ES2657625T3 - Procedimiento de producción de alérgeno hidrolizado - Google Patents
Procedimiento de producción de alérgeno hidrolizado Download PDFInfo
- Publication number
- ES2657625T3 ES2657625T3 ES07730314.7T ES07730314T ES2657625T3 ES 2657625 T3 ES2657625 T3 ES 2657625T3 ES 07730314 T ES07730314 T ES 07730314T ES 2657625 T3 ES2657625 T3 ES 2657625T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- allergens
- extract
- purified
- proteins
- allergen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 90
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 90
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 73
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 claims abstract description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 14
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 9
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 8
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 4
- 102000013090 Thioredoxin-Disulfide Reductase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010079911 Thioredoxin-disulfide reductase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 3
- 241000124001 Alcyonacea Species 0.000 claims description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 244000043261 Hevea brasiliensis Species 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 3
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 1,25-Dihydroxy-vitamin D3' Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CC(O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 claims description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 2
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 claims description 2
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 claims description 2
- 229940126157 adrenergic receptor agonist Drugs 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- NDAUXUAQIAJITI-UHFFFAOYSA-N albuterol Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(CO)=C1 NDAUXUAQIAJITI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 claims description 2
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 claims description 2
- 239000003601 chymase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 claims description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 claims description 2
- 229930013032 isoflavonoid Natural products 0.000 claims description 2
- 150000003817 isoflavonoid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000012891 isoflavonoids Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 2
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003232 mucoadhesive effect Effects 0.000 claims description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 claims description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 claims description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960002052 salbutamol Drugs 0.000 claims description 2
- 150000001629 stilbenes Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 claims description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 claims description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 2
- 230000024664 tolerance induction Effects 0.000 claims 2
- TWUSDDMONZULSC-QMTHXVAHSA-N (1s,2r)-2-(tert-butylamino)-1-(2,5-dimethoxyphenyl)propan-1-ol Chemical compound COC1=CC=C(OC)C([C@H](O)[C@@H](C)NC(C)(C)C)=C1 TWUSDDMONZULSC-QMTHXVAHSA-N 0.000 claims 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 claims 1
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims 1
- 239000013569 fungal allergen Substances 0.000 claims 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 claims 1
- 239000002462 tachykinin receptor antagonist Substances 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 3
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 42
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 6
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 6
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 101000984570 Enterobacteria phage T4 Baseplate wedge protein gp53 Proteins 0.000 description 3
- 101000997743 Escherichia phage Mu Serine recombinase gin Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101000968532 Dictyocaulus viviparus DVA-1 polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- 241000238711 Pyroglyphidae Species 0.000 description 1
- QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N Resveratrol Natural products OC1=CC=CC(C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000674 adrenergic antagonist Substances 0.000 description 1
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940046533 house dust mites Drugs 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 235000021283 resveratrol Nutrition 0.000 description 1
- 229940016667 resveratrol Drugs 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013017 sartobind Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
- A61K39/36—Allergens from pollen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Un procedimiento de producción de un hidrolizado de alérgeno purificado que comprende los pasos de a) extraer una fuente natural de alergenos que comprende proteínas alergénicas para formar un extracto, b) purificación de dicho extracto para eliminar componentes no proteicos para formar un extracto purificado, c) desnaturalizar dicho extracto purificado para formar un extracto desnaturalizado purificado, en el que la desnaturalización se realiza con mezclas de agentes caotrópicos y agentes reductores, dicho extracto desnaturalizado purificado comprende proteínas, en el que ninguna proteína individual es el 60 % o más (p/p) de todas las proteínas medidas por SDS-PAGE seguido de densitometría y todas las proteínas representan al menos 60 % (p/p) del peso seco del extracto desnaturalizado purificado medido por un ensayo de BCA, d) hidrolizar dicho extracto desnaturalizado purificado con una enzima para formar un hidrolizado de alérgeno, e) purificar dicho hidrolizado de alérgeno para eliminar péptidos con un peso molecular superior a 10.000 Da e inferior a 1.000 Da con el fin de obtener un hidrolizado purificado en el que el 70 %, más preferentemente el 80 % de los péptidos están entre 10.000 Da y 1.000 Da.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Procedimiento de producción de alérgeno hidrolizado
La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la producción de un hidrolizado de alérgeno purificado y el hidrolizado de alérgeno obtenible mediante el nuevo procedimiento.
Los alergenos comunes son pólenes, ácaros del polvo doméstico, mohos, fármacos, alimentos y pelo de animales y caspa.
Las enfermedades alérgicas más comunes son la rinitis, el asma y la dermatitis atópica. El asma alérgica es un trastorno inflamatorio crónico. El tratamiento sintomático de los trastornos alérgicos se efectúa mediante el uso de antihistamínicos, antagonistas p y corticosteroides.
Además, la denominada inmunoterapia "específica" se basa en una hiposensibilización. Típicamente, se administra a los pacientes una inyección subcutánea de alergenos ofensivos específicos. El tratamiento comienza con pequeñas dosis de alergenos y las dosis aumentan. El tratamiento generalmente se mantiene durante varios años. Este tipo de tratamiento adolece del cumplimiento puro del paciente y ha sido cuestionado por razones de seguridad porque un paciente puede sufrir reacciones anafilácticas graves.
Además de los procedimientos que comprenden inyecciones subcutáneas repetidas, también hay procedimientos de hiposensibilización oral.
El documento US 4.822.611 divulga un procedimiento para tratar alergias que comprende el tratamiento oral con alergenos. Describe el uso de extractos alergénicos "a granel" disponibles comercialmente que muestran la variación de lote a lote y las diferencias en los extractos de diferentes fabricantes. La preparación de estos extractos no se describe.
El documento GB 1 247 614 divulga un procedimiento para extraer un alergeno. El objetivo de este procedimiento es tener un extracto alergénico más completo y eficaz al incluir todos los componentes extraíbles del alergeno.
El documento US 5.770.698 divulga un proceso para purificar extractos de proteínas alergénicamente activas. El espectro de la figura 2 no presenta un pico a 280nm. Esto implica que el extracto contiene una cantidad significativa de impurezas no proteicas. El documento WO 99/22762 divulga un procedimiento similar, por lo tanto, el producto también comprende grandes cantidades de impurezas no proteicas.
