ES2632768T3 - Flujo de trabajo para la detección de ligandos empleando ácidos nucleicos - Google Patents

Flujo de trabajo para la detección de ligandos empleando ácidos nucleicos Download PDF

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ES2632768T3
ES2632768T3 ES12702099.8T ES12702099T ES2632768T3 ES 2632768 T3 ES2632768 T3 ES 2632768T3 ES 12702099 T ES12702099 T ES 12702099T ES 2632768 T3 ES2632768 T3 ES 2632768T3
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Abstract

Un método para acoplar al menos dos oligonucleótidos para producir un oligonucleótido acoplado y amplificar el oligonucleótido acoplado, en el que el acoplamiento y la amplificación se producen en una única mezcla de reacción, comprendiendo dicho método las etapas, en combinación, de: a) poner en contacto una proteína diana o analito con al menos una primera y una segunda sonda, teniendo cada sonda una especificidad de unión por la proteína o el analito y estando unida al menos a un tipo de oligonucleótido; b) acoplar entre sí los oligonucleótidos sobre la primera y la segunda sonda empleando (i) una ligasa seleccionada del grupo que consiste en la ligasa de SEQ ID NO:77, la ligasa de SEQ ID NO:78, la ligasa de SEQ ID NO:79, la ligasa de SEQ ID NO:80, la ligasa de SEQ ID NO:81, la ligasa de SEQ ID NO:82, y sus combinaciones, y (ii) un puente oligonucleotídico, en el que dicho puente oligonucleotídico comprende un extremo 3' de cuatro a nueve bases de longitud, y un extremo 5' de cuatro a nueve bases de longitud, para producir un ácido nucleico diana y amplificar el ácido nucleico diana; y, c) detectar el ácido nucleico diana amplificado

Description

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5.476.930; Fung et al., patente de EE. UU. n.º 5.593.826; Kool, patente de EE. UU. n.º 5.426.180; Landegren et al., patente de EE. UU. n.º 5.871.921; Xu y Kool, Nucleic Acids Research, 27:875-881 (1999); Higgins et al., Methods in Enzymology, 68:50-71 (1979); Engler et al., The Enzymes, 15-3-29 (1982); y Namsaraev, publicación de patente de EE. UU. 2004/0110213. Se ha indicado la fidelidad de varias ligasas conocidas, basándose, por ejemplo, en la evaluación de las tasas de acoplamiento o de acoplamiento desapareado. Por ejemplo, se ha indicado que la ligasa dependiente de NAD+ de la bacteria hipertermófila Aquifex aeolicus genera productos de acoplamiento erróneo 3' detectables con desapareamientos de C:A, T:G, y G:T (Tong et al., Nucl. Acids Res., 28(6):1447-1454, 2000); se ha indicado que una preparación parcialmente purificada de la ADN ligasa III bovina genera productos de acoplamiento erróneo 3' detectables con desapareamientos de C:T, G:T, y T:G, mientras que la ligasa I humana genera productos de acoplamiento erróneo 3' detectables con desapareamientos de C:T y G:T, pero no de T:G (Husain et al., J. Biol. Chem., 270(16):9683-9690, 1995); y se ha indicado que la ADN ligasa de la bacteria termófila Thermus thermophilus (Tth) genera niveles detectables de productos de acoplamiento erróneo 3' detectables con desapareamientos de T:G y G:T (Luo et al., Nucl. Acids Res., 24(14):3071-3078, 1996). La ADN ligasa del bacteriófago T4 genera productos de acoplamiento erróneo detectables con una amplia gama de sustratos desapareados y parece tener menor fidelidad que las ligasas de especies de Thermus en al menos uno a dos órdenes de magnitud (Landegren et al., Science, 241:1077-1080, 1988; Tong et al., Nucl. Acids Res., 27(3):788-794, 1999).
