ES2617612T3 - Procedimiento para la determinación de la actividad de proteína S. - Google Patents

Procedimiento para la determinación de la actividad de proteína S. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la determinación de la actividad de cofactor de proteína Ca de proteína S en una muestra de líquido corporal humano o animal, en el que a. en una primera formulación de reacción se mezcla la muestra con i. proteína C activada o una sustancia para la activación de proteína C y ii. factor Va o una sustancia para la activación directa o indirecta de factor V b. y en el que se mide la reacción de coagulación en la formulación de reacción, caracterizado porque en una segunda formulación se mezcla la muestra, adicionalmente a los mismos componentes que son usados para la preparación de la primera formulación de reacción, con un inhibidor que inhibe la actividad de cofactor de proteína Ca de proteína S y se mide la reacción de coagulación en la formulación de reacción y entonces se determina actividad de cofactor de proteína Ca de proteína S, en lo cual se forma el cociente de la reacción de coagulación que fue medida en la primera formulación de reacción, y la reacción de coagulación que fue medida en la segunda formulación de reacción.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para la determinacion de la actividad de protelna S
La invencion esta en el campo del diagnostico por coagulacion y se refiere a un procedimiento in vitro para la determinacion de la actividad de protelna S.
El sistema de coagulacion sangulnea satisface dos objetivos opuestos: por un lado cuida mediante mecanismos de anticoagulacion que se mantenga una corriente sangulnea continua correcta; por otro lado, en el caso de una herida vascular mediante mecanismos de procoagulacion, garantiza que tiene lugar un cierre de la herida.
Para la activacion del sistema de coagulacion como consecuencia de una herida vascular, mediante un sistema tipo cascada de proteasas activadoras, surge finalmente la proteasa activa trombina (factor Ila). La formacion de trombina inicialmente solo muy lenta, es acelerada mediante la trombina en si misma, en lo cual se activan los cofactores factor V y VIII, mediante escision proteolltica. Los cofactores activados factor Va y Villa forman sobre superficies de fosfollpidos con las proteasas factor Xa y IXa, un complejo enzima-cofactor cuya actividad activadora de trombina es aproximadamente 1000 veces mas alta que la actividad de las proteasas singulares. Mediante este acoplamiento inverso positivo se llega a un surgimiento explosivo de grandes cantidades de trombina. La trombina transforma el fibrinogeno hasta fibrina, la cual forma pollmeros y conduce al cierre de la herida.
Para impedir un aumento de la coagulacion peligroso para la salud, que pudiese conducir a un cierre del sistema circulatorio en el cuerpo, tiene que inactivarse la trombina formada, como tambien prevenirse la formacion de mas trombina. La trombina activa es neutralizada mediante la formacion de complejo con inhibidores de trombina como por ejemplo antitrombina. La formacion de mas trombina es moderada mediante la trombina en si misma. La trombina se une a la protelna de membrana trombomodulina. El complejo celular trombina-trombomodulina activa el inhibidor de protelna Protelna C (PC) hasta dar Protelna Ca (Protelna C activada, APC). La APC inactiva los factores Va y VIIIa y regula con ello la formacion de trombina. Para su optimo efecto inhibidor de la coagulacion, la APC requiere, entre otras, de protelna S como cofactor.
La protelna S es una protelna de plasma dependiente de la vitamina K. En la sangre, la protelna S esta unida parcialmente a la protelna que se une a C4b (C4b-BP). Solo aproximadamente 40 % de la protelna S presente, ocurre como protelna S libre, no unida. Solo la protelna S libre estimula la inactivacion de factor Va y VIIIa mediante APC. Esta actividad inhibidora de la coagulacion de la protelna S es denominada tambien como actividad de cofactor de protelna Ca o actividad de cofactor de APC.
