ES2630186T3 - Sondas y procedimientos para el tipado del virus de la hepatitis C usando análisis multidimensional de sondas - Google Patents

Sondas y procedimientos para el tipado del virus de la hepatitis C usando análisis multidimensional de sondas Download PDF

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Abstract

Un procedimiento en tubo cerrado para determinar el tipo y la carga vírica de un virus de la hepatitis C (VHC) en una muestra, si está presente, comprendiendo el procedimiento a) amplificar una porción del genoma de VHC de la muestra en una reacción de RT-PCR asimétrica, produciendo de este modo al menos un amplicón; b) determinar la carga vírica del VHC en la muestra controlando una velocidad de acumulación del amplicón y correlacionando la velocidad de acumulación de amplicón con la carga vírica, en el que el control se realiza usando una sonda de cuantificación de amplicón; c) hibridar el amplicón con al menos una primera sonda y una segunda sonda, para formar al menos dos complejos de hibridación diana, en el que: i) cada sonda es complementaria o parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos dentro de un genoma de VHC; ii) la secuencia de nucleótidos dentro del genoma de VHC muestra heterogeneidad de secuencia entre al menos dos tipos de VHC; iii) complejos de hibridación que comprenden dicha primera sonda y dicha secuencia de nucleótidos tienen una propiedad de hibridación distintiva que diferencia al menos dos tipos de VHC; y iv) complejos de hibridación que comprenden dicha segunda sonda y dicha secuencia de nucleótidos tienen una propiedad de hibridación distintiva que diferencia al menos dos tipos de VHC, en el que la propiedad de hibridación distintiva de la etapa iv) es la misma que la propiedad de hibridación distintiva de la etapa iii), y los al menos dos tipos de virus diferenciados por la primera sonda son diferentes de los al menos dos tipos de VHC diferenciados por la segunda sonda; d) medir la propiedad de hibridación distintiva de los complejos de hibridación diana para generar un perfil de hibridación para cada complejo de hibridación; e) comparar los perfiles de hibridación entre sí en un análisis multidimensional para generar un perfil compuesto; y f) correlacionar dicho perfil compuesto con uno de al menos cinco tipos de VHC, en el que una asignación de un tipo de VHC se realiza considerando dichos complejos de hibridación que comprenden dicha primera sonda y dicha segunda sonda, en el que la sonda de cuantificación de amplicón está diseñada para ser complementaria a la cadena de amplicón limitante y las sondas de tipado de VHC están diseñadas para ser complementarias a la cadena de amplicón en exceso abundante.

Description

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heterogeneidad de secuencia entre al menos dos tipos de VHC; iii) complejos de hibridación que comprenden (i) cualquier sonda de la pluralidad de sondas y (ii) secuencias de nucleótidos de al menos dos tipos de VHC que tienen una propiedad de hibridación distintiva que permite la diferenciación de los al menos dos tipos de virus; iv) los al menos dos tipos de VHC diferenciados por una sonda de la pluralidad de sondas son diferentes de los al menos dos tipos de VHC diferenciados por una segunda sonda diferente de la pluralidad de sondas; y v) la propiedad de hibridación distintiva de cada uno de los complejos de hibridación que comprenden al menos dos sondas de la pluralidad de sondas se correlaciona con uno de al menos cinco tipos de VHC, en el que se hace una asignación de un tipo de VHC considerando la propiedad de hibridación distintiva de los complejos de hibridación; y b) instrucciones para medir la propiedad de hibridación distintiva de complejos de hibridación que comprenden una sonda diana de la pluralidad de sondas diana.
