un producto tal como, por ejemplo, luz o un producto activado, que da como resultado la activación de otro miembro de sps.

En algunas realizaciones de ensayos, los miembros sps comprenden un sensibilizante tal como, por ejemplo, un fotosensibilizante y una composición quimioluminiscente donde la activación del sensibilizante da como resultado un producto que activa la composición quimioluminiscente. El segundo miembro sps normalmente genera una señal detectable que se relaciona con la cantidad de miembro sps unido y/o no unido, esto es, la cantidad de miembro sps unido o no unido al analito de vitamina D que se detecta o a un compuesto de acuerdo con los principios descritos en este documento. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, uno del reactivo sensibilizante o el reactivo quimioluminiscente comprende el presente reactivo compuesto.

En un ejemplo particular, se puede emplear un inmunoensayo de luminiscencia inducida. El inmunoensayo de luminiscencia inducida se menciona en la Patente de los Estados Unidos No. 5,340,716 (Ullman). En un enfoque, el ensayo usa una partícula que tiene asociado un fotosensibilizante donde un análogo de vitamina D se une a la partícula (reactivo partícula-compuesto). El reactivo quimioluminiscente comprende un anticuerpo para el analito de vitamina D. El analito de vitamina D compite con el reactivo partícula-compuesto por unirse al anticuerpo de la vitamina D. Si el analito de vitamina D está presente, menor es el número de moléculas de reactivo partícula-compuesto que se acercan al reactivo quimioluminiscente. Por lo tanto, habrá una disminución en la señal del ensayo. El fotosensibilizante genera oxígeno singlete y activa el reactivo quimioluminiscente cuando los dos marcadores están muy próximos. Posteriormente, el reactivo quimioluminiscente activado produce luz. La cantidad de luz producida está relacionada con la cantidad de complejo formado, que a su vez está relacionada con la cantidad de analito de vitamina D presente en la muestra.

En otro ejemplo particular de un inmunoensayo de luminiscencia inducida, el ensayo usa una partícula que tiene asociado un compuesto quimioluminiscente donde un análogo de vitamina D se une a la partícula (reactivo partículacompuesto). El reactivo fotosensibilizante comprende un anticuerpo para la vitamina D. El analito de vitamina D compite con el reactivo partícula-compuesto por unirse al anticuerpo de la vitamina D. Si el analito de vitamina D está presente, menor es el número de moléculas de reactivo partícula-compuesto que entran en estrecha proximidad con el reactivo fotosensibilizante. Por lo tanto, habrá una disminución en la señal del ensayo. El fotosensibilizante genera oxígeno singlete y activa el compuesto quimioluminiscente del reactivo partícula-compuesto cuando los dos marcadores están muy próximos. El compuesto quimioluminiscente activado posteriormente produce luz. La cantidad de luz producida está relacionada con la cantidad de complejo formado, que a su vez está relacionada con la cantidad de analito de vitamina D presente en la muestra.

En otro ejemplo particular de un ensayo de luminiscencia inducida, se emplea una partícula fotosensibilizante que se conjuga con un socio de unión para una molécula pequeña como, por ejemplo, avidina o estreptavidina (que son socios de unión para biotina). También se emplea un análogo de vitamina D que comprende biotina (reactivo compuestobiotina). Se emplea un reactivo quimioluminiscente que comprende un anticuerpo para el analito de vitamina D como parte del sistema de detección. El medio de reacción se incuba para permitir que la avidina o estreptavidina de las partículas del fotosensibilizante se una al reactivo compuesto-biotina en virtud de la unión entre avidina y biotina y también para permitir el anticuerpo para el analito de vitamina D que es parte del reactivo quimioluminiscente se una al analito de vitamina D o al análogo de vitamina D que ahora está unido a las partículas fotosensibilizantes. Luego, el medio se irradia con luz para excitar el fotosensibilizante, que es capaz en su estado excitado de activar oxígeno a un estado singlete. Debido a que ahora hay menos reactivo quimioluminiscente en las proximidades del fotosensibilizante debido a la presencia del analito de vitamina D, hay menos activación del reactivo quimioluminiscente por el oxígeno singlete y menos luminiscencia. A continuación, se examina el medio para determinar la presencia y/o la cantidad de luminiscencia o luz emitida, estando relacionada su presencia con la presencia y/o la cantidad del analito de vitamina D donde se observa una disminución de la señal en presencia del analito de vitamina D.

En otro ejemplo particular de un ensayo de luminiscencia inducida, se emplea una partícula fotosensibilizante que se conjuga con un socio de unión para una molécula pequeña tal como, por ejemplo, avidina o estreptavidina (que son socios de unión para biotina). Un reactivo conjugado comprende un anticuerpo para el analito de vitamina D conjugado con biotina. Se emplea un análogo de vitamina D cuando también se emplea el compuesto se une a una partícula quimioluminiscente (reactivo quimioluminiscente-compuesto). El medio de reacción se incuba para permitir que la avidina o estreptavidina de las partículas fotosensibilizantes se una al reactivo anticuerpo-biotina en virtud de la unión entre avidina y biotina y también para permitir que el anticuerpo del analito de vitamina D se una al analito de vitamina D si está presente en la muestra y al análogo de vitamina D que forma parte del reactivo quimioluminiscentecompuesto. Luego, el medio se irradia con luz para excitar el fotosensibilizante, que es capaz en su estado excitado de activar oxígeno a un estado singlete. Debido a que ahora hay menos reactivo quimioluminiscente-compuesto en las proximidades del fotosensibilizante debido a la presencia del analito de vitamina D, hay menos activación del reactivo quimioluminiscente por el oxígeno singlete y menos luminiscencia. A continuación, se examina el medio para determinar la presencia y/o la cantidad de luminiscencia o luz emitida, estando relacionada su presencia con la presencia y/o la cantidad del analito de vitamina D donde se observa una disminución de la señal en presencia del analito de vitamina D.

Otro ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, de un formato de ensayo para la detección de un analito de vitamina D es el formato de ensayo ACMIA. Para el formato de ensayo ACMIA, las partículas de cromo, que se recubren con un análogo de vitamina D (reactivo de partículas de cromo), se emplean como primer componente. Un segundo componente es un anticuerpo para el analito de vitamina D. Este anticuerpo, reticulado a una enzima informadora (por ejemplo, p-galactosidasa) para formar un conjugado anticuerpo-enzima, se agrega a un recipiente de reacción en una cantidad en exceso, esto es, una cantidad mayor que la requerida para unir todo el analito de vitamina D que pueda estar presente en una muestra. Una muestra, que previamente se somete a tratamiento con un agente de liberación, se trata con un anticuerpo para el analito de vitamina D, que se une al analito de vitamina D en la muestra. El conjugado anticuerpo-enzima se mezcla con la muestra en el medio para permitir que el analito de vitamina D se una al anticuerpo. A continuación, se agrega el reactivo de partículas de cromo para unir cualquier exceso de conjugado anticuerpo-enzima. Luego, se aplica un imán, que extrae todas las partículas de cromo y el exceso de anticuerpo-enzima de la suspensión, y el sobrenadante se transfiere a un recipiente de reacción final. El sustrato de la enzima informadora se agrega al recipiente de reacción final y la actividad de la enzima se mide espectrofotométricamente como un cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo. La cantidad de esta señal está relacionada con la cantidad de analito de vitamina D en la muestra.