Aparte de la actividad de cofactor de protelna Ca, que conduce a la inactivacion de factor Va y VIIIa, la protelna S libre puede inhibir tambien directamente el complejo protrombinasa de procoagulacion y el complejo tenasa de procoagulacion, en lo cual se une al factor Va y al factor Xa. Esta segunda actividad inhibidora de la coagulacion de la protelna S es denominada tambien como actividad independiente de APC (van Wijnen, M. et al., A plasma coagulation assay for an activated protein C-independent anticoagulant activity of protein S. Thromb Haemost 1998, 80: 930-035).
De acuerdo con ello, la protelna S tiene una importante funcion inhibidora en el sistema de coagulacion. Una falta de protelna S o una actividad reducida de protelna S son factores reconocidos de riesgo para una trombofilia. En particular, la actividad de protelna S es un importante marcador para la evaluacion de un riesgo de trombosis.
La determinacion de la actividad de protelna S en el laboratorio cllnico ocurre frecuentemente mediante la determinacion de la actividad del cofactor de protelna Ca de la protelna S. Para ello, comunmente se mezcla la muestra con una cantidad estandarizada de protelna C activada, y se activa la coagulacion, mediante lo cual surge el factor Va, el cual es inhibido mediante la protelna C activada anadida. La protelna S presente en la muestra actua como cofactor para la protelna C activada. Cuanto mayor sea la actividad de protelna S en la muestra, mayor sera el tiempo de coagulacion de la formulacion de reaccion. Son por ejemplo pruebas conocidas, obtenibles comercialmente, la prueba de la protelna S Ac de Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Alemania o la prueba de coagulacion STA de protelna S de Diagnostica Stago, Francia.
Es un problema, que diferentes magnitudes de influencia pueden perjudicar la determinacion de la actividad de cofactor de protelna Ca de la protelna S y pueden conducir a falsos resultados de medicion.
Una magnitud de influencia conocida es una mutacion que ocurre frecuentemente de factor V en la posicion de escision de la protelna Ca del factor V (dolencia del factor V), que conduce a que el factor Va ser resistente contra la protelna C activada (resistencia a APC), es decir que el ya no pueda ser inactivado por la protelna Ca. En muestras de pacientes con una mutacion de dolencia (no reconocida) de factor V, la protelna S puede no desarrollar su efecto de refuerzo a la protelna Ca, en lo cual comienza la reaccion de coagulacion sin impedimentos, de modo que se determina una falsa actividad muy baja de protelna S. Para excluir la perturbacion de la mutacion de dolencia de factor V, en el estado de la tecnica se sugiere que a la muestra se agregue factor Va
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ya activado (Wolf, M. et al., A new functional assay for human protein S activity using activated factor V as substrate. Thromb Haemost. 1989, 62(4): 1144-1145 y STA protein S Clotting Test).
Otra dimension conocida de influencia es la presencia de trombocitos en la muestra. En muestras de plasma, que por procesamiento inadecuado contienen mas de 10.000 trombocitos/mL, existe el peligro de que se determine una actividad falsa muy baja de protelna S (Patzke, J. et al., Characterization of a protein S assay measuring the APC cofactor activity. J Lab Med 2007, 31(6): 262-272).
Aun otra dimension conocida de influencia son anticuerpos antifosfollpidos presentes en la muestra de pacientes, en particular aquellos que interfieren el tiempo de coagulacion in vitro de la muestra del paciente (anticoagulantes de lupus). En muestras de pacientes con un slndrome (no reconocido) antifosfollpido puede superponerse el efecto de la protelna S de prolongacion del tiempo de coagulacion de anticoagulantes de lupus, de modo que se determina una actividad falsa muy alta de protelna S.
El objetivo de la presente invencion consiste en mejorar un procedimiento conocido para la determinacion de la actividad de cofactor de protelna Ca de la protelna S, en el cual se mezcla la muestra con protelna C activada o una sustancia para la activacion de protelna C y con factor Va o una sustancia para la activacion directa o indirecta de factor V hasta dar una formulacion de reaccion y se mide la reaccion de coagulacion en la formulacion de reaccion, de modo que se elimina la influencia de cualquier perturbacion, de modo que puede determinarse especlficamente la verdadera actividad de protelna S de la muestra.
