ES2684178B1 - Obtención de fosfolípidos a partir de cefalópodos mediante extracción secuencial con fluidos supercríticos - Google Patents

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Description

DESCRIPCION
Obtencion de fosfoKpidos a partir de cefalopodos mediante extraccion secuencial con fluidos supercriticos
Campo de la invencion
La presente invencion esta relacionada con procedimientos de extraccion de fosfoKpidos de forma secuencial a partir de subproductos de cefalopodos mediante el empleo de fluidos supercriticos, asi como con el producto obtenible mediante dichos procedimientos.
Antecedentes de la invencion
La pesca y el sector transformador de los productos del mar generan un gran volumen de subproductos. Estos subproductos son ampliamente utilizados para la produccion de harinas y aceites de pescado y constituyen tambien una fuente de otros productos de alto valor anadido con aplicaciones para la industria farmaceutica y cosmetica, como peptidos de colageno, gelatina, pigmentos, sustancias antimicrobianas y enzimas. Los aceites de pescado han sido tradicionalmente la principal fuente de acidos grasos omega-3, de los cuales el acido eicosapentaenoico (EPA) y el acido docosahexaenoico (DHA), han sido ampliamente reconocidos por sus numerosos beneficiosos para la salud [Narayan, B., et al., Food Reviews International, 2006, 22(3), 291-307; Riediger, N. D., et al., Journal of the American Dietetic Association, 2009, 109(4), 668-67]. Estos acidos grasos (AGs) son obtenidos fundamentalmente a partir de fuentes marinas.
Por otro lado, la gestion de los subproductos generados en el sector transformador de productos del mar supone un elevado coste debido a que los procesos actuales de valorization no estan optimizados para esta tipologia de material.
Entre los componentes de interes dentro de estos subproductos marinos encontramos los fosfolipidos (PLs), cuyo consumo ha aumentado en los ultimos anos debido a su potencial en la prevention de la obesidad, enfermedades cardiovasculares e hipercolesterolemia [Blokland, A., et al., Nutrition, 1999, 15(10), 778-783; Stamler, C.J., et al., Journal of Lipid Research, 2000, 41(8), 1214-1221; Pandey, N.R. and D.L. Sparks, Current Opinion in Investigational Drugs, 2008, 9(3), 281-285; Sahebkar, A., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids, 2013, 1831(4), 887-893]. Diversos estudios han demostrado la capacidad de ciertos fosfoKpidos para disminuir los Kpidos en plasma e higado, y ademas, tambien se ha detallado la prevention de enfermedades relacionadas con obesidad, proporcionada por fosfatidilcolina conteniendo acidos grasos omega 3 de cadena larga [Buang, Y., et al., Nutrition, 2005, 21(7), 867-873; Buckley, J.D. and P.R.C., Howe, Obesity Reviews, 2009, 10(6), p. 648­ 659]. Ademas, el consumo de fosfolipidos ha mostrado una mejora de las funciones cognitivas, estres y depresion [Vakhapova, V., et al., Dementia and Geriatric Cognitive Disorders, 2014, 38(1-2), 39-45] y se ha observado su potencial como mediadores de inflamacion e inmunidad [Feige, E., et al., Current Opinion in Lipidology, 2010, 21(6), 525-529; Schmitz, G. and Ruebsaamen K., Atherosclerosis, 2010, 208(1), 10-18; Banskota, A. H., et al., Phytochemistry, 2014, 101, 101-108].
Ademas de su actividad biologica, los fosfolipidos poseen numerosas aplicaciones tecnologicas como estabilizadores, texturizantes, dispersantes, emulsionantes o antioxidantes.
Para la production de mezclas de fosfolipidos de origen marino habitualmente se emplean tanto biomasas secas como humedas, como por ejemplo krill, usando diferentes procesos de extraction basados principalmente en el uso de disolventes organicos toxicos y contaminantes. Ademas, la pesca masiva de krill tambien conlleva un alto impacto ecologico, ya que es fuente fundamental de alimentation de peces y otros organismos marinos.
Los cefalopodos son un alimento tradicional en la dieta espanola, siendo el segundo mercado consumidor de estas especies a nivel mundial. En el ano 2013 el consumo "per capita” de calamares y potas congelados fue 0,44 Kg/persona y de pulpo congelado 0,13 Kg/persona. Esto hace que, dentro del sector de transformation de productos marinos, el procesado de cefalopodos tenga relevancia.
La piel de cefalopodos y mas en particular la piel de pota (Illex argentinus), es un subproducto marino con un contenido relativamente alto en fosfolipidos ricos en AGs omega-3 (en particular, EPA y DHA). Sin embargo, el aprovechamiento de dicho subproducto marino plantea dificultades ya que se trata de un material inadecuado para su procesado, tanto en forma de harinas de pescado (salida mas habitual e inmediata para los subproductos de origen marino) como para la obtencion de lipidos bioactivos, debido al bajo rendimiento de los procesos de decantation habitualmente utilizados. Es por ello que estos subproductos suelen ser eliminados por incineration con una nula recuperation y revalorization [Martinez, J.J.
Secretaria de la Comision Nacional de Subproductos de origen animal no destinados al consumo humano. LIBRO blanco subproductos de origen animal no destinados al consumo humano. Madrid: Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacion. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacion: Secretaria General Tecnica: Centro de Publicaciones, 2007. 392 p.; il. col., graf.; 27 cm.: ISBN 978-84-491-0774-0; Nam, K. A., et al., Journal of Food Science, 2008, 73(4), 249-255; Kader, A., et al., Aquaculture Research, 2012, 43(10), 1427-1438]. Este hecho supone un coste adicional de gestion para las empresas que generan dichos subproductos, asi como el desperdicio de un importante recurso marino ya que, en la transformation de las especies de cefalopodos como por ejemplo pota y sepia, alrededor de un 10% del peso entero esta constituido por la piel.
Ademas, en el campo de la extraction de lipidos, gran parte de los procesos de extraction habitualmente utilizados carecen de la suficiente selectividad y extraen conjuntamente lipidos neutros (gliceridos, acidos grasos y colesterol) y fosfolipidos, lo que da lugar a productos de baja pureza y menor valor anadido [Sahena, F., et al., Journal of Food Engineering, 2010, 99(1), 63-69; Rubio-Rodriguez, N., et al., Journal of Food Engineering, 2012, 109(2), 238-248].
