ES2620410T3 - Selección de células que expresan polipéptidos heterómeros - Google Patents

Abstract

Un sistema de expresión en hospedadores que comprende una célula hospedadora que ha sido modificada genéticamente para que exprese un primer vector que codifica un transcrito que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina, en el que la transcripción de dicha primera secuencia de ácido nucleico es inducida simultáneamente con la transcripción de una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una primera subunidad de un marcador seleccionable, y un segundo vector que codifica un transcrito que comprende una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina que es capaz de asociarse con la primera cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina para formar un complejo heterómero, en el que la transcripción de dicha tercera secuencia de ácido nucleico es inducida simultáneamente con la transcripción de una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda subunidad de un marcador seleccionable, y en el que dichas primera y segunda subunidades del marcador seleccionable se asocian para proporcionar una actividad seleccionable, en el que un sitio de entrada a ribosomas interno aparece entre la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico, en el que un sitio de entrada a ribosomas interno aparece entre la tercera secuencia de ácido nucleico y la cuarta secuencia de ácido nucleico, y el complejo heterómero es un anticuerpo.

Description

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DESCRIPCION

Seleccion de celulas que expresan polipeptidos heteromeros Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo general de la expresion recombinante de polipeptidos en cultivos de celulas animales. Mas en concreto, la invencion se refiere a la seleccion mejorada en celulas de vectores modificados de modo recombinante, disenados para expresar polipeptidos.

Antecedentes de la invencion

Muchas protemas importantes desde el punto de vista comercial se producen en celulas modificadas de modo recombinante que se han adaptado para el crecimiento a largo plazo en cultivo. Con frecuencia, las protemas se expresan como una unica cadena polipeptidica. En estas celulas tambien se expresan multiples polipeptidos heterologos que pueden asociarse para formar complejos heteromeros, tales como, por ejemplo, un anticuerpo, que se forma por la expresion de partes equivalentes de cadenas pesadas y cadenas ligeras.

Una dificultad que puede aparecer cuando se expresan complejos heteromeros en celulas es la obtencion de cantidades apropiadas de los polipeptidos recombinantes que forman un componente del complejo. Por ejemplo, en la expresion de un anticuerpo, con frecuencia la cadena pesada o la cadena ligera se expresan a unos niveles relativamente elevados con respecto a su correspondiente pareja; sin embargo, la obtencion de una lmea celular que exprese ambas cadenas a niveles elevados y aproximadamente en cantidades equivalentes resulta diffcil.

Estas dificultades dan como resultado la adicion de etapas y tambien la repeticion de etapas en el proceso de generar lmeas celulares que expresen polipeptidos recombinantes, lo cual produce retrasos que tambien aumentan sustancialmente los costes asociados con la expresion recombinante de los polipeptidos. Asf, en la tecnica son necesarios metodos mas sencillos para seleccionar un alto nivel de expresion de polipeptidos en cultivos celulares para aumentar la produccion de los polipeptidos y, con ello, reducir la inversion de dinero y tiempo necesaria para la seleccion de celulas que expresen los polipeptidos. La invencion satisface esta necesidad proporcionando un metodo mejorado para seleccionar celulas que expresan polipeptidos.

La produccion de protemas recombinantes en celulas de ovario de hamster chino (CHO) empleando un vector de expresion de intron de la dihidrofolato reductasa (DHFR) dicistronico se ha descrito en Lucas et al. (1996), Nucleic Acids Research, 24:1774-1779.

Sumario de la invencion

La invencion se basa, en parte, en la premisa de que la produccion eficaz de complejos heteromeros recombinantes en celulas mejora si cada componente del complejo se expresa en cantidades proporcionales. Asf, la presente invencion proporciona sistemas de expresion en hospedadores y metodos, segun se define en las reivindicaciones, para seleccionar celulas modificadas de modo recombinante que expresan mas de un polipeptido, en los que los polipeptidos se expresan en cantidades proporcionales, de forma que los polipeptidos pueden asociarse con eficacia para formar un complejo heteromero y se logra una expresion mayor.

Segun un primer aspecto de la invencion, se proporciona un sistema de expresion en hospedadores que comprende una celula hospedadora que ha sido modificada geneticamente para que exprese un primer vector que codifica un transcrito que comprende una primera secuencia de acido nucleico que codifica una primera cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de dicha primera secuencia de acido nucleico es inducida simultaneamente con la transcripcion de una segunda secuencia de acido nucleico que codifica una primera subunidad de un marcador seleccionable, y un segundo vector que codifica un transcrito que comprende una tercera secuencia de acido nucleico que codifica una segunda cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina que es capaz de asociarse con la primera cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina para formar un complejo heteromero, en el que la transcripcion de dicha tercera secuencia de acido nucleico es inducida simultaneamente con la transcripcion de una cuarta secuencia de acido nucleico que codifica una segunda subunidad de un marcador seleccionable, y en el que dichas primera y segunda subunidades del marcador seleccionable se asocian para proporcionar una actividad seleccionable, en el que un sitio de entrada a ribosomas interno aparece entre la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico, en el que un sitio de entrada a ribosomas interno aparece entre la tercera secuencia de acido nucleico y la cuarta secuencia de acido nucleico, y el complejo heteromero es un anticuerpo.

El marcador seleccionable puede seleccionarse del grupo que consiste en un marcador de resistencia a farmacos y un marcador de supervivencia metabolica. El marcador seleccionable puede seleccionarse del grupo que consiste en dihidrofolato reductasa, resistencia a neomicina, resistencia a higromicina, y beta-galactosidasa. La subunidad del marcador seleccionable puede ser un polipeptido de fusion que comprende un dominio de interaccion. El dominio de interaccion puede ser una cremallera de leucina procedente de un polipeptido seleccionado del grupo que

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consiste en GCN4, C/EBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc y c-Max.

En la invencion, el sistema de expresion en hospedadores puede codificar ademas un marcador seleccionable funcional diferente seleccionado de la lista que consiste en zeomicina, neomicina, puromicina, blasticidina S, y GPT. La celula hospedadora puede seleccionarse del grupo que consiste en celulas CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, una lmea de celulas de mieloma, y celulas WI38.

Segun un segundo aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para producir un complejo heteromero que comprende la etapa de cultivar la celula hospedadora, segun se define en el primer aspecto, bajo condiciones en las que el complejo heteromero es expresado por la celula hospedadora. El metodo puede comprender ademas aislar el complejo heteromero.

En la invencion, el sistema de expresion en hospedadores puede comprender una celula hospedadora que ha sido modificada geneticamente para que exprese un primer vector que comprende una primera secuencia de acido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de dicha cadena ligera es inducida simultaneamente con la transcripcion de una segunda secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion de una primera subunidad de dihidrofolato reductasa condensada con una secuencia de dimerizacion, y un segundo vector que comprende una tercera secuencia de acido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de dicha cadena pesada es inducida simultaneamente con la transcripcion de una cuarta secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion de una segunda subunidad de una dihidrofolato reductasa condensada con una secuencia de dimerizacion, en el que cada subunidad de dihidrofolato reductasa no presenta una actividad seleccionable cuando se expresa por sf sola, y la coexpresion de la primera subunidad de dihidrofolato reductasa con la segunda subunidad de dihidrofolato reductasa proporciona actividad dihidrofolato reductasa. En esta realizacion, una subunidad de la dihidrofolato reductasa (DHFR) puede estar formada por los aminoacidos 1 a 105 de DHFR, y la otra subunidad de la dihidrofolato reductasa (DHFR) puede estar formada por los aminoacidos 106 a 187 de DHFR. La secuencia de dimerizacion condensada con la subunidad de dihidrofolato puede derivarse de la secuencia de cremallera de leucina de GCN4.

En la invencion, el sistema de expresion en hospedadores puede comprender una celula hospedadora que ha sido modificada geneticamente para que exprese un primer vector que codifica un transcrito que comprende una primera secuencia de acido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de dicha primera secuencia de acido nucleico es inducida simultaneamente con la transcripcion de una segunda secuencia de acido nucleico que codifica una primera subunidad de un marcador seleccionable, y un segundo vector que codifica un transcrito que comprende una tercera secuencia de acido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de la tercera secuencia de acido nucleico es inducida simultaneamente con la transcripcion de una cuarta secuencia de acido nucleico que codifica una segunda subunidad de un marcador seleccionable, y en el que dichas primera y segunda subunidades del marcador seleccionable se asocian para proporcionar una actividad seleccionable. El marcador seleccionable puede seleccionarse del grupo que consiste en dihidrofolato reductasa, resistencia a neomicina, resistencia a higromicina, y beta-galactosidasa. La subunidad del marcador seleccionable puede ser un polipeptido de fusion que comprende un dominio de interaccion. El dominio de interaccion puede ser una cremallera de leucina procedente de un polipeptido seleccionado del grupo que consiste enGCN4, c/eBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc y c-Max.

