ES2637174T3 - Expresión de ROS mutante en el cáncer de hígado humano - Google Patents

Expresión de ROS mutante en el cáncer de hígado humano Download PDF

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Abstract

Un inhibidor de ROS para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde el cáncer se caracteriza por una translocación del gen de ROS o expresa un polipéptido FIG-ROS, y el inhibidor de ROS se selecciona entre NVP-TAE684 y PF-02341066.

Description

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Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de un polipéptido de fusión FIG-ROS pueden variar sin efecto significativo de la estructura o de la función de la proteína mutante. Si se contemplan dichas diferencias en la secuencia, debe recordarse que habrá zonas críticas en la proteína que determinan la actividad (p. ej., el dominio quinasa de ROS). En general, es posible sustituir los restos que forman la estructura terciaria, siempre que se usen restos que desempeñen una función similar. En otros casos, el tipo de resto puede ser completamente irrelevante si la alteración se produce en una región no crítica de la proteína.
En la presente memoria, se describe además una variante de FIG-ROS de un polipéptido de fusión FIG-ROS que muestra una actividad sustancial de la ROS quinasa o que incluye regiones de proteínas FIG y ROS. En algunas realizaciones, una variante de FIG-ROS descrita en la presente memoria contiene sustituciones conservativas en comparación con FIG-ROS (L), FIG-ROS (XL) o FIG-ROS (S). Algunas sustituciones conservativas no limitantes incluyen el intercambio, entre sí, entre los aminoácidos alifáticos Ala, VaI, Leu e IIe; el intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr; el intercambio de los restos ácidos Asp y GIu; el intercambio de los restos de amida Asn y GIn; el intercambio de los restos básicos Lys y Arg; y el intercambio de los restos aromáticos Phe y Tyr. Otros ejemplos de sustituciones conservativas de aminoácidos conocidas por los expertos en la técnica son: aromáticos: fenilalanina, triptófano, tirosina (p. ej., se reemplaza un resto de triptófano por una fenilalanina); hidrófobos: leucina, isoleucina, valina; polares: glutamina, asparaginas; básicos: arginina, lisina, histidina; ácidos: ácido aspártico, ácido glutámico; pequeños: alanina, serina, treonina, metionina, glicina. Como se indica con detalle anteriormente, se pueden encontrar más directrices sobre qué cambios de aminoácidos son fenotípicamente silenciosos (es decir, no es probable que tengan un efecto perjudicial significativo sobre una función) en Bowie et al., Science 247, supra.
En algunas realizaciones, una variante puede tener cambios "no conservativos", p. ej., el reemplazo de una glicina por un triptófano. Las variantes similares también pueden incluir eliminaciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. La orientación para determinar qué restos de aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados o eliminados sin abolir la actividad biológica o inmunológica puede encontrarse usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNASTAR.
Los polipéptidos de fusión FIG-ROS, sus fragmentos y variantes descritos en la presente memoria pueden proporcionarse en forma aislada o purificada. Una versión producida recombinantemente de un polipéptido de fusión FIG-ROS descrito en la presente memoria se puede purificar esencialmente mediante el método de una sola etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
Los polipéptidos descritos en la presente memoria incluyen los polipéptidos de fusión FIG-ROS que tienen las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 2 y 4 y 17 (incluyendo o no una secuencia líder), una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido que comprende al menos seis aminoácidos contiguos que abarcan la unión de fusión de un polipéptido de fusión FIG-ROS descrito en la presente memoria, así como polipéptidos que tienen al menos un 90 % de similitud, más preferiblemente al menos un 95 % de similitud, y aún más preferiblemente al menos un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de similitud con los descritos anteriormente.
Por "% de similitud" para dos polipéptidos se entiende una puntuación de similitud producida comparando las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) y los ajustes predeterminados para determinar la similitud. Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (“Advances in Applied Mathematics” 2: 482-489 (1981)) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias.
Por polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido ROS mutante descrito en la presente memoria se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polipeptídica puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia del polipéptido de fusión FIG-ROS. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5 % de los restos de aminoácidos de la secuencia de referencia puede suprimirse o sustituirse con otro aminoácido, o un número de aminoácidos de hasta el 5 % de los restos de aminoácidos totales de la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden darse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre restos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una determinada secuencia es, p. ej., un 95 % idéntica a una secuencia de referencia según la presente descripción, los parámetros se establecen, como es evidente, de modo que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia y se permitan huecos en la homología de hasta el 5 % del número total de restos de aminoácidos en la secuencia de referencia.
Se podría usar un polipéptido de fusión FIG-ROS descrito en la presente memoria como marcador de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de filtración en gel de tamiz molecular, por ejemplo, usando
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métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Como se describe además más adelante, los polipéptidos descritos en la presente memoria también se pueden usar para generar reactivos específicos de los polipéptidos de fusión, tales como anticuerpos policlonales y monoclonales, que sean útiles en ensayos de detección de la expresión de polipéptidos ROS mutantes como se describe a continuación o como agonistas y antagonistas capaces de potenciar o inhibir la función/actividad de la proteína ROS mutante. Además, dichos polipéptidos se pueden usar en el sistema de dos híbridos de levadura para "capturar" proteínas de unión al polipéptido de fusión FIG-ROS, que también son agonistas y antagonistas candidatos descritos en la presente memoria. El sistema de dos híbridos de levadura se describe en Fields y Song, Nature 340: 245-246 (1989).
En la presente memoria, también se describe un péptido o polipéptido que comprende una parte portadora de epítopo de un polipéptido descrito en la presente memoria, tal como un epítopo que comprende la unión de fusión de una variante de polipéptido de fusión FIG-ROS. Un “epítopo” se refiere a bien un epítopo inmunogénico (es decir, capaz de generar una respuesta inmune) o un epítopo antigénico (es decir, la región de una molécula de proteína a la que un anticuerpo puede unirse específicamente). El número de epítopos inmunogénicos de una proteína, en general, es inferior al número de epítopos antigénicos. Véase, p. ej., Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81: 3998-4002 (1983). La producción de anticuerpos específicos del polipéptido de fusión FIG-ROS descrito en la presente memoria se describe con más detalle a continuación.
Los anticuerpos que se unen específicamente a péptidos o polipéptidos portadores de epítopos son útiles para detectar una proteína imitada, y pueden usarse anticuerpos contra diferentes péptidos para rastrear el destino de diversas regiones de un precursor de proteína que experimenta procesamiento posterior a la traducción. Los péptidos y anticuerpos anti-péptido pueden usarse en una variedad de ensayos cualitativos o cuantitativos para la proteína imitada, p. ej., en ensayos de competición, ya que se ha demostrado que incluso péptidos cortos (p. ej., de aproximadamente 9 aminoácidos) pueden unirse y desplazar a los péptidos más grandes en ensayos de inmunoprecipitación. Véase, p. ej., Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984) en 777. Los anticuerpos anti-péptido descritos en la presente memoria también son útiles para la purificación de la proteína imitada, p. ej., por cromatografía de adsorción usando métodos bien conocidos en la técnica. Los formatos de ensayo inmunológico se describen con más detalle a continuación.
En la presente memoria, también se describen polipéptidos ROS quinasa mutantes recombinantes, y pueden producirse usando polinucleótidos de fusión descritos en la presente memoria, como se describió anteriormente. Por ejemplo, en la presente memoria, se describe un método de producción de un polipéptido de fusión FIG-ROS recombinante mediante el cultivo de una célula hospedadora recombinante (como se describió anteriormente) en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de fusión y la recuperación del polipéptido. Las condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento de células hospedadoras y la expresión de polipéptidos recombinantes a partir de dichas células son bien conocidas por los expertos en la técnica.
En la presente memoria, también se describe un polinucleótido de fusión FIG-ROS purificado. Por “polinucleótido de fusión FIG-ROS” o “polinucleótido FIG-ROS” se entiende un gen de translocación de FIG-ROS (es decir, un gen que ha sufrido translocación) o polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión FIG-ROS (p. ej., los polipéptidos de fusión FIG-ROS (L), FIG-ROS (XL) o FIG-ROS (S) descritos en la presente memoria), obtenidos de cualquier especie, en particular, de mamíferos, incluyendo bovinos, ovinos, porcinos, murinos, equinos y seres humanos, de cualquier fuente ya sea natural, sintética, semisintética o recombinante.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de fusión FIG-ROS comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polinucleótido de fusión FIG-ROS codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 En algunas realizaciones, el polinucleótido de fusión FIG-ROS comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el polinucleótido de fusión FIG-ROS codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4.En algunas realizaciones, el polinucleótido de fusión FIG-ROS comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 16.En algunas realizaciones, el polinucleótido de fusión FIG-ROS codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 17.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de fusión FIG-ROS comprende una parte de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 26. Como se emplea en la presente memoria, una "parte" o "fragmento" significa un fragmento de secuencia inferior a la secuencia completa (p. ej., una secuencia de 50 nucleótidos es una parte de una secuencia de 100 nucleótidos de longitud). En otras palabras, el polinucleótido de fusión FIG-ROS puede comprender partes de secuencias intrónicas que no codifican ningún aminoácido en el polipéptido de fusión FIG-ROS resultante.
