ES2626000T3 - Composiciones terapéuticas de nucleasas y métodos - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende una RNasa y un dominio Fc variante, en el que la RNasa se acopla operativamente, opcionalmente con un enlazador, al dominio Fc variante, en el que el dominio Fc variante es un dominio Fc de IgG1 humana variante que comprende una sustitución de aminoácidos que disminuye la unión, en comparación con el tipo natural, a un receptor Fcγ o a una proteína complemento o los dos, en el que el polipéptido tiene una función efectora reducida opcionalmente seleccionada entre el grupo que consiste en opsonización, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento y citotoxicidad celular dependiente de un anticuerpo.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

15

25

35

45

55

65

híbrida de la invención puede comprender más de un dominio enlazador o enlazador peptídico.

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "enlazador polipeptídico gly-ser" se refiere a un péptido que consiste en los residuos de glicina y serina. Un enlazador polipéptido gly/ser a modo de ejemplo comprende la secuencia de aminoácidos Ser(Gly4Ser)n. En una realización, n = 1. En una realización, n = 2. En otra realización, n = 3, es decir, Ser(Gly4Ser)3. En otra realización, n = 4, es decir, Ser(Gly4Ser)4. En otra realización, n = 5. En otra realización, n = 6. En otra realización, n = 7. En otra realización, n = 8. En otra realización, n = 9. En otra realización, n = 10. Otro enlazador polipéptido gly/ser a modo de ejemplo comprende la secuencia de aminoácidos Ser(Gly4Ser)n. En una realización, n = 1. En una realización, n = 2. En una realización preferente, n = 3. En otra realización, n = 4. En otra realización, n = 5. En otra realización, n = 6.

Como se utiliza en la presente memoria, los términos "ligado", "fusionado", o "fusión", se utilizan indistintamente. Estos términos se refieren a la combinación de dos o más elementos o componentes o dominios, por cualquier medio, incluyendo conjugación química o medios recombinantes. Los métodos de conjugación química (p. ej., utilizando agentes de reticulación heterobifuncionales) se conocen en la materia.

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "región Fc" se definirá como la porción de una inmunoglobulina nativa formada por los respectivos dominios Fc (o restos Fc) de sus dos cadenas pesadas.

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "dominio Fc" se refiere a una porción de una cadena pesada sencilla de inmunoglobulina (Ig). Como tal, el dominio Fc también puede referirse como "Ig" o "IgG." En algunas realizaciones, un dominio Fc comienza en la región bisagra justo aguas arriba del sitio de escisión de papaína y finaliza en el extremo C-terminal del anticuerpo. Por consiguiente, un dominio Fc completo comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En ciertas realizaciones, un dominio Fc comprende al menos uno de: un dominio bisagra (p. ej., región bisagra superior, intermedia, y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4, o una variante, porción, o fragmento del mismo. En otras realizaciones, un dominio Fc comprende un dominio Fc completo (es decir, un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3). En una realización, un dominio Fc comprende un dominio bisagra (o porción del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o porción del mismo). En otra realización, un dominio Fc comprende un dominio CH2 (o porción del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o porción del mismo). En otra realización, un dominio Fc consiste en un dominio CH3 o porción del mismo. En otra realización, un dominio Fc consiste en un dominio bisagra (o porción del mismo) y un dominio CH3 (o porción del mismo). En otra realización, un dominio Fc consiste en un dominio CH2 (o porción del mismo) y un dominio CH3. En otra realización, un dominio Fc consiste en un dominio bisagra (o porción del mismo) y un dominio CH2 (o porción del mismo). En una realización, un dominio Fc carece de al menos una porción de un dominio CH2 (p. ej., la totalidad o parte de un dominio CH2). En una realización, un dominio Fc de la invención comprende al menos la porción de una molécula de Fc conocida en la materia que se requiere para la unión a FcRn. En otra realización, un dominio Fc de la invención comprende al menos la porción de una molécula de Fc conocida en la materia que se requiere para la unión a FcγR. En una realización, un dominio Fc de la invención comprende al menos la porción de una molécula de Fc conocida en la materia que se requiere para la unión a la proteína A. En una realización, un dominio Fc de la invención comprende al menos la porción de una molécula de Fc conocida en la materia que se requiere para la unión a la proteína G. Un dominio Fc se refiere en la presente memoria en general a un polipéptido que comprende la totalidad o parte del dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Esto incluye, entre otros, polipéptidos que comprenden todo los dominios completos CH1, bisagra, CH2, y/o CH3, así como fragmentos de dichos péptidos que comprenden solamente, p. ej., el dominio bisagra, CH2 y CH3. El dominio Fc puede derivarse a partir de una inmunoglobulina de cualquier especie y/o cualquier subtipo, incluyendo, entre otros, un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM humana. El dominio Fc abarca moléculas variantes de Fc y Fc nativas. Al igual que con las variantes de Fc y Fc nativos, la expresión dominio Fc incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, si se digieren del anticuerpo completo o se producen por otros medios.