En este sentido, el empleo de CO2 supercritico para extraer lipidos ha demostrado tener propiedades muy interesantes, especialmente teniendo en cuenta que es una tecnologia respetuosa con el medio ambiente, que no deja residuos en el producto final despues de la separation, no es inflamable, no es toxico, es inerte a la mayoria materiales, es barato, y puede ser usado en condiciones operativas relativamente suaves, evitandose oxidaciones y procesos hidrolrticos. Ademas, la extraccion con CO2 supercritico es una tecnica muy adecuada para el fraccionamiento de materiales de partida de naturaleza lipidica, debido a la baja polaridad del CO2. Sin embargo, se ha descrito que el CO2 supercritico solo es capaz de extraer lipidos neutros y es necesario anadir un cosolvente, como por ejemplo etanol en cantidades superiores al 5% en peso, para la extraccion de fosfolipidos [Catchpole, O.J., et al., Journal of Supercritical Fluids, 2009, 47, 591-597]. Ademas, se ha descrito que la extraccion de lipidos neutros se ve dificultada segun aumenta la fraction de lipidos polares [Catchpole, O.J., et al., Journal of Supercritical Fluids, 2009, 47, 591-597] y que la solubilidad de los lipidos polares se reduce cuando los lipidos neutros han sido extraidos [Cocero, M.J., Calvo, L., Journal of the American Oil Chemists’ Society, 1996, 73(11), 1573-1578]. Estos hechos dificultan el aprovechamiento de subproductos marinos, en particular de piel de cefalopodos, ya que en dichos subproductos marinos los lipidos neutros son minoritarios frente a los lipidos polares (fosfolipidos).
Por todo ello, existe una necesidad de disponer de procedimientos de extraction selectivos, eficientes y respetuosos con el medioambiente que permitan obtener fosfoKpidos a partir de subproductos marinos que comprenden tanto dichos fosfoKpidos como Kpidos neutros, y asi conseguir un mejor aprovechamiento y valorization de dichos subproductos marinos.
Sumario de la invention
Los autores de la presente invencion han encontrado un procedimiento de extraccion secuencial de lipidos a partir de subproductos marinos, en particular de piel de cefalopodos, selectivo, eficiente y respetuoso con el medioambiente mediante el empleo de fluidos supercriticos. En particular, los autores de la presente invencion han encontrado que la extraccion de lipidos a partir de subproductos marinos, en particular de piel de cefalopodos, utilizando fluidos supercriticos no modificados (por ejemplo CO2 supercritico) y una celda de extraccion con agitation, sorprendentemente logra una extraccion practicamente cuantitativa de lipidos neutros a tiempos reducidos en presencia de concentraciones elevadas de fosfolipidos. En una segunda etapa de extraccion utilizando como disolvente de extraccion un fluido supercritico (por ejemplo CO2 supercritico) modificado con pequenas cantidades de alcohol (por ejemplo etanol), se logran extraer los fosfolipidos de forma cuantitativa y con alta pureza, donde ademas, dichos fosfolipidos pueden llegar a comprender un porcentaje importante de acidos grasos omega-3, en particular, acido eicosapentaenoico (EPA), acido docosapentaenoico (DPA) y acido docosahexaenoico (DHA).
El procedimiento de la presente invencion es, por tanto, selectivo y eficaz en la extraccion de lipidos neutros y fosfolipidos a partir de subproductos marinos, en particular de piel de cefalopodos. De este modo, se convierte un subproducto de origen marino con reducido valor industrial en una fuente de productos de alto valor anadido, orientados hacia mercados emergentes, planteando estrategias que implican el uso de tecnologias limpias y respetuosas con el medio ambiente. Con ello se incrementa el potencial de valorizacion de estos subproductos del sector transformador de productos del mar para su posible uso en alimentation humana.
Por ello, el primer aspecto de la invencion esta relacionado con un procedimiento para la obtencion de una composition que comprende fosfolipidos a partir de un producto de cefalopodos que comprende fosfoKpidos y Kpidos neutros, donde dicho procedimiento comprende:
(a) proporcionar un producto de cefalopodos seco y particulado que comprende lipidos neutros y fosfolipidos;
(b) someter el producto de la etapa (a) a extraction con un fluido supercritico aplicando agitation para obtener un residuo que comprende menos de un 30% en peso de lipidos neutros respecto al peso total de lipidos neutros y fosfolipidos en dicho residuo; y (c) someter el residuo de la etapa (b) a extraccion con disolvente, donde dicho disolvente comprende un fluido supercritico y del 1% al 10% en volumen con respecto al volumen total del fluido supercritico de un alcohol C1-C4, para obtener un extracto que comprende al menos el 80% en peso de fosfolipidos respecto al peso de fosfolipidos presente en el producto de la etapa (a).
En una realization particular, el procedimiento para la obtencion de una composition que comprende fosfolipidos a partir de un producto de cefalopodos que comprende fosfolipidos y lipidos neutros, comprende:
(a) proporcionar un producto de cefalopodos seco y particulado que comprende lipidos neutros y fosfolipidos;
(b) poner en contacto el producto de cefalopodos de la etapa (a) con un fluido supercritico mediante agitacion;
(c) separar el fluido supercritico que contiene los componentes solubles de los componentes insolubles;
(d) poner en contacto los componentes insolubles de la etapa (c) con un disolvente que comprende un fluido supercritico y del 1% al 10% en volumen con respecto al volumen total del fluido supercritico de un alcanol C1-C4 mediante agitacion;
(e) separar el disolvente que contiene los componentes solubles de los componentes insolubles; y
(f) aislar los componentes solubles de la mezcla de componentes solubles y disolvente obtenida en la etapa (e).
Otro aspecto de la invention esta relacionado con una composicion que comprende fosfolipidos obtenible mediante el procedimiento definido en el primer aspecto.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra la cantidad de Kpidos e x ^ d o s respecto al tiempo de extraccion para la piel de Illex argentinus liofilizada y molida, mediante CO2 supercritico a 350 bares de presion, caudal de CO2 de 16 g/min y temperatura de 40°C.
La Figura 2 muestra la cantidad de lipidos e x ^ d o s respecto al tiempo de extraccion para la piel de Illex argentinus parcialmente desgrasada, mediante CO2 supercritico usando 5% de etanol como modificador, y 350 bares de presion, caudal de CO2 de 25 g/min y temperatura de 40°C.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
Por “fosfolipido” se entiende un lipido anfipatico compuesto por una molecula de glicerol o de esfingosina a la que se encuentran unidos dos acidos grasos y un grupo fosfato unido mediante un enlace fosfodiester a otro grupo como por ejemplo colina, etanolamina. Ejemplos de fosfolipidos son fostatidilcolina (PC), lisofosfatidilcolina (PLC), fosfatidiletanolamina (PE) y esfingomielina (SM).