Por otro lado, ha habido una tendencia a desarrollar preparaciones altamente específicas basadas en epítopos individuales. Por ejemplo, el documento WO 00/58349 divulga un péptido aislado y purificado que comprende una leucina situada dos enlaces peptídicos más allá de un par de tirosina/arginina. Estos péptidos pueden usarse para preparar una composición farmacéutica para llevar a cabo el tratamiento o la profilaxis, en este caso especialmente dirigida a la alergia canina en perros.
Por un lado, los procedimientos se usan para purificar una molécula alergénica individual específicamente identificada. Por otro lado, las personas están tratando de producir extractos alergénicos lo más completos posible.
De acuerdo con la primera alternativa, siempre es posible que la preparación alergénica carezca de los epítopos relevantes para inducir tolerancia en un paciente determinado. La segunda alternativa tiene el inconveniente de la variabilidad de lote a lote y de la presencia de compuestos capaces de desencadenar la respuesta inmune como moléculas de ADN, carbohidratos, lípidos de complejos de los mismos.
Un objeto de la presente invención es superar al menos algunos de los inconvenientes de la técnica anterior, especialmente para proporcionar antígenos de alergenos naturales con una capacidad reducida significativa para desencadenar una reacción de alergenicidad en comparación con el extracto de alérgeno sin purificar, pero capaz de estimular también células T.
El problema se resuelve mediante la provisión de procedimientos para preparar un extracto alergénico que comprende la mayoría de las partes que contienen proteína de un extracto de alergeno, pero con un contenido reducido, preferiblemente muy bajo, de componentes no proteicos tales como ácidos nucleicos, lípidos, azúcares y similares.
Los extractos preparados de acuerdo con la invención son superiores a los extractos de la técnica anterior, especialmente muestran una composición reproducible de proteínas, pero no se purifican hasta un único epítopo.
Un procedimiento para la producción de un hidrolizado de alérgeno purificado que comprende las etapas de
a) extraer una fuente natural de alergenos que comprende proteínas alergénicas para formar un extracto,
b) purificación de dicho extracto para eliminar componentes no proteicos para formar un extracto purificado,
5
10
15
20
25
30
35
40
c) desnaturalizar dicho extracto purificado para formar un extracto desnaturalizado purificado, en el que la desnaturalización se realiza con mezclas de agentes caotrópicos y agentes reductores,
dicho extracto desnaturalizado purificado que comprende proteínas, en el que ninguna proteína individual es el 60 % o más (p/p) de todas las proteínas medidas por SDS-PAGE seguido de densitometría y todas las proteínas representan al menos 60 % (p/p) del peso seco del extracto desnaturalizado purificado medido por un ensayo de BCA,
d) hidrolizar dicho extracto desnaturalizado purificado con una enzima para formar un hidrolizado de alérgeno,
e) purificar dicho hidrolizado de alérgeno para eliminar péptidos con un peso molecular superior a 10.000 Da e inferior a 1.000 Da con el fin de obtener un hidrolizado purificado en el que el 70 %, más preferentemente el 80 % de los péptidos están entre 10.000 Da y 1.000 Da.
Las etapas a) a c) se refieren a la parte I del procedimiento
En contraste con los procedimientos de la técnica anterior, el procedimiento de la presente invención produce extractos de alergenos que comprenden predominantemente proteínas sin purificación del extracto hasta un único péptido o proteína.
A diferencia de los productos de la técnica anterior, los productos de la invención tienen las siguientes ventajas:
- Las sustancias inmunogénicas distintas de las proteínas se eliminan sustancialmente
- El extracto de alergeno natural es capaz de estimular células T con la capacidad reducida de desencadenar una reacción alérgica inmediata (activación de basófilos, desgranulación de mastocitos)
Como materiales de partida se pueden usar diferentes alergenos naturales. Los materiales de partida naturales típicos son leche, veneno, huevo, hierba, pasto, árbol, arbusto, flor, vegetal, grano, hongos, fruta, baya, nuez, semilla, judía, pescado, marisco, marisco, carne, especias, insecto, ácaro, moho, animal, garrapata, gusano, coral blando, caspa animal, nematodo, Hevea brasiliensis y mezclas de los mismos.
Después de la extracción del material, el extracto se purifica para eliminar componentes no proteicos tales como azúcares, lípidos, ácidos nucleicos y similares. Típicamente, varias proteínas diferentes están presentes en la fracción proteica del extracto purificado.
De acuerdo con la técnica anterior, una proteína se purifica y las otras proteínas restantes son "impurezas".
En contraste con esto, el objetivo de la presente invención es purificar las proteínas juntas. Las cantidades relativas de las proteínas en el extracto purificado se pueden medir fácilmente usando procedimientos como SDS-PAGE seguido de densitometría.
Para el 60 % del peso total de las proteínas, es necesario combinar al menos las dos proteínas más dominantes, es decir, ninguna proteína individual es 60 % (p/p) o más de todas las proteínas. Más preferiblemente, el 60 % de todas las proteínas están formadas por al menos las 3 proteínas dominantes, preferiblemente por al menos las 4 proteínas dominantes y más preferiblemente por al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 proteínas.
Por ejemplo, existen las siguientes proteínas:
- Proteína 1:
- 27 %
- Proteína 2:
- 13 %
- Proteína 3:
- 34 %
- Proteína 4:
- 19 %
- Proteína 5:
- 17 %
Las proteínas más dominantes que forman juntas al menos 60 % (= 60 % o más) son proteínas 3 + 1 (34 + 27 = 61 %).
Además, el contenido de proteína total del extracto purificado es al menos 60 % en peso, preferiblemente el contenido es al menos 70 % en peso o 80 % en peso, más preferiblemente 90 % en peso del extracto purificado.
La extracción se realiza preferiblemente con soluciones acuosas. Las sales adecuadas son sales tales como, pero
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
sin limitación, carbonato, bicarbonato, fosfato, acetato, TRIS y HEPES.
También, en contraste con muchos otros procedimientos de extracción, se prefiere que la cantidad de medio de extracción sea comparativamente grande, es decir, al menos 20 veces el peso de la fuente natural de alergenos, preferiblemente 100 veces el peso o más.
