ES2672695T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento del mismo que tienen reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1, comprendiendo el anticuerpo o el fragmento del mismo una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7 y una región variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NOs: 9, 10 y 11.

Description

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DESCRIPCION

Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de un anticuerpo contra CAPRIN-1 o un fragmento del mismo en un fármaco tal como un agente terapéutico y/o preventivo para el cáncer, como se especifica en las reivindicaciones.

Técnica antecedente

El cáncer es la principal causa de muerte. Actualmente, esta enfermedad se trata principalmente mediante terapia quirúrgica en combinación con radioterapia y/o quimioterapia. A pesar del reciente desarrollo de novedosas técnicas quirúrgicas o el descubrimiento de novedosos agentes anticancerosos, el tratamiento existente del cáncer tiene un resultado insuficientemente mejorado, excepto en algunos tipos de cáncer. Con los avances recientes de la biología molecular o la inmunología del cáncer, se han identificado anticuerpos que reaccionan específicamente con el cáncer, antígenos cancerosos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos, genes que codifican dichos antígenos cancerosos y similares, elevando las expectativas sobre la terapia específica contra el cáncer dirigida a antígenos cancerosos (bibliografía no de patente 1).

Para reducir el efecto secundario de la terapia contra el cáncer, es deseable que los péptidos, polipéptidos o proteínas reconocidos como antígenos del cáncer rara vez existan en las células normales y existan específicamente en las células cancerígenas. En 1991, Boon y col., (Ludwig Institute for Cancer Research, Bélgica) aislaron un antígeno de melanoma humano MAGE1 reconocido por linfocitos T CD8 positivos mediante un método de clonación de expresión de ADNc usando líneas de células cancerosas autólogas y linfocitos T reactivos con cáncer (bibliografía no de patente 2). A continuación, se indicó un método SEREX (identificación serológica de antígenos mediante clonación de expresión recombinante), que adopta un enfoque de clonación de expresión génica para identificar antígenos tumorales reconocidos por anticuerpos producidos en respuesta al cáncer autólogo in vivo en un paciente con cáncer (bibliografía no de patente 3 y bibliografía de patente 1). De acuerdo con este método, se han aislado algunos antígenos cancerosos que rara vez se expresan en células normales y se expresan específicamente en cáncer (bibliografía no de patente 4 a 9). Además, la terapia celular que usa inmunocitos que reaccionan específicamente con antígenos cancerosos o la inmunoterapia específica para el cáncer usando vacunas o similares que comprenden antígenos cancerosos está bajo ensayo clínico dirigido a algunos de los antígenos cancerosos aislados.

En los últimos años han surgido en el mundo diversos fármacos de anticuerpos para el tratamiento del cáncer dirigidos a las proteínas antigénicas en las células cancerosas. Estos fármacos han recibido atención debido a su determinada eficacia como agentes terapéuticos específicos para el cáncer. Sin embargo, una gran mayoría de las proteínas antigénicas dirigidas por los fármacos, también se expresan en células normales. Como resultado de la administración de los anticuerpos, las células normales que expresan los antígenos así como las células cancerosas se dañan, dando como resultado, de manera desventajosa, un efecto secundario. Por tanto, si se pueden identificar los antígenos cancerosos expresados específicamente en la superficie de las células cancerosas y se pueden usar los anticuerpos dirigidos a los antígenos como fármacos, se puede esperar que estos fármacos de anticuerpos consigan un tratamiento con menos efectos secundarios.

La proteína 1 (CAPRIN-1) asociada a la proliferación y la activación citoplásmica se conoce como una proteína intracelular que se expresa tras la activación o la división celular de células normales en reposo y forma gránulos de estrés citoplásmico con ARN intracelulares para participar en la regulación del transporte y traducción de ARNm. Se ha encontrado que esta proteína se expresa específicamente en la superficie de las células cancerosas y, por lo tanto, se está estudiando como objetivo de los fármacos de anticuerpos para el tratamiento del cáncer (bibliografía de patente 2).

Lista de citas

Bibliografía de patente

Bibliografía de patente 1: patente de los EE.UU. n.° 5698396 Bibliografía de patente 2: documento WO2010/016526

Bibliografía no de patente

Bibliografía no de patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, vol. 24, p. 511-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japón)

Bibliografía no de patente 2: Bruggen P y col., Science, 254: 1643-1647 (1991)

Bibliografía no de patente 3: Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 92: 11810-11813 (1995)

Bibliografía no de patente 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

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Bibliografía no de patente 5 Bibliografía no de patente 6 Bibliografía no de patente 7 Bibliografía no de patente 8 Bibliografía no de patente 9

Sumario de la invención

Problema técnico

Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998) Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998) Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999) Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996) Hum. Mol. Gene 6:33-39 1997

Un objetivo de la presente invención es producir un anticuerpo que se dirija a CAPRIN-1 específicamente expresada en la superficie de las células cancerosas y tenga una mejor actividad antitumoral que los anticuerpos convencionales, y proporcione el uso del anticuerpo para su uso como agente terapéutico y/o preventivo del cáncer.

Solución al problema

La presente invención tiene los siguientes aspectos:

La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1, comprendiendo el anticuerpo o fragmento del mismo una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 9, 10 y 11.

En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo biespecífico.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento del mismo como principio activo, y una combinación farmacéutica como se define en las reivindicaciones. La invención también proporciona dichas composición farmacéutica y dicha combinación farmacéutica, cada una para su uso en un método para tratar y/o evitar el cáncer.

En una realización de la presente invención, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.

Efectos ventajosos de la invención

El anticuerpo contra CAPRIN-1 usado en la presente invención daña las células cancerosas. Por tanto, el anticuerpo contra CAPRIN-1 es útil en el tratamiento y/o la prevención del cáncer.

Descripción de las realizaciones

El anticuerpo contra un polipéptido CAPRIN-1 usado en la presente invención se puede examinar para determinar su actividad antitumoral, como se describe más adelante, examinando in vivo la inhibición de la proliferación tumoral en un animal portador de cáncer o examinando ex vivo la presencia o la ausencia de actividad citotóxica mediada por inmunocitos o complemento mostrada por el anticuerpo contra células tumorales que expresan el polipéptido.

El anticuerpo contra CAPRIN-1 usado en la presente invención es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína CAPRIN-1. Dicho anticuerpo monoclonal puede ser cualquier tipo de anticuerpo que pueda ejercer actividad antitumoral e incluye, por ejemplo, anticuerpos de animales no humanos (p. ej, anticuerpos monoclonales de ratón, rata, conejo y pollo), anticuerpos recombinantes (p. ej, anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos monocatenarios (scFv)), anticuerpos humanos y sus fragmentos de anticuerpos (p. ej., Fab, F(ab')2 y Fv). Estos anticuerpos y sus fragmentos se pueden preparar mediante los métodos generalmente conocidos por los expertos en la técnica. En el caso de un sujeto humano, es deseable un anticuerpo humanizado para evitar o suprimir el rechazo.

El anticuerpo es una clase de molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD o IgY o cualquier subclase, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2.

El anticuerpo puede modificarse adicionalmente por acetilación, formilación, amidación, fosforilación, PEGilación o similares, además de glicosilación.

En este contexto, la expresión " que se une específicamente a la proteína CAPRIN-1" significa que el anticuerpo se une específicamente a la proteína CAPRIN-1 sin unirse sustancialmente a otras proteínas.

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El sujeto para recibir el tratamiento y/o la prevención del cáncer de acuerdo con la presente invención es un mamífero tal como un ser humano, un animal de compañía, ganado o un animal de deporte, preferentemente un ser humano.

En lo sucesivo en el presente documento, se describirá la preparación del antígeno, la preparación del anticuerpo y una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención.

<Preparación del antígeno para la preparación del anticuerpo>

Las proteínas o fragmentos de las mismas usados como antígenos sensibilizantes para obtener el anticuerpo contra CAPRIN-1 usado en la presente invención no están limitados por los tipos de animales que sirven como sus orígenes, incluyendo seres humanos, perros, ganado bovino, caballos, ratones, ratas y pollos. Las proteínas o los fragmentos de las mismas, sin embargo, se seleccionan preferentemente en vista de la compatibilidad con las células parentales para su uso en la fusión celular. En general, se prefieren las proteínas procedentes de mamíferos. En particular, se prefieren las proteínas procedentes de seres humanos. Por ejemplo, cuando CAPRIN-1 es CAPRIN-1 humana, las proteínas humanas CAPRIN-1, sus péptidos parciales o las células que expresan CAPRIN-1 humana pueden usarse como antígenos sensibilizantes.

Las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la CAPRIN-1 humana y sus homólogos se pueden obtener, por ejemplo, creando un acceso a GenBank (NCBI, EE.UU.) y usando el algoritmo BLAST o FASTA (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90: 5873-5877, 1993; y Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25:3389- 3402, 1997).

En la presente invención, con referencia a la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1 o 3) o la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 o 4) de CAPRIN-1 humana, los objetivos son ácidos nucleicos o proteínas que consisten en secuencias que tienen 70 % a 100 %, preferentemente 80 % a 100 %, más preferentemente 90 % a 100 %, aún más preferentemente 95 % a 100 %, por ejemplo, 97 % a 100 %, 98 % a 100 %, 99 % a 100 %, o una identidad de secuencia del 99,5 % al 100 % con la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos de la ORF o la porción madura de la referencia. En este contexto, la expresión "% de identidad de secuencia" significa un porcentaje (%) del número de aminoácidos (o bases) idénticos al número total de aminoácidos (o bases) cuando dos secuencias están alineadas de manera que el grado máximo de la similitud o identidad se puede conseguir con o sin huecos introducidos.

Los fragmentos de cada proteína CAPRIN-1 tienen longitudes que oscilan entre la longitud de aminoácidos de un epítopo (o un determinante antigénico), que es la unidad más pequeña reconocida por el anticuerpo, y menos de la longitud completa de la proteína. El epítopo se refiere a un fragmento polipeptídico que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamíferos, preferentemente seres humanos. Su unidad más pequeña consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, por ejemplo, 8 a 11 aminoácidos.