Un ensayo particularmente útil es el ensayo de acoplamiento de oligonucleótidos (OLA). El OLA es un método conveniente y altamente riguroso que permite la distinción entre variantes de secuencias de ADN conocidas (Landegren, 1988). Por ejemplo, el análisis múltiplex de loci altamente polimorfos es útil para la identificación de individuos, por ejemplo, para ensayos de paternidad y en la ciencia forense, la correspondencia entre donantes y receptores en transplantes de órganos, el diagnóstico de enfermedades genéticas, la prognosis, y el asesoramiento prenatal y otros ensayos con base genética que dependen de la discriminación de diferencias de una sola base en múltiples loci (Delahunty, 1996). Los productos de un OLA múltiplex pueden separarse de modo electroforético y de las sondas no acopladas bajo condiciones desnaturalizantes con detección de fluorescencia (Grossman, 1994). Por ejemplo, dos quimeras de PNA-ADN, una quimera de secuencia de tipo salvaje ("wild-type", WT) y una quimera de secuencia mutante pueden llevar diferentes tintes fluorescentes. Solo cuando la secuencia mutante está presente en la muestra diana es cuando la quimera de secuencia mutante se acopla a la segunda sonda (oligo) acoplada en posición adyacente si el par de bases mutante está en el sitio de acoplamiento. Los productos del acoplamiento pueden separarse basándose en: (i) el tamaño, empleando electroforesis y/o cromatografía y/o (ii) marcadores detectables (Grossman, 1994). Con una pluralidad de tintes fluorescentes como marcadores de quimeras con secuencias que se dirigen a secuencias diana exclusivas, pueden realizarse OLA múltiplex en una sola muestra en un único recipiente. Los requisitos para un OLA múltiplex eficaz incluyen sondas que se asocian y se acoplan de una manera muy específica y rápida. Las quimeras y las secuencias de la segunda sonda pueden seleccionarse de modo que la base mutante, o polimorfismo de una sola base, pueda estar en el 5'-fosfato de la segunda sonda o en el 3'-terminal de la quimera. Se contempla que los experimentos de OLA de la presente invención puedan realizarse sobre soportes sólidos, en los que el ácido nucleico molde, la sonda quimérica de PNA-ADN, o la segunda sonda pueden estar inmovilizados sobre una partícula sólida o esfera, o una superficie sólida porosa o no porosa. Cuando están inmovilizados, el molde, la quimera o la segunda sonda preferiblemente están unidos covalentemente al sustrato sólido, por ejemplo, a través de una unidad de monómero terminal. El sustrato sólido puede ser poliestireno, vidrio de tamaño de poro controlado, gel de sílice, sílice, poliacrilamida, esferas magnéticas, hidroxietilmetacrilato, poliamida, polietileno, polietileoxi, y copolímeros e injertos de cualquiera de los anteriores sustratos sólidos. La configuración o el formato del sustrato sólido puede ser de pequeñas partículas o esferas con un diámetro de aproximadamente 1 a 50 µm, membranas, fritas, portaobjetos, placas, chips fabricados con micromáquinas, capas de alcantiol-oro, superficies no porosas y medios inmovilizantes de polinucleótidos.
Tal como se describió anteriormente, el acoplamiento enzimático generalmente se logra empleando una ligasa, que puede ser un polipéptido. Las ligasas adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido nucleico ligasa, oligonucleótido ligasa, ADN ligasa, ARN ligasa, y similares. Las ARN ligasas adecuadas incluyen las descritas o empleadas, por ejemplo, en cualquiera de las patentes de EE. UU. n.os 4.582.802; 5.665.545; 6.194.637; 6.444.429; 6.455.274; 6.576.453; 6.635.425; 6.855.523; 7.811.753; y/o cualquiera de las publicaciones de patente de EE. UU. 2004/0171047A1, 2004/0191871A1, US20050266487A1, 2006/0223098A1, 2007/0037190A1, 20080160526A1; 2009/0061481A1, 2010/0099683A1, y/o 2010/0184618A1. Los ejemplos de ADN ligasas pueden incluir, por ejemplo ADN ligasa de T3, ADN ligasa de T4, ADN ligasa de T5, ADN ligasa de T7, ADN ligasa del virus de vaccinia, ADN ligasa de E. coli, ADN ligasa I de mamífero, ADN ligasa II de mamífero, ADN ligasa III de mamífero, ADN ligasa de Tth, ADN ligasa de KOD, una ADN ligasa termoestable y/o sus derivados, fragmentos y/o combinaciones. Las ARN ligasas adecuadas incluyen las descritas o empleadas, por ejemplo, en cualquiera de las patentes de EE. UU. n. os 4.661.450; 5.516.664; 5.602.000; 5.807.674; 6.368.801; 6.492.161; 6.635.453; o cualquiera de las publicaciones de patente de EE. UU. n. os 2003/0082536A1; 2004/0058330A1; 2005/0266439A1; 2005/0074774A1; 2008/0045418A1; 2010/00159526A1. Los ejemplos de ARN ligasas pueden incluir, por ejemplo, ARN ligasa de T4, ARN ligasa del bacteriófago RB69, ARN ligasa del virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica, una ARN ligasa termófila, ARN ligasa del bacteriófago RM378, ARN ligasa del bacteriófago TS2126 y/o sus derivados, fragmentos y/o combinaciones.
