ES2641787T3 - Procedimientos de tratamiento de dolor por osteoartritis administrando un antagonista del factor de crecimiento nervioso y composiciones que contienen el mismo - Google Patents

Abstract

Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista anti-NGF en la fabricación de un medicamento para mejorar la función física en un individuo que tiene osteoartritis.

Description

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selecciona independientemente de la selección de un aminoácido en cualquier otra localización.

En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a NGF (tal como NGF humano). En algunas realizaciones, los anticuerpos comprenden cualquiera de las configuraciones de CDR (incluyendo combinaciones, variaciones, etc.) descritas en este documento.

Como es evidente de la descripción en este documento, la numeración de la región variable usada en este documento es la numeración secuencial. Un experto en la materia entiende fácilmente que existen varios sistemas de numeración de anticuerpos (tales como la numeración de Kabat y de Chothia), y cómo convertir la numeración secuencial en otro sistema de numeración, tal como la numeración de Kabat o la numeración de Chothia.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una secuencia de CDR3) seleccionada de SEC ID Nº: 46 ó 50. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 3, 4, 5, 6, 7 y 8. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 9, 10, 11, 12, 13, 14 y

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En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR, tal como una región CDRH1 y/o CDR H2) seleccionada de (a) SEC ID Nº: 28 y/o 29; (b) SEC ID Nº: 30 y/o 31; (c) SEC ID Nº: 32 y/o 33; (d) SEC ID Nº: 34 y/o 35; (e) SEC ID Nº: 36 y/o 37; (f) SEC ID Nº: 38 y/o 39; y (g) SEC ID Nº: 40 y 41. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR H1) seleccionada de SEC ID Nº: 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 40. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR H2) seleccionada de SEC ID Nº: 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 3, 4, 5, 6, 7 y 8. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR, tal como una región CDR L1 y/o CDR L2) seleccionada de (a) SEC ID Nº: 18 y/o 19; (b) SEC ID Nº: 20 y/o 21; y (c) SEC ID Nº: 22 y/o 23. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR L1) seleccionada de SEC ID Nº: 18, 20 y 22. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR L2) seleccionada de SEC ID Nº: 19, 21 y 23. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 3, 4, 5, 6, 7,

8. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR, tal como una región CDRL3 y/o CDR H3) seleccionada de (a) SEC ID Nº: 51 y/o 52; (b) SEC ID Nº: 55 y/o 56; (c) SEC ID Nº: 57 y/o 58; (c) SEC ID Nº: 59 y/o 60; (d) SEC ID Nº: 61 y/o 62; (e) SEC ID Nº: 63 y/o 64. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR L3) seleccionada de SEC ID Nº: 51, 55, 57, 59, 61 y 63. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR H3) seleccionada de SEC ID Nº: 52, 56, 58, 60, 62 y 64. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende además una secuencia de aminoácidos mostrada en una o más de SEC ID Nº: 18, 19, 30 y 31. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 3, 4, 5, 6, 7 y 8. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende además una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una o más de una secuencia de aminoácidos (tal como una región CDR) mostrada en SEC ID Nº: 61, 63, 18, 19, 30 y 31.

En un aspecto, el anticuerpo antagonista anti-NGF se une a NGF (tal como NGF humano) con alta afinidad. En algunas realizaciones, alta afinidad es (a) unión a NGF con una KD inferior a aproximadamente 2 nM (tal como cualquiera de aproximadamente 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, o menos), y/o una Kdis más lenta de aproximadamente 6x10-5 s-1); y/o (b) inhibición (reducción y/o bloqueo) de la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 15 pM de NGF) de aproximadamente cualquiera de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM, o menos; y/o (c) inhibición (reducción y/o bloqueo) de la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 1,5 pM de NGF) de aproximadamente cualquiera de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM, o menos; y/o (d) inhibición (reducción y/o bloqueo) de la supervivencia dependiente de NGF de rata de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 15 pM de NGF) de aproximadamente cualquiera de 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, o menos; y/o (e) inhibición (reducción y/o bloqueo) de la supervivencia dependiente de NGF de rata de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 1,5 pM de NGF) de aproximadamente cualquiera de 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM, o menos; y/o (f) y/o unión a NGF con mayor afinidad que el receptor trkA.

En otro aspecto, los anticuerpos (a) se unen a NGF (tal como NGF humano) con una KD inferior a aproximadamente

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el anticuerpo E3 (como se ha descrito anteriormente). FIGURA 1B: muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 (marcada “5” o “4 + L3 de maduración por afinidad). Las CDR de Chothia y las CDR de Kabat se representan por texto subrayado y texto en negrita y en cursiva, respectivamente. La Figura 1B también muestra el alineamiento de las siguientes secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera: (2) secuencia del aceptor de la línea germinal humana 08 (marcada “08” o “2”) (SEC ID Nº: 73); (3) las secuencias del aceptor injertadas con las CDR extendidas del anticuerpo 911 de ratón (marcada “CDR injertada” o “3”) (SEC ID Nº: 74); (4) secuencias del aceptor injertado de CDR (marcada “3 + L1, L2 de maduración por afinidad”

o “4”) (SEC ID Nº: 75); (5) el clon que contiene CDR L1 y L2 maduradas por afinidad (marcada “5” o “4 + L3 de maduración por afinidad”); y el anticuerpo E3 (como se ha descrito anteriormente). FIGURA 2: muestra un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo E3 (SEC ID Nº: 76). FIGURA 3: muestra un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 (SEC ID Nº: 77). FIGURA 4: es una gráfica que representa la supervivencia dependiente de NGF de neuronas E13.5 en presencia de concentración variable de NGF humano y de rata. El eje X se corresponde con la concentración de NGF (ng/ml) y el eje Y se corresponde con las neuronas contadas. FIGURA 5: es una gráfica que compara el efecto de bloqueo de NGF de diversos Fab en presencia de tanto 0,04 ng/ml de NGF humano (aproximadamente 1,5 pM; mostrado en el panel inferior) como 0,4 ng/ml de NGF humano (aproximadamente 15 pM; mostrado en el panel superior). Se evaluó la supervivencia de neuronas trigeminales de ratón E13.5 en diversas concentraciones de Fab E3; Fab 911 murino; y Fab H19-L129 y Fab 8L2-6D5. La CI50 (en pM) se calculó para cada Fab a cada concentración de NGF, y se muestra en la Tabla 9. Fab E3 bloqueó fuertemente la supervivencia de neuronas trigeminales dependiente de NGF humano, con una CI50 de aproximadamente 21 pM en presencia de NGF humano 15 pM, y una CI50 de aproximadamente 1,2 pM en presencia de NGF humano 1,5 pM. Fab 3C y H19-L129 también bloquearon fuertemente la supervivencia de neuronas trigeminales dependiente de NGF humano. En ambos paneles, el eje X se corresponde con la concentración de anticuerpo (nM) y el eje Y se corresponde con las neuronas contadas. 1,5 pM de NGF fue aproximadamente la CI50, mientras que 15 pM representó una concentración saturante de NGF. FIGURA 6: es una gráfica que compara el efecto de bloqueo de NGF de diversos Fab en presencia de tanto 0,04 ng/ml de NGF de rata (aproximadamente 1,5 pM; mostrado en el panel inferior) como 0,4 ng/ml de NGF de rata (aproximadamente 15 pM; mostrado en el panel superior). La supervivencia de neuronas trigeminales de ratón E13.5 en diversas concentraciones de Fab E3; Fab 911 murino; y Fab H19-L129 y 8L2-6D5 se evaluó como se ha descrito anteriormente. La CI50 (en pM) se calculó para cada Fab a cada concentración de NGF, y se muestra en la Tabla 9. Fab E3 bloqueó fuertemente la supervivencia de neuronas trigeminales dependiente de NGF humano, con una CI50 de aproximadamente 31,6 pM en presencia de NGF de rata 15 pM, y una CI50 de aproximadamente 1,3 pM en presencia de NGF de rata 1,5 pM. Fab 3C y H19-L129 también bloquearon fuertemente la supervivencia de neuronas trigeminales dependiente de NGF de rata. 1,5 pM de NGF fue aproximadamente la CI50, mientras que 15 pM representó una concentración saturante de NGF. En ambos paneles, el eje X se corresponde con la concentración de anticuerpo (nM) y el eje Y se corresponde con las neuronas contadas. FIGURA 7: es una gráfica que representa el dolor en reposo evaluado 24 horas después de la cirugía y que muestra que el tratamiento con 0,02 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,6 mg/kg o 1 mg/kg de anticuerpo anti-NGF E3 redujo el dolor. “*” indica una diferencia estadísticamente significativa (p<0,5) del control negativo. FIGURA 8: es una gráfica que representa el dolor en reposo evaluado 24 horas después de la cirugía y que muestra que el tratamiento con 0,5 mg/kg de anticuerpo anti-NGF E3 redujo significativamente (p<0,005) el dolor en reposo cuando se inyecta dos horas después de la cirugía. FIGURA 9: es una gráfica que muestra los resultados del análisis BIAcore de la afinidad de unión por NGF humano del anticuerpo 911 de ratón (Fab). El anticuerpo 911 de ratón se unió a NGF con una KD de 3,7 nM, kdis de 8,4x10-5 s-1 y kas de 2,2x104 Ms-1. FIGURA 10: es una gráfica que muestra los resultados del análisis BIAcore de la afinidad de unión por NGF humano del anticuerpo E3 (Fab) (denominado en lo sucesivo “Fab 3E”). E3 se unió a NGF humano con una KD

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de aproximadamente 0,07 nM (y con una Kas de aproximadamente 6,0 x 105 y una kdis de aproximadamente 4,2 x 10-5 s-1). FIGURA 11: es una gráfica que representa que el anticuerpo E3 bloquea la interacción de NGF con sus receptores, trkA y p75, como se evalúa por el porcentaje de unión detectado entre NGF y trkA (mostrado en círculos negros) y NGF y p75 (mostrado como cuadrados huecos). El eje X se corresponde con la concentración de anticuerpo 3E (Fab) y el eje Y se corresponde con la unión de NGF (porcentaje máximo de UR). El aumento de las concentraciones de Fab E3 bloqueó la interacción de NGF con tanto p75 como trkA, como se muestra por la diminución de la señal (medida en UR). Cuando la concentración de anticuerpo E3 (Fab) igualó a la concentración de NGF, no se observó unión de NGF (como se muestra por una señal de cero). FIGURA 12: es una gráfica que representa la capacidad de bloqueo de NGF humano del anticuerpo E3 completo y Fab E3. Se evaluó la supervivencia de neuronas trigeminales de ratón E13.5 en presencia de NGF humano y diversas concentraciones de Fab E3 y anticuerpo E3. El eje X se corresponde con sitios de unión a NGF (nM) y el eje Y se corresponde con el recuento normalizado de neuronas trigeminales (TG). El anticuerpo E3 completo y Fab 3E mostraron niveles similares de inhibición de la supervivencia dependiente de NGF de

