ES2664224T3

ES2664224T3 - Proteína de unión a VEGF para el bloqueo de la angiogénesis

Info

Publication number: ES2664224T3
Application number: ES12826108.8T
Authority: ES
Inventors: Bob Carter; Jeng-Shin Lee; Szofia S. BULLAIN; Richard C. Mulligan
Original assignee: Harvard College; General Hospital Corp; Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Harvard College; General Hospital Corp; Childrens Medical Center Corp
Priority date: 2011-08-19
Filing date: 2012-08-17
Publication date: 2018-04-18
Anticipated expiration: 2032-08-17
Also published as: US9701731B2; WO2013028541A1; DK2744508T3; EP2744508A4; NO2892808T3; US10259862B2; US20140302025A1; EP2744508A1; US20190292239A1; US20180127483A1; EP2744508B1

Abstract

Una proteína quimérica de unión a VEGF, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Description

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Se puede usar la mutagénesis específica dirigida al sitio de la secuencia de ADN de VEGF quimérica en un vector para crear mutaciones y sustituciones específicas de aminoácidos en la porción Fc para reducir adicionalmente las propiedades inmunogénicas de la proteína quimérica eventual de unión a VEGF. Del mismo modo, se puede llevar a cabo la mutagénesis dirigida al sitio en el dominio 2 similar a Ig para mejorar la afinidad de unión a VEGF de la proteína quimérica de unión a VEGF. Los ejemplos de mutaciones de aminoácidos son la mutación de serina por prolina y una sustitución de leucina por glutamato en la región Fc. La mutagénesis dirigida al sitio se puede llevar a cabo usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio de QuikChange® de Stratagene, según las instrucciones del fabricante, o cualesquiera métodos conocidos en la técnica.

Vectores de expresión y sistemas de expresión para la expresión de proteína quimérica de unión a VEGF

Se proporcionan vectores de expresión que portan un polinucleótido que codifica una proteína quimérica de unión a VEGF para la expresión y purificación de la proteína quimérica recombinante de unión a VEGF producida a partir de un sistema de expresión de proteína usando células hospedantes seleccionadas, por ejemplo, de células de mamífero, de insecto, de levadura, bacterianas, o vegetales.

El vector recombinante que expresa una proteína quimérica de unión a VEGF puede ser un vector vírico. El vector vírico puede ser cualquier vector vírico conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos derivados de adenovirus, virus adenoasociado (AAV), retrovirus, y lentivirus. Los virus recombinantes proporcionan un sistema versátil para estudios de expresión génica y aplicaciones terapéuticas.

Se proporciona una célula hospedante que comprende un vector de expresión que expresa la proteína quimérica de unión a VEGF. La célula hospedante de expresión puede derivar de cualquiera de un número de fuentes, por ejemplo bacterias, tales como E. coli, levaduras, mamíferos, insectos, y células vegetales tales como chymadomonas. La proteína quimérica recombinante de unión a VEGF se puede producir a partir de vectores de expresión adecuados para sistemas de expresión libres de células. A partir del vector de clonación, la secuencia quimérica de ADN de VEGF se puede subclonar en un vector de expresión recombinante que es apropiado para la expresión de la proteína quimérica de unión a VEGF en células de mamífero, de insecto, de levadura, bacterianas, o vegetales, o un sistema de expresión libre de células tal como el sistema de expresión de reticulocitos de conejo. La subclonación se puede lograr mediante clonación por PCR, digestión mediante restricción seguido de ligación, o reacción de recombinación tal como aquellas de la recombinación específica del sitio a base del fago lambda que usa las mezclas de enzimas Gateway® LR y BP Clonase™. La subclonación debería ser unidireccional, de tal manera que el codón de inicio de 5’ ATG de la secuencia quimérica de ADN de VEGF esté en dirección 3’ del promotor en el vector de expresión. Como alternativa, cuando la secuencia quimérica de ADN de VEGF se clona en pENTR/D-TOPO®, pENTR/SD/D-TOPO® (vectores de entrada direccional), o cualquiera de los vectores de Invitrogen Gateway® Technology pENTR (entrada), la secuencia quimérica de ADN de VEGF se puede transferir a los diversos vectores de expresión Gateway® (destino) para la expresión proteica en células de mamífero, E. coli, insectos y levadura, respectivamente, en una única reacción de recombinación. Algunos de los vectores de destino Gateway® se diseñan para las construcciones de baculovirus, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), retrovirus, y lentivirus, que, al infectar a sus células hospedantes respectivas, permiten la expresión heteróloga de la proteína quimérica de unión a VEGF en las células hospedantes. La tecnología Gateway® usa recombinación específica del sitio a base del fago lambda, en lugar de endonucleasa de restricción y ligasa para insertar un gen de interés en un vector de expresión. Las secuencias de recombinación de ADN (attL, attR, attB, y attP) y las mezclas enzimáticas LR y BP Clonase™ que median las reacciones de recombinación de lambda son la base de la tecnología Gateway®. La transferencia de un gen a un vector de destino se logra en solamente dos etapas: Etapa 1: Clonación de la secuencia de ADN quimérica en un vector de entrada tal como pENTR/D-TOPO®. Etapa 2: Mezclamiento del clon de entrada que contiene la secuencia de ADN quimérica in vitro con el vector de expresión Gateway® apropiado

