ES2666458T3

ES2666458T3 - Macrociclos peptidomiméticos

Info

Publication number: ES2666458T3
Application number: ES09736335.2T
Authority: ES
Inventors: Huw M. Nash; David Allen Annis; Rosana Kapeller-Libermann; Tomi K. Sawyer; Noriyuki Kawahata
Original assignee: Aileron Therapeutics Inc
Current assignee: Aileron Therapeutics Inc
Priority date: 2008-09-22
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2029-09-22
Also published as: JP5711128B2; US20100216688A1; CN102482336A; CA2737922A1; US8399405B2; JP2014221801A; AU2009294877C1; US20170299576A1; EP2342222A1; US20140135255A1; EP2342222B1; WO2010034034A1; US9175045B2; IL211836A0; AU2009294877B2; JP2016190882A; US8524653B2; BRPI0918948A2; JP6067626B2; AU2009294877A1

Abstract

Método de cribado de un polipéptido que comprende una hélice alfa y un entrecruzador que conecta un primer aminoácido y un segundo aminoácido del polipéptido, en donde el polipéptido penetra las membranas celulares mediante un proceso dependiente de la energía y se une a una diana intracelular, método que comprende: (a) medir la eficacia in vitro del polipéptido en un ensayo de células enteras en donde la actividad está mediada por la unión a la diana intracelular, en presencia y en ausencia de suero humano; (b) calcular la CE50 y la afinidad aparente (Kd*) del polipéptido por las proteínas séricas humanas, y (c) seleccionar un polipéptido, que tenga una Kd* de 1 a 700 micromolar.

Description

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DESCRIPCION

Macrociclos peptidomiméticos Antecedentes de la invención

Los péptidos producidos recombinantemente o sintéticamente tienen importantes aplicaciones como medicamentos. Sin embargo, los péptidos sufren con frecuencia de pobre estabilidad metabólica, pobre penetrabilidad celular y unión promiscua debido a su flexibilidad conformacional. Una estrategia para estabilizar estos péptidos es usar entrecruzadores intramoleculares para mantener el péptido en la configuración deseada, por ejemplo, usando enlaces disulfuro, enlaces amida o enlaces carbono-carbono para conectar cadenas laterales de aminoácidos. Véase, p. ej., Jackson et al. (1991), J. Am. Chem. Soc. 113:9391-9392; Phelan et al. (1997), J. Am. Chem. Soc. 119:455-460; Taylor (2002), Biopolymers 66: 49-75; Brunel et al. (2005), Chem. Commun. (20):2552-2554; Hiroshige et al. (1995), J. Am. Chem. Soc. 117: 11590-11591; Blackwell et al. (1998), Angew. Chem. Int. Ed. 37:3281-3284; Schafmeister et al. (2000), J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892; Walensky et al. (2004), Science 305:1466-1470; Bernal et al. (2007), J. Am. Chem Soc. 129:2456-2457; la patente de Estados Unidos US7192713B1 (Verdine et al) (que describe péptidos helicoidales estabilizados entrecruzados que comprenden aminoácidos naturales y no naturales, en donde el péptido comprende al menos dos restos reactivos capaces de experimentar una reacción de formación de enlace C-C); y la patente de Estados Unidos US5811515 (Grubbs et al) (que describe la síntesis de péptidos y peptidomiméticos estabilizados restringidos conformacionalmente/cíclicos a partir de precursores que contienen dos o más enlaces C-C insaturados); los contenidos de estas patentes y publicaciones se incorporan por referencia en la presente memoria. A veces, se hace referencia a tales polipéptidos que están estabilizados conformacionalmente por medio de entrecruzadores intramoleculares como polipéptidos "grapados".

Una ventaja importante de estos polipéptidos entrecruzados es que tienen una capacidad para penetrar las membranas celulares mejorada con respecto a sus equivalentes no grapados. Se cree que esta captación celular está mediada por un mecanismo de transporte activo que utiliza la endocitosis.

Algunas de las características físicas que facilitan la entrada de los péptidos en las células también tienden a aumentar la afinidad de los polipéptidos entrecruzados por las proteínas séricas, tales como la albúmina. Por consiguiente, muchas cabezas de serie muy prometedoras exhiben un marcado "cambio en presencia de suero", tienen una actividad in vivo o en ensayos con medios a base de suero considerablemente reducida en comparación con la actividad en ensayos que usan medios libres de suero, lo que hace que los péptidos no sean lo suficientemente óptimos para aplicaciones terapéuticas o diagnósticas. Sin embargo, los polipéptidos entrecruzados que tienen bajos niveles de unión al suero tienden a tener una pobre penetración celular, así como una pobre farmacocinética, p. ej., una rápida eliminación renal o de primer paso. Esta invención aborda este y otros problemas.

Los documentos WO 2005/044839, WO 2008/061192 y WO 2008/104000 se refieren a péptidos entrecruzados. Rusnak, D. W. et al. ((2004), Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (14), 2309-2312) describen ensayos de cribado para determinar la KD de fármacos de molécula pequeña por las proteínas plasmáticas.

Compendio

La presente invención proporciona métodos como se expone en las reivindicaciones. En la presente memoria se describen métodos para la identificación y optimización de polipéptidos entrecruzados que poseen una afinidad reducida por las proteínas séricas para permitir una buena actividad en presencia de suero, a la vez que retienen suficiente afinidad por las membranas celulares como para ser transportados fácilmente al interior de la célula, retienen suficiente afinidad por las proteínas séricas como para tener farmacocinéticas aceptables y retienen una alta afinidad de unión a uno o más receptores diana del interior de la célula. Los inventores han descubierto que, para alcanzar estos objetivos, hay un intervalo óptimo de unión a las proteínas séricas para los polipéptidos entrecruzados. Se describen compuestos óptimos con una penetración celular y actividades biológicas superiores en presencia de suero y relaciones estructura-actividad para permitir la optimización de los polipéptidos entrecruzados que tienen eficacias terapéuticas o actividades diagnósticas mejoradas.

En la presente memoria se describe un método de identificar polipéptidos entrecruzados con eficacias mejoradas en sangre entera humana, que comprende las etapas de sintetizar análogos del polipéptido entrecruzado progenitor y realizar ensayos celulares en ausencia de proteínas séricas humanas y también en presencia de una o más concentraciones de suero humano, con el fin de determinar la afinidad aparente de cada polipéptido entrecruzado por las proteínas séricas humanas.

En la presente memoria se describe un método de preparar un polipéptido con eficacia celular optimizada en sangre entera humana, método que comprende: a) proporcionar un polipéptido progenitor que comprende un entrecruzador que conecta un primer aminoácido y un segundo aminoácido de dicho polipéptido, y en donde el polipéptido progenitor penetra las membranas celulares mediante un proceso dependiente de la energía y se une a una diana intracelular; b) identificar uno o más motivos dipeptídicos en dicho polipéptido progenitor que consten de una cadena lateral ácida adyacente a una cadena lateral hidrofóbica grande, en donde la cadena lateral ácida no es esencial para unir la diana; c) sustituir la cadena lateral ácida en dicho motivo por una cadena lateral neutra para preparar un polipéptido progenitor modificado; d) medir las eficacias in vitro del polipéptido polipéptidos progenitor modificado en

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un ensayo de células enteras en donde la actividad está mediada por la unión a la diana intracelular, en presencia y ausencia de suero humano; e) calcular la afinidad aparente (Kd*) del polipéptido modificado por las proteínas séricas humanas y su CE50; y f) seleccionar el polipéptido progenitor modificado como un polipéptido optimizado si dicho polipéptido progenitor modificado tiene una Kd* más alta y una CE50 igual o más baja que el polipéptido progenitor.

( \

CE'?„ = CE,„ P

1 +

K,*

CE,,

En algunos casos, Kd* se define por la ecuación: v J en la que n es 1, CE50 es una eficacia

in vitro medida en un ensayo de células enteras en ausencia de suero humano alguno y CE'50 es una eficacia in vitro medida en un ensayo de células enteras en un N % de suero humano en donde P es igual a (N/100)x (700) micromolar.