Como se expone en la presente memoria, un experto en la materia entenderá que cualquier dominio Fc puede ser modificado de forma tal que varía la secuencia de aminoácidos del dominio Fc nativo de una molécula de inmunoglobulina de origen natural. En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, el dominio Fc retiene una función efectora (p. ej., unión a FcγR).

Los dominios Fc de un polipéptido de la invención pueden derivarse de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fc de un polipéptido puede comprender un dominio CH2 y/o CH3 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, un dominio Fc puede comprender una región bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, un dominio Fc puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.

Una secuencia de polipéptidos o aminoácidos "derivada de" un polipéptido o proteína designado se refiere al origen del polipéptido. Preferentemente, la secuencia de polipéptidos o aminoácidos que se deriva de una secuencia particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia o una porción de la misma, en la que la porción consiste en al menos 10-20 aminoácidos, preferentemente al menos 20-30 aminoácidos, más preferentemente al menos 30-50 aminoácidos, o que es de otra manera identificable para un experto en la

7 5

15

25

35

45

55

65

materia por tener su origen en la secuencia.

Los polipéptidos derivados de otro péptido pueden tener una o más mutaciones en relación con el polipéptido de partida, p. ej., uno o más residuos de aminoácidos que han sido sustituidos con otro residuo de aminoácidos o que tiene una o más inserciones o deleciones de residuos de aminoácidos.

Un polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que es de origen no natural. Dichas variantes tienen necesariamente menos del 100 % de identidad de secuencia o similitud con las moléculas de nucleasa híbridas de partida. En una realización preferente, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 75 % a menos del 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos o similitud con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de partida, más preferentemente de aproximadamente 80 % a menos del 100 %, más preferentemente de aproximadamente 85 % a menos del 100 %, más preferentemente de aproximadamente 90 % a menos del 100 % (p. ej., 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o, 99 %) y más preferentemente de aproximadamente 95 % a menos del 100 %, p. ej., sobre la longitud de la molécula variante.

En una realización, existe una diferencia de aminoácidos entre una secuencia polipeptídica de partida y la secuencia derivada de la misma. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en la presente memoria como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que es idéntico (es decir, mismo residuo) con los residuos de aminoácidos de partida, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencias.

En una realización, un polipéptido de la invención consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la Tabla 2 y variantes funcionalmente activas de la misma. En una realización, un polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos expuesta en la Tabla 2. En una realización, un polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos contiguos al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos contiguos expuesta en la Tabla 2. En una realización, un polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, o 500 (o cualquier número entero en estos números) aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos expuesta en la Tabla 2.

En una realización, los péptidos de la invención se codifican por una secuencia nucleotídica. Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser útiles para una serie de aplicaciones, incluyendo: clonación, terapia génica, expresión y purificación de proteínas, introducción de mutaciones, vacunación con ADN de un huésped en necesidad del mismo, generación de anticuerpos para, p. ej., inmunización pasiva, PCR, generación de cebadores y sondas, diseño y generación de ARNip (véase, p. ej., la web de Dharmacon siDesign), y similares. En una realización, la secuencia nucleotídica de la invención comprende, consiste en, o consiste esencialmente en, una secuencia nucleotídica seleccionada entre la Tabla 2. En una realización, una secuencia nucleotídica incluye una secuencia nucleotídica al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a una secuencia nucleotídica expuesta en la Tabla 2. En una realización, una secuencia nucleotídica incluye una secuencia nucleotídica contigua al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia nucleotídica contigua expuesta en Tabla 2. En una realización, una secuencia nucleotídica incluye una secuencia nucleotídica que tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, o 500 (o cualquier número entero en estos números) nucleótidos contiguos de una secuencia nucleotídica expuesta en la Tabla 2.

Las moléculas de nucleasa híbridas preferentes de la invención comprenden una secuencia (p. ej., al menos un dominio Fc) derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana. No obstante, las secuencias desveladas pueden comprender una o más secuencias de otra especie de mamífero. Por ejemplo, un dominio Fc o dominio nucleasa de primate puede incluirse en la secuencia del sujeto. Alternativamente, uno o más aminoácidos murinos pueden estar presentes en un polipéptido. En algunas realizaciones, las secuencias polipeptídicas de la divulgación no son inmunogénicas y/o han reducido su inmunogenicidad.

Un experto en la materia también entenderá que las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden alterarse de manera tal que varían la secuencia de las secuencias de origen natural o nativas de las que se derivaron, al tiempo que retienen la actividad deseable de las secuencias nativas. Por ejemplo, pueden efectuarse sustituciones de nucleótidos o de aminoácidos que conducen a sustituciones conservadoras o cambios en residuos de aminoácidos "no esenciales". Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una variante no natural de una molécula de nucleasa híbrida derivada de una inmunoglobulina (p. ej., un dominio Fc) puede crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia nucleotídica de la inmunoglobulina de manera tal que una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos se introducen en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse por técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR.