Por “lipido neutro” se entiende un lipido apolar, sin carga, principalmente hidrofobico. Ejemplos de estos lipidos incluyen acidos grasos, acilgliceridos como mono, di y trigliceridos, ceridos, colesterol y esteres de colesterol.
Por “cefalopodo” se entiende una clase de invertebrados marinos que comprende, entre otros sepias (por ejemplo Sepia pharaonis y Sepia officinalis), calamares (por ejemplo Illex argentinus), pulpos y nautilos.
Por “producto de cefalopodo” se entiende una o mas partes de uno o varios cefalopodos, como por ejemplo, la piel, las visceras, mezclas de piel y visceras, o el cefalopodo en su totalidad.
Por “seco” se entiende que comprende menos del 15% en peso de agua respecto al peso total del producto de cefalopodo, preferiblemente menos del 10%, mas preferiblemente menos del 5%, aun mas preferiblemente menos del 1%.
Por “particulado” se entiende un producto solido en forma de particulas en donde el 90% en peso de las particulas presentan un tamano de particula inferior a 5 mm, preferiblemente inferior a 3 mm. De forma preferida, el 95% en peso de las particulas presentan un tamano de particula inferior a 5 mm, preferiblemente inferior a 3 mm. De forma aun mas preferida, el 99% en peso de las particulas presentan un tamano de particula inferior a 5 mm, preferiblemente inferior a 3 mm. Para determinar el porcentaje de particulas con un tamano de particula inferior a un valor concreto, por ejemplo 5 mm o 3 mm se puede someter al material a caracterizacion granulometrica mediante el uso de una serie de tamices mecanicos de tamanos de particula concretos, como por ejemplo de 5 mm o 3 mm y determinar el peso de particulas que pasan dicho tamiz.
Por “fluido supercntico” se entiende cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presion y temperatura superiores a su punto critico. Por encima, pero proximo a dicho punto, la sustancia se encuentra en estado fluido pero comparte las propiedades de un liquido y un gas. Asi, el fluido tiene una densidad similar a la de un liquido, mientras que su viscosidad y difusividad son similares a las de un gas. Un ejemplo de fluido supercntico es CO2 supercntico.
Por alcanol C1-C4 se entiende un radical alquilo lineal o ramificado de entre 1 a 4 atomos de carbono unido a un grupo hidroxilo. Ejemplos de alcanoles C1-C4 son metanol, etanol, npropanol, iso-propanol, n-butanol, iso-butanol, sec-butanol y terc-butanol.
Procedimiento de la invention
El primer aspecto de la invencion esta relacionado con un procedimiento para la obtencion de una composition que comprende fosfolipidos a partir de un producto de cefalopodos que comprende fosfolipidos y lipidos neutros, donde dicho procedimiento comprende:
(a) proporcionar un producto de cefalopodos seco y particulado que comprende lipidos neutros y fosfolipidos;
(b) someter el producto de la etapa (a) a extraction con un fluido supercntico aplicando agitation para obtener un residuo que comprende menos de un 30% en peso de lipidos neutros respecto al peso total de lipidos neutros y fosfolipidos presentes en dicho residuo; y
(c) someter el residuo de la etapa (b) a extraccion con disolvente, donde dicho disolvente comprende un fluido supercntico y del 1% al 10% en volumen con respecto al volumen total del fluido supercritico de un alcanol C1-C4 para obtener un extracto que comprende al menos el 80% en peso de fosfoKpidos respecto al peso de fosfoKpidos presente en el producto de la etapa (a).
El producto de cefalopodos preferiblemente es un producto de sepia (por ejemplo Sepia pharaonis y Sepia officinalis), de calamar (por ejemplo Illex argentinus), o mezcla de los mismos; mas preferiblemente de calamar, aun mas preferiblemente de Illex argentinus. El producto de cefalopodos, preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en visceras, pieles y mezclas de visceras y pieles. De forma preferida, el producto de cefalopodos se selecciona del grupo que consiste en visceras, pieles y mezcla de visceras y pieles de Illex argentinus; mas preferiblemente es piel de Illex argentinus.
El producto de cefalopodos de la etapa (a) esta seco y particulado.
El contenido en agua del producto de cefalopodos seco y particulado de la etapa (a) es inferior al 15% en peso, mas preferiblemente inferior al 10% en peso, aun mas preferiblemente inferior al 10% en peso, aun mas preferiblemente inferior al 5% en peso, lo mas preferido con un contenido en agua inferior al 1% en peso.
El 90% en peso de las particulas de las particula del producto de cefalopodos seco y particulado de la etapa (a) presentan un tamano de particula inferior a 5 mm, preferiblemente inferior a 3 mm. Preferiblemente el 95% en peso de las particulas presentan un tamano de particula inferior a 5 mm, preferiblemente inferior a 3 mm. De forma aun mas preferida, el 99% en peso de las particulas presentan un tamano de particula inferior a 5 mm, preferiblemente inferior a 3 mm.
Si el producto de cefalopodos presenta un contenido en agua o un tamano de particula superior a los valores requeridos en la etapa (a), dicho producto de cefalopodos se somete a una(s) etapa(s) previa de acondicionamiento en donde se reduce el contenido en agua y/o se disminuye el tamano de particula. De forma ventajosa, el contenido en agua se puede reducir mediante liofilizacion ya que dicha tecnica evita el deterioro del producto. Para reducir el tamano de particula el producto de cefalopodos se puede trocear y/o moler hasta obtener el tamano deseado.
En una realization particular, el producto de cefalopodos seco y particulado de la etapa (a) se homogeneiza antes de someterlo a la extraction de la etapa (b), por ejemplo mediante mezcla o agitation del producto.
El producto de cefalopodos comprende fosfoKpidos y Kpidos neutros. Preferiblemente, los lipidos neutros se seleccionan del grupo que consiste en trigliceridos, acidos grasos, colesterol, esteres de colesterol y mezclas de los mismos. Preferiblemente, los fosfoKpidos se seleccionan del grupo que consiste en fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina y mezcla de los mismos. Una parte de los fosfolipidos presentes en los cefalopodos contienen acidos grasos omega-3 como acidos grasos. Dichos acidos grasos omega-3 son preferiblemente acido eicosapentaenoico (EPA), acido docosapentaenoico (DPA) y acido docosahexaenoico (DHA). El contenido mas alto en dichos acidos grasos se encuentra en las pieles de calamar, en particular de Illex argentinus, y de sepia. Por ello, dichos productos de cefalopodos son especialmente ventajosos como material de partida del procedimiento de la presente invencion.
