ES2642154T3 - Anticuerpos Foxc1 y métodos de su utilización - Google Patents

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Description

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Descripcion
ANTICUERPOS FOXC1 Y METODOS DE SU UTILIZACION ANTECEDENTES
Los factores de transcripcion de estructura de horquilla, incluyendo la estructura de horquilla C1 (FOXC1), son factores de transcripcion caracterizados por un dominio comun de union de ADN de helice alada de 100 aminoacidos denominado dominio de estructura de horquilla y juegan papeles importantes en la regulacion de la expresion de genes implicados en el crecimiento, supervivencia, diferenciacion del desarrollo del mesodermo embrionario, migracion y longevidad de celulas (Nishimura et al., 1998). Como resultado de los estudios descritos en el presente documento, se ha determinado que la expresion de FOXC1 en el cancer de mama humano, tanto en el nivel de ARNm como de protema, se produce de manera consistente y exclusiva en los canceres de mama de tipo basal (BLBC). El cancer de mama de tipo basal (BLBC) tiene un pronostico pobre y se identifica a menudo por un fenotipo triple negativo (ER-/PR-/HER2-) y citoqueratinas basales. Recientemente, sin embargo, la sobreexpresion de mRNA para el factor de transcripcion FOXC1 se ha identificado como un importante biomarcador pronostico de BLBC (Ray et al., 2010). Tambien se ha encontrado que la expresion de la protema FOXC1 es un predictor significativo de la supervivencia global en analisis univariados y multivariados (Ray et al., 2010).
Aunque se han descrito muchos genes como biomarcadores caractensticos de ciertos tipos de cancer y muchos otros se describen como de importancia funcional para la supervivencia y el mantenimiento del fenotipo maligno, muy pocos han demostrado tener una fuerte significacion a nivel de pronostico. Esto se debe a que muy pocos son cnticos por sf mismos y en su lugar forman parte de redes extremadamente grandes y complejas de biomoleculas cuya funcion global no puede determinarse a menos que se identifiquen las moleculas que son mas centrales y pivotales en la red. Se ha demostrado que FOXC1 tiene una alta significacion pronostica, siendo predictivo de la alta tasa de mortalidad y metastasis asociada espedficamente con canceres de mama de tipo basal. Por lo tanto, FOXC1 es un biomarcador indicativo y caractenstico de BLBC. La significacion clmica de FOXC1 en lo que se refiere a canceres de mama de tipo basal se describe en detalle en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US10/44817, presentada el 6 de agosto de 2010.
El significado clmico de la expresion de FOXC1 no se limita al cancer de mama, sino que puede extenderse a otros tipos de cancer, incluyendo pero sin limitarse a tumores cerebrales (como glioblastoma multiforme o astrocitoma), cancer de colon, cancer gastrico, melanoma, tumores neuroendocrinos, cancer de prostata (por ejemplo, cancer de prostata insensible a los androgenos), cancer de celulas renales, sarcomas (como sarcoma sinovial) y leucemia. Se ha demostrado que la expresion de FOXC1 define subconjuntos agresivos biologicamente y clmicamente en dichos canceres y puede utilizarse tanto como biomarcador diagnostico como pronostico para estos tipos espedficos de cancer. Ademas, FOXC1 es un objetivo terapeutico adecuado para BLBC y los otros tipos espedficos de cancer descritos anteriormente. Por lo tanto, se desea el desarrollo de sustancias que se dirigen a FOXC1 y son adecuados para su uso en el diagnostico, pronostico y tratamiento de BLBC y otros canceres.
Los hallazgos descritos anteriormente tienen implicaciones claras e importantes para la medicina personalizada y el cuidado personalizado del cancer, ya que la deteccion del estado de FOXC1 de los subgrupos espedficos descritos de pacientes con cancer de mama (y/u otros tipos de cancer descritos anteriormente) permitira intervenciones terapeuticas mas pesonalizadas y espedficas con una mayor probabilidad de detener la progresion de la enfermedad, alargar la esperanza de vida o incluso lograr una cura.
Ray et al. (Ray, P.S. et al., 2009, Journal of clinical oncology, vol. 27, no. 15, pagina 11016) describe que FOXC1 es un determinante dominante del fenotipo similar a basal del cancer de mama. Taube et al. (Taube, J.H., 2010, PNAS, vol. 107, no. 35, paginas 15449-15454) describe que la expresion de FOXC1 marca tumores similares a basales. Muggerud et al. (Muggerud, A.A. et al., 2010, Breast Cancer Research, vol. 12, no. 1, pagina R3) describe un incremento de la frecuencia de metilacion del gen FOXC1 en tumores invasivos. Berry et al. (Berry, F.B. et al., 2002, JBC, vol. 227, no. 12, paginas 10292-10297) describe dominios estructurales de FOXC1 incluyendo dominios de activacion N- and C-terminales. Ray et al. (Ray, P.S. et al., 2010, Cancer Research, vol. 70, no. 10, paginas 3870-3876) describe que fOxC1 es un biomarcador pronostico potencial con una significacion funcional en cancer de mama similar a basal.
RESUMEN
En un primer aspecto, la invencion se dirige a un anticuerpo aislado que enlaza una secuencia de peptidos antigenicos correspondiente al dominio de transactivacion de N-terminales del FOXC1 humano, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, en que la secuencia de peptidos antigenicos comprende aminoacidos 51-75 de FOXC1 humano (SEQ ID NO:1), y en que el anticuerpo aislado se utiliza para detectar FOXC1 en una prueba de inmunidad in vitro.
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En diversas formas de realizacion, el anticuerpo es producido por una lmea de celulas de hibridoma.
En diversas formas de realizacion, la secuencia pepffdica antigenica es:
5'-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3'(SEQ ID NO:2); o 5'-C-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:3).
En un segundo aspecto, la invencion se dirige a un metodo in vitro para diagnosticar un cancer de mama de tipo basal en un sujeto que tiene cancer de mama o que se sospecha que tiene cancer de mama, en que el metodo comprende:
contactar con una o mas celulas de cancer de mama en una muestra biologica con un anticuerpo FOXC1 conjugado con un agente diagnostico, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, y en que el anticuerpo FOXC1 une una secuencia de peptidos antigenicos correspondiente al dominio de transactivacion N-terminal de FOXC1 y que comprende aminoacidos 51-75 de FOXC1 (SEQ ID NO:1);
detectar la presencia o ausencia de FOXC1 en la una o mas celulas de cancer de mama; y diagnosticar que el sujeto tiene un cancer de mama de tipo basal cuando esta presente FOXC1.
En diversas formas de realizacion, la muestra biologica es una muestra de tumor primario o metastatico, una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de plasma, una muestra de linfa, una muestra de ganglio linfatico, una muestra de ffquido cefalorraqmdeo, una muestra de medula osea, una muestra de fluido intersticial o una muestra de orina.
En diversas formas de realizacion, el agente diagnostico es una sustancia radiactiva, un agente de contraste de colorantes, un compuesto o molecula fluorescente, un compuesto o molecula bioluminiscente, enzima o un agente potenciador.
En diversas formas de realizacion, la deteccion de la presencia o ausencia de FOXC1 se consigue mediante un inmunoensayo in vitro, como por ejemplo inmunocitoqmmica (ICC), inmunohistoqmmica (IHC), Western blot o hibridacion fluorescente in situ (FISH).
En diversas formas de realizacion, el metodo comprende ademas:
Lisado o permeabilizacion de las una o mas celulas de cancer de mama cuando el inmunoensayo in vitro utiliza el contenido de todas las celulas o los preparados de todas las celulas.
En diversas formas de realizacion, el anticuerpo FOXC1 se conjuga con un agente de administracion intracelular.
En diversas formas de realizacion, la secuencia pepffdica antigenica es:
5'-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:2); o 5'-C-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:3).
El agente de diagnostico puede ser cualquier sustancia adecuada, incluyendo una sustancia radiactiva, un colorante o agente de contraste, un compuesto o molecula fluorescente, un compuesto o molecula bioluminiscente o una enzima o agente potenciador.
La deteccion de la presencia o ausencia de FOXC1 se consigue mediante un inmunoensayo in vitro, como por ejemplo inmunocitoqmmica (ICC), inmunohistoqmmica (IHC), Western blot o hibridacion fluorescente in situ (FISH). Alternativamente, puede utilizarse una modalidad de formacion de imagenes in vivo, como por ejemplo imagen de resonancia magnetica (MRI), tomograffa de emision de positrones (PET) o microPET, tomograffa computerizada (CT), marcador de combinacion PET/CT, dispositivo cargado acoplado refrigerado (CCD), imagenes opticas de camara, imagenes opticas y tomograffa computerizada de emision de foton simple (SPECT). Cuando la presencia o ausencia de FOXCl se determina por un metodo in vivo, el anticuerpo FOXC1 o su fragmento funcional debe conjugarse con un agente de administracion intracelular para facilitar la administracion del anticuerpo o fragmento funcional del mismo al citoplasma de las celulas objetivo.
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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es una inmunotransferencia de celulas de cancer de mama humano MCF-7 que se transfectaron con FOXC1 (+) o vector (-) utilizando anticuerpos policlonales FOXC1 comerciales (Santa Cruz Biotechnology) y anticuerpos monoclonales FOXC1 aislados de la lmea celular de hibridomas B2E3. Ambos anticuerpos se utilizaron a una dilucion 1:100.
La Figura 2 son imagenes representativas de celulas de cancer de mama humano MCF-7 transfectadas con GFP-FOXC1 (A) en las que se realizo tincion de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales FOXC1 aislados de la lmea celular de hibridoma B2E3 para detectar celulas (B) transfectadas satisfactoriamente. Se uso DAPI para tenir el ADN de todas las celulas (C).
La Figura 3 muestra imagenes representativas de tincion inmunohistoqmmica de FOXC1 en dos muestras representativas de cancer de mama (tejido de cancer de mama positivo FOXC1 y tejido de cancer de mama negativo FOXC1) utilizando anticuerpos monoclonales FOXC1 aislados de la lmea celular de hibridoma B2E3.
La Figura 4 es la secuencia de la protema C1 de caja de horquilla humana (FOXC1) (SEQ ID NO:1, numero de acceso AAH70124). La secuencia de peptidos antigenicos objetivo utilizada para generar anticuerpos monoclonales FOXC1 de acuerdo con algunas formas de realizacion esta en negrita y subrayada.