8 5

15

25

35

45

55

65

Las moléculas de nucleasa híbridas peptídicas de la invención pueden comprender sustituciones de aminoácidos conservadores en uno o más residuos de aminoácidos, p. ej., en residuos de aminoácidos esenciales o no esenciales. Una "sustitución de aminoácidos conservadores" es aquella en la que el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la materia, incluyendo cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De este modo, un residuo de aminoácidos no esenciales en un polipéptido de unión se reemplaza preferentemente con otro residuo de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral. En otra realización, una variable de cadena de aminoácidos puede reemplazarse con una variable de cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o composición de los miembros de la familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden incorporarse en los polipéptidos de unión de la invención e identificarse sistemáticamente por su capacidad para unirse a la diana deseada.

El término "mejorar" se refiere a cualquier resultado terapéuticamente beneficioso en el tratamiento de un estado de enfermedad, p. ej., un estado de enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, LES), incluyendo profilaxis, disminución en la gravedad o progresión, remisión, o cura del mismo.

La expresión "in situ" se refiere a procesos que ocurren en una célula viva que crece separada de un organismo vivo, p. ej., que crece en un cultivo tisular.

La expresión "in vivo" se refiere a procesos que ocurren en un organismo vivo.

El término "mamífero" o "sujeto" o "paciente", como se utiliza en la presente invención, incluye tanto seres humanos como no humanos e incluye, entre otros, seres humanos, primates no humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos, y porcinos.

El término porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para la máxima correspondencia, como se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias descritos a continuación (p. ej., BLASTP y BLASTN u otros algoritmos disponibles para los expertos) o mediante inspección visual. Dependiendo de la aplicación, el porcentaje de "identidad" puede existir sobre una región de la secuencia que compara, p. ej., más de un dominio funcional, o, alternativamente, existe sobre la longitud completa de las dos secuencias a comparar.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, las coordenadas posteriores se designan, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencias para la secuencia o secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, en función de los parámetros del programa designados.

El alineamiento óptimo de secuencias para su comparación puede llevarse a cabo, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programas de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual (véase en general Ausubel et al., infra).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través de la web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica.

La expresión "cantidad suficiente" significa una cantidad suficiente para producir un efecto deseado, p. ej., una cantidad suficiente para modular la agregación de proteínas en una célula.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad que es eficaz para mejorar un síntoma de una enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una "cantidad profilácticamente eficaz" cuando la profilaxis puede considerarse terapia.

9 5

15

25

35

45

55

65

Cabe señalar que, al igual que se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular de "un", "una" y "el", "la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Composiciones

Moléculas de nucleasa híbridas

En algunas realizaciones, una composición incluye una molécula de nucleasa híbrida. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio nucleasa ligado operativamente a un dominio Fc. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio nucleasa ligado a un dominio Fc. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida es una proteína nucleasa. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida es un polinucleótido de nucleasa.

En algunas realizaciones, el dominio nucleasa se liga al dominio Fc por un dominio enlazador. En algunas realizaciones, el dominio enlazador es un péptido enlazador. En algunas realizaciones, el dominio enlazador es un nucleótido enlazador. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye una molécula líder, p. ej., un péptido líder. En algunas realizaciones, la molécula líder es un péptido líder situado en el extremo N-terminal del dominio nucleasa. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluirá un codón de terminación. En algunas realizaciones, el codón de terminación se encontrará en el extremo C-terminal del dominio Fc.

En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye además un segundo dominio nucleasa. En algunas realizaciones, el segundo dominio nucleasa se liga al dominio Fc por un segundo dominio enlazador. En algunas realizaciones, el segundo dominio enlazador se encontrará en el extremo C-terminal del dominio Fc. La Figura 12 muestra al menos una realización de una molécula de nucleasa híbrida. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye una secuencia mostrada en la Tabla 2.

En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida es una molécula de RNasa o molécula de DNasa o una molécula multienzimática (p. ej., RNasa y DNasa o dos nucleasas de ARN o ADN con diferente especificidad para un sustrato) unida a un dominio Fc que se une específicamente a complejos inmunitarios extracelulares. En algunas realizaciones, el dominio Fc no se une eficazmente a receptores Fcγ. En un aspecto, la molécula de nucleasa híbrida no se une eficazmente a C1q. En otros aspectos, la molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio Fc en la región marco de IgG1. En otros aspectos, la molécula de nucleasa híbrida comprende además mutaciones en los dominios bisagra, CH2 y/o CH3. En otros aspectos, las mutaciones son P238S, P331S o N297S, y pueden incluir mutaciones en una o más de tres cisteínas bisagra. En algunos de estos aspectos, las mutaciones en una o más de tres cisteínas bisagra pueden ser SCC o SSS. En otros aspectos, las moléculas contienen la bisagra SCC, pero por lo demás son de tipo natural para los dominios CH2 y CH3 de Fc de IgG1 humana, y se unen eficazmente a receptores Fc, lo que facilita la captación de la molécula de nucleasa híbrida en el compartimento endocítico de las células a las que se unen. En otros aspectos, la molécula tiene una actividad contra los sustratos de ARN monocatenario y/o bicatenario.