En la etapa (b) del procedimiento de la invention, se somete el producto de cefalopodos de la etapa (a) a extraccion con un fluido supercritico aplicando agitacion. Para ello, el producto de cefalopodos se pone en contacto con dicho fluido supercritico a la vez que se aplica agitacion. De esta manera se obtiene una fraction soluble (extracto) que comprende fundamentalmente lipidos neutros y una fraccion insoluble (residuo), donde dicha fraccion insoluble o residuo comprende menos de un 30% en peso de lipidos neutros respecto al peso total de lipidos neutros y fosfolipidos presentes en dicho residuo.
En una realizacion preferente, dicho residuo comprende menos de un 15% en peso de lipidos neutros con respecto al peso total de lipidos neutros y fosfolipidos presentes en dicho residuo.
Por su parte, la fraccion soluble o extracto contiene menos del 5% en peso de fosfolipidos respecto al peso de lipidos neutros, preferiblemente menos del 1%, mas preferiblemente menos del 0,5%, aun mas preferiblemente menos del 0,1%, aun mas preferiblemente menos del 0,05%, lo mas preferido un 0%, es decir, los fosfolipidos estan ausentes del extracto obtenido tras esta primera extraccion o etapa (b) del procedimiento de la invencion.
El experto en la materia puede determinar la cantidad de fosfolipidos y lipidos neutros mediante tecnicas habituales, como por ejemplo mediante cromatografia liquida de alta resolution (HPLC), neutralization de la acidez libre o cromatografia de gases utilizando patrones puros de cada una de las clases de Kpidos y la cuantificacion mediante rectas de calibrado de cada uno de los lipidos detectados. La cantidad de lipidos neutros se pueden determinar mediante HPLC acoplado a un detector evaporativo de dispersion de luz segun el metodo previamente descrito por Torres et al. [Journal of Chromatography A, 2005, 1078(1), 28-34]. La cantidad de lipidos polares se pueden determinar mediante HPLC acoplado a un detector evaporativo de dispersion de luz segun la metodologia descrita por Casado et al. [Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2014, 99, 14-19].
Esta etapa permite, por tanto, la extraction selectiva de lipidos neutros respecto a los fosfoKpidos. Este hecho resulta sorprendente ya que se conoce que la extraccion de lipidos neutros se ve dificultada segun se aumenta la fraction de lipidos polares. En el producto de cefalopodos generalmente los lipidos neutros son minoritarios frente a los lipidos polares, y sin embargo, mediante el procedimiento de la presente invention, los lipidos neutros son extraidos casi cuantitativamente en la etapa (b) del procedimiento.
La etapa (b) del procedimiento de la invencion preferiblemente se lleva a cabo en una celda de extraccion dotada de un sistema de agitation, preferiblemente un agitador mecanico. La extraccion con agitacion es ventajosa ya que permite reducir los tiempos de extraccion y evita la formation de caminos preferenciales del fluido supercritico durante la extraccion. De este modo tambien se evita tener que dispersar el producto de cefalopodos en un material inerte (por ejemplo arena de mar) que dificultaria su posterior recuperation y utilization en posteriores procesos. Ademas, dicha agitacion permite homogeneizar el tamano de parricula del residuo obtenido que posteriormente se sometera a la segunda extraccion (etapa (c) del procedimiento de la invencion). Asi, el residuo de la etapa (b) se recupera y se utiliza directamente en la siguiente etapa de extraccion sin someterlo a un cribado adicional.
En una realization particular, el producto de cefalopodos de la etapa (a) se introduce en la celda de extraccion dotada del sistema de agitacion y se pone en contacto con el fluido supercritico. Preferiblemente el fluido supercritico pasa de forma continua a traves de la celda de extraccion. En una realizacion particular, el caudal de dicho fluido supercritico es de 10 a 30 g/minuto, preferiblemente de 10 a 20 g/min, mas preferiblemente de 13 a 19 g/min, aun mas preferiblemente de 15 a 17 g/min, lo mas preferido aproximadamente 16 g/min. Preferiblemente, la extraccion de la etapa (b) se realiza a una presion de entre 150 y 400 bares, mas preferiblemente de entre 300 y 400 bares, aun mas preferiblemente entre 325 y 375 bares, aun mas preferiblemente entre 340 y 360 bares, lo mas preferido aproximadamente 350 bares. Preferiblemente, la extraccion de la etapa (b) se realiza a una temperatura de entre 30 y 50 °C, mas preferiblemente de entre 35 y 45 °C, lo mas preferido de aproximadamente 40 °C.
De forma preferida, el fluido supercritico utilizado en la etapa (b) es CO2 supercritico.
Como ventaja adicional, y derivado fundamentalmente de la aplicacion de agitacion durante el proceso de extraccion, esta extraccion selectiva puede realizarse en tiempos reducidos, por ejemplo entre 20 y 120 minutos, entre 30 y 120 minutos, entre 40 y 120 minutos, entre 50 y 120 minutos, entre 60 y 120 minutos, entre 70 y 120 minutos, entre 80 y 120 minutos, entre 20 y 90 minutos, entre 30 y 90 minutos, entre 40 y 90 minutos, entre 50 y 90 minutos, entre 60 y 90 minutos, entre 70 y 90 minutos, entre 80 y 90 minutos, preferiblemente entre 60 y 120 minutos, mas preferiblemente entre 70 y 90 minutos, aun mas preferiblemente en aproximadamente 80 minutos.
Una vez finalizada la extraccion de la etapa (b) se obtiene un extracto con los lipidos neutros y un residuo. Los lipidos neutros se pueden separar del fluido supercritico utilizado en la extraccion mediante despresurizacion, lo que provoca su precipitacion y facilita su recuperacion. Dichos lipidos neutros se pueden utilizar en la industria farmaceutica, alimentaria y cosmetica, en particular como precursores de hormonas esteroideas en la industria farmaceutica y tambien en la elaboration de liposomas para su estabilizacion. Dichos lipidos neutros son ricos en colesterol.
De forma ventajosa, el residuo de la etapa (b) se puede utilizar directamente en la siguiente etapa de extraccion, etapa (c) del procedimiento de la invention, ya que no es necesario utilizar ningun material inerte para dispersar el material de partida de la etapa (b) (es decir, el producto de cefalopodos provisto en la etapa (a)) y, por tanto, no es necesario separar dicho material inerte del residuo de la etapa (b) antes de realizar la extraccion de la etapa (c). Ademas, dado que la agitacion aplicada durante la primera extraccion (etapa (b)) permite homogeneizar el tamano de parricula, tampoco es necesario moler o triturar dicho residuo antes de realizar la extraccion de la etapa (c).