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de E. coli para proporcionar el amortiguador de alimentación continuo libre de células. Este sistema de flujo continuo es compatible con vectores de expresión tanto procariotas como eucariotas. Chang G. el. al., Science 310:1950-3 (2005) describen la producción libre de células a gran escala de la proteína integral de membrana, transportador de múltiples fármacos EmrE.

Otros sistemas de expresión libres de células comercialmente disponibles incluyen los sistemas de expresión libres de células Expressway™ (Invitrogen), que utilizan un sistema in vitro a base de E. coli para reacciones acopladas eficientes de transcripción y traducción para producir hasta cantidades de miligramos de proteína recombinante activa en un formato de reacción en tubo; el Sistema de Traducción Rápida (RTS) (Roche Applied Science), que también usa un sistema in vitro a base de E. coli; y los Sistemas de Lisados de Reticulocitos Acoplados TNT (Promega), que usa un sistema in vitro a base de reticulocitos de conejo.

Usos terapéuticos y formulación

Se describe un método para tratar una enfermedad o trastorno angiogénico, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un vector que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico que se une a VEGF, en el que el polipéptido quimérico de unión a VEGF comprende un dominio 2 similar a Ig de un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular y una región Fc de inmunoglobulina G1 o un derivado inmunogénico reducido de una región Fc de inmunoglobulina G1. Como alternativa, se puede administrar una composición farmacéutica que comprende una proteína quimérica que se une a VEGF y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, el mencionado sujeto que necesita tratamiento puede ser un mamífero, tal como un perro o un gato, preferiblemente un ser humano.

Se describe un método para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición farmacéutica que comprende una proteína quimérica, en la que el polipéptido quimérico comprende un dominio 2 similar a inmunoglobulina de un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular y una región Fc de inmunoglobulina G1 o un derivado inmunogénico reducido de una región Fc de inmunoglobulina G1. Los métodos descritos aquí se pueden usar en combinación con otras opciones de tratamiento disponibles para enfermedades o trastornos relacionados con la angiogénesis.

Como se usa aquí, angiogénesis se refiere a la aparición de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos preexistentes, caracterizado por la proliferación y migración de células endoteliales disparada por ciertas condiciones patológicas, tal como el crecimiento de tumores sólidos y metástasis.

Como se usa aquí, la expresión “enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis” se refiere a enfermedades

o trastornos que dependen de un suministro rico de sangre y una proliferación de vasos sanguíneos para la progresión patológica de la enfermedad (por ejemplo, tumores metastásicos), o enfermedades o trastornos que son el resultado directo de la proliferación aberrante de vasos sanguíneos (por ejemplo retinopatía diabética y hemangiomas). Los ejemplos incluyen proliferación vascular anormal, formación de ascitis, psoriasis, degeneración macular relacionada con la edad, hiperplasia tiroidea, preclamsia, artritis reumatoide y osteoartritis, enfermedad de Alzheimer, obesidad, efusión pleural, aterosclerosis, endometriosis, retinopatías diabéticas/de otro tipo, neovascularizaciones oculares tales como glaucoma neovascular y neovascularización corneal.

La enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis se puede seleccionar, por ejemplo, de un grupo que consiste en cáncer, formación de ascitis, psoriasis, degeneración macular relacionada con la edad, hiperplasia tiroidea, preeclampsia, artritis reumatoide y osteoartritis, enfermedad de Alzheimer, obesidad, efusión pleural, aterosclerosis, endometriosis, retinopatías diabéticas/de otro tipo, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, hemangiomas, y neovascularización corneal. En una realización, la degeneración macular relacionada con la edad es degeneración macular húmeda.

La enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis puede ser cáncer, en el que las células cancerosas neoplásicas que se dividen rápidamente requieren un suministro eficiente de sangre para mantener el crecimiento continuo del tumor. Como se usa aquí, cáncer se refiere a cualesquiera de los diversos neoplasmas malignos caracterizados por la proliferación de células anaplásicas que tienden a invadir el tejido circundante y metastatizarse a nuevos sitios del cuerpo, y también se refiere a la condición patológica caracterizada por tales crecimientos neoplásicos malignos. Los vasos sanguíneos proporcionan conductos para la metástasis y difusión a cualquier parte en el cuerpo. Al llegar al sitio metastásico, las células cancerosas trabajan entonces estableciendo una nueva red de suministro sanguíneo. La administración de un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico que se une a VEGF, o una composición farmacéutica que comprende una proteína quimérica que se une a VEGF y un vehículo farmacéuticamente aceptable, puede inhibir la angiogénesis. Al inhibir la angiogénesis en el sitio de tumor primario y en el sitio de tumor secundario, las composiciones pueden servir para prevenir y limitar la progresión de la enfermedad.

La eficacia de un polipéptido quimérico dado de unión a VEGF como se describe aquí se puede evaluar in vitro o in vivo, o de ambas maneras, como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos proporcionados aquí más abajo. Para evitar dudas, también se pueden usar otros ensayos aceptados habitualmente en el campo. Por ejemplo, se puede usar el ensayo de “CAM”. El ensayo de membrana corioalantoica de pollito (CAM) se usa frecuentemente para

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evaluar los efectos de los factores que regulan la angiogénesis, debido a que es relativamente fácil y proporciona resultados relativamente rápidos. Un polipéptido quimérico de unión a VEGF útil en los métodos y composiciones descritos aquí disminuirá el número de microvasos en el ensayo de CAM modificado descrito por Iruela-Arispe et al., 1999, Circulation 100: 1423-1431, con respecto a controles sin el polipéptido quimérico añadido o expresado. El método se basa en el crecimiento vertical de nuevos vasos capilares en un pelete de gel de colágeno colocado en la CAM. En el ensayo como se describe por Iruela-Arispe et al., el gel de colágeno está suplementado con VEGF (250 ng/gel) en presencia o ausencia de proteínas/péptidos de ensayo. El grado del efecto antiangiogénico se mide usando FITC-dextrano (50 g/ml) (Sigma) inyectado en la circulación de la CAM. El grado de intensidad de la fluorescencia iguala a las variaciones en la densidad capilar; la linealidad de esta correlación se puede observar con un intervalo de capilares entre 5 y 540. Se pueden realizar análisis morfométricos, por ejemplo mediante adquisición de imágenes con una cámara CCD. Las imágenes se analizan entonces importándolas en un paquete de análisis, por ejemplo NHImage 1.59, y las medidas de la intensidad de la fluorescencia se obtienen como píxeles positivos. Cada punto de dato se compara con sus propios controles positivos y negativos presentes en la misma CAM, y se interpretan como un porcentaje de inhibición, considerando que el control positivo es 100% (VEGF solo) y el control negativo (vehículo solo) es 0%. La evaluación estadística de los datos se lleva a cabo para comprobar si los grupos difieren significativamente del azar, por ejemplo mediante análisis de contingencia con corrección de Yates.

En la técnica se conocen ensayos de angiogénesis adicionales, y se pueden usar para evaluar polipéptidos quiméricos de unión a VEGF para uso en los métodos y composiciones descritos aquí. Estos incluyen, por ejemplo, el ensayo de microbolsillo corneal, el ensayo del saco de mejilla de hámster, el ensayo de Matrigel y sus modificaciones, y ensayos de cocultivo. Donovan et al. describen una comparación de tres ensayos in vitro diferentes desarrollados para evaluar reguladores de la angiogénesis en un trasfondo humano (Donovan et al., 2001, Angiogenesis 4: 113-121. De forma breve, los ensayos examinados incluyen: 1) un ensayo de Matrigel básico en el que se siembran en placas células endoteliales humanas de baja pasada (células endoteliales de la vena umbilical humanas, HUVEC) en pocillos revestidos con Matrigel (Becton Dickinson, Cedex, Francia) con o sin regulador o reguladores de la angiogénesis; 2) un ensayo de Matrigel similar que usa Matrigel con “factor de crecimiento reducido” o GFR; y 3) un ensayo de cocultivo en el que se cocultivan fibroblastos humanos primarios y HUVEC con