La purificación del extracto puede realizarse por uno o más de los siguientes procedimientos:
- etapas de cromatografía de intercambio iónico (incluida la cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía de intercambio catiónico),
- la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño (también llamado filtración en gel),
- etapas de precipitación,
- etapas de cromatografía de interacción hidrófoba,
- cromatografías de pseudoafinidad y afinidad y/o
- diafiltración.
En una realización preferida, se usa la cromatografía de intercambio iónico en la que, en el caso de un intercambiador de cationes, la solución de carga tiene un pH entre el pKa de la función ácida del intercambiador de cationes y el pKa de la proteína que tiene el pKa más bajo de las proteínas en el extracto. En el caso de un intercambiador de aniones, el pH está entre el pKa de la función básica del intercambiador de aniones y el pKa de la proteína que tiene el pKa más alto de las proteínas que constituyen el extracto.
Mediante este procedimiento, todas las proteínas se unen al intercambiador de iones mientras que las impurezas neutras y las impurezas con la misma carga que la resina de intercambio iónico serán eliminadas.
En una realización preferida, al menos una etapa de purificación se realiza con una solución que comprende uno o más de un tensoactivo y/o un agente desnaturalizante. El agente tensoactivo puede ser no iónico, aniónico, catiónico o anfótero. Los agentes desnaturalizantes adecuados son agentes caotrópicos, agentes reductores y mezclas de los mismos. Los agentes de desnaturalización adecuados son, por ejemplo, urea, cloruro de guanidinio, etilenglicol, isopropanol. Una concentración adecuada de urea es 3 M o más, preferiblemente 4 M o más. Una concentración adecuada de guanidinio es preferiblemente 2 M, preferiblemente 3 M o más. Una concentración adecuada de etilenglicol y/o isopropanol es del 5 % o más, más preferiblemente del 10 % o más, hasta 20 % en peso.
En algunos casos, la producción del extracto purificado según el procedimiento parte I de la descripción es suficiente. Los extractos de este tipo pueden usarse para producir un diagnóstico ex vivo/in vivo e in vitro, tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades alérgicas. Un aspecto adicional de la presente divulgación es un procedimiento para la producción de un hidrolizado de alérgeno, ya sea a partir de extractos según el procedimiento parte I o de cualquier otra fuente. Si el extracto proviene de cualquier otra fuente de alergenos purificados que el procedimiento parte I, se requiere una etapa preliminar de desnaturalización para mejorar la digestibilidad.
Las etapas d) y e) se denominan procedimiento parte II.
Las ventajas del producto obtenido de este modo son que los péptidos son el resultado de la digestión de proteínas desnaturalizadas. Debido a una calibración de tamaño específico, tienen una potencia reducida para inducir una reacción alérgica inmediata y también una reacción proinflamatoria.
La desnaturalización, si es necesario, se realiza preferiblemente en presencia de agentes caotrópicos, agentes reductores o mezclas de los mismos. Los agentes caotrópicos adecuados son, por ejemplo, urea y cloruro de guanidinio. Los agentes reductores típicos son, por ejemplo, ditiotreitol, p-mercaptoetanol, tio-glicerol y mezclas de los mismos.
La etapa de hidrolización se realiza típicamente con una enzima. Las enzimas adecuadas son, por ejemplo, pepsina, tripsina, quimotripsina. Esta etapa de hidrolización puede realizarse en presencia de un agente caotrópico, preferiblemente también urea o cloruro de guanidinio. Durante la hidrolización, la concentración de urea y cloruro de guanidinio debe estar por debajo de 4 M, preferiblemente por debajo de 3 M.
En la etapa e) del procedimiento, se eliminan péptidos con un peso molecular mayor que 10.000 Da o menor que
1.000 Da.
Los péptidos del hidrolizado purificado, por lo tanto, comprenden péptidos con pesos moleculares entre 1.000 y
10.000 Da. Los procedimientos adecuados para eliminar péptidos grandes o pequeños son la ultrafiltración y la cromatografía de exclusión por tamaño. De nuevo, esta cromatografía de exclusión por tamaño puede realizarse en presencia de agentes caotrópicos, por ejemplo, urea, cloruro de guanidinio, etilenglicol, isopropanol y mezclas de los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
mismos.
Una descripción adicional es un extracto de alérgeno que se puede obtener mediante la parte I del procedimiento. Típicamente también en este extracto las proteínas más dominantes en peso, que forman juntas al menos 60 % en peso de todas las proteínas, son al menos 2 proteínas, preferiblemente al menos 3 o 4 proteínas o más preferible al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 proteínas. La pureza se observa por una densidad óptica a 260nm: relación de densidad óptica a 280 nm de <1, preferiblemente <0,9, más preferiblemente entre 0,75 y 0,9.
El hidrolizado de alérgeno se puede usar para
- diagnóstico in vivo de enfermedades alérgicas: pruebas de punción, pruebas con inyecciones intracutáneas, conjuntivales, de aspiración e inhalación.
- diagnóstico ex vivo e in vitro de enfermedades alérgicas: kits de ELISA o estándares que se utilizan en las pruebas
- Tratamientos profilácticos y terapéuticos de enfermedades alérgicas: vacuna para tratamientos de desensibilización / hiposensibilización y modulación de la respuesta inmune con/sin combinación de adyuvantes.
Una realización adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el extracto de alérgeno de la presente invención en forma hidrolizada. Adicionalmente, la composición farmacéutica puede comprender una o más de las siguientes sustancias: trifosfatos de nucleósido, difosfatos de nucleósido, monofosfatos de nucleósido, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptídicos, nucleósidos o análogos de los mismos, citoquinas inmunosupresoras, compuestos que inducen la expresión de inmunoproteasomas, 1,25-dihidroxivitamina D3 o análogos de los mismos, lipopolisacáridos, endotoxinas, proteínas de choque térmico, tiorredoxina con NADPH o NADP-tiorredoxina reductasa, ditiotreitol, agonistas del receptor adrenérgico tales como salbutamol, antagonistas del receptor adrenérgico tales como butoxamina, compuestos que regulan la expresión de la molécula de adhesión ICAM-1, N-acetil-L-cisteína, y-L-glutamil-L-cisteinil-glicina (L-glutatión reducido), alfa-2-macroglobulinas, inductores de la expresión del gen Foxp3, flavonoides, isoflavonoides, pterocarpanoides, estilbenos como resveratrol, antagonistas del receptor de taquiquinina, inhibidores de la quimasa, adyuvante de vacuna tal como CpG o MPL o adyuvante tolerogénico tal como zimosano, beta-1,3-glucano, inductor de células T reguladoras, un agente mucoadhesivo para unir la partícula al revestimiento de la mucosa intestinal, tal como lectina vegetal, zinc, sales de zinc, polisacáridos, vitaminas y lisados bacterianos.