Los polipéptidos que comprenden las proteínas CAPRIN-1 humanas anteriores y sus péptidos parciales se pueden sintetizar de acuerdo con métodos de síntesis química, por ejemplo, métodos Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) y tBoc (t-butiloxicarbonilo) (Seikagaku Jikken Koza (Curso de Experimentación Bioquímica en Inglés) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokio Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japón), 1981). Además, estos polipéptidos se pueden sintetizar mediante métodos habituales usando diversos sintetizadores de péptidos disponibles en el mercado. Como alternativa, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos pueden prepararse usando enfoques de ingeniería genética conocidos en la técnica (Sambrook y col., Molecular Cloning, 2a edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edición, Un compedio de Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; etc.) y se incorporan en vectores de expresión, que luego se introducen en las células huésped de modo que las células huésped produzcan los polipéptidos. De este modo, pueden obtenerse los polipéptidos de interés.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos se pueden preparar fácilmente mediante enfoques de ingeniería genética conocidos en la técnica o métodos habituales usando sintetizadores de ácidos nucleicos disponibles en el mercado. Por ejemplo, un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos del gen CAPRIN-1 humano se puede preparar mediante RCP usando una biblioteca de ADN o ADNc cromosómico humano como molde y un par de cebadores diseñados para poder amplificar la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ. ID NO: 1. Las condiciones de reacción para esta RCP pueden determinarse de manera adecuada. Ejemplos de las condiciones pueden incluir, pero sin limitación, 30 ciclos cada uno que implican etapas de reacción que consisten en 94 °C durante 30 segundos (desnaturalización), 55 °C durante 30 segundos a 1 minuto (hibridación), y 72 °C durante 2 minutos (elongación) usando ADN polimerasa de termotolerancia (p. ej., Taq polimerasa, Pfu polimerasa) y un tampón de RCP que contiene Mg2, seguido de reacción a 72 °C durante 7 minutos. El enfoque de RCP, las condiciones, etc. se describen, por ejemplo, en Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edición, Un compedio de Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (en particular, el capítulo 15).

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Además, se pueden preparar sondas o cebadores adecuados basándose en la información sobre las secuencias de nucleótidos del gen CaPrIN-1 y las secuencias de aminoácidos de las proteínas CAPRIN-1, y se pueden usar en el tamizaje de, por ejemplo, una biblioteca de ADNc humano, para aislar el ADN deseado. Preferentemente, dicha biblioteca de ADNc se produce a partir de células, órganos o tejidos que expresan proteínas CAPRIN-1. Ejemplos de dichas células o tejidos incluyen células o tejidos procedentes de los testículos o de cánceres o tumores tales como leucemia, cáncer de mama, linfoma, tumor cerebral, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas y cáncer de intestino grueso. Estas operaciones, incluida la preparación de sondas o cebadores, la construcción de una biblioteca de ADNc, el tamizaje de la biblioteca de aDNc y la clonación del gen de interés, son conocidos por los expertos en la técnica y se pueden realizar de acuerdo con los métodos descritos, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning, 2a edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), y Ausubel y col., (ibídem.). Los ADN que codifican las proteínas humanas CAPRIN-1 y sus péptidos parciales se pueden obtener a partir del ADN así obtenido.

Las células huésped pueden ser cualquier célula que pueda expresar los polipéptidos anteriores. Ejemplos de células procariotas incluyen, pero sin limitación, E. coli. Ejemplos de células eucariotas incluyen, pero sin limitación: células de mamíferos tales como células de riñón de mono COS1 y células de ovario de hámster chino CHO; una línea celular HEK293 de riñón embrionario humano; una línea celular NIH3T3 de piel embrionaria de ratón; células de levadura tales como levadura en gemación y células de levadura de fisión; células de gusano de seda; y óvulos de Xenopus.

En el caso de usar células procariotas como células huésped, los vectores de expresión usados tienen un origen que permite la replicación en las células procariotas, un promotor, un sitio de unión ribosómica, un sitio de multiclonación, un terminador, un gen de resistencia a fármacos, un gen complementario auxotrófico, etc. Ejemplos de vectores de expresión para E. coli pueden incluir series pUC, pBluescript II, sistemas de expresión pET y sistemas de expresión pGEX. Los ADN que codifican los polipéptidos anteriores pueden incorporarse en dichos vectores de expresión con los que las células huésped procariotas se transforman a continuación, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de modo que los polipéptidos codificados por los ADN se expresen en las células huésped procariotas. A este respecto, los polipéptidos se pueden expresar como proteínas de fusión con otras proteínas.

En el caso de usar células eucariotas como células huésped, se usan vectores de expresión para células eucariotas que tienen un promotor, una región de corte y empalme, un sitio de adición de poli(A), etc. como vectores de expresión. Ejemplos de dichos vectores de expresión pueden incluir vectores pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 y pYES2. De la misma manera que antes, los ADN que codifican los polipéptidos anteriores pueden incorporarse en dichos vectores de expresión con los que las células huésped eucariotas se transforman a continuación, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de modo que los polipéptidos codificados por los ADN se expresen en las células huésped eucariotas. En el caso de usar vectores de expresión tales como pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 o pEGFP-C1, los polipéptidos pueden expresarse como diversas proteínas de fusión marcadas con la etiqueta His (p. ej., (His)6-(His)10), etiqueta FLAG, etiqueta myc, etiqueta HA, gFp, o similares.

Los vectores de expresión se pueden introducir en las células huésped usando métodos bien conocidos tales como electroporación, un método de fosfato de calcio, un método de liposomas, un método de DEAE dextrano, microinyección, infección viral, lipofección y unión con péptidos que penetran en la célula.

El polipéptido de interés se puede aislar y purificar a partir de las células huésped mediante una combinación de operaciones de separación conocidas en la técnica. Ejemplos de las mismos incluyen, pero sin limitación, tratamiento con un desnaturalizante (p. ej., urea) o un detergente, ultrasonidos, digestión enzimática, precipitación de proteínas por adición de sal, fraccionamiento y precipitación del disolvente, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, electroforesis de enfoque isoeléctrico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad y cromatografía de fase inversa.

<Estructura del anticuerpo>

Generalmente, los anticuerpos son glicoproteínas heteromultiméricas que comprenden al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las inmunoglobulinas distintas de IgM son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 kDa, cada una compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Normalmente, cada cadena ligera está conectada a una cadena pesada a través de un único enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas varía entre diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada una de las cadenas pesadas y ligeras también tiene un enlace disulfuro intracatenario. Cada cadena pesada tiene un dominio variable (región VH) en un extremo, seguido de una serie de regiones constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (región VL) en un extremo y tiene una sola región constante en el otro extremo. La región constante de la cadena ligera está alineada con la primera región constante de la cadena pesada, mientras que el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las regiones particulares denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en los dominios variables del anticuerpo muestran variabilidad específica y transmiten especificidad de unión al anticuerpo. Las porciones relativamente conservadas en las regiones variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables completos de cadena pesada y ligera comprenden cada uno cuatro FR conectadas a través de

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tres CDR. Estas tres CDR se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3 en este orden desde el extremo N de la cadena pesada. Análogamente, las CDR se denominan CDRL1, CDRL2 y CDRL3 en la cadena ligera. CDRH3 es la más importante para la especificidad de unión del anticuerpo por su antígeno. Además, las CDR en cada cadena se mantienen cercanas entre sí por las regiones FR y contribuyen a la formación de un sitio de unión a antígeno en el anticuerpo, junto con las CDR en la otra cadena. Las regiones constantes no contribuyen directamente a la unión anticuerpo-antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, por ejemplo, implicación en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis mediada por la unión a un receptor Fcy, tasa de semivida/eliminación mediada por un receptor Fc neonatal (FcRn) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediada por un componente C1q en la cascada del complemento.

<Preparación del anticuerpo>

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 de acuerdo con la presente invención significa un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 de longitud completa o un fragmento de la misma.

En este contexto, la "reactividad inmunológica" significa la propiedad del anticuerpo que se une al antígeno CAPRIN- 1 in vivo. A través de dicha unión, el anticuerpo ejerce la función de dañar (p. ej, matar, suprimir o retroceder) el tumor. Específicamente, el anticuerpo usado en la presente invención no está limitado por su tipo siempre que el anticuerpo pueda dañar tumores tales como cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma como resultado de la unión a la proteína CAPRIN-1.

En lo sucesivo en el presente documento, se mostrarán ejemplos de preparación de diversos anticuerpos monoclonales.

Por ejemplo, las líneas celulares de cáncer de mama SK-BR-3 que expresan CAPRIN-1 se administran a cada ratón para la inmunización. El bazo se extrae de este ratón. Después de la separación de las células esplénicas, las células se fusionan con células de mieloma de ratón. Los clones que producen anticuerpos que tienen un efecto antiproliferativo de una célula cancerosa se seleccionan de entre las células de fusión obtenidas (hibridomas). Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que tienen un efecto antiproliferativo de una célula cancerosa se aíslan y se cultivan. El anticuerpo de interés se puede preparar por purificación del sobrenadante del cultivo de acuerdo con un método de purificación por afinidad general.

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales se pueden preparar, por ejemplo, de la siguiente manera: en primer lugar, los animales se inmunizan con antígenos sensibilizantes de acuerdo con un método conocido en la técnica. Este método de inmunización generalmente implica la inyección intraperitoneal o subcutánea de los antígenos sensibilizantes a los mamíferos. Específicamente, los antígenos sensibilizantes se diluyen con o se suspenden en PBS (solución salina tamponada con fosfato), solución salina fisiológica o similar en una cantidad adecuada y luego se mezclan, si se desea, con una cantidad adecuada de un adyuvante convencional, por ejemplo, un adyuvante completo de Freund. Después de la emulsificación, la emulsión resultante se administra a cada mamífero varias veces cada 4 a 21 días. Como alternativa, se puede usar un portador adecuado para la inmunización con antígenos sensibilizantes.

Después de la confirmación de un aumento en el nivel del anticuerpo deseado en el suero del mamífero así inmunizado, los inmunocitos se recogen del mamífero y se someten a fusión celular. Ejemplos preferentes de los inmunocitos incluyen particularmente células esplénicas.

Las células de mieloma de mamíferos se usan como células parentales asociadas para fusionarse con los inmunocitos. Diversas líneas celulares conocidas en la técnica, por ejemplo, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (temas actuales en microbiología e inmunología ( 1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DH y col., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. y col., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, SF y col., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), SS194 (Trowbridge, IS J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), y R210 (Galfre, G. y col., Nature (1979) 277, 131-133), se usan preferentemente como células de mieloma.