También se divulga un sistema que correlaciona la detección de una pluralidad de señales con un tipo de virus de la hepatitis C (VHC), en el que el sistema comprende a) un detector para detectar las señales, en el que las señales se correlacionan con una propiedad de hibridación distintiva de una pluralidad de complejos de hibridación ; y, b) un módulo de correlación acoplado funcionalmente al detector, en el que el módulo de correlación recibe las señales detectadas por el detector y correlaciona las señales con un tipo de VHC correlacionando las señales detectadas con señales predichas o predeterminadas observadas cuando se detecta la propiedad de hibridación distintiva de complejos de hibridación que comprenden una pluralidad de tipos de VHC conocidos, en el que durante el funcionamiento del sistema i) las señales se generan a partir de una pluralidad de complejos de hibridación que comprenden una secuencia de nucleótidos de VHC y al menos una primera y segunda sonda; ii) las secuencias de nucleótidos de la primera y segunda sonda de tipado son complementarias o parcialmente complementarias a secuencias de nucleótidos dentro de un genoma de VHC; iii) las secuencias de nucleótidos dentro del genoma de VHC muestran heterogeneidad de secuencia entre al menos dos tipos de VHC; iv) complejos de hibridación que comprenden la primera sonda y la secuencia de nucleótidos tienen una propiedad de hibridación distintiva que diferencia al menos dos tipos de VHC; y v) complejos de hibridación que comprenden la segunda sonda y la secuencia de nucleótidos tienen una propiedad de hibridación distintiva que diferencia al menos dos tipos de VHC, en el que la propiedad de hibridación distintiva de la etapa iv) es la misma que la propiedad de hibridación distintiva de la etapa v), y los al menos dos tipos de virus diferenciados por la primera sonda son diferentes de los al menos dos tipos de virus diferenciados por la segunda sonda.
También se divulga un oligonucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 9 a 57.
DEFINICIONES
Debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento se utiliza con el propósito de describir únicamente modos de realización particulares y no pretende ser limitante. Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, los términos en singular y las formas singulares "un", "una", "el" y "ella", por ejemplo, incluyen referentes plurales a menos que el contenido claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un ácido nucleico" incluye también una pluralidad de moléculas de ácido nucleico; el uso del término "sonda" incluye, en la práctica, muchas moléculas de sonda, y similares.
A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3', y las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación amino (N-terminal) a carboxi (C-terminal). Los intervalos numéricos enumerados en la especificación incluyen los números que definen el intervalo e incluyen cada número entero y cualquier fracción no entera dentro del intervalo definido.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque en la práctica para someter someter a prueba la presente divulgación se puede usar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación se describen los materiales y procedimientos preferentes. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones que se exponen a continuación.
Como se usa en el presente documento, el término "base" se refiere a cualquier resto heterocíclico que contiene nitrógeno capaz de formar enlaces de hidrógeno de tipo Watson-Crick en el apareamiento con una base complementaria o un análogo de base. Se conocen un gran número de bases naturales y sintéticas (no naturales o antinaturales), análogos de bases y derivados de bases. Los ejemplos de bases incluyen purinas y pirimidinas y formas modificadas de las mismas. Las bases de origen natural incluyen, pero no se limitan a, adenina (A), guanina (G), citosina (C), uracilo (U) y timina (T). Como se usa en el presente documento, no se pretende que la invención se limite a bases de origen natural, ya que un gran número de bases no naturales (que no se producen de forma natural) y sus respectivos nucleótidos no naturales que encuentran uso con la invención son conocidos por un experto en la técnica. A continuación se dan ejemplos de dichas bases no naturales.
El término "nucleósido" se refiere a un compuesto que consiste en una base unida al carbono C-1' de un azúcar, por ejemplo, ribosa o desoxirribosa.
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EE. UU. n.º 6.214.979, titulada "HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM", concedida el 10 de abril de 2001 a Gelfand et al.; la patente de EE. UU. n.º 5.804.375, titulada "REACTION MIXTURES FOR DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACIDS", concedida el 8 de septiembre de 1998 a Gelfand et al.; la patente de EE. UU. n.º 5.487.972, titulada "NUCLEIC ACID DETECTION BY THE 5'-3' EXONUCLEASE ACTIVITY OF POLYMERASES ACTING ON ADJACENTLY HYBRIDIZED OLIGONUCLEOTIDES", concedida el 30 de enero de 1996 a Gelfand et al.; y la patente de EE. UU. n.º 5.210.015, titulada "HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM USING THE NUCLEASE ACTIVITY OF A NUCLEIC ACID POLYMERASE", concedida el 11 de mayo de 1993 a Gelfand et al.
También se conocen variaciones en las metodologías para la detección de amplicones en tiempo real y, en particular, cuando la sonda de 5'-nucleasa se reemplaza por un tinte de intercalación de ADN bicatenario que da lugar a una fluorescencia que depende de la cantidad de amplicón bicatenario presente en la reacción de amplificación. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 6.171.785, titulada "METHODS AND DEVICES FOR HOMOGENOUS NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION", concedida el 9 de enero de 2001 a Higuchi; y la patente de EE. UU. n.º 5.994.056, titulada "HOMOGENEOUS METHODS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION", concedida el 30 de noviembre de 1999 a Higuchi.
