ES2638579T3 - Composiciones de anticuerpos recombinantes contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico - Google Patents

Abstract

Una composición de anticuerpos para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto que se ha sometido a un régimen de tratamiento anterior que implica un anticuerpo anti-EGFR humano, comprendiendo dicha composición de anticuerpos 5 una primera molécula de anticuerpo anti-EGFR humano y una segunda molécula de anticuerpo anti- EGFR humano distinta de la primera molécula, a) en donde la primera molécula de anticuerpo anti-EGFR humano se selecciona del grupo que consiste en: i) un anticuerpo cuya cadena ligera comprende los aminoácidos 3-216 de la SEQ ID NO: 72, y cuya cadena pesada comprende los aminoácidos 3-124 de la SEQ ID NO: 40 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91; ii) un anticuerpo cuya cadena ligera comprende los aminoácidos 3-109 de la SEQ ID NO: 72 y cuya cadena pesada comprende los aminoácidos 3-124 de la SEQ ID NO: 40; y iii) un anticuerpo que tiene las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera en la SEQ ID NO: 72 y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada en la SEQ ID NO: 40; y b) en donde la segunda molécula de anticuerpo anti-EGFR humano se selecciona del grupo que consiste en: i) un anticuerpo cuya cadena ligera comprende los aminoácidos 3-221 de la SEQ ID NO: 73, y cuya cadena pesada comprende los aminoácidos 3-120 de la SEQ ID NO: 41 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 91; ii) un anticuerpo cuya cadena ligera comprende los aminoácidos 3-114 de la SEQ ID NO: 73 y cuya cadena pesada comprende los aminoácidos 3-120 de la SEQ ID NO: 41; y iii) un anticuerpo que tiene las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera en la SEQ ID NO: 73 y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada en la SEQ ID NO: 41.

Description

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Para estos métodos, la composición de anticuerpos puede ser cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento. Preferentemente, la composición de anticuerpos de la invención es tal como se describe en la sección titulada Una composición de anticuerpo preferida, es decir, una composición de anticuerpo basada en los anticuerpos 1024 y 992 tal como se describe en el presente documento.

Definiciones

El término “anticuerpo” describe un componente de suero funcional y a menudo hace referencia a cualquiera de una colección de moléculas (anticuerpos o inmunoglobulinas) o a una molécula (la molécula de anticuerpo o la molécula de inmunoglobulina). Una molécula de anticuerpo tiene la capacidad de unirse a, o reaccionar con, un determinante antigénico específico (el antígeno o el epítopo antigénico), que a su vez, puede conducir a la inducción de mecanismos efectores inmunológicos. Una molécula de anticuerpo individual normalmente se considera como monoespecífica, y una composición de moléculas de anticuerpo pueden ser monoclonal (es decir, consistir en moléculas de anticuerpo idénticas) o policlonal (es decir, consistir en dos o más moléculas de anticuerpo diferentes que reaccionan con el mismo epítopo o con epítopos diferentes en el mismo antígeno o incluso en antígenos diferentes, distintos). Cada molécula de anticuerpo tiene una estructura exclusiva que permite que se una específicamente a su antígeno correspondiente, y todas las moléculas de anticuerpo naturales tienen la misma estructura básica general de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos también se conocen conjuntamente como inmunoglobulinas. Los términos anticuerpo o anticuerpos, de la manera en la que se usa en el presente documento, también pretenden incluir anticuerpos quiméricos y monocatenarios, así como fragmentos de unión de anticuerpos, tales como Fab, fragmentos Fv o fragmentos scFv, así como formas multiméricas tales como moléculas de IgA diméricas o IgM pentavalente. Un anticuerpo puede ser humano, murino, quimérico, humanizado o puede remodelarse.

La expresión “par codificante VH y VL homólogo” describe un par original de secuencias codificantes VH y VL contenidas dentro, o procedentes de, la misma célula productora del anticuerpo. Por tanto, un par VH y VL homólogo representa el emparejamiento de VH y VL originalmente presente en el donante del cual procede dicha célula. La expresión “un anticuerpo expresado a partir de un par codificante VH y VL” indica que un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se produce a partir de un vector, plásmido o similar, que contiene las secuencias codificantes VH y VL. Cuando se expresa un par codificante VH y VL homólogo, bien como un anticuerpo completo o como un fragmento estable del mismo, conserva la afinidad y especificidad de unión del anticuerpo originalmente expresado a partir de la célula de la que procede. Una biblioteca de pares homólogos también se denomina repertorio o colección de pares homólogos, y puede guardarse individualmente o agruparse.

El término “CDR” -región determinante de la complementariedad -es como definen Lefranc et al (2003) en IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp Immunol 27, 55-77.

La expresión “un miembro distinto de una proteína policlonal recombinante” se refiere a una molécula de proteína de una composición de proteínas que comprende moléculas de proteína homólogas aunque diferentes, siendo cada molécula de proteína homóloga a las otras moléculas de la composición, aunque conteniendo también uno o más tramos de secuencia polipeptídica variable, que se caracteriza (caracterizan) por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal.

La expresión “promotores cabeza con cabeza” se refiere a un par de promotores que se coloca en estrecha proximidad de tal manera que la transcripción de dos fragmentos génicos conducida por los promotores se produce en direcciones opuestas. Un promotor cabeza con cabeza también puede construirse con un relleno compuesto de ácidos nucleicos irrelevantes entre los dos promotores. Dicho fragmento de relleno puede contener fácilmente más de 500 nucleótidos. Los promotores cabeza con cabeza también se denominan promotores bidireccionales.

La expresión “inmunoglobulina” normalmente se usa como un nombre colectivo de la mezcla de anticuerpos que se encuentra en la sangre o en el suero, pero también puede usarse para nombrar una mezcla de anticuerpos que procede de otras fuentes.

La expresión “molécula de inmunoglobulina” indica una molécula de anticuerpo individual, por ejemplo, que forma parte de una inmunoglobulina, o parte de cualquier composición de anticuerpos policlonal o monoclonal.