En algunos aspectos, la actividad de la molécula de nucleasa híbrida es detectable in vitro y/o in vivo. En algunos aspectos, la molécula de nucleasa híbrida se une a una célula, a una célula maligna, o a una célula cancerosa e interfiere con su actividad biológica.

En otro aspecto, se proporciona una molécula de RNasa multifuncional que se une a otra enzima o anticuerpo con especificidad de unión, tal como scFv orientado selectivamente a ARN o a un segundo dominio nucleasa con las mismas o diferentes especificidades que el primer dominio.

En otro aspecto, se proporciona una molécula de DNasa multifuncional que se une a otra enzima o anticuerpo con especificidad de unión, tal como scFv orientado selectivamente a ADN o a un segundo dominio nucleasa con las mismas o diferentes especificidades que el primer dominio.

En otro aspecto, una molécula de nucleasa híbrida se adapta para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero mediante la administración de una molécula de nucleasa híbrida unida a una región Fc, en una cantidad terapéuticamente eficaz al mamífero en necesidad del mismo, en el que la enfermedad se previene o se trata. En otros aspectos, la enfermedad o trastorno es una enfermedad autoinmunitaria o cáncer. En algunos de estos aspectos, la enfermedad autoinmunitaria es diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental, artritis reumatoide, artritis autoinmune experimental, miastenia gravis, tiroiditis, una forma experimental de uveorretinitis, tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, tirotoxicosis, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmune, enfermedad de Addison, menopausia prematura, infertilidad masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmía simpática, uveítis facogénica, anemia hemolítica autoinmune, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis Hbs-ve crónica activa, cirrosis criptogénica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, polimiositis, dermatomiositis, LE discoide, lupus eritematoso sistémico, y enfermedad del tejido conectivo.

10 5

15

25

35

45

55

65

En algunas realizaciones, las dianas de la actividad enzimática de RNasa de las moléculas de nucleasa híbridas de RNasa son principalmente extracelulares, que consisten en, p. ej., ARN contenido en complejos inmunitarios con autoanticuerpo anti-RNP y el ARN se expresa en la superficie de las células sometidas a apoptosis. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida de RNasa está activa en el entorno ácido de las vesículas endocíticas. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida de RNasa incluye un dominio Fc de tipo natural (tn) con el fin de permitir, p. ej., que la molécula se una a FcR y entre en el compartimento endocítico a través de la vía de entrada utilizada por complejos inmunitarios. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida de RNasa que incluye un dominio Fc tn se adapta para que sea activa tanto extracelularmente como en el entorno endocítico (en el que puede expresarse TLR7). En algunos aspectos, esto permite que una molécula de nucleasa híbrida de RNasa que incluye un dominio Fc tn detenga la señalización de TLR7 a través de complejos inmunitarios previamente envueltos o por ARNs que activan TLR7 después de la infección viral. En algunas realizaciones, la RNasa tn de una molécula de nucleasa híbrida de RNasa no es resistente a la inhibición por un inhibidor citoplásmico de RNasa. En algunas realizaciones, la RNasa tn de una molécula de nucleasa híbrida de RNasa no está activa en el citoplasma de una célula.

En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida que incluye un dominio Fc tn se utiliza para la terapia de una enfermedad autoinmunitaria, por ejemplo, LES.

En algunas realizaciones, se aumenta la unión del Fc dominio a un receptor Fc (FcR), p. ej., por alteraciones de glicosilación y/o cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida tiene una o más alteraciones de Fc que aumentan la unión FcR.

Se prevén formas alternativas para la construcción de una molécula de nucleasa híbrida unida a un dominio Fc. En algunas realizaciones, la orientación de dominio puede alterarse para construir una molécula de Ig-RNasa o una molécula de Ig-DNasa o una molécula de RNasa-Ig o una molécula de RNasa-Ig que retiene la unión de FcR y tiene dominios nucleasa activos.

En algunas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas de DNasa incluyen un dominio Fc tn que puede permitir, p. ej., que las moléculas se sometan a endocitosis después de la unión de FcR. En algunas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas de DNasa pueden ser activas hacia los complejos inmunitarios extracelulares que contienen ADN, p. ej., ya sea en forma soluble o depositado como complejos insolubles.

En algunas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas incluyen tanto DNasa como RNasa. En algunas realizaciones, estas moléculas de nucleasa híbridas pueden mejorar la terapia de LES puesto que pueden, p. ej., digerir los complejos inmunitarios que contienen ARN, ADN, o una combinación de ARN y ADN; y cuando incluyen además un dominio Fc tn, son activas tanto extracelularmente como en el compartimento endocítico en el que pueden localizarse TLR7 y TLR9.