El residuo obtenido tras la etapa (b) del procedimiento de la invencion contiene un porcentaje en peso de materia grasa que oscila entre el 5 y 20% en peso con respecto al peso total del residuo, mas preferiblemente entre 10 y 15% en peso de materia grasa. Por materia grasa se entiende la suma de Kpidos neutros y fosfoKpidos.
La siguiente etapa del procedimiento de la invention es la etapa (c). En dicha etapa del procedimiento se somete el residuo de la etapa (b) a extraction con disolvente. Para ello, dicho residuo se pone en contacto con un disolvente, donde dicho disolvente comprende un fluido supercritico y del 1% al 10% en volumen con respecto al volumen total del fluido supercritico de un alcanol C1-C4. Mediante esta etapa se obtiene un extracto que comprende al menos un 80% en peso de fosfolipidos respecto al peso total de fosfolipidos presentes en el producto de la etapa (a), preferiblemente al menos el 90% en peso de los fosfolipidos respecto al peso total de fosfolipidos presentes en el producto de la etapa (a). El experto en la materia puede determinar la cantidad de fosfolipidos mediante tecnicas habituales, como por ejemplo mediante cromatografia liquida de alta resolution (HPLC), tal como se ha descrito anteriormente.
Resulta sorprendente que con el procedimiento de la presente invencion se logre extraer de forma casi cuantitativa los lipidos polares (fosfolipidos) utilizando cantidades bajas de alcanol C1-C4 ya que es conocido que la solubilidad de lipidos polares (por ejemplo fosfolipidos) se reduce cuando los lipidos neutros han sido extraidos.
La etapa (c) del procedimiento de la invencion preferiblemente se lleva a cabo en una celda de extraccion dotada de un sistema de agitation, preferiblemente un agitador mecanico. La extraccion con agitacion es ventajosa ya que permite reducir los tiempos de extraccion y evita la formation de caminos preferenciales del disolvente durante la extraccion. De este modo tambien se evita tener que dispersar el residuo de la etapa (b) en un material inerte (por ejemplo arena de mar) que dificultaria su posterior recuperation y utilization en posteriores procesos.
Para la extraccion de la etapa (c), el residuo de la etapa (b) se introduce en la celda de extraccion dotada del sistema de agitacion, preferiblemente agitacion mecanica, y se pone en contacto con el disolvente. De forma ventajosa, en la presente invencion no es necesario realizar ningun cribado adicional tras la extraccion de la etapa (b) para separar, por ejemplo, materiales inertes de dispersion que en la presente invencion no se han tenido que anadir para lograr una extraccion selectiva y eficiente de lipidos neutros. Preferiblemente el disolvente pasa de forma continua a traves de la celda de extraccion. En una realization particular, el caudal de dicho fluido supercritico es de 10 a 40 g/minuto, preferiblemente de 15 a 35 g/min, mas preferiblemente de 20 a 30 g/min, aun mas preferiblemente de 23 a 27 g/min, lo mas preferido aproximadamente 25 g/min. Preferiblemente, la extraccion de la etapa (c) se realiza a una presion de entre 150 y 400 bares, mas preferiblemente de entre 200 y 300 bares, aun mas preferiblemente entre 225 y 275 bares, aun mas preferiblemente entre 240 y 260 bares, lo mas preferido aproximadamente 250 bares. Preferiblemente, la extraccion de la etapa (c) se realiza a una temperatura de entre 30 y 50 °C, mas preferiblemente de entre 35 y 45 °C, lo mas preferido de aproximadamente 40 °C.
En una realization, el disolvente de la etapa (c) comprende del 1% al 8% en volumen con respecto al volumen total del fluido supercritico de un alcanol, preferiblemente del 1% al 5%, mas preferiblemente del 2% al 5%, aun mas preferiblemente del 2,5% al 5%, lo mas preferiblemente aproximadamente el 5%. De forma preferida, el fluido supercritico utilizado en la etapa (c) es CO2 supercritico. De forma preferida el alcanol C1-C4 utilizado en la etapa (c) es etanol. De forma particularmente preferida el disolvente de la etapa (c) es CO2 supercritico y del 1% al 10% en volumen con respecto al volumen total del CO2 supercritico de etanol, preferiblemente CO2 supercritico y del 1% al 8% en volumen con respecto al volumen total del CO2 supercritico de etanol, mas preferiblemente CO2 supercritico y del 1% al 5% en volumen con respecto al volumen total del CO2 supercritico de etanol, mas preferiblemente CO2 supercritico y del 2% al 5% en volumen con respecto al volumen total del CO2 supercritico de etanol, aun mas preferiblemente CO2 supercritico y del 2,5% al 5% en volumen con respecto al volumen total del CO2 supercritico de etanol, lo mas preferido CO2 supercritico y aproximadamente el 5% en volumen con respecto al volumen total del CO2 supercritico de etanol.
Como ventaja adicional, y derivado fundamentalmente de la aplicacion de agitation durante el proceso de extraccion, esta extraccion practicamente cuantitativa puede realizarse en tiempos reducidos, por ejemplo entre 20 y 120 minutos, entre 30 y 120 minutos, entre 40 y 120 minutos, entre 50 y 120 minutos, entre 60 y 120 minutos, entre 70 y 120 minutos, entre 80 y 120 minutos, entre 20 y 90 minutos, entre 30 y 90 minutos, entre 40 y 90 minutos, entre 50 y 90 minutos, entre 60 y 90 minutos, entre 70 y 90 minutos, entre 80 y 90 minutos, preferiblemente entre 60 y 120 minutos, mas preferiblemente entre 70 y 90 minutos, aun mas preferiblemente en aproximadamente 80 minutos.
Una vez finalizada la extraccion de la etapa (c) se obtiene un extracto con los fosfolipidos y un residuo. Los fosfolipidos se pueden separar o aislar del fluido supercritico utilizado en la extraction mediante despresurizacion y evaporation del alcanol C1-C4, preferiblemente mediante evaporacion a presion reducida (por ejemplo inferior a 10 mbar) y temperatura no superior a 40 °C, obteniendose as^ una composition que comprende fosfoKpidos.