La fusión celular entre los inmunocitos y las células de mieloma puede realizarse básicamente de acuerdo con un método conocido en la técnica, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Más específicamente, la fusión celular se lleva a cabo, por ejemplo, en presencia de un promotor de fusión celular en un medio nutriente convencional. Por ejemplo, se usa polietilenglicol (PEG) o virus hemaglutinante de Japón (HVJ) como el promotor de fusión. Si se desea, se puede añadir adicionalmente un auxiliar tal como dimetilsulfóxido con el fin de potenciar la eficacia de la fusión.

La relación entre los inmunocitos y las células de mieloma usadas puede establecerse arbitrariamente. Por ejemplo,

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la cantidad de los inmunocitos se ajusta preferentemente de 1 a 10 veces la cantidad de células de mieloma. Ejemplos del medio que puede usarse en la fusión celular incluyen medios RPMI1640 y MEM adecuados para el crecimiento de las líneas celulares de mieloma, así como medios convencionales para su uso en este tipo de cultivo celular. Además, se puede usar un suplemento de suero tal como suero de ternera fetal (FCS) en combinación con estas células.

Para la fusión celular, los inmunocitos y las células de mieloma se mezclan bien en una cantidad predeterminada del medio. Generalmente se añade una solución de PEG (peso molecular medio: por ejemplo, aproximadamente 1000 a 6000) precalentada a aproximadamente 37 °C a la mezcla a una concentración de 30 a 60 % (p/v) y se mezcla con la misma para formar los hibridomas de interés. Posteriormente, se repiten procedimientos para añadir secuencialmente un medio adecuado y eliminar el sobrenadante por centrifugación para eliminar los agentes de fusión celular o similares desfavorables para el crecimiento de los hibridomas.

Los hibridomas así obtenidos se cultivan en un medio selectivo convencional, por ejemplo, un medio HAT (medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina) para la selección. El cultivo en el medio HAT se continúa durante un período (generalmente, varios días a varias semanas) suficiente para la muerte de células distintas de los hibridomas de interés (células no fusionadas). Posteriormente, los hibridomas que producen el anticuerpo de interés se tamizan y se clonan como clones individuales mediante un método de dilución limitante convencional.

Además de dicha obtención de los hibridomas mediante la inmunización de animales no humanos con antígenos, se pueden obtener hibridomas que producen anticuerpos humanos que tienen la actividad deseada (p.ej., actividad antiproliferativa celular) sensibilizando linfocitos humanos, por ejemplo, linfocitos humanos infectado por el virus EB, con proteínas, células que expresan proteínas, o sus lisados in vitro y que fusionan los linfocitos sensibilizados con células de mieloma procedentes de seres humanos que pueden dividirse permanentemente, por ejemplo, U266 (n.° de acceso TIB 196).

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales así preparados pueden subcultivarse en un medio convencional y también pueden almacenarse durante un largo período en nitrógeno líquido.

Específicamente, los antígenos o células deseadas que expresan los antígenos deseados se usan como antígenos sensibilizantes en la inmunización de acuerdo con un método de inmunización convencional. Los inmunocitos obtenidos se fusionan con células parentales conocidas en la técnica de acuerdo con un método de fusión celular convencional. Las células productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) se pueden tamizar mediante un método de tamizaje convencional para preparar el anticuerpo de interés.

En este contexto, por ejemplo, los ratones KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) y los ratones Xeno (Amgen Inc.) son conocidos como ratones productores de anticuerpos humanos (p. ej., publicaciones internacionales n.° WO02/43478 y WO02/092812). Pueden obtenerse anticuerpos policlonales humanos completos a partir de la sangre de dichos ratones inmunizados con proteínas CAPRIN-1 o fragmentos de las mismas. Como alternativa, las células esplénicas se pueden aislar de los ratones así inmunizados y fusionarse con células de mieloma. De este modo, se pueden obtener anticuerpos monoclonales humanos.

Los antígenos pueden prepararse de acuerdo con, por ejemplo, un método que usa células animales (publicación de patente JP (Kohyo) n.° 2007-530068) o un método que usa baculovirus (p. ej., publicación Internacional n.° WO98/46777). Los antígenos que tienen baja inmunogenicidad pueden unirse a macromoléculas inmunogénicas tales como albúmina para la inmunización.

Como alternativa, se pueden usar anticuerpos recombinantes, que se producen usando una técnica de recombinación génica que implica: clonar los genes del anticuerpo a partir de hibridomas; incorporar los genes del anticuerpo en vectores adecuados; e introducir los vectores en los huéspedes (véase, p. ej., Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Específicamente, los ADNc de la región variable del anticuerpo (región V) se sintetizan a partir de los ARNm de hibridomas usando transcriptasa inversa. Después de la obtención de los ADN que codifican las regiones V del anticuerpo de interés, los ADN se ligan con ADN que codifican las regiones constantes del anticuerpo deseado (regiones C). Los productos de ligación resultantes se incorporan a continuación en vectores de expresión. Como alternativa, los ADN que codifican la región V del anticuerpo pueden incorporarse en vectores de expresión que contienen ADN de la región C del anticuerpo. Estos ADN se incorporan en los vectores de expresión para expresarse bajo el control de regiones de control de la expresión, por ejemplo, un potenciador y un promotor. A continuación, las células huésped se pueden transformar con los vectores de expresión resultantes y se les permite expresar anticuerpos.

Tal como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invención es cualquiera de los diversos anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos monoclonales de animales no humanos y anticuerpos recombinantes.

Estos anticuerpos monoclonales de animales no humanos pueden prepararse mediante el cultivo de hibridomas

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obtenidos mediante la fusión entre células esplénicas de animales no humanos (p. ej., ratones, ratones productores de anticuerpos humanos, pollo o conejos) inmunizados con proteínas CAPRIN-1 y células de mieloma.

El anticuerpo recombinante incluye, como se ha descrito anteriormente, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos multiespecíficos y similares.

El anticuerpo quimérico puede prepararse: ligando los ADN que codifican regiones variables de cadena ligera o pesada de un anticuerpo procedente de un animal no humano (p. ej., ratón, rata, conejo o pollo) con los ADN que codifican regiones constantes de cadena ligera o pesada procedentes de un anticuerpo humano; incorporando los genes de fusión resultantes en vectores de expresión; e introduciendo los vectores en huéspedes de modo que se produzcan anticuerpos.

Específicamente, el anticuerpo quimérico es, por ejemplo, un anticuerpo compuesto por regiones variables de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos de ratón y una región constante de cadena pesada y ligera de anticuerpos humanos. El anticuerpo quimérico puede prepararse usando un método conocido en la técnica que implica, por ejemplo: ligar los ADN que codifican regiones V de anticuerpo de ratón con los ADN que codifican regiones C de anticuerpo humano; incorporar los productos de ligación resultantes en vectores de expresión; e introducir los vectores en huéspedes de modo que se produzcan anticuerpos. En los ejemplos descritos más adelante, se prepararon anticuerpos quiméricos de humano-ratón y se confirmó que tenían un efecto antitumoral. Estos anticuerpos monoclonales comprenden una región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, en los que la región VH comprende CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la región VL comprende CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11.

El anticuerpo humanizado, también denominado anticuerpo humano reconformado, es un anticuerpo modificado por ingeniería genética. El anticuerpo humanizado se construye injertando las CDR de anticuerpo humano con las CDR correspondientes al anticuerpo procedente de un animal inmunizado. Específicamente, los ADN en los que las secuencias codificantes de CDR en los ADN que codifican una región variable de cadena ligera o pesada procedente de anticuerpo humano se sustituyen por las secuencias codificantes de CDR correspondientes de un anticuerpo procedente de animales no humanos (p. ej., ratón, rata, conejo o pollo) se preparan y se ligan con los ADN que codifican regiones constantes de cadenas ligeras o pesadas procedentes de anticuerpos humanos. Los genes de fusión resultantes se pueden incorporar en vectores de expresión, que luego se introducen en huéspedes para la producción de anticuerpos para preparar el anticuerpo humanizado de interés.

Específicamente, por ejemplo, las secuencias de ADN diseñadas para unir las CDR de anticuerpos de ratón y pollo y las regiones marco de anticuerpos humanos (FR) se sintetizan por RCP usando varios oligonucleótidos preparados que tienen porciones terminales solapadas entre sí. Los ADN obtenidos se ligan con los ADN que codifican regiones constantes de anticuerpos humanos. Posteriormente, los productos de ligación resultantes se incorporan en vectores de expresión, que luego se introducen en huéspedes para la producción de anticuerpos para obtener el anticuerpo de interés (véase la publicación de solicitud de patente europea n.° EP239400 y la publicación internacional n.° WO96/02576). Las fR de anticuerpo humano conectadas mediante CDR se seleccionan de manera que las CDR forman un sitio de unión a antígeno favorable. Si es necesario, los aminoácidos en las regiones marco de las regiones variables de anticuerpos pueden estar sustituidos de modo que las CDR del anticuerpo humano reconformado resultante forman un sitio de unión a antígeno adecuado (Sato K. y col., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Además, estas regiones marco pueden reemplazarse por regiones marco procedentes de diversos anticuerpos humanos (véase la publicación internacional n.° WO99 /51743).

Las regiones marco de anticuerpo humano conectadas mediante CDR se seleccionan de manera que las CDR forman un sitio de unión a antígeno favorable. Si es necesario, los aminoácidos en las regiones marco de las regiones variables de anticuerpos pueden estar sustituidos de modo que las CDR del anticuerpo humano reconformado resultante forman un sitio de unión a antígeno adecuado (Sato K. y col., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

El anticuerpo monocatenario se refiere a un anticuerpo o el fragmento del mismo que comprende regiones variables de cadenas pesadas y ligeras conectadas linealmente entre sí a través de un enlazador. Se puede preparar un ADN que codifica el anticuerpo monocatenario ligando un ADN que codifica la región variable de la cadena pesada, un ADN que codifica el enlazador, y un ADN que codifica la región variable de la cadena ligera. En este contexto, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se obtienen ambas de un anticuerpo humano o se obtienen de un anticuerpo humano que tiene las CDR solas sustituidas por las CDR de un anticuerpo procedente de un animal no humano (p. ej., ratón, rata, conejo o pollo). El enlazador consiste en 12 a 19 aminoácidos. Ejemplos del mismo incluyen (G4S)3 que consiste en15 aminoácidos (GB Kim y col., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).