La expresión “una biblioteca de moléculas de ácido nucleico variante de interés” se usa para describir el conjunto de moléculas de ácido nucleico, que colectivamente codifica una “proteína policlonal recombinante de interés”. Cuando se usa para la transfección, la biblioteca de moléculas de ácido nucleico variante de interés está contenida en una biblioteca de vectores de expresión. Dicha biblioteca típicamente tiene al menos 2, 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 o 106 miembros distintos.

La expresión “transferencia masiva” se usa para describir la transferencia de secuencias de ácido nucleico de interés de una población de vectores a otra población de vectores y hacer esto para cada ADN simultáneamente sin recurrir el aislamiento del ADN individual de interés. Dichas poblaciones de vectores pueden ser bibliotecas que contienen,

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consistir en un subconjunto definido de moléculas de proteína, que se ha definido por una característica común, tal como la actividad de unión compartida hacia una diana deseada, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo policlonal contra el antígeno diana deseado.

Por “proteína o “polipéptido” se entiende que es cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación postraduccional. Las proteínas pueden existir como monómeros o multímeros, que comprenden dos o más cadenas polipeptídicas, fragmentos de proteínas, polipéptidos, oligopéptidos o péptidos ensamblados.

El término “RFLP” (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a “polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción”, un método mediante el cual el patrón migratorio del gel de los fragmentos de la molécula de ácido nucleico se analiza después de escisión con enzimas de restricción.

La expresión “translocación” describe situaciones en las que dos o más miembros distintos de una proteína policlonal que comprende dos cadenas polipeptídicas diferentes, por ejemplo, de la superfamilia de inmunoglobulina, se expresan a partir de una célula individual. Esta situación puede surgir cuando la célula individual ha integrado, en el genoma, más de un par de segmentos génicos, en el que cada par de segmentos génicos codifica un miembro distinto de la proteína policlonal. En dichas situaciones pueden hacerse combinaciones involuntarias de las cadenas polipeptídicas expresadas a partir de los segmentos génicos. Estas combinaciones involuntarias de las cadenas polipeptídicas podrían no tener ningún efecto terapéutico.

La expresión “translocación de cadenas VH-VL” es un ejemplo de la translocación descrita anteriormente. En este ejemplo, los segmentos génicos que codifican VH y VL constituyen un par de segmentos génicos. La translocación ocurre cuando se producen combinaciones involuntarias de polipéptidos de VH y VL de una célula en la que dos pares de segmentos génicos que codifican VH y VL diferentes se integran en la misma célula. Es probable que dicha molécula de anticuerpo translocada no conserve la especificidad original y por tanto podría no tener ningún efecto terapéutico.

El término “transfección”, como se usa en el presente documento, es un término amplio para introducir ADN extraño en una célula. El término también significa que incluye otros métodos equivalentes funcionales para introducir ADN extraño en una célula, tal como, por ejemplo, transformación, infección, transducción o fusión de una célula donadora y una célula aceptora.

Las expresiones “secuencia polipeptídica variable” y “región variable” se usan indistintamente.

La expresión “epítopos distintos” significa que cuando dos anticuerpos diferentes se unen a epítopos distintos, hay una competencia menor del 100 % para la unión antigénica, preferentemente una competencia menor del 50 % para la unión antigénica, más preferentemente de un modo esencial no hay competencia para la unión antigénica. Un análisis para “epítopos distintos” de pares de anticuerpos se determina típicamente mediante experimentos de unión en condiciones de anticuerpos saturantes con cualquiera de análisis FACS en células que expresan EGFR y anticuerpos marcados individualmente con fluorescencia o Resonancia de Plasmón Superficial usando el antígeno EGFR capturado o conjugado con una superficie de célula de flujo como se describe en los ejemplos.

La expresión ser capaz de “inhibir la unión con EGF” cuando se aplica a una molécula de anticuerpo significa que la molécula de anticuerpo presenta un valor de CI50 con respecto a la unión de EGF con EGFR de menos de 10 nM, preferentemente menos de 8 nM, más preferentemente menos de 7 nM, más preferentemente menos de 5 nM, más preferentemente menos de 4 nM, más preferentemente menos de 3 nM, más preferentemente menos de 2 nM, más preferentemente menos de 2 nM, más preferentemente menos de 1 nM.

Las expresiones “receptor del factor de crecimiento epidérmico” “EGFR” y “antígeno EGFR” se usan indistintamente en el presente documento, e incluyen variantes, isoformas y homólogos de especie del EGFR humano. En una realización preferida, la unión de un anticuerpo de la invención con el antígeno EGFR inhibe el crecimiento de células que expresan EGFR (por ejemplo, una célula tumoral) inhibiendo o bloqueando la unión del ligando de EGFR con EGFR. La expresión “ligando de EGFR” incluye todos los ligandos (por ejemplo fisiológicos) para EGFR, incluyendo pero sin limitación EGF, TGF-alfa, EGF de unión a heparina (HB-EGF), anfirregulina (AR), herregulina, betacelulina y epirregulina (EPI). En otra realización preferida, la unión de un anticuerpo de la invención con el antígeno EGFR media la fagocitosis de células efectoras y/o la destrucción de células que expresan EGFR.

Estructura de dominio de EGFR: la parte extracelular del EGFR maduro (SwissProt n.º de acceso P00533) consta de 621 aminoácidos y de cuatro dominios receptores: el dominio I incluye los restos 1-165, el dominio II los restos 166312, el dominio III los restos 313-481 y el dominio IV los restos 482-621 (Cochran et al., 2004, J. Immunol. Methods 287, 147-158). Se ha sugerido que los dominios I y III contribuyen a la formación de sitios de unión de alta afinidad para ligandos. Los dominios II y IV son regiones similares a laminina ricas en cisteína que estabilizan el plegamiento de las proteínas y contienen una posible interfaz de dimerización con EGFR.