o sin regulador o reguladores de la angiogénesis adicionales – los fibroblastos producen matriz extracelular y otros factores que apoyan la diferenciación de HUVEC y la formación de túbulos. En el documento de Donovan et al., el ensayo de cocultivo proporcionó redes de microvasos que se parecieron muchísimo a las redes de microvasos in vivo. Sin embargo, el ensayo de Matrigel básico y el ensayo de Matrigel GFR también pueden ser usados por alguien de pericia en la técnica para evaluar si un polipéptido quimérico de unión a VEGF dado es un inhibidor de la angiogénesis necesario para los métodos y composiciones descritos aquí. Finalmente, Chemicon (Millipore) comercializa un kit de ensayo de angiogénesis in vitro. El Kit de Ensayo de Angiogénesis In Vitro en Gel de Fibrina tiene el Número de Catálogo de Chemicon ECM630. Un polipéptido quimérico de unión a VEGF como se describe aquí es considerado útil en un método o composición para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis como se describe aquí si reduce la angiogénesis en uno cualquiera de estos ensayos en 10% o más con respecto a un ensayo de control llevado a cabo sin el polipéptido quimérico de unión a VEGF. Un polipéptido quimérico de unión a VEGF como se describe aquí reduce preferiblemente la angiogénesis en uno o más de estos ensayos en al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o más, hasta e incluyendo 100% de inhibición.

Como alternativa, la inhibición de la angiogénesis se puede medir funcionalmente aguas abajo, como reducción o cese del crecimiento tumoral o del tamaño tumoral. Por ejemplo, si hay un crecimiento cero de la masa tumoral, o al menos una reducción del 5% en el tamaño de la masa tumoral, hay una inhibición de la angiogénesis mediante una composición o método como se describe aquí.

Una diana candidata es cualquier tumor sólido que requiera un suministro eficiente de sangre para mantener el crecimiento. Por ejemplo, los candidatos para los métodos de tratamiento descritos aquí incluyen carcinomas y sarcomas encontrados en el ano, vejiga, conducto biliar, hueso, cerebro, mama, cuello uterino, colon/recto, endometrio, esófago, ojo, vesícula biliar, cabeza y cuello, hígado, riñón, laringe, pulmón, mediastino (pecho), boca, ovarios, páncreas, pene, próstata, piel, intestino delgado, estómago, médula espinal, coxis, testículos, tiroide y útero. Los tipos de carcinomas incluyen papiloma/carcinoma, coriocarcinoma, tumor del seno endodérmico, teratoma, adenoma/adenocarcinoma, melanoma, fibroma, lipoma, leiomioma, rabdomioma, mesotelioma, angioma, osteoma, condroma, glioma, linfoma/leucemia, carcinoma de células escamosas, carcinoma microcítico, carcinomas no diferenciados de células grandes, carcinoma de células basales, y carcinoma no diferenciado senonasal. Los tipos de sarcomas incluyen sarcoma de tejidos blandos tal como sarcoma de la parte blanda alveolar, angiosarcoma, dermatofibrosarcoma, tumor desmoide, tumor de células redondas pequeñas dermoplásico, condrosarcoma extraesquelético, osteosarcoma extraesquelético, fibrosarcoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, linfosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, neurofibrosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial, y tumor de Askin, sarcoma Ewing (tumor neuroectodérmico primitivo), hemangioendotelioma maligno, schwannoma maligno, osteosarcoma, y condrosarcoma. La acumulación y crecimiento anormales de vasos sanguíneos en la piel u órganos internos en forma de hemangiomas también se pueden tratar según los métodos descritos aquí.

Las composiciones se pueden usar para prevenir el crecimiento deslumbrante de vasos sanguíneos asociados con

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células víricas hospedantes (vectores) que alojan la secuencia de ADN quimérica que codifica la proteína quimérica de unión a VEGF y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se usa aquí, la expresión “composición farmacéutica” se refiere al agente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable de sustancias químicas y compuestos usados habitualmente en la industria farmacéutica. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” excluye medio de cultivo tisular.