El objetivo se logra mediante la mezcla de la muestra en una segunda formulacion de reaccion adicionalmente a los mismos componentes que son usados para la preparacion de una primera formulacion de reaccion, con un inhibidor, el cual inhibe la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, y la medicion de la reaccion de coagulacion en la formulacion de reaccion y entonces determinacion de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, en lo cual se forma el cociente de la reaccion de coagulacion que fue medido en la primera formulacion de reaccion, y la reaccion de coagulacion que fue medido en la segunda formulacion de reaccion.
La adicion de un inhibidor que inhibe la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, a la segunda formulacion de reaccion, provoca que la actividad de protelna S en la formulacion de reaccion sea igual o cercana a 0 %, mientras la influencia de cualquier perturbacion en la muestra, como por ejemplo dolencia de factor V, muy alto numero de trombocitos o anticuerpos antifosfollpidos, permanece sin modificacion en la reaccion de coagulacion de la formulacion de reaccion. En la segunda formulacion de reaccion se mide por consiguiente solo la influencia de cualquier perturbacion. Mediante la formacion del cociente de los resultados de prueba de la primera y segunda formulaciones de reaccion, se elimina la influencia de cualquier perturbacion, y es cuantificable la actividad real de protelna S.
Se entiende por un "inhibidor que inhibe la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S", toda sustancia que inhibe al menos la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, como por ejemplo anticuerpos monoclonales que se unen a protelna S o fragmentos de anticuerpos monoclonales que se unen a protelna S, que fueron producidos mediante procedimientos conocidos, adecuados para la preparacion de anticuerpos monoclonales y fueron seleccionados de acuerdo con su capacidad para inhibir la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S (vease tambien ejemplo 1). Otra sustancia adecuada es protelna que se une a C4b (C4b-BP), que se une a la protelna S libre y mediante ello la inactiva.
Un inhibidor preferido que inhibe la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, es un anticuerpo monoclonal que se une a la protelna S y que es producido por la llnea de celulas de hibridoma 96-168/01. Esta llnea de celulas de hibridoma fue depositada el 7 de noviembre de 2012 en el Leibniz-Institut DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, bajo el numero de acceso DSM ACC3188. Ademas se prefieren fragmentos de anticuerpo monoclonal que se une a protelna S, producido por la llnea de celulas de hibridoma 96-168/01.
Otro objetivo descrito en el documento es la llnea de celulas de hibridoma, que fue depositada en el DSMZ bajo el numero de acceso DSM ACC3188 as! como el anticuerpo que fue producido por la llnea de celulas de hibridoma DSM ACC 3188, as! como fragmentos de el que se unen a protelna S. En el sentido de la invencion, se entiende por una "muestra", un material que presumiblemente contiene la protelna S que va a ser determinada. El concepto de muestra se refiere a llquidos corporales humanos o animales, especialmente sangre y plasma, preferiblemente plasma pobre en plaquetas.
En formas de realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion, en las cuales se mezcla la muestra con protelna C activada, se usa preferiblemente protelna Ca humana purificada. De modo alternativo puede mezclarse la muestra con una sustancia para la activacion de la protelna C, que puede activar la protelna C en la muestra y/o cualquiera anadida a la muestra. Son sustancias adecuadas para la activacion de protelna C por ejemplo trombina, preferiblemente trombina o bovina, o un activador de protelna C del veneno de serpientes, preferiblemente de
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veneno de serpientes del genero Agkistrodon contortrix.