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Como se usa en el presente documento, la expresión “inhibe el crecimiento” (por ejemplo, referente a células) pretende incluir cualquier disminución medible en la proliferación (aumento en el número de células) o metabolismo de una célula cuando se pone en contacto con un anticuerpo contra EGFR en comparación con el crecimiento de las mismas células que no se ponen en contacto con un anticuerpo contra EGFR, por ejemplo, la inhibición del crecimiento de un cultivo de células por al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80%, 90%, 99% o 100%.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “inhibe la unión” y “bloquea la unión” (por ejemplo, en referencia a la inhibición/bloqueo de la unión de un ligando de EGFR con EGFR) se usan indistintamente e incluyen inhibición/bloqueo tanto parcial como completo. La inhibición/bloqueo de la unión del ligando de EGFR con EGFR reduce o altera preferentemente el nivel o tipo normal de señalización celular que se produce cuando el ligando de EGFR se une a EGFR sin inhibición o bloqueo. La inhibición y el bloqueo también pretenden incluir cualquier disminución medible en la afinidad de unión del ligando de EGFR con EGFR cuando se pone en contacto con un anticuerpo contra EGFR en comparación con el ligando cuando no se pone en contacto con un anticuerpo contra EGFR, por ejemplo, el bloqueo de ligandos de EGFR con EGFR por al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% o 100%.

La expresión “anticuerpo recombinante” se usa para describir una molécula de anticuerpo o diversas moléculas de anticuerpo que se expresa (expresan) a partir de una célula o línea celular transfectada con un vector de expresión que comprende la secuencia codificante del anticuerpo que no está asociada de manera natural con la célula.

Cáncer -Cáncer (término médico: neoplasia maligna) es una clase de enfermedades en las que un grupo de células presenta un crecimiento descontrolado (división más allá de los límites normales), invasión (intrusión en y destrucción de los tejidos adyacentes), y a veces metástasis (se extienden a otras partes del cuerpo a través de la linfa o la sangre). Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencia de los tumores benignos, que están autolimitados, no son invasivos ni metastatizan. La mayoría de los cánceres forman un tumor, pero algunos, como la leucemia, no lo hacen. El cáncer también se puede denominar crecimiento neoplásico y trastorno hiperproliferativo.

Terapia adyuvante: Tratamiento dado tras el tratamiento primario para aumentar las esperanzas de una cura. La terapia adyuvante puede incluir quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal o terapia biológica.

Quimioterapia: Tratamiento con fármacos de moléculas pequeñas.

Radioterapia: Tratamiento con radiación.

Terapia de primera línea: El primer tratamiento para una enfermedad o afección. En pacientes con cáncer, la terapia de primera línea puede ser la cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia con anticuerpos o una combinación de estas terapias. También denominado terapia primaria y tratamiento primario.

Terapia de segunda línea: Tratamiento que se da cuando un tratamiento inicial (terapia de primera línea) no funciona

o deja de funcionar.

Terapia de tercera línea: Tratamiento dado cuando la terapia de segunda línea no funciona o deja de funcionar.

TKI -inhibidores de inhibidores de tirosina

Progresión: En medicina, el trascurso de una enfermedad, tal como cáncer, a medida que empeora o se propaga en el cuerpo.

Cáncer resistente: Cáncer que no responde al tratamiento. El cáncer puede ser resistente al comienzo del tratamiento o puede volverse resistente durante el tratamiento. También denominado cáncer refractario. En contraste con esto, un tratamiento eficaz provoca la erradicación del tumor.

Cáncer parcialmente resistente: Un cáncer parcialmente resistente responde al tratamiento, pero el tratamiento no provoca la erradicación del tumor. En un cáncer parcialmente resistente, el crecimiento tumoral se puede inhibir parcialmente o completamente, pero el tumor no remite o solo remite de manera insignificante.

La resistencia o la resistencia parcial a un anticuerpo anti-EGFR seleccionado del grupo que consiste en Cetuximab, panitumumab, Zalutumumab, nimotuzumab, ICR62, mAb425, Matuzumab y anticuerpos capaces de unirse al mismo epítopo como cualquiera de estos se puede observar en un paciente que recibe uno o más de los anticuerpos, o se puede medir en un ensayo in vitro, por ejemplo, determinando la expresión de EGFR y la no unión o la unión baja del anticuerpo monoclonal, o en un ensayo de proliferación tal como se describe en el Ejemplo 21.

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Descripción de los dibujos

Figura 1: Clasificación de esplenocitos (para detalles véase el Ejemplo 1). Se realizaron las siguientes selecciones (representadas):

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Selección 1: células vivas (representación gráfica de FSC/yoduro de propidio). (Panel izquierdo inferior)

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Selección 2: las células plasmáticas se seleccionan como CD43 pos/CD138 pos (Panel derecho inferior)

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Selección 3: discriminación doblete (panel derecho superior)

Figura 2: PCR mSymplex™ murina. RT-PCR de extensión solapante Multiplex para la amplificación y unión afín de genes de anticuerpo de cadena pesada y ligera de una sola célula. Para detalles remítase al Ejemplo 1.

Figura 3: Clonación del repertorio murino. Un conjunto de productos de la PCR mSymplex™ que codificaba los pares de genes VH/VL de células plasmáticas sencillas se cortaron y empalmaron con el gen que codificaba la cadena ligera constante kappa humana mediante corte y empalme por extensión solapante. El conjunto de genes, que codificaban anticuerpos quiméricos completos de ser humano-ratón, se insertó en un vector de expresión seguido de una inserción de un casete promotor bidireccional (2xCMV)

Figura 4: Representación esquemática del vector de expresión de anticuerpos de longitud completa de mamífero 00VP-002. Amp y Amp pro, gen de resistencia a ampicilina y su promotor; origen pUC, origen de replicación pUC; CMV, promotor de mamífero que dirige la expresión de la cadena ligera y la cadena pesada; líder IGHV, líder de cadena pesada humana genómica; relleno H, inserto que se intercambia por la secuencia que codifica la región variable de cadena pesada; IGHG1, secuencia que codifica la región constante de la cadena pesada del isotipo G1 de inmunoglobulina genómica (la secuencia se muestra en el Anexo 2); β globina A de conejo, secuencia poli A de la betaglobina de conejo; Líder IGKV, líder kappa murino; relleno L, inserto que se intercambia por secuencia que codifica la cadena ligera, term SV40, secuencia terminadora del virus de simio 40; FRT, sitio de reconocimiento diana de Flp; Neo, gen de resistencia a neomicina; SV40 poli A, secuencia señal poli A del virus de simio 40.