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neuronas trigeminales cuando la concentración de anticuerpo completo y Fab se normalizaron al número de sitios de unión a NGF (Fab tiene un sitio de unión y el anticuerpo completo tiene dos sitios de unión). FIGURA 13: es una gráfica que representa la capacidad de diversas concentraciones (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 y 0,0 nM) del anticuerpo E3 (triángulos sólidos; denominados en lo sucesivo “3E”), anticuerpo 911 (círculos sólidos) y una inmunoadhesina del receptor trkA (cuadrados sombreados; denominada “trkA-Fc) para inhibir la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigeminales E13.5 en presencia de 0,4 ng/ml de NGF humano (condiciones saturantes). El eje X se corresponde con la concentración de anticuerpo (nM) y la concentración de Y se corresponde con las neuronas contadas. Estos resultados demostraron que el anticuerpo E3 bloqueó NGF significativamente mejor que tanto el anticuerpo anti-NGF monoclonal de ratón 911 como la inmunoadhesina de trkA. FIGURA 14: es una gráfica que representa que el anticuerpo antagonista anti-NGF E3 (llamado “3E” en la figura) o Fab 911 no inhiben la supervivencia neuronal promovida por NT3, NT4/5 y MSP, incluso a concentraciones de anticuerpo de hasta 200 nM. Los datos representaron la supervivencia en porcentaje media después de 48 horas en cultivo (± error estándar de la media, n=3 para cada punto de datos) con respecto a la supervivencia observada en el control positivo para cada experimento (100% de supervivencia de neuronas trigeminales cultivadas en presencia de concentración de NGF saturante). Se usaron diversas concentraciones (20 nM, 2 nM o 0,2 nM) de Fab E3 (llamado “3E” en la figura) y el anticuerpo de ratón Fab 911 en presencia de neurotrofina no añadida (llamado “control”), NGF 400 pM (llamado “NGF-400pM), NT3 10 nM (llamado “NT310nM) o MSP 600 pM (llamado “MSP-600pM). FIGURA 15: es una gráfica que representa que el anticuerpo antagonista anti-NGF E3 (Fab o anticuerpo completo) (llamado “3E” en la figura) o anticuerpo 911 de ratón (Fab o anticuerpo completo) no inhibió la supervivencia neuronal promovida por NT3, NT4/5 y MSP, incluso a concentraciones de anticuerpo de hasta 200 nM Diversas concentraciones (200 nM y 80 nM) de Fab E3 y anticuerpo completo y el anticuerpo de ratón anticuerpo completo 911 y Fab se usaron en presencia de neurotrofinas no añadidas (llamado “sin factor”), NGF 400 pM (llamado “NGF-400pM), NT3 10 nM (llamado “NT3-10nM) o MSP 600 pM (llamado “MSP-600pM). FIGURA 16: es una gráfica que representa que el anticuerpo antagonista anti-NGF E3 o Fab E3 no inhibió la supervivencia de neuronas nodosas E17 promovida por BDNF, NT4/5 o LIF. También se probó el anticuerpo antagonista anti-NGF de ratón 911, y se observaron resultados similares. Diversas concentraciones (200 nM o 80 nM) de anticuerpo completo E3 (llamado “3E” en la figura), Fab E3, anticuerpo completo 911 o Fab 911 se probaron en presencia de neurotrofinas no añadidas (llamado “sin factores”), BDNF 400 pM (llamado “BDNF400pM), NT4/5 400 pM (llamado “NT4/5-400pM) o LIF 2,5 nM (llamado “LIF-2,5nM). FIGURA 17: es una gráfica que representa que el anticuerpo antagonista anti-NGF E3 o Fab E3 no inhibió la supervivencia de neuronas nodosas E17 promovida por BDNF, NT4/5 o LIF. Se probaron diversas concentraciones (200 nM, 20 nM, 2 nM) de Fab E3 (llamado “3E” en la figura), o Fab 911 en presencia de neurotrofinas no añadidas (llamado “control”), BDNF 400 pM (llamado “BDNF-400pM), NT4/5 400 pM (llamado “NT4/5-400pM) o LIF 2,5 nM (llamado “LIP-2,5nM). FIGURA 18: es una gráfica que demuestra la respuesta nociceptiva en ratas artríticas (modelo de artritis reumatoide) después de la administración de anticuerpos anti-NGF (E3 y 911) en D 14 y D 19. E3 (1 mg/kg, i.v. en el día 14 y día 19), 911 (10 mg/kg, i.v. en el día 14 y día 19) o indo (indometacina 3 mg/kg, p.o. diariamente durante 10 días) se administraron a ratones artríticos. Los valores de intensidad de la vocalización se expresan en mV como medias ± e.e.m. FIGURA 19: es una gráfica que demuestra los efectos de anticuerpos anti-NGF sobre el peso corporal en artritis en ratas (modelo de artritis reumatoide) después de la administración de anticuerpos anti-NGF en D 14 y D 19. E3 (1 mg/kg, i.v. en el día 14 y día 19), 911 (10 mg/kg, i.v. en el día 14 y día 19) o indo (indometacina 3 mg/kg, p.o. diariamente durante 10 días) se administraron a ratones artríticos. Los valores del peso corporal se expresan en gramos como media ± e.e.m. FIGURA 20: es una gráfica que demuestra la respuesta nociceptiva en ratas artríticas (modelo de artritis reumatoide) después de la administración de diferentes dosis de anticuerpo anti-NGF E3 (0,003 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg y 5 mg/kg) en D 14 y D 18. Los valores de intensidad de la vocalización se expresan en mV como medias ± e.e.m. FIGURA 21: es una gráfica que demuestra los efectos del anticuerpo anti-NGF E3 sobre el porcentaje de peso en el día 14 (normalizados al día 14) en ratas artríticas (modelo de artritis reumatoide) después de la administración de diferentes dosis de anticuerpo anti-NGF E3 (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg y 5 mg/kg) en D 14 y D

18. FIGURA 22: es una gráfica que demuestra los efectos del anticuerpo anti-NGF E3 sobre la pérdida de peso en ratas artríticas (modelo de artritis reumatoide) después de la administración de diferentes dosis del anticuerpo anti-NGF E3 (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg y 5 mg/kg) en D 14 y D 18. Los valores del peso corporal se normalizaron al día 0. FIGURA 23: representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada E3 (Fig. 23A) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (Fig. 23B), como se numera usando la numeración secuencial, numeración de Kabat y numeración de Chothia. FIGURA 24: representa los cambios en la intensidad de dolor diaria media después de la administración del anticuerpo anti-NGF E3 con respecto al nivel inicial en el día 0. El eje Y se corresponde con la reducción en la intensidad de dolor diaria media (puntuación VAS) con respecto a la intensidad de dolor diaria media en el día

0. El eje X se corresponde con los días después de la administración del anticuerpo anti-NGF E3. FIGURA 25: representa la puntuación VAS media después de la administración del anticuerpo anti-NGF E3.

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“EE” se refiere al error estándar. FIGURA 26: representa porcentaje de reducción máxima en la suma de la diferencia en intensidad de dolor (SPID) del día 2 al día 14 y del día 2 al día 28 después de la administración del anticuerpo anti-NGF E3. FIGURA 27: representa la respuesta media de los mínimos cuadrados (MMC) para WOMAC, subescala de dolor, subescala de función física y subescala de rigidez del día 1 al día 28 después de la administración de diferentes dosis (3 µg/kg, 10 µg/kg, 30 µg/kg, 100 µg/kg y 300 µg/kg) del anticuerpo anti-NGF E3. “EE” se refiere al error estándar. Los ejes X se corresponden con la dosis de anticuerpo anti-NGF E3 administrado. “*” indica P < 0,05 con respecto al nivel inicial bajo la prueba de Dunnett.

Descripción detallada de la invención

La invención desvelada en este documento proporciona el uso de un anticuerpo antagonista anti-NGF en la preparación de un medicamento para mejorar la función física en un individuo que tiene osteoartritis. La invención proporciona además un anticuerpo antagonista anti-NGF para su uso en mejorar la función física en un individuo que tiene osteoartritis. La invención proporciona además el uso de un anticuerpo antagonista anti-NGF en la fabricación de un medicamento para tratar dolor, mejorar la función física y mejorar la rigidez en un individuo que tiene osteoartritis. La invención proporciona además un anticuerpo antagonista anti-NGF para su uso en tratar dolor, mejorar la función física y mejorar la rigidez en un individuo que tiene osteoartritis.

La invención desvelada en este documento proporciona el uso de anticuerpos antagonista anti-NGF que se unen a NGF (tal como NGF humano) con alta afinidad. La invención proporciona además anticuerpos derivados de E3 que se unen a NGF, y usos médicos de estos anticuerpos. En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo humanizado, E3, que se une al factor de crecimiento nervioso (“NGF”), y usos médicos de este anticuerpo. La invención también proporciona usos médicos de anticuerpos E3 que se unen a NGF.

Técnicas generales

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad de la materia. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook y col., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed.,1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths y D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis y col., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan y col., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita y col., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

Definiciones

Un “anticuerpo” es una molécula de inmunoglobulina que puede unirse específicamente a una diana, tal como un hidrato de carbono, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., mediante al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en este documento, el término engloba no sólo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), monocatenarios (scFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA o IgM (o subclase de los mismos), y el anticuerpo no necesita ser de cualquier clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas

“Fv” es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo. En una especie de Fv bicatenaria, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera en estrecha asociación no covalente. En una especie de Fv monocatenaria, un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera pueden unirse covalentemente por un ligador de péptidos flexible de forma que las cadenas ligeras y pesadas puedan asociarse en una estructura dimérica análoga la de en una especie Fv

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bicatenaria. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir una especificidad de unión a antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo 3 CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse a antígeno, aunque generalmente a una menor afinidad que el sitio de unión entero.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de las regiones bisagra del anticuerpo.

Un “anticuerpo monoclonal” se refiere a una población de anticuerpos homogénea en la que el anticuerpo monoclonal comprende aminoácidos (que se producen naturalmente y que no se producen naturalmente) que participan en la unión selectiva de un antígeno. Una población de anticuerpos monoclonales es altamente específica, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. El término “anticuerpo monoclonal” engloba no sólo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), monocatenarios (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad y la capacidad requerida para unirse a un antígeno. No pretende limitarse en cuanto a la fuente del anticuerpo o al modo en el que se produce (por ejemplo, por hibridoma, selección en fago, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.).

Como se usa en este documento, “anticuerpo humano” significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que ha sido producido usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos conocidas en la técnica o desveladas en este documento. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de la cadena pesada humana o al menos un polipéptido de la cadena ligera humana. Un ejemplo tal es un anticuerpo que comprende polipéptidos de la cadena ligera murina y de la cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, en la que esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets y col., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks y col., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Los anticuerpos humanos también pueden prepararse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena han sido inactivados parcialmente o completamente. Este enfoque se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016. Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o pueden haberse inmunizado in vitro). Véase, por ejemplo, Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner y col., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; y la patente de EE.UU. nº

5.750.373.