DESCRIPCION DETALLADA
La descripcion esta dirigida a anticuerpos que se unen espedficamente a la protema C1 de caja de horquillas (FOXC1) y a metodos de diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones pendientes. De acuerdo con algunas formas de realizacion descritas en la presente memoria, dichos anticuerpos anti- FOXC1 pueden usarse en metodos para diagnosticar y tratar el cancer de mama de tipo basal y se generaron para desarrollar un enfoque conveniente, pragmatico y eficiente para ensayos inmunohistoqmmicos que explotan el potencial de diagnostico de FOXC1 en la gestion del cancer de mama.
Un anticuerpo tal como se describe en el presente documento es una molecula que incluye una inmunoglobulina intacta o una o mas partes de una inmunoglobulina o molecula relacionada con inmunoglobulina que se une espedficamente a, o es inmunologicamente reactiva con un epftopo antigenico de una sustancia objetivo (por ejemplo, una protema objetivo). Dicha inmunoglobulina o molecula relacionada con inmunoglobulina puede incluir anticuerpos monoclonales o policlonales de cualquier isotipo (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG o IgM), anticuerpos modificados o fragmentos de anticuerpos funcionales.
El termino anticuerpo modificado incluye, aunque sin limitacion, formas modificadas geneticamente o modificadas de otro modo de inmunoglobulinas o fragmentos funcionales de las mismas, como por ejemplo intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quimericos, anticuerpos totalmente humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos bivalentes o biespedficos y anticuerpos conjugados (por ejemplo, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos). Los anticuerpos modificados pueden ser monovalentes o multivalentes. El termino fragmento de anticuerpo funcional incluye uno o mas fragmentos de anticuerpos que se unen a antfgenos de anticuerpos solos o en combinacion con otras moleculas, incluyendo, pero sin limitacion, fragmentos Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG, scFv y fragmentos de dominio unico. Ejemplos de los tipos de anticuerpos, anticuerpos modificados y fragmentos de anticuerpos funcionales que pueden utilizarse de acuerdo con las formas de realizacion descritas en el presente documento se describen adicionalmente en Huson PJ y Souriau C, Engineered Antibodies, Nature Medicine (2003) 9(1):129-134.
Anticuerpos FOXC1
Los anticuerpos descritos en el presente documento se unen espedficamente a una secuencia de peptidos antigenicos objetivo de FOXC1 humano (Figura 4; SEC ID NO:1). La secuencia de peptidos antigenicos objetivo corresponde a un epftopo presente en el estado nativo intacto de la protema objetivo, FOXC1. La secuencia de peptidos antigenicos objetivo corresponde a un epftopo continuo (es decir, compuesto por una secuencia contigua de aminoacidos en una protema).
Diversas caractensticas son importantes para seleccionar una secuencia de peptidos antigenicos objetivo adecuada dentro de una secuencia de protema objetivo como por ejemplo FOXC1. Los epftopos antigenicos potenciales dentro de una secuencia de protema objetivo debenan tener, pero no estar limitados a, las siguientes caractensticas: (i) hidrofilo, porque la mayona de las protemas naturales en soluciones acuosas tienen residuos hidrofflicos en la superficie y residuos hidrofobicos en el interior; (ii) orientada a la superficie, porque los anticuerpos y sus fragmentos funcionales generalmente se unen a epftopos sobre la superficie de las protemas; y (iii) flexible, porque se ha demostrado que los epftopos tienen un alto grado de movilidad. Los algoritmos para predecir caractensticas de protemas tales como hidrofilia/hidrofobicidad y regiones de
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estructura secundaria tales como helice alfa, hoja beta y giro beta pueden ayudar a seleccionar una secuencia interna inmunogenica potencialmente expuesta para la generacion de anticuerpos. Se puede utilizar un paquete de software comercial para ayudar a seleccionar una secuencia de peptidos antigenicos objetivo, tal como MacVector™, DNAStar™ y PC-GeneTM. Los anticuerpos de la invencion se unen a una secuencia de peptidos antigenicos objetivo que corresponde al dominio de transactivacion N-terminal de FOXC1. La secuencia de peptidos antigenicos objetivo es 5'-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:2), que corresponde a los aminoacidos 51 a 75 de SEQ ID NO:1 (vease la Figura 4).
En el presente documento tambien se describe que una secuencia de peptidos antigenicos objetivo puede conjugarse con una protema vehmuloa para aumentar su inmunogenicidad. Las protemas vehmuloas pueden incluir epftopos que estimulan celulas T auxiliares, que a su vez ayudan a inducir la respuesta de las celulas B frente a la secuencia del peptido antigenico objetivo. Por ejemplo, el peptido vehmulo puede incluir, pero no esta limitado a, hemacianina de lapa de ojo de cerradura (kLh), albumina de suero bovino (BSA), ovoalbumina (OVA) y albumina de suero de conejo (RSA).
La conjugacion de la secuencia de peptidos antigenicos objetivo a la protema vehmuloa puede realizarse mediante un metodo de acoplamiento adecuado. El metodo de acoplamiento es un metodo de carbodiimida que utiliza carbodiimidas que pueden activar los grupos carboxflicos de cadena lateral de acido aspartico y glutamico asf como el grupo carboxilo terminal para convertirlos en sitios reactivos para acoplamiento con aminas primarias. Alternativamente, el gluteraldehfdo puede utilizarse como un reactivo de acoplamiento bifuncional que enlaza dos compuestos a traves de sus grupos amino. En otro aspecto, se puede usar el ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) para enlazar peptidos a protemas vehmuloas a traves de cistemas. El acoplamiento tiene lugar con el grupo tiol de residuos de cistema. Si la secuencia elegida no contiene Cys, puede colocarse un residuo Cys en el terminal N- o C- para obtener una union controlada del peptido a la protema vehmuloa. Por lo tanto, la secuencia de peptidos antigenicos objetivo descrita anteriormente (SEQ ID NO:2; 5'-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3') puede tener una cistema anadida al terminal N para ayudar en su conjugacion a una protema vehmuloa segun sea necesario (por ejemplo, 5'-C-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3'; SEQ ID N°:3).
En algunas formas de realizacion, el anticuerpo que se une espedficamente a una secuencia de peptidos antigenicos objetivo de FOXC1 humano (el "anticuerpo FOXC1" o los "anticuerpos FOXC1") es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos porque estan dirigidos contra un unico sitio antigenico. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales son utiles para mejorar la selectividad y la especificidad de los ensayos analtticos y de diagnostico asf como las aplicaciones terapeuticas en comparacion con las preparaciones policlonales convencionales.
En el presente documento tambien se describe que el anticuerpo FOXC1 es un fragmento funcional del anticuerpo monoclonal FOXC1 tal como se ha descrito anteriormente. El fragmento funcional del anticuerpo monoclonal FOXC1 puede ser una parte del anticuerpo (por ejemplo, un dominio), que retiene la capacidad de unirse espedficamente a una secuencia de peptidos antigenicos objetivo de FOXC1 humana. Los ejemplos de dichos fragmentos de anticuerpos incluyen: F(ab')2, Fab', Fab, Fv de cadena sencilla (en adelante referido como "scFv"), Fv unido a disulfuro (en adelante, denominado "dsFv"), un polfmero del mismo, region V dimerica (en lo sucesivo denominado "diacuerpo"), y peptidos o pepcticuerpos que contienen regiones determinantes de complementariedad (CDR).
Se pueden utilizar varios metodos conocidos en la tecnica para la produccion de anticuerpos, incluyendo hibridoma, biblioteca de fagos y tecnicas recombinantes (vease, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E. y Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, y Making and Using Antobodies: A Practical Handbook, Howard G y Kaser M, 2006, cRc Press; Los anticuerpos FOXC1 descritos en el presente documento se generan mediante una lmea celular de hibridoma. La lmea celular de hibridoma se produce mediante una tecnica de hibridoma adecuada conocida en la tecnica, como por ejemplo la descrita por Kohler y Milstein (Kohler & Milstein, 1975). En una tecnica de hibridoma, un animal huesped (por ejemplo, un raton o conejo) se inmuniza habitualmente con un agente inmunizante para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran espedficamente al agente inmunizante. Alternativamente, el animal puede inmunizarse con celulas transfectadas con un vector que contiene una molecula de acido nucleico que codifica FOXC1 o un fragmento inmunogenico, derivado o variante del mismo o los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Dichos metodos de produccion de mAb recombinante se describen mas adelante.
El agente inmunizante puede ser un antfgeno de protema objetivo (por ejemplo, FOXC1), un fragmento del mismo o una protema de fusion del mismo (por ejemplo, las secuencias de peptido antigenico objetivo de FOXC1 humano; SEQ ID NO:2-3). Los linfocitos se fusionan despues con una lmea celular inmortalizada (por ejemplo, celulas de mieloma) utilizando un agente de fusion adecuado, como por ejemplo polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma. Las celulas de hibridoma se cultivan despues en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo
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para los hibridomas incluira habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de celulas con deficiencia de HGPRT.
A continuacion, el medio de cultivo en el que se cultivan las celulas de hibridoma puede ser ensayado para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el anffgeno.
Preferentemente, la especificidad de union de anticuerpos monoclonales producidos por las celulas de hibridoma se determina mediante un metodo adecuado conocido en la tecnica, como por ejemplo inmunoprecipitacion o un ensayo de union in vitro, como por ejemplo radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).