Figura 5: Análisis de grupo de la diferencia de absorbancia a 450-620 nm. Los sobrenadantes se agruparon según reactividad tal como se indica con el número indicado (del 1 al 4) después del número de clon. El color gris oscuro indica una disminución en el número de células metabólicamente activas, mientras que el gris claro indica un aumento en el número de células metabólicamente activas. El color negro indica sobrenadantes sin efecto sobre el número de células metabólicamente activas.

Figura 6: Grado de inhibición de anticuerpos contra EGFR con anticuerpos de referencia enumerados dirigidos contra dominios específicos de EGFR, determinado en un ensayo ELISA de competición. A) Cálculo de inhibición. B) La puntuación de inhibición es la siguiente: 25-49 %: competición moderada (+); 50-74 %: competición fuerte (++); 75-100 %: competición muy fuerte (+++). Los cuadros que presenta inhibición significativa (50-100 %) se sombrean en gris. Erbitux y Vectibix se muestran por duplicado (cuatro experimentos independientes) para ilustrar la reproducibilidad del ensayo. Ab2 (225) es el precursor murino que conduce a Erbitux.

Figura 7: Ilustración de un ciclo de mapeo epitópico realizado en el aparato Biacore 3000 SPR, en el que un mAb de muestra compite por la unión con el dominio extracelular de EGFR con cuatro anticuerpos de referencia diferentes.

Figura 8: Grado de inhibición de anticuerpos contra EGFR con anticuerpos de referencia enumerados dirigidos contra dominios específicos de EGFR, determinado por análisis de competición con tecnología de resonancia por plasmón superficial, SPR. A) Cálculo de inhibición. B) La puntuación de la inhibición fue la siguiente: 25-49 %: competición moderada (+); 50 -74 %: competición fuerte (++); 75-100 %: competición muy fuerte (+++). Las células que representan inhibición significativa (50-100 %) se sombrean en gris. El clon 1229 marcado con asterisco (*) no se unió en el ensayo Biacore.

Figura 9: Determinación de grupos de epítopos dentro del repertorio de anticuerpos contra EGFR mediante análisis de competición con SPR de pares de anticuerpos contra EGFR. Los anticuerpos se agruparon de acuerdo con un supuesto reconocimiento de dominio de EGFR. Las células en las que se descubrieron combinaciones de anticuerpos que se unían a epítopos solapantes que dieron como resultado una inhibición de más del 50 % se sombrean en color gris. Las células en las que no se realizaron determinaciones se colorearon en negro. A) Cálculo de inhibición. B) La puntuación de la inhibición fue la siguiente: 25-49 %: competición moderada (+); 50-74 %: competición fuerte (++); 75-100 %: competición muy fuerte (+++).

Figura 10: Mapas epitópicos de anticuerpos de referencia y anticuerpos contra EGFR dirigidos contra el dominio extracelular de EGFR determinado por análisis Biacore. A) Mapeo epitópico de anticuerpos dirigidos contra el dominio I o dominio I/II del dominio extracelular (ECD, Extra Cellular Domain) de EGFR. B) Mapeo epitópico de anticuerpos dirigidos contra el dominio III del ECD de EGFR.

Figura 11: Investigación de la unión simultánea de una mezcla oligoclonal de anticuerpos dirigidos contra epítopos no solapantes en EGFR. A) adición secuencial de anticuerpos contra el dominio III, dominio I o especificidad desconocida. Los valores de inhibición de los mAb de muestras sencillas ensayados frente a diferentes mezclas de

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Figura 37: Inhibición de la proliferación de células A431 NS. El eje X muestra diferentes combinaciones representativas de 3 anticuerpos de la invención. El eje Y muestra la actividad metabólica como porcentaje de control no tratado (control). Se representan barras de error +/-ETM. Para detalles adicionales véase el Ejemplo 6.

Figura 38. Efecto inhibidor del crecimiento de dos dosis diferentes de la mezcla de 992+1024 en comparación con Erbitux en xenoinjertos tumorales humanos A431 NS. Ratones nu/nu BALB/c se inocularon con 106 células A431 NS. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 100 mm3 (día 8) los ratones se asignaron al azar en grupos de 9 y comenzó el tratamiento. Los anticuerpos indicados se inyectaron a 0,5 mg/dosis o a 1 mg/dosis, dos veces a la semana durante un total de 9 inyecciones. En el gráfico, el área en color gris claro indica el periodo de tratamiento. El inicio de una línea de puntos señala el momento en el cual el primer ratón de un grupo determinado se sometió a eutanasia debido a un tamaño tumoral excesivo. Las diferencias estadísticamente significativas entre 2 mg/semana de 992+1024 frente a 2 mg/semana de Erbitux y 1 mg/semana de 992+1024 frente a 2 mg/semana de Erbitux se calcularon todas el día 60 excepto el grupo de 992+1024 2 mg/semana. El tamaño tumoral de los animales excluidos antes del día 60 se realizó, por tanto, el gráfico muestra el volumen tumoral acumulado de todos los ratones en un grupo determinado. Se muestran los valores medios +/-ETM.

Figura 39: Representación gráfica Kaplan-Meyer de la supervivencia de los ratones tratados con la mezcla de anticuerpos 992+1024, Erbitux o anticuerpo de control (mismo experimento que el mostrado en la Figura 38). Los resultados se presentan como porcentaje de supervivencia de los ratones tratados. Se observó una diferencia significativa entre el porcentaje de supervivencia de los ratones en los grupos tratados con una dosis alta (2 mg/semana, P = 0,0008)) y una dosis baja (1 mg/semana, P = 0,0004) cuando se comparaba con 992+1024 y Erbitux. Además, una dosis baja de 992+1024 fue significativamente mejor cuando se comparó con una dosis alta de Erbitux (P = 0,0087). La diferencia estadística se calculó usando un ensayo de rango logarítmico (Mantel-Cox).

Figura 40: Análisis de reactividad cruzada de las IgG 992, 1024 y 1320 contra células CHO transfectadas con EGFR de longitud completa de Cinomolgo y de Humano mediante análisis FACS. El anticuerpo unido se detectó con un anticuerpo de cabra contra Fc F(ab’)2 de IgG de ser humano marcado con PE. La selección se realizó en células uniformes (propiedades SCC/FCS) que expresaban EGFR. La unión se expresó como % máximo de unión del anticuerpo a una concentración de 1 nM.