Breve descripcion de la figura

Figura 1: Una representacion esquematica de las construcciones de acidos nucleicos utilizadas en los ejemplos, que comprenden, cada una, una subunidad de un marcador seleccionable y que expresan, cada una, un polipeptido diferente, que pueden asociarse para formar un complejo heteromero en una celula. Las abreviaturas son las siguientes: ESpE, elemento de secuencia potenciador de la expresion; CMV, promotor de citomegalovirus; CP, cadena pesada; CL, cadena ligera; SERI, sitio de entrada a ribosomas interno; DHFR, dihidrofolato reductasa; y pA, senal de poliadenilacion.

Descripcion detallada de la invencion

La produccion eficaz de complejos heteromeros recombinantes en celulas mejora si cada componente del complejo se expresa en cantidades proporcionales y elevadas. La presente invencion proporciona metodos y composiciones para seleccionar celulas modificadas de modo recombinante que expresan mas de un polipeptido heterologo en cantidades proporcionales, de forma que los polipeptidos pueden asociarse con eficacia para formar un complejo heteromero a niveles de expresion mas altos que los complejos heteromeros preparados de la manera tradicional. La presente invencion tambien resulta ventajosa porque disminuye el tiempo necesario para seleccionar las celulas que expresan niveles elevados de un complejo heteromero de polipeptidos recombinante deseado.

La invencion emplea marcadores seleccionables que pueden existir en forma de dos o mas subunidades que, cuando se expresan juntas, interaccionan para proporcionar, con ello, una actividad seleccionable. Las subunidades individuales no tienen una actividad seleccionable significativa por sf mismas, pero sf proporcionan una actividad seleccionable cuando son coexpresadas con su subunidad homologa. La actividad optima de las subunidades puede

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depender de su interaccion y, as^ puede verse facilitada por la existencia de dominios de interaccion. Estos dominios de interaccion pueden ser endogenos a la subunidad o pueden ser heterologos a la subunidad.

Se construyen moleculas de acidos nucleicos que codifican un polipeptido y una subunidad del marcador seleccionable, dispuestas de tal forma que la expresion de la subunidad se correlaciona con la expresion del polipeptido. Por tanto, cuando las moleculas de acido nucleico que codifican ambas subunidades se transfectan a celulas y se aplican condiciones selectivas, unos niveles de expresion elevados y aproximadamente equivalentes de cada una de las subunidades proporcionaran la actividad seleccionable mas alta. Ademas, los polipeptidos unidos operablemente se expresaran en cantidades elevadas y casi equivalentes, por lo cual se produce una optimizacion de la seleccion de las celulas que expresan cantidades elevadas y equivalentes de los polipeptidos deseados.

La invencion implica el uso de dos subunidades de un marcador seleccionable, y cada una se expresa como una protema de fusion con un dominio de interaccion. Cuando se expresa, el dominio de interaccion estimula la asociacion o la dimerizacion de las dos subunidades, permitiendo, con ello, que las subunidades actuen y proporcionen una actividad seleccionable (como ejemplo, pero si limitarse a esta, la descrita en Pelletier et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci., 95:12141-12146).

En la presente tambien se describe el uso de tres subunidades de un marcador seleccionable, y cada una se expresa como una protema de fusion con un dominio de interaccion, potenciando, con ello, la asociacion para proporcionar una actividad seleccionable. En esta realizacion, existen tres componentes del complejo heteromero. En las secuencias codificadoras del vector o vectores expresados, cada una esta unida operablemente a secuencias codificadoras para cada una de las respectivas subunidades del marcador seleccionable, por ejemplo, un anticuerpo biespedfico que expresa una unica cadena pesada y dos cadenas ligeras diferentes, en el que las dos cadenas ligeras son ambas capaces de asociarse con la cadena pesada. En la presente tambien se describe el uso de marcadores seleccionables conocidos o que aun no se han descrito, que presenten cuatro o incluso mas subunidades.

Tal como se demostrara a continuacion en los ejemplos, se ha descubierto que los sistemas de expresion en hospedadores y los metodos de la invencion reducen la cantidad de tiempo necesaria para seleccionar las celulas deseadas que expresan niveles elevados de un unico polipeptido.

En la presente tambien se describe la seleccion de celulas que expresan niveles elevados de un polipeptido recombinante.

Tal como se describe tambien en la presente, los acidos nucleicos que codifican las subunidades del marcador seleccionable estan condensados dentro de marco con un acido nucleico que codifica un conector, que despues se condensa dentro de marco con un acido nucleico que codifica un dominio de interaccion. Los conectores pueden incluir cualquier secuencia flexible, relativamente corta, que permita que el dominio de interaccion interaccione y que las subunidades actuen para proporcionar una actividad seleccionable. Existen ejemplos abundantes de conectores en la tecnica pertinente y estos pueden comprender GGPGG, GPGGG, en los que, en el codigo de una sola letra para aminoacidos, G es la glicina y P es la prolina. En una realizacion, el conector es GGGGSGGGGGS (Curtis et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., 88(13):5809-5813).

Un dominio de interaccion es un dominio que incluye, pero no se limita a polipeptidos capaces de facilitar la interaccion o la asociacion de dos o mas polipeptidos homologos o heterologos. Tal como se emplean en la presente, los terminos "asociar" o "interaccionar" pretenden describir una relacion entre al menos dos moleculas, en la que una molecula se une a otras y/o afecta a la actividad de otras. La interaccion puede incluir la union directa o indirecta de dos polipeptidos (o un polipeptido y un acido nucleico) o la activacion o inhibicion funcional de la actividad de una molecula por otra molecula.

En una realizacion, el dominio de interaccion es un dominio de dimerizacion. Un dominio de dimerizacion puede ser un polipeptido capaz de inducir la interaccion o la asociacion de dos polipeptidos. Existen dos tipos de dfmeros, los dfmeros capaces de formar homodfmeros (con la misma secuencia) o los heterodfmeros (con otra secuencia).

En una realizacion ilustrativa, pero no limitante, el dominio de interaccion es un polipeptido enrollado de cremallera de leucina enrollada. Una cremallera de leucina generalmente comprende aproximadamente 35 aminoacidos que contienen una repeticion de siete restos caractenstica con restos hidrofobos en el primer y el cuarto resto de la repeticion (Harbury et al. (1993), Science, 262:1401). Por tanto, una cremallera de leucina es susceptible de fusionarse con un polipeptido para la oligomerizacion del polipeptido, puesto que es una molecula pequena y es menos probable que altere la funcion normal del polipeptido con respecto a un dominio de interaccion mas grande. Los ejemplos de cremalleras de leucina incluyen, pero no se limitan a los dominios de cremallera de leucina procedentes de polipeptidos tales como GCN4, C/EBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc y c-Max.

Otros ejemplos de dominios de dimerizacion incluyen los dominios de helice-bucle-helice (Murre et al. (1989), Cell, 58:537-544). El receptor del acido retinoico, el receptor de la hormona tiroidea, otros receptores de hormonas nucleares (Kurokawa et al. (1993), Genes Dev., 7:1423-1435) y los factores de la transcripcion de levaduras GAL4 y

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HAP1 (Marmonstein et al. (1992), Nature, 356:408-414; Zhang et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:28512855; patente de EEUU n.° 5.624.818) presentan dominios de dimerizacion con este motivo.

Tal como se describe tambien en la presente, el dominio de interaccion es un dominio de tetramerizacion, que consiste en un polipeptido capaz de unirse a tres dominios de tetramerizacion distintos para formar un complejo tetramero. Los ejemplos de protemas que contienen dominios de tetramerizacion incluyen, pero no se limitan al represor de lactosa de E. coli (aminoacidos 46-360; Chakerian et al. (1991), J. Biol. Chem., 266:1371; Alberti et al. (1993), EMBO J., 12:3227; y Lewis et al. (1996), Nature, 271:1247), y el dominio de tetramerizacion de p53 en los restos 322-355 (Clore et al. (1994), Science, 265:386; Harbury et al. (1993), Science, 262:1401; patente de EEUU n.° 5.573.925).