En algunos casos del método, tanto la cadena lateral ácida como la hidrofóbica grande de dicho motivo dipeptídico no son esenciales para unir la diana y se reemplazan por cadenas laterales neutras y menos hidrofóbicas, respectivamente.

Por ejemplo, en la presente memoria se describe un método de cribar un polipéptido que comprende un entrecruzador que conecta un primer aminoácido y un segundo aminoácido de dicho polipéptido, en donde el polipéptido penetra las membranas celulares mediante un proceso dependiente de la energía y se une a una diana intracelular, método que comprende medir la eficacia in vitro del polipéptido en un ensayo de células enteras en presencia y ausencia de suero humano; calcular la afinidad aparente (Kd*) del polipéptido por las proteínas séricas

imagen1

humanas, en donde Kd* se define por la ecuación V so J en la que n es 1, CE50 es una eficacia

in vitro medida en un ensayo de células enteras en ausencia de suero humano alguno y CE'50 es una eficacia in vitro medida en un ensayo de células enteras en un N % de suero humano en donde P es igual a (N/100) x (700) micromolar; y seleccionar compuestos que tienen una Kd* de 1 a 700 micromolar, p. ej., 1-70 micromolar, por ejemplo, 10-70 micromolar. Por ejemplo, el compuesto seleccionado puede poseer una fracción libre estimada en sangre humana del 0,1-50 %, p. ej., 0,5-10 %, en donde la fracción libre estimada se define por la ecuación

y [ASH]total es 700 micromolar.

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En algunos casos del método, la actividad biológica (CE50) se mide como el porcentaje del número de células destruidas en un ensayo in vitro en el que las células cultivadas se exponen a una concentración efectiva de dicho polipéptido.

En algunos casos, el polipéptido se selecciona de tal forma que la afinidad aparente de unión al suero (Kd*) del polipéptido entrecruzado es 1, 3, 10, 70 micromolar o mayor. En otros casos, la Kd* del polipéptido entrecruzado es de 1 a 10, 70 o 700 micromolar. En otros casos, el polipéptido entrecruzado se selecciona de tal forma que posee una fracción libre estimada en sangre humana de entre el 0,1 y 50 %, o entre el 0,15 y 10 %.

También se describen polipéptidos seleccionados usando los métodos de la invención o, de lo contrario, que cumplen con los criterios de la invención. Por ejemplo, en algunos casos, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 1 micromolar o más débil. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 3 micromolar o más débil. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 10 micromolar o más débil. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 70 micromolar o más débil. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de entre 1-70 micromolar. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de entre 1-700 micromolar. En algunos casos, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una fracción libre estimada en sangre entera de entre el 0,1-50 %. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una fracción libre estimada en sangre entera de entre el 0,5-10 %.

En algunos casos del método, dicho polipéptido contiene un enlace cruzado. En algunos casos del método, dicho polipéptido contiene dos enlaces cruzados.

En algunos casos del método, un enlace cruzado conecta dos átomos de carbono a. En otros casos del método, un átomo de carbono a al que está unido un enlace cruzado está sustituido con un sustituyente de fórmula R-. En otro caso del método, dos átomos de carbono a a los que está unido un enlace cruzado están sustituidos con sustituyentes independientes de fórmula R-.

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En un caso de los métodos de la invención, R- es alquilo. Por ejemplo, R- es metilo. Como alternativa, R- y una parte de un enlace cruzado tomados juntos pueden formar una estructura cíclica. En otro caso del método, un enlace cruzado está formado por dos enlaces carbono-carbono consecutivos. Por ejemplo, un enlace cruzado puede comprender al menos 8, 9, 10, 11 o 12 enlaces consecutivos. En otros casos, un enlace cruzado puede comprender al menos 7, 8, 9, 10 u 11 átomos de carbono.

En algunos casos del método, el polipéptido entrecruzado penetra las membranas celulares mediante un proceso dependiente de la energía y se une a una diana intracelular.

En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado comprende un dominio a-helicoidal de un miembro de la familia BCL-2. Por ejemplo, el polipéptido entrecruzado comprende un dominio BH3. En otros casos, el polipéptido entrecruzado tiene una identidad de secuencia de al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % con cualquiera de las secuencias de las Tablas 1, 2, 3 y 4, p. ej., como se mide en un algoritmo BLAST.

También se describen métodos de uso de los polipéptidos entrecruzados mejorados descritos en métodos profilácticos y terapéuticos de tratamiento de un sujeto con riesgo de (o susceptible de) padecer un trastorno o que tiene un trastorno asociado a una expresión o actividad (p. ej., anomalías de la vía apoptótica extrínseca o intrínseca) aberrantes (p. ej., insuficientes o excesivas) de un miembro de la familia BCL-2; y de tratamiento o prevención de enfermedad hiperproliferativa mediante interferencia con la interacción o unión entre p53 y MDM2 en células hiperproliferativas, p. ej., células tumorales.

Los casos adicionales de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada, los ejemplos, los dibujos y las reivindicaciones que se presentan a continuación.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Se conseguirá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención consultando la descripción detallada siguiente, que expone casos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los que:

La FIG. 1 muestra las curvas dosis-respuesta del macrociclo peptidomimético (compuesto 1) en presencia de concentraciones variables de suero humano.

La FIG. 2 muestra un gráfico de CE50 celular frente a concentraciones de suero humano para análogos del macrociclo peptidomimético con propiedades mejoradas.

La FIG. 3 muestra un gráfico de CE50 celular frente a concentraciones de suero humano para análogos del macrociclo peptidomimético con propiedades mejoradas.

La FIG. 4 muestra representaciones de tipo rueda helicoidal de análogos del macrociclo peptidomimético mejorado. Descripción detallada

Como se emplea en la presente memoria, el término "macrociclo" se refiere a una molécula que tiene una estructura química que incluye un anillo o ciclo formado por al menos 9 átomos enlazados covalentemente.

Como se emplea en la presente memoria, el término "polipéptido grapado" o "polipéptido entrecruzado" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de residuos de aminoácido unidos por una pluralidad de enlaces peptídicos y al menos un conector formador de macrociclo que forma un macrociclo entre un primer residuo de aminoácido presente de forma natural o no presente de forma natural (o análogo) y un segundo residuo de aminoácido presente de forma natural o no presente de forma natural (o análogo) dentro de la misma molécula. El polipéptido entrecruzado incluye casos en los que el conector formador de macrociclo conecta el carbono a del primer residuo de aminoácido (o análogo) al carbono a del segundo residuo de aminoácido (o análogo). Los polipéptidos entrecruzados incluyen opcionalmente uno o más enlaces no peptídicos entre uno o más residuos de aminoácido y/o residuos de análogo de aminoácido e incluyen opcionalmente uno o más residuos de aminoácido o residuos de análogo de aminoácido no presente de forma natural además de cualquiera que forma el macrociclo.

Como se emplea en la presente memoria, el término "estabilidad" se refiere al mantenimiento de una estructura secundaria definida en solución por parte de un polipéptido entrecruzado de la invención como se mide mediante dicroísmo circular, RMN u otra medición biofísica, o resistencia a la degradación proteolítica in vitro o in vivo. Ejemplos no limitantes de estructuras secundarias contempladas en esta invención son las hélices a, los giros p y las hojas plegadas p.

Como se emplea en la presente memoria, el término "estabilidad helicoidal" se refiere al mantenimiento de una estructura a-helicoidal por parte de un polipéptido entrecruzado de la invención como se mide mediante dicroísmo circular o RMN. Por ejemplo, en algunos casos, los polipéptidos entrecruzados de la invención exhiben al menos un aumento de 1,25, 1,5, 1,75 o 2 veces de la a-helicidad como se determina mediante dicroísmo circular en comparación con un macrociclo correspondiente al que le falta el sustituyente R-.