La PCR TaqMan® se puede realizar utilizando kits y equipos disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) o LightCycler® (Roche Applied Sciences, Mannheim, Alemania). En un modo de realización preferente, el procedimiento de ensayo de 5'nucleasa se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7700. El sistema consiste en un termociclador, láser, dispositivo de acoplamiento de carga (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de placa de microtitulación de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge en tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos y se detecta en la cámara CCD. El sistema incluye un programa informático para ejecutar el instrumento y para analizar los datos. Este sistema ABI PRISM® tiene el beneficio adicional de controlar la temperatura hasta temperaturas tan bajas como 20 ºC, permitiendo así el análisis de la curva de fusión.
Los dispositivos que son capaces de excitar y detectar emisiones en dos canales diferentes en el mismo recipiente de reacción también encuentran uso con la invención. Por ejemplo, los ejemplos descritos a continuación utilizan el Analizador COBAS™ TaqMan® 48 de Roche Molecular Diagnostics (Roche Molecular Systems, Inc, Pleasanton, CA). No se pretende que la invención se limite al uso de un aparato particular.
Como se usan en el presente documento, los términos "hibridación" y"atemperado" y similares se usan indistintamente y se refieren a la interacción de apareamiento de bases de un polinucleótido con otro polinucleótido (típicamente un polinucleótido antiparalelo) que da como resultado la formación de una estructura dúplex u otra estructura de orden superior, típicamente denominada complejo de hibridación. La interacción primaria entre las moléculas de polinucleótidos antiparalelos es típicamente específica de la base, por ejemplo, A/T y G/C, por enlace de hidrógeno de tipo Watson/Crick y/o Hoogsteen. No es un requisito que dos polinucleótidos tengan un 100 % de complementariedad en toda su longitud para lograr la hibridación. En algunos aspectos, un complejo de hibridación se puede formar a partir de interacciones intermoleculares, o de forma alternativa, se puede formar a partir de interacciones intramoleculares.
Como se usan en el presente documento, las frases "hibridar específicamente", "hibridación específica" y similares se refieren a hibridación que da como resultado un complejo en el que el par hibridado muestra complementariedad y se unen preferentemente entre sí con la exclusión de otros posibles patrones de unión en la reacción de hibridación. Se observa que la expresión "hibridar específicamente" no requiere que un complejo de hibridación resultante tenga un 100 % de complementariedad; complejos de hibridación que tienen emparejamientos erróneos también pueden hibridar específicamente y formar un complejo de hibridación. El grado de especificidad de la hibridación se puede medir usando una propiedad de hibridación distintiva, por ejemplo, la temperatura de fusión del complejo de hibridación (Tf).
Como se usa en el presente documento, la frase "condiciones en las que se produce apareamiento de bases" se refiere a cualquier condición de hibridación que permita que polinucleótidos complementarios o polinucleótidos parcialmente complementarios formen un complejo de hibridación estable.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "riguroso", "condiciones rigurosas", "alta rigurosidad" y similares indican condiciones de hibridación de fuerza iónica generalmente baja y temperatura generalmente alta, como es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., ed., J. Wiley & Sons Inc., Nueva York, 1997). En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5-30 ºC más bajas que el punto de fusión térmico (Tf) para el complejo de hibridación que comprende la secuencia especificada a una fuerza iónica y pH definidos. De forma alternativa, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5-15 ºC más bajas que la Tf para la secuencia especificada a una fuerza iónica y pH definidos. La Tf es la temperatura (a una
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fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) a la que se disocian un 50 % de los complejos de hibridación que comprenden polinucleótidos complementarios (o parcialmente complementarios).
Como se usa en el presente documento, la expresión "baja rigurosidad" indica condiciones de hibridación de fuerza iónica generalmente alta y temperatura generalmente más baja. En condiciones de hibridación de baja rigurosidad, los polinucleótidos con complementariedad imperfecta pueden formar más fácilmente complejos de hibridación.