Una vez que se identifican las celulas de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilucion limitados y cultivarse mediante metodos estandar. (Ver Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) paginas 59-103). Medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las celulas de hibridoma pueden crecer in vivo como ascitis en un mairnfero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o fluido asdtico mediante un procedimiento de purificacion de inmunoglobulina conocido en la tecnica incluyendo, pero sin limitarse a, la protema A-Sefarosa, cromatograffa de hidroxilapetato, electroforesis en gel, dialisis o afinidad cromatograffa.
Los anticuerpos pueden prepararse por metodos de ADN recombinante conocidos en la tecnica. Se describen metodos para la produccion recombinante de anticuerpos monoclonales, por ejemplo en la Patente de Estados Unidos N° 4.816.397 de Boss et al. (caducada) y la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567 de Cabilly (caducada). El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales FOXC1 descritos en este documento puede aislarse y secuenciarse usando procedimientos conocidos en la tecnica (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleoffdicas que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma pueden servir como una fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresion, que son transfectados a continuacion en celulas huesped (por ejemplo, celulas COS simies, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que no producen protema de inmunoglobulina) que sintetizan los anticuerpos monoclonales. El ADN tambien puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homologas o uniendo covalentemente la totalidad o parte de una secuencia codificante para un polipeptido no inmunoglobulina a la secuencia de codificacion de inmunoglobulina. Dicho polipeptido no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invencion o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinacion de anffgenos de un anticuerpo de la invencion para crear un anticuerpo bivalente quimerico.
En el presente documento tambien se describe que los fragmentos de anticuerpo pueden prepararse por hidrolisis proteofftica del anticuerpo o por expresion en E. coli de ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse por digestion con pepsina o papama de anticuerpos enteros por metodos convencionales. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos de anticuerpos por escision enzimatica de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente utilizando un agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo resultantes de la escision de enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' 3,5S. Alternativamente, una escision enzimatica que utiliza pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fc directamente. Tambien pueden usarse otros metodos de escision de anticuerpos, como por ejempo separacion de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera pesada monovalente, escision adicional de fragmentos u otras tecnicas enzimaticas, qmmicas o geneticas, siempre que los fragmentos se unan al anffgeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
En algunas formas de realizacion, pueden producirse variantes conservadoras de los anticuerpos. Dichas variantes conservadoras empleadas en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos funcionales deben retener residuos de aminoacidos que son necesarios para plegarse y estabilizarse correctamente entre las regiones Vh y VLy conservaran las caracteffsticas de carga de los residuos con el fin de preservar el punto isoelectrico (pi) bajo y la baja toxicidad de las moleculas. Pueden hacerse sustituciones de aminoacidos en las regiones Vh y Vl para aumentar el rendimiento. Las tablas de sustitucion de aminoacidos conservadoras que proporcionan aminoacidos funcionalmente similares son conocidas por los expertos en la tecnica. Generalmente, las variantes conservadoras se uniran al anffgeno objetivo con una eficacia igual o mayor que el anticuerpo monoclonal parental.
Una vez que se puede determinar la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo que es espedfico de una secuencia de peptidos antigenicos objetivo de FOXC1 humano tal como las descritas anteriormente se puede disenar una secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos. Ademas, se pueden construir una diversidad de clones que contienen moleculas de acido nucleico funcionalmente
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equivalentes, como por ejemplo moleculas de acido nucleico que difieren en secuencia pero que codifican el mismo efecto o molecula o secuencia de anticuerpos. Por lo tanto, en el presente documento se describen tambien acidos nucleicos que codifican anticuerpos espedficos de FOXC1 o fragmentos funcionales de los mismos (tales como los espedficos para el epttopo AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD, aminoacidos 51 a 75 de SEQ ID NO:1), conjugados y protemas de fusion.
Derivados y conjugados anti-FOXCI
En algunas formas de realizacion, los anticuerpos FOXC1 pueden incluir derivados de anticuerpos que se modifican qmmicamente. Por ejemplo, los derivados de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos que han sido modificados por glicosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion o derivatizacion por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escision proteolftica y enlaces a un ligando celular u otra protema. Cualquiera de las numerosas modificaciones qmmicas puede llevarse a cabo mediante tecnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a, escision qmmica espedfica, acetilacion, gormilacion y smtesis metabolica de tunicamicina. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o mas aminoacidos no naturales.
En otras formas de realizacion, el anticuerpo FOXC1 o fragmento de anticuerpo funcional puede conjugarse con otra sustancia para formar un conjugado anti-FOXCI. Los conjugados anti-FOXCI descritos en el presente documento se pueden preparar mediante metodos conocidos de union de anticuerpos con lfpidos, carbohidratos, protemas u otros atomos y moleculas. En un aspecto, el conjugado anti-FOXCI se forma por conjugacion espedfica del sitio utilizando un enlace o union adecuados. Es mas probable que la conjugacion espedfica del sitio preserve la actividad de union de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional. La sustancia puede conjugarse o unirse en la region bisagra de un componente de anticuerpo o fragmento de anticuerpo reducido mediante la formacion de un enlace disulfuro. Por ejemplo, la introduccion de residuos de cistema en el extremo C-terminal de un fragmento scFv, como por ejemplo los que se introducen en los cis- diacuerpos descritos anteriormente, permite el acoplamiento tiol-reactivo espedfico del sitio en un sitio alejado del sitio de union al antfgeno a una amplia variedad de los agentes. Alternativamente, otros enlaces o enlaces utilizados para formar el conjugado anti-FOXCI pueden incluir, pero no estan limitados a, un enlace covalente, un enlace no covalente, un enlace sulfuro, un enlace hidrazona, un enlace hidrazina, un enlace ester, un enlace amido, y un enlace amino, un enlace imino, un enlace tiosemicabazona, un enlace semicarbazona, un enlace oxima y un enlace carbono-carbono.
En una forma de realizacion, el conjugado anti-FOXCI puede incluir un anticuerpo FOXC1 conjugado con un agente de administracion intracelular. En un aspecto, el agente de administracion es un peptido que penetra en las celulas. Los peptidos penetrantes de celulas son peptidos cortos que facilitan la captacion celular de diversas moleculas y sustancias (por ejemplo, moleculas pequenas, peptidos, protemas y acidos nucleicos), para la administracion de dichas moleculas y sustancias al citoplasma de una celula. Esto se logra mediante la explotacion de diversos procesos celulares tales como la penetracion directa de la membrana plasmatica, el transporte mediado por endocitosis y la translocacion mediante la formacion de una estructura transitoria. Los peptidos penetrantes de celulas que pueden utilizarse para formar un conjugado anti-FOXCI para administracion intracelular incluyen, pero no se limitan a, la protema Trans- Activadora de Transcripcion (TAT) (Mie et al., 2003, Wadia et al. 2004, Kameyama et al, 2006), la protema esencial durante la penetracion 1 (Pep-1) (Morris et al., 2001). Otros agentes de administracion que pueden utilizarse para suministrar el anticuerpo FOXC1 o el fragmento funcional que contiene incluyen, pero no se limitan a, lfpidos cationicos (Weill et al., 2008), poli-L-arginina (Chen & Erlanger 2002); farmacos liposomiales (Roth et al., 2007) y vehmulos polimericos (por ejemplo, poli (acido propil acnlico, PPAA) (Stayton et al., 2005).
En una forma de realizacion, el conjugado anti-FOXC1 puede incluir un anticuerpo FOXC1 conjugado con un agente de diagnostico. Un "agente de diagnostico" es un atomo, molecula, compuesto u otra sustancia que es util para diagnosticar, detectar o visualizar el cancer u otras condiciones asociadas con FOXC1 por metodos in vitro o ex vivo conocidos en la tecnica y que se describen a continuacion. De acuerdo con las formas de realizacion descritas en la presente memoria, los agentes de diagnostico pueden incluir, pero no se limitan a, sustancias radiactivas (por ejemplo, radioisotopos, radionucleidos, radiomarcadores o radiotrazadores), colorantes, agentes de contraste, compuestos fluorescentes o moleculas, compuestos o moleculas bioluminiscentes, enzimas y agentes potenciadores (por ejemplo, iones paramagneticos). Ademas, debe observarse que algunas nanopartmulas, por ejemplo puntos cuanticos y nanopartmulas metalicas (que se describen mas adelante) tambien pueden ser adecuadas para su uso como agente de deteccion.
Las sustancias radiactivas que pueden utilizarse como agentes de diagnostico de acuerdo con las formas de realizacion de la descripcion incluyen, pero no se limitan a, 18F, 32P, 33P, 45Ti, 47Sc, 52Fe, 59Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 75Sc, 77As, 86Y, 90Y. 89Sr, 89Zr, 94Tc, 94Tc, 99mTc, 99Mo, 105Pd, 105Rh, 111Ag, 111In 123l, 124l, 125l 131 i 142Pr 143Pr 149Pm 153sm 154-1581Gd 161Tb 166Dy 166Ho 1®9Er ^Lu ^Lu 18®Re 188Re 189Re 194|r 198Au, 199Au, 211At, 211Pb, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra y 225Ac. Los iones paramagneticos que pueden utilizarse como agentes de diagnostico de acuerdo con las formas de realizacion de la descripcion incluyen, pero no
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se limitan a, iones de metales de transicion y lantanidos (por ejemplo metales que tienen numeros atomicos de 6 a 9, 21-29, 42, 43, 44 o 57-71). Estos metales incluyen iones de Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb y Lu.