Tal como se define en las reivindicaciones, las dos subunidades se expresan a partir de dos vectores, en los que el primer vector comprende un primer acido nucleico que codifica un primer polipeptido, y en los que el primer acido nucleico esta unido operablemente a un segundo acido nucleico que codifica una subunidad de un marcador seleccionable. El segundo vector comprende un tercer acido nucleico que codifica un polipeptido que es capaz de asociarse con el polipeptido codificado por el primer acido nucleico, en el que el tercer acido nucleico esta unido operablemente a un cuarto acido nucleico que codifica una subunidad diferente del marcador seleccionable. Asf, ambos vectores se transfectan simultaneamente a una poblacion celular y se aplica una seleccion para la expresion del marcador seleccionable (formado por dos subunidades).

En otra realizacion, la invencion comprende ademas un acido nucleico que codifica un marcador seleccionable funcional diferente, ademas de una subunidad de un marcador seleccionable y un polipeptido de un complejo heteromero. Para los objetivos de la presente, un "marcador seleccionable funcional diferente" no es una subunidad de un marcador seleccionable, sino una protema con actividad seleccionable totalmente funcional. Pueden emplearse marcadores muy conocidos, tales como neomicina, puromicina, blasticidina S, o GPT, que confieren resistencia al acido micofenolico, etc., como marcadores seleccionables funcionales diferentes. En esta realizacion, la invencion comprende dos vectores, en los que cada uno de los vectores comprende un primer acido nucleico que codifica un polipeptido que puede formar un complejo heteromero unido operablemente a un segundo acido nucleico que codifica al menos una subunidad de un marcador seleccionable, asf como tambien un acido nucleico que codifica un marcador seleccionable funcional diferente. Ademas, los respectivos polipeptidos codificados por el primer acido nucleico de cada vector pueden asociarse para formar un complejo, y la subunidad o subunidades codificadas por el segundo acido nucleico de cada vector pueden asociarse para proporcionar una actividad seleccionable, y los polipeptidos codificados por el tercer acido nucleico proporcionan actividades seleccionables diferentes de la actividad seleccionable de las subunidades codificadas por el segundo acido nucleico. Por ejemplo, el primer vector puede codificar la resistencia a la neomicina y el segundo vector puede codificar la resistencia a la zeomicina, o solo un vector puede contener el marcador seleccionable funcional diferente adicional. Asf, un vector se transfecta en una lmea celular y se aplica una seleccion (concretamente, se anade el farmaco G418 a las celulas resistentes a la neomicina). Despues de la seleccion, pueden emplearse metodos convencionales para determinar la presencia del vector y el nivel de expresion de los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos en el vector, por ejemplo, mediante PCR, analisis de la transferencia Southern, ELISA, analisis de la transferencia Western y similares. Tras haber obtenido un nivel elevado de expresion, el segundo vector se transfecta en la lmea celular. Mientras se mantiene la seleccion para el primer vector, se aplica una seleccion para el segundo marcador seleccionable (concretamente, la resistencia a la zeomicina) y se evalua la presencia del segundo vector y la expresion de las respectivas protemas codificadas por el vector. En esta realizacion, tras determinar que ambos vectores estan presentes, se aplica una seleccion para la expresion de las subunidades que se han asociado en la celula para proporcionar una actividad seleccionable, por ejemplo, dihidrofolato reductasa (DHFR), tal como se describio anteriormente.

Tal como se describe en la presente, ambos acidos nucleicos de la invencion que codifican actividades seleccionables independientes se transfectan simultaneamente y se aplica una seleccion al mismo tiempo. Tras determinar que ambos vectores estan presentes, se aplica una seleccion para la expresion de las subunidades que se han asociado en la celula para proporcionar una actividad seleccionable, por ejemplo, dihidrofolato reductasa (DHFR), tal como se describio anteriormente.

Tal como se describe en la presente, los vectores de la invencion que codifican actividades seleccionables independientes se transfectan cada uno en lmeas celulares diferentes. Tras haber aplicado la seleccion y haber identificado los clones que expresan niveles elevados de las protemas codificadas por cada vector deseado, las celulas se fusionan, tal como se describe en Hori et al. (patente de EEUU n.° 5.916.771). Tras completarse la fusion, se aplica una seleccion para la actividad seleccionable proporcionada por las subunidades.

Tal como se describe en la presente, los acidos nucleicos de la invencion que opcionalmente no contienen una actividad seleccionable independiente se transfectan simultaneamente con un tercer vector. El tercer vector codifica una actividad seleccionable distinta, tal como, por ejemplo, la resistencia a neomicina o beta-galactosidasa, que puede permitir realizar una seleccion preliminar de celulas que han sido transfectadas con exito. Tras realizar esta seleccion preliminar, puede aplicarse una seleccion para la actividad seleccionable de las subunidades, por ejemplo, DHFR. En esta realizacion, se transfectan cantidades equivalentes de los dos vectores de expresion, mientras que el

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tercer vector se transfecta a un tercio de la concentracion de los primeros dos vectores (por ejemplo, una proporcion de 3:3:1 o 6:6:1 o similares). Los expertos en la tecnica reconoceran que, dentro del alcance de la invencion, se incluyen las variaciones en las proporciones.

Los acidos nucleicos que codifican un componente del complejo heteromero deseado pueden obtenerse como un ADNc o como un ADN genomico por medio de metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, un ARN mensajero que codifique un componente deseado puede aislarse a partir de una fuente adecuada empleando tecnicas convencionales de aislamiento de ARN y el uso de una cromatograffa de oligo-dT y celulosa para segregar el ARNm de poli-A. Cuando el complejo heteromero que se va a expresar es un anticuerpo, pueden aislarse fuentes adecuadas de los acidos nucleicos deseados a partir de celulas B madura o de un cultivo de hibridoma. Ademas, los acidos nucleicos para su uso en la invencion pueden obtenerse mediante smtesis qmmica.

La expresion "complejo heteromero" pretende incluir un complejo molecular formado por la asociacion de al menos dos moleculas diferentes. La asociacion puede ser una interaccion no covalente o una union covalente, por ejemplo, enlaces disulfuro. Las dos moleculas diferentes generalmente son dos polipeptidos diferentes, aunque la invencion contempla complejos heteromeros entre polipeptidos y acido nucleicos, y entre diferentes acidos nucleicos. Tal como se describe en la presente, el complejo heteromero proporciona una actividad funcional, tal como la capacidad de unirse a un sustrato (por ejemplo, una inmunoglobulina capaz de unirse al correspondiente antigeno), una actividad enzimatica o similares. En una realizacion, el complejo heteromero de la invencion se segrega hacia el medio de cultivo de la celula hospedadora en que se esta produciendo.

Tal como se describe en la presente, el complejo heteromero es una molecula de inmunoglobulina. La inmunoglobulina, en sistemas de vertebrados, es un anticuerpo formado por dos cadenas ligeras identicas y dos cadenas pesadas identicas. Las cuatro cadenas se unen entre sf por medio de enlaces disulfuro, de modo que cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada y las cadenas pesadas estan conectadas a lo largo de sus colas formando, en su conjunto, un complejo heteromero con forma de Y. Se conocen numerosas tecnicas mediante las cuales un ADN que codifica moleculas de inmunoglobulina puede manipularse para producir ADN que son capaces de codificar protemas recombinantes, tales como anticuerpos con afinidad potenciada, u otros polipeptidos basados en anticuerpos (vease, por ejemplo, Larrick et al. (1989), Biotechnology, 7:934-938; Reichmann et al. (1988), Nature, 332:323-327; Roberts et al. (1987), Nature, 328:731-734; Verhoeyen et al. (1988), Science, 239:1534-1536; Chaudhary et al. (1989), Nature, 339:394-397).