Además, en la presente memoria, se describen polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de fusión FIG-ROS descrito en la presente memoria, sondas de nucleótidos que se hibridan a dichos polinucleótidos, y métodos, vectores y células hospedadoras para utilizar dichos polinucleótidos para producir polipéptidos de fusión recombinantes. A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias de nucleótidos determinadas mediante la secuenciación de una molécula de ADN en la presente memoria se determinaron usando un secuenciador de ADN
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nucleótidos que codifican un polipéptido de fusión FIG-ROS (XL) maduro que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 16 con restos de ácido nucleico adicionales situados 5' con respecto a los restos terminales de 5’ de SEQ ID NO. 16, e incluye la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión FIG-ROS
(XL) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 17 con restos de aminoácidos adicionales situados N-terminalmente con respecto al resto N-terminal de SEQ ID NO. 17.
Como se indicó, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo, p. ej., ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o producido sintéticamente. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario. El ADN o ARN monocatenario puede ser la cadena codificante, también conocida como la cadena sentido, o puede ser la cadena no codificante, también denominada cadena antisentido.
Los polinucleótidos aislados descrito en la presente memoria son moléculas de ácido nucleico, ADN o ARN, que han sido retiradas de su entorno nativo. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los fines de la presente descripción. Otros ejemplos de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células hospedadoras heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o esencialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN descritas en la presente memoria. Las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente memoria incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente.
Los polinucleótidos aislados descritos en la presente memoria incluyen las moléculas de ácido nucleico que tienen las secuencias expuestas en las moléculas de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1,3 y 16, que comprenden la secuencia codificante de las proteínas de fusión FIG-ROS (S), FIG-ROS (L) y FIG-ROS (XL) que comprenden una secuencia diferente de las descritas anteriormente, pero que, debido a la degeneración del código genético, sigue siendo un polipéptido ROS mutante descrito en la presente memoria. El código genético es bien conocido en la técnica, por lo tanto, sería rutinario para un experto en la técnica generar dichas variantes degeneradas.
También se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de fusión FIG-ROS que comprende la secuencia de nucleótidos de translocación FIG-ROS contenida en los clones de ADNc descritos anteriormente. En algunas realizaciones, dicha molécula de ácido nucleico codificará el polipéptido de fusión FIG-ROS (S) maduro, el polipéptido de fusión FIG-ROS (L) maduro o el polipéptido de fusión FIG-ROS (XL) maduro. En otra realización, una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido de fusión FIG-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos N-terminal de FIG y el dominio quinasa de ROS. En una realización, el polipéptido que comprende el dominio quinasa de ROS comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13. En otra realización, la secuencia de aminoácidos N-terminal de FIG y el dominio quinasa de ROS están codificadas por las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 16.
En la presente memoria, se describen polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen una secuencia complementaria a uno de los polipéptidos ROS mutantes descrito en la presente memoria. Dichas moléculas aisladas, en particular, moléculas de ADN, son útiles como sondas para la cartografía de genes, por hibridación in situ con cromosomas y para detectar la expresión de la proteína de fusión FIG-ROS o el polipéptido ROS quinasa truncado en tejido humano, p. ej., mediante análisis de transferencia Northern.
También se describen en la presente memoria fragmentos de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente memoria. Por un fragmento de un polinucleótido FIG-ROS aislado o polinucleótido ROS truncado descrito en la presente memoria se entiende fragmentos de al menos aproximadamente 15 nucleótidos, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, o al menos aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, que son útiles como sondas de diagnóstico y cebadores como se describe en la presente memoria. Como es evidente, también son útiles fragmentos mayores de aproximadamente 50 a 1.500 nucleótidos de longitud según la presente descripción, así como fragmentos que corresponden a la mayoría, si no a la totalidad, de la secuencia de nucleótidos de FIG-ROS de los ADNc que tienen secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1, 3 o 16. Por "un fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud", por ejemplo, se entiende fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de las respectivas secuencias de nucleótidos de las que se obtienen los fragmentos.
La generación de dichos fragmentos de ADN es rutinaria para el experto en la técnica, y puede realizarse, a modo de ejemplo, mediante escisión por endonucleasa de restricción o cizalla mediante sonicación de ADN obtenible del clon de ADNc descrito en la presente memoria o sintetizarse según la secuencia descrita en la presente memoria. Como alternativa, dichos fragmentos se pueden generar directamente de manera sintética.
En la presente memoria, se describe además un polinucleótido aislado (p. ej., una sonda nucleotídica) que se hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido de ROS quinasa mutante descrito en la presente memoria, tal como un polinucleótido de fusión FIG-ROS). La expresión "condiciones rigurosas" con respecto a la secuencia de nucleótidos o las condiciones de hibridación de la sonda nucleotídica es la "rigurosidad" que se produce en intervalo de aproximadamente una Tf inferior a 5 ºC (es decir, 5 ºC por debajo de la temperatura de fusión (Tf) de la sonda o secuencia) a aproximadamente 20 ºC a 25 ºC por debajo de la Tf. Las condiciones rigurosas típicas son: incubación
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durante la noche a 42 ºC en una solución que comprende: formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución Denhardt, sulfato de dextrano al 10 %, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cizallado, seguido por el lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 ºC. Como comprenderán los expertos en la técnica, la rigurosidad de la hibridación puede alterarse para identificar o detectar secuencias de polinucleótidos idénticas o relacionadas.
Por sonda de polinucleótido o nucleótidos que se hibrida con un polinucleótido de referencia (p. ej., un polinucleótido de fusión FIG-ROS (S)) se entiende que la sonda de polinucleótido o de nucleótidos (p. ej., ADN, ARN o híbrido de ADN-ARN) se hibrida a lo largo de toda la longitud del polinucleótido de referencia o se hibrida con una parte del polinucleótido de referencia que es al menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt), o al menos aproximadamente 20 nt, o al menos aproximadamente 30 nt, o aproximadamente 30-70 nt del polinucleótido de referencia. Estas sondas de nucleótidos son útiles como sondas y cebadores de diagnóstico (p. ej., para la PCR) como se analiza en la presente memoria.
Como es evidente, los polinucleótidos que se hibridan con una parte mayor del polinucleótido de referencia (p. ej., el polinucleótido de fusión FIG-ROS (S) que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3, por ejemplo, una parte de 50 a 750 nt de longitud, o incluso con toda la longitud del polinucleótido de referencia, son útiles como sondas según la presente descripción, así como los polinucleótidos que corresponden a la mayoría, si no a la totalidad, de la secuencia de nucleótidos de los ADNc descritos en la presente memoria o las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 1 o 3.
Como se emplea en la presente memoria, por "una parte de un polinucleótido de ‘al menos 15 nucleótidos’ de longitud", por ejemplo, se entiende 15 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia. Como se ha indicado, dichas partes son útiles como sondas de nucleótidos para su uso en el diagnóstico según técnicas convencionales de hibridación de ADN o para su uso como cebadores para la amplificación de una secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se describe por ejemplo, en “MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL”, 2ª edición, Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Como es evidente, un polinucleótido que se hibrida solo con una secuencia poli A (tal como el tramo poli(A) del extremo 3’ de las secuencias de FIG-ROS (p.ej., SEQ ID NO: 1 o 3) o a un tramo complementario de restos de T (o U), no se incluiría en un polinucleótido descrito en la presente memoria usado para hibridarse con una parte de un ácido nucleico descrito en la presente memoria, ya que dicho polinucleótido se hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contuviera un tramo poli (A) o el complemento del mismo (p. ej., prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario).
Como se indica, las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria, que codifican un polipéptido ROS quinasa mutante descrito en la presente memoria, pueden incluir, pero no se limitan a, aquellas que codifican la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro, por sí mismas; la secuencia codificante para el polipéptido maduro y secuencias adicionales, tales como las que codifican la secuencia líder o secretora, tal como una secuencia pre-, o pro-o pre-pro-proteína; la secuencia codificante del polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificantes adicionales mencionadas anteriormente, junto con secuencias adicionales no codificantes, que incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, intrones y secuencias 5’ y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, no traducidas que desempeñan un papel en la transcripción, el procesamiento del ARNm, incluyendo las señales de corte y empalme, y poliadenilación, por ejemplo -unión a ribosomas y estabilidad del ARNm; una secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales.