En algunas realizaciones, los dominios enlazadores incluyen 3, 4 o 5 variantes (gly4ser) que alteran la longitud del enlazador por progresiones de 5 aminoácidos. En otra realización, un dominio enlazador es de aproximadamente 18 aminoácidos de longitud e incluye un sitio de glicosilación ligado a N, que puede ser sensible a la escisión por proteasas in vivo. En algunas realizaciones, un sitio de glicosilación ligado a N puede proteger las moléculas de nucleasa híbridas de la escisión en el dominio enlazador. En algunas realizaciones, un sitio de glicosilación ligado a N puede ayudar en la separación del plegado de dominios funcionales independientes separados por el dominio enlazador.

En algunas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas pueden incluir dominios Fc de IgG1 humana mutantes y/o de tipo natural. En algunas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas pueden expresarse a partir de transfecciones transitorias de COS y CHO estables. En algunas realizaciones, la unión CD80/86 y la actividad de RNasa se conservan en una molécula de nucleasa híbrida. En algunas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas incluyen construcciones DNasa1L3-Ig-enlazador-RNasa. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye una construcción DNasa1-Ig-enlazador-RNasa o una construcción RNasa-Ig-enlazador-DNasa. En algunas realizaciones, las uniones de fusión entre dominios enzimáticos y los otros dominios de la molécula de nucleasa híbrida se optimizan.

En algunas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas incluyen moléculas de nucleasa híbridas DNasa-Ig y/o moléculas de nucleasa híbridas DNasa-RNasa híbrida.

En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye TREX1. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida TREX1 puede digerir cromatina. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida TREX1 se expresa por una célula. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida expresada incluye TREX-1 murino y un dominio Fc (tn o mutante) murino. En algunas realizaciones, un dominio enlazador de 20-25 aminoácidos (aa) entre TREX1 y la bisagra de IgG puede ser necesario para permitir la actividad de DNasa. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida con un dominio enlazador de 15 aa no está activa. En algunas realizaciones, el uso de los dominios enlazadores de 20 y 25 aminoácidos (además de 2 o más aminoácidos para incorporar sitios de restricción) da lugar a la actividad funcional medida por la digestión de la cromatina. En

11

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

5

15

25

35

45

55

65

potencien la función efectora, y tales moléculas tienen aplicaciones útiles en métodos de tratamiento de mamíferos en los que se desea la destrucción de la molécula diana. Por el contrario, se espera que las variantes Fc con una disminución de la afinidad de unión a FcγR reduzcan la función efectora, y tales moléculas también son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de condiciones en las que la destrucción de células diana no es deseable, p. ej., cuando las células normales pueden expresar moléculas diana, o cuando la administración crónica del polipéptido podría dar lugar a la activación del sistema inmunitario no deseada. En una realización, el polipéptido que comprende Fc exhibe al menos una función efectora dependiente del antígeno alterada seleccionada entre el grupo que consiste en opsonización, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento, citotoxicidad celular dependiente de un antígeno (CCDA), o modulación de células efectoras en comparación con un polipéptido que comprende una región Fc de tipo natural.

En una realización, las moléculas de nucleasa híbridas exhiben una unión alterada a un FcγR activador (p. ej., Fcγl, Fcγlla, o FcγRIIIa). En otra realización, las moléculas de nucleasa híbridas exhiben una afinidad de unión alterada a un FcγR inhibidor (p. ej. FcγRIIb). Las sustituciones de aminoácidos a modo de ejemplo que alteraron FcR o la actividad de unión al complemento se desvelan en la publicación PCT internacional n.º WO05/063815.

Una molécula de nucleasa híbrida de la invención también puede comprender una sustitución de aminoácidos que altera la glicosilación de la molécula de nucleasa híbrida. Por ejemplo, el dominio Fc de la molécula de nucleasa híbrida puede comprender un dominio Fc que tiene una mutación que conduce a la reducción de la glicosilación (p. ej., glicosilación ligada a N u O) o puede comprender una glicoforma alterada del dominio Fc de tipo natural (p. ej., un glicano con un contenido bajo en fucosa o exento de fucosa). En otra realización, la molécula de nucleasa híbrida tiene una sustitución de aminoácidos próxima o dentro de un motivo de glicosilación, por ejemplo, un motivo de glicosilación ligada a N que contiene la secuencia de aminoácidos NXT o NXS. Las sustituciones de aminoácidos a modo de ejemplo que reducen o alteran la glicosilación se desvelan en la publicación PCT internacional n.º WO05/018572 y en la publicación de patente de Estados Unidos n.º 2007/0111281.

En otras realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fc que tiene un residuo de cisteína modificado por ingeniería genética o análogo del mismo que se encuentra en la superficie expuesta al disolvente. Preferentemente, el residuo de cisteína modificado por ingeniería genética o análogo del mismo no interfiere con una función efectora conferida por Fc. Más preferentemente, la alteración no interfiere con la capacidad de Fc para unirse a receptores Fc (p. ej., FcγRI, FcγRII, o FcγRIII) o proteínas del complemento (p. ej., C1q), o para activar la función efectora inmunitaria (p. ej., citotoxicidad dependiente de un anticuerpo (CCDA), fagocitosis o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)). En realizaciones preferentes, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención comprenden un dominio Fc que comprende al menos un residuo de cisteína libre modificado por ingeniería genética o análogo del mismo que está esencialmente libre de enlaces disulfuro con un segundo residuo de cisteína. Cualquiera de los residuos de cisteína modificados por ingeniería genética anteriores o análogos de los mismos pueden conjugarse posteriormente con un dominio funcional utilizando técnicas reconocidas en la materia (p. ej., conjugados con un enlazador heterobifuncional reactivo con tiol).