Como se usa en el presente documento, los términos "complementario" o "complementariedad" se usan en referencia a cadenas antiparalelas de polinucleótidos relacionadas con las reglas de apareamiento de bases de tipo Watson-Crick y Hoogsteen. Por ejemplo, la secuencia 5'-AGTTC-3' es complementaria a la secuencia 5'-GAACT-3'. Las expresiones "completamiento complementario" o "100 % complementario" y similares se refieren a secuencias complementarias que tienen apareamiento de bases perfecto de Watson-Crick entre las cadenas antiparalelas (sin emparejamientos erróneos en el dúplex de polinucleótido). No obstante, la complementariedad no necesita ser perfecta; los dúplex estables, por ejemplo, pueden contener pares de bases mal emparejados o bases no emparejadas. Las expresiones "complementariedad parcial", "parcialmente complementario", "complementariedad incompleta" o "no completamente complementarios" y similares se refieren a cualquier alineación de bases entre cadenas antiparalelas de polinucleótidos que sea menos de un 100 % perfecta (por ejemplo, existe al menos un emparejamiento erróeno o base no emparejada en el dúplex de polinucleótido). Por ejemplo, la alineación de bases entre las cadenas antiparalelas de polinucleótidos puede ser al menos de un 99 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 % o 50 % o cualquier valor entre ellos.
Además, un "complemento" de un polinucleótido diana se refiere a un polinucleótido que se puede combinar (por ejemplo, hibridar) en una asociación antiparalela con al menos una porción del polinucleótido diana. La asociación antiparalela puede ser intramolecular, por ejemplo, en forma de una horquilla dentro de una molécula de ácido nucleico, o intermolecular, tal como cuando dos o más moléculas de ácido nucleico monocatenario hibridan entre sí.
Como se usan en el presente documento, "diana", "polinucleótido diana" y "secuencia diana" y similares se refieren a una secuencia polinucleotídica específica que es el objeto de hibridación con un polinucleótido complementario, por ejemplo, una sonda marcada o un cebador de ADN polimerasa. El complejo de hibridación formado como resultado de la hibridación de un polinucleótido con su diana se denomina "complejo de hibridación diana". El complejo de hibridación se puede formar en solución (y, por lo tanto, es soluble), o uno o más componentes del complejo de hibridación se pueden fijar a una fase sólida (por ejemplo, a una inmunotransferencia por puntos, fijados a un sistema de perlas para facilitar la eliminación o aislamiento de los complejos de hibridación diana, o en una micromatriz). La estructura de la secuencia diana no está limitada, y puede estar compuesta de ADN, ARN, análogos de los mismos o combinaciones de los mismos, y puede ser monocatenaria o bicatenaria. Un polinucleótido diana se puede derivar de cualquier fuente, incluyendo, por ejemplo, cualquier organismo vivo o que una vez estuvo vivo, incluyendo, pero sin limitarse a, procariota, eucariota, planta, animal y virus, así como secuencias diana sintéticas y/o recombinantes. Por ejemplo, como se describe en el presente documento, un amplicón de PCR derivado de la secuencia genómica del virus puede servir como diana.
En algunos aspectos, el polinucleótido diana de un complejo de hibridación sirve como una "plantilla", en la que un cebador de polinucleótido extensible se une a la plantilla e inicia la polimerización de nucleótidos utilizando la secuencia de bases de la plantilla como patrón para la síntesis de un polinucleótido complementario.
Como se usa en el presente documento, el término "sonda" se refiere típicamente a un polinucleótido que es capaz de hibridar con un ácido nucleico diana de interés. Típicamente, pero no exclusivamente, una sonda se asocia con un marcador o grupo indicador adecuado de modo que la sonda (y, por lo tanto, su diana) se pueda detectar, visualizar, medir y/o cuantificar. Los sistemas de detección para sondas marcadas incluyen, pero no se limitan a, la detección de fluorescencia, desactivación de fluorescencia (por ejemplo, cuando se utiliza un sistema de detección de par de FRET), actividad enzimática, absorbancia, masa molecular, radiactividad, luminiscencia o propiedades de unión que permiten la unión específica del indicador (por ejemplo, cuando el indicador es un anticuerpo). En algunos modos de realización, una sonda puede ser un anticuerpo, en lugar de un polinucleótido, que tiene especificidad de unión por una secuencia de nucleótidos de ácido nucleico de interés. No se pretende que la presente invención se limite a ningún sistema de detección de sonda o marcador de sonda particular. La fuente del polinucleótido utilizado en la sonda no está limitada, y se puede producir sintéticamente en un sistema no enzimático, o puede ser un polinucleótido (o una parte de un polinucleótido) que se produce usando un sistema biológico (por ejemplo, enzimático) (por ejemplo, en una célula bacteriana).