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El anticuerpo multiespecífico se refiere a un anticuerpo que puede unirse específicamente a una pluralidad de epítopos diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico (diacuerpo) puede unirse específicamente a dos epítopos diferentes. Un ADN que codifica el anticuerpo biespecífico puede prepararse ligando, por ejemplo, un ADN que codifica una región variable A de cadena pesada, un ADN que codifica una región variable B de cadena ligera, un ADN que codifica una región variable B de cadena pesada y un ADN que codifica una la región variable A de cadena ligera en este orden (a condición de que el ADN que codifica una región variable B de cadena ligera y el ADN que codifica una región variable B de cadena pesada se liguen a través de un ADN que codifica un enlazador como se ha descrito anteriormente). En este contexto, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se obtienen todas de un anticuerpo humano o se obtienen de un anticuerpo humano que tiene las CDR solas sustituidas por las CDR de un anticuerpo procedente de un animal no humano (p. ej., ratón, rata, conejo o pollo).

Los aminoácidos en las regiones variables (p. ej., FR) o las regiones constantes del anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado así preparado pueden sustituirse por otros aminoácidos.

La sustitución de aminoácidos es la sustitución de, por ejemplo, menos de 15, menos de 10, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos aminoácidos, preferentemente 1 a 5 aminoácidos, más preferentemente 1 o 2 aminoácidos. El anticuerpo sustituido debe ser funcionalmente equivalente a un anticuerpo no sustituido. Deseablemente, la sustitución es una sustitución conservativa de aminoácidos, que es la sustitución entre aminoácidos con propiedades similares, tales como carga, cadenas laterales, polaridad y aromicidad. Los aminoácidos se pueden clasificar en términos de propiedades similares en, por ejemplo: aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina); aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico); aminoácidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína y tirosina); aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina); aminoácidos ramificados (leucina, valina e isoleucina); y aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina).

Ejemplos de anticuerpos modificados pueden incluir anticuerpos unidos a diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). En el anticuerpo modificado de la presente invención, la sustancia a unir no está limitada. Con el fin de obtener dicho anticuerpo modificado, el anticuerpo obtenido puede modificarse químicamente. Un método para esto ya se ha establecido en la técnica.

En este contexto, la expresión "funcionalmente equivalente" significa que un anticuerpo de interés tiene una actividad biológica o bioquímica similar a la del anticuerpo de la presente invención, específicamente, el anticuerpo de interés tiene la función de dañar el tumor y esencialmente no produce rechazo cuando se aplica a seres humanos, por ejemplo. Ejemplos de dicha actividad pueden incluir actividad antiproliferativa y actividad de unión.

Un método para preparar un polipéptido funcionalmente equivalente a un determinado polipéptido, que implica introducir una mutación en un polipéptido, es bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los expertos en la materia pueden introducir adecuadamente una mutación en el anticuerpo de la presente invención usando mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T. y col., (1995) Gene 152: 271-275; Zoller, M J., y Smith, M. (1983) Methods Enzymol., 100: 468-500; Kramer, W. y col., (1984) Nucleic Acids Res., 12: 9441-9456; Kramer, W. y Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol., 154: 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 82: 488-492; y Kunkel (1988) Methods Enzymol., 85: 2763-2766) o similares, preparando de este modo un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invención.

Un anticuerpo que reconoce un epítopo de una proteína CAPRIN-1 reconocida por cada anticuerpo anti-CAPRIN-1 descrito anteriormente puede obtenerse mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo se puede obtener mediante un método que implica determinar el epítopo de la proteína CAPRIN-1 reconocida por el anticuerpo anti-CAPRIN-1 mediante un método convencional (o.ej., mapeo de epítopos) y preparar un anticuerpo usando un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos contenida en el epítopo como un inmunógeno, o un método que implica determinar un epítopo para un anticuerpo preparado mediante un método convencional y seleccionar un anticuerpo que reconoce el mismo epítopo que el del anticuerpo anti- CAPRIN-1.

El anticuerpo de la presente invención tiene una constante de afinidad Ka (kon/koff) de preferentemente 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 x 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 x 109 M, al menos 1010 M-1, al menos 5 x 1010

M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 x 1011 M-1, al menos 1012 M-1, o al menos 1013 M-1.

El anticuerpo de la presente invención puede conjugarse con un agente antitumoral. La conjugación del anticuerpo con el agente antitumoral se puede realizar a través de un espaciador que tiene un grupo (p. ej., un grupo

succinimidilo, un grupo formilo, un grupo 2-piridiltio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo o un grupo

hidroxi) reactivo con un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo tiol o similares.

Ejemplos del agente antitumoral incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos públicamente en las bibliografías, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfano, improsulfano, piposulfano, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, butalacinona, camptotecina, briostatina,

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Como alternativa, el anticuerpo de la presente invención se puede administrar en combinación con un agente antitumoral para producir un mayor efecto terapéutico. Este enfoque es adaptable a un paciente con cáncer que expresa CAPRIN-1 antes o después de la operación quirúrgica. Este enfoque puede aplicarse, particularmente después de la cirugía, al cáncer que expresa CAPRIN-1, que se ha tratado convencionalmente con un agente antitumoral solo, para producir una mayor prevención de la reaparición del cáncer o la prolongación del tiempo de supervivencia.

Ejemplos del agente antitumoral usado en la administración combinada con el anticuerpo de la presente invención incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos públicamente en las bibliografías, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfano, improsulfano, piposulfano, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, butalacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, ácido tenuazónico, triazicuona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, irinotecán, inhibidores de topoisomerasas, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina y sales farmacéuticamente aceptables (conocidas en la técnica) y derivados (conocidos en la técnica) de los mismos. En particular, de estos agentes antitumorales, se usan preferentemente ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel o vinorelbina.

Como alternativa, el anticuerpo de la presente invención se puede unir a un radioisótopo conocido públicamente en

De forma deseable,

las bibiliografías, etc., tales como 2llAt, 131I, 125I, 90Y, l86Re, l88Re, l53Sm, 2I‘ se usa un radioisótopo eficaz para el tratamiento o el diagnóstico del tumor.

Bi, 32P

175Lu o 176Lu.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con CAPRIN-1, un anticuerpo que reconoce específicamente CAPRIN-1, o un anticuerpo que se une específicamente a CAPRIN-1 y muestra actividad citotóxica o efecto antiproliferativo sobre el cáncer. El anticuerpo preferentemente debe tener una estructura que provoque poco o ningún rechazo en los animales receptores. Ejemplos de dichos anticuerpos

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incluyen anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos (p. ej., anticuerpos quiméricos de humano-ratón), anticuerpos monocatenarios y anticuerpos biespecíficos cuando los animales receptores son seres humanos. Estos anticuerpos (1) tienen regiones variables de cadenas pesadas y ligeras procedentes de un anticuerpo humano, (2) tienen regiones variables con CDR (CDR1, CDR2, y CDR3) de cadenas pesadas y ligeras derivadas de un anticuerpo animal no humano y regiones marco procedentes de un anticuerpo humano, o (3) estos anticuerpos son anticuerpos recombinantes que tienen regiones variables de cadenas pesadas y ligeras procedentes de un anticuerpo de animal no humano y regiones constantes de cadenas pesadas y ligeras procedentes de un anticuerpo humano. El anticuerpo de la presente invención es preferentemente el anticuerpo (1) o (2).

Dichos anticuerpos recombinantes pueden prepararse de la siguiente manera: los ADN que codifican anticuerpos monoclonales (p. ej., anticuerpos monoclonales humanos, de ratón, de rata, de conejo y de pollo) contra CAPRIN-1 humana se clonan de células productoras de anticuerpos tales como hibridomas y se usan como moldes en RCP-RT o similares para preparar los ADN que codifican las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas en los anticuerpos. Las secuencias respectivas de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas y las respectivas secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 en cada región se determinan basándose en el sistema de numeración Kabat EU (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Dicho ADN que codifica cada región variable o un ADN que codifica cada CDR se prepara usando una técnica de recombinación génica (Sambrook y col., Molecular Cloning A Laborator y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) o un sintetizador de ADN. En este contexto, los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar inmunizando animales humanos productores de anticuerpos (p. ej., ratones) con CAPRIN-1 humana y luego fusionando las células esplénicas extirpadas de los animales inmunizados con células de mieloma. Aparte de esto, se preparan los ADN que codifican regiones variables y constantes de cadenas ligeras o pesadas procedentes de anticuerpo humano, si es necesario, usando una técnica de recombinación génica o un sintetizador de ADN.

Los ADN recombinantes preparados se pueden incorporar a uno o más vectores adecuados, que luego se introducen en células huésped (p. ej., células de mamífero, células de levadura y células de insecto) de modo que los ADN se (co)expresen para producir anticuerpos recombinantes (PJ Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd y C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; y JW Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Ejemplos del anticuerpo de la presente invención preparado mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente incluyen el siguiente anticuerpo (a) obtenido en los ejemplos descritos más adelante:

(a) un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 9, 10 y 11 (p. ej., un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12).

En este contexto, las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7 corresponden a CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo de ratón. Las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 9, 10 y 11 corresponden a CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de una región variable de cadena ligera de un anticuerpo de ratón.

Ejemplos del anticuerpo humanizado, el anticuerpo quimérico, el anticuerpo monocatenario o el anticuerpo multiespecífico de la presente invención incluyen los siguientes anticuerpos (i), (ii) e (iii):

(i) un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7 y las secuencias de aminoácidos de las regiones marco procedentes de anticuerpo humano y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 9, 10 y 11 y las secuencias de aminoácidos de las regiones marco procedentes de anticuerpo humano;

(ii) un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7 y las secuencias de aminoácidos de las regiones marco procedentes de anticuerpo humano, una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano, una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 9, 10 y 11 y las secuencias de aminoácidos de las regiones marco procedentes de anticuerpo humano, y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano; y

(iii) un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencia de aminoácidos representadas por la SEQ ID NO: 8, una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano, una región variable de cadena

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ligera que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano.

Las secuencias de las regiones constantes y variables de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos están disponibles en, por ejemplo, NCBI (EE.UU.; GenBank, UniGene, etc.). Por ejemplo, se puede hacer referencia a las siguientes secuencias: N.° de acceso J00228 para una región constante de una cadena pesada de IgG1 humana; N.° de acceso J00230 para una región constante de una cadena pesada de IgG2 humana; N.° de acceso X03604 para una región constante de una cadena pesada de IgG3 humana; N.° de acceso K01316 para una región constante de una cadena pesada de IgG4 humana; Los n.° de acceso V00557, X64135 y X64133 para una región constante de una cadena k ligera humana; y los n.° de acceso X64132 y X64134 para una región constante de una cadena A ligera humana.