En una realización, la molécula de nucleasa híbrida de la invención puede comprender un dominio Fc fusionado genéticamente que tiene dos o más de sus dominios Fc constituyentes seleccionados independientemente entre los dominios Fc descritos en la presente memoria. En una realización, los dominios Fc son los mismos. En otra realización, al menos dos de los dominios Fc son diferentes. Por ejemplo, los dominios Fc de las moléculas de nucleasa híbridas de la invención comprenden el mismo número de residuos de aminoácidos o pueden diferir en su longitud en uno o más residuos de aminoácidos (p. ej., aproximadamente 5 residuos de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de aminoácidos), aproximadamente 10 residuos, aproximadamente 15 residuos, aproximadamente 20 residuos, aproximadamente 30 residuos, aproximadamente 40 residuos, o aproximadamente 50 residuos). En otras realizaciones, los dominios Fc de las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden diferir en la secuencia en una o más posiciones de aminoácidos. Por ejemplo, al menos dos de los dominios Fc pueden diferir en aproximadamente 5 posiciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 posiciones de aminoácidos), aproximadamente 10 posiciones, aproximadamente 15 posiciones, aproximadamente 20 posiciones, aproximadamente 30 posiciones, aproximadamente 40 posiciones, o aproximadamente 50 posiciones).

Dominios enlazadores

En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio enlazador. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye una pluralidad de dominios enlazadores. En algunas realizaciones, el dominio enlazador es un enlazador polipeptídico. En ciertos aspectos, es deseable emplear un enlazador polipeptídico para fusionar uno o más dominios Fc a uno o más dominios de nucleasa para formar una molécula nucleasa híbrida.

En una realización, el enlazador polipeptídico es sintético. Como se utiliza en la presente memoria, el término "sintético" con respecto a un enlazador polipeptídico incluye péptidos (o polipéptidos) que comprenden una secuencia de aminoácidos (que puede o no puede ser de origen natural) que se liga en una secuencia lineal de aminoácidos a una secuencia (que puede o no puede ser de origen natural) (p. ej., una secuencia de dominio Fc) a la que no se liga naturalmente en la naturaleza. Por ejemplo, el enlazador polipeptídico puede comprender

16

imagen10

imagen11

5

15

25

35

45

55

65

En algunas realizaciones, la DNasa es TREX1.

En algunas realizaciones, un dominio nucleasa es una RNasa. En algunas realizaciones, la RNasa es una RNasa extracelular o secretora de la superfamilia de la RNasa A, p. ej., RNasa A.

En una realización, el dominio nucleasa se liga operativamente (p. ej., conjuga químicamente o fusiona genéticamente (p. ej., ya sea directamente o por un enlazador polipeptídico)) al extremo N-terminal de un dominio Fc. En otra realización, el dominio nucleasa se liga operativamente (p. ej., conjuga químicamente o fusiona genéticamente (p. ej., ya sea directamente o por un enlazador polipeptídico)) al extremo C-terminal de un dominio Fc. En otras realizaciones, un dominio nucleasa se liga operativamente (p. ej., conjuga químicamente o fusiona genéticamente (p. ej., ya sea directamente o por un enlazador polipeptídico)) por una cadena lateral de aminoácidos de un dominio Fc. En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, el dominio nucleasa se fusiona a un dominio Fc por un dominio bisagra de inmunoglobulina humana o porción del mismo.

En ciertas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención comprenden dos o más dominios nucleasa y al menos un dominio Fc. Por ejemplo, los dominios nucleasa pueden ligarse operativamente tanto a los extremos N-terminal y C-terminal de un dominio Fc. En otras realizaciones a modo de ejemplo, los dominios nucleasa pueden ligarse operativamente a los extremos N-y C-terminales de múltiples dominios Fc (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, o más dominios Fc) que se ligan entre sí en serie para formar una matriz en tándem de dominios Fc.

En otras realizaciones, dos o más dominios nucleasa se ligan entre sí (p. ej., por un enlazador polipeptídico) en serie, y la matriz en tándem de dominios nucleasa se liga operativamente (p. ej., conjuga químicamente o fusiona genéticamente (p. ej., ya sea directamente o por un enlazador polipeptídico)) ya sea en el extremo C-terminal o Nterminal de un dominio Fc o una matriz en tándem de dominios Fc. En otras realizaciones, la matriz en tándem de dominios nucleasa se liga operativamente tanto al extremo C-terminal como al extremo N-terminal de un dominio Fc

o una matriz en tándem de dominios Fc.