Por lo tanto, la secuencia que codifica el polipéptido puede fusionarse a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones de este aspecto descrito en la presente memoria, la secuencia de aminoácidos del marcador es un péptido de hexahistidina, tal como el marcador proporcionado en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales se encuentran disponibles en el mercado. Según lo descrito en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. El marcador "HA" es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe, que ha sido descrita por Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). Como se describe a continuación, otras de dichas proteínas de fusión incluyen el polipéptido de fusión FIG-ROS fusionado a Fc en el extremo N-o C-terminal.
En la presente memoria, también se describen variantes de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria, que codifican partes, análogos o derivados de un polipéptido de fusión FIG-ROS o polipéptido ROS quinasa truncado descrito en la presente memoria. Las variantes pueden darse de manera natural, tal como una variante alélica natural. Por "variante alélica" se entiende una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. Véase, por ejemplo, GENES II, Fewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985). Las variantes de origen no natural pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica.
Dichas variantes incluyen las producidas por sustituciones, eliminaciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, eliminaciones o adiciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden alterarse en
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ácido nucleico expuestas en SEQ ID NO: 1, 3 o 16 o a secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 2, 4 o 17 codificarán un polipéptido de fusión que tiene actividad de ROS quinasa. De hecho, puesto que todas las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican el mismo polipéptido, esto será evidente para el experto incluso sin realizar el ensayo de comparación descrito anteriormente. Se reconocerá además en la técnica que, para dichas moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable codificará también un polipéptido que conserva la actividad de ROS quinasa. Esto se debe a que el experto en la técnica es plenamente consciente de las sustituciones de aminoácidos que con menor o ninguna probabilidad afectarán significativamente la función de la proteína (p. ej., reemplazando un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático). Por ejemplo, en Bowie et al., “Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions”, Science 247:1306-1310 (1990), se describen dos enfoques principales sobre cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio. Los expertos en la técnica familiarizados con dichas técnicas también aprecian qué cambios de aminoácidos son susceptibles de ser permisivos en una cierta posición de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los restos de aminoácidos enterrados requiere cadenas laterales no polares, mientras que pocas características de las cadenas laterales superficiales se conservan en general. Otras de dichas sustituciones fenotípicamente silenciosas se describen en Bowie et al., supra, y las referencias citadas en la misma.
Los métodos para la secuenciación del ADN que son bien conocidos y, en general, se encuentran disponibles en la técnica pueden usarse para poner en práctica cualquier realización de los polinucleótidos descrita en la presente memoria. Los métodos pueden emplear enzimas tales como el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, SEQUENASE® (US Biochemical Corp., Cleveland, Ohio), Taq polimerasa (Invitrogen), polimerasa T7 termoestable (Amersham, Chicago, Ill) o combinaciones de polimerasas recombinantes y exonucleasas de corrección tales como el sistema de amplificación ELONGASE comercializado por Gibco BRL (Gaithersburg, Md.). El proceso se puede automatizar con máquinas tales como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, Nev.), el ciclador térmico de Peltier (PTC200; MJ Research, Watertown, Mass.) y el secuenciador de ADN ABI 377 (Applied Biosystems).
Las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido ROS mutante descrito en la presente memoria pueden extenderse utilizando una secuencia de nucleótidos parcial y empleando diversos métodos conocidos en la técnica para detectar secuencias cadena arriba tales como elementos promotores y reguladores. Por ejemplo, un método que puede emplearse, la PCR de "sitio de restricción", usa cebadores universales para recuperar una secuencia desconocida adyacente a un locus conocido ((Sarkar, G., PCR Methods Applic. 2: 318-322 (1993)). En particular, el ADN genómico se amplifica en primer lugar en presencia de cebador a secuencia enlazador y un cebador específico para la región conocida. Los cebadores ilustrativos son los descritos en el Ejemplo 4 de la presente memoria. Las secuencias amplificadas se someten entonces a una segunda serie de PCR con el mismo cebador enlazador y otro cebador específico interno al primero. Los productos de cada serie de PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada y se secuencian usando transcriptasa inversa.
También se puede usar la PCR inversa para amplificar o extender secuencias usando cebadores divergentes basados en una región conocida (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16:8186 (1988)). Los cebadores pueden diseñarse usando el software de análisis de cebadores OLIGO 4.06 (National Biosciences Inc., Plymouth, Minnesota), u otro programa apropiado, para tener una longitud de 22-30 nucleótidos, tener un contenido de GC del 50 % o superior e hibridarse con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68-72 ºC. El método usa varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. El fragmento se circulariza luego mediante ligación intramolecular y se usa como molde de PCR.
Otro método que se puede usar es la PCR de captura que implica la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en ADN de cromosomas artificiales humanos y de levaduras (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-119 (1991)). En este método, también se pueden usar múltiples digestiones y ligaciones de enzimas de restricción para colocar una secuencia bicatenaria modificada genéticamente en una parte desconocida de la molécula de ADN antes de realizar la PCR. Otro método que puede usarse para recuperar secuencias desconocidas es el descrito en Parker et al., Nucleic Acids Res. 19:3055-3060 (1991)). Además, se pueden usar PCR, cebadores anidados y bibliotecas PROMOTERFINDER® para recorrer el ADN genómico (Clontech, Palo Alto, Calif.). Este proceso evita la necesidad de explorar bibliotecas y es útil para encontrar uniones intrón/exón.
Cuando se exploran ADNc de longitud completa, se pueden usar bibliotecas que han sido seleccionadas en tamaño para incluir ADNc mayores o bibliotecas de cebado aleatorio, que contienen más secuencias que contienen las regiones 5’ de genes. Una biblioteca cebada al azar es útil para situaciones en las que una biblioteca oligo d(T) no produce un ADNc de longitud completa. Las bibliotecas genómicas pueden ser útiles para la extensión de la secuencia en las regiones reguladoras 5’ y 3' no transcritas.
Pueden usarse sistemas de electroforesis capilar, que se encuentran disponibles en el mercado, para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de los productos de secuenciación o PCR. En particular, la secuenciación capilar puede emplear polímeros fluidos para la separación electroforética, cuatro colorantes fluorescentes diferentes (uno por cada nucleótido) que son activados por láser y la detección de las longitudes de onda emitidas por una cámara de dispositivo de carga acoplada. La intensidad de salida/luz se puede convertir en señal eléctrica usando el software apropiado (p. ej., GENOTYPER™ y SEQUENCE NAVIGATOR™, Applied
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son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb que actúan para aumentar la actividad de transcripción de un promotor en un tipo de célula hospedadora dado. Los ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador de SV40, que está situado en el lado tardío del origen de replicación en los pares de bases 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.
Para la secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplasmático, en el espacio periplasmático o en el entorno extracelular, se pueden incorporar señales de secreción apropiadas al polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
El polipéptido puede expresarse en una forma modificada, tal como una proteína de fusión (p. ej., una fusión GST), y puede incluir no solo señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, se puede añadir una región de aminoácidos adicionales, en particular, aminoácidos cargados, al extremo N-terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación o durante la manipulación y el almacenamiento subsiguientes. Además, se pueden añadir fracciones peptídicas al polipéptido para facilitar la purificación. Dichas regiones se pueden eliminar antes de la preparación final del polipéptido. La adición de fracciones peptídicas a polipéptidos para generar secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y facilitar la purificación, entre otros, son técnicas conocidas y rutinarias en la técnica.
En un ejemplo no limitante, un polipéptido de fusión FIG-ROS descrito en la presente memoria puede comprender una región heteróloga de una inmunoglobulina que es útil para solubilizar proteínas. Por ejemplo, la patente europea EP-A-O 464 533 (homólogo canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas partes de región constante de moléculas de inmunoglobina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc de una proteína de fusión es completamente ventajosa para su uso en terapia y diagnóstico y, por lo tanto, da lugar, por ejemplo, a propiedades farmacocinéticas mejoradas (patente europea EP-A 0232 262). Por otra parte, para algunos usos, sería deseable poder eliminar la parte Fc tras la expresión, detección y purificación de la proteína de fusión de la manera ventajosa descrita. Este es el caso cuando la parte Fc demuestra ser un obstáculo para el uso en terapia y diagnóstico, por ejemplo, cuando la proteína de fusión se va a usar como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas, tales como, hIL-5 con partes Fc con el propósito de ensayos de rastreo de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. Véase Bennett et al., Journal of Molecular Recognition 8: 52-58 (1995) y Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry 270(16): 9459-9471 (1995).
Los polipéptidos FIG-ROS pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen sulfato de amonio o precipitación con etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. En algunas realizaciones, se emplea cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos descritos en la presente memoria incluyen productos purificados de manera natural, productos de procedimientos sintéticos químicos y productos producidos por técnicas recombinantes desde un hospedador procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Además, los polipéptidos descritos en la presente memoria también pueden incluir un resto de metionina modificado inicial, en algunos casos, como resultado de procesos mediados por el hospedador.