Para enfermedades o trastornos angiogénicos que son accesibles externamente sobre la piel, tales como hemangiomas dérmicos y lesiones de cáncer de piel (melanoma), se pueden aplicar preferiblemente de forma tópica virus de terapia génica, vectores de expresión o proteína quimérica de unión a VEGF al hemangioma o sitio de lesión cancerosa en una cantidad terapéuticamente eficaz en mezcla con vehículos farmacéuticos, en forma de composiciones farmacéuticas tópicas. El virus de terapia génica puede estar en forma de adenovirus, virus adenoasociado, o lentivirus. Tales composiciones incluyen disoluciones, suspensiones, lociones, geles, cremas, ungüentos, emulsiones, parches para la piel, etc. Todas estas formas de dosificación, junto con los métodos para su preparación, son bien conocidos en la técnica farmacéutica y cosmética. HARRY'S COSMETICOLOGY (Chemical Publishing, 7ª ed. 1982); REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co., 18ª ed. 1990). Típicamente, tales formulaciones tópicas contienen el ingrediente activo en un intervalo de concentración de 0,1 a 100 mg/ml, en mezcla con vehículos adecuados. Un vehículo adecuado no promoverá una respuesta inmune a los péptidos quiméricos descritos aquí. Para los virus de terapia génica, la dosificación oscila de 10(6) a 10(14) partículas por aplicación. Otros ingredientes deseables para uso en tales preparaciones incluyen conservantes, codisolventes, agentes que provocan viscosidad, portadores, etc. El propio portador, o un componente disuelto en el portador, puede tener propiedades paliativas o terapéuticas por sí mismo, incluyendo propiedades hidratantes, limpiadoras, o antiinflamatorias/contra el picor. Los potenciadores de la penetración pueden ser, por ejemplo, agentes tensioactivos; ciertos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulfóxido y otros sulfóxidos, dimetilacetamida y pirrolidona; ciertas amidas de aminas heterocíclicas, glicoles (por ejemplo propilenglicol); carbonato de propileno; ácido oleico; alquilaminas y derivados; diversos agentes tensioactivos catiónicos, aniónicos, no iónicos y anfóteros; y similares.

La administración tópica de una cantidad farmacológicamente eficaz puede utilizar sistemas de suministro transdérmicos bien conocidos en la técnica. Un ejemplo es un parche dérmico. Como alternativa, se puede usar el método de suministro mediante pistola génica biolística. La pistola génica es un dispositivo para inyectar células con información genética, diseñada originalmente para la transformación de plantas. La carga es una partícula elemental de un metal pesado revestido con ADN plasmídico. Esta técnica se denomina a menudo simplemente como biolística. Otro instrumento que usa tecnología biolística es el sistema de suministro de partículas PDS-1000/He. La proteína quimérica de unión a VEGF, el vector de expresión y/o el virus de terapia génica se pueden revestir sobre partículas de oro pequeñas, y estas partículas revestidas son “disparadas” en tejidos biológicos tales como hemangiomas y melanoma, a alta presión. Un ejemplo del método a base de la pistola génica se describe para la vacunación de ganado a base de ADN por Loehr B. I. et. al. J. Virol. 2000, 74:6077-86.

Las composiciones descritas aquí se pueden administrar directamente mediante inyección. Si los tumores sólidos y hemangiomas son accesibles mediante inyección, la proteína quimérica de unión a VEGF, el vector de expresión y/o el vector vírico se pueden administrar mediante inyección directamente en la masa tumoral como una formulación farmacéutica. La formulación preferida es también disolución salina estéril o disolución de Ringer lactada. La disolución de Ringer lactada es una disolución que es isotónica con la sangre, y está destinada para la administración intravenosa.

En el tratamiento y prevención de retinopatía diabética y degeneración macular húmeda, la proteína descrita aquí, que es mucho más pequeña que otra proteína de unión a VEGF en el mercado y en ensayos clínicos, se puede aplicar al ojo mediante inyección como una formulación farmacéutica. La inyección introduce directamente la proteína quimérica de unión a VEGF en el humor vítreo. Las composiciones se pueden formular como una disolución de gotas oculares para la aplicación directa en los ojos.