En algunas realizaciones, la ligasa es una "ligasa de huella pequeña" ("small footprint ligase", SFL). Una SFL tiene la capacidad de acoplarse a polinucleótidos cortos (por ejemplo, al menos aproximadamente 3 nucleótidos). Tal como
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fragmentos funcionales o variantes. Los ejemplos representativos de SFL incluyen ligasa CV, DLX, DLXd, DLXd2 y ligasa MnM. Una SFL preferida es la ligasa del virus de Chlorella. Se identifican algunos ejemplos de ligasas y se indica su GI o número de registro en la siguiente Tabla 1:
Tabla 1
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B. Acidobacteria
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Bacteria; grupo de Fibrobacteres/Acidobacteria; Acidobacteria; Acidobacteria no clasificada; Candidatus Koribacter; Candidatus Koribacter versatilis
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Candidatus Solibacter usitatus Ellin6076Candidatus Solibacter (1 proteína)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_826317
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C. Actinobacteria
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Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria (clase); Actinobacteridae; Actinomycetales; Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium; Mycobacterium marinum
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Mycobacterium gilvum PYR-GCKMycobacterium (26 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001132524
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1Mycobacterium (26 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_956315
Mycobacterium sp. MCSMycobacterium (26 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_642076
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F. Chlamydiae/Verrucomicrobia
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Bacteria; grupo de Chlamydiae/Verrucomicrobia; Verrucomicrobia; Opitutae; Opitutales; Opitutaceae; Opitutus; Opitutus terrae
imagen30 imagen31
Opitutus terrae PB90-10pitutus (1 proteína)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001821013
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PRK09125
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Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
O. Betaproteobacteria
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Neisseria meningitidis Z2491Neisseria (7 proteínas)
ADN ligasa YP_002341892
Thiobacillus denitrificans ATCC 25259Thiobacillus (1 proteínas)
ADN ligasa YP_314570
Variovorax paradoxus S110Variovorax (1 proteínas)
ADN ligasa YP_002944627
14
PRK08224
imagen39 imagen40
B. Acidobacteria
imagen41 imagen42
Verminephrobacter eiseniae EF01-2Verminephrobacter (1 proteínas)
ADN ligasa YP_998235
imagen43
imagen44 imagen45
P. Deltaproteobacteria
- -
Desulfobacterium autotrophicum HRM2Desulfobacterium (1 proteína)
LigA2 YP_002604477
Myxococcus xanthus DK 1622Myxococcus (1 proteína)
ADN ligasa YP_628883
imagen46
- -
Q. Epsilonproteobacteria
imagen47 imagen48
Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168Campylobacter (10 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_002345037
Sulfurimonas denitrificans DSM 1251Sulfurimonas (1 proteínas)
ADN ligasa YP_393098
imagen49
- -
R. Gammaproteobacteria
imagen50 imagen51
Aggregatibacter aphrophilus NJ8700Aggregatibacter (2 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_003007537
Haemophilus influenzae PittEEHaemophilus (3 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001290961
Shewanella baltica OS195Shewanella (18 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001554317
Shewanella loihica PV-4Shewanella (18 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001093713
Vibrio cholerae M66-2Vibrio (9 proteínas)
ADN ligasa YP_002810248
imagen52
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PHA0454
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Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
b. Virus
- -
Virus; virus de ADNbc, sin etapa de ARN; Caudovirales; Podoviridae; Autographivirinae; virus similares a phiKMV
imagen57
virus similares al fago de LKD16phiKMV de Pseudomonas (7 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001522807
15
PRK08224
imagen58 imagen59
B. Acidobacteria
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CLSZ2445448
imagen65 imagen66
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
a. Eukaryota
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Eukaryota; Alveolata; Ciliophora; Intramacronucleata; Oligohymenophorea; Peniculida; Parameciidae; Paramecium; Paramecium tetraurelia
imagen69 imagen70
Paramecium tetraurelia strain d4-2Paramecium (5 proteínas)
ADN ligasa XP_001347270
imagen71
imagen72 imagen73
PRK07636
imagen74 imagen75
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
J. Firmicutes
imagen76 imagen77
Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; Bacillus clausii
imagen78 imagen79
Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168Bacillus
ADN ligasa dependiente de ATP NP_389932
Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Geobacillus
imagen80 imagen81
Geobacillus sp. Y412MC10Geobacillus
ADN ligasa dependiente de ATP YP_003240778
CLSK2551528
imagen82 imagen83
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
J. Firmicutes
imagen84 imagen85
Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Geobacillus
imagen86 imagen87
Geobacillus sp. Y412MC10Geobacillus (1 proteína)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_003245332
imagen88
- -
CLSK2470953
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Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