Preferentemente, estos anticuerpos tienen actividad citotóxica y, por lo tanto, pueden ejercer un efecto antitumoral.

Las secuencias particulares anteriores de las regiones variables y las CDR de cadenas pesadas y ligeras en cada anticuerpo se proporcionan simplemente con fines ilustrativos. Es obvio que el anticuerpo de la presente invención no está limitado por las secuencias particulares. Se preparan hibridomas que puedan producir anticuerpos humanos CAPRIN-1 antihumanos o anticuerpos de animales no humanos (p. ej.,anticuerpos de ratón) diferentes de los descritos anteriormente, y los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas se recuperan y se evalúan como (o no) los anticuerpos de interés con actividad de unión inmunológica contra CAPRIN-1 humana y actividad citotóxica como índices. De este modo, se identifican los hibridomas de interés productores de anticuerpos monoclonales. A continuación, los ADN que codifican regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de interés se producen a partir de los hibridomas y se secuencian, como se ha descrito anteriormente. Los ADN se usan para la preparación de los diferentes anticuerpos.

El anticuerpo de la presente invención puede ser el anticuerpo (a) que tiene la sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, particularmente en una secuencia de una región marco y/o una región constante, siempre que el anticuerpo tenga tal especificidad que pueda reconocer específicamente CAPRIN-1. En este contexto, el término "varios" significa preferentemente 2 a 5, más preferentemente 2 o 3.

La presente invención proporciona además un ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención, un ADN que codifica la cadena pesada o ligera del anticuerpo, o un ADN que codifica la región variable de la cadena pesada o ligera en el anticuerpo. Dicho ADN incluye, por ejemplo, un ADN que codifica una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7, y un ADN que codifica una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 9, 10, y 11, en el caso del anticuerpo (a).

Las CDR codificadas por el ADN que tiene estas secuencias sirven como regiones que determinan la especificidad del anticuerpo. Las secuencias que codifican las otras regiones (es decir, regiones constantes y regiones marco) del anticuerpo pueden por lo tanto ser secuencias procedentes de otros anticuerpos. En este contexto, "otros anticuerpos" también incluyen anticuerpos procedentes de organismos no humanos y son preferentemente los procedentes de seres humanos desde el punto de vista de la reducción de los efectos secundarios. Específicamente, el ADN de la presente invención comprende preferentemente secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos procedentes de anticuerpos humanos correspondientes de regiones que codifican cada región marco y cada región constante en las cadenas pesadas y ligeras.

Otros ejemplos del ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención incluyen un ADN que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8, y un ADN que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12. En este contexto, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 es, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 13. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12 es, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 14. Para estos ADN, se prefiere que una región que codifica cada región constante en las cadenas pesadas y ligeras comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente procedente de un anticuerpo humano.

Estos ADN de anticuerpos se pueden obtener, por ejemplo, mediante los métodos descritos anteriormente o el siguiente método: en primer lugar, se preparan ARN totales a partir de hibridomas relacionados con el anticuerpo de la presente invención usando un kit de extracción de ARN disponible en el mercado, y los ADNc se sintetizan usando transcriptasa inversa y cebadores aleatorios o similares. Posteriormente, los ADNc que codifican anticuerpos se amplifican por RCP usando cebadores oligonucleotídicos para secuencias conservadas de cada región variable en genes de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de ratón conocidos. Las secuencias que codifican las regiones constantes se pueden obtener mediante la amplificación por RCP de secuencias conocidas. La secuencia de nucleótidos del ADN puede incorporarse en un plásmido o un fago para la secuenciación, por ejemplo, y

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determinarse de acuerdo con un método habitual.

El efecto antitumoral del anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención sobre las células cancerosas que expresan CAPRIN-1 parece ser provocado por la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediada por células efectoras (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra las células que expresan CAPRIN-1.

Se sabe que el efecto antitumoral basado en el mecanismo se correlaciona con el número de moléculas objetivo que se unen al anticuerpo expresadas en la superficie de las células cancerosas (Niwa R., Clinical Cancer Research 2005 15 de marzo; 11 (6): 2327-2336). El número de moléculas objetivo expresadas en la superficie de las células cancerosas se puede examinar usando un kit de ensayo existente que pueda medir el número de moléculas en la superficie celular. Específicamente, el número de moléculas objetivo que se unen al anticuerpo puede determinarse: haciendo reaccionar células cancerosas con, por ejemplo, anticuerpos contra las moléculas objetivo como anticuerpos primarios; haciendo reaccionar con anticuerpos marcados fluorescentemente contra los anticuerpos primarios, junto con perlas de curva de calibración con el número preliminarmente conocido de moléculas; midiendo la intensidad media de fluorescencia de las muestras; y determinando el número de moléculas objetivo basándose en la curva de calibración obtenida.

Por tanto, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención puede evaluarse para determinar su actividad determinando ex vivo la actividad de ADCC o la actividad de CDC contra células cancerosas que expresan CAPRIN- 1 o examinando el número de moléculas de CAPRIN-1 expresadas en la superficie de las células cancerosas en el caso de usar el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de acuerdo con la presente invención como un anticuerpo primario como se muestra específicamente a continuación en los ejemplos.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención se une a proteínas CAPRIN-1 en células cancerosas y muestra un efecto antitumoral a través de la actividad. Por tanto, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invención es presumiblemente útil en el tratamiento o la prevención del cáncer. Específicamente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, que comprende el anticuerpo anti-CAPRIN-1 como principio activo. El anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado para la administración a cuerpos humanos (terapia de anticuerpos) es preferentemente un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 con mayor afinidad de unión por una proteína CAPRIN-1 en la superficie de las células cancerosas ejerce una actividad antitumoral más fuerte. Por tanto, se puede esperar un efecto antitumoral más fuerte si se puede obtener el anticuerpo anti-CAPRIN-1 que tiene una alta afinidad de unión por la proteína CAPRIN- 1. Dicho anticuerpo es adaptable a una composición farmacéutica destinada al tratamiento y/o la prevención del cáncer. De forma deseable, dicha afinidad de unión alta es preferentemente al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 x 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 x 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 x 1010 M-1, al menos 1011 M' , al menos 5 x 10 M' , al menos 10 M' , o al menos 10 M' , en términos de una constante de asociación (constante de afinidad) Ka (kon/koff), como se ha descrito anteriormente.

La unión de anticuerpos anti-CAPRIN-1 a un número mayor de moléculas de CAPRIN-1 en la superficie de la célula cancerosa produce una actividad antitumoral más fuerte. De forma deseable, el número de moléculas de CAPRIN-1 a las que se unen los anticuerpos para el efecto antitumoral esperado es 104 o más, preferentemente 105 o más moléculas CAPRIN-1 por célula cancerosa medidas usando el anticuerpo anti CAPRIN-1 de la presente invención.

<Unión a células que expresan antígeno>

La capacidad del anticuerpo para unirse a CAPRIN-1 puede determinarse mediante el uso de un ensayo de unión usando, por ejemplo, ELISA, transferencia Western, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo, como se describe en los ejemplos.

<Tinción inmunohistoquímica>

Puede probarse la reactividad del anticuerpo que reconoce CAPRIN-1 con CAPRIN-1 mediante un método inmunohistoquímico bien conocido por los expertos en la técnica usando una sección congelada fijada con paraformaldehído o acetona o una sección de un tejido impregnada en parafina fijada con paraformaldehído obtenido de un paciente durante la operación quirúrgica o de un animal que porta un heterotrasplante inoculado con una línea celular que expresa CAPRIN-1 de manera espontánea o después de la transfección.

Para la tinción inmunohistoquímica, el anticuerpo reactivo con CAPRIN-1 puede teñirse mediante diversos métodos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede visualizar a través de la reacción con un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante o un anticuerpo de cabra anti-pollo.

<Composición farmacéutica>

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Un objetivo de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer de la presente invención no está particularmente limitado siempre que el objetivo sea cáncer (células) que expresen un gen CAPRIN-1.

Los términos "tumor" y "cáncer" usados en el presente documento significan neoplasia maligna y se usan de manera intercambiable entre sí.

El cáncer dirigido en la presente invención es cáncer que expresa un gen que codifica la proteína CAPRIN-1 y es preferentemente cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.

Ejemplos específicos de estos cánceres incluyen, pero sin limitación, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama de tipo complejo, tumor maligno mixto de la glándula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de células escamosas, cáncer de células pequeñas, cáncer de células grandes, glioma que es tumor de tejido neuroepitelial, ependimoma, tumor neuronal, tumor neuroectodérmico embrionario, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentario, linfoma de células pequeñas a medianas, cáncer cecal, cáncer de colon ascendente, cáncer de colon descendente, cáncer de colon transverso, cáncer de colon sigmoide, cáncer de recto, cáncer de ovario epitelial, tumor de células germinales, tumor de células estromales, carcinoma ductal pancreático, carcinoma ductal pancreático invasivo, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasia papilar-mucinosa intraductal, neoplasia quística mucinosa, pancreatoblastoma, cistadenocarcinoma seroso, tumor sólido-pseudopapilar, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endocrina múltiple tipo 1 (síndrome de Wermer), tumor de células de islotes no funcionales, somatostatinoma y VIPoma.

El sujeto de prueba como receptor es preferentemente mamíferos, por ejemplo, mamíferos que incluyen primates, animales de compañía, ganado y animales de deporte, y son particularmente preferentemente los seres humanos, perros y gatos.

En el caso de usar el anticuerpo de la presente invención como una composición farmacéutica, la composición farmacéutica se puede formular mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede usar en forma de una inyección parenteral de una solución o suspensión aséptica con agua o cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede formular con el anticuerpo mezclado en una forma farmacéutica unitaria requerida para la práctica farmacéutica generalmente aceptada, en combinación adecuada con portadores o medios farmacológicamente aceptables, específicamente, agua esterilizada, solución salina fisiológica, aceite vegetal, un emulsionante, un agente de suspensión, un detergente, un estabilizador, un agente aromatizante, un excipiente, un vehículo, un conservante, un aglutinante, etc. La cantidad del principio activo en dicha preparación se determina de modo que se pueda conseguir una dosis adecuada dentro del intervalo prescrito.

Una composición aséptica para inyección se puede formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional usando un vehículo tal como agua destilada inyectable.