Otro ejemplo de un ensayo de vitamina D de acuerdo con los principios descritos en este documento es un inmunoensayo marcado con éster de acridinio que usa partículas paramagnéticas como fase sólida (inmunoensayo ADVIA). El sistema de detección empleado para este ejemplo de un ensayo de vitamina D incluye un análogo de vitamina D marcado como molécula pequeña (unidad estructural de captura) como conjugado de molécula pequeña o conjugado de captura, socio de unión para las partículas de látex paramagnético recubiertas de molécula pequeña como fase sólida (SP) y un anticuerpo marcado con éster de acridinio para el analito de vitamina D (anticuerpo de detección). La molécula pequeña puede ser, por ejemplo, biotina o fluoresceína y el respectivo socio de unión puede ser estreptavidina o anticuerpo para fluoresceína. El análogo de vitamina D se puede unir a la molécula pequeña directamente o a través de un grupo de unión tal como, por ejemplo, una proteína, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA). El analito de vitamina D en una muestra de paciente compite con el análogo de vitamina D de la unidad estructural de captura por unirse al anticuerpo anti-vitamina D de detección marcado con éster de acridinio. La muestra sospechosa de contener vitamina D se somete a un tratamiento previo con 1,8-ANS. El ensayo se puede llevar a cabo en un aparato Centaur®, Centaur® XP o Centaur® CP (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante suministradas con el mismo.

Otro ejemplo de un ensayo para un analito de vitamina D de acuerdo con los principios descritos en este documento es un inmunoensayo marcado con éster de acridinio que usa partículas paramagnéticas como fase sólida (inmunoensayo ADVIA). El sistema de detección empleado para este ejemplo de un ensayo de vitamina D incluye un anticuerpo marcado como molécula pequeña para el analito de vitamina D (anticuerpo de captura) como conjugado de biotina o conjugado de captura, partículas de látex paramagnético recubiertas de estreptavidina como fase sólida (SP), y un análogo de vitamina D marcado con éster de acridinio (hapteno de detección). El marcador de éster de acridinio se puede unir directamente al análogo de vitamina D para formar el hapteno de detección o se puede emplear un grupo de unión que incluya, por ejemplo, una proteína tal como, por ejemplo, BSA. El analito de vitamina D en una muestra de paciente compite con el hapteno de detección marcado con éster de acridinio por la unión con el anticuerpo anti-vitamina D. La muestra sospechosa de contener vitamina D se somete a un tratamiento previo con 1,8-ANS. El ensayo se puede llevar a cabo en un aparato Centaur®, Centaur® XP o Centaur® CP (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante suministradas con el mismo. En variaciones de los ensayos de éster de acridinio anteriores, la molécula pequeña puede ser, por ejemplo, biotina o fluoresceína.

La concentración del analito de vitamina D en una muestra que puede ensayarse varía generalmente desde aproximadamente 10-5 a aproximadamente 10-17 M, o desde aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-14 M, por ejemplo. Consideraciones tales como si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo (en relación con la cantidad del analito de vitamina D presente en la muestra), la técnica de detección particular y la concentración esperada del analito de vitamina D normalmente determinan las concentraciones de los diversos reactivos.

Las concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo se determinarán generalmente por el intervalo de concentración de interés del analito de vitamina D, la naturaleza del ensayo y similares. Sin embargo, la concentración final de cada uno de los reactivos normalmente se determina empíricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo en el rango de interés. Es decir, una variación en la concentración de analito de vitamina D que sea importante debería proporcionar una diferencia de señal medible con precisión. Consideraciones tales como la naturaleza del sistema productor de señales y la naturaleza de los analitos determinan normalmente las concentraciones de los diversos reactivos.

Ejemplos de ensayos para epímeros de vitamina D que emplean reactivos de acuerdo con los principios descritos en este documento

Como se mencionó anteriormente, un ejemplo particular de acuerdo con los principios descritos en este documento se dirige a métodos de determinación de uno o ambos de la presencia y la cantidad de epímeros de vitamina D en una muestra sospechosa de contener epímeros de vitamina D. Cualquiera de los formatos de ensayo anteriores se pueden emplear usando un anticuerpo generado contra un inmunógeno que es un compuesto de fórmula I en la que Z es un portador inmunogénico. En algunos ejemplos, el inmunógeno es un compuesto de fórmula IIa (véase, la figura 3). En algunos ejemplos, el inmunógeno es un compuesto de fórmula 11b (véase, la figura 5). En algunos ejemplos, el anticuerpo empleado es el anticuerpo 4G8 o el anticuerpo 8F10. Los anticuerpos producidos a partir de otros inmunógenos consistentes con los principios descritos en este documento se pueden emplear en cualquiera de los formatos de ensayo anteriores.

Un ejemplo de un ensayo para un epímero de vitamina D es un ensayo de luminiscencia inducida para la detección de 3-epi-25-hidroxivitamina D3 en una muestra sospechosa de contener 3-epi-25-hidroxivitamina D3. La muestra se trata con un agente de liberación para liberar 3-epi-25-hidroxivitamina D3 de las unidades estructurales de unión endógenos. Luego, la muestra se combina con un reactivo que comprende el anticuerpo 4G8.2, que es un anticuerpo para 3-epi-25-hidroxivitamina D3, conjugado con biotina (reactivo anticuerpo-biotina) en un medio de reacción, que se incuba para permitir la unión entre el reactivo de biotina del anticuerpo y el analito 3-epi-25-hidroxivitamina D3. Luego, se agrega un reactivo quimioluminiscente donde el reactivo comprende un compuesto de fórmula IIa como un análogo de vitamina D unido a una partícula quimioluminiscente. El reactivo quimioluminiscente se une al exceso de reactivo anticuerpo-biotina, es decir, reactivo anticuerpo-biotina que no se une al analito 3-epi-25-hidroxivitamina D3 en la muestra. Luego, se agrega un reactivo de partículas fotosensibilizantes que se conjuga con una estreptavidina. El medio de reacción se incuba para permitir que la estreptavidina de las partículas fotosensibilizantes se una al reactivo anticuerpo-biotina en virtud de la unión entre estreptavidina y biotina. Luego, el medio se irradia con luz para excitar el fotosensibilizante, que es capaz en su estado excitado de activar oxígeno a un estado singlete. Debido a que ahora hay menos reactivo quimioluminiscente en las proximidades del fotosensibilizante debido a la presencia del analito 3-epi-25-hidroxivitamina D3, hay menos activación del reactivo quimioluminiscente por el oxígeno singlete y menos luminiscencia. Luego se examina el medio para determinar la presencia y/o la cantidad de luminiscencia o luz emitida, estando relacionada su presencia con la presencia y/o cantidad del analito 3-epi-25-hidroxivitamina D3 donde se observa una disminución en la señal en la presencia del analito 3-epi-25-hidroxivitamina D3.

Ejemplos de ensayos para analitos de vitamina D que emplean anticuerpos de acuerdo con los principios descritos en este documento como anticuerpos bloqueadores

Se pueden emplear anticuerpos de acuerdo con los principios descritos en este documento para minimizar o eliminar la reactividad cruzada de 3 epímeros en ensayos para formas no epiméricas de analitos de vitamina D. La sobreestimación del analito de vitamina D no epimérico total causada por la reactividad cruzada de la vitamina D de 3 epímeros con un anticuerpo para el analito de vitamina D puede evitarse sustancialmente empleando, como agentes bloqueantes, anticuerpos preparados contra inmunógenos que son un compuesto de fórmula I en la que Z es un portador inmunogénico.