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El término "a-aminoácido" o simplemente "aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo unidos a un carbono que se denomina el carbono a. Los aminoácidos adecuados incluyen, sin limitación, los isómeros D- y L- de los aminoácidos presentes de forma natural, así como aminoácidos no presentes de forma natural preparados mediante síntesis orgánica u otras rutas metabólicas. A menos que el contexto indique específicamente lo contrario, el término aminoácido, como se emplea en la presente memoria, tiene por objeto incluir análogos de aminoácido.

El término "aminoácido presente de forma natural" se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos que se encuentran habitualmente en los péptidos sintetizados en la naturaleza y conocidos por las abreviaturas de una letra A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y y V.

El término "análogo de aminoácido" o "aminoácido no natural" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar a un aminoácido y que puede ser sustituida por un aminoácido en la formación de un polipéptido entrecruzado. Los análogos de aminoácido incluyen, sin limitación, compuestos que son estructuralmente idénticos a un aminoácido, como se define en la presente memoria, excepto por la inclusión de uno o más grupos metileno adicionales entre el grupo amino y el carboxilo (p. ej., a-amino p-carboxi ácidos) o por la sustitución del grupo amino o carboxi por un grupo de reactividad similar (p. ej., sustitución de la amina primaria por una amina secundaria o terciaria o sustitución del grupo carboxi por un éster).

Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar a partir de la secuencia de tipo salvaje de un polipéptido (p. ej., un dominio BH3 o el dominio de unión a MDM2 de p53) sin suprimir o alterar sustancialmente su actividad biológica o bioquímica esencial (p. ej., unión al receptor o activación). Un residuo de aminoácido "esencial" es un residuo que, cuando se altera a partir de la secuencia de tipo salvaje del polipéptido, da lugar a la supresión o supresión sustancial de la actividad biológica o bioquímica esencial del polipéptido.

Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., K, R, H), cadenas laterales ácidas (p. ej., D, E), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., G, N, Q, S, T, Y, C), cadenas laterales no polares (p. ej., A, V, L, I, P, F, M, W), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., T, V, I) y cadenas laterales aromáticas (p. ej.,Y, F, W, H). Por tanto, un residuo de aminoácido no esencial previsto en un polipéptido BH3, por ejemplo, se reemplaza preferiblemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Otros ejemplos de sustituciones aceptables son sustituciones basadas en consideraciones isostéricas (p. ej., norleucina por metionina) u otras propiedades (p. ej., 2-tienilalanina por fenilalanina).

El término "miembro", como se emplea en la presente memoria, junto con macrociclos o conectores formadores de macrociclo se refiere a los átomos que forman o pueden formar el macrociclo y excluye átomos de sustituyente o cadena lateral. Por analogía, ciclodecano, 1,2-difluorodecano y 1,3-dimetilciclodecano se consideran todos ellos macrociclos de diez miembros, ya que los sustituyentes hidrógeno o flúor o las cadenas laterales metilo no participan en la formación del macrociclo.

Los símbolos " v' ", cuando se emplean como parte de una estructura molecular, se refieren a un enlace sencillo o un doble enlace cis o trans.

El término "cadena lateral de aminoácido" se refiere a un resto unido al carbono a de un aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral de aminoácido para alanina es metilo, la cadena lateral de aminoácido para fenilalanina es fenilmetilo, la cadena lateral de aminoácido para cisteína es tiometilo, la cadena lateral de aminoácido para aspartato es carboximetilo, la cadena lateral de aminoácido para tirosina es 4-hidroxifenilmetilo, etc. También se incluyen otras cadenas laterales de aminoácidos no presentes de forma natural, por ejemplo, aquellos que están presentes en la naturaleza (p. ej., un metabolito de aminoácido) o los que se fabrican sintéticamente (p. ej., un aminoácido a,a- disustituido).

El término "aminoácido a,a-disustituido" se refiere a una molécula o resto que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo unidos a un carbono (el carbono a) que está unido a dos cadenas laterales de aminoácidos naturales o no naturales.

El término "polipéptido" abarca dos o más aminoácidos presentes de forma natural o no presentes de forma natural unidos por un enlace covalente (p. ej., un enlace amida). Los polipéptidos, como se describen en la presente memoria, incluyen proteínas de longitud total (p. ej., proteínas procesadas totalmente), así como secuencias de aminoácidos más cortas (p. ej., fragmentos de proteínas presentes de forma natural o fragmentos de polipéptidos sintéticos).

El término "reactivo de macrociclación" o "reactivo formador de macrociclo", como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier reactivo que se puede usar para preparar un polipéptido entrecruzado de la invención mediando la reacción entre dos grupos reactivos. Los grupos reactivos pueden ser, por ejemplo, una azida y un alquino, en cuyo caso, los reactivos de macrociclación incluyen, sin limitación, reactivos de Cu tales como reactivos que proporcionan una especie de Cu(I) reactiva, tales como CuBr, Cul o CuOTf, así como sales de Cu(II)

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tales como Cu(CO2CH3)2, CuSO4 y CuCl2 que se pueden convertir in situ en un reactivo de Cu(I) activo mediante la adición de un agente reductor tal como ácido ascórbico o ascorbato sódico. Los reactivos de macrociclación pueden incluir además, por ejemplo, reactivos de Ru conocidos en la técnica tales como Cp*RuCl(PPh3)2, [Cp*RuCl]4 u otros reactivos de Ru que puedan proporcionar una especie de Ru(II) reactiva. En otros casos, los grupos reactivos son olefinas terminales. En tales casos, los reactivos de macrociclación o reactivos formadores de macrociclo son catalizadores de metátesis que incluyen, pero no se limitan a, catalizadores de complejo metal de transición temprano-carbeno estabilizados tales como catalizadores de metal de transición del grupo VIII-carbeno. Por ejemplo, tales catalizadores son centros metálicos de Ru y Os que tienen un estado de oxidación +2, un recuento de electrones de 16 y son pentacoordinados. Se describen catalizadores adicionales en Grubbs et al., "Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis" Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452 y en la patente de Estados Unidos n.° 5 811 515. En otros casos más, los grupos reactivos son grupos tiol. En tales casos, el reactivo de macrociclación es, por ejemplo, un conector funcionalizado con dos grupos tiol-reactivos tales como grupos halógeno.

El término "halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo, o a un radical de los mismos.

El término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, que es una cadena lineal o una cadena ramificada, que contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C1-C10 indica que el grupo tiene de 1 a 10 (incluidos) átomos de carbono en él. En ausencia de designación numérica alguna, "alquilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 1 a 20 (incluidos) átomos de carbono en ella.

El término "alquileno" se refiere a un alquilo divalente (es decir, -R-).

El término "alquenilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, que es una cadena lineal o una cadena ramificada, que contiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono. El resto alquenilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo tiene de 2 a 10 (incluidos) átomos de carbono en él. El término "alquenilo inferior" se refiere a una cadena alquenilo C2-C6. En ausencia de designación numérica alguna, "alquenilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 2 a 20 (incluidos) átomos de carbono en ella.

El término "alquinilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, que es una cadena lineal o una cadena ramificada, que contiene uno o más triples enlaces carbono-carbono. El resto alquinilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo tiene de 2 a 10 (incluidos) átomos de carbono en él. El término "alquinilo inferior" se refiere a una cadena alquinilo C2-C6. En ausencia de designación numérica alguna, "alquinilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 2 a 20 (incluidos) átomos de carbono en ella.

El término "arilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 6 carbonos o bicíclico de 10 carbonos en donde 0, 1, 2, 3 o 4 átomos de cada anillo están sustituidos por un sustituyente. Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo y similares. El término "arilalquilo" o el término aralquilo" se refiere a alquilo sustituido con un arilo. El término "arilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con arilo.