En la invencion tambien pueden emplearse celulas recombinantes que producen anticuerpos totalmente humanos (tales como los que se preparan utilizando bancos de anticuerpos y/o animales transgenicos, y que opcionalmente son modificados posteriormente in vitro), asf como anticuerpos humanizados. Vease, por ejemplo, Cabilly et al., patente de EEUU n.° 4.816.567; Cabilly et al., patente europea n.° 0.125.023 B1; Boss et al., patente de eEuU n.° 4.816.397; Boss et al., patente europea n.° 0.120.694 B1; Neuberger et al., documento WO 86/01533; Neuberger et al., patente europea n.° 0.194.276 B1; Winter, patente de EEUU n.° 5.225.539; Winter, patente europea n.° 0.239.400 B1; Queen et al., patente europea n.° 0.451.216 B1; y Padlan et al., patente europea n.° 0.519.596 A1. Por ejemplo, la invencion puede emplearse para inducir la expresion de anticuerpos humanos y/o humanizados que reconocen, de manera inmunoespedfica, dianas celulares espedficas, por ejemplo, el receptor de EGF humano, el antfgeno her-2/neu, el antfgeno CEA, el antfgeno de membrana espedfico de prostata (PSMA), CD5, CD11a, CD 18, NGF, CD20, CD45, Ep-cam, otras moleculas de la superficie de celulas cancerosas, TNF-alfa, TGF-b1, VEGF, otras citoquinas, alfa 4 beta 7 integrina, IgE, protemas vmcas (por ejemplo, citomegalovirus), etc., por nombrar solo unas cuantas.

Los ejemplos de complejos heteromeros, ademas de las inmunoglobulinas, incluyen, pero no se limitan a cualquier protema heterodfmera o hetero-oligomera, por ejemplo, BMP2/BMP7, protema osteogenica, enzima convertidora de interleuquina 1 (ICE), diversos receptores de interleuquina (por ejemplo, el receptor de IL-18, el receptor de IL-13, el receptor de IL-4 y el receptor de IL-7), receptores del nucleo, tales como receptores retinoides, receptores de celulas T, integrinas, tales como moleculas de adhesion celular, beta-integrinas, receptor del factor de necrosis tumoral y formas solubles y unidas a membranas de protemas del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I y de clase II (MHC). Para los complejos heteromeros que son receptores, la invencion incluye las formas solubles y unidas a membranas de los polipeptidos. Pueden encontrarse descripciones de otras protemas heteromeros que pueden producirse segun la invencion, por ejemplo, en Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, vol. II (Aggarwal y Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay y Leigh, eds. Oxford University Press Inc., Nueva York, 1993), y The Cytokine Handbook (AW Thompson, ed., Academic Press, San Diego CA, 1991).

Tal como se emplea en la presente, la expresion "protema de fusion" se refiere a una protema o a un dominio de una protema (por ejemplo, un dominio extracelular soluble) condensado con una protema o un peptido heterologo. Los ejemplos de dichas protemas de fusion incluyen protemas expresadas como una fusion con una porcion de una molecula de inmunoglobulina, protemas expresadas como protemas de fusion con un resto de cremallera, y protemas polifuncionales nuevas, tales como las protemas de fusion de citoquinas y factores del crecimiento (concretamente, GM-CSF e IL-3, MGF e IL-3). Los documentos WO 93/08207 y WO 96/40918 describen la preparacion de diversas formas oligomeras solubles de una molecula denominada CD40L, que incluyen una

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protema de fusion de inmunoglobulina y una protema de fusion de cremallera, respectivamente; las tecnicas analizadas en estos documentos son aplicables a otras protemas. Cualquiera de las moleculas descritas en la presente puede expresarse como una protema de fusion, que incluyen, pero no se limitan al dominio extracelular de una molecula de receptor celular, una enzima, una hormona, una citoquina, una porcion de una molecula de inmunoglobulina, un dominio de cremallera y un epftopo.

La invencion resulta particularmente util para mejorar la produccion de complejos heteromero a traves de procesos de cultivo celular. Las lmeas celulares empleadas en la invencion pueden modificarse geneticamente para que expresen una protema de interes comercial o cientifico. "Modificada geneticamente" significa que la lmea celular se ha transfectado, transformado o transducido con una molecula de un polinucleotido recombinante, para que la celula exprese una protema deseada. Los metodos y los vectores para modificar geneticamente celulas y/o lmeas celulares para que expresen una protema de interes son muy conocidos por los expertos en la tecnica; por ejemplo, se ilustran diversas tecnicas en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, Nueva York, 1988, y las actualizaciones trimestrales), y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989).

Ademas del acido nucleico que codifica el componente deseado del complejo heteromero, las construcciones de vectores pueden incluir otros componentes para facilitar la replicacion en celulas procariotas y/o eucariotas, la integracion de la construccion en un cromosoma eucariota, y marcadores para ayudar a la seleccion y/o la busqueda de celulas que contienen la construccion. Los vectores de la invencion son vectores de ADN recombinante que incluyen, pero no se limitan a plasmidos, fagos, fagemidos, cosmidos, virus, retrovirus y similares, que insertan un acido nucleico deseado en una celula.

Un acido nucleico esta "unido operablemente" cuando esta colocado en una relacion funcional con otro acido nucleico. De modo mas concreto, unido operablemente significa que la traduccion de dos acidos nucleicos diferentes que codifican polipeptidos diferentes se induce simultaneamente. Unido operablemente tambien significa que los acidos nucleicos conectados pueden aparecer contiguos en una unica unidad transcripcional, mientras que la traduccion se dirige desde uno o mas sitios de inicio ribosomicos (por ejemplo, sitios de inicio ribosomicos internos).

Los metodos de la invencion tambien pueden utilizarse en combinacion con metodos conocidos o por descubrir para inducir la produccion de protemas recombinantes. "Condiciones inductoras" significa una tecnica para aumentar la produccion relativa por celula de una protema recombinante deseada. Estas tecnicas incluyen el desplazamiento hacia una temperatura fria, adiciones de productos qmmicos, y combinaciones de cualquiera de las tecnicas conocidas o por descubrir, por mencionar solo algunos ejemplos, asf como cualquier tecnica de induccion aun por describir y/o descubrir. Generalmente, un lote o un cultivo de perfusion de celulas a alta densidad se induce para que produzca la protema recombinante. A menudo se inhiben otros procesos celulares (tales como el crecimiento y la division) para dirigir la mayor parte de la energfa de la celula a la produccion de protemas recombinantes.

En los metodos y las composiciones de la invencion puede utilizarse cualquier marcador seleccionable que presente subunidades complementarias. Tal como se emplea en la presente, el termino "subunidad", cuando se refiere a un marcador seleccionable, indica una porcion de un marcador seleccionable. Ademas, una primera subunidad de un marcador seleccionable puede expresarse con una segunda subunidad diferente del mismo marcador seleccionable para proporcionar un nivel de actividad seleccionable que no esta presente en ninguna de las subunidades por sf solas. Una subunidad tambien puede indicar un polipeptido que contenga mutaciones que son complementadas por otro polipeptido mutado que tambien es una subunidad diferentes del marcador seleccionable.

En los metodos y las composiciones de la invencion pueden utilizarse marcadores seleccionables que confieren resistencia a farmacos concretos que normalmente son toxicos para una celula animal. Por ejemplo, a continuacion se ofrecen ejemplos no limitantes de marcadores seleccionables de resistencia: zeomicina (zeo); puromicina (PAC); blasticidina S (BlaS), GPT, que confiere resistencia al acido micofenolico (Mulligan y Berg (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072); el gen de resistencia a la neomicina, que confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Colberre- Garapin et al. (1981), J. Mol. Biol., 150:1); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al. (1984), Gene, 30:147).

En los metodos y las composiciones de la invencion tambien pueden emplearse enzimas metabolicas que confieren supervivencia a la celula o que inducen la muerte celular bajo condiciones prescritas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: dihidrofolato reductasa (DHFR); timidina quinasa del virus del herpes simplex (TK) (Wigler et al. (1977), Cell, 11:223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT) (Szybalska y Szybalski (1962), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026), y adenina fosforribosiltransferasa (ApRT) (Lowy et al. (1980), Cell, 22:817), cuyos genes pueden emplearse en celulas que carecen de TK, HGPRT o APRT, respectivamente.