Cuando el agente diagnostico es un metal radioactivo o un ion paramagnetico, el agente puede hacerse reaccionar con un reactivo que tiene una cola larga con uno o mas grupos quelantes unidos a la cola larga para unir estos iones. La cola larga puede ser un polfmero como por ejemplo una polilisina, un polisacarido u otra cadena derivatizada o derivatizable que tenga grupos pendientes a los que se pueda unir a un grupo quelante para unir los iones. Los ejemplos de grupos quelantes que se pueden usar de acuerdo con la descripcion incluyen, pero no se limitan a, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), dietilentriaminopentaacetico (DTPA), DOTA, NOTA, NETA, porfirinas, poliaminas, eteres corona, bis- tiosemicarbazonas, polioximas y grupos similares. El quelato esta normalmente unido al anticuerpo FOXC1 por un grupo que permite la formacion de un enlace a la molecula con perdida minima de inmunoreactividad y agregacion minima y/o reticulacion interna. Los mismos quelatos, cuando se complejan con metales no radiactivos, como por ejemplo manganeso, hierro y gadolinio, son utiles para la RM, cuando se utilizan junto con los anticuerpos y vefuculos descritos en la presente memoria. Los quelatos macrodclicos como por ejemplo NOTA, DOTA y TETA son de uso con una variedad de metales y radiometales incluyendo, pero sin limitarse a, radionuclidos de galio, itrio y cobre, respectivamente. Pueden usarse otros quelatos de tipo anillo tales como polieteres macrodclicos, que son de interes para los nuclidos que se unen establemente, como por ejemplo 223Ra para RAIT. En ciertas formas de realizacion, los restos quelantes pueden usarse para unir un agente de formacion de imagenes de PET, como por ejemplo un complejo AI-18F, a una molecula objetivo para su utilizacion en analisis de PET.
Los compuestos o moleculas bioluminescentes y fluorescentes y los colorantes que pueden utilizarse como agentes de diagnostico de acuerdo con las formas de realizacion de la descripcion incluyen, pero no se limitan a, fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo cloruro, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Oregon Green™, rodamina, rojo de Texas, tetrarhodimina isotiocianato (TRITC), Cy3, Cy5, fosforo lantanido, protema fluorescente verde (GFP), protema fluorescente amarilla (YFP), ficoeritrina y compuestos fluorescentes autocongelados que son activados por proteasas y enzimas asociadas a tumores (por ejemplo, luciferasa, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, nanopartmulas, biotina, digoxigenina) o una combinacion de las mismas.
Las enzimas que pueden utilizarse como agentes de diagnostico de acuerdo con las formas de realizacion de la descripcion incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, fosfatasa acida, glucosa oxidasa, p-galactosidasa, p-glucoronidasa o p-lactamasa. Dichas enzimas se pueden utilizar en combinacion con un cromogeno, un compuesto fluorogenico o un compuesto luminogenico para generar una senal detectable.
Aunque no entra dentro del ambito de la invencion tal como se reivindica, en el presente documento tambien se describe un conjugado anti-FOXCI que puede incluir un anticuerpo FOXC1 o fragmento de anticuerpo FOXC1 funcional conjugado con un agente terapeutico. Un "agente terapeutico" tal como se utiliza en la presente memoria es un atomo, molecula, compuesto u otra sustancia que es util en el tratamiento del cancer u otras afecciones asociadas con FOXC1. Ejemplos de agentes terapeuticos incluyen, pero sin limitarse a, farmacos, agentes quimioterapeuticos, anticuerpos terapeuticos y fragmentos de anticuerpos, toxinas, radioisotopos, enzimas (por ejemplo, enzimas para escindir los profarmacos a un agente citotoxico en el sitio del tumor), nucleasas, hormonas, inmunomoduladores, oligonucleotidos antisentido, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos y colorantes.
Los agentes quimioterapeuticos son a menudo citotoxicos o citostaticos por naturaleza y pueden incluir agentes alquilantes, antimetabolitos, antibioticos antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, terapia hormonal con inhibidores mitoticos, terapeutica dirigida e inmunoterapeuticos. En algunas formas de realizacion, los agentes quimioterapeuticos que pueden utilizarse como agentes terapeuticos de acuerdo con las formas de realizacion de la descripcion incluyen, pero no se limitan a, acido 13-cis-retinoico, 2- clorodeoxiadenosina, 5-azacitidina, 5-fluorouracilo, 6-Mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina-D, adriamicina, aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoma, acido totalmente transretinoico, alfa interferon, altretamina, ametopterina, amifostina, anagrelida, anastrozol, arabinosilcitosina, trioxido de arsenico, amsacrina, aminocamptotecina, aminoglutetimida, asparaginasa, azacitidina, bacilo calmante-guerin (BCG), bendamustina, bevacizumab, bexaroteno, bicalutamida, bortezomib, bleomicina, busulfan, leucovorina de calcio, factor citrovorum, capecitabina, canertinib, carboplatino, carmustina, cetuximab, clorambucil, cisplatino, cladribina, cortisona, ciclofosfamida, citarabina, darbepoetina alfa, dasatinib, daunomicina, decitabina, denileucina diftitox, dexametasona, dexasona, dexrazoxano, dactinomicina, daunorrubicina, decarbazina, docetaxel, doxorubicina, doxifluurina, eniluracilo, epirubicina, epoetina alfa, erlotinib, everolimus, exemestano, estramustina, etoposido, filgrastim, fluoxesterona, fulvestrante, flavopiridol, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo , flutamida, gefitinib, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, goserelina, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de macrofagos de granulocitos, hexametilmelamina, hidrocortisona, hidroxiurea, ibritumomab, interferon alfa, interleucina-2, interleucina-11, isotretinoma, ixabepilona, idarubicina, mesilato de imatinib, ifosfamida,
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irinotecan, lapatinib, lenalidomida, letrozol, leucovorina, leuprolida, Ara-C liposomal, lomustina, mecloretamina, megastrol, melfalan, mercaptopurina, mesna, metotrexato, metilprednisolona, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nelarabina, nilutamida, octreotido, oprelvekin, oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato, pemetrexed, panitumumab, PEG Interferon, pegaspargasa, pegfilgrastim, PEG-L- asparaginasa, pentostatina, plicamicina, prednisolona, prednisona, procarbazina, raloxifeno, rituximab, romiplostim, ralitrexed, sapacitabina, sargramostim, satraplatino, sorafenib, sunitinib, semustina, estreptozocina, tamoxifeno, tegafur, tegafur-uracilo, temsirolimus, temozolamida, teniposido, talidomida, tioguanina, tiotepa, topotecan, toremifeno, tositumomab, trastuzumab, tretinoma, trimitrexato, alrubicina, vincristina, vinblastina, vindestina, vinorelbina, vorinostat o acido zoledronico.
En el presente documento tambien se describe que los anticuerpos terapeuticos y sus fragmentos funcionales que pueden utilizarse como agentes de diagnostico de acuerdo con las formas de realizacion de la descripcion, incluyen, pero sin limitacion, alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab, edrecolomab, gemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, panitumumab, rituximab, tositumomab y trastuzumab
Asimismo, en el presente documento tambien se describe que las toxinas que pueden usarse como agentes de diagnostico de acuerdo con las formas de realizacion de la descripcion incluyen, pero no se limitan a, ricina, abrina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina-estafilococal A, protema antiviral de phytolacca americana, gelonina, toxina difterica, Exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas.
Los radioisotopos que pueden utilizarse como agentes de diagnostico de acuerdo con las formas de realizacion de la descripcion incluyen, pero no se limitan a, 32P, 89Sr, 90Y. 99mTc, “Mo, 131I, 153Sm, 177Lu, 186Re, 213Bi, 223Ra y 225Ac.
En otra forma de realizacion, el conjugado anti-FOXCI puede incluir un anticuerpo FOXC1 conjugado a una nanopartfcula. El termino nanopartfcula se refiere a una partfcula microscopica, cuyo tamano se mide en nanometros, por ejemplo, una partfcula con al menos una dimension inferior a aproximadamente 100 nm. Las nanopartfculas son particularmente utiles como sustancias detectables porque son lo suficientemente pequenas para dispersar la luz visible en lugar de absorberla. Por ejemplo, las nanopartfculas de oro poseen propiedades de extincion de luz visible significativas y aparecen de color rojo oscuro a negro en solucion. Como resultado, pueden utilizarse composiciones que comprenden anticuerpo espedfico de FOXC1 o fragmentos conjugados a nanopartfculas para la formacion de imagenes in vivo de tumores o celulas cancerosas en un sujeto. En el extremo pequeno de la gama de tamanos, las nanopartfculas se denominan a menudo como racimos. Se han formado nanopartfculas de metal, dielectricas y semiconductoras, asf como estructuras fnbridas (por ejemplo nanopartfculas nucleo-envoltura). Las nanoesferas, nanobarras y nanocopas son solo algunas de las formas que han sido creadas. Los puntos cuanticos y los nanocristales semiconductores son ejemplos de tipos adicionales de nanopartfculas. Dichas partfculas de nanoescala, cuando se conjugan con un anticuerpo FOXC1, pueden utilizarse como agentes de formacion de imagenes para la deteccion in vivo de celulas tumorales tal como se ha descrito anteriormente. En el presente documento tambien se describe que las nanopartfculas pueden utilizarse en aplicaciones terapeuticas como vefnculos farmacos que, cuando se conjugan con un anticuerpo o fragmento espedfico de PSCA de la presente invencion, administran agentes quimioterapeuticos, agentes terapeuticos hormonales, agentes radioterapeuticos, toxinas o cualquier otro agente citotoxico o agente anticancengeno conocido en la tecnica a celulas cancerosas que sobreexpresan PSCA sobre la superficie celular.
En el presente documento tambien se describe que cualquiera de los conjugados anti-FOXCI descritos anteriormente puede conjugarse adicionalmente con uno o mas agentes terapeuticos adicionales, agentes de diagnostico, nanopartfculas, vefnculos o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, un anticuerpo FOXC1 o fragmento de anticuerpo FOXC1 funcional puede radiomarcarse con 131I y conjugarse con un vehfculo lipfdico, de manera que el conjugado anti-FoXC1-lfpido forme una micela. La micela puede incorporar uno o mas agentes terapeuticos o de diagnostico. Alternativamente, ademas del vehfculo, el anticuerpo FOXC1 o fragmento de anticuerpo FOXC1 funcional puede conjugarse a 131I (por ejemplo, en un residuo de tirosina) y un farmaco (por ejemplo, en el grupo amino epsilon de un residuo de lisina) y el vehfculo puede incorporar un agente terapeutico o de diagnostico adicional.