“Anticuerpos quiméricos” se refiere a aquellos anticuerpos en los que una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras es homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase particular, mientras que el segmento restante de las cadenas es homólogo a secuencias correspondientes en otra. Normalmente, en estos anticuerpos quiméricos, la región variable de tanto las cadenas ligeras como pesadas imita las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias en anticuerpos derivados de la otra. Una ventaja clara para tales formas quiméricas es que, por ejemplo, las regiones variables pueden derivarse convenientemente de fuentes presentemente conocidas usando hibridomas o linfocitos B fácilmente disponibles de organismos huésped no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Aunque la región variable tiene la ventaja de facilitar la preparación, y la especificidad no es afectada por su fuente, la región constante que es humana, es menos probable que provoque una respuesta inmunitaria de un sujeto humano cuando los anticuerpos se inyectan que la que provocaría la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.

Una “región Fc funcional” posee al menos una función efectora de una región Fc de la secuencia nativa. “Funciones efectoras” a modo de ejemplo incluyen unión a C1q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueda evaluarse usando diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar tales funciones efectoras de anticuerpos.

Una “región Fc de la secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Una “variante de la región Fc” comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la de una región Fc de la secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, aunque retiene al menos una función efectora de la región Fc de la secuencia nativa. Preferentemente, la variante de la región Fc tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una

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región Fc de la secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de la secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. La variante de la región Fc en este documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencias con una región Fc de la secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido parental y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con la misma, más preferentemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencias con la misma.

Como se usa en este documento, “citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo” y “ADCC” se refieren a una reacción mediada por célula en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos espontáneos (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido sobre una célula diana y posteriormente producen la lisis de la célula diana. La actividad de ADCC de una molécula de interés puede evaluarse usando un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de EE.UU. nº 5.500.362 o

5.821.337. Células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos NK. Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes y col., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

Como se usa en este documento, “receptor de Fc” y “FcR” describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. La FcR preferida es una FcR de la secuencia humana nativa. Además, una FcR preferida es una que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, que incluyen variantes alélicas y alternativamente formas cortadas y empalmadas de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor activante”) y FcγRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplásmicos de las mismas. Las FcR se revisan en Ravetch y Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel y col., 1994, Immunomethods, 4:25-34; y de Haas y col., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. “FcR” también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternal al feto (Guyer y col., 1976, J. Immunol., 117:587; y Kim y col., 1994,

J. Immunol., 24:249).

“Citotoxicidad dependiente del complemento” y “CDC” se refieren a la lisis de una diana en presencia de complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) complejada con un antígeno relacionado. Para evaluar la activación del complemento puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Como se usa en este documento, los términos “E3”, “3E” y “anticuerpo E3” se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera mostradas en las Figuras 1A (SEC ID Nº: 1) y 1B (SEC ID Nº: 2), respectivamente. Las porciones de CDR del anticuerpo E3 (incluyendo CDR de Chothia y Kabat) se representan en diagramas en las Figuras 1A y 1B. Las Figuras 2 y 3 muestran polinucleótidos que codifican cadenas pesadas y ligeras, respectivamente, que comprende las regiones variables de la cadena pesada y ligera mostradas en las Figuras 1A y 1B, respectivamente. La generación y caracterización de E3 se describe en los ejemplos. Diferentes funciones biológicas están asociadas a E3, que incluyen, pero no se limitan a, capacidad para unirse a NGF e inhibir la actividad biológica de NGF y/o ruta(s) en la dirección 3' mediada(s) por la señalización de NGF; y capacidad para inhibir la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigeminales E13.5 de ratón. Como se trata en este documento, los anticuerpos de la invención pueden tener una cualquiera o más de estas características. En algunas realizaciones, el término “E3” se refiere a inmunoglobulina codificada por (a) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de E3 que tiene un número de depósito de ATCC nº PTA-4893 o ATCC nº PTA-4894, y (b) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de E3 que tiene un número de depósito de ATCC nº PTA-4895.

Como se usa en este documento, unión “inmunoespecífica” de anticuerpos se refiere a la interacción de unión específica para antígeno que se produce entre el sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo y el antígeno específico reconocido por ese anticuerpo (es decir, el anticuerpo reacciona con la proteína en un ELISA u otro inmunoensayo, y no reacciona detectablemente con proteínas sin relacionar).

Un epítope que “se une específicamente” o “se une preferencialmente” (usado indistintamente en este documento) a un anticuerpo o un polipéptido es un término bien entendido en la materia, y procedimientos para determinar tal unión específica o preferencial también son muy conocidos en la técnica. Una molécula se dice que presenta “unión específica” o “unión preferencial” si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo “se une específicamente” o “se une preferencialmente” a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o preferencialmente a un epítope de NGF es un anticuerpo que se une a este epítope con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que se une a otros epítopes de NGF o epítopes de no NGF. También se entiende leyendo esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítope) que se une específicamente o preferencialmente a una primera diana puede o puede no unirse específicamente o preferencialmente a una segunda diana. Como tal, la “unión específica” o “unión preferencial” no requiere

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necesariamente (aunque puede incluir) unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, referencia a unión significa unión preferencial.

Los términos “polipéptido”, “oligopéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser linear o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y pueden estar interrumpidos por no aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marca. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), además de otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de la presente invención se basan en un anticuerpo, los polipéptidos pueden producirse como cadenas individuales o cadenas asociadas.

“Polinucleótido” o “ácido nucleico”, como se usan indistintamente en este documento, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero por ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación a la estructura del nucleótido puede conferirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes de no nucleótido. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación con un componente de marca. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, “tapas”, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen naturalmente con un análogo, modificaciones de internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen restos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contiene alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), además de formas sin modificar de polinucleótido(s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo generalmente presentes en los azúcares puede sustituirse, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse por grupos protectores estándar, o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse con soportes sólidos. El OH del extremo 5' y 3' puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de remate orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, 2'-Ometil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro-o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares α-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como metilrribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que fosfato se sustituye con P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), “(O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 (“formacetal”), en las que cada R o R' es independientemente H o alquilo (C1-20) sustituido o sin sustituir que opcionalmente contiene un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo

o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos citados en este documento, que incluyen ARN y ADN.

Una “región variable” de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, tanto solas como en combinación. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera consisten cada una en cuatro regiones estructurales (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Hay al menos dos técnicas para determinar CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5ª ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Chothia y col. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani y col. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Como se usa en este documento, una CDR puede referirse a CDR definidas por cualquier enfoque o por una combinación de ambos enfoques.

Una “región constante” de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, tanto solas como en combinación.

Como se usa en este documento, el término “factor de crecimiento nervioso” y “NGF” se refieren al factor de crecimiento nervioso y variantes del mismo que retienen al menos parte de la actividad biológica de NGF. Como se usa en este documento, NGF incluye todas las especies de mamífero de NGF de secuencia nativa, que incluyen humana, canina, felina, equina o bovina.

“Receptor de NGF” se refiere a un polipéptido que está unido por o activado por NGF. Los receptores de NGF

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incluyen el receptor TrkA y el receptor p75 de cualquier especie de mamífero que incluyen, pero no se limitan a, humana, canina, felina, equina, primate o bovina.

Como se usa en este documento, un “anticuerpo antagonista anti-NGF” (llamado indistintamente “anticuerpo anti-NGF”) se refiere a un anticuerpo que puede unirse a NGF e inhibir la actividad biológica de NGF y/o ruta(s) en la dirección 3' mediada(s) por la señalización de NGF. Un anticuerpo antagonista anti-NGF engloba anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (incluyendo significativamente) la actividad biológica de NGF, que incluye rutas en la dirección 3' mediadas por la señalización de NGF, tal como unión a receptor y/o provocación de una respuesta celular a NGF. Para el fin de la presente invención, se entenderá explícitamente que el término “anticuerpo antagonista anti-NGF” engloba todos los términos, títulos y estados funcionales previamente identificados y las características por las cuales el propio NGF, una actividad biológica de NGF (incluyendo, pero no se limita a, su capacidad para mediar en cualquier aspecto de dolor posquirúrgico) o las consecuencias de la actividad biológica, son sustancialmente anulados, disminuidos o neutralizados en cualquier grado significativo. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-NGF se une a NGF y previene la dimerización de NGF y/o unión a un receptor de NGF (tal como p75 y/o trkA). En otras realizaciones, un anticuerpo anti-NGF se une a NGF y previene la dimerización del receptor trkA y/o autofosforilación de trkA. Ejemplos de anticuerpos antagonista anti-NGF se proporcionan en este documento.

“Actividad biológica” de NGF generalmente se refiere a la capacidad para unirse a receptores de NGF y/o activar rutas de señalización de receptores de NGF. Sin limitación, una actividad biológica incluye una cualquiera o más de las siguientes: la capacidad para unirse a un receptor de NGF (tal como p75 y/o trkA); la capacidad para promover la dimerización y/o autofosforilación del receptor trkA; la capacidad para activar una ruta de señalización de los receptores de NGF; la capacidad para promover la diferenciación, proliferación, supervivencia, crecimiento celular y otros cambios en la fisiología célula, que incluyen (en el caso de neuronas, incluyendo neurona periférica y central) cambio en la morfología neuronal, sinaptogénesis, función sináptica, liberación de neurotransmisores y/o neuropéptidos y regeneración tras la lesión; la capacidad para promover la supervivencia de neuronas trigeminales E13.5 de ratón; y la capacidad para mediar en dolor, que incluye dolor posquirúrgico.

Como se usa en este documento, “sustancialmente puro” se refiere a un material que es al menos el 50% puro (es decir, libre de contaminantes), más preferentemente al menos el 90% puro, más preferentemente al menos el 95% puro, más preferentemente al menos el 98% puro, más preferentemente al menos el 99% puro.

Una “célula huésped” incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor para vector(es) para la incorporación de insertos de polinucleótidos. Las células huésped incluyen progenie de una única célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula parental original debido a mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido(s) de la presente invención.

Como se usa en este documento, “tratamiento” es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: mejora o alivio de cualquier aspecto de dolor, que incluye dolor agudo, crónico, inflamatorio, neuropático, posquirúrgico, dolor por artritis reumatoide o dolor por osteoartritis. Para los fines de la presente invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: que incluye reducir la gravedad, alivio de uno o más síntomas asociados al dolor que incluyen cualquier aspecto de dolor (tal como acortar la duración del dolor, reducción de la sensibilidad al dolor o sensación).