Ejemplos de soluciones acuosas para inyección incluyen solución salina fisiológica, soluciones isotónicas que contienen glucosa y otros adyuvantes, por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol o cloruro de sodio. Estas soluciones se pueden usar en combinación con un solubilizante adecuado, por ejemplo, un alcohol (específicamente, etanol) o un polialcohol (p. ej., propilenglicol y polietilenglicol), o un detergente no iónico, por ejemplo, polisorbato 80 (TM) o HCO-60.

Ejemplos de soluciones oleosas incluyen aceite de sésamo y aceite de soja. Estas soluciones pueden usarse en combinación con un solubilizante tal como benzoato de bencilo o alcohol bencílico. Las soluciones se pueden mezclar adicionalmente con un tampón (p. ej., una solución tampón de fosfato y una solución tampón de acetato de sodio), un agente suavizante (p. ej., hidrocloruro de procaína), un estabilizador (p. ej., alcohol bencílico y fenol) y un antioxidante. Las soluciones de inyección así preparadas se cargan generalmente en ampollas adecuadas.

La composición farmacéutica de la presente invención se administra por vía oral o parenteral, preferentemente por vía parenteral. Ejemplos específicos de sus formas farmacéuticas incluyen inyecciones, agentes de administración intranasal, agentes de administración transpulmonar y agentes de administración percutánea. Ejemplos de las inyecciones incluyen inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal e inyección subcutánea, a través de los cuales la composición farmacéutica se puede administrar sistémica o localmente.

Además, el método de administración puede seleccionarse adecuadamente dependiendo de la edad, el peso, el sexo, los síntomas, etc. de un paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo o un polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede seleccionar dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por dosis. Como alternativa, la dosis se puede seleccionar dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0,001 a 100000 mg/cuerpo de un paciente, aunque la dosis no se limita necesariamente a estos valores numéricos. Aunque la dosis y el método de administración varían dependiendo del peso, la edad, el sexo, los

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síntomas, etc. de un paciente, los expertos en la técnica pueden seleccionar adecuadamente la dosis y el método.

La composición farmacéutica que incluye el anticuerpo o fragmentos del mismo de la presente invención se puede administrar a un sujeto de prueba para tratar y/o evitar el cáncer, preferentemente cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.

La presente invención abarca además métodos para tratar y/o evitar el cáncer, mediante la administración de la composición farmacéutica de la presente invención en combinación con el agente antitumoral como se ha ejemplificado anteriormente o una composición farmacéutica que comprende el agente antitumoral para un sujeto de prueba. El anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invención se puede administrar simultáneamente con o por separado del agente antitumoral al sujeto de prueba. En el caso de la administración por separado de estas composiciones farmacéuticas, cualquiera de las dos puede administrarse primero o más tarde. Sus intervalos de dosificación, dosis, vías de administración y el número de dosis pueden ser seleccionadas adecuadamente por un especialista. Las formas farmacéuticas de fármacos separados que se administrarán simultáneamente también incluyen, por ejemplo, composiciones farmacéuticas formuladas cada una mezclando el anticuerpo o el fragmento del mismo de la presente invención y el agente antitumoral en un portador (o medio) farmacológicamente aceptable. Las descripciones anteriores sobre prescripción, formulación, vías de administración, dosis, cáncer, etc. en cuanto a las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas que contienen el anticuerpo de la presente invención también son aplicables a cualquiera de las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas descritas anteriormente que contienen el agente antitumoral.

Por tanto, la presente invención también proporciona una combinación farmacéutica como se define en las reivindicaciones, que comprende una composición farmacéutica de la presente invención y una composición farmacéutica que comprende el agente antitumoral, como se ha ejemplificado anteriormente. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, que comprende el anticuerpo o el fragmento del mismo de la presente invención y el agente antitumoral junto con un portador farmacológicamente aceptable.

<Polipéptido y ADN>

La presente invención proporciona además los siguientes polipéptidos y los ADN relacionados con el anticuerpo (a):

(i) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 8 y 12, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos representadas por las sEq ID NOs: 13 y 14;

(ii) un polipéptido de CDR de cadena pesada seleccionado de entre el grupo que consiste en secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7, y un ADN que codifica el polipéptido; y

(iii) un polipéptido de CDR de cadena ligera seleccionado de entre el grupo que consiste en secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 9, 10 y 11, y un ADN que codifica el polipéptido.

Estos polipéptidos y los ADN pueden prepararse usando técnicas de recombinación génica como se ha descrito anteriormente.

Ejemplos

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no está destinado a estar limitado por estos ejemplos específicos.

<Ejemplo 1: Análisis de la expresión génica de CAPRIN-1 en cada tejido>

La expresión génica de CAPRIN-1 en tejidos normales caninos y humanos y las diversas líneas celulares se examinaron mediante RCP-RT de acuerdo con el Ejemplo 1(4) descrito en el documento WO2010/016526. Como resultado, se observó una fuerte expresión en los testículos entre los tejidos caninos sanos, mientras que se observó expresión en cáncer de mama canino y tejidos de adenocarcinoma. Como resultado de confirmar también la expresión en tejidos humanos, la expresión se confirmó solo en los testículos entre tejidos normales, como con el gen canino CAPRIN-1. Por el contrario, la expresión se detectó en muchos tipos de líneas celulares de cáncer, incluidas 8 líneas celulares (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB -231V y MRK-nu-1) de cáncer de mama humano y 4 líneas celulares (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 y BxPc-3) de cáncer de páncreas, entre las células cancerosas. Estos resultados demostraron que CAPRIN-1 se expresa en diversas células cancerosas, aunque su expresión no se observa en tejidos normales distintos de los testículos.

<Ejemplo 2: Preparación de anticuerpo monoclonal de ratón contra CAPRIN-1>

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100 |jg de proteínas CAPRIN-1 humanas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que se prepararon en el Ejemplo 3 descrito en el documento WO2010/016526, se mezclaron con una cantidad igual de adyuvante MPL+tDm (Sigma-Aldrich Corp.). Esta mezcla se usó como una solución de antígeno por ratón. La solución de antígeno se administró intraperitonealmente a cada ratón Balb/c de 6 semanas de edad (Japan SLC, Inc.). A continuación, se realizaron 7 refuerzos cada 1 semana para completar la inmunización. Tres días después de la última descarga, se extirpó el bazo de cada ratón y se molió entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS(-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y la eliminación del sobrenadante por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos se repitieron tres veces para obtener células esplénicas. Las células esplénicas obtenidas se mezclaron con células SP2/0 de mieloma de ratón (adquiridas en ATCC) en una proporción de 10:1. Se calentaron 200 jl de un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 % a 37 °C y se mezclaron con 800 pl de PEG1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), y se añadió la solución de PEG así preparada a la mezcla de células, que luego se dejó en reposo durante 5 minutos para la fusión celular. Después de eliminar el sobrenadante por centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos, las células se suspendieron en 150 ml de un medio RPM 11640 que contenía FBS al 15 % suplementado con un equivalente de 2 % de una solución HAT (Life Technologies, Inc./Gibco) (medio HAT selectivo). Esta suspensión se inoculó en quince placas de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) a una concentración de 100 jl/pocillo. Las células esplénicas y las células de mieloma se fusionaron mediante cultivo a 37 °C durante 7 días en condiciones de 5 % de Co2 para obtener hibridomas.

Los hibridomas preparados se tamizaron con la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra las proteínas CAPRIN-1 como índice. Se añadió una solución de jg/ml de las proteínas CAPRIN-1 preparadas en el Ejemplo 3 descrito en el documento WO2010/016526 a una placa de 96 pocillos a una concentración de 100 jl/pocillo y se dejó en reposo a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. A continuación, se añadió una solución de albúmina de suero bovino (ASB) al 0,5 % (Sigma-Aldrich Corp.) a una concentración de 400 jl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución en cada pocillo se descartó, y cada pocillo se lavó tres veces con 400 jl de PBS-T. A continuación, el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente se añadió a la misma a una concentración de 100 jl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. A continuación, se añadieron anticuerpos IgG (H+L) anti-ratón marcados con HRP (Invitrogen Corp.) diluidos 5000 veces con PBS a una concentración de 100 jl/pocillo y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. A continuación, se añadió una solución de sustrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a una concentración de 100 jl/pocillo y se dejó en reposo durante 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, la reacción se terminó mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a una concentración de 100 jl/pocillo. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que tienen una alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana después, se observaron hibridomas que formaban colonias individuales en los pocillos. Las células en estos pocillos se cultivaron adicionalmente, y los hibridomas clonados se tamizaron con la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra las proteínas CAPRIN-1 como índice. Se añadió una solución de jg/ml de las proteínas CAPRIN-1 preparadas en el Ejemplo 3 descrito en el documento WO2010/016526 a una placa de 96 pocillos a una concentración de 100 jl/pocillo y se dejó en reposo a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. A continuación, se añadió una solución de ASB al 0,5 % a una concentración de 400 jl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución en cada pocillo se descartó, y cada pocillo se lavó tres veces con 400 jl de PBS-T. A continuación, el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente se añadió a la misma a una concentración de 100 jl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. A continuación, se añadieron anticuerpos IgG (H+L) anti-ratón marcados con HRP (Invitrogen Corp.) diluidos 5000 veces con PBS a una concentración de 100 jl/pocillo y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. A continuación, se añadió una solución de sustrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a una concentración de 100 jl/pocillo y se dejó en reposo durante 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, la reacción se terminó mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a una concentración de 100 jl/pocillo. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvieron 112 hibridomas productores de anticuerpos monoclonales reactivos con las proteínas CAPRIN-1.

A continuación, estos anticuerpos monoclonales se tamizaron para determinar anticuerpos reactivos con la superficie de las células de cáncer de mama que expresan CAPRIN-1. Específicamente, se centrifugaron 106 células de la línea celular MDA-MB-231V de cáncer de mama humano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadieron 100 pl del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente y se dejó en reposo durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, se añadieron anticuerpos IgG de cabra anti-ratón marcados con FITC (Invitrogen Corp.) diluidos 500 veces con PBS que contenía FBS al 0,1 % y se dejaron en reposo durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, se realizó la misma operación que antes usando el suero de cada ratón Balb/c no tratado de 6 semanas de edad diluido 500 veces con un medio para cultivo de hibridoma, en lugar de los anticuerpos, para preparar un control. Como resultado, se seleccionó un anticuerpo monoclonal (n.° 1) que tiene una intensidad de fluorescencia más fuerte que la del control, es decir, reactivo con la superficie de las células de cáncer de mama.