Por consiguiente, en la presente memoria, también se describe un método de producción de un polipéptido de fusión FIG-ROS recombinante mediante el cultivo de una célula hospedadora recombinante (como se describió anteriormente) en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de fusión y la recuperación del polipéptido. Las condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento de células hospedadoras y la expresión de polipéptidos recombinantes a partir de dichas células son bien conocidas por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., “CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY”, Ausubel FM et al, eds., Volumen 2, Capítulo 16, Wiley Interscience.
Se describe además en la presente memoria un agente de unión que se une específicamente a un polipéptido de fusión FIG-ROS. En algunas realizaciones, el agente de unión se une específicamente a una unión de fusión entre una parte FIG y una parte ROS en dicho polipéptido de fusión FIG-ROS. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión FIG-ROS es un polipéptido de fusión FIG-ROS (S), un polipéptido de fusión FIG-ROS (L) o un polipéptido de fusión FIG-ROS (XL).
En algunas realizaciones, el agente de unión está unido a un marcador detectable. Por "marcador detectable" con respecto a un polipéptido, polinucleótido o agente de unión descrito en la presente memoria significa una modificación química, biológica o de otro tipo del o en el polipéptido, polinucleótido o agente de unión, incluyendo, pero no se limitan a, fluorescencia, masa, resto, colorante, radioisótopo, marcador o modificaciones de marcador, etc., mediante las que se puede detectar la presencia de la molécula de interés. El marcador detectable puede estar unido al polipéptido, polinucleótido o agente de unión mediante un enlace químico covalente o no covalente.
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En la presente memoria, se describen también agentes de unión tales como anticuerpos o péptidos AQUA, o fracciones de unión de los mismos, que se unen específicamente a los polipéptidos de fusión FIG-ROS (p. ej., FIG-ROS (S), FIG-ROS (L) o FIG-ROS (XL) descritos en la presente memoria). Por "que se unen específicamente" o "se une específicamente" se entiende que un agente de unión descrito en la presente memoria (p. ej., un anticuerpo o péptido AQUA) interactúa con su molécula diana (p. ej., un polipéptido de fusión FIG-ROS), donde la interacción es dependiente de la presencia de una determinada estructura (es decir, el determinante antigénico o epítopo) sobre la proteína; en otras palabras, el reactivo reconoce y se une a una estructura proteica específica en lugar de a todas las proteínas en general. Por "fragmento de unión del mismo” se entiende un fragmento o una parte de un reactivo de unión que se une específicamente a la molécula diana (p. ej., un fragmento Fab de un anticuerpo). Un agente de unión que se une específicamente a la molécula diana se puede denominar agente de unión específico de la diana. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido FIG-ROS (L) puede denominarse anticuerpo específico de FIG-ROS (L). En algunas realizaciones, un agente de unión tiene una afinidad de unión (KD) hacia su molécula diana (p. ej., un polipéptido de fusión FIG-ROS) de 1 x 10-6 M o inferior. En algunas realizaciones, un agente de unión se une a su molécula diana con una KD de 1 x 10-7 M o inferior, o una KD de 1 x 10-8 M o inferior, o una KD de 1 x 10-9 M o inferior, o una KD de 1 x 10-10 M o inferior, de una KD de 1 x 10-11 M o inferior, de una KD de 1 x 10-12 M o inferior. En ciertas realizaciones, la KD de un agente de unión por su molécula diana es de 1 pM a 500 pM, o de 500 pM a 1 μM, o de 1 μM a 100 nM, o de 100 mM a 10 nM. Los ejemplos no limitantes de una molécula diana a la que se une específicamente un agente de unión para incluir el polipéptido de fusión FIG-ROS (L), el polipéptido de fusión FIG-ROS (S) y fragmentos de los mismos, particularmente aquellos fragmentos que incluyen la unión entre la parte FIG y la parte ROS de un polipéptido de fusión FIG-ROS.
El agente de unión descrito en la presente memoria, incluyendo los útiles en la práctica de los métodos descritos, incluyen, entre otros, anticuerpos específicos de polipéptido de fusión FIG-ROS y péptidos AQUA (péptidos marcados con isótopos pesados) correspondientes a y adecuados para la detección y cuantificación de la expresión de polipéptido de fusión FIG-ROS en una muestra biológica. Por lo tanto, un "agente de unión específica del polipéptido de fusión FIG-ROS” es cualquier reactivo, agente biológico o químico, capaz de unirse específicamente a, detectar y/o cuantificar la presencia/el nivel de polipéptido de fusión FIG-ROS expresado en una muestra biológica. La expresión incluye, pero no se limita a, los anticuerpos y reactivos peptídicos AQUA que se tratan a continuación, y agentes de unión equivalentes.
En algunas realizaciones, el agente de unión que se une específicamente a un polipéptido de fusión FIG-ROS es un anticuerpo (es decir, un anticuerpo específico del polipéptido de fusión FIG-ROS). En algunas realizaciones, un anticuerpo específico del polipéptido de fusión FIG-ROS descrito en la presente memoria es un anticuerpo aislado o anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de fusión FIG-ROS descrito en la presente memoria (p. ej., FIG-ROS (L), FIG-ROS (XL) o FIG-ROS (S)), pero no se une sustancialmente a la FIG de tipo silvestre ni a ROS de tipo silvestre. También son útiles en la práctica de los métodos descritos en la presente memoria otros reactivos tales como anticuerpos específicos del epítopo que se unen específicamente a un epítopo en los dominios extracelulares o quinasa de la secuencia de proteína ROS de tipo silvestre (cuyos dominios no están presentes en la ROS quinasa truncada descrita en la presente memoria), y son, por lo tanto, capaces de detectar la presencia (o ausencia) de la ROS de tipo silvestre en una muestra.
Los anticuerpos específicos de los polipéptidos de fusión FIG-ROS humanos también pueden unirse a secuencias de péptidos epitópicos altamente homólogos y equivalentes en otras especies de mamífero, por ejemplo, murina o de conejo, y viceversa. Los anticuerpos útiles en la práctica de los métodos descritos en la presente memoria incluyen (a) anticuerpos monoclonales; (b) anticuerpos policlonales purificados que se unen específicamente al polipéptido diana (p. ej., la unión de fusión del polipéptido de fusión FIG-ROS; (c) anticuerpos como los descritos en (a)-(b) anteriores que se unen a epítopos o sitios de fosforilación equivalentes y altamente homólogos en otras especies no humanas (p. ej., ratón, rata); y (d) fragmentos de (a)-(c) anteriores que se unen al antígeno (o más preferiblemente el epítopo) unidos por los anticuerpos ilustrativos descritos en la presente memoria.
El término "anticuerpo" o "anticuerpos" se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, incluyendo fragmentos de unión de las mismas (es decir, fragmentos de un anticuerpo que son capaces de unirse específicamente a la molécula diana del anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2), así como anticuerpos recombinantes, humanizados, policlonales y monoclonales y/o fragmentos de unión de los mismos. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden derivarse de cualquier especie de animal, tal como de un mamífero. Los anticuerpos naturales ilustrativos no limitantes incluyen anticuerpos derivados de seres humanos, pollos, cabras y roedores (p. ej., ratas, ratones, hámsteres y conejos), incluyendo roedores transgénicos manipulados genéticamente para producir anticuerpos humanos (véase, p. ej., Lonberg et al., documento WO93/12227; patente de EE.UU. n.º 5.545.806; y Kucherlapati, et al, documento WO91/10741; de EE.UU. n.º 6.150.584). Los anticuerpos descritos en la presente memoria también pueden ser anticuerpos quiméricos. Véase, p.ej., M. Walker et al., Molec. Immunol. 26: 403-11 (1989); Morrision et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984)). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos según los métodos descritos en la patente de EE.UU. n.º 4.474.893 (Lectura) o patente de EE.UU. n.º
4.816.567 (Cabilly et al.) Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos específicos construidos químicamente según el método descrito en la patente de EE.UU. n.º 4.676.980 (Segel et al.)
Los anticuerpos naturales son los anticuerpos producidos por un animal hospedador; sin embargo, también se
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cuantificar tanto las formas modificadas como no modificadas del sitio en una muestra biológica.
También se pueden generar patrones internos de péptidos examinando la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína y determinando los límites de péptidos producidos por escisión de proteasa. Como alternativa, una proteína puede digerirse realmente con una proteasa y, a continuación, se puede secuenciar un fragmento de péptido en particular producido. Las proteasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, serina proteasas (p. ej., tripsina, hepsina), metalo proteasas (p. ej., PUMP1), quimotripsina, catepsina, pepsina, termolisina, carboxipeptidasas, etc.