En formas de realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion, en las cuales a la muestra se anade factor Va, se usa preferiblemente factor Va humano o bovino purificado o factor Va purificado de conejo. De modo alternativo a ello, puede mezclarse la muestra con una sustancia para la activacion directa o indirecta de factor V. Para la activacion directa de factor V son adecuadas en particular trombina, preferiblemente trombina humana o bovina, o un activador de factor V de veneno de serpientes, preferiblemente activador del factor V de veneno de serpiente del genero Vipera russelli. Para la activacion indirecta de factor V son adecuadas en particular sustancias del grupo de los activadores de fase de contacto, como por ejemplo caolln, sllice, vidrio o acido elagico, o tromboplastina. Otra sustancia para la activacion indirecta de factor V es un activador de protrombina, preferiblemente el activador de protrombina de veneno de serpientes del genero Echis carinatus. Aun otra sustancia para la activacion indirecta de factor V es un activador de factor X de veneno de serpientes, preferiblemente activador de factor X del veneno de serpiente del genero Vipera russelli.
En otra forma de realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion, puede mezclarse la muestra adicionalmente con un plasma carente de protelna S. Esto tiene como ventaja que se compensa cualquier otra carencia de factores en la muestra de paciente que va a ser investigada y no tiene influencia en los resultados de la prueba.
La reaccion de coagulacion en la primera y en la segunda formulacion de reaccion puede ser medida mediante determinacion del momento de coagulacion. Para ello se mide en segundos el tiempo desde el momento de adicion de factor Va o la sustancia para la activacion directa o indirecta de factor V a la muestra o bien a la formulacion de reaccion, hasta la formacion de un coagulo identificable de fibrina. De modo alternativo puede usarse un sustrato cromogeno para trombina y medir el intervalo de tiempo desde la adicion de factor Va o la sustancia para la activacion directa o indirecta de factor V a la muestra, hasta alcanzar una velocidad de cambio de absorcion definida.
El tiempo de coagulacion puede ser determinado mediante metodos manuales o automaticos. En la determinacion automatica es adecuada la medicion de una propiedad mecanica u optica de la formulacion de reaccion, por ejemplo la viscosidad o turbidez. En casos de medicion automatica, comunmente se mide de manera continua una propiedad de la formulacion de reaccion, y a partir de la modificacion de la propiedad en funcion del tiempo, con ayuda de procedimientos de valoracion puede determinarse el tiempo de coagulacion como punto final.
Se determina la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S de acuerdo con la invencion, mediante la formacion del cociente de la reaccion de coagulacion que fue medida en la primera formulacion de reaccion en ausencia de un inhibidor especlfico de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, y la reaccion de coagulacion que fue medida en la segunda formulacion de reaccion en presencia de un inhibidor especlfico de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S. Cuanto mayor es el cociente determinado, mayor es la actividad del cofactor de protelna Ca de protelna S en la muestra. Mediante la comparacion del cociente determinado para una muestra de paciente con una curva de calibracion adecuada, se determina la actividad de protelna S.
Descripcion de las figuras
Figura 1
La figura 1 muestra la inhibicion de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en plasma normal, mediante anticuerpo monoclonal MAK49 (rectangulo no lleno) en comparacion con la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en plasma normal sin inhibidor (rectangulo lleno). Tiempos de coagulacion de 143 s corresponden a 100 % de actividad de protelna S, tiempos de coagulacion de 96 s corresponden a 0 % de actividad de protelna S (plasma carente de protelna S, llnea discontinua). Desde una concentracion de aproximadamente 300 a 500 nM MAK49 en la formulacion de reaccion se alcanza una inhibicion maxima de actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S. Se entiende por "inhibicion depurada" (asteriscos) la inhibicion que se restaura exclusivamente en presencia de MAK49. La inhibicion condicionada aparente por dilucion fue determinada mediante adicion de cantidades correspondientes de amortiguador sin MAK49 (rectangulo lleno), y la inhibicion total (rectangulo no lleno) fue depurada a los valores correspondientes.
Figura 2
La figura 2 muestra una curva de calibracion para los cocientes (relacion) de los tiempos de coagulacion en ausencia y en presencia del anticuerpo monoclonal MAK49 que inhibe protelna S, contra la actividad de protelna S (en % del estandar). La curva de calibracion sirve para derivar de manera directa actividades de protelna S en % del estandar, a partir del resultado del procedimiento de acuerdo con la invencion, con formacion de cocientes de una muestra desconocida.