En una realizacion concreta, la dihidrofolato reductasa (DHFR) es el marcador seleccionable empleado en los metodos y las composiciones de la presente invencion. La DHFR tambien puede utilizarse para la resistencia de antimetabolitos al metotrexato (Wigler et al. (1980), Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567; O'Hare et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527). Mas en concreto, tal como se emplea en la invencion, la DHFR se divide en dos subunidades, F[1,2] y F[3] (desde los aminoacidos 1-105 y 106-187) y la asociacion de las subunidades en una

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celula es estimulada por los dominios de interaccion unidos a las respectivas subunidades (veanse los siguientes ejemplos; Pelletier et al. (1998), PNAS, 95:12141-12146). Durante el proceso de seleccion, las celulas carecen de actividad DHFR, de modo que no creceran en un medio de seleccion (-GHT) sin la actividad DHFR. El crecimiento se restablece tras la asociacion de los fragmentos de la DHFR. Como alternativa, pueden emplearse celulas que expresan DHFR endogena, y los transfectantes pueden seleccionarse confiriendo una mayor resistencia a niveles toxicos de metotrexato.

El metotrexato tambien se puede utilizar segun la invencion para amplificar acidos nucleicos recombinantes despues de la seleccion de celulas sensibles a -GHT. La seleccion se realiza habitualmente a una concentracion de 25 nM, mas preferiblemente 50 nM, aun mas preferiblemente 150 nM, y lo mas preferiblemente 300 nM de metotrexato. Los expertos en la tecnica reconoceran que las concentraciones de metotrexato pueden ser tan altas como de 500 nM o mayor para amplificar acidos nucleicos recombinantes que presentan resistencia al farmaco, tales como los descritos en la presente. La amplificacion empleando los vectores y los metodos de la invencion resulta particularmente ventajosa, porque se ha descubierto que, en el caso de la expresion de una cadena pesada y ligera, ambas cadenas se amplifican aproximadamente a niveles equivalentes.

En los metodos y las composiciones de la invencion tambien pueden utilizarse marcadores seleccionables basados en la seleccion de un color. En un ejemplo concreto, puede emplearse la beta-galactosidasa (Blau et al., documento WO 98/44350). Tambien pueden emplearse marcadores de fluorescencia en los metodos de la presente invencion, por ejemplo, se ha empleado GFP para la seleccion clonal de celulas para medir las interacciones entre protemas en ensayos de complementacion de fragmentos-protemas (Remy y Michnick (1999), Proc. Natl. Acad. Sci., 96:53945399). De modo similar, puede utilizarse el metotrexato conjugado con fluorescema para detectar celulas que expresan fragmentos de DHFR complementarios (Remy y Michnick (2001), Proc. Natl. Acad. Sci., 98:7678-7683). Una ventaja de los marcadores fluorescentes es que esta seleccion puede realizarse en cualquier tipo de celula animal y no se limita a las que presentan una deficiencia en una via metabolica, por ejemplo, como en la seleccion con DHFR, ni tampoco requiere la presencia de sensibilidad frente a un farmaco, por ejemplo, frente a la neomicina.

Tal como se emplea en la presente, el termino "polipeptido" incluye las protemas que aparecen en la naturaleza o expresadas de modo recombinante, que incluye el procesamiento pre- y postraduccional, o sus fragmentos, que generalmente conservan la estructura secundaria. Las protemas son moleculas grandes con pesos moleculares elevados (de aproximadamente 10.000 para las pequenas [de 50-100 aminoacidos] hasta mas de 1.000.000 para ciertas formas); estan compuestas de cantidades variables de los mismos 20 aminoacidos, los cuales, en la protema intacta, estan unidos a traves de enlaces qmmicos covalentes denominados enlaces peptfdicos. Los aminoacidos, unidos entre sf, forman estructuras polimericas lineales no ramificadas denominadas cadenas polipeptfdicas; estas cadenas pueden contener cientos de restos aminoacidos; estos estan dispuestos en un orden espedfico para una especie concreta de protema. El termino "peptido" incluye fragmentos cortos de polipeptidos o protemas, generalmente con una longitud menor que 20 aminoacidos.

La expresion "cultivo celular" pretende incluir el crecimiento y la propagacion de celulas fuera de un tejido u organismo multicelular. Generalmente, el cultivo celular se realiza bajo condiciones atmosfericas y de temperatura controlada esteriles, en placas de cultivo de tejidos (por ejemplo, placas de 10 cm, placas de 96 pocillos, etc.), u otro cultivo adherente (por ejemplo, sobre esferas microportadoras) o en un cultivo en suspension, tal como en botellas rodantes. Los cultivos pueden cultivarse en matraces de agitacion, biorreactores a pequena escala y/o biorreactores a gran escala. Un biorreactor es un dispositivo empleado para cultivar celulas, en el que las condiciones ambientales, tales como la temperatura, la atmosfera, la agitacion y/ el pH, pueden controlarse y ajustarse. Una serie de empresas (por ejemplo, ABS Inc., Wilmington, DE; Cell Trends, Inc., Middletown, MD), asf como universidades y/u organizaciones de subvencion publica (por ejemplo, The Cell Culture Center, Minneapolis, MN) ofrecen servicios de cultivos celulares bajo contrato.

Los periodos optimos durante los cuales los cultivos estan en contacto con agentes que seleccionan la actividad seleccionable son mas largos que el periodo tfpico para un ciclo de crecimiento normal (por ejemplo, para las celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO), en las que se ha indicado que un ciclo de crecimiento dura aproximadamente 20-22 horas (Rasmussen et al. (1998), Cytotechnology, 28:31-42)). Asf, en una realizacion, los cultivos comprenden condiciones seleccionables, por ejemplo, farmacos, metabolitos, o sustratos de color, preferiblemente durante al menos aproximadamente un dfa, mas preferiblemente durante al menos aproximadamente 3 dfas, y aun mas preferiblemente durante al menos aproximadamente 7 dfas.

Esta disponible una amplia diversidad de lmeas de celulas animales adecuadas para el crecimiento en cultivo, por ejemplo, en la coleccion americana de cultivos tipo (ATCC, Manassas, VA) y NRRL (Peoria, IL). Algunas de las lmeas celulares mas establecidas que se emplean generalmente en la industria o en laboratorios academicos incluyen las lmeas de celulas CHO, VeRO, BHK, HeLa, Cos, CV1, MDCK, 293, 3T3, PC12, mieloma (por ejemplo, NSO), y WI38, por mencionar unos pocos ejemplos. En otras realizaciones, pueden emplearse lmeas de celulas no animales en los metodos de la invencion, por ejemplo, lmeas de celulas vegetales, lmeas de celulas de insecto (por ejemplo, sf9), celulas de levaduras o celulas bacterianas, tales como E. coli.

Tal como se describio en la presente, las lmeas de celulas mutantes deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR)

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(Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220) DXB11 y DG-44 son las lmeas de celulas CHO hospedadoras preferidas, debido al eficaz sistema de expresion de genes amplificables y seleccionables de DHFR, que permite un elevado nivel de expresion de protemas recombinantes en estas celulas (Kaufman R.J. (1990), Meth. Enzymol., 185:527-566). Ademas, estas celulas son faciles de manipular en forma de cultivos adherentes o en suspension, y muestran una estabilidad genetica relativamente buena. Ademas, pueden establecerse nuevas lmeas de celulas animales empleando metodos muy conocidos por los expertos en la tecnica (por ejemplo, mediante transformacion, infeccion vffica y/o seleccion).

Tal como se indico anteriormente, puede utilizarse una diversidad de sistemas de vectores de expresion en hospedadores para expresar los complejos heteromeros de la invencion. Cuando el complejo heteromero es soluble, el peptido o el polipeptido puede recuperarse del cultivo, es decir, de la celula hospedadora en los casos en que los complejos heteromeros no son segregados, y desde el medio de cultivo en los casos en que los complejos heteromeros son segregados por las celulas. Sin embargo, los sistemas de expresion tambien incluyen celulas hospedadoras modificadas que expresen los complejos heteromeros anclados en la membrana celular.

La purificacion o el enriquecimiento de los complejos heteromeros a partir de estos sistemas de expresion puede llevarse a cabo empleando micelas lipfdicas y detergentes apropiados y metodos muy conocidos por los expertos en la tecnica. Sin embargo, las propias celulas hospedadoras modificadas pueden emplearse en situaciones en las que resulta importante no solo conservar las caracteffsticas estructurales y funcionales de los complejos heteromeros, sino tambien evaluar la actividad biologica, por ejemplo, en ensayos de seleccion de farmacos.