Figura 41: Alineamiento Clustalw2 de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables candidatas humanizadas (hu) y murinas (qui (quiméricas)) de las cadenas tanto pesada como ligera de 992 (A) y 1024 (B). Las regiones CDR, definidas por IMGT, se indican subrayadas; los huecos se presentan con (-), los aminoácidos idénticos con (*), las mutaciones conservativas con (:) y las semiconservativas con (.). El aminoácido en negrita indica posiciones de aminoácidos donde se realizarán retromutaciones en el resto murino identificado original si las variantes estructurales completamente humanas presentan afinidad de unión disminuida. Los números de secuencia ID son los siguientes: VH 992 humanizado (SEQ ID NO 104). VL 992 humanizado (SEQ ID NO 105). VH 1024 humanizado (SEQ ID NO 106). VL 1024 humanizado (SEQ ID NO 107). VH 992 quimérico (aa 3-124 de SEQ ID NO 40). VL 992 quimérico (aa 3-109 de SEQ ID No 72). VH 1024 quimérico (aa 3-120 de SEQ ID NO 41). VL 1024 quimérico (aa 3-114 de SEQ ID NO 73).

Figura 42A: Representación esquemática de los genes que codifican el dominio variable doble para 992L1024; IGHV 992L1024 (751 pb) se representa desde el sitio de restricción 5’ AscI seguido por IGHV 992, el enlazador ASTKGP, IGHV 1024 y terminación en el sitio de restricción 3’ XhoI, IGKV 992L1024 (1071 pb) se representa desde el sitio de restricción 5’ NheI seguido por IGKV 992, el enlazador TVAAP, IGKV 1024, IGKC y la terminación en el sitio de restricción 3’ NotI.

Figura 42B: Representación esquemática de los genes que codifican el dominio variable doble de 1024L992; IGHV 1024L992 (751 pb) se representa desde el sitio de restricción AscI 5’ seguido por IGHV 1024, el enlazador ASTKGP, IGHV 992 y terminación en el sitio de restricción 3’ XhoI, IGKV 1024L992 (1071 pb) se representa desde el sitio de restricción 5’ NheI seguido por IGKV 1024, el enlazador TVAAP, IGKV 992, IGKC y terminación en el sitio de restricción 3‘ NotI.

Figura 43: Actividad metabólica de células HN5wt en FBS al 0,5 % (máximo) y células HN5 resistentes a Erbitux (mínimo) en presencia de concentraciones variantes de los anticuerpos indicados. Leyenda: los anticuerpos 992 y 1024 son tal como se definen en la presente solicitud. Sym004 es una composición de anticuerpos con los anticuerpos 992 y 1024.

Figura 44: Curvas de crecimiento tumoral de los tumores individuales A431NS después del tratamiento inicial con 1 mg de una composición de anticuerpos con los anticuerpos 992+1024 para un total de nueve inyecciones (recuadro gris de la izquierda). Todos los tumores respondieron a la terapia pero no más de 80 días tras el tratamiento, tres de los tumores comenzaron a crecer de nuevo. El tratamiento de nuevo de estos tumores con una composición de anticuerpos con los anticuerpos 992+1024 indujo regresión tumoral (recuadros grises de la derecha).

Figura 45: Los ratones BALB/c nu/nu con xenoinjertos de tumores A431NS se trataron previamente con Erbitux y posteriormente se distribuyeron al azar para continuar con el tratamiento de Erbitux o cambiar a un tratamiento con

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una composición de anticuerpos con los anticuerpos 992+1024 (Sym004 en la leyenda de la Figura) cuando los tumores tenían un tamaño de tumor promedio de aproximadamente 500 mm3. Se vio un descenso significativo de la carga tumoral en el grupo que se cambió al tratamiento con una composición de anticuerpos con los anticuerpos 992+1024 en comparación con el grupo que continuó con el tratamiento de Erbitux.

Figura 46: Actividad metabólica de clones HN5 resistentes a Erbitux en FBS al 0,5 % en presencia de las concentraciones variables de los anticuerpos indicados.

Figura 47: Crecimiento de xenoinjertos de tumor del clon n.º 7 de HN5 resistente a Erbitux tratado con 50 mg/kg de Sym004 o Erbitux. El error estándar de la media se indica en el gráfico.

Descripción detallada de la invención

Mezclas de anticuerpos

La invención se refiere a una composición de anticuerpos para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto que se ha sometido a un régimen de tratamiento anterior que implica un anticuerpo anti-EGFR humano o en el que dicho cáncer es resistente o parcialmente resistente al tratamiento con al menos un otro anticuerpo anti-EGFR, comprendiendo dicha composición de anticuerpos al menos 2 moléculas de anticuerpo anti-EGFR humano distintas. En la presente invención los al menos 2 anticuerpos anti-EGFR humanos se unen a epítopos no solapantes. La naturaleza no solapante de los anticuerpos se determina preferentemente usando anticuerpos marcados de manera diferente en un análisis FACS con células que expresan EGFR o usando resonancia de plasmón superficial usando el antígeno EGFR capturado o conjugado con una superficie de célula de flujo. También pueden usarse métodos basados en ELISA como se describe en los ejemplos. Una composición que se une a dos o más epítopos de EGFR no solapantes puede usarse contra una amplia serie de tipos de cáncer dependiente de EGFR dado que puede ser menos vulnerable a diferencias en la conformación de EGFR y menos vulnerable a mutaciones en comparación con una composición de anticuerpos monoclonales que se dirige a uno o más epítopos. Adicionalmente, la composición de anticuerpos que se une a dos o más epítopos de EGFR no solapantes puede proporcionar una eficacia superior en comparación con una composición que se dirige a solo un epítopo. En particular, la composición de anticuerpos puede proporcionar eficacia superior con respecto a la diferenciación terminal de células cancerosas in vivo. Para una terapia con anticuerpos monoclonales contra EGFR una determinada proporción de pacientes no responderá eficazmente al tratamiento con anticuerpos. Para algunos de los pacientes, esto puede deberse a la rápida eliminación del anticuerpo o debido a que el anticuerpo genera una respuesta inmunitaria en el paciente contra el anticuerpo. Para algunos pacientes, la ausencia de respuesta puede ser porque su cáncer dependiente de EGFR particular expresa EGFR en una conformación en la que el anticuerpo monoclonal no puede unirse a su epítopo. Esto podría deberse a diferencias en la glucosilación, debido a una deleción de dominio, o debido a mutaciones y/o SNP.