Típicamente, una sonda es suficientemente complementaria a una secuencia diana específica contenida en un ácido nucleico para formar un complejo de hibridación estable con la secuencia diana en una condición de hibridación seleccionada, tal como, pero sin limitarse a, una condición de hibridación rigurosa. Un ensayo de hibridación llevado a cabo utilizando la sonda en condiciones de hibridación suficientemente rigurosas permite la detección selectiva de una secuencia diana específica.
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Como se usa en el presente documento, la expresión "carga vírica", "número de copias víricas" y expresiones equivalentes o similares se refieren a la evaluación cuantitativa de un genoma de virus en una muestra. Una carga vírica se puede expresar como el número de partículas de virus (por ejemplo, virión) por unidad de volumen de muestra. De forma alternativa, una carga vírica se puede expresar como el número de partículas de genoma vírico en una muestra por unidad de volumen. Por ejemplo, la carga vírica de un VHC en una muestra se puede expresar como el número de moléculas de genoma de ARN por unidad de volumen de muestra.
Como se usan en el presente documento, los términos "subsecuencia", "fragmento", "porción" y similares se refieren a cualquier porción de una secuencia mayor (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido o polipéptido) hasta e incluyendo la secuencia completa. La longitud mínima de una subsecuencia generalmente no está limitada, excepto que una longitud mínima pueda ser útil en vista de su función prevista. Por ejemplo, una porción de polinucleótido se puede amplificar a partir de un genoma vírico para producir un amplicón, que a su vez se puede usar en una reacción de hibridación que incluye una sonda polinucleotídica. Por lo tanto, en este caso, la porción amplificada debe ser suficientemente larga para que hibride específicamente con una sonda polinucleotídica. Las porciones de polinucleótidos pueden tener cualquier longitud, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150 óo200 nucleótidos o más de longitud.
Como se usa el presente documento, el término "controlar" se refiere a vigilancia, pruebas, recogida de datos y/o cuantificación periódica o continua. El control se puede automatizar y la información (por ejemplo, un conjunto de datos) recopilada durante el control se puede imprimir o se puede compilar como un formato legible y/o almacenable por un ordenador.
Como se usa en el presente documento, el término "correlacionar" se refiere a crear una relación entre dos o más variables, valores o entidades. Si dos variables se correlacionan, la identificación de una de esas variables se puede usar para determinar el valor de la variable restante.
Como se usa en el presente documento, el término "kit" se usa en referencia a una combinación de artículos que facilitan un proceso, procedimiento, ensayo, análisis o manipulación de una muestra. Los kits pueden contener instrucciones escritas que describan cómo usar el kit (por ejemplo, instrucciones que describan los procedimientos de la presente invención), reactivos químicos o enzimas requeridos para el procedimiento, cebadores y sondas, así como cualquier otro componente. También se divulgan kits para tipado de VHC en "tubo cerrado" que emplean RT-PCR. Estos kits pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, reactivos para la recogida de muestras (por ejemplo, la recogida de una muestra de sangre), reactivos para la recogida y purificación de ARN de sangre, una transcriptasa inversa, cebadores adecuados para transcripción inversa y para síntesis de la primera cadena y segunda cadena de ADNc para producir un amplicón de VHC, una ADN polimerasa termoestable dependiente de ADN y desoxirribonucleótidos trifosfato libres. En algunos modos de realización, la enzima que comprende actividad de transcriptasa inversa y actividad de ADN polimerasa termoestable dependiente de ADN son la misma enzima, por ejemplo, polimerasa de Thermus sp. ZO5 o polimerasa de Thermus thermophilus.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 proporciona una representación esquemática del genoma de VHC y los polipéptidos codificados correspondientes. Se proporcionan longitudes aproximadas del genoma de longitud completa y del marco abierto de lectura. También se indican sitios de escisión de poliproteínas. Los tamaños exactos de los diferentes dominios genómicos variarán dependiendo del genotipo y subtipo de VHC.
La figura 2 proporciona una tabla que describe la nomenclatura de tipado de VHC.
La figura 3 proporciona una tabla que muestra los porcentajes de identidad de secuencia de nucleótidos entre varios subtipos de VHC en un segmento de 222 nucleótidos derivado de la región NS5 en las posiciones 7975 a 8196 del genoma vírico prototipo de VHC.