"Arilalquilo" se refiere un grupo arilo, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se ha reemplazado por un grupo alquilo C1-C5, como se definió anteriormente. Los ejemplos representativos de un grupo arilalquilo incluyen, pero no se limitan a, 2-metilfenilo, 3-metilfenilo, 4-metilfenilo, 2- etilfenilo, 3-etilfenilo, 4-etilfenilo, 2-propilfenilo, 3-propilfenilo, 4-propilfenilo, 2-butilfenilo, 3-butilfenilo, 4-butilfenilo, 2- pentilfenilo, 3-pentilfenilo, 4-pentilfenilo, 2-isopropilfenilo, 3-isopropilfenilo, 4-isopropilfenilo, 2-isobutilfenilo, 3- isobutilfenilo, 4-isobutilfenilo, 2-sec-butilfenilo, 3-sec-butilfenilo, 4-sec-butilfenilo, 2-t-butilfenilo, 3-t-butilfenilo y 4-t- butilfenilo.

"Arilamido" se refiere un grupo arilo, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se ha reemplazado por uno o más grupos -C(O)NH2. Los ejemplos representativos de un grupo arilamido incluyen 2-C(O)NH2-fenilo, 3-C(O)NH2-fenilo, 4-C(O)NH2-fenilo, 2-C(O)NH2-piridilo, 3-C(O)NH2-piridilo y 4-C(O)NH2- piridilo,

"Alquilheterociclo" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado por un heterociclo. Los ejemplos representativos de un grupo alquilheterociclo incluyen, pero no se limitan a, -CH2CH2-morfolina, -CH2CH2-piperidina, -CH2CH2CH2- morfolina y -CH2CH2CH2-imidazol.

"Alquilamido" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado por un grupo -C(O)NH2. Los ejemplos representativos de un grupo alquilamido incluyen, pero no se limitan a, -CH2-C(O)NH2, -cH2CH2-C(O)NH2, -CH2CH2CH2C(O)NH2, - CH2CH2CH2CH2C(O)NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2C(O)NH2, -CH2CH(C(O)NH2)CH3, -CH2CH(C(O)NH2)CH2CH3, - CH(C(O)NH2)CH2CH3, -C(CH3)2CH2C(O)NH2, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH3, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH3-CH3 y -CH2-CH2- NH-C(O)-CH=CH2.

"Alcanol" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha remplazado por un grupo hidroxilo. Los ejemplos representativos de un

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grupo alcanol incluyen, pero no se limitan a, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, -CH2CH2CH2CH2OH, - CH2CH2CH2 CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CHa, -CH2CH(OH)CH2CHs, -CH(OH)CH3 y -C(CH3)2CH2OH.

"Alquilcarboxi" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado por un grupo --COOH. Los ejemplos representativos de un grupo alquilcarboxi incluyen, pero no se limitan a, -CH2COOH, -CH2CH2COOH, -CH2CH2CH2COOH, - CH2CH2CH2CH2COOH, -CH2CH(COOH)CH3, -CH2CH2CH2CH2CH2COOH, -CH2CH(COOH)CH2CH3, -

CH(COOH)CH2CH3 y -C(CH3)2CH2COOH.

El término "cicloalquilo", como se emplea en la presente memoria, incluye grupos hidrocarburo cíclicos saturados y parcialmente insaturados que tienen de 3 a 12 carbonos, preferiblemente de 3 a 8 carbonos y más preferiblemente de 3 a 6 carbonos, en donde el grupo cicloalquilo está además opcionalmente sustituido. Algunos grupos cicloalquilo incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo y ciclooctilo.

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8-12 miembros o tricíclico de 11-14 miembros que tiene de 1-3 heteroátomos si es monocíclico, de 1-6 heteroátomos si es bicíclico o de 1-9 heteroátomos si es tricíclico, dichos heteroátomos seleccionados de O, N o S (p. ej., átomos de carbono y de 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de O, N o S si es monocíclico, bicíclico o tricíclico, respectivamente), en donde 0, 1, 2, 3 o 4 átomos de cada anillo están sustituidos por un sustituyente. Los ejemplos de grupo heteroarilo incluyen piridilo, furilo o furanilo, imidazolilo, benzimidazolilo, pirimidinilo, tiofenilo o tienilo, quinolinilo, indolilo, tiazolilo y similares.

El término "heteroarilalquilo" o el término "heteroaralquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un heteroarilo. El término "heteroarilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con heteroarilo.

El término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillo no aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 812 miembros o tricíclico de 11-14 miembros que tiene de 1-3 heteroátomos si es monocíclico, de 1-6 heteroátomos si es bicíclico o de 1-9 heteroátomos si es tricíclico, dichos heteroátomos seleccionados de O, N o S (p. ej., átomos de carbono y de 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de O, N o S si es monocíclico, bicíclico o tricíclico, respectivamente), en donde 0, 1, 2, o 3 átomos de cada anillo están sustituidos por un sustituyente. Los ejemplos de grupo heterociclilo incluyen piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo y similares.

El término "sustituyente" se refiere a un grupo que reemplaza a un segundo átomo o grupo tal como un átomo de hidrógeno o cualquier molécula, compuesto o resto. Los sustituyentes adecuados incluyen, sin limitación, los grupos halo, hidroxi, mercapto, oxo, nitro, haloalquilo, alquilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alcoxi, tioalcoxi, ariloxi, amino, alcoxicarbonilo, amido, carboxi, alcanosulfonilo, alquilcarbonilo y ciano.

En algunos casos, los compuestos descritos contienen uno o más centros asimétricos y, por tanto, se presentan como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros únicos, diastereómeros individuales y mezclas diastereoméricas. Todas tales formas isoméricas de estos compuestos están incluidas en la presente invención a menos que indique expresamente lo contrario. En algunos casos, los compuestos de esta invención también se representan en formas tautoméricas múltiples, en tales casos, la invención incluye todas las formas tautoméricas de los compuestos descritos en la presente memoria (p. ej., si la alquilación de un sistema de anillo da lugar a alquilación en múltiples sitios, la invención incluye todos tales productos de reacción). Todas tales formas isoméricas de tales compuestos están incluidas en la presente invención a menos que indique expresamente lo contrario. Todas las formas cristalinas de los compuestos descritos en la presente memoria están incluidas en la presente invención a menos que indique expresamente lo contrario.

Como se emplean en la presente memoria, los términos "aumentar" y "reducir" significan, respectivamente, provocar un aumento o reducción estadísticamente significativos (es decir, p. ej., p < 0,1) de al menos el 5 %.

Como se emplea en la presente memoria, la mención de un intervalo numérico para una variable tiene como objeto transmitir que la invención se puede poner en práctica con la variable igual a cualquiera de los valores dentro de ese intervalo. Por tanto, para una variable que es inherentemente discreta, la variable es igual a cualquier valor de número entero dentro del intervalo numérico, incluyendo los extremos del intervalo. De forma similar, para una variable que es inherentemente continua, la variable es igual a cualquier valor real dentro del intervalo numérico, incluyendo los extremos del intervalo. Como ejemplo, y sin limitación, una variable que se describe como que tiene valores entre 0 y 2 toma los valores 0, 1 o 2 si la variable es inherentemente discreta y toma los valores 0,0; 0,1; 0,01; 0,001 o cualquier otro valor real >0 y <2 si la variable es inherentemente continua.

Como se emplea en la presente memoria, a menos que se indique específicamente lo contrario, la palabra "o" se usa en el sentido inclusivo de "y/o" y no en el sentido exclusivo de "uno/u otro".

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El término "en promedio" representa el valor medio derivado de realizar al menos tres réplicas independientes para cada punto de datos.

El término "actividad biológica" abarca las propiedades estructurales y funcionales de un macrociclo de la invención. La actividad biológica es, por ejemplo, estabilidad estructural, alfa-helicidad, afinidad por una diana, resistencia a la degradación proteolítica, penetrabilidad celular, estabilidad intracelular, estabilidad in vivo o cualquier combinación de las mismas.

Los detalles de uno o más casos concretos de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción que se presenta a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones.