Una secuencia peptídica dentro de una proteína diana se selecciona según uno o más criterios para optimizar el uso del péptido como un patrón interno. Preferiblemente, el tamaño del péptido se selecciona para minimizar las posibilidades de que la secuencia peptídica se repita en otras partes de otras proteínas no diana. Así pues, un péptido es preferiblemente al menos aproximadamente 6 aminoácidos. El tamaño del péptido también se optimiza para maximizar la frecuencia de ionización. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el péptido no es más largo de aproximadamente 20 aminoácido. En algunas realizaciones, el péptido tiene entre 7 y 15 aminoácidos de longitud. También se selecciona una secuencia peptídica que no es probable que sea reactive químicamente durante la espectrometría de masas, por lo que se evitan secuencias que comprenden cisteína, triptófano o metionina.
Una secuencia peptídica que no incluye una región modificada de la región diana puede seleccionarse de manera que el patrón interno del péptido pueda usarse para determinar la cantidad de todas las formas de la proteína. Como alternativa, puede ser deseable un patrón interno de péptido que incluya un aminoácido modificado para detectar y cuantificar solamente la forma modificada de la proteína diana. Los patrones peptídicos para regiones tanto modificadas como no modificadas pueden usarse juntos para determinar la extensión de una modificación en una determinada muestra (es decir, para determinar qué fracción de la cantidad total de proteína está representada por la forma modificada). Por ejemplo, se pueden usar patrones de péptidos para la forma tanto fosforilada como no fosforilada de una proteína que se sabe que está fosforilada en un determinado sitio para cuantificar la cantidad de forma fosforilada en una muestra.
El péptido se marca usando uno o más aminoácidos marcados (es decir, el marcador es una parte real del péptido)
o menos preferiblemente, se pueden unir los marcadores después de la síntesis según métodos convencionales. Preferiblemente, el marcador es un marcador de alteración de masa seleccionado basándose en las siguientes consideraciones: La masa debe ser única para desplazar masas de fragmentos producidas por análisis de MS a regiones del espectro con fondo bajo; el componente de distintivo de masa de iones es la parte de la fracción de marcaje que presenta preferiblemente un distintivo de masa iónica único en el análisis de MS; la suma de las masas de los átomos constituyentes del marcador es preferiblemente única y distinta a la de los fragmentos de todos los aminoácidos posibles. Como resultado, los aminoácidos y péptidos marcados se distinguen fácilmente de los no marcados por el patrón de iones/masa en el espectro de masas resultante. Preferiblemente, el componente de distintivo de masa de iones confiere una masa a un fragmento de proteína que no coincide con la masa de resto para ninguno de los 20 aminoácidos naturales.
El marcador debe ser robusto en las condiciones de fragmentación de la MS y no sufrir una fragmentación desfavorable. La química de marcaje debe ser eficaz en una selección de condiciones, particularmente en condiciones desnaturalizantes, y el marcador marcado permanece preferiblemente soluble en el sistema tampón de MS de elección. El marcador no suprime preferiblemente la eficacia de ionización de la proteína y no es reactivo químicamente. El marcador puede contener una mezcla de dos o más especies isotópicamente distintas para generar un patrón de espectrometría de masas único en cada posición del fragmento marcado. Los isótopos estables, tales como 2H, 13C, 15N, 17O, 18O o 34S, son algunos marcadores no limitantes. Pueden prepararse también pares de patrones internos de péptidos que incorporan un marcador de isótopo diferente. Los restos de aminoácidos no limitantes a los que se puede incorporar un marcador de isótopos pesados incluyen leucina, prolina, valina y fenilalanina.
Los patrones internos de péptidos se caracterizan según su proporción de la masa con respecto a la carga (m/z), y preferiblemente, también según su tiempo de retención en una columna cromatográfica (p. ej., una columna de HPLC). Los patrones internos que se eluyen junto con péptidos no marcados de secuencia idéntica se seleccionan como patrones internos óptimos. A continuación, se analiza el patrón interno mediante la fragmentación del péptido por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por disociación inducida por colisión (CID) usando, p. ej., argón o helio como gas de colisión. A continuación, se analizan los fragmentos, por ejemplo, mediante espectrometría de masas de múltiples etapas (MSn) para obtener un espectro de iones de fragmentos, para obtener un distintivo de fragmentación de péptidos. Preferiblemente, los fragmentos peptídicos tienen diferencias significativas en las proporciones de m/z para permitir que los máximos correspondientes a cada fragmento se separen bien y se obtenga un distintivo que sea único para el péptido diana. Si no se obtiene un distintivo de fragmento adecuado en la primera etapa, se realizan etapas adicionales de MS hasta que se obtiene un distintivo único.
Los iones de los fragmentos de los espectros MS/MS y MS3 son normalmente muy específicos del péptido de interés y, junto con los métodos de LC, permiten un medio altamente selectivo de detectar y cuantificar un péptido/una proteína diana en una mezcla de proteínas complejas, tal como un lisado celular, que contiene muchos miles o decenas de miles de proteínas. Puede analizarse cualquier muestra biológica que contenga potencialmente una
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proteína/un péptido diana de interés. Preferiblemente, se emplean extractos celulares en bruto o parcialmente purificados. En general, la muestra tiene al menos 0,01 mg de proteína, normalmente, una concentración de 0,1-10 mg/ml, y puede ajustarse a una concentración de tampón y pH deseados.
A continuación, se añade una cantidad conocida de un patrón interno de péptido marcado, preferiblemente aproximadamente 10 femtomoles, correspondientes a una proteína diana que se vaya a detectar/cuantificar, a una muestra biológica, tal como un lisado celular. La muestra añadida se digiere luego con una o más proteasas durante un período de tiempo adecuado para permitir la digestión. Se realiza entonces una separación (p. ej., por HPLC, HPLC de fase inversa, electroforesis capilar, cromatografía de intercambio iónico, etc.) para aislar el patrón interno marcado y su correspondiente péptido diana de otros péptidos de la muestra. La LC microcapilar es un método no limitante.
Después, se examina cada péptido aislado mediante el control de una reacción seleccionada en la MS. Esto implica usar el conocimiento previo obtenido por la caracterización del patrón interno de péptido y luego requerir que la MS supervise de manera continua un ion específico en el espectro de MS/MS o MSn tanto para el péptido de interés como para el patrón interno. Después de la elución, se calcula el área bajo la curva (AUC) para los máximos tanto del patrón de péptido como de los péptidos diana. La proporción de las dos áreas proporciona la cuantificación absoluta que puede normalizarse para el número de células usadas en el análisis y el peso molecular de la proteína, para proporcionar el número exacto de copias de la proteína por célula. Otros detalles de la metodología de AQUA se describen en Gygi et al., y Gerber et al. supra.
Los patrones internos de péptidos AQUA (péptidos marcados con isótopos pesados) se pueden producir deseablemente, como se describió anteriormente, para detectar y cuantificar cualquier sitio único (p. ej., la unión de fusión dentro de un polipéptido de fusión FIG-ROS) dentro de un polipéptido ROS mutante descrito en la presente memoria. Por ejemplo, se puede preparar un fosfopéptido AQUA correspondiente a la secuencia de unión de fusión del polipéptido de fusión FIG-ROS. Se pueden producir patrones de péptidos para la unión de fusión FIG-ROS y dichos patrones empleados en la metodología AQUA para detectar y cuantificar la unión de fusión (es decir, la presencia del polipéptido de fusión FIG-ROS) en una muestra biológica.
Por ejemplo, un péptido AQUA ilustrativo descrito en la presente memoria comprende la secuencia de aminoácidos AGSTLP, que corresponde a los tres aminoácidos que flanquean inmediatamente cada lado de la unión de fusión en la segunda variante (corta) del polipéptido de fusión FIG-ROS (es decir, polipéptido de fusión FIG-ROS (S)). Se apreciará que también pueden construirse péptidos AQUA mayores que comprendan la secuencia de unión de fusión (y restos adicionales cadena abajo o cadena arriba de la misma). De forma similar, se puede construir, como alternativa, un péptido AQUA más pequeño que comprenda menos que todos los restos de dicha secuencia (pero que todavía comprenda el propio punto de unión de fusión). Se prevén péptidos AQUA más largos o más cortos, y la selección y producción de péptidos AQUA pueden llevarse a cabo como se ha descrito anteriormente (véase Gygi et al., Gerber et al., supra).
En la presente memoria, también se describe un método de detección de una translocación del gen de FIG-ROS, método que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica con un agente de unión que se une específicamente a un polipéptido de fusión FIG-ROS (p. ej., un polipéptido de fusión FIG-ROS (S), FIG-ROS (XL) o FIG-ROS (L), donde la unión específica del agente de unión a la muestra biológica indica la presencia de una translocación del gen de FIG-ROS (p.ej., que codifica un polipéptido de fusión FIG-ROS (S), FIG-ROS (XL) o FIG-ROS (L)), en dicha muestra biológica.