La figura 4 proporciona una tabla que enumera varios subtipos de VHC y ejemplos de aislados conocidos.
La figura 5 proporciona una tabla que enumera varios tipos de VHC y las secuencias de nucleótidos de consenso de un dominio de 33 nucleótidos en la región 5'-UTR de cada uno de los subtipos respectivos.
La figura 6 proporciona una tabla que enumera ejemplos de sondas de tipado de VHC, su longitud (en nucleótidos) y sus secuencias de bases respectivas. En la parte inferior se muestra una leyenda que describe los símbolos usados para indicar nucleótidos no estándar y marcadores.
La figura 7 proporciona ejemplos de estructuras de desactivadores solubles de tintes de tiazina.
La figura 8 proporciona un esquema que muestra una hipotética varianza de Tf intragenotípica y ambigüedad de asignación de tipo utilizando una única sonda de tipado hipotética de VHC, Sonda A.
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Una vez formados los complejos de hibridación entre el material de VHC y las sondas de tipado de VHC, se mide la propiedad de hibridación distintiva. En un aspecto, como se analiza anteriormente, la propiedad de hibridación es una Tf y se realiza un análisis de la curva de fusión Tf. Sin embargo, no se pretende que la invención se limite al uso de Tf como una propiedad distintiva. De hecho, el uso (es decir, la medición) de otras propiedades, solas o en combinación, puede ser ventajoso, especialmente para aplicaciones de alto rendimiento.
En algunos modos de realización (por ejemplo, cuando Tf se utiliza como propiedad distintiva), la reacción de RT-PCR, la reacción de hibridación sonda/diana y la medición de la Tf se realizan en un único sistema de "tubo cerrado" sin necesidad de añadir ningún reactivo adicional después del inicio de la reacción de RT-PCR. En el sistema de tubo cerrado, todos los reactivos necesarios para cada etapa están presentes en el tubo desde el comienzo del análisis. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el sistema de RT-PCR y Tf de tubo cerrado contendrá la muestra de ARN de VHC, los cebadores de RT-PCR universales, la ADN polimerasa (preferentemente con actividad RT), desoxirribonucleótidos, sondas de tipado de VHC adecuadas (opcionalmente en el que las sondas están marcadas con uno o más componentes FRET adecuados) y opcionalmente un desactivador de FRET soluble. En ciertos modos de realización, el sistema de RT-PCR y Tf de tubo cerrado se puede colocar en un termociclador adecuado, y la progresión del análisis de RT-PCR, hibridación y curva de fusión Tf se controla simplemente controlando la temperatura del recipiente de reacción, sin necesidad de mover el recipiente de reacción para diferentes etapas de las reacciones y análisis. De forma similar, en algunos modos de realización, el termociclador se acopla a un espectrofotómetro de fluorescencia adecuado de manera que se puede realizar un control de la fluorescencia de la curva de fusión sin mover el recipiente de reacción.
No se pretende que la invención se limite a un procedimiento particular para la determinación de Tf. Diversos procedimientos para la determinación experimental de Tf son ampliamente conocidos en la técnica y se describen en una variedad de fuentes, por ejemplo, Liew et al., "Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphism by High-Resolution Melting of Small Amplicons", Clinical Chemistry 50(7):1156-1164 (2004); Reed y Wittwer "Sensitivity and Specificity of Single-Nucleotide Polymorphism Scanning by High-Resolution Melting Analysis", Clinical Chemistry 50(10):1748-1754 (2004); Zhou et al., "Closed-Tube Genotyping with Unlabeled Oligonucleotide Probes and a Saturating DNA Dye", Clinical Chemistry 50(8):1328-1335 (2004); y Zhou et al., "High-resolution DNA melting curve analysis to establish HLA genotypic identity", Tissue Antigens 64:156-164 (2004). La instrumentación para el análisis de la curva de fusión está disponible comercialmente de una variedad de fabricantes. Se reconoce que la diferente instrumentación para el análisis de curvas de fusión puede tener sensibilidades diferentes. Por ejemplo, un instrumento puede ser capaz de resolver Tf a ±0,5 ºC, mientras que un aparato diferente puede ser capaz de resolver Tf a ±0,1 ºC. Por lo tanto, una sonda de tipado de VHC que es capaz de proporcionar teóricamente valores de Tf de cada tipo de VHC con una separación de 0,2 ºC se puede utilizar eficazmente en una marca y modelo de instrumentación de Tf, pero no en otra instrumentación de VHC que no tenga la sensibilidad requerida.