Propiedades biológicas de los polipéptidos entrecruzados descritos

En un caso, la presente invención proporciona un método de identificar polipéptidos entrecruzados con eficacias mejoradas en sangre entera humana, que comprende las etapas de sintetizar análogos del polipéptido entrecruzado progenitor y realizar ensayos celulares en ausencia de proteínas séricas humanas y también en presencia de dos o más concentraciones de suero humano, con el fin de determinar la afinidad aparente de cada polipéptido entrecruzado por las proteínas séricas humanas y calcular una CE50 en sangre entera mediante extrapolación matemática.

En algunos casos, el polipéptido se selecciona de tal forma que la afinidad aparente de unión al suero (Kd*) del polipéptido entrecruzado es 1, 3, 10, 70 micromolar o mayor, pero no mayor de 700 micromolar. En otros casos, la Kd* del polipéptido entrecruzado es de 1 a 10, 70 o 700 micromolar. En otros casos, el polipéptido entrecruzado se selecciona de tal forma que posee una fracción libre estimada en sangre humana de entre el 0,1 y 50 %, o entre el 0,15 y 10 %.

En algunos casos, los valores de Kd aparentes para proteína sérica mediante análisis del cambio en CE50 se usan para proporcionar un medio sencillo y rápido de cuantificar la propensión de los compuestos experimentales a unir ASH y otras proteínas séricas. Existe una relación lineal entre la CE50 aparente en presencia de proteína sérica (CE '50) y la cantidad de proteína sérica añadida a un ensayo in vitro. Esta relación se define mediante la afinidad de unión del compuesto por las proteínas séricas, expresada como Kd*. Este término es una constante de disociación aparente determinada experimentalmente que puede ser el resultado de los efectos acumulativos de múltiples eventos de unión experimentalmente indistinguibles. La forma de esta relación se presenta aquí en la Ec. 0.1 y su derivación se puede encontrar en Copeland et al, Biorg. Med Chem Lett. 2004, 14:2309-2312.

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Una proporción significativa de unión de proteína sérica se puede atribuir a interacciones del fármaco con la ASH, debido a la alta concentración de esa proteína en el suero (35-50 g/L o 530-758 jM). Para calcular el valor de Kd para estos compuestos hemos asumido que el cambio en CE50 tras la adición de proteína se puede atribuir por completo a la aSh presente en el suero añadido, donde P es 700 jM para suero al 100 %, P es 70 jM para suero al 10 %, etc. Además, hacemos la suposición simplificadora de que todos los compuestos unen ASH con una estequiometría 1:1, de tal forma que el término n de la Ec. (0.1) sea constantemente la unidad. Con estos parámetros definidos, calculamos el valor de Kd* para cada péptido grapado a partir de los cambios en los valores de CE50 con concentraciones crecientes de suero (y proteína sérica) mediante el análisis de regresión no lineal de la Ec. 1.1 usando Mathematica 4.1 (Wolfram Research, Inc.,
www.wolfram.com). La fracción libre en sangre se estima por la ecuación siguiente, en la que la [ASH]tota/ se ajusta a 700 jM, como derivó Trainor, Expert Opin. Drug Disc., 2007, 2(1):51-64.

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En un caso, la actividad biológica mejorada se mide como penetrabilidad celular mejorada o una capacidad de inducir la apoptosis mejorada. En otros casos más, la actividad biológica se mide como el porcentaje del número de células destruidas en un ensayo in vitro en el que las células cultivadas se exponen a una concentración efectiva de dicho polipéptido.

En algunos casos, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 1 micromolar o más débil. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 3 micromolar o más débil. En otro caso, el polipéptido entrecruzado

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mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 10 micromolar o más débil. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 70 micromolar o más débil. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de entre 1-70 micromolar. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de entre 1-700 micromolar.

En algunos casos, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una fracción libre estimada en sangre entera de entre el 0,1-50 %. En otro caso, el polipéptido entrecruzado mejorado posee una fracción libre estimada en sangre entera de entre el 0,5-10 %.

Polipéptidos entrecruzados

Cualquier proteína o polipéptido con una secuencia de aminoácidos primaria conocida que contiene una estructura secundaria que se cree que otorga actividad biológica mediante interacción con una o más dianas de proteína intracelular, dominio proteico o ácido nucleico es objeto de la presente descripción. Por ejemplo, se puede analizar la secuencia del polipéptido y se pueden sustituir los análogos de aminoácido que contienen grupos reactivos con reactivos de macrociclación en las posiciones apropiadas. Las posiciones apropiadas se determinan comprobando qué superficie o superficies moleculares de la estructura secundaria son necesarias para la actividad biológica y, por lo tanto, a través de qué otra superficie o superficies los conectores formadores de macrociclo de la invención pueden formar un macrociclo sin bloquear estéricamente la superficie o superficies requeridas para la actividad biológica. Tales determinaciones se hacen usando métodos tales como cristalografía de rayos X de complejos entre la estructura secundaria y un ligando natural para visualizar residuos (y superficies) críticos para la actividad; mediante mutagénesis secuencial de residuos en la estructura secundaria para identificar funcionalmente residuos (y superficies) críticos para la actividad; o mediante otros métodos. Mediante tales determinaciones, los aminoácidos apropiados se sustituyen por los análogos de aminoácido y conectores formadores de macrociclo de la descripción. Por ejemplo, para que una estructura secundaria a-helicoidal tenga actividad biológica, puede ser necesario que una superficie de la hélice (p. ej., una superficie molecular que se extiende longitudinalmente a lo largo del eje de la hélice y radialmente 45-135° en torno al eje de la hélice) entre en contacto con otra biomolécula in vivo o in vitro. En tal caso, se diseña un conector formador de macrociclo para que conecte dos carbonos a de la hélice a la vez que se extiende longitudinalmente a lo largo de la superficie de la hélice en la parte de esa superficie no directamente requerida para la actividad.

En algunos casos, la secuencia peptídica deriva de la familia de proteínas BCL-2. La familia BCL-2 se define por la presencia de hasta cuatro dominios de homología BCL-2 (BH) conservados denominados BH1, BH2, BH3 y BH4, todos ellos incluyen segmentos a-helicoidales (Chittenden et al. (1995), EMBO 14:5589; Wang et al. (1996), Genes Dev. 10:2859). Las proteínas antiapoptóticas, tales como BCL-2 y BCL-Xl, presentan conservación de secuencia en todos los dominios BH. Las proteínas antiapoptóticas se dividen en miembros de la familia "multidominio" (p. ej., BAK, BAX), que poseen homología en los dominios BH1, BH2 y BH3, y miembros de la familia "solo dominio BH3" (p. ej., BID, BAD, BIM, BIK, NOXA, PUMA), que contienen homología de secuencia exclusivamente en el segmento a-helicoidal anfipático BH3. Los miembros de la familia BCL-2 tienen la capacidad de formar homo- y heterodímeros, lo que sugiere que la unión competitiva y la proporción entre los niveles de proteína pro- y antiapoptótica dictan la susceptibilidad a estímulos de muerte. Las proteínas antiapoptóticas sirven para proteger a las células del exceso proapoptótico, es decir, la muerte celular programada excesiva. Las medidas de seguridad "adicionales" incluyen la regulación de la transcripción de proteínas proapoptóticas y el mantenimiento de estas como confórmeros inactivos, que requieren activación proteolítica, desfosforilación o cambio conformacional inducido por ligando para activar las funciones promuerte. En ciertos tipos de células, las señales de muerte recibidas en la membrana plasmática desencadenan la apoptosis por medio de una vía mitocondrial. Las mitocondrias pueden servir como guardián de la muerte celular secuestrando el citocromo c, un componente crítico de un complejo citosólico que activa la caspasa 9, lo que lleva a eventos proteolíticos aguas abajo fatales. Las proteínas multidominio tales como BCL-2/bCl-Xl y BAK/BAX juegan papeles enfrentados de guardián y verdugo en la membrana mitocondrial, con sus actividades reguladas además por miembros solo BH3 de la familia BCL-2 aguas arriba. Por ejemplo, la BID es un miembro de la familia solo dominio BH3 de proteínas proapoptóticas y transmite las señales de muerte recibidas en la membrana plasmática a proteínas proapoptóticas efectoras situadas en la membrana mitocondrial. La BID tiene la capacidad de interaccionar con proteínas tanto pro- como antiapoptóticas y, tras activación por la caspasa 8, desencadena la liberación del citocromo c y la apoptosis mitocondrial. Los estudios de deleción y mutagénesis determinaron que el segmento BH3a-helicoidal anfipático de los miembros de la familia proapoptótica puede servir como un dominio de muerte y, por tanto, puede representar un motivo estructural crítico para la interacción con proteínas apoptóticas multidominio. Los estudios estructurales han mostrado que la hélice de BH3 puede interactuar con proteínas antiapoptóticas insertando en un surco hidrofóbico, formado por la interfaz de BH1, 2 y 3 dominios. La BID activada puede ser unida y secuestrada por proteínas antiapoptóticas (p. ej., BCL-2 y BCL-Xl) y puede desencadenar la activación de las proteínas proapoptóticas BAX y bAk, lo que lleva a la liberación del citocromo c y a un programa de apoptosis mitocondrial. La BAD también es un miembro de la familia proapoptótica de solo dominio BH3 cuya expresión desencadena la activación de BAX/BAK. Sin embargo, al contrario que la BID, la BAD presenta una unión preferente a los miembros de la familia antiapoptótica BCL-2 y BCL-Xl. Mientras que el dominio BH3 de la BAD exhibe una unión a BCL-2 de alta afinidad, el péptido BH3 de la BAD es incapaz de activar la liberación del citocromo c desde las mitocondrias in vitro, lo que sugiere que la BAD no es un activador directo de BAX/BAK. Las mitocondrias que sobreexpresan BCL-2 son resistentes a la liberación del citocromo c inducida por BID, pero el