En la presente memoria, también se describe un método de detección de una translocación del gen de FIG-ROS mediante la puesta en contacto de una muestra biológica con una sonda nucleotídica que se hibrida con un polinucleótido de fusión FIG-ROS en condiciones rigurosas, en donde la hibridación de dicha sonda nucleotídica a dicha muestra biológica indica una translocación del gen de FIG-ROS (p.ej., que codifica un polipéptido de fusión FIG-ROS (S), FIG-ROS (XL) o FIG-ROS (L)) en dicha muestra biológica.
También se describe en la presente memoria un método de identificación de un cáncer que es probable que responda a un inhibidor de ROS. El método incluye poner en contacto una muestra biológica de dicho cáncer que comprende al menos un polipéptido con un agente de unión que es une específicamente bien con un polipéptido de fusión FIG-ROS (p.ej., un polipéptido de fusión FIG-ROS (S), FIG-ROS(XL) o FIG-ROS (L)) o un polipéptido ROS mutante, en donde la unión específica de dicho agente de unión con al menos un polipéptido en dicha muestra biológica identifica dicho cáncer como un cáncer que es probable que responda a un inhibidor de ROS. En algunas realizaciones, el agente de unión es un anticuerpo y un péptido AQUA. En algunas realizaciones, el cáncer es de un paciente (p.ej., un paciente de cáncer). En realizaciones adicionales, el cáncer puede ser un cáncer de hígado, un cáncer de páncreas, un cáncer de riñón, un cáncer de testículo, o puede ser un cáncer de un conducto (p.ej., un cáncer de conducto biliar hepático o un cáncer de conducto pancreático).
Como se emplea en la presente memoria, por "probable que responda" se entiende que un cáncer es más probable que muestre retraso del crecimiento o inhibición en respuesta a (p. ej., al contacto con o el tratamiento mediante) un inhibidor de ROS. En algunas realizaciones, un cáncer que es probable que responda a un inhibidor de ROS es aquel que muere (p. ej., las células cancerosas sufren apóptosis) en respuesta al inhibidor de ROS.
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(Forrest et at, “Immunoassay of Antigens”); la patente de EE.UU. n.º 4.376.110 (David et al., “Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies”).Las condiciones adecuadas para la formación de complejos de reactivo-anticuerpo son bien conocidas por los expertos en la técnica. Véase id. Los anticuerpos monoclonales específicos del polipéptido de fusión FIG-ROS pueden usarse en un ensayo de "dos sitios" o de tipo "sándwich", con una sola estirpe celular de hibridoma que sirve como fuente tanto para el anticuerpo monoclonal marcado como para el anticuerpo monoclonal unido. Dichos ensayos se describen en la patente de EE.UU. n.º 4.376.110. La concentración de reactivo detectable debe ser suficiente para que la unión del polipéptido de fusión FIG-ROS sea detectable en comparación con el fondo.
Los anticuerpos útiles en la práctica de los métodos descritos en la presente memoria pueden conjugarse con un soporte sólido adecuado para un ensayo de diagnóstico (p. ej., perlas, placas, portaobjetos o pocillos formados a partir de materiales tales como látex o poliestireno) según técnicas conocidas, tales como precipitación. Los anticuerpos u otros reactivos de unión al polipéptido de fusión FIG-ROS pueden igualmente estar conjugados a grupos detectables tales como radiomarcadores (p. ej., 35S, 125I, 131I), marcadores enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina) y marcadores fluorescentes (p. ej., fluoresceína) según técnicas conocidas.
Los ensayos basados en células tales como la citometría de flujo (FC), inmunohistoquímica (IHC) o inmunofluorescencia (IF) son particularmente deseables en la práctica de los métodos descritos en la presente memoria, ya que dichos formatos de ensayo son clínicamente adecuados, permiten la detección de la expresión de polipéptidos ROS mutantes in vivo, y evitan el riesgo de cambios artificiales en la actividad resultante de manipular células obtenidas de, p. ej., una muestra tumoral para obtener extractos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria se implementan en un formato de ensayo de citometría de flujo (FC), inmunohistoquímica (IHC) o de inmunofluorescencia (IF).
Se puede emplear citometría de flujo (FC) para determinar la expresión del polipéptido ROS mutante en un tumor de mamífero antes, durante y después del tratamiento con un fármaco dirigido a inhibir la actividad de la ROS quinasa. Por ejemplo, se pueden analizar las células tumorales de la sustancia aspirada con aguja fina por citometría de flujo para la expresión y/o activación del polipéptido de fusión de FIG-ROS, así como para marcadores que identifican tipos de células de cáncer, etc., si así se desea. La citometría de flujo se puede llevar a cabo según métodos convencionales. Véase, p. ej. Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78 (2001). En resumen y a modo de ejemplo, se puede emplear el siguiente protocolo para el análisis citométrico: fijación de las células con paraformaldehído al 2 % durante 10 minutos a 37 ºC, seguida de la permeabilización en metanol al 90 % en f0 minutos con hielo. Las células pueden entonces teñirse con el anticuerpo específico de polipéptido de fusión FIG-ROS primario, lavarse y marcarse con un anticuerpo secundario marcado fluorescente. A continuación, las células se analizarán en un citómetro de flujo (p. ej., un Beckman Coulter FC500) según los protocolos específicos del instrumento usado. Dicho análisis identificaría el nivel de polipéptido de fusión FIG-ROS expresado en el tumor. Un análisis similar después del tratamiento del tumor con un agente terapéutico inhibidor de ROS revelaría la capacidad de respuesta de un tumor que expresa un polipéptido de fusión FIG-ROS hacia el inhibidor dirigido de ROS quinasa.
También se puede emplear tinción de inmunohistoquímica (IHC) para determinar la expresión y/o estado de activación del polipéptido ROS quinasa mutante en un tumor de mamífero (p. ej., un cáncer de hígado o de páncreas) antes, durante y después del tratamiento con un fármaco dirigido a inhibir la actividad de la ROS quinasa. La IHC se puede llevar a cabo según técnicas conocidas. Véase, p. ej., “ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL”, Capítulo 10, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988). En resumen, y a modo de ejemplo, se prepara tejido embebido en parafina (p. ej., tejido tumoral de una biopsia) para la tinción inmunohistoquímica por desparafinación de secciones de tejido con xileno seguido de etanol; la hidratación en agua, luego en PBS; el desenmascaramiento del antígeno calentando el portaobjetos en tampón de citrato de sodio; la incubación de las secciones en peróxido de hidrógeno; el bloqueo en la solución de bloqueo; la incubación del portaobjetos en anticuerpo anti-polipéptido de fusión FIG-ROS primario y anticuerpo secundario; y finalmente la detección usando el método de avidina/biotina ABC según las instrucciones del fabricante.
También se pueden emplear ensayos de inmunofluorescencia (IF) para determinar la expresión y/o el estado de activación del polipéptido de fusión FIG-ROS en un cáncer de mamífero antes, durante y después del tratamiento con un fármaco dirigido a inhibir la actividad de la ROS quinasa. La IF se puede llevar a cabo según técnicas conocidas. Véase, p. ej., J. M. polak y S. Van Noorden (1997) “INTRODUCTION TO IMMUNOCYTOCHEMISTRY”, 2ª Ed.; ROYAL MICROSCOPY SOCIETY MICROSCOPY HANDBOOK 37, BioScientific/Springer-Verlag. En resumen y a modo de ejemplo, las muestras de pacientes pueden fijarse en paraformaldehído seguido de metanol, bloquearse con una solución de bloqueo tal como suero de caballo, incubarse con el anticuerpo primario contra el polipéptido de fusión FIG-ROS seguido de un anticuerpo secundario marcado con un colorante fluorescente tal como Alexa 488 y analizarse con un microscopio epifluorescente.
Se conoce en la técnica una variedad de otros protocolos, incluyendo el ensayo de inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), para la medición de polipéptidos ROS quinasa mutantes, y proporcionan una base para diagnosticar niveles modificados o anómalos de expresión del polipéptido de fusión FIG-ROS. Los valores normales o patrón para la expresión del polipéptido de fusión FIG-ROS se establecen combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de
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por el tampón de quinasa (Cell Signaling Technology). Las reacciones de quinasa se iniciaron volviendo a suspender el complejo inmune de ROS en 25 ul de tampón de quinasa que contiene ATP 50 uM, 0,2 uCi/ul de [gamma32p] ATP, con 1 mg/ml de Poli (EY, 4: 1). Las reacciones se detuvieron detectando el cóctel de reacción en papeles de filtro p81. A continuación, se lavaron las muestras y se ensayaron para determinar la actividad quinasa por detección con un contador de centelleo. Como se muestra en la Fig. 12, aunque tanto FIG-ROS (L) como FIG-ROS (S) pueden fosforilar su sustrato, FIG-ROS (S) es más potente que FIG-ROS (L). En otras palabras, FIG-ROS (S) tiene una actividad quinasa mucho más alta que FIG-ROS (L). La carga igual de los carriles se muestra en el análisis de transferencia Western de los complejos inmunes de ROS usando un anticuerpo específico de ROS (véase la Fig. 12, panel inferior).