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Metodos para diagnosticar
Se puede utilizar un anticuerpo FOXC1 funcional tal como los descritos anteriormente para dirigirse a una celula positiva de FOXC1, como por ejemplo celulas de cancer que expresan o sobreexpresan FOXC1. Se ha demostrado que la expresion de FOXCl define subconjuntos agresivos biologicamente y clmicamente en varios tipos de cancer y puede utilizarse tanto como biomarcador diagnostico como pronostico. FOXC1 es tambien un objetivo terapeutico adecuado para el cancer, tal como se describe mas adelante. Los canceres que estan asociados con la expresion de FOXC1 pueden incluir, pero no se limitan a, tumores cerebrales (como por ejemplo glioblastoma multiforme o astrocitoma), cancer de mama, cancer de colon, cancer gastrico, leucemia, melanoma, tumores neuroendocrinos, cancer de prostata (como por ejemplo cancer de prostata resistente a los androgenos), cancer de celulas renales y sarcomas (como por ejemplo sarcoma sinovial).
En particular, la expresion de FOXC1 es un biomarcador teranostico importante que puede utilizarse para definir clmicamente, diagnosticar el pronostico y tratar el cancer de mama basal de tipo primario y metastasico y los subtipos basales similares relacionados. La relacion entre la expresion de FOXC1 y su papel en el cancer de mama de tipo basal se describe con detalle en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US10/44817, presentada el 6 de agosto de 2010. En pocas palabras, FOXC1 se eleva solo en basal-como los subtipos moleculares de los canceres de mama, y ha demostrado ser de alto significado pronostico, ya que es predictivo de la alta mortalidad y la tasa de metastasis espedficamente asociada con los canceres de mama de tipo basal.
Por lo tanto, un anticuerpo FOXC1 de acuerdo con la reivindicacion 1 se utiliza en metodos para diagnosticar, cancer de mama basal de tipo primario y metastasico de acuerdo con la reivindicacion 4. En una forma de realizacion, el anticuerpo FOXC1 es un anticuerpo monoclonal FOXC1 que se produce mediante una lmea celular de hibridoma.
El anticuerpo FOXC1 descrito en el presente documento puede utilizarse para detectar celulas que expresan o sobreexpresan FOXC1. Esto se logra poniendo en contacto una o mas celulas de cancer de mama en una muestra biologica con el anticuerpo FOXC1 o fragmento de anticuerpo funcional. En algunas formas de realizacion, la muestra biologica puede ser por cualquier muestra biologica que contiene o se sospecha que contiene celulas de cancer de mama incluyendo, pero sin limitarse a tumores primarios o metastasicos, sangre, suero, plasma, linfa, ganglios linfaticos, lfquido cefalorraqrndeo, medula osea, lfquido intersticial y orina. En algunas formas de realizacion, la muestra biologica puede ser eliminada de un sujeto que tiene cancer de mama o que se sospecha que tiene cancer. En el presente documento tambien se describe que la muestra biologica que contiene o se sospecha que contiene celulas de cancer de mama puede ser retirada de un sujeto que tiene cancer de mama o que se sospecha que tiene cancer de mama. En los presentes metodos de diagnostico, el anticuerpo FOXCl se conjuga con un agente de diagnostico para permitir detectar la presencia o ausencia de FOXC1 en las celulas de cancer de mama. El agente diagnostico puede ser cualquier sustancia radioactiva adecuada, colorantes, agente de contraste, compuesto o molecula fluorescente, compuesto o molecula bioluminiscente, enzima o agente potenciador descrito en detalle anteriormente o de otro modo conocido en la tecnica. El conjugado anti-FOXCI diagnostico puede conjugarse o asociarse con una o mas sustancias adicionales descritas en el presente documento, como por ejemplo lfpidos vehmulos o nanopartmulas.
La deteccion de FOXC1 puede realizarse mediante cualquier metodo in vitro o in vivo adecuado. En una forma de realizacion, se realizara un inmunoensayo de diagnostico in vitro para determinar el nivel de expresion de FOXC1 en una muestra de tejido que contiene celulas de cancer (por ejemplo, celulas de cancer de mama). La muestra de tejido puede tomarse de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene un cancer asociado con FOXC1 (por ejemplo, cancer de mama) y se compara con una muestra de tejido normal (es decir, no canceroso) o una muestra de tejido de control (por ejemplo, una muestra de tejido benigno o canceroso conocido). En otras formas de realizacion, la muestra de tejido se puede analizar en cuanto a la presencia o ausencia de FOXC1.
La deteccion de la presencia o ausencia de FOXC1 o la deteccion de un nivel de expresion de FOXC1 en una muestra de tejido se lleva a cabo mediante cualquier inmunoensayo in vitro adecuado, como por ejemplo inmunohistoqmmico, inmunocitoqmmico, hibridacion fluorescente in situ (FISH) u otras tinciones de inmunofluorescencia y transferencias de Western. Debido a que las membranas de plasma no son generalmente permeables a anticuerpos, protemas, peptidos, farmacos y otras sustancias terapeuticas, los inmunoensayos in vitro que utilizan los contenidos de celulas enteras o preparaciones de celulas enteras (por ejemplo, inmunocitoqmmica, tincion de inmunofluorescencia, transferencia de Western) debenan includir una fase para el lisado o permeabilizacion de las celulas en la muestra de tejido para permitir que el anticuerpo FOXCl o fragmento de anticuerpo funcional alcance su objetivo intracelular, FOXC1.
En otra forma de realizacion, el metodo de formacion de imagenes puede incluir imagen de resonancia magnetica (MRI), tomograffa de emision de positrones (PET) o microPET, tomograffa computerizada (CT),
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marcador de combinacion PET/CT, dispositivo cargado acoplado refrigerado (CCD), imagenes opticas de camara, imagenes opticas y tomograffa computerizada de emision de foton simple (SPECT).
Las membranas de plasma celular generalmente no son permeables a anticuerpos, protemas, peptidos, farmacos y otras sustancias terapeuticas. Por lo tanto, en algunos metodos de creacion de imagen, el conjugado anti-FOXCI diagnostico debe administrarse de forma intracelular. De acuerdo con algunas formas de realizacion, el conjugado anti-FOXCI puede administrarse intracelularmente por conjugacion o asociacion con un agente de administracion intracelular o un vehmulo. En una forma de realizacion, el agente o vehmulo de administracion puede incluir un peptido penetrante de celulas o un reactivo de administracion. Los peptidos penetrantes de celulas que pueden usarse para formar un conjugado anti- FOXCI para administracion intracelular incluyen, pero no se limitan a, protema TAT y protema Pep-1. Otros agentes de administracion que pueden utilizarse para suministrar el anticuerpo FOXC1 o el fragmento funcional que contiene incluyen, pero no se limitan a, nanopartmulas, lfpidos cationicos, poli-L-arginina; farmacos liposomicos y vehmulos polimericos (por ejemplo, poli (acido propil acnlico) (PPAA). En otras formas de realizacion, el conjugado anti-FOXCI puede administrarse intracelularmente mediante cualquier otro metodo adecuado, por ejemplo, terapia genica, administracion de material genetico a traves de un vector viral, mediada por el receptor endocitosis y produccion de intracuerpos.
Ademas de diagnosticar un cancer asociado con la expresion de FOXC1, en el presente documento tambien se describe que el conjugado anti-FOXCI tambien puede utilizarse para estadificar y monitorizar la progresion del cancer de acuerdo con metodos que son similares a los descritos anteriormente.
Metodos para el tratamiento del cancer
Aunque no entran dentro del ambito de la invencion tal como se reivindica, en el presente documento tambien se describen algunos metodos para tratar el cancer u otras condiciones asociadas con la sobreexpresion de FOXC1. Tales metodos incluyen administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que incluye un anticuerpo FOXC1 o un fragmento de anticuerpo FOXC1 funcional tal como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo FOXC1 puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo modificado o un fragmento de anticuerpo funcional tal como se ha descrito con detalle anteriormente.
Cuando se administra un anticuerpo FOXC1 como parte de una composicion farmaceutica, se debe administrar intracelularmente. Tal como se ha descrito anteriormente, la administracion intracelular del anticuerpo FOXC1 puede realizarse por conjugacion o asociacion con un agente de administracion intracelular o un vehmulo o por cualquier otro metodo adecuado conocido en la tecnica. Por lo tanto, el anticuerpo FOXC1 o el fragmento funcional se puede conjugar con un agente de administracion intracelular para permitir la administracion del anticuerpo al citoplasma de las celulas.
"Tratar" o "tratamiento" de una afeccion puede referirse a prevenir la afeccion, retardar la aparicion o tasa de desarrollo de la afeccion, reducir el riesgo de desarrollar la afeccion, prevenir o retrasar el desarrollo de los smtomas asociados con la afeccion, reducir o finalizar los smtomas asociados con la afeccion, generando una regresion completa o parcial de la enfermedad, o alguna combinacion de los mismos.
Una "cantidad terapeuticamente eficaz" o una "dosis terapeuticamente eficaz" es una cantidad de un compuesto que produce un efecto terapeutico deseado en un sujeto, como por ejemplo prevenir o tratar una condicion objetivo o aliviar los smtomas asociados con la afeccion. La cantidad terapeuticamente eficaz precisa es una cantidad de la composicion que producira los resultados mas efectivos en terminos de eficacia del tratamiento en un sujeto determinado. Esta cantidad variara dependiendo de una variedad de factores, incluyendo pero no limitandose a las caractensticas del compuesto terapeutico (incluyendo actividad, farmacocinetica, farmacodinamica y biodisponibilidad), la condicion fisiologica del sujeto (incluyendo la edad, sexo, tipo y etapa de la enfermedad, estado ffsico general, capacidad de respuesta a una dosis dada y tipo de medicamento), la naturaleza del vehmulo o vehmulos farmaceuticamente aceptables en la formulacion, y la via de administracion. Un experto en las tecnicas clmicas y farmacologicas sera capaz de determinar una cantidad terapeuticamente eficaz mediante la experimentacion rutinaria, es decir, monitorizando la respuesta de un sujeto a la administracion de un compuesto y ajustando la dosis en consecuencia. Para obtener orientacion adicional, vease Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21a Edicion, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005.