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cotratamiento con BAD puede restablecer la sensibilidad a BID. La inducción de la apoptosis mitocondrial mediante BAD parece ser el resultado de: (1) el desplazamiento de activadores de BAX/BAK, tales como proteínas BID o similares a BID, desde el bolsillo de unión de BCL-2/BCL-XL o (2) la ocupación selectiva del bolsillo de unión de BCL-2/BCL-XL por la BAD para evitar el secuestro de proteínas similares a BID por proteínas antiapoptóticas. Por tanto, han surgido dos clases de proteínas de solo dominio BH3, las proteínas similares a BID, que activan directamente la apoptosis mitocondrial, y las proteínas similares a BAD, que tienen la capacidad de sensibilizar las mitocondrias a proapoptóticas similares a BID ocupando los bolsillos de unión de las proteínas antiapoptóticas multidominio. Se han descrito diversos dominios a-helicoidales de proteínas miembros de la familia BCL-2 susceptibles a la metodología descrita en la presente memoria (Walensky et al. (2004), Science 305:1466 y Walensky et al., patente de Estados Unidos de n.° de publicación 2005/02506 80).

En otros casos, la secuencia peptídica deriva de la proteína supresora de tumores p53 que se une a la proteína oncogén MDM2. El sitio de unión de la MDM2 está localizado dentro de una región de la supresora de tumores p53 que forma una hélice a. En la patente de Estados Unidos n.° 7 083 983, Lane et al. describen que la región de p53 responsable de la unión a MDM2 está representada aproximadamente por los aminoácidos 13-31 (PLSQETFSDLWKLLPENNV) de la proteína p53 humana madura. Otras secuencias modificadas descritas por Lane también están contempladas en la presente invención. Asimismo, la interacción de p53 y MDM2 ha sido comentada por Shair et al. (1997), Chem. & Biol. 4:791, y se han identificado mutaciones del gen p53 en virtualmente la mitad de todos los casos de cáncer de los que se ha informado. A medida que una célula se somete a tensiones, se cree que la p53 orquesta una respuesta que lleva a la detención del ciclo celular y reparación del ADN, o a la muerte celular programada. Además de las mutaciones del gen p53 que alteran la función de la proteína p53 directamente, la p53 se puede alterar por cambios en la MDM2. Se ha mostrado que la proteína MDM2 se une a la p53 e interrumpe la activación transcripcional asociándose con el dominio de transactivación de la p53. Por ejemplo, un péptido de 11 aminoácidos derivado del dominio de transactivación de la p53 forma una hélice a anfipática de 2,5 giros que se inserta en la hendidura de la MDM2. Por tanto, en algunos casos, se diseñan novedosas estructuras de hélice a generadas mediante el método de la presente invención para generar estructuras que se unen fuertemente al aceptor de la hélice e interrumpen las interacciones proteína-proteína nativas. A continuación, se criban estas estructuras usando técnicas de alto rendimiento para identificar péptidos de molécula pequeña óptimos. Las estructuras novedosas que interrumpen la interacción de MDM2 son útiles para muchas aplicaciones, que incluyen, pero no se limitan a, el control de sarcomas de tejido blando (que sobreexpresan MDM2 en presencia de p53 de tipo salvaje). A continuación, en algunos casos, estos cánceres se contienen con moléculas pequeñas que interceptan la MDM2, evitando de este modo la supresión de la p53. Además, en algunos casos, se usan disruptores de molécula pequeña de las interacciones MDM2-p53 como terapia adyuvante para ayudar a controlar y modular la magnitud de la respuesta apoptótica dependiente de p53 en la quimioterapia convencional.

A continuación, se facilita una lista ejemplar no limitante de secuencias peptídicas adecuadas para su uso como punto de partida para la optimización según la presente descripción:

TABLA 1

Nombre: Secuencia (negrita = residuos críticos) Secuencia entrecruzada (X = residuo con enlace cruzado)

Péptidos BH3

BID-BH3: QEDIIRNIARHLAQVGDSMDRSIPP QEDIIRNIARHLAXVGDXMDRSIPP

BIM-BH3: DNRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYAR DNRPEIWIAQELRXIGDXFNAYYAR

BAD-BH3: NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKK NLWAAQRYGRELRXMSDXFVDSFKK

PUMA-BH3: EEQWAREIGAQLRRMADDLNAQYER EEQWAREIGAQLRXMADXLNAQYER

Hrk-BH3: RSSAAQLTAARLKALGDELHQRTM RSSAAQLTAARLKXLGDXLHQRTM

NOXAA-BH3: AELPPEFAAQLRKIGDKVYCTW AELPPEFAAQLRXIGDXVYCTW

NOXAB-BH3: VPADLKDECAQLRRIGDKVNLRQKL VPADLKDECAQLRXIGDXVNLRQKL

BMF-BH3: QHRAEVQIARKLQCIADQFHRLHT QHRAEVQIARKLQXIADXFHRLHT

BLK-BH3: SSAAQLTAARLKALGDELHQRT SSAAQLTAARLKXLGDXLHQRT

BIK-BH3: CMEGSDALALRLACIGDEMDVSLRA CMEGSDALALRLAXIGDXMDVSLRA

Bnip3: DIERRKEVESILKKNSDWIWDWSS DIERRKEVESILKXNSDXIWDWSS

Péptidos BH3

BOK-BH3: GRLAEVCAVLLRLGDELEMIRP GRLAEVCAVLLXLGDXLEMIRP

BAX-BH3: PQDASTKKSECLKRIGDELDSNMEL PQDASTKKSECLKXIGDXLDSNMEL

BAK-BH3: PSSTMGQVGRQLAIIGDDINRR PSSTMGQVGRQLAXIGDXINRR

BCL2L1-BH3: KQALREAGDEFELR KQALRXAGDXFELR

BCL2-BH3: LSPPWHLALALRQAGDDFSRR LSPPWHLALALRXAGDXFSRR

BCL-XL-BH3: EVIPMAAVKQALREAGDEFELRY EVIPMAAVKQALRXAGDXFELRY

BCL-W-BH3: PADPLHQAMRAAGDEFETRF PADPLHQAMRXAGDXFETRF

MCLI-BH3: ATSRKLETLRRVGDGVQRNHETA ATSRKLETLRXVGDXVQRNHETA

MTD-BH3: LAEVCTVLLRLGDELEQIR LAEVCTVLLXLGDXLEQIR

MAP-1-BH3: MTVGELSRALGHENGSLDP MTVGELSRALGXENGXLDP

NIX-BH3: WEGEKEVEALKKSADWVSDWS VVEGEKEVEALKXSADXVSDWS

4ICD(ERBB4)-BH3: SMARDPQRYLVIQGDDRMKL SMARDPQRYLVXQGDXRMKL

La Tabla 1 enumera secuencias humanas que se dirigen al sitio de unión de BH3 y están implicadas en cánceres, trastornos autoinmunes, enfermedades metabólicas y otras enfermedades humanas.