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<Ejemplo 3: Caracterización del anticuerpo monoclonal seleccionado

Los anticuerpos monoclonales obtenidos en el Ejemplo 2 se analizaron de acuerdo con un método descrito en el Ejemplo 5 del documento WO2010/016526 para sus secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos codificadas por el mismo. El anticuerpo monoclonal n.° 1 resultante estaba compuesto por una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ iD NO: 12. La secuencia de nucleótidos resultante que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal n.° 1 se muestra en la SEQ ID NO: 13, y la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 8. La secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera de la misma se muestra en la SEQ ID NO: 14, y la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 12.

Específicamente, se confirmó que el anticuerpo monoclonal n.° 1 consistía en la región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 y la región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12, en el que la región variable de la cadena pesada tenía CDR1, CDR2 y CDR3 que consistían en secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 5, 6, y 7, respectivamente, y la región variable de la cadena ligera tenía CDR1, CDR2 y CDR3 que consistían en secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 9, 10, y 11, respectivamente.

<Ejemplo 4: Preparación del anticuerpo monoclonal quimérico de humano-ratón>

Ambos extremos del fragmento de amplificación génica que comprende el nucleótido que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal n.° 1 de ratón obtenido en el Ejemplo 3, que consiste en una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 13, se trató con enzimas de restricción, luego se purificaron y se insertaron de acuerdo con un método habitual en un vector pcDNA4/myc-His (Invitrogen Corp.) que ya tiene insertos génicos de una secuencia líder procedente de anticuerpo de ratón y una región constante de cadena H de IgG1 humana que comprende la SEQ ID NO: 37. Además, el fragmento de amplificación génica que comprende el gen de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal n.° 1 de ratón que consiste en una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 14 se trató en ambos extremos con enzimas de restricción, luego se purificó y se insertó de acuerdo con un método habitual en un vector pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen Corp.) que ya tiene insertos génicos de una secuencia líder procedente de anticuerpo de ratón y una región constante de cadena L de IgG1 humana que comprende la SEQ ID NO: 38.

A continuación, el vector recombinante que tiene el inserto de la región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 13) del anticuerpo monoclonal n.° 1 de ratón y el vector recombinante que tiene el inserto de la región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 14) del el anticuerpo monoclonal n.° 1 de ratón se introdujo en células CHO-K1 (obtenidas de Riken Cell Bank). Específicamente, 2 x 105 de las células se cultivaron en un medio Ham's F12 (Invitrogen Corp.) que contenía 1 ml de FBS al 10 % por pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos, y se lavaron con PBS(-). A continuación, se añadió a la misma un medio Ham's F12 fresco que contenía 1 ml de FBS al 10 % por pocillo. Se mezclaron 250 ng de cada uno de los vectores lisados en 30 pl de OptiMEM (Invitrogen Corp.) con 30 pl de reactivo de transfección Polyfect (Qiagen NV), y esta mezcla se añadió a cada pocillo. Las células CHO-K1 cotransfectadas con los vectores recombinantes se cultivaron en un medio Ham's F12 que contenía FBS al 10 % suplementado con 200 pg/ml de Zeocin (Invitrogen Corp.) y 200 pg/ml de Geneticin (Roche Diagnostics KK) y luego se inocularon a una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo para preparar una línea celular de manera estable que produce un anticuerpo monoclonal n.° 1 (n.° 1) quimérico de humano-ratón que tiene las regiones variables del anticuerpo monoclonal n.° 1 de ratón.

Cada línea celular preparada se cultivó durante 5 días en un matraz de 150-cm2 a una densidad de 5 x 105 células/ml usando 30 ml de un medio OptiCHO sin suero (Invitrogen Corp.) para obtener sobrenadantes de cultivo que contienen el anticuerpo monoclonal n.° 1 quimérico de humano-ratón.

Además, se prepararon líneas celulares que producen de manera estable anticuerpos monoclonales comparativos 1 a 11 quiméricos de humano-ratón de la misma manera que anteriormente usando los siguientes anticuerpos monoclonales procedentes de ratón anti-CAPRIN-1 descritos en el documento WO2010/016526 como anticuerpos comparativos: un anticuerpo comparativo 1 que consiste en la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 15 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 16; un anticuerpo comparativo 2 que consiste en la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 18; un anticuerpo comparativo 3 que consiste en la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; un anticuerpo comparativo 4 que consiste en la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 21 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22; un anticuerpo comparativo 5 que consiste en la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 24; un anticuerpo comparativo 6 que consiste en la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 25 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 26; un anticuerpo comparativo 7 que consiste en la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 27 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 28; un anticuerpo comparativo 8 que consiste en la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; un anticuerpo comparativo 9 que consiste en la región

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variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32; un anticuerpo comparativo 10 que consiste en la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; y un anticuerpo comparativo 11 que consiste en la región variable de

cadena pesada de la SEQ ID NO: 35 y la región variable de2cadena ligera de la SEQ ID NO: 36. Cada línea celular preparada se cultivó durante 5 días en un matraz de 150-cm a una densidad de 5 x 10 células/ml usando 30 ml de un medio OptiCHO sin suero (Invitrogen Corp.) para obtener sobrenadantes de cultivo que contienen cualquiera de los anticuerpo comparativos 1 a 11 quiméricos de humano-ratón.

<Ejemplo 5: Expresión de CAPRIN-1 en la superficie de diversas células cancerosas usando anticuerpo anti- CAPRIN-1 n.° 1>

A continuación, las líneas celulares (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V y MRK- nu-1) de cáncer de mama humano, las líneas celulares (Caki-1, Caki-2, A498 y ACHN) de cáncer de riñón, la línea celular (T24) de cáncer de vejiga urinaria, la línea celular (SKOV3) de cáncer de ovario, las líneas celulares (QG56 y A549) de cáncer de pulmón, las líneas celulares (Capan-2 y MIAPaCa-2) de cáncer de páncreas, la línea celular (PC3) de cáncer de próstata, la línea celular (SW756) de cáncer de cuello uterino, la línea celular (HT1080) de fibrosarcoma, las líneas celulares (T98G, U87MG, U251, SNB19 y U373) de tumor cerebral, las líneas celulares (MNK28 y MNK45) de cáncer gástrico, las líneas celulares (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 y HCT116) de cáncer de intestino grueso, la línea celular (AML5) de leucemia,y la línea celular de linfoma (Ramos) confirmadas que tienen la expresión del gen CAPRIN-1 se examinaron para su expresión de proteínas CAPRIN-1 en la superficie celular usando los sobrenadantes de cultivo que contenían n.° 1 obtenidos en el Ejemplo 4. Se centrifugaron 5 x105 células de cada línea celular en cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cada sobrenadante de cultivo (100 pl) que contenía el anticuerpo n.° 1 se añadió al tubo y se dejó en reposo durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, se añadieron anticuerpos IgG (H+L) de cabra anti-ratón marcados con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluidos con PBS que contenía FBS al 0,1 % y se dejaron en reposo a 4 °C durante 30 minutos. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). El control negativo usado fue células que reaccionaron solo con anticuerpos secundarios. Como resultado, las células suplementadas con el anticuerpo n.° 1 tenían una intensidad de fluorescencia al menos un 35 % más fuerte que la del control negativo. Esto demostró que las proteínas CAPRIN-1 se expresan en la superficie de la membrana celular de las líneas celulares de cáncer humano. La tasa de potenciación de la intensidad de fluorescencia anterior se indicó mediante la tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia media (IFM) en cada línea celular y se calculó de acuerdo con la siguiente expresión:

Tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia media (Tasa de potenciación en la intensidad de

fluorescencia) (%) = ((IFM de células que reaccionaron con los anticuerpos anti-CAPRIN-1)-(Control

IFM))/(Control IFM) x 100.

<Ejemplo 6: Efecto antitumoral (actividad ADCC) del antiocuerpo anti-CAPRIN-1 en la célula cancerosa>

El anticuerpo monoclonal n.° 1 anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-ratón obtenido en el Ejemplo 4 se estudió para su capacidad para dañar las células cancerosas que expresan CAPRIN-1 por ensayo de actividad ADCC. El sobrenadante del cultivo de las células que producen el n. ° 1 se purificó usando Hitrap Protein A Sepharose FF (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). Después del reemplazo con PBS (-), la solución se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (Millipore Corp.). El anticuerpo resultante se uso para el ensayo de actividad. Se recogieron 106 células de cada una de las líneas celulares MCF7 de cáncer de mama humano, la línea celular HCT-116 de cáncer de intestino grueso humano, la línea celular MIAPaCa-2 de cáncer de páncreas humano, la línea celular Caki-2 de cáncer de riñón humano y la línea celular QG56 de cáncer de pulmón humano que se confirmó que tenían expresión de CAPRIN-1 en un tubo de centrífuga de 50 ml, a las que luego se añadió 100 pCi de cromo 51, seguido de incubación a 37 °C durante 2 horas. A continuación, las células se lavaron tres veces con un medio RPMI 1640 que contenía SFB al 10 % y se añadieron a una densidad de 2 x 103 células/pocillo a cada placa de 96 pocillos con fondo en V para preparar las células objetivo. El anticuerpo purificado n.° 1 y los anticuerpos comparativos 1 a 11 quiméricos de humano-ratón obtenidos en el Ejemplo 4 se añadieron cada uno a una concentración de 1 pg/pocillo. Una población celular que contiene células nK humanas separadas usando un método habitual a partir de linfocitos de sangre periférica humana se añadió a la placa a una densidad de 2 x 105 células/pocillo y se cultivaron a 37 °C durante 4 horas en condiciones de 5 % de CO2. Después del cultivo, se midió la cantidad de cromo 51 liberado de las células tumorales dañadas en el sobrenadante de cultivo para calcular la actividad citotóxica de cada anticuerpo anti- CAPRIN-1 contra las células cancerosas. El control negativo usado fue células suplementadas con anticuerpos de control de isotipo. La población celular que contenía células NK que se usó en esta evaluación se preparó de la siguiente manera: se hicieron reaccionar células mononucleares de sangre periférica humana separadas de sangre periférica humana de acuerdo con un método habitual usando una solución de separación de gravedad específica Histopaque para la separación de células mononucleares de sangre periférica humana (Sigma-Aldrich Corp.) con diversos anticuerpos marcados con FITC (anticuerpo CD3 antihumano, anticuerpo CD20 antihumano, anticuerpo CD19 antihumano, anticuerpo CD11c antihumano y anticuerpo anti HLA-DR (Becton y Dickinson and Company)), y una población celular no teñida con los anticuerpos se separó usando un clasificador de células (FACS Vantage SE (Becton, y Dickinson and Company)) o un kit de separación de células NK humanas (Miltenyi Biotec KK). Como resultado de evaluar la actividad citotóxica contra las células cancerosas, los anticuerpos de control de isotipo