Una “cantidad eficaz” de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados que incluyen resultados clínicos tales como alivio o reducción en la sensación de dolor. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de la presente invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para tratar, mejorar, reducir la intensidad de y/o prevenir el dolor, que incluye dolor posquirúrgico, dolor por artritis reumatoide y/o dolor por osteoartritis. En algunas realizaciones, la “cantidad eficaz” puede reducir el dolor en reposo

o dolor mecánicamente inducido (incluyendo dolor tras movimiento), o ambos, y puede administrarse antes, durante

o después de una incisión, corte, desgarro o lesión y/o antes, durante o después de estímulo doloroso. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o puede no lograrse conjuntamente con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, una “cantidad eficaz” puede considerarse en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos, y un único agente puede considerarse que se administra en una cantidad eficaz si, conjuntamente con uno o varios agentes, puede lograr o logra un resultado deseable.

“Reducir la incidencia” de dolor significa cualquiera de reducir la gravedad (que puede incluir reducir la necesidad de y/o cantidad de (por ejemplo, exposición a) otros fármacos y/o terapias generalmente usadas para estas afecciones, que incluyen, por ejemplo, opiáceos), duración y/o frecuencia (incluyendo, por ejemplo, retrasar o aumentar el momento hasta el dolor posquirúrgico en un individuo). Como es entendido por aquellos expertos en la materia, los individuos pueden variar en términos de su respuesta a tratamiento y, como tales, por ejemplo, un “procedimiento de reducir la incidencia de dolor por artritis reumatoide o dolor por osteoartritis en un individuo” refleja administrar el anticuerpo antagonista anti-NGF basándose en una esperanza razonable de que tal administración pueda producir

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probablemente una reducción tal en la incidencia en ese individuo particular.

“Mejorar” un dolor o uno o más síntomas de un dolor (tal como dolor por artritis reumatoide o dolor por osteoartritis) significa una reducción o mejora de uno o más síntomas de un dolor con respecto a no administrar un anticuerpo antagonista anti-NGF. “Mejorar” también incluye acortar o reducir en duración un síntoma.

“Paliar” un dolor o uno o más síntomas de un dolor (tal como dolor por artritis reumatoide o dolor por osteoartritis) significa reducir el grado de una o más manifestaciones clínicas no deseables de dolor posquirúrgico en un individuo

o población de individuos tratados con un anticuerpo antagonista anti-NGF según la invención.

Como se usa en este documento, “retrasar” el desarrollo de dolor significa diferir, dificultar, ralentizar, retardar estabilizar y/o posponer la progresión de dolor, tal como dolor posquirúrgico, dolor por artritis reumatoide o dolor por osteoartritis. Este retraso puede ser de longitudes de tiempo variables, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o individuos que están tratándose. Como es evidente para un experto en la materia, un retraso suficiente o significativo puede englobar, en efecto, la prevención, de forma que el individuo no desarrolle dolor. Un procedimiento que “retrasa” el desarrollo del síntoma es un procedimiento que reduce la probabilidad de desarrollar el síntoma en un intervalo de tiempo dado y/o reducir el grado de los síntomas en un intervalo de tiempo dado, cuando se compara con no usar el procedimiento. Tales comparaciones se basan normalmente en estudios clínicos, usando un número de sujetos estadísticamente significativo.

“Dolor” como se usa en este documento se refiere a dolor de cualquier etiología, que incluye dolor agudo y crónico, y cualquier dolor con un componente inflamatorio. Ejemplos de dolor incluyen dolor posquirúrgico, dolor posoperatorio (incluyendo dolor dental), migraña, cefalea y neuralgia trigeminal, dolor asociado a quemadura, herida o cálculo renal, dolor asociado a traumatismo (incluyendo lesión de cabeza traumática), dolor neuropático, dolor asociado a trastornos musculoesqueléticos tales como artritis reumatoide, osteoartritis, espondilitis anquilosante, artropatías sero-negativas (no reumatoides), reumatismo no articular y trastornos peri-articulares, y dolor asociado a cáncer (incluyendo “dolor intercurrente” y dolor asociado a cáncer terminal), neuropatía periférica y neuralgia posherpética. Ejemplos de dolor con un componente inflamatorio (además de algunos de aquellos descritos anteriormente) incluyen dolor reumático, dolor asociado a mucositis y dismenorrea.

“Dolor posquirúrgico” (llamado indistintamente “dolor posincisional” o “postraumático”) se refiere a dolor que se produce o resultante de un traumatismo externo tal como un corte, punción, incisión, desgarro o herida en el tejido de un individuo (incluyendo el que se produce a partir de todos los procedimientos quirúrgicos, tanto si son invasivos como no invasivos). Como se usa en este documento, dolor posquirúrgico no incluye dolor que tiene lugar (se produce u origina) sin un traumatismo físico externo. En algunas realizaciones, el dolor posquirúrgico es dolor interno o externo (incluyendo periférico), y la herida, corte, traumatismo, desgarro o incisión puede producirse accidentalmente (como con una herida traumática) o deliberadamente (como con una incisión quirúrgica). Como se usa en este documento, “dolor” incluye nocicepción y la sensación de dolor, y el dolor puede evaluarse objetivamente y subjetivamente, usando puntuaciones de dolor y otros procedimientos muy conocidos en la técnica. El dolor posquirúrgico, como se usa en este documento, incluye alodinia (es decir, respuesta elevada a un estímulo normalmente no tóxico) e hiperalgesia (es decir, respuesta elevada a un estímulo normalmente tóxico o desagradable), que a su vez puede ser de naturaleza térmica o mecánica (táctil). En algunas realizaciones, el dolor se caracteriza por sensibilidad térmica, sensibilidad mecánica y/o dolor en reposo. En algunas realizaciones, el dolor posquirúrgico comprende dolor mecánicamente inducido o dolor en reposo. En otras realizaciones, el dolor posquirúrgico comprende dolor en reposo. El dolor puede ser dolor primario o secundario, como es muy conocido en la técnica.

Una “muestra biológica” engloba una variedad de tipos de muestras obtenidas de un individuo y puede usarse en un ensayo de diagnóstico o monitorización. La definición engloba sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras sólidas de tejido tal como un espécimen de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos, y la progenie de los mismos. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de cualquier forma después de su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento para ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos, o incorporación en una matriz semi-sólida o sólida para fines de seccionamiento. El término “muestra biológica” engloba una muestra clínica, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes de células, lisados celulares, suero, plasma, líquido biológico y muestras de tejido.

Un “individuo” es un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja (tales como vacas), animales para deportes, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas.

Como se usa en este documento, “vector” significa una construcción que puede administrar, y preferentemente expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos, vectores de expresión de ADN o ARN desnudo, vectores de plásmidos, cósmidos o de fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados a agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tales como células productoras.

Como se usa en este documento, “secuencia de control de la expresión” significa una secuencia de ácidos nucleicos

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que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de la expresión está operativamente ligada a la secuencia de ácidos nucleicos que va a transcribirse.

Como se usa en este documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquier material que, cuando se combina con un principio activo, permite que el componente retenga la actividad biológica y es no reactivo con el sistema inmunitario del sujeto. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Diluyentes preferidos para administración por aerosol o parenteral son solución salina tamponada con fosfato o solución salina normal (0,9%). Las composiciones que comprenden tales vehículos se formulan por procedimientos convencionales muy conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20ª Ed. Mack Publishing, 2000).

El término “Kdis”, como se usa en este documento, pretende referirse a la constante de disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.

El término “KD”, como se usa en este documento, pretende se refieren a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno.

ANTICUERPO E3, ANTICUERPOS DERIVADOS DE E3, COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS DE USO

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La presente invención engloba composiciones, que incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo E3. Como se usa en este documento, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen a NGF. Estas composiciones pueden comprender adicionalmente excipientes adecuados tales como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones, que son muy conocidos en la técnica.

La divulgación también engloba realizaciones de anticuerpos, polipéptidos y polinucleótidos aislados. La divulgación también engloba realizaciones de anticuerpos, polipéptidos y polinucleótidos sustancialmente puros.

Los anticuerpos para su uso en la invención se caracterizan por cualquiera (una o más) de las siguientes características: (a) capacidad para unirse a NGF; (b) capacidad para reducir y/o inhibir la actividad biológica de NGF y/o ruta(s) en la dirección 3' mediadas por la señalización de NGF; (c) capacidad para reducir y/o inhibir la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigeminales E13.5 de ratón; (d) ausencia de cualquier reactividad cruzada significativa con NT3, NT4/5 y/o BDNF; (e) capacidad para tratar y/o prevenir dolor (incluyendo dolor posquirúrgico); (f) capacidad para aumentar la eliminación de NGF; (g) capacidad para reducir o inhibir la activación del receptor trkA como se detecta, por ejemplo, usando ensayo de activación de receptores de cinasas (KIRA) (véase la patente de EE.UU. nº 6.027.927).

Las propiedades de unión del anticuerpo E3, que se une a NGF humano con alta afinidad, y la lenta cinética de disociación, en comparación con el anticuerpo monoclonal anti-NGF murino parental 911, se resumen más adelante. E3 se une a NGF humano con una afinidad de unión aproximadamente 50 veces superior al anticuerpo de ratón parental 911.

anticuerpo

kD Kdis Kas

911 (Fab)

3,7 nM 9x10-5 s -1 2,2x104 M-1s -1

E3 (Fab)

0,07 nM <4x10-5 s -1 6x105 M-1s -1

El anticuerpo E3 y anticuerpos relacionados también presentan una fuerte capacidad para antagonizar NGF humano, como se evalúa por los ensayos in vitro (véanse los Ejemplos 2 y 3). Por ejemplo, el anticuerpo E3 antagoniza la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigeminales E13 de ratón a una CI50 de aproximadamente 21 pM en presencia de 15 pM de NGF humano, y aproximadamente 1,2 pM en presencia de 1,5 pM de NGF humano.

Por consiguiente, en otro aspecto, los anticuerpos para su uso en la invención se identifican adicionalmente y se caracterizan por: (h) unión de alta afinidad a NGF humano con baja cinética de disociación (en algunas realizaciones, con una KD inferior a aproximadamente 2 nM, y/o una Kdis más lenta de aproximadamente 6x10-5 s-1) y/o (i) capacidad para inhibir (bloquear) la supervivencia dependiente de NGF de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 de aproximadamente 100 pM o menos a aproximadamente 15 pM de NGF (en algunas realizaciones, NGF humano) y/o una CI50 de aproximadamente 20 pM o menos a aproximadamente 1,5 pM de NGF.

En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a NGF humano, y no se une significativamente a un NGF de otra

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En otra realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de E3 que tiene cualquiera de lo siguiente: al menos 5 aminoácidos contiguos, al menos 8 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de una secuencia de E3 en la que la secuencia de E3 comprende uno cualquiera o más de: residuo de aminoácido L29 de CDRH1, I50 de CDRH2, W101 de CDRH3, y/o A103 de CDRH3; y/o residuo de aminoácido S28 de CDRL1, N32 de CDRL1, T51 de CDRL2, 91E de CDRL3 y/o H92 de CDRL3, con el entendimiento de que las realizaciones que consisten en la secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de anticuerpo monoclonal de ratón, 911, son específicamente excluidas.