La protema expresada por medio de los metodos de la invencion puede recolectarse. Ademas, la protema puede purificarse, o purificarse parcialmente, de dicho cultivo o componente 14 (por ejemplo, del medio de cultivo o de extractos celulares o de fluidos corporales) empleando procesos conocidos. La expresion "purificarse parcialmente" significa que se ha llevado a cabo algun procedimiento o procedimientos de fraccionamiento, aunque estan presentes mas especies polipepffdicas (al menos 10%) ademas de la protema deseada. "Purificada" significa que la protema es fundamentalmente homogenea, es decir, estan presentes menos del 1% de protemas contaminantes. Los procedimientos de fraccionamiento pueden incluir, pero no se limitan a una o mas etapas de filtracion, centrifugacion, precipitacion, separacion de fases, purificacion por afinidad, filtracion en gel, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de exclusion molecular (SEC), cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC, que emplea resinas tales como fenil eter, butil eter o propil eter), HPLC, o algunas de sus combinaciones.

La invencion opcionalmente incluye ademas formular las protemas en un momento posterior. El termino "formular" significa que las protemas pueden someterse a un intercambio de tampon, esterilizarse, envasarse a granel y/o envasarse para un usuario final. Para los objetivos de la invencion, la expresion "forma a granel esteril" significa que una formulacion esta exenta, o fundamentalmente exenta, de contaminacion microbiana (en la medida en que sea aceptable para fines alimentarios y/o farmacologicos) y tiene una composicion y una concentracion definidas.

La expresion "forma de dosis unitaria" significa una forma que es apropiada para la administracion o el consumo por parte del cliente y/o del paciente. Estas composiciones pueden comprender una cantidad eficaz de la protema, en combinacion con otros componentes, tales como un diluyente, vehmulo o excipiente fisiologicamente aceptable. La expresion "fisiologicamente aceptable" significa un material no toxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biologica del ingrediente o ingredientes activos.

Habiendo descrito la invencion, los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustracion y no como limitacion.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construccion de vectores de complementacion de DHFR

La construccion de vectores recombinantes que expresan subunidades de un marcador seleccionable se realizo como sigue. Se eligio la dihidrofolato reductasa (DHFR) como marcador seleccionable para ser empleada en los siguientes experimentos. Trabajos previos han demostrado que, debido a su estructura tridimensional modular, la DHFR puede romperse en dos partes y, cuando se expresa como una protema que presenta un dominio de interaccion, las subunidades despues pueden reasociarse en una celula para proporcionar una actividad seleccionable. Vease la figura 1 para un resumen general del orden de los diversos acidos nucleicos descritos en una realizacion de la invencion.

Se empleo la reaccion en cadena de la polimerasa secuencial (PCR) SOEing para generar acidos nucleicos adecuados para clonar en vectores de expresion que codifican una fusion de un dominio de interaccion de cremallera de leucina condensado con un polipeptido conector condensado con una subunidad de DHFR. Brevemente, la PCR SOEing consiste en el corte y empalme de genes mediante extension de solapamiento para recombinar moleculas de ADN en zonas de union sin utilizar endonucleasas de restriccion ni ligasa (Methods in Molecular Biology, vol. 15, "PCR protocols: Current Methods and Applications," y "Chapter 25: In Vitro Recombination," editor. B.A. White, 1993, Humana Press, Inc., Totowa, Nj; y Mutagenesis of DNA, Robert M. Horton, pp. 251-261).

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Los fragmentos de los genes que se van a recombinar se generan en reacciones en cadena de la polimerasa distintas (PCR). Los cebadores se disenan de modo que los extremos de los productos contengan secuencias complementarias, tales como un sitio de restriccion comun, concretamente, BamHI. Cuando estos productos de la PCR posteriormente se mezclan, se desnaturalizan y se reasocian, las hebras que poseen secuencias que se aparean en sus extremos 3' se solapan y actuan como cebadores entre sf (Horton et al. (1989), Gene, 77(1):61-68).

Los cebadores empleados en el presente ejemplo son los siguientes:

JM238 5'-ATATCTCGAGATCCGTGCCATCATGTCTGACCGTATGAAAC-3'

JM239 5'-GCCACCGCCGGATCCACCGCCACCCCGCTCGCCTACCAGCTTTT'-3'

JM240 5'-GGTGGATCCGGCGGTGGCGGCG-GCTCAATGGTTCGACCATTGAAC-3'

PDHFR106 5'-ATATCAATTGTTATTCCGGTTGTTCAATAAGTC-3'

JM242 5'-GTGGATCCGGCGGTGGCGGCGGCTCATTGGCAAGTAAAGTAGACA-3'

JM244 5'-ATATCAATTGTTAGTCTTTCTTCTCGTAGACTT-3'

Se empleo la siguiente estrategia para crear un acido nucleico que codifica un dominio de interaccion de cremallera de leucina condensado dentro de marco con un conector condensado dentro de marco con los aminoacidos 1-105 de DHFR. La primera reaccion de PCR amplifica la cremallera de leucina de GCN4 de levaduras (Lz) empleando los cebadores JM238 (SEQ ID NO:1) y JM239 (SEQ ID NO:2). Todas las reacciones de PCR utilizan el sistema de PCR Roche Expand High Fidelity, que incluye todos los reactivos necesarios, excepto por los dNTP 10 mM, que estan disponibles en el mercado. Las condiciones termicas del ciclo (condicion 1 de la PCR) fueron las siguientes:

94 °C durante 5 min

94 °C durante 30 seg-------

37 °C durante 30 seg |— 25 ciclos

72 °C durante 30 seg-------

72 °C durante 7 minutos 4 °C (mantenimiento).

El cebador JM238 presenta un sitio Xho1 en el extremo 5' terminal, y el cebador JM239 presenta un sitio BamH1 en el extremo 5' terminal. Al mismo tiempo, se emplearon los cebadores JM240 (SEQ ID NO:3) y PDHFR106 (SEQ ID NO:4) para amplificar mediante PCR los aminoacidos 1-105 que codifican una subunidad de DHFR (SEQ ID NO:5) [igual que antes, excepto con 1 minuto de duracion a 94 °C y a 72 °C para los 25 ciclos (condicion 2 de la PCR)]. El JM240 tiene un sitio BamH1 en su extremo 5' terminal y el PDHFR106 tiene un sitio Mfe1 en su extremo 5' terminal. Cada respectivo producto de la PCR se purifico en gel empleando tecnicas de purificacion en gel convencionales, y se realizo una segunda reaccion de PCR empleando la condicion 2 de la PCR. Despues el producto resultante se clono en un vector pGEM-T (Promega) y se secuencio.

Se empleo una estrategia similar para crear un acido nucleico que codifica una cremallera de leucina condensada dentro de marco con un conector condensado dentro de marco con los aminoacidos 106-187 de DHFR. La primera reaccion de PCR amplifica la cremallera de leucina de GCN4 de levaduras empleando los cebadores JM238 (SEQ ID NO:1) y JM239 (SEQ ID NO:2) empleando la condicion 1 de la PCR. El cebador JM238 presenta un sitio Xho1 en el extremo 5' terminal, y el cebador JN239 presenta un sitio BamH1 en el extremo 5' terminal. Al mismo tiempo, se emplearon los cebadores JM242 (SEQ iD NO:6) y JM244 (SEQ ID NO:7) para amplificar mediante PCR los aminoacidos 106-187 que codifican una subunidad de DHFR (SEQ ID NO:5) empleando la condicion 1 de la PCR. El JM242 tiene un sitio BamH1 en su extremo 5' terminal y el JM244 tiene un sitio Mfe1 en su extremo 5' terminal. Cada respectivo producto de la PCR se purifico en gel empleando tecnicas de purificacion en gel convencionales, y se realizo una segunda reaccion de PCR empleando la condicion 1 de la PCR. Despues el producto resultante se clono en un vector pGEM-T vector (Promega) y se secuencio.

Tras haber verificado las secuencias correctas, los fragmentos Lz-conector-DHFR 1-105 (363 pb) y Lz-conector- DHFR 106-187 (343 pb) se cortaron del vector pGEM-T con Xho1 y Mfe1, y los acidos nucleicos se purificaron en gel. El vector pDC317 se digirio con Not1 y Xho1, y el elemento de entrada a ribosomas interno (SIRE) de 558 pb se recupero mediante purificacion en gel. Puesto que Xho1 no es un sitio exclusivo sobre pDC317, se realizo un acoplamiento triple entre el elemento Not1/Xho1 SIRE, el Xho1/Mfe1 Lz-conector-DHFR 1-105 y el Lz-conector- DHFR 106-187 en pDC317 y los aislados se ensayaron y se confirmo que portaban el acoplamiento correcto mediante digestion de restriccion.