C. Actinobacteria
imagen91 imagen92
16
Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria (clase); Actinobacteridae; Actinomycetales; Micrococcineae; Micrococcaceae; Arthrobacter; Arthrobacter chlorophenolicus
imagen93
Arthrobacter chlorophenolicus A6 (plasmid)Arthrobacter (2 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_002478427
imagen94
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CLSK2469924
imagen97 imagen98
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
J. Firmicutes
imagen99 imagen100
Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Alicyclobacillaceae; Alicyclobacillus; Alicyclobacillus acidocaldarius; Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. acidocaldarius
imagen101 imagen102
Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. acidocaldarius DSM 446Alicyclobacillus
ADN ligasa dependiente de ATP YP_003185050
imagen103
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CLSK2340991
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Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
N. Alphaproteobacteria
imagen108 imagen109
Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; Phenylobacterium; Phenylobacterium zucineum
Phenylobacterium zucineum HLK1 (plásmido)Phenylobacterium (2 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_002128631
imagen110
- -
CLSK2333706
imagen111 imagen112
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
J. Firmicutes
imagen113 imagen114
Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptococcaceae; Candidatus Desulforudis; Candidatus Desulforudis audaxviator
Candidatus Desulforudis audaxviator MP104CCandidatus Desulforudis (1 proteína)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001716762
imagen115
- -
CLSK962101
imagen116 imagen117
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
17
C .Actinobacteria
imagen118 imagen119
Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria (clase); Actinobacteridae; Actinomycetales; Micromonosporineae; Micromonosporaceae; Salinispora; Salinispora arenicola
- -
Salinispora arenicola CNS-205Salinispora (2 proteínas)
región de la ligasa LigD de ADN polimerasa YP_001539124
Salinispora tropica CNB-440Salinispora (2 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001160776
imagen120
- -
CLSK915249
imagen121 imagen122
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
C. Actinobacteria (véase CLSK2303611 anterior)
imagen123 imagen124
Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria (clase); Actinobacteridae; Actinomycetales; Streptomycineae; Streptomycetaceae; Streptomyces; Streptomyces coelicolor
imagen125 imagen126
Streptomyces avermitilis MA-4680 (plásmido)Streptomyces (2 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP putativa NP_828839
Streptomyces sp. HK1 (plásmido)Streptomyces (2 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP putativa YP_001661618
CLSK862724
imagen127 imagen128
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
A. Archaea
imagen129 imagen130
Archaea; Euryarchaeota; Archaeoglobi; Archaeoglobales; Archaeoglobaceae; Archaeoglobus; Archaeoglobus fulgidus
imagen131 imagen132
Archaeoglobus fulgidus DSM 4304Archaeoglobus (1 proteína)
ADN ligasa, putativa NP_070553
imagen133
imagen134 imagen135
J. Firmicutes
imagen136 imagen137
Pelotomaculum thermopropionicum SIPelotomaculum (1 proteína)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001211793
Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223Thermoanaerobacter (2 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_001664477
imagen138
imagen139 imagen140
CLSK820690
imagen141 imagen142
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
18
A. Archaea
imagen143 imagen144
Archaea; Euryarchaeota; muestras ambientales
imagen145 imagen146
muestras ambienteles RC-I de arqueas metanogénicas no cultivadas (1 proteína)
ADN ligasa dependiente de ATP YP_686457
N. Alphaproteobacteria
imagen147 imagen148
Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Bradyrhizobiaceae; Bradyrhizobium; Bradyrhizobium japonicum
imagen149 imagen150
Bradyrhizobium japonicum USDA 110Bradyrhizobium (2 proteínas)
ADN ligasa NP_774671
Bradyrhizobium sp. BTAilBradyrhizobium (2 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP putativa YP_001243518
imagen151
imagen152 imagen153
CLSK808255
imagen154 imagen155
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
N. Alphaproteobacteria
imagen156 imagen157
Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; grupo de SinorhizobiumlEnsifer; Sinorhizobium; Sinorhizobium medicae
imagen158 imagen159
Sinorhizobium medicae WSM419Sinorhizobium (2 proteínas)
región de la ligasa LigD de ADN polimerasa YP_001326990
Sinorhizobium meliloti 1021 (plasmid)Sinorhizobium (2 proteínas)
proteína de ADN ligasa dependiente de ATP putativa NP_437750
CLSK806855
imagen160 imagen161
Organismo
Nombre de la proteína n.º de registro
N. Alphaproteobacteria
imagen162 imagen163
Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; grupo de Rhizobium/Agrobacterium; Agrobacterium; Agrobacterium tumefaciens
imagen164 imagen165
Agrobacterium tumefaciens str. C58 (plásmido)Agrobacterium (3 proteínas)
ADN ligasa dependiente de ATP NP_396032
Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM1325 (plásmido)Rhizobium (10 proteínas)
proteína del dominio de ligasa LigD de ADN polimerasa YP_002973496
Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM2304 (plásmido)Rhizobium (10 proteínas)
proteína del dominio de ligasa LigD de ADN polimerasa YP_002278005
19
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