Además de la terapia tópica, las composiciones descritas aquí también se pueden administrar sistémicamente en una formulación farmacéutica. Las rutas sistémicas incluyen, pero no se limitan a, oral, parenteral, inhalación nasal, intratraqueal, intratecal, intracraneal, e intrarrectal. La formulación farmacéutica es preferiblemente una disolución salina estéril o disolución de Ringer lactada. Para aplicaciones terapéuticas, las preparaciones descritas aquí se administran a un mamífero, preferiblemente un ser humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, incluyendo aquellas que se pueden administrar a un ser humano intravenosamente como un bolo o mediante infusión continua a lo largo de un período de tiempo, mediante las rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarterial, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalación. Se describe la inyección intramuscular de vectores víricos de AAV que codifican una proteína quimérica de VEGF y/o sus formas variantes. Las composiciones descritas aquí también se administran de forma adecuada mediante las rutas intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos locales así como sistémicos. Se espera que la ruta intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo en el tratamiento de tumores ováricos. Para estos usos, se pueden requerir preferentemente preparaciones farmacéuticas convencionales adicionales tales como comprimidos, gránulos, polvos, cápsulas, y pulverizaciones. En tales formulaciones, también se pueden requerir aditivos convencionales adicionales, tales como agentes ligantes, agentes hidratantes, propelentes, lubricantes, y

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Además de en los ejemplos operativos, o donde se indique de otro modo, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usados aquí se deben entender como modificados en todos los casos por la expresión “alrededor de”. La expresión “alrededor de”, cuando se usa en relación con los porcentajes, puede significar ±1%.

Todas las patentes y otras publicaciones identificadas se proporcionan solamente por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. A este respecto, no se debería de considerar como una admisión que los inventores no están autorizados para anteceder tal descripción en virtud de una razón previa o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación en cuanto a los contenidos de estos documentos se basa en la información disponible a los solicitantes, y no constituye ninguna admisión en cuanto a la corrección de las fechas o contenidos de estos documentos.

EJEMPLO

Se ha mostrado que las proteínas que se unen a VEGF, en forma de mAb’s, dominios extracelulares del receptor de VEGF soluble, o constructos heterólogos derivados de subdominios de receptores de VEGF (denominados como VEGF-Traps), exhiben efectos antitumorales potentes en estudios preclínicos (1, 2) y clínicos (3). Los estudios hasta la fecha han utilizado en gran medida el suministro proteico sistémico directo de estas proteínas. Debido al requisito del suministro sostenido de agentes antiangiogénicos para mantener un efecto antitumoral, existe interés en investigar el uso de enfoques a base de terapia génica para suministrar proteínas que se unen a VEGF a fin de lograr el suministro sistémico sostenido de proteína. En un informe previo, (2) se observó que los adenovirus suministrados sistémicamente podrían segregar un nivel elevado de dominios extracelulares del receptor de VEGF soluble y controlar el crecimiento de varios xenoinjertos de tumores humanos diferentes in vivo. Este sistema a base de adenovirus es menos favorable para el uso clínico secundario con respecto a aspectos de la reducción, mediada inmunitariamente, en la expresión del transgén, y potencial para la toxicidad específica del órgano (por ejemplo, hígado) tras el suministro sistémico del virus. Debido a estas limitaciones, se exploró la estrategia de suministrar estas proteínas usando vectores más clínicamente aceptables suministrados vía inyección intramuscular.

Para este fin, se diseñó y expresó una proteína que se une a VEGF cargada de forma neutra VEGF-trap 3 (VT3), más apropiada para la capacidad de empaquetamiento más pequeña de virus adenoasociados, así como aquellas con propiedades de carga mejorada en comparación con la VEGF-Trap descrita por Holash et al. (1) Esta modificación implicó eliminar uno de dos dominios que se unen a VEGF de Ig básicos en las proteínas VEGF-Trap1 (VT1) parentales. Se encontró que esta trampa modificada retuvo una afinidad de unión similar a VEGF en comparación con VT1. La VEGF-Trap3 (VT3) modificada produjo niveles significativamente mayores de proteína sérica cuando se suministra vía un vector de AAV usando una técnica de suministro intramuscular directo. Las características únicas de esta Trampa la hacen particularmente adecuada para los enfoques de terapia génica para estrategias terapéuticas antiangiogénicas anti-VEGF.