Dicha composicion comprende preferiblemente al menos un 70% en peso de fosfoKpidos respecto al peso total de la composicion, mas preferiblemente al menos un 75% en peso, aun mas preferiblemente al menos un 80% en peso. Los fosfolipidos de la composicion de la invention, preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina y mezcla de los mismos. Preferiblemente, la composicion comprende de 55% a 75% en peso de fosfatidilcolina, de 3% a 10% en peso de lisofosfatidilcolina, de 3% a 10% en peso de fosfatidiletanolamina y de 5% a 12% en peso de esfingomielina, en donde los porcentajes en peso se expresan respecto al peso total de la composicion. Dicha composicion que comprende fosfolipidos se puede utilizar en la industria farmaceutica, alimentaria y cosmetica. El residuo de la etapa (c) se puede utilizar en la industria farmaceutica, alimentaria y cosmetica, en particular para la obtencion de colageno e hidrolizados proteicos.
El peso (en gramos) de producto de cefalopodos que se introduce en la celda de extraccion en la etapa (b) como en la etapa (c) puede ser igual o diferente, preferiblemente es de entre 0,05 y 0,5 veces el volumen (en mililitros) de la celda de extraccion, mas preferiblemente entre 0,05 y 0,2 veces, mas preferiblemente entre 0,05 y 0,1 veces, aun mas preferiblemente entre 0,05 y 0,2 veces, lo mas preferido entre 0,05 y 0,1 veces.
Extracto y composicion de la invencion
En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con un extracto obtenible segun el procedimiento definido en el primer aspecto. Dicho extracto contiene al menos un 80% en peso de fosfolipidos respecto al peso total de fosfolipidos presentes en el producto de la etapa (a), preferiblemente al menos el 90% en peso de los fosfolipidos respecto al peso total de fosfolipidos presentes en el producto de la etapa (a)
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion que comprende fosfolipidos, siendo dicha composicion obtenible mediante el procedimiento de la invencion que ademas comprende la etapa de aislar o separar los componentes solubles del extracto del disolvente empleado en la segunda extraccion.
Esta composition, preferiblemente comprende al menos un 70% en peso de fosfoKpidos respecto al peso total de la composicion, mas preferiblemente al menos un 75% en peso, aun mas preferiblemente al menos un 80% en peso. La composicion tambien puede comprender una parte minoritaria de lipidos neutros, preferiblemente inferior al 15% en peso respecto al peso total de la composicion, mas preferiblemente inferior al 10% en peso, aun mas preferiblemente inferior al 5% en peso. Dicha composicion tambien puede contener otros componentes, como por ejemplo agua y opcionalmente xantomatina [Williams, T. L. et al., 2016, Langmuir, 2016, 32(15), 3754-3759].
Los fosfolipidos de la composicion de la invention, preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina y mezcla de los mismos. Preferiblemente, la composicion comprende de 55% a 75% en peso de fosfatidilcolina, de 3% a 10% en peso de lisofosfatidilcolina, de 3% a 10% en peso de fosfatidiletanolamina y de 5% a 12% en peso de esfingomielina, en donde los porcentajes en peso se expresan respecto al peso total de la composicion.
Los fosfolipidos de la composicion de la invencion preferiblemente contienen acidos grasos omega-3 como acidos grasos que se encuentran unidos al glicerol o esfingosina de dichos fosfolipidos. Preferiblemente, los grasos omega-3 son acido eicosapentaenoico (EPA), acido docosapentaenoico (DPA), acido docosahexaenoico (DHA) o mezcla de los mismos.
Dicha composicion se pueden utilizar en la industria farmaceutica, alimentaria y cosmetica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se aportan a efectos ilustrativos, y no suponen una limitation de la presente invencion.
Materiales y metodos
Los productos de cefalopodos fueron cedidos por la empresa CEFRICO S.L consistieron en pieles de pota de la especie Illex argentinus procedente de Argentina.
El CO2 fue adquirido y suministrado por la empresa Carburos Metalicos en forma Kquida y formato de botella con sifon o espadm y pureza del 99,98%.
Las extracciones con fluidos supercriticos se realizaron en el equipo TharSFC (Thar SFC, a Waters company). La celda de extraction posee una capacidad en volumen de 104 mL, y en su parte superior alberga un eje de agitation que puede ser opcionalmente activado o no. El CO2 es vehiculizado hacia el interior de la celda a traves de varios orificios. La presion de trabajo del CO2 oscila entre 73 bar y 400 Bar y esta controlada mediante un regulador de presion (Automated Back Pressure Regulator TharSFC) y el caudal de trabajo definido es mantenido por action de una bomba hidraulica (High pressure P-series pump TharSFC) estando establecido en un rango entre 10 y 50 g/min. La temperatura del proceso se controla mediante una resistencia electrica. El CO2 es pre-enfriado para licuarlo previamente a su bombeo mediante un criostato (Huber CC508) y posteriormente calentado a la temperatura del proceso mediante un intercambiador de calor (Heat exchanger TharSFC).
El etanol absoluto utilizado como co-solvente o modificador se obtuvo de AppliChem Panreac (Barcelona, Spain), con una pureza del 99,5%.
La concentration de acidos grasos libres se determino mediante su neutralization con hidroxido potasico en presencia de fenolftalema.
El analisis de lipidos neutros mediante cromatografia de gases se realizo usando un cromatografo de gases Agilent (6890N Network GC System) acoplado a un detector de triple eje (5975C) y a un muestreador automatico (Agilent 7683B). Para ello se utilizo el metodo previamente descrito por Torres et al [Chromatographia, 2009, 69(7-8), 729-734].
El analisis de lipidos neutros tambien se realizo mediante HPLC usando un cromatografo Agilent Technologies Serie 1200 (Santa Clara, CA, EE.UU.) acoplado a un detector evaporativo de dispersion de luz (ELSD) (Agilent 1260 Infinity) segun el metodo previamente descrito por Torres et al. [Journal of Chromatography A, 2005, 1078(1), 28-34].
El analisis de lipidos polares mediante HPLC Agilent Technologies Serie 1200 (Santa Clara, CA, EE.UU.) acoplado a un detector evaporativo de dispersion de luz (ELSD) (Agilent 1260 Infinity) segun la metodologia descrita por Casado et al. [Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2014, 99, 14-19].
Acondicionamiento del producto de cefalopodos
Para el acondicionamiento del producto, las pieles Illex argentinus fueron inicialmente congeladas y almacenadas en una camara congeladora a -20°C hasta su posterior liofilizacion. El producto congelado se coloco en bandejas de acero inoxidable y se introdujo en un liofilizador durante 4 dias. Se partio de 6 kg de pieles Illex argentinus y se obtuvo un peso de liofilizado de 720 g.