Los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo (Ab), que codifican un anticuerpo que reconoce espedficamente el receptor de interleuquina-4 murino (lL4R), se clonaron cada uno en los vectores preparados como se describio anteriormente. La cadena pesada (CP) del anti-IL4R se digirio con Not1 y Sal1. A partir de esta digestion se aislo un fragmento de 1413 pb mediante purificacion en gel. De forma similar, la cadena ligera (CL) del anticuerpo anti-IL4R se corto de un vector con las mismas enzimas, y el fragmento de cadena ligera de 736 pb se purifico en gel. Los vectores Lz-CONECTOR-DHFR-pDC317 (ambos 1-105 y 106-187) tambien se cortaron con Not1 y Sal1, y las cadenas pesada y ligera se clonaron en los correspondientes vectores de expresion. Se obtuvieron las siguientes combinaciones:

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IL4R Ab HC: Lz-conector-DHFR 1-105 pDC317 IL4R Ab LC: Lz-conector-DHFR 106-187 pDC317 IL4R Ab LC: Lz-conector-DHFR 1-105 pDC317 IL4R Ab HC: Lz-conector-DHFR 106-187 pDC317

Ejemplo 2: Construccion de un segundo conjunto de vectores de complementacion de DHFR

La construccion de un segundo conjunto de vectores recombinantes que expresan subunidades de un marcador seleccionable se realizo como sigue. Los vectores bicistronicos que contienen el sitio de entrada a ribosomas interno (SIRE) se basan en pED4 (Kaufman (1991), Nuc. Acids Res., 19(16):4485-4490). El vector basico, pDC318, es un derivado de pG2.1 (Aldrich (1998), Cytotechnology, 28:9-17) que contiene una porcion de 600 pares de bases truncada del elemento de secuencia de potenciacion de la expresion (ESPE). El pDC317 es un vector similar que contiene el ESPE mas grande de 3,6 kilobases. Se empleo una PCR para condensar una cremallera de leucina de GCN4 (LZ) y un conector flexible a dos fragmentos distintos del marcador seleccionable dihidrofolato reductasa (DHFR). El primer fragmento se extiende desde los aminoacidos 1-105 y el segundo fragmento incluye los aminoacidos 106-187. Los productos finales de la PCR despues se clonaron en pDC317 o pDC318 justo cadena abajo del elemento SIRE.

El elemento SIRE se modifico basandose en el vector pED3 creado por Davies et al., para potenciar la traduccion de los fragmentos LZ-conector-DHFR (Davies (1992), J. Virol., 66(4):1924-1932). Este cambio se incorporo en los fragmentos SIRE LZ-conector-DHFR en pDC317 por medio de una PCR empleando el cebador JM256 (5’- GATAATATGGCCACAACCATGTCTGACCGTATGAAACA-3’). El ATG subrayado marca la transicion del SIRE de pED3 a LZ. Despues los fragmentos se subclonaron en pGEM-T (Invitrogen) que contema la secuencia SIRE de longitud completa. Los fragmentos pED3 SIRE LZ-conector-DHFR 1-105 y 106-187 despues se clonaron en pDC318 para crear pDC321 y pDC322, o en pDC317 para crear pDC323 o pDC324, respectivamente.

Las cadenas del anticuerpo anti-IL4R murino se clonaron en los sitios de clonacion multiple de pDC321 y pDC322, justo cadena arriba del SIRE de pED3 para crear pDC321 CL, pDC321 CP, pDC322 CL, y pDC322 CP. De modo similar, las cadenas pesada y ligera se clonaron en los sitios de clonacion multiple de pDC323 y pDC324 para crear pDC323 CL, pDC323 CP, pDC324 CL, y pDC324 CP.

Ejemplo 3: Transfeccion y seleccion

Se realizo la transfeccion de los vectores anteriores en una lmea de celulas CHO deficiente en DHFR. Se emplearon protocolos de transfeccion convencionales. Se incubaron celulas a 37 °C hasta que alcanzaron la fase logantmica y se transfectaron con una concentracion apropiada de plasmidos purificados con 150 ul de lipofectamina (Gibco BRL), segun recomienda el fabricante. Las transfecciones con lipofectamina (Invitrogen) se realizaron con una proporcion 6:6:1 de pDC321 CL:pDC322 CP:pCDNA3 (Invitrogen), pDC321 C:PpDC322 CL:pCDNA3, pDC323 CL:pDC323 CP:pCDNA3, o pDC324 CP: pDC324 CL:pCDNA3.

La seleccion inicial se realizo en matraces de agitacion en un medio de seleccion sin DHFR con G418, con la recuperacion de hasta 70% de viabilidad, seguido de una seleccion en medio de seleccion de DHFR que carecfa de glicina, hipoxantina y timidina (-GHT), con una recuperacion de hasta 90% de viabilidad. Las agrupaciones establecidas despues de la seleccion con G418 y -GHT se expusieron a metotrexato 25 nM para intentar amplificar las cadenas de los anticuerpos y, por tanto, potenciar la produccion de anticuerpos en las agrupaciones. Tanto las agrupaciones no amplificadas como las agrupaciones amplificadas mostraron una produccion estable de anticuerpos durante este periodo de tiempo.

Para la clonacion, las celulas transfectadas se diluyeron y se cultivaron directamente en placas de 96 pocillos en medio de crecimiento -T. No fue necesaria una preseleccion en G418 ni -GHT.

Para los vectores pDC321 y pDC322, la agrupacion no amplificada mantuvo una qP de 1 |ig/106 celulas/dfa. Un aumento en la qP para la agrupacion amplificada se correlaciona con un aumento en la viabilidad despues de la recuperacion de las celulas de la seleccion. La qP de la agrupacion amplificada vano de 8-18 |ig/106 celulas/dfa, lo cual indica un aumento en 8-18 veces en la produccion de anticuerpos, comparado con la agrupacion no amplificada. Se evaluaron cinco agrupaciones independientes y se descubrio que mostraban niveles de expresion similares. Ademas del analisis de las agrupaciones, dos de los clones se escalaron en matraces de agitacion, se amplificaron con metotrexato 25 nM y se evaluaron para la expresion. La expresion fue similar a los resultados descritos para las agrupaciones.

Para los vectores pDC323 y pDC324, es decir, los vectores con el elemento ESPE de 3,6 kilobases, la agrupacion no amplificada mantuvo una qP de aproximadamente 5 |ig/106 celulas/dfa.

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Ejemplo 4: Expresion de anticuerpos procedentes de los vectores de complementacion

Despues las agrupaciones no amplificadas y las agrupaciones amplificadas se evaluaron bajo condiciones de produccion simuladas. Un desplazamiento hacia una temperatura mas baja, por ejemplo, 31 °C, conduce a unas titulaciones mayores. La induccion se realizo en 20 ml de cultivos de matraces agitados sometidos a una temperatura mas baja. Las titulaciones de los anticuerpos se midieron mediante ELISA. Una agrupacion no amplificada produjo 80 |ig/ml de anticuerpo en 9 dfas, manteniendo, al mismo tiempo, una viabilidad final de 65,8%. Se analizaron tres agrupaciones independientes. Las agrupaciones amplificadas produjeron un promedio de 407,8 |ig/ml de anticuerpo en 10 dfas, con un promedio de viabilidad final de 47,2%. La productividad espedfica (qP) de las agrupaciones vario de 10-20 jj.g/106 celulas/dfa.

Ejemplo 5: Analisis de la transferencia Western de anticuerpos

Se aislaron anticuerpos expresados a partir de las celulas transfectadas con los vectores pDC321 o pDC322 empleando metodos convencionales, se purificaron y se ensayaron en geles nativos y desnaturalizantes. Se utilizo un gel de Tris al 4-20%-glicina de 1 mm, 10 pocillos (Invitrogen, n.° de catalogo E6025) a 125 V durante aproximadamente 2 horas. Las muestras no se calentaron y se suspendieron en 2X tampon de muestras de gel de Tris-glicina nativo (Invitrogen, n.° de catalogo LC2673) con (reducido) o sin (no reducido) beta-mercaptoetanol al 5% (concentracion final del 2,5%). El tampon de muestra fue 1X tampon de ensayo de SDS. Los geles no eran desnaturalizantes porque, en ellos, no hada SDS ni agentes reductores, solo los tampones de muestra.