En un ejemplo de un ensayo para analito de vitamina D no epimérico, el ensayo usa, como reactivo quimioluminiscente, un reactivo de quimioterapia que comprende un colorante olefínico y 25-hidroxivitamina D3 como análogo de vitamina D. Una muestra sospechosa de contener un analito de vitamina D no epimérico se combina en un medio de ensayo con un anticuerpo biotinilado para el analito de vitamina D no epimérico y un segundo anticuerpo que es el anticuerpo 8F10 y luego con el reactivo Chemibead. Las Chemibeads se unen a la fracción de los sitios de unión del anticuerpo monoclonal que no está ocupada por el analito de vitamina D no epimérico de la muestra. El anticuerpo 8F10 se une a la 3-epi-25-hidroxivitamina D3 que está presente en la muestra y que interfiere en la determinación por reacción cruzada con el anticuerpo biotinilado. Posteriormente, se agregan a la mezcla de reacción microesferas sensibilizantes acopladas a estreptavidina que comprenden un fotosensibilizante (Sensibeads). Esto conduce a la formación de pares de aditivos químicos/aditivos cuya concentración está inversamente relacionada con una concentración de analito de vitamina D no epimérico en la muestra. Tras la iluminación a 680 nm, las microesferas sensibilizantes generan oxígeno singlete que se difunde en las Chemibeads, que se emparejan con Sensibeads, reacciona con el colorante olefínico en el quimioluminiscente y desencadena una señal quimioluminiscente a aproximadamente 612 nm que está inversamente relacionada con la concentración del analito de vitamina D no epimérico.

Ejemplos de ensayos para analitos de vitamina D que emplean un compuesto marcado de acuerdo con los principios descritos en este documento

Los ensayos para analitos de vitamina D se pueden llevar a cabo usando un compuesto de fórmula I en la que Z es un marcador de poli(aminoácido), o un marcador no poli(aminoácido) o un soporte.

En un ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, de un ensayo para la detección de analito de vitamina D, se emplea un formato de ensayo ACMIA. Las partículas de cromo, que están recubiertas con un análogo de vitamina D que es un compuesto de fórmula I en la que Z es un marcador no poli(aminoácido) que es la partícula de cromo (reactivo de partículas de cromo), se emplean como primer componente. Un segundo componente es un anticuerpo para el analito de vitamina D. Este anticuerpo, reticulado a una enzima informadora (por ejemplo, p-galactosidasa) para formar un conjugado anticuerpo-enzima, se agrega a un recipiente de reacción en una cantidad en exceso, esto es, una cantidad mayor que la requerida para unir todo el analito de vitamina D que pueda estar presente en una muestra. Una muestra, que previamente se somete a tratamiento con un agente de liberación, se trata con un anticuerpo para la vitamina D, que se une al analito de vitamina D en la muestra. El conjugado anticuerpo-enzima se mezcla con la muestra en el medio para permitir que el analito de vitamina D se una al anticuerpo. A continuación, se agrega el reactivo de partículas de cromo para unir cualquier exceso de conjugado anticuerpo-enzima. Luego, se aplica un imán, que extrae todas las partículas de cromo y el exceso de anticuerpo-enzima de la suspensión, y el sobrenadante se transfiere a un recipiente de reacción final. El sustrato de la enzima informadora se agrega al recipiente de reacción final y la actividad de la enzima se mide espectrofotométricamente como un cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo. La cantidad de esta señal está relacionada con la cantidad de analito de vitamina D en la muestra.

En el ejemplo anterior, se puede emplear un anticuerpo de acuerdo con los principios descritos en este documento para bloquear la unión de 3-epi-25-hidroxivitamina D3, que puede estar presente en la muestra, al anticuerpo para el analito de vitamina D. El anticuerpo anti-3-epi-25-hidroxivitamina D3 puede ser un anticuerpo producido contra un inmunógeno que es un compuesto de fórmula I en la que Z es un portador inmunogénico.

Etapa de examen

En una siguiente etapa de un método de ensayo, se examina el medio para detectar la presencia de un complejo que comprende el analito de vitamina D y el anticuerpo para el analito de vitamina D y/o un complejo que comprende un análogo de vitamina D y un anticuerpo para la vitamina D. La presencia y/o cantidad de uno o ambos complejos indica la presencia y/o cantidad del analito de vitamina D en la muestra.

La expresión "medir la cantidad de un analito de vitamina D" se refiere a la determinación cuantitativa, semicuantitativa y cualitativa de vitamina D. Métodos que son cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, así como todos los demás métodos de determinación del analito de vitamina D, se consideran métodos de medición de la cantidad de analito de vitamina D. Por ejemplo, un método, que simplemente detecta la presencia o ausencia del analito de vitamina D en una muestra sospechosa de contener el analito de vitamina D, se considera incluido dentro del alcance de la presente invención. Los términos "detectar" y "determinar", así como otros sinónimos comunes para medir, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.

En muchas realizaciones, el examen del medio implica la detección de una señal del medio. La presencia y/o cantidad de señal está relacionada con la presencia y/o cantidad del analito de vitamina D en la muestra. El modo particular de detección depende de la naturaleza del sistema de producción de señales. Como se discutió anteriormente, existen numerosos métodos mediante los cuales un marcador de una señal que produce una señal puede producir una señal detectable por medios externos. La activación de un sistema de producción de señales depende de la naturaleza de los miembros del sistema de producción de señales.

Las temperaturas durante las mediciones oscilan generalmente desde aproximadamente 10 °C a aproximadamente 70 °C o desde aproximadamente 20 °C a aproximadamente 45 °C, o aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C, por ejemplo. En un enfoque, las curvas estándar se forman usando concentraciones conocidas de analito de vitamina D. También se pueden usar calibradores y otros controles.

La luminiscencia o luz producida a partir de cualquier marcador se puede medir visual, fotográfica, actinométrica, espectrofotométrica, tal como usando un fotomultiplicador o un fotodiodo, o por cualquier otro medio conveniente para determinar la cantidad de la misma, que está relacionada con la cantidad analito de vitamina D en el medio. El examen de la presencia y/o cantidad de la señal también incluye la detección de la señal, que generalmente es simplemente una etapa en la que se lee la señal. La señal normalmente se lee usando un instrumento, cuya naturaleza depende de la naturaleza de la señal. El instrumento puede ser, pero no se limita a, un espectrofotómetro, fluorómetro, espectrómetro de absorción, luminómetro y quimioluminómetro, por ejemplo.

Kits que comprenden reactivos para la realización de ensayos

Los kits que comprenden reactivos para realizar ensayos se pueden formular en base a la naturaleza de un ensayo particular. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, un kit puede comprender un socio de unión tal como, por ejemplo, un anticuerpo generado contra un inmunógeno que es un compuesto de fórmula I en la que Z es un portador inmunogénico. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, un kit puede comprender un reactivo que es un compuesto de fórmula I en la que Z es una unidad estructural marcadora de poli(aminoácido) o una unidad estructural marcadora de no poli(aminoácido) que incluye un soporte. Un kit también puede incluir otros reactivos para realizar un ensayo particular para un analito de vitamina D. En algunas realizaciones, un kit comprende en combinación empaquetada un socio de unión a la biotina tal como, por ejemplo, avidina o estreptavidina, asociado con una partícula, compuesto biotinilado de fórmula I y un anticuerpo marcado para el analito de vitamina D. El kit puede incluir además otros reactivos para realizar el ensayo, cuya naturaleza depende del formato de ensayo particular.

Los reactivos pueden estar cada uno en recipientes separados o se pueden combinar diversos reactivos en uno o más recipientes dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos. El kit puede incluir además otros reactivos empaquetados por separado para realizar un ensayo, tales como miembros de pares de unión específicos adicionales, miembros del sistema de producción de señales y reactivos auxiliares, por ejemplo.