La composicion farmaceutica puede incluir un anticuerpo FOXC1, un anticuerpo modificado o un fragmento de anticuerpo funcional por sf mismo o un conjugado terapeutico anti-FOXCI. El conjugado puede incluir un anticuerpo FOXC1, un anticuerpo modificado o un fragmento de anticuerpo funcional conjugado con uno o mas agentes terapeuticos tal como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo FOXC1 o un fragmento de anticuerpo FOXC1 funcional es un anticuerpo monoclonal FOXC1 producido por una lmea celular de hibridoma y se une espedficamente a una secuencia de peptidos antigenicos objetivo (por ejemplo, SEQ ID NO:2-3).
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Un anticuerpo FOXC1, un anticuerpo modificado o un fragmento de anticuerpo funcional o un conjugado terapeutico anti-FOXCI pueden conjugarse o asociarse con una o mas sustancias adicionales descritas en la presente memoria, tales como conjugados anti-FOXCI de diagnostico (descritos anteriormente), agentes de diagnostico no conjugados, soluciones de contraste, lfpidos vehmulos o nanopartmulas.
La composicion farmaceutica tambien puede incluir un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Un vehmulo farmaceuticamente aceptable puede ser un material, composicion o vehmulo farmaceuticamente aceptable que este implicado en vehicular o transportar un compuesto de interes desde un tejido, organo o parte del cuerpo a otro tejido, organo o parte del cuerpo. Por ejemplo, el vehmulo puede ser un relleno, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante lfquido o solido, o alguna combinacion de los mismos. Cada componente del soporte debe ser "farmaceuticamente aceptable" en que debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion. Tambien debe ser adecuado para el contacto con cualquier tejido, organo o parte del cuerpo que pueda encontrar, lo que significa que no debe implicar un riesgo de toxicidad, irritacion, respuesta alergica, inmunogenicidad o cualquier otra complicacion que supere excesivamente sus beneficios terapeuticos.
Las composiciones farmaceuticas descritas en la presente invencion pueden administrarse por cualquier via de administracion adecuada. Una via de administracion puede referirse a cualquier via de administracion conocida en la tecnica, incluyendo pero sin limitarse a aerosol, enteral, nasal, oftalmica, oral, parenteral, rectal, transdermica (por ejemplo, crema o unguento topico, parche) o vaginal. La administracion "transdermica" puede realizarse utilizando una crema topica o una pomada o por medio de un parche transdermico. "Parenteral" se refiere a una via de administracion que esta generalmente asociada con inyeccion, incluyendo infraorbitaria, infusion, intraarterial, intracapsular, intracardfaca, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intrapulmonar, intraespinal, intraesternal, intratecal, intrauterina, intravenosa, subaracnoide, subcapsular, subcutanea, transmucosal o transtraqueal.
Ejemplo 1 Generacion de un anticuerpo monoclonal FOXC1
Se genero un anticuerpo anti-FOXCI tal como se describe a continuacion.
Diseno de la secuencia de peptidos antigenicos. Se diseno una secuencia de peptidos antigenicos utilizando la suite de software Lasergene de DNASTAR™. El software se utilizo para determinar las regiones de la protema FOXC1 que maximizan la hidrofilicidad (H), la antigenicidad (A) y la probabilidad de superficie (SP), pero no contienen giros ni sitios de glicosilacion. Ademas, se realizaron busquedas BLAST contra bases de datos geneticas para asegurar que la homologfa de estos peptidos con otros genes de la familia FOX es baja. Basandose en los resultados del proceso de diseno descrito anteriormente, los residuos 51-75 de la protema FOXC1 humana se seleccionaron como la secuencia de peptidos antigenicos tal como se muestra a continuacion:
5'-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:2)
Se anadio un residuo de cistema al terminal N (mostrado mas abajo) para ayudar a la conjugacion con la protema vehmuloa segun sea necesario.
5'-C-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:3)
Esta secuencia peptfdica antigenica se encuentra en el dominio de transactivacion N-terminal FOXC1. Informes anteriores han sugerido que el dominio FOXC1 N-terminal juega un papel importante en la funcion de FOXC1 en la activacion transcripcional (Berry et al., 2002). Por lo tanto, los anticuerpos FOXC1 que se unen espedficamente a este dominio no solo son utiles en ensayos diagnosticos y pronosticos, sino que son propensos a ser buenos candidatos para tratar canceres de mama basales, asf como otros canceres que estan asociados con la expresion o sobreexpresion de FOXC debido a que bloquean la actividad de FOXC1.
Produccion de hibridomas y anticuerpos. La generacion de hibridomas y anticuerpos se contrato a traves de Pro-Sci Inc. En resumen, se inyectaron ratones Balb / c con la secuencia de antfgeno de peptido FOXC1 descrita anteriormente para generar linfocitos que producen o son capaces de producir un anticuerpo monoclonal complementario. A continuacion, se seleccionaron ratones inmunizados con altos tftulos de respuesta de anticuerpos anti-FOXCI y senales de inmunotransferencia positiva mediante ELISA e inmunotransferencia,
A continuacion se genero la lmea celular de hibridoma B2E3 fusionando celulas de mieloma con celulas B aisladas del bazo de los ratones inmunizados seleccionados. Despues se utilizaron ELISA y inmunotransferencia para seleccionar los clones de celulas de hibridoma positivos, seguidos de dos subclonaciones consecutivas. Basandose en los resultados de inmunotransferencia, se expandieron en cultivo varios clones positivos que inclrnan la lmea celular de hibridoma B2E3. Los anticuerpos producidos por los clones se purificaron usando una columna de purificacion de IgG.
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Los anticuerpos producidos por los hibridomas tal como se ha descrito anteriormente pueden utilizarse para la deteccion de la protema FOXC1 y para acoplar otras moleculas a la protema FOXC1. Ademas, se ensayo el anticuerpo anti-FOXC1 mediante inmunotransferencia, inmunofluorescencia e inmunohistoqmmica tal como se describe a continuacion.
Inmunotransferencia. Se transfectaron celulas de cancer de mama humano MCF-7 con vectores FOXC1 (+) o FOXC1 (-). Se generaron lisados de celulas enteras para transferencia Western por tampon de lisis celular (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, NP-40 al 1%, glicerol al 10%) suplementado con un coctel inhibidor de proteasa (Sigma, St Louis, MO). Se separaron cantidades iguales de protema mediante SDS-PAGE al 10% y a continuacion se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Los pasos restantes se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo estandar de inmunotransferencia (Qu et al., 2009). La inmunotransferencia se realizo con anticuerpos policlonales comerciales FOXC1 (Santa Cruz Biotechnology), y los anticuerpos monoclonales FOXC1 aislados de la lmea celular de hibridoma B2E3. Despues de la incubacion del anticuerpo primario, la membrana se lavo de nuevo con PBST tres veces (5 min cada una) y luego se incubo con un anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rabano picante (HRP) (Amersham, Piscataway, NJ) a una dilucion de 1:4000 en una solucion de bloqueo. La membrana se lavo y las bandas se visualizaron utilizando ensayos de quimioluminiscencia.
Tal como se muestra en la Figura 1, el anticuerpo monoclonal FOXC1 aislado a partir de la lmea celular de hibridoma B2E3 produjo menos bandas no especificas en comparacion con un anticuerpo policlonal comercial anti-FOxC1 de Santa Cruz Biotechnology Inc. Otros anticuerpos comerciales anti-FOXC1 disponibles producinan resultados similares o menos deseables en comparacion con el anticuerpo anti- FOXC1 de Santa Cruz en terminos de especificidad y sensibilidad. Por lo tanto, el anticuerpo FOXC1 descrito en el presente documento es mas sensible y es superior como herramienta diagnostica y pronostica que los anticuerpos que se encuentran actualmente disponibles.
Coloracion por inmunofluorescencia. Las celulas MCF-7 se transfectaron transitoriamente con el plasmido GFP-FOXC1 durante 24 h. A continuacion, las celulas se digirieron con tripsina y se sembraron en portaobjetos de camara (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) (Figura 2A). Despues de 12 horas de incubacion, las celulas se fijaron con formaldetndo al 4% y a continuacion se permeabilizaron con PBS que contema 0.1% de Triton X-100. Los portaobjetos se bloquearon con BSA al 5% durante 30 minutos y se incubaron con un anticuerpo monoclonal primario FOXC1 aislado de la lmea celular de hibridoma B2E3 a temperatura ambiente durante 1 h. Las celulas se incubaron despues con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (1:200, Invitrogen) durante 30 min (Figura 2B). Los portaobjetos se lavaron con PBS tres veces durante 5 minutos cada uno, se montaron en DAPI y se observaron bajo un microscopio Nikon Tl-E de alta resolucion (Figura 2C). Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 2.
Inmunohistoqumica. La inmunohistoqmmica (IHC) se realizo de acuerdo con protocolos estandar, con la excepcion de: (1) la recuperacion del anrtgeno se realizo durante 30 minutos a 100°C en tampon citrato (pH 6,0); (2) los anticuerpos anti-FOXC1 de raton primario se hibridaron durante 16 horas a 4°C (durante la noche); y (3) el reactivo de marcado usado fue un anticuerpo anti-raton basado en polfmero (BioCare) con cromogeno DAB. La presencia de FOXC1 en tejidos de cancer de mama (FOXC1+ y FOXC1-) tejidos se muestra en la Figura 3.
REFERENCIAS
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> JOHN WAYNE CANCER INSTITUTE Cui, Xiaojiang
<120 FOXC1 ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
<130 79877.8002.WO00
<150> 61/439,825 <151> 2011-02-04
<160> 3
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 553
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<300>
<308> GenBank/AAH70124 <309> 2006-07-15 <313> (1 )..(553)
<400> 1