Figura 3
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La figura 3 despliega para muestras de 5 donantes con dolencia de mutacion FV homocigotica, la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S (tiempo de coagulacion) en ausencia del inhibidor MAK49 (barra punteada), la cantidad de antlgeno de protelna S libre (barra de tiras longitudinales) y los cocientes de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S (tiempo de coagulacion) medida en ausencia de MAK49 y la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S (tiempo de coagulacion) medida en presencia de MAK49 (barras con tiras transversales). La muestra numero 4 proviene de un paciente que fue tratado adicionalmente con un anticoagulante oral.
Ejemplos
Ejemplo 1: preparacion de un anticuerpo monoclonal antiprotelna S, que inhibe la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S
Se uso protelna S humana coagulada como antlgeno de inmunizacion. Se inyectaron por via intraperitoneal en cada caso a seis ratones, 20 pg de antlgeno de inmunizacion (protelna S). Despues de varias semanas se sacrificaron los ratones, y se tomaron los bazos y se produjeron suspensiones individuales de celulas. Se realizo fusion de las celulas de los bazos con celulas de mieloma (Sp2/0), y se transfirieron las celulas de hibridoma as! obtenidas a placas de cultivo celular de microtitulacion. Se probo la especificidad de los anticuerpos dejados en el sobrenadante del cultivo celular, en una primera etapa con ayuda de placas de microtitulacion recubiertas con protelna S humana (recubrimiento 1 pg/ml = 0,15 pg/depresion). A cada depresion se transfirio con pipeta una allcuota de un sobrenadante de cultivo celular. Despues de un tiempo de incubacion se retiro el sobrenadante, y se lavo cada depresion con amortiguador. A continuacion se transfirio con pipeta a cada depresion una solucion que contenla un anticuerpo anti-raton-IgG acoplado con peroxidasa. Despues de un tiempo de incubacion y lavado de las depresiones con amortiguador de lavado, se anadio a cada depresion una allcuota de una solucion de TMB cromogenico, y se midio la reaccion de color a 405 nm.
A continuacion se probo el anticuerpo monoclonal obtenido despues de la clonacion, que se une de manera especlfica a la protelna S, respecto a su capacidad de inhibir la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S. Para ello se anadieron a plasma normal concentraciones crecientes del anticuerpo monoclonal antiprotelna S, y se midio la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en las muestras de plasma (para la medicion de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S vease ejemplo 2). De modo paralelo se anadio a plasma normal, protelna purificada que se une a C4b (C4b-BP), y se midio la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S.
Los anticuerpos, con los cuales puede alcanzarse una inhibicion de la actividad de protelna S, que corresponde a la inhibicion de la actividad de protelna S, que es causada por 100 nMol/L de protelna que se une a C4b (C4b-BP) en plasma normal, son adecuados como inhibidores de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S. Se prepara un anticuerpo monoclonal ("MAK49") identificado de este modo, de la llnea de celulas de hibridoma 96- 168/01. Esta llnea de celulas de hibridoma fue depositada el 7 de noviembre de 2012 en el Leibniz-Institut DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, bajo el numero de acceso DSM ACC3188.
La figura 1 muestra la inhibicion de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en plasma normal, por el anticuerpo monoclonal MAK49 (rectangulo no lleno) en comparacion con la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en plasma normal sin inhibidor (rectangulo lleno). Se midio el tiempo de coagulacion como se describe en el ejemplo 2. Tiempos de coagulacion de 143 s representan 100 % de actividad de protelna S, tiempos de coagulacion de 96 s representan 0 % de actividad de protelna S (plasma carente de protelna S, llnea punteada). Desde una concentracion de aproximadamente 300 a 500 nM MAK49 en la formulacion de reaccion, se alcanza una inhibicion maxima de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S. Se entiende por "inhibicion depurada" (asteriscos) la inhibicion que se restaura exclusivamente en presencia de MAK49. La inhibicion condicionada aparente por dilucion fue determinada mediante adicion de cantidades correspondientes de amortiguador sin MAK49 (rectangulo lleno), y la inhibicion total (rectangulo no lleno) fue depurada a los valores correspondientes.