TABLA 2

Péptidos BH3

BID-BH3: QEDIIRNIARHLAQVGDSMDRSIPP QEDIIRNIXRHLXQVGDSMDRSIPP

BIM-BH3: DNRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYAR DNRPEIWIXQELXRIGDEFNAYYAR

BAD-BH3: NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKK NLWAAQRYXRELXRMSDEFVDSFKK

PUMA-BH3: EEQWAREIGAQLRRMADDLNAQYER EEQWAREIXAQLXRMADDLNAQYER

Hrk-BH3: RSSAAQLTAARLKALGDELHQRTM RSSAAQLTXARLXALGDELHQRTM

NOXAA-BH3: AELPPEFAAQLRKIGDKVYCTW AELPPEFXAQLXKIGDKVYCTW

NOXAB-BH3: VPADLKDECAQLRRIGDKVNLRQKL VPADLKDEXAQLXRIGDKVNLRQKL

BMF-BH3: QHRAEVQIARKLQCIADQFHRLHT QHRAEVQIXRKLXCIADQFHRLHT

BLK-BH3: SSAAQLTAARLKALGDELHQRT SSAAQLTXARLXALGDELHQRT

BIK-BH3: CMEGSDALALRLACIGDEMDVSLRA CMEGSDALXLRLXCIGDEMDVSLRA

Bnip3: DIERRKEVESILKKNSDWIWDWSS DIERRKEVXSILXKNSDWIWDWSS

BOK-BH3: GRLAEVCAVLLRLGDELEMIRP GRLAEVXAVLXRLGDELEMIRP

BAX-BH3: PQDASTKKSECLKRIGDELDSNMEL PQDASTKKXECLXRIGDELDSNMEL

BAK-BH3: PSSTMGQVGRQLAIIGDDINRR PSSTMGQVXRQLXIIGDDINRR

BCL2L1-BH3: KQALREAGDEFELR XQALXEAGDEFELR

Péptidos BH3

BCL2-BH3: LSPPVVHLALALRQAGDDFSRR LSPPWHLXLALXQAGDDFSRR

BCL-XL-BH3: EVIPMAAVKQALREAGDEFELRY EVIPMAAVXQALXEAGDEFELRY

BCL-W-BH3: PADPLHQAMRAAGDEFETRF PADPLXQAMXAAGDEFETRF

MCLI-BH3: ATSRKLETLRRVGDGVQRNHETA ATSRKXETLXRVGDGVQRNHETA

MTD-BH3: LAEVCTVLLRLGDELEQIR LAEVXTVLXRLGDELEQIR

MAP-1-BH3: MTVGELSRALGHENGSLDP MTVGELXRALXHENGSLDP

NIX-BH3: WEGEKEVEALKKSADWVSDWS VVEGEKEXEALXKSADWVSDWS

4ICD(ERBB4)-BH3: SMARDPQRYLVIQGDDRMKL SMARDPXRYLXIQGDDRMKL

La Tabla 2 enumera secuencias humanas que se dirigen al sitio de unión de BH3 y están implicadas en cánceres, trastornos autoinmunes, enfermedades metabólicas y otras enfermedades humanas.

TABLA 3

Péptidos p53

Péptido hp53 1: LSQETFSDLWKLLPEN LSQETFSDXWKLLPEX

Péptido hp53 2: LSQETFSDLWKLLPEN LSQEXFSDLWKXLPEN

Péptido hp53 3: LSQETFSDLWKLLPEN LSQXTFSDLWXLLPEN

Péptido hp53 4: LSQETFSDLWKLLPEN LSQETFXDLWKLLXEN

Péptido hp53 5: LSQETFSDLWKLLPEN QSQQTFXNLWRLLXQN

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La Tabla 3 enumera secuencias humanas que se dirigen al sitio de unión a p53 de MDM2/X y están implicadas en cánceres.

TABLA 4

Nombre: Secuencia (negrita = residuos críticos) Secuencia entrecruzada (X = enlace cruzado

Ligandos peptídicos de GPCR

Angiotensina II: DRVYIHPF DRXYXHPF

Bombesina: EQRLGNQWAVGHLM EQRLGNXWAVGHLX

Bradiquinina: RPPGFSPFR RPPXFSPFRX

C5a: ISHKDMQLGR ISHKDMXLGRX

C3a: ARASHLGLAR ARASHLXLARX

Hormona a-melanocito estimulante: SYSMEHFRWGKPV SYSMXHFRWXKPV

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La Tabla 4 enumera secuencias que se dirigen a receptores acoplados a proteínas G humanos y están implicadas en numerosas enfermedades humanas (Tyndall et al. (2005), Chem. Rev. 105:793-826).

Polipéptidos entrecruzados

En algunos casos del método, un polipéptido de la descripción contiene un enlace cruzado. En algunos casos del método, dicho polipéptido contiene dos enlaces cruzados. En algunos casos del método, un enlace cruzado conecta dos átomos de carbono a. En otros casos del método, un átomo de carbono a al que está unido un enlace cruzado está sustituido con un sustituyente de fórmula R-. En otro caso del método, dos átomos de carbono a a los que está unido un enlace cruzado están sustituidos con sustituyentes independientes de fórmula R-. En un caso de los métodos de la invención, R- es alquilo. Por ejemplo, R- es metilo. Como alternativa, R- y una parte de un enlace cruzado tomados juntos pueden formar una estructura cíclica. En otro caso del método, un enlace cruzado está formado por dos enlaces carbono-carbono consecutivos. Por ejemplo, un enlace cruzado puede comprender al menos 8, 9, 10, 11 o 12 enlaces consecutivos. En otros casos, un enlace cruzado puede comprender al menos 7, 8, 9, 10 u 11 átomos de carbono.

En otro caso del método, el polipéptido entrecruzado comprende un dominio a-helicoidal de un miembro de la familia BCL-2. Por ejemplo, el polipéptido entrecruzado comprende un dominio BH3. En otros casos, el polipéptido entrecruzado comprende al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de cualquiera de las secuencias de las Tablas 1, 2, 3 y 4. En algunos casos del método, el polipéptido entrecruzado penetra las membranas celulares mediante un proceso dependiente de la energía y se une a una diana intracelular.

En algunos casos, dicho polipéptido helicoidal contiene un enlace cruzado. En otros casos, dicho polipéptido helicoidal contiene dos enlaces cruzados.

En algunos casos, un enlace cruzado conecta dos átomos de carbono a. En otros casos, un átomo de carbono a al que está unido un enlace cruzado está sustituido con un sustituyente de fórmula R-. En otro caso, dos átomos de carbono a a los que está unido un enlace cruzado están sustituidos con sustituyentes independientes de fórmula R-. En un caso de la invención, R- es alquilo. Por ejemplo, R- es metilo. Como alternativa, R- y una parte de un enlace cruzado tomados juntos pueden formar una estructura cíclica. En otro caso, un enlace cruzado está formado por enlaces carbono-carbono consecutivos. Por ejemplo, un enlace cruzado puede comprender al menos 8, 9, 10, 11 o 12 enlaces consecutivos. En otros casos, un enlace cruzado puede comprender al menos 7, 8, 9, 10 u 11 átomos de carbono.