Materiales y métodos.

Proteínas que se unen a VEGF

VEGF-Trap 1 (VT1) purificada se obtuvo como un regalo de Regeneron Pharmaceuticals. La quimera de Flt-1/Fc humana recombinante (R&D System 321-FL), la quimera de KDR/Fc humana recombinante (R&D System 357-KD) y Fc de IgG1 humana recombinante (R&D System 110-HG) se adquirieron de R&D Systems.

Manipulación de vectores de AAV que codifican VEGF-Trap1 y VEGF-Trap3

A fin de construir un vector de AAV que codifica VEGF-Trap 1 (VT1), se usó una PCR de fusión de oligos que codifican el transgén para crear un constructo de VEGF-Trap de longitud completa que codifica la secuencia señal de VEGF-receptor 1 (aminoácidos 1-26 de Número de Acceso Genbank: BC039007, SEQ. ID. No.: 1) fusionada directamente al segundo dominio de Ig (aminoácidos 129-231 de Número de Acceso Genbank: BC039007, SEQ. ID. No.: 1) fusionado directamente al tercer dominio de Ig de VEGF-Receptor 2 (aminoácidos 226 -327 de Número de Acceso Genbank: AF035121, SEQ. ID. No.: 9) fusionado directamente a la huIgG1 (aminoácidos 247-473 de Número de Acceso Genbank: BC092518), como se describe por Holash et al. (Holash et al., 2002).

Vegf-Trap 3 (VT3) se construyó de forma similar uniendo el segundo dominio de Ig de Flt-1 a Fc-huIgG1. El constructo final codifica la secuencia señal de VEGF-receptor 1 (aminoácidos 1-26 de Número de Acceso Genbank: BC039007, SEQ. ID. No.: 1), el segundo dominio de Ig (aminoácidos 129-231 de Número de Acceso Genbank: BC039007, SEQ. ID. No.: 1) fusionado a la huIgG1 (aminoácidos 247-473 de Número de Acceso Genbank: BC092518). Los constructos finales que codifican tanto a VT1 como a VT3 se secuenciaron en las hebras tanto sentido como antisentido para confirmar la secuencia y orientación correctas.

La producción de los vectores de AAV recombinantes que codifican VEGF-Trap1 y VEGF-Trap 3 se llevó a cabo mediante transfección triple como se describió previamente (4). De forma breve, los plásmidos del vector pAAV-VEGF-Trap se cotransfectaron con el plásmido auxiliar de AAV pLT-RC02 (Jeng-Shin Lee y Richard Mulligan, sin publicar) y el miniplásmido auxiliar de adenovirus pHGTI-Adeno1 (John Gray y Richard Mulligan, sin publicar) en células 293. 48 horas después de la transfección, las células se cosecharon y se lisaron. Después del tratamiento

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con benzonasa y de la eliminación del desecho celular mediante centrifugación a baja velocidad, las partículas de AAV recombinante se purificaron mediante gradiente de densidad de yodixanol. La fracción de yodixanol del 40% que contiene partículas de rAAV se recuperó, se dializó extensamente frente a PBS, y se tituló mediante hibridación de transferencia de punto usando como sonda el promotor de CMV.

pLT-RC02 codifica proteínas Rep híbridas a partir de serotipos 1 y 2 de AAV, y proteínas Cap a partir del serotipo 1. Cuando se usa en el sistema de producción de transfección triple, el plásmido pLT-RC02 empaqueta partículas de AAV en un nivel comparable con respecto al obtenido con el plásmido de expresión de Rep/Cap del serotipo 2 de AAV. Pero las partículas del vector resultantes transdujeron músculos esqueléticos a una eficiencia significativamente mayor que los vectores normales del serotipo 2 (Jeng-Shin Lee y Richard Mulligan, sin publicar), como se da a conocer previamente para los vectores del serotipo 1 de AAV.

Purificación de proteína de VEGF-Trap 3.

La producción estable de VEGF-Trap 1 y VEGF-Trap 3 en células 293T se logró mediante infección con lentivirus que codifican las proteínas VEGF-Trap respectivas. La producción estable de las VEGF-Traps se confirmó mediante ELISA. Subsiguientemente se reunió el medio acondicionado, Medio de Eagle Modificado de Dulbecco libre de suero (Gibco 11965-092), a partir de células infectadas, y se sometió a cromatografía de afinidad de Proteína A.