La mayor potencia de FIG-ROS (S) en comparación con FIG-ROS (L) coincide con los datos del ensayo de agar blando (véase la Fig. 7) y el ensayo de crecimiento independiente de IL-3 (véase la Fig. 11).
EJEMPLO 9
Sensibilidad de FIG-ROS (L) y FIG-ROS (S) a TAE-684
La molécula pequeña, TAE-684, una 5-cloro-2,4-diaminofenilpirimidina, que tiene la estructura:
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y se ha demostrado que inhibe la ALK quinasa. Galkin, et al., Proc. National Acad. Sci 104(1) 270-275, 2007.
En este ejemplo, se determinó si TAE-684 también inhibía el polipéptido de fusión FIG-ROS. Para ello, se obtuvieron células BaF3 y Karpas 299 de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Alemania). Las células BaF3 se mantuvieron como se ha descrito anteriormente y se cultivaron células Karpas 299 (una estirpe celular de linfoma) en RPMI-1640 con FBS al 10 %.
Las células BaF3 se transdujeron con retrovirus codificante de FIG-ROS (S), FIG-ROS (L) o FLT-3ITD (la mutación de duplicación en tándem interna en FLT3 causa leucemia AML) y se seleccionaron para el crecimiento independiente de IL3. Se usaron células Karpas 299, que expresan NPM-ALK, como control positivo.
Se realizó un ensayo de MTS usando la el reactivo CellTiter 96 Aqueous One Solution (Promega. N.º de catálogo G3582). En resumen, se sembraron 1 x 105 células/pocillo en una placa de 24 pocillos en 1 ml de medio que incluía TAE-684 0 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM o 1000 nM. Después de 72 horas, se añadieron 20 ul del reactivo CellTiter 96 Aqueous One Solution a cada pocillo de una placa de ensayo de 96 pocillos (fondo plano) y a continuación se añadieron 100 ul de células cultivadas con o sin tratamiento. Se usaron pocillos solo para medios como controles. La placa de 96 pocillos se incubó durante 1-4 horas a 37 ºC, y luego se realizó el recuento de las células viables leyendo la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas de 96 pocillos.
Como se muestra en la Fig. 13, las células BaF3 transducidas con retrovirus que expresan uno de los polipéptidos
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FIG-ROS dejaron de crecer en presencia de TAE-684. Curiosamente, FIG-ROS (S) es menos susceptible a TAE-684 que FIG-ROS (L). Las células Karpas 299 también respondieron (es decir, dejaron de crecer) en presencia de TAE684, lo que era de esperar, ya que expresan ALK, y TAE-684 inhibe la ALK quinasa. Las células BaF3 transducidas con FLT3/ITD no fueron susceptibles a TAE-684.
A continuación, se revisó el mecanismo de muerte de las células BaF3 y Karpas 299 midiendo el porcentaje de células positivas en caspasa 3 escindidas mediante ensayo de citometría de flujo usando caspasa 3 escindida como marcador de apoptosis. Estos resultados se obtuvieron usando el protocolo disponible para el público en general de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA).
Como se muestra en la Fig. 14, la presencia de TAE-684 hizo que las células BaF3 que expresan la FIG-ROS (S) o FIG-ROS (L) murieran por apoptosis. Curiosamente, las células Karpas 299, que dejan de crecer en presencia de TAE-684, no murieron por apoptosis -simplemente sufrieron la detección del ciclo celular. Por lo tanto, el mecanismo mediante el cual TAE-684 inhibe los polipéptidos de fusión FIG-ROS es probablemente diferente del mecanismo mediante el que TAE-684 inhibe la ALK quinasa.
Para identificar mejor el mecanismo de acción de TAE-684 sobre los polipéptidos de fusión FIG-ROS de la invención, las cuatro estirpes celulares (es decir, células Karpas 299 y células BaF3 transducidas con retrovirus que codifican FIG-ROS (S), FIG-ROS (L) y FLT-3ITD) se sometieron a análisis de transferencia Western después del tratamiento con TAE-684 0, 10, 50 o 100 nM durante tres horas. Todos los anticuerpos eran de Cell Signaling Technology, Inc.
Como se muestra en la Fig. 15, la fosforilación tanto de FIG-ROS (S) como de FIG-ROS (L) en células BaF3 que expresan FIG-ROS (S) y FIG-ROS (L) fue inhibida por TAE-684. Además, la fosforilación de STAT3, AKT, y ERK, y Shp2 se inhibieron en FIG-ROS (S) y FIGOS (L) que expresan células BaF3. La fosforilación de STAT3, AKT y ERK, y Shp2 no se vio afectada en las células BaF3 transducidas con el retrovirus FLT-3ITD. TAE-684 también inhibió la fosforilación de ALK y ERK en células Karpas 299. Dado que ROS, ALK, LTK, InsR e IGF1R pertenecen a la misma familia de tirosina quinasas, pueden compartir una estructura similar en el dominio quinasa. Los inhibidores de quinasa o anticuerpos diseñados contra ALK, LTK, InsR e IGF1R pueden tener efectos terapéuticos contra la ROS quinasa.
EJEMPLO 10
Detección de la expresión de ROS mutante en una muestra de cáncer humano usando un ensayo FISH
La presencia de un polinucleótido de fusión ROS (p. ej., un FIG-ROS(L), FIG-ROS (S), FIG-ROS (XL), SLC34A2-ROS(S), SLC34A2-ROS (VS), SLC34A2-ROS (L) o CD74-ROS) en cáncer de hígado (p. ej., en un colangiocarcinoma), cáncer de páncreas, cáncer de riñón o cáncer testicular se detecta usando un ensayo de hibridación in situ por fluorescencia (FISH). Dichos ensayos FISH son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Verma et al. “Human Chromosomes: A Manual de Basic Techniques”, Pergamon Press, Nueva York, N. Y. (1988).
Para ello, se examinan muestras de tumores humanos introducidas en parafina. Algunos tejidos que se examinan incluyen cánceres de hígado, páncreas, testículo y de riñón, en particular, cánceres que afectan a los conductos de todos estos tejidos.
Para analizar la redisposiciones que implican el gen de ROS, se diseñó una sonda de escisión de dos colores. Como se muestra en la Figura 16, varias sondas BAC rodean los genes de FIG y ROS en el cromosoma 6. Aunque estas sondas son ideales para identificar las translocaciones entre el gen de FIG (también conocido como el gen GOPCvéase la Fig. 16) y el gen de ROS, estas sondas también pueden usarse para identificar otra translocación del gen de ROS.
Para estos estudios, se diseñó una sonda proximal (clon BAC RP1-179P9) y dos sondas distales (clon BAC RP11323O17, RP1-94G16) (estando todas ellas disponibles en el mercado, p. ej., en Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, como los n.º de catálogo RPCI1.C y RPCI11.C). La sonda proximal puede marcarse con Spectrum Orange dUTP y la sonda distal puede marcarse con Spectrum Green dUTP, el marcaje de las sondas mediante traducción de muescas y FISH de interfase usando secciones de tejido FFPE pueden realizarse según las instrucciones del fabricante (Vysis Inc., Downers Grove, IL) con las siguientes modificaciones. En resumen, se rehidrataron las secciones de tejido embebidas en parafina y se sometieron a pretratamiento primero en HCl 0,2 N durante 20 minutos seguido de tiocianato de sodio 1 M a 80 ºC durante 30 min.
Después de un breve lavado, las secciones se digieren con proteasa (8 mg de Pepsina, 2000-3000 U/mg) durante 45-60 minutos a 37 ºC y luego se fijaron en NBF al 10 % y se deshidrataron. A continuación, se carga el conjunto de sondas en las secciones y se incuba a 94 ºC durante 3 min con el fin de desnaturalizar la sonda y el cromosoma diana. Después de la desnaturalización, se incuban los portaobjetos a 37 ºC durante un mínimo de 18 horas. Después del lavado, se aplicará 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; mg/ml) en un medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para la contratinción nuclear.