Las cantidades relativas de los diversos reactivos en los kits se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones de los reactivos que optimicen sustancialmente las reacciones que deben producirse durante los presentes métodos y optimicen además sustancialmente la sensibilidad de un ensayo. En circunstancias apropiadas, uno o más de los reactivos en el kit se pueden proporcionar como un polvo seco, normalmente liofilizado, incluidos los excipientes, que al disolverse proporcionarán una solución de reactivo que tenga las concentraciones adecuadas para realizar un método o ensayo usando un reactivo compuesto de acuerdo con los principios descritos en este documento. El kit puede incluir además una descripción escrita de un método que usa los reactivos que incluyen un reactivo compuesto de acuerdo con los principios descritos en este documento.

Composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de acuerdo con los principios descritos en este documento

Los ejemplos de compuestos y anticuerpos de acuerdo con los principios descritos en este documento pueden tener actividad terapéutica. Estos compuestos se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz, que es una cantidad para proporcionar el tratamiento de un estado de enfermedad particular asociado con la vitamina D. La administración de los ejemplos de compuestos de acuerdo con los principios descritos en este documento puede realizarse mediante cualquiera de los modos aceptados de administración para agentes que tienen utilidades similares. Los compuestos se pueden usar tanto de forma profiláctica como terapéutica.

La cantidad de compuesto administrado depende de uno o más del sujeto y del estado de enfermedad que se esté tratando, la gravedad de la aflicción, la manera y el programa de administración (por ejemplo, administración oral) y el criterio del médico que prescribe.

Al emplear los compuestos de esta invención para el tratamiento de las afecciones anteriores, se puede usar cualquier modo de administración farmacéuticamente aceptable. Los compuestos de acuerdo con los principios descritos en este documento se pueden administrar solos o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables, que incluyen, pero no se limitan a, formas farmacéuticas sólidas, semisólidas, líquidas o en aerosol, tales como, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, polvos, líquidos, inyectables, suspensiones, supositorios y aerosoles, por ejemplo. Los compuestos también se pueden administrar en formas de dosificación de liberación sostenida o controlada, que incluyen inyecciones de depósito, bombas osmóticas, píldoras y parches transdérmicos (incluido el electrotransporte), por ejemplo, para la administración prolongada del compuesto a una velocidad predeterminada, preferiblemente en formas de dosificación unitarias apropiadas para la administración única de dosis precisas. Las composiciones farmacéuticas incluyen uno o más portadores o excipientes farmacéuticos convencionales y un compuesto de acuerdo con los principios descritos en este documento. Además, estas composiciones pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores y adyuvantes, por ejemplo.

Dependiendo del modo de administración pretendido, una composición farmacéuticamente aceptable contendrá aproximadamente 0.1 % a aproximadamente un 90 % en peso de un compuesto de acuerdo con los principios descritos en este documento, siendo el resto excipientes y portadores farmacéuticos apropiados, por ejemplo.

Un modo de administración para las afecciones detalladas anteriormente es oral, usando un régimen de dosificación diario conveniente, que se puede ajustar según el grado de aflicción. Para tal administración oral, se forma una composición farmacéuticamente aceptable mediante la incorporación de cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, povidona, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, croscarmelosa sódica, glucosa, gelatina, sacarosa y carbonato de magnesio, por ejemplo, y combinaciones de dos o más de los mismos. Tales composiciones pueden ser soluciones, suspensiones, comprimidos, comprimidos dispersables, píldoras, cápsulas, polvos o formulaciones de liberación sostenida, por ejemplo.

En un enfoque a modo de ilustración y no de limitación, una composición puede estar en forma de píldora o comprimido y puede contener, junto con un compuesto de acuerdo con los principios descritos en este documento, un diluyente tal como lactosa, sacarosa, o fosfato dicálcico, por ejemplo, o una combinación de dos o más de los mismos; un lubricante tal como estearato de magnesio, por ejemplo; un desintegrante tal como croscarmelosa sódica, por ejemplo; y un aglutinante tal como almidón, goma arábiga, polivinilpirrolidina, gelatina, celulosa y derivados de los mismos, por ejemplo.

La administración parenteral se caracteriza generalmente por inyección, ya sea por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas apropiadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los excipientes apropiados incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, dextrosa, glicerol y etanol, por ejemplo. Además, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH y potenciadores de la solubilidad, por ejemplo, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, polioxietileno, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas.

En un ejemplo de acuerdo con los principios descritos en este documento, una composición farmacéutica comprende un compuesto de fórmula:

en la que

W es N-O-(CH2)n"C(O)-Z",

n" es un número entero desde 1 a 10,

R11"es H, alquilo o acilo, y

Z" es OR8 en el que R8 es H, alquilo o NR9R10 en el que R9 y R10 son independientemente H o alquilo.

La expresión "al menos" como se usa en este documento significa que el número de elementos especificados puede ser igual o mayor que el número mencionado. La expresión "aproximadamente" como se usa en este documento significa que el número citado puede diferir en más o menos un 10 %; por ejemplo, "aproximadamente 5" significa un intervalo de 4.5 a 5.5.

La siguiente discusión está dirigida a ejemplos específicos de acuerdo con los principios descritos en este documento a modo de ilustración y no de limitación; los ejemplos específicos no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación y las reivindicaciones adjuntas. Pueden idearse numerosas modificaciones y composiciones, métodos y sistemas alternativos sin apartarse del espíritu y alcance de la presente divulgación.

Ejemplos

A menos que se indique lo contrario, los materiales de los experimentos siguientes pueden adquirirse de Sigma-Aldrich Chemical Corporation (St. Louis MO), Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI), o Steraloids Inc. (Wilton NH). Las partes y porcentajes descritos en este documento son en peso a volumen a menos que se indique lo contrario Definiciones:

mg = miligramo

g = gramo (s)

ng = nanogramo (s)

mL = mililitro (s)

|iL = microlitro (s)

mmol = micromolar

°C = grados centígrados

min = minuto (s)

sec = segundo (s)

h = hora (s)

p/v = peso a volumen

TLC = cromatografía en capa fina

HPLC = cromatografía líquida de alta resolución

EDA = etilendiamina

EtOAc = acetato de etilo

DMF = dimetilformamida

DMSO = dimetilsulfóxido

MeOP = 1-metoxi-2-propanol

MES = ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico

CMO = carboximetoxioxima

TMB = tetrametilbencidina

SNHS = sulfo-N-hidroxisuccinimida

Solución reguladora de lavado de pH alto = Na3PO45.5 mM Na2CO34.4 mM, pH 11

Solución reguladora de lavado Hapten = HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, TRITON® X405 al 0.1 %, conservante PROCLIN® al 0.15 % y 1 mg/ml de neomicina DI = desionizada