Como es evidente, en toda esta divulgación se usa un esquema de numeración de aminoácidos secuencial para referirse a lo residuos de aminoácidos en las regiones variables (es decir, los residuos de aminoácidos en cada región variable están numerados en la secuencia). Como es muy conocido en la técnica, los sistemas de numeración de Kabat y/o de Chothia son útiles cuando se comparan dos anticuerpos o polipéptidos, tales como un anticuerpo E3 y una variante de E3 (o polipéptido que se sospecha que es una variante de E3). Es bien entendido en la materia cómo convertir la numeración secuencial en la numeración de Chothia y/o de Kabat, si se desea, por ejemplo, para su uso en la realización de comparaciones entre E3 y otro polipéptido. La Figura 23 representa las regiones variables de E3 numeradas usando la numeración secuencial, de Chothia y de Kabat. Además, para facilitar la comparación, generalmente se entiende que los residuos de la región estructural tienen generalmente, pero no siempre, aproximadamente el mismo número de residuos. Sin embargo, las CDR pueden variar en tamaño (es decir, es posible tener inserciones y/o deleciones de uno o más residuos de aminoácidos). Si se compara un anticuerpo E3 y una variante de E3 candidata (por ejemplo, en el caso de una región CDR de una secuencia candidata que es más larga en la secuencia en el anticuerpo E3 con la que está alineada), pueden seguirse las siguientes etapas (aunque se conocen otros procedimientos en la técnica). La secuencia de anticuerpos candidata se alinea con regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo E3. El alineamiento puede hacerse a mano, o por ordenador usando programas informáticos comúnmente aceptados. El alineamiento puede facilitarse usando algunos residuos de aminoácidos que son comunes a la mayoría de las secuencias de Fab. Por ejemplo, las cadenas ligeras y pesadas tienen cada una normalmente dos cisteínas, que se encuentran frecuentemente en una posición conservada. Se entiende que la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de variante candidato puede ser más larga (es decir, tener residuos de aminoácidos insertados) o más corta (tener residuos de aminoácidos delecionados). Pueden añadirse sufijos al número de residuo para indicar la inserción de residuos adicionales, por ejemplo, residuo 34 abc. Para secuencias candidatas que, por ejemplo, se alinean con una secuencia de E3 para, por ejemplo, los residuos 33 y 35, pero no tienen residuos entre ellas para alinearse con el residuo 35, el residuo 35 simplemente no se asigna a un residuo. En otro enfoque, es generalmente muy conocido que la comparación pueda hacerse entre aminoácidos equivalentes estructurales (por ejemplo, misma posición en el complejo antígeno-anticuerpo) cuando se comparan CDR de diferentes longitudes. Por ejemplo, la numeración de Chothia (Al-Lazikani y col., arriba) sitúa generalmente (pero no en todos los casos) inserciones y deleciones en las posiciones estructuralmente correctas. La equivalencia estructural también puede deducirse o demostrarse usando cristalografía de rayos X o análisis de ciclo de dobles mutantes (véase Pons y col. (1999) Prot. Sci. 8:958-968).

La afinidad de unión de un anticuerpo anti-NGF por NGF (tal como hNGF) puede ser aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,80 nM, aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,75 nM y aproximadamente 0,18 a aproximadamente 0,72 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 40 pM, o superior a aproximadamente 40 pM. En una realización, la afinidad de unión es entre aproximadamente 2 pM y 22 pM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es inferior a aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3,5 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 2,5 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 1,5 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 900 pM, aproximadamente 800 pM, aproximadamente 700 pM, aproximadamente 600 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 90 pM, aproximadamente 80 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 10 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es aproximadamente 10 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es inferior a aproximadamente 10 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es aproximadamente 0,1 nM o aproximadamente 0,07 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es inferior a aproximadamente 0,1 nM o inferior a aproximadamente 0,07 nM. En otras realizaciones, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3,5 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 2,5 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 1,5 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 900 pM, aproximadamente 800 pM, aproximadamente 700 pM, aproximadamente 600 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 90 pM, aproximadamente 80 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 10 pM a cualquiera de aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, o aproximadamente 40 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 4 nM,

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Un ejemplo de un péptido de enlace es (GGGGS)3 (SEC ID Nº: 15), que une mediante puentes aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxi de una región variable y el extremo amino de la otra región variable. Se han diseñado y usado ligadores de otras secuencias (Bird y col. (1988)). Los ligadores pueden modificarse a su vez para funciones adicionales, tales como unión de fármacos o unión a soportes sólidos. Las variantes monocatenarias pueden producirse tanto recombinantemente como sintéticamente. Para la producción sintética de scFv puede usarse un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante de scFv, un plásmido adecuado que contiene polinucleótido que codifica el scFv puede introducirse en una célula huésped adecuada, tanto eucariota, tal como células de levadura, planta, insecto o de mamífero, como procariota, tal como E. coli. Los polinucleótidos que codifican el scFv de interés pueden prepararse por manipulaciones rutinarias tales como ligación de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse usando técnicas convencionales de purificación de proteínas conocidas en la técnica.

También están englobadas otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son bivalentes, anticuerpos biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena de polipéptidos, pero usando un ligador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando así a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión a antígeno (véase por ejemplo, Holliger, P. y col. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:64446448; Poljak, R. J. y col. (1994) Structure 2:1121-1123).

El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monoclonal que tiene especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. Un anticuerpo biespecífico puede prepararse usando los anticuerpos desvelados en este documento. Los procedimientos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Suresh y col., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basó en la coexpresión de dos pares de cadenas pesadas-cadenas ligeras de la inmunoglobulina, teniendo las dos cadenas pesadas diferentes especificidades (Millstein y Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

Según un enfoque para producir anticuerpos biespecíficos, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) están fusionados con secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones cuando relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos usadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales dé altos rendimientos o cuando las relaciones no sean de significancia particular.

En un enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de la inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par híbrido de cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica, con una cadena ligera de la inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas no deseadas. Este enfoque se describe en la publicación PCT nº WO 94/04690 publicada el 3 de marzo de 1994.

Los anticuerpos heteroconjugados, que comprenden dos anticuerpos covalentemente unidos, también están dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos se han usado para elegir como diana células del sistema inmunitario para células no deseadas (la patente de EE.UU. nº 4.676.980), y para el tratamiento de infección por el VIH (publicaciones de solicitud PCT nº WO 91/00360 y WO 92/200373; documento EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Agentes y técnicas de reticulación adecuados son muy conocidos en la técnica, y se describen en la patente de EE.UU. nº

4.676.980.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, por ejemplo, como se conoce en la técnica, y como se describe en este documento.

Los anticuerpos pueden modificarse como se describe en publicación PCT nº WO 99/58572 publicada el 18 de noviembre de 1999. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula diana, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a todo o parte de un dominio constante de una cadena pesada humana de la inmunoglobulina. Estos anticuerpos pueden unirse a la molécula diana sin desencadenar una lisis dependiente del complemento significativa, o destrucción mediada por células de ladiana. Preferentemente, el dominio efector puede unirse específicamente a FcRn y/o FcγRIIb. Éstos se basan normalmente en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos modificados de este modo se prefieren para su uso en terapia con

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(continuación)

Residuo original

Sustituciones conservativas Sustituciones a modo de ejemplo

Cys (C)

Ser Ser; Ala

Gln (Q)

Asn Asn; Glu

Glu (E)

Asp Asp; Gln

Gly (G)

Ala Ala

His (H)

Arg Asn; Gln; Lys; Arg

Ile (I)

Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina

Leu (L)

Ile Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe

Lys (K)

Arg Arg; Gln; Asn

Met (M)

Leu Leu; Phe; Ile

Phe (F)

Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr

Pro (P)

Ala Ala

Ser (S)

Thr Thr

Thr (T)

Ser Ser

Trp (W)

Tyr Tyr; Phe

Tyr (Y)

Phe Trp; Phe; Thr; Ser

Val (V)

Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina

Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se llevan a cabo seleccionando sustituciones que se diferencian significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del

5 esqueleto de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se producen naturalmente se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1) Hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) Hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;10 (3) Ácidos: Asp, Glu;

(4)

Básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5)

Residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

(6)

Aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas se hacen intercambiando un miembro de una de estas clases con otra clase.

15 Cualquier residuo de cisteína que no participe en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también puede estar sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir reticulación anómala. En cambio, el (los) enlace(s) de cisteína puede(n) añadirse al anticuerpo para mejorar su estabilidad, particularmente si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv.

Las modificaciones de aminoácidos pueden oscilar de cambiar o modificar uno o más aminoácidos para completar el

20 rediseño de una región, tal como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad de unión y/o especificidad. En alguna realización, no más de una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas se hacen dentro de un dominio CDR. En otras realizaciones, no más de una a tres sustituciones de aminoácidos conservativas se hacen dentro de un dominio CDR3. En otras realizaciones más, el dominio CDR es CDRH3 y/o CDRL3.

25 Las modificaciones también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, además de polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales tales como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Lo anticuerpos se glicosilan en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferes Y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright y Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan la función de la proteína (Boyd y col., 1996, Mol. Immunol. 32:1311

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mediante procedimientos conocidos en la técnica

En otro aspecto, la divulgación proporciona composiciones (tal como una composición farmacéutica) que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la divulgación. En algunas realizaciones, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo E3 como se describe en este documento. En otra realización, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos o polipéptidos descritos en este documento. En otras realizaciones más, la composición comprende cualquiera o ambos de los polinucleótidos mostrados en las Figuras 2 y 3. Vectores de expresión, y administración de composiciones de polinucleótidos, se describen adicionalmente en este documento.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de preparación de cualquiera de los polinucleótidos descritos en este documento.

Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de tales secuencias también están englobados por la presente invención. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnARN, que contienen intrones y se corresponden con una molécula de ADN en una forma una a una, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden estar presentes, pero no se necesita, dentro de un polinucleótido de la presente divulgación, y un polinucleótido puede ligarse, pero no se necesita, a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o una parte del mismo) o pueden comprender una variante de una secuencia tal. Las variantes de polinucleótidos contienen una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de forma que la inmunorreactividad del polipéptido codificado no disminuya con respecto a una molécula inmunorreactiva nativa. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en este documento. Las variantes presentan preferentemente al menos aproximadamente el 70% de identidad, más preferentemente al menos aproximadamente el 80% de identidad y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 90% de identidad con una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo nativo o una parte del mismo.

Dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos se dice que son “idénticas” si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para la máxima correspondencia como se describe más adelante. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan normalmente comparando las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una “ventana de comparación” como se usa en este documento se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente 30 a aproximadamente 75, 40 a aproximadamente 50, en la que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinearse óptimamente las dos secuencias.