La sonda de redisposición de FIG-ROS contendrá tres sondas marcadas de forma diferente. Dos de estas sondas
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Secuencia del péptido: (biotina)AGAGCQEKQVAYCP Extremo carboxilo del péptido: CONH2 Escala de la síntesis (µmol): 5
Número del péptido: M09-6299 Nombre del péptido: ROS-9 Secuencia del péptido: (biotina)AGAGVAYCPSGKPE Extremo carboxilo del péptido: CONH2 Escala de la síntesis (µmol): 5
Tras lavar, se realice la detección con reactivo de detección de IHC SignalStain® Boost (HRP, Conejo) n.º 8114 y NovaRed (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Los resultados muestran que solo el péptido 9 fue capaz de competir por la unión del anticuerpo fuera del portaobjetos de IHC. La Figura 19A muestra un portaobjetos de IHC con la adición del péptido ROS-1, y la Figura 19B muestra un portaobjetos de IHC con la adición del péptido ROS-9. Por lo tanto, la secuencia de ROS-9, en concreto, AGAGVAYCPSGKPE, está dentro del fragmento de ROS quinasa específicamente unido al anticuerpo usado en estos estudios. Dado que esta secuencia aparece dentro del dominio quinasa de la ROS quinase, estos estudios sugieren con fuerza que los tejidos de CCA y HCC que se tiñeron positivos para la unión con el anticuerpo específico de ROS expresaban el dominio quinasa de ROS.
La descripción se puede describir con mayor detalle mediante las siguientes cláusulas:
1.
Un polipéptido de fusión FIG-ROS (S) purificado, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 17.
2.
Un polinucleótido de fusión FIG-ROS (S) purificado, en donde dicho polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 16.
3.
Un agente de unión que se une específicamente a un polipéptido de fusión FIG-ROS.
4.
El agente de unión de la cláusula 3, en donde el agente de unión se une específicamente a una unión de fusión entre una parte FIG y una parte ROS en dicho polipéptido de fusión FIG-ROS.
5.
El agente de unión de la cláusula 4, en donde la unión de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AGSTLP, LQVWHR y LQAGVP.
6.
El agente de unión de la cláusula 3, en donde el polipéptido de fusión FIG-ROS se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido de fusión FIG-ROS (S), un polipéptido de fusión FIG-ROS (L) y un polipéptido de fusión FIG-ROS (XL).
7.
El agente de unión de la cláusula 3, en donde el agente de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo y un péptido AQUA.
8.
Una sonda nucleotídica para detectar un polinucleótido de fusión FIG-ROS (S) o un polinucleótido de fusión FIG-ROS (XL), en donde dicha sonda se hibrida con dicho polinucleótido de fusión FIG-ROS (S) o a un polinucleótido de fusión FIG-ROS (XL) en condiciones rigurosas.
9.
Un método de detección de una translocación del gen de FIG-ROS en una muestra biológica, comprendiendo dicho método la puesta en contacto de una muestra biológica con un agente de unión que se une específicamente a un polipéptido de fusión FIG-ROS, en donde la unión específica de dicho agente de unión a dicha muestra biológica indica una translocación del gen de FIG-ROS en dicha muestra biológica.
10.
Un método de detección de una translocación del gen de FIG-ROS en una muestra biológica, comprendiendo dicho método la puesta en contacto de una muestra biológica con una sonda nucleotídica que se hibrida con un polinucleótido de fusión FIG-ROS en condiciones rigurosas, en donde la hibridación de dicha sonda nucleotídica a dicha muestra biológica indica una translocación del gen de FIG-ROS en dicha muestra biológica.
11.
Un método de diagnóstico de un paciente que tiene un cáncer o cáncer sospechoso caracterizado por una ROS quinasa, en donde dicho cáncer o cáncer sospechoso no es un cáncer ni cáncer sospechoso seleccionado del grupo que consiste en carcinoma pulmonar no microcítico y glioblastoma, comprendiendo dicho método la puesta en contacto de una muestra biológica de dicho cáncer o cáncer sospechoso, comprendiendo dicha muestra biológica al menos un polipéptido, con un agente de unión que se une específicamente a un polipéptido ROS mutante, en donde la unión específica de dicho agente de unión a al menos un polipéptido en dicha muestra biológica identifica a dicho paciente como aquel que tiene un cáncer o un cáncer sospechoso caracterizado por una ROS quinasa.
12.
Un método de identificación de un cáncer o un cáncer sospechoso que es probable que responda a un inhibidor de ROS, en donde dicho cáncer o cáncer sospechoso no es un cáncer ni un cáncer sospechoso seleccionado del grupo que consiste en carcinoma pulmonar no microcítico y glioblastoma, comprendiendo dicho método la puesta en
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contacto de una muestra biológica de dicho cáncer o cáncer sospechoso, comprendiendo dicha muestra biológica al menos un polipéptido con un agente de unión que se une específicamente a un polipéptido ROS mutante, en donde la unión específica de dicho agente de unión a al menos un polipéptido en dicha muestra biológica identifica dicho cáncer o cáncer sospechoso como un cáncer o cáncer sospechoso que es probable que responda a un inhibidor de ROS.
13.
El método de la cláusula 11 o 12, en donde dicho polipéptido ROS mutante es polipéptido ROS de tipo silvestre expresado de forma aberrante.
14.
El método de la cláusula 11 o 12, en donde dicho polipéptido ROS mutante se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido ROS truncado y un polipéptido de fusión ROS.
15.
El método de la cláusula 14, en donde el polipéptido de fusión ROS se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido de fusión FIG-ROS (S), un polipéptido de fusión FIG-ROS (L), un polipéptido de fusión FIG-ROS (XL), un polipéptido de fusión SLC34A2-ROS (S), un polipéptido de fusión SLC34A2-ROS (L), un polipéptido de fusión SLC34A2-ROS (VS) y un polipéptido de fusión CD74-ROS.
16.
El método de la cláusula 11 o 12, en donde el agente de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o un péptido AQUA.
17.
Un método de diagnóstico de un paciente que tiene un cáncer o cáncer sospechoso caracterizado por una ROS quinasa, en donde dicho cáncer o cáncer sospechoso no es un cáncer ni un cáncer sospechoso seleccionado del grupo que consiste en carcinoma pulmonar no microcítico y glioblastoma, comprendiendo dicho método la puesta en contacto de una muestra biológica de dicho cáncer o cáncer sospechoso, comprendiendo dicha muestra biológica al menos una molécula de ácido nucleico, con una sonda que se hibrida en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en un polinucleótido de fusión FIG-ROS, un polipéptido de fusión SLC34A2-ROS, un polipéptido de fusión CD74-ROS y un polinucleótido ROS truncado, y en donde la hibridación de dicha sonda con al menos una molécula de ácido nucleico en dicha muestra biológica identifica que dicho paciente tiene un cáncer o un cáncer sospechoso caracterizado por una ROS quinasa.
18.
Un método de identificación de un cáncer o un cáncer sospechoso que es probable que responda a un inhibidor de ROS, en donde dicho cáncer o cáncer sospechoso no es un cáncer ni un cáncer sospechoso seleccionado del grupo que consiste en carcinoma pulmonar no microcítico y glioblastoma, comprendiendo dicho método la puesta en contacto de una muestra biológica de dicho cáncer o cáncer sospechoso, comprendiendo dicha muestra biológica al menos una molécula de ácido nucleico, con una sonda que se hibrida en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en un polinucleótido de fusión FIG-ROS, un polipéptido de fusión SLC34A2-ROS, un polipéptido de fusión CD74-ROS y un polinucleótido ROS truncado, y en donde la hibridación de dicha sonda con al menos una molécula de ácido nucleico en dicha muestra biológica identifica que dicho cáncer o cáncer sospechoso como un cáncer o cáncer sospechoso que es probable que responda a un inhibidor de ROS.
19.
El método de la cláusula 17 o 18, en donde el polinucleótido de fusión FIG-ROS codifica un polipéptido de fusión seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de fusión FIG-ROS (S), un polipéptido de fusión FIG-ROS (L) y un polipéptido de fusión FIG-ROS (XL).
20.
El método de la cláusula 17 o 18, en donde el polinucleótido de fusión SCL34A2-ROS codifica un polipéptido de fusión seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de fusión SCL34A2-ROS (S), un polipéptido de fusión SCL34A2-ROS (L) y un polipéptido de fusión SCL34A2-ROS (VS).
21.
El método de la cláusula 11, 12, 17 o 18, en donde dicho cáncer o cáncer sospechoso se selecciona del grupo que consiste en un cáncer de riñón, un cáncer de hígado, un cáncer de páncreas y un cáncer de testículo.
22.
El método de la cláusula 11, 12, 17 o 18, en donde el cáncer es de un ser humano.
23.
El método de la cláusula 12 o 18, en donde, el inhibidor de ROS se selecciona del grupo que consiste en un agente de unión que se une específicamente a un polipéptido de fusión FIG-ROS, un agente de unión que se une específicamente a un polipéptido ROS truncado, un ARNip dirigido a un polinucleótido de fusión FIG-ROS y un ARNip dirigido a un polinucleótido ROS truncado.
24.
El método de la cláusula 12 o 18, en donde el inhibidor de ROS es un inhibidor de una quinasa seleccionada del grupo que consiste en una ALK quinasa, una LTK quinasa, un receptor de insulina y un receptor de IGF1.
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