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usados y los anticuerpos comparativos 1 a 11 usados tuvieron actividad citotóxica inferior al 5 % contra toda la línea celular MCF7 de cáncer de mama humano, la línea celular QG56 de cáncer de pulmón humano, la línea celular HCT-116 de cáncer de intestino grueso humano, la línea celular MIAPaCa-2 de cáncer de páncreas humano y la línea celular Caki-2 de cáncer de riñón humano. Por el contrario, el anticuerpo n.° 1 mostró actividad citotóxica del 21 %, 11 %, 21 %, 27 % y 23 % contra la línea celular MCF7 de cáncer de mama humano, la línea celular QG56 de cáncer de pulmón humano, la línea celular HCT-116 de cáncer de intestino grueso humano, la línea celular MIAPaCa-2 de cáncer de páncreas humano y la línea celular Caki-2 de cáncer de riñón humano, respectivamente. Análogamente, los anticuerpos de control de isotipo usados y los anticuerpos comparativos 1 a 11 usados tuvieron actividad citotóxica inferior al 4 % contra todas las demás células cancerosas, las líneas celulares ZR75-1, T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V, y MRK-nu-1 de cáncer de mama, las líneas celulares T98G y U373 de glioma, una línea celular A549 de cáncer de pulmón, las líneas celulares Caki-1 y ACHN de cáncer de riñón, una línea celular SW756 de cáncer de cuello uterino, una línea célular T24 de cáncer de vejiga urinaria, las líneas celulares MKN28 y MKN45 de cáncer gástrico, una línea celular SW480 de cáncer de intestino grueso, una línea celular AML5 de leucemia y una línea celular Ramos de linfoma. Por el contrario, se confirmó que el anticuerpo n.° 1 tenía una actividad citotóxica del 10 % o mayor contra estas líneas celulares. Estos resultados mostraron que el anticuerpo monoclonal n.° 1 obtenido contra CAPRIN-1 daña las células cancerosas que expresan CAPRIN-1 mediante su actividad ADCC, y demostraron que el anticuerpo n.° 1 muestra una actividad citotóxica más fuerte contra células cancerosas humanas que la de los anticuerpos comparativos 1 a 11.

Estos resultados sobre la actividad citotóxica se obtuvieron mezclando el anticuerpo contra las CAPRIN-1 usadas en la presente invención, células linfocíticas (población que contiene células NK) y 2 x 103 células de cada línea de células cancerosas con cromo 51 incorporado, como se ha descrito anteriormente, seguido de cultivo de las células durante 4 horas, después del cultivo, midiendo la cantidad de cromo 51 liberado en el medio, y calculando la actividad citotóxica contra cada línea de células cancerosas de acuerdo con la siguiente expresión.

Expresión: Actividad citotóxica (%) = cantidad de cromo 51 liberado de las células objetivo suplementadas con el anticuerpo contra CAPRIN-1 y células linfocíticas (población que contiene células NK)/cantidad de cromo 51 liberado de las células objetivo suplementadas con ácido clorhídrico 1 N x 100.

<Ejemplo 7: Efecto antitumoral del anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 sobre el ratón in vivo>

A continuación, el anticuerpo monoclonal n.° 1 quimérico de humano-ratón obtenido en el Ejemplo 4 se evaluó para determinar su efecto antitumoral sobre ratones portadores de cáncer in vivo. El anticuerpo usado se purificó en columna a partir del sobrenadante de cultivo de cada línea celular produciendo el anticuerpo n.° 1. De forma similar, los anticuerpos monoclonales comparativos 1 a 11 quiméricos de humano-ratón de los anticuerpos anti-CAPRIN-1 preparados en el Ejemplo 4 también se evaluaron para determinar sus efectos antitumorales sobre ratones portadores de cáncer in vivo.

El anticuerpo n.° 1 se estudió por su efecto antitumoral usando ratones portadores de cáncer en los que se trasplantó una línea celular de cáncer procedente de seres humanos que expresan CAPRIN-1. Se transplantaron 2 x 106 células Capan-2 de la línea celular de cáncer pancreático humano (adquiridas en ATCC) por ratón por vía subcutánea en los lomos de 65 ratones desnudos Balb/c (Japan SLC, Inc.) y se desarrollaron hasta que el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 5 mm de diámetro. El anticuerpo n.° 1 y los anticuerpos comparativos 1 a 11 quiméricos de humano-ratón se administraron cada uno por vía intraperitoneal a una dosis de 200 pg (200 pl)/ratón a 5 (por anticuerpo) de estos ratones portadores de cáncer. A continuación, cada anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a los ratones portadores de cáncer a la misma dosis que antes, un total de tres veces durante 2 días. El tamaño del tumor se midió todos los días, y se observó el efecto antitumoral. Por otro lado, se administró PBS(-) en lugar de los anticuerpos a los 5 ratones restantes portadores de cáncer, que a su vez se usaron como grupo de control. El tamaño del tumor se calculó en términos de volumen de acuerdo con la expresión 0,5 x (eje mayor x eje menor).

Como resultado de observar el efecto antitumoral en el grupo de prueba que recibió el anticuerpo n.° 1 contra CAPRIN-1, la proliferación tumoral se redujo al 65 % el día 29 después de la administración del anticuerpo (con el tamaño del tumor en el grupo control a la mismo fecha definida como 100 %). Por el contrario, en los ratones que recibieron los anticuerpos comparativos 1 a 11 quiméricos de humano-ratón, la proliferación tumoral se redujo a aproximadamente 85 %. Estos resultados demostraron que el anticuerpo n.° 1 obtenido contra CAPRIN-1 ejerce un efecto antitumoral in vivo sobre las células cancerosas que expresan CAPRIN-1. Estos resultados también demostraron que el anticuerpo n.° 1 ejerce un efecto antitumoral in vivo más fuerte que el de los anticuerpos comparativos 1 a 11.

<Ejemplo 8: El número de moléculas de CAPRIN-1 en la superficie de diversas células cancerosas reconocidas por el anticuerpo anti-CAPRIN-1 n.° 1>

Las líneas celulares (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V y MRK-nu-1) de cáncer de mama humano, las líneas celulares (Caki-1, Caki-2, A498 y ACHN) de cáncer de riñón, una línea celular (T24) de cáncer de vejiga urinaria, una línea celular (SKOV3) de cáncer de ovario, las líneas celulares (QG56 y A549) de

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cáncer de pulmón, las líneas celulares Capan-2 y MIAPaCa-2) de cáncer de páncreas, una línea celular (PC3) de cáncer de próstata, una línea celular (SW756) de cáncer de cuello uterino, una línea celular (HT1080) de fibrosarcoma, las líneas celulares (T98G, U87MG, U251, SNB19 y U373) de tumor cerebral, las líneas celulares (MNK28 y MNK45) de cáncer gástrico, las líneas celulares (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 y HCT116) de cáncer de intestino grueso, una línea celular (AML5) de leucemia y una línea celular (Ramos) de linfoma se examinaron usando un kit de ensayo QIFIKIT para el número de moléculas (Dako Japan Inc.) para el número de moléculas CAPRIN-1 en su superficie celular reconocidas por el anticuerpo n.° 1 anti-CApRIN-1. De forma similar, el número de moléculas de CAPRIN-1 en la superficie de estas diversas células cancerosas también se examinó usando los anticuerpos comparativos 1 a 11, que son anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 preparados en el Ejemplo 4.

De acuerdo con el protocolo adjunto al kit, el anticuerpo n.° 1 y los anticuerpos comparativos 1 a 11 se diluyeron en 5 pg/ml (en términos de concentración final) con PBS, y esta dilución se añadió a cada línea celular y se hizo reaccionar durante 30 minutos. Después de lavar con PBS, se añadieron anticuerpos IgG anti-ratón marcados fluorescentemente adjuntos al kit como anticuerpos secundarios, junto con perlas de calibración adjuntas al kit a cada línea celular y se dejaron en reposo durante 45 minutos en hielo. Cada línea celular y las perlas de calibración se lavaron con PBS. A continuación, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACs Calibur (Becton, Dickinson and Company) para obtener un valor medio de intensidad de fluorescencia (media). Además, los anticuerpos comparativos se miden de forma similar a la anterior para obtener una media. El control negativo usado fue células reaccionadas con anticuerpos de control de isotipo y también se obtuvo una media. Cada valor medio de intensidad de fluorescencia (media) se usó para calcular el número de moléculas de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Como resultado, el número de moléculas de CAPRIN-1 en la superficie de diversas células cancerosas reconocidas por el anticuerpo n.° 1 fue de 105 o más por célula para todas las líneas celulares de cáncer humano examinadas. Por otro lado, el número de moléculas reconocidas por los anticuerpos monoclonales comparativos 1 a 11 fue inferior a 105 por célula.

Aplicabilidad industrial

El anticuerpo de la presente invención es útil en el tratamiento y/o la prevención del cáncer.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Toray Industries, Inc.

<120> Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer

<130> CMD/FP6964613

140) Documento EP12820091.2 <141 >

<150> Documento PCT/JP2012/069853 <151 > 03/08/2012

<150> Documento JP 2011-171377 <151 > 04/08/2011

<160>38

<170> PatentIn version 3.1

<210>1 <211>5562 <212>ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (190)..(2319)

<223>

<400>1

Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que tienen reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1, comprendiendo el anticuerpo o el fragmento del mismo una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7 y una región variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad de las sEq ID NOs: 9, 10 y 11.
2. 2. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo multiespecífico.
3. 3. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo están conjugados con un agente antitumoral.
4. 4. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en un método para tratar y/o evitar el cáncer.
5. 5. El anticuerpo o el fragmento del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.
6. 6. Una composición farmacéutica, que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como un principio activo.
7. 7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, para su uso en un método para tratar y/o evitar el cáncer.
8. 8. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.
9. 9. Una combinación farmacéutica, que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 y una composición farmacéutica que comprende un agente antitumoral.
10. 10. La combinación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, para su uso en un método para tratar y/o evitar el cáncer.
11. 11. La combinación farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.
12. 12. Un ADN que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.