ELISA = ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

UPA = Ultra analizador de partículas

LOCI = inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente

BSA = albúmina de suero bovino

BGG = gammaglobulina bovina

mIgG = inmunoglobulina de ratón

MS = espectrometría de masas

Ejemplo 1

Preparación de los compuestos de la figura2 donde R11 es acetilo

Se hizo reaccionar acetato de 5-androsten-3a-ol-17-ona (VIII) (100 mg) con etilenglicol (0.245 ml) y ácido ptoluenosulfónico monohidrato (4 mg) en benceno a reflujo durante la noche para dar 5-androsten-3a-ol-17-ona acetato etilen cetal (IX) (112 mg). El etilen cetal IX (112 mg) se sometió a bromación con N-bromosuccinimida (69 mg)/azoisobutironitrilo (3.3 mg) en hexano (13 ml) a reflujo durante 30 minutos para dar el compuesto X, seguido de deshidrobromación con fluoruro de tetrabutilamonio (1 M en THF), 1.6 ml) en THF (7.3 ml) a temperatura ambiente durante 2 horas para dar androsta-5,7-dien-3a-ol-17-ona acetato etilen cetal (XI) (55 mg). Se hizo reaccionar androsta-5,7-dien-3a-ol-17-ona acetato etilen cetal (XI) (55 mg) con hidróxido de sodio 1 N (2 mL) en metanol (10 ml) a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 horas para dar androsta-5,7-dien-3a-ol-17-ona etilen cetal (XII) (48 mg). Se hizo reaccionar androsta-5,7-dien-3a-ol-17-ona etilen cetal (XII) (48 mg) con ácido p-toluenosulfónico monohidrato (35 mg) en una mezcla de acetona (5 mL) y agua (0.2 mL) a temperatura ambiente durante la noche para dar androsta-5,7-dien-3a-ol-17-ona (XIII) (43.4 mg). Se irradió androsta-5,7-dien-3a-ol-17-ona (XIII) (43.4 mg) con una lámpara de mercurio de 450 W con un filtro VYCOR® (Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ) en éter (1100 ml) de -20 a 0 °C, durante 5 minutos para dar pre-HMCHEMOIO, que se calentó a reflujo en etanol (15 ml) durante 3 horas para producir HMCHEMOIO (VII) (13.5 mg).

El HMCHEMOIO (VII) (13.5 mg) anterior se hizo reaccionar con hemihidrocloruro de O-(carboximetil) hidroxilamina (12 mg) y acetato de sodio (24 mg) en 1 ml de metanol durante la noche a temperatura ambiente para dar HMCHEMOIOCMO (13.2 mg).) (compuesto de fórmula XX en la figura 3 donde n = 1).

Se preparó BSA cationizada de la siguiente manera: se agregó trietilentetraamina (0.5 mL) (compuesto de fórmula XXI en la figura 3 donde cada r = 1 y s = 1) a 4.5 ml de solución reguladora MES 50 mM pH 6, y el pH fue ajustado a 6 seguido de la adición de 20 mg de BSA. La combinación se mezcló para disolver completamente los componentes. Se agregó EDAC (5 mg) a la solución anterior cada hora durante 5 horas. La solución se lavó en una celda AMICON® de 10 mL (Amicon Inc., Beverly MA) con 10 x 10 mL de solución reguladora de lavado (fosfato 10 mM NaCl 300 nM) a pH 7. Luego, se agregaron 100 mg de TWEEN®20 a un matraz de fondo redondo de 50 mL. Se agregó solución reguladora de lavado (50 mL) y la mezcla se agitó durante 10 min para dispersar Tween 20. El BSA cationizado (compuesto de fórmula XXIa en la figura 3, donde cada r = 1 y s = 2) se almacenó en solución reguladora de lavado con TWEEN® 20 de 0.2 % a aproximadamente 5 mg/mL.

Para la preparación de HMCHEMOIO-CMO BSA (compuesto de fórmula IIa en la figura 3), se colocaron EDAC (25 mg) y 10 mg de NHS en un matraz de 10 ml con 13.2 mg de HMCHEMOIO-CMO (XX) preparado como se describe anteriormente. Se agregó DMF (0.5 ml) al matraz. La mezcla se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente para dar HMCHEMOIOCMO activado. La solución fue clara. La TLC (acetato de etilo:metanol 1:1) indicó que no quedaba material de partida.

Se agregó gota a gota el HMCHEMOIO-CMO activado del anterior a la solución de BSA cationizada del anterior y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se transfirió a una celda AMICON® (Amicon Inc., Beverly MA) y luego se lavó con 5 x 10 ml de solución reguladora de lavado y se concentró (corte de 30,000) hasta aproximadamente 4 mL. La mezcla se separó adicionalmente en una columna SD-25 (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburg PA) usando solución reguladora de lavado pH 7.0 como eluyente para dar una mezcla de compuestos HMCHEMOIO-CMO BSA (mezcla como se discutió anteriormente con respecto a compuestos de la fórmula IIa en la figura 3).

Ejemplo 2

Preparación de anticuerpos

Se inmunizó la cepa AJ de ratones (hembras, al menos ocho semanas de edad) para generar anticuerpos monoclonales. La primera inmunización fue 100 |ig de inmunógeno (HMCHEMOIO-CMO BSA) de arriba en un volumen de 100 |iL con adyuvante de Freund completo (de Sigma-Aldrich, Cat # F5881). Tres semanas después, se administró una inmunización de refuerzo con el mismo inmunógeno con 100 |ig en un volumen de 100 |iL con adyuvante de Freund incompleto (de Sigma-Aldrich Cat # F5506). Posteriormente, después de otras 3 semanas, se administró una segunda inmunización de refuerzo con el mismo inmunógeno con 100 |ig en un volumen de 100 |iL con adyuvante de Freud incompleto. Una semana después de la última inmunización de refuerzo, se extrajo sangre de los ratones y se ensayaron antisueros en ELISA para detectar anticuerpos anti-3-epímero. Posteriormente, se administró un refuerzo de prefusión durante tres días consecutivos antes de la fusión con el mismo inmunógeno (20 |ig en un volumen de 50 |iL en PBS sin ningún adyuvante. Al cuarto día, se sacrificaron los ratones y se realizó la esplenectomía. Se extrajeron las células del bazo y la fusión se realizó mediante métodos estándar usando una línea celular de mieloma murino no secretora denominada P3-X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580™). La clonación se realizó mediante métodos estándar.

Los clones se cribaron mediante ELISA de unión e inhibición. El siguiente procedimiento de inmunoensayo ELISA de unión según el siguiente protocolo. Las placas se recubrieron con 3-epímero conjugado con ovoalbúmina preparada de una manera similar a la descrita anteriormente para el conjugado de BSA a 1 |ig/mL en PBS a 50 |iL por pocillo. El recubrimiento de la placa se realizó durante 1 hora o más a temperatura ambiente. Después, las placas se secaron y bloquearon con 200 |iL por pocillo de diluyente de solución reguladora de bloqueo (solución de caseína al 0.5 % en PBS que contenía Tween® 20 al 0.05 %). El bloqueo de la placa se realizó durante 1 hora o durante la noche a 2 °C-8 °C. A continuación, las placas se lavaron tres veces y se secaron. A continuación, se agregó el anticuerpo monoclonal que se va a cribar a cada pocillo de la siguiente manera: 25 |iL de PBS mezclado con 25 |iL de sobrenadante de cultivo transferidos desde el pocillo correspondiente en la placa de crecimiento de fusión. La incubación fue durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación de la placa. La placa se lavó usando un lavador de placas (BioTek, Winooski VT) con un apilador de placas, siendo la solución reguladora de lavado agua MILLI-Q® (Millipore Corporation, Billerica, MA) que contenía Tween® 20 al 0.05 %. Se agregó un conjugado enzimático (IgG anti-ratón de cabra acoplado a HRP diluido en diluyente de solución reguladora de bloqueo a 1:3000 a 50 |iL por pocillo. La incubación se realizó durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó y una solución cromogénica Se añadió TMB de Moss Substrates, Pasadena MD) a un volumen de 100 ml por pocillo durante diez minutos a temperatura ambiente. Las placas se leyeron a 650 nm usando un lector de placas ELISA. La incubación se realizó durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación. A continuación, la placa se lavó y una solución cromogénica (TMB de Moss Substrates, Pasadena MD) se agregó a un volumen de 100 |iL por pocillo durante diez minutos a temperatura ambiente. Las placas se leyeron a 650 nm usando un lector de placas ELISA.