Ejemplo 2: Calibracion de la actividad de protelna S de diferentes muestras con actividad conocida de protelna S contra los cocientes de los tiempos de coagulacion de las muestras en ausencia y en presencia de un inhibidor de protelna S
Procedimiento para la determinacion de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S
Para la determinacion de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en ausencia o bien en presencia de un inhibidor que inhibe la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, se mezclaron 95 pl de muestra con 5 pl de amortiguador o bien con 5 pl de solucion de inhibidor (MAK49 10 pM) y se incubo por aproximadamente tres minutos. Se diluyeron entonces las muestras 1:7 con plasma carente de protelna S. Se mezclaron 16 pL de esta dilucion una vez con 27 pL de plasma carente de protelna S, y despues de 20 segundos de incubacion se anadieron 58 pL de un reactivo APC que contiene protelna C humana activada (APC) y cloruro de calcio. Despues de otros 110 segundos de duracion, para iniciar la reaccion de coagulacion se anadieron 145 pL de un reactivo
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activador, el cual contiene veneno Russells Viper (RVV, veneno de Vipera russelli) y fosfollpidos, para la activacion de factor X a factor Xa, el cual nuevamente activa factor V a factor Va.
La determinacion de la actividad de protelna S ocurre segun el siguiente principio: APC escinde de manera proteolltica al factor Va, el cual surge en la activacion de la cascada de coagulacion mediante RVV. La protelna S actua al respecto como cofactor, el cual acelera la reaccion considerablemente. Mediante ello se llega a un tiempo de coagulacion creciente de manera proporcional a la actividad de protelna S en la muestra. La adicion de plasma carente cuida de un suficiente suministro a la formulacion de fibrinogeno, factor V y los otros factores de coagulacion necesarios. La coagulacion se pone en marcha en la etapa del factor X mediante el activador de factor X de RVV. El factor Xa forma bajo mediacion del factor Va aun remanente, trombina a partir de protrombina. La trombina se transforma finalmente en fibrinogeno.
El momento de coagulacion fue determinado opticamente.
Se prepararon muestras de plasma con diferentes concentraciones de protelna S, en lo cual se mezclo plasma humano normal con una actividad de protelna de 90 % del estandar, con plasma carente de protelna S con una actividad de protelna S de 0 % (muestras de plasma con 90 %, 67,5 %, 45 %, 22,5 % y 0 % de actividad de protelna S), y se examinaron las muestras con el procedimiento descrito anteriormente.
Para cada muestra se determino el tiempo de coagulacion en ausencia y en presencia del anticuerpo monoclonal MAK49 que inhibe la protelna S, el cual inhibe la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, y se formo el cociente del tiempo de coagulacion medido en ausencia de MAK49 y tiempo de coagulacion medido en presencia de MAK49. Se realizo una grafica de los cocientes as! determinados, contra la actividad conocida de protelna S de las muestras, y la curva resultante sirvio como curva de calibracion para la medicion de muestras con actividades desconocidas de protelna S. En la figura 2 se muestra la curva de calibracion.
Ejemplo 3: determinacion de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en muestras de donantes con dolencia de mutacion FV homocigotica
Se descongelaron en el bano de agua a 37 °C por 15 min, muestras de plasma congeladas de cinco donantes con dolencia de mutacion FV homocigotica, y se midio la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en presencia y en ausencia de MAK49 (como se describe en el ejemplo 2). Ademas se determino en cada muestra con un inmunoensayo, la cantidad de antlgeno de protelna S libre. En la figura 3 se representan los resultados de manera comparativa.
La figura 3 ensena para cada muestra la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en ausencia del inhibidor MAK49 (barras punteadas), la cantidad de antlgeno de protelna S libre (barras con llneas longitudinales) y los cocientes de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S (tiempo de coagulacion) medida en ausencia del MAK49 y la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S (tiempo de coagulacion) medida en presencia de MAK49 (barras con llneas transversales).