La transferencia a nitrocelulosa (papeles de filtro de membrana de nitrocelulosa Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, Invitrogen, LC2001) se realizo durante 45 minutos a 33 V. Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 °C en leche en polvo desnatada al 5% en PBST (Tween 20 al 0,1%) o disolucion "de transferencia". El anticuerpo anti-IgG de raton de cabra (H+L) conjugado con HRP purificado por afinidad de calidad de transferencia (Bio-Rad, n.° de catalogo 170-6516) se diluyo 1:2000 en disolucion de transferencia y se aplico a las transferencias durante 2,5 horas. Despues las transferencias se enjuagaron 5X durante 5 minutos cada una en PBST y se revelaron durante 30 segundos con los reactivos de deteccion de analisis de la transferencia Western ECL (Amersham Pharmacia Biotech, n.° de catalogo RPN2106).

Las muestras se derivaron todas de los sobrenadantes de transferencia 90 de los cultivos. De modo espedfico, el anticuerpo purificado se extrajo de un cultivo inducido no amplificado y se purifico en una columna de protema G. El sobrenadante de 0 nM se concentro hasta 10X en un concentrador Millipore (UFV2BCC40) a 3000 rpm, puesto que su concentracion, segun Mu FC ELISA, era menor que en las otras muestras. El gel no reducido demostro que el anticuerpo con la cadena pesada y ligera estaba presente en todos los casos y que existe muy poca cantidad de cadena ligera libre o cadena ligera dimerizada en los sobrenadantes de 25 y 50 nM, mientras que no apareda en los sobrenadantes de 0 nM y sf apareda una pequena cantidad de cadena ligera dimerizada en el Ab purificado.

Las cadenas pesadas y las cadenas ligeras estaban presentes en todos los sobrenadantes en proporciones equivalente al del anticuerpo purificado y, de modo significativo, apareda una cantidad considerablemente mayor de anticuerpo total en los sobrenadantes amplificados con metotrexato, lo cual resulta coherente con los resultados del ejemplo 3.

Tambien se purificaron anticuerpos procedentes de las celulas transfectadas con los vectores pDC323 o pDC324. Los anticuerpos procedentes de los sobrenadantes de las celulas presentaban proporciones equivalentes de cadenas pesadas y ligeras en el gel no reducido, con una cantidad muy pequena de cadena ligera libre o cadena ligera dimerizada.

Ejemplo 6: Analisis FACS de la expresion de DHFR

Se empleo la clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS) para verificar una amplificacion concurrente de la expresion de DHFR despues de la exposicion a metotrexato. Las agrupaciones no amplificadas y amplificadas se marcaron con metotrexato marcado con fluorescema, que se une a DHFR, y se analizaron en un analizador FACS Calibur. Se emplearon celulas CS9 no marcadas y no transfectadas como control. Tanto las agrupaciones no amplificadas como las agrupaciones amplificadas mostraron actividad DHFR, tal como se esperaba. Se observo un grado mayor de fluorescencia en la agrupacion amplificada con metotrexato 25 nM, comparada con la agrupacion no amplificada con metotrexato 0 nM. Esto verifica que la amplificacion de la expresion del anticuerpo se correlaciona con una amplificacion de la expresion de DHFR.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un sistema de expresion en hospedadores que comprende una celula hospedadora que ha sido modificada geneticamente para que exprese un primer vector que codifica un transcrito que comprende una primera secuencia de acido nucleico que codifica una primera cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de dicha primera secuencia de acido nucleico es inducida simultaneamente con la transcripcion de una segunda secuencia de acido nucleico que codifica una primera subunidad de un marcador seleccionable, y un segundo vector que codifica un transcrito que comprende una tercera secuencia de acido nucleico que codifica una segunda cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina que es capaz de asociarse con la primera cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera de inmunoglobulina para formar un complejo heteromero, en el que la transcripcion de dicha tercera secuencia de acido nucleico es inducida simultaneamente con la transcripcion de una cuarta secuencia de acido nucleico que codifica una segunda subunidad de un marcador seleccionable, y en el que dichas primera y segunda subunidades del marcador seleccionable se asocian para proporcionar una actividad seleccionable, en el que un sitio de entrada a ribosomas interno aparece entre la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico, en el que un sitio de entrada a ribosomas interno aparece entre la tercera secuencia de acido nucleico y la cuarta secuencia de acido nucleico, y el complejo heteromero es un anticuerpo.
2. 2. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 1, en el que el marcador seleccionable se

   selecciona del grupo que consiste en un marcador de resistencia a farmacos y un marcador de supervivencia

   metabolica.
3. 3. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 2, en el que el marcador seleccionable se

   selecciona del grupo que consiste en dihidrofolato reductasa, resistencia a neomicina, resistencia a higromicina, y

   beta-galactosidasa.
4. 4. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 1, en el que la subunidad del marcador seleccionable es un polipeptido de fusion que comprende un dominio de interaccion.
5. 5. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 4, en el que el dominio de interaccion es una cremallera de leucina procedente de un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en GCN4, C/EBP, c-Fos, c- Jun, c-Myc y c-Max.
6. 6. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 1, que codifica ademas un marcador seleccionable funcional diferente seleccionado de la lista que consiste en zeomicina, neomicina, puromicina, blasticidina S y GPT.
7. 7. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 1, en el que la celula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en celulas CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, una lmea de celulas de mieloma, y celulas WI38
8. 8. Un metodo para producir un complejo heteromero, que comprende la etapa de cultivar la celula hospedadora, segun se define en la reivindicacion 1, bajo condiciones en las que el complejo heteromero es expresado por la celula hospedadora.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende ademas aislar el complejo heteromero.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, que comprende ademas formular el complejo heterotnmero en una forma a granel esteril o una forma de dosis unitaria esteril.
11. 11. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 1, que comprende una celula hospedadora que ha sido modificada geneticamente para que exprese un primer vector que comprende una primera secuencia de acido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de dicha cadena ligera es inducida simultaneamente con la transcripcion de una segunda secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion de una primera subunidad de dihidrofolato reductasa condensada con una secuencia de dimerizacion, y un segundo vector que comprende una tercera secuencia de acido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de dicha cadena pesada es inducida simultaneamente con la transcripcion de una cuarta secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion de una segunda subunidad de una dihidrofolato reductasa condensada con una secuencia de dimerizacion, en el que cada subunidad de dihidrofolato reductasa no presenta una actividad seleccionable cuando se expresa por sf sola, y la coexpresion de la primera subunidad de dihidrofolato reductasa con la segunda subunidad de dihidrofolato reductasa proporciona actividad dihidrofolato reductasa.
12. 12. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 11, en el que una subunidad de la dihidrofolato reductasa (DHFR) esta formada por los aminoacidos 1 a 105 de DHFR, y la otra subunidad de la dihidrofolato reductasa (DHFR) esta formada por los aminoacidos 106 a 187 de DHFR.

    5

    10

    15

    20

    25
13. 13. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 12, en el que la secuencia de dimerizacion condensada con la subunidad de dihidrofolato reductasa se deriva de la secuencia de cremallera de leucina de GCN4.
14. 14. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 1, que comprende una celula hospedadora que ha sido modificada geneticamente para que exprese un primer vector que codifica un transcrito que comprende una primera secuencia de acido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de dicha primera secuencia de acido nucleico es inducida simultaneamente con la transcripcion de una segunda secuencia de acido nucleico que codifica una primera subunidad de un marcador seleccionable, y un segundo vector que codifica un transcrito que comprende una tercera secuencia de acido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, en el que la transcripcion de la tercera secuencia de acido nucleico es inducida simultaneamente con la transcripcion de una cuarta secuencia de acido nucleico que codifica una segunda subunidad de un marcador seleccionable, y en el que dichas primera y segunda subunidades del marcador seleccionable se asocian para proporcionar una actividad seleccionable.
15. 15. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 14, en el que el marcador seleccionable se selecciona del grupo que consiste en dihidrofolato reductasa, resistencia a neomicina, resistencia a higromicina y beta-galactosidasa.
16. 16. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 15, en el que la subunidad del marcador seleccionable es un polipeptido de fusion que comprende un dominio de interaccion.
17. 17. El sistema de expresion en hospedadores de la reivindicacion 16, en el que el dominio de interaccion es una cremallera de leucina procedente de un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en GCN4, C/EBP, c-Fos, c- Jun, c-Myc y c-Max.