En base a la técnica de cribado anterior, se seleccionaron hibridomas que producían anticuerpos monoclonales apropiados. Uno de tales anticuerpos monoclonales se denominó anticuerpo 8F10 y es un anticuerpo IgG2a kappa. Otro anticuerpo monoclonal de este tipo se denominó anticuerpo 4G8 y es un anticuerpo kappa IgG2a.

Adicionalmente, los clones también se cribaron usando un procedimiento de ELISA de inhibición de acuerdo con el siguiente protocolo. Las placas se recubrieron con 3-epímeros conjugados con ovoalbúmina a 1 |ig/mL en solución salina regulada con fosfato a 50 |iL por pocillo. El recubrimiento de la placa se realizó durante 1 hora o más a temperatura ambiente o durante la noche a aproximadamente 2 °C a 8 °C. A continuación, las placas se secaron y bloquearon con 200 |iL por pocillo de diluyente de solución reguladora de bloqueo (solución de caseína al 0.5 % en PBS que contenía TWEEn® 20 al 0.05 %). El bloqueo de la placa se realizó mediante incubación durante 30 minutos o más a temperatura ambiente con agitación de la placa. Se lavaron las placas. A continuación, se agregó el anticuerpo monoclonal que se va a cribar a cada pocillo junto con 3-epímeros libres de la siguiente manera: se transfirieron 25 |iL por pocillo de sobrenadante de cultivo desde el pocillo correspondiente en la placa de crecimiento de fusión y se agregaron 25 |iL de 2 |ig/mL de 3-epímeros - 25OH Vitamina D3. La incubación fue durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación de la placa. La placa se lavó usando un lavador de placas (BioTek, Winooski VT) con apilador de placas, siendo la solución reguladora de lavado agua MILLI-Q® (Millipore Corporation, Billerica, MA) que contenía TWEEN® 20 al 0.05 %. Se agregó un conjugado enzimático (IgG anti-ratón de cabra acoplado a HRP diluido en diluyente de solución reguladora de bloqueo a 1:3000 a 50 |iL por pocillo. La incubación se realizó durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación. A continuación, la placa se lavó y se agregó una solución cromogénica (TMB de Moss Substrates, Pasadena MD) en un volumen de 100 |iL por pocillo. Si un anticuerpo deseado estaba presente en el sobrenadante del hibridoma, luego se observó una disminución en la densidad óptica en comparación con el pocillo que no contenía 3-epímeros libres. Se usó 25OH vitamina D3 en lugar de 25OH Vitamina D3 libre de 3-epímero como control para controlar la especificidad de los anticuerpos. Se seleccionaron los anticuerpos que se unen al 3-epímero y no se unen a 25OH vitamina D3.

Generación de anticuerpos policlonales: Se inmunizaron conejos con 500 ^g/dosis de HMCHEMOIO-CMO BSA preparado como se describió anteriormente. Se realizaron una inmunización primaria y cinco de refuerzo con dos semanas de diferencia y se recogieron dos sangrados de prueba y un sangrado de producción y se probaron antisueros en ELISA como se describió anteriormente.

Ejemplo 3

Inmunoensayo para la 25OH vitamina D

Procedimiento de inmunoensayo

El formato de inmunoensayo de 25OH Vitamina D (25(OH)D) empleado fue un inmunoensayo quimioluminiscente competitivo homogéneo en base a la tecnología de ensayo LOCI@. El ensayo se realizó en el sistema químico clínico integrado automatizado Siemens Dimension® EXL (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield, IL). El ensayo midió la concentración total de 25(OH)D2 y/o 25(OH)D3 en muestras de suero y plasma. Los reactivos del ensayo LOCI@ incluían un reactivo de liberación, dos reactivos de microesferas sintéticas y un reactivo de anticuerpo de anti-25OH vitamina D monoclonal biotinilado. El primer reactivo de microesferas (denominado "Sensibeads") se recubrió con estreptavidina y contenía un colorante fotosensible. El segundo reactivo de microesferas (denominado "Chemibeads") se recubrió con un análogo de 25(OH)D3 y contenía colorante quimioluminiscente. La muestra se incubó con el reactivo de liberación para liberar moléculas de 25(OH)D que incluyen compuestos 3-epiméricos de proteínas de unión a vitamina D. Después, la mezcla de reacción se incubó con anticuerpo biotinilado para formar un complejo de 25(OH)D-anticuerpo biotinilado. Debido a que el anticuerpo biotinilado (un anticuerpo monoclonal de oveja) reaccionó de forma cruzada con 3-epi-25(OH)D, se agregaron 100 |ig/mL de anticuerpo anti-3-epímero-VD 8F10.1 para minimizar la señal de ensayo proveniente de los compuestos de 3-epímero vitamina D. Se agregaron Chemibeads para unir el exceso de anticuerpo biotinilado libre. A continuación, se agregaron Sensibeads para unirse a la porción de biotina del anticuerpo biotinilado. Como resultado se formaron agregados de Chemibeadanálogo/anticuerpo-biotina/estreptavidina-Sensibeads. La iluminación de la mezcla de reacción con luz a 680 nm genera oxígeno singlete de Sensibeads, que se difundió en los Chemibeads y desencadenó una reacción quimioluminiscente. La señal quimioluminiscente resultante se midió a 612 nm y es inversamente proporcional a la concentración de 25(OH)D total en la muestra.

Preparación de reactivos para inmunoensayo

Síntesis de 25(OH)D3 Chemibeads - Las 25(OH)D3 Chemibeads se sintetizaron acoplando EPRM-EDA con 25(OH)D3 carbamato. Los materiales empleados fueron microesferas de EPRM-EDA, 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida (EDAC) Fluka Sulfo-N-hidroxisuccinimida (SNHS), 25(OH)D3-3-Carbamato, solución del surfactante GAFAC® al 16 %, DMSO anhidro, solución reguladora Me s pH 6 50 mM que contiene 10 % de MeOP y 1 % de surfactante GAFAC®.

Preparación de microesferas de EPRM-EDA: se agregan microesferas de EPRM (2000 mg, 20.0 mL) a un vial de 40 mL. Las microesferas de EPRM se preparan mediante un procedimiento similar al descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 7,179,660 y el compuesto quimioluminiscente es 2-(4-(N, N, di-tetradecil)-anilino-3-feniltioxeno con quelato de europio. EDA (800 mg, 890 |iL) se combina con 10 mL de solución reguladora MES pH 6 (la "Solución reguladora") y aproximadamente 4.2 mL de HCl 6 N. El pH de la mezcla es, o se ajusta para que sea, aproximadamente 6.9. La solución de EDA se agrega a las microesferas de EPRM con agitación en vórtex y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se combina cianoborohidruro de sodio (400 mg) en un vial de 15 m con 10 m de agua DI y la combinación se agrega a la mezcla de microesferas de arriba. La mezcla se agita a 37 °C, durante 18-20 horas. Las microesferas se transfieren a seis tubos de centrífuga de 40 mL. Se agrega solución reguladora MES para llevar el volumen a 35 mL y la mezcla se centrifuga a 19,000 rpm durante 30 min. El sobrenadante se decanta y las microesferas se vuelven a suspender en 2 mL de solución reguladora con una varilla de agitación y se agrega solución reguladora adicional a 35 mL. La mezcla se somete a ultrasonidos a una potencia de 18 vatios durante 30 segundos, usando hielo para mantener la mezcla fría. La etapa de lavado/sonicación se realiza 4 veces para eliminar todo el reactivo químico de activación. Después de la última centrifugación de solución reguladora MES, se agregan 2 mL de solución reguladora que contiene MeOP al 5 % y Tween® 20 al 0.1 % (la "Segundo solución reguladora") a los tubos para la etapa de volver a suspender. Se agrega una segunda solución reguladora adicional a 35 mL antes de la sonicación. La suspensión de microesferas se centrifuga a 19,000 rpm durante 30 min. Se descarta el sobrenadante. La sonicación final usó 12 ml de la segunda solución reguladora en cada tubo para dar una dilución de 25 mg/mL. El tamaño de partícula es 277 nm según se determina en un instrumento de UPA.