En otras realizaciones, uno o más dominios nucleasa pueden insertarse entre dos dominios Fc. Por ejemplo, uno o más dominios nucleasa pueden formar la totalidad o parte de un enlazador polipeptídico de una molécula de nucleasa híbrida de la invención.

Las moléculas de nucleasa híbridas preferentes de la invención comprenden al menos un dominio nucleasa (p. ej., RNasa o DNasa), al menos un dominio enlazador, y al menos un dominio Fc.

En ciertas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención tienen al menos un dominio nucleasa específico para una molécula diana que media un efecto biológico. En otra realización, la unión de las moléculas de nucleasa híbridas de la invención a una molécula diana (p. ej., ADN o ARN) da lugar a la reducción o eliminación de la molécula diana, p. ej., de una célula, un tejido, o de la circulación.

En ciertas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden comprender dos o más dominios nucleasa. En una realización, los dominios nucleasa son idénticos, p. ej., RNasa y RNasa, o TREX1 y TREX1. En otra realización, los dominios nucleasa son diferentes, p. ej., DNasa y RNasa.

En otras realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden ensamblarse entre sí o con otros polipéptidos para formar proteínas de unión que tienen dos o más polipéptidos ("multímeros"), en los que al menos un polipéptido del multímero es una molécula de nucleasa híbrida de la invención. Las formas multiméricas a modo de ejemplo incluyen proteínas de unión alteradas diméricas, triméricas, tetraméricas, hexaméricas y similares. En una realización, los polipéptidos del multímero son los mismos (es decir, proteínas de unión alteradas homoméricas,

p. ej., homodímeros, homotetrámeros). En otra realización, los polipéptidos del multímero son diferentes (p. ej. heteroméricos).

Métodos de fabricación de moléculas de nucleasa híbridas

Las moléculas de nucleasa híbridas de la presente invención pueden fabricarse en gran medida en células huésped transformadas utilizando técnicas de ADN recombinante. Para ello, se prepara una molécula de ADN recombinante que codifica el péptido. Los métodos de preparación de tales moléculas de ADN son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las secuencias que codifican los péptidos podrían extirparse del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN podría sintetizarse utilizando técnicas de síntesis química, tales como el método con fosforamidato. Asimismo, podría utilizarse una combinación de estas técnicas.

La invención también incluye un vector capaz de expresar los péptidos en un huésped apropiado. El vector comprende la molécula de ADN que codifica los péptidos ligados operativamente a secuencias de control de expresión apropiadas. Los métodos que afectan a este enlace operativo, antes o después de que se inserte la molécula de ADN en el vector, son bien conocidos. Las secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, potenciadores, operadores, dominios nucleasa ribosomales, señales de inicio, señales de terminación, señales de capuchón, señales de poliadenilación y otras señales implicadas en el control de la transcripción o la

19

imagen12

5

15

25

35

45

55

65

viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o la penetración de la composición. En ciertas realizaciones, los materiales de formulación adecuados incluyen, entre otros, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de carga (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); materiales de carga; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas); colorantes, aromatizantes y agentes de dilución; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos, tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metal alcalino, preferentemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. (Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995). En algunas realizaciones, la formulación comprende TFS; 20 mM de NaOAc, pH 5,2, 50 mM de NaCl, y/o 10 mM de NaOAc, pH 5,2, sacarosa al 9 %.

En ciertas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida y/o una molécula terapéutica se liga a un vehículo que extiende la semivida conocida en la materia. Tales vehículos incluyen, entre otros, polietilenglicol, glicógeno (p. ej., glicosilación de la molécula de nucleasa híbrida), y dextrano. Tales vehículos se describen, p. ej., en la solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 09/428.082, en la actualidad la patente de Estados Unidos n.º 6.660.843 y la solicitud PCT publicada n.º WO 99/25044.

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica óptima será determinada por un experto en la materia dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración pretendida, el formato de administración y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences, supra. En ciertas realizaciones, tales composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de depuración in vivo de los anticuerpos de la invención.

En ciertas realizaciones, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser acuoso o no acuoso en la naturaleza. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. En algunas realizaciones, la solución salina comprende solución salina tamponada con fosfato isotónica. En ciertas realizaciones, la solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con seroalbúmina son vehículos a modo de ejemplo adicionales. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden por lo tanto tampón Tris de aproximadamente pH 7,08,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5 que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado. En ciertas realizaciones, una composición que comprende una molécula de nucleasa híbrida, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede prepararse para el almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences, supra) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en ciertas realizaciones, una composición que comprende una molécula de nucleasa híbrida, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse como un liofilizado utilizando excipientes apropiados, tales como sacarosa.

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica puede seleccionarse para la administración parenteral. En ciertas realizaciones, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para administración a través del tracto digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la capacidad de un experto en la materia.