El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse usando el programa Megalign en el juego Lasergene del software de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, WI) usando parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins -Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pág. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach for Alignment and Phylogenes pág. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

Preferentemente, el “porcentaje de identidad de secuencias” se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones en la que la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, normalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, con respecto a las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en el que las bases de ácido nucleico idénticas o residuo de aminoácido se producen en ambas secuencias para dar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencias.

Por tanto, o alternativamente, las variantes pueden ser sustancialmente homólogas a un gen nativo, o una parte o complemento del mismo. Tales variantes de polinucleótidos pueden hibridarse bajo condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de ADN que se produce naturalmente que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).

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La invención también proporciona un kit que comprende un anticuerpo antagonista anti-NGF e instrucciones para administrar el anticuerpo antagonista anti-NGF a un individuo que tiene osteoartritis para su uso en mejorar la función física en el individuo. La invención también proporciona un kit que comprende un anticuerpo antagonista anti-NGF e instrucciones para administrar el anticuerpo antagonista anti-NGF a un individuo que tiene osteoartritis para su uso en tratar dolor, mejorar la función física y mejorar la rigidez en el individuo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los kits comprenden un anticuerpo E3. En algunas realizaciones, el kit comprende cualquier anticuerpo descrito en este documento.

En otros aspectos, la divulgación proporciona kits que pueden usarse para cualquiera de los procedimientos descritos en este documento que incluyen, por ejemplo, para tratar un individuo con dolor (incluyendo dolor posquirúrgico, dolor por artritis reumatoide y dolor por osteoartritis). Los kits de la presente invención están en envases adecuados y opcionalmente pueden proporcionar componentes adicionales tales como tampones e instrucciones para el uso del anticuerpo en los usos médicos. En algunas realizaciones, los kits incluyen instrucciones para tratar dolor. En otras realizaciones, el kit comprende un anticuerpo antagonista anti-NGF descrito en este documento e instrucciones para su uso en los usos médicos. En algunas de las realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF es el anticuerpo E3.

La divulgación también proporciona kits que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido E3 como se describe en este documento. En algunas realizaciones, los kits comprenden además instrucciones para el uso del polinucleótido en cualquiera de los procedimientos descritos en este documento.

Procedimientos para ajustar la afinidad de un anticuerpo y procedimientos para caracterizar una cdr

Los inventores han desarrollado un novedoso procedimiento para caracterizar una CDR de un anticuerpo y/o alterar (tal como mejorar) la afinidad de unión de un polipéptido, tal como un anticuerpo, llamado “mutagénesis por barrido de bibliotecas”. Generalmente, la mutagénesis por barrido de bibliotecas trabaja del siguiente modo. Una o más posiciones de aminoácidos en la CDR se reemplazan por dos o más (tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20) aminoácidos usando procedimientos reconocidos en la técnica. Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, una para cada posición de aminoácido que se analiza), cada una con un complejidad de dos o más miembros (si dos o más aminoácidos están sustituidos en cada posición). Generalmente, la biblioteca también incluye un clon que comprende el aminoácido nativo (sin sustituir). Un pequeño número de clones, por ejemplo, aproximadamente 20-80 clones (dependiendo de la complejidad de la biblioteca), de cada biblioteca se criba para afinidad de unión por el polipéptido diana, y se identifican candidatos con unión elevada, la misma, reducida o sin unión. Los procedimientos para determinar la afinidad de unión son muy conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, la afinidad de unión se determina usando el análisis de resonancia de plasmones superficiales BIAcore, que detecta diferencias en la afinidad de unión de aproximadamente 2 veces o superiores. BIAcore es particularmente útil cuando el anticuerpo de partida ya se une con una afinidad relativamente alta, por ejemplo, una KD de aproximadamente 10 nM o inferior. El cribado usando resonancia de plasmones superficiales BIAcore se describe en los ejemplos, en este documento.

En otras realizaciones, la afinidad de unión se determina usando Kinexa Biocensor, ensayos de proximidad por centelleo, ELISA, inmunoensayo ORIGEN (IGEN), extinción de la fluorescencia, transferencia de la fluorescencia y/o expresión en levadura. En otras realizaciones, la afinidad de unión se criba usando un bioensayo adecuado.

En algunas realizaciones, cada posición de aminoácido en una CDR se sustituye (en algunas realizaciones, una a una) con los 20 aminoácidos naturales usando procedimientos de mutagénesis reconocidos en la técnica (algunos de los cuales se describen en este documento). Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, una para cada posición de aminoácido que se analiza), cada una con una complejidad de 20 miembros (si los 20 aminoácidos están sustituidos en cada posición).

En algunas realizaciones, la biblioteca que va a cribarse comprende sustituciones en dos o más posiciones, que puede estar en la misma CDR o en dos o más CDR. Por tanto, en algunas realizaciones, la biblioteca comprende sustituciones en dos o más posiciones en una CDR. En otras realizaciones, la biblioteca comprende sustitución en dos o más posiciones en dos o más CDR. En otras realizaciones más, la biblioteca comprende sustitución en 3, 4, 5

o más posiciones, dichas posiciones encontradas en dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. En algunas realizaciones, la sustitución se hace usando codones de baja redundancia. Véase, por ejemplo, la Tabla 2 de Balint y col. (1993) Gene 137(1):109-18).

En algunas realizaciones, la CDR es CDRH3 y/o CDRL3. En otras realizaciones, la CDR es una o más de CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 y/o CDRH3. En algunas realizaciones, la CDR es una CDR de Kabat, una CDR de Chothia o una CDR extendida.

Pueden secuenciarse candidatos con unión mejorada, identificándose así un mutante de sustitución de CDR que produce afinidad mejorada (también llamada una “sustitución mejorada”). Por ejemplo, como se demuestra en el Ejemplo 1, el uso de este procedimiento permitió la identificación de una única sustitución que mejoró la unión, incluso cuando un estimado de otras 18 sustituciones en la misma posición de aminoácidos no produjo unión (es

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5

10

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50

proporciona información referente a si la sustitución de alanina permite o evita la unión. Generalmente, las posiciones en las que una sustitución de alanina evita la unión se eliminan de la biblioteca de maduración por afinidad. En muchos casos, sin embargo, la alanina puede ser un mal sustituto en la posición de CDR.

Los presentes procedimientos también permiten la identificación y caracterización del efecto de mutaciones únicas de CDR. Por el contrario, procedimientos tales como la expresión en fago introducen y seleccionan muchas mutaciones simultáneamente y, por tanto, aumentan potencialmente el riesgo de que mutaciones positivas sean enmascaradas por la presencia de una mutación perjudicial presente en un clon particular.

Los presentes procedimientos también son útiles para mejorar la afinidad, a la vez que retienen la especificidad de unión del anticuerpo original (de partida), en tanto que los presentes procedimientos permitan la identificación de pequeños números de mutaciones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó 5 mutaciones en una única CDR) que produzcan afinidad de unión mejorada. Por el contrario, procedimientos tales como la expresión en fago normalmente mejoran la afinidad de unión usando múltiples mutaciones a la vez que pueden producir el desplazamiento de la especificidad del anticuerpo y/o el aumento de reactividad cruzada no deseable.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no limitar, la invención.

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Ejemplo 1: Humanización y maduración por afinidad del anticuerpo anti-NGF antagonista de ratón 911

A. Procedimientos generales

En este ejemplo se usaron los siguientes procedimientos generales.

Generación de bibliotecas

Se generaron bibliotecas por mutagénesis en casete por PCR con oligonucleótidos degenerados como se describe en Kay y col. (1996), Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, San Diego, Academic Press (véanse, páginas 277-291). El codón de dopaje NNK se usó para aleatorizar una posición de aminoácido para incluir 20 aminoácidos posibles. Para aleatorizar una posición de aminoácido para incluir sólo un subconjunto de aminoácidos con propiedades específicas se usaron codones de dopaje como se describe en Balint y col., (1993) Gene 137(1):109-18). La mutagénesis dirigida a sitio se realizó usando PCR recombinante como se describe en Innis y col., (1990) PCR protocols: A guide to methods and applications (véase, pág. 177-183).

Preparación de Fab a pequeña escala

La expresión a pequeña escala en placa de 96 pocillos se optimizó cribando bibliotecas de Fab. A partir de E. coli transformada con una biblioteca de Fab, las colonias se recogieron para inocular tanto una placa maestra (agar LB + ampicilina (50 µg/ml) + 2% de glucosa) como una placa de trabajo (2 ml/pocillo, 96 pocillos/placa que contiene 1,5 ml de LB + ampicilina (50 µg/ml) + 2% de glucosa). Ambas placas se cultivaron a 30ºC durante 8-12 horas. La placa maestra se almacenó a 4ºC y las células de la placa de trabajo se sedimentaron a 5000 rpm y se resuspendieron con 1 ml de LB + ampicilina (50 µg/ml) + IPTG 1 mM para inducir la expresión de Fab. Las células se recogieron por centrifugación después de 5 h de tiempo de expresión a 30ºC, luego se resuspendieron en 500 µl de tampón HBS-EP (tampón HEPES 100 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005% de P20, EDTA 3 mM). La lisis de células resuspendidas en HBS-EP se obtuvo por un ciclo de congelación (-80ºC), luego descongelación a 37ºC. Los lisados celulares se centrifugaron a 5000 rpm durante 30 min para separar residuos de células de sobrenadantes que contenían Fab. Entonces, los sobrenadantes se inyectaron en el aparato de resonancia de plasmones BIAcore para obtener información de afinidad para cada Fab. Los clones que expresan Fab se rescataron de la placa maestra para secuenciar el ADN y para la producción de Fab a gran escala y caracterización detallada como se describe más adelante.

Preparación de Fab a gran escala

Para obtener parámetros cinéticos detallados, los Fab se expresaron y se purificaron a partir de cultivos grandes. Matraces Erlenmeyer que contenían 200 ml de LB + ampicilina (50 µg/ml) + 2% de glucosa se inocularon con 5 ml de cultivo durante la noche de un clon de E. coli que expresa Fab seleccionado. Los clones se incubaron a 30ºC hasta que se obtuvo una DO550nm de 1,0 y luego se indujeron sustituyendo el medio por 200 ml de LB + ampicilina (50 µg/ml) + IPTG 1 mM. Después de 5 h de tiempo de expresión a 30ºC, las células se sedimentaron por centrifugación, luego se resuspendieron en 10 ml de PBS (pH 8). La lisis de las células se obtuvo por dos ciclos de congelación/descongelación (a -80ºC y 37ºC, respectivamente). El sobrenadante de los lisados celulares se cargó sobre columnas de Ni-NTA Superflow Sepharose (Qiagen, Valencia. CA) equilibradas con PBS, pH 8, luego se lavó con 5 volúmenes de columna de PBS, pH 8. Los Fab individuales se eluyeron en diferentes fracciones con PBS (pH 8) + imidazol 300 mM. Las fracciones que contenían Fab se reunieron y se dializaron en PBS, luego se cuantificaron por ELISA antes de la caracterización por afinidad.