La Chemibead de EPRM se prepara de una manera similar al método descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 6,153,442 y la Publicación de Solicitud de Patente No. 20050118727A. La Chemibead de EPRM comprende una capa interna de aminodextrano y una capa externa de aldehído dextrano que tiene funcionalidades de aldehído libre. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,929,049, 7,179,660 y 7,172,906.

La reacción se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 40 °C, durante un período de aproximadamente 16 a aproximadamente 64 horas a un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 6, en un medio acuoso regulado empleando una solución reguladora apropiada tal como, por ejemplo, MES. La reacción se apaga mediante la adición de un agente de extinción apropiado tal como, por ejemplo, hemihidrocloruro de carboximetoxiamina (CMO) y el posterior lavado de las partículas.

Los grupos aldehido de la capa exterior de dextrano aldehido se hacen reaccionar con etilendiamina en condiciones de aminación reductora para formar el reactivo EPRM-EDA que tiene unidades estructurales colgantes que comprenden una cadena de etileno y un grupo amina terminal. Las condiciones de aminación reductora incluyen el uso de un agente reductor tal como, por ejemplo, un hidruro metálico. La reacción se lleva a cabo en un medio acuoso a una temperatura durante la reacción de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 100 °C, durante un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas.

Síntesis de 25(OH)D3-3-carbamato (25(OH)D3-3-carbamato) - una mezcla de 22 mg (55 |imol) de 25(OH)D3 comprada en ChemReagents.com, Sugarland TX, 100 mg (420 |imol) de carbonato de disuccinimidilo (DSC), 100 |iL de trietilamina en 1 mL de acetonitrilo anhidro, se agitó en un matraz de 5 mL (cubierto con papel de aluminio) a temperatura ambiente durante 18 h bajo nitrógeno para preparar 25(OH)D3 activado. La TLC (EtOAc:Hexano = 2:1) mostró que no quedaba material de partida. Se preparó una suspensión agregando 150 mg de hemihidrocloruro de carboximetoxilamina (CMO), 0.3 ml de trietilamina y 1 ml de DMF a un matraz de 10 ml. Se agregó gota a gota una solución que contenía 25(OH)D3 activado a la suspensión de CMO con agitación, que se continuó durante otras 18 horas. Se aplicó vacío para eliminar los disolventes tanto como fuera posible (manteniendo la temperatura del baño de calentamiento por debajo de 50 °C). Se agregó EtOAc (25 ml) al residuo, que se lavó tres veces con 2 ml de salmuera. La fase orgánica se secó con Na2SO4 anhidro y se filtró; El disolvente se eliminó usando un rotavapor. Se obtuvo producto en bruto (42 mg) después de secar y se purificó por HPLC. Se obtuvo producto puro (24 mg) después de secar a alto vacío. El producto se disolvió en 1.2 ml de DMSO anhidro. Las alícuotas se transfirieron a viales, que se mantuvieron a -70 °C.

Acoplamiento de EPRM-EDA con el hapteno 25(OH)D3-Carbamato: se agregaron 1.2 mg de hapteno a un vial de 2 mL. Se agregaron 11.2 mg de EDAC y 15.5 mg de SNHS más 3.73 ml de DMSO seco a un vial de 5 ml. La solución de EDAC/SNHS se giró para disolver el contenido. Se agregaron 1.14 mL de solución de EDAC/SNHS al vial que contenía el hapteno. La mezcla se hizo girar durante 22 horas. EPRM-EDA (200 mg) se lavó una vez con solución reguladora de lavado de pH alto y luego con solución reguladora MES pH 6. A un vial de 5 ml se le agregaron 1.08 mL (100 mg) de solución reguladora de lavado seguido de 143 mL de surfactante GAFAC® al 1.6 %. A un pequeño tubo de prueba se le agregó 256 DMSO seco seguido de 49 |iL de EDAC/SNHS/hapteno. La solución de DMSO/hapteno se agregó gota a gota a la mezcla de microesferas (sometida a agitación durante la adición). La mezcla de microesferas/hapteno se hizo girar durante la noche a temperatura ambiente.

La mezcla de microesferas/hapteno se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 mL y se diluyó a 35 mL con 1-metoxi-2- propanol al 10 %/surfactante GAFAC® al 1 %/solución reguladora MES pH 6. El tubo se centrifugó a 18,500 rpm a 10 °C, durante 30 min. El sobrenadante se descartó y se reemplazó por 1 mL de la misma solución reguladora. Las pellas se volvieron a suspender con una varilla agitadora. El vial se llenó hasta 35 mL con la misma solución reguladora. El tubo se sonicó a 18-21 vatios durante 1 minuto usando hielo para mantener el tubo frío. La centrifugación/lavado se repitió seis veces. Después del sexto lavado, la solución reguladora se cambió a solución reguladora de lavado Hapten pH 7.2 y se realizaron dos lavados más. Después del último lavado y la de volver a suspender con 1 ml de solución reguladora de lavado Hapten, se agregaron 4 mL de solución reguladora de lavado Hapten. La mezcla de microesferas se sonicó al 50 % de potencia en un sonicador de copa. El tamaño de partícula se midió mediante UPA como 298 nm. Se realizó un ensayo de porcentaje de sólidos y la mezcla de microesferas se diluyó a 10 mg/mL. Este reactivo Chemibead se formuló en solución reguladora MES 50 mM.

Se acopló la biotinilación del anticuerpo anti-25(OH)D - NHS-PEO4-biotina (Pierce Chemical Company, Rockford IL) con el anticuerpo anti-25(OH)D (un anticuerpo monoclonal de oveja de Bioventix, Farnham, Surrey Reino Unido). Se intercambiaron en solución reguladora 3 mg del anticuerpo anti-25(OH)D dos veces cada una con 10 ml de solución reguladora de diálisis de anticuerpo (NaH2PO410 mM pH 7.0/NaCl 300 mM) en 10 mL de Amicon y luego se concentró a 3.0 mg/mL. Se disolvió 1 mg de NHS-PEO4-biotina en 100 |iL de solución reguladora de diálisis de anticuerpo para preparar 10 mg/mL de la solución de reactivo de biotina, que se agregó (35 |iL) a la solución de anticuerpo anti-25(OH)D. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se lavó tres veces con 10 mL de solución reguladora de diálisis de anticuerpo en 10 mL de Amicon y luego se concentró hasta aproximadamente 1 mL. La concentración se midió en UV A280. El reactivo de anticuerpo anti-25(OH)D biotinilado se formuló en una solución reguladora acuosa que contenía solución reguladora de ácido cítrico 25 mM, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, proteínas de bloqueo y conservantes, pH 5.0.

Sensibeads - La microesfera sensibilizante de estreptavidina se preparó usando un método análogo al descrito en las Patentes de los Estados Unidos No. 6,153,442, 7.022,529, 7,229,842 y la Publicación de Solicitud de Patente No.