Además, para algunos cánceres, la estimulación autocrina del EGFR causada por la producción de ligandos de células cancerosas es importante, aunque en otros casos, el EGFR expresado por las células cancerosas no requiere estimulación de ligando. Para los últimos tipos de cáncer, un anticuerpo capaz de inhibir la unión con el ligando puede que no sea eficaz.

Una composición de anticuerpos en la que los anticuerpos pueden unirse al menos a dos epítopos distintos en EGFR será más ampliamente aplicable, dado que disminuye la probabilidad de que se cambien ambos epítopos en comparación con el epítopo (o epítopos) reconocido por los anticuerpos. Adicionalmente, la probabilidad de que el paciente elimine todos los anticuerpos es mucho más baja. La superioridad se ha mostrado más claramente en términos de inducción de diferenciación terminal de las células cancerosas usando dos anticuerpos de Dominio III con epítopos no solapantes. Dicha diferenciación terminal eficaz inducida por anticuerpos de las células cancerosas no se ha notificado anteriormente y representa una etapa significativa hacia adelante en el diseño eficaz de carcinoterapias basadas en anticuerpos. Resultados posteriores han mostrado que pueden obtenerse resultados similares o incluso superiores con una combinación particular de dos anticuerpos.

Para una eficacia clínica mejorada y una utilidad más general contra una amplia serie de tipos de cáncer dependientes de EGFR, el número de anticuerpos presente en la composición puede aumentarse. Por tanto, la composición puede comprender anticuerpos con capacidad para unirse a tres epítopos no solapantes. La composición puede comprender anticuerpos con capacidad para unirse a cuatro epítopos no solapantes. La composición puede comprender anticuerpos con capacidad para unirse a cinco epítopos no solapantes. La composición puede comprender anticuerpos con capacidad para unirse a seis epítopos no solapantes. Los ejemplos de la presente solicitud muestran que al menos seis anticuerpos distintos pueden unirse a la vez al EGFR (Ejemplo 3). Esto no excluye que sea posible, o incluso ventajoso, diseñar una composición que comprenda anticuerpos con capacidad para unirse a más de seis, tal como siete u ocho epítopos no solapantes, seleccionando cuidadosamente anticuerpos.

Puede haber ventajas de incluir anticuerpos con epítopos solapantes ya que esto aumenta la probabilidad de que se una el epítopo. Una lógica detrás de esto es que el epítopo, en algunos pacientes y/o en algunas células

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N.º de anticuerpo

Especificidad deltaEGFR EGFR de cinomolgo Inhib. de EGF Proliferación

1229

Sin dominio I/II sí No no sí (A431)

1284

Dominio I no Sí sí sí

1344

Dominio I/II no sí nd HN5 w/992

1260

Dominio I/II no Sí sí A431

1308

Dominio I no sí nd HN5 w/992

1347

Dominio I no sí nd HN5 w/992

1428

Dominio I y II no Sí sí HN5 w/992

A partir de los datos generados con los anticuerpos quiméricos ensayados en solitario o en combinación en ensayos de proliferación, unión, degradación/inactivación de receptor y motilidad, y en modelos animales, pueden extraerse diversas conclusiones.

Los resultados obtenidos con dos líneas celulares de cáncer, HN-5 y A431 (Ejemplo 6) se han repetido con líneas celulares de diferentes cánceres (MDA-MB-468 una línea celular de cáncer de mama; DU145 una línea celular de cáncer de próstata). Lo que es evidente a partir de estos experimentos es que las combinaciones de los anticuerpos proporcionadas por los autores de la presente invención presentan eficacia contra una serie muy amplia de líneas de células cancerosas, confirmando la eficacia de las composiciones de anticuerpos contra una serie de conformaciones de EGFR.

También se ha mostrado que la superioridad de las mezclas de anticuerpos es mayor en ensayos de proliferación cuando se añaden al medio de crecimiento concentraciones fisiológicas de ligando (EGF) en comparación con cuando no se añade EGF (Figura 17). De acuerdo con la bibliografía (Hayashi y Sakamoto 1998 J Pharmacobiodyn 11; 146-51) el suero contiene aproximadamente de 1 a 1,8 ng/ml o de 0,2 a 0,3 nM de EGF aunque se indica que el jugo gástrico contiene 0,3 ng/ml (aprox. 0,05 nM) (Pessonen et al. 1987 Life Sci 40; 2489-94). En un entorno in vivo, el EGF y otros ligandos de EGFR están probablemente presentes y la capacidad de la mezcla de anticuerpos para que sea efectiva en presencia de ligando EGFR es por lo tanto una característica importante de las mezclas de anticuerpos de la presente invención.

Los anticuerpos de ratón/ser humano quiméricos de la presente invención proporcionan mejores resultados cuando se usan en combinación que cuando se usan en solitario. Esto se ilustra en diversos experimentos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 6), en el que cuando los anticuerpos se ensayan en solitario solo muestran efectos antiproliferativos moderados en una línea celular de cáncer (A431-NS), pero cuando se usan en cualquier combinación, muestran resultados notablemente superiores. Estos resultados se han confirmado con numerosas combinaciones de los anticuerpos quiméricos de la presente invención. Se han obtenido resultados particularmente superiores con una composición que comprende los anticuerpos 992 y 1024.

Por ejemplo, en un ensayo de antiproliferación con A431-NS y HN-5, se han analizado diversos anticuerpos junto con cualquiera de los anticuerpos 992, 1208, 1254, y 1277.

Estudios de unión con receptores han mostrado que algunos anticuerpos pueden estimular realmente la unión de anticuerpos adicionales, de tal manera que un anticuerpo particular se une en mayores cantidades con el receptor después de la saturación del receptor con uno o varios anticuerpos. La unión del anticuerpo 992, dirigida contra el dominio III, se beneficia claramente de este efecto sinérgico obtenido por saturación previa del receptor con uno o más anticuerpos que se unen a epítopos no solapantes. Otro ejemplo de este efecto cooperativo se observa cuando el anticuerpo 1396, dirigido contra un epítopo desconocido, se ensaya contra EGFR saturado con anticuerpos que se unen a epítopos no solapantes.