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(continuación) F54 se cambió a F o L

S56 se cambió a S y T

Para los experimento de cribado de afinidad, cada biblioteca se emparejó adicionalmente con la cadena ligera o pesada injertada con CDR correspondiente (por ejemplo, la biblioteca H1/H2 se emparejó con la cadena ligera 5 injertada con CDR), el anticuerpo se expresó y afinidad por NGF humano de los clones individuales se cribó usando el sistema de resonancia de plasmones superficiales (SPR) BIACORE (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ) según las instrucciones del fabricante y como se ha descrito anteriormente. Se determinaron kdis, kas y KD. Los clones del anticuerpo se clasificaron basándose en las constantes kdis, ya que generalmente la mayor variación en la afinidad se observa en las constantes kdis, y además porque las constantes kdis son independientes de la concentración de

10 anticuerpo.

Se determinó la secuencia de clones que se unió y la secuencia de clones que se unió se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de L1 y L2, secuencias de aminoácidos de H1 y H2 y datos cinéticos para los clones que se unieron siguiendo el cribado de afinidad de clones de la biblioteca H1/H2 o L1/L2.

Datos cinéticos de los mutantes CDR 1-2

Clones de la biblioteca de la cadena ligera emparejados con la cadena pesada 8L2

CDRL1 CDRL2 kdis *KD

Secuencia de AA

Secuencia de AA

(s-1) (nM)

8L2-6D5 (control)

RASQDISNHLN (SEC ID Nº: 12) YISRFHS (SEC ID Nº: 13) **1e-3 25

L129

RASQSISNNLN (SEC ID Nº: 18) YTSRFHS (SEC ID Nº: 19) 4,5e-4 11

L208

RASQYISNHLN (SEC ID Nº: 20) YTSRFHS (SEC ID Nº: 21) 4,6e-4 11

L97

RASQSISNQLN (SEC ID Nº: 22) YVSRFHS (SEC ID Nº: 23) 5,6e-4 14

L81

RAFQAISNQLN (SEC ID Nº: 24) YISRFHT (SEC ID Nº: 25) 7,4e-4 18

L6

RAFQSISNQLN (SEC ID Nº: 26) YASRFHS (SEC ID Nº: 27) 8,2e-4 20

Clones de la biblioteca de la cadena pesada emparejados con la cadena ligera 6D5

CDRH1 CDRH2 kdis *KD

Secuencia de AA

Secuencia de AA

(s-1) (nM)

8L2-6D5 (control)

GFSLIGYDIN (SEC ID Nº: 9) MIWGDGTTDYNSAL (SEC ID Nº: 10) 1e-3 25

H109

GFSLIGYDSN (SEC ID Nº: 28) IIWGDGTTDYNSAL (SEC ID Nº: 29) 1,6e-4 4

H19

GFSLIGYDLN (SEC ID Nº: 30) IIWGDGTTDYNSAV (SEC ID Nº: 31) 2,4e-4 6

H222

GFSLIGYDVT (SEC ID Nº: 32) GIWGDGTTDYNSAV (SEC ID Nº: 33) 3,8e-4 9,5

H225

GFSLIGYDVT (SEC ID Nº: 34) GIWGDGTTDYNSSV (SEC ID Nº: 35) 3,8e-4 9,5

H18

GFSLIGYDAT (SEC ID Nº: 36) GIWGDGTTDYNSAV (SEC ID Nº: 37) 4,2e-4 10,5

54

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(continuación)

Mutaciones de CDR H3 (molde de 8L2-6D5, que incluye la secuencia de aminoácidos de CDR-H3 del anticuerpo 911: GGYYYGTSYYFDY (SEC ID Nº: 11)

kdis (s-1) 1E-3 KD*(nM) 25

T104S

2,2E-3 55

S105A

5,1E-4 13

S105T

6,4E-4 16

Y106R

1,6E-3 40

Y106T

2,0E-3 50

Y106M

2,7E-3 67

Y107F

1,4E-3 35

F108W

1,22E-3 30

D109N

1,5E-3 37

D109G

1E-3 25

Y110K

1,4E-3 35

Y110S

1,5E-3 37

Y110R

1,6E-3 40

Y110T

1,7E-3 42

Mutaciones de CDR L3 (molde de 8L2-6D5, que incluye la secuencia de aminoácidos de CDR-L3 (sin sustituir) natural: QQSKTLPYT (SEC ID Nº: 14)

kdis (s-1) 1E-3 KD*(nM) 25

S91E

2,5E-4 6

Y96R

1,7E-3 42

*KD calculada usando kas 4e4 M-1s -1

Varias mutaciones produjeron un aumento de la afinidad de unión. Al menos las siguiente mutaciones produjeron significativamente un aumento de la afinidad de unión en comparación con el molde de 8L2-6D5: (H_Y101W

5 (secuencia de CDR GGYWYGTSYYFDY (SEC ID Nº: 46)); H_S105A (secuencia de CDR GGYYYGTAYYFDY (SEC ID Nº: 47)); H_S105T (secuencia de CDR GGYYYGTTYYFDY (SEC ID Nº: 48)); H_G103A (secuencia de CDR GGYYYATSYYFDY (SEC ID Nº: 49); y L_S91E (secuencia de CDR QQEKTLPYT (SEC ID Nº: 50)).

Los resultados de este experimento se usaron para guiar la selección de posiciones de aminoácidos para la generación de las bibliotecas de maduración por afinidad.

10 Este experimento también proporcionó información referente a la frecuencia de sustituciones de aminoácidos en cualquier posición dada que produjo unión mejorada, la misma unión, peor unión o sin unión, como se muestra en la Tabla 5. Esta información permitió la identificación de posiciones de aminoácidos en las CDR que pudieron cambiarse a muchos aminoácidos diferentes (incluyendo los 20 aminoácidos) y posiciones en las CDR que pudieron cambiarse a algunos aminoácidos o a muy pocos aminoácidos (en algunas realizaciones, sin aminoácidos). Estos

15 resultados también demostraron sustituciones de aminoácidos que aumentaron la afinidad de unión.

(b) Maduración por afinidad

A continuación, los resultados del análisis de aleatorización de bibliotecas pequeñas (arriba) se usaron para seleccionar residuos para la producción de las bibliotecas de H3 y L3 para la maduración por afinidad de las CDR H3 y L3. Los residuos Y101 y G103 de CDR H3 y los residuos S91 y K92 de CDR L3 se seleccionaron para la

20 producción de las bibliotecas de H3 y L3 para la maduración por afinidad de las CDR H3 y L3.

58

Esta biblioteca combinó las mutaciones en H3 y L3 al mismo tiempo en el clon injertado con CDR 8L2-6D5, y por separado en la referencia de H19-L129, y tuvo una diversidad de 80 clones diferentes. La Tabla 7 muestra los residuos de aminoácidos seleccionados para la sustitución y los aminoácidos que se sustituyeron en cada posición.

Tabla 7. Residuos de aminoácidos en H3 y L3 seleccionados para la sustitución y los aminoácidos que se sustituyeron en cada posición

CDR-H3:

Y101 se cambió a Y y W, C. (Obsérvese que C se incluyó debido a que el uso del codón TRS en un oligonucleótido degenerado también generó el codón C).

G103 se cambió a A, P, S

CDR-L3:

S91 se cambió a E.

K92 se cambió a los veinte aminoácidos. A, R, K, y H unidos.

Cada polipéptido se expresó como un Fab, y la afinidad por NGF humano de los 96 clones individuales se cribó para cada biblioteca usando el análisis BIAcore según las instrucciones del fabricante y descritas anteriormente. Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8.

Mutaciones de COMBINACIÓN de CDR L3 H3 (molde de 8L2-6D5)

kdis(s-1) 1E-3 KD *(nM) 25

L_S91E; L_K92A (secuencia de CDR QQEATLPYT (SEC ID Nº: 51)) H_Y101W; H_G103A (secuencia de CDR GGYWYATSYYFDY (SEC ID Nº: 52))

5,5E-4 13

L_S91E; L_K92R (secuencia de CDR QQERTLPYT (SEC ID Nº: 53)) H_Y101W; H_0103A (secuencia de CDR GGYWYATSYYFDY (SEC ID Nº: 54))

1,0E-4 25

L_S91E; L_K92H (secuencia de CDR QQEHTLPYT (SEC ID Nº: 55)) H_Y401W; H_G103A (secuencia de CDR GGYWYATSYYFDY (SEC ID Nº: 56)) (CLON E3)

1,2E-5 0,3

L_S91E; L_K92S (secuencia de CDR QQESTLPYT (SEC ID Nº: 57)) H_Y101W; H_G103S (secuencia de CDR GGYWYSTSYYFDY (SEC ID Nº: 58))

4,7E-5 1,1

L_K92K (secuencia de CDR QQEKTLPYT (SEC ID Nº: 59)) H_Y101Y; H_G103A (secuencia de CDR GGYYYATSYYFDY (SEC ID Nº: 60))

2E-5 0,5

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neuronas trigeminales dependiente de NGF de rata.

Tabla 9:

NGF humano

CI50 (en presencia de NGF 15 pM) CI50 (en presencia de NGF 1,5 pM)

pM

pM

Fab 8L2-6D5

1580,5 461,8

Fab H19-L129

60,1 9,6

Fab 3E

<21,0 <1,2

Fab 3C

80,9 5,6

Fab 911

322,3 63,5

NGF de rata

CI50 (NGF 15 pM) CI50 (NGF 1,5 pM)

pM

pM

Fab 8L2-6D5

730,3 169,4

Fab H19-L129

31,0 6,0

Fab 3E

<8,3 <1,3

Fab 3C

31,6 6,0

Fab 911

161,0 34,6

En un experimento diferente, los inventores compararon la capacidad del anticuerpo completo E3 y Fab 3E para

5 inhibir la supervivencia dependiente de NGF de neuronas E13.5 en presencia de 0,4 ng/ml (concentración saturante) de NGF humano. Los resultados del análisis se muestran en la Figura 12. El anticuerpo completo E3 y Fab 3E mostraron niveles similares de inhibición de la supervivencia dependiente de NGF cuando la concentración de anticuerpo completo y Fab se normalizaron al número de sitios de unión de NGF (Fab tiene un sitio de unión y el anticuerpo completo tiene dos sitios de unión). Estos resultados demostraron que no hubo efecto de avidez debido a

10 la unión de un anticuerpo completo con el NGF dímero.

En otro experimentos, los inventores compararon la capacidad de diversas concentraciones (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 y 0,0 nM) de anticuerpo E3, anticuerpo 911 y una inmunoadhesina de receptor trkA (que consiste en el dominio extracelular del receptor de NGF trkA fusionado con el dominio Fc de inmunoglobulina, CH2-CH3) para inhibir la supervivencia dependiente de NGF de neuronas E13.5 en presencia de 0,4 ng/ml (condiciones

15 saturantes). Estos resultados se muestran en la Figura 13. Estos resultados demostraron que el anticuerpo E3 bloqueó NGF mejor que tanto el anticuerpo 911 como la inmunoadhesina de TrkA.