A continuation, el material liofilizado se troceo y molio utilizando un molino de martillos con tamiz de 3 mm. El material molido se sometio a caracterizacion fisica por granulometria mediante el uso de una serie de 4 tamices mecanicos de tamanos de particula de 3 mm, 1 mm, 500 ^m y 250 ^m.
El material molido se homogeneizo y conservo protegido de la luz, envasado al vado y a temperatura de refrigeration de 4°C para su posterior extraction con fluidos supercriticos dividida en dos etapas.
EJEMPLO 1. Estudio de los tiempos de extraccion de la etapa (b)
Se extrajo el producto de Illex argentinus acondicionado (10 g) con CO2 supercritico a 350 bar de presion, caudal de CO2 de 16 g/min y temperatura de 40°C a distintos tiempos con el fin de definir el tiempo necesario para la extraccion completa de los lipidos neutros. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Ese primer extracto de lipidos neutros se cuantifico y caracterizo qtimicamente mediante neutralization de la acidez libre, cromatografia de gases y cromatografia liquida alta eficacia (HPLC acoplado a un detector evaporativo de dispersion de luz). La identification se realizo utilizando patrones puros de cada una de las clases de lipidos y la cuantificacion mediante rectas de calibrado de cada uno de los lipidos detectados, dando como resultado la composition que se muestra en la Tabla 3. Es posible observar la total ausencia de lipidos polares en estos primeros extractos, lo cual indica la selectividad del metodo secuencial de extraccion de la invencion.
Tabla 3: Porcentaje en peso de l'lpidos neutros
Figure imgf000019_0001
DE = desviacion estandar
EJEMPLO 2. Estudio de los tiempos de extraction de la etapa (c)
Se extrajo el producto de Illex argentinus parcialmente desgrasado procedente del ejemplo 1 (7,5 g) con CO2 supercritico usando 5% de etanol como modificador a 350 bar de presion, caudal de CO2 de 25 g/min y temperatura de 40°C a distintos tiempos con el fin de definir el tiempo necesario para la extraccion completa de los lipidos polares. Los resultados se muestran en la Figura 2.
El extracto obtenido en esta segunda etapa se cuantifico y caracterizo quimicamente mediante HPLC acoplado a un detector evaporativo de dispersion de luz. La identification de los lipidos polares se realizo utilizando patrones comerciales de distintos fosfolipidos, como fosfatidilcolina (PC), lisofosfatidilcolina (PLC), fostatidiletanolamina (PE) y esfingomielina (SM). La cuantificacion de los mismos se realizo mediante rectas de calibrado de cada uno de los lipidos detectados, dando como resultado la composition que se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4: Porcentaje en peso de fosfol'ipidos
Figure imgf000019_0002
DE = desviacion estandar
El balance de materia se cerro con una pequena fraction (10% aprox.) correspondiente principalmente a lipidos neutros que no fueron extraidos en la primera etapa de extraccion.
El extracto obtenido presento elevada coloration, que podria ser debido a la presencia de xantomatina (omocromo) residual, un pigmento presente en la piel de algunos cefalopodos, como el Illex argentinus. Ademas esta sustancia podria proteger al propio extracto de su oxidation tras el proceso de extraccion con CO2 supercritico.
El estado de oxidacion de estos extractos fue determinado mediante la medida del mdice de peroxidos utilizando el equipo de medida rapida "Food-Lab Fat”. Los resultados del mdice de peroxidos determinados muestran un bajo estado de oxidacion en estos extractos, siendo de media aproximadamente 1,3±0,21 mEq/Kg.
EJEMPLO 3. Desgrasado de piel de Illex argentinus molida mediante CO2 supercritico en celda con agitation
Se partio de 10 g de la piel de Illex argentinus acondicionada previamente. La granulometria obtenida para este material fue del 7,9% de parricula menor de 250 ^m, un 7,8% entre 500 y 250 ^m, un 18,2% entre 500 ^m y 1 mm y un 66% entre 1 y 3 mm. Este material se introdujo en la celda de extraction del equipo TharSFC y se extrajo con agitacion mecanica. La presion del CO2 aplicada fue de 350 bar, caudal de CO2 circulado 16 g/min y temperatura del proceso 40°C. El tiempo de la extraccion fue de 80 min. En estas condiciones se obtuvo un residuo de 416,9±15,50 mg, que representa el 4,17% del material deshidratado de partida.
EJEMPLO 4. Desgrasado de piel de Illex argentinus molida mediante CO2 supercritico en celda sin agitacion (ejemplo comparativo)
Se partio de 10 g de la piel de pota molida acondicionada previamente. La granulometria obtenida para este material fue del 7,9% de parricula menor de 250 ^m, un 7,8% entre 500 y 250 ^m, un 18,2% entre 500 ^m y 1 mm y un 66% entre 1 y 3 mm. Este material se introdujo en la celda de extraccion del equipo TharSFC sin aplicar agitacion mecanica. Se extrajo en unas condiciones de presion de CO2 de 350 bar, caudal de CO2 circulado 16 g/min, temperatura de 40°C y tiempo de extraccion de 80 min. Se obtuvo un residuo de aproximadamente 354 mg, que representa el 3,54% del material deshidratado de partida.
EJEMPLO 5. Extraccion de la fraction de fosfolipidos presentes en la piel de Illex argentinus molida y desgrasada mediante la aplicacion de CO2 supercritico y 5% de etanol como modificador
Se partio de 7,5 g de piel de Illex argentinus molida parcialmente desgrasada obtenida en el ejemplo 3, que se introdujo en la celda de extraccion con agitacion del equipo TharSCF. La granulometria obtenida para este material fue del 8,8% de parricula menor de 250 ^m, un 19,1% entre 500 y 250 ^m, un 37,9% entre 500 ^m y 1 mm y un 33,6% entre 1 y 3 mm. El proceso de extraction se realizo del mismo modo que el definido en el Ejemplo 3, con la diferencia de que en esta ocasion se bombeo junto con el CO2 una cantidad de etanol correspondiente al 5% del volumen de CO2 utilizado, usando una bomba hidraulica Dosapro Milton Roy, para que mediante la mezcla de estos dos solventes en una camara de premezcla sea posible la extraccion de los fosfolipidos presentes en el material de partida. Los parametros de trabajo fueron: presion 350 bar, caudal de CO225 g/min, caudal de etanol 1,58 mL/min, y 40°C. El tiempo de la extraccion fue de 80 min. El etanol presente en el extracto obtenido se evaporo en condiciones de vado (menor a 10 mbar) y temperatura maxima de 40°C, para evitar la oxidation del mismo. Se obtuvo en estas condiciones un peso de extracto de 826,6±8,13 mg, que representa el 11,02% de la piel de Illex argentinus molida desgrasada.