Estudios de unión con receptores también han mostrado que es posible unir al menos 6 anticuerpos con el dominio extracelular de EGFR simultáneamente. Estos 6 anticuerpos representan 3 anticuerpos de dominio III, un anticuerpo de dominio I, un anticuerpo de dominio I/II y un anticuerpo que se une a un epítopo desconocido. Cabe destacar que, la unión de los tres anticuerpos de dominio III parece facilitar la unión posterior de anticuerpos adicionales. Esto confirma claramente el concepto de proporcionar composiciones de anticuerpos con diversos anticuerpos que se unan a epítopos distintos.

Cuando se diseña la composición de una composición de anticuerpos contra EGFR, los anticuerpos con epítopos no solapantes se usan preferentemente como estos proporcionando un efecto sinérgico superior.

El dominio III de EGFR es de importancia para la unión del ligando con el receptor. Además, la unión del anticuerpo con el Dominio III puede estabilizar al EGFR en la conformación monomérica unida, que no conduce a la señalización del receptor. Por estas razones, es preferible que la composición de anticuerpos contiene al menos dos anticuerpos con especificidad para el dominio III. Los anticuerpos de dominio III preferidos incluyen los anticuerpos 992, 1024, 1030, 1208, 1254, 1277 y 1320. La composición de anticuerpos puede comprender más de dos

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En el caso en el que la región constante Kappa de un clon seleccionado contenga mutaciones, introducidas durante la amplificación de los genes, esta se reemplaza por una región constante no mutada. Esto se realiza en una PCR solapante en la que el gen VL reparado (amplificado sin la región constante) se fusionó con una región constante con secuencia corregida (obtenida en una PCR distinta). La secuencia entera se amplificó y se clonó en el vector que contenía VH como se ha descrito anteriormente y en la cadena ligera reparada se secuenció para verificar la corrección.

Tabla 2 Programas de inmunización usados para generar material de partida para la clonación contra EGFR

Programa, Grupo de ratones

Cepa Inyección 1 Inyección 2 Inyección 3 Inyección 4 Finalización

101

Balb/c Día 1, 25 μg de rhEGFR (R&D systems 1095-ER) CFA s.c. Día 35, 25 μg de rhGH-EGFR (Symphogen) IFA s.c Día 56, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) IFA s.c Día 70, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) IFA s.c Día 73

108

Balb/c Día 1, 1x107 células HN5 CFA i.p. Día 28, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) IFA s.c. Día 42, 1x107 células HN5 IFA i.p. Día 56, 25 μg de rhEGFR*, (Symphogen) IFA s.c. Día 59

109

Balb/c Día 1, 1x107 células HN5, CFA i.p. Día 28, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) IFA s.c. Día 42, 1x107 células HN5 IFA i.p. Día 56, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) PBS i.v. Día 59

111

Balb/c Día 1, 25 μg de rhEGFR* (Symphogen) CFA s.c. Día 28, 25 μg de rhEGFR+ rhEGFRvIII** (Symphogen) IFA s.c. Día 42, 25 μg de rhEGFR+ rhEGFRvIII** (Symphogen) IFA s.c. Día 56, 25 μg de rhEGFR+ rhEGFRvIII** (Symphogen) IFA s.c. Día 59

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Balb/c Día 1, 1x107 células HN5 CFA i.p. Día 29, 100 μg de rhGH-EGFR (Symphogen) IFA s.c. Día 44, 1x107 células HN5 IFA i.p. Día 58, 25 μg de rhEGFR, (Sigma E3641) IFA s.c. Día 61

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C57B Día 1, 1x107 células HN5 CFA i.p. Día 29, 100 μg de rhGH-EGFR (Symphogen) IFA s.c. Día 44, 1x107 células HN5 IFA i.p. Día 58, 25 μg de rhEGFR, (Sigma E3641) IFA s.c. Día 61

Tabla 3 Mezcla de cebadores de extensión para RT-PCR de solapamiento Multiplex

Nombre del cebador

Conc. (nM) Secuencia SEQ ID

mHCre

0,2 GACSGATGGGCCCTTGGTGG 1

mKapp

0,2 GCTGTAGGTGCTGTCTTTGC 2

mVH

mVH A

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTCCARCTGCARCAGYCTG 3

mVH B

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCGARGTGMAGCTKGTKGAGTC 4

mVH C

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTGCAGCTKMAGGAGTC 5

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mVH 8

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTTACTCTGAAAGAGTC 6

mVH 9

0,04 TATTCCCATGGCGCGCCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTG 7

mVK

mVK D

0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAYATCCAGATGACHCARWCT 8

mVK E

0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCRACATTGTGMTGACHCAGTC 9

mVK F

0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCSAMATTGTKCTSACCCARTCTC 10

mVK 1

0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATRTTGTGATGACBCARRCT 11

W=A/T, R=A/G, S=G/C, Y=C/T, K=G/T, M=A/C, H=ACT, B=GCT; Conc. -concentración final.

Tabla 4 Conjunto de cebadores anidados

Nombre del cebador

Conc. (nM) Secuencia SEQ ID

mHCrev

0,2 GGACAGGGMTCCAKAGTTCCADKT 16

hmJK

hmJK1

0,2 GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCAGCTTGGTG 17

hmJK2

0,2 GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAGCTTGGTC 18

hmJK4

0,2 GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAACTTTGTC 19

hmJK5

0,2 GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTC 20

K=G/T, M=A/C, D=AGT; Conc. -concentración final.