Con base en la fuente de alergenos naturales en la composición, puede comprender alergenos seleccionados entre alergenos de polen, alergenos de leche, alergenos de veneno, alergenos de huevos, alergenos de malezas, alergenos de pastos, alergenos de árboles, alergenos de arbustos, alergenos de flores, alergenos vegetales, alergenos de granos, alergenos de hongos, alergenos de frutas, alergenos de bayas, alergenos de nueces, alergenos de semillas, alergenos de judías, alergenos de pescado, alergenos de mariscos, alergenos de marisco, alergenos de carne, alergenos de especias, alergenos de insectos, alergenos de ácaros, alergenos de moho, alergenos de animales, alergenos de garrapatas, alergenos de gusanos, alergenos de corales blandos, alergenos de caspa de animales, alergenos de nematodos, alergenos de Hevea brasiliensis.
En una realización preferida, la composición farmacéutica se prepara para administración oral, para administración sublingual de fármacos, para administración entérica de fármacos.
Figura 1: Inmunorreactividad por transferencia de Western de IgG. Carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: extracto de proteína sin purificar, carril 3: extracto desnaturalizado de alérgeno purificado. Membrana bloqueada por BSA al 5 % y leche al 3 %. Suero del paciente diluido hasta 1/250. La unión de IgG se detectó por HRP anti-IgG humana de cabra diluida a 1/2.500 y revelada por sustrato de TMB. Alérgeno 1: ± 61-54 kDa, Alérgeno 2: ± 36-31 kDa.
Figura 2: Inmunorreactividad por transferencia de Western de IgE. Carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: extracto de proteína sin purificar, carril 3: proteínas purificadas. Membrana bloqueada por BSA al 5 % y leche al 3 %. Suero del paciente diluido hasta 1/5. La unión de IgE detectada por HRP anti-IgE humana de cabra diluida hasta 1/
10.000 y revelada por sustrato de TMB. Alérgeno 1: ± 61-54 kDa, Alérgeno 2: ± 36-31 kDa.
Figura 3: Pico de exclusión del perfil de elución SEC G25. La relación del volumen de la columna / volumen de muestra fue de 12. La resina se equilibró con Tris.HCl 25 mM, urea 1,5 M, pH 8,0 a una caudal de 9 ml/min. La elución fue seguida por la absorbancia a 280 nm.
Figura 4: Perfil de proteína mediante SDS-PAGE. 4 - 12 % de gel Bis-Tris. Carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: extracto desnaturalizado de alergeno purificado. Tinción realizada con Coomassie R-250.
Figura 5: Perfiles de proteína y de péptido por SDS-PAGE. 4 - 12 % de gel Bis-Tris. Carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: extracto desnaturalizado de alergeno purificado (13 pg), carril 3: hidrolizado (13 pg). Tinción realizada con azul brillante de Coomassie R-250.
Figura 6: Perfil de elución G50 SEC. La columna se equilibró con urea 2 M, NaCl 100 mM, pH 3,0. Caudal 15 ml /
5
10
15
20
25
30
35
40
45
min. La relación del volumen de la columna / volumen de muestra fue de 10. La elución fue seguida por la absorbancia a 280 nm.
Figura 7: Curva de calibración para análisis por HPLC. Se inyectaron 10 pl de los siguientes estándares (1 mg / ml) en la columna BioSep-SEC S2000: 1. Albúmina de suero bovino (66 kDa), 2. p-Lactoglobulina (18,5 kDa), 3. Citocromo C (12 kDa), 4. Glucagón (3.5 kDa), 5. Péptido sintético de 1 kDa.
Figura 8: Perfil de HPLC de exclusión por tamaño. Columna: BioSep-SEC S2000 (PHENOMENEX). Regulador de elución: Na2HPO4 50 mM - SDS al 0,5 % (p/v) pH 6,8. Caudal 1 ml/min. Detección a 214 nm. Se inyectaron 10 pl de las muestras. El área bajo la curva, entre los límites de 10 kDa y 1 kDa, se usó para calcular el porcentaje de los péptidos de interés.
Figura 9: Propiedades de alergenicidad de los productos derivados del polen. Se incubaron muestras de sangre de voluntarios alérgicos al polen con concentraciones crecientes (0, 1, 10, 100 y 1000 ng/ml) de extracto sin procesar de polen, proteínas purificadas de polen y péptidos purificados de polen. La expresión de la proteína gp53 se midió mediante citometría de flujo con regulación periódica en leucocitos positivos para IgE. Los resultados se expresan como % de células positivas para gp53 en células activadas (media ± desviación de 2 determinaciones).
Figura 10: Estimulación de la proliferación de PBMC humana por proteínas de polen y péptidos de polen. Las PBMC humanas purificadas de voluntarios alérgicos al polen se incubaron 5 días a 37°C en presencia de concentraciones crecientes (10, 30 y 90 pg/ml) de proteínas de polen o péptidos de polen. Se añadió [3H]-timidina al cultivo celular durante 16 horas y se midió la incorporación de [3H]-timidina con un contador beta usando el principio de centelleo líquido. Los resultados se expresan como la media de 5 determinaciones. El procedimiento de la presente invención se ejemplifica adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Extracción
Se añadió polen al 1 % (p/v) (Lolium perenne de ALLERGON) a bicarbonato de sodio (12,5 mM) y se incubó durante 2 h bajo agitación. La solución se clarificó luego y se filtró añadiendo Celite (ACROS) al 2 % (p/v) y pasando a través de un filtro de 0,2 pm. Esta muestra constituye el extracto sin purificar.