En otro caso, el polipéptido entrecruzado comprende un dominio a-helicoidal de un miembro de la familia BCL-2. Por ejemplo, el polipéptido entrecruzado comprende un dominio BH3. En otros casos, el polipéptido entrecruzado comprende al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de cualquiera de las secuencias de las Tablas 1, 2, 3 y 4. En algunos casos, el polipéptido entrecruzado penetra las membranas celulares mediante un proceso dependiente de la energía y se une a una diana intracelular.

En algunos casos, los polipéptidos entrecruzados de la invención tienen la Fórmula (I):

imagen5

en donde:

cada A, C, D y E son independientemente un aminoácido natural o no natural;

r3

H o

B es un aminoácido natural o no natural, análogo de aminoácido, , [-NH-L3-CO-], [-NH-L3-SO2-] o [-NH-L3-];

5

10

15

20

25

30

35

40

Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, sin sustituir o sustituidos con halo-;

R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo,

cicloalquilalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, opcionalmente sustituidos con R5;

L es un conector formador de macrociclo de fórmula -L1-L2-;

L1 y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno,

heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno o [-R4-K-R4-K estando cada uno opcionalmente sustituidos con

R5;

cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno o heteroarileno;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2 o CONR3;

cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N(Ra)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, un resto fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

cada Ra es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, un resto fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, opcionalmente sustituidos con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D;

R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, opcionalmente sustituidos con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E;

u es un número entero de 0-10;

v es un número entero de 1-1000;

w es un número entero de 1-1000;

x es un número entero de 0-10;

y es un número entero de 0-10;

z es un número entero de 0-10; y

n es un número entero de 1-5.

En un ejemplo, al menos uno de R1 y R2 es alquilo, sin sustituir o sustituido con halo-. En otro ejemplo, tanto R1 como R2 son independientemente alquilo, sin sustituir o sustituido con halo-. En algunos casos, al menos uno de R1 y R2 es metilo. En otros casos, R1 y R2 son metilo.

En algunos casos de la descripción, x+y+z es al menos 3. En otros casos de la descripción, x+y+z es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Cada aparición de A, B, C, D o E en un macrociclo o precursor de macrociclo de la descripción se selecciona independientemente. Por ejemplo, una secuencia representada por la fórmula [A]x, cuando x es 3, abarca casos en los que los aminoácidos no son idénticos, p. ej., Gln-Asp-Ala, así como casos en los que los aminoácidos son idénticos, p. ej., Gln-Gln-Gln. Esto se aplica para cualquier valor de x, y o z en los intervalos indicados.

En algunos casos, el polipéptido entrecruzado de la descripción comprende una estructura secundaria que es una hélice a y R8 es -H, lo que permite la formación de enlaces de hidrógeno intrahelicoidales. En algunos casos, al menos uno de A, B, C, D o E es un aminoácido a,a-disustituido. En un ejemplo, B es un aminoácido a,a-disustituido. Por ejemplo, al menos uno de A, B, C, D o E es ácido 2-aminoisobutírico. En otros casos, al menos uno de A, B, C,

En otros casos, la longitud del conector formador de macrociclo L, como se mide desde un primer Ca a un segundo Ca, se selecciona para estabilizar una estructura peptídica secundaria deseada, tal como una hélice a formada por residuos del polipéptido entrecruzado que incluyen, pero no se limitan necesariamente a, los que se encuentran entre el primer Ca y un segundo Ca.

En un caso, el polipéptido entrecruzado de Fórmula (I) es:

Ra O

D o E es

imagen6

imagen7

en donde cada Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, sin sustituir o sustituidos con halo-;

5

En casos relacionados, el polipéptido entrecruzado de Fórmula (I) es:

imagen8

imagen9

En otros casos, el macrociclo peptidomimético de Fórmula (I) es un compuesto de cualquiera de las fórmulas mostradas a continuación:

10

imagen10

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Método de cribado de un polipéptido que comprende una hélice alfa y un entrecruzador que conecta un primer aminoácido y un segundo aminoácido del polipéptido, en donde el polipéptido penetra las membranas celulares mediante un proceso dependiente de la energía y se une a una diana intracelular, método que comprende:

(a) medir la eficacia in vitro del polipéptido en un ensayo de células enteras en donde la actividad está mediada por la unión a la diana intracelular, en presencia y en ausencia de suero humano;

(b) calcular la CE50 y la afinidad aparente (Kd*) del polipéptido por las proteínas séricas humanas, y

(c) seleccionar un polipéptido, que tenga una Kd* de 1 a 700 micromolar.
2. Método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido seleccionado tiene una Kd* inferior a 70 micromolar.
3. Método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido seleccionado tiene una Kd* de 1-10 micromolar.
4. Método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido seleccionado posee una fracción libre estimada en

sangre humana del 0,1-50 %, en donde la fracción libre estimada se define por la ecuación

K *

Fracción libre =-----------------------------------------------------------

y [ASH]totai es 700 micromolar.
5. Método de la reivindicación 4, en donde el polipéptido seleccionado posee una fracción libre estimada en sangre humana del 0,5-10 %.
6. Método de la reivindicación 1, en donde el mecanismo de penetración celular dependiente de la energía es endocitosis.
7. Método de la reivindicación 1, en donde al menos uno del primero y segundo aminoácidos es un aminoácido a,a-disustituido.
8. Método de la reivindicación 1, en donde tanto el primero como el segundo aminoácidos son a,a- disustituidos.
9. Método de la reivindicación 1, en donde el primer aminoácido y el segundo aminoácido están separados por tres o seis aminoácidos.
10. Método de la reivindicación 1, en donde el entrecruzador abarca 1 o 2 giros de la hélice alfa.
11. Método de la reivindicación 1, en donde la longitud del entrecruzador es de aproximadamente 5 A a

aproximadamente 9 A por giro de la hélice alfa.
12. Método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido seleccionado lleva una carga neta positiva a pH 7,4.
13. Método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido seleccionado proporciona un efecto terapéutico.
14. Método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido seleccionado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 1 micromolar o más débil.
15. Método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido seleccionado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 3 micromolar o más débil.
16. Método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido seleccionado posee una afinidad aparente por las proteínas séricas humanas de 10 micromolar o más débil.
17. Método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido seleccionado posee una capacidad mejorada de penetrar las membranas celulares mediante un proceso dependiente de la energía con respecto a un polipéptido no entrecruzado correspondiente.

CE í0 = CE,, t P ^

]+-^-

CE
18. Método de la reivindicación 1, en donde Kd* se define por la ecuación v ■ en la que n es

1, CE50 es una eficacia in vitro medida en un ensayo de células enteras en ausencia de suero humano alguno y CE'50 es una eficacia in vitro medida en un ensayo de células enteras en un N % de suero humano en donde P es igual a (N/100) x (700) micromolar.

% viables

Figura 1

imagen1

Concentración del compuesto 1 (pM)

Figura 2

CE50 frente a porcentaje de suero (como concentración de ASH en pM) para los péptidos seleccionados

imagen2

3

4

5

-O- 6 -D- 7

8

-B- 9

Figura 3

CE50 frente a porcentaje de suero (como concentración de ASH en pM) para los péptidos seleccionados

imagen3

10 • 11

-ér- 12

13

14

-O- 15 O 16

Figura 4

O)

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Compuesto 10

Kd* = < 0,1 uM CE„ {WB)= 1781 uM

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Compuesto 11

Kd* = 1,1 uM CE50 (WB) = 367 uM

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1.5

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Compuesto 12

Kd* = 2,3 uM CES0 (WB) = 246 uM

Compuesto 16

Kd* = 3,5 uM CE50 (WB) = 88 uM