Tabla 5 Conjunto de cebadores de corte y empalme de la cadena kappa constante

Cebador

Conc. (nM) Secuencia SEQ ID

Amplificación de la cadena constante kappa humana

hKCforw-v2

0,2 GAACTGTGGCTGCACCATCTGTC 21

Kappa3’

0,2 ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTG 22

Corte y empalme por extensión solapante

mhKCrev

0,2 ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT 23

conjunto mJH

mJH1

0,2 GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC 12

mJH2

0,2 GGAGGCGCTCGAGACTGTGAGAGTGGTGCC 13

mJH3

0,2 GGAGGCGCTCGAGACAGTGACCAGAGTCCC 14

mJH4

0,2 GGAGGCGCTCGAGACGGTGACTGAGGTTCC 15

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SEQ NO

ID Nombre cebador del Secuencia

129

1024H_O3’ CGGGGCCCTTGGTGCTGGCTGACGAGACGGTGACTGAG

130

992H_O5’ GCCAGCACCAAGGGCCCCGAGGTCCAACTGCAGCAAC

131

992K_O3’ GTCTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCAGCTTGGTG

132

1024K_O5’ CGAACTGTGGCTGCACCAGACATCGTGATGACACAAGC

133

1024K_O3’ GTCTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCC

134

992K_O5’ CGAACTGTGGCTGCACCAGACATTCAGATGACTCAGACTAC

Tabla 14 Combinaciones de cebadores y moldes para la 1ª etapa de la PCR para construir genes que codifican DVD de 992 y 1024

DVD

Moldes para la PCR Cebadores para la amplificación del gen IGHV Cebadores para la amplificación del gen IGKV

1ª etapa de PCR

1er producto de PCR (tamaño en pb) 1ª etapa de PCR 1er producto de PCR (tamaño en pb)

992L1024

992 992_5’VH 92H_O3’ 992HO (406 pb) 992_5’VK 992K_O3’ 992KO (359 pb)

1024

1024H_O5’ 3’JH HO1024 (381 pb) 1024K_O5’ Kappa3’ KO1024* (702 pb)

1024L992

992 992H_O5’ 3’JH HO992 (393 pb) 992K_O5’ Kappa3’ KO992 (687 pb)

1024

1024_5’VH 1024H_O3’ 1024HO (392 pb) 1024_5’VK 1024K_O3’ 1024KO* (374 pb)

*La secuencia codificante amplificada incluye el gen IGKC

Tabla 15 Combinaciones de cebadores y moldes para la 2ª etapa de la PCR, corte y empalme mediante extensión solapante, para construir genes que codifican DVD de 992 y 1024

IGHV

IGKV

DVD

Moldes Cebadores Producto (pb) Moldes Cebadores Producto (pb)

992L1024

992HO 992_5’VH 766 992KO 992_5’VK 1040

HO1024

3’JH KO1024 Kappa3’

1024L992

HO992 1024_5’VH 766 KO992 1024_5’VK 1040

1024HO

3’JH 1024KO Kappa3’

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suspensión celular (1500 células/pocillo) a los pocillos experimentales en las columnas 2-11. Las placas se incubaron durante 4 días en una incubadora humidificada a 37 °C. Después se añadieron 20 µl de reactivo WST-1 por pocillo y las placas se incubaron durante una hora a 37 °C. Las placas se transfirieron después a un agitador de placa orbital durante una hora. La absorbancia se midió a 450 y 620 nm (longitud de onda de referencia) usando un lector de ELISA. La cantidad de células metabólicamente activas (MAC, del inglés metabolically active cells) se calcula como el porcentaje del control no tratado como sigue:

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10 La CI50 de cada mezcla se calculó usando GraphPad Prism mediante ajuste de curvas de titulación a la ecuación Y= mínimo + (máximo-mínimo)/(1+10^((LogCI50-X)*pendiente de la curva)).

Resultados

15 Los resultados de las titulaciones se muestran en la Figura 46 para cuatro clones representativos. Es evidente que los clones tienen diferentes niveles de resistencia a Erbitux. No obstante, Sym004 es superior en la inhibición del crecimiento de los cuatro clones en comparación con Erbitux y Vectibix. La superioridad fue evidente bien como una eficacia aumentada (clones n.º 7, 11 y 14) y/o como en potencia (clones n.º 8, 11 y 14). (Tabla 19).

20 Tabla 19. Valores de CI50 y eficacia de inhibición de cuatro clones de HN5 resistentes a Erbitux mediante los anticuerpos indicados. *Los valores de CI50 no se pueden comparar debido a la diferencia en el nivel máximo de inhibición.

Potencia de CI50 (µg/ml)

HN5 parental

Clon n.º 7 Clon n.º 8 Clon n.º 11 Clon n.º 14

Erbitux

0,050 0,016* 1,06 0,366* 0,314*

Vectibix

0,035 0,023* 2,70 0,311* 0,190*

Sym004

0,053 0,029* 0,33 0,267* 0,110*

Eficacia (% de inh

ibición máxim a)

HN5 parental

Clon n.º 7 Clon n.º 8 Clon n.º 11 Clon n.º 14

Erbitux

88,1 % 60,9 % 42,5 % 35,7 % 32,0 %

Vectibix

88,3 % 61,1 % 51,3 % 28,6 % 33,7 %

Sym004

88,2 % 70,3 % 57,5 % 38,9 % 43,5 %

25 Ejemplo 25: Tratamiento in vivo de células HN5 resistentes a Erbitux usando Erbitux y una composición de anticuerpos con anticuerpos 992+1024

Método

30 Se inyectaron por vía subcutánea 5*106 células del clon n.º 7 de HN5 resistente a Erbitux en el flanco derecho de ratones atímicos desnudos hembra de seis a ocho semanas de vida. Los tumores se midieron dos veces a la semana con calibres, y se calculó un volumen tumoral en mm3 de acuerdo con la fórmula: (ancho)2 x (largo) x 0,5. El tratamiento se inició de manera secuencial cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de ~650 mm3. Los ratones se trataron con 50 mg/kg de Sym004 o de Erbitux mediante inyecciones intraperitoneales dos veces a la

35 semana durante tres semanas. Tras el período de tratamiento de tres semanas, los ratones se siguieron durante cinco semanas.

Resultados

40 Tras tres semanas de terapia con Sym004, ambos tumores en el grupo con Sym004 se eliminaron por completo (Figura 47). Dos de los tres ratones tratados en el grupo con Erbitux respondieron solo parcialmente al tratamiento. Esto indica que los tumores que son parcialmente resistentes o no responden al tratamiento con Erbitux se pueden tratar de manera eficaz con Sym004. Por lo tanto, el mecanismo de resistencia adquirida frente a Erbitux no afecta a la eficacia de Sym004.

45 Anexo 1. Secuencias de la región variable de los anticuerpos

>992VH (Seq. no. 24)

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Claims (1)

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