En muestras de pacientes con una dolencia de mutacion de factor V la protelna S no puede desarrollar su accion de refuerzo de protelna Ca, en lo cual da inicio la reaccion de coagulacion sin impedimento, de modo que se determina un tiempo de coagulacion muy corto y con ello una falsa actividad muy baja de protelna S. Esto es claro en particular mediante la comparacion con la concentracion medida de antlgeno de protelna S. La formacion de cociente segun el procedimiento de acuerdo con la invencion muestra sin embargo una mejor comparabilidad con los resultados de la determinacion de antlgeno de protelna S. La unica excepcion es una muestra, que proviene de un paciente con dolencia de factor V homocigotico, que adicionalmente es tratado con un anticoagulante oral (muestra numero 4). Aqul se reduce de manera similar la actividad de protelna S, tanto en la prueba de actividad de cofactor de protelna Ca como tambien en el procedimiento de acuerdo con la invencion con formacion de cocientes.

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    I. Procedimiento para la determinacion de la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S en una muestra de llquido corporal humano o animal, en el que
    a. en una primera formulacion de reaccion se mezcla la muestra con
    1. protelna C activada o una sustancia para la activacion de protelna C y
    ii. factor Va o una sustancia para la activacion directa o indirecta de factor V
    b. y en el que se mide la reaccion de coagulacion en la formulacion de reaccion,
    caracterizado porque en una segunda formulacion se mezcla la muestra, adicionalmente a los mismos componentes que son usados para la preparacion de la primera formulacion de reaccion, con un inhibidor que inhibe la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S y se mide la reaccion de coagulacion en la formulacion de reaccion y entonces se determina actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, en lo cual se forma el cociente de la reaccion de coagulacion que fue medida en la primera formulacion de reaccion, y la reaccion de coagulacion que fue medida en la segunda formulacion de reaccion.
  2. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que en la primera y la segunda formulacion de reaccion se mezcla la muestra adicionalmente con plasma carente de protelna S.
  3. 3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que la protelna C activada, que se mezcla con la muestra, es protelna Ca humana purificada.
  4. 4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2, en el que la sustancia para la creacion de protelna C es trombina o un activador de protelna C de veneno de serpiente, preferiblemente de veneno de serpiente del genero Agkistrodon contortrix.
  5. 5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes,en el que la sustancia para la activacion directa de factor V es trombina o un activador de factor V de veneno de serpiente, preferiblemente el activador de factor V del veneno de serpiente del genero Vipera russelli.
  6. 6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, en el que la sustancia para la activacion indirecta de factor V es un activador de fase de contacto, preferiblemente en activador de fase de contacto del grupo de caolln, sllice, vidrio y acido elagico.
  7. 7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, en el que la sustancia para la activacion indirecta de factor V es tromboplastina.
  8. 8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, en el que la sustancia para la activacion indirecta de factor V es un activador de protrombina, de forma mas preferida el activador de protrombina del veneno de serpiente del genero Echis carinatus.
  9. 9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, en el que la sustancia para la activacion indirecta de factor V es un activador de factor X, de manera mas preferida el activador de factor X del veneno de serpiente del genero Vipera russelli.
  10. 10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, en el que el factor Va, que se mezcla con la muestra, es factor Va humano o bovino purificado o factor Va purificado de conejo.
    II. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que el inhibidor que inhibe de manera especlfica la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, es un anticuerpo que se une a la protelna S o un fragmento de anticuerpo que se une a la protelna S o protelna que se une a C4b.
  11. 12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion11, en el que el inhibidor que inhibe de manera especlfica la actividad de cofactor de protelna Ca de protelna S, es un anticuerpo que se une a la protelna S, que es producido por la llnea de celulas de hibridoma DSM ACC3188, o un fragmento de el que se une a la protelna S.
  12. 13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que se mide la reaccion de coagulacion en la primera y en la segunda formulacion de reaccion, mediante determinacion del momento de coagulacion.
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