(D) Correlación de la propiedad de hibridación medida (por ejemplo),Tf) con un tipo de VHC.
Una vez medida la propiedad de hibridación usando la pluralidad de sondas como se describe en (C), dicha información se utiliza para asignar un tipo de VHC al VHC de la muestra basándose en los valores de la propiedad de hibridación que se midieron. Por ejemplo, cuando Tf es la propiedad distintiva medida, se combinan tablas de valores de Tf estandarizados usando aislados de tipo de VHC conocido para dos o más sondas de tipado antes del análisis de la muestra experimental. Las tablas de Tf estandarizadas constarán de valores de Tf predeterminados para cada sonda de tipado y para cada genotipo o subtipo de VHC en las mismas condiciones de hibridación utilizadas en el análisis de la muestra experimental. Una vez medidos los valores de Tf para la muestra experimental, dichos valores se comparan con las tablas estandarizadas de valores de Tf y se completa un análisis análogo al descrito en la figura 9. Valores idénticos o casi idénticos para las muestras estandarizadas y experimentales indican una correspondencia entre el tipo conocido y el tipo experimental.
De forma alternativa, las muestras estandarizadas de cada genotipo o subtipo de VHC se pueden analizar en paralelo con la muestra experimental y se puede realizar una asignación de tipo de VHC basándose en la comparación de los valores experimentales con los valores estándar (por ejemplo, los valores de Tf) medidos en el momento del ensayo.
En algunos modos de realización, los procedimientos para el tipado de VHC se complementan con procedimientos para determinar la carga vírica de VHC. La combinación de análisis cualitativos (tipado) y cuantitativos (concentración vírica) de VHC en el mismo ensayo es muy beneficioso para el médico que está tratando a un paciente. Los procedimientos para la cuantificación de VHC son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, Kit COBAS AMPLICOR™ HCV MONITOR (Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA). Estos sistemas comerciales usan típicamente una sonda de tipo TaqMan en una reacción de PCR para controlar la acumulación en tiempo real de un amplicón de VHC universal en una reacción de RT-PCR.
La velocidad de acumulación de amplicón de PCR, controlada a través de la fluorescencia de la sonda TaqMan, es directamente proporcional a la cantidad de material de partida de genoma de ARN de una muestra. Mediante la inclusión de estándares de concentración de VHC apropiados en una reacción de PCR de TaqMan, se puede
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Por lo tanto, con los datos combinados de las figuras 29 y 31, es posible realizar una asignación de tipado de VHC definitiva. La sonda AG0203A (en el canal FAM) es capaz de asignar una muestra de VHC al tipo 1a, 5a o 6a, mientras que la sonda AG0308K es capaz de realizar una asignación de tipo de VHC al tipo 3a o 4a utilizando el canal HEX. Por lo tanto, estos dos conjuntos de datos son complementarios y proporcionan información suficiente
5 para realizar una asignación de tipo de VHC a los tipos 1a, 3a, 4a, 5a o 6a.
Como se puede ver en este ejemplo, es posible combinar el análisis multidimensional de tipado de VHC con la cuantificación de VHC en un sistema de reacción en tubo cerrado, en el que todos los reactivos necesarios para el análisis de RT-PCR cuantitativo (TaqMan) se incluyen en una mezcla de reacción que no requiere modificación (por
10 ejemplo, etapas de purificación o componentes adicionales). La progresión del análisis de cuantificación de VHC y del análisis de la fusión del VHC (Tf) está regulada por el programa de termociclado.
EJEMPLO 6
15 Secuencias de nucleótidos
Este ejemplo proporciona secuencias de nucleótidos usadas en la descripción de la presente invención. Las secuencias proporcionadas en la tabla siguiente pretenden proporcionar únicamente ejemplos, y no se pretende que la invención se limite de ninguna manera a las secuencias proporcionadas en la tabla siguiente.