La presencia de alergenos en el extracto se analizó por transferencia de Western usando sueros de pacientes alérgicos al polen. Los epítopos de IgG e IgE se visualizan con anticuerpos anti-IgG o IgE humanos.
Como se muestra en la figura 1 y 2, hay dos alergenos principales en el extracto.
Dicho extracto sin purificar se acidificó a pH 3,0 y se añadió Tween 20 (0,1 %, v/v). Esta muestra constituye el extracto acidificado.
Ejemplo 2: Purificación de proteínas alergénicas El extracto de alérgeno se purificó por:
- Cromatografía de intercambio de cationes
Se equilibró una membrana Sartobind S' (SARTORIUS) con un volumen de lecho 28x (Bv) de bicarbonato de sodio
12,5 mM, citrato 30 mM, pH 3,0, Tween 20 0,1 % (v/v). Dicho extracto acidificado se cargó en la membrana equilibrada. La columna se lavó primero con 35x Bv de bicarbonato sódico 12,5 mM, citrato 30 mM, pH 3,0, Tween 20 al 0,1 % (v/v) y luego se lavó con 42x Bv de bicarbonato sódico 12,5 mM, citrato 30 mM, pH 3,0. Las proteínas se eluyeron con carbonato 0,1 M, cloruro de sodio 0,5 M, pH 9,15. La presencia de proteínas se siguió por la OD a 280 nm. Las fracciones de interés se combinaron.
- Precipitación con sulfato de amonio Esta etapa se realizó a 0-4°C.
Se añadió una cantidad de sulfato de amonio para alcanzar el 90 % de saturación al producto bajo agitación. La agitación se detuvo después de la disolución completa de la sal. La suspensión se incubó durante la noche y se centrifugó 2 veces durante 15 minutos a 10.000 g. El sobrenadante se descartó cuidadosamente cada vez.
- Desnaturalización
Los sedimentos se resuspendieron a razón de 9 mg/ml en urea 6 M, DTT 10 mM, Tris.HCl 0,1 M, pH 8,0 y se incubaron a 37°C durante 1 h.
- Cromatografía de exclusión por tamaño en resina G25 (Sefadex fino de AMERSHAM)
La muestra desnaturalizada se cargó en la columna y las proteínas se eluyeron con Tris.HCl 25 mM, urea 1,5 M, pH
5
10
15
20
25
30
35
40
8,0.
La presencia de proteínas fue seguida por la medición de OD a 280 nm. Las fracciones de interés se combinaron para constituir el extracto de alérgeno desnaturalizado purificado.
El extracto de alergeno purificado se analizó adicionalmente. El contenido de proteína (Ensayo de BCA) y el peso seco se determinaron para evaluar la pureza de la proteína. La eficacia de purificación también fue seguida por la eliminación de carbohidratos (prueba de Orcinol) y por la disminución de la relación OD260 / OD280.
Tabla 1: Eliminación de componentes no proteicos para formar un extracto purificado
- Relación proteína/peso seco Relación OD260/OD280 Relación carbohidratos/ proteínas
- Extracto crudo
- 16 % 1,3 400 %
- Extracto Purificado
- 85 % 0,75 17 %
Como se muestra en la tabla 1, el proceso de purificación permite
- El aumento del porcentaje de proteínas en el extracto de ~ 15 % a 80 %
- La relación OD260 / OD280 tiende a 0,5 caracterizando una proteína pura
- Una eliminación significativa de carbohidratos (el contenido residual podría representar el residuo de carbohidrato de las proteínas).
La Figura 4 ilustra un perfil típico de SDS-PAGE obtenido para el extracto de alérgeno desnaturalizado purificado. Como se puede ver, 6 proteínas representan al menos 60 % del peso total de las proteínas en el extracto purificado.
Ejemplo 3: Hidrólisis de extracto de alérgeno desnaturalizado
El extracto se hidrolizó usando el siguiente protocolo:
Dicho extracto de alérgeno purificado se acidificó a pH 2,0. La digestión se realizó a 2,5 mg/ml de proteínas de polen y 1 Eu. Ph. U de pepsina (MERCK) para 337 mg de proteínas, a 37°C, durante 2 h.
La Figura 5 muestra una comparación entre el extracto purificado (carril 2) y el extracto hidrolizado (carril 3). Como puede verse, las proteínas de alto peso molecular correspondientes a proteínas desnaturalizadas no digeridas han desaparecido después de la incubación con pepsina.
Ejemplo 4: Purificación
Para eliminar los péptidos con un PM > 10.000 Da y MW < 1.000 Da, el hidrolizado se purificó mediante
- Cromatografía de exclusión por tamaño en resina G50 (Sefadex fino de AMERSHAM). Se añadieron al hidrolizado
16.5 % (v/v) de isopropanol y 0,1 M de NaCl. Esta muestra se cargó inmediatamente en una columna G50. Los péptidos se eluyeron y las fracciones que contenían los péptidos (PM < 10 kDa) se agruparon como se muestra en la figura 6.
- Diafiltración sobre membrana 1kda (casete de ultrafiltración Omega PES de PALL). Los péptidos se concentraron 10 veces, se sometieron a diafiltración contra 10 volúmenes de Tris.HCl 50 mM, pH 7,4 y finalmente se concentraron
2.5 veces. Esta muestra constituye el hidrolizado de alérgeno purificado.
La eficacia de la purificación se controló mediante HPLC de exclusión por tamaño. Se equilibró una columna BioSep- SEC S2000 (PHENOMENEX) con Na2HPO4 50 mM - SDS al 0,5 % (p/v) pH 6,8 con una caudal de 1 ml/min. Los péptidos se detectaron a 214 nm.
Los límites de 10 kDa y 1 kDa se calcularon a partir de una curva de calibración como se ejemplifica en la figura 7.
Como se muestra en la figura 8, los péptidos con un peso molecular entre 1.000 Da y 10.000 Da representan aproximadamente el 75 % de todos los péptidos en el hidrolizado purificado.
Ejemplo 5: Disminución de la alergenicidad
Las propiedades de alergenicidad del extracto sin purificar de polen (según el ejemplo 1), las proteínas de polen purificadas (según el ejemplo 2) y los péptidos de polen purificados (según el ejemplo 4) se evaluaron midiendo su capacidad para inducir la desgranulación de basófilos.