20050118727A. El fotosensibilizante fue bis-(trihexil)-silicio-t-butil-ftalocianina. La concentración de reactivo Sensibead fue de 200 |ig/mL en solución reguladora HEPES, pH 8.0 que contenía NaCl 150 mM.

Reactivo de liberación: salicilato de sodio en solución reguladora HEPES 5 mM.

Resultados del inmunoensayo

El efecto de agregar el anticuerpo anti-3-epímero-VD 8F10.1 (anti-3-epímero VD Ab) sobre la reactividad cruzada de 3- epímeros para el ensayo se muestra en la tabla 1. Diez sueros de pacientes que contienen los compuestos 25(OH)D2 o 25(OH)D3 se enriquecieron con 100 ng/mL del compuesto 3 epímero-vitamina D3 adquiridos de Sigma (No. de stock 751324). La reactividad cruzada de 3 epímeros se calculó mediante la diferencia entre los valores de 25(OH)D2 o 25(OH)D3 con y sin el compuesto enriquecido con 3 epímeros dividido por la cantidad de compuesto de 3 epímeros agregado. Con la adición de 100 pg/mL del anticuerpo anti-3-epímero-VD 8F10.1, la reactividad cruzada promedio de 3-epímeros se redujo del 13.7 % a menos del 2 %.

Tabla 1

La figura 9 ilustra una comparación de curvas estándar generadas usando reactivos con y sin anticuerpo anti-3-epímero-VD 8F10.1 agregado (3-epímero Ab). La superposición completa de las dos curvas muestra que el anticuerpo anti-3-epímero-VD 8F10.1 no afecta la medición de 25(OH)D3 (25OH Vit D3 en la figura 9), lo que indica que el anticuerpo es específico para el compuesto 3-epímero y no tiene reactividad cruzada observable con el 25(OH)D3.

Ejemplo 4

Inmunoensayo para 3-epi-25OH vitamina D

Procedimiento de inmunoensayo

La medición de 3-epi-25OH Vitamina D (3-epi-25(OH)D) empleó un inmunoensayo quimioluminiscente competitivo homogéneo basado en tecnología de ensayo LOCI@ similar a la descrita anteriormente en el ejemplo 3. El ensayo se realizó en el sistema de química clínica integrado automatizado Siemens Dimension® EXL (Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Los reactivos de ensayo LOCI@ usados para la medición de 3-epi-25(OH)D incluían un reactivo de liberación, dos reactivos de microesferas sintéticas y un reactivo de anticuerpo monoclonal biotinilado anti-3 epímero. El primer reactivo de microesferas (Sensibeads) se recubrió con estreptavidina y contenía colorante fotosensible. El segundo reactivo de microesferas (Chemibeads) se recubrió con un análogo de 3 epímeros (compuesto de la Fórmula IIa anterior en la que Z' es un marcador no-poli(aminoácido), es decir, EPRM-EDA Chemibead) preparado de una manera similar a la descrita anteriormente para el ejemplo 1. La muestra se incubó con el reactivo de liberación para liberar moléculas de 25(OH)D que incluyen compuestos 3-epiméricos de proteínas de unión de la vitamina D. Después, la mezcla de reacción se incubó con anticuerpo biotinilado para formar un complejo 3-epi-25(OH)D/anticuerpo biotinilado. Se agregaron Chemibeads para eliminar el exceso de anticuerpo biotinilado libre. A continuación, se agregan Sensibeads y se unen a la porción de biotina del anticuerpo biotinilado. Como resultado se formaron agregados de Chemibead-análogo/anticuerpo-biotina/estreptavidina-Sensibeads. La iluminación de la mezcla de reacción con luz a 680 nm generó oxígeno singlete de los Sensibeads, que se difundió en los Chemibeads y desencadenó una reacción quimioluminiscente. La señal quimioluminiscente resultante se mide a 612 nm y es inversamente proporcional a la concentración de 3-epi-25(OH)D total en la muestra.

Preparación de reactivos para inmunoensayo

Síntesis de Chemibeads análogos de 3-epímeros: se prepararon Chemibeads para usar en este ensayo para la detección de 3-epi-25(OH)D de una manera similar a la descrita anteriormente en el ejemplo 3 para la síntesis de 25(OH)D3 Chemibeads siendo el hapteno un compuesto de fórmula IIa donde Z' es el Chemibead.

Reactivo Chemibead - Chemibeads análogos de 3 epímeros en solución reguladora MES 50 nM.

Biotinilación del anticuerpo anti-3-epímero-VD 8F10.1 - La biotinilación del anticuerpo anti-3-epímero-VD 8F10.1 se llevó a cabo de una manera similar a la descrita anteriormente en el ejemplo 3 para la biotinilación de anticuerpo anti-25(OH)D.

Reactivo de anticuerpo biotinilado - Anticuerpo anti-3-epímero-VD biotinilado 8F10.1 indicado anteriormente en solución reguladora cítrica 25 mM.

Reactivo Sensibead - El reactivo Sensibead fue el mismo que en el ejemplo 3.

Resultados del inmunoensayo

La figura 10 ilustra una curva estándar para el inmunoensayo para la determinación de 3-epi-25(OH)D en muestras usando el anticuerpo anti-3-epímero-VD 8F10.1. Kilocuentas quimioluminiscentes representa la señal quimioluminiscente medida como se describió anteriormente.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula:

(R1)p-(L)q-Z

en la que

Y es O, S o NR4,

X es -O-(CH2)n-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-(CH2)x-C(O)-, -(CH2)w-C(O)-NH(CH2)y-C(O)-, o

-NR3-C(O)-,

R2 es independientemente H o alquilo,

R3, R4, R5 y R6 son independientemente H o alquilo, o R4 y R5 se pueden tomar juntos para formar un enlace, o R5 y R6 se pueden tomar juntos para formar un enlace, o R y R5 se pueden tomar juntos para formar un enlace, R11 es H, alquilo o acilo,

n es un número entero desde 0 a 10,

w es un número entero desde 1 a 10,

x es un número entero desde 1 a 10,

y es un número entero desde 1 a 10,

p es un número entero desde 1 a 10,

L es un grupo de unión,

q es 0 o 1, y

Z es OR8 en el que R8 es H, alquilo o NR9R10 en el que R9 y R10 son independientemente H o alquilo.

2. El compuesto según la reivindicación 1, en el que

o H, en la que al menos un R1 no sea H.

3. El compuesto según la reivindicación en la que (R1)p-(L)q- es NHR1-(CH2)r-NR1-((CH2)r-NR1)s-(CH2)r-NR7- en el que R1 es independientemente

o

H, en la que al menos un R1 no sea H,

r es independientemente un número entero de 1 a 10,

s es un número entero desde 1 a 10, y

R7 es H o alquilo.

4. El compuesto según la reivindicación 3, en el que r es 2, s es 1, R7 es H y un R1 es

5. El compuesto según la reivindicación 3, en el que r es 2, s es 1, R7 es H y dos R1 son

6. El compuesto según la reivindicación 3, en el que r es 2, s es 1, R7 es H y tres R1 son

7. El compuesto según la reivindicación 1 de fórmula:

en la que

W es N-O-(CH2)n"C(O)-Z",

n" es un número entero desde 1 a 10,

R11" es H, alquilo o acilo, y

Z" es OR8 en el que R8 es H, alquilo o NR9R10 en el que R9 y R10 son independientemente H o alquilo.

8. El compuesto según la reivindicación 7, en el que Z" es OH.