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TABLA
SEQ NO:
ID Descripción SECUENCIA
1
Secuencia de bases de consenso de 5'-UTR de VHC Tipo 1a/1b/1c de VHC
2
Secuencia de bases de consenso de 5'-UTR de VHC Tipo 2a/2c de VHC
3
Secuencia de bases de consenso de 5'-UTR de VHC Tipo 2b de VHC
4
Secuencia de bases de consenso de 5'-UTR de VHC Tipo 3a de VHC
5
Secuencia de bases de consenso de 5'-UTR de VHC Tipo 4a de VHC
6
Secuencia de bases de consenso de 5'-UTR de VHC Tipo 5a de VHC
7
Secuencia de bases de consenso de 5'-UTR de VHC Tipo 6a de VHC
8
Secuencia de bases de 5'-UTR de VHC, variante de Tipo 2a de VHC
9
Sonda de tipado de VHC AG0203A
10
Sonda de tipado de VHC AG0203A-FAM
11
Sonda de tipado de VHC AG0203A_HEX
45
12
Sonda de tipado de VHC AG0203A–JA
13
Sonda de tipado de VHC AG0203A_ET
14
Sonda de tipado de VHC AG0303A
15
Sonda de tipado de VHC AG0303B
16
Sonda de tipado de VHC AG0403B
17
Sonda de tipado de VHC AG0503A
18
Sonda de tipado de VHC AG0305B
19
Sonda de tipado de VHC AG0503D
20
Sonda de tipado de VHC AG0503E
21
Sonda de tipado de VHC AG0503F
22
Sonda de tipado de VHC AG0503G
23
Sonda de tipado de VHC AG0503H
24
Sonda de tipado de VHC AG0303A-SYBR
25
Sonda de tipado de VHC AG0307D
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Sonda de tipado de VHC AG0307M
27
Sonda de tipado de VHC AG0307N
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Sonda de tipado de VHC AG0308A imagen39
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Sonda de tipado de VHC AG0308B imagen40
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Sonda de tipado de VHC AG0308L imagen42
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Sonda de tipado de VHC AG0308N imagen44
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Sonda de tipado de VHC AG0308P imagen45
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Sonda de tipado de VHC AG0308Q imagen46
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Sonda de tipado de VHC AG0308R imagen47
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Sonda de tipado de VHC AG0308S imagen48
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Sonda de tipado de VHC AG0308T imagen49
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Sonda de tipado de VHC AG0308U imagen50
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Sonda de tipado de VHC AG0308V imagen51
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Sonda de tipado de VHC AG0308W imagen52
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Sonda de tipado de VHC AG0308X imagen53
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Sonda de tipado de VHC AG0308Y imagen54
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Sonda de tipado de VHC AG0308Z imagen55
45
Sonda de tipado de VHC AG0308AB imagen56
46
Sonda de tipado de VHC AG0308AC imagen57
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Sonda de tipado de VHC AG0308AD imagen58
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Sonda de tipado de VHC AG0308C imagen59
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Sonda de tipado de VHC AG0308D imagen60
50
Sonda de tipado de VHC AG0308E imagen61
51
Sonda de tipado de VHC AG0308H-FAM imagen62
52
Sonda de tipado de VHC AG0308H-HEX imagen63
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Sonda de tipado de VHC AG0308J imagen64
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54
Sonda de tipado de VHC AG0308K imagen65
55
Sonda de tipado de VHC AG0308G (FAM) imagen66
56
Sonda de tipado de VHC AG0308G (HEX) imagen67
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Sonda de tipado de VHC AG0308AA imagen68
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Cebador de amplificación de VHC ST280ATBUA1 imagen69
59
Cebador de amplificación de VHC ST778AATBA1 imagen70
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Sonda de cuantificación de TaqMan de VHC ST650AAFBHQ2 imagen71
SEQ ID NO:
Descripción SECUENCIA
F = 6-carboxi-fluoresceína (FAM) H = 2',4,4’,5’,7,7’-hexaclorofluoresceína (HEX) W = derivado de rodamina JA270 (véase la patente de EE. UU. n.º 6.184.379, concedida el 6 de febrero de 2001 a Josel et al.) P = grupo fosfato 3'-terminal / bloqueado enzimáticamente J = acridina S = 5-propinil-dU D = 5-Me-dC B = 2'-O-metil-U K = 2'-O-metil-rA M = 2'-O-metil-rG V = 2'-O-metil-rC Q = BHQ-2 Z = N6-t-butilbencil-dA
Aunque la invención precedente se ha descrito con algún detalle con fines de claridad y comprensión, será evidente para un experto en la técnica, a partir de una lectura de la presente divulgación, que se pueden realizar diversos cambios en forma y detalle. Por ejemplo, todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente se pueden usar en diversas combinaciones.
48

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