El ensayo se realizó in vitro en muestras de sangre humana fresca de voluntarios alérgicos al polen incubadas con concentraciones crecientes de extracto sin purificar de polen, proteínas purificadas y péptidos purificados. La desgranulación de basófilos se evaluó midiendo, mediante el procedimiento de citometría de flujo, la expresión del marcador de proteína gp53 en la membrana celular de células activadas (es decir, células positivas para IgE). Esta 5 proteína normalmente está presente dentro de la membrana de los gránulos en las células en reposo y aparece en la superficie de la célula tras la activación celular (debido a la fusión de la membrana de gránulos con la membrana citoplasmática). Por lo tanto, se vuelve detectable por anticuerpos específicos anti-gp53 marcados. Como se muestra en la figura 9, los péptidos purificados son aproximadamente 30 veces menos alergénicos que las proteínas purificadas y 100 veces menos alergénicos que el extracto sin purificar de polen.
10 Ejemplo 6: Inmunogenicidad de las proteínas de polen y péptidos de polen
La inmunogenicidad de las proteínas y péptidos alergénicos se estudió midiendo su capacidad para estimular la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana.
Se cultivaron PBMC purificadas a partir de muestras de sangre de voluntarios "alérgicos al polen" mediante centrifugación en gradiente de densidad durante 5 días en placas de 96 pozos en presencia de concentraciones 15 crecientes de proteínas de polen y péptidos de polen. El día 5, se añadió [3H]-timidina al cultivo celular y las placas se incubaron adicionalmente a 37°C durante 16 horas. La incorporación de [3H]-timidina se midió con un contador beta usando el principio de centelleo líquido.
Las proteínas de polen (de acuerdo con el ejemplo 2) y los péptidos de polen (según el ejemplo 4) estimulan la proliferación de PBMC humanas de una manera dependiente de la concentración de la dosis. La proliferación 20 inducida por los péptidos alergénicos es ligeramente menor que la observada en respuesta a las proteínas. Estos resultados muestran que el proceso de producción de péptidos conserva la mayoría de los epítopos del alérgeno implicado en la activación de las células T.
Claims (13)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un procedimiento de producción de un hidrolizado de alérgeno purificado que comprende los pasos dea) extraer una fuente natural de alergenos que comprende proteínas alergénicas para formar un extracto,b) purificación de dicho extracto para eliminar componentes no proteicos para formar un extracto purificado,c) desnaturalizar dicho extracto purificado para formar un extracto desnaturalizado purificado, en el que la desnaturalización se realiza con mezclas de agentes caotrópicos y agentes reductores,dicho extracto desnaturalizado purificado comprende proteínas, en el que ninguna proteína individual es el 60 % o más (p/p) de todas las proteínas medidas por SDS-PAGE seguido de densitometría y todas las proteínas representan al menos 60 % (p/p) del peso seco del extracto desnaturalizado purificado medido por un ensayo de BCA,d) hidrolizar dicho extracto desnaturalizado purificado con una enzima para formar un hidrolizado de alérgeno,e) purificar dicho hidrolizado de alérgeno para eliminar péptidos con un peso molecular superior a 10.000 Da e inferior a 1.000 Da con el fin de obtener un hidrolizado purificado en el que el 70 %, más preferentemente el 80 % de los péptidos están entre 10.000 Da y 1.000 Da.
- 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la extracción se realiza en una solución que no contiene sal o una sal seleccionada de carbonato, bicarbonato, fosfato, acetato, TRIS y HEPES y/o se realiza la extracción con un medio de extracción en el que el peso del medio de extracción es al menos 20 veces, preferiblemente 100 veces el peso de la fuente natural de alergenos.
- 3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en el que la purificación comprende una o más de una etapa de cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel o cromatografía de exclusión por tamaño, una etapa de precipitación, una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba, una etapa de cromatografía de pseudo afinidad o afinidad o una etapa de diafiltración y/o en el que al menos una etapa de purificación se realiza con una solución que comprende un agente tensoactivo y/o desnaturalizante.
- 4. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que la desnaturalización se realiza con mezclas de agentes caotrópicos y reductores seleccionados del grupo de urea, cloruro de guanidinio, ditiotreitol, tioglicerol, p- mercaptoetanol y mezclas de los mismos, preferiblemente en el que la concentración de urea es mayor a 4 M, preferiblemente mayor a 5 M y/o la concentración de cloruro de guanidinio está por encima de 3 M, preferiblemente por encima de 4 M.
- 5. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la hidrólisis se realiza con una enzima, preferiblemente pepsina, tripsina o quimotripsina y/o en el que la hidrólisis se realiza en presencia de un agente caotrópico, preferiblemente seleccionado entre urea y cloruro de guanidinio.
- 6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la eliminación de los péptidos se realiza mediante cromatografía de exclusión por tamaño y/o ultrafiltración, preferiblemente en el que la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño se realiza en presencia de un agente caotrópico, preferiblemente seleccionado entre urea, cloruro de guanidinio, etilenglicol, isopropanol y mezclas de los mismos.
- 7. Un hidrolizado de alérgeno purificado que se puede obtener por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
- 8. Uso del hidrolizado de alérgeno de la reivindicación 7 para la preparación de una composición farmacéutica para inducir tolerancia, en el que la inducción de tolerancia se usa para curar o prevenir reacciones alérgicas.
- 9. Uso del hidrolizado de alérgeno de la reivindicación 7 para la preparación de una composición alimenticia para inducir tolerancia, en el que la inducción de tolerancia se usa para prevenir reacciones alérgicas.
- 10. Una composición farmacéutica que comprende un hidrolizado de alérgeno de la reivindicación 7.