EJEMPLO 6. Extraccion de la fraction de fosfolipidos presentes en la piel de Illex argentinus molida desgrasada mediante la aplicacion de CO2 supercritico y 2,5% de etanol como modificador
Se partio de 7,5 g de piel de Illex argentinus molida parcialmente desgrasada obtenida en el ejemplo 3, que se introdujo en la celda de extraccion con agitation del equipo TharSCF. El proceso de extraccion se realizo durante 80 min, del mismo modo que el definido en el Ejemplo 5, utilizando esta vez 2,5% de etanol. Los parametros de trabajo fueron: presion del CO2350 bar, caudal de CO225 g/min, caudal de etanol 0,79 mL/min, y 40°C. El peso del extracto obtenido fue de aproximadamente 605,56 mg, que representa el 8,06% de la piel de pota molida desgrasada.

Claims (35)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para la obtencion de una composition que comprende fosfoKpidos a partir de un producto de cefalopodos que comprende fosfoKpidos y Kpidos neutros, donde dicho procedimiento comprende:
(a) proporcionar un producto de cefalopodos seco y particulado que comprende lipidos neutros y fosfolipidos;
(b) someter el producto de la etapa (a) a extraction con un fluido supercritico aplicando agitation para obtener un residuo que comprende menos de un 30% en peso de lipidos neutros respecto al peso total de lipidos neutros y fosfolipidos en dicho residuo; y (c) someter el residuo de la etapa (b) a extraccion con disolvente, donde dicho disolvente comprende un fluido supercritico y del 1% al 10% en volumen con respecto al volumen total del fluido supercritico de un alcanol C1-C4 para obtener una composicion que comprende al menos el 80% en peso de fosfolipidos respecto al peso de fosfolipidos presente en el producto de la etapa (a).
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que los lipidos neutros se seleccionan del grupo que consiste en trigliceridos, acidos grasos, colesterol, esteres de colesterol y mezclas de los mismos.
3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que los fosfolipidos se seleccionan del grupo que consiste en fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina y mezcla de los mismos.
4. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto de cefalopodos se selecciona de entre piel y visceras de cefalopodos.
5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, en el que el producto de cefalopodos es piel de cefalopodos.
6. Procedimiento segun la cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cefalopodo se selecciona de entre sepia y calamar.
7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que el cefalopodo es Illex argentinus.
8. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto de cefalopados seco y particulado de la etapa (a) definida en la reivindicacion 1 comprende un 90% de particulas con un tamano de parricula inferior a 3 mm.
9. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el fluido supercritico es CO 2 supercritico.
10. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente de la etapa (c) comprende del 1% al 8% en volumen con respecto al volumen total del fluido supercritico de un alcanol C 1 -C 4 .
11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, en el que el disolvente de la etapa (c) comprende del 1% al 8% en volumen con respecto al volumen total del fluido supercritico de un alcanol C 1 -C 4 .
12. Procedimiento segun la reivindicacion 11, en el que el disolvente de la etapa (c) comprende del 2% al 5% en volumen con respecto al volumen total del fluido supercritico de un alcanol C 1 -C 4 .
13. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el alcanol C 1 -C 4 es etanol.
14. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que tras la etapa (b) definida en la reivindicacion 1 se obtiene un residuo con menos de un 15% en peso de lipidos neutros respecto al peso total de lipidos neutros y fosfolipidos en dicho residuo.
15. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (b) definida en la reivindicacion 1 se lleva a cabo durante al menos 60 minutos.
16. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (b) definida en la reivindicacion 1 se lleva a cabo durante un periodo de tiempo de entre 60 minutos y 120 minutos.
17. Procedimiento segun la reivindicacion 16, en el que el periodo de tiempo es de entre 70 minutos y 90 minutos.
18. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la extraction de la etapa (b) definida en la reivindicacion 1 se realiza a una presion de entre 150 y 400 bares.
19. Procedimiento segun la reivindicacion 18, en el que la extraccion de la etapa (b) definida en la reivindicacion 1 se realiza a una presion de entre 300 y 400 bares.
20. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la extraccion de la etapa (b) definida en la reivindicacion 1 se realiza a una temperatura de entre 30 y 50 °C.
21. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que tras la etapa (c) definida en la reivindicacion 1 se obtiene una composition que comprende al menos el 90% en peso de los fosfolipidos respecto al peso total de fosfolipidos presentes en el producto de la etapa (a).
22. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (c) definida en la reivindicacion 1 se lleva a cabo durante al menos 60 minutos.
23. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (c) definida en la reivindicacion 1 se lleva a cabo durante un periodo de tiempo de entre 60 minutos y 120 minutos.
24. Procedimiento segun la reivindicacion 23, en el que el periodo de tiempo es de entre 70 minutos y 90 minutos.
25. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la extraccion de la etapa (c) definida en la reivindicacion 1 se realiza a una presion de entre 150 y 400 bares.
26. Procedimiento segun la reivindicacion 25, en el que la extraccion de la etapa (c) definida en la reivindicacion 1 se realiza a una presion de entre 200 y 300 bares.
27. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la extraccion de la etapa (c) definida en la reivindicacion 1 se realiza a una temperatura de entre 30 y 50 °C.
28. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que ademas comprende tras la etapa (c), aislar los componentes solubles del extracto del disolvente empleado en la etapa (c).
29. Un extracto que comprende fosfolipidos obtenible mediante el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.
30. Extracto segun la reivindicacion 29, donde los fosfolipidos comprenden acidos grasos omega-3.
31. Extracto segun la reivindicacion 30, donde los acidos grasos omega-3 se seleccionan entre acido eicosapentaenoico (EPA), acido docosapentaenoico (DPA), acido docosahexaenoico (DHA) y mezcla de los mismos.
32. Una composicion que comprende fosfolipidos obtenible mediante el procedimiento definido en la reivindicacion 28.
33. Composicion segun la reivindicacion 32, que comprende al menos un 80% en peso de fosfolipidos.
34. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 32 o 33, donde los fosfolipidos comprenden acidos grasos omega-3.
35. Composicion segun la reivindicacion 34, donde los acidos grasos omega-3 se seleccionan entre acido eicosapentaenoico (EPA), acido docosapentaenoico (DPA), acido docosahexaenoico (DHA) y mezcla de los mismos.
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