Ejemplo 3: Evaluación de la especificidad del anticuerpo anti-NGF E3 usando ensayos de supervivencia de neuronas trigeminales y nodosas de ratón

La capacidad del anticuerpo E3 para bloquear específicamente la actividad de NGF se evaluó por medición de la

20 capacidad del anticuerpo para inhibir la supervivencia de neuronas trigeminales E17/18 de ratón in vitro en presencia de concentraciones saturantes de NGF, la neurotrofina relacionada con NGF NT3 o el factor neurotrófico no relacionado con NGF, la proteína estimulante de macrófagos (MSP). La supervivencia de neuronas trigeminales E17/18 de ratón es un ensayo sensible para evaluar la actividad de bloqueo de NGF de anticuerpos antagonista anti-NGF debido a que se requiere NGF para soportar la supervivencia de estas neuronas a mayores concentraciones

25 que el nivel de NGF requerido para soportar la supervivencia de neuronas TG E13.5. La supervivencia de estas neuronas también está soportada por NT3 o MSP; por tanto, la supervivencia de estas neuronas también es un ensayo sensible para evaluar si el anticuerpo antagonista anti-NGF también bloqueó NT3 o MSP.

La capacidad del anticuerpo E3 para bloquear específicamente la actividad de NGF también se evaluó por medición

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de la capacidad del anticuerpo para inhibir la supervivencia de neuronas E17 nodosas de ratón en presencia de concentraciones saturantes de BDNF o NT4/5. La supervivencia de neuronas nodosas está soportada por BDNF o NT4/5; por tanto, la supervivencia de estas neuronas es un ensayo sensible para evaluar la capacidad de bloqueo de BDNF o NT4/5 del anticuerpo antagonista anti-NGF.

El ensayo de supervivencia se realizó del siguiente modo: ratones hembra Swiss Webster preñados apareados en periodos de 24 horas se sacrificaron por inhalación de CO2. Los cuernos uterinos se extirparon y los embriones (en el día embrionario 17 ó 18) se extrajeron y se decapitaron. Los ganglios trigeminales y nodosos se diseccionaron y se limpiaron. Entonces, los ganglios se tripsinaron, se disociaron mecánicamente y se sembraron a una densidad de 100-300 células por pocillo en medio sin suero definido en placas de 4 pocillos (Greiner) recubiertas con poli-Lornitina y laminina.

Las neuronas trigeminales E17/18 se cultivaron tanto sin factores neurotróficos añadidos (control negativo) como en presencia de concentraciones saturantes de NGF humano (400 pM y 15 pM) (control positivo); NT3 (400 pM); o MSP (600 pM). Se establecieron cultivos por duplicado que incluyeron concentraciones variables de Fab E3 y 911 y anticuerpos completos. La concentración de Fab y anticuerpos completos se indicó por sitio de unión (por ejemplo, un anticuerpo completo contiene dos sitios de unión, mientras que un Fab contiene un sitio de unión).

Las neuronas nodosas E17 se cultivaron tanto en ausencia de factores neurotróficos añadidos (control negativo) como con concentraciones saturantes de BDNF (400 pM) (control positivo) o NT4/5 (400 pM) o factor de crecimiento no relacionado con NGF ILF (factor inhibidor de interleucina). Se usaron altas concentraciones de neurotrofinas, ya que el objetivo de este experimento era probar la especificidad de los anticuerpos. Se establecieron cultivos por duplicado que incluyeron de nuevo variar con y sin la adición de anticuerpos E3 y 911. Después de 48 horas en cultivo, el número total de neuronas que sobrevivió en cada pocillo bajo cada condición se determinó por recuento manual usando un microscopio de contraste de fase.

Los resultados de estos experimentos demostraron que los anticuerpos E3 y 911 bloquearon completamente la supervivencia que promovía los efectos de NGF sobre neuronas trigeminales E18. Por el contrario, los anticuerpos E3 y 911 no tuvieron efecto sobre la supervivencia de neuronas trigeminales promovidas por NT3 o MSP, o la supervivencia de neuronas nodosas promovidas por BDNF o NT4/5 o LIF. Estos resultados demostraron que el anticuerpo E3 poseyó especificidad selectiva por NGF, ya que no se detectó interacción entre estos anticuerpos y otras neurotrofinas relacionadas con NGF (NT3, NT4/5, BDNF) a concentraciones de 1000 veces a 10.000 veces superiores a una concentración eficaz para bloquear NGF. Además, estos resultados demostraron que la muerte neuronal observada en cultivos complementados con NGF de neuronas dependientes de NGF con la adición de anticuerpo o Fab E3 fue debida a una interacción específica entre estos anticuerpos y NGF y no fue debida a un efecto tóxico generalizado. También se probó el anticuerpo antagonista anti-NGF de ratón 911, y se observaron resultados similares. Obsérvese que debido a las altas concentraciones de neurotrofinas usadas, tanto el anticuerpo E3 como 911 están muy próximos a sus condiciones de valoración y era de esperar que se unieran a NGF a niveles similares debido a que las diferencias en la afinidad de unión de estos anticuerpos por NGF serían menos evidentes bajo estas condiciones.

Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 14, 15, 16 y 17. Los datos mostraron porcentaje de supervivencia medio después de 48 horas en cultivo (± error estándar de la media, n=3 para cada punto de datos) con respecto a la supervivencia observada en el control positivo para cada experimento (por ejemplo, 100% de supervivencia de neuronas trigeminales cultivadas en presencia de concentración saturante de NGF, y 100% de supervivencia de neuronas nodosas cultivadas en presencia de concentración de BDNF saturante, respectivamente). Las Figuras 14-15 son gráficas que muestran que el anticuerpo antagonista anti-NGF E3 o Fab E3 no inhibió la supervivencia promovidas por NT3 y MSP, incluso a concentraciones de anticuerpo de hasta 200 nM. Por el contrario, 20 nM del anticuerpo E3 o Fab 3E y Fab 911 bloquearon totalmente la supervivencia provocada por NGF. También se probó el anticuerpo antagonista anti-NGF de ratón 911, y se observaron resultados similares. Específicamente, la Figura 14 es una gráfica que muestra la comparación del efecto de diversas concentraciones (20 nM, 2 nM, o 0,2 nM) de Fab E3 (llamado “3E” en la figura) y el anticuerpo de ratón Fab 911 sobre la supervivencia de neuronas trigeminales E18 en presencia de neurotrofina no añadida (llamado “control”), NGF 400 pM (llamado “NGF-400pM), NT3 10 nM (llamado “NT3-10nM) o MSP 600 pM (llamado “MSP-600pM). La Figura 15 es una gráfica que representa la comparación del efecto de diversas concentraciones (200 nM y 80 nM) de anticuerpo Fab y completo E3 y el anticuerpo de ratón anticuerpo completo 911 y Fab de supervivencia de neuronas trigeminales E17 en presencia de neurotrofinas no añadidas (llamado “sin factor”), NGF 400 pM (llamado “NGF400pM), NT3 10 nM (llamado “NT3-10nM) o MSP 600 pM (llamado “MSP-600pM).

Las Figura 16-17 son gráficas que muestran que el anticuerpo antagonista anti-NGF E3 o Fab E3 no inhibió la supervivencia de neuronas nodosas E17 promovida por BDNF, NT4/5 o LIF. También se probó el anticuerpo antagonista anti-NGF de ratón 911, y se observaron resultados similares. Específicamente, la Figura 16 es una gráfica que muestra la comparación del efecto de diversas concentraciones (200 nM o 80 nM) de anticuerpo completo E3 (llamado “3E” en la figura), Fab E3, anticuerpo completo 911 o Fab 911 sobre la supervivencia de neuronas nodosas E17 en presencia de neurotrofinas no añadidas (llamado “sin factores”), BDNF 400 pM (llamado “BDNF-400pM), NT4/5 400 pM (llamado “NT4/5-400pM), o LIF 2,5 nM (llamado “LIP-2,5nM). La Figura 17 es una gráfica que muestra la comparación del efecto de diversas concentraciones (200 nM, 20 nM, 2 nM) de Fab E3

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(continuación)

Días 2-8

Días 2-14 Días 2-21 Días 2-28

10 µg/kg

-671 (0,04) (0,17) -1174 (0,05) (0,24) -1623 (0,15) (0,55) -2020 (0,29) (0,81)

30 µg/kg

-733 (0,02) (0,09) -1371 (0,02) (0,08) -2042 (0,04) (0,17) -2566 (0,10) (0,40)

100 µg/kg

-766 (<0,01) (0,02) -1403 (<0,01) (0,02) -1996 (0,02) (0,10) -2726 (0,04) (0,17)

300 µg/kg

-769 (<0,01) (0,02) -1340 (<0,01) (0,04) -1869 (0,04) (0,17) -2521 (0,07) (0,29)

Todos

-713 (<0,01) (<0,01) -1269 (<0,01) (<0,01) -1752 (0,01) (0,06) -2254 (0,04) (0,18)

El análisis estadístico se realizó sin ajuste y con ajuste para múltiples comparaciones. La primera fila de los valores de p entre paréntesis para cada intervalo de tiempo fue sin ajuste; la segunda fila de los valores de p entre 5 paréntesis fue con ajuste de Dunnett.

Como se muestra en la Figura 26, el porcentaje de reducción máxima en SPID por la única administración de anticuerpo anti-NGF E3 alcanzó aproximadamente del 45% a aproximadamente el 65% del día 2 al día 14 para cada dosis de E3 probada, y alcanzó aproximadamente del 45% a aproximadamente el 60% del día 2 al día 28 para 10 µg/kg, 30 µg/kg, 100 µg/kg y 300 µg/kg de dosis de E3.

10 Como se muestra en la Figura 27, la administración del anticuerpo anti-NGF E3 también redujo la puntuación de WOMAC del día 1 al día 28. La puntuación de dolor, función física y rigidez se redujeron significativamente a 100 µg/kg de dosis de E3. Estos datos indican que la única administración de anticuerpo anti-NGF no sólo reduce el dolor, sino que también mejora la función física y rigidez en pacientes que tienen osteoartritis.

Depósito de material biológico

15 Los siguientes materiales se han depositado en la Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EE.UU. (ATCC):

Material Nº de acceso de ATCC Fecha del depósito

Eb.911.3E cadena ligera de E3 PTA-4893 8 de enero de 2003

Eb.pur.911.3E cadena ligera de E3 PTA-4894 8 de enero de 2003

Db.911.3E cadena pesada de E3 PTA-4895 8 de enero de 2003

El vector Eb.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena ligera de E3; el vector Eb.pur.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena ligera de E3 y el vector Db.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena pesada de E3.

20 Este depósito se hizo bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento de patente y las reglamentaciones bajo el mismo (Tratado de Budapest). Éste asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. El depósito será puesto a disposición por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y

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Claims (1)

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