- 11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 que comprende adicionalmente al menos una sustancia seleccionada del grupo de trifosfatos de nucleósido, difosfatos de nucleósido, monofosfatos de nucleósido, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptídicos, nucleósidos o análogos de los mismos, citoquinas inmunosupresoras, compuestos que inducen la expresión de inmunoproteasomas, 1,25-dihidroxivitamina D3 o análogos de los mismos, lipopolisacáridos, endotoxinas, proteínas de choque térmico, tiorredoxina con NADPH o NADP-tiorredoxina reductasa, ditiotreitol, agonistas del receptor adrenérgico tales como salbutamol, antagonistas del receptor adrenérgico tales como butoxamina, compuestos que regulan la expresión de la molécula de adhesión ICAM-1, N- acetil-L-cisteína, y-L-glutamil-L-cisteinil-glicina (L-glutatión reducido), alfa-2-macroglobulinas, inductores de la expresión del gen Foxp3, flavonoides, isoflavonoides, pterocarpanoides, estilbenos como resveratrol, antagonistas del receptor de taquiquinina, inhibidores de la quimasa, adyuvante de vacuna tal como CpG o MPL o adyuvante tolerogénico tal como zimosano, beta-1,3-glucano, inductor de células T reguladoras, un agente mucoadhesivo paraunir la partícula al revestimiento de la mucosa intestinal, tal como lectina vegetal, zinc, sales de zinc, polisacáridos, vitaminas y lisados bacterianos.
- 12. Una composición farmacéutica de las reivindicaciones 10 u 11 en la que los alergenos se seleccionan entre alergenos de polen, alergenos de leche, alergenos de veneno, alergenos de huevos, alergenos de malezas,5 alergenos de pastos, alergenos de árboles, alergenos de arbustos, alergenos de flores, alergenos vegetales, alergenos de granos, alergenos de hongos, alergenos de frutas, alergenos de bayas, alergenos de nueces, alergenos de semillas, alergenos de judías, alergenos de pescado, alergenos de mariscos, alergenos de marisco, alergenos de carne, alergenos de especias, alergenos de insectos, alergenos de ácaros, alergenos de moho, alergenos de animales, alergenos de garrapatas, alergenos de gusanos, alergenos de corales blandos, alergenos de 10 caspa de animales, alergenos de nematodos, alergenos de Hevea brasiliensis.
- 13. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para administración oral, para administración sublingual de fármacos, para administración entérica de fármacos.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06116322 | 2006-06-29 | ||
| EP06116322A EP1872792A1 (en) | 2006-06-29 | 2006-06-29 | A method for the production of hydrolyzed allergen |
| US84248506P | 2006-09-06 | 2006-09-06 | |
| US842485P | 2006-09-06 | ||
| PCT/EP2007/056454 WO2008000783A1 (en) | 2006-06-29 | 2007-06-28 | A method for the production of hydrolyzed allergen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2657625T3 true ES2657625T3 (es) | 2018-03-06 |
Family
ID=37526991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07730314.7T Active ES2657625T3 (es) | 2006-06-29 | 2007-06-28 | Procedimiento de producción de alérgeno hidrolizado |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20090324650A1 (es) |
| EP (3) | EP1872792A1 (es) |
| JP (2) | JP6029803B2 (es) |
| CN (2) | CN105854012A (es) |
| BR (1) | BRPI0713436B1 (es) |
| DK (1) | DK2043684T3 (es) |
| ES (1) | ES2657625T3 (es) |
| PL (1) | PL2043684T3 (es) |
| WO (1) | WO2008000783A1 (es) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100278880A1 (en) * | 2008-01-02 | 2010-11-04 | Biotech Tools S.A. | Pharmaceutical formulation for allergen preparation |
| EP3299379A1 (en) | 2011-06-15 | 2018-03-28 | ASIT BioTech S.A. | A method for the production of hydrolyzed allergens |
| CN103687616A (zh) | 2011-07-21 | 2014-03-26 | 生物技术工具公司 | Dnak制剂 |
| CA3208225A1 (en) | 2012-01-16 | 2013-07-25 | Elizabeth Mckenna | Compositions and methods for the treatment of hepatitic diseases and disorders |
| JP6129832B2 (ja) * | 2012-05-29 | 2017-05-17 | 日本ハム株式会社 | 食品成分抽出液および抽出方法 |
| WO2014047588A1 (en) | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Elizabeth Mckenna | Naturally occurring cpg oligonucleotide compositions and therapeutic applications thereof |
| CA2903345A1 (en) * | 2013-03-19 | 2014-09-25 | Biotech Tools S.A. | Allergen preparation |
| CA2942122A1 (en) * | 2014-04-10 | 2015-10-15 | Asit Biotech S.A. | Hsp-free allergen preparation |
| CN104447943A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-03-25 | 浙江我武生物科技股份有限公司 | 一种提取狗毛皮屑变应原的方法 |
| KR101721944B1 (ko) * | 2015-01-30 | 2017-04-04 | (주)청룡수산 | 연산호의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물 |
| US10143742B2 (en) | 2015-02-20 | 2018-12-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Mixed allergen compositions and methods for using the same |
| US11452774B2 (en) | 2015-02-20 | 2022-09-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Mixed allergen compositions and methods for using the same |
| US10166286B2 (en) | 2015-02-20 | 2019-01-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Mixed allergen compositions and methods for using the same |
| US10149904B2 (en) | 2015-02-20 | 2018-12-11 | The Board Of Trusteees Of The Leland Stanford Junior University | Mixed allergen compositions and methods for using the same |
| US10064936B2 (en) | 2015-02-20 | 2018-09-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Mixed allergen compositions and methods for using the same |
| GB201602850D0 (en) * | 2016-02-18 | 2016-04-06 | Bial Ind Farmaceutica S A | Fusion proteins |
| EP3503746B8 (en) * | 2016-08-25 | 2023-04-05 | Usgreentech, L.L.C. | Treated walnut shell infill for artificial turf and manufacturing process |