En ciertas realizaciones, los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables en el sitio de administración. En ciertas realizaciones, se utilizan tampones para mantener la composición en un pH fisiológico o un pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

En ciertas realizaciones, cuando se contempla la administración parenteral, una composición terapéutica puede estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende una molécula de nucleasa híbrida deseada, con o sin agentes terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, un vehículo para la inyección parenteral es agua destilada estéril en la que una molécula de nucleasa híbrida, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se formula como una solución isotónica estéril, apropiadamente preservada. En ciertas realizaciones, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos

21

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

TABLAS

Tabla 1

Listado de cebadores para las construcciones de genes de fusión que expresan Rnasa-Dnasa-Ig

SEQ ID NO:

Nombre Secuencia

-

Cebadores humanos:

30

mahIgG1CH2M tgtccaccgtgtccagcacctgaactcctgggtggatcgtcagtcttcc

31

huIgG1-H1 agatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgtccaccgtgt

32

hIgG1-5scc gaagatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgt

33

hIgG1SSSH gttagatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatct

34

mahIgG1S

35

P331S aaggtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaacaatctcc

36

P331AS gttttctcgatggaggctgggagggctttgttggagacc

37

5’hrnasa

38

3’hrnasabx ctcgagatctgtagagtcctccacagaagcatcaaagtgg

39

5’hrnasaedad accggtaaggaatcccgggccaagaaattcc

40

3’hRNasaRV gatatcccttccctgggcaaggaatcccgggccaagaaattccag

41

3’hRNasaparada gtttctagattattaggtagagtcctccacagaagcatcaaagtg

42

hdnasa1L3-5NL

43

hdnasa1L3-3bx

44

hDNasa1L35edad accggtatgaggatctgctccttcaacgtcaggtcctttgg

45

5’hDNasa1edad GTT ACC GGT CTG AAG ATC GCA GCC TTC AAC ATC CAG

46

5’hDNasa1-bx

47

3’hDNasa1-RV GTT GAT ATC CTG AAG ATC GCA GCC TTC AAC ATC CAG

48

3’hDNasa1terminación

49

hDNasa1 s105114

50

hDNasa1as114-105

51

hDNasa1-as114

52

hDNasa1-s114

53

hTrex1-5’edad accggtatgggccctggagctcgcagacagggcag

54

hTrex1-3’bx ctcgagatctttggtcctagcagaggctgtgacc

55

hTrex1 -5’ AX accggtctcgagatgggccctggagctcgcagacagg

56

hTrex13’xhon.º2 ctcgagtttggtcctagcagaggctgtgacc

Cebadores murinos:

57

mTrex1-5’edad accggtatgggctcacagaccctgccccatggtcaca

58

mTrex1-3’bx ctcgagatctgttgttccagtggtagccggagtgccgtacatg

59

mdnasa1L3-5NL

60

mdnasa1L3-3bx

61

mrib1-NL

62

mrib3NH2

40

Tabla 1

Listado de cebadores para las construcciones de genes de fusión que expresan Rnasa-Dnasa-Ig

SEQ ID NO:

Nombre Secuencia

63

muIgG2aCH2

64

mIgG2a-5

65

mIgG2a-5scc gaagatctcgagcccagaggtcccacaatcaagccctctcctcca

66

muIgG2aSSSH atcaagccctctcctccatctaaatccccagcacctaac

67

mIgG2aKP5

68

mIgG2aKP3

69

mIgG2a3S gtttctagattatcatttacccggagtccgagagaagctcttagtcgt

Otros cebadores para mutaciones de cola diferentes y genes de fusión multiespecíficos:

70

hIgG1-3ns-ns gctagctccgtcgactttacccggagacagagagagg

71

K322S

72

K322AS

73

hIgG1N297S ccgcgggaggagcagtacagcagcacgtaccgtgtggtcagcgtc

74

hIgG1N297S3 gacgctgaccacacggtacgtgctgctgtactgctcctcccgcgg

75

mIgG2aNS gatatctctagatttacccggagtccgagagaagctcttagtcgt

76

mIgG2a3ns-sal gatatctccggagtcgactttacccggagtccgagagaagctcttag

77

mIgG2N297S5 cacaaacccatagagaggattacagcagtactctccgggtggtc

78

mIgG2N297S3 gaccacccggagagtactgctgtaatcctctctatgggtttgag

79

80

g4s4clnk3

81

g4s4clnk5

82

Nlnkgly5 aaagtcgacggagctagcagccccgtgaacgtgagcagccccagcgtg

83

Nlnkgly3 cccatgatatcctgcacgctggggctgctc

84

hdnasaledad

85

hdnasa1L3-3S

86

mdnasa1L3-3S

87

mdnasa1L3edad

88

mrib-L5’

89

mrib5X

90

mrib3X

91

hRNasaG88D-S agactgccgcctgacaaacgactccaggtaccc

92

hRNAsaG88D-AS gggtacctggagtcgtttgtcaggcggcagtct

93

g4s5-5-1

94

g4s5-2s

95

g4s5-asxho

41

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen46

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

imagen52

imagen53

imagen54

imagen55

imagen56

imagen57

imagen58

imagen59

imagen60

imagen61

imagen62

imagen63

imagen64

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2