Claims (10)

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    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo aislado que se une a una secuencia de peptidos antigenicos correspondiente al dominio de transactivacion N-terminal de FOXC1 humano, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, en que la secuencia de peptidos antigenicos comprende los aminoacidos 51-75 de FOXC1 humano (SEQ ID NO:1), y en que el anticuerpo aislado se utiliza para detectar FOXC1 en un inmunoensayo in vitro.
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en que el anticuerpo es producido por una lmea celular de hibridoma.
  3. 3. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la secuencia peptfdica antigenica es:
    5'-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:2); o 5'-C-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:3).
  4. 4. Un metodo in vitro para diagnosticar un cancer de mama de tipo basal en un sujeto que tiene cancer de mama o que se sospecha que tiene cancer de mama, en que el metodo comprende:
    poner en contacto una o mas celulas de cancer de mama en una muestra biologica con un anticuerpo FOXC1 conjugado con un agente diagnostico; en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, y en que el anticuerpo FOXC1 une una secuencia de peptidos antigenicos que corresponde al dominio de transactivacion N-terminal del FOXC1 humano y que comprende aminoacidos 51-75 de FOXC1 humano (SEQ ID NO:1); detectar la presencia o ausencia de FOXC1 en una o mas celulas de cancer de mama; y diagnosticar que el sujeto tiene un cancer de mama de tipo basal cuando FOXC1 esta presente.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en que la muestra biologica es una muestra tumoral primaria o metastasica, una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de plasma, una muestra de linfa, una muestra de ganglio linfatico, una muestra de lfquido cefalorraqmdeo, una muestra de medula osea, una muestra de fluido intersticial o una muestra de orina.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 4, en que el agente de diagnostico es una sustancia radiactiva, agente de contraste de colorantes, compuesto o molecula fluorescente, compuesto o molecula bioluminiscente, enzima o agente potenciador.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 4, en que la deteccion de la presencia o ausencia de FOXC1 se logra mediante un inmunoensayo in vitro, en que el inmunoensayo in vitro se selecciona de forma opcional entre inmunocitoqmmico (ICC), inmunohistoqmmico (IHC), Western blot o hibridacion fluorescente in situ (FISH).
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, que comprende ademas:
    lisado o permeabilizacion de una o mas celulas de cancer de mama cuando el inmunoensayo in vitro utiliza el contenido de celulas enteras o preparaciones de celulas enteras.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 4, en que el anticuerpo FOXC1 se conjuga con un agente de administracion intracelular.
  10. 10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en que la secuencia de peptidos antigenicos es:
    5'-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:2); o 5'-C-AHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKD-3' (SEQ ID NO:3).
    FOXC1