| ES2868631T3 (es) * | 2016-10-05 | 2021-10-21 | Asit Biotech S A | Prevención de la alergia |
| CN111465328A (zh) | 2017-07-18 | 2020-07-28 | 前品牌股份有限公司 | 制备混合型变应原组合物的方法 |
| WO2019166544A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Asit Biotech Sa | Detection of blocking antibodies |
| WO2019211312A1 (en) | 2018-04-30 | 2019-11-07 | Asit Biotech Sa | Evaluation of hydrolyzed allergen preparations |
| US11766477B2 (en) | 2019-01-23 | 2023-09-26 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Methods for making mixed allergen compositions |
| CN110872357B (zh) * | 2019-11-06 | 2021-04-30 | 中国石油天然气股份有限公司 | 一种多肽表面活性剂及其制备及应用 |
| CN111471730A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-07-31 | 珠海良仆食品有限公司 | 一种澳洲坚果多肽超声辅助提取工艺 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1247614A (en) | 1969-06-20 | 1971-09-29 | Miles Lab | Improved therapeutic and diagnostic allergenic extract and process for preparing same |
| US4822611A (en) * | 1986-12-09 | 1989-04-18 | Immunotec, Inc. | Oral hyposensitization in the treatment of allergies |
| JPH06507494A (ja) * | 1991-04-26 | 1994-08-25 | カレノフ，エマニユエル | 細菌性アレルゲンにより惹起される疾患の検出及び治療方法 |
| US6555116B1 (en) * | 1991-10-12 | 2003-04-29 | Regents Of The University Of California | Alleviation of the allergenic potential of airborne and contact allergens by thioredoxin |
| JP3397791B2 (ja) * | 1992-09-21 | 2003-04-21 | ラボラトリオス レティ ソシエダッド アノニマ | アレルゲンとして活性なタンパク質を含有する水性エキスの精製方法，この方法で得られるエキスならびにそれらの使用 |
| AU675629B2 (en) | 1992-09-21 | 1997-02-13 | Laboratorios Leti S.A. | A process for the purification of aqueous extracts containing allergenically active proteins, extracts obtainable according to this process as well as their use |
| DE69738525T2 (de) * | 1996-09-04 | 2009-02-19 | Takara Bio Inc., Otsu | Pilz-antigene und verfahren zu deren herstellung |
| JPH10234379A (ja) * | 1997-02-27 | 1998-09-08 | Takara Shuzo Co Ltd | 真菌抗原及びその製造方法 |
| US6350590B1 (en) * | 1997-10-30 | 2002-02-26 | C.B.F. Leti, S.A. | Tolerogenic fragments of natural allergens |
| JP2869531B2 (ja) * | 1998-01-05 | 1999-03-10 | フマキラー株式会社 | 精製ダニアレルゲン |
| AU4053600A (en) | 1999-03-30 | 2000-10-16 | Idexx Laboratories, Inc. | Peptide vaccine for canine allergy |
| DE19939982A1 (de) * | 1999-08-24 | 2001-03-01 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Gräserpollenallergenen |
| JP2001231563A (ja) * | 2000-02-18 | 2001-08-28 | Asahi Breweries Ltd | 改変したダニアレルゲン（システイン変異体）及びその製造方法 |
| CU22983A1 (es) * | 2002-05-08 | 2004-09-09 | Inst Finlay | Composición vacunal contra las alergias y método para su obtención y empleo en el tratamiento de las mismas |
| AU2003280324A1 (en) * | 2002-11-26 | 2004-06-18 | Alk-Abello A/S | Pharmaceutical allergen product |
| JP2008529960A (ja) * | 2003-06-23 | 2008-08-07 | バイオテック トゥールス ソシエテ アノニム | エピトープ組成物 |
| DE602004013957D1 (de) * | 2004-07-15 | 2008-07-03 | Biomay Ag | Reagenzien zur Diagnose und Behandlung von Latexallergie und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| AT501101B1 (de) * | 2004-12-02 | 2008-01-15 | Biomay Ag | Protein-allergen-derivat |
| US20070003579A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-04 | Mannkind Corporation | Allergen-specific immunotherapy |
-
2006
- 2006-06-29 EP EP06116322A patent/EP1872792A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-06-28 PL PL07730314T patent/PL2043684T3/pl unknown
- 2007-06-28 BR BRPI0713436-3A patent/BRPI0713436B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-06-28 EP EP07730314.7A patent/EP2043684B1/en not_active Not-in-force
- 2007-06-28 CN CN201610191809.6A patent/CN105854012A/zh active Pending
- 2007-06-28 EP EP17198661.5A patent/EP3308799A1/en not_active Withdrawn
- 2007-06-28 JP JP2009517199A patent/JP6029803B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-28 US US12/308,859 patent/US20090324650A1/en not_active Abandoned
- 2007-06-28 DK DK07730314.7T patent/DK2043684T3/en active
- 2007-06-28 WO PCT/EP2007/056454 patent/WO2008000783A1/en active Search and Examination
- 2007-06-28 CN CN200780023913.3A patent/CN101478986B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-28 ES ES07730314.7T patent/ES2657625T3/es active Active
-
2014
- 2014-10-09 JP JP2014208256A patent/JP6014100B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2018
- 2018-05-09 US US15/974,916 patent/US20180256708A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL2043684T3 (pl) | 2018-04-30 |
| JP2010504278A (ja) | 2010-02-12 |
| EP3308799A1 (en) | 2018-04-18 |
| US20180256708A1 (en) | 2018-09-13 |
| DK2043684T3 (en) | 2018-02-05 |
| WO2008000783A1 (en) | 2008-01-03 |
| BRPI0713436A2 (pt) | 2012-03-13 |
| CN101478986B (zh) | 2016-05-04 |
| CN105854012A (zh) | 2016-08-17 |
| BRPI0713436B1 (pt) | 2018-06-12 |
| JP6014100B2 (ja) | 2016-10-25 |
| EP1872792A1 (en) | 2008-01-02 |
| EP2043684A1 (en) | 2009-04-08 |
| JP6029803B2 (ja) | 2016-11-24 |
| CN101478986A (zh) | 2009-07-08 |
| JP2015051979A (ja) | 2015-03-19 |
| US20090324650A1 (en) | 2009-12-31 |
| EP2043684B1 (en) | 2017-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2657625T3 (es) | Procedimiento de producción de alérgeno hidrolizado | |
| JP6419775B2 (ja) | アレルゲン調製物 | |
| US20100278880A1 (en) | Pharmaceutical formulation for allergen preparation | |
| JP6581636B2 (ja) | 加水分解されたアレルゲンの製造方法 | |
| ES2395093T3 (es) | Proceso para producir un extracto de alérgenos | |
| ES2623050T3 (es) | Polipéptidos profilinas vegetales para su uso en inmunoterapia de alergia inespecífica | |
| BR112020022128A2 (pt) | avaliação de preparações de alérgenos hidrolisados |