Se prepararon columnas de NProtein A Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences 17-5280-04) según las instrucciones del fabricante. A fin de asegurar la concentración iónica apropiada, el medio acondicionado libre de suero se suplementó con 3,3 M de NaCl antes de aplicarlo a la columna. Las muestras se cargaron toda la noche a 4ºC, después la columna se lavó con 5 volúmenes de lecho de 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl y 0,1% de Tween20 pH 8,0. Las proteínas VEGF-Trap se eluyeron con 1-3 volúmenes de lecho de 0,1 M de citrato pH 3, y se neutralizaron con 2 M de Tris pH 8,5. Los eluatos se dializaron frente a disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) (Gibco) en casetes de diálisis de 10.000 MWCO (Pierce 66380) a 4ºC, toda la noche. Finalmente, las muestras se concentraron mediante dispositivos de filtro de centrifugadora de unión ultrabaja Amicon (Millipore UFC901008), y la pureza se evaluó mediante SDS PAGE y tinción de Coomassie.

Caracterización de proteínas – glicosilación y análisis de transferencia Western

Muestras de proteína purificada se sometieron a SDS PAGE (12% gel, Life Gels, NH21-012) a 100V durante 45 minutos, y después el gel se transfirió a un sistema de electrotransferencia húmeda a una corriente constante de 35 mA durante 2 horas. Después de la transferencia, la membrana de nitrocelulosa soportada (Bio-Rad 162-0095) se bloqueó con 10% de leche desnatada seca en PBS-0,1% de Tween-20 a temperatura ambiente durante 1 hora. La membrana se sondó con anticuerpo primario anti-Flt-1 (R&D System AF321 o Imclone) y con anticuerpo secundario anti-IgG de cabra conjugado con HRP, o con anticuerpo primario conjugado con HRP frente a IgG-Fc humana (Sigma A0170) diluida en PBS-0,1% de Tween-20. Las transferencias se desarrollaron usando sustrato de HRP ECL-Plus (Amersham Biosciences RPN2132) y película de quimioluminiscencia Kodak Biomax (Kodak 178 8207).

A fin de eliminar todos los hidratos de carbono enlazados mediante N y O, las muestras de proteínas se desnaturalizaron a 100ºC durante 5 minutos, y después se incubaron con las enzimas PNGasa F, 2(3,6,8,9)neuraminidasa, O-glicosidasa, (1-4)-galactosidasa y -N-acetilglucosaminidasa (Sigma, E-DEGLY), toda la noche a 37ºC. El grado de glicosilación se evaluó mediante SDS-PAGE de las muestras de proteína desglicosiladas y no desglicosiladas. Tras la electroforesis, el gel se tiñó con Coomassie (Gradipore, Gradiflash SG010) durante 5 h a temperatura ambiente, después se destiñó con ácido acético al 6% a temperatura ambiente durante 20 horas.

Medida de la afinidad de unión

Las afinidades de unión de Vegf-Trap 3, VEGF-Trap 1 recombinante (un regalo de Regeneron pharmaceuticals), quimera de Flt-1/Fc humana recombinante (R&D System 321-FL), quimera de KDR/Fc humana recombinante (R&D System 357-KD) e IgG1 Fc humana recombinante (R&D System 110-HG) se midieron mediante ELISA (R&D System DVE00) como se describió previamente por Holash et al. (1).

Detección de VEGF-Trap sérica – ELISA de VEGF-Trap

Se revistieron placas Immulon-4 HBX con 25 ng/pocillo de Vegf165 humana (R&D System 293 VE) toda la noche a 4ºC. Las placas se bloquearon con 3% de leche desnatada seca en PBS-0,1% de Tween-20 a temperatura ambiente durante 1 hora.

Los patrones y las muestras de suero se diluyeron en disolución de PBS-10% de suero de ratón-0,1% de Tween-20, se aplicaron a la placa y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron cinco veces con PBS-0,1% de Tween-20. El anticuerpo de detección conjugado con HRP, diluido (1:5000), contra IgG-Fc humana (Sigma A0170) se añadió a los pocillos. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron con PBS-0,1% de Tween-20. La O.D. se leyó a 405 nm en 10 min. de adición del sustrato de HRP (KPL 50-66-06).

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Claims

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