    250 kD------►

    150 KD------►

    100 KD------►

    75 KD------►

    50 KD------►

    37 KD------►

    25 KD------►
    Anti- FOXC1 monoclonal (B2E3)
    1:100 + -
    imagen1
    Anti- FOXC1 policlonal (Santa Cruz)
    1:100
    +
    imagen2
    Figura 1
    Contraste de
    Anti- FOXC1
    Fases
    monoclonal
    imagen3
    Figura 2
    imagen4
    Figura 3
    Figura 4: Secuencia de Aminoacidos de FOXC1 humano (SEQ ID NO:1)

    MQARYSVSSPNSLGVVPYLGGEQSYYRAAAAAAGGGYTAMPAPMSVYSHP 10 20 30 40 50
    AHAEOYPGGMARAYGPYTPOPOPKDMVKPPYSYIALITMAIONAPDKKIT

    60 70 80 90 100
    LNGIYQFIMDRFPFYRDNKQGWQNSIRHNL SLNECFVKVPRDDKKPGKGS

    110 120 130 140 150
    YWTLDPDSYNMFENGSFLRRRRRFKKKDAVKDKEEKDRLHLKEPPPPGRQ

    160 170 180 190 200
    PPPAPPEQADGNAPGPQPPPVRIQDIKTENGTCPSPPQPLSPAAALGSGS

    210 220 230 240 250
    AAAVPKIESPDSSSSSLSSGSSPPGSLPSARPLSLDGADSAPPPPAPSAP

    260 270 280 290 300
    PPHHSQGFSVDNIMTSLRGSPQSAAAELSSGLLASAAASSRAGIAPPLAL

    310 320 330 340 350
    GAYSPGQSSLYSSPCSQTSSAGSSGGGGGGAGAAGGAGGAGTYHCNLQAM

    360 370 380 390 400
    SLYAAGERGGHLQGAPGGAGGSAVDNPLPDYSLPPVTSSSSSSLSHGGGG

    410 420 430 440 450
    GGGGGGQEAGHHPAAHQGRLTSWYLNQAGGDLGHLASAAAAAAAAGYPGQ

    460 470 480 490 500
    QQNFHSVREMFESQRIGLNNSPVNGNSSCQMAFPSSQSLYRTSGAFVYDC

    510 